MX2013014548A - Preparacion de camaras de reaccion con proteinas deshidratadas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método de aplicación de un punto de una biomolécula no marcada, por ejemplo, anticuerpo o antígeno proteico, a una superficie de una cámara de reacción de ensayo de diagnóstico. Este método comprende los pasos de aplicar a la superficie de la cámara de reacción una solución que comprende un azúcar y que comprende una biomolécula no marcada, por ejemplo anticuerpo o antígeno proteico, y permitir que la solución se seque. En este método la biomolécula está en una concentración suficiente para saturar los sitios de enlace para una proteína sobre la superficie, donde ha sido aplicada la solución. La presente invención se refiere a una cámara de reacción de un dispositivo de diagnóstico para realizar un ensayo de detección basado en biomolécula, por ejemplo en anticuerpo o en antígeno proteico. En la presente, la cámara de reacción comprende una región de detección con uno o más puntos de biomolécula no marcada enlazada a la región de detección. Uno o más puntos tienen entre 0.1 a 0.5 mm. El punto comprende un azúcar y una proteína y comprende entre 0.01 y 0.5 ng de la biomolécula.

Description

PREPARACION DE CAMARAS DE REACCION CON PROTEINAS DESHIDRATADAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la fabricación de cámaras de reacción para ensayos de detección basados en biomoléculas , por ejemplo, anticuerpos o antígenos proteicos. La ' presente invención se refiere más en particular a la aplicación de biomoléculas, por ejemplo anticuerpos o antígenos proteicos, a una superficie de una cámara de reacción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Diferentes tipos de ensayos de detección basados en anticuerpos han sido desarrollados en las últimas décadas. La producción de ensayos de emparedado de flujo lateral comprende típicamente la aplicación de una zona de un anticuerpo no marcado sobre una lámina de material (por ejemplo, nitrocelulosa) después de lo cual la parte restante de la lámina es al menos tratada con una solución de bloqueo para prevenir el enlace del analito o el anticuerpo marcado durante el ensayo. La lámina deshidratada es dividida en tiras y ensamblada en cámaras de reacción con aberturas para la aplicación de una muestra y la lectura del ensayo. Para incrementar la vida de anaquel del anticuerpo inmovilizado, son, a menudo aplicados estabilizadores tales como azúcares, REF. 245177 sales y proteínas portadoras, sobre la parte superior del anticuerpo no marcado, inmovilizado.

En los ensayos de ELISA, una solución con un anticuerpo es aplicada dentro de un pozo, con lo que el anticuerpo enlazado y libre permanece en una solución durante los pasos posteriores del proceso de inmovilización (bloqueo, lavado y detección) .

Los ensayos de emparedado desde el punto de vista moderno son realizados en cámaras de reacción miniaturizadas . En ' tal ensayo una muestra entra a la cámara de reacción después de lo cual el anticuerpo marcado y el analito son enlazados . Estos ensayos no están basados en la migración de flujo lateral capilar de una muestra a través de una membrana. En consecuencia, no existe necesidad para aplicar el anticuerpo no marcado como una línea dentro de la cámara de .reacción. Para aumentar la sensibilidad del ensayo, el anticuerpo no marcado es típicamente aplicado como un punto. Aunque estas cámaras de reacción muestran diferencias significativas con las cámaras de reacción de flujo lateral de la técnica anterior, la aplicación del anticuerpo no marcado es todavía realizada utilizando los métodos de la técnica anterior, incluyendo los pasos de bloqueo, lavado y de estabilización.

El documento US2003/0175827 describe los microarreglos de proteína, en donde los anticuerpos son aplicados a un sustrato a una concentración entre 0.1 y 2.0 mg/ml en una solución que comprende azúcar. Estos arreglos de : proteínas no han sido adicionalmente optimizados para los ensayos de detección basados en anticuerpo.

El documento WO2010/086772 describe los ensayos basados inmunitariamente, en donde las partículas magnéticas con anticuerpos son secadas en una solución que comprende azúcar, en un sitio remoto de la región de detección de una cámara de reacción.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION : Los aspectos particulares y preferidos de la invención son descritos en las reivindicaciones independientes y dependientes anexas. Las características de ¡las reivindicaciones dependientes pueden ser combinadas con¡ características de las reivindicaciones independientes y con características de otras reivindicaciones dependientes, como sea apropiado, y no meramente como se describe explícitamente en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona los métodos en donde una biomolécula no marcada, por ejemplo, un anticuerpo o un antígeno proteico, es inmovilizada a una superficie de una, cámara de reacción. Al seleccionar los parámetros apropiados, tal como la concentración de la biomolécula y la composición de amortiguador, la aplicación, el secado y la preservación del anticuerpo pueden ser realizados en un paso simple. Al seleccionar la concentración apropiada de la biomolécula, no existe necesidad para realizar los pasos de lavado para eliminar un exceso de la biomolécula no marcada. Al incluir los estabilizadores proteicos, tales como azúcares, sales y proteínas la biomolécula es secada y almacenada bajo condiciones que garantizan una vida de anaquel prolongada, sin necesidad de aplicar recubrimientos adicionales con agentes estabilizadores.

Las muestras que son típicamente utilizadas en los ensayos de punto de cuidado son las mezclas complejas de proteínas, las cuales por sí mismas bloquearán los sitios de enlace a la proteína específica en la cámara de reacción. Esto hace redundante un paso de bloqueo. En el caso eventual de que una muestra sea utilizada, la cual comprende únicamente una cantidad limitada de proteína, aparte del analito de interés, puede ser agregada a tal muestra una proteína.

El método de la presente invención disminuye dramáticamente el número de pasos de manipulación y compuestos necesarios en la fabricación de una cámara de reacción. El método de la presente invención puede ser utilizado para fabricar cámaras de reacción para ensayos de emparedado de competencia para anticuerpos o antígenos, por ejemplo.

' Un aspecto de la presente invención se refiere a un método de aplicación de un punto de una biomolécula no marcada, por ejemplo, anticuerpo o antígeno proteico, a una superficie de una cámara de reacción de un ensayo de diágnóstico, el método comprende los pasos de: - aplicar a la superficie de la cámara de reacción una solución que comprende un azúcar y que comprende una biomolécula no marcada, y - permitir que la solución se seque, en donde la biomolécula está en una concentración justo suficiente para saturar los sitios de enlace para una proteína sobre la superficie, donde ha sido aplicada la solución.

I En las modalidades de estos métodos, la solución comprende además una sal y/o un amortiguador.

En modalidades de estos métodos, la solución comprende además una proteína. En otras modalidades de estos métodos el volumen de ía solución aplicada es adaptado para obtener un punto o mancha con un diámetro de entre 100 a 500 micrómetros.

En otras modalidades de estos métodos, el volumen de la solución está entre 1 y 10 nanolitros.

En otras modalidades de estos métodos, la solución comprende entre 0.01 y 0.5 g biomolécula por mi de solución.

En otras modalidades de estos métodos, la solución es aplicada mediante métodos de impresión.

En modalidades particulares de estos métodos, la cámara de reacción con la biomolécula deshidratada no sufre pasos de lavado antes de la aplicación de una muestra en la cámara de reacción.

En otras modalidades particulares de estos métodos, el volumen de la solución es ajustado para obtener un punto circular de entre 0.005 y 1.0 mm2.

: En otras modalidades particulares de estos métodos en donde el azúcar es sacarosa, la sal es cloruro de potasio, y la proteína es albúmina sérica bovina.

En modalidades particulares de estos métodos, el secado es realizado mediante la colocación de la cámara de reacción a 37 °C.

En otras modalidades particulares de estos métodos, una; pluralidad de diferentes biomoléculas no marcadas es aplicada como gotitas individuales separadas en diferentes posiciones a la superficie de la cámara de reacción.

En modalidades de estos métodos, la biomolécula comprende uno de los siguientes: anticuerpo, antígeno, proteína, peptido, molécula pequeña, moléculas de ácido nucleico y combinaciones y/o sus fragmentos de las mismas.

En modalidades de estos métodos, la concentración de 'la biomolécula en la solución es determinada al dividir una; capacidad de enlace de la superficie multiplicada con el tamaño de la superficie del punto por punto por el volumen de solución utilizada por punto.

\ Otro aspecto más de la presente invención se refiere a una cámara de reacción de un dispositivo de diagnóstico para llevar a cabo un ensayo de detección basado en ' biomolécula , por ejemplo, en anticuerpo o antígeno proteico, en donde la cámara de reacción comprende una región de detección con uno o más puntos de una biomolécula no marcada enlazada a la región de detección, en donde uno o más puntos tienen un diámetro de entre 0.1 a 0.5 mm, y en donde el punto comprende un azúcar, caracterizado porque el punto comprende un punto entre 0.01 y 0.5, ng de biomolécula.

En modalidades de estas cámaras de reacción, el punto comprende además una sal .

; En modalidades de estas cámaras de reacción, el punto comprende además una proteína.

En otras modalidades de estas cámaras de reacción, el azúcar es sacarosa.

En otras modalidades adicionales de estas cámaras de reacción, la sal es cloruro de potasio y el amortiguador es por ejemplo Bis-tris-propano .

En otras modalidades adicionales de estas cámaras de reacción, la proteína es albúmina sérica bovina.

En modalidades de estas cámaras de reacción, la concentración de la biomolécula en la solución utilizada para imprimir el punto ha sido determinada al dividir una capácidad de enlace de la superficie multiplicada por el tamaño de la superficie de punto por punto entre el volumen de ía solución impresa por punto.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención será descrita con respecto a las modalidades particulares y con referencia a ciertas figuras, pero la invención no está limitada a éstas, sino únicamente por las reivindicaciones. Cualesquiera signos de referencia en las reivindicaciones no serán considerados como limitantes del alcance. Las figuras descritas son sólo esquemáticas y no son limitantes. En las figuras, el tamaño i de i algunos de los elementos puede ser exagerado y no dibujado a escala para fines ilustrativos. Donde el término "que comprende" es utilizado en la presente descripción y en las reivindicaciones, éste no excluye otros elementos o pasos.

Donde es utilizado un artículo indefinido o definido cuando se hace referencia a un sustantivo singular, por ejemplo, "un" o "una", "el" o "la", esto incluye un plural de ese sustantivo a no ser que se especifique específicamente algo más.

• Además, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones, son utilizados para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Se debe entender que los términos así usados son intercambiables bajo las circunstancias apropiadas y que las modalidades de la invención descrita en el presente son susceptibles de operación en otras secuencias diferentes a las; que se describen o se ilustran en la presente.

Los siguientes términos o definiciones son proporcionados únicamente para ayudar en el entendimiento de la: invención. Estas definiciones no deben ser consideradas como poseedoras de un alcance menor que el que es entendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica.

Los métodos de la presente invención son aplicables a la detección de antígenos en una muestra utilizando dos anticuerpos. Un primer anticuerpo para el antígeno i (anticuerpo primario) , el cual está no marcado, es inmovilizado sobre un sustrato.

: Un segundo anticuerpo (anticuerpo secundario) para el , mismo antígeno, es detectablemente marcado y está en solución o en suspensión. Un antígeno que está presente en una muestra se enlazará al anticuerpo no marcado, así como al el anticuerpo marcado. Como consecuencia, el anticuerpo secundario, con su marcador, se llega a inmovilizar en el sustrato en la posición donde el anticuerpo primario ha sido inmovilizado.

La posición donde el anticuerpo no marcado es aplicado sobre la superficie de la cámara de reacción es en consecuencia la posición en donde el complejo del anticuerpo no marcado, el antígeno y el anticuerpo marcado es determinado, y también es referido como una región de detección. 1 Los métodos de la presente invención son también aplicables a los métodos mediante los cuales un antígeno proteico es inmovilizado sobre la superficie de reacción.

Este antígeno proteico es idéntico al analito de interés en una muestra, o es un polipéptido con afinidades de enlaces similares para un anticuerpo contra el analito. Por ejemplo, el: antígeno proteico puede ser un dominio o parte de enlace al anticuerpo del analito, y puede ser una proteína quimérica que lleva un epitopo para el anticuerpo contra el analito. Después de la entrada de una muestra un anticuerpo marcado contra el analito se enlazará ya sea con el analito no enlazado en la muestra, o con el antígeno proteico inmovilizado sobre la superficie de la cámara de reacción. En consecuencia, entre menos analito esté presente en una muestra, más anticuerpo se enlazará al antígeno inmovilizado, y más marcador será detectado.

Los antígenos proteicos inmovilizados son igualmente adecuados para la detección de anticuerpos en una muestra. En tal ensayo, el anticuerpo en la muestra (el cual no está marcado) y el anticuerpo marcado, competirán por el mismo antígeno de proteico inmovilizado.

Los diferentes tipos de marcadores detectables son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo secúndario puede ser acoplado a una enzima con una actividad enzimática detectable (por ejemplo, la conversión de un compuesto incoloro coloreado. Otros métodos de detección confían en la presencia de un grupo cromóforo (por ejemplo, grupo fluorescente) sobre el anticuerpo secundario. En los métodos de detección particulares, el anticuerpo secundario es; marcado con partículas magnéticas. Por ejemplo, los anticuerpos son acoplados a un material polimérico que comprende material magnético. Las propiedades magnéticas del marcador permiten por una parte la manipulación del anticuerpo secundario (impulsión, movimiento del complejo antígeno-anticuerpo hacia el anticuerpo primario, eliminación de janticuerpo secundario no enlazado) . i Por otra parte, la partícula magnética puede ser utilizada como un marcador detectable, ya sea por la medición de ; las propiedades magnéticas de la partícula, o por la detección de la presencia de partículas mismas mediante métodos ópticos (por ejemplo, Reflexión Interna Total Frustrada (FTIR por sus siglas en Inglés) ) .

La solución del anticuerpo no marcado o del antígeno proteico es aplicada sobre una superficie de una cámara de reacción que tiene capacidades de enlace a la proteína. Los materiales adecuados incluyen vidrio y plásticos tales como poliestireno . Cuando es aplicable, los materiales pueden ser funcionalizados con compuestos que permiten una reacción con el grupo reactivo de una proteína (NH, NH2, COOH, OH, SH, .. ) En modalidades particulares de la invención, la detección de los analitos enlazados es llevada a cabo mediante métodos ópticos mediante los cuales el anticuerpo no marcado o el antígeno proteico es aplicado sobre un material transparente óptico tales como vidrio o plásticos transparentes .

La descripción se referirá además a los métodos y dispositivos en donde los anticuerpos o los antígenos proteicos son aplicados sobre la superficie de una cámara de reacción. , Las diversas modalidades son explicadas con detalle para la aplicación de los anticuerpos, pero son igualmente adecuados para proporcionar una descripción completa para la aplicación de los antígenos proteicos.

En los métodos de la presente invención, el anticuerpo primario es aplicado en una gotita de la solución, para obtener un punto con un diámetro entre 0.1 y 0.5 mm (milímetros) . Las modalidades particulares cubren los puntos con un diámetro de 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.40 y 0.45 mm. Dependiendo de la tensión superficial del sustrato y del tamaño del punto considerado, esto implica la colocación de puntos de volúmenes de entre 0.05 y 50 ni (nanolitros) . Las modalidades particulares se refieren a volumen de entre 0.05 y 1 ni, 0.5 a 5 ni , 2.5 a 10 ni, 5 a 20 ni, de 10 a 30 ni y 20 a 50 ni, y combinaciones de los mismos.

Por otra parte, es el objetivo tener el punto sobre la superficie saturada con el anticuerpo primario. Por otra parte, cantidades excesivas del anticuerpo primario tienen que ser evitadas. El anticuerpo primario no enlazado que está presente sobre la región de detección formará un emparedado con el antígeno y el anticuerpo marcado secundario. No obstante, éste no será detectado en la región de, detección, ya que éste migrará lejos de la región de detección.

Dependiendo de la capacidad teórica de enlace a la próteína, de la superficie de la cámara de reacción, es posible ajustar la concentración de anticuerpo en la solución aplicada de tal que un exceso de una vez, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces o 5 veces del anticuerpo es aplicado en comparación a la !capacidad teórica de enlace del sustrato.

Dependiendo de las propiedades de la superficie y los anticuerpos, la concentración de anticuerpo es de 0.10 a 0.7!5 pg/ml (microgramo por mililitro). En modalidades particulares, la concentración está entre 0.10 a 0.25 µg/ml, entre 20 a 50 µg/ml, entre 0.30 a 0.50 g/ml o entre 0.40 a 0.75 yg/ml .

Dependiendo del volumen de la solución y la concentración del anticuerpo, pueden ser obtenidos puntos que contienen desde tan poco como 0.01 ng hasta 0.5 ng. Dependiendo del marcador sobre el anticuerpo secundario y la sensibilidad del ensayo, cantidades adecuadas del anticuerpo primario por punto están en el intervalo entre 0.01 ng y 0.1 ng, 0.05 a 0.2 ng y 0.1 a 0.5 ng . En modalidades particulares, de la presente invención, en donde se utilizan partículas magnéticas, cantidades tan pequeñas como entre 0.Ó1 ng y 0.05 ng del anticuerpo primario son suficientes para la detección de un antígeno sobre una muestra de sangre.

La aplicación de una gotita de solución de anticuerpo puede ser realizada mediante impresoras de chorro de; tinta. Las solicitudes de patente Europeas Nos.

EP1378359, EP1378360 y EP 1378361 describen métodos de control de una cabeza de impresión por chorro de tinta, que contiene tinta, en la cual un impulso de accionamiento es aplicado por un transductor electromagnético con el fin de expulsar una gota o gotita de tinta fuera de un conducto, en donde un circuito electrónico es utilizado para medir la impedancia del transductor electromagnético y para adaptar el pulso de accionamiento o un impulso de accionamiento subsecuente. Versiones modificadas adaptadas para la aplicación de las proteínas se describen por ejemplo en el documento WO 2007060634. Los anticuerpos que son utilizados son1 típicamente anticuerpos monoclonales o policlonales producidos contra un epitopo de la invención. Como una alternativa, es igualmente posible utilizar fragmentos naturales o sintéticos de los anticuerpos que conservan sus propiedades de enlace al antígeno, tales como los fragmentos Fab; Fab2 y fragmentos scFv.

; Como se mencionó anteriormente, cuando son utilizados antígenos proteicos, es suficiente que el antígeno proteico comprenda el epitopo del analito para el anticuerpo marcado. En consecuencia, el anticuerpo proteico puede ser un fragmento del analito que comprende el epitopo para el anticuerpo marcado o puede ser una proteína quimérica que comprende el epitopo del analito para el anticuerpo marcado.

: La solución de anticuerpo comprende además un azúcar. Los azúcares adecuados que tienen un efecto estabilizador sobre las proteínas incluyen sacarosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, maltosa, lactosa, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melecitosa y dextrano.

Las concentraciones típicas del azúcar están en el intervalo de 0.05% a 5% (p/v) . Las modalidades particulares de la presente invención se refieren al uso de la sacarosa entre aproximadamente 0.1 y 1.0% (p/v) .

, Durante el secado y la reducción en volumen el anticuerpo se llega a concentrar cerca de la superficie y tiene la oportunidad de enlazarse a la superficie. Con la adición de un azúcar estabilizador, la solución que comprende el anticuerpo se vuelve un material sólido acoplado a la superficie en donde la proteína es preservada en su estado activo nativo. Como consecuencia no existe necesidad adicional para aplicar capas adicionales del material estabilizador como un recubrimiento protector sobre la parte superior de los puntos de anticuerpos secos. Con la presencia de un azúcar, a la solución le toma más tiempo secarse en comparación a una solución sin azúcar. Durante el período de tiempo para secar los anticuerpos, se tiene suficiente tiempo para interactuar con la superficie de la cámara de reacción.

Los métodos de la presente invención tienen además la ventaja de que no tienen que ser realizados pasos de bloqueo adicionales. La cantidad del anticuerpo y la proteína opcional que es utilizada, es suficiente para ocupar todo el sitio de enlace a la proteína sobre la superficie donde la gotita es aplicada.

Una capa delgada de solución hidrofílica puede ser, no obstante, aplicada después de esto sobre la superficie del car,tucho que posee puntos, con el fin de facilitar la entrada y la dispersión de la muestra en la cámara de reacción. Tal recubrimiento final puede mejorar la situación, especialmente si , el soporte de cartucho es elaborado de un material hidirofóbico (por ejemplo, un material de plástico) . El volumen de esta solución hidrofílica es más bajo o en el intervalo de o ligeramente más alto que el volumen interno del' cartucho (típicamente menor de 1 µ? para una cámara de aproximadamente 240 ni) y previene la necesidad de un paso de lavado y de bloqueo extra de las partículas enlazadas (por supuesto un paso de lavado/bloqueo es usualmente realizado mediante el enjuague con un volumen mucho más grande que el volumen de la cámara, para enjuagar así el exceso de los anticuerpos - por e emplo, un volumen mayor de 1 mi para una cámara de aproximadamente 240 ni) . Esta solución hidrófila puede comprender algún azúcar por ejemplo sacarosa, sal (por ejemplo, cloruro de potasio) y/o proteína (por ejemplo albúmina sérica bovina) .

Las muestras que son típicamente utilizadas en estos tipos de detecciones (por ejemplo, sangre, suero, orina, saliva y otros fluidos corporales) son en general mezclas complejas de proteínas las cuales después de la entrada a una cámara de reacción ocuparán cualquier sitio remanente de enlace a la proteína. La cantidad del analito que puede eventualmente participar en tal enlace a la proteína específica es despreciable y no tiene ningún efecto sustancial sobre la precisión y la sensibilidad de un ensayo.

Los métodos de acuerdo con la presente invención son1 muy adecuados para la producción de cámaras de reacción con, puntos individuales separados de anticuerpo primario. i Esto permite llevar a cabo ensayos de multiplexión en donde son: determinados 2, 4, 6, o incluso más antígenos.

La solución de anticuerpo comprende opcionalmente además una sal que tiene un efecto estabilizador sobre las proteínas, tales como cloruro de potasio, cloruro de sodio y cloruro de magnesio.

; Las modalidades particulares de la presente invención se refieren al uso de cloruro de potasio entre aproximadamente 0.01 y 2% (p/v) , aun más preferentemente entre 0.05-0.5%.

La solución de anticuerpo comprende opcionalmente además una proteína que tiene un efecto estabilizador sobre las proteínas (proteína portadora) , tal como albúmina sérica bovina. Otras proteínas portadoras conocidas en la técnica incluyen ovoalbúmina, hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura, proteínas de choque térmico (HSP) , tiroglobulina , moléculas de inmunoglobulina , toxoide tetánico, derivado de proteína purificada (PPD) , aprotinina, lisozima de clara de huevo de gallina (HE L por sus siglas en Inglés) , anhidrasa carbónica, gelatina, transíerrina , fosforilasa B, beta-galactosidasa y miosina.

Las modalidades particulares de la presente invención se refieren al uso de BSA entre aproximadamente 5 y 15 g/ml, más particularmente de 10 µg/ml.

Alternativamente, la concentración de la proteína portadora es expresada en comparación a la concentración del anticuerpo primario. Las modalidades particulares de la presente invención se refieren a una proporción de proteína portadora/anticuerpo primario entre ½, ¼, 1/6 hasta 1/10.

, La solución de anticuerpo no marcado que es aplicada sobre la superficie de la cámara de reacción se deja secar al colocarla en una estufa a temperaturas entre 5 y 50° C, ' típicamente a temperatura ambiente (20 a 15°C) o aproximadamente a 37 °C. Durante el proceso de secado, el anticuerpo se llega a concentrar, entra en contacto con la superficie de la cámara de reacción y se enlaza con ésta. La presencia de azúcar y sal en la solución tiene la ventaja de que el secado del líquido toma un tiempo suficientemente largo para permitir el enlace del anticuerpo a la superficie. Dependiendo de la capacidad de enlace de la superficie, la concentración del anticuerpo puede ser ajustada tal que por una parte la superficie se enlaza a una cantidad suficiente del anticuerpo para permitir la detección de un analito, o por otra parte ningún anticuerpo enlazado permanece el cual podría depurar al analito que podría permanecer no detectado.

Los inventores notaron, además, que puede ser omitido un paso de bloqueo para el recubrimiento del resto de la superficie de la cámara de reacción. En comparación a los ensayos de flujo lateral y los ensayos de ELISA, la superficie de la cámara de reacción que permite el enlace específico de la proteína puede ser despreciada en comparación a la cantidad de proteína que está presente en una muestra típica tal como un fluido corporal. Después de la entrada de una muestra en la cámara de xeacción, la muestra y las proteínas en ésta actuarán como un amortiguador de bloqueo. La cantidad eventual de analito y de anticuerpo marcado que se enlaza a la superficie de la cámara de ; reacción, no tiene influencia sustancial sobre el desempeño y la sensibilidad del ensayo.

Mediante la adición de estabilizadores como azúcares y/o proteínas al amortiguador de impresión, el punto impreso se seca lentamente, con lo cual se forma un punto en forma de lente cuando toda el agua se evapora. Enseguida de la formación del punto en forma de lente la concentración que se incrementa lentamente de los componentes también estabiliza los anticuerpos enlazados y de este modo hace obsoleto el uso del amortiguador de estabilización. Mediante la optimización (disminución) de ila concentración del anticuerpo en combinación con las sales y proteínas de adición, el número de anticuerpos no enlazados es limitado y se asegura una buena sensibilidad.

Los métodos de la presente invención proporcionan un control de calidad mejorado sobre la fabricación, debido a que, el tamaño/forma/posición del punto permanece visible. En seguida de eso el punto puede ser utilizado como una verificación de sensor de líquido. Cuando la muestra entra a la ¡cámara el punto se disuelve y de este modo desaparece. Cuando el o (todos) los puntos han desaparecido, se asegura que| la cámara se haya llenado completamente.

Los métodos como se describen en la presente invención hacen posible fabricar un cartucho de reacción mediante el cual un anticuerpo primario no marcado es aplicado como una gotita en una solución que contiene azúcar, y se seca. No se requiere ningún lavado, bloqueo o provisión de capas de estabilización adicionales.

No obstante, una capa delgada de solución hidrofílica puede ser aplicada después de esto sobre la superficie del cartucho que posee los puntos, con el fin de facilitar la entrada y la dispersión de la muestra en la cámara. Tal recubrimiento final puede mejorar la situación, especialmente si el soporte de cartucho es elaborado de un material hidrofóbico (por ejemplo, un material de plástico) . El volumen de esta solución hidrofílica es más bajo o está en el ¡intervalo de o ligeramente mayor que el volumen interno del: cartucho (típicamente menor de 1 µ? para una cámara de aproximadamente 240 ni) y previene la necesidad de un paso de lavado y bloqueo extra de las partículas enlazadas (por supuesto un paso de lavado/bloqueo es usualmente realizado mediante el enjuague con un volumen mucho mayor que el volümen de la cámara, para lavar así el exceso de anticuerpos - por ejemplo, un volumen mayor de 1 mi de una cámara de aproximadamente 240 ni) . Esta solución hidrofílica puede comprender algún azúcar (por ejemplo) de sacarosa, sal (por ejemplo, cloruro de potasio) y/o proteína (por ejemplo albúmina sérica bovina) .

, ' Después del secado de la gotita (y, opcionalmente, habiendo aplicado el recubrimiento hidrofílico) el elemento que : comprende el anticuerpo primario seco puede ser ensámblado en un cartucho o dispositivo y está listo para ser utilizado. El azúcar que está presente en el punto de anticuerpo primario seco asegura una larga vida útil de anaquel prolongada del anticuerpo. Después del uso, la cámara de reacción es llenada con una muestra que contiene proteína, que> comprende el analito. El anticuerpo secundario puede ser agregado a la muestra antes de la introducción de la muestra dentro de la cámara de reacción, o es introducido dentro de la ¡cámara de reacción después de la entrada de la muestra, para evitar el enlace específico del anticuerpo secundario a la cámara de reacción.

Otros arreglos de los sistemas y métodos que ejemplifican la invención serán obvios para aquellos expertos en la técnica.

Se debe entender que aunque han sido discutidas en la presente las modalidades preferidas, las construcciones específicas y construcciones específicas, así como los materiales, para dispositivos para la presente invención, pueden ser realizados diversos cambios o modificaciones en forma y detalle sin apartarse del alcance y espíritu de esta invención .

Ej em lo 1.

I Una placa de poliestireno tiene una capacidad de enlace promedio típica de aproximadamente 5 ng/mm2 (Datos de Nunc) . La colocación de puntos de 2 nanolitros da como resultado típicamente un punto con un diámetro de aproximadamente 0.160 mm. La superficie de este punto es entpnces de 3.14 x 0.082= 0.02 mm2. Esto podría significar que se utilice 5 x 0.02 = 0.1 ng por punto. Con un volumen de 2 ni esto podría significar que la concentración en la e?? ???? de impresión podría ser de 0.1/2 = 0.05 mg/ml. La solución de impresión de la presente invención comprende 40 µg/ml de anticuerpo y 10 mg/ml de BSA en una solución de 0.5% de sacarosa, 0.025 M de cloruro de potasio y 0.025 M de un amortiguador de Bis-Tris-propano (BTP) en combinación con un conservante (0.09% de NaN3) . La solución es secada por >90% dentro de un minuto a temperatura ambiente. El secado adicional fue realizado toda la noche a 37°C en una estufa sin! control de humedad y flujo de aire interno. Después del secado, el punto secado tiene una forma homogénea similar a un lente.

Ejemplo 2.

En esta modalidad, son impresos cuatro puntos sobre una] arte base. La solución de impresión tiene un volumen de i aproximadamente 2 ni /punto dando como resultado un diámetro de punto de 240 ym. Los puntos son impresos en una cavidad que; funciona como una cámara de reacción. La solución de impresión contiene 40 g de anticuerpo anti-PTH, 10 g/ml de BSAi en una solución de 0.5% de sacarosa, cloruro de potasio 0.025 M, 0.09% NaN3 en un amortiguador de BTP 0.025 M, de pH 6.8: La solución es secada por >90% dentro de un minuto a temperatura ambiente. El secado adicional es realizado toda I la noche a 37°C en una estufa con flujo interno sin control de humedad. Después del secado, un laminado es colocado sobre la parte superior de la parte base. Sobre el laminado, las' esferas son dosificadas y secadas (200 ni) de una manera tal! que las esferas secas son colocadas en la cámara de reacción de la parte de base. Las esferas son recubiertas con^ un anticuerpo anti-PTH. La combinación de la parte base y el laminado es parte del cartucho sobre el cual una muestra de sangre (25 µ?) puede ser colocada con pipeta, el plasma es generado y transportado hacia una cámara de reacción. Después del accionamiento magnético de las esferas de PTH, adicionadas en la muestra de sangre, se enlaza con las perlas, así como con el anticuerpo colocado en el punto. Después de un paso de lavado magnético, las esferas no enlazadas son eliminadas y las esferas enlazadas son medidas utilizando FTIR.

] Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para, llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

, REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método de aplicación de un punto con un diámetro de entre 100 a 500 ym de una biomolécula no marcada a una superficie de una cámara de reacción de un ensayo de diagnóstico a partir de una muestra, caracterizado porque comprende los pasos de : aplicar a la superficie de la cámara de reacción una solución que comprende un azúcar y que comprende una biomolécula no marcada, y - permitir que la solución se seque, en donde la biomolécula está en una concentración justo suficiente para saturar los sitios de enlace para una proteína sobre la superficie donde ha sido aplicada la solución, tal que la cámara de reacción con la biomolécula seca no sufre pasos de lavado previos a la aplicación de una muestra determinada en la cámara de reacción, para eliminar un exceso de biomoléculas no enlazadas.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomolécula está en una concentración tal que es aplicado un exceso de una vez, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces o 5 veces de la biomolécula en comparación a la capacidad de enlace teórica del sustrato.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende un paso de aplicar una; muestra a la cámara de reacción.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además la solución comprende una sal ylo un amortiguador .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el volumen de la solución aplicada está entre 1 y 10 nanolitros.

, 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución aplicada comprende entre 0.01 y 0.5 µ de biomolécula por mi de solución.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de la biomolécula en la solución es determinada al dividir la capacidad de enlace de la superficie multiplicada con el tamaño de la superficie del punto por punto entre el volumen de solución utilizado por punto.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además la solución aplicada comprende una ! proteína .

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una pluralidad de diferentes biomoléculas no marcadas son aplicadas como gotitas individuales separadas en diferentes posiciones a la superficie de la cámara de reacción.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomolécula comprende uno de los siguientes: anticuerpo, antígeno, proteína, péptido, molécula pequeña, moléculas de ácido nucleico y/o combinaciones y/o fragmentos de los mismos.

11. Una cámara de reacción de un dispositivo de diagnóstico para realizar un ensayo de detección basado en I biomolécula, en donde la cámara de reacción comprende una región de detección con uno o más puntos de una biomolécula no marcada enlazada a la región de detección, en donde uno o más i puntos tienen un diámetro de entre 0.1 y 0.5 mm, y en donde el punto comprende una solución seca de la biomolécula no ¡marcada y un azúcar, caracterizado porque un punto comprende entre 0.01 y 0.5 ng de biomolécula.

12. La cámara de reacción de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque además el punto comprende una sal .

13. La cámara de reacción de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque además el punto comprende una proteína. '

14. La cámara de reacción de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la biomolécula comprende uno de los siguientes: anticuerpo, antígeno, proteína, péptido, molécula pequeña, moléculas de ácido nucleico y/o combinaciones y/o fragmentos de los mismos. \

15. La cámara de reacción de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la concentración de la biomolécula en la solución utilizada para imprimir el punto ha sido determinada al dividir una capacidad de enlace de la superficie multiplica con · el tamaño de la superficie por punto entre el volumen de la solución impresa por punto.