MX2013011684A - Preparaciones oftalmicas basadas en el polipeptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria que restauran la funcion visual normal en glaucoma temprano. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con preparaciones oftálmicas en la forma de gotas para los ojos basadas en PACAP (Polipéptido Activador de la Adenilato Ciclase de la Pituitaria) que restauran la función visual normal en distrofia de la retina/retinopatía y neuropatía óptica, con especial referencia al glaucoma; dichas preparaciones se pueden administrar tópicamente a la superficie del ojo intacto, y son útiles en el tratamiento de varias formas de distrofia de la retina/retinopatía y neuropatía óptica, como el glaucoma.

Description

PREPARACIONES OFTÁLMICAS BASADAS EN EL POLIPÉPTIDO ACTIVADOR DE LA ADENILATO CICLASA DE LA PITUITARIA QUE RESTAURAN LA FUNCIÓN VISUAL NORMAL EN GLAUCOMA TEMPRANO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con preparaciones oftálmicas en forma de gotas para los ojos que comprenden un péptido expresado en numerosas áreas del sistema nervioso central, incluyendo la retina, es decir, PACAP (Polipéptido Activador de la Adenilato Ciclasa de la Pituitaria).

Dichas preparaciones son útiles para restaurar la función visual normal en distrofias retinales/retinopatías y neuropatías ópticas como glaucoma (glaucoma congénito, glaucoma infantil, glaucoma juvenil, glaucoma adulto, glaucoma primario crónico de ángulo abierto, glaucoma primario crónico de ángulo cerrado y glaucoma secundario incluyendo glaucoma pigmentario, glaucoma iatrogénico y glaucoma agudo). -En particular, la invención está diseñada para restaurar la función visual normal en la etapa temprana de la enfermedad glaucomatosa, cuando la secuencia de eventos que conducen a la pérdida de las células glanglionares retínales todavía es reversible.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN PACAP, un péptido que pertenece a la familia de VIP (polipéptido intestinal vasoactivo)/glucagon/secretina, se considera por ser uno de los péptidos más interesantes en vista de sus acciones biológicas. La estructura y propiedades funcionales así conservadas en la escala de vertebrados sugiere que PACAP está involucrado en varias funciones vitales; de hecho, los descubrimientos experimentales han demostrado su participación en el desarrollo de varios órganos, las funciones de los sistemas endocrino, cardiovascular, respiratorio, reproductivo y nervioso, y las respuestas inmunes y ritmos circadianos. Se sintetiza en diferentes áreas del SNC, incluyendo la retina, con un papel pleiotrópico, actuando como neurotransmisor, neuromodulador o factor neurotrófico. PACAP se expresa en dos formas: un péptido más largo de 38 aminoácidos (PACAP 38) y un péptido más corto de 27 aminoácidos (PACAP 27), la forma más larga es la que principalmente se expresa en el sistema nervioso. Dos tipos básicos de receptor son capaces de unir tanto PACAP 27 como 38: el receptor clase 1 (PAC 1 , con alta afinidad) y el receptor clase 2 (con afinidad igual para PACAP y para VIP; se pueden distinguir dos tipos de receptor de clase 2: VPAC 1 y 2). Después de enlazarse con PAC1 , PACAP induce la activación de una adenilato ciclasa y fosfolipasa C, conduciendo a un incremento en los niveles de A P cíclico (AMPc). PACAP también puede considerarse como un ligando de los receptores acoplados de la proteína g (GPCR), una familia de receptores capaces de activar la tirosina cinasa A y B (TrkA y TrkB, respectivamente) en ausencia de sus ligandos específicos, NGF y BDNF respectivamente, conduciendo a la fosforilación de múltiples objetivos intracelulares (Lee y Chao, 2002; Rajagopal et al., 2004).

La distribución de células de la retina capaces de sintetizar y liberar PACAP parece estar limitada a las células ganglionares, un sub-grupo de células amacrinas y células horizontales (Seki et al. 2000; Hannibal y Fahrenkrug 2004); la distribución del receptor específico de PAC1 incluye, además de las células ganglionares, algunos tipos de células amacrinas y células de Müller (Seki et al. 1997; 2000; D'Agata y Cavallaro 1998; Kubrusly et al. 2005).

Por lo tanto, se ha propuesto que PACAP debe considerarse como un agente capaz de enlazarse con dos tipos de receptor presentes en la retina, PAC1 y PAC2, los cuales ejercen un efecto neuroprotector sobre las células de la retina que los expresan, especialmente las células ganglionares, y también las células amacrinas y células de Müller; en este caso específico, "efecto neuroprotector" se refiere a la habilidad de moléculas farmacológicamente activas de oponerse a la muerte celular característica de numerosas retinopatías. Por ejemplo, se ha probado que PACAP (PACAP 38 y 27) es capaz de actuar como un neuroprotector, previniendo el daño de las células de la retina en varios trastornos vasculares como la retinopatía isquémica, y previniendo la muerte de células ganglionares que sucede a la lesión del nervio óptico; PACAP también previene la muerte de células de la retina causada por el tratamiento con excitotoxinas, como el ácido glutámico y el ácido kaínico, y la muerte celular causada por irradiación con rayos UV (Silveira et al., 2002; Seki et al. 2006; Atlasz et al. 2007; Atlasz et al, 2010).

Estos estudios demuestran que PACAP se ha usado en el campo de la neuroprotección, y más específicamente para prevenir la muerte de células de la retina en varios modelos de retinopatía animal. Además, nunca se ha descrito una acción directa por parte de PACAP sobre las células de la retina afectadas para restaurar su funcionalidad normal, especialmente durante una etapa neurodegenerativa temprana que precede a la muerte celular.

Se sabe que en pacientes que sufren de glaucoma y en modelos experimentales de glaucoma, la degeneración/muerte de células ganglionares, con una consecuente reducción en su densidad de retina, representa una etapa avanzada de glaucoma (Quigley et al. 1989; Buckingham et al. 2008; Boland y Quigley 201 1). Sin embargo, en una etapa temprana de glaucoma, las células ganglionares todavía no están tan dañadas como para estar cerca de la muerte, sino que empiezan a funcionar anormalmente, conduciendo a una reducción en la capacidad visual; estas alteraciones funcionales se pueden detectar registrando el electroretinograma evocado por estímulos visuales estructurados (patrón ERG, P-ERG), la fuente de los cuales está en la capa nuclear interior, al nivel de las células ganglionares ( affei y Fiorentini, 1982; Maffei y Fiorentini, 1985). Se ha probado que P-ERG es útil para detectar daño temprano en la capa nuclear interior tanto en modelos experimentales animales como en pacientes que sufren de hipertensión infraocular o glaucoma (Domenici et al., 1991 ; Ventura y Porciatti 2006; Parisi et al. 2006; Falsini et al, 2008).

En cuanto a los métodos de administración de PACAP, datos recientes indican que PACAP 38 y 27 son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica, preparando el camino para su posible aplicación farmacológica en el tratamiento sistémico (Nonaka et al., 2002; Dogrükol-Ak et al, 2009). Sin embargo, se debe evitar el uso sistémico de PACAP (por inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal), debido a que puede causar efectos secundarios, como efectos sobre la regulación de los ritmos circadianos (Kawaguchi et al., 2010); de hecho, los ratones knock-out con receptor PAC1 presentan cambios en los ritmos circadianos (Hannibal et al. 2008). Además, los tratamientos sistémicos con PACAP no pueden prevenir completamente la degeneración de células de la retina en modelos animales, a diferencia de las inyecciones intravítreas de PACAP, las cuales liberan la molécula directamente en la retina (Babai et al. 2006; Kiss et al. 2006). Por lo tanto, actualmente existe la necesidad de identificar nuevas preparaciones de PACAP que se puedan administrar por medio de técnicas no-invasivas para transportar PACAP a la retina, evitando así técnicas de administración como las inyecciones infraoculares, subretinales o retrobulbares, métodos altamente invasivos que son inadecuados para tratamiento crónico a largo plazo debido al riesgo asociado de causar perforación del globo ocular, infecciones o hemorragia, por ejemplo.

US 2008/0300182 describe preparaciones oftálmicas que contienen PACAP, PACAP 27 y 38, que son útiles para prevenir la muerte de células de la retina en varios modelos de retinopatía. La actividad neuroprotectora de PACAP se ha demostrado in vivo por medio de inyección intravítrea en un modelo experimental en el que la muerte de células de la retina se induce farmacológicamente; sin embargo, no se han reportado ni la administración tópica en forma de gotas para los ojos ni el uso de modelos de glaucoma in vivo. La prevención de la muerte de células de la retina se atribuye a la liberación de interleucina-6 (IL-6), una citocina inflamatoria, por parte de las células de la retina de Müller que expresan el receptor PAC1. Sin embargo, el receptor PAC1 principalmente se concentra en la capa nuclear interior, es decir, en las células ganglionares, como se reporta en la literatura. Además, el incremento de IL-6 en la retina, como el de otras citocinas involucradas en los procedimientos inflamatorios, genera una alteración de la respuesta de la retina a la luz que se puede medir con el electroretinograma de destello (ERG de destello; Ozawa et al., 2008); por lo tanto, un incremento de IL-6 puede inducir, en lugar de tratar, una discapacidad visual adicional.

Además, la muerte celular en el glaucoma representa una etapa tardía de daño a las células ganglionares y al nervio óptico; para ese momento, la función visual está seriamente deteriorada y es difícil de restaurar.

US 62242563 propone análogos de PACAP para la prevención de muerte celular en mamíferos y el tratamiento de varios tipos de trastornos (enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, enfermedad cardiovascular, diabetes, retinopatías y enfermedad renal). La prevención de la muerte celular se considera responsable de la actividad terapéutica en dichos trastornos, entre los que las retinopatías solo se mencionan genéricamente. Por lo tanto, aplican los comentarios reportados anteriormente para US 2008/0300182.

JP 10-505863 divulga el uso de PACAP para prevenir la muerte neuronal en varios tipos de enfermedades cerebrales. Aquí una vez más el objetivo es prevenir la muerte neuronal, de modo que aplican los comentarios hechos acerca de US 2008/0300182.

EP 1752158 divulga el uso de PACAP o análogos del mismo para promover la génesis de células de la córnea para incrementar la sensibilidad de la córnea y tratar a pacientes que sufren de "ojo seco" y de lesiones traumáticas del epitelio de la córnea.

WO 200823717 divulga preparaciones oftálmicas que contienen PACAP para promover la secreción de lágrimas actuando sobre el receptor PAC1 , y por lo tanto no se relaciona con una retinopatía.

EP 1546198 divulga el uso de PACAP para incrementar la capacidad proliferativa y de diferenciación de las células madre del prosencéfalo basal de modo que dichas células se puedan usar para tratar trastornos neurodegenerativos.

EP 1507551 divulga el uso de PACAP para impulsar la capacidad proliferati va/de diferenciación de los progenitores neuronales presentes en el cerebro adulto para el tratamiento de varias alteraciones del sistema nervioso.

US 20020182729 divulga un método basado en el uso de PACAP para regular el ciclo celular en el desarrollo de neuronas y en la etapa de multiplicación para tratar varios trastornos del sistema nervioso.

Aunque los efectos de PACAP en la reducción y/o prevención de la muerte celular se han sugerido en algunas retinopatías y/o trastornos neurodegenerativos que afectan otras áreas del SNC, no se ha descrito el uso terapéutico de PACAP o sus análogos para restaurar la visión normal a pacientes con glaucoma, ni se puede inferir a partir de los antecedentes de la técnica.

El glaucoma es uno de una serie de trastornos progresivos que afectan el ojo que, si no se trata adecuadamente, conduce a ceguerg debido a la pérdida de las células ganglionares y a la atrofia progresiva de las fibras del nervio óptico. El glaucoma, especialmente su forma más frecuente, llamada glaucoma primario de ángulo abierto (POAG; 70-80% de los casos de glaucoma), se caracteriza en la mayoría de los pacientes por presión infraocular incrementada (IOP), con estrechamiento gradual de los canales de drenaje del humor acuoso; si este trastorno crónico no se diagnostica y trata rápidamente puede conducir, en una etapa avanzada, a la muerte de células ganglionares y a daño del nervio óptico, y estas alteraciones son prácticamente irreversibles. En la etapa progresiva, así como a la retina, el glaucoma puede afectar a los centros visuales, como el cuerpo geniculado lateral, eventualmente involucrando a la corteza visual, etapa para la cual el tratamiento es inútil. En años recientes, el tratamiento farmacológico ha tenido como meta reducir la IOP, aunque un número considerable de pacientes son resistentes al tratamiento farmacológico actual y sufren de pérdida progresiva e irreversible de la función visual.

El tratamiento farmacológico de glaucoma, como se ha reportado anteriormente, necesariamente requiere un método de administración ocular tópica que evite los efectos secundarios (administraciones sistémicas) y el riesgo de perforación del globo ocular, infecciones o hemorragia (administraciones intravítreas y subretinales).

La retina es una parte parcialmente separada del sistema nervioso central; varios tipo de barrera existen, incluyendo la barrera de sangre retinal, la cual evita la difusión no específica de compuestos tales como moléculas grandes hacia la retina. La penetración infraocular de compuestos farmacológicamente activos aplicados tópicamente se regula por y medio de barreras ubicadas en la córnea y en la conjuntiva, la esclerótica, los vasos sanguíneos de la coroides y coroideos, y por medio de absorción sistémica y descomposición metabólica efectuada por las enzimas presentes en esos tejidos. Una vez instilados, los compuestos farmacológicamente activos deben cruzar un sistema complejo de barreras, incluyendo la barrera hemato-retiniana, para penetrar en los tejidos subyacentes hasta la retina.

Además, la retina, a través de las células ganglionares, a partir de las cuales se originan las fibras del nervio óptico, está conectada vía el nervio óptico a los centros visuales como la parte dorsal del cuerpo geniculado lateral (dLGN).

Por lo tanto, es necesario identificar moléculas, como PACAP, que se puedan aplicar tópicamente para evitar los riesgos asociadlos con el uso de métodos invasivos, y alcancen la retina en concentraciones efectivas que no solo inhiban el progreso del trastorno inducido por glaucoma en las células ganglionares y en el nervio óptico antes de su muerte, sino que sobre todo restauren las alteraciones visuales a su estado normal antes de que se vuelvan irreversibles.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ahora se ha encontrado que PACAP (o análogos de) mismo), cuando se administra por medio de administración ocular tópica en glaucoma, restaura la funcionalidad normal de las células de la retina, especialmente de las células ganglionares. Por lo tanto, PACAP contrarresta la discapacidad visual característica de una etapa temprana de glaucoma, antes de que tenga lugar la muerte de células ganglionares.

La presente invención está basada en la demostración de que el tratamiento con PACAP en un modelo murino espontáneo de glaucoma restaura la funcionalidad normal de la capa nuclear interior (células ganglionares), conduciendo a la recuperación de la capacidad visual evaluada por medio de P-ERG; esta recuperación ocurre en una etapa de la enfermedad que precede a la etapa caracterizada por muerte de células ganglionares, que se evalúa analizando su densidad en la retina.

Por lo tanto, la presente invención se relaciona con formulaciones oftálmicas que contienen PACAP y que están diseñadas para restaurar la capacidad visual normal en glaucoma.

La formulación oftálmica de conformidad con la invención preferiblemente toma la forma de gotas para los ojos que contienen PACAP (Polipéptido Activador de la Adenilato Ciclasa de la Pituitaria, PACAP 27 o PACAP 38).

La invención también se relaciona con el uso de PACAP (27 y 38) para preparar un producto medicinal en la forma de gotas para los ojos para el tratamiento de trastornos degenerativos de la retina, el nervio óptico y el cuerpo geniculado lateral para el propósito de restaurar la visión normal en una etapa temprana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 - Determinación de los niveles de AMPc en la retina tras la aplicación tópica de PACAP 38.

Figura 2 - Medición de los niveles de presión intraocular (IOP) a varias edades en un modelo experimental de glaucoma espontáneo (ratón DBA/2J).

Figuras 3A-3B - Densidad de células ganglionares en glaucoma, medida a diferentes edades asociadas con IOP incrementada; estudio conducido en un modelo experimental de glaucoma espontáneo (ratón DBA/2 J).

Figuras 4A-4B - Electroretinograma de patrón (P-ERG) en el modelo murino de glaucoma (ratón DBA/2J) a diferentes edades.

Figura 5 - La aplicación tópica de PACAP 38 reduce significativamente la alteración de la respuesta de la retina derivada de las células ganglionares en la capa nuclear interior durante una etapa de glaucoma que precede a la reducción en la densidad de las células ganglionares; estudio conducido en un modelo experimental de glaucoma espontáneo (ratón DBA/2J).

Figura 6 - ERG de destello registrado en el modelo experimental de glaucoma espontáneo (ratón DBA/2J) después del tratamiento tópico con PACAP para demostrar la ausencia total de alteraciones funcionales en los fotorreceptores y en la capa nuclear exterior.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las composiciones de conformidad con la invención preferiblemente toman la forma de soluciones, suspensiones, geles o ungüentos que contienen PACAP a concentraciones de entre 0.2 y 50 g/pl (preferiblemente de 1-10 µ?/µ?). Las dosis terapéuticas diarias están aproximadamente entre 4 y 10000 g (preferiblemente de 20-2000 g), y se pueden alcanzar en dos o más administraciones diarias de una solución oftálmica de 10-100 µ? instilada tópicamente en la conjuntiva.

El PACAP (27 y 38) se puede administrar solo o en combinación con otros constituyentes activos, como bloqueadores-ß, prostaglandinas e inhibidores de anhidrasa carbónica.

La preparación contendrá un portador adecuado que es farmacéuticamente aceptable, compatible con el ingrediente activo, y tolerado por los ojos.

Los ejemplos de dichos portadores incluyen solución salina, que preferiblemente contiene 0.9% de cloruro de sodio, y/o soluciones que contienen agentes controladores de la viscosidad como carboximetilcelulosa, carbopol, hidroxipropilcelulosa, polisacáridos, glicosaminoglicanos y mezclas y derivados de los mismos (como sales).

El uso de agentes controladores de la viscosidad puede mejorar la biodisponibilidad, garantizando un paso más lento y más gradual de PACAP que cuando se administra en solución salina, la cual se lava de la conjuntiva más rápidamente.

El agente controlador de la viscosidad preferiblemente es el polisacárido de semilla de tamarindo (TSP), un polisacárido extraído de las semillas de la planta de tamarindo {Tamarindus indica) como se divulga en EP 0 892 636.

El contenido de TSP puede variar, preferiblemente entre 0.05 y 2% (peso/volumen - p/v), y más preferiblemente entre 0.25 y 0.5% (p/v).

El TSP es transparente en solución. Las soluciones son viscoelásticas y estériles, y se usan para proteger la córnea y la conjuntiva. El TSP también forma una película de larga duración sobre la superficie del ojo, la cual lubrica y humecta la córnea y la conjuntiva.

De conformidad con otro aspecto preferido, la solución viscosificada contiene carboximetilcelulosa de sodio en porcentajes que varían entre 0.01 y 2% (p/v), preferiblemente entre 0.2 y 0.4% (p/v). La carboximetilcelulosa de sodio es no-tóxica e inerte, y tiene un pH estable en solución. Además, una concentración de aproximadamente 1% tiene un índice de refracción similar al de las lágrimas.

Un aspecto adicional preferido es que la solución viscosificada contiene ácido hialurónico, más preferiblemente ácido hialurónico en combinación con TSP.

El contenido de ácido hialurónico puede variar entré 0.05% y 0.8% (p/v), preferiblemente entre 0.2 y 0.4% (p/v).

De conformidad con una modalidad preferida, la preparación contiene PACAP a la concentración de 2 mg/mL en solución salina que contiene 0.9% de NaCI.

De conformidad con otra modalidad preferida, la preparación contiene PACAP a una concentración de 2 mg/mL en solución salina que contiene 0.2% de carboximetilcelulosa de sodio.

De conformidad con una modalidad preferida, la preparación contiene PACAP a una concentración de 1 mg/mL en solución salina con 0.25% de TSP.

La preparación en gotas para los ojos se puede administrar tópicamente directamente a la superficie del ojo intacto, es decir, por medio de una técnica no-invasiva, evitando el uso de métodos invasivos como inyecciones intraoculares, subretinales y retrobulbares. En particular, la preparación se puede administrar en el saco conjuntival. La preparación también se puede formular como un parche de ojos o en lentes de contacto.

Como se demuestra en la sección experimental, cuando se administra tópicamente de conformidad con la invención, PACAP se transporta a la retina, induciendo un incremento en la concentración en la retina del segundo mensajero de AMPc en las células de la retina, uno de los objetivos intracelulares de activación de los receptores de PACAP, como se reporta en la introducción a la técnica previa. Estos resultados indican que PACAP no solamente es capaz de pasar a través de las varias barreras tisulares después del tratamiento tópico y difundirse en la retina, sino también de retener una estructura que lo habilite para enlazarse a y activar sus receptores específicos expresados en varias células de la retina, incluyendo las células ganglionares.

Las formulaciones de conformidad con la invención se pueden usar para la prevención y/o tratamiento de trastornos neurodegenerativos de la retina, del nervio óptico y del cuerpo geniculado lateral, en particular las varias formas de glaucoma (glaucoma congénito, glaucoma infantil, glaucoma juvenil, glaucoma adulto, glaucoma primario de ángulo-abierto, glaucoma primario crónico de ángulo cerrado y glaucoma secundario incluyendo glaucoma pigmentario, glaucoma iatrogénico y glaucoma agudo).

Los ejemplos proporcionados a continuación ilustran adicionalmente la invención.

EJEMPLO 1 Determinación de los niveles de AMPc en la retina después del tratamiento tópico del ojo de 6 horas con preparaciones basadas en PACAP Se usó la preparación basada en solución salina (0.9% de NaCI) que contiene PACAP 38 La prueba se condujo en ratones (C57BL-6J, Harían, Italia); se aplicó PACAP 38 tópicamente, se instiló en el saco conjuntival de un ojo, mientras que el otro ojo, usado como control, se trató solamente con la solución salina ("placebo").

Determinación de niveles de AMPc en la retina Los animales se sacrificaron 6 horas después de la aplicación tópica, cuando se había inducido anestesia profunda por medio de una inyección intraperitoneal de uretano (20%). Después se retiró el ojo, y se midió el nivel de AMPc en el homogeneizado de la retina del ojo tratado con PACAP y del otro ojo tratado solamente con solución salina (ojo control). Las mediciones se realizaron por medio de ensayo de AMP cíclico usando el Cyclic AMP EIA KIT (Cayman Chemicon Company). Los resultados mostrados en la gráfica de la Figura 1 se obtuvieron con una aplicación tópica de PACAP (50 µ?; 0.226 pg/µ?) en solución salina (0.9% de NaCI) y ácido acético (5%), y se expresan como valores relativos (%) en comparación con el ojo control. El análisis estadístico se condujo con la prueba t de Student, comparando el ojo tratado con PACAP con el ojo control: en todos los casos el nivel de AMPc fue significativamente más alto en el ojo tratado que en el ojo control (*, p<0.05).

Estos resultados indican que PACAP es capaz de cruzar las varias barreras y alcanzar la retina después de la aplicación tópica en el saco conjuntival; parece ser que PACAP también es capaz de activar sus receptores celulares que causan un incremento en AMPc.

EJEMPLO 2 Efectos inducidos por aplicación tópica repetida de PACAP a varias edades en un modelo murino de glaucoma El receptor de PACAP, llamado PAC1 , se conoce por expresarse en las células ganglionares (Seki et al. 1997; 2000; D'Agata y Cavallaro 1998; Hannibal y Fahrenkrug 2004; Kubrusly et al. 2005). Se verificó la actividad de PACAP en el modelo experimental más común de glaucoma espontáneo, un ratón doble muíante llamado DBA/2J (John et al., 1998; Chang et al.,, 1999). El ratón DBA/2J presenta mutaciones homocigotas de dos genes separados; el primero es la proteína relacionada a la tirosina (Tyrpl-/-) que codifica una proteína de melanosoma, y el segundo es una glicoproteína de membrana (Gpnmb-/-); los gránulos de pigmento se acumulan en la malla trabecular, de forma similar a la forma de glaucoma pigmentario, con consecuente degeneración trabecular, atrofia del iris y discapacidad progresiva de la salida de humor acuoso, que conduce a un incremento en la IOP.

Este ratón se caracteriza por un incremento progresivo en la IOP, con pérdida progresiva de la respuesta de la retina a estímulos visuales estructurados (que pueden ser rejillas formadas por franjas pálidas alternadas con franjas oscuras, o piezas de ajedrez, con diferentes contrastes tamaños) que depende de la capa nuclear interior/células ganglionares; en humanos y en el modelo animal, esta respuesta de la retina es llamada electroretinograma de patrón (P-ERG; Domenici et al., 1991 ; Ventura y Porciatti, 2006; Falsini et al., 2008). La disfunción de las células ganglionares es seguida en una etapa tardía por degeneración de las células ganglionares, con una reducción en su densidad y atrofia progresiva del nervio óptico (Ventura et al., 2006; Buckingham et al., 2008). Como se muestra en la Figura 2, en este modelo murino de glaucoma (DBA/2J), la IOP empieza a incrementarse entro los 5 y 6 meses de vida postnatal: a los 6½ meses la IOP en el ratón DBA/2J ya parece significativamente mayor (prueba t;* p<0.05) que la medida en el ratón normal (C57bl/6J) y en el ratón DBA/2J a la edad de 5 meses, es decir, antes del inicio del trastorno. A la edad de 1 1 meses la IOP se eleva más; por lo tanto, se puede inferir una progresión del trastorno similar a la que tiene lugar en pacientes humanos.

Evaluamos si el incremento en la IOP corresponde a un incremento en la muerte celular y una consecuente pérdida de células ganglionares, cuya densidad se reduce. La gráfica en la Figura 3B muestra la densidad de las células ganglionares medida por medio de análisis de microscopio confocal de la distribución de células ganglionares etiquetadas con un anticuerpo fluorescente capaz de detectar a-Sinucleína (Surgucheva et al., 2008); la gráfica muestra una ligera reducción en la densidad de las células ganglionares, que empezando en la retina periférica, solo comienza a aparecer a la edad avanzada de 11 meses. Estos resultados demuestran que la muerte de las células ganglionares inicia a manifestarse a la edad avanzada de 11 meses en el modelo murino de glaucoma, el ratón DBA/2J, es decir, aproximadamente 5 meses después del incremento inicial de la IOP; Buckingham et al. (2008) sugieren que el nivel máximo de muerte celular tiene lugar después de 16 meses en el ratón DBA/2J. Los estudios conducidos previamente sobre pacientes que sufren de glaucoma están alineados con aquellos reportados en el modelo murino, sugiriendo que la discapacidad visual inicia a manifestarse en una etapa temprana, antes de que la densidad de las células ganglionares se reduzca y las fibras del nervio óptico se atrofien (Quigley, 1989; Harwerth, Quigley, 2006).

Las discapacidades visuales tempranas causadas por funcionamiento anormal de las células ganglionares de la retina, especialmente sus sinapsis, son fácilmente medibles en pacientes y en modelos animales registrando el electroretinograma de patrón (P-ERG), un método no invasivo capaz de detectar alteraciones funcionales, incluso en la etapa temprana, de la capa nuclear interior, y en particular de las células ganglionares (Ventura et al. 2006; Falsini et al., 2008; 2009). Las Figuras 4A-4B muestran el P-ERG evocado por estímulos visuales estructurados (las rejillas visuales usadas como estímulos fueron rejillas horizontales, cuyo perfil de luminancia se caracterizó por frecuencias espaciales de 0.05, 0.1 y 0.2 ciclos/grado, y 90% de contraste que se invirtió a la frecuencia de tiempo de 2 Hz) registrados por electrodos de la córnea conectados a un amplificador y conectados a una computadora para análisis en línea. Como se muestra en las Figuras 4A-4B, el P-ERG ya está alterado en el ratón DBA/2 J dé 7 meses de edad (una reducción significativa en las amplitudes P-ERG evocadas por estímulos visuales con una frecuencia espacial de 0.05 y 0.2 c/grado; prueba de t de Student* p<0.05) en correspondencia con la IOP incrementada (Figura 2). A la edad de 8 meses, es decir, cuando la IOP se había incrementado sobre una base estable (Figura 2) pero no había reducción en la densidad de las células ganglionares (Figuras 3A-3B), se dio tratamiento de dos semanas con aplicaciones tópicas repetidas de PACAP en solución salina (un tratamiento cada 48 horas) en un ojo y el portador (solución salina) en el otro (ojo control). Se usaron tres concentraciones diferentes de PACAP (N = 3 ratones DBA/2 J por grupo): 500 nM (0.0022 pg/µ?), 1 µ? (0.0045 pg/µ?), 50 µ? (0.226 g l); solo la concentración más alta (50 µ?, 0.226 g/pl) fue efectiva. El histograma de la Figura 5 muestra que el tratamiento tópico con PACAP a la concentración de 50 µ? (0.226 pg/µ?) por 2 semanas entre 8 y 8.5 meses (una aplicación cada 48 horas) previno la alteración del P-ERG en el ratón DBA/2J, deteniendo el progreso del trastorno (comparar los datos para el ojo tratado con el ojo control; prueba de t de Student, * p<0.05) y restaurando la respuesta visual de las células ganglionares de la capa nuclear interior a su estado normal.

El otro tipo de electroretinograma, ERG de destello, que mide la respuesta de los fotorreceptores y de la capa nuclear exterior a la luz, parece completamente intacto en glaucoma, sustentando adicionalmente la teoría de que éste es un tipo de trastorno que afecta la capa nuclear interior, es decir, las células ganglionares, al menos en la etapa temprana. La Figura 6 muestra las amplitudes de la respuesta de la capa nuclear exterior (fotorreceptores y células de post-receptor) a la luz (ERG de destello), que indica que en el ratón DBA/2J sin tratar la respuesta de la capa nuclear exterior a lá luz está presente y es perfectamente normal. Un segundo resultado, mostrado en la Figura 6, es particularmente importante: el ojo del ratón DBA/ J, tratado tópicamente con PACAP (50 µ?) en solución salina (dos semanas, un tratamiento cada 48 horas), presenta un ERG de destello normal. Este segundo resultado sugiere que PACAP no es capaz de modificar el fotopigmento contenido en el segmento exterior de los fotorreceptores, y consecuentemente de alterar la respuesta de los fotorreceptores a la luz (ERG de destello), lo que se esperaría si este tipo de tratamiento indujera un incremento de IL-6 a nivel de la retina (Ozawa et al. 2008), como se propone en US 2008/0300182.

Los datos reportados condujeron a la conclusión de que el tratamiento tópico repetido con PACAP a concentraciones efectivas previene las alteraciones funcionales de las células ganglionares y restaura la capacidad visual de la retina en un modelo experimental de glaucoma en una etapa temprana. La concentración efectiva mínima de PACAP capaz de ejercer efectos protectores sobre la función de las células ganglionares fue de 0.226 pg/µ?.

REFERENCIAS Atlasz T, Babai N, Kiss P, Reglodi D, Tamás A, Szabadfi K, Tóth G, Hegyi O, Lubics A, Gábriel R. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide is protective in bilateral carotid occlusion-induced retinal lesión in rats. Gen Comp Endocrinol. 2007 Aug-Sep;153(1-3):108-14.

Atlasz T, Szabadfi K, Kiss P, Tamas A, Toth G, Reglodi D, Gabriel R. Evaluation of the protective effects of PACAP with céll-specific markers in ischemia-induced retinal degeneration. Brain Res Bull. 2010 Mar 16;81 (4-5):497-504.

Babai N, Atlasz T, Tamás A, Reglodi D, Tóth G, Kiss P, Gábriel R. Degree of damage compensation by various PACAP treatments in monosodium glutamate-induced retinal degeneration. Neurotox Res. 2005 Nov;8(3-4):227-33.

Boland MV, Quigley HA. Evaluation of a combined index of optic nerve structure and function for glaucoma diagnosis. BMC Ophthalmol. 201 1 Feb 1 1 ;11 (1 ):6.

Buckingham BP, Inman DM, Lambert W, Oglesby E, Calkins DJ, Steele MR, Verter ML, Marsh-Armstrong N, Horner PJ. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J Neurosci. 2008 Mar 12;28(11):2735-44.

Domenici L, Gravina A, Berardi N, Maffei L. Different effects of intracranial and intraorbital section of the optic nerve on the functional responses of rat retinal ganglion cells. Exp Brain Res. 1991 ;86(3):579-84.

D'Agata V, Cavallaro S. Functional and molecular expression of PACAP/VIP receptors in the rat retina. Brain Res Mol Brain Res. 1998 Feb;54(1):161-4.

Dogrukol-Ak D, Kumar VB, Ryerse JS, Farr SA, Verma S, Nonaka N, Nakamachi T, Ohtaki H, Niehoff ML, Edwards JC, Shioda S, Morley JE, Banks WA. Isolation of peptide transport system-6 from brain endothelial cells: therapeutic effects with antisense inhibition in Alzheimer and stroke models. J Cereb Blood Flow Metab. 2009 Feb;29(2):411 -22.

Falsini B, Marangoni D, Salgarello T, Stifano G, Montrone L, Campagna F, Aliberti S, Balestrazzi E, Colotto A. Structure-function relationship in ocular hypertension and glaucoma: interindividual and interocular analysis by OCT and pattern ERG. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2008 Aug;246(8):1153-62.

Hannibal J, Fahrenkrug J. Target áreas innervated by PACAP-immunoreactive retinal ganglion cells. Cell Tissue Res. 2004 Apr;3l6(1): 99-113.

Hannibal J, Brabet P, Fahrenkrug J. Mice lacking the PACAP type I receptor have impaired photic entrainment and negative masking. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008 Dec;295(6):R2050-8.

John SW, Smith RS, Savinova OV, Hawes NL, Chang B, Turnbull D, Davisson M, Roderick TH, Heckenlively JR. Essential iris atrophy, pigment dispersión, and glaucoma in DBA/2J mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998 Mayo¡39(6):951-62.

Kawaguchi C, Isojima Y, Shintani N, Hatanaka M¡ Guo X, Okumura N, Nagai K, Hashimoto H, Baba A. PACAP-deficient mice exhibit light parameter-dependent abnormalities on nonvisual photoreception and early activity onset. PLoS One. 2010 Feb 18;5(2):e9286 Kubrusly RC, da Cunha MC, Reís RA, Soares H, Ventura AL, Kurtenbach E, de Mello MC, de Mello FG. Expression of functional receptors and transmitter enzymes in cultured Muller cells. Brain Res. 2005 Mar 21 ;1038(2):141-9.

Kiss P, Tamás A, Lubics A, Lengvári I, Szalai M, Hauser D, Horvath ZS, Racz B, Gabriel R, Babai N, Toth G, Reglódi D. Effects of systemic PACAP treatment in monosodium glutamate-induced behavioral changes and retinal degeneration. Ann N Y Acad Sci. 2006 Jul; 1070:365-70.

Lee FS, Rajagopal R, Kim AH, Chang PC, Chao MV. Activation of Trk neurotrophin receptor signaling by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptides. J Biol Chem. 2002 Mar 15;277(1 1 ):9096-102.

Maffei L, Fiorentini A. Electroretinographic respúnses to altemating gratings in the cat. Exp Brain Res. 1982;48(3):327-34.

Maffei L, Fiorentini A, Bisti S, Hollánder H. Pattern ERG in the monkey after section of the optic nerve. Exp Brain Res. 1985;59(2):423-5.

Nonaka N, Banks WA, Mizushima H, Shioda S, Mórley JE. Regional differences in PACAP transport across the blood-brain barrier in mice: a possible influence of strain, amyloid beta protein, and age. Peptides. 2002 Dic;23(12):2197-202.

Ozawa Y, Nakao K, Kurihara T, Shimazaki T, Shimmura S, Ishida S, Yoshimura A, Tsubota K, Okano H. Roles of STAT3/SOCS3 pathway ¡n regulating the visual function and ubiquitin-proteasome-dependent degradation of rhodopsin during retinal inflammation. J Biol Chem. 2008 Sep 5;283(36):24561-70.

Parisi V, Miglior S, Manni G, Centofanti M, Bucci MG. Clinical ability of pattern electroretinograms and visual evoked potentials in: detecting visual dysfunction in ocular hypertension and glaucoma. Ophthalmology. 2006 Feb;113(2):216-28.

Quigley HA, Dunkelberger GR, Green WR. Retinal ganglion cell atrophy correlated with automated perimetry in human eyes with glaucoma. Am J Ophthalmol. 1989 May 15;107(5):453-64.

Rajagopal R, Chen ZY, Lee FS, Chao MV. Transactivation of Trk neurotrophin receptors by G-protein-coupled receptor ligands occurs on intracellular membranes. J Neurosci. 2004 Jul 28;24(30):6650-8.

Seki T, Shioda S, Ogino D, Nakai Y, Arimura A, Koide R. Distribution and ultrastructural localization of a receptor for pituitary adenylate cyclase activating polypeptide and its mRNA in the rat retina. Neurosci Lett. 1997 Dec 5;238(3): 127-30.

Seki T, Shioda S, Izumi S, Arimura A, Koide R. Electron microscopic observation of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)-containing neurons in the rat retina. Peptides. 2000 Jan;21(1):109- 13.

Seki T, Itoh H, Nakamachi T, Shioda S. Suppression of ganglion cell death by PACAP following optic nerve transection in the rat. J Mol Neurosci. 2008 Nov;36(1-3):57-60.

Silveira MS, Costa MR, Bozza M, Linden R. Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide prevenís induced cell death in retinal tissue through activation of cyclic AMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 2002 May 3;277(18):16075-80.

Ventura LM, Porciatti V. Pattern electroretinogram in glaucoma.

Curr Opin Ophthalmol. 2006 Abril; 17(2): 196-202.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Formulaciones oftálmicas tópicas que contienen un portador y un PACAP (Polipéptido Activador de la Adenilato Ciclasa de la Pituitaria) para usarse en el tratamiento de déficits visuales relacionados con glaucoma.

2.- Las formulaciones de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque PACAP es PACAP 27 o PACAP 38.

3.- Las formulaciones de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizadas además porque los déficits visuales están relacionados con una etapa temprana de glaucoma, antes del inicio de la muerte de células ganglionares.

4. - Las formulaciones de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas además porque están en la forma de soluciones, suspensiones, geles o ungüentos que contienen PACAP en concentraciones que varían de 0.2 a 50 pg/µ?.

5. - Las formulaciones de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas además porque el portador es una solución salina que opcionalmente contiene agentes que incrementan la viscosidad seleccionados de carboximetilcelulosa, Carbopol, hidroxipropilcelulosa, polisacáridos, glicosaminoglicanos y mezclas y derivados de los mismos.

6.- Las formulaciones de conformidad con la reivindicación 5, caracterizadas además porque el agente que incrementa la viscosidad es el polisacárido de semilla de tamarindo (TSP).

7.- Las formulaciones de conformidad con la reivindicación 6, caracterizadas además porque el TSP está presente en concentraciones de 0.05 a 2% (peso/volumen - p/v).

8. - Las formulaciones de conformidad con la reivindicación 5, caracterizadas además porque el agente que incrementa la viscosidad es carboximetilcelulosa de sodio en porcentajes que varían de 0.01 a 2% (p/v).

9. - Las formulaciones de conformidad con la reivindicación 5, caracterizadas además porque el agente que incrementa la viscosidad es ácido hialurónico en concentraciones de 0.05 a 0.8% (p/v), opcionalmente mezclado con TSP.

10.- El uso de PACAP para preparar un medicamento en la forma de gotas para los ojos para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos de la retina, el nervio óptico y el cuerpo geniculado lateral para restaurar la visión normal en una etapa temprana de la enfermedad.

11. - El uso de las formulaciones oftálmicas tópicas como el que se reclama en las reivindicaciones 1-9, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de déficits visuales relacionados con glaucoma.

12. - Un PACAP para usarse en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina, el nervio óptico y el cuerpo geniculado lateral para restaurar la visión normal en una etapa temprana de la enfermedad, donde PACAP se formula en la forma de gotas para los ojos.