MX2013008944A - Mimeticos sinteticos de mir-124. - Google Patents

Abstract

Las modalidades se refieren a los métodos y composiciones que involucran los miméticos de miR-124. En algunas modalidades, existen moléculas de ARN de doble hebra con nucleótidos modificados que tienen una hebra activa con una secuencia miR-124 y una hebra pasajera complementaria.

Description

MIMETICOS SINTETICOS DE MIR-124 Campo de la Invención La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y a la medicina. Más específicamente, existen métodos y composiciones que involucran moléculas de ARN con al menos las propiedades funcionales de miR-124 y en algunas modalidades, características mejoradas relacionadas a miR-124 para el tratamiento de trastornos y/o condiciones.

Antecedentes de la Invención En 2001, varios grupos utilizaron un método de clonación para aislar e identificar un gran número, de "microARNs" (miARNs) de C. elegans, Drosophila , y humanos (Lau et al, 2001; Lee y Ambros, 2001; Lagos-Quintana et al, 2003) .

Las secuencias maduras humanas publicadas de microARN, descritas en la base de datos miRBase 15.0 (Griffths-Jones et al, 2006) , están en el intervalo de tamaño de 16-27 nucleótidos de longitud y surgen de precursores más largos. Los precursores forman estructuras que se pliegan hacia atrás sobre sí mismas en regiones auto-complementarias y son procesadas por la nucleasa Dicer (en animales)" o DCL1 (en plantas) para generar el miARN maduro de doble hebra, corto. Una de las hebras maduras de miARN es incorporada dentro de un complejo de proteínas y miARN llamado el Ref.242981 complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) . El miARN guía el complejo RISC hacia un mARN objetivo, el cual es luego escindido o traduccionalmente silenciado, dependiendo del grado de complementariedad de secuencia del miARN a su mARN objetivo. Actualmente, se cree que la complementariedad perfecta o casi perfecta conduce a la degradación del mARN, como es más comúnmente observado en plantas. En contraste, el apareamiento de base es imperfecto, como principalmente encontrado en animales, conduce al silenciamiento traduccional . Sin embargo, datos recientes sugieren la complejidad adicional (Bagga et al, 2005; Lim et al, 2005), y los mecanismos de silenciamiento de genes por miARNs permanecen bajo estudio intenso.

Los estudios han mostrado que los cambios en los niveles de expresión de numerosos miARNs están asociados con diversos cánceres (revisado en Calin y Croce, 2006; Esquela-Kerscher y Slack, 2006; Wiemer, 2007) . Los miARNs han sido también implicados en la regulación del crecimiento celular y la diferenciación celular y tisular - procesos celulares que están asociados con el desarrollo del cáncer.

La actividad de una variedad de miARNs ha sido identificada y analizada. Aunque los miméticos de miARN efectivos ha sido identificados previamente en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación 20080050744, la cual se incorpora por referencia en la presente, existe una necesidad para miméticos de miARN adicionales que mejoran en gran medida una o más propiedades del miARN de origen natural, particularmente ya que estas moléculas se mueven desde el laboratorio hacia la clínica.

Breve Descripción de la Invención Los microARNs terapéuticos deben ser estables, activos, y especialmente hibridarse con el objetivo de mARN correcto. Las modalidades se refieren a los miméticos miR-124 que ha mantenido y/o aumentado la resistencia a la digestión por nucleasas, la capacidad de hibridación con los mARNs objetivo, correctos, y/o la funcionalidad.

Las modalidades se refieren a diferentes moléculas de ARN que contienen la secuencia de un miR-124 maduro. Las moléculas de ARN pueden ser doble hebra y/o de extremo romo, lo cual significa que la molécula es de doble hebra a todo lo largo de la molécula y/o de extremo romo sobre ambos extremos. Además, las modalidades se refieren a modificaciones químicas de tales moléculas de ARN para producir los miméticos de miR-124 con propiedades mejoradas o aumentadas. La hebra activa de una molécula de ARN de doble hebra contiene la secuencia de miR-124 maduro. En ciertas modalidades, la secuencia de una hebra de una molécula de ARN de doble hebra consiste de la secuencia madura de miR-124.

En algunas modalidades, existe una molécula de ARN que es de doble hebra, lo que significa que la molécula está compuesta de dos polinucleótidos o hebras que pueden ser separadas una de la otra. Una molécula de doble hebra no incluye una molécula de horquilla, la cual es una hebra o polinucleótido . En algunas modalidades, la molécula de AR es de extremo romo sobre uno o ambos extremos. En una doble hebra molécula de ARN, una o ambas hebras pueden ser de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo derivable en éste. En ciertas modalidades, una molécula de extremo romo, de doble hebra es de 20, 21 ó 22 pares de bases (bps) de longitud.

Se contempla que en algunas modalidades una molécula de ARN de doble hebra contenga dos hebras que son completamente complementarias una con la otra, lo cual da como resultado una molécula que es necesariamente de extremo romo.

En ciertas modalidades, una molécula de ARN tiene una hebra activa que comprende una secuencia miR-124 humana madura ( 5 ' -UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3 ' ) (SEQ ID No.: 1) (20-Mer) . En ciertas modalidades, la secuencia miR-124 madura tiene la secuencia de la SEQ ID No.: 1 y una U adicional en el extremo 5' y una A extra en el extremo 3' ( 5 ' -UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA-3') (SEQ ID No.: 2) (22-mer) . De este modo, en .ciert-as modalidades, una molécula de ARN tiene una hebra activa con la secuencia de los nucleótidos 2 a la 21 de la SEQ ID No.: 2. En modalidades adicionales, una molécula de ARN tiene una hebra activa con la secuencia de los nucleótidos 2 a la 21 de la SEQ ID No. : 2, pero es 21 ó de 22 nucleótidos de longitud debido a que 1) en el extremo 5' existe un nucleótido adicional seleccionado del grupo que consiste de A, C, G, y U y/o 2) en el extremo 3' existe un nucleótido adicional ' seleccionado del grupo que consiste de A, C, G, U. De este modo, una molécula de ARN con una hebra activa que tiene la secuencia de la SEQ ID No.: 2 es específicamente contemplada en la modalidad discutida en el enunciado previo. En algunas modalidades, la hebra activa tiene un nucleótido modificado en una o más posiciones internas.

Por convención, las secuencias discutidas en la presente son descritas 5' a 3' a no ser que se especifique de otro modo. Además, una hebra que contiene la secuencia de la SEQ ID No. tiene esa secuencia desde 5' a 3' a no ser que se especifique de otro modo.

El término "posiciones internas" se refiere a una posición que no es ni la primera ni la última posición en la hebra. El término "nucleótido modificado" significa un nucleótido o nucleósido (si se hace referencia ' a la nucleobase en la posición 5') con una porción adicional o una porción de reemplazo comparada a un nucleótido no modificado. Con las hebras activas que contienen uno o más nucleótidos modificados, se contempla que no existan menos de, o que no existan más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ó 15 nucleótidos modificados, o cualquier intervalo derivable en éstos. Se contempla específicamente, que en algunas modalidades, menos que cada nucleótido en la hebra activa sea modificado, y que menos de la mitad de los nucleótidos en la hebra activa sean modificados en ciertas modalidades. Además, en algunas modalidades, se contempla específicamente que una hebra activa que tienen múltiples nucleótidos modificados no tiene cada nucleótido o cada nucleótido en la hebra activa modificada. Los miméticos de miARN descritos en la presente son específicos de secuencia y/o de posición.

En algunas modalidades, la hebra activa comprende al menos dos nucleótidos modificados. En modalidades adicionales, la hebra activa no tiene un nucleótido modificado en las dos primeras posiciones en cada extremo. En otras modalidades, la hebra activa no comprende un nucleótido modificado en las cuatro primeras posiciones del extremo S'".

En algunas modalidades, una hebra activa puede comprender una secuencia miR-124 madura de la SEQ ID No: 1 ( 5 ' -UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3 ') o comprender la secuencia de nucleótidos 2 a 21 de la SEQ ID No: 2 (5'-UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA-3 ' ) . La SEQ ID No: 2 madura tiene la secuencia de miR-124 de la SEQ ID No: 1 en conjunto con una U adicional en el extremo 5' y una A extra en el extremo 3'. En cualquiera de estas modalidades, la hebra activa comprende la misma secuencia. En modalidades adicionales, una hebra' activa tiene una secuencia que comprende o consiste de la SEQ ID No: 2. En algunas modalidades, una hebra activa puede tener nucleótidos modificados en la que la identidad de los nucleótidos modificados es relativa a la SEQ ID No: a la que se refiere.

En modalidades especificas, los nucleótidos modificados en la hebra activa son los nucleótidos situados en las posiciones 5 (G) , 6 (G) , 7 (C) , 8 (A), 11 (C) , 12 (G) , 17 (A), 18 (U), 19 (G), y/o 20 (C) con respecto a la SEQ ID No: 2. Esto significa que son los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos en la posición indicada en la SEQ ID NO indicada. Por otra parte, estos nucleótidos citados están situados en las posiciones 4 (G) , 5 (G) , 6 (C) , 7 (A), 10 (C), 11 (G), 16 (A), 17 (U) , 18 (G) , y/o 19 (C) , respectivamente, en la SEQ ID No: 1. En otras modalidades, una hebra activa tiene un nucleótido modificado que se encuentra en las siguientes posiciones: 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, y/o 20 en la hebra activa.

Una hebra activa que comprende la secuencia de nucleótidos 2 a la 21 de la SEQ ID No: 2 y que tiene un nucleótido modificado en la posición 5 con respecto a la SEQ ID No: 2 significa que la primera G en la secuencia -de 2-21 de la SEQ ID NO : 2 se modifica. En otras palabras, a menos que se especifique lo contrario, los nucleótidos modificados en el contexto de una SEQ ID NO son específicos de nucleótidos. Con una hebra activa de 22 bases que comprende la SEQ ID No: 2 (22 residuos de longitud), las posiciones de los nucleótidos modificados en comparación con la SEQ ID No: 2 constituyen las mismas posiciones indicadas en la hebra activa de 22 bases, porque la hebra activa de 22- bases tiene la misma secuencia que la SEQ ID No: 2. Bajo estas circunstancias, los nucleótidos modificados en la hebra activa son los nucleótidos situados en las posiciones 5 (G) , 6 (G), 7 (C), 8 (A)., 11 (C), 12 (G) , 17 (A ) , 18 (U), 19 (G) , y/o 20 (C) en la SEQ ID No: 2.

De este modo, en ciertas modalidades, una molécula de ARN tiene una hebra activa que tiene la secuencia de nucleótidos 2 a la 21 de la SEQ ID No: 2. En algunas modalidades, la hebra activa tiene un nucleótido modificado en una o más posiciones internas. En modalidades adicionales, la hebra activa comprende al menos dos nucleótidos modificados localizados en las posiciones 5 (G) , 6 (G) , 7 (C), 8 (A), 11 (C), 12 (G), 17 (A) , 18 (U) , 19 (G), "y/o 20 (C) con respecto a la SEQ ID No: 2. En otras modalidades, hay al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos modificados (o cualquier ' intervalo derivable en el mismo) localizados en las posiciones 5 (G) , 6 (G) , 7 (C) , 8 (A), 11 (C) , 12 (G) , 17 (A), 18 (U), 19 (G) , y/ó 20 (C) con respecto a la SEQ ID No: 2.

Cuando se designa la base de nucleótido particular (como una "A", "C", "G" o "U") y se describe como "relativo" a una posición en una secuencia (tal como, una SEQ ID No: 2), esto significa que la modificación de ese nucleótido particular designado se contempla en la hebra incluso si cambia su posición por 1 ó 2 posiciones (± 1 o ± 2 posiciones) (debido a una supresión o inserción con respecto a la secuencia de referencia) . En otras modalidades, un nucleótido modificado se describe con respecto a la posición en la hebra y no como con relación a una SEQ ID No: 2 particular, en cuyo caso, la posición se refiere a la posición en la hebra, donde el extremo 5' de la hebra comienza con la posición 1 y continúa a través de 2, 3, 4, etc. hasta que se alcanza la posición del nucleótido en el extremo 3'.

En ciertas modalidades, la hebra activa comprende no más de seis nucleótidos modificados.

En otras modalidades, la hebra activa tiene un nucleótido modificado en una o más de las siguientes posiciones 1 (U) , 2 (U) , 3 (A), 4 (A), 9 (C) , 10 (G ) , 11 (C), 12 (G), 13 (G), 14 (U) , 15 (G) , 16 (A), 21 (C) , y/o 22 (A) con respecto a la SEQ ID No: 2. En otras modalidades, la hebra activa tiene un nucleótido modificado en la posición 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 20, 21, y/o 22 en la hebra activa. Estas pueden ser en lugar de o además de modificaciones en otras posiciones discutidas en- este documento.

En algunas modalidades, la hebra activa comprende un nucleotido modificado en las posiciones 7 (C) y 8 (A) con respecto a la SEQ ID No: 2. En modalidades adicionales, la hebra activa comprende además un nucleotido modificado en las posiciones 17 (A) y 18 (U) en relación con la SEQ ID No: 2 o un nucleotido modificado en las posiciones 9 (C) , 10 (G) , 11 (C) , y 12 (G) con relación a la- SEQ ID No: 2. En otras modalidades, la hebra activa tiene un nucleotido modificado en la posición 8, 9, 10, 12, 16, 17, y/o 18 en la hebra activa. Estas pueden ser en lugar de o además de modificaciones en otras posiciones discutidas en este documento .

En algunas modalidades, las moléculas de ARN que son de doble hebra contienen tanto una hebra activa que comprende toda o parte de la secuencia de un miARN maduro y una hebra pasajera total o parcialmente complementaria a la hebra activa. En . algunas modalidades, la hebra pasajera es, es por lo menos, o es como máximo 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99, ó 100% complementaria, o cualquier intervalo derivable en el mismo, a la hebra activa. En ciertas modalidades, las hebras activas y pasajeras son totalmente complementarias entre si.

Con hebras pasajeras que contienen uno o más nucleótidos modificados, se contempla que hay, no hay menos de, o no hay más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ó 15 nucleótidos modificados, o cualquier intervalo derivable en el mismo. Se contempla específicamente que en algunas modalidades, menos de todos los nucleótidos en la hebra pasajera es modificado, y que menos de la mitad de los nucleótidos en la hebra pasajera se modifican en ciertas modalidades. Por otra parte, en algunas modalidades, se contempla específicamente que se modifica una hebra pasajera que tiene múltiples nucleótidos modificados no tiene todos los otros nucleótidos en la hebra pasajera.

En tales modalidades, la hebra pasajera comprende una modificación de nucleótido en el extremo 5' , que puede ser referido como una modificación 5' terminal. Tal modificación terminal puede ser con respecto al nucleótido (o nucleósido si carece de un grupo fosfato) en el extremo 5' . Esta modificación terminal se contempla específicamente en algunas modalidades para ser una modificación que no 'es "una modificación de una molécula de azúcar. Se contempla específicamente que esta modificación puede ser una de las siguientes: N¾, biotina, un grupo amino, un grupo alquilamino inferior, NHCOCH3, un grupo acetilo, 2'0-Me, DMTO, fluoresceína, un tiol, acridina, Espaciador 18; (PEG) amidita (DMT-hexa (etilenglicol) ) , o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad. En modalidades específicas, la modificación 5' terminal en la hebra pasajera es un enlazádor de amina C6. En otras modalidades, el nucleótido en el extremo 5' de la hebra pasajera puede tener tanto una modificación no azúcar y una modificación de azúcar.

En algunas modalidades, una hebra pasajera contiene al menos un nucleótido modificado en los primeros seis nucleótidos y/o los últimos seis nucleótidos con respecto al extremo 5' de la hebra pasajera. En otras modalidades, la hebra pasajera tiene, tiene al menos, o tiene a lo sumo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más nucleótidos modificados , o cualquier intervalo derivable en el mismo.

En ciertas modalidades, la hebra pasajera comprende un nucleótido modificado situado en las posiciones 1 (U) , 2 (G), 3 (G), 4 '(C), 5 (A), 6 (T) , 13 (C ) , 14 (G) , 15 (U) , 16 (G), 17 (C), 18 (C), 19 (U), 20 (U) , 21 (A), y/o 22 (A) con respecto a la SEQ ID No: 4 ( 5 ' -UGGCAUUCACCGCGUGCCUUAA-3 ' ) . La SEQ ID No: 4 contiene una secuencia que es totalmente complementaria a la SEQ ID No: 2. La SEQ ID No: 4 tiene una U extra en el extremo 5' y una A extra en el extremo 3' en comparación con el complemento de la secuencia de miR-124 humana en la base de datos miRBase 16,0 (Griffths-Jones et al, 2006) (la secuencia madura de miR-124 es la SEQ ID No: 1, y su complemento es la SEQ ID No: 3) . En algunas modalidades, una hebra pasajera consiste de o comprende la SEQ ID No:: 3, pero no consiste de o comprende la SEQ ID No: A. Los nucleótidos modificados con relación a la SEQ ID No: 4 (expuesta anteriormente) corresponden en la SEQ ID No: 3 (5'- GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3 ' ) a aquellos en las posiciones 1 (G) , 2 (G), 3 (C), 4 (A), 5 (U), 12 (C) , 13 (G) , 14 (U) , 15 (G) , 16 (C), 17 (C), 18 (U), 19 (U) , y/o 20 (A).

En algunas modalidades, una hebra pasajera comprende un nucleótido modificado como posiciones 1 (U) y 22 (A) con respecto a la SEQ ID No: 4. En otras modalidades, la hebra pasajera comprende un nucleótido modificado como posiciones 2 (G) y 21 (A) con respecto a la SEQ ID No: 4, que puede ser., además de o en lugar de las modificaciones en las posiciones 1 (U) y 22 (A ) . En ciertas modalidades, la hebra pasajera comprende un nucleótido modificado en las posiciones 1 (U), 2 (G), 3 (G), 20 (U), 21 (A), y 22 (A) con respecto a la SEQ ID No: 4. Se contempla además que la hebra pasajera puede comprender o comprender adicionalmente un nucleótido modificado en la posición 4 (C) con respecto a la SEQ ID No: 4. En otras modalidades, la hebra pasajera comprende además un nucleótido modificado en las posiciones 5 (A) y 6 (U) con respecto a la SEQ ID No: 4, además de los nucleótidos modificados en las posiciones i) 1 (U) y 22 (A) y/o ii) 4 (C) con respecto a la SEQ ID No: 4.

En ciertas modalidades, la hebra pasajera no tiene un nucleótido modificado localizado en las posiciones 7 (U) , 8 (C), 9 (A), 10 (C), 11 (C) o 12 (G) con respecto a la SEQ ID No: 4, mientras que en otras modalidades se contemplan una o más posiciones relativas a la SEQ ID No: 4. ' ; Se contemplan las combinaciones de una hebra activa particular y una hebra pasajera particular. Se contempla que cualquier hebra activa descrita en este documento puede combinarse con cualquier hebra pasajera descrita en este documento para formar una molécula de ARN de doble hebra. En algunas modalidades, hay una hebra pasajera que comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 2 (G) y 21 (A) con respecto a la SEQ ID No: 4 y una hebra activa que comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 7 (C) y 8 (A) con respecto a la SEQ ID No: 2. En otras modalidades, la hebra pasajera comprende además nucleótidos modificados en las posiciones 1 (U) y 22 (A) en la SEQ ID No: 4, que pueden ser en lugar de o además de las modificaciones en las posiciones 3 (G) y 20 (U) con relación a la SEQ ID No: 4. En modalidades adicionales, la hebra activa puede comprender además los nucleótidos modificados en las posiciones 17 (A) y 18 (U) con relación a la SEQ ID No: 2.

. En algunas modalidades, existe una molécula de ARN de doble hebra, de extremos romos, con 1) una hebra activa con la secuencia de la SEQ ID No: 2 y los nucleótidos modificados en las posiciones 7 (C) y 8 (A) , y opcionalmente también en las posiciones 9 (C) , 10 (G) , 11 (C) , y 12 (G) y/o las posiciones 17 (A) y 18 (U) con relación a la SEQ ID No: 2, y 2) una hebra pasajera con una modificación 5·' terminal y modificaciones de nucleótidos en el primero y los tres últimos nucleótidos, y modificaciones de nucleótidos también opcionalmente en la posición 4 (C) , 5 (A) , y/o 6 (T) con respecto a la SEQ ID No: 4. En ciertas modalidades, esta combinación de hebras activas y pasajeras tiene una modificación terminal 5' de la hebra pasajera en la que la modificación terminal es un alquilamino tal como un enlazador de amina C6, y las modificaciones de nucleótidos están en el azúcar en la posición 2'. En modalidades especificas, la modificación de azúcar es un 2 'OMe .

En algunas modalidades, existe una molécula de ARN de doble hebra, de extremos romos de 20 a 22 pares de bases de longitud que comprende: a) una hebra activa que comprende: i) la secuencia de nucleótidos 2 a la 21 de SEQ ID No: 2 y ii) un nucleótido modificado en- una o más posiciones internas, en el que la hebra no tiene un nucleótido modificado en su extremo 5' y hay no más de 10 nucleótidos modificados; y, b) una hebra pasajera separada que es totalmente complementaria a la hebra activa y comprende una modificación de nucleótido en el extremo 5' y al menos un nucleótido modificado más, en donde los nucleótidos situados en las posiciones 7-19 en relación a la SEQ ID No: 2 no se modifican. En modalidades específicas, la hebra activa comprende la secuencia de la SEQ ID No: 2.

En modalidades adicionales, existe una molécula de ARN de doble hebra, de 20 a 22 pares de bases de longitud, en la que la molécula de ARN es de extremos romos en ambos extremos, que comprende una hebra activa que tiene la secuencia de nucleótidos 2 a 21 de la SEQ ID No: 2 y una hebra pasajera separada y totalmente complementaria con un nucleótido modificado en el extremo 5' , en el que la hebra activa comprende al menos un nucleótido modificado interno y en el que la molécula de ARN de doble hebra es más estable en presencia de una nucleasa en comparación a una molécula de ARN de doble hebra, de extremos romos, carente de cualquier modificación de un nucleótido interno.

En algunas modalidades, la molécula de ARN tiene nucleótidos que se modifican con una modificación de azúcar. En modalidades especificas, la modificación de azúcar es 2'-OMe.

Las modalidades especificas incluyen composiciones farmacéuticas que contienen una o más moléculas de ^AR diferentes, capaces de actuar como miméticos de miARN; la diferencia puede estar relacionada con la secuencia y/o el tipo o la posición de la modificación. En ciertas modalidades, las moléculas de ARN están comprendidas en una formulación de lipidos. En otras modalidades, las moléculas de ARN se pueden formular con una nanopartícula liposomal, a base de polímero, conjugado de coles'terol, complejo de ciclodextrano, polímero de polietilenimina y/o un complejo de proteínas . : ' :': : Los métodos para proporcionar la actividad de miR-124 a una célula se exponen también en las modalidades. En algunas modalidades, existen métodos para proporcionar la actividad de miR-124 a una célula, que comprende administrar a la célula una cantidad eficaz de una molécula de ARN que tiene actividad de miR-124. En algunas modalidades, la célula es una célula de cáncer. Tales moléculas de ARN se discuten en toda esta descripción.

Otros métodos incluyen un método para disminuir la proliferación celular, que comprende administrar a la célula una cantidad eficaz de una molécula de ARN de miR-124, tales como las moléculas de ARN de doble hebra discutidas en este documento. Modalidades adicionales incluyen métodos para inducir la apoptosis en una célula, que comprende administrar a la célula una cantidad eficaz de las moléculas de ARN. Otras modalidades se refieren a métodos para tratar el cáncer en un paciente, que comprenden administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende una o más de las moléculas, de ARN que tienen la función de miAR . Otras modalidades se refieren a métodos para inhibir la progresión a través del ciclo celular mediante la administración de una cantidad eficaz de · uno o más miméticos de miR-124 discutidos en este documento. En algunas modalidades, los métodos comprenden, además, administrar al paciente una terapia adicional contra el cáncer. En algunas modalidades, un paciente que ha sido probado para y/o diagnosticado con cáncer .

Otras modalidades se refieren a la utilización de moléculas de ARN para el tratamiento de las células cancerosas, o su uso en la disminución de la proliferación celular, la inducción de la apoptosis o la provisión de una función de miR-124 a una célula. Se contempla específicamente para el uso con células humanas y pacientes humanos.

Las composiciones y métodos para su uso pueden "comprender", "consistir esencialmente de", o "consistir de" cualquiera de las moléculas o pasos descritos a todo lo largo de la descripción. Con respecto a la fase transicional "que consiste esencialmente de", y en un aspecto no limitante, una característica básica y novedosa de las composiciones y métodos descritos en esta descripción incluye la actividad del mimético de miARN .

El uso de la palabra "un", "uno" o "una" cuando se utiliza en conjunto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la descripción puede significar "uno", pero es también consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más de uno".

Se contempla que cualquier modalidad discutida en la presente puede ser implementada con respecto a cualquier método o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones y kits de la invención pueden ser utilizados para llevar a cabo los métodos de la invención.

A todo lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" es utilizado para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o el método que es empleado para determinar el valor.

El uso del término "o" en las reivindicaciones es utilizado para dar entender "y/o" a no ser que se indique explícitamente para referirse a las alternativas únicamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción apoya una definición que se refiere únicamente a las alternativas y "y/o." Se contempla también que cualquier cosa listada utilizando el término "o" puede ser también específicamente excluida.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se volverán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, no obstante, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras que indican modalidades específicas de la invención, se dan a manera de ilustración únicamente, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Descripción Detallada de la Invención Las modalidades están dirigidas a las composiciones y métodos relacionados a los miARNs, asi como al uso de los miméticos de miARN. Los métodos incluyen la preparación de tales miméticos y el uso de tales miméticos para proporcionar actividad o función de miARN a una célula. En ciertas modalidades, miméticos de miARN son utilizados para aplicaciones terapéuticas, de pronóstico, y de diagnóstico, particularmente aquellos métodos y composiciones relacionados a las aplicaciones terapéuticas para condiciones o trastornos en los cuales está involucrada la actividad o la función de miARN.

I . Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos incluyen las secuencias o segmentos de secuencias que son secuencias idénticas o complementarias a las moléculas maduras de microARN ("miARN" - o "miR") . Las moléculas maduras de miARN son en general de 21 a 22 nucleótidos de longitud, aunque han sido reportadas longitudes de 16 y hasta 27 nucleótidos. Los miARNs son cada uno procesados a partir de una molécula de ARN precursora más larga ("miARN precursor"). Los miARNs precursores son transcritos a partir de los genes que no codifican para la proteina. Los miARNs precursores tienen dos regiones de complementariedad que hace posible que formen una estructura de tallo-bucle o similar a un plegamiento, que es escindido en animales por una enzima nucleasa similar a la ribonucleasa III, llamada Dicer. El miARN procesado es típicamente una porción del tallo.

El miARN procesado (también denominado como "miARN maduro") se vuelve parte de un complejo grande para disminuir un gen objetivo particular. Los ejemplos de miARNs animal incluyen aquellos que se aparean en bases de manera imperfecta con el objetivo, lo cual impide la traducción (Olsen et al., 1999; Seggerson et al., 2002). Las moléculas de siARN son también procesadas por Dicer, pero a partir de una molécula de ARN de doble hebra, larga. Los siARNs no son naturalmente encontrados en las células animales, pero pueden dirigir la escisión especifica de la secuencia de un objetivo de mARN a través de un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) (Denli et al., 2003).

A. miR-124 Se demostró previamente que el hsa-miR-124 está involucrado con la regulación de numerosas actividades celulares que representan puntos de intervención para la terapia contra el cáncer . y para la terapia de otros trastornos y enfermedades (Solicitudes de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 11/141,707 presentada el 31 de Mayo del 2005 y No. de Serie 11/273, 640 presentada el 14 de Noviembre del 2005, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . Por ejemplo, la proliferación celular, la división celular, ' y '"' la supervivencia celular son frecuentemente alteradas en cánceres humanos. La transíección de las células de carcinoma pulmonar humano (?549) y las células de cáncer cervical humano (HeLa) con el hsa-miR-124 sintético, redujo el número de células viables. Además, los inventores mostraron que miR-124 incrementó significativamente la capacidad de dos compuestos terapéuticos (TRAIL, un activador de la vía de la apoptosis en las células cancerosas, y etopósido, un inhibidor de la topoisomerasa II que activa la vía de la apoptosis en células cancerosas y células normales) para inducir la muerte celular en las células A549 o HeLa. La sobreexpresión de miR-124 sintético con diversas líneas celulares disminuyó la proliferación celular. En estos estudios, los inventores observaron la proliferación reducida de las células de cáncer de mama humano (BT549), las células epiteliales de mama humano normales (MCF12A) , las células de cáncer cervical humano (HeLa) , las células de carcinoma prostético humano (22RV1), las células de carcinoma de células básales humanas (TE 354. T), las células de piel humana normales (TE 353.5 k) , y las células de carcinoma pulmonar humano (A549, CRL-5826, HTB-57) . La sobreexpresión de miR-124 en las células HeLa redujo de manera significativa el . número de células en la fase G2/M del ciclo Celular, cuando se compararon a las células transíectadas con un miARN control negativo. Los inventores demostraron previamente que hsa-miR-124 regula la expresión de muchos genes que funcionan en la transducción de las señales intracelulares en respuesta a los estímulos mitóticos o apoptóticos (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre del 2008, la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . También, otros han observado recientemente que el silenciamiento epigenético de miR-124 en las células cancerosas modulan la actividad del oncogén, CDK6 y el gen supresor de tumores, Rb (Lujambio et al, 2007) .

Hsa-miR-124 afecta la señalización intracelular a diversos niveles y controla la expresión de las proteínas secretoras, los receptores del factor de crecimiento transmembranal , y las moléculas de señalización citoplásmica. Las proteínas secretoras incluyen el factor 2 de crecimiento de fibroblastos (FGF2, por sus siglas en inglés), la proteína 1 y 3 de enlace al factor de crecimiento de insulina (iGFBPl, IGFBP3, por sus siglas en inglés), el factor beta-2 de crecimiento transformante (TGFB2, por sus siglas en inglés) , y la quimiocina inflamatoria interleucina 8 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre del 2008) . FGF-2 es una proteína secretora con potente actividad mitogénica y angiogénica que transmite su señal a las células vía los receptores transmembranales (FGFRs) compuestos de 2-3 dominios similares a la inmunoglobulina extracelulares , y un dominio ", de tirosina-cinasa intracelular (Chandler et al, 1999) . Los niveles de los mARNs de FGF-2 son incrementados en las células de cáncer renal, oral y pulmonar no microcitico (Chandler et al, 1999) . Similarmente, la IL-8 es frecuentemente incrementada en diversos cánceres y correlaciona con la vascularización tumoral, la metástasis y el pronóstico pobre (Rosenkilde y Schwartz, 2004; Sparmann y Bar-Sagi, 2004). TGFB2 es el ligando correspondiente para los receptores de TGF-beta (TGFBR, por sus siglas en inglés) , una clase de receptores que pueden funcionar como supresores tumorales (Massague et al, 2000) .

Las proteínas asociadas a la membrana, reguladas por hsa-miR-124 son derivadas del receptor similar al factor de crecimiento derivado plaquetas (PDGFRL; también denominado como supresor de tumor similar al receptor beta de PDGF, PRLTS) y la proteína 2 de la familia de asociación de Ras 2 (RASSF2) . (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre ' del 2008). RASSF2 es un candidato supresor de tumores que es frecuentemente disminuido en las líneas de células tumorales pulmonares (Vos et al, 2003) . RASSF2 interactúa con -Ras y promueve el paro del ciclo celular y la apoptosis. PDGFRL también funciona como un supresor tumoral que muestra pérdida de la función en una pluralidad de cánceres ya sea por pérdida del carácter heterocigoto (LOH, por sus siglas en inglés) o la mutación por mal sentido y desplazamiento estructural (Fujiwara et al, 1995; Komiya et al, 1997). Ya que el tratamiento de las células cancerosas con hsa-miR-124 conduce a niveles de expresión reducidos de FGF2, IL8 e IGFBPs, y a niveles de expresión incrementados de TGFB2, RASSF2 y PDGFRL, hsa-miR-124 es probable que induzca una respuesta ' terapéutica en pacientes con cáncer que muestran expresión o función aberrante de estas proteínas estimuladoras del crecimiento o inhibidoras del mismo (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre del 2008).

Las moléculas de señalización intracelular , reguladas por hsa-miR-124 incluyen la cinasa alfa IkappaB (IK alfa, CHUK) , c-Src (SRC) , la subunidad catalítica de las 3-cinasas de fosfoinosituro de la clase IA pllO.alfa. (PIK3CA) y la fosfolipasa C beta-1 (PLCB1) . PLC beta-1 cataliza la generación del inositol-1 , 4 , 5-trisfosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG) a partir del fosfatidilinositol-bis-fosfato (PIP2), regulando las señales proliferativas y los puntos de verificación del ciclo celular (Lo Vasco et al, 2004). (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre del 2008). IKKalpha es un regulador positivo de la cascada de señalización intracelular y funciona para activar el factor nuclear kappa B del factor de transcripción (NFkappaB) ( arin et al, 2002) . NFkappaB es constitutivamente activado en varios tipos de cánceres y promueve las vías anti-apoptótica y de supervivencia. La proto-oncoproteina c-Src es el homólogo humano de la v-Src aviar que ha sido aislada como el componente tumorigénico del virus de Sarcoma de Rous Sarcoma (RSV) (Rous, 1911; Stehelin et al, 1976; Yeatman, 2004). c-Src es una tirosina-cinasa asociada a la membrana que es activada en respuesta a la señalización intracelular o indirectamente a los estímulos extracelulares por el enlace a las tirosinas-cinasas del receptor activadas, incluyendo EGFR, ERBB2, PDGFR y FGFR. Src es una molécula crucial en una red compleja de proteínas de interacción, regulando la adhesión celular, la motilidad, la invasión y la proliferación. c-Src es frecuentemente sobreexpresada o hiperactividad en numerosos tipos de cáncer (Yeatman, 2004). El producto génico de PI 3CA activa la vía de señalización de Akt en respuesta a la mayoría de las tirosinas-cinasas receptoras con dirección 5' (Vanhaesebroeck et al, 1997). PIK3CA frecuentemente adquiere una ganancia de función en la gran mayoría de los cánceres humanos, ya sea por amplificación o sobreexpresión, tal como en los cánceres de ovario y cervicales, o mediante la activación de . las mutaciones somáticas (Bader y Vogt, 2004; Bader et al, 2005). PIK3CA se ha vuelto un nuevo objetivo farmacológico en la industria farmacéutica, y es también un objetivo predicho de hsa-miR-124. Con base en los datos previos de los inventores (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre del 2008, la cual es incorporada por referencia en la presente) , hsa-miR-124 regula negativamente estas proteínas y por lo tanto es probable que funcione como un miARN supresor de tumores.

Otra más clase de genes y sus proteínas correspondientes que son reguladas por hsa-miR-124, funciona en la progresión del ciclo celular (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre del 2008). Algunas de estas proteínas son críticas en la transición a través de las fases Gl y S, tales como las ciclinas A2 y E2 (CCNA2, CCNE2), las cinasas 2, 4 y 6 dependientes de ciclina (CDK2, CDK4, CDK6) y el ciclo 6 de la división celular (CDC6) . Otras son requeridas para la progresión a través del punto de verificación de husillo de G2/M y la segregación adecuada de las cromátides hermanas durante la mitosis, para mantener la estabilidad cromosómica. Éstos incluyen las cinasas A y B aurora (AURKA, también conocida como STK6; AURKB, también conocida como STK12), el cáncer de mama 1 y 2 (BRCA1; BRCA2) , la gemación no inhibida por bencimidazoles 1 (BUB1), la gemación no inhibida por bencimidazoles 1 beta (BUB IB) , la cinasa 1 similar a polo (PLK1), la cinasa 1 dependiente de ciclina (CDK1, también conocida como CDC2), las ciclinas Bl y B2 (CCNBl, CCNB2), y el ciclo 20 y 23 de la división celular (CDC20, CDC23, también conocida como subunidad 8 del complejo promotor de la anafase) . La mayoría de estos transcritos son regulados de una manera que sugiere que hsa-miR-124 bloquea la progresión del ciclo celular.

Otras moléculas reguladas por hsa-miR-124 que indirectamente controlan la progresión del ciclo celular son SKP2, MDM2 y AKAP12 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre del 2008). AKAP12, también denominada como gravina o SSeCKS (sustrato de cinasa C suprimido por Src) , funciona como una proteína de andamiaje de cinasa que promueve la interacción enzima-sustrato (Nauert et al, 1997). La expresión de AKAP12 interfiere con la transformación de células oncogénicas inducida por las proteínas Src o Jun in vitro y es pérdida o reducida en numerosos cánceres, tales como la leucemia y carcinomas del recto, pulmón y estómago (Lin y Gelman, 1997; Cohén et al, 2001; Xia et al, 2001; Wikman et al, 2002; Boultwood et al, 2004; Choi et al, 2004; ori et al, 2006) . Una actividad anti-oncogénica aparente de AKAP12 en la próstata y en los cánceres gástricos marca esta proteína como un supresor tumoral putativo (Xia et al, 2001; Choi et al, 2004). Skp2 es un componente del complejo de ubiquitína-ligasa de las multi-subunidad E3 que marca ..las proteínas para la degradación por proteasomas. Un objetivo bien caracterizado es el inhibidor p27 de CDK que ofrece una explicación para la actividad de promoción del ciclo celular de Skp2 (Carrano et al, 1999) . Skp2 es inherentemente oncogénico y muestra niveles elevados en diferentes tipos de cánceres (Gstaiger et al, 2001; Kamata et al, 2005; Saigusa et al, 2005; Einama et al, 2006) .

Hsa-miR-124 también gobierna la expresión de FAS, Bim (BCL2L11) y MCL1, todos los cuales están funcionalmente vinculados a la vía apoptótica (Solicitud de Patente de los Estados Unidos número de serie 12/325,971 presentada el 1 de Diciembre del 2008) . miPv-124 ha mostrado que tiene las siguientes actividades cuando es proporcionado a una célula: reduce la vialidad celular, inhibe la proliferación celular, disminuye la proliferación, e inhibe la progresión a través del ciclo celular. Estas actividades han sido mostradas en células enfermas, tales como las células del cáncer.

B. Compuestos Oligoméricos Las modalidades se refieren a los miméticos de miARN, los cuales contienen moléculas capaces de imitar la actividad de una molécula de ARN . Una molécula de ARN contiene un nucleósido, que es una combinación de base-azúcar. La porción base del nucleósido es típicamente una porción de base heterocíclica . Las dos clases más comunes de tales bases heterocíciclas son purinas y pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato covalentemente enlazado a la porción azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar en pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar enlazado a la porción del hidroxilo 2', 3' ó 5' del azúcar. Se contempla que una hebra de ARN estará compuesta de nucleótidos ( ribonucleótidos ) y que el extremo 5' puede ser un nucleótido o un nucleósido. En otras palabras, puede existir un grupo de fosfato enlazado a la porción azúcar del nucleósido o puede existir únicamente un grupo hidroxilo en vez del grupo fosfato. Como se discutió en la presente, en algunas modalidades, existe una modificación de un nucleósido o nucleótido terminal en el cual una porción o grupo químico está enlazada al azúcar a través de lo que es, o de lo que era antiguamente, un grupo hidroxilo o fosfato.

En la formación de los oligonucleótidos , los grupos fosfato enlazan nucleósidos covalentes uno al otro para formar un compuesto polimérico lineal. Los extremos respectivos de esta estructura polimérica lineal pueden estar unidos para formar una estructura circular por hibridación o por formación de un enlace covalente. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad de nucleobases internas y pueden por lo tanto plegarse de una manera para producir una estructura parcial o totalmente de doble hebra. Dentro de la estructura, los grupos fosfato son comúnmente denominados como formadores de los enlaces internucleósidos del oligonucleotido. El enlace internucleósido normal del ARN y del ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'.

En algunas modalidades, existe un ARN, una molécula de ARN, o análogo de ARN que tiene una longitud de entre 17 y 130 residuos. Las modalidades se refieren a las moléculas de miARN sintéticas que son, son al menos, o son a lo más de 15, 16,. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ó 40 o más residuos de longitud, incluyendo cualquier número entero o cualquier intervalo derivable en éstos. Cada hebra o molécula de ARN en una molécula de ARN de doble hebra puede ser de tales longitudes como se indicaron anteriormente. En algunas modalidades, una molécula de ARN tiene un extremo romo sobre uno o ambos extremos. En ciertas modalidades, la molécula de ARN tiene un extremo romo sobre un lado que tiene el .extremo 5' de la hebra activa. En otras modalidades, la molécula de ARN tiene un extremo romo sobre un lado que tiene el extremo 5' de la hebra pasajera.

Las moléculas de ARN descritas en la presente pueden tener una o dos hebras. En las moléculas con dos hebras, las dos hebras puede ser hibridadas una con la otra, pero éstas no están conectadas una con la otra por un enlace internucleósido .

En ciertas modalidades, tales moléculas de ARN que comprenden o que consisten de la SEQ ID No.: 1 o la SEQ ID No. : 2 (o que consiste de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con una de la SEQ ID Nos. indicadas) tienen un nucleotido o nucleósido modificado localizado en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, y/o 21, en una hebra pasajera (la posición 1 es el extremo 5' ) . En modalidades adicionales, un nucleotido o nucleósido modificado está localizado en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, y/o 21 en una hebra pasajera (la posición 1 es el extremo 5' ) que comprende o que consiste de la SEQ ID No.: 3, o la SEQ ID No.: 4 (o que consiste de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con una de las SEQ ID Nos. indicadas). La designación del nucleotido modificado es especifica de posición, en oposición especifica de nucleotido. En consecuencia, una modalidad en la cual '"son discutidas las modificaciones especificas de nucleótidos, por ejemplo, "una hebra pasajera que comprende nucleótidos modificados en las posiciones 2 (G) y 21 (A) con relación a la SEQ ID No.: 4," puede ser implementada en otras modalidades con respecto a posición; en consecuencia, en modalidades adicionales, una molécula de ARN puede comprender, por ejemplo, una hebra que comprende un nucleotido modificado en las posiciones 2 y 21.

En algunas modalidades, el mimético de miARN o la molécula de ARN no es de extremo romo sobre ambos lados. Se contempla que pueden existir 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 bases sobresalientes sobre el extremo 3' ó 5 'de las hebras pasajera o activas de un mimético o molécula de ARN de doble hebra.

En algunas modalidades, la hebra pasajera y la hebra activa no son completamente complementarias. Se contempla que éstas pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más nucleótidos entre las dos hebras que no son complementarias. En algunas modalidades, estos nucleótidos están dentro de los primeros 10 nucleótidos en el extremo 5' de la hebra pasajera .

Se contempla que los miméticos de ARN tengan bases de ARN, las cuales pueden o no ser modificadas. Como tales, miméticos de ARN son ARN o moléculas de ARN. Además, se entiende que un ácido nucleico, que incluye el ARN, puede tener más de una hebra. Como se discute en la presente, en algunas modalidades un mimético de miARN o molécula de ARN es de doble hebra. A no ser que se especifique de otro modo, una molécula de ARN de doble hebra o mimético de miARN se entenderá que tiene dos hebras que pueden estar separadas una de la otra, y que no están simplemente conectadas una con la otra por un ligador de horquilla. Una molécula de horquilla tiene una hebra que es capaz de realizar la hibridación intramolecular. En algunas modalidades, el mimético de miARN es una molécula de horquilla. En otras, el mimético de miARN es una molécula de ARN de doble hebra.

En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos de doble hebra terapéuticos tienen una primera hebra activa con (a) una "región de miARN" cuya secuencia de 5' a 3' es idéntica a toda o a un segmento de una secuencia de miARN madura, y una segunda hebra pasajera que tienen (b) una "región complementaria" cuya secuencia de 5' a 3' es entre 60% y 100% complementaria a la secuencia de miARN. En ciertas modalidades, estas miARN sintéticas son también aisladas, como se define más adelante, o purificadas. El término "región de miARN" se refiere a una región sobre el miARN sintético que es al menos 75, 80, 85, 90, 95, ó 100% idéntica, incluyendo todos los números enteros entre éstos, a la secuencia completa de una secuencia de miARN de origen natural, madura. En ciertas modalidades, la región de miARN es o es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 ó 100% idéntica a la secuencia de un miARN de origen natural, tal como la secuencia de miARN humana. Alternativamente, la región de miARN puede comprender 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más posiciones de nucleótidos en común con un miARN de origen natural en comparación con los algoritmos de alineamiento de secuencias y los métodos bien conocidos en la técnica.

El término "región complementaria" se refiere a una región de un miARN sintético que es, o es al menos :60% complementario a la secuencia de miARN de origen natural, madura, que es la región de miARN a la que es idéntica. La región complementaria es, o es al menos 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,. 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 ó 100%) complementaria, o cualquier intervalo derivable en éstos. Con la secuencia de polinucleótidos simples, puede existir una estructura de bucle de horquilla como resultado del enlace químico entre la región de miARN y la región complementaria. En otras modalidades, la región complementaria está sobre una hebra diferente de ácido nucleico que la región de miARN, en cuyo caso la región complementaria está sobre la hebra pasajera y la región de miARN está sobre la hebra activa.

El término "oligonucleótido" es entendido en la técnica para referirse a un oligómero o polímero o ácido ribonucleico . (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) , típicamente uno que no es mayor de 100 bases o de pares de bases de longitud. Se contempla que un oligonucleótido puede tener un nucleósido en el extremo 5' . Este término incluye los olígonucleótidos compuestos de nucleobases de origen natural, azúcares y enlaces de internucleósidos covalentes. El término "análogo de oligonucleótido" se refiere a los oligonucleótidos que tienen una o más porciones de origen natural que funcionan de una manera similar a los oligonucleótidos . Tales oligonucleótidos de origen natural pueden tener propiedades deseables en comparación a los oligonucleótidos de origen natural tales como, por ejemplo, aquellos discutidos en la presente, incluyendo, pero no limitados a, actividad fisiológica- incrementada, estabilidad incrementada en presencia de una o más nucleasas, y/o propiedades farmacocinéticas incrementadas.

El término "oligonucleósido" se refiere a los nucleósidos que son químicamente manejados vía enlaces internucleosídicos que no tienen átomos de fósforo. Los enlaces internucleosídicos incluyen alquilo de cadena corta, cicloalquilo, alquilo mezclado con heteroátomo, cicloalquilo y heteroátomos mixtos, y uno o más heteroátomos de cadena corta y uno o más heterocíclicos de cadena corta. Estos enlaces internucleosídicos incluyen, pero no están limitados a, siloxano, sulfuro, sulfóxidos, sulfona, acetilo, formacetilo, tioformacetilo, metileno, formacetilo, tioformacetilo, alquenilo, sulfamato; metilenimino, metilenhidrazino, sulfonato, sulfonamida, amida y otros que tienen partes componentes N, 0, S y CH2 mixtas. Además de las modificaciones descritas anteriormente, los nucleósidos de los compuestos oligoméricos de la invención pueden tener una variedad de otras modificaciones. Otros nucleósidos adicionales adecuados para las modalidades que tienen porciones de base modificadas y/o porciones de azúcar modificadas se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6, 383, 808 y en la solicitud del PCT PCT/US89/02323, las cuales se incorporan por referencia en la presente.

Las porciones de base alteradas o las porciones de azúcar alteradas también incluyen otras modificaciones consistentes con el propósito de un mimético de miARN . Tales compuestos oligoméricos son . mejor descritos por ser estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con, los oligonucleótidos no modificados de origen natural o sintéticos. Todos los compuestos oligoméricos tales están comprendidos por esta invención, siempre y cuando éstos funcionen efectivamente para imitar la estructura o la función de una hebra deseada de oligonucleótido de ARN o de ADN.

En algunas modalidades, los miméticos de ,,??? incluyen una modificación o sustitución de base. Las bases naturales o no modificadas en el ARN son adenina (A) y guanina (G) , y las bases de pirimidina citosina (C) y uracilo (U) (el ADN tiene timina (T) ) . En contraste, las bases modificadas, también denominadas como porciones de base heterociclicas , incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como la 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil- y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propil- y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas , 5-halo (incluyendo 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas ) , 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina .

Una o más modificaciones de bases o de azúcares pueden ser utilizadas para inducir una conformación de azúcar 3'-endo. Un nucleósido puede incorporar modificaciones sintéticas de la base heterociclica, la porción de azúcar o ambas para inducir una conformación de azúcar 3'-endo deseada. Estos nucleósidos modificados son utilizados para imitar los nucleósidos similares a la ARN, de modo que las proteínas particulares de un compuesto oligomérico pueden ser aumentadas al tiempo que se mantiene la geometría conformacional 3 ' -endo deseada (ver Esquema 1 de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación 2005/0261218, la cual se incorpora por referencia en la presente) .

En algunas modalidades, un mimético de ARN tiene una modificación particularmente del residuo 5' terminal específicamente de la hebra de un mimético de ARN que tienen la secuencia que es complementaria al miARN maduro. Esta hebra es denominada como la hebra "pasajera" en la presente. Sin estar comprometidos por alguna teoría, parece que la presencia de una porción estable diferente de un fosfato o hidroxilo del extremo 5' de la hebra complementaria, deteriora o elimina la absorción de la hebra pasajera por el complejo de la vía de miARN y favorece subsecuentemente la absorción de la hebra activa por el complejo proteico de miARN. Las modificaciones 5' incluyen, pero no están limitadas a, NH2, biotina, un grupo amina, un grupo alquilamina inferior, un grupo alquilo inferior, NHCOCH^, un grupo acetilo, 2-oxígeno-metilo (2'0-Me), DMTO, fluoresceína , un tiol, o acridina, o cualquier otro grupo con este tipo de funcionalidad. En otras modalidades, existe un Espaciador 18 (PEG) amidita (DMT-Hexa (etilenglicol) ) . En otras modalidades, existe una alquilamina o grupo alquilo de 40 átomos de carbono o menos. En algunas modalidades que involucran una alquilamina "inferior" o grupo alquilo "inferior" se entenderá que se refiere a una molécula con 20 o menos carbonos .

En modalidades específicas, existe un ligador de amina de 4 a 12 átomos de carbono sobre el extremo 5' de la hebra pasajera. En modalidades específicas., existe una amina de 6 átomos de carbono C6 sobre el fosfato terminal del primer nucleótido de la hebra pasajera: En modalidades especificas, existe un ligador de amina de 12 átomos de carbono (C12) sobre el extremo 5' de la hebra pasajera. En otras modalidades, existe un ligador de amina de 8 átomos de carbono sobre el fosfato terminal del primer nucleótido de la hebra pasajera.

En diferentes miméticos de miARN discutidos en la presente, estas moléculas de ARN pueden tener nucleótidos con porciones azúcar que corresponden a los azúcares de origen natural o los azúcares modificados. Los azúcares modificados representativos incluyen azúcares carbociclicos o aciclicos, azúcares que tienen grupos sustituyentes en una o más de sus posiciones 2', 3' ó 4' y azúcares que tienen sustituyentes en lugar de uno o más. átomos de hidrógeno del azúcar. En ciertas modalidades, el azúcar es modificado al tener un grupo sustituyente en la posición 2' . En modalidades adicionales, el azúcar es modificado al tener un grupo sustituyente en la posición 3'. En otras modalidades, el azúcar es modificado al tener un grupo sustituyente en la posición 4'. Se contempla también que un azúcar puede tener una modificación en 'más' de una de esas posiciones, o que una molécula de ARN puede tener uno o más nucleótidos con una modificación de azúcar en una posición y también uno o más nucleótidos con una modificación de azúcar en una posición diferente.

Las modificaciones de azúcar contempladas en los miméticos de miARN incluyen, pero no están limitadas a, a un grupo sustituyente de azúcar seleccionado de: OH; F; 0—, S—, o N-alquilo; 0— S—, o N-alquenilo; 0—, S— o N-alquinilo; o 0-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, el alquenilo y el alquinilo pueden ser alquilo de 1 a 10 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono sustituidos o no sustituidos, y alquinilo. En algunas modalidades, estos grupos pueden ser elegidos de: .0 (CH2) x0CH3, 0 ( (CH2) x0) yCH , 0(CH2)xNH2, 0(CH2)xCH3, 0(CH2)xONH2, y_ 0 (CH2) X0N ( (CH2) XCH3) 2, donde x e y son de 1 a 10.

En algunas modalidades, los miméticos de miARN tienen un grupo sustituyente de azúcar seleccionado de los siguientes: alquilo inferior de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, Cl, Br, CN, OCN, CF3, OCF3, S0CH3, S02CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un mimético, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un mimético, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En una modalidad, la modificación incluye 2'-metoxietoxi (2 ' -0—CH2CH2OCH3, que es también conocido como 2'-0- (2-metoxietilo) o 2'-M0E) (Martin et al., Helv, Chim. Acta 78,486-504, 1995), es decir, un grupo alcoxialcoxi . Otra modificación más incluye 2 ' -dimetilaminooxietoxi , es decir, un grupo 0 (CH2) 2ON (CH3) 2, también conocido como 2 ' -DMAOE y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2 ' -O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2 ' -DMAEOE) , es decir, 2 ' -0-CH2-O-CH2-N (CH3) 2.

Los grupos sustituyentes de azúcar adicionales incluyen alilo (-CH2-CH==CH2 ) , - O-alilo (-0-CH2-CH==CH2) , metoxi (-O-CH3) , aminopropoxi ( -OCH2CH2CH2NH2 ) , y fluoro (F). Los grupos sustituyentes de azúcar sobre la posición 2' (2'-) pueden estar en la posición del arabino (superior) o del ribo (inferior). Una modificación 2 ' -arabino es 2'-F. . Otras modificaciones similares pueden también ser realizadas en otras posiciones sobre el compuesto oligomérico, particularmente la posición 3' del azúcar sobre el nucleósido 3' terminal o en oligonucleótidos enlazados 2 '-5' y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los compuestos oligoméricos pueden también tener miméticos de azúcar, por ejemplo, porciones ciclobutilo, en lugar del azúcar pentofuranosilo . Los ejemplos de Patentes de los Estados Unidos que describen la preparación de las estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no están limitados a, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5, 646, 265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920, que son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad.

Los grupos sustituyentes de azúcar representativos incluyen los grupos descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación 2005/0261218, la cual se incorpora por referencia en la presente. En modalidades particulares, la modificación de azúcar es una modificación 2'0-Me, una modificación 2'F, una modificación 2"H, una modificación 2'amino, una modificación 4'tiorribosa o una modificación fosforotioato sobre el grupo carboxilo enlazado al carbono en la posición 6', o combinaciones de los mismos.

Modificaciones adicionales son descritas en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Publicación 2010/0267814, la cual se incorpora por referencia en la presente. Mientras que estas referencias describen modificaciones generales que pueden ser realizadas, ésta no describe lo que se describe en la presente de que las modificaciones pueden ser realizadas en el contexto de una secuencia particular de nucleótidos específicos y/o en posiciones específicas y selectas.

En algunas modalidades, un ácido nucleico terapéutico contiene uno o más elementos de diseño. Estos elementos de diseño incluyen, pero no están limitados a: (i) un grupo de reemplazo para el fosfato o el hidroxilo del nucleótido o nucleósido, respectivamente, en el extremo 5' de la región complementaria; (ii) una o más modificaciones de azúcar en los. primeros o últimos 1 a 6 residuos de la región complementaria; o, (iii) la no complementariedad entre uno o más nucleótidos en los últimos 1 a 5 residuos en el extremo 3' de la región complementaria y los nucleótidos correspondientes de la región de miARN .

En ciertas modalidades, un miARN sintético tiene un nucleótido de su extremo 5' de la región complementaria en la cual el grupo fosfato y/o hidroxilo ha sido reemplazado con otro grupo químico (denominado como el "diseño de reemplazo") . En algunos casos, el grupo fosfato es reemplazado o agregado con una porción adicional, mientras que en otras, el grupo hidroxilo ha sido reemplazado o agregado con una porción adicional, tal como se describe anteriormente con el ligador de amina C6. En modalidades particulares, la porción es biotina, un grupo amina, un grupo alquilamino inferior, un grupo acetilo, 2 ?-Me (2'oxígeno-metilo) , DMTO ( 4 , ' -dimetoxitritilo con oxígeno), fluoresceína , un tiol, o acridina, aunque son bien conocidas otras porciones para aquellos expertos en la materia y pueden ser también utilizadas.

En otras modalidades de la invención, existe un miARN sintético en el cual uno o más nucleótidos en los últimos 1 a 5 residuos en el extremo 3' de la región complementaria no son complementarios a los nucleótidos correspondientes de la región de miARN ("no complementariedad") (denominado como "diseño de no complementariedad"). La no complementariedad puede ser en los últimos 1, 2, 3, 4, y/o 5 residuos del miARN complementario. En ciertas modalidades, existe la no complementariedad con al menos 2 nucleótidos en la región complementaria.

Se contempla que una miARN sintético de la invención tenga uno o más diseños de reemplazo, de modificación de azúcar, o de no complementariedad. En ciertos casos, las moléculas de ARN sintéticas tienen dos de ellos, mientras que en otras de estas moléculas tienen los tres diseños en su sitio.

La región de miARN y la región de complementariedad pueden estar sobre el mismo o sobre polinucleótidos separados. En los casos en los cuales éstas están contenidas sobre o en el mismo polinucleótido, la molécula de miARN será considerada un polinucleótido simple. En modalidades en las cuales las diferentes regiones están sobre polinucleótidos separados, el miARN sintético será considerado cómo comprendido de dos polinucleótidos.

Cuando la molécula de ARN es un polinucleótido simple, existe una región ligadora entre la región de miARN y la región complementaria. En algunas modalidades, el polinucleótido simple es capaz de formar una estructura de bucle de horquilla como resultado del enlace entre la región de miARN y la región complementaria. El ligador constituye el bucle de horquilla. Se contempla que en algunas modalidades, la región ligadora sea, sea al menos, o sea a lo más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ó 40 residuos de longitud, o cualquier intervalo derivable en éstos. En ciertas modalidades, el ligador está entre 3 y 30 residuos (inclusive) de longitud.

Además de tener una región miARN y una región complementaria, pueden existir secuencias flanqueantes también ya sea en el extremo 5' ó 3' de la región. En algunas modalidades, existe o hay al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleótidos o más, o cualquier intervalo derivable en éstos, flanqueando uno o ambos lados de estas regiones. : Las moléculas de ARN con la función de miARN pueden ser, ser al menos, o ser a lo más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, , 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ó 1000 nucleótidos, o cualquier intervalo derivable en éstos, de longitud. Tales longitudes cubren las longitudes del miARN procesado, las sondas de miARN, el miARN precursor, los vectores que contienen miARN, los ácidos nucleicos control, y otras sondas y cebadores. En muchas modalidades, los miARN son de 19-24 nucleótidos de longitud, mientras que las sondas de miARN son de 5, 10, 15, 20, 25, 30, a 35 nucleótidos de .longitud, incluyendo todos los valores e intervalos entre éstos, dependiendo de la longitud del miARN procesado y cualesquiera regiones flanqueantes agregadas. Los precursores de miARN son en general entre 62 y 110 nucleótidos en humanos.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden tener regiones de identidad o complementariedad a otro ácido nucleico. Se contempla que la región de complementariedad o de identidad puede ser al menos 5 residuos contiguos, aunque se contempla específicamente que la región sea, sea al menos, o sea a lo más de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, ó 110 nucleótidos contiguos. Se entiende además que la longitud de la complementariedad dentro de un miARN precursor o entre una sonda de miARN y un miARN o un gen de miARN son de tales longitudes. Además, la complementariedad puede ser expresada como un porcentaje, lo que significa que la complementariedad entre una sonda y su objetivo de 90% idéntica o mayor sobre la longitud de la sonda. En algunas modalidades, la complementariedad es, o es al menos de 90%, 95% ó 100% idéntica. En particular,- tales longitudes pueden ser aplicadas a cualquier ácido nucleico que comprenda una secuencia de ácido nucleico identificada en cualquiera de la SEQ ID Nos., descritas en la presente.' El término "recombinante" puede ser utilizado y éste se refiere en general a una molécula que ha sido manipulada in vitro o que es un producto replicado o expresado de tal molécula.

El término "miARN" en general se refiere a una molécula de ARN que tienen una secuencia y función de una molécula de miARN. En modalidades especificas, las moléculas implementadas en la invención abarcarán también una región o una hebra adicional que es parcialmente (entre 10 y 50%) complementaria a través de la longitud de la hebra) , sustancialmente (más de 50% pero menos de 100% complementaria a través de la longitud de la hebra) o completamente complementaria a otra región más de la misma molécula de hebra simple o a otro ácido nucleico. De este modo, los ácidos nucleicos pueden abarcar una molécula que comprende una o más hebras complementarias o auto-complementarias o "complemento ( s ) " de una secuencia particular que comprende una molécula. Por ejemplo, el miARN precursor puede ser una región de auto-complementaria, la cual es hasta 100% complementaria. Las sondas de miARN o los ácidos nucleicos de la invención pueden incluir, pueden ser o puede ser al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% complementarios a su objetivo.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser elaborados mediante cualquier técnica conocida para una persona experta en la materia, tal como por ejemplo, la síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Se contempla específicamente que sondas de miARN de la invención sean químicamente sintetizadas.

En algunas modalidades de la invención, los miARNs son recuperados o aislados de una muestra biológica. El miARN puede ser recombinante o puede ser natural o endógeno a la célula (producida a partir del genoma de la célula). Se contempla que una muestra biológica puede ser tratada de una manera como para aumentar la recuperación de las moléculas de ARN pequeñas tales como miARN. La Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie. 10/667,126 describe tales métodos y es específicamente incorporada por referencia en la presente. En general, los métodos involucran la lisis de la célula con una solución que tiene guanidinio y un detergente.

En ciertos aspectos, el miARN sintético son ARN o análogos de ARN. Los miméticos de miARN puede ser de ADN y/o ARN, o análogos de los mismos. Los miméticos de miARN con modificaciones químicas pueden ser colectivamente denominados como "ácidos nucleicos sintéticos".

En algunas modalidades, un ácido nucleico terapéutico puede tener un miARN o una secuencia de miARN sintética de entre 10-200 hasta entre 17-130 residuos, incluyendo todos los valores e intervalos entre éstos. La presente invención se refiere al miARN o a las moléculas sintéticas de miARN que son, son al menos, o son a lo más 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o más residuos de longitud, incluyendo cualquier número entero o cualquier intervalo entre éstos.

En ciertos aspectos, los ácidos nucleicos sintéticos tienen (a) una "región de miARN" cuya secuencia o región de enlace de 51 a 3' es idéntica o complementaria a un segmento de una secuencia de miARN madura, y (b) una "región complementaria" cuya secuencia de 5' a 3' está entre 60% y 100% complementaria a la secuencia de miARN en (a) . En ciertas modalidades, estos ácidos nucleicos sintéticos son también aislados, como se define más adelante. El término "región de miARN" se refiere a una región sobre el ácido nucleico sintético que es al menos 75, 80, 85, 90, 95, ó 100% idéntica, incluyendo todos los números enteros entre éstos, a la secuencia completa de una secuencia de miARN de origen natural, madura o un complemento de la misma. En ciertas modalidades, la región de miARN es o es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 ó 100% idéntica a la secuencia de un miARN de origen natural, o segmento de la misma, o complemento de la misma.

En la presente se discuten las modalidades que involucran los miméticos de miR-124. Diferentes hebras activas y pasajeras para estos miméticos son descritos a todo lo largo de la descripción. Se contempla que las modalidades discutidas en el contexto de una SEQ ID No. particular pueden ser implementadas además de o en vez de otras modalidades discutidas en la misma SEQ ID No. Por ejemplo, una hebra activa que es al menos 90% idéntica a la SEQ ID No.: 2 y también tiene una sustitución de uno de los nucleótidos/nucleósidos , puede ser combinada con una modalidad de una hebra activa que involucra la SEQ. ID No.: 2 que también tiene una inserción en la secuencia; en consecuencia, una hebra activa que tiene al menos 90% de identidad a la SEQ ID No.: 2 tendría una sustitución y una inserción con relación a la SEQ ID No.: 5.

Se contempla que una molécula de ARN pueda contener una hebra activa que es o es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% idéntica, o cualquier intervalo derivable de éstos, a la SEQ ID No.: 1. En otras modalidades, la hebra activa es o es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% idéntica, o cualquier intervalo derivable en éstos, a la SEQ ID No.: 2.

En algunas modalidades, una hebra activa es al menos 95% idéntica a la SEQ ID No.: 1 (UAAGGCACGCGGUGAAUGCC) . En ciertas modalidades, la hebra activa tiene la siguiente secuencia de 5' a 3' en la cual un nucleótido de la SEQ ID No.: 1 está suprimida: UAAGGCACGCGGUGAAUGC (SEQ ID No.: 5) (C antiguamente en la posición 20 suprimida) UAAGGCACGCGGUGAAUGC (SEQ ID No.: 5) (C antiguamente en la posición 19 suprimida) UAAGGCACGCGGUGAAUCC (SEQ ID No.: 6) (G antiguamente en la posición 18 suprimida) UAAGGCACGCGGUGAAGCC (SEQ ID No.: 7) (U antiguamente en la posición 17 suprimida) UAAGGCACGCGGUGAUGCC (SEQ ID No.: 8) (A antiguamente en la posición 16 suprimida) UAAGGCACGCGGUGAUGCC (SEQ ID No.: 8) (A antiguamente en la posición 15 suprimida) UAAGGCACGCGGUAAUGCC (SEQ ID No. : 9) (G antiguamente en la posición 14 suprimida) UAAGGCACGCGGGAAUGCC (SEQ ID No.: 10) (U antiguamente en la posición 13 suprimida) UAAGGCACGCGUGAAUGCC (SEQ ID No.: 11) (G antiguamente en la posición 12 suprimida) UAAGGCACGCGUGAAUGCC (SEQ ID No.: 11) (G antiguamente en la posición 11 suprimida) UAAGGCACGGGUGAAUGCC (SEQ ID No.: 12) (C antiguamente en la posición 10 suprimida) UAAGGCACCGGUGAAUGCC (SEQ ID No.: 13) (G antiguamente en la posición 9 suprimida ) UAAGGCAGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No. : 14) (C antiguamente en la posición 8 suprimida ) UAAGGCCGCGGUGAAUGCC (SEQ ID . No. : 15) (A antiguamente en la posición 7 suprimida) UAAGGACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No. : 16) (C antiguamente en la posición 6 suprimida ) UAAGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No. : 17) (G antiguamente en la posición 5 suprimida ) UAAGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No. : 17) (G antiguamente en la posición 4 suprimida ) UAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No. : 18) (A antiguamente en la posición 3 suprimida ) UAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No. : 18) (A antiguamente en la posición 2 suprimida ) AAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No. : 19) (U antiguamente en la posición 1 suprimida ) En modalidades donde un nucleotido ha sido suprimido con relación a la SEQ ID No. : 1, se contempla que la designación de un nucleotido modificado pueda ser ajustada en consecuencia. En algunas modalidades, se contempla que una hebra activa que tiene una secuencia que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID No.: 1 tiene una modificación de un nucleotido con una o más de las siguientes posiciones:; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, ó 21 con respecto ya sea al extremo 5' ó 3' de la hebra. En otras modalidades, se contempla que una hebra activa puede tener los siguientes nucleótidos modificados: U en la posición 1 con relación a la SEQ ID No. : 1; A en la posición 2 con relación a la SEQ ID No. : 1; A en la posición 3 con relación a la SEQ ID No.: 1; G en la posición 4 con relación a la SEQ ID No.: 1; G en la posición 5 con relación a la SEQ ID No.: 1 ; C en la posición 6 con relación a la SEQ ID No.: 1 ; A en la posición 7 con relación a la SEQ ID No. : 1 ; C en la posición 8 con relación a la SEQ ID No.: 1; G en la posición 9 con relación a la SEQ ID No.: 1; C en la posición 10 con relación a la SEQ ID No.: 1; G en la posición 11 con relación a la SEQ ID No. : 1; G en la posición 12 con relación a la SEQ ID No.: 1; U en la posición 13 con relación a la SEQ ID No.: 1; G en la posición 14 con relación a la SEQ ID No.: 1; A en la posición 15 con relación a la SEQ ID No. : 1; A en la posición 16 con relación a la SEQ ID No. : 1; U en la posición 17 con relación a la SEQ ID No.: 1; G en la posición 18 con relación a la SEQ ID No.: 1; C en la posición :19 con relación a la SEQ ID No.: 1; y/o, C en la posición 20 con relación a la SEQ ID No.: 1. Esto significa que la hebra activa ya no puede tener al nucleótido en esta posición, pero en el contexto de la secuencia de la SEQ ID No.: 1, el nucleótido particular en la hebra activa es modificado'. Esto significa que su posición puede ser alterada por -1 ó +1; por ejemplo, la G en la posición 11 con relación a la SEQ ID No. : 1, puede estar en la posición 10 o en la posición 12 en la hebra activa debido a que ha sido una inserción o supresión que afecta su número de posición.

En algunas modalidades, una hebra activa es al menos 95% idéntica a la SEQ ID No.: 2 (UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA) , que es 2 bases más larga que la SEQ ID No.: 1. En ciertas modalidades, la hebra activa tiene la siguiente secuencia de 5' a 3' en la cual un nucleótido de la SEQ ID No.: 2 está suprimido: UUAAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No.: 20) (A antiguamente en la posición 22 suprimida) UUAAGGCACGCGGUGAAUGCA (SEQ ID No.: 21) (C antiguamente en la posición 21 suprimida) UUAAGGCACGCGGUGAAUGCA (SEQ ID No.: 21) (C antiguamente en la posición 20 suprimida) UUAAGGCACGCGGUGAAUCCA (SEQ ID No.: 22) (G antiguamente en la posición 19 suprimida) UUAAGGCACGCGGUGAAGCCA (SEQ ID No.: 23) (U antiguamente en la posición 18 suprimida) UUAAGGCACGCGGUGAUGCCA (SEQ ID No.: 24) (A antiguamente en la posición 17 suprimida) UUAAGGCACGCGGUGAUGCCA (SEQ ID No.: 24) (A antiguamente en la posición 16 suprimida) UUAAGGCACGCGGUAAUGCCA (SEQ ID No.: 25) (G antiguamente en la posición 15 suprimida) UUAAGGCACGCGGGAAUGCCA (SEQ ID No.: 26) (U antiguamente en la posición 14 suprimida) UUAAGGCACGCGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 27) (G antiguamente en la posición 13 suprimida) UUAAGGCACGCGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 27) (G antiguamente en la posición 12 suprimida) UUAAGGCACGGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 28) (C antiguamente en la posición 11 suprimida) UUAAGGCACCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 29) (G antiguamente en la posición 10 suprimida) UUAAGGCAGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 30) (C antiguamente en la posición 9 suprimida) UUAAGGCCGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 31) (A antiguamente en la posición 8 suprimida) UUAAGGACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 32) (C antiguamente en la posición 7 suprimida) UUAAGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 33) (G antiguamente en la posición 6 suprimida) UUAAGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 33) (G antiguamente en la posición 5 suprimida) UUAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 34) (A antiguamente en la posición 4 suprimida) UUAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 34) (A antiguamente en la posición 3 suprimida) UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 35) (U antiguamente en la posición 2 suprimida) UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No.: 35) (U antiguamente en la posición 1 suprimida) En modalidades donde un nucleotido ha sido suprimido con relación a la SEQ ID No.:' 2, se contempla que la designación de un nucleotido modificado pueda ser ajustada en consecuencia.

En algunas modalidades, se contempla que una hebra activa que tiene una secuencia que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID No. : 2 tiene una modificación de un nucleotido con una o más de las siguientes posiciones: 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 con respecto ya sea el extremo 5' ó 3' de la hebra. En otras modalidades, se contempla que una hebra activa puede tener los siguientes nucleótidos modificados: U en la posición 1 con relación a la SEQ ID No. : 2; U en la posición 2 con relación a la SEQ ID No. : 2; A en la posición 3 con relación a la SEQ ID No.: 2; A en la posición 4 con relación a la SEQ ID No.: 2; G en la posición 5 con relación a la SEQ ID No.: 2; G en la posición 6 con relación a la SEQ ID No. : 2; C en la posición 7 con relación a la SEQ ID No.: 2; A en la posición 8 con relación a la SEQ ID No.: 2; C en la posición 9 con relación a la SEQ ID No.: 2; G en la posición 10 con relación a la SEQ ID No.: 2; C en la posición 11 con relación a la SEQ ID No.: 2; G en la posición 12 con relación a la SEQ ID No.: 2; G en la posición 13 con relación a la SEQ ID No.: 12 U en la posición 14 con relación a la SEQ ID No.: 2; G en la posición 15 con relación a la SEQ ID No. : 2; A en la posición 16 con relación a la SEQ ID No.: 2; A- en la posición 17 con relación a la SEQ ID No.: 2; U en la posición 18 con relación a la SEQ ID No.: 2; G en la posición 19 con relación a la SEQ ID No.: 2; C en la posición 20 con relación a la SEQ ID No.: 2; C en la posición 21 con relación a la SEQ ID No.: 2; y/o, A en la posición 22 con relación a la SEQ ID No.: 2. Esto significa que la hebra activa ya no puede tener al nucleótido en esta posición, pero en el contexto de la secuencia de la SEQ ID No. : 2, el nucleótido particular en la hebra activa es modificado. Esto significa que su posición puede ser alterada por -1 o -2; por ejemplo, la C en la posición 11 con relación a la SEQ ID No.: 2, puede estar en la posición 10 en la hebra activa debido a que ha sido una supresión que afecta su número de posición.

En algunas modalidades, una hebra activa es 95% idéntica a la SEQ ID No.: 1 (UAAGGCACGCGGUGAAUGCC) . En ciertas modalidades tal hebra activa tiene la siguiente secuencia de 5' a 3' en la cual un nucleótido está sustituido con un ribonucleótido diferente (A, C, G, o U) , como es representado por N: NAAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No. : 36) UNAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UANGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAANGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGNCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGNACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCNCGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCANGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACNCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGNGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCNGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGNUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGNGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUNAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUGNAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUGANUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUGAANGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUGAAUNCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUGAAUGNC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUGAAUGCN (SEQ ID No En algunas modalidades, una hebra activa es 95-100% idéntica a la SEQ ID No.: 1, la cual debe incluir las secuencias descritas anteriormente. Otros ejemplos de tales hebras activas incluyen hebras activas con una inserción de un nucleótido simple, como se discute más adelante, en la cual las siguientes secuencias desde 5' a 3' tienen una inserción de un nucleótido designado como N, lo cual puede estar en A, C, G, o U: NUAAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UNAAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UANAGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAANGGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No 59) UAAGNGCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGNCACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCNACGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No 62) UAAGGCANCGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No 63) UAAGGCACNGCGGUGAAUGCC (SEQ ID No 64) UAAGGCACGNCGGUGAAUGCC (SEQ ID No 65) UAAGGCACGCNGGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGNGUGAAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGNUGAAUGCC (SEQ ID No 68) UAAGGCACGCGGUNGAAUGCC (SEQ ID No 69) UAAGGCACGCGGUGNAAUGCC (SEQ ID No 70) UAAGGCACGCGGUGANAUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUGAANUGCC (SEQ ID No UAAGGCACGCGGUGAAUNGCC (SEQ ID No 73) UAAGGCACGCGGUGAAUGNCC (SEQ ID No 74) UAAGGCACGCGGUGAAUGCNC (SEQ ID No 75) UAAGGCACGCGGUGAAUGCCN (SEQ ID No 76) En algunas modalidades, además de la inserción simple mostrada anteriormente, existe una segunda inserción o adición en otro sitio en la secuencia con relación a la SEQ ID No.: 1. En algunas modalidades, además de la inserción simple mostrada anteriormente, existe una segunda inserción o adición en otro sitio en la secuencia con relación a la SEQ ID No.: 1. Se contempla que la segunda inserción puede ser después del nucleótido nuevamente o previamente localizado en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23.

En algunas modalidades, una hebra activa es o es al menos 90% idéntica a la SEQ ID No.: 2 (UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA) . En ciertas modalidades, tal hebra activa tiene la siguiente secuencia de 5' a 3' en la cual uno o dos nucleótidos está sustituido con un ribonucleótido diferente. En ciertas modalidades existe una sustitución como es representado por N: NUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 77) UNAAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 78) UUNAGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 79) UUANGGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 80) UUAANGCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 81) UUAAGNCACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 82) UUAAGGNACGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 83) UUAAGGCNCGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 84) UUAAGGCANGCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 85) UUAAGGCACNCGGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 86) UUAAGGCACGNGGUGAAUGCCA ( SEQ ID No. : 87) UUAAGGCACGCNGUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 88) UUAAGGCACGCGNUGAAUGCCA (SEQ ID No. : 89) UUAAGGCACGCGGNGAAUGCCA (SEQ ID No. : 90) UUAAGGCACGCGGUNAAUGCCA (SEQ ID No. : 91) UUAAGGCACGCGGUGNAUGCCA ( SEQ ID No. : 92) UUAAGGCACGCGGUGANUGCCA (SEQ ID No. : 93) UUAAGGCACGCGGUGAANGCCA (SEQ ID No. : 94) UUAAGGCACGCGGUGAAUNCCA (SEQ ID No. : 95) UUAAGGCACGCGGUGAAUGNCA (SEQ ID No. : 96) UUAAGGCACGCGGUGAAUGCNA (SEQ ID No. : 91) UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCN (SEQ ID No. : 98) En algunas modalidades, además de la sustitución simple mostrada anteriormente, existe una segunda sustitución en otro sitio en la secuencia con relación a la SEQ ID No. : 2. Se contempla además que puede existir una segunda sustitución con una de las sustituciones descritas en una hebra activa descritas anteriormente, o una o dos supresiones de nucleótidos además de la sustitución descritas anteriormente.

En algunas modalidades, una hebra activa es 95-100% idéntica a la SEQ ID No.: 2, la cual debe incluir las secuencias descritas anteriormente. Otros ejemplos de tales hebras activas incluyen hebras activas con una inserción de un nucleótido simple dentro de la secuencia de la SEQ ID No.: 2.

En ciertas modalidades, la hebra activa tiene una secuencia que es o es al menos 95% idéntica a la SEQ ID No.: 1 o SEQ ID No.: 2. SEQ ID No.: 1 (20 nucleótidos de longitud) es aproximadamente 90.9% idéntica a la SEQ ID No.: 2 (22 nucleótidos de longitud) , y un fragmento de 20 nucleótidos contiguos en la SEQ ID No.: 2 es 100% idéntica a la SEQ ID: 1.

Se nota que en algunas modalidades la secuencia de la hebra activa consiste de la SEQ ID No. : 1, lo cual significa que la hebra activa tiene una secuencia que es 100% idéntica a la SEQ ID No.: 1. En otras modalidades, la secuencia de la hebra activa consiste de la SEQ ID No.: 2, lo cual significa que la hebra activa tiene una secuencia que es 100% idéntica a la SEQ ID No.: 2. En cualquiera de estas modalidades, se contempla que una hebra activa puede incluir una modificación de un nucleotido localizado en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 171, 18, 19, 20, 21, y/o 22 (donde la posición 1 es el extremo 5' de la hebra) con respecto al extremo 5' of la hebra activa. Esto significa que el nucleotido en la posición indicada está modificado, y esta designación es independiente de la identidad del nucleotido particular en esa posición indicada. Esta designación está basada en posición, en oposición a que está basada en nucleotido. En otras modalidades, las designaciones están basadas en nucleótido. En ciertas modalidades, una designación puede estar basada en posición con respecto al extremo 3' de la hebra activa; en tal caso, la hebra activa puede incluir una modificación de un nucleótido localizado 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 171, 18, 19, 20, 21, y/o 22 nucleótidos del extremo 3' of la hebra activa. Cualesquiera modalidades discutidas en la presente en las cuales un nucleótido modificado fue identificado como basado en nucleótido pueden ser implementados en otras modalidades en la que un nucleótido modificado que está basado en posición utilizando la posición del nucleótido identificado. Esto aplica a las hebras activas, asi como las hebras pasajeras.

En algunas modalidades, las designaciones basadas en nucleótidos describen que una hebra activa puede ser modificada en los siguientes nucleótidos: U en la posición 1 en la SEQ ID No.: 2; U en la posición 1 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 2 en la SEQ ID No . : 2; A en la posición 2 en la SEQ ID No. : 1 y en la posición 3 en la SEQ ID No. : 2; A en la posición 3 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 4 en la SEQ ID No.: 2; G en la posición 4 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 5 en la SEQ ID No.: 2; G en la posición 5 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 6 en la SEQ ID No.: 2; C en la posición 6 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 7 en la SEQ ID No.: 2; A en la posición 7 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 8 en la SEQ ID No.: 2; C en la posición 8 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 9 en la SEQ ID No.: 2; G en la posición 9 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 10 en la SEQ ID No.: 2; C en la posición 10 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 11 en la SEQ ID No. : 2; G en la posición 11 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 12 en la SEQ ID No.: 2; G en la posición 12 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 13 en la SEQ ID No.: 2; U en la posición 13 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 14 en la SEQ ID No. : 2; G en la posición 14 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 15 en la SEQ ID No.: 2; A en la posición 15 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 16 en la SEQ ID No.: 2; A en la posición 16 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 17 en la SEQ ID No. : 2; U en la posición 17 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 18 en la SEQ ID No.: 2; G en la posición 18 en la SEQ ID No. : 1 y en la posición 19 en la SEQ ID No.: 2; C en la posición 19 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 20 en la SEQ ID No.: 2; C en la posición 20 en la SEQ ID No.: 1 y en la posición 21 en la SEQ ID No.: 2;: y/o A en la posición 22 en la SEQ ID No.: 2.

En ciertas modalidades, las hebras pasajeras tienen una secuencia que es o es al menos 95% idéntica a la SEQ ID No.: 3 o la SEQ ID No.: 4. SEQ ID No.: 3 (20 nucleótidos de longitud) es aproximadamente 90.9% idéntica a la SEQ ID No.: 4 (22 nucleótidos de longitud) , y un fragmento de 20 nucleótidos contiguos en la SEQ ID No. : 4 es 100% idéntica a la SEQ ID No. : 3.

Se nota que en algunas modalidades la secuencia de las hebras pasajeras consiste de la SEQ ID No.: 3, lo cual significa que las hebras pasajeras tiene una secuencia que.es 100% idéntica a la SEQ ID No.: 3. En otras modalidades, la secuencia de las hebras pasajeras consiste de la SEQ ID No.: 4, lo cual significa que las hebras pasajeras tienen una secuencia que es 100% idéntica a la SEQ ID No.: 4. En cualquiera de estas modalidades, se contempla que una hebra pasajera puede incluir una modificación de un nucleótido localizado en la posición 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 171 , 18, 19, 20, 21 y/o 22 (donde la posición 1 es el extremo 5' de la hebra) con respecto el extremo 5' de las hebras pasajeras. Esto significa que el nucleótido en la posición indicada está modificado, y esta designación es independiente de la identidad del nucleótido particular en esa posición indicada. Esta designación está basada en posición, en oposición a que está basada en nucleótido. En otras modalidades, las designaciones están basadas en nucleótido. En ciertas modalidades, una designación puede estar basada en posición con respecto al extremo 3' de las hebras pasajeras; en tal caso, las hebras pasajeras puede incluir una modificación de un nucleótido localizado 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 171, 18, 19, 20, 21 y/o 22 nucleótidos del extrema 3' de las hebras pasajeras.

Se contempla que una molécula de ARN pueda contener una hebra pasajera que es o es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% idéntica, o cualquier intervalo derivable de éstos, a la SEQ ID No.: 3. En otras modalidades, una hebra pasajera es o es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% idéntica, o cualquier intervalo derivable de éstos, a la SEQ ID No.: 4.

En algunas modalidades, una hebra pasajera es 95% idéntica a la SEQ ID No.: 3 (GGCAUUCACCGCGUGCCUUA) . En ciertas modalidades, la hebra activa tiene la siguiente secuencia de 5' a 3' en la cual un nucleótido de la SEQ ID No.: 1 está suprimida: GGCAUUCACCGCGUGCCUU (SEQ ID No.: 99) (A antiguamente en la posición 20 suprimida) GGCAUUCACCGCGUGCCUA (SEQ ID No.: 100) ; (U antiguamente en la posición 19 suprimida) GGCAUUCACCGCGUGCCUA (SEQ ID No.: 100) (U antiguamente en la posición 18 suprimida) GGCAUUCACCGCGUGCUUA (SEQ ID No.: 101) (C antiguamente en la posición 17 suprimida) GGCAUUCACCGCGUGCUUA (SEQ ID No.: 101) (C antiguamente en la posición 16 suprimida) GGCAUUCACCGCGUCCUUA (SEQ ID No.: 102) (G antiguamente en la posición 15 suprimida) GGCAUUCACCGCGGCCUUA (SEQ ID No. : 103) (U antiguamente en la posición 14 suprimida) GGCAUUCACCGCUGCCUUA (SEQ ID No. : 104) (G antiguamente en la posición 13 suprimida) GGCAUUCACCGGUGCCUUA (SEQ ID No. : 105) (C antiguamente en la posición 12 suprimida) GGCAUUCACCCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 106) (G antiguamente en la posición 11 suprimida) GGCAUUCACGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 107) (C antiguamente en la posición 10 suprimida) GGCAUUCACGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 107) (C antiguamente en la posición 9 suprimida ) GGCAUUCCCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 108) (A antiguamente en la posición 8 suprimida ) GGCAUUACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 109) (C antiguamente en la posición 7 suprimida ) GGCAUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 110) (U antiguamente en la posición 6 suprimida ) GGCAUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 110) (U antiguamente en la posición 5 suprimida ) GGCUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 111) (A antiguamente en la posición 4 suprimida ) GGAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 112) (C antiguamente en la posición 3 suprimida ) GCAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No . : 11.3) (G antiguamente en la posición 2 suprimida) GCAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No.: 113) (G antiguamente en la posición 1 suprimida) En modalidades donde un nucleótido ha sido suprimido con relación a la SEQ ID No.: 3, se contempla que la designación de un nucleótido modificado pueda ser ajustada en consecuencia.

En algunas modalidades, se contempla que una hebra activa que tiene una secuencia que es al menos 95% idéntica, a la SEQ ID No. : 3 tiene una modificación de un nucleótido con una o más de las siguientes posiciones: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ó 21 con respecto ya sea el extremo 5' ó 3' de la hebra: G en la posición 1 con relación a la SEQ ID No.: 3; G en la posición 2 con relación a la SEQ ID No.: 3; C en la posición 3 con relación a la SEQ ID No. : 3; A en la posición 4 con relación a la SEQ ID No. : 3; U en la posición 5 con relación a la SEQ ID No.: 3; U en la posición 6 con relación a la SEQ ID No.: 3; C en la posición 7 con relación a la SEQ ID No.: 3; A en la posición 8 con relación a la SEQ ID No.: 3; C "en la posición 9 con relación a la SEQ ID No.: 3; C en la posición 2 con relación a la SEQ ID No.: 10; G en la posición .11.con relación a la SEQ ID No.: 3; C en la posición 12 con relación a la SEQ ID No.: 3; G en la posición 13 con relación a la SEQ ID No.: 3; U en la posición 14 con relación a la SEQ I'D No.: 3; G en la posición 15 con relación a la SEQ ID No. : 3; C en la posición 16 con relación a la SEQ ID No.: 3; C en la posición 17 con relación a la SEQ ID No.: 3; U en la posición 18 con relación a la SEQ ID No.: 3; U en la posición 19 con relación a la SEQ ID No.: 3; y/o, A en la posición 20 con relación a la SEQ ID No.: 3. Esto significa que las hebras pasajeras ya no pueden tener al nucleótido en esa posición, pero en el contexto de la secuencia de la SEQ ID No.: 3, el nucleótido particular en la hebra activa es modificado. Esto significa que su posición puede ser alterada por -1 ó +1; por ejemplo, la G en la posición 11 con relación a la SEQ ID No. : 3, puede estar en la posición 10 ó en la posición 12 in una hebra pasajera debido a que ha sido una inserción o supresión que afecta su número de posición.

En algunas modalidades, una hebra pasajera es 95% idéntica a la SEQ ID No.: 4 (UGGCAUUCACCGCGUGCCUUAA), que es 2 bases más larga que la SEQ ID No.: 3. En ciertas modalidades, las hebras pasajeras tienen la siguiente secuencia de 5' a 3' en la cual un nucleótido de la SEQ ID No.: 4 está suprimida: UGGCAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No.: 114) (A antiguamente en la posición 22 suprimida) UGGCAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No.: 114) (A antiguamente en la posición 21 suprimida) UGGCAUUCACCGCGUGCCUAA (SEQ ID No. : 115) (U antiguamente en la posición 20 suprimida) UGGCAUUCACCGCGUGCCUAA (SEQ ID No.: 115) (U antiguamente en la posición 19 suprimida) UGGCAUUCACCGCGUGCUUAA (SEQ ID No.: 116) (C antiguamente en la posición 18 suprimida) UGGCAUUCACCGCGUGCUUAA (SEQ ID No.: 116) (C antiguamente en la posición 17 suprimida) UGGCAUUCACCGCGUCCUUAA (SEQ ID No.: 117) (G antiguamente en la posición 16 suprimida) UGGCAUUCACCGCGGCCUUAA (SEQ ID No.: 118) (U antiguamente en la posición 15 suprimida) UGGCAUUCACCGCUGCCUUAA (SEQ ID No.: 119) (G antiguamente en la posición 14 suprimida) UGGCAUUCACCGGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 120) (C antiguamente en la posición 13 suprimida) UGGCAUUCACCCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 121) (G antiguamente en la posición 12 suprimida) UGGCAUUCACGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 122) (C antiguamente en la posición 11 suprimida) UGGCAUUCACGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 122) (C antiguamente en la posición 10 suprimida) UGGCAUUCCCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 123) (A antiguamente en la posición 9 suprimida) UGGCAUUACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 124) (C antiguamente en la posición 8 suprimida) UGGCAUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 125) (U antiguamente en la posición 7 suprimida) UGGCAUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 125) (U antiguamente en la posición 6 suprimida) UGGCUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 126) (A antiguamente en la posición 5 suprimida) UGGAUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 127) (C antiguamente en la posición 4 suprimida) UGCAUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 128) (G antiguamente en la posición 3 suprimida) UGCAUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 129) (G antiguamente en la posición 2 suprimida) GGCAUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No.: 130) (U antiguamente en la posición 1 suprimida) En modalidades donde un nucleótido ha sido suprimido con relación a la SEQ ID No.: 4, se contempla que la designación de un nucleótido modificado pueda ser ajustada en consecuencia. En algunas modalidades, se contempla que una hebra activa que tiene una secuencia que es al menos 95% idéntica a la SEQ ID No.: 4 tiene una modificación de un nucleótido con una o más de las siguientes posiciones: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 con respecto ya sea al extremo 5' ó 3' de la hebra. En otras modalidades, se contempla que una hebra activa puede tener los siguientes nucleótidos modificados: U en la posición 1 con relación a la SEQ ID No.: 4; G en la posición 2 con relación a la SEQ ID No.: 4; G en la posición 3 con relación a la SEQ ID No.: 4; C en la posición 4 con relación a. la SEQ ID No.: 4; A en la posición 5 con relación a la SEQ ID No.: 4; U en la posición 6 con relación a la SEQ ID No.: 4; U en la posición 7 con relación a la SEQ ID No.: 4; C en la posición 8 con relación a la SEQ ID No.: 4; A en la posición 9 con relación a la SEQ ID No. : 4; C en la posición 10 con relación a la SEQ ID No.: 4; C en la posición 11 con relación a la SEQ ID No.: 4; G en la posición 12 con relación a la SEQ ID No.: 4; C en la posición 13 con relación a la SEQ ID No.: 4; G en la posición 14 con relación a la SEQ ID No.: 4; U en la posición 15 con relación a la SEQ ID No.: 4; G en la posición 16 con relación a la SEQ ID No.: 4; C en la posición 17 con relación a la SEQ ID No.: 4; C en la posición 18 con relación a la SEQ ID No.: 4; U en la posición 19 con relación a la SEQ ID No.: 4; U en la posición 20 con relación a la SEQ ID No.: 4; A en la posición 21 con relación a la SEQ ID No.: 4; y/o A en la posición 20 con relación a la SEQ ID No.: 4. Esto significa que la hebra activa ya no puede tener al nucleótido en esa posición, pero en el contexto de la secuencia de la SEQ ID No.: 2, el nucleótido particular en la hebra activa es modificado. Esto significa que su posición puede ser alterada por -1 ó -2; por ejemplo, la C en la posición 11 con relación a la SEQ ID No.: 2, puede estar en la posición 10 en la hebra activa debido a que ha sido una supresión que afecta su número de posición.

En algunas modalidades, una hebra pasajera es 95% idéntica a la SEQ ID No.: 3 (GGCAUUCACCGCGUGCCUUA) . En ciertas modalidades tal hebra pasajera tiene la siguiente secuencia de 5' a 3' en la cual un nucleótido está sustituido con un ribonucleótido diferente (A, C, G, o U) , como es representado por N: NGCAUUCACCGCGUGCCUUA SEQ ID No GNCAUUCACCGCGUGCCUUA SEQ ID No GGNAUUCACCGCGUGCCUUA SEQ ID No GGCNUUCACCGCGUGCCUUA SEQ ID No GGCANUCACCGCGUGCCUUA SEQ ID No GGCAUNCACCGCGUGCCUUA SEQ ID No GGCAUUNACCGCGUGCCUUA SEQ ID No GGCAUUCNCCGCGUGCCUUA SEQ ID No GGCAUUCANCGCGUGCCUUA SEQ ID No GGCAUUCACNGCGUGCCUUA SEQ ID No GGCAUUCACCNCGUGCCUUA SEQ ID No GGCAUUCACCGNGUGCCUUA SEQ ID No GGCAUUCACCGCNUGCCUUA SEQ ID No GGCAUUCACCGCGNGCCUUA SEQ ID No GGCAUUCACCGCGUNCCUUA SEQ ID No GGCAUUCACCGCGUGNCUUA SEQ ID No GGCAUUCACCGCGUGCNUUA SEQ ID No GGCAUUCACCGCGUGCCNUA (SEQ ID No.: 148) GGCAUUCACCGCGUGCCUNA (SEQ ID No.: 149) GGCAUUCACCGCGUGCCUUN (SEQ ID No.: 150) En algunas modalidades, además de la sustitución simple mostrada anteriormente, existe una segunda sustitución en otro sitio en la secuencia con relación a la SEQ ID No.: 3. Se contempla además que puede existir una segunda sustitución con una de las sustituciones descritas en una hebra pasajera descrita anteriormente, o una o dos supresiones de nucleótidos además de la sustitución descrita anteriormente .

En algunas modalidades, una hebra pasajera es 95-100% idéntica a la SEQ ID No. : 3, la cual debe incluir las secuencias descritas anteriormente. Otros ejemplos de tales hebras activas incluyen hebras activas con una inserción de un nucleótido simple, como se discute más adelante, en la cual las siguientes secuencias desde 5' a 3' tienen una inserción, de un nucleótido designado como N, lo cual puede estar en A, C, G, o U: NGGCAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID NO. : 151) GNGCAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 152) GGNCAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No . : 153) GGCNAUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 154) GGCANUUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 155) GGCAUNUCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 156) GGCAUUNCACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 157) GGCAUUCNACCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 158) GGCAUUCANCCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 159) GGCAUUCACNCGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 160) GGCAUUCACCNGCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 161) GGCAUUCACCGNCGUGCCUUA (SEQ ID No. : 162) GGCAUUCACCGCNGUGCCUUA (SEQ ID No. : 163) GGCAUUCACCGCGNUGCCUUA (SEQ ID No. : 164) GGCAUUCACCGCGUNGCCUUA (SEQ ID No. : 165) GGCAUUCACCGCGUGNCCUUA (SEQ ID No. : 166) GGCAUUCACCGCGUGCNCUUA (SEQ ID No. : 167) GGCAUUCACCGCGUGCCNUUA (SEQ ID No. : 168) GGCAUUCACCGCGUGCCUNUA (SEQ ID No. : 169) GGCAUUCACCGCGUGCCUUNA (SEQ ID No. : 170) GGCAUUCACCGCGUGCCUUAN (SEQ ID No. : 171) En algunas modalidades, además de la inserción en la hebra pasajera mostrada anteriormente con relación a la SEQ ID No.: 3, puede existir una segunda inserción en otro sitio en la hebra. Las combinaciones de inserciones en las hebras pasajeras mostradas anteriormente son también contempladas para las hebras pasajeras adicionales.

En algunas modalidades, una hebra pasajera es o es al menos 90% idéntica a la SEQ ID No. : 4 (UGGCAUUCACCGCGUGCCUUAA) . En ciertas modalidades, tal hebra pasajera tiene la siguiente secuencia de 5' a 3' en la cual uno o dos nucleótidos está sustituido con un ribonucleótido diferente. En ciertas modalidades, existe una sustitución representada por N: NGGCAUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 172) UNGCAUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 173) UGNCAUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 174) UGGNAUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 175) UGGCNUUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 176) UGGCANUCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 177) UGGCAUNCACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 178) UGGCAUUNACCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 179) UGGCAUUCNCCGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 180) UGGCAUUCANCGCGUGCCUUAA ( SEQ ID No. : 181) UGGCAUUCACNGCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 182) UGGCAUUCACCNCGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 183) UGGCAUUCACCGNGUGCCUUAA (SEQ ID No. : 184) UGGCAUUCACCGCNUGCCUUAA (SEQ ID No. : 185) UGGCAUUCACCGCGNGCCUUAA (SEQ ID No. : 186) UGGCAUUCACCGCGUNCCUUAA ( SEQ ID No. : 187) UGGCAUUCACCGCGUGNCUUAA (SEQ ID No. : 188) UGGCAUUCACCGCGUGCNUUAA (SEQ ID No. : 189) UGGCAUUCACCGCGUGCCNUAA (SEQ ID No. : 190) UGGCAUUCACCGCGUGCCUNAA (SEQ ID No. : 191) UGGCAUUCACCGCGUGCCUUNA (SEQ ID No. : 192) UGGCAUUCACCGCGUGCCUUAN (SEQ ID No. : 193) En algunas modalidades, además de la sustitución simple mostrada anteriormente, existe una segunda sustitución en otro sitio en la secuencia con relación a la SEQ ID No.: 4. Además, cualquier combinación de sustituciones mostrada anteriormente en las hebras pasajeras es contemplada.

En algunas modalidades, una hebra pasajera es 95-100% idéntica a la SEQ ID No.: 4, la cual debe incluir las secuencias descritas anteriormente. Otros ejemplos de tales hebras pasajeras incluyen las hebras pasajeras con una inserción de un nucleótido simple dentro de la secuencia de la SEQ ID No. : 4.

Se nota que en algunas modalidades la secuencia de las hebras pasajeras consiste de la SEQ ID No.: 3, lo cual significa que las hebras pasajeras tiene una secuencia que es 100% idéntica a la SEQ ID No.: 3. En otras modalidades, la secuencia de las hebras pasajeras consiste de la SEQ ID No.: 4, lo cual significa que las hebras pasajeras tiene una secuencia que es 100% idéntica a la SEQ ID No.: 4. En cualquiera de estas modalidades, se contempla que una hebra pasajera puede incluir una modificación de un nucleótido localizado en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 171, 18, 19, 20, 21, y/o 22 (donde la posición 1 es el extremo 5' de la hebra) con respecto al extremo 5' de las hebras pasajeras. Esto significa que el nucleótido en la posición indicada está modificado, y esta designación es independiente de la identidad del nucleótido particular en esa posición indicada. Esta designación está basada en posición, en oposición a que está basada en nucleótido. En otras modalidades, las designaciones están basadas en nucleótido. En ciertas modalidades, una designación puede estar basada en posición con respecto al extremo 3' de las hebras pasajeras; en tal caso, las hebras pasajeras puede incluir una modificación de un nucleótido localizado 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 171, 18, 19, 20, 21, y/o 22 nucleótidos del extremo 3' de las hebras pasajeras.

En algunas modalidades, las designaciones basadas en nucleótidos describen que una hebra pasajera puede ser modificada en los siguientes nucleótidos: U en la posición 1 en la SEQ ID No.: 4; G en la posición 2 en la SEQ ID No.: 4 ; G en la posición 3 en la SEQ ID No.: 4; C en la posición 4 en la SEQ ID No.: 4; A en la posición 5 en la SEQ ID No.: 4; U en la posición 6 en la SEQ ID No.: 4; U en la posición 7 en la SEQ ID No.: 4; C en la posición 8 en la SEQ ID No.: 4; A en la posición 9 en la SEQ ID No.: 4; C en la posición 10 en la SEQ ID No.: 4; C en la posición 11 en la SEQ ID No.: 4; G en la posición 12 en la SEQ ID No. : 4; C en la posición 13 en la SEQ ID No.: 4; G en la posición 14 en la SEQ ID No.: 4; U en la posición 15 en la SEQ ID No. : 4; G en la posición 16 en la SEQ ID No.: 4; C en la posición 17 en la SEQ ID No.: 4; C en la posición 18 en la SEQ ID No.: 4; U en la posición 19 en la SEQ ID No.: 4; U en la posición 20 en la SEQ ID No.: 4; ? en la posición 21 en la SEQ ID No.: 4; y/o, A en la posición 22 en la SEQ ID No. : .

El término "región complementaria" o "complemento" se refiere a una región de un ácido nucleico o mimético que es, o es al menos 60% complementaria a la secuencia de miARN de origen natural, madura. La región complementaria es, o es al menos 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 ó 100% complementaria, o cualquier intervalo derivable en éstos. Con las secuencias polinucleotídicas simples, puede existir una estructura de bucle de horquilla como resultado del enlace químico entre la región de miARN y la región complementaria. En otras modalidades, la región complementaria está sobre una molécula diferente de ácido nucleico que la región de miARN, en cuyo caso la región complementaria está sobre la hebra complementaria y la región de miARN está sobre la hebra activa .

Cuando la molécula de ARN es un polinucleótido simple, puede existir una región ligadora entre la región del miARN y la región complementaria. En algunas modalidades, el polinucleótido es capaz de formar una estructura de bucle de horquilla como resultado del enlace entre la región de miARN y la región complementaria. El ligador constituye el bucle de horquilla. Se contempla que en algunas modalidades, la región ligadora sea, es al menos o es a lo más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ó 40 residuos de longitud,- o cualquier intervalo derivable en estos. En ciertas modalidades, el ligador es entre 3 y 30 residuos (inclusive) de longitud.

A. Aislamiento de Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos pueden ser aislados utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia, aunque en modalidades particulares, los métodos para el aislamiento de moléculas pequeñas de ácido nucleico, y/o el aislamiento de moléculas de ARN pueden ser empleados. La cromatografía es un proceso a menudo utilizado para separár o aislar ácidos nucleicos de las proteínas o de otros ácidos nucleicos. Tales métodos pueden involucrar la electroforesis con una matriz de gel, columnas de filtro, electroforesis capilar, precipitación, con alcohol, y/u otra cromatografía. Si el miARN proveniente de las células va a ser utilizado o evaluado, los métodos involucran en general la lisis de las células con un agente caotrópico (por ejemplo, isotiocianato de guanidinio) y/o detergente (por ejemplo, N-lauroil-sarcosina) antes de implementar los procesos para el aislamiento de las poblaciones particulares de ARN.

En métodos particulares para separar el miARN de otros ácidos nucleicos, una matriz de gel es preparado utilizando poliacrilamida, aunque puede también ser utilizada la agarosa. Los geles pueden ser graduados por concentración o éstos pueden ser uniformes. Las placas o tuberías pueden ser utilizadas para retener la matriz de gel para electroforesis . Usualmente, la electroforesis unidimensional es empleada para la separación de los ácidos nucleicos. Las placas son utilizadas para preparar una placa de gel, mientras que la tubería (vidrio o caucho, típicamente) puede ser utiliza para preparar un gel de tubo. La frase "electroforesis en tubo" se refiere al uso de un tubo o tubería, en vez de placas, para formar el gel. Los materiales para implementar la electroforesis en gel pueden ser fácilmente preparados por una persona experta en la técnica o adquiridos, tal como de C.B.S. Scientific Co . , Inc. o Scie-Plas.

Los métodos pueden involucrar el uso de solventes orgánicos y/o alcohol para aislar los ácidos nucleicos, particularmente el miARN utilizado en los métodos y composiciones de la invención. Algunas modalidades son descritas en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/667,126, la cual se incorpora por referencia en la presente. En general, esta descripción proporciona los métodos para aislar eficientemente las moléculas pequeñas de ARN de las células, que comprenden: agregar una solución de alcohol a un lisado celular y aplicar la mezcla de alcohol/lisado a un soporte sólido antes de eluir las moléculas de ARN desde el soporte sólido. En algunas modalidades, la cantidad de alcohol agregado a un lisado celular alcanza una concentración de alcohol de aproximadamente 55 % a 60 %. Mientras que diferentes alcoholes pueden ser empleados, el etanol funciona bien. Un soporte sólido puede ser cualquier estructura, y éste incluye esferas, filtros, y columnas, que pueden incluir un soporte mineral o polimérico con grupos electronegativos. Un filtro de fibra de vidrio o columna ha funcionado particularmente bien para tales procedimientos de aislamiento.

En modalidades especificas, los procesos de aislamiento de miARN incluyen: a) la lisis de las células en la muestra con una solución de lisis que comprende guanidinio, en donde es producido un lisado con una concentración de al menos aproximadamente guanidinio 1M; b) la extracción de moléculas de miARN del lisado con una solución de extracción que comprende fenol, c) agregarle al lisado una solución alcohólica para formar una mezcla de lisado/alcohol, en donde la concentración del alcohol en la mezcla está entre aproximadamente 35 % a aproximadamente 70 % ; d) aplicar la mezcla de lisado/alcohol a un soporte sólido; e) eluir las moléculas de miARN del soporte sólido con una solución iónica, y, f) capturar las moléculas de miARN. Típicamente, la muestra es secada y resuspendida en un líquido y volumen apropiados para la manipulación subsiguiente.

B. Preparación de los Ácidos Nucleicos Alternativamente, la síntesis de ácido nucleico es realizada de acuerdo a los métodos estándares. Ver, por ejemplo, Itakura y Riggs (1980). Además, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,704,362, 5,221,619, y 5,583,013 cada una describen diversos métodos de preparación de los ácidos nucleicos sintéticos. Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, un oligonucleótido sintético) , incluyen un ácido nucleico elaborado mediante la síntesis química in vitro utilizando fosfotriéste , fosfito, o la química de la fosforamidita y técnicas en fase sólida tales como se describen en la Patente Europea EP 266,032, incorporada por referencia en la presente, o vía los intermediarios de H-fosfonato de desoxinucleósido como se describe por Froehler et al., 1986 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,705,629, cada una incorporada por referencia en la presente. En los métodos descritos en la presente, uno o más oligonucleótidos pueden ser utilizados. Las síntesis de oligonucleótidos es bien conocida por aquellos expertos en la técnica. Diversos mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos han sido descritos por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146, 5,602,244, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente.

Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico enzimáticamente producido incluye uno producido por las enzimas en reacciones de amplificación tales como la PCRMR (ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,202 y 4,682,195, cada una incorporada por referencia en la presente) , o la síntesis de un oligonucleótido descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,645,897, incorporada por referencia en la presente. Los ejemplos no limitantes de ácido nucleico biológicamente producido incluyen un ácido nucleico recombinante producido (es decir, replicado) en una célula viva, tal como un vector de ADN recombinante replicado en bacterias o en ARN recombinante o vectores de ARN replicados en virus (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, incorporada por referencia en la presente) .

Los métodos recombinantes para la producción de los ácidos nucleicos en una célula son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen el uso de vectores (virales y no virales) , plásmidos, cósmidos, y otros vehículos para distribuir un ácido nucleico a una célula, que puede ser la célula objetivo (por ejemplo, una célula cancerosa) o, simplemente, una célula hospedera (para producir grandes cantidades de la molécula de ARN deseada) . Alternativamente, tales vehículos pueden ser utilizados en el contexto de un sistema libre de células, siempre y cuando los reactivos para generar la molécula de ARN estén presentes. Tales métodos incluyen aquellos descritos en Sambrook, 2003, Sambrook, 2001 y Sambrook, 1989, las cuales se incorporan por referencia en la presente.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que no son sintéticas. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico tiene una estructura química de un ácido nucleico de origen natural y una secuencia de un ácido nucleico de origen natural, tal como la secuencia exacta y completa de un miARN primario, de una sola hebra (ver Lee, 2002) , un miARN precursor de una sola hebra, o un miARN maduro de una sola hebra.

II . Métodos Terapéuticos Ciertas modalidades se refieren a los ácidos nucleicos que realizan las actividades del miR-124 endógeno cuando es introducido dentro de las células. En ciertos aspectos, los ácidos nucleicos terapéuticos (también denominados como ácidos nucleicos) pueden ser sintéticos, no sintéticos, o una combinación de secuencias sintéticas o no sintéticas de miARN. Las modalidades se refieren, en ciertos aspectos, a las moléculas cortas de ácido nucleico (ácidos nucleicos terapéuticos) que funcionan como miR-124. Las moléculas de ácido nucleico son típicamente sintéticas. El término "sintético" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es químicamente sintetizada por una máquina o aparato y no producido naturalmente en una célula.

En ciertos aspectos, las moléculas de ARN pueden no tener una secuencia completa que es idéntica o complementaria a una secuencia de un miARN maduro de origen natural. Tales moléculas pueden abarcar toda o parte de una secuencia de origen natural o un complemento de la misma. Por ejemplo, un ácido nucleico sintético puede tener una secuencia que difiere de la secuencia de un miARN maduro, pero que la secuencia alterada puede proporcionar una o más funciones que pueden ser logradas con la secuencia natural.

El término "aislado" significa que las moléculas de ácido nucleico son inicialmente separadas de las diferentes moléculas (en términos de secuencia o estructura) y las moléculas de ácidos nucleicos no deseadas, tal que una población de ácidos nucleicos aislados es al menos aproximadamente 90 % homogénea, y puede ser al menos aproximadamente 95, 96, 97, 98, 99, ó 100 % homogénea con respecto a otras moléculas de polinucleótidos . En muchos aspectos de la invención, un ácido nucleico es aislado en virtud de haber sido sintetizado in vitro separado de los ácidos nucleicos endógenos en una célula. Se entenderá, no obstante, que los ácidos nucleicos aislados pueden ser subsecuentemente mezclados o combinados entre si.

En ciertos métodos, existe un paso adicional de administrar el mimético de miARN seleccionado o la molécula de ARN a una célula, tejido, órgano, u organismo (colectivamente "material biológico") en necesidad de tratamiento con relación a la modulación del miARN objetivo o en necesidad de los resultados fisiológicos o biológicos discutidos en la presente (tal como con respecto a una vía celular o resultado particular, por ejemplo, la disminución en la viabilidad celular) . Por consecuencia, en algunos métodos existe un paso de identificar un paciente en necesidad de tratamiento que puede ser proporcionado con el o los miméticos de miARN. Se contempla que una cantidad efectiva de un mimético de miARN puede ser administrado en algunas modalidades. En ciertas modalidades particulares, existe un beneficio terapéutico conferido sobre el material biológico, donde un "beneficio terapéutico" se refiere a un mejoramiento en una o más condiciones o síntomas asociados con un trastorno o condición, o un mejoramiento en el pronóstico, duración, o estado con respecto al trastorno. Se contempla que un beneficio terapéutico incluya, pero no está limitado a, una disminución en el dolor, una disminución en la morbilidad, una disminución de un. síntoma. Por ejemplo, con respecto al cáncer, se contempla que un efecto terapéutico puede ser la inhibición del crecimiento tumoral, la prevención de la metástasis, la reducción en el número de metástasis, la inhibición de la proliferación de las células cancerosas, la inhibición de la proliferación de células cancerosas, la inducción de la muerte celular en células cancerosas, la inhibición de la angiogénesis cerca de las células cancerosas, la inducción de la apoptosis de las células cancerosas, la reducción de la viabilidad de las células cancerosas o el número de células cancerosas viables, la reducción en el dolor, la reducción en el riesgo de recurrencia, la reducción de la quimio- o radiosensibilidad en las células cancerosas, la prolongación de la vida, y/o el plazo de muerte directa o indirectamente relacionado al cáncer .

En ciertas modalidades, un mimético de miARN es utilizado para tratar el cáncer. El cáncer incluye, pero no está limitado, a cánceres malignos, tumores, cánceres metastáticos , cánceres no extirpables, cánceres resistentes a la quimio- terapia y/o a la radiación, y cánceres terminales.

Los cánceres que pueden ser evaluados, diagnosticados, y/o tratados por los métodos y composiciones de la invención incluyen las células cancerosas de la vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, mama, sistema cardiovascular, cérvix, colon, tejido conectivo, endometrio, epitelio, esófago, intestino, gastrointestino, glándulas, encías, cabeza, riñon, hígado, pulmón, meninges, músculo, nasofaringe, cuello, neuronas, ovario, páncreas, próstata, recto, retina, piel, bazo, estómago, testículos, timo, la tiroides, la lengua, o útero. Además, el cáncer puede ser específicamente del siguiente tipo histológico, aunque no está limitado a estos: neoplasma, maligno; carcinoma; carcinoma no diferenciado; carcinoma de células gigantes y en husillo; carcinoma de células pequeñas, carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de células básales,¦ carcinoma de la matriz pilosa; carcinoma de células transicionales ; carcinoma de células transicionales papilares; adenocarcinoma ; gastrinoma, maligno, colangiocarcinoma ; carcinoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular combinado y colangiocarcinoma; adenocarcinoma trabecular, carcinoma quístico adenoide; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso, adenocarcinoma, poliposis coli familiar; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquiolo-alveolar, adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo, carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma de basófilos; adenocarcinoma de células claras, carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular carcinoma esclerosante no encapsulante, carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometroide, carcinoma de apéndice de piel; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide, cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en anillo de signet; carcinoma de conductos de infiltración; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio, enfermedad de Paget, mamario; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor estromal de ovario, maligno; tecoma, maligno; tumor de células granulosas, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli, tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipidicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extra-mamario, maligno; feocromocitoma ; glomangiosarcoma, melanoma maligno, melanoma amelanótico, melanoma de dispersión superficial, melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides ; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma, histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; leiomiosarcoma ; rabdomiosarcoma ; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar, sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mixto muleriano; nefroblastoma ; hepatoblastoma ; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filodo (en forma de hoja) , maligno, sarcoma sinovial, mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma maligno; tumor ovárico (estruma) , maligno; coriocarcinoma ; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma ; hemangioendotelioma, maligno, sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical ; condrosarcoma, condroblastoma , maligno; condrosarcoma mesenquimal ; tumor de células gigantes de hueso; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma maligno; fibrosarcoma , ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma maligno; ependimoma, astrocitoma, astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar, astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma · cerebelar; ganglioneuroblastoma, neuroblastoma, retinoblastoma, tumor neurogénico olfatorio; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma ; neurolemoma , maligne-tumor de células granulares, maligno; linfoma maligne-enfermedad de Hodgkin, linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, linfocítico pequeño, linfoma maligno, macrocitico, difuso; linfoma maligno, folicular; micosis fungoides; otros linfomas no-Hodgkin específicos; histiocitosis maligna; mieloma múltiple sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado, leucemia, leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia, leucemia de células linfosarcoma, leucemia mieloide; leucemia basofílica, leucemia eosinofilica; leucemia monocitica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica ; sarcoma mieloide y leucemia de células pilosas. Además, los miméticos de miARN pueden ser utilizados para las células precancerosas , tales como aquellas células en metaplasia, displasia, e hiperplasia .

Los métodos incluyen el suministro o el aumento de la actividad de una o más rniARNs en una célula. Los métodos también se refieren a la inducción de ciertas características celulares, al proporcionarle a una célula un ácido nucleico particular, tal como una molécula de ácido nucleico terapéutico, específico, es decir, una molécula mimética de miARN. El mimético de miARN terapéutico puede tener una secuencia que es idéntica a un miARN de origen natural con una o más modificaciones de diseño.

En ciertos aspectos, una molécula de ácido nucleico particular proporcionada a la célula se entiende que corresponden al miARN particular en la célula, y de este modo, el miARN en la célula es denominado como el "miARN correspondiente". En situaciones en las cuales una nombrada molécula de miARN es introducida dentro de una célula, se entenderá que el miARN correspondiente proporciona la función de miARN. Se contempla, no obstante, que el ácido nucleico terapéutico introducido dentro de una célula no es un miARN maduro, pero es capaz de llegar a ser o de funcionar como un miARN maduro bajo las condiciones fisiológicas apropiadas. En casos en los cuales un gen correspondiente particular o un transcrito de gen están siendo dirigidos por un mimético de miARN, el gen particular o el transcrito del gen será denominado como el "gen objetivo". Se contempla que múltiples genes correspondientes pueden ser dirigidos por uno o más miméticos de miARN diferentes. En modalidades particulares, más de un ácido nucleico terapéutico es introducido dentro de una célula. Además, en otras modalidades, más de un mimético de miARN es introducido dentro de una célula. Además, una combinación del o de los ácidos nucleicos terapéuticos puede ser introducida dentro de una célula. Los inventores contemplan que una combinación de los ácidos nucleicos terapéuticos puede actuar en uno o más puntos en las vías celulares de las células y que tal combinación puede temer eficacia incrementada sobre la célula objetivo mientras que no afecte de manera adversa las células normales o no objetivo. De este modo, una combinación de los ácidos nucleicos terapéuticos puede tener un efecto adverso mínimo sobre un sujeto o paciente, al tiempo que suministra un efecto terapéutico suficiente, tal como el mejoramiento de una condición, inhibición del crecimiento de una célula, muerte de una célula objetivo, alteración del fenotipo o fisiología celular, el retardo del crecimiento celular, sensibilización a una segunda terapia, sensibilización a una terapia particular, y similares.

Los métodos incluyen la identificación de una célula o paciente en necesidad de inducir esos efectos terapéuticos o las características celulares. También, se entenderá que una cantidad de un ácido nucleico terapéutico que es proporcionada a una célula u organismo es una "cantidad efectiva", que se refiere a una cantidad necesaria (o una cantidad suficiente) para alcanzar una meta deseada, tal como la inducción un efecto terapéutico particular o una o varias características celulares o la reducción del crecimiento celular o la muerte de las células cancerosas o el alivio de los síntomas asociados con un cáncer.

En ciertos aspectos, los métodos pueden incluir la provisión o la introducción dentro de una célula, de una molécula de ácido nucleico que corresponde a un miARN maduro en la célula en una cantidad efectiva para lograr un resultado fisiológico deseado. Además, los métodos pueden involucrar la provisión de múltiples ácidos nucleicos terapéuticos sintéticos. Se contempla que en estas modalidades, los métodos pueden o no estar limitados a la provisión de una o más moléculas sintéticas. En esta situación, una célula o células pueden ser proporcionadas con una molécula sintética que corresponde a un miARN particular, y una molécula sintética que corresponde a un miARN diferente. Además, cualquier método articulado utilizando una lista de objetivos de miARN utilizando el lenguaje grupos de Markush pueden ser articulados sin el lenguaje de grupos de Markush y un articulo disyuntivo (es decir, o) en vez de, y viceversa.

En algunas modalidades, existe un método para reducir o inhibir la proliferación celular, la propagación, o la renovación en una célula que comprende introducir dentro de o proporcionarle a la célula una cantidad efectiva de (i) un ácido nucleico terapéutico o (ii) una molécula sintética que corresponde a una molécula de miARN. En ciertas modalidades, los métodos involucran la introducción dentro de la célula, de una cantidad efectiva de (i) una molécula mimética de miARN que tiene las secuencias 5' a 3' que es al menos 90 % idéntica a la secuencia 5' a 3' de uno o más miARN maduros.

Ciertos aspectos de la invención incluyen los métodos de tratar una condición patológica, tal como el cáncer o las condiciones precancerosas . En un aspecto, el método comprende poner en contacto una célula objetivo con uno o más ácidos nucleicos, que comprende al menos un segmento de ácido nucleico que tiene toda o una porción de una secuencia de miARN o un complemento de la misma. El segmento puede ser de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 o más nucleótidos o análogos de nucleótido, incluyendo todos los números enteros entre estos. Algunas modalidades incluyen la modulación de la expresión del gen, la expresión de miARN o la función o la expresión o la función del mARN dentro de una célula objetivo, tal como una célula de cáncer de próstata o célula madre de cáncer (CSC, por sus siglas en inglés) .

Típicamente, un gen endógeno, miARN o mARN es modulado en la célula. En ciertos aspectos, una secuencia de ácido nucleico terapéutico comprende al menos un segmento que es al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, ó 100 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a uno o más miARN o secuencias de genes o complementos de los mismos. La modulación de la expresión o el procesamiento de un gen, miARN, o mARN de la célula o un virus puede ser a través de la modulación del procesamiento de un ácido nucleico, incluyendo tal procesamiento a la transcripción, transportación y/o traducción dentro de una célula. La modulación puede ser también efectuada por la inhibición o el mejoramiento de la actividad de miARN dentro de una célula, tejido, u órgano. Tal procesamiento puede afectar la expresión de un producto codificado o la estabilidad del mARN.

Se entenderá en los métodos de la invención que una célula u otro material biológico tal como un organismo (incluyendo pacientes) puede ser proporcionado un ácido nucleico terapéutico correspondiente a o que se dirige a un miARN particular, por administración a la célula o al organismo de una molécula de ácido nucleico que funciona como el miARN correspondiente una vez dentro de la célula. De este modo, se contempla que un ácido nucleico sea proporcionado tal que éste se vuelva procesado dentro de un miARN maduro o activo una vez que tenga acceso a la maquinaria de procesamiento de la célula. En ciertos aspectos, se contempla específicamente que la molécula de miARN proporcionada no sea una molécula madura, sino una molécula de ácido nucleico que pueda ser procesada dentro del miARN maduro o su equivalente funcional una vez que está accesible a la maquinaria de procesamiento .

El término "no sintético" en el contexto de miARN significa que el miARN no es "sintético", como se define en la presente. Además, se contempla que en las modalidades de la invención que se refieren al uso de los miARNs sintéticos, el uso de los miARNs no sintéticos correspondientes es también considerado un aspecto de la invención, y viceversa. Se entenderá que el término "proporcionar" un agente es utilizado para incluir "administrar" el agente a un paciente.

En ciertas modalidades, los métodos también incluyen dirigir un miARN dentro de una célula u organismo. El término "que corresponde a un miARN" significa que un ácido nucleico será empleado para imitar (proporcionar la actividad o la función de) un miARN seleccionado.

Además, se contempla que las composiciones de ácidos nucleicos pueden ser proporcionadas como parte de una terapia para un paciente, en conjunto con las terapias tradicionales o los agentes preventivos tradicionales. Además, se contempla que cualquier método discutido en el contexto de la terapia puede ser aplicado de manera preventiva, particularmente en un paciente identificado como potencialmente en necesidad de la terapia o en riesgo de la condición o el trastorno para el cual es necesaria una terapia.

Además, los métodos de la invención se refieren, al empleo de uno o más ácidos nucleicos que corresponden a un miARN y un fármaco terapéutico. El ácido nucleico puede aumentar el efecto o la eficacia del fármaco, reducir cualesquiera efectos colaterales o toxicidad, modificar su biodisponibilidad, y/o disminuir la dosis o la frecuencia necesarias. En ciertas modalidades, el fármaco terapéutico es un agente terapéutico contra el cáncer. En consecuencia, en algunas modalidades, existen métodos de tratamiento de un precáncer o cáncer en un paciente que comprende administrarle al paciente un agente terapéutico anticáncer (es decir, un segundo terapéutico) y una cantidad efectiva de al menos una molécula de ácido nucleico que mejora la eficacia del agente terapéutico contra el cáncer o protege a las células no cancerosas. Las terapias contra el cáncer también incluyen una variedad de terapias de combinación con tratamientos basados en productos químicos y en radiación.

En general, los miméticos de miARN pueden ser administrados para disminuir la actividad de un ácido nucleico dirigido por el miARN. Los métodos contemplados en general incluyen la provisión o la introducción de una o más moléculas diferentes de ácido nucleico que corresponden a uno o más diferentes genes. Se contempla que las siguientes, al menos las siguientes, o a lo más el siguiente número de diferentes moléculas de ácido nucleico o de miARN puedan ser detectadas, evaluadas, proporcionadas o introducidas: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 , 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, '79, 80, 81, 82, 83 , 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o más, incluyendo cualquier valor o intervalo derivable entre éstos. ' III. Formulaciones Farmacéuticas y Distribución Los métodos incluyen la distribución de una cantidad efectiva de un ácido nucleico terapéutico, que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia madura de miARN. Una "cantidad efectiva" de la composición farmacéutica, en general, es definida como aquella cantidad suficiente para ser detectable y de manera repetida el resultado deseado establecido, por ejemplo, para mejorar, reducir, minimizar o limitar el grado del trastorno o sus síntomas. Otras definiciones más rigurosas pueden aplicar, incluyendo la eliminación, erradicación o curación de la enfermedad o trastorno.

En ciertas modalidades, se desea matar las células, inhibir el crecimiento celular, inhibir la metástasis, disminuir el tamaño del tumor o del tejido, y/o revertir o reducir el fenotipo maligno o de enfermedad de las células. Las vías de administración variarán, naturalmente, con la localización y la naturaleza de la lesión o el sitio objetivo, e incluyen, por ejemplo, la administración intradérmica, subcutánea, regional, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, sistémica, y oral y las formulaciones para las mismas. La inyección o la venoclisis de un ácido nucleico terapéutico es específicamente contemplada para precánceres o cánceres discretos, sólidos y accesibles, y otras áreas objetivo accesibles. La administración local, regional o sistémica puede también ser apropiada .

En el caso de la intervención quirúrgica, la presente invención puede ser utilizada preoperatoriamente, para hacer a una lesión no inoperable sujeta a extirpación. Alternativamente, la presente invención puede ser utilizada al tiempo de la cirugía, y/o después de ésta, para tratar el trastorno residual o metastásico. Por ejemplo, un lecho tumoral extirpado puede ser inyectado o perfundido con una formulación que comprende ácido nucleico terapéutico o combinaciones de los mismos. La administración puede ser post-extirpación continua, por ejemplo, al dejar un catéter implantado en el sitio de la cirugía.- Se considera también el tratamiento post-quirúrgico periódico. La perfusión o venoclisis continua de un ácido nucleico es también contemplada.

La administración continua también puede ser aplicada donde sea apropiado, por ejemplo, donde un tumor u otra área afectada no deseada es extirpada, y el lecho tumoral o el sitio objetivo es tratado para eliminar el trastorno microscópico, residual. La administración por medio de jeringa o cateterización es contemplada. Tal venoclisis continua puede tener lugar por un periodo de aproximadamente 1-2 horas, a aproximadamente de 2-6 horas, hasta aproximadamente 6-12 horas, hasta aproximadamente 12 a 24 horas, hasta aproximadamente 1-2 días, hasta aproximadamente 1-2 semanas o más después del inicio del tratamiento. En general, la dosis de la composición terapéutica vía la venoclisis continua será equivalente a aquella dada por inyecciones simples o múltiples, ajustadas en un periodo de tiempo durante el cual ocurre la venoclisis.

Los regímenes de tratamiento pueden variar también, y a menudo dependen del tipo y/o de la localización de una lesión, el sitio objetivo, la progresión de la enfermedad, y la salud, la condición inmunitaria, y la- edad del paciente. Ciertos tipos de tumores requerirán tratamiento más agresivo. El clínico estará más preparado para realizar tales decisiones con base en la eficacia y toxicidad conocidas (si las hay) de las formulaciones terapéuticas.

En ciertas modalidades, la lesión o el área afectada que se trata puede no ser, al menos inicialmente, extirpable. Los tratamientos con las composiciones de la invención pueden incrementar la capacidad de la extirpación debido al encogimiento de los márgenes o por eliminación de ciertas porciones particularmente invasoras. Después de los tratamientos, puede ser posible la extirpación. Los tratamientos adicionales subsecuentes a la extirpación pueden servir para eliminar el trastorno residual microscópico en el tumor o en el sitio objetivo.

Los tratamientos pueden incluir diversas "dosis unitarias". Una dosis unitaria es definida como que contiene una cantidad predeterminada de una o varias composiciones terapéuticas. La cantidad que va a ser administrada, y la vía particular y la formulación, están dentro de la experiencia de aquellos expertos en las técnicas clínicas. Una dosis unitaria no necesita ser administrada como una inyección simple, pero puede comprender la venoclisis continua en un periodo de tiempo establecido. Una dosis unitaria puede ser convenientemente descrita en términos de ng, µg, o mg de miARN o el mimético de miARN. Alternativamente, la cantidad especificada puede ser la cantidad administrada como la dosis promedio diaria, promedio semanal o promedio mensual.

Un ácido nucleico terapéutico puede ser administrado al paciente en una dosis de aproximadamente o de al menos aproximadamente 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 , 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 ng, µg o mg, o más, o cualquier intervalo derivable en éstos. Alternativamente, la cantidad especificada puede ser la cantidad administrada como la dosis diaria promedio, semanal promedio o mensual promedio, o ésta puede ser expresada en términos de mg/kg, donde kg se refiere al peso del paciente y mg es especificado anteriormente. En otras modalidades, la cantidad especificada es cualquier número discutido anteriormente, pero expresado como mg/m2 (con respecto al tamaño del tumor o al área superficial del paciente) . En algunas modalidades, una dosis o régimen puede ser administrado cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas, y/o 1, 2, 3 4, 5, 6, 7 días, y/o 1, 2, 3 y 4 semanas, y cualquier intervalo derivable entre estos, a un paciente en necesidad de tratamiento.

Ert algunas modalidades, el método para la distribución de un ácido nucleico terapéutico es vía la administración local o sistémica. Sin embargo, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden también ser administradas parenteralmente, subcutáneamente, intratraquealmente, intravenosamente, intradérmicamente, intramuscularmente, o incluso intraperitonealmente como se describe en las Patente de los Estados Unidos Nos. 5,543,158; 5,641,515 y 5,399,363 (cada una específicamente incorporada por referencia en la presente en su totalidad) .

La inyección de los ácidos nucleicos puede ser distribuida por jeringa o cualquier otro método utilizado para inyección de una solución, siempre y cuando el ácido nucleico y cualesquiera componentes asociados puedan pasar a través del calibre particular de la aguja requerida para la inyección. Un sistema de 'jeringa ha sido también descrito para el uso en la terapia génica que permite múltiples inyecciones de cantidades predeterminadas de una solución precisamente a cualquier profundidad (Patente de los Estados Unidos No. 5,846, 225) .

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden ser preparadas en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa . Las dispersiones pueden ser también preparadas en glicerol, polietilenglicoles líquidos, mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de los microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (Patente de los Estados Unidos No. 5,466,468, específicamente incorporada en la presente en su totalidad) . Típicamente, la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado en que exista la fácil administración con jeringa. Esta debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y preservada contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líguido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos . La prevención de la acción de los microorganismos puede ser originada por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser originada por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En ciertas formulaciones, una formulación basada en agua es empleada, mientras que en otras, ésta puede estar basada en lípidos. En modalidades particulares de la invención, una composición que comprende un ácido nucleico de la invención es una formulación basada en agua. En otras modalidades, la formulación está basada en lípido.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser adecuadamente amortiguada si es necesario y el diluyente líquido primeramente hecho isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral , intralesional e intraperitoneal . A este contexto, los medios acuosos estériles que pueden ser empleados serán conocidos por aquellos de experiencia en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede ser disuelta en 1 mi de solución isotónica de NaCl y adicionada hasta 1000 mi de fluido para hipodermoclisis o inyectada en el sitio de infusión propuesto, (ver, por ejemplo, "Remington Pharmaceutical Sciences" 15va edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Cierta variación en la dosis ocurrirá necesariamente dependiendo de la condición del sujeto que se trate. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Además para la administración en humanos, las preparaciones deben cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza como es requerido por la Oficina de estándares Biológicos de la FDA (Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos) . Como se utiliza en la presente, un "portador" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y que retardan la absorción, amortiguadores, soluciones portadoras, suspensiones, coloides, y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Excepto en cuanto a que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas es contemplado. Los ingredientes activos suplementarios pueden también ser incorporados dentro de las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las entidades moleculares y a las composiciones que no producen una reacción alérgica o similar no deseada cuando se administra a un humano. El o los ácidos nucleicos son administrados de una manera compatible con la formulación de dosis, en una cantidad tal que será terapéuticamente efectiva. La cantidad que va a ser administrada depende del sujeto que va a ser tratado, incluyendo, por ejemplo, la agresividad del trastorno o cáncer, el tamaño de cualesquiera lesiones o tumores, los cursos previos u otros cursos de tratamiento. Las cantidades precisas del ingrediente activo requerido que va a ser administrado dependen del juicio del practicante. Los regímenes adecuados para la administración inicial y la administración subsecuente son también variables, pero son tipificados por una administración inicial seguida por otras administraciones. Tal administración puede ser sistémica, como una dosis simple, continua durante un período de tiempo que abarca 10, 20, 30, 40, 50, 60 minutos, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más horas, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días o más. Además, la administración puede ser a través de un mecanismo de liberación en el tiempo o liberación sostenida, implementada por la formulación y/o el modo de administración. Otros sistemas de distribución adecuados incluyen, pero no están limitados a, la liberación en el tiempo, liberación retardada, liberación sostenida, o sistemas de distribución de liberación controlada. Tales sistemas pueden evitar las administraciones repetidas en muchos casos, incrementando la conveniencia para el sujeto y para el médico. Muchos tipos de sistemas de distribución de liberación son disponibles y son conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, sistemas basados en polímeros tales como ácidos polilácticos y/o poliglicólicos, polianhídridos , policaprolactonas , copolioxalatos, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutürico, y/o combinaciones de éstos. Las microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen ácidos nucleicos son descritos en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,075,109. Otros ejemplos incluyen los sistemas no poliméricos que son basados en lípido incluyendo esteróles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di- y triglicéridos sistemas de liberación por hidrogel; sistemas basados en liposomas ; sistemas basados en fosfolipidos ; sistemas silásticos ;' sistemas basados en péptidos, recubrimientos de cera; tabletas comprimidas utilizando aglutinantes y excipientes convencionales; o implantes parcialmente fusionados. Los ejemplos específicos incluyen, pero no están limitados a, sistemas erosiónales en los cuales la molécula de ARN es contenida en una formulación dentro de una matriz (por ejemplo, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,452,775, 4,675,189, 5,736,152, 4,667,013, 4,748,034 y 5,239,660, las cuales se incorporan por referencia en la presente) , o los sistemas difusionales en los cuales un componente activo controla la velocidad de liberación (por ejemplo, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,832,253, 3,854,480, 5,133,974 y 5,407,686, las cuales se incorporan por referencia en la presente) . La formulación puede ser como, por ejemplo, microesferas , hidrogeles, depósitos poliméricos, matrices de colesterol, o sistemas poliméricos. En algunas modalidades, el sistema puede permitir la liberación sostenida o controlada de la composición, por ejemplo, para que ocurra a través ¦ del control de la difusión o la velocidad de erosión/degradación de la formulación que contiene las moléculas de ARN. Además, un sistema de distribución de equipo físico basado en bomba puede ser utilizado para distribuir una o más modalidades. Los ejemplos de sistemas en los cuales ocurre la liberación en estallidos incluye, por ejemplo, los sistemas en los cuales la composición es atrapada en liposomas que son encapsulados en una matriz polimérica, siendo sensibles los liposomas a los estímulos específicos, por ejemplo, la temperatura, el pH, la luz o una enzima de degradación y sistemas en los cuales la composición es encapsulada por una microcápsula iónicamente recubierta con una enzima de degradación de núcleo de la microcápsula. Los ejemplos de sistemas en los cuales la liberación del inhibidor es gradual y continua incluyen, por ejemplo, sistemas erosiónales en los cuales la composición está contenida en una forma dentro de una matriz y los sistemas de efusión en los cuales la composición se permea a una velocidad controlada, por ejemplo, a través de un polímero. Tales sistemas de liberación sostenida pueden ser, por ejemplo, en la forma de pelotillas o cápsulas. Las composiciones y métodos pueden ser utilizados para aumentar la distribución de las moléculas de ARN (ver Shim y Kwon (2010) , la cual se incorpora por referencia en la presente, en la revisión) . Las composiciones y los métodos para la distribución mejorada puede proporcionar la distribución eficiente a través de la circulación, la biodistribución apropiada, el transporte celular eficiente, el procesamiento intracelular eficiente, y similares. Las formulaciones y composiciones pueden incluir, pero no están limitadas a" una o más de modificación química de las moléculas de ARN, la incorporación de una molécula de ARN o precursores de ARN dentro de un vector viral o no viral, la dirección del objetivo de la distribución de la molécula de ARN, y/o el acoplamiento de las moléculas de ARN con un aumentador de la distribución celular.

En ciertos aspectos, las moléculas de ARN químicamente modificadas pueden incluir, con o sin las modificaciones químicas discutidas anteriormente, la conjugación de una molécula de ARN a una molécula portadora. En ciertos aspectos, la molécula portadora es un polímero natural o sintético. Por ejemplo, una molécula portadora puede ser el colesterol o un aptámero de ARN y similares. Una molécula portadora puede ser conjugada a las moléculas de ARN en el extremo 5' y/o 3' de la hebra activa o de la hebra pasajera, o en una posición de nucleótido interno. El portador puede ser conjugado a la hebra de una de las moléculas de ARN.

En un aspecto adicional, una o dos hebras de la molécula de ARN pueden ser codificadas o distribuidas con un vector viral. Una variedad de vectores virales conocidos en la técnica pueden ser modificados para expresar o para llevar una molécula de ARN en una célula objetivo, por ejemplo, el virus 1 del herpes simple o vectores lentivirales han sido utilizados para mejorar la distribución del siARN.

En un aspecto adicional, una molécula de ARN puede ser asociada con un vector no viral. Los vectores no virales pueden . ser acoplados a las porciones de aumento de la dirección y la distribución, tales como los anticuerpos, diversos polímeros (por ejemplo, PEG) , péptidos fusogénicos, ligadores, péptidos de penetración de células y similares. Los vectores no virales incluyen, pero no están limitados a liposomas y lipoplexos, polímeros y péptidos, partículas sintéticas y similares. En ciertos aspectos un liposoma o lipoplex tiene una carga neutra, negativa o positiva y puede comprender cardiolipina, polietilenglicol conjugado a la anisamida, dioleoil-fosfatidilcolina, o una variedad de otros lípidos neutros, aniónicos o catiónicos o conjugados de lípidos. Los siARNs pueden ser formados en complejos con polímeros catiónicos (por ejemplo, polietilenimina (PEI)), polisacáridos catiónico biodegradable (por ejemplo, quitosano) , o polipéptidos catiónicos (por ejemplo, atelocolágeno, polilisina, y protamina) .

En ciertos aspectos la distribución del ARN puede ser mejorada por la dirección del ARN hacia una célula. Las porciones de dirección al objetivo pueden ser conjugadas a una variedad de composiciones de distribución y proporcionar el enlace selectivo o específico a una o varias células objetivo. Las porciones de dirección al objetivo : pueden incluir, pero no están limitadas a porciones que se enlazan a los receptores de la superficie celular, polipéptidos , sacáridos o lipidos extracelulares específicos de células, y similares. Las moléculas pequeñas tales como folato, péptidos tales como los péptidos que contienen RGD, y anticuerpos tales como anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento epidérmico pueden ser utilizados para dirigirse a otros tipos celulares específicos.

En un aspecto adicional, la distribución puede ser aumentada por porciones que interactúan con los mecanismos y la maquinaria celulares, tales como la absorción y el tráfico intracelulares . En ciertos aspectos los péptidos de penetración de células (CPPs, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, TAT y MPG de HIV-1, penetratina, poliarginina pueden ser acoplados con un siARN o un vector de distribución para aumentar la distribución hacia una célula. Los péptidos fusogénicos (por ejemplo, derivados del endodominio de la envoltura del HIV-1 (HGP, por sus siglas en inglés) o el péptido fusogénico de la influenza (dilNF-7)) puede también ser utilizado para aumentar la distribución celular.

Una variedad de sistemas de distribución tales como colesterol-siARN, aptámeros de ARN-siARN, vector adenoviral, vector lentiviral, partícula lipídica de ácido nucleico estable (SNALP) , liposoma basado en análogo de cardiolipina, liposoma de DSPE-polietilenglicol-DOTAP-colesterol, liposoma de hialuronano-DPPE, liposoma neutro de DOPC, atelocolágeno, quitosano, polietilenimina , polilisina, protamina, RGD-polietilenglicol-polietilenimina, liposoma HER-2 con el péptido de histidina-lisina, anticuerpo para el VIH-protamina, arginina, lipopolímero soluble en agua conjugado a oligoarginina (9R) (WSLP) , oligoarginina (15R), TAT-PAMAM, colesterol- PG-8, liposoma DOPE-catiónico, péptido-PEG-MMP-2-péptido escindible-DOPE y similares, han sido utilizados para aumentar la distribución del siARN.

El intervalo de dosis terapéutica óptima para los miméticos de miARN en los pacientes de cáncer es contemplado como de 0.01-5.0 mg de miARN por kg de peso corporal del paciente (mg/kg) . En algunas modalidades, se contempla que aproximadamente, al menos aproximadamente, o a lo más aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7. 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 mg de una molécula de ARN, o cualquier intervalo derivable en éstos, pueda ser formulado en una composición y/o administrado a un paciente. En algunas modalidades, un paciente puede ser administrado con 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09,; ?,.,?, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2 , 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 . 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 mg/kg de una molécula de ARN, o cualquier intervalo derivable en éstos, por dosis o régimen, que puede ser administrado cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días, y/o 1, 2, 3, 4 semanas, y cualquier intervalo derivable en éstos.

Las inyecciones pueden ser intravenosa (IV), intraperitoneal (IP), intramuscular (I ), intratumoral (IT), intratraquealmente (para la distribución pulmonar) , intravitreal (para trastornos del ojo) , o subcutánea, todas las cuales han sido determinadas como efectivas como un método de distribución para las moléculas de ARN descritas en la presente. Varias tecnologías de distribución son específicamente contempladas, incluyendo, pero no limitadas a, emulsión lipídica neutra (NLE, por sus siglas en inglés), atelocolágeno, SNALP, DiLa, y ciclodextrina , las cuales son discutidas con más detalle más adelante.

Las emulsiones lipídicas neutras (NLEs) son una colección de formulaciones que combinan un lípido neutro, aceite y emulsificante con un mimético de miARN para producir los complejos que hacen posible la distribución de los miARNs a los tumores y otros tejidos después de la inyección intravenosa (IV). Una formulación de este tipo combina la 1 , 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), escualeno, Polisorbato 20 (Tween-20), y ácido ascórbico a una proporción de 1:2.6:53.4:0.1 (p/p) . Los componentes de NLE son mezclados en un solvente como cloroformo y luego el solvente es eliminado utilizando un evaporador rotatorio, dejando una solución viscosa. Un mimético de miARN disuelto en PBS es agregado a una proporción de 1:2 (p/p) al DOPC. En ciertas modalidades, la proporción de la molécula de ARN al DOPC es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o a lo más aproximadamente 0.1:1, 0:2:1, 0.3:1, 0.4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4; 1:0.3, 1:0.2, 1:0.1 y cualquier intervalo derivable en éstos. La sonicación produce partículas + miARN que pueden ser inyectadas IV a proporcionas ^ "de aproximadamente 0.01-1 mg/kg en humanos. En ciertas modalidades, la cantidad de esta formulación es proporcionada a un paciente en cantidades de 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7. 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 mg/kg a un paciente por dosis o régimen, que puede ;ser administrado cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas, y/o 1, 2, 3, 4, 5' , 6, 7 días, y/o 1, 2, 3, 4 semanas, y cualquier intervalo derivable en éstos.

Los complejos de atelocolágeno/miARN son preparados al mezclar volúmenes iguales de atelocolágeno (0.1 % en PBS a pH 7.4) (Koken Co . , Ltd.; Tokio, Japón) y la solución de miARN (miARN 20 µ?) y agitando las mezclas por 1 hora a 4°C. Los complejos de miARN/atelocolágeno resultantes son diluidos en PBS hasta una concentración final de atelocolágeno de 0.05 %. En ciertas modalidades, la concentración porcentual final de atelocolágeno es de aproximadamente, alrededor de, al menos, o aproximadamente a lo más 0.01 %, 0.02 %, 0.03 , 0.04 %, 0.05 %, 0.06 %, 0.07 %, 0.08 %, 0.09 %, 0.10 %, 0.11 %, 0.10 %, 0.11 %, 0.12 %, 0.13 %, 0.14 %. 0.15 %, 0.16 %, 0.17 , 0.18 %), 0.19 %), 0.20 %), y cualquier intervalo derivable en éstos.

SNALP categoriza una colección de formulaciones desarrolladas por TekmiRa para la distribución sistémica de los ácidos nucleicos. La formulación más publicada contiene los lipidos de 3-N- [ (qmetoxipoli (etilenglicol) 2000) carbamoil] -1,2-dimiRistiloxi-propilamina (PEG-C-DMA), 1 , 2-dilinoleiloxi-N , N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1 , 2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) y colesterol, en una proporción porcentual molar 2:40:10:48. La formulación lipidica es mezclada con siARN/miARN y forma partículas utilizando un método de dilución con etanol (Jeffs 2005, la cual se incorpora por referencia en la presente) . En algunas modalidades, la proporción del lípido al ácido nucleico (p:p) es, es al menos, o es a lo más de aproximadamente 0.001:1, 0.002:1, 0.003:1, 0.004:1, 0.005:1, 0.006:1, 0.007:1, 0.008:1, 0.009:1, 0.01:1, 0.02:1, 0.03:1, 0.04:1, 0.05:1, 0.06:1, 0.07:1, 0.08:1, 0.09:1, 0.1:1, 0.2:1, 0.3:1, 0.4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4; 1:0.3, 1:0.2, 1:0.1, 1:0.09, 1:0.08, 1:0.07, 1:0.06, 1:0.05, 1:0.04, 1:0.03, 1:0;0>2, 1:0.01, 1:0.009, 1:0.008, 1:0.007, 1:0.006, 1:0.005, 1:0.004, 1:0.003, 1:0.002, 1:0.001, o cualquier intervalo derivable en éstos.

TekmiRa reclama alcanzar más de 90 % de eficiencia de encapsulamiento . Los tamaños de partícula son de aproximadamente 110 nm.

DiLA2 describe un grupo de una variedad de formulaciones desarrolladas por Marina Biotech Inc. (Bothell, WA Estados Unidos) para la liberación sistémica de dsARNs pequeños. Una formulación combina Cl 8 : 1 -norArg-NH3Cl-C16, hemisuccinato de colesterilo (CHEMS, Anatrace, CH210), colesterol (Anatrace CH200), y DMPE-PEG2k (Genzyme): a proporciones de 50:28:20:2 (p/p) . Un dsARN pequeño es combinado con la formulación lipidica a una proporción de ARN:lipido de entre 1.7:1 a 5:1 (p/p) . En algunas modalidades, la proporción ARN:lipido es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o a lo más aproximadamente 0.001:1, 0.002:1, 0.003:1, 0.004:1, 0.005:1, 0.006:1, 0.007:1, 0.008:1, 0.009:1, 0.01:1, 0.02:1, 0.03:1, 0.04:1, 0.05:1, 0.06:1, 0.07:1, 0.08:1, 0.09:1, 0.1:1, 0.2:1, 0.3:1, 0,4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4; 1:0.3, 1:0.2, 1:0.1, 1:0.09, 1:0.08, 1:0.07, 1:0.06, 1:0.05, 1:0.04, 1:0.03, 1:0.02, 1:0,01, 1:0.009, 1:0.008, 1:0.007, 1:0.006, 1:0.005, 1:0.004, 1:0.003, 1:0.002, 1:0.001, y cualquier intervalo derivable en éstos. Los dos componentes son mezclados vía una corriente de choque e incubados por 1 hora para producir partículas estables con diámetros de aproximadamente 125 nra.

Calando Pharmaceuticals, Inc. (Pasadena¿ CA, Estados Unidos) ha desarrollado una plataforma de distribución llamada RONDELMR que caracteriza las partículas basadas en ciclodextrina . Los policationes de ciclodextrina (CDP) son mezclados con un conjugado de adamantano-PEG5000 (AD-PEG) a una proporción AD:CDP 1:1 (mol/mol) (Hu-Lieskovan 2005, la cual se incorpora por referencia en la presente). El AD-PEG modificado con transferrina (AD-PEG-transferrína) puede ser agregado a una proporción AD-PEG-transferrina : AD-PEG de 1:1.000 (p/p) para proporcionar una proporción objetivo para mejorar la distribución a las células cancerosas con niveles elevados de transíerrina . La mezcla es agregada a un volumen igual de molécula de ARN a una proporción de carga (cargas positivas de CDP a cargas negativas de la cadena principal de miARN) de 3:1 (+/-). En ciertas modalidades, la proporción de carga entre la mezcla y las moléculas de ARN es de aproximadamente, al menos aproximadamente o a lo más aproximadamente 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o cualquier intervalo derivable en éstos. Un volumen igual de 10 % (p/v) de glucosa en agua es agregado a los poliplexos resultantes para dar una formulación de Polyplex final en 5 % de glucosa (p/v) (D5 ) adecuada para la inyección.

En algunas modalidades, las partículas son utilizadas para la distribución a un ácido nucleico terapéutico. En algunas modalidades, el tamaño de partícula es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o a lo más aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 nm, o cualquier intervalo derivable en éstos.

?. Tratamientos en Combinación En ciertas modalidades, las composiciones y los métodos involucran un ácido nucleico terapéutico. Estas composiciones pueden ser utilizadas en combinación con una segunda terapia para aumentar el efecto de la terapia de miARN, o incrementar el efecto terapéutico de otra terapia que es empleada. Estas composiciones serian proporcionadas en una cantidad combinada, efectiva para lograr el efecto deseado, tal como la muerte de una célula cancerosa y/o la inhibición de la hiperproliferación celular. Este proceso puede involucrar el contacto de las células con el ácido nucleico terapéutico o la segunda terapia al mismo tiempo o a un tiempo diferente. Esto puede ser logrado al poner en contacto la célula con una o más composiciones o la formulación farmacológica que incluye una o más de los agentes, o al poner en contacto la célula con dos o más composiciones o formulaciones distintas, en donde una composición proporciona (1) el ácido nucleico terapéutico; y/o (2) una segunda terapia. Una segunda composición o método puede ser administrado, el cual incluye una quimioterapia, radioterapia, terapia quirúrgica, inmunoterapia o terapia génica.

Se contempla que se puede le proporcionar a un paciente la terapia con miARN y la segunda terapia dentro de aproximadamente 12 a 24 horas una de la otra, y, más preferiblemente, dentro de aproximadamente 6 a 12 horas una de la otra. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el periodo de tiempo para tratamiento significativamente, no obstante, donde varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7· o 8) transcurren entre las administraciones respectivas.

En ciertas modalidades, un curso de tratamiento durará 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 días o más. Se contempla que un agente puede ser administrado en el dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,· 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 y/o 90, una combinación de los mismos, 'y otro agente es administrado en el dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 , 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, y/o 90, o cualquier combinación de los mismos. Dentro de un dia simple, (periodo de 24 horas), al paciente se le puede dar una o varias administraciones del o de los agentes. Además, después de un curso de tratamiento, se contempla que existe un periodo de tiempo en el cual no se administra tratamiento. Este periodo de tiempo puede durar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dias, y/o 1, 2, 3, 4, 5 semanas, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más, dependiendo de la condición del paciente, tal como su pronóstico, la fuerza, la salud, etc.

La administración de cualquier compuesto o la terapia de la . presente invención a un paciente seguirá protocolos generales para la administración de tales compuestos, tomando en cuenta la toxicidad, si la hay, del vector o cualquier proteina u otro agente. Por lo tanto, en algunas modalidades existe un paso de monitoreo de la toxicidad que es atribuible a la terapia de combinación. Se espera que los ciclos de tratamiento pudieran ser repetidos como sea necesario. Se contempla también que diversas terapias estándares, asi como la intervención quirúrgica, pueden ser aplicadas en combinación con la terapia descrita.

En aspectos específicos, se contempla que una segunda terapia, tal como la quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia , terapia quirúrgica u otra terapia génica, sea empleada en combinación con la terapia de miAR , como se describe en la presente.

Los ejemplos de agentes quimioterapéutieos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo, tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, y trietilentiofosforamida y trimetiiolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; y camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina ; una sarcodict ina ; espongistatina, mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato del óxido de mecloretamina , melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina , trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina ; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina omegall; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina, asi como cromóforo de neocarzinostatina . y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados a la cromoproteina , aclacinomisinas , actinomicina , autrarnicina , azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina) , epirrubicina , esorrubicina, idarrubicina, raarcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalarnicina , olivomicinas , peplomicina, potfiromicina , puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina , estreptozocina , tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, anti-metabolitos tales como metotréxato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotréxato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina , tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina , carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina , enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, ·. propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona ; anti-adrenales tales como aminoglutetimida , mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolinico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida , ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina ; demecolcina ; diaziquona; elformitina, acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides- tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona ; mitoxantrona ; mopidanmol; nitraerina; pentostatina ; fenamet; pirarrubicina ; losoxantrona; ácido podofilinico, 2-etilhidrazida ; procarbazina; complejo de PSK polisacárido ) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio, ácido tenuazónico; triaziquona ; 2 , 2 ' , 2 "-triclorotrietilamina ; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobromano ; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida ; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel; clorambucilo ; gemcitabina; ß-tioguanina; mercaptopurina , metotrexato, complejos de coordinación de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino, etopósido (VP-16) , ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina ; xeloda; ibandronato; irinotecan (por ejemplo, CPT-11); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina ; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

La radioterapia, también llamada terapia por radiación es el tratamiento del cáncer y otros trastornos con radiación ionizante. La radiación ionizante deposita energía que daña o destruye las células en el área que es tratada al dañar su material genético, haciendo imposible que estas células continúen creciendo. Aunque la radiación daña a las células cancerosas y a las células normales, las últimas son capaces de repararse a si mismas y funcionar adecuadamente. La radioterapia puede ser utilizada para tratar tumores sólidos localizados, tales como cánceres de la piel, lengua, laringe, cerebro, mama o cérvix. Esta puede ser también utilizada para tratar la leucemia y linfoma (cánceres de las células formadoras de la sangre y el sistema linfático, respectivamente) .

La radioterapia con radiación utilizada de acuerdo a la presente invención pueden incluir, pero no. está limitada a, el uso de rayos ?, rayos X, y/o la distribución dirigida de radioisótopos a las células tumorales. Otras formas de factores que dañan el ADN son también contemplados tales como las microondas, irradiación de haces de protones (Patente de los Estados Unidos Nos. 5,760,395 y 4,870,287) y radiación UV. Es lo más probable que todos estos factores efectúen un amplio 'intervalo de daño sobre el ADN, sobre los precursores de ADN, sobre la replicación y reparación de ADN, y sobre el montaje y mantenimiento de los cromosomas . Los intervalos de dosis para los rayos X van desde las dosis diarias de 50 a 200 roentgens por periodos prolongados de tiempo (3 a 4 semanas), hasta dosis simples de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosificación para los radioisótopos varían ampliamente, y dependen de la vida media del isótopo, la fuerza y tipo de radiación emitida, y la absorción por las células neoplásicas. La radioterapia puede comprender el uso de anticuerpos radiomarcados para distribuir dosis de radiación directamente al sitio del cáncer (radioinmunoterapia) . Una vez inyectados dentro del cuerpo, los anticuerpos buscan activamente las células cancerosas, las cuales son destruidas por la acción de muerte celular (citotóxicas ) de la radiación. Este procedimiento puede reducir al mínimo el riesgo de daño por radiación a las células saludables.

La radio-cirugía estereotáctica (bisturí gamma) para el cerebro y otros tumores no utiliza un bisturí, sino haces muy precisamente dirigidos de radioterapia gamma desde cientos de diferentes ángulos. Únicamente una sesión de radioterapia, que toma aproximadamente cuatro a cinco horas, es necesaria. Para ese tratamiento, una estructura metálica especialmente elaborada es acoplada a la cabeza. Luego, varias exploraciones y rayos x son llevados a cabo para encontrar el área precisa donde se necesita el tratamiento. Durante la radioterapia para los tumores cerebrales, el paciente- yace con su cabeza en un casco grande, el cual tiene cientos de orificios en éste para permitir que pasen los haces de radioterapia. Los procedimientos relacionados permiten el pos icionamiento para el tratamiento de tumores en otras áreas del cuerpo.

En el contexto del tratamiento para el cáncer, los inmunoterapéuticos , en general, confian en el uso de células efectoras inmunitarias y moléculas para dirigirse a, y destruir las células cancerosas. Trastuzumab (HerceptinMR) es un ejemplo de este tipo. El efector inmunitario puede ser, por ejemplo, un anticuerpo especifico para algún marcador sobre la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo solo puede servir como un efector de la terapia o este puede reclutar otras células para afectar efectivamente la muerte celular. El anticuerpo también puede ser conjugado a un fármaco o toxina (quimioterapéutico, radionúclido, cadena de ricina A, toxina del cólera, toxina pertussis, etc.), y servir meramente como un agente de dirección al objetivo. Alternativamente, el efector puede ser un linfocito que lleva una molécula superficial que interactúa, ya sea directa o indirectamente, con una célula tumoral objetivo. Diversas células efectoras incluyen células T citotóxicas y células NK. La combinación de las modalidades terapéuticas, es decir, la actividad citotóxica, directa y la inhibición o la reducción de ErbB2 podrían proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento de los cánceres que sobre-expresan ErbB2.

En un aspecto de la inmunoterapia , la célula tumoral o la célula enferma deben llevar cierto marcador que sea adecuado para la dirección al objetivo, es decir, no está presente sobre la mayoría de las otras células. Muchos marcadores tumorales existen y cualquiera de éstos pueden ser adecuados para la dirección en el contexto de la presente invención. Los marcadores tumorales comunes incluyen el antígeno carcinoembrionario, antígeno específico de la próstata, antígeno asociado a tumor urinario, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Sialil antígeno de Lewis Sialilado, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógeno, receptor de laminina, erb B y pl55. Un aspecto alternativo de la inmunoterapia es combinar los efectos anticancerosos con los efectos estimuladores inmunitarios . Las moléculas inmunoestimuladoras también existen incluyendo: citocinas tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFN-gamma, quimiocinas tales como MIP-1, CP-1, IL-8 y factores de crecimiento tales como el ligando FLT3. La combinación de las moléculas estimuladoras, ya sea como proteínas o mediante el uso de distribución génica en combinación con un supresor tumoral tal como MDA-7 ha mostrado que aumenta los efectos anti- tumorales (Ju et al., 2000) . Además, los anticuerpos contra cualquiera de estos compuestos pueden ser utilizados para dirigir los agentes anti-cancerosos discutidos en la presente .

Los ejemplos de inmunoterapias actualmente bajo investigación o en uso son adyuvantes inmunitarios por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenceno y compuestos aromáticos (Patente de los Estados Unidos Nos. 5,801,005 y 5,739,169; Hui y Hashimoto, 1998; Christodoulides et al, 1998), terapia con citocina, interferones , ß y ?, IL-1, terapia génica con GM-CSF y TNF (Bukowski et al, 1998; Davidson et al, 1998; Hellstrand y col, 1998) terapia génica por ejemplo, TNF, IL-1, IL-2, p53 (Qin et al, 1998; Austin-Ward y Villaseca, 1998; Patente de los Estados Unidos No. 5,830,880 y 5,846,945) y anticuerpos monoclonales, ' por ejemplo, GM2 anti-gangliósido anti-HE -2, anti-pl85; Pietras et al, 1998; Hanibuchi et al, 1998; Patente de los Estados Unidos No. 5,824,311) . Herceptina ( trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal quimérico (ratón-humano) bloquea el receptor HER2-neu. Este posee actividad anti-tumoral que ha sido aprobado para el uso en el tratamiento de tumores malignos (Dillman, 1999) . Una lista no limitante de varios agentes inmunoterapéuticos anticáncer conocidos y sus objetivos incluye (Nombre Genérico / Objetivo) Cetuximab / EGFR, Panitumuma / EGFR, Trastuzumab / receptor de erbB2, Bevacizumab / VEGF, Alemtuzumab / CD52, ozogamicina gemtuzumab / CD33, Rituximab / CD20, Tositumomab / CD20, Matuzumab / EGFR, Ibritumomab tiuxetan / CD20, Tositumomab / CD20, HuPAM4 / MUC1, MORAb-009 / Mesotelina, G250 / anhidrasa carbónica IX, mAb 8H9 / antigeno 8H9, M195 / CD33, Ipilimumab / CTLA , HuLuc63 / CS1, Alemtuzumab / CD53, Epratuzumab / CD22, BC8 / CD45, HuJ591 / antigeno membranal especifico de próstata, hA20 / CD20, Lexatumumab / receptor-2 de TRAIL, Pertuzumab / receptor de HER-2, Mik-beta-1 / IL-2R, RAV12 / RAAG12, SGN-30 / CD30, AME-133V / CD20, HeFi-1 / CD30, BMS-663513 / CD137, Volociximab / anti-integrina anti-a5pl, GC1008 / TGFp, HCD122 / CD40, Siplizumab / CD2, MORAb-003 / receptor alfa de folato, CNTO 328 / IL-6, MDX-060 / CD30, Ofatumumab / CD20, y SGN-33 / CD33. Se contempla que una o más de estas terapias pueden ser empleadas con las terapias con miARN descritas en la presente .

Un número de diferentes procedimientos para la inmunoterapia pasiva del cáncer existen. Estos pueden ser ampliamente categorizados en los siguientes: inyección de anticuerpos solos; inyección de anticuerpos acoplados a toxinas o agentes quimioterapéuticos ; inyección de anticuerpos acoplados a isótopos radiactivos, inyección de anticuerpos anti-idiotipo; y finalmente, la purga de las células tumorales en la médula ósea.

Aproximadamente el 60 % de las personas con cáncer sufrirán cirugía de algún tipo, lo cual incluye la cirugía preventiva, de diagnóstico o en etapas, curativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento contra el cáncer que puede ser utilizado en conjunto con otras terapias, tales como el tratamiento de la presente invención, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia génica, inmunoterapia y/o terapias alternativas.

La cirugía curativa incluye la extirpación en la cual todo o parte del tejido canceroso es físicamente removido, extirpado, y/o destruido. La extirpación tumoral se refiere a la eliminación física de al menos parte de un tumor. Además de la extirpación tumoral, el tratamiento por cirugía incluye cirugía con láser, criocirugía, electrocirugía y cirugía microscópicamente controlada (cirugía de Mohs) . Se contempla además que la presente invención puede ser utilizada en conjunto con la eliminación de los cánceres superficiales, pre-cánceres , o cantidades incidentales de tejido normal. 1 Después de la extirpación de parte de todas las células cancerosas, el tejido o tumor, una cavidad puede ser formada en el cuerpo. El tratamiento puede ser logrado mediante venoclisis, inyección directa o aplicación local del área con una terapia anticáncer adicional. Tal tratamiento puede ser repetido, por ejemplo, cada 1,' 2, 3, 4, 5, 6, ó 7 días, o cada 1, 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, ó 12 meses. Estos tratamientos pueden ser también de dosis variantes.

La terapia hormonal puede ser también utilizada en conjunto con la presente invención o en combinación con cualquier otra terapia contra el cáncer previamente descrita. El uso de hormonas puede ser empleado en el tratamiento de ciertos cánceres tales como cáncer de mama, de próstata, de ovario o cervical, para disminuir el nivel o bloquear los efectos de ciertas hormonas tales como testosterona o el estrógeno. Este tratamiento es a menudo utilizado en combinación con al menos otra terapia contra el cáncer como una opción de tratamiento o para reducir el riesgo de metástasis.

IV. Ejemplos Los siguientes ejemplos son incluidos para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Debe ser apreciado por aquellos de experiencia en la materia que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y de este modo se 'puede considerar que constituyen modalidades preferidas para su práctica. No obstante, aquellas personas de experiencia en la técnica deben, a la luz de la presente descripción, apreciar que muchos cambios pueden ser realizados en las modalidades especificas, las cuales son descritas y todavía obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

E emplo 1 : Efecto de las modificaciones de nucléotido en las hebras pasajera o activa de miR-34 sobre la actividad antiproliferación celular La actividad de miARN depende de su habilidad para interactuar con las proteínas del Complejo de Silenciamiento Inducido por ARN (RISC por sus siglas en Inglés) y su habilidad para interactuar con un objetivo de mARN a través de la hibridación. Para determinar cuáles nucleótidos en un miR-124 de doble hebra podrían ser modificados sin perturbar la actividad del miARN dentro de las células, se utilizó una serie de miméticos de miR-124 de doble hebra con nucleótidos modificados con 2 ' -oxígeno-metilo (2'0-Me) incorporados en dos posiciones adyacentes sobre la hebra activa o sobre la hebra pasajera del miARN de doble hebra (Tabla 1). Además de las modificaciones 2'0-Me, cada hebra pasajera tiene una modificación en el extremo 5' que consiste de un nucleótido de 6 átomos de carbono 5'-amino (grupo amino primario enlazado a un espaciador de 6 átomos de carbono) enlazado al grupo PO4" terminal 5' .

Tabla 1. Secuencia y patrones de modificación dé los miméticos de miR-124. Las posiciones de los nucleótidos modificados por 2'0-Me son indicadas como letras negritas, cursivas y subrayadas.

Los inventores examinaron los efectos de las modificaciones de oligonucleótidos sobre las actividades de los miméticos de miR-124. Un oligonucleótido de hebra pasajera, sintético, que tenia una modificación C6 5'- amino y ninguna modificación 2'0-Me fue recocido a cada uno de los nucleótidos de hebra activa modificados, sintéticos (Tabla 1). Un oligonucleótido de hebra activa no modificado, sintético fue recocido a cada uno de los oligonucleótidos de hebra pasajera, modificada, sintética (Tabla 1). La linea celular de cáncer de pulmón (H460) fue transfectada inversamente con los oligonucleótidos de ¦ doble hebra resultantes o con un miARN control negativo (Life Technologies, Inc./Ambion, Inc; Austin, TX, USA; cat . no. AM17103) a concentraciones finales de 30 nM. Las lineas celulares fueron transitoriamente transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Inc . /Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante utilizando los siguientes parámetros: 5,000 células por pozo en una placa de 96 pozos 0.1-0.2 µ? de Lipofectamine 2000 (optimizada especifica de linea celular), en un volumen total de 100 µ? del medio. Los ensayos de viabilidad celular fueron realizados utilizando el reactivo alamarBlue® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA; cat. no. DALI 100 ) de acuerdo con el protocolo del fabricante a los días 3, 4, y 7 después de la transfección . Un lector de placas fluorescente fue utilizado para medir la acumulación de resorrufina (excitación de 560 nm, emisión de 590 nm) que es el sustrato reducido de alamarBlue®. La acumulación de resorrufina es indicadora del número de células viables por pozo. El número relativo de las células proliferantes para cada población celular transfectada con un miR-124 de doble hebra que tiene modificaciones 2'0-Me fue calculado al dividir la fluorescencia de las células transfectadas con el mimético de miR-124 no modificado, entre la fluorescencia de las células transfectadas con los. miR-124s modificados con 2'0-Me, y multiplicando el resultado por 100. Los valores ant i-proliferación . relativos se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Efecto de los nucleótidos modificados con 2' -O Me en miR-124 sobre la proliferación de las células de cáncer de pulmón H460. La actividad ant i-proliferación celular de un miR-124 de doble hebra, sintético que no tenia modificaciones 2'0-ME fue ajustada al 100 %. Los valores porcentuales · anti-proliferación celular mayores de 100 indican la actividad antiproliferativa que es mayor que aquella del control de miR-124 no modificado. Las modificaciones indicadas fueron en la hebra pasajera o en la hebra activa únicamente. Todas las hebras pasajeras tuvieron una modificación C6 5'-amino.

Como se muestra en la Tabla 2, las modificaciones 2 ' O-Me en la hebra pasajera en las posiciones 1+2; 3+4; 17+18; 1+2+21+22; y 1+2+3+20+21+22 y en la hebra activa en las posiciones 7+8 dio como resultado actividad antiproliferativa incrementada sobre aquella observada para miR- 124 control, no modificado. Las modificaciones 2 ?-Me en la hebra activa en las posiciones 1+2; 3+4; 9+10; 13+14; 15+16; 19+20; 1+2+21+22; y 1+2+3+20+21+22 y en la hebra pasajera en 7+8; 9+10; y 11+12 dio como resultado actividad anti-proliferativa sustancialmente deteriorada cuando se comparó al mimético de miR-124 que no tenia modificaciones 21 O-Me . Las modificaciones 2 ?-Me en las posiciones 5+6; 11+12; y 17+18 de la hebra activa y .en las posiciones 5+6; 13+14; 15+16; y 19+20 de la hebra pasajera tuvieron poco efecto dañino sobre la actividad anti-proliferativa .

Ejemplo 2: Modificaciones de nucléotidos combinados en las hebras pasajera o activa de MiR-34 sobre la actividad antiproliferación celular Los inventores evaluaron la actividad antiproliferación celular de los miméticos de miR-124 que 'tienen nucleótidos modificados en las hebras pasajera y activa. Diversos oligonucleótidos modificados de hebra pasajera y activa fueron recocidos para formar los miméticos de miR-124 con modificaciones sobre ambas hebras. Las lineas celulares de cáncer de pulmonar (H460) y cáncer de hígado (C3A) fueron transfectadas inversamente con los diversos miméticos asi como con un miARN control negativo (Ambion, cat . no. AM17103) a concentraciones finales de 30 n . Se utilizó Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante,- utilizando los siguientes parámetros: 5,000 células por pozo en una placa de 96 pozos, 0.1-0.2 µ? de Lipofectamine 2000 (optimizado por linea celular) , en un volumen total de 100 µ? de medio. Se realizó un ensayo alamarBlue® (Invitrogen, cat . no. DAL1100) sobre las células de acuerdo al protocolo del fabricante, en el dia seis después de la transfección . Un lector de placa fluorescente fue utilizado para medir la acumulación de resorrufina (excitación de 560 nm, emisión de 590 nm) que es el substrato reducido de alamarBlue®. La fluorescencia de resorrufina correlaciona con el número de células viables por pozo. El número relativo de células en proliferación para cada población de células transfectadas fue calculado al dividir la fluorescencia de las células transfectadas con el miméticos de miR-124 no modificado por la fluorescencia de las células transfectadas con el miR-124 modificado con 2?-Me de doble hebra, y multiplicando el resultado por 1Q0. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Efectos de las modificaciones de nucleótidos en un mimético de miR-124 de doble hebra sobre la actividad antiproliferación celular de las células de cáncer de pulmonar (H460) y las células de cáncer de hígado (C3A) . Los valores para el porcentaje de la actividad, anti-proliferación celular representan un promedio de aquel observado para todas las tres lineas celulares. Los valores mayores de 100 indican actividad anti-proliferativa que es más alta con los miméticos de miR-124 modificados que aquel observado con miR-124 no modificado.

Las modificaciones indicadas estuvieron en la hebra pasajera, la hebra activa o en ambas hebras. Todas las hebras pasajeras tuvieron una modificación C6 5'-amino.

Como se muestra en la Tabla 3 (que involucra una hebra activa con la SEQ ID NO: 2 y una hebra pasajera con la SEQ ID NO: ), la mayoría de los miméticos de miR-124 que tienen modificaciones 2'O-Me en las posiciones 5,6; 7,8; ó 17,18 en la hebra activa tuvieron más alta actividad anti-proliferación celular que la que tuvo el mimético de miR-124 no modificado, no obstante del número de modificaciones en la hebra pasajera.

Varios miméticos que tienen modificaciones en la hebra activa y pasajera tienen significativamente mayores actividades antiproliferación celular que la que podría ser esperada con base en los datos a partir de los miméticos que tienen únicamente una hebra modificada simple, lo cual sugiere efectos sinérgicos de las modificaciones. Por ejemplo, la hebra activa modificada con 2 O-Me 7+8 combinada con 1+2+21+22 o con las hebras pasajeras modificadas con 2'OMe 1+2+3+20+21+22 son considerablemente más anti-proliferatívas que los miméticos que tienen únicamente una hebra modificada. De igual modo, la hebra activa modificada con 2 'O-Me 17+18 tiene significativamente más actividad que la que es esperada cuando es combinado con la hebra pasajera con 2' O-Me 1+2+3+20+21+22. Estos datos sugieren que las modificaciones 2 ?-Me no solamente aumentan las actividades anti-proliferativas de los miméticos de miR-124, sino que ciertas modificaciones de combinaciones pueden ser aplicadas para aumentar significativamente las actividades de un mimético de miR-124.

Ejemplo 3: Modificaciones de nucléotido en las hebras activa o pasajera contribuyen a la estabilidad de los miméticos de miAR Debido a que se requiere 2 ?? para que las ribonucleasas rompan las. moléculas de ARN, la incorporación de los nucleótidos 2 ' -modificados dentro de las moléculas de ARN puede hacerlos más resistentes a la digestión con nucleasa. Los inventores utilizaron un ensayo de estabilidad in vitro y la ARNasa A purificada (Ambion, cat. no AM2270) para comparar las estabilidades de los miméticos de miR-124 modificados y no modificados .

Los miméticos de miR-124 fueron preparados al hibridar los oligonucleótidos complementarios que tenian los nucleótidos modificados con 2'0-Me en diversas posiciones, e incubando los híbridos con 720 U de la ARNasa A a 37 °C por 30 min. Después de la incubación de 30 minutos se agregó ditiotreitol (DTT) hasta una concentración final de 10 mM y la mezcla fue calentada a 60°C por 10 minutos para inactivar la actividad de ARNasa. El ARN fue transcrito inversamente con M LV-RT (Invitrogen, cat. no. 28025-021) utilizando el cebador de RT de ensayo de MicroARN hsa-miR-124 TaqMan® (Applied Biosystems Inc., cat no. 4427975, ensayo ID 000425). Se realizó qRT-PCR sobre el cADN utilizando el ensayo TaqMan® de MicroARN con un cebador específico para hsa-miR-124 y la polimerasa Platinum Taq (Invitrogen, cat. no. 10966-083), en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (Applied Biosystems) . La Tabla 4 muestra los efectos de las modificaciones de nucleótidos sobre la estabilidad de diversos miméticos de miR-124.

Tabla 4. Efectos de las modificaciones de hebra sobre la estabilidad de los miméticos de miR-124 de doble hebra, después de la incubación con la ARNasa A. Las secuencias de hebra pasajera y activa son mostradas. Las letras negrita, cursiva y subrayada indican los nucleótidos modificados con 2'0-Me. Las hebras activas y pasajera dentro . de cada hilera fueron hibridadas e incubadas en una solución de ARNasa A. Los porcentajes relativos de los miméticos de doble hebra que permanecen después del tratamiento con ARNasa fueron calculados al determinar el porcentaje de miméticos de doble hebra que permanecen y dividiendo entre el porcentaje del mimético de doble hebra no modificado, remanente. Valores mayores de 1.00 indican los miméticos modificados que tienen más estabilidad que el mimético no modificado. Un valor de 100 en la tabla podría indicar que un mimético de miR-124 modificado fue 100 veces más estable que el mimético de miR-124 no modificado. A-ID, número de ID de hebra activa; P-ID, número de ID de hebra pasajera. Todas las hebras pasajeras tuvieron modificación C6 5'-amino.

El mimético que tiene combinación de hebra activa y pasajera A119/P102 es más de 125 veces más estable que el mimético no modificado. La estabilidad aumentada de los miméticos puede mejorar profundamente las propiedades farmacodinámicas durante la terapia con los miARNs.

En ausencia de estos datos, se puede predecir que el mimético con la mayoría de los nucleótidos modificados con 2'0-Me podrían ser los más estables, debido a que tiene; menos sitios sensibles a la nucleasa. Sorprendentemente, en nuestro ensayo, el mimético más modificado (A120/P108) no fue observado como el mimético más estable. Estos datos indican que contando simplemente el número de modificaciones 2'0-Me no es un reflejo preciso de o una manera predecible para determinar la estabilidad de los miméticos de miR-124 de doble hebra, modificados.

Ejemplo : Las modificaciones de nucléotidos en las hebras activa y pasajera contribuyen a la actividad de los miméticos de miARN Las actividades anti-proliferativas de los miméticos de miR-124 fueron evaluadas y comparadas al mimético de miR-124 sin las modificaciones 2 ' O-Me . Las células de cáncer pulmonar (H460) fueron transíectadas inversamente con los cuatro diferentes miméticos de miR-124 de doble hebra y un miARN control negativo (Ambion, cat . no. A 17103) a concentraciones finales de 1, 3, y 10 nM . Se utilizó Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, utilizando los siguientes parámetros: 5000 células por pozo en una placa de 96..pozos, 0.1-0.2 µ? de Lipofectamine 2000 (optimizado especifico de linea celular), en 100 µ? de volumen total del medio. Un ensayo de alamarBlue® (Invitrogen, cat. no. DAL1100) fue realizado sobre las células a los 3 días después de la transíección, de acuerdo al protocolo del fabricante. Un lector de placa fluorescente fue utilizado para medir la acumulación de resorrufina (excitación de 560 nm, emisión de 590 nm) que es el sustrato reducido de alamarBlue®. La fluorescencia de la resorrufina correlaciona con el número de células viables por pozo. El porcentaje relativo de células viables para cada población de células transíectadas se calculó al dividir la fluorescencia proveniente de las células transíectadas con una concentración dada del mimético de miR-124 entre la fluorescencia de las células transfectadas con la misma concentración de miARN control negativo y multiplicando el resultado por 100. Valores menores de 100% indican que el mimético de miR-124 redujo el número de células viables en la población con relación a las poblaciones de células que fueron transfectadas con el miARN control negativo. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Efectos de las modificaciones de 2 ' -OMe sobre la actividad anti-proliferación celular de los miméticos de miR-124 después de la transfección de las células de cáncer pulmonar H460. Se muestran las secuencias de hebras pasajera y activa. Las letras en negritas, cursivas y subrayadas indican los nucleótidos modificados con 2'0-Me. Las hebras activas y pasajeras dentro de cada hilera fueron hibridadas y transfectadas dentro de las células H460 a las concentraciones mostradas. A-ID, número de ID de la hebra activa; P-ID, número de ID de la hebra pasajera. El porcentaje de células viables es el porcentaje de células que permanecen viables después de la transfección con el mimético de miR-12 . Los valores para el miARN control negativo fueron establecidos a 100%. Todas las hebras pasajeras tuvieron una modificación C6 5'-amino.

Los pares de miméticos P102/A119, P107/A119, y P108/A113 cada uno demostraron estabilidad de nucleasa aumentada (Tabla 4) y también mostraron actividad incrementada anti-proliferativa (Tabla 5) . Los miméticos de miR124 modificados tienen actividades anti-proliferativas similares como el efecto de mimético de miR-124 estándar cuando se utiliza a un tercio de la dosis, indicando que los miméticos de miR-124 modificados, elegidos, son aproximadamente tres veces más activos que el mimético de miR-124 estándar. Los tres miméticos modificados tienen actividades anti-proliferación celular considerablemente mejoradas (Tabla 5) y estabilidades de nucleasa (Tabla 4) que aquellas observadas para el mimético no modificado con 2'-OMe.

Ejemplo 5: Regulación de genes por miméticos de miR-34 modificados Los miARNs funcionan como secuencias de guia para la regulación del Complejo de Silenciamiento Inducido por ARN (RISC) de la transcripción del mARN. Después de entrar al RISC, un mimético de miARN puede alterar los perfiles de transcripción de mARN de las células transfectadas por: (1) la inducción de RISC para escindir un mARN que es enlazado a miARN, (2) la alteración de la vida media de un mARN enlazado previniendo que éste interactué con los ribosomas, y/o (3) provocar cambios en las cantidades de los mARNs que son reguladas por los genes que por si mismos no son regulados por el mimético de miARN.

Para saber si los miméticos de miR-124 modificados tienen los mismos efectos sobre la expresión de mARN que el que tiene un mimético de miR-124 no modificado, se utilizaron arreglos de mARN para perfilar la transcripción génica en las células de cáncer pulmonar H460 transfectadas con uno de dos miARNs control negativo diferentes (Ambion, cat . no. AM17111; Ambion, cat. no. AM17103) , un mimético de miR-124 no modificado, o tres diferentes miméticos de miR-124 modificados (P102/A119, P107/A119, y P108/A113). Los miméticos de miARN a 1 nm, 3 nM, o 10 nM fueron complejados con 0.2 µ? de Lipofectamine 2000 y agregados a las células H460 a 5,000 por pozo en una placa de 96 pozos, en un volumen total de 100 µ? de medio RPMI . Las células fueron cosechadas a los 3 días después de la transfección, y el ARN total fue extraído utilizando el Kit miRVanaMR PARISMR (Ambion, cat. no. AMI 556) siguiendo el protocolo recomendado pbr '! el fabricante .

Los análisis del arreglo de mARN fueron realizados por Asuragen, Inc. (Austin, TX, Estados Unidos), de acuerdo a los procedimientos de operación estándar de la compañía. Utilizando el kit de amplificación de aARN MessageAmpMR 11-96 (Ambion, cat. no. 1819) 200 ng del ARN total introducido fueron marcados con biotina. Los rendimientos de cARN fueron cuantificados utilizando un instrumento de electroforesis capilar bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.). El objetivo marcado fue hibridado a los arreglos de mARN Affymetrix (arreglos humanos HG-U133A 2.0) utilizando las recomendaciones del fabricante y los siguientes parámetros. Las hibridaciones fueron llevadas a cabo a 45°C por 16 horas en un horno de hibridación Affymetrix Modelo 640. Los arreglos fueron lavados y teñidos sobre una estación Affymetrix FS450 Fluidics, corriendo el escrito de lavado Midi_euk2v3_450. Los arreglos fueron explorados sobre un escáner 3000 de Affymetrix GeneChip. Los resúmenes de los datos de señales de imágenes, los valores medios grupales, los valores de p con banderas de significancia, las proporciones logarítmicas y las anotaciones de los genes para cada gen sobre el arreglo fueron generados utilizando el algoritmo MAS 5.0 de Affymetrix Statistical (GCOS vi.3). Los datos fueron reportados conteniendo los datos de Affymetrix y los archivos de resultados (archivo de gabinete) y contiendo la imagen primaria y las intensidades de la células procesadas de los arreglos (.cel) .

Los perfiles del arreglo de mARN para las diversas muestras fueron comparados para determinar sus similitudes. Los coeficientes de correlación del producto-momento de Pearson entre las muestras (grupo de sondas completo) fueron calculados y se muestran en las Tablas 6, 7 y 8. Los coeficientes de correlación para todas las muestras fueron observados como mayores de 0.98.

Tabla 6. Coeficientes de correlación del producto-momento de Pearson después del análisis de arreglo de la expresión génica después de la transfeccion de las células de cáncer de pulmonar con 1 nM del mimético de miARN indicado. Las secuencias y las modificaciones 2 ' -O Me de las hebras pasajera P y activa A se muestran en la Tabla 5. Todas las hebras pasajeras tuvieron una modificación C6 5'-amino.

Tabla 7. Coeficientes de correlación del producto-momento de Pearson después del análisis de arreglo de la expresión del gen después de la transfeccion de las células de cáncer pulmonar con 3 nM del mimético de miARN indicado. Las secuencias y las modificaciones 21 -OMe de las hebras pasajera P y activa A se muestran en la Tabla 5. Todas los hebras pasajeras tuvieron una modificación C6 5'-amino.

Tabla 8 . Coeficientes de correlación de producto-momento Pearson después del análisis de arreglo de la expresión del gen después de la transfección de las células de cáncer pulmonar con 10 nM del mimético de miARN indicado. Las secuencias y las modificaciones 2'-OMe de las hebras pasajera P y activa A se muestran en la Tabla 5. Todas las hebras pasajeras tuvieron una modificación C6 5'-amno.

Limitando el análisis aquellos mARNs cuyos niveles de expresión fueron alterados al menos dos veces por cualquiera de los miméticos de miR-124 utilizados, las correlaciones más fuertes fueron observadas entre las células transfectadas con 3 nM de los miméticos de miR-124 modificados con 2'-OMe y 10 nM del mimético de miR-124 no modificado (Tabla 9) . Esto no es sorprendente dadas las actividades aproximadamente tres veces mayores para los miméticos de miR-124 modificados con 2'-OMe que el mimético de miR-124 sin las modificaciones de 2'-O e que observamos en el Ejemplo 4. Estos datos revelan que las especificidades objetivo de los tres miméticos de miR-124 modificados son las mismas que el mimético de miR-124 no modificado.

Tabla 9. Coeficientes de correlación del producto-momento de Pearson después del análisis de arreglo de la expresión del gen alterada al menos dos veces después de la transfeccion de las células de cáncer pulmonar con 10 nM del mimético de miR-124 que no tiene nucleótidos modificados (P101/A111) y 3 nM de otros miméticos de miR-124 (P102/A119, P107/A119, P108/A113) . Las secuencias y las modificaciones 2'-OMe de las hebras pasajera P y activa A se muestran én la Tabla 5. Toda las hebras pasajeras tuvieron una modificación C6 5'-amino.

Además de los perfiles de expresión globales, comparamos la actividad de los miméticos de miR-124 modificados con 2 ' O-Me y no modificados sobre los genes objetivos de miR-124 conocidos. Los datos del arreglo revelaron que los niveles de dos de los objetivos de inARN directos de miR-124, VAMP3 y ATP6VOEI, fueron significativamente reducidos en todas las poblaciones de células tratadas con miR-124 cuando se compararon, a las células transíectadas con un miARN control negativo (Tabla 10) .

Tabla 10. Niveles de mARN de VAMP3 o ATP6VOE1 después de la transfección de las células H460 con el mimético de miR-124 indicado a una concentración de 1 n , 3 nM, o 10 nM. Los valores representan la expresión porcentual comparada a aquella observada después de la transfección de las células con un miARN control negativo (100%). Las secuencias y las modificaciones de 2'-OMe de las hebras pasajera P y activa A se muestran en la Tabla 5. Todas las hebras pasaj tuvieron una modificación C6 5'-amino.

Mimético Porcentaje de Expresión versus miARN Control de miR- Negativo 124 VA P3 ATP6VOEI 1 nM 3 nM 10 nM 1 nM 3 nM 10 nM P101/ 69 .02 74.35 33.96 81.16 16.31 44 .5 Allí P102/ 72 .44 34.75 14.85 72.27 47.62 38. 36 A119 P107/ 76 .79 43.08 9.30 72.72 43.48 32. 18 A119 P108/ 56 .48 28.54 11.11 72.30 44.90 30. 20 A113 Ejemplo 6: Propiedades Farmacocinéticas de los miméticos de miR-124 modificados con 2 ' -OMe El tiempo de circulación mejorado y la absorción celular objetivo mejorada pueden aumentar la efectividad del tratamiento con los oligonucleótidos terapéuticos. Para determinar si los miméticos de miR-124 modificados con 2' -OMe tuvieron propiedades farmacocinéticas mejoradas con relación al mimético de miR-124 no modificado, ratones que tenían xenoinjertos de cáncer pulmonar H460 fueron repetidamente dosificados con los miméticos de miR-124 y luego evaluados para los niveles en circulación y asociados al tejido de miR-124.

Los xenoinjertos de tumores pulmonares fueron inducidos en ratones NOD/SCID al inyectar 3 x 106 células de cáncer pulmonar humano (H460) en 50% de matrigel dentro de los flancos de los ratones (n = 7) . Los ratones fueron verificados periódicamente para los nodulos firmes en los sitios de inyección, para determinar el tiempo en el cual los tumores habían crecido a ~ 100 mm3. Los tumores fueron detectados en el día 11, después de lo cual fueron iniciadas las inyecciones en la vena de la cola ya sea con el mimético no modificado o uno de los tres miméticos modificados con 2'-OMe a una proporción de 20 iq del mimético por animal por dosis. Las dosis fueron repetidas una vez cada dos días por dos semanas. Los animales fueron sacrificados 10 ó 60 minutos después de la dosis final dada. La sangre, los tumores y los hígados fueron recuperados de cada animal. El ARN fue aislado de cada de las muestras utilizando el Kit miRVanaMR PARISMR (Ambion, cat . No. AM 1556).

Los niveles de miR-124 en las muestras de sangre, tumor, e hígado fueron medidas por qRT-PCR 10 y 60 minutos después de las inyecciones en la vena de la cola de los miméticos no modificados (P101/A111) o modificados (P102/A119, P107/A119, P108/A113) de miR-124. Los niveles de miARN fueron medidos utilizando un Ensayo de MicroARN TaqMan® (Applied Biosystems; Foster City, CA, Estados Unidos) . Para hacer posible la normalización de la muestra, los niveles de miR-103, miR-191, y miR-24 fueron también medidos por qRT-PCR utilizando los Ensayos de MicroARN TaqMan®. Antes del inicio de la reacción de transcripción inversa (RT) , 10 ng del ARN total fueron mezclados con 0.5 µ? del cebador RT y suficiente agua para llevar el volumen total hasta 5 µ?. La mezcla de ARN/cebador fue calentada a 90°C por 1 minuto, luego transferida a 4°C. El agua (2.85 µ?), 10x de amortiguador RT (1 µ?), dNTPs 2.5 mM (1 µ?), RIP (0.1 µ? de 40 U/µ?), y MMLV-RT (0.05 µ? de 200 U/µ?) fueron agregados a cada tuvo sobre hielo. Las reacciones de RT fueron incubadas en un Sistema de PCR 9700 Gene Amp® de 384 pozos (Applied Biosystems); a 4°C por 30 minutos, luego a 16°C por 30 minutos, luego a 42°C por 30 minutos, luego a 85°C por 5 minutos.

Los componentes de PCR (Tabla 11) fueron ensamblados sobre hielo antes de la adición del cADN (2 µ?) a partir de la reacción de RT. Las reacciones fueron incubadas en un sistema de PCR en Tiempo Real Rápido ABI PRISMMR 7900HT (Applied Biosystems) a 95°C por 1 minuto, luego por 50 ciclos a 95°C por 5 segundos y 60°C por 30 segundos. Los resultados fueron analizados con software SDS V2.3 del Sistema de PCR en Tiempo Real Rápido 7900HT (Applied Biosystems) .

Tabla 11. Componentes de PCR. Todos los componentes de reacción fueron tal cual fueron proporcionados por el fabricante (Applied Biosystems; Foster City, CA, Estados Unidos) a no ser que se especifique de otro modo.

Los datos de qRT-PCR provenientes de miR-103, miR- 191, y miR-24 fueron inicialmente evaluados para identificar las muestras con demasiado poco miARN para medirse de manera exacta. Estas muestras no fueron sometidas a análisis adicional. Las muestras en las cuales el valor de miR-124 Ct excedió 40 fueron también eliminadas. La media geométrica de los datos de Ct de miR-24, miR-103, y miR-191 para cada muestra remanente fue calculada, y el Ct resultante fue sustraído de las lecturas de Ct bruto para miR-124 en la muestra correspondiente para producir un dCt. Los valores normalizados resultantes para las muestras fueron utilizados para estimar la abundancia relativa de miR-124 en cada una de las muestras. Los cambios en los niveles de miR-124 en sangre, hígado y tumor fueron calculados al sustraer los dCts promedios de las muestras tomadas de los ratones que fueron tratados con un miARN control negativo (Life Technologies, Inc./Ambion, Inc; Austin, TX, Estados Unidos; cat. no. AM 17103) a partir de los dCts promedios de las muestras tomadas de ratones tratados con los diversos miméticos de miR- 124. Los valores de ddCt resultantes para cada mimético de miR- 124 fueron utilizados para calcular la proporción de incremento en los niveles de miR-124 en los diversos tejidos por elevación a 2 a la potencia del valor de ddCt. Los incrementos proporcionales de miR-124 sobre los niveles endógenos observados en los diversos tejidos después de la inyección de cada mimético de miARN se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12. Acumulación en circulación y tejido de los miméticos de miR-124 en ratones. Las secuencias y las modificaciones 2'- OMe de las hebras pasajera P y activa A se muestran en la Tabla 5. Todas las hebras pasajeras tuvieron una modificación C6 5'- amino.

Diez minutos después de la inyección de los ratones con miméticos de miR-124, los inventores observaron que los niveles de miR-124 en sangre eran de 52 veces a 1, 779 veces más altos que los niveles observados después de la inyección con un miARN control negativo. Los niveles de miR-124 elevados fueron también observados en sangre sesenta minutos después la inyección con los miméticos. La inyección con cada uno de los miméticos modificados por 2'0- e indujeron más altos niveles en sangre comparativos de miR-124 que 'el que tuvo la inyección con el mimético no modificado. Resultados similares fueron observados para los niveles de miR-124 en tejidos de higado y en los tumores de xenoinjerto. Los resultados indican que los miméticos modificados con 2'0-Me utilizados aqui dan como resultado persistencia aumentada en sangre, en tumor, y en tejidos en comparación a un mimético no modificado.

Referencias Las siguientes referencias, al grado en que éstas proporcionen detalles de procedimiento ejemplares u otros detalles suplementarios a aquellos descritos en la presente, son específicamente incorporados por referencia aquí.

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Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (46)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una molécula de ARN de extremo romo, de doble hebra, de 20-22 pares de bases de longitud, caracterizada porque comprende : a) una hebra activa que comprende i) la secuencia de nucleótidos 2 al 21 de la SEQ ID No. : 2 y ii) un nucleótido modificado en una o más posiciones internas, en donde no existen más de 10 nucleótidos modificados; y, b) una hebra pasajera que es completamente complementaria a la hebra activa y comprende una modificación de nucleótido del extremo 5' y al menos un nucleótido modificado más en los primeros seis nucleótidos y/o los últimos seis nucleótidos con respecto al extremo 5' de la hebra pasajera.

2. La molécula de ARN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra ' activa comprende la secuencia de SEQ ID No.: 2.

3. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la hebra activa comprende al menos dos nucleótidos modificados.

4. La molécula de ARN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la hebra activa no tiene un nucleótido modificado en las primeras dos posiciones en cualquier extremo.

5. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la hebra activa no comprende un nucleótido modificado en las primeras cuatro posiciones del extremo 5'.

6. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque los nucleótidos modificados en la hebra activa son seleccionados del grupo que consiste de los nucleótidos localizados en las posiciones 5 (G) , 6 (G) , 7 (C) , 8 (A) , 11 (C), 12 (G) , 17 (A), y 18 (U) con relación a la SEQ ID No.: 2.

7. La molécula de ARN de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la hebra activa comprende al menos dos nucleótidos modificados seleccionados del grupo.

8. La molécula, de ARN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la hebra activa comprende al menos tres nucleótidos modificados seleccionados del grupo.

9. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque la hebra activa comprende no más de seis nucleótidos modificados .

10. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque la hebra activa comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 7 (C) y 8 (A) con relación a la SEQ ID No.: 2.

11. La molécula de ARN de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la hebra activa comprende además los nucleótidos modificados en las posiciones 17 (A) y 18 (U) con relación a la SEQ ID No.: 2.

12. La molécula de ARN de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la hebra activa comprende además los nucleótidos modificados en las posiciones 9 (C) , 10 (G) , 11 (C) , y 12 (G) con relación a la SEQ ID No. : 2.

13. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque la hebra pasajera comprende un nucleotido modificado localizado en las posiciones 1 (U) , 2 (G) , 3 (G), 4 (C) , 5 (A), 6 (U), 13 (C), 14 (G) , 15 (U), 16 (G) , 17 (C) , 18 (C) , 19 (U) , 20 (U), 21 (A), ó 22 (A) con relación a la SEQ ID No. : .

14. La molécula de ARN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la hebra pasajera comprende un nucleotido modificado en las posiciones 1 (U) , 2 (G) , 3 (G), 20 (U) , 21 (A), y/o 22 (A) con relación a la SEQ ID No. : 4.

15. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque la hebra pasajera no tiene un nucleótido modificado localizado en las posiciones 7 (U) , 8 (C) , 9 (A), 10 (C) , 11 (C) , ó 12 (G) con relación a la SEQ ID No.: 4.

16. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque la hebra pasajera tiene al menos dos nucleótidos modificados en la hebra pasajera.

17. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque la hebra pasajera tiene al menos tres nucleótidos modificados en la hebra pasajera.

18. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada, porque la hebra pasajera tiene al menos cuatro nucleótidos modificados en la hebra pasajera.

19. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizada, porque la hebra pasajera tiene al menos cinco nucleótidos modificados en la hebra pasajera.

20. La molécula de ARN de · conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizada porque la hebra pasajera tiene al menos seis nucleótidos modificados en la hebra pasajera.

21. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque la hebra pasajera comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 1 (U) y 22 (A) con relación a la SEQ ID No.: 4.

22. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizada porque la hebra pasajera comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 2 (G) y 21 (A) con relación a la SEQ ID No.: 4.

23. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, caracterizada porque la hebra pasajera comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 1 (U), 2 (G) , 3 (G) , 20 (U) , 21 (A), y 22 (A) con relación a la SEQ ID No.: 4.

24. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, caracterizada porque la hebra pasajera comprende además un nucleótido modificado en la posición 4 (C) con relación a la SEQ ID No.: 4.

25. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-24, caracterizada porque la hebra pasajera comprende además los nucleótidos modificados en las posiciones 5 (A) y 6 (U) con relación a la SEQ ID No. : 4.

26. La molécula de ARN de conformidad con las reivindicaciones 22-24, caracterizada porque la hebra activa comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 7 (C) y 8 (A) con relación a la SEQ ID No.: 2.

27. La molécula de ARN de conformidad con las reivindicaciones 22-24, caracterizada porque la hebra activa comprende además los nucleótidos modificados en las posiciones 17 (A) y 18 (U) con relación a la SEQ ID No.: 2.

28. La molécula de ARN de conformidad con las reivindicaciones 22-24, caracterizada porque la hebra activa comprende además los nucleótidos modificados en las posiciones 9 (C) , 10 (G) , 11 (C) , y 12 (G) con relación a la SEQ ID No. : 2.

29. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizada- porque la hebra activa comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 7 (C) y 8 (A) con relación a la SEQ ID No.: 2.

30. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizada" porque la hebra activa comprende además nucleótido modificado en las posiciones 17 (A) y 18 (U) con relación a la SEQ ID No.: 2.

31. La molécula de ARN de conformidad . con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizada porque la hebra activa comprende además un nucleótido modificados en las posiciones 9 (C) , 10 (G) , 11 (C) , y 12 (G) con relación a la SEQ ID No. : 2.

32. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizada porque la hebra activa comprende los nucleótidos modificados en las posiciones 7 (C) y 8 (A) con relación a la SEQ ID No.: 2.

33. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizada porque la hebra activa comprende además los nucleótidos modificados en las posiciones 17 (A) y 18 (U) con relación a la SEQ ID No.: 2.

3 . La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizada porque la hebra activa comprende además los nucleótidos modificados en las posiciones 9 (C) , 10 (G) , 11 (C) , y 12 (G) con relación a la SEQ ID No.: 2.

35. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizada porque la modificación en el extremo 5' de la hebra pasajera comprende un grupo alquilamino inferior.

36. La molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-35, caracterizada porque los nucleótidos modificados son modificados con una modificación de azúcar.

37. La molécula de ARN de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la modificación de azúcar es 2'-0Me.

38. Una molécula de ARN de extremo romo, de doble hebra, de 20-22 pares de bases de longitud, caracterizada porque comprende: a) una hebra activa que comprende i) la secuencia de nucleótidos 2 al 21 de la SEQ ID No. : 2 y ii) un nucleótido modificado en una o más posiciones internas, en donde la hebra no tiene un nucleótido modificado en su extremo 5' y no existen más de 10 nucleótidos modificados; y, b) una hebra pasajera separada que es completamente complementaria a la hebra activa y comprende una modificación de nucleótido en el extremo 5' y al menos un nucleótido modificado más, en donde los nucleótidos localizados en las posiciones 7-19 con respecto a la secuencia de SEQ ID No.: 4 no son modificados.

39. Una molécula de ARN de doble hebra de 20-22 pares de bases de longitud, caracterizada porque la molécula de ARN es de extremo romo en ambos extremos, que comprende una hebra activa que tiene la secuencia de nucleótidos 2 al 21 de la SEQ ID No.: 2 y una hebra pasajera separada y completamente complementaria con un nucleótido modificado en el extremo 5', en donde la hebra activa comprende al menos un nucleótido interno modificado y en donde la molécula de ARN de doble hebra es más estable en comparación a una molécula de ADN de extremo romo, de doble hebra, que carece de cualquier modificación de un nucleótido interno.

40. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39.

41. Un método para proporcionar actividad de rniR-124 a una célula, caracterizado porque comprende administrar a la célula la molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39.

42. Un método para disminuir la proliferación celular, caracterizado porque comprende administrar a la célula una cantidad efectiva de la molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39.

43. Un método para inducir la apoptosis en una célula, caracterizado porque administrar a la célula una cantidad efectiva de la molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39.

44. Un método para tratar el cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición farmacéutica que comprende la molécula de ARN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39.

45. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque comprende además administrar al paciente una terapia adicional contra el cáncer.

46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el paciente ha sido diagnosticado con cáncer.