MX2013014174A

MX2013014174A - El anticuerpo neutralizador del receptor de prolactina mat3 y su uso terapeutico.

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Publication number: MX2013014174A
Application number: MX2013014174A
Authority: MX
Inventors: Christoph Freiberg; Christiane Otto; Lars Linden; Axel Harrenga; Mark Trautwein; Simone Greven; Andreas Wilmen
Original assignee: Bayer Ip Gmbh
Priority date: 2011-06-03
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2014-11-13
Also published as: CR20130632A; WO2012163932A1; ECSP13013063A; PL2714740T3; BR112013030995A2; TW201302798A; IL229504B; HK1195081A1; US9777063B2; JP5859641B2; BR112013030995B1; DOP2013000285A; AR086631A1; EP2530089A1; MX343683B; EA029316B1; TN2013000501A1; US9353186B2; ZA201309683B; CN103764679A

Abstract

El anticuerpo neutralizador del receptor de prolactina Mat3. Fragmentos de unión al antígeno de éste. Composiciones farmacéuticas que contienen dicho anticuerpo o dichos fragmentos de unión al antígeno. Su uso en el tratamiento o la prevención de las afecciones y los trastornos benignos que son mediados por el receptor de prolactina, tales como la endometriosis, la adenomiosis, las enfermedades benignas de las mamas, la mastalgia, la hiperplasia prostática benigna, los fibroides o la pérdida de cabello hiperprolactinémica o normoprolactinémica, en la inhibición de la lactancia, en la anticoncepción femenina no hormonal, en una terapia hormonal combinada, en la inhibición de la proli-feración de las células de las mamas o en el tratamiento o la prevención del cáncer de mama resistente a los agentes antiestrogénicos. El anticuerpo de acuerdo con la invención bloquea la señalización que es mediada por el receptor de prolactina.

Description

EL ANTICUERPO NEUTRALIZADOR DEL RECEPTOR DE PROLACTINA MAT3 Y SU USO TERAPÉUTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el anticuerpo contra el receptor de prolactina Mat3. En ella, se proveen regiones de unión al antígeno del anticuerpo Mat3 y fragmentos funcionales recombinantes que contienen regiones de unión al antígeno como las mencionadas, que pueden unirse específicamente al receptor de prolactina y neutralizarlo. En la presente también se proveen secuencias de ácidos uncleicos que codifican anticuerpos como los que se describieron con anterioridad, vectores que los comprenden, composiciones farmacéuticas que los contienen y su uso en el tratamiento o la prevención de la endometriosis o de otras enfermedades que podrían beneficiarse a través de la inhibición de la señalización que es mediada por el receptor de prolactina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La prolactina (PRL) es una hormona polipeptídica que está compuesta por 199 aminoácidos. La PRL pertenece a la familia de los polipéptidos que actúan como hormonas del crecimiento (GH) o como lactógenos placentarios (PL). Es sintetizada en las células lactotróficas de la pituitaria y en diversos tejidos extrapituitarios, tales como los linfocitos, las células del epitelio mamario, el miometrio y la próstata. Dos promotores diferentes regulan la síntesis de PRL en la pituitaria y fuera de ella (BioEssays 28:1051-1055, 2006).

La PRL puede unirse al receptor de la PRL (PRLR), que es un receptor transmembrana individual que pertenece a la superfamilia de los receptores de citoquinas de la clase 1 (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998). El PRLR puede existir como tres ¡soformas diferentes, la isoforma corta, la isoforma larga y la isoforma intermedia, que pueden distinguirse sobre la base de la longitud de sus colas citoplasmáticas. Cuando tiene lugar la unión al ligando, se desencadena un proceso que da como resultado la activación del PRLR. La PRL interactúa con una molécula del PRLR a través del sitio de unión 1 , después de lo cual se une a una segunda molécula receptora a través del sitio de unión 2, con lo que se obtiene un dímero activo de PRLR. La dimerización del PRLR da como resultado una activación notable de la vía JAK/STAT (es decir, la vía de las quinasas, los transductores de señales y los activadores de la transcripción Janus). Una vez que el receptor se dimeriza, las JAK (predominantemente JAK2) que están asociadas al receptor, se transfosforilan y se activan mutuamente. A su vez, el PRLR también se fosforila y puede unirse a las proteínas que contienen el dominio SH2, como es el caso de los STAT. Posteriormente, los STAT que están unidos a los receptores se fosforilan, lo que da como resultado su separación de dichos receptores y su translocación hacia el núcleo, en el cual estimulan la transcripción de diversos genes blanco. También se ha informado que los PRLR inducen la activación de la vía Ras-Raf-MAPK y la activación de la quinasa citoplasmática src (para hallar una revisión, véase Endocrine Reviews 19: 225-268, 1998).

La señalización que es mediada por el PRLR ocurre en diversos procesos, tales como el desarrollo de las glándulas mamarias, la lactancia, la reproducción, el desarrollo de los tumores en las mamas y en la próstata, las enfermedades autoinmunes, el crecimiento y el metabolismo en general y la modulación inmune (Endocrine Reviews 19: 225-268, 1998; Annu. Rev. Physiol. 64: 47-67, 2002).

En la actualidad, no hay medicaciones disponibles con las que pueda producirse una interferencia completa en la señalización que es mediada por el PRLR, aparte de la inhibición de la secreción de la PRL en la pituitaria, para lo cual puede emplearse bromocriptina y otros agonistas del receptor de dopamina del tipo 2 (Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism 2(10): 571-581 , 2006). Sin embargo, estos agentes no suprimen la síntesis de la PRL fuera de la pituitaria, que en efecto puede servir para compensar la inhibición de la síntesis de la PRL en la pituitaria y puede anular prácticamente cualquier interrupción en la señalización que es mediada por el PRLR (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998). Por lo tanto, no resulta sorprendente que los agonistas del receptor de dopamina del tipo 2 no hayan producido beneficios en aquellos pacientes que padecían cánceres de mama o enfermedades autoinmunes en las cuales se ha indicado que participa la prolactina, tales como el lupus sistémico o la artritis reumática (Breast Cáncer Res. Treat. 14:289-29, 1989; Lupus 7:414-419, 1998). La síntesis de prolactina a nivel local, es decir, en las células de las mamas o en los linfocitos, cumple una función fundamental en los carcinomas en las mamas o en las enfermedades autoinmunes, respectivamente, y no puede ser bloqueada por medio de agonistas de los receptores de dopamina.

En WO2003/004989 (de Millenium Pharmaceuticals) se describieron por primera vez anticuerpos que podían unirse al PRLR para diagnosticar el cáncer de mama, así como numerosos genes y proteínas que podían inducir la sobreéxpresión del PRLR en diversos tejidos tumorales en las mamas. Más aun, se indicó que estos anticuerpos podrían servir como marcadores apropiados para detectar los desarrollos malignos.

En WO03/008583 se describen genes y proteínas, que incluyen el PRLR, que están asociados a diversos carcinomas, particularmente a diversos linfomas y a diversas leucemias.

Además, en WO2006/110585 (de Novartis) se indica que la sobreéxpresión del PRLR puede utilizarse como indicador del cáncer, y que los anticuerpos específicos contra el PRLR pueden ser útiles en el contexto del diagnóstico y el tratamiento del cáncer de mama y de otros cánceres (tales como el cáncer de pulmón, el cáncer de próstata y el cáncer de piel). Se reivindican anticuerpos monoclonales que presentan una actividad antagónica, ya que pueden bloquear la expresión del PRLR en las células de cáncer de mama MCF7 y pueden inducir la fosforilación de STAT5 y de la MAPK en diversas líneas de células de cáncer de mama, tales como T47D. Sin embargo, no se proveen evidencias de que estos anticuerpos monoclonales puedan inhibir la proliferación de las células cancerosas en las mamas ni se describen anticuerpos concretos.

La primera evidencia in vivo del concepto de que los antagonistas del PRLR pueden interferir con éxito en el desarrollo del cáncer de mama fue publicada en 1988. En un modelo de tumores de mama DMBA en ratones, con un anticuerpo monoclonal contra el PRLR fue posible reducir la incidencia de tumores en las mamas (Am. J. Pathol. 133:589-595,1988).

En 2007/0269438 (de Biogen) se describieron por primera vez anticuerpos contra el PRLR que podrían usarse para prevenir o tratar el cáncer de mama. Se indicó que los productos de la expresión en cinco líneas de hibridomas (que eran anticuerpos) podían unirse con gran afinidad a las líneas de células cancerosas de las mamas T47D y MCF7, y que de esta manera podían bloquear la señalización que es mediada por la PRL (es decir, la fosforilación de STAT5, de la MAPK y de la AKT). Sin embargo, no se proveen evidencias in vivo de este concepto. Tampoco se proveen evidencias más detalladas, particularmente en el contexto de los cánceres que se tornan independientes de los agentes antiestrogénicos.

En WO 2008/022295 (de Novartis) se describe un segundo conjunto de anticuerpos monoclonales específicos contra el PRLR, así como sus secuencias primarias. Aunque se indica que estos anticuerpos pueden ser usados como agentes terapéuticos para tratar el cáncer de mama, el cáncer de pulmón y el cáncer de próstata, tan solo se emplea un modelo basado en un linfoma para comprobar el efecto antiproliferativo de estos agentes in vivo.

Por otro lado, los antagonistas peptidérgicos del PRLR que derivan de la prolactina y que presentan una supresión en el extremo N y una mutación puntual (p.ej., la prolactina delta1-9G129R) también se comportan como antagonistas del PRLR. Sin embargo, estos antagonistas presentan una vida media breve (de 15-20 minutos) y una potencia baja en comparación con la prolactina (Pituitary 6:89-95,2003). Sobre la base de esto, puede concluirse que los anticuerpos neutralizadores del PRLR son superiores, especialmente en el contexto de la inhibición de la señalización autocrina incrementada de la prolactina, que cumple una función importante en el cáncer de mama y en el cáncer de próstata.

También se analizó la participación de la señalización mediada por el PRLR en el contexto de la endometriosis benigna. En un estudio en el que se analizó el patrón de expresión del PRLR en muestras de endometrio y de endometrio eutópico obtenidas de pacientes que padecían endometriosis (Acta Obstet. Gynecol. Scand. 81 :5-10, 2002) durante la fase proliferativa media/tardía del ciclo menstrual, se comprobó que el ARNm del PRLR estaba presente en el endometrio eutópico de 79% de los pacientes, y también se demostró que dicho ARNm estaba ausente en las lesiones en el endometrio de 86% de los pacientes. Sobre la base de estos datos, puede concluirse que es posible que en el tejido afectado por la endometriosis haya una regulación de la expresión del PRLR diferente de la que se observa en el tejido normal. Sin embargo, sobre la base de los datos relacionados con la expresión, no puede concluirse que la inhibición del PRLR represente una terapia apropiada para la endometriosis, especialmente debido a que no fue posible detectar la expresión del PRLR en las lesiones provocadas por la endometriosis (Acta Obstet. Gynecol. Scand. 81 :5-10, 2002).

En conclusión, aunque se ha demostrado qué la señalización que es mediada por el PRLR cumple una función determinante en diversos procesos en las células, hay pocos resultados, más bien contradictorios, con relación al valor terapéutico del antagonismo del PRLR en el contexto del tratamiento de la mayor parte de las enfermedades benignas, incluyendo la endometriosis.

En diversos trabajos, se ha sugerido la posibilidad de que el PRLR cumpla una función importante en el desarrollo del cáncer de mama, por lo que, en principio, los antagonistas potentes del PRLR podrían ser agentes apropiados para demostrar el valor terapéutico de la inhibición del PRLR en el contexto del tratamiento del cáncer de mama. Aun así, no se han descripto demostraciones in vivo de que el bloqueo del PRLR efectivamente dé como resultado la inhibición del crecimiento de los tumores (excepto en el contexto del tratamiento de los linfomas y de la inhibición del desarrollo del cáncer de mama) ni de la posibilidad de usar los anticuerpos que antagonizan el PRLR en el tratamiento de las enfermedades benignas que podrían beneficiarse a través del bloqueo de dicha señalización que es mediada por el PRLR. Por lo tanto, los anticuerpos disponibles en la actualidad no pueden usarse en modelos predictivos en los cuales puedan basarse los estudios conceptuales, i En este contexto, existe la necesidad de anticuerpos que puedan unirse con una afinidad elevada al PRLR humano, de mono o de ratón, sin que compitan con la PRL, de manera tal que puedan neutralizar la señalización mediada por el PRLR en estos tres grupos de especies. De disponerse de estos anticuerpos, sería posible llevar a cabo estudios conceptuales en ratones y en monos, mediante el uso de dosis razonables.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, el objetivo de la presente invención era proveer nuevos anticuerpos contra el PRLR que pudieran usarse en modelos predictivos en los cuales pudieran basarse los estudios conceptuales. En este contexto, los anticuerpos también tendrían que poder usarse para tratar aquellas enfermedades benignas que pudieran beneficiarse a través del bloqueo de dicha señalización que es mediada por el PRLR.

Este objetivo se cumple con el nuevo anticuerpo Mat3.

Recientemente, a través de diversos análisis basados en la unión en células y sobre la base de diversos estudios bioquímicos, ha sido posible comprobar que este anticuerpo presenta una especificidad y una afinidad sorprendentes por el PRLR humano y que no compite con la PRL, por lo que sirve para neutralizar la señalización mediada por el PRLR en los tres grupos de especies, en contraste con los anticuerpos que se describen en WO 2008/022295, tales como HE06642, que tampoco compiten con la PRL. De esta manera, este anticuerpo puede ser de utilidad para poner en práctica estudios conceptuales preclínicos en ratones o en monos, mediante el uso de dosis razonables. Más aun, se ha demostrado que con este anticuerpo puede obtenerse un beneficio terapéutico en los sujetos, ya que se trata de un anticuerpo más potente, que se encuentra relacionado más estrechamente con las secuencias de la línea germinal humana, por lo que presenta un mejor perfil de efectos colaterales y un menor riesgo de desencadenar una reacción inmune, particularmente en comparación con los anticuerpos que se describen en WO 2008/022295, tales como HE06642, que tampoco compiten con la PRL.

El anticuerpo novedoso Mat3 reacciona con los PRLR de diversas especies, tales como Macaca mulatta (el macaco), Macaca fascicularis (el mono cangrejero), Mus musculus (el ratón) y Homo sapiens (el ser humano). Esto denota que la afinidad (el valor de la KD) y el valor de la EC50 de dicho anticuerpo sobre el PRLR humano, de mono y de ratón es menor que 10 x 10"9 M (véanse la tabla 1 y los ejemplos 9, 10, 13 y 14), y que el valor de la IC50 en el contexto de la inhibición de la proliferación es inferior a 20 x 10"9 M (véanse los ejemplos 1 a 3). La presente invención se basa en el descubrimiento de que el anticuerpo novedoso Mat3 puede servir para obtener un beneficio terapéutico en los sujetos (la secuencia del anticuerpo novedoso se describe en SEQ ID N° 1-10). El anticuerpo de la invención, que más preferiblemente es un anticuerpo humano completo, cuya secuencia es muy cercana a la de la línea germinal humana, pero que también puede ser un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o una variante modificada merced a la intervención humana que comprende las CDR de la versión humana completa, puede usarse en diversos contextos, los cuales se describirán con mayor detalle más adelante.

Para demostrar la superioridad que presenta dicho anticuerpo en el contexto de la potencia y la reactividad en el ser humano, en el mono y en el ratón, en comparación con el anticuerpo humano bien caracterizado que se describe en WO 2008/022295, HE06642, se llevaron a cabo estudios basados en la proliferación (ejemplos 1-3). Los anticuerpos de los antecedentes técnicos que se describen en la presente, HE06642, HE06.642 y 06.642, contienen dominios variables que tienen las secuencias de SEQ ID N° 14 y 15, que son idénticas a la secuencia de he06.642-2, que se describe en WO 2008/022295.

El anticuerpo Mat3 fue caracterizado en diversos sistemas celulares para determinar su especificidad y su potencia en numerosas especies, así como su eficacia en distintos paradigmas de análisis, en el contexto de la inactivación de la señalización y la proliferación que son mediadas por el PRLR. Los análisis de la proliferación se llevaron a cabo en líneas de células Ba/F que habían sido transfectadas de manera estable con un PRLR humano (véase el ejemplo 1 ), con un PRLR murino (véase el ejemplo 2) o con un PRLR de macaco (véase el ejemplo 3). El anticuerpo Mat3 inhibió por completo la proliferación de las células en las que se expresaba el PRLR humano, murino o de macaco (ejemplos 1-3). El anticuerpo HE06642 (WO 2008/022295) no presentó actividad sobre las células en las que se expresaba el PRLR murino. En comparación con el anticuerpo Mat3, el anticuerpo HE06642 presentó una actividad muy reducida sobre las células en las que se expresaba el PRLR de macaco. El anticuerpo Mat3 también presentó una potencia superior sobre el PRLR humano que el anticuerpo humano HE06.642. También hay evidencias de que Mat3 inhibe la proliferación de las células de linfoma de rata NB2 con una potencia mayor que HE06422. Además de los análisis basados en la proliferación celular, se pusieron en práctica ensayos en los que se usó una enzima luciferasa como indicador y una línea de células HEK293 que habían sido transfectadas de manera estable con un PRLR humano o murino (véase el ejemplo 12) y que habían sido transfectadas de manera transitoria con un gen indicador que codificaba la luciferasa, bajo el control de los LHRE (los elementos que participan en la respuesta a las hormonas lactogénicas). Mediante el uso de estos sistemas, fue posible confirmar que hay un elemento promotor que depende de la señalización que es mediada por el PRLR que se desactiva en presencia del anticuerpo Mat3. Dé esta manera, se comprobó una vez más la incapacidad del anticuerpo HE06.642 de bloquear de manera eficiente la señalización mediada por el PRLR en ratones.

Sobre la base de lo anterior, puede concluirse que el anticuerpo Mat3 es apropiado para analizar la inhibición de la señalización que es mediada por el PRLR en modelos basados en ratones o en monos.

El anticuerpo de acuerdo con la presente invención contiene dominios variables que son más similares a los que están codificados por los genes de la línea germinal humana, en comparación con el anticuerpo HE06642. En la figura 6 se ilustra que los dominios VH y VL del anticuerpo de acuerdo con la presente invención son 90% idénticos a los que codifican los genes de las cadenas respectivas de la línea germinal humana (véase Retter, I., Althaus, H. H., Munich, R., Müller, W.: VBASE2, an integrative V gene datábase. Nucleic Acids Res. 1o de Enero de 2005; 33:D671-4). HE06642 presenta una identidad de 89% con las secuencias de la línea germinal del dominio VH, pero su identidad con VBASE2 es de apenas 80%. Sobre la base de este descubrimiento, puede concluirse que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, Mat3, es más apropiado para aplicarlo en el tratamiento de los pacientes, ya que resulta menos inmunogénico.

A través de los estudios basados en la unión de Mat3 y de HE06642 a los dominios extracelulares de los PRLR humano, de mono y de ratón, se demostró que los dos anticuerpos pueden interactuar con estos dominios en formas purificadas (véanse el ejemplo 10 y la tabla 1 más adelante). Sin embargo, cuando estos dominios fueron expuestos en la superficie de las células, se determinó que había diferencias más pronunciadas entre el anticuerpo Mat3 y el anticuerpo HE06642. Vale destacar que HE06642 no se unió al PRLR murino expresado en las células Ba/F, en contraste con el anticuerpo Mat3 (véanse la tabla 2, la figura 5 y el ejemplo 9). Este descubrimiento es consistente con la observación de que el anticuerpo Mat3 bloquea la señalización y la proliferación que son mediadas por el PRLR en los ratones, en contraste con el anticuerpo HE06642. Mediante un análisis que se llevó a cabo con el dominio extracelular del PRLR humano en una forma purificada o expresado en la superficie de las células, fue posible demostrar que el, anticuerpo Mat3 puede unirse al subdominio S2 (véase el ejemplo 11 ), al igual que el anticuerpo HE06642 (véase la descripción precedente en WO 2008/022295). Con este análisis, también se demostró que había diferencias en la unión a los dominios S2 entre los anticuerpos Mat3 y HE06642 (figura 8). Recientemente se informó que las diferencias en la unión que habían presentado estos anticuerpos podían usarse como un fundamento para explicar las diferencias que había entre sus propiedades (Niederfellner et al., Blood., 28 de Marzo de 2011 : 10.1182/blood-2010-09-305847). A partir de estos análisis, fue posible elucidar las causas de las diferencias que hay en la especificidad y en la potencia entre el anticuerpo Mat3 y el anticuerpo HE06642.

Se provee el anticuerpo monoclonal humano Mat3, de acuerdo con la tabla 5 (SEQ ID N° 1-10), o un fragmento de unión al antígeno de éste, que antagoniza la señalización que es mediada por el receptor de prolactina. El anticuerpo puede unirse específicamente al dominio extracelular (ECD) del PRLR (SEQ ID N° 12) o a las variantes polimórficas humanas de SEQ ID N° 12, tales como las variantes I146L e I76V, que se describen en PNAS 105 (38), 14533, 2008, y en J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (1 ), 271 , 2010. Más aun, el anticuerpo puede unirse específicamente al dominio extracelular (ECD) del PRLR de macaco y de mono cangrejero (SEQ ID N° 11 ) y al PRLR murino (SEQ ID N° 13).

En una forma de realización, se describe el anticuerpo humano Mat3, una vanante humanizada, modificada merced a la intervención humana o quimérica de éste o un fragmento de unión al antígeno de éste, donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 3 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 1 , así como una región variable de la cadena liviana que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 4 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 2, que antagoniza la señalización que es mediada por el receptor de prolactina.

En una forma de realización, se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que comprenden las CDR que se describieron en el párrafo anterior, donde la región variable de la cadena pesada contiene CDR que comprenden secuencias de acuerdo con SEQ ID N° 5, 6 y 7 y la región variable de la cadena liviana contiene CDR que comprenden secuencias de acuerdo con SEQ ID N° 8, 9 y 10.

En otra forma de realización de la presente invención, el anticuerpo Mat3 consiste en una región de unión al antígeno que puede unirse específicamente a una o más regiones del dominio extracelular del PRLR humano, de mono o de ratón, donde las secuencias de aminoácidos del PRLR humano abarcan las posiciones 1 a 210 de SEQ ID N° 12 y las variantes polimórficas humanas de SEQ ID N° 12, las secuencias de aminoácidos del PRLR de mono abarcan las posiciones 1 a 210 de SEQ ID N° 11 y las secuencias de aminoácidos del PRLR de ratón abarcan SEQ ID N° 13.

En otra forma de realización de la presente invención, el anticuerpo Mat3 consiste en una región de unión al antígeno cuya afinidad por el dominio extracelular del PRLR humano, de mono o de ratón es de al menos 100 nM, preferiblemente es menor que aproximadamente 100 nM, más preferiblemente es menor que aproximadamente 30 nM, y aún más preferiblemente es menor que aproximadamente 10 nM.

En otra forma de realización, el anticuerpo Mat3 con-siste en una región de unión al antígeno que puede unirse específicamente a una o más regiones del dominio extracelu-lar del PRLR humano con una afinidad de al menos 10 nM, más preferiblemente con una afinidad menor que aproximadamente 1 nM.

En la presente invención también se provee un anticuerpo Mat3 como el que se describió con anterioridad, donde los dominios constantes de la cadena pesada constituyen una lgG1 , una lgG2, una lgG3 o una lgG4 modificada o no modificada.

En la tabla 1 se provee un resumen de las constantes de disociación (que representan la afinidad) y las velocidades de disociación del anticuerpo Mat3 de acuerdo con la presente invención, que pueden determinarse sobre la base de una resonancia de plasmón superficial (Biacore) con dominios extracelulares monoméricos (que abarcan los aminoácidos 1 a 210) del PRLR humano (SEQ ID N° 12), del PRLR de macaco y de mono cangrejero PRLR (SEQ ID N° 11 , donde la fusión con la región Fc-His ha sido eliminada por medio de una digestión con el factor proteolítico Xa), o del PRLR murino (SEQ ID N° 13), sobre el anticuerpo inmovilizado de manera directa (ejemplo 10).

Tabla 1. Constantes de disociación monovalentes y velocidades de disociación determinadas con dominios extracelulares purificados del PRLR humano, de macaco/mono cangrejero o de ratón expresados en células HEK293, sobre la base de una resonancia de plasmón superficial, con el anticuerpo Mat3 en forma de una molécula de IgG humana (véase el ejemplo 10) En WO 2008/022295, se indica que la afinidad de HE06642 sobre el dominio extracelular del PRLR humano es de 2,6 x 10"9 M, que es de 38,9 x 10"9 M sobre el dominio extracelular del PRLR de mono cangrejero, y que es de 2,7 x 10"9 M sobre el dominio extracelular del PRLR murino.

La afinidad del anticuerpo Mat3 en las células se determinó sobre la base de una clasificación de las células activadas por fluorescencia (FACS), en combinación con un análisis de Scatchard (ejemplo 9).

En la tabla 2 se detalla la fuerza de la unión que presenta el anticuerpo Mat3, en forma de una molécula de lgG2 humana, en una línea de células HEK293 que han sido transfectadas de manera estable con un PRLR humano o de macaco.

Tabla 2. Potencia de la unión del anticuerpo anti-PRLR at3, en forma de una molécula de lgG2 humana, en una línea de células HEK293 que han sido transfectadas de manera estable con un PRLR humano o de macaco, determinada por medio de una FACS (véase el ejemplo 9) Generación de los anticuerpos Para aislar un panel de anticuerpos con capacidad de bloquear de manera funcional el PRLR humano y murino, se investigaron en paralelo dos formatos de la biblioteca de presentación de anticuerpos humanos sintéticos en fagos denominada n-CoDeR®, de Bioinvent (Sóderlind et al. 2000, Nature BioTechnology. 18, 852-856), donde se expresaban fragmentos scFv y Fab, respectivamente. Los blancos usados para la selección de los fragmentos scFv o Fab fueron el ECD soluble del PRLR humano (los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210 de SEQ ID N° 12) y del PRLR de ratón (los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210 de SEQ ID N° 13), que se aplicaron como variantes biotiniladas (con biotina NHS-LC, Pierce) y no biotiniladas, así como la línea de células de cáncer de mama humano T47D, donde se expresaba el PRLR.

Se usó una combinación de diversos abordajes con una tecnología de presentación en fagos (PDT) para aislar anticuerpos monoclonales con especificidad y una gran afinidad por el PRLR. Se trató de una combinación de análisis de proteínas y ensayos en células completas que comprendió el desarrollo de herramientas específicas. Las herramientas y los métodos usados para el análisis incluyen el ECD del PRLR humano y de ratón expresados de manera recombinante en una fusión con un dominio Fe (R&D Systems, catálogo N° 1 167-PR y 1309-PR, respectivamente, posiciones 1-216 de SEQ ID N° 12 y 13, respectivamente, cada uno fusionado al dominio Fe de la lgG1 humana, posiciones 100-330 de la lgG1 humana), el dominio extracelular del PRLR humano expresado de manera recombinante en una fusión con una marca de seis histidinas (SEQ ID N° 12), la línea de células HEK293 y la línea de células de linfoma murino Ba/F, cada una transfectada de manera estable con el PRLR humano y murino, respectivamente, así como la línea de células de cáncer de mama T47D y la línea de células de linfoma de rata Nb2, en cada una de las cuales se expresaba de manera natural el PRLR. También abarcaron el desarrollo de procedimientos y ensayos de búsqueda con los que pudieran identificarse los anticuerpos neutralizadores con capacidad de unirse de manera preferencial al PRLR en la superficie de las células, y que también pudieran reaccionar con los PRLR de ratón.

El análisis comprendió primero identificar los componentes que se unieran al PRLR humano y eventualmente al PRLR de ratón en pruebas de ELISA, mediante el uso de antígenos expresados de manera recombinante.

La combinación de estos métodos específicos permitió el aislamiento - entre otros - del anticuerpo "005-C04".

Por maduración de afinidad de "005-C04" en los dominios extracelulares del PRLR humano y PRLR murino, se identificaron sustituciones beneficiosas de acuerdo al procedimiento descripto en el ejemplo 8. Finalmente, las sustituciones individuales beneficiosas para una afinidad mejorada se evaluaron de acuerdo a su influencia en la termoestabilidad del anticuerpo. Especialmente, el despligue cooperativo del dominio Fab durante la desnaturalización de los anticuerpos maduros (por ejemplo por elevación de la temperatura) debería haber sido asegurado (referencia respecto al despliegue cooperativo: Roethlisberger, D. et al., J. Mol. Biol. 2005: 347, 773-789). El anticuerpo Mat3 surgió del descubrimiento del anticuerpo descripto anteriormente y estrategia de maduración.

Variantes de los péptidos Los anticuerpos de la invención no se limitan a las secuencias peptídicas específicas que se proveen en la presente. Por el contrario, la invención también abarca variantes de estos polipéptidos. Con relación a la presente invención y a la tecnología y las referencias disponibles en la actualidad, aquellos versados en la técnica han de poder preparar, evaluar y utilizar variantes funcionales de los anticuerpos que se describen en la presente, pero también han de apreciar que las variantes que puedan unirse al PRLR y lo bloqueen de manera funcional quedarán dentro del alcance de la presente invención.

Una variante puede incluir, p.ej., un anticuerpo que tiene al menos una región de determinación de la complementariedad (CDR) (hipervariable) y/o un dominio/una posición del marco (FR) (variable) alterados respecto de la secuencia peptídica que se describe en la presente. Para ilustran con mayor detalle este concepto, a continuación se proveerá una descripción breve de la estructura de los anticuerpos.

Un anticuerpo está compuesto por dos cadenas peptídicas, cada una de las cuales contiene un dominio constante de la cadena liviana o tres dominios constantes de la cadena pesada y una región variable (VL, VH). En cada caso, esta última está compuesta por cuatro regiones FR (VH: HFR1 , HFR2, HFR3, HFR4; VL: LFR1 , LFR2, LFR3, LFR4) y tres CDR separadas (VL: LCDR , LCDR2, LCDR3; VH: HCDR1 , HCDR2, HCDR3). El sitio de unión al antígeno está formado por una o más CDR, pero son las regiones FR las que proveen el marco estructural para las CDR, por lo que tienen una función importante en la unión al antígeno. Por medio de la alteración de uno o más residuos de aminoácidos en una región CDR o FR, aquellos versados en la técnica han de poder generar o diversificar de manera convencional las secuencias de los anticuerpos. Estas secuencias pueden analizarse contra el antígeno, p.ej., para establecer si presentan propiedades novedosas o mejoradas.

En la figura 4 se proveen esquemas de la numeración de la posición de cada aminoácido en los dominios variables VL y VH. En las tablas 3 (VH) (VL) se detallan las regiones de las CDR del anticuerpo Mat3 de la invención y se comparan los aminoácidos en una posición dada. También se los compara con una secuencia de consenso correspondiente o con un "gen maestro", en cuyo caso las regiones de las CDR están marcadas con una las tablas 5 y 6 se detallan las asignaciones de los números de los identificadores de secuencias para los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos y las variantes del PRLR que se proveen en esta invención.

Tabla 3. Secuencia VH del anticuerpo Mat3 que incluye anotación de CDR l -HCD l— I I Mat3 VH EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS S. YWMHWRQ APGKGLEWS Consenso EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTXX X>00000<VRQ APGKGLEWVX HCDR2 I I - Mat3 VH DIARL . SSYT NYADSVKGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRA EDTAVYYCAR Consenso XXXXXXXXXX XXXXXXXXXF TISRDNSKNT LYLQMNSLRA EDTAVYYCXX — HCOR3 1 Mat3 H GLDA R RMDYWGQGTL VTVSS Consenso XXXXXXXXXX >C >C<WGQGTL VTVSS Tabla 4. Secuencia VL del anticuerpo Mat3 que incluye anotación de CDR I LGORl 1 at3 L QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTG5SSNIG AGYWHWYQQ LPGTAPKLLI Consenso QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SO XXXXXX XXxXXXWYQQ LPGTAPKLLI | LC0R2 | I LCDR3— Mat3 VL YRNNQRPSGV PORFSGSKSG TSASLAISGL RSEOEADYYC AAWODSLNG. Consenso YXXX XXXGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYX XXXX> 0 0<X -I Mat3 VL WLFGGGTKLT VLGQ Consenso XXFGGGTKLT VLGQ Tabla 5. Secuencias de los anticuerpos Tabla 6. Secuencias de los dominios extracelulares de PRLR de humano, mono y ratón Aquellos versados en la técnica han de poder usar los datos en las tablas 3, 4 y 5 para diseñar variantes de los péptidos que se hallen dentro del alcance de la presente invención. Es preferible que las variantes se construyan cambiando los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR. Una variante también puede presentar una o más regiones del marco (FR) alteradas. Por ejemplo, puede alterarse un péptido en el dominio de la FR para obtener una desviación respecto de la secuencia de la línea germinal.

Además, las variantes pueden obtenerse por maduración, es decir, usando un anticuerpo como punto de partida para la optimización, mediante la diversificación de uno o más residuos de aminoácidos en el anticuerpo, preferiblemente los residuos de aminoácidos en una o más CDR, a lo que sigue el análisis la colección resultante de variantes del anticuerpo, con el objeto de hallar variantes con propiedades mejoradas. En particular, se prefiere la d ¡versificación de uno o más residuos de aminoácidos en la LCDR3 de la VL, en la HCDR3 de la VH, en la LCDR1 de la VL y/o en la HCDR2 de la VH. La diversificación puede efectuarse sintetizando una colección de moléculas de ADN con la tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (TRIM) [Virnekás, B., Ge, L, Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., y Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reacants for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagénesis. Nucí. Acids Res. 22, 5600]. Véase además el ejemplo 8.

Variantes de aminoácidos conservativas Pueden prepararse variantes de los polipéptidos que conservan la estructura molecular general de un anticuerpo con una secuencia peptídica como las que se describen en la presente. Cuando se analizan las propiedades de los aminoácidos individuales, es posible reconocer algunas sustituciones racionales. Las sustituciones de aminoácidos, es decir, las "sustituciones conservativas", pueden realizarse, p.ej., sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos en cuestión.

Por ejemplo, (a) los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptofano y la metionina; (b) los aminoácidos polares neutros incluyen la glicina, la serina, la treonina, la cisteína, la tirosina, la asparagina y la glutamina; (c) los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen la arginina, la Usina y la histidina; y (d) los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen el ácido áspártico y el ácido glutámico. Las sustituciones típicamente pueden efectuarse dentro de los grupos (a)-(d). Además, es posible reemplazar glicina por prolina, o viceversa, sobre la base de su Í i capacidad de interrumpir las hélices a. De manera similar, determinados i aminoácidos, tales como la alanina, la cisteína, la leucina, la metionina, el i ácido glutámico, la glutamina, la histidina y la lisina, pueden hallarse con I rjnayor frecuencia en las hélices a, mientras que la valina, la isoleucina, la fenilalanina, la tirosina, el triptofano y la treonina pueden hallarse con mayor frecuencia en las láminas plegadas ß. La glicina, la serina, el ácido áspártico, la asparagina y la prolina pueden hallarse con frecuencia en los giros. A continuación se detallan grupos de sus-titución preferidos: (i) S y T; (¡i) P y G; y (iii) A, V, L y I. Al tomar en consideración el código genético conocido y las i técnicas de ADN recombinante y sintético, aquellos versados en la técnica i r^an de poder construir con facilidad ADN que codifican las variantes de aminoácidos conservativas.

Como se la usa en la presente, la "identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos hace referencia al porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. La "homología de secuencia" hace referencia al porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservativas. Las secuencias preferidas de polipéptidos de la invención contienen secuencias de aminoácidos, en donde I a. la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 es idéntica a SEQ ID NO: 5 en al menos 7 de 8 aminoácidos, y b. la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 es idéntica a SEQ ID NO: 6 en al menos 14 de 19, más preferido 15 de 19, más preferido 16 de 19, más preferido 17 de 19, o incluso más preferido 18 de 19 aminoácidos, y c. la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 es idéntica a SEQ ID NO: 7 en al menos 8 of 11 , más preferido 9 de 11 , o incluso más preferido 10 de 11 aminoácidos, y d. la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 es idéntica a SEQ ID NO: 8 en al menos 12 de 14, o más preferido 13 de 14 aminoácidos, y e. la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 es idéntica a SEQ ID NO: 9 en al menos 4 de 7, más preferido 5 de 7, o incluso más preferido 6 de 7 aminoácidos, y f. la secuencia de aminoácidos de la LCR3 es idéntica a SEQ ID NO: 10 en al menos 11 de 12 aminoácidos.

Moléculas de ADN de la invención La presente invención también se relaciona con moléculas de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Estas secuencias incluyen, sin i limitaciones, las moléculas de ADN que se detallan en SEQ ID N° 3 y 4. i Las moléculas de ADN de la invención no se limitan a las secuencias i describen en la presente, sino que también incluyen variantes de Las variantes de ADN en el contexto de la invención pueden describirse en referencia a sus propiedades físicas en la hibridación.

I Aquellos versados en la técnica han de reconocer que el ADN puede usarse para identificar su complemento, y como el ADN tiene dos cadenas, sus equivalentes u homólogos, por medio de procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos. También ha de reconocerse que la hibridación puede i ocurrir con una complementariedad menor que 100%. Sin embargo, si se I seleccionan las condiciones apropiadas, los procedimientos de hibridación pueden usarse para distinguir las secuencias de ADN sobre la base de sus relaciones estructurales con una sonda particular. Para hallar lineamientos sobre estas condiciones, véanse Sambrook et al., 1989 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EE.UU.)] y Ausubel et al., 1995 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., y Struhl, K., editores (1995). Current Protocols ¡n Molecular Biology. Nueva York: John Wiley and Sons].

La similitud estructural entre las secuencias de los dos polinucleótidos puede expresarse en función de la "severidad" de las condiciones bajo las que las dos secuencias hibridan una con otra. Como se lo usa en la presente, el término "severidad" hace referencia a la medida en que las condiciones desfavorecen la hibridación. Las condiciones severas desfavorecen fuertemente la hibridación, de modo que, bajo estas condiciones, solamente podrán hibridar las moléculas muy relacionadas desde el punto de vista estructural. Por otro lado, las condiciones no severas favorecen la hibridación de aquellas moléculas que presentan un menor grado de relación estructural. Por consiguiente, la severidad de la hibridación está correlacionada directamente con las relaciones estructurales entre las i dos secuencias de ácidos nucleicos. Las siguientes ecuaciones son útiles i para correlacionar la hibridación y las relaciones entre las secuencias (donde i Tm es la temperatura de fusión de una dupla de ácidos nucleicos): i ¡ a. Tm = 69,3 + 0,41 (G+C)% b. La Tm de una dupla de ADN disminuye 1°C al incrementarse 1% la cantidad de pares de bases no coincidentes. c. (Tm)M2 - (Tm) µ? = 18,5 Iog10p2/p1 , donde µ1 y µ2 son las fuerzas iónicas de las dos soluciones.

La severidad de la hibridación es una función de diversos factores, incluyendo la concentración general del ADN, la fuerza iónica, la temperatura, el tamaño de la sonda y la presencia de agentes que alteran los enlaces de hidrógeno. Los factores que promueven la hibridación incluyen las concentraciones elevadas de ADN, las fuerzas iónicas elevadas, las temperaturas reducidas, las sondas de gran tamaño y la ausencia de agentes que destruyen los enlaces de hidrógeno. La hibridación típicamente i se lleva a cabo en dos fases: la fase de "unión" y la fase de "lavado".

Primero, en la fase de unión, la sonda se une al blanco bajo i condiciones que favorecen la hibridación. En esta etapa, la severidad usualmente se controla alterando la temperatura. Para obtener una severidad elevada, la temperatura usualmente se fija entre 65°C y 70°C, a menos que se usen oligonucleótidos cortos (de menos de 20 nucleótidos). Una solución de hibridación representativa comprende SSC 6x, 0,5% de SDS, solución de Denhardt 5x y 100 pg de ADN de transporte no específico [véase Ausubel et I al., sección 2.9, suplemento 27 (1994)]. Evidentemente, se conocen condiciones de amortiguación muy diferentes que pueden ser equivalentes desde el punto de vista funcional. Cuando el grado de relación es menor, puede seleccionarse una menor temperatura. Las temperaturas de unión propias de las severidades menores son de aproximadamente entre 25°C y 40°C. La severidad media tiene lugar entre al menos aproximadamente 40°C y menos de aproximadamente 65°C. La severidad elevada ocurre a al menos aproximadamente 65°C.

En segundo lugar, se retira la sonda en exceso por lavado. En esta fase, usualmente se aplican condiciones más severas. Por lo tanto, la etapa de "lavado" es la más importante para determinar la relación por hibridación. Las soluciones de lavado típicamente contienen menores concentraciones de sal. Un ejemplo de una solución de lavado de severidad mediana contiene SSC 2x y 0,1 % de SDS. Una solución de lavado de severidad alta contiene el équivalente (en términos de la fuerza iónica) de SSC menos de aproximadamente 0,2x, y una solución de lavado severa preferida contiene i SSC aproximadamente 0,1 x. Las temperaturas asociadas a los diversos grados de severidad en el lavado son idénticas a las que se describieron con I anterioridad para la "unión". La solución de lavado típicamente también es reemplazada una cantidad de veces durante el lavado. Por ejemplo, las condiciones de lavado de gran severidad típicas comprenden dos lavados de 30 minutos a 55°C y tres lavados de 15 minutos a 60°C. i ! Por consiguiente, un sujeto de la presente invención es una i secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo y los I fragmentos de unión al antígeno de la presente invención.

Otra forma de realización de la presente invención es la secuencia de ácido nucleico aislada mencionada con anterioridad, que codifica los anticuerpos de la presente invención, donde las secuencias de ácidos nucleicos son como las que se detallan en la tabla 5.

I ¡ Por consiguiente, la presente invención abarca aquellas moléculas de ácidos nucleicos que hibridan con las moléculas que se detallan en la tabla 5 bajo condiciones de unión y lavado de gran severidad, donde estas i ijnoléculas de ácidos nucleicos codifican un anticuerpo o un fragmento de éste, que tienen propiedades como las que se describen en la presente. Las moléculas preferidas (desde la perspectiva del ARNm) son aquellas que tienen al menos 75% u 80% (preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente al menos 95%) de i identidad de secuencia con una de las moléculas de ADN que se describen en la presente. Las moléculas bloquean la señalización mediada por el i receptor de prolactina.

Variantes equivalentes desde el punto de vista funcional Aun otra clase de variantes de ADN que se hallan dentro del alcance de la invención puede describirse en referencia al producto que codifican.

Estos genes equivalentes desde el punto de vista funcional se caracterizan i porque codifican las mismas secuencias peptídicas que se proveen en SEQ i ID N° 1 y 2, debido a la degeneración del código genético.

Se reconoce que las variantes de las moléculas de ADN que se proveen en la presente pueden construirse de diversas maneras. Por ejemplo, es posible construirlas como ADN completamente sintético. Los métodos para sintetizar de manera eficiente oligonucleótidos con tamaños en el rango de entre 20 y aproximadamente 150 nucleótidos están ampliamente i disponibles. Véase Ausubel et al., sección 2.1 1 , suplemento 21 (1993). Los oligonucleótidos superpuestos pueden sintetizarse y ensamblarse de una manera que fue descripta por primera vez por Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971 ); véase también Ausubel et al., supra, sección 8.2. El ADN sintético preferiblemente se sintetiza con la inserción de sitios de restricción I convenientes en los extremos 5' y 3' del gen, con el propósito de facilitar la clonación en un vector apropiado.

Como se indicó, un método para generar las variantes comprende bomenzar con los ADN que se describen en la presente y luego llevar a cabo una mutagénesis dirigida a un sitio. Véase Ausubel et al., supra, capítulo 8, suplemento 37 (1997). En un método típico, se clona un ADN blanco en un vehículo basado en un bacteriófago con ADN de cadena simple. El ADN de cadena simple se aisla y se hace hibridar con un oligonucleótido que contiene una o más alteraciones deseadas a nivel de los nucleótidos. Se sintetiza la cadena complementaria y se introduce el fago de cadena doble I en un huésped. Parte de la progenie resultante contendrá la mutación deseada, lo cual podrá confirmarse por medio de una secuenciación del i ADN. Además, hay diversos métodos disponibles que permiten incrementar la probabilidad de que la mutación deseada se halle en los fagos de la progenie. Estos métodos son bien conocidos por aquellos versados en la técnica, y hay conjuntos de elementos disponibles comercialmente para generar estas mutaciones.

' Construcciones de ADN recombinante y su expresión En la presente invención también se proveen construcciones de ADN recombinantes que comprenden una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Las construcciones recombinantes de la presente invención se usan en conexión con un vector, tal como un plásmido, un fago i ? un vector viral, en el cual se inserta una molécula de ADN que codifica un I anticuerpo de la invención.

El gen codificado puede producirse con las técnicas que se describen en Sambrook et al., 1989, y Ausubel et al., 1989. Como alternativa, las secuencias de ADN pueden sintetizarse por medios químicos, usando, por I ejemplo, sintetizadores. Véanse, por ejemplo, las técnicas que se describen en Oligonucleotide Synthesis (1984, Gait, editor, IRL Press, Oxford), que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad. Aquellos versados en la técnica han de ser capaces de fusionar el ADN que codifica los dominios variables con fragmentos de genes que codifican regiones constantes de diversos isotipos humanos de IgG o derivados de éstos, tanto i en formas mutadas como en formas no mutadas. La tecnología de ADN i recombinante puede aplicarse para fusionar ambos dominios variables en un formato de una sola cadena, mediante el uso de conectares, p.ej., extensiones de quince aminoácidos que contienen tres motivos de glicina- glicina-glicina-glicina-serina. Las construcciones recombinantes de la invención están compuestas por vectores de expresión a partir de los cuales puede expresarse el ARN y/o los productos proteicos codificados por el ADN.

El vector también puede comprender secuencias de regulación, incluyendo un promotor unido operativamente al marco abierto de lectura (ORF). El vector también puede comprender una secuencia marcadora de selección.

También pueden ser necesarias señales de inicio y secreción específicas p iara bacterias para que tenga lugar una traducción eficiente de las j secuencias insertadas que codifican los genes deseados.

En la presente invención también se proveen células huésped que contienen al menos un ADN de la presente invención. La célula huésped podrá ser virtualmente cualquier célula para la que haya disponibles vectores de expresión. Por ejemplo, podrá tratarse de una célula huésped eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula huésped eucariota I inferior, tal como una célula de levadura, y también puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La construcción recombinante podrá introdu-cirse en la célula huésped por medio de una transfección mediada por fosfato de calcio o DEAE, a través de una transfección mediada por dextrano, por electroporación o por medio de una infección con un fago.

Expresión en bacterias Los vectores de expresión útiles para usar en bacterias se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica la proteína deseada, en combinación con señales apropiadas para el inicio y la terminación de la traducción, en un marco de lectura operativo con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores de I selección fenotípica, un origen de replicación para asegurar el mantenimiento clel vector, y de resultar deseable, para proveer la amplificación en el, I huésped. Los huéspedes procariotas apropiados para la transformación incluyen E. co//, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.

Los vectores bacterianos pueden estar basados, por ejemplo, en bacteriófagos, en plásmidos o en fagémidos. Estos vectores pueden contener un marcador de selección y un origen de replicación para bacterias i derivado de plásmidos disponibles comercialmente, que típicamente contienen elementos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Una vez realizada la transformación de la cepa huésped apropiada y i de cultivarla hasta alcanzar la densidad celular apropiada, se desreprime/induce el promotor seleccionado por medios apropiados (p.ej., variaciones en la temperatura o inducción química) y se cultivan las células ¿Jurante un período adicional. Las células típicamente se cosechan por i centrifugación y se destruyen por medios físicos o químicos, y el extracto en bruto resultante se retiene para continuar con la purificación.

En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse numerosos vectores de expresión en función del uso que se desee darle a la proteína expresada. Por ejemplo, cuando se desee producir una gran cantidad de esta proteína para generar anticuerpos o analizar bibliotecas de péptidos, por ejemplo, resultarán deseables aquellos vectores que dirijan la expresión de productos de fusión de proteínas que puedan ser purificados con facilidad en i niveles elevados.

Entonces, un objeto de la presente invención es un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica los anticuerpos novedosos de la presente invención.

Expresión en mamíferos v purificación Las secuencias de regulación preferidas para la expresión en células I huésped de mamíferos incluyen los elementos virales que dirigen la expresión de proteínas en niveles elevados en las células de mamíferos, tales como los promotores y/o los potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador del CMV), del i virus del simio 40 (SV40) (tales como el promotor/potenciador de SV40), de adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío mayor del adenovirus (AdMLP)) y de poliomas. Para hallar una descripción más detallada de los elementos de regulación virales y de las secuencias que los codifican, véanse, por ejemplo, U.S. 5168062, de Stinski, U.S. 4510245, de Bell et al., y U.S. 4968615, de Schaffner et al. Los vectores de expresión recombinantes también pueden incluir orígenes de replicación y marcadores de selección (véanse, por ejemplo, U.S. 4399216, 4634665 y U.S. 5179017, de Axel et al.). Los marcadores de selección apropiados incluyen genes que le confieren resistencia a drogas, tales como el G418, la higromicina o el metotrexato, a la célula huésped en la que se introduce el vector. Por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) confiere resistencia al metotrexato y el gen neo confiere resistencia al G418.

La transfección del vector de expresión a una célula huésped puede realizarse de acuerdo con procedimientos convencionales, tales como la electroporación, la precipitación con fosfato de calcio y la transfección mediada por DEAE-dextrano.

Las células huésped de mamíferos apropiadas para expresar los anticuerpos, las porciones de unión al antígeno o los derivados de éstos que se proveen en la presente incluyen las células de ovario de hámster chino ( icélulas CHO) [incluyendo las células CHO dhfr-, descriptas por Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, que se usan con un marcador de selección DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]], las células de mieloma NSO, las células COS y las células SP2. En algunas formas de I realización, el vector de expresión está diseñado de manera tal que la i proteína expresada es secretada hacia el medio de cultivo en el que se desarrollan las células huésped. Los anticuerpos, las porciones de unión al antígeno o los derivados de éstos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Los anticuerpos de la invención o los fragmentos de unión al antígeno de éstos pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos recombinantes de acuerdo con métodos bien conocidos, incluyendo, sin limitaciones, la precipitación con sulfato de amonio o con etanol, la extracción con ácido, la cromatografía con la proteína A, la cromatografía con la proteína G, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la fosfo-celulosa, la cromatografía de interacción hidrofóbica, por afinidad, la cromatografía con hidroxilapatita y la cromatografía con lectina. Para la purificación, también puede emplearse una cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC"). Véanse, por ejemplo, Colligan, Current Protocole ¡n Immunology, o Current Protocols in Protein I Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001 ), p.ej., los capítulos 1 , 4, 6, 8, 9, 10, cada uno de los cuales se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad. i Los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de unión al antígeno de éstos incluyen los productos purificados por medios naturales, los productos de procedimientos de síntesis química y los productos que se obtienen mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped i embrionario, incluyendo, por ejemplo, una levadura, una planta superior, un insecto o una célula de mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la presente I invención puede estar glicosilado o no glicosilado. Estos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio, tales como Sambrook, supra, en las secciones 17,37-17,42, o Ausubel, supra, en los capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20.

? Entonces, un objeto de la presente invención también son las células iuésped que comprenden un vector o una molécula de ácido nucleico, donde la célula huésped puede ser una célula huésped eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula huésped eucariota inferior, tal como lina célula de levadura, y también puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana.

Otro objeto de la presente invención es un método para usar la célula i huésped para producir un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, que comprende cultivar la célula huésped bajo condiciones apropiadas y recuperar dicho anticuerpo.

Entonces, otro objeto de la presente invención es el anticuerpo descripto en la presente invención, que es producido por las células huésped I de la presente invención y es purificado hasta alcanzar una homogeneidad de al menos 95% en peso.

Endometriosis y adenomiosis (endometriosis interna) La endometriosis es un trastorno ginecológico benigno dependiente del estrógeno que se caracteriza por la presencia de tejido endometrial (glándulas y estroma) fuera de la cavidad uterina. Las lesiones en el endometrio se ha-llan principalmente en el peritoneo pélvico, en los ovarios y en el septo rectovaginal (Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 24:235-238, 1997). La endometriosis frecuentemente está asociada a la infertilidad y a síntomas dolorosos como la dismenorrea. Además, muchos pacientes sufren enfermedades autoinmunes (Hum. Reprod. 17(19):2715-2724, 2002). La adenomiosis uteri, también conocida como endometriosis interna, es una Subforma de la endometriosis que está restringida al útero. En el caso de la adenomiosis uteri, las glándulas endometriales invaden el miometrio y la pared del útero.

De acuerdo con la teoría del trasplante, los fragmentos del endometrio son transportados por la menstruación retrógrada hacia la cavidad peritoneal en los pacientes y en las mujeres saludables (Obstet. Gynecol. 64:151-154, 1984). A continuación se detallan los cuatro factores principales que parecen tener una participación crítica en el establecimiento exitoso de las lesiones endometriales en la cavidad pélvica de los pacientes. a) En el caso de la fase de secreción del ciclo menstrual, las células endometriales en las mujeres saludables se tornan apoptóticas. En los pacientes, la extensión de la apoptosis en las \ células endometriales se reduce claramente (Fértil. Steril. 69:1042- 1047,1998). Entonces, en los pacientes hay una mayor probabilidad j que en las mujeres saludables de que los fragmentos del endometrio que hayan sido transportados a la cavidad peritoneal por medio de la menstruación retrógrada no mueran y se implanten con éxito. b) Para que tenga lugar un implante exitoso en el peritoneo y para que los fragmentos del endometrio ectópicos presenten una supervivencia a largo plazo, es necesario que se formen nuevos vasos sanguíneos (British Journal of Pharmacology, 149: 33-135, 2006). c) Muchos pacientes sufren enfermedades autoinmunes, ¡ por lo que presentan un sistema inmune comprometido (Hum. Reprod. 17(19): 2002, 2715-2724, 2002). A partir de esto, puede concluirse ! que una respuesta inmune intacta, como la que ocurre en las mujeres saludables, puede ser fundamental para la prevención del \ establecimiento de las lesiones endometriales. d) Es necesario que las lesiones se desarrollen, para lo cual dependen de la presencia de estímulos mitogénicos y factores de crecimiento.

A continuación se detallan los abordajes disponibles actualmente tratamiento de la endometriosis. a) Los análogos de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH) dan como resultado la supresión de la síntesis de estradiol en el ovario e inducen la atrofia de los implantes endometriales ectópicos que dependen de manera crítica de la presencia de estradiol para su crecimiento. b) Los inhibidores de la aromatasa inhiben la producción local de estradiol por los implantes endometriales, inducen la apoptosis e inhiben la proliferación de los fragmentos ectópicos del endometrio. c) Los moduladores selectivos del receptor de estrógeno presentan una actividad antagónica sobre el receptor de estrógeno en los implantes endometriales normales y ectópicos, lo que resulta en la atrofia del tejido endometrial ectópico implantado. d) Los agonistas del receptor de progesterona inhiben la proliferación de las células endometriales normales y ectópicas e inducen la diferenciación y la apoptosis. e) Los anticonceptivos orales combinados mantienen el ! status quo, previenen el progreso de la enfermedad e inducen la I atrofia del endometrio ectópico y eutópico. f) La extracción quirúrgica de las lesiones.

Los análogos de la GnRH, los SERM y los inhibidores de la áromatasa tienen efectos colaterales severos y dan como resultado calores y pérdida de hueso en las mujeres jóvenes que sufren endometriosis. El tratamiento con agonistas del receptor de progesterona da como resultado la inhibición de la ovulación, una hemorragia menstrual irregular seguida por amenorrea, ganancia de peso corporal y depresión. Debido al riesgo incrementado de tromboembolia venosa, los anticonceptivos orales combinados no están indicados para mujeres con edades mayores que 35 años, para las personas que fuman y para los individuos que sufren exceso de peso. La extracción quirúrgica de las lesiones es susceptible a tasas de recurrencia elevadas.

El anticuerpo de la presente invención interfiere con la señalización mediada por el PRLR, que es estimulada por la prolactina producida en la pituitaria y de manera local, o que también puede deberse a mutaciones de activación del PRLR, por lo que son más efectivos que los agonistas del receptor de dopamina 2, que solamente interfieren con la secreción de prolactina en la pituitaria.

Por lo tanto un objetivo de la presente invención es el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno como se describe en la presente invención como un medicamento.

La PRL y el PRLR se expresan en el útero y participan en la fisiología del útero. La PRL puede actuar como un mitógeno potente y cumple una función de inmunomodulación. En la presente invención, se demuestra que las alteraciones en el sistema de la PRL/el PRLR es importante en la endometriosis humana. En las figuras 1 y 2 se ilustra un análisis de PCR cuantitativa Taqman de la expresión de la PRL y el PRLR en endometrio de mujeres saludables y en endometrio y lesiones de pacientes (véase el ejemplo 4).

Como se demuestra en la figura 1 (expresión de la PRL) y en la figura 2 (expresión del PRLR), tanto la PRL y como su receptor están regulados de una manera notablemente positiva en las lesiones del endometrio. Estos hallazgos son sorprendentes y en contraste con un estudio publicado previamente (Acta Obstet Gynecol Scand 81 :5-10, 2002) que describe una ausencia casi completa de la expresión de PRLR en lesiones endometriósicas humanas.

Los descubrimientos de la presente invención generan por. primera vez evidencias experimentales de que la señalización autocrina de la PRL cumple una función fundamental en el establecimiento, el crecimiento y el mantenimiento de las lesiones del endometrio.

El anticuerpo at3 contra el PRLR fue evaluado con éxito en un modelo de endometriosis interna en animales, es decir, la adenomiosis uteri I en ratones (véase el ejemplo 5). La adenomiosis se caracteriza por el crecimiento infiltrativo de las glándulas endometriales en la capa del miometrio del endometrio. Se asemeja a una forma de la endometriosis restringida al útero, la única forma de endometriosis que puede desarrollarse en los individuos sin menstruación.

El danazol, que es efectivo en el tratamiento clínico de los pacientes que sufren endometriosis, también es efectivo en el tratamiento de la adenomiosis uteri (Life Sciences 51 :1119-1125, 1992). Sin embargo, el danazol es una progestina androgénica y da como resultado efectos colaterales androgénicos severos en las mujeres jóvenes, lo que limita su uso.

El anticuerpo de la presente invención soluciona este problema, ya que constituye nuevos agentes para el tratamiento o la prevención de la endometriosis y presentan menos efectos colaterales que las terapias convencionales que se usan en la actualidad.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo Mat3 y; los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención para el tratamiento o la prevención de la endometriosis y la adenomiosis (endometriosis interna).

Enfermedad mamaria benigna y mastalgia La enfermedad mamaria benigna abarca una variedad de síntomas, tales como la enfermedad fibroquística mamaria, el fibroadenoma, la mastalgia y los macroquistes. Entre el 30 y 50% de las mujeres premenopáusicas sufren la enfermedad fibroquística mamaria (Epidemiol. Rev. 19:310-327, 1997). Dependiendo de la edad de la mujer, la enfermedad mamaria benigna puede presentar fenotipos diferentes (J. Mammal Gland Biol. Neoplasia 10:325-335, 2005): durante las prime-ras fases de la reproducción (entre los 15 años y los 25 años), cuando ocurre el desarrollo lobular en la mama nor-mal, la enfermedad mamaria benigna da como I resultado fibro-adenomas. Se observan fibroadenomas gigantes individuales y también adenomas múltiples. Estos fibroadenomas están com-puestos por células del estroma y del epitelio y surgen de los lóbulos. En la fase i reproductiva madura (entre los 25 años y los 40 años), la mama pasa por cambios cíclicos du-rante cada ciclo menstrual. Las mujeres enfermas se caracterizan por una mastalgia cíclica y por diversos nodulos en sus mamas. Más tarde (entre los 35 años y los 55 años de edad), la mama normal involuciona, pero en la mama enferma se observan macroquistes e hiperplasia epitelial, con atipia o sin ella. Las formas de la enfermedad mamaria benigna que están acompañadas por una proliferación incrementada de las células epiteliales se caracterizan por un mayor riesgo I de desarrollar carcinomas mamarios. Este riesgo puede ser de hasta 11% si hay atipias celulares presentes en la fracción de las células en proliferación (Zentralbl Gynákol 119:54-58,1997). 25% de las mujeres con edades de 60-80 años también sufren la enfermedad mamaria benigna. Frecuentemente, la terapia de reemplazo del estrógeno o la adiposidad son las razones de la persistencia de la enfermedad mamaria benigna después de la menopausia (Am. J. Obstet. Gynecol. 154:161-179, 1986).

La patofisiología de la enfermedad fibroquística ma-maria está determinada por la predominancia del estrógeno y la deficiencia de progesterona, lo que da como resultado una hiperproliferación en los tejidos conectivos (una fibrosis), a lo que sigue una proliferación facultativa de las I células epiteliales. Como ya se mencionó, el riesgo de desarrollar un cáncer i cié mama es elevado en los pacientes que presentan una proliferación incrementada de las células epiteliales en los focos fibroquísticos. La enfermedad fibroquística mamaria se caracteriza por dolor y sensibilidad en as mamas. 70% de los pacientes que sufren la enfermedad fibroquística mamaria también sufren insuficiencias en el cuerpo lúteo o anovulación (Am. J. Obstet. 154:161-179,1986). Las insuficiencias en el cuerpo lúteo dan como resultado los niveles reducidos de progesterona y la predominancia del estrógeno.

La mastalgia (el dolor en las mamas) afecta a aproximadamente 70% ¿le las mujeres en algún momento de su vida reproductiva. El dolor en las ijnamas puede estar asociado o no a otros criterios del síndrome [premenstrual. Se ha demostrado que las mujeres que sufren mastalgia Responden con una liberación excesiva de prolactina después de la estimulación del eje del hipotálamo y la pituitaria (Clin. Endocrinol. 23:699- 704,1985). j A continuación se detallan las terapias convencionales para la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia. 1 ) Bromocriptina Como agonista de la dopamina, la bromocriptina solamente bloquea l síntesis de prolactina en la pituitaria, pero no la síntesis local de prolactina en las células del epitelio mamario. Por lo tanto, solamente es efectiva en i aquellas formas de la mastalgia y la enfermedad mamaria benigna que se deben a niveles elevados de prolactina a nivel sistémico. Los efectos colaterales más importantes de la bromocriptina son las náuseas, los vómitos, el edema, la hipotensión, los mareos, la pérdida de cabello, las cefaleas y las alucinaciones. 2) Danazol i El danazol es una progestina androgénica que, a través de su i actividad antigonadotrófica, contrarresta la predominancia del estrógeno que i se observa en la enfermedad mamaria benigna. Sus efectos colaterales más importantes son las irregularidades menstruales, la depresión, el acné, el hirsutísmo, la adquisición de un tono grave en la voz y los calores, así como ganancia de peso. 3) Tamoxifeno i El tamoxifeno es un modulador selectivo del receptor de estrógeno que presenta actividad antiestrogénica en las mamas y actividad estrogénica én el útero. Sus efectos colaterales más importantes incluyen síntomas osmenopáusicos como la pérdida de hueso y los calores, los quistes ¡ ováricos y el carcinoma endometrial. 4) Progestinas Las progestinas inhiben la enfermedad mamaria benigna a través de la supresión del eje de la pituitaria y las gónadas, la inhibición de la ovulación y la eliminación del estrógeno. La eliminación del estrógeno da como esultado síntomas menopáusicos como la pérdida de hueso y los calores. j 5) Dosis reducidas de anticonceptivos orales combinados Este tratamiento no está indicado para las mujeres con edades superiores a 35 años, para las mujeres fumadoras o para los pacientes diabéticos y con sobrepeso.

En general, se ha descubierto que los niveles de prolactina están incrementados en un tercio de las mujeres que sufren la enfermedad mamaria benigna. Como los estrógenos incrementan la secreción de I prolactina en la pituitaria, se cree que el incremento en los niveles de prolactina en el suero es una consecuencia de la predominancia de los éstrógenos en esta enfermedad. Se ha informado que frecuentemente hay Una mutación de activación del PRLR en las mujeres que sufren múltiples adenomas de mama, lo que es similar a un subtipo de la enfermedad fibroquística mamaria (Paul Kelly, Breast Congress, Turín, 2007, y Proc. Nati. Ácad. Sci. 105:14533-14538;2008).

La enfermedad mamaria benigna, la mastalgia y la tensión mamaria ¡ remenstrual tienen un mecanismo patofisiológico en común: la señalización incrementada de la prolactina. La señalización incrementada de la prolactina puede ser una consecuencia de los siguientes factores: ¦ una hiperprolactinemia sistémica (debida a un adenoma en la pituitaria), ¦ una hiperprolactinemia local (debida a la síntesis de I ¡ prolactina en las células en proliferación en el epitelio de la glándula i l mamaria), que no se traduce en niveles elevados de prolactina en la ! sangre, ¦ una señalización constitutivamente activa del PRLR en presencia de niveles normales de prolactina (debida a una mutación de activación del PRLR).

Como determinadas formas de la enfermedad mamaria benigna pueden dar lugar a un cáncer de mama, hay una necesidad médica relacionada con el tratamiento de esta enfermedad.

Para demostrar la eficacia del anticuerpo Mat3 neutralizador contra el PRLR en un modelo preclínico de la enfermedad mamaria benigna, se empleó un modelo de la hiperprolactinemia sistémica basado en ratones. Se sometieron ratones Balb/c adultos a isoinjertos de pituitaria bajo la cápsula I del riñon como se describe en el ejemplo 16 (véase Methods in Mammal Gland Biology and Breast Cáncer Research, 101-107,2000). En el modelo i ratón de la presente invención para la enfermedad de mama benigna, no se ha usado un carcinógeno tal como DMBA; los ratones sólo fueron trasplantados con glándulas pituitarias con el objetivo de estudiar las consecuencias de la aplicación de anticuerpo Mat3 en la proliferación mejorada de células epiteliales benignas. En un estudio previo los animales isoinjertados de pituitaria se trataron además con el carcinógeno DMBA y se analizaron los efectos de un anticuerpo monoclonal diferente contra PRLR I en el desarrollo de cáncer de mama (Am J Pathol 133:589- Estos anticuerpos fueron eficaces para tratar el cáncer de mama, I sin embargo no se analizaron los efectos en la enfermedad de mama benigna (Am J Pathol 133:589-595,1988).

En el modelo de la presente invención, la hiperprolactinemia sistémica provocó una proliferación aumentada de las células en la glándula mamaria, y desarrollo estimulado de ramificación lateral y lóbuloalveolar en comparación con ratones control vírgenes no tratados. Como se describe en él ejemplo 6, el anticuerpo neutralizador Mat3 contra PRLR se ensayó en éste modelo de ratón Balb/c en comparación con un anticuerpo inespecífico respecto a su habilidad para: ¦ bloquear el desarrollo de ramificación lateral y j lóbuloalveolar ¦ inhibir la proliferación de células epiteliales mamarias ¦ inhibir la expresión del gen blando de prolactina elf5 El anticuerpo neutralizador Mat3 contra PRLR inhibió la ramificación lateral (Figura 3A) y la expresión del gen blanco de prolactina elf5 (Figura 3B).

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo Mat3 y fragmentos de unión a antígeno como se describe en la presente invención para el tratamiento de enfermedad de mama benigno y mastalgia en mujeres pre y postmenopáusicas.

¡ Otras indicaciones que se benefician del bloqueo de la señalización mediada por PRLR por el anticuerpo Mat3: i Anticonceptivos femeninos no hormonales: Las estrategias actuales para la anticoncepción femenina son las siguientes: a) Anticonceptivos orales combinados que contienen ! estrógenos y progestinas.

Los componentes progestogénicos median los efectos anticonceptivos por medio de una retroalimentación negativa en el eje hipotalámico-pituitario-gonadal. El componente estrogénico asegura un buen control del sangrado y potencia la acción gestagénica por medio de la inducción del receptor de progesterona en células blanco. j b) Dispositivos intrauterinos que contienen progestinas solamente.

La progestina liberada localmente pone al endometrio en un estado resistente a la implantación. Adicionalmente, el moco cervical se vuelve casi impermeable a las células espermáticas.

I : c) Pildoras sólo de progestina e implantes.

La progestina inhibe la ovulación por medio de una retroalimentación negativa en el eje hipotalámico-pituitario-gonadal. Adicionalmente la { ermeabilidad del moco cervical a células espermáticas está reducida. ! d) Anillos vaginales que contienen etinilestradiol más I progestinas.

El efecto secundario principal de anticonceptivos orales combinados es el riesgo elevado de tromboembolismos venoso (VTE). Adicionalmente, las mujeres con sobrepeso o que fuman, así como mujeres que padecen de i enfermedades autoinmunes tal como lupus y mujeres mayores de 35 años rio pueden usar anticonceptivos combinados orales.

Los dispositivos intrauterinos e implantes que contienen progestinas sólo pueden llevar a un sangrado uterino disfuncional.

¡ Las pildoras de progestina sola pueden provocar patrones irregulares I de sangrado, manchas de sangre, amenorrea. El riesgo de embarazos ectópicos aumenta. El aumento y reducción de peso en la densidad de masa ósea son efectos secundarios adicionales.

Los anillos vaginales pueden llevar a vaginitis, leucorrea o expulsión, i Los ratones deficientes de PRLR han sido generados unos años atrás (Genes Dev 11:167-178, 1997). Interesantemente, los ratones hembras deficientes de PRLR, pero no los machos, son completamente estériles. Las i , hembras PRLR muestran una detención del desarrollo del huevo inmediatamente luego de la fertilización, es decir que muestran una detención del desarrollo preimplantación si bien la ovulación fue normal. Sólo unos pocos ovocitos alcanzaron el estadio de blastocisto y no tuvieron la capacidad de implantarse en hembras mutantes pero se desarrollaron a ¦i embriones normales en madres adoptivas de tipo salvaje luego de la I implantación. El fenotipo de infertilidad de los ratones deficientes de PRLR pudo ser rescatado hasta la preñez a medio término por suplemento de progesterona. Obviamente, la señalización mediada por PRLR tiene un rol importante en el mantenimiento y función del cuerpo lúteo que produce progesterona que es necesaria para permitir y mantener la preñez, / jicionalmente las hembras deficientes de PRLR, pero no los machos, mostraron una reducción en el peso corporal asociado con una reducción en la masa de grasa abdominal y niveles de leptina.

; Hasta la fecha, no se conoce ninguna mutación de PRLR humana ¡ijiactivante, por lo tanto el rol preciso de la señalización mediada por PRLR en la fertilidad humana aún es desconocida. Sin embargo, hay evidencia en aumento que en los humanos también se requiere un nivel de prolactina rhínimo para permitir el embarazo exitoso. Los pacientes que padecen de infertilidad primaria debido a insuficiencia del cuerpo lúteo hiperprolactinémica fueron tratados con bromocriptina. En algunos cosas, los niveles de prolactina fueron disminuidos y las fases luteales acortadas reaparecieron nuevamente (Bohnet HG et al. in Lisuride and other dopamine agonists aditado por D.B. Calne et al, Raven Press, Nueva York, 1983). A partir de estos datos se concluyó que los estados de hiper e hipoprolactinemia interfieren negativamente con lá fertilidad femenina. Esto puede ser explicado por la interacción de PRL con su receptor. En el caso de niveles bajos de prolactina, no hay activación suficiente del receptor, I mientras que en el caso de la hiperprolactinemia, tampoco hay activación suficiente del receptor, ya que todos los receptores están bloqueados por üna molécula de prolactina y no se pueden dimerizar más. En otras palabras, la respuesta a dosis para prolactina tiene forma de campana y la activación óptima' del receptor se logra sólo en un cierto rango de concentración. Hay evidencia de un segundo estudio que la carencia de expresión de prolactina endometrial en pacientes lleva a una falla de implantación temprana (Human Reprod. 19:191 1-1916, 2004). Sin embargo, se ha mostrado que la prolactina ex vivo puede prevenir la apoptosis de células granulosas humanas cultivadas y por lo tanto mantiene la función temprana del cuerpo lúteo como ha sido demostrado en ratones deficientes de PRLR (Human Reprod. 18:2672-2677,2003).

! En comparación con las estrategias mencionadas anteriormente, la I anticoncepción femenina con anticuerpos neutralizadores de PRLR tiene v'arias ventajas: ¡ · los anticuerpos pueden ser usados en mujeres fumadoras, con sobrepeso, y mayores así como en mujeres que padecen de lupus eritematoso (los anticuerpos contra PRLR pueden incluso ser beneficioso para el tratamiento del lupus y la reducción de grasa abdominal, es decir que los ratones deficientes de PRLR tuvieron menos grasa abdominal). • los anticuerpos contra PRLR no elevaron el riesgo de \ VTE (tromboembolismo venoso). ! · al contrario de los estrógenos y progestinas usadas en la anticoncepción oral combinada, la neutralización de la señalización mediada por PRLR lleva a la inhibición de la proliferación del epitelio ! mamario y al contrario de las estrategias hormonales para el control de la fertilidad podría incluso proteger a los usuarios del cáncer de mama.

Otro objeto de la presente invención es el uso del anticuerpo Mat3 para la anticoncepción femenina con efectos secundarios reducidos en comparación con los tratamientos estándares.

Inhibición de la lactancia La prolactina es la hormona principal relacionada con la lactancia d'espués del nacimiento del niño. Esto se ve reflejado en el fenotipo de los ratones con deficiencias en el PRLR. Incluso los ratones heterocigotas son completamente Neuroendocrinology Las mujeres pueden verse obligadas a interrumpir la lactancia debido a muchas razones. Algunas de ellas incluyen los regímenes con drogas que podrían ser potencialmente peligrosas para el lactante, las infecciones serias (ila mastitis, la nefritis), las hemorragias posparto profusas y las I enfermedades maternas severas, p.ej., la diabetes, los carcinomas y la debilidad, o las enfermedades de los neonatos. En la actualidad, se usan agonistas del receptor de dopamina como la bromocriptina y el lisuride para inhibir la lactancia después del nacimiento. Sin embargo, estos compuestos I pueden provocar efectos colaterales severos, tales como náuseas, vómitos, édema, hipotensión, mareos, pérdida de cabello, cefaleas y alucinaciones.

Además, los agonistas del receptor de dopamina no están indicados para las mujeres que sufren enfermedades cardiovas-culares o hipertensión. Otra desventaja de la bromocriptina es su vida media breve, por lo cual es i necesario ingerirla 4-6 veces al día durante un período de 14 días.

Por lo tanto, los inventores esperan que los anticuerpos neutralizadores de PRLR sean adecuados para la inhibición de la lactancia. En una publicación anterior un antisuero generado contra PRLR parcialmente parificado se dio a ratas lactantes. Se especuló que el antisuero llevara a la inhibición de la lactancia ya que hubo una disminución pequeña en el peso lechigadas (Endocrinology 102:1657-1661 ,1978). Sin embargo los no pudieron excluir que incluso otros mecanismos podrían haber llevado a una reducción leve en el peso de la lechigada. Adicionalmente observaron que el antisuero provocó un aumento en el cuerpo lúteo de las ratas tratadas (Endocrinology 102:1657-1661 ,1978). Esta observación está en claro con-traste con el fenotipo de ratones deficientes de PRLR (Genes Dev 1 1 :167-178, 1997) en los cuales la ovulación no se alteró y en los cuales i ijio se observó aumento en el cuerpo lúteo. Probablemente el antisuero empleado bloqueó algunas moléculas desconocidas adicionales.

Otro objeto de la presente invención es el uso del anticuerpo Mat3 la inhibición de la lactancia.

Hiperplasia prostética benigna La hiperplasia prostética benigna (BPH) es la cuarta afección de la salud más prevalente en los hombres de edad. El agrandamiento de la próstata es una afección progresiva que afecta a más de 50% de los hombres con edades superiores a 50 años. La BPH se caracteriza por la riiperplasia del estroma y las células epiteliales de la próstata, lo que resulta i en la formación de grandes nodulos discretos en la región periuretral de la I próstata, que comprime el canal uretral. Por consiguiente, la interrupción del flujo de orina es una consecuencia importante de la BPH. i A continuación se detallan las terapias convencionales para la BPH. j a) Los antagonistas del receptor adrenérgico D 1 (por ejemplo la tamsulosina, la alfuzosina, la terazosina, la doxazosina) alivian los síntomas de la BPH en el tracto urinario inferior. Disminuyen las obstrucciones a la salida de la vejiga al bloquear la estimulación del músculo liso de la próstata mediada por los receptores alfa. Los efectos colaterales más importantes incluyen efectos adversos relacionados con la vasodilatación, mareos e insuficiencias en la eyaculación. b) Los inhibidores de la 5D-reductasa (p.ej., el finasteride) previenen la formación de dihidrotestosterona, la forma activa de la testosterona en la próstata, que es responsable del agrandamiento de la próstata. Los efectos colaterales más importantes incluyen las disfunciones sexuales, tales como los trastornos eréctiles y la libido disminuida. c) La resección transuretral de la próstata (TURP) es un tratamiento quirúrgico que está asociado a una morbilidad elevada. Los efectos colaterales incluyen las hemorragias, la incontinencia, la formación de obstrucciones, la pérdida de eyaculación y las perforaciones en la vejiga. d) La colocación de stents en la próstata. Se inserta un stent en la parte prostética de la uretra para ga-rantizar un flujo apropiado de orina. Los efectos colaterales más importantes incluyen las incrustaciones, las infecciones en el tracto urinario y la migración del stent. Más aún, es necesario retirar los stents antes de realizar cualquier manipulación transuretral.

Como se describió para la glándula mamaria, la PRL y el PRLR actúan en una vía autocrina/paracrina (J. Clin. Invest. 99:618 pp. 1997) en la próstata.

| En estudios clínicos, se ha demostrado que la hiperprolactinemia (y la acromegalia) está asociada al agrandamiento de la próstata y a la acumulación de células inflamadas en el estroma. La hormona de crecimiento humana puede unirse al PRLR humano en presencia de cinc, con lo que podría explicarse por qué la acromegalia puede dar como resultado una hiperplasia prostática benigna. Los niveles de PRL en el suero frecuentemente son elevados en los pacientes con BPH.

Los animales transgénicos donde se sobreexpresa el gen de la PRL de manera ubicua desarrollan una hiperplasia severa en el estroma de la próstata, lo que refleja que la PRL es un factor patofisiológico importante para el desarrollo de la hiperplasia prostática (Endocrinology 138:4410 pp. 1997). Además, la sobreexpresión local de la prolactina en los ratones i transgénicos bajo el control del promotor de la probasina específico de la próstata da como resultado una expansión del estroma, una acumulación de células inflamatorias y una displasia epitelial focal, que son las características básicas de la BPH en los seres humanos (Endocrinology 144:2269 pp. 2003).

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo Mat3 ó fragmentos de unión a antígeno como se describe en la presente invención para el tratamiento de hiperplasia prostética benigna.

Terapia hormonal combinada Para el tratamiento de sofocos en mujeres postmenopáusicas que aún tienen útero, se usaron combinaciones de estrógeno (estradiol, o estrógeno equino conjugado = CEE) y progestinas (p.ej. acetato de n edroxiprogesterona (MPA), progesterona, drospirenona, levonorgestrel). i Üas progestinas tienen que ser agregadas para inhibir la proliferación de células epiteliales uterinas activadas por estradiol. Sin embargo, el agregado de progestinas aumenta la proliferación de células epiteliales mamarias. Debido a que ambas, células normales así como células cancerosas de epitelio mamario responden con proliferación al tratamiento combinado de estrógeno más progestina, se encontró aumentado el riesgo relativo de cáncer de mama luego del tratamiento con CEE más MPA (JAMA 233:321-333;2002).

El anticuerpo de la presente invención resuelve el problema para tratar la proliferación potenciada de células epiteliales de mama observada durante la terapia combinada de hormonas.

¡ Otro objeto de la presente invención es el uso del anticuerpo n utralizador Mat3 contra PRLR o fragmentos de unión a antígeno en terapia combinada de hormonas (es decir terapia de estrógeno + progestina) para i inhibir la proliferación de células de epitelio mamario. i I ! Pérdida de cabello El tratamiento para la pérdida de cabello aún es una necesidad no satisfecha. Crecimiento del cabello en el cuero cabelludo en ciclos: la fase ánágena se caracteriza por crecimiento activo del cabello; la fase catágena i muestra involución y es seguida por la fase telógena (reposo). La fase éxógena (la liberación del cabello muerto) coincide con el fin de la fase telógena. La pérdida de cabello puede ser la consecuencia de un crecimiento alterado del cabello en cualquier fase.

La pérdida de cabello telogénica puede tener diversos desencadenantes (el estrés fisiológico y emocional, las afecciones médicas, las deficiencias de hierro y de cinc). Vale destacar que, en sus primeras etapas, la alopecia androgénica se caracteriza por una pérdida de cabello telogénica (Cleveland clinic journal of medicine 2009; 76:361-367). La pérdida de cabello anagénica frecuentemente es la consecuencia de la radiación o de la quimioterapia.

| Para el tratamiento de la pérdida de cabello androgénica, suele i usarse minoxidil y finasteride. Para la alopecia areata, suelen usarse glucocorticoides. En general, todos estos tratamientos tienen efectos colaterales (finasteride: pérdida de libido e impotencia en los hombres, I glucocorticoides: diabetes, ganancia de peso, osteoporosis), por lo que todavía no ha sido posible solucionar completamente el problema de la pérdida de cabello.

Se han realizado experimentos de afeitado en roedores adultos para analizar el efecto de los compuestos sobre la pérdida de cabello, mediante el uso del crecimiento de nuevo cabello en el área afeitada como paradigma de lectura (British Journal of dermatology 2008; 159:300-305). El afeitado de los animales adultos (cuyo cabello suele hallarse en la fase telogénica) induce la fase anagénica, que se caracteriza por el crecimiento del cabello. i Se ha encontrado que la prolactina y el PRLR se expresan en los fplículos pilosos. De los datos de expresión se sugirió que la interferencia con i Ib señalización mediada por PRLR podría ser útil contra la pérdida de cbabello, pero no mostraron datos funcionales para probar esta hipótesis ¿Aktuelle Dermatologie 31 :109-116,2005).

El anticuerpo de la presente invención resuelve el problema de proveer nuevos tratamientos para la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica en mujeres y hombres.

' Por lo tanto otro aspecto de la presente invención es emplear el anticuerpo Mat3 o fragmentos de unión a antígeno para el tratamiento o prevención de pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica. i Tratamiento y prevención del cáncer de mama resistente a ! Se ha sugerido que el PRLR se sobreexpresa en cáncer de mama en humanos (J Clin Endocrinol Metab 83:667-674,1998) y que la interferencia negativa con la interacción PRL-PRLR podría tener un impacto positivo en el tratamiento de cáncer de mama (Int. J. Cáncer: 55(5): 712-721 , 1993). Existe évidencia, que en general, los niveles de prolactina en plasma se correlacionan con el riesgo de cáncer de mama (Cáncer Lett 243:160- 169,2006). En pacientes con cáncer de mama resistente a tamoxifeno, el desarrollo de la enfermedad progresiva se correlaciona con los niveles prolactina en plasma (Eur J Surg Oncol 20:118-121 ,1994). Los ratones transgénicos que sobreexpresan prolactina son más propensos al desarrollo I ele cáncer de mama (J Clin Invest 00:2744-2751 ,1997).

' Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo Mat3 0 fragmentos de unión a antígeno como se describe en la presente invención para el tratamiento o prevención de cáncer de mama resistente a antiestrógenos.

Definiciones 1 El antígeno blanco, el "PRLR" humano, como se lo usa en la presente, hace referencia a un polipéptido humano que tiene I sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos en su dominio éxtracelular que los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210 de SEQ ID N° 12 y las variantes alélicas y/o de separación naturales de ésta. El "ECD del PRLR", como se lo usa en la presente, hace referencia a la porción éxtracelular del de PRLR que está representada por los ami-noácidos mencionados con anterioridad. Además, el PRLR humano blanco también abarca las versiones mutadas del receptor, tales como la mutación de activación I146L, descripta por Paul Kelly (Proc Nati Acad Sci USA, I i 05(38): 14533-14538,2008; y una comunicación oral, Turín, 2007). i El antígeno blanco, "PRLR" de mono, como se usa en la presente hace referencia a un polipéptido de macaco así como de mono cangrejero que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos en su dominio extracelular que las posiciones de aminoácidos entre 1 y 210 de SEQ ID NO. 11 y las variantes alélicas y/o de corte y empalme de origen I natural de las mismas. El "ECD de PRLR" como se usa en la presente hace i referencia a la porción extracelular de PRLR representado por los i aminoácidos mencionados anteriormente.

El antígeno blanco murino o de ratón "PRLR" como se usa en la presente hace referencia a un polipéptido murino que tiene sustancialmente lá misma secuencia de aminoácidos en su dominio extracelular que las i posiciones de aminoácidos entre 1 y 210 de SEQ ID NO. 13 y las variantes i alélicas y/o de corte y empalme de origen natural de las mismas. El "ECD de PRLR" como se usa en la presente hace referencia a la porción extracelular de PRLR representado por los aminoácidos mencionados anteriormente.

Como se la usa en la presente, la frase "cantidad eficaz para el uso terapéutico" hace referencia a una cantidad de un anticuerpo terapéutico o profiláctico que sería apropiada para provocar el efecto o la respuesta i terapéutica o profiláctica deseada, lo que incluye el alivio de algunos o la l totalidad de los síntomas de la enfermedad o la reducción de la predisposición a la enfermedad, cuando se la administra de acuerdo con el régimen de tratamiento deseado.

Como se lo usa en la presente, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un antígeno (en este caso, el PRLR), que "presenta especificidad" por él o que lo "reconoce específicamente" cuando dicho anticuerpo es capaz de discriminar entre dicho antígeno y uno o más antígenos de referencia, ya que la especificidad de la unión no es una I propiedad absoluta, sino relativa. En su forma más general (y cuando no se menciona una referencia definida), la "unión específica" hace referencia a la capacidad del anticuerpo de discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, lo cual puede determinarse, p.ej., de acuerdo con uno de los métodos que se describen a continuación. Los métodos comprenden, sin limitaciones, las transferencias Western, las pruebas de ELISA, RIA, ECL e IRMA y los análisis de péptidos. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo de ELISA convencional. La calificación puede llevarse a cabo mediante el desarrollo de color (p.ej., con un anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano con picante y tetrametil benzidina con peróxido de I hidrógeno). La reacción en determinadas cavidades se califica en función de lá densidad óptica, p.ej., a 450 nm. El valor de fondo típico (que equivale a la reacción negativa) puede ser de 0,1 OD. Una reacción positiva típica puede ser de 1 OD. Esto implica que la diferencia entre el positivo y el negativo p!uede ser de más de 10 veces. Típicamente, la determinación de la es- pecificidad de la unión se efectúa usando no solamente un antígeno de referencia, sino más bien un conjunto de aproxi-madamente tres a cinco antígenos no relacionados, tales como la leche en polvo, la BSA, la transferrina o semejantes.

Sin embargo, la "unión específica" también puede hacer referencia a la capacidad de un anticuerpo de discriminar entre el antígeno blanco y uno o antígenos relacionados estrechamente, los cuales se usan como puntos de referencia. Adicionalmente, la "unión específica" puede estar relacionada con la capacidad de un anticuerpo de discriminar entre distintas partes de su antígeno blanco, por ejemplo, distintos dominios, subdominios o regiones del PRLR, tales como los epitopes en la región del extremo N o el extremo C del i i ECD del PRLR, o entre uno o más residuos de aminoácidos o extensiones de residuos de aminoácidos fundamentales del ECD del PRLR.

La KD de la "afinidad" o de la "afinidad de unión" frecuentemente se determina midiendo la constante de asociación en equilibrio (ka) y la constante de disociación en equilibrio (kd) y calculando el cociente entre la kd y la ka (KD = kd/ka). Los términos "inmunoespecífico" y "caracterizado por i una unión específica" denotan que el anticuerpo se une al PRLR o a su ECD con una KD de afinidad menor o igual que 10"6 M (una afinidad monovalente).

El término "afinidad elevada" denota que la KD de afinidad con la que se une el anticuerpo al PRLR o a su ECD con es menor o igual que 10"7 M (una afinidad monovalente). El anticuerpo puede presentar una afinidad sustáncialmente mayor por el antígeno blanco que por otras moléculas no rjelacionadas. El anticuerpo también puede presentar una afinidad sustancialmente mayor por el antígeno blanco que por sus homólogos, por ejemplo, una afinidad relativa al menos 1 ,5 veces, 2 veces, 5 veces 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces mayor por el antígeno blanco, o incluso mayor. Estas afinidades pueden ser determinadas con facilidad usando técnicas convencionales, tales como la diálisis en equilibrio, con el instrumento BIAcore 2000, de acuerdo con los i procedimientos generales provistos por el fabricante, con un radioinmunoensayo, usando un antígeno blanco radiomarcado, o con otro método conocido por aquellos versados en la técnica. Los datos de la afinidad pueden analizarse, por ejemplo, con el método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51 :660 (1949).

Como se la usa en la presente, la frase "los anticuerpos antagonizán ? la señalización mediada por la prolactina" hace referencia a un bloqueo de la I activación del receptor de prolactina por los anticuerpos de la presente invención, lo que da como resultado una inhibición completa de la señalización mediada por el receptor de prolactina.

Como se la usa en la presente, la frase "los anticuerpos compiten por la unión" hace referencia a una competición de un anticuerpo con un segundo ligando por la unión al receptor de prolactina.

El término "anticuerpo" se usa en su sentido más amplio e incluye los anticuerpos completamente ensamblados, los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos), los fragmentos de anticuerpos que pueden unirse al antígeno (por ejemplo, los fragmentos Fab', F'(ab)2 o Fv, los anticuerpos de cadena simple, los diacuerpos), los cuerpos de camello y los péptidos recombinantes que abarcan los anteriores, con la condición de que presenten la actividad biológica deseada. Los anticuerpos pueden presentan i distintos dominios constantes (dominios Fe) en su cadena pesada, que I preferiblemente derivan de los isotipos lgG1 , lgG2 o lgG4 (véase la descripción más adelante). Pueden introducirse mutaciones para modificar i | las funciones efectoras. Se han identificado residuos de aminoácidos en el dominio Fe que cumplen una función dominante en las interacciones entre la proteína complementaria C1q y los receptores Fe, y se han descripto mutaciones que influyen en las funciones efectoras (para hallar una revisión, véase Labrijn et al., Current opinión in Immunology 20:479-485, 2008). En particular, es posible realizar la aglicoilación de lgG1 por medio de una mutación de asparagina en alanina o de asparagina en glutamina en el aminoácido en la posición 297. Se ha informado que esta mutación anula la mediada por células (ADCC) derivada del anticuerpo (Sazinsky ef al., Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (51 ): 20169, 2008; Simmons et al., J. of Immunological Methods 263:133-147, 2002). El reemplazo de lisina por i alanina en la posición 322 da como resultado una reducción en la ADCC y la remoción de la citotoxicidad derivada del complemento (CDC), mientras que el reemplazo simultáneo de dos leucinas en las posiciones 234 y 235 por álaninas permite evitar la ADCC y la CDC [Hezareh et al., J. of Virology, 75 (24):12161-12168, 2001]. Con el objeto de aplicar isotipos lgG4 como agentes terapéuticos bivalentes in vivo que retengan la avidez, podrá introducirse una modificación en forma de un intercambio de serina por I prolina en la "región de la bisagra principal" (Schuurman, J. et al. Immunology 97:693-698, 1999). La tendencia de las moléculas de lgG2 humanas a formar dimeros covalentes heterogéneos puede evitarse cambiando una de las cisternas en las posiciones 127, 232 y 233 por serina (Alien et al., Biochemistry, 2009, 48 (17), pp. 3755-3766). Un formato alternativo con una i función efectora reducida puede ser el formato lgG2m4, que deriva de una lgG2 que contiene cuatro cambios por residuos de aminoácidos específicos de la lgG4 (An et al., mAbs 1 (6), 2009). Es posible producir fragmentos de anticuerpos con técnicas de ADN recombinante o mediante la escisión enzimática o química de los anticuerpos intactos, lo cual se describirá con mayor detalle más adelante. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos rhonoclonales incluyen los anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados y humanos, así como las inmunoglobulinas humanas modificadas, las proteínas de fusión quiméricas que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulinas, las muteínas o los derivados de éstas, cada uno de los duales se describirá con mayor detalle más adelante. También se los multímeros o los agregados de moléculas intactas y de fragmentos de éstas, incluyendo los anticuerpos modificados por medios químicos.

¡ El término "anticuerpo monoclonal", como se lo usa en la presente, rjace referencia a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, una población de anticuerpos individuales que son idénticos, excepto por las posibles ilutaciones naturales que pudiera haber presentes en cantidades menores. i Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra determinantes (epitopes) diferentes, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque son sintetizados en un cultivo, homogéneo, es decir, no están contaminados con otras inmunoglobulinas, que podrían tener especificidades y características diferentes.

El adjetivo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo: se lo ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. No restringe la producción del anticuerpo a un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que pueden usarse pueden ela-borarse con el método de los hibridomas, que fue descripto por primera vez por Kohler et I al., Nature, 256:495, 1975, o pueden elaborarse con métodos de ADN recombinante (véase, p.ej., la Patente de los EE.UU. N° 4816567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser, por ejemplo, anticuerpos recombinantes, quiméricos, humanizados o humanos modificados, así como fragmentos de anticuerpos.

Una "inmunoglobulina" o un "anticuerpo nativo" hacen referencia a una glicoproteína tetramérica. En una inmunoglobulina natural, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, donde cada par tiene una cadena "liviana" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción del extremo amino de cada cadena incluye una región "variable" de aproximadamente entre 100 y 110 aminoácidos, o más, que es la responsable primaria del reconocimiento del antígeno. La porción del extremo carboxilo de cada cadena define una región constante que es la responsable primaria de la función efectora. Las inmunoglobulinas pueden i separarse en distintas clases en función de la secuencia de aminoácidos del I dominio constante de sus cadenas pesadas. Las cadenas pesadas se clasifican como mu (µ), delta (?), gamma (?), alfa (a) y épsilon (e) y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. i Además, varias de éstas pueden ser divididas en subclases o isotipos, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgAl e lgA2. Los distintos isotipos pueden tener funciones efectoras diferentes; por ejemplo, los isotipos lgG1 e lgG3 frecuentemente presentan actividad de ADCC. Las cadenas livianas i humanas se clasifican como cadenas livianas kappa (K) y lambda (?). Dentro dé las cadenas livianas y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J", de aproximadamente 12 aminoácidos o más, donde la cadena pesada también incluye una región "D" de i aproximadamente 10 aminoácidos o más. Véase en general Fundamental Immunology, capítulo 7 (Paul, W., editor, 2A edición, Raven Press, N.Y. "fragmento funcional" o un "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo/una inmunoglobulina se definen en la presente como un fragmento de anticuerpo/inmunoglobulina (p.ej., una región variable de una Ig'G) que retiene la región de unión al antígeno. La "región de unión al antígeno" de un anticuerpo típicamente se halla en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo, es decir, las regiones CDR 1, 2 y/o 3. Sin embargo, las regiones variables "del marco" también pueden cumplir una función importante en la unión al antígeno, p.ej., al proveer un andamiaje para las CDR. Preferiblemente, la "región de unión al antígeno" comprende al menos los residuos de aminoácidos 4 a 103 de la cadena liviana variable (VL) y los residuos de aminoácidos 5 a 109 de la cadena pesada variable más preferiblemente los residuos de aminoácidos 3 a 107 de la VL y los residuos de aminoácidos 4 a 111 de la VH, y en particular, particularmente las cadenas VL y VH completas [los aminoácidos en las posiciones 1-109 de la VL y en las posiciones 1-1 13 de la VH; la numeración de las posiciones de los aminoácidos se realiza de acuerdo con la base de datos de Kabat (Johnson y Wu, Nucleic Acids Res., 2000, 28, 214-218)]. Una clase preferida de inmunoglobulinas que pueden usarse en la presente invención es la de la IgG.

¡ El término "región hipervariable" hace referencia a los residuos de I aminoácidos de los dominios variables VH y VL de un anticuerpo o de un i fragmento funcional de un anticuerpo que son responsables de la unión al ahtígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos de la "región de determinación de la complementanedad" o CDR [es decir, los residuos 24-34 (LCDR1 ), 50- 56 (LCDR2) y 88-97 (LCDR3) en el dominio I variable de la cadena liviana y los residuos 29-36 (HCDR1 ), 48-66 (HCDR2) y 93-102 (HCDR3) en el dominio variable de la cadena pesada, como se ilustra en la figura 12] y/o los residuos de un rizo hipervariable [es decir, los residuos 26-32 (dentro de LCDR1 ), 50-52 (dentro de LCDR2) y 91 -96 (dentro d¡e LCDR3) en el dominio variable de la cadena liviana y los residuos 26-32 (¿entro de HCDR1 ), 53- 55 (dentro de HCDR2) y 96-101 (dentro de HCDR3) I en el dominio variable de la cadena pesada, como se describe en Chotia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].

Los ejemplos no limitativos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, los dominios de anticuerpos (dAb), los fragmentos de las regiones de determinación de la complementanedad (GDR), los anticuerpos de cadena simple (scFv), los fragmentos de i anticuerpos de cadena simple, los diacuerpos, los triacuerpos, los tétracuerpos, los minicuerpos, los anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Ehg.,8(10):1057-1062 (1995)), los anticuerpos recombinantes quelantes, los tricuerpos, los bicuerpos, los intracuerpos, los nanocuerpos, los inmunofármacos modulares pequeños (SMIP), las proteínas de fusión de dominios de unión al antígeno con inmunoglobulinas, los anticuerpos camelizados, los anticuerpos que contienen VHH, las muteínas o los derivados de éstas y los polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferirle al polipéptido la capacidad de unirse de manera específica al antígeno, tal como una secuencia de la CDR, con la condición de que el anticuerpo retenga la actividad biológica deseada, así como los anticuerpos multiespecíficos que pueden formarse a partir de fragmentos de anticuerpos (C. A. K Borrebaeck, i eclitor (1995), Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), i Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editores (2001), Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Ha de interpretarse que un anticuerpo que no es un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene todos los sitios de unión idénticos. Podrían diseñarse fragmentos F(ab')2 o Fab para minimizar o eliminar por completo las interacciones intermoleculares mediadas por los enlaces disulfuro que pudieran aparecer entre los dominios CHi y CL. Mediante la digestión de los anticuerpos con papaína, se producen dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, que se denominan fragmentos "Fab", cada uno de los cuales tiene un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual "Fe", cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizarse con facilidad. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento F(ab')2 que tiene dos fragmentos "Fv". Un fragmento "Fv" es el fragmento mínimo de un anticuerpo que contiene un sitio completo para reconocer al antígeno y unirse a él. Esta región consiste eiji un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la i cadena liviana, asociados estrechamente a través de enlaces no covalentes. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL.

Ei|i conjunto, las seis CDR le confieren especificidad a la unión al antígeno I del anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un fragmento Fv que comprenda tan solo tres CDR específicas para un antígeno) tendrá la capacidad de reconocer el antígeno y unirse a él.

| Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena simple", "sFv" o "scFv" comprenden los dominios de la VH y la VL del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica.

Preferiblemente, el polipéptido Fv también comprende un conector polipeptídico entre los dominios de la VH y la VL, que permite que el I fragmento Fv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para hallar una revisión de los fragmentos sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, j ¦ editores, Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994). i ! El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de la bisagra del anticuerpo. i Fab'-SH es la designación que se le da en la presente a aquellos fragmentos Fab' donde uno o más residuos de cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de los anticuerpos F(ab')2 fueron producidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas entre ellos.

Los residuos "del marco" o FR son aquellos residuos del dominio ? variable que no son los residuos de la región hipervariable.

| La frase "región constante" hace referencia a la porción de la molécula del anticuerpo que confiere las funciones efectoras.

Los términos "muteína" y "variante" pueden usarse indistintamente y hacen referencia a la secuencia polipeptídica un anticuerpo que contiene al mjenos una sustitución, supresión o inserción de aminoácidos en la región variable o en una porción equivalente a la región variable, con la condición i dé que la muteína o la variante retengan la afinidad de unió o la actividad biológica deseada.

Las muteína pueden ser sustancialmente homologas o sustancialmente idénticas al anticuerpo progenitor.

El término "derivados" hace referencia a aquellos anticuerpos que han sido modificados por medios covalentes, p.ej., con procedimientos como la ubiquitinación, la conjugación con agentes terapéuticos o de diagnóstico, el marcado (p.ej., con radionucleidos o con diversas enzimas), la unión covalente de polímeros, tal como el tratamiento con PEG (la derivatización con polietilenglicol), y la inserción o la sustitución de aminoácidos nativos por i aminoácidos no naturales por medio de una síntesis química.

Un anticuerpo "humano" o un fragmento funcional de un anticuerpo humano se definen en la presente como un anticuerpo que no es quimérico o "humanizado" y que no proviene (por completo o en parte) de una especie no humana. Un anticuerpo humano o un fragmento funcional de un anticuerpo humano pueden derivar de un anticuerpo humano o pueden ser anticuerpos humanos sintéticos. Un "anticuerpo humano sintético" se define en la presente como un anticuerpo que tiene una secuencia que deriva por cdmpleto o en parte de secuencias sintéticas a través de procedi-mientos in silico, que se basan en el análisis de secuencias de anticuerpos humanos conocidos. El diseño in silico de la secuencia de un anticuerpo humano o de un fragmento de éste puede efectuarse, p.ej., analizando una base de datos de secuencias de anticuerpos humanos o de fragmentos de éstos y concibiendo una secuencia polipeptídica mediante el uso de los datos obtenidos. Otro ejemplo de un anticuerpo humano o de un fragmento funcional de un anticuerpo humano es uno que es codificado por un ácido nucleico que ha sido aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de origen humano (es decir, una biblioteca basada en anticuerpos tomados de una fuente humana natural). Los ejemplos de anticuerpos humanos incluyen los anticuerpos basados en n-CoDeR, que fueron descriptos por Carlsson y Sóderlind, Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1 ), 102-108 (2001), y por i Sóderlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000), así como en la Patente de humanizado" o un fragmento funcional de un anticuerpo humanizado se definen en la presente como un anticuerpo (i) que i deriva de una fuente no humana (por ejemplo, un ratón transgénico que tiene i un sistema inmune heterólogo), donde el anticuerpo está basado en la línea i germinal humana, o (ii) que tiene CDR injertadas, donde las CDR del dominio y 'murinos, generalmente regiones constantes humanas y regiones variables de ratón.

Los anticuerpos "humanos modificados" se generan alterando la secuencia progenitora de acuerdo con los métodos que se detallan en Studnicka et al., Patente de los EE.UU. N° 5766886, por ejemplo, como en los anticuerpos que se representan en SEQ ID N° 14 y 15 y los qué se describen en la solicitud de patente WO08/022295. i ¡ Un anticuerpo de la invención puede derivar de una biblioteca de genes de anticuerpos recombinantes. El desarrollo de tecnologías para preparar repertorios de genes de anticuerpos humanos recombinantes y para presentar los fragmentos de anticuerpos codificados en la superficie de bacteriófagos filamentosos ha permitido elaborar y seleccionar directamente anticuerpos humanos, lo cual también puede aplicarse a los anticuerpos humanizados, quiméricos o murinos o a las muteínas. Los anticuerpos que se elaboran con esta tecnología basada en fagos se producen como una función efectora. Típicamente, el fragmento Fd (VH-CH1 ) y la cadena liviana (VL-CL) de los anticuerpos son clonados por separado por PCR y son recombinados de manera aleatoria en bibliotecas de combinación presentadas en fagos, en las que posteriormente puede realizarse la selección en función de la unión a un antígeno particular. Los fragmentos Fáb se expresan en la superficie del fago, es decir, se unen físicamente a los genes que los codifican. Por consiguiente, la selección de los fragmentos a través de la unión a los antígenos también permite seleccionar las secuencias que codifican los fragmentos Fab, que luego pueden amplificarse. Al realizarse diversos procedimientos de unión al antígeno y amplificación recurrente, un procedimiento que se conoce como análisis, se incrementa el nivel de los fragmentos Fab con especificidad por el antígeno, i y finalmente se los aisla.

Se ha desarrollado una variedad de procedimientos para obtener anticuerpos humanos de bibliotecas de presentación en fagos. Estas i bibliotecas pueden construirse en un solo marco maestro, en el cual pueden recombinarse diversas CDR formadas in vivo (es decir, no derivadas del ser humano), como se describe en Carlsson y Sóderlind, Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1 ), 102-108 (2001 ), Sóderlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000), y la Patente de los EE.UU. N° 6989250. Como alternativa, esta biblioteca de anticuerpos podrá basarse en secuencias de aminoácidos que hayan sido diseñadas in silico y que estén codificadas por ácidos nucleicos creados por medios sintéticos. El diseño in silico de la secuencia de un anticuerpo se efectúa, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias humanas y I concibiendo una secuencia polipeptídica mediante el uso de los datos obtenidos. Se describen métodos para diseñar u obtener secuencias creadas in silico, p.ej., en Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57, Krebs et al., J.

Immunol. Methods (2001) 254:67, y la Patente de los EE.UU. N° 6300064.

Para hallar una revisión de las técnicas de presentación en fagos, véase í WO08/022295 (Novartis). i ¡ Como alternativa, un anticuerpo de esta invención puede provenir de arómales. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado o un anticuerpo human modificado, como se resume en WO08/022295 (Novartis). i El| anticuerpo puede provenir de animales transgénicos [véase también Vvjo08/022295 (Novartis)].

Como se las usa en la presente, las distintas "formas" de un antígeno, por ejemplo, el PRLR, se definen en la presente como las distintas moléculas proteicas que son el resultado de distintas modificaciones que I ocurren durante la traducción y después de la traducción, tales como, sin limitaciones, las diferencias en la separación del transcripto primario del i receptor de prolactina, las diferencias en la glicosilación y las diferencias en la escisión proteolítica posterior a la traducción.

Como se lo usa en la presente, el término "epitope" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse de manera específica a una i inmunoglobulina o a un receptor en una célula T. Los determinantes competitiva, que puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquiera de los i métodos que son bien conocidos en la técnica, y cuando los dos anticuerpos se unen a la totalidad de los aminoácidos del epitope.

Los términos "anticuerpos maduros" y "fragmentos de unión al antígeno maduros", por ejemplo, las variantes de los fragmentos Fab maduros, incluyen los derivados de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo que presentan una unión más fuerte a un antígeno dado, tal como el dominio extracelular del PRLR, es decir, que se unen a él con una mayor afinidad. La maduración es el proceso en el que se identifica una pequeña cantidad de mutaciones dentro de las seis CDR de un anticuerpo o de un i fragmento de anticuerpo que dan como resultado este incremento en la afinidad. El proceso de maduración es la combinación de métodos de biología molecular que permiten introducir mutaciones en el anticuerpo y analizar e identificar los miembros de unión mejorados. j Métodos terapéuticos I Los métodos terapéuticos comprenden administrarle al sujeto que necesita el tratamiento una cantidad eficaz para el uso terapéutico de un anticuerpo contemplado en la invención. En la presente, una "cantidad eficaz i para el uso terapéutico" se define como una cantidad de un anticuerpo que i es suficiente para bloquear la proliferación de las células positivas para el PRLR en el área tratada del sujeto, que puede administrarse como una sola dosis o de acuerdo con un régimen de múltiples dosis, por sí sola o en combinación con otros agentes. Esto puede dar como resultado el alivió de uijia condición adversa, pero la cantidad debe ser tolerable desde el punto de vista toxicológico. El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano (por ejemplo, un conejo, una rata, un ratón, un mono u otro primate de un orden inferior).

Es posible administrar un anticuerpo de la invención de manera concurrente con medicamentos conocidos, y en algunos casos, es posible modificar el propio anticuerpo. Por ejemplo, sería posible conjugar el anticuerpo con una inmunotoxina o un radioisótopo para potencialménte incrementar aún más la eficacia. í ¡ Los anticuerpos de la invención pueden usarse como herramienta terapéutica o de diagnóstico en una variedad de situaciones donde el PRLR se exprese en un nivel indeseablemente elevado. Los trastornos y las afecciones que son particularmente susceptibles al tratamiento con los anticuerpos de la invención son la endometriosis, la adenomiosis, la anticoncepción de la fertilidad femenina no hor-monal, la enfermedad terapia hormonal combinada, con el fin de inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario.

Para tratar cualquiera de los trastornos precedentes, las composiciones farmacéuticas que han de usarse de acuerdo con la presente inyención pueden formularse de manera convencional, mediante el uso de i uno o más vehículos o excipientes aceptables para aplicaciones fisiológicas. i Un anticuerpo de la invención puede administrarse por cualquier medio apropiado, que puede variar en función del tipo de trastorno que se desea tratar. Las rutas de administración posibles incluyen las vías parenteral (por i ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraarterial, ¡ntraperitoneal o I subcutánea), intrapulmonar e intranasal, y si resulta deseable para un tratamiento de inmunosupresión local, la administración intralesional.

Aclemás, un anticuerpo de la invención puede administrarse a través de una infusión en pulsos, por ejemplo, con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosis se administra por inyección, más preferiblemente por inyección intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte del carácter breve o crónico de la administración. La cantidad que ha de administrarse depende de una variedad de factores, tales como los síntomas clínicos, el peso del individuo y la administración concurrente de otras drogas. Aquellos versados en la técnica han de reconocer que la ruta de administración variará en función del trastorno o la afección que se desee tratar.

La determinación de una cantidad eficaz para el uso terapéutico del pólipéptido novedoso de acuerdo con esta invención dependerá en gran medida de las características del paciente particular, de la ruta de administración y de la naturaleza del trastorno que se desee tratar. Pueden hallarse lineamientos generales, p.ej., en las publicaciones de la Conferencia I Internacional para la Armonización y en Remington's Pharmaceutical I Sciences, capítulos 27 y 28, pp. 484-528 (18a edición, Alfonso R. Gennaro, I editor, Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Más específicamente, la i determinación de la cantidad eficaz para el uso terapéutico dependerá de factores como la toxicidad y la eficacia del medicamento. La toxicidad puede determinarse con métodos bien conocidos en la técnica, que pueden hallarse eri las referencias precedentes. La eficacia puede determinarse empleando los mismos lineamientos, en conexión con los métodos que se describirán en los ejemplos más adelante.

Composiciones farmacéuticas y administración La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que pueden comprender anticuerpos contra el PRLR solos o eri combinación con al menos un agente adicional, tal como un compuesto estabilizador, que pueden administrarse en cualquier vehículo farmacéutico estéril biocompatible, incluyendo, sin limitaciones, la solución salina, la d xtrosa y el agua. Cualquiera de estas moléculas podrá administrársele a un paciente por sí sola o en combinación con otros agentes, drogas u hormonas, en composiciones farmacéuticas donde se la mezcle con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una forma de realización de la presente invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable es inerte desde el punto de vista farmacéutico.

I i La presente invención también se relaciona con la administración de i las composiciones farmacéuticas. Esta administración se efectúa por vía párenteral. Los métodos para efectuar la administración parenteral incluyen la administración tópica, intraarterial (directamente en el tumor), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina o intranasal. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas podrán contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprendan excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos, con el fin dé obtener preparaciones que puedan usarse en aplicaciones farmacéuticas. Pueden hallarse detalles adicionales sobre la formulación y la administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (editado por Maack Publishing Co., Easton, Pa.). j Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen las soluciones acuosas de los compuestos activos. Para la inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores compatibles con aplicaciones fisiológicas, tales como la solución de Hank, la solución de Ringer o la solución salina amortiguada de uso fisiológico. Las suspensiones acuosas inyectables podrán contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como la carboximetil celulosa de sodio, el sorbitol o el dextrano. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas inyectables apropiadas. Los solventes o los vehículos lipofílicos apropiados los aceites grasos, tales como el aceite de sésamo, los ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como el oleato de etilo o los triglicéridos, o los liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes apropiados para incrementar la solubilidad de los compuestos, con el objeto de facilitar la preparación de soluciones altamente concentradas.

Para la administración tópica o nasal, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera particular que se desea atravesar. Estos penetrantes generalmente son conocidos en la técnica.

La administración parenteral también comprende métodos de administración parenteral que también incluyen la administración intraarterial, intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, j intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, vaginal o intranasal.

Conjuntos de elementos La invención también se relaciona con lotes farmacéuticos y conjuntos de elementos comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención que se mencionaron con anterioridad. En estos recipientes podrá haber una indicación donde se señale la aprobación de la manufactura, el uso y la comercialización del producto para la administración a los seres humanos por la¡ agencia gubernamental correspondiente, responsable de la regulación de la' manufactura, el uso y la comercialización de fármacos o productos i biológicos. i ! En otra forma de realización, los conjuntos de elementos pueden contener secuencias de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Preferiblemente, las secuencias de ADN que codifican estos anticuerpos se proveen en un plásmido apropiado para transfectar y expresar en una célula huésped. El plásmido puede contener un promotor (frecuentemente un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula huésped.

ElJ plásmido también puede contener sitios de restricción para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN en el plásmido, con el propósito de terminación y semejantes.

Manufactura y almacenamiento Las composiciones farmacéuticas de la presente invención podrán manufacturarse de una manera que sea conocida en la técnica, p.ej., con procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, captura o lió Ifilización.

La composición farmacéutica puede proveerse como un polvo i liofilizado en histidina 1 mM-50 mM, con 0,1 %-2% de sacarosa y 2%-7% de I m|anitol, con un pH en el rango de entre 4,5 y 5,5, que puede combinarse con un amortiguador antes de usarlo.

Una vez completa la elaboración de las composiciones farmacéuticas qiie comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo aceptable, es posible colocarlas en un recipiente apropiado, con instrucciones para el tratamiento de una afección indicada. Para administrar los anticuerpos contra el PRLR, en estas instrucciones puede detallarse la cantidad, la frecuencia y el método de administración.

Dosis con eficacia terapéutica ¡ Las composiciones farmacéuticas que son apropiadas para usar en i la presente invención incluyen aquellas composiciones donde los ingredientes activos están presentes en una cantidad eficaz para el propósito deseado, es decir, el tratamiento de un estado de enfermedad particular I caracterizado por la expresión del PRLR. La determinación de una dosis eficaz está dentro del alcance de aquellos versados en la técnica.

Para cualquier compuesto, la dosis con eficacia terapéutica puede estimarse inicialmente en ensayos en cultivos celulares, por ejemplo, en células de linfoma, o en modelos en animales, usualmente ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o simios. También puede usarse un modelo en un aijiimal para determinar el rango de concentración y la ruta de administración ! deseados. Posteriormente, esta información puede usarse para determinar i las dosis y las rutas útiles para la administración en seres humanos.

La dosis con eficacia terapéutica hace referencia a la cantidad de una proteína, de un anticuerpo contra ella o de un antagonista o un inhibidor de dicha proteína que permite mejorar los síntomas o la afección. La eficacia i terapéutica y la toxicidad de estos compuestos pueden determinarse de acuerdo con procedimientos farmacéuticos convencionales, en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, a través de la ED50 (la dosis con eficacia terapéutica en 50% de la población) y la LD50 (la dosis letal para 50% de la población). La proporción entre las dosis correspondientes a los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, que puede i expresarse como la proporción ED50/LD5o. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos en los ensayos en cultivos celulares y en los estudios en animales sé usan para formular un rango de dosificación para el uso en los seres humanos. La dosis de estos compuestos preferiblemente se halla en un rango de concentraciones en la circulación que incluyen la ED50, y se caracteriza por una toxicidad escasa o nula. Dentro de este rango, la dosis puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada, de la sensibilidad del paciente y de la ruta de administración.

La dosis exacta es seleccionada por el médico individual, en función del paciente que desea tratar. La dosis y la administración se ajustan para proveer niveles de la unidad activa que son suficientes para mantener el i efecto deseado. Otros factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la severidad del estado de enfermedad, por ejemplo, el tamaño y la localización de las lesiones en el endometrio, la edad, el peso y el género del paciente, la dieta, la duración y la frecuencia de la administración, las combinaciones de drogas, la sensibilidad a la reacción y la y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse con una frecuencia de 3 ó 4 días, una vez por semana, una vez por quincena o una vez por mes, dependiendo de la vida media y la tasa dé eliminación de la formulación particular.

Las dosis normales pueden variar entre 0,1 y 100000 microgramos, dé poder emplear distintas formulaciones para los polinucleótidos y para las proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la administración de los polinucleótidos o los polipéptidos será específica para las células, las afecciones, las localizaciones u otros factores particulares. Las actividades preferidas para un anticuerpo radiomarcado pueden variar entre 0,1 y 10 mCi/mg de proteínas (Riva et al., Clin. Cáncer Res. 5:3275s-3280s, 1999; Wong et al., Clin. Cáncer Res. 6:3855-3863, 2000; Wagner et al., J. Nuclear Ivljed. 43:267-272, 2002).

' La presente invención se describirá con mayor detalle en los ejemplos más adelante. Los ejemplos se proveen exclusivamente para ilustrar la invención en referencia a formas de realización específicas. Si bien en estos ejemplos se ilustran determinados aspectos específicos de la I invención, los ejemplos no han de constituir limitaciones para el alcance de la presente invención. i i Todos los ejemplos fueron puestos en práctica de acuerdo con procedimientos convencionales, que han de ser bien conocidos y de uso convencional para aquellos versados en la técnica, excepto donde se indique lo' contrario y se provea una descripción detallada. Los procedimientos convencionales de biología molecular que se describirán en los ejemplos más adelante pueden ponerse en práctica como se describe en los manuales dé laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición; Coid Spring Harbor Laboratory Préss, Coid Spring Harbor, N.Y., 1989.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Expresión del ARNm de la prolactina (PRL-ARNm) (determinada con un análisis de PCR en tiempo real de TaqMan) en endometrio humano y en lesiones (tejido ectópico) de mujeres saludables y de mujeres que sufren endometriosis.

Figura 2. Expresión del ARNm del receptor de prolactina (PRLR- i ARNm) (determinada con un análisis de PCR en tiempo real de TaqMan) en endometrio humano y en lesiones (tejido ectópico) de mujeres saludables y dé mujeres que sufren endometriosis. j Figura 3A: El anticuerpo Mat3 neutralizador del receptor de prolactina inhibió la ramificación lateral en glándulas mamarias de ratones que han sido I empleados en un modelo de reemplazo hiperprolactinémico de enfermedad mamaria benigna. El anticuerpo inespecífico no tuvo efecto. Los ratones nórmoprolactinémicos sanos (sin pituitaria) mostraron ramificación lateral reducida, mientras que el trasplante de pituitaria (hiperprolactinemia) mejoró la ramificación lateral y el desarrollo lóbuloalveolar. El anticuerpo Mat3 específico actuó como antagonista de los efectos de la hiperprolactinemia.

Figura 3B: El anticuerpo Mat3 neutralizador del receptor de prolactina inhibió la inducción del gen blanco de prolactina elf5 en glándulas mamarias dé ratones en un modelo de reemplazo hiperprolactinémico de enfermedad mamaria benigna. El anticuerpo inespecífico no tuvo efecto. Los ratones normoprolactinémicos sanos (sin pituitaria) mostraron una expresión reducida de elf5 en la glándula mamaria, mientras que el trasplante de pituitaria (h'iperprolactinemia) estimuló fuertemente la expresión del gen elf5. El anticuerpo Mat3 específico actuó como antagonista de los efectos de la hiperprolactinemia pero no el anticuerpo control inespecífico.

¡ Figura 4: Numeración de Kabat de las posiciones de. aminoácidos del marco de trabajo de acuerdo a Johnson y Wu (Nucleic Acids Res. 2000, 28, i 5A: Resultados del análisis por FACS con el anticuerpo anti-PRLR HE06642. La unión del anticuerpo se determinó a una concentración fija en células HEK293 que expresan el PRLR humano y de ratón en comparación con la línea celular parental que no expresa PRLR. Eje Y: #, i mediana de la intensidad de la fluorescencia a 0,37 pg/ml HE06642 como molécula lgG1. *, 1 = HEK293 con PRLR humano; 2 = HEK293 con PRLR I murino; 3 = HEK293 sin PRLR.

I j Figura 5B: Resultados del análisis por FACS con el anticuerpo anti- PRLR Mat3. La unión del anticuerpo se determinó a una serie de cojncentraciones diferentes en células HEK293 que expresan el PRLR humano y células Ba/F que expresan el PRLR de macaco en comparación una línea celular (HEK293) que no expresa PRLR. Las intensidades de señal máximas a las mayores concentraciones de anticuerpo dependen del numero de PRLR expresados en las superficies celulares, es decir las células HEK293 y Ba/F no tienen el mismo número de PRLR en sus superficies. Eje Y: #, mediana de la intensidad de la fluorescencia; eje X: °, diferentes concentraciones en µ9/?t?? del anticuerpo Mat3 como molécula lgG2; *, 1 i (círculos) = HEK293 con PRLR humano; 2 (triángulos) = Ba/F con PRLR de macaco; 3 (cuadrados) = HEK293 sin PRLR.

Figura 6A: Alineamiento de la región de secuencia del dominio Mat3- VL con el segmento V humano más similar identificado en VBASE2 (Mat3-VL i es 90% idéntico a la secuencia de la línea germinal humlGLV056). i 1 Figura 6B: Alineamiento de la región de secuencia del dominio Mat3-VH con el segmento V humano más similar identificado en VBASE2 (Mat3- VrH es 90% idéntico a la secuencia de la línea germinal humlGHV313).

Figura 6C: Alineamiento de la región de secuencia del dominio I HE06642-VL con el segmento V humano más similar identificado en VBASE2 (HE06642-VL es 80% idéntico a la secuencia de la línea germinal humlGKV083).

! Figura 6D: Alineamiento de la región de secuencia del dominio HE06642-VH con el segmento V humano más similar identificado en i VBASE2 (HE06642-VH es 89% idéntico a la secuencia de la línea germinal humlGHV313).

Figura 7: Ensayos de unión basados en ELISA de una variante de Fab madurado: i Se ensayaron los sobrenadantes de E. coli conteniendo Fab para la unión del dominio extracelular inmovilizado del PRLR humano. La figura ilustra la unión de las variantes de Fab como un diagrama de barras. Las i intensidades de la señal (extinción) se dan en los ejes y (#), los nombres de las variantes de Fab (*) en los ejes x. La intensidad de señal elevada de las variantes de Fab madurado 005-C04-20-2 en comparación con el Fab no demuestra una mejor unión a 005-C04. La "variante" pET28 I representa un sobrenadante de una cepa de E. coli que porta el plásmido de expresión de Fab pET28a (Novagen, EMD Chemicals Group, Merck, Darmstadt, Alemania) que no expresa ningún Fab.

! Figura 8: Representación de gráfico de barras de resultados de ELj-ISA Pepscan.

Cada valor graficado representa el valor promedio obtenido para 54 péptidos con S.E.M (error estándar de la media). Las barras negras representan la potencia de unión relativa del anticuerpo HE06642. Las barras I blancas representan la potencia de unión relativa del anticuerpo Mat3. Los datos se normalizaron al promedio para todo el conjunto de datos de 2916 i péptidos y se corrigió para la señal de fondo.

La figura 8A muestra los resultados de ELISA para un subconjunto de péptidos que varían entre los aminoácidos 103-PDPPLELAVEVKQPE-117 ? eje X y 127-WSPPTLIDLKTGWFT-141 (indicado estos péptidos, que fueron desplazados por tres aminoácidos a lo largo de la secuencia de aminoácidos de ECD, cubren la región entre la posición del aminoácido 103 y 141 del ECD del PRLR humano. Las diferencias más fuertes observadas en este conjunto de datos son para el péptido 109-LAVEVKQPEDRKPYL-123 (indicado como '123') j con un valor p de significancia de 4x10"12, y para el péptido 121-PYLWIKWSPPTLIDL-135 (indicado como '135') con un valor p de significancia de 7x10"40.

I \ La figura 8B muestra los resultados de ELISA para un subconjunto dé péptidos que varían en un rango entre 139-WFTLLYEIRLKPEKA- 53 (indicado como '153' en el eje X) y 163-QQTEFKILSLHPGQK-177 (indicado como '177'). Es decir que estos péptidos, que fueron desplazados por tres aminoácidos a lo largo de la secuencia de aminoácidos de ECD, cubren la región entre la posición del aminoácido 139 y 177 del ECD del PRLR humano. Las diferencias más fuertes observadas en este conjunto de datos son para el péptido 148-LKPEKAAEWEIHFAG-162 (indicado como '162') con un valor p de significancia de 6x10"26, y para el péptido 160- i F GQQTEFKILSLHP- 74 (indicado como '174') con un valor p de i significancia de 8x10"8.

Estos datos demuestran que ambos anticuerpos se unen al sujbdominio S2 del ECD del PRLR humano (aminoácidos entre 101 y 210) y por lo tanto no son competitivos con el ligando natural PRL que principalmente se une al dominio S1. Sin embargo, este barrido de péptidos mostró que hay diferencias en la unión a los dominios S2 entre Mat3 y HE06642. Este hallazgo indica por qué el anticuerpo Mat3 muestra una especificidad de especie y potencia diferentes en comparación con HE06642.

Figura 9: inhibición de la proliferación inducida por prolactina de células BaF3 (células monoclonales transfectadas establemente con el receptor humano de prolactina) por anticuerpos neutralizadores del receptor i de prolactina y anticuerpos inespecíficos control. Los valores de IC50 se 1 determinaron para los siguientes anticuerpos en formato IgGV. Mat3 (círculos cerrados), IC50 = 0,7 nM [100% de inhibición a 1 Mg/ml (= 6,7 nM)]; HE06.642 (cuadrados abiertos), IC50 = 4,2 nM [81% de inhibición a 1 pg/ml (= 6,7 nM)]; i anticuerpo inespecífico control (triángulos abiertos): sin efecto inhibitorio.

Figura 10: inhibición de la proliferación inducida por prolactina de células BaF3 (células monoclonales transfectadas establemente con el receptor murino de prolactina) por anticuerpos neutralizadores del receptor de prolactina v anticuerpos inespecíficos control. Los valores de IC50 se determinaron para los siguientes anticuerpos en formato lgG1 : Mat3 (círculos cerrados), IC50 = 3,0 nM [97,4% de inhibición a 1 Mg/ml (= 6,7 nM)]; HE06.642 (cuadrados abiertos), sin efecto inhibitorio; anticuerpo inespecífico control (tr iiángulos abiertos): sin efecto inhibitorio.

Figura 11A y B: inhibición de la proliferación inducida por prolactina dé células BaF3 (células monoclonales transfectadas establemente con el i receptor de macaco de prolactina) por anticuerpos neutralizadores del receptor de prolactina y anticuerpos inespecíficos control. Los valores de IC50 si determinaron para los siguientes anticuerpos en formato lgG1 : Mat3 (círculos cerrados), IC50 = 4,6 nM [99,1% de inhibición a 1 pg/ml (= 6,7 nM)] Figura 12: Tratamiento de útero con adenomiosis (= endometriosis interna) en ratones SHN con anticuerpo Mat3 neutralizador de PRLR. Los resultados se describen en el eje Y como puntuación de la enfermedad (puntuación de la adenomiosis) como se describe en el ejemplo 5. La mediana de la puntuación de la enfermedad para cada grupo experimental se | indica como una barra horizontal. Los grupos experimentales son los siguientes: grupo 1 , sin injerto de pituitaria (ratón normoprolactinémico que desarrolla endometriosis interna en algún grado, mediana de la puntuación de la enfermedad = 1 ); grupo 2, con isoinjerto de pituitaria (la hiperprolactinemia debido al isoinjerto de pituitaria potencia la puntuación de la enfermedad, mediana de la puntuación de la enfermedad = 3); grupo 3, con isoinjerto de pituitaria tratado con anticuerpo inespecífico murino control de isotipo lgG2a una vez por semana a una dosis de 30 mg/kg (mediana de la puntuación de la enfermedad = 3); grupo 4, con isoinjerto de pituitaria tratado con anticuerpo Mat3 en el formato lgG2a murina (Mat3-mlgG2a) una vez por semana a una dosis de 30 mg/kg (Mat3 curó completamente los animales. La puntuación de la enfermedad luego de 30 mg/kg Mat3 dado una vez por semana fue incluso menor (mediana de la puntuación de la enfermedad = 0) que la puntuación de enfermedad de los ratones normoprolactinémicos (mediana de la puntuación de la enfermedad = 1 ); grupo 5, con isoinjerto de pituitaria tratado con anticuerpo Mat3-mlgG2a una vez por semana a una dosis de 10 mg/kg (mediana de la puntuación de la enfermedad = 2); grupo 6, con isoinjerto de pituitaria tratado con anticuerpo Mat3-mlgG2a una vez por semana a una dosis de 3 mg/kg (mediana de la de la enfermedad = 2,5); grupo 7, con isoinjerto de pituitaria tratado con el anticuerpo Mat3-mlgG2a una vez por semana a una dosis de 1 mg/kg (mediana de la puntuación de la enfermedad = 2.5). El tratamiento con el j anticuerpo Mat3 muestra una disminución dependiente de la dosis en la i máxima obtenida sin el agregado de ningún anticuerpo. Los valores de IC50 sé determinaron para los siguientes anticuerpos en formato lgG1 : Mat3 (círculos cerrados), IC50 = 0,5 nM (fig. 13A, hPRLR) y 1 ,3 nM (fig. 13B, mPRLR); HE06.642 (cuadrados abiertos), IC50 = 4,6 nM (fig. 13A, hPRLR) y >>1333 nM (= 20 pg/ml) (fig. 13B, mPRLR); anticuerpo inespecífico control de isotipo (triángulos abiertos): sin efecto inhibitorio (véase figura 13A y B). Estos datos muestran la actividad mejorada de Mat3 sobre hPRLR en I comparación con HE06.642 y demuestran la actividad de Mat3 sobre mPRLR mientras que HE06.642 no inhibe la actividad luciferasa dependiente de mPRLR.

Figura 14: Unión a células de los anticuerpos neutralizadores de PRLR en células que expresan PRLR de humano, ratón y mono usando citometría de flujo. La mediana de la intensidad de señal fluorescente se gráfica contra la concentración de anticuerpo. Se aplicaron los siguientes anticuerpos lgG1 : Mat3 (círculos cerrados), HE06.642 (cuadrados abiertos), anticuerpo inespecífico control de isotipo (triángulos abiertos). Se ensayaron diferentes líneas celulares: A) línea celular HEK293 transfectada establemente con PRLR humano, B) línea celular HEK293 transfectada establemente con PRLR murino, C) línea celular HEK293 no transfectada con ningún gen de PRLR (línea celular control negativo), D) línea de células d ^ cáncer de mama humano T47D, E) línea celular BaF3 transfectada establemente con PRLR de macaco, F) línea celular BaF3 transfectada Í establemente con PRLR humano, G) línea celular BaF3 transfectada establemente con PRLR murino. La potencia de unión a la linea celular de los anticuerpos en las diferentes líneas celulares ha sido deducida a partir de las curvas dosis-respuesta como valores EC50 (véase la tabla 8). Los gráficos dé dosis-respuesta indican las superiores propiedades de unión a células de comparación con HE06.642.

SEQ ID N° 1 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de Mat3. i 1 SEQ ID N° 2 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana de Mat3.

SEQ ID N° 3 representa la secuencia del ácido nucleico que codifica la| región variable de la cadena pesada de Mat3.

SEQ ID N° 4 representa la secuencia del ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena liviana de Mat3.

SEQ ID N° 5 representa la secuencia de aminoácidos de la región HCDR1 de Mat3.

SEQ ID N° 6, representa la secuencia del ácido nucleico que codifica I la región HCDR2 de Mat3.

SEQ ID N° 7 representa la secuencia del ácido nucleico que codifica la HCDR3. de Mat3.

! SEQ ID N° 8 representa la secuencia del ácido nucleico que codifica Í la|región LCDR1 de Mat3.

SEQ ID N° 9 representa la secuencia del ácido nucleico que codifica la región LCDR2 de Mat3.

SEQ ID N° 10 representa la secuencia del ácido nucleico que codifica la región LCDR3 de Mat3.

SEQ ID N° 11 representa la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del PRLR de macaco y de mono cangrejero fusionado a una región Fc-His. i ! SEQ ID N° 12 representa las posiciones 1 a 210, las posiciones 1 a 100 del dominio S1 (la construcción que comprende las posiciones 1 a 102 del dominio S1 ) y las posiciones 101 a 210 de la secuencia de aminoácidos del dominio S2 del ECD_PRLR humano.

SEQ ID N° 13 representa las posiciones 1 a 210 de la secuencia de aminoácidos del ECD_PRLR murino. i | SEQ ID N° 14 representa la secuencia de aminoácidos de la región i variable de la cadena pesada de HE06642, de Novartis (WO2008/22295). ? | SEQ ID N° 15 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana de HE06642, de Novartis (WO2008/22295).

SEQ ID N° 16 representa la secuencia del ácido nucleico que codifica la; región variable de la cadena pesada de HE06642, de Novartis (WO2008/22295).

SEQ ID N° 17 representa la secuencia del ácido nucleico que codifica la¡ región variable de la cadena liviana de HE06642, de Novartis DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLOS Ejemplo 1. Inhibición de la proliferación inducida por la prolactina de las células BaF3 (que habían sido transfectadas de manera estable con un receptor de prolactina humano) con anticuerpos i neutralizadores del receptor de prolactina v con anticuerpos no específicos de control ' Para analizar la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores del PRLR, se determinó la inhibición de la proliferación de las células BaF3 inducida por la prolactina. Las células fueron transfectadas de manera eótable con un PRLR humano y fueron sometidas a un cultivo de rutina en un I medio RPMI que contenía glutamina 2 mM, en presencia de 10% de FCS y i 10 ng/ml de prolactina humana. Después de mantenerlas sin nutrientes en un medio libre de prolactina que contenía 1 % de FCS, las células se sembraron en placas de 96 cavidades en una densidad de 25000 células por cavidad. Las células fueron estimuladas con 35 ng/ml de prolactina y fueron incubadas con dosis crecientes de los anticuerpos neutralizadores del PRLR durante dos días. La proliferación de las células se analizó usando un ensayo para determinar la viabilidad de las células sobre la base de la luminiscencia CelITiter-Glo (de Promega). Para determinar la inhibición de la proliferación dé las células, se representaron curvas de la respuesta a la dosis y se calculó el valor de la IC50. Como control negativo, se aplicó una estimulación con un anticuerpo no específico. En este estudio, se comparó la actividad del anticuerpo Mat3 con la actividad del anticuerpo HE 06.642 (ambos en forma dé moléculas de lgG1 ; véase la figura 9).

¡ Ejemplo 2. Inhibición de la proliferación inducida por la prolactina de las células BaF3 (que habían sido transfectadas de manera estable con un receptor de prolactina murino) con anticuerpos neutralizadores del receptor de prolactina v con anticuerpos no específicos de control i i Para analizar la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores del PRLR, se determinó la inhibición de la proliferación de las células BaF3 inducida por la prolactina. Las células fueron transfectadas de manera estable con un PRLR murino y fueron sometidas a un cultivo de rutina en un I medio RPMI que contenía glutamina 2 mM, en presencia de 10% de FCS y i 10 ng/ml de prolactina humana. Después de mantenerlas sin nutrientes en un í medio libre de prolactina que contenía 1 % de FCS, las células se sembraron eri placas de 96 cavidades en upa densidad de 20000 células por cavidad. Las células fueron estimuladas con 50 ng/ml de prolactina y fueron incubadas con dosis crecientes de los anticuerpos neutralizadores del PRLR durante dos días. La proliferación de las células se analizó usando un ensayo para determinar la viabilidad de las células sobre la base de la luminiscencia CelITiter-Glo (de Promega). Para determinar la inhibición de la proliferación de las células, se representaron curvas de la respuesta a la dosis y se calculó el valor de la IC50. Como control negativo, se aplicó una estimulación con un anticuerpo no específico. En este estudio, se comparó la actividad del anticuerpo Mat3 con la actividad del anticuerpo HE 06.642 (ambos en forma moléculas de lgG1; véase la figura 10).

Ejemplo 3. Inhibición de la proliferación inducida por la I prolactina de las células BaF3 (que habían sido transfectadas de manera estable con un receptor de prolactina de macaco) con anticuerpos neutralizadores del receptor de prolactina y con anticuerpos no específicos de control ! Para analizar la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores del PRLR, se determinó la inhibición de la proliferación de las células BaF3 inducida por la prolactina. Las células fueron transfectadas de manera estable con un PRLR de macaco y fueron sometidas a un cultivo de rutina en un medio RPMI que contenía glutamina 2 mM, en presencia de 10% de FCS i y |10 ng/ml de prolactina humana. Después de mantenerlas sin nutrientes en i un medio libre de prolactina que contenía 1 % de FCS, las células se sembraron en placas de 96 cavidades en una densidad de 25000 células por cavidad. Las células fueron estimuladas con 100 ng/ml de prolactina y fueron incubadas con dosis crecientes de los anticuerpos neutralizadores del PRLR i durante dos días. La proliferación de las células se analizó usando un ensayo para determinar la viabilidad de las células sobre la base de la luminiscencia CelITiter-Glo (de Promega). Para determinar la inhibición de la proliferación de las células, se representaron curvas de la respuesta a la dosis y se calculó el valor de la IC50. Como control negativo, se aplicó una estimulación con un anticuerpo no específico. En este estudio, se comparó la actividad del anticuerpo Mat3 con la actividad del anticuerpo HE 06.642 (ambos en forma de moléculas de lgG1 ; véase la figura 11 ). i ¡ Ejemplo 4. Análisis cuantitativo de la prolactina v de expresión j Se llevó a cabo un análisis basado en una PCR TaQman en tiempo real usando el sistema detector de secuencias ABI Prism 7700, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PE Applied Biosystems) y con la descripción que se provee en Endocrinolgy 2008, 149 (8): 3952-3959, condiciones que han de resultar conocidas para aquellos versados en la técnica. La concentración de la PRL y el nivel de expresión del PRLR fueron normalizados sobre la base de la expresión de la ciclofilina. En particular, con el análisis basado en la PCR TaQman en tiempo real se analizó la concentración de la PRL y el nivel de expresión del PRLR en muestras de endometrio que habían sido obtenidas de mujeres saludables y en muestras de lesiones de diversa índole que habían sido provocadas por la endometnosis. La concentración de la prolactina y la expresión de su receptor fueron claramente superiores en las muestras de lesiones provocadas por la endometnosis, en comparación con las muestras de endometrios saludables. Los resultados se ilustran en las figuras 1 y 2.

· Sobre la base de los resultados obtenidos, puede inferirse que la señalización autocrina de la prolactina cumple una función importante en el desarrollo y el mantenimiento de la endometnosis y de la adenomiosis en el útero (es decir, la endometriosis interna, que es una forma de la endometnosis que está restringida al útero).

Ejemplo 5. Tratamiento de la adenomiosis en el útero fes decir. de la endometriosis interna) en ratones SHN con el anticuerpo I neutralizador del PRLR Mat3 Para analizar la eficacia de los anticuerpos neutralizadores del PRLR sobre la endometriosis, se usó un modelo de la adenomiosis en el útero basado en ratones SHN que padecían una hiperprolactinemia sistémica (véase Acta anat. 116:46-54,1983). La hiperprolactinemia se indujo llevando i a !cabo un isoinjeto de pituitaria debajo la cápsula renal de ratones SHN hémbra de 7 semanas de edad (Acta anat. 116:46-54,1983). Se administró el anticuerpo neutralizador del PRLR Mat3 (en una concentración de 30 mg/kg, 10 mg/kg, 3 mg/kg o 1 mg/kg) o un anticuerpo no específico (en una concentración de 30 mg/kg) por vía subcutánea. La administración comenzó dos semanas después del injerto de pituitaria. Los animales fueron i sometidos a un tratamiento semanal con los anticuerpos, durante un período to al de siete semanas. Se analizó la infiltración del tejido glandular en la capa muscular del útero como se describe en Laboratory Animal Science 1998,48:64-68. 66 días después del transplante de pituitaria, se sacrificaron los animales, se los sometió a una autopsia, se fijaron los úteros en formalina amortiguada al 4% durante la noche y se los embebió en parafina. La severidad de la adenomiosis (es decir, de la endometriosis interna) se calificó como se indica a continuación.

! Grado 0 = ausencia de adenomiosis Grado 1 = pérdida de la orientación concéntrica en la capa interna del miometrio ; Grado 2 = invasión de la capa interna del miometrio por las glándulas del endometrio i ! Grado 3 = presencia de glándulas endometriales entre la capa I interna y la capa externa del miometrio del útero Grado 4 = invasión de la capa externa del miometrio por las glándulas del endometrio Grado 5 = presencia de glándulas endometriales en el exterior de la capa externa del miometrio del útero A continuación se detallan los grupos que fueron analizados en este experimento. 1. Animales que no fueron sometidos a un transplante de decir, ratones normoprolactinémicos.

Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria, es decir, ratones hiperprolactinémicos. 3. Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria y fueron sometidos a un tratamiento semanal con un anticuerpo no específico de control en una concentración de 30 mg/kg. 4. Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria y I que fueron sometidos a un tratamiento semanal con el anticuerpo i neutralizador del receptor de prolactina Mat3, en forma de una molécula de lgG2a murina, en una concentración de 30 mg/kg. 5. Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria y que fueron sometidos a un tratamiento semanal con el anticuerpo neutralizador del receptor de prolactina Mat3, en forma de una molécula de lgG2a murina, en una concentración de 10 mg/kg. i 6. Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria y i que fueron sometidos a un tratamiento semanal con el anticuerpo i neutralizador del receptor de prolactina Mat3, en forma de una molécula de I lgG2a murina, en una concentración de 3 mg/kg. ' 7. Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria y que fueron sometidos a un tratamiento semanal con el anticuerpo neutralizador del receptor de prolactina Mat3, en forma de una molécula de lgG2a murina, en una concentración de 1 mg/kg.

I ? El anticuerpo neutralizador del PRLR Mat3 inhibió la endometriosis interna (es decir, la adenomiosis; véase la figura 12). Sobre la base de esto, puede concluirse que el anticuerpo neutralizador del PRLR Mat3 es apropiado para tratar la endometriosis interna (es decir, la adenomiosis en el útero) y la endometriosis externa en las mujeres.

Ejemplo 6. El anticuerpo neutralizador del PRLR Mat3 es apropiado para tratar las enfermedades benignas de las mamas i Una mutación local que da como resultado la activación del PRLR o una hiperprolactinemia local o sistémica pueden provocar enfermedades i benignas en las mamas. Por lo tanto, se recurrió a un modelo basado en ratones hiperprolactinémicos que presentaban una proliferación incrementada en las glándulas mamarias (que es una característica de las enfermedades benignas más severas en las mamas). En el contexto de este experimento, se usaron ratones Balb/c hembra de 12 semanas de edad en los que se había llevado a cabo un isoinjerto de pituitaria debajo de la cápsula renal, así como ratones no operados. Algunos de los ratones en los que se había llevado a cabo el isoinjerto de pituitaria no fueron tratados, mientras que otros fueron sometidos a un tratamiento subcutáneo semanal i con el anticuerpo neutralizador del PRLR Mat3, en forma de una molécula de lg(32, o con un anticuerpo no específico de control, también en forma de una i molécula de lgG2, los días 15, 22, 29 y 36 después del transplante de i pituitaria. La concentración del anticuerpo fue de 30 mg/kg. Cada grupo experimental comprendió 8 animales. i ! A continuación se detallan los grupos que fueron analizados en este i experimento. i ! 1. Animales que no fueron sometidos a un transplante de pituitaria, es decir, ratones normoprolactinémicos.

I 2. Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria, es decir, ratones hiperprolactinémicos. i 3. Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria y que fueron sometidos a un tratamiento semanal con un anticuerpo no i específico de control en una concentración de 30 mg/kg. 4. Animales que fueron sometidos a un transplante de pituitaria y que fueron sometidos a un tratamiento semanal con el anticuerpo n utralizador del receptor de prolactina Mat3 en una concentración de 30 j Los ratones fueron sacrificados el día 38 después del transplante de pituitaria. Dos horas ante de la muerte, a los animales se les aplicó una i inyección intraperitoneal de BrdU para monitorear la proliferación de las células epiteliales. La glándula mamaria inguinal izquierda fue fijada en una solución de Carnoy. Se prepararon montajes de las glándulas mamarias completas y se los coloreó con un colorante carmín. En estos montajes, se analizó la ramificación lateral de las glándulas. Los resultados se ilustran en I la ¡figura 3A. El anticuerpo Mat3 inhibió la ramificación lateral de las glándulas mamarias, mientras que el anticuerpo no específico de control careció de efecto (figura 3A).

Posteriormente, se embebieron los montajes de las glándulas mamarias completas en parafina y se aplicaron inmunocoloraciones basadas erji BrdU como se ha descripto con anterioridad (Endocrinology 149 (8): 3952- 3959; 2009). La proliferación de las células epiteliales se analizó en 4 cortes i histológicos de las glándulas mamarias de cada animal.

I ! Se congeló en nitrógeno líquido el tercio lateral de la glándula mamaria inguinal derecha, sin el nodo linfático, y se lo procesó para obtener el ARN. Después de llevar a cabo una transcripción inversa, se puso en práctica un análisis basado en una PCR en tiempo real con el sistema détector de secuencias ABI Prism 7700, de acuerdo con las instrucciones del d Biosystems). Se determinó la expresión del gen que , elf5, y se la normalizó sobre la base de la expresión de El nivel relativo del ARNm se calculó con un método en ACT. El insoinjerto de pituitaria dio como resultado u a hiperprolactinemia, es decir, una concentración más elevada de la prplactina, a causa de una expresión mayor del gen elg5 (figura 3B). En contraste con el anticuerpo no específico de control, el anticuerpo específico Mat3 inhibió la expresión del gen elf5, por lo que sirvió para bloquear con éxito el receptor de prolactina (figura 3B). i i i Sobre la base de lo anterior, puede concluirse que el anticuerpo Mat3 es apropiado para tratar las enfermedades benignas de las mamas.

Ejemplo 7. Aislamiento de anticuerpos que presentan especificidad por los blancos a partir de bibliotecas de expresión de anticuerpos humanos en fagos Para aislar un panel de anticuerpos que pudieran neutralizar la actividad dél PRLR humano, se analizaron simultáneamente tres bibliotecas de expresión de anticuerpos humanos en fagos, que en particular comprendían fragmentos Fab y scFv. El blanco que se usó en el análisis de las bibliotecas fue el dominio extracelular (ECD) soluble de diversos receptores de prolactina humanos y de ratón, que comprendían los aminoácidos 1-210 de SEQ ID N° 12 y 13, respectivamente. Otros blancos un ECD del PRLR humano unido en el extremo C a una marca que comprendía seis residuos de histidina, así como un ECD del PRLR humano unido a un dominio lgG1-Fc humano a través de un conector que comprendía los aminoácidos isoleucina, glutamato, glicina, arginina, I metionina y aspartato. j La selección de los anticuerpos con especificidad por los blancos sobre basada en la expresión en los fagos se llevó a cabo de acuerdo con los métodos que se describen en Marks et al. (Methods Mol. Biol. 248:161-76, 2004). La biblioteca de expresión en los fagos se incubó con 50 pmol del ECD biotinilado, a temperatura ambiente durante 1 hora. El complejo formado se capturó usando 100 µ? de una suspensión de esferas (Dynabeads® M-280, de Invitrogen) con estreptavidina. Los fagos no específicos se eliminaron lavando las esferas con un amortiguador apropiado j (que comprendió PBS y 5% de leche). Los fagos unidos se eluyeron con 0,5 mi de trietilamina (TEA) 100 nM, inmediatamente después de lo cual se los neutralizó agregando un volumen idéntico de TRIS-HCI 1 M con un pH de 7,4. El conjunto de fagos eluidos se usó para infectar células de E. coli TG1 que se estaban desarrollando en una fase logarítmica. Los fagémidos se rescataron como se describió con anterioridad (Methods Mol. Biol. 248:161- i 76, 2004). La selección se repitió durante un total de tres ciclos. Se estudió la actividad de unión a través de un ensayo de ELISA en el que se emplearon colonias únicas provenientes de células TG1 que habían sido infectadas con i los fagos que habían sido eluidos durante el tercer ciclo del análisis. En resumen, se emplearon colonias únicas que se habían formado a partir de las células TG1 que habían sido infectadas con las fagos eluidos para inocular placas de 96 cavidades.

Los microcultivos se desarrollaron hasta alcanzar una OD6oo de 0,6, í momento en el cual se indujo la expresión del fragmento del anticuerpo j soluble agregando de IPTG 1 mM y realizando un cultivo durante la noche en una incubadora a 30°C, con agitación. Se centrifugaron las bacterias, se preparó un extracto periplásmico y se lo usó para detectar la actividad de I unión del anticuerpo al ECD inmovilizado en las microplacas de 96 cavidades (que eran placas Immunosorb de 96 cavidades de fondo plano, de Nunc).

Posteriormente, se puso en práctica un protocolo de ELISA convencional, sobre la base de las instrucciones del fabricante de las microplacas.

Las afinidades de unión por el dominio extracelular (ECD) recombinante que presentaron los anticuerpos contra el receptor de prolactina (PRLR) se estimaron usando Biacore® 2000 y se usaron para clasificar los anticuerpos sobre la base de su afinidad. i i Ejemplo 8. Maduración de las variantes de los anticuerpos i La maduración de los anticuerpos basada en la afinidad es un proceso que comprende dos pasos, en el que se combina una mutagénesis hasta la saturación y un análisis de alto desempeño en múltiples cavidades para identificar una pequeña cantidad de mutaciones que dan como I resultado sendos incrementos en la afinidad. En la primera etapa del proceso dé maduración basado en la afinidad, se introduce una variación en los anticuerpos salvajes basada en la posición por medio de una mutagénesis dirigida a sitios específicos, mediante el uso de casetes con tres nucleótidos I NI K (donde N representa una mezcla que comprende 25% de adenina, 25% i de timina, 25% de guanina y 25% de citosina y K representa una mezcla que i cdmprende 50% de timina y 50% de guanina), de acuerdo con BMC i Biotechnology 7: 65, 2007. De esta manera, pueden introducirse los 20 aminoácidos en sendas posiciones. Esta introducción al azar está restringida a jas seis regiones de determinación de la complementariedad (CDR). En la se!gunda etapa del proceso de maduración basado en la afinidad, se combinan las variaciones beneficiosas y se analizan los resultados para determinar si se han obtenido beneficios adicionales.

Para analizar las variantes de los fragmentos Fab maduros del anticuerpo "005-C04", en este experimento se llevaron a cabo diversos análisis ELISA. En este contexto, se recubrieron placas de microtitulación de 96 cavidades con 1 pg por mililitro del PRLR humano. Las placas fueron i incubadas a 4°C durante la noche. Después de aplicar un bloqueo con un amortiguador que comprendía PBS y 3% de albúmina de suero bovino, se agregaron sobrenadantes de E. coli normalizados que contenían las variantes de los fragmentos Fab. Los complejos formados se detectaron i agregando un anticuerpo específico contra la marca (A8592, de Sigma) que había sido marcado con peroxidasa de rábano picante. j Se usó un colorante rojo de Amplex como sustrato fluorogénico para la; peroxidasa de rábano picante, que se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se midió la absorción a 570 nm y la extinción a 585 nm i usando un lector Tecan Infinite F500. Los resultados que se obtuvieron con el,anticuerpo "005-C04-20-2" se ilustran en la figura 7. Las modificaciones en el anticuerpo "005-C04-20-2" (figura 7) que resultaron beneficiosas para la afinidad se analizaron sobre la base de la estabilidad térmica y la idoneidad I para el plegamiento del fragmento Fab del anticuerpo. El anticuerpo Mat3 fue i un derivado del anticuerpo "005-C04-20-2" que comprendió características del anticuerpo progenitor "005-C04", que estaban ausentes en el anticuerpo "Q05-C04-20-2", que fueron más apropiadas en el contexto de la estabilidad térmica.

Ejemplo 9. Reactividad transversal de los anticuerpos sobre el PRLR de ratón y el PRLR humano expresados en la superficie de las células Con el objeto de comprender la pérdida de la actividad antiproliferativa del anticuerpo HE06642 que se observó en las células en las I qt!ie se expresaba el PRLR murino, se analizaron las características de la urjiión del anticuerpo HE06642 sobre el PRLR de ratón y el PRLR humano expresados en células HEK293 que habían sido transfectadas de manera estable con los PRLR mencionados, por medio de una citometría de flujo. Se cosecharon las células que se describieron con anterioridad, así como una línea de células HEK293 en las que no se expresaba PRLR alguno, y se las suspendió nuevamente hasta alcanzar una concentración de 5 x 106 células/ml, en PBS 1x que contenia 2% de FBS y 0,1% de azida de sodio (q'ue fue el amortiguador que se usó en la FACS). El anticuerpo HE06642 se sometió a una dilución al medio en el amortiguador para la FACS hasta í alcanzar la concentración final deseada (50 µ? en cada cavidad de la placa). Al¡ anticuerpo secundario y a los controles autofluorescentes se les agregaron 50 ul del amortiguador para la FACS. En cada cavidad, se colocaron 50 µ? de i lalsuspensión de células. Las muestras se incubaron a 4°C durante una hora. Se realizaron dos lavados con el amortiguador para la FACS y se suspendieron nuevamente las muestras en una mezcla que comprendía el amortiguador para la FACS y una IgG de cabra anti-humano conjugada con en una dilución de 1 :100. Después de incubar durante 30 minutos 4°C, las células fueron sometidas a dos lavados con el amortiguador para la suspendidas nuevamente en una mezcla que contenía el la FACS con 1 mg/ml de ioduro de propidio (de Invitrogen, San Diego, CA) y fueron sometidas a un análisis de citometría de flujo. En la figura 5A puede observarse que el anticuerpo HE06.642 solamente se unió al I I PRLR humano, y no al PRLR murino. Esta observación es consistente con el descubrimiento que se describe en los ejemplos 2 y 12, que está relacionado con la pérdida de la actividad del anticuerpo HE06.642 que se determinó en uri análisis de la proliferación dependiente del PRLR y en un análisis con un gen de luciferasa como indicador. i Con el propósito de demostrar la unión del anticuerpo Mat3 a las células en las que se expresaba un PRLR humano o un PRLR de macaco, cuyos dominios extracelulares comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a las del dominio extracelular del PRLR de mono cangrejero, se determinaron las características de unión del anticuerpo Mat3 sobre el PRLR humano y el PRLR de macaco expresados en células HEK293 que habían sido transfectadas de manera estable con los PRLR mencionados, por medio dé una citometría de flujo. Se cosecharon las células que se describieron con anterioridad, se las centrifugó y se las suspendió nuevamente hasta alcanzar una concentración de aproximadamente 2 x 106 células/ml en PBS 1x que contenía 3% de FBS y 0,05% de azida de sodio (que fue el amortiguador que se usó en la FACS). El anticuerpo Mat3 se sometió a una dilución al medio en el amortiguador para la FACS hasta alcanzar la concentración final deseada (50 µ? en cada cavidad de la placa). Al anticuerpo secundario y a los controles autofluorescentes se les agregaron 50 µ? del amortiguador para la FACS. En cada cavidad, se colocaron 50 µ? de la suspensión de células. Las muestras se incubaron a 4°C durante una hora. Se realizaron dos lavados cqn el amortiguador para la FACS y se suspendieron nuevamente las muestras en una mezcla que comprendía el amortiguador para la FACS y una IgG de cabra anti-humano conjugada con PE en una dilución de 1 :100.

| Después de incubar durante 30 minutos 4°C, las células fueron sometidas a i dos lavados con el amortiguador para la FACS frío, fueron suspendidas nuevamente en una mezcla que contenía el amortiguador para la FACS con 1 ¡ mg/ml de ioduro de propidio (de Invitrogen, San Diego, CA) y fueron i sometidas a un análisis de citometría de flujo. En la figura 5B puede observarse que el anticuerpo Mat3 se unió al PRLR humano y al PRLR de macaco. Se determinó que la intensidad máxima de la señal que se obtuvo cón la concentración más alta del anticuerpo dependió de la cantidad de moléculas del PRLR que se expresaron en la superficie de las células (ya que las células HEK293 y Ba/F no presentan la misma cantidad de moléculas del PRLR en su superficie). El valor de la EC50 se calculó sobre la base de las curvas de la respuesta a la dosis que se ilustran en la figura 5B, y sirvió de la unión entre el anticuerpo Mat3 y las células unión entre el anticuerpo Mat3 y el PRLR humano eri las células HEK293 fue de 0,53 nM. La potencia de la unión entre el anticuerpo Mat3 y el PRLR de macaco en las células Ba/F fue de 2,94 nM.

Sobre la base de estos datos, puede concluirse que el Mat3 no solamente es un agente muy potente que presenta especificidad por el ser humano, sino que también presenta actividad sobre los PRLR de diversos monos en dosis razonables, que en particular se encuentran en el rango nanomolar inferior.

Ejemplo 10. Estudios de la unión basados en análisis de resonancia de plasmón superficial con dominios extracelu lares de PRLR purificados La afinidad de unión del anticuerpo Mat3 se determinó por medio de un análisis de resonancia de plasmón superficial, en un instrumento Biacore TÍ 00 (de GE Healthcare Biacore, Inc.). Los anticuerpos se inmovilizaron en i uri chip sensor CM5 por medio de un reactivo de captura indirecta, que fue una región Fe de una IgG anti-humano. Se usaron los reactivos del conjunto de elementos para capturar anticuerpos humanos BR-1008-39, de GE fabricante. En un anticuerpo mpnoclonal anti-humano de ratón, en forma de una región Fe de una IgG. El anticuerpo Mat3 se inyectó en una concentración de 5 pg/ml, a una velocidad dé 10 µ?/minuto durante 10 segundos, de manera tal de alcanzar un nivel de captura de aproximadamente 200-600 RU. Sobre el anticuerpo Mat3 inmovilizado, se inyectaron diversas concentraciones del ECD del PRLR humano, de mono o de ratón (400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 i nlj/l, 6,25 nM o 3,12 nM) en un amortiguador que estaba basado en HEPES- EP (de GE Healthcare Biacore, Inc.), a una velocidad de flujo de 60 µ?/minuto i durante 3 minutos. El período de disociación fue de 10 minutos. Los ECD del PRLR humano (SEQ ID N° 12), del PRLR de mono (SEQ ID N° 1 1 , al cual se ^suprimió la marca de histidina que estaba unida a una región Fe por medio de una digestión con el factor Xa) y' del PRLR de ratón (SEQ ID N° 13) representaron analitos monovalentes. Se generaron diversos sensogramas después de aplicar una corrección en línea basada en las cavidades de referencia y de sustraer el resultado que se obtuvo con el amortiguador solo.

La constante de disociación en el equilibrio (KD) se calculó sobre la base de la| proporción entre la constante de asociación (kon) y la constante de disociación (koff = kd), que a su vez habían sido calculadas aplicando un modelo basado en una unión de 1 :1 de primer orden a los sensogramas con eli Software BiaEvaluation. Los valores de la constante de disociación monovalente (KD, que representa la afinidad) y de la constante de disociación (kd = koff) se representan en la tabla 1. i Ejemplo 11. Análisis de los péptidos I ¡ a) Síntesis de los péptidos Para reconstruir los epitopes discontinuos de la molécula deseada, SEQ ID N° 12, que abarcaba los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210 del ECD del PRLR humano, se sintetizó una biblioteca de péptidos estructurados. Esto se llevó a cabo usando una tecnología basada en andamiajes de péptidos unidos a través de enlaces químicos (CLIPS), de Pepscan (Timmerman et al., 2007, J. Mol. Recognit. 20:283-99; Pepscan i Therapeutics, Lelystad, Países Bajps). Con la tecnología CLIPS, es posible estructurar los péptidos en rizos individuales, en rizos dobles, en rizos triples, en rizos en forma de láminas, en rizos en forma de hélices o en de éstos. Los moldes que se emplearían en el procedimiento * CLIPS fueron unidos a residuos de cisteína. Las cadenas laterales de varias I cisteínas en los péptidos fueron unidas a uno o dos de los moldes que se usarían en el procedimiento CLIPS. Por ejemplo, se mezcló una solución 0,5 mM del molde para CLIPS T2 en 1 ,3-bis (bromometil) benceno con una mezcla 1 :1 (v/v) de bicarbonato de amonio 20 mM y acetonitrilo que tenía un phH de 7,9. Esta fue la solución que se usó con el conjunto de péptidos. De esta manera, los moldes para el procedimiento CLIPS que estaban unidos a los dos residuos de cisteína en una fase sólida se unieron a los péptidos en de 455 cavidades de 3 µ? por placa). Los agitados suavemente mientras estaban solución, durante un período de entre 30 y 60 minutos. Finalmente, los conjuntos de péptidos fueron lavados exhaustivamente con un exceso de H2O y fueron sometidos a una sonicación en un amortiguador que contenía 1 por ciento de SDS y 0,1 por ciento de beta-mercaptoetanol en PBS y que tenía un pH de 7,2, a una temperatura de 70°C durante un período de 30 minutos. Posteriormente, se llevó a cabo una sonicación en H20 durante 45 minutos adicionales. Los péptidos para el procedimiento CLIPS que comprendían el mold T3 se prepararon de manera similar, excepto que se emplearon tres residuos de cisteína. j b) ELISA basado en la tecnología Pepscan ! La unión del anticuerpo Mat3 y del anticuerpo HE06642 a cada péptido se analizó con un ELISA que estaba basado en la tecnología Pepscan (Slootstra et al., 1996, Molecular Diversity 1 : 87-96). Los conjuntos de péptidos fueron preincubados con entre 5% y 100% del amortiguador de uriión (a 20°C durante 1 hora), que estaba compuesto por 1 % de Tween-80, 4% de suero de caballo, 5% de ovoalbúmina (todas las proporciones son p/v) eri PBS. Después de lavar los conjuntos de péptidos, se los incubó con la solución del anticuerpo primario (en una concentración de entre 1 y 5 pg/ml), i en PBS que contenía 1% de Tween-80, a una temperatura de 4°C durante la noche. Posteriormente, se realizó un lavado y se incubaron los conjuntos de péptidos con una dilución de 1/1000 del anticuerpo antihumano deseado conjugado con peroxidasa en el amortiguador de unión al 100%, a 35°C durante una hora. Se realizó un lavado adicional y se agregaron 2 rrucrolitros/mililitro del sustrato para la pe-roxidasa, que era sulfonato de 2,2'- azino-di-3-etil-benzo-tiazolina (ABTS) al 3 por ciento en H2O2. Después de una hora, se cuantificó el desarrollo de color con un dispositivo para analizar laicarga, una cámara y un sistema para procesar imágenes. c) Procesamiento de los datos 1 Los datos en bruto eran los valores ópticos que se habían obtenido con la cámara. Los valores variaban entre 0 y 3000 mAU y eran similares eritre las 96 cavidades de la placa que se usó en el ELISA. Los resultados se almacenaron en la base de datos Peplab. Sobre la base del análisis realizado, fue posible obtener los valores indicativos de la unión. Hubo algunas cavidades que contenían burbujas de aire, por lo que presentaron I valores falsamente positivos. Después de realizar una inspección manual de las muestras, a estos resultados falsamente positivos se les asignó un valor dé 0. i d) Análisis y representación de los datos I Un mapa de calor es una representación gráfica de los datos en la que los valores que se han obtenido en los experimentos se organizan en un mapa bidimensional y se representan en colores (Brinton, 1914, Graphic Methods for Presenting Facts, Nueva York: The Engineering Magazine Cómpany; Gower y Digby, 1981 ; "Expressing complex relationships in two dirjnensions", en Interpreting Multivariate Data, editado por Barnett, V., Chichester, Reino Unido: John Wiley & Sons, pp. 83-118). De esta manera, se' construyó un mapa bidimensional con la secuencia de cada rizo de los I péptidos en forma de rizos dobles que se usaron en el procedimiento CLIPS.

! La proteína que se usó como blanco (el ECD del PRLR humano) comprendía secuencias que eran permutaciones de 54 secuencias secundarias propias de los diversos rizos. Como consecuencia, los datos que j se obtuvieron a través del ELISA basado en la tecnología Pepscan se representaron en una matriz de 54 x 54, donde cada coordenada en el eje x la secuencia de aminoácidos del primer rizo y cada coordenada en el Y fu¡e la secuencia de aminoácidos del segundo rizo. En cada coordenada xy dé la matriz se colocó un valor proveniente de un péptido x+y que había sido obtenido a través del ELISA basado en la tecnología Pepscan. Para facilitar la1 visualización, los valores fueron representados con colores en un gradiente continuo. En este caso, los valores más bajos se representaron en verde, los valores más altos se representaron en rojo y los valores intermedios se representaron en negro. Cuando se aplicó este mapa de color a la matriz que comprendía los datos que se describieron con anterioridad, se obtuvo el mapa de calor deseado. Con este mapa de calor, se seleccionaron los péptidos que habían presentado las diferencias más notables en el ELISA, en el contexto de su reactividad con el anticuerpo Mat3 y con el anticuerpo HE06642. La señal de cada uno de estos péptidos en el ELISA se representó en un gráfico de barras (figuras 8A y 8B), donde cada valor representó el promedio de los 54 péptidos se usados, en combinación cch el error estándar de la media. Los datos fueron normalizados sobre la base del promedio del conjunto de 2916 péptidos que se usaron en el experimento. Adicionalmente, se aplicó una corrección basada en el valor de fondo.

En la figura 8A se ¡lustran los resultados que se obtuvieron en el ELISA con un subconjunto de péptidos que com-prendían los aminoácidos 103 a 117, es decir, PDPPLELAVEVKQPE, que se representan como "117" en el eje x, y con un subconjunto de péptidos que comprendían los ¡ aminoácidos 127 a 141 , es decir, WSPPTLIDLKTGWFT, que se representan como "141", que formaban parte de la secuencia de aminoácidos del ECD del PRLR humano, aunque presentaban un desplazamiento de tres aminoácidos en el marco de lectura. En este conjunto de datos, las se observaron con relación al péptido 109- (que se representa como "123"), con un valor de p de 4 x 10-12, y con relación al péptido 121 -PYLWIKWSPPTLIDL-135 (que se representa como "135"), con un valor de p de 7 x 10"40.

En la figura 8A se ¡lustran los resultados que se obtuvieron en el ELISA con un subconjunto de péptidos que comprendían los aminoácidos 139 a. 153, es decir, WFTLLYEIRLKPEKA, que se representan como "153" en el eje x, y con un subconjunto de péptidos que comprendían los aminoácidos 163 a 177, es decir, QQTEFKILSLHPGQK, que se representan cómo "177", que formaban parte de la secuencia de aminoácidos del ECD del PRLR humano, aunque presentaban un desplazamiento de tres lectura. En este conjunto de datos, las observaron con relación al péptido 148- se representa como "162"), con un valor de p de 6 x 10"26, y con relación al péptido 160-FAGQQTEFKILSLHP-174 (indicated as '174'), con un valor de p de 8x10"8.

Con estos datos, puede demostrarse que los dos anticuerpos se unieron al subdominio S2 del ECD del PRLR humano (que abarca los aminoácidos 101 a 210), por lo que no compitieron con el ligando natural del PRLR, es decir, la PRL, que se une al dominio S1. Sin embargo, con este análisis de los péptidos también se demostró que hay diferencias en la unión i a los dominios S2 entre el anticuerpo Mat3 y el anticuerpo HE06642. Sobre la base de lo anterior, pueden justificarse las diferencias que se observan en laj especificidad y en la potencia entre el anticuerpo Mat3 y el anticuerpo HE06642.

Ejemplo 12. Inhibición de la actividad del gen indicador de la ¡ Para analizar con mayor detalle la actividad in vitro del anticuerpo neutralizador del PRLR Mat3 sobre el PRLR humano y sobre el PRLR murino, se recurrió a un análisis basado en un gen indicador. En él, se ernplearon células HEK293 que habían sido transfectadas de manera estable con un PRLR humano o murino y que habían sido transfectadas de manera transitoria con un gen indicador que codificaba la luciferasa, bajo el control de los LHRE (los elementos que participan en la respuesta a las hormonas labtogénicas). Estas células se sembraron en una densidad de 20000 células por cavidad (80 µ?), en una placa de 96 cavidades que comprendía un medio DMEM que comprendía 4,5 g/l de glucosa, Glutamax 2 mM, 0,5% de FCS y 1% de penicilina/estreptomicina. Al día siguiente, se agregaron 200 ng/ml de prolactina humana (10 µ?) en combinación con dosis crecientes de los i anticuerpos que se deseaba analizar (10 µ?). Como control, se agregó prplactina humana sin anticuerpos. Veinticuatro horas después, se determinó i la actividad de la luciferasa. Con fines comparativos, también se analizó el anticuerpo HE06642 y un anticuerpo no específico denominado CTX, que I estaba dirigido a la toxina del cólera. Los anticuerpos analizados tomaron la i forma de moléculas de lgG1 (figuras 13A y 13B).

Ejemplo 13. Estudios de la unión basados en análisis de déterminó por medio de un análisis de resonancia de plasmón superficial, en urj instrumento Biacore T100 (de GE Healthcare Biacore, Inc.). Los anticuerpos se inmovilizaron en un chip sensor CM5 por medio de un reactivo i de captura indirecta, que fue una región Fe de una IgG anti-humano. Se usaron los reactivos del conjunto de elementos para capturar anticuerpos de acuerdo con las se inmovilizaron aproximadamente 5000 RU de un anticuerpo monoclonal anti-humano de I ratón, en forma de una región Fe de una IgG. Cada uno de los anticuerpos analizados se inyectó en una concentración de 5 pg/ml, a una velocidad de j 10 µ?/minuto durante 10 segundos, de manera tal de alcanzar un nivel de de aproximadamente 200-600 RU. Sobre el anticuerpo Mat3 i inmovilizado, se inyectaron diversas concentraciones del ECD del PRLR I humano, de mono o de ratón (400 nM, 200 nM, 100 n , 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM o 3,12 nM) en un amortiguador que estaba basado en HEPES- de flujo de 60 µ?/minuto 0 minutos. Los ECD del PRLR humano (SEQ ID N° 12), del PRLR de mono (SEQ ID N° 1 1 , al cual se le suprimió la marca de histidina que estaba unida a una región Fe por medio dé una digestión con el factor Xa) y del PRLR de ratón (SEQ ID N° 13) i representaron analitos monovalentes. Se generaron diversos sensogramas después de aplicar una corrección en línea basada en las cavidades de i referencia y de sustraer el resultado que se obtuvo con el amortiguador solo.

Lá constante de disociación en el equilibrio (KD) se calculó sobre la base de la¡ proporción entre la constante de asociación (kon) y la constante de disociación (koff = kd), que a su vez habían sido calculadas aplicando un modelo basado en una unión de 1 :1 de primer orden a los sensogramas con el Software BiaEvaluation (véase la tabla 7).

Tabla 7. Constantes de disociación monovalentes y velocidades de disociación determinadas con dominios extracelulares purificados i del PRLR humano, de mono o de ratón (expresados en células HEK293), sobre la base de una resonancia de plasmón superficial, con los anticuerpos Mat3 y HE06.642 #En WO 2008/022295, se indica que la afinidad de HE06642 sobre el dominio extracelular del PRLR humano es de 2,6 x 10"9 M, que es de 38,9 x 10'9 M sobre el dominio extracelular del PRLR de mono cangrejero, y que es dé 2,7 x 10"9 M sobre el dominio extracelular del PRLR murino.

En la tabla 7 puede observarse que el anticuerpo Mat3 presenta una afinidad superior a la del anticuerpo HE06.642 sobre el PRLR de mono y de ratón, aunque no sobre el PRLR humano. A pesar de poder unirse al ECD l purificado del PRLR de ratón, el anticuerpo HE06.642 no se puede unirse a las células en las que se expresa el PRLR de ratón ni puede inhibir su proliferación (figuras 10 y 14, tabla 8). En contraste, el anticuerpo Mat3 puede bloquear la proliferación de las células de las tres especies en una I concentración en el rango nanomolar/subnanomolar.

Adicionalmente, se capturó y se bloqueó una forma soluble del ECD del PRLR (SEQ ID N° 12) en una superficie de prueba que comprendía los I anticuerpos Mat3 y HE06642 inmovilizados. Se hizo pasar PRL sobre esta superficie, y se determinó que ésta podía unirse a los ECD del PRLR inmovilizados, incluso en presencia de los anticuerpos.

Sobre la base de la determinación de que la PRL puede unirse al ECD del PRLR independientemente de la presencia de los anticuerpos Mat3 y HE06.642, puede concluirse que ninguno de los anticuerpos compite con el ligando natural del ECD del PRLR, es decir, la PRL.

| Ejemplo 14. Estudios de la unión de los anticuerpos en diversas i líneas de células en las que se expresaban PRLR humano, de ratón o de mono j Se llevó a cabo un estudio de la unión en células con los anticuerpos at3 y HE06642 y con un anticuerpo de control del mismo isotipo que I presentaba especificidad por la toxina del cólera, todos en forma de i moléculas de lgG1. Las células analizadas fueron células de la línea HEK293 que habían sido transfectadas de manera estable con un PRLR humano o con un PRLR de ratón, así como células de la línea de cáncer de mama humano T47D y células de la línea Ba/F en las que se expresaban PLRL húmanos, de ratón o de macaco. La unión en las células se determinó por i medio de un análisis de citometría de flujo. Las células se cosecharon, se centrifugaron y se suspendieron nuevamente hasta alcanzar una concentración de 2 x 106 células/ml en PBS 1 x que contenía 3% de FBS y 0,05% de azida de sodio (que fue el amortiguador que se usó en la FACS).

Cada uno de los anticuerpos analizados se sometió a una dilución al medio en el amortiguador para la FACS hasta alcanzar la concentración final i deseada (50 µ? en cada cavidad de la placa). Al anticuerpo secundario y a los controles autofluorescentes se les agregaron 50 µ? del amortiguador para la de la suspensión de células. Las hora. Se realizaron dos lavados con el amortiguador para la FACS y se suspendieron nuevamente las muestras en una mezcla que comprendía el amortiguador para la FACS y urjia IgG de cabra anti-humano conjugada con PE en una dilución de 1 :100.

Después de incubar durante 30 minutos 4°C, las células fueron sometidas a dos lavados con el amortiguador para la FACS frío, fueron suspendidas nuevamente en una mezcla que contenía el amortiguador para la FACS con i 1 mg/ml de ioduro de propidio (de Invitrogen, San Diego, CA) y fueron sometidas a un análisis de citometría de flujo.

En la figura 14 se representan los datos obtenidos en forma de curvas de respuesta a la dosis, sobre la base de las cuales fue posible calcular el valor de la EC50, que sería representativo de la potencia de la unión a las células (tabla 8). A partir de los resultados obtenidos, puede concluirse que el anticuerpo Mat3 presentó propiedades de unión superiores a las del anticuerpo HE06.642 en las distintas líneas de células en las que se expresaron los PRLR que se analizaron.

Tabla 8. Potencia de la unión de los anticuerpos neutralizadores del PRLR Mat3 y He06.642, en forma de moléculas de lgG1, en las células en las que se expresaba un PRLR humano, de mono o de ratón, determinada sobre la base de un análisis de citometría de flujo ¦ *no hubo una unión significativa #los diagramas de la respuesta a la dosis se ilustran en la figura 14

Claims

REIVINDICACIONES

1. El anticuerpo Mat3, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que antagoniza la señalización que es mediada por el receptor de prólactina, donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pes i ada que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 3 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 1 , así como una región variable de la cadena liviana que tiene una secuencia de ácido i nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 4 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 2.

' 2. El anticuerpo Mat3 de acuerdo con la reivindi-cación 1 , o un j fragmento de unión al antígeno de éste, que comprende las CDR del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , donde la región variable de la cadena pesada contiene CDR que comprenden secuencias de acuerdo con SEQ ID N° 5, 6 y 7 y la región variable de la cadena liviana contiene CDR que comprenden secuencias de acuerdo con SEQ ID N° 8, 9 y 10.

¡ 3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que i consiste en una región de unión al antígeno que puede unirse i específicamente a una o más regiones del dominio extracelular del PRLR humano, de mono o de ratón, donde las secuencias de aminoácidos del PRLR humano abarcan las posiciones 1 a 210 de SEQ ID N° 12 y las i variantes polimórficas humanas de SEQ ID N° 12, las secuencias de aminoácidos del PRLR de mono abarcan las posiciones 1 a 210 de SEQ ID y las secuencias de aminoácidos del PRLR de ratón abarcan SEQ ID

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, donde la afinidad por el dominio extraceiular del PRLR humano, de mono o de ratón es de al menos 100 nM, preferiblemente es menor que aproximadamente 100 nM, más preferiblemente es menor que aproximadamente 30 nM, y aun más preferiblemente es menor que aproximadamente 10 nM. i ,

¡ 5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el anticuerpo consiste en una región de unión al antígeno que puede unirse específicamente a una o más regiones del dominio extraceiular del PRLR humano con una afinidad de al menos 0 nM, más preferiblemente con una I afinidad menor que aproximadamente 1 nM.

6. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ¡a 5, donde los dominios constantes de la cadena pesada constituyen una lg|G1 , una lgG2, una lgG3 o una lgG4 modificada o no modificada.

! 7. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un i anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 7, que corresponde a SEQ ID N° 3 ó 4.

9. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

10. Una célula huésped que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 9 o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, donde la célula huésped puede ser una célula huésped proveniente de un eucariota superior, tal como una célula de un mamífero, una célula huésped proveniente de un eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o una célula huésped procariota, tal como una bacteria.

11. Un método para usar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 en la producción de un anticuerpo o de un fragmento de unión al antígeno, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10 bajo condiciones apropiadas y recuperar el anticuerpo. j

12. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que se producen con el método de acuerdo con la reivindicación 11.

! 13. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuérdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que han sido purificados hasta una homogeneidad de al menos 95% en peso.

14. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que pueden usarse como medicamentos.

15. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o uiji fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, que I 139 taijnbién puede comprender un excipiente y/o un auxiliar.

16. Un conjunto de elementos que comprende un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, es decir, un anticuerpo Mat3, envasado en un recipiente en una cantidad eficaz para el uso terapéutico, donde dicho conjunto de elementos opcionalmente puede contener un segundo agente terapéutico y un instructivo sobre el recipiente o en su interior, en el cual pueden describirse los contenidos del conjunto de elementos y pueden proveerse indicaciones y/o instrucciones para usarlos en el tratamiento de la endometriosis, de la adenomiosis, de las enfermedades benignas de las mamas, de la mastalgia, de la hiperplasia prostática benigna, de los fibroides o de la pérdida de cabello hiperprolactinémica o i normoprolactinémica, en la inhibición de la lactancia, en la anticoncepción femenina no hormonal, en una terapia hormonal combinada (es decir, en una terapia con estrógeno y progestina), en la inhibición de la proliferación de las células de las mamas o en el tratamiento o la prevención del cáncer de mima resistente a los agentes antiestrogénicos.

17. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que pueden usarse en un método para tratar y/o prevenir la endometriosis o la adenomiosis (la endometriosis interna).

18. El uso de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la manufactura de un médicamente- para proveer anticoncepción en las mujeres.

19. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que pueden usarse en un método para tratar las enfermedades benignas de las mamas o la mastalgia.

20. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo co'n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que pueden usarse en la i manufactura de un medicamento para inhibir la lactancia.

21. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que pueden usarse en un método para tratar la hiperplasia prostética benigna. i

22. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que pueden usarse en un método para tratar la pérdida de cabello hiperprolactinémica o normoprolactinémica.

! 23. El uso de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la manufactura de un i medicamento para tratar las mujeres que están siendo sometidas a una i terapia con hormonas combinadas.

! 24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, donde la terapia con hormonas combinadas es una terapia en la que se administra estrógeno y progestina.

! 25. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que pueden usarse en un método para tratar o prevenir el cáncer de mama resistente a los agentes antiestrogénicos.

26. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende un anticuerpo contra el PRLR de acuerdo con cualquiera i de las reivindicaciones 1 a 6, o un fragmento de unión al antígeno de éste, en j combinación con al menos un agente adicional. j El anticuerpo neutralizador del receptor de prolactina Mat3. i Fragmentos de unión al antígeno de éste. Composiciones farmacéuticas que contienen dicho anticuerpo o dichos fragmentos de unión al antígeno. Su uso en el tratamiento o la prevención de las afecciones y los trastornos benignos í que son mediados por el receptor de prolactina, tales como la endometriosis, laíadenomiosis, las enfermedades benignas de las mamas, la mastalgia, la hiperplasia prostética benigna, los fibroides o la pérdida de cabello i hiperprolactinémica o normoprolactinémica, en la inhibición de la lactancia, erí la anticoncepción femenina no hormonal, en una terapia hormonal combinada, en la inhibición de la proli-feración de las células de las mamas o en el tratamiento o la prevención del cáncer de mama resistente a los agentes antiestrogénicos. El anticuerpo de acuerdo con la invención bloquea la; señalización que es mediada por el receptor de prolactina. I I I