MX2013008071A - Vacuna de omv contra infecciones por burkholderia. - Google Patents

Abstract

La presente descripción se relaciona con composiciones de vacunación y métodos para utilizar las composiciones de vacunación para proporcionar protección contra diversas infecciones por bacterias Gram negativas, incluyendo infecciones por Burkholderia.

Description

VACUNA DE OMV CONTRA INFECCIONES POR BURKHOLDERIA DECLARACIÓN CON RESPECTO A INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO POR EL GOBIERNO FEDERAL Esta invención se realizó con apoyo del gobierno bajó las donaciones U54 AI057156 otorgadas por el Instituto Nacional de Enfermedades Alérgicas e Infecciosas (NIAID)/NIH. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se relaciona en general con vacunas antibacterianas y con la prevención de la infección por un patógeno bacteriano por inmunización y, en particular, con vacunas contra el género Burkholderia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Burkholderia es un género de proteobacterias, probablemente mejor conocidas por sus miembros patogénicos: Burkholderia mallei, responsable de muermo, una enfermedad que se presenta en su mayor parte en caballos y animales relacionados; Burkholderia pseudomallei, agente causante de la melioidosis; y Burkholderia cepacia, un patógeno importante de las infecciones pulmonares en personas con fibrosis qufstica (CF). El nombre del género Burkholderia (previamente parte de Pseudomonas) se refiere a un grupo de bacterias en forma de bastón obligatoriamente aerobias, móviles, Gram negativas, virtualmente ubicuas, que incluye patógenos tanto de animales/humanos como de plantas, asi conío algunas especies ambientalmente importantes. Debido a su resistencia a antibióticos y la alta tasa de mortalidad de sus enfermedades asociadas, Burkholderia mallei y Burkholderia pseudomallei se consideran agentes potenciales como armas biológicas, que se orientan a ganado y humanos.

La bacteria Burkholderia pseudomallei (bacilo Gram negativo, intracelular facultativo) es el agente causante de la melioidosis, una seria enfermedad emergente responsable de una morbilidad y mortalidad significativas en el sureste de Asia y norte de Australia [Cheng AC, Currie BJ (2005) Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin Microbiol Rev 18: 383-416.]'. La infección natural puede presentarse a través de de inoculación subcutánea, ingestión o inhalación del organismo. Las manifestaciones clínicas son inespecíficas y ampliamente variables, y pueden incluir septicemia aguda, neumonía e infección crónica (Wiersinga WJ, van der Poli T (2009) Immunity to Burkholdería pseudomallei. Curr Opin Infect Dis 22: 102-108]. Las tasas de mortalidad asociadas con una infección severa por B. pseudomallei se aproximan a 50% y pueden alcanzar 80-95% en pacientes con choque séptico, a pesar del tratamiento con antibióticos [Leelarasamee A (2004) Recent development in melioidosis. Curr Opin Infect Dis 17: 131-136; Peacock SJ (2006) Melioidosis. Curr Opin Infect Dis 19: 421-428]. Esto se debe parcialmente a la resistencia innata a antímicrobianos de B. pseudomallei así como al nicho intracelular del organismo [Cheng AC, Currie BJ (2005) Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin Microbiol Rev 18: 383-416; Jones AL, Beveridge TJ, Woods DE (1996) Intracellular survival of Burkholdería pseudomallei. Infect Immun 64: 782-790]. De esta manera, se necesitan medidas preventivas, tal como la inmunización activa, para reducir la morbilidad y mortalidad asociadas con la infección por B. pseudomallei.

Estrategias previas de inmunización que utilizaron S. pseudomallei inactivada por calor o atenuada viva, lipopolisacárido (LPS), polisacárido capsular (CPS), o subunidades basadas en proteínas (es decir proteínas del sistema de secreción Tipo III (TTSS-3) o de membrana externa) conferían grados variables de protección contra un desafio sistémico, pero se comprobó que eran inefectivas o no se hablan probado contra la infección con aerosoles [Harland DN, Chu K, Haque A, Nelson M, Walker NJ, et al. (2007) Identification of a LolC homologue in Burkholdería pseudomallei, a novel protective antigen for melioidosis. Infect Immun 75: 4173-4180; Jones SM, Ellis JF, Russell P, Griffin KF, Oyston PC (2002) Passive protection against Burkholdería pseudomallei infection in mice by monoclonal antibodies against capsular polysaccharide, lipopolysaccharide or proteins. J Med Microbiol 51 : 1055-1062; Nelson M, Prior JL, Lever MS, Jones HE, Atkins TP, et al. (2004) Evaluation of lipopolysaccharide and capsular polysaccharide as subunit vaccines against experimental melioidosis. J Med Microbiol 53: 1177-1182; Haque A, Chu K, Easton A, Stevens MP, Galyov EE, et al. (2006) A live experimental vaccine against Burkholdería pseudomallei elicits CD4+ T cell-mediated immunity, priming T cells specific for 2 type III secretion system proteins. J Infect Dis 194: 1241-1248; Hará Y, Mohamed R, Nathan S (2009) Immunogenic Burkholdería pseudomallei outer membrane proteins as potential candidate vaccine targets. PLoS One 4: e6496; Druar C, Yu F, Barnes JL, Okinaka RT, Chantratita N, et al. (2008) Evaluating Burkholdería pseudomallei Bip proteins as vaccines and Bip antibodies as detection agents. FEMS Immunol Med Microbiol 52: 78-87; Breitbach K, ohler J, Steinmetz I (2008) Induction of protective immunity against Burkholdería pseudomallei using attenuated mutants with defects in the intracellular life cycle. Trans R Soc Trop Med Hyg 102 Suppl 1 : S89-94; Stevens P, Haque A, Atkins T, Hill J, Wood MW, et al. (2004) Attenuated virulence and protective efficacy of a Burkholdería pseudomallei bsa type III secretion mutant in murine models of melioidosis. Microbiology 150: 2669-2676]. Además, las preparaciones de vacunación administradas en forma parenteral, con adyuvante de hidróxido de aluminio, suscitan respuestas inmunitarias robustas de anticuerpos y de Tipo 2 contra B. pseudomallei, pero son insuficientes para una protección completa [Bondi SK, Goldberg JB (2008) Strategies toward vaccines against Burkholdería mallei and Burkholdería pseudomallei. Expert Rev Vaccines 7: 1357-1365]. Las solas respuestas de anticuerpos a menudo son deficientes para proporcionar una inmunidad estéril contra patógenos bacterianos intracelulares [Newman M (1995) Immunological and Formulation Design Considerations for Subunit Vaccines; Newman M, editor. New York: Plenum Press. 1 -42 p]. Una vacuna ideal contra B. pseudomallei probablemente requerirá la inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células (CMI) Tipo 1 para una eficacia completa, como se sugiere a partir de estudios anteriores de inmunización [Haque A, Chu K, Easton A, Stevens MP, Galyov EE, et al. (2006) A live experimental vaccine against Burkholdería pseudomallei elicits CD4+ T cell-mediated immunity, priming T cells specific for 2 type III secretion system proteins. J Infect Dis 194: 1241-1248; Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED (2005) Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholdería pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Immun 73. 5945-5951]. Adicionalmente, el tejido linfoide asociado a la nariz (NALT) puede representar un sitio primario de invasión por B. pseudomallei [Owen SJ, Batzloff M, Chehrehasa F, Meedeniya A, Casart Y, et al. (2009) Nasal-Associated Lymphoid Tissue and Olfactory Epithelium as Portáis of Entry for Burkholdería pseudomallei in Murine Melioidosis. J Infect Dis 199: 1761-1770]. Las estrategias de vacunación que se orientan a la superficie de mucosas e inducen respuestas de Tipo 1 por lo tanto pueden proporcionar una protección mejorada contra la infección por aerosoles con B. pseudomallei.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se relaciona con composiciones de vacunación y métodos para utilizar las composiciones de vacunación para proporcionar protección contra infecciones por Gram negativos y, particularmente, contra diversas infecciones por Burkholdería. Se identificaron objetivos de vacunación al emplear una estrategia de inmunoproteómica para identificar una serie de proteínas inmunorreactivas novedosas en B. thailandensis que tienen potencial para su uso como vacunas de subunidades contra la infección por inhalación de B. pseudoma!lei. B. thailandensis comparte 94% de identidad con B. pseudomallei a nivel de aminoácidos y ha servido como sustituto útil para S. pseudomallei en múltiples estudios [Stevens JM, Ulrich RL, Taylor LA, Wood MW, Deshazer D, et al. (2005) Actin-binding proteins from Burkholderia mallei and Burkholderia thailandensis can functionally compénsate for the actin-based motility defect of a Burkholderia pseudomallei bimA mutant. J Bacteriol 187: 7857-7862; Kim HS, Schell MA, Yu Y, Ulrich RL, Sarria SH, et al. (2005) Bacterial genome adaptation to niches: divergence of the potential virulence genes in three Burkholderia species of different survival strategies. BMC Genomics 6: 174; West TE, Frevert CW, Liggitt HD, Skerrett SJ (2008) Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonía in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg 102 Suppl 1 : S119-126; Morici LA, Heang J, Tate T, Didier PJ, Roy CJ Differential susceptibility of inbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection. Microb Pathog 48: 9-17; Wiersinga WJ, de Vos AF, de Beer R, Wieland CW, Roelofs JJ, et al. (2008) Inflammation patterns induced by different Burkholderia species in mice. Cell Microbiol 10: 81 -87]. La presente descripción proporciona una función novedosa para las vesículas de membrana externa (OMVs) de Burkholderia, como inmunógeno de vacunación y, en este documento, se demuestra su capacidad para suscitar respuestas de anticuerpos en ratones inmunizados. Adicionalmente, en este documento se presenta la capacidad protectora de la inmunización con OMV en un modelo de desafio con aerosoles de B. pseudomallei lethal.

La presente descripción proporciona una composición que comprende vesículas de membrana externa de bacterias Gram negativas, para su uso como vacuna. La composición de la presente descripción además comprende lipopolisacárido, y carece de adyuvante agregado. La composición de la presente descripción además comprende vesículas de membrana externa, en donde las vesículas comprenden lipopolisacárido y carecen de adyuvante agregado.

Las vesículas de membrana externa pueden derivarse de por lo menos una Burkholderia spp. La o las Burkholderia spp. pueden ser S. ambifaria, B. andropogonis, B. anthina, B. brasilensis, B. caledonica, B. caribensis, B. caryophylli, B. cenocepacia, B. cepacia, B. cepacia complex, B. dolosa, B. fungorum, B. gladioli, B. glathei, B. glumae, B. graminis, B. hospita, B. kururiensis, B. mallei, B. multivorans, B. oklahomensis, B. phenazinium, B. phenoliruptrix, B. phymatum, B. phytofirmans, B. plantarii, B. pseudomallei, B. pyrrocinia, B. sacchari, B. singaporensis, B. sordidicola, B. stabilis, B. terrícola, B. thailandensis, B. trópica, B. tuberum, B. ubonensis, B. unamae, B. vietnamiensis, B. xenovorans, o cualquier combinación de las mismas.

La presente descripción proporciona un método para proteger a un mamífero contra la infección ocasionada por bacterias Gram negativas, el método comprende administrar por lo menos una de las composiciones de vesículas de membrana externa mencionadas anteriormente. Preferiblemente, la infección se ocasiona por una Burkholderia spp., y las vesículas de membrana externa se derivan de una Burkholderia spp., preferiblemente la misma especie.

La presente descripción proporciona un método para producir una vacuna contra bacterias Gram negativas, en particular una vacuna contra diversas Burkholderia, el método comprende: a. Hacer crecer un cultivo de bacterias Gram negativas; b. Someter opcionalmente el cultivo a estrés durante el crecimiento (por ejemplo, mediante la exposición a diferentes temperaturas, diferente pH, privación de nutrientes, antibióticos, y combinaciones de los mismos); C Sedimentar las bacterias completas a partir del cultivo por centrifugación para obtener un sedimento de células y una fracción de sobrenadante; d. Recolectar las vesículas de membrana externa a partir del sobrenadante; y e. Purificar además las vesículas de membrana externa por centrifugación en gradientes de densidad.

En una modalidad, la etapa opcional (b) comprende someter el cultivo a estrés oxidante durante el crecimiento.

La presente descripción también proporciona una vacuna producida por el método mencionado anteriormente. Las composiciones pueden administrarse de manera intraperitoneal (IP), intranasal (IN), subcutánea (SQ), intramuscular (I ), transdérmica, oral, tópica, como aerosol, o mediante cualquier otra ruta de administración comúnmente conocida. Las composiciones pueden proporcionarse como aerosol, líquido, suspensión, o cualquier otra formulación farmacéuticamente aceptable conocida por los expertos en la técnica.

Las composiciones pueden administrarse en una cantidad de alrededor de 25 ng a alrededor de 25 mg, de alrededor de 50 ng a alrededor de 20 mg, de alrededor de 75 ng a alrededor de 15 mg, de alrededor de 100 ng a alrededor de 10 mg, de alrededor de 150 ng a alrededor de 7.5 mg, de alrededor de 0.2 g a alrededor de 5 mg, de alrededor de 0.25 pg a alrededor de 2.5 mg, de alrededor de 0.5 pg a alrededor de 2 mg, de alrededor de 0.75 pg a alrededor de 1.5 mg, de alrededor de 1 pg a alrededor de 1 mg, de alrededor de 1.5 pg a alrededor de 750 pg, de alrededor de 2 pg a alrededor de 500 pg, de alrededor de 2.5 pg a alrededor de 250 pg, de alrededor de 5 pg a alrededor de 150 pg, de alrededor de 10 pg a alrededor de 100 pg, de alrededor de 15 pg a alrededor de 75 pg, de alrededor de 15 pg a alrededor de 50 pg, de alrededor de 15 pg a alrededor de 35 pg, y preferiblemente alrededor de 25 pg de OMVs por inmunización.

La presente descripción proporciona métodos para proteger a un mamífero contra la infección ocasionada por bacterias Gram negativas, el método comprende administrar una composición que comprende vesículas de membrana externa de por lo menos una bacteria Gram negativa. En una modalidad, la bacteria Gram negativa es una especie de Burkholderia y las vesículas de membrana externa se derivan de la especie de Burkholderia.

La presente descripción también proporciona métodos para proteger a un sujeto contra la infección ocasionada por al menos una especie de Burkholderia, el método comprende: administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende vesículas purificadas de membrana externa, derivadas de por lo menos una especie de Burkholderia; en donde la administración de la composición inmunogénica proporciona protección contra la infección. En una modalidad de los métodos presentes, la composición inmunogénica se administra de manera subcutánea, intranasal y/o intramuscular. En una modalidad de los métodos presentes, la administración de la composición inmunogénica produce inmunidad protectora humoral y celular para por lo menos una especie de Burkholderia. En una modalidad de los métodos presentes, la inmunidad humoral protectora en el sujeto comprende la producción de IgG y/o IgA especificas para las vesículas de membrana externa administradas. En una modalidad de los métodos presentes, la producción de IgG especifica para las vesículas de membrana externa administradas se incrementa en por lo menos alrededor de 1 logaritmo cuando la composición inmunogénica se administra de manera subsecuente. En una modalidad de los métodos presentes, la IgG específica para las vesículas de membrana externa administradas comprende lgG1 y/o lgG2a. En una modalidad de los métodos presentes, la inmunidad celular protectora en el sujeto comprende la activación de células T de memoria en respuesta a las vesículas de membrana externa administradas. En una modalidad de los métodos presentes, la activación de células T de memoria comprende la producción de interferón gamma (IFN-?) por parte de células de memoria Th1. En una modalidad de los métodos presentes, la administración de la composición inmunogénica proporciona protección cuando el sujeto se expone de manera subsecuente a un desafío con aerosoles que comprende por lo menos una especie de Burkholderia. En una modalidad de los métodos presentes, el desafio con aerosoles comprende una dosis letal de la o las especies de Burkholderia. En una modalidad de los métodos presentes, el sujeto se protege contra la infección ocasionada por Burkholderia pseudomallei y/o Burkholderia mállei, y en donde la composición inmunogénica comprende vesículas purificadas de membrana externa, derivadas de por lo menos Burkholderia pseudomallei y/o Burkholderia mallei.

La presente descripción también proporciona métodos para inducir una respuesta inmunitaria a por lo menos una especie de Burkholderia en un sujeto, el método comprende: administrar una composición inmunogénica que comprende por lo menos una vesícula purificada de membrana externa, derivada de por lo menos una especie de Burkholderia a un sujeto en una cantidad efectiva para suscitar la producción de anticuerpos específicos para la o las especies de Burkholderia. En una modalidad de los métodos presentes, la composición inmunogénica se produce al: (a) hacer crecer un cultivo de bacterias Gram negativas; (b) someter el cultivo a centrifugación, con lo que en consecuencia se obtiene un sedimento de células y una fracción de sobrenadante; (c) recolectar las vesículas de membrana externa a partir de la fracción de sobrenadante; (d) purificar las vesículas de membrana externa recolectadas de la etapa (c) por centrifugación en gradientes; y (e) recolectar las vesículas purificadas de membrana externa de la etapa (d). En una modalidad de los métodos presentes, la centrifugación en gradientes de la etapa (d) comprende centrifugación de alta velocidad seguida por centrifugación en gradientes de densidad.

La presente descripción también proporciona métodos para prevenir una infección respiratoria en un sujeto, en donde la infección respiratoria se ocasiona por al menos una especie de Burkholderia, el método comprende: administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende vesículas purificadas de membrana externa, derivadas de por lo menos una especie de Burkholderia; en donde la administración de la composición inmunogénica previene por lo menos un síntoma de la infección respiratoria. En una modalidad de los métodos presentes, la composición inmunogénica se administra de manera subcutánea, intranasal y/o intramuscular. En una modalidad de los métodos presentes, la infección respiratoria se ocasiona por Burkholderia pseudomallei y/o Burkholderia mallei, en donde la composición inmunogénica comprende vesículas purificadas de membrana externa, derivadas de por lo menos Burkholderia pseudomallei y lo Burkholderia mallei.

La presente descripción también proporciona métodos para prevenir la melioidosis en un sujeto, en donde la melioidosis se ocasiona por al menos una especie de Burkholderia, el método comprende: administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende vesículas purificadas de membrana externa, derivadas de por lo menos una especie de Burkholderia; en donde la administración de la composición inmunogénica produce inmunidad a la o las especies de Burkholderia; y en donde la administración de la composición inmunogénica previene por lo menos un síntoma de la melioidosis. En una modalidad de los métodos presentes, la composición inmunogénica se administra de manera subcutánea, intranasal y/o intramuscular. En una modalidad de los métodos presentes, la inmunidad en el sujeto es inmunidad protectora humoral y celular. En una modalidad de los métodos presentes, la inmunidad humoral protectora en el sujeto comprende la producción de IgG y/o IgA especificas para las vesículas de membrana externa administradas cuando el sujeto se expone a por lo menos una especie de Burkholderia después de la administración de la composición inmunogénica. En una modalidad de los métodos presentes, la inmunidad celular protectora en el sujeto comprende la activación de células T de memoria en respuesta a las vesículas de membrana externa administradas. En una modalidad de los métodos presentes, la activación de células T de memoria comprende la producción de interferón gamma (IFN-?) por parte de células T CD4+ y/o CD8+. En una modalidad de los métodos presentes, la administración de la composición inmunogénica proporciona protección cuando el sujeto se expone de manera subsecuente a un desafío con aerosoles que comprende la o las especies de Burkholderia. En una modalidad de los métodos presentes, la melioidosis es melioidosis neumónica y/o melioidosis septicémica. En una modalidad de los métodos presentes, la melioidosis se ocasiona por Burkholderia pseudomallei, en donde la composición inmunogénica comprende vesículas purificadas de membrana externa, derivadas de por lo menos Burkholderia pseudomallei. En una modalidad de los métodos presentes, la composición inmunogénica además comprende por lo menos un adyuvante En una modalidad de los métodos presentes, el o los adyuvantes se seleccionan del grupo que consiste en oligodesoxinucleótidos de CpG (CpG ODN) metilados, hidróxido de aluminio (alumbre), lípido A de MPL-monofosfato, flagelina, citocinas y toxinas. En una modalidad de los métodos presentes, la toxina es enterotoxina termolábil de E. coli y/o toxina del cólera. En una modalidad de los métodos presentes, el o los adyuvantes son emulsiones.

La presente descripción también proporciona métodos para prevenir una infección respiratoria en un sujeto, en donde la infección respiratoria se ocasiona por al menos una especie del complejo de Burkholdería cepacia, el método comprende: administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende vesículas purificadas de membrana externa, derivadas de por lo menos una especie del complejo de Burkholdería cepacia, en donde la administración de la composición inmunogénica produce inmunidad a la o las especies del complejo de Burkholdería cepacia; y en donde la administración de la composición inmunogénica previene por lo menos un síntoma de la infección respiratoria. En una modalidad de los métodos presentes, la inmunidad en el sujeto es inmunidad protectora humoral y/o celular. En una modalidad de los métodos presentes, la infección respiratoria es infección pulmonar rápidamente fatal. En una modalidad de los métodos presentes, el sujeto está enfermo de fibrosis qulstica. En una modalidad de los métodos presentes, la infección respiratoria se ocasiona por Burkholdería cenocepacia y/o Burkholdería multivorans, en donde la composición inmunogénica comprende vesículas purificadas de membrana extema, derivadas de Burkholdería cenocepacia y/o Burkholdería multivorans.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Para una comprensión posterior de la naturaleza, objetos y ventajas de la presente descripción, debe hacerse referencia a la siguiente descripción detallada, leída en conjunto con los siguientes dibujos, en donde los números de referencia similares denotan elementos similares.

La Figura 1 representa un lisado de células completas de B. thailandensis separado por electroforesis en gel bidimensional.

La Figura 2 representa la inmunogenicidad de EF-Tu durante la infección e inmunización» al utilizar métodos de detección de proteínas.

La Figura 3 muestra datos que evidencian que EF-Tu se presenta en vesículas de membrana externa de B. pseudomallei.

La Figura 4 representa datos que muestran concentraciones de IgG e IgA específicas de EF-Tu, en sueros y BAL de ratones inmunizados.

La Figura 5 representa respuestas de citocinas Th1 y Th2 a rEF-Tu en esplenocitos estimulados nuevamente de ratones inmunizados.

La Figura 6 representa datos de carga bacteriana en pulmones de ratones inmunizados y desafiados con EF-Tu.

La Figura 7 representa IgG de suero especifica para OMV de B. pseudomallei en ratones inmunizados.

La Figura 8 muestra datos de transferencia Western que muestran ausencia de reactividad cruzada del anticuerpo especifico para EF-Tu con tejido de mamífero.

La Figura 9 muestra datos que evidencian que el EF-Tu no es capaz de proporcionar una protección total contra la infección en ratones inmunizados.

La Figura 10 muestra datos que evidencian que las OMV de B. pseudomallei proporcionan una protección significativa contra la infección en ratones inmunizados.

La Figura 11 muestra un alineamiento de proteínas EF-Tu de B. thailandensis E264 (SEQ ID NO: 3), B. pseudomallei K96243 (SEQ ID NO: 4), B. mallei ATCC 23344 (SEQ ID NO: 5), E. coli cepa K-12 subcepa MG1655 (SEQ ID NO: 6), y Homo sapiens (SEQ ID NO: 7).

La Figura 12 muestra un alineamiento de proteínas EF-Tu de diferentes cepas de B. pseudomallei: (S. pseudomallei K96243, la cual es la SEQ ID NO: 4; B. pseudomallei Pasteur 52237, la cual es la SEQ ID NO: 8; B. pseudomallei 406e, la cual es la SEQ ID NO: 9; B. pseudomallei 1106a, la cual es la SEQ ID NO: 10; y S. pseudomallei MSHR346, la cual es la SEQ ID NO: 11 ).

La Figura 13 muestra la caracterización de OMVs de B. pseudomallei. (13A) Microfotografía electrónica de crio-transmisión de OMVs de B. pseudomallei. OMVs purificadas (0.8 mg/ml) se diluyeron 1 :10 en agua estéril filtrada para formación de imágenes. La imagen se tomó al utilizar un Microscopio Electrónico de Transmisión JEOL 2010. La barra indica 100 nm. (B) Transferencia Western que demuestra la presencia de polisacárido capsular (CPS) en OMVs de B. pseudomallei. Diez g de dos lotes separados de vacunas de Bp OMVs (1 - y 2) se examinaron con el anticuerpo monoclonal 3C5 especifico para B. pseudomallei CPS [33J. Lisados de células completas de S. thailandensis (Bth), la cual carece de cápsula, y B. pseudomallei 1026b (Bp) se utilizaron como controles negativo y positivo, respectivamente.

La Figura 14 muestra que las OMVs secretadas por S. pseudomallei cultivada en caldo contienen antlgenos inmunoreactivos. 14(A) SDS-PAGE y tinción de Coomassie de 5 mg de OMVs purificadas. (14B) OMVs examinadas con suero preinmune de un macaco rhesus o (14C) con suero de fase convaleciente obtenido del macaco 6 semanas postinfección con 1 x 106 cfu de S. pseudomallei 1026b (dilución 1 :100; 2o anticuerpo = IgG anti-mono de cabra - conjugado con HRP, dilución 1 :1000). MW = marcador .de pesos moleculares de proteínas La Figura 15 muestra que las respuestas séricas de IgG a OMVs de S. pseudomallei son específicas y no requieren adyuvante exógeno. Títulos de extremos recíprocos medios para IgG sérica específica de OMV de B. pseudomallei se muestran para sueros preinmunes, y sueros obtenidos 3 semanas después de dos (1er refuerzo) y tres (20 refuerzo) administraciones de 2.5 µg de OMVs de B. pseudomallei o E. coli sin adyuvante exógeno. Los grupos de tratamiento (n = 5 ratones por grupo) son: nal've = sin tratamiento; Ec IN = inmunizados intranasalmente con OMV de E. coli; B. pseudomallei IN = inmunizados intranasalmente con OMV de B. pseudomallei; y B. pseudomallei SC = inmunizados de manera subcutánea con OMV de B. pseudomallei. Los asteriscos indican diferencia estadística de títulos de extremos finales en comparación con títulos preinmunes dentro de los grupos (*P < 0.05,***P < 0.001 al utilizar una ANOVA de dos factores con prueba posterior de Bonferroni).

La Figura 16 muestra que anticuerpos dirigidos contra múltiples proteínas se inducen por inmunización con OMV. Las OMVs de B. pseudomallei se examinaron con sueros combinados obtenidos de ratones sin contacto previo (16A) e inmunizados con OMV SC (16B) (n = 5 por grupo) (dilución 1: 100; 2o anticuerpo = IgG de cabra anti-ratón - conjugado con HRP, dilución 1 : 1000). MW = marcador de pesos moleculares de proteínas La Figura 17 muestra que la inmunización SC con OMVs de B. pseudomallei protege a los ratones contra el desafío letal con aerosoles. Los ratones (n = 15 por grupo) se desafiaron con 5 LD5o de B. pseudomallei 1026b por aerosol de partículas pequeñas. Datos combinados de supervivencia de dos experimentos independientes se muestran hasta el día 14. Los ratones inmunizados SC con OMVs de B. pseudomallei se protegieron significativamente (P < 0.001 al utilizar un análisis de supervivencia Mantel-Cox de rango logarítmico).

La Figura 18 muestra que la inmunización con OMV de B. pseudomallei induce inmunidad humoral. La IgG (A) e IgA (B) séricas, específicas de OMV de B. pseudomallei, e IgG (C) e IgA (D) séricas especificas de OMV de E. coli, se midieron por ELISA. Placas de microtitulación se recubrieron con 500 ng/pozo de OMVs de B. pseudomallei o OMVs de E. coli purificadas. Na'íve = sin tratamiento; Ec IN = inmunizados intranasalmente con OMV de E. coli; Bp IN = inmunizados intranasalmente con OMV de B. pseudomallei; y Bp SC = inmunizados de manera subcutánea con OMV de B. pseudomallei. La línea horizontal representa el valor medio para cada grupo (n = 5) (*P < 0.05, **P < 0.01 , *"P < 0.001 al utilizar una ANOVA de un factor con prueba posterior de Bonferroni).

La Figura 19 muestra que la inmunización con OMV de B. pseudomallei induce respuestas de memoria de células T. (19A) Esplenocitos de ratones individuales en cada grupo (n = 3) se estimularon nuevamente por triplicado con OMVs de B. pseudomallei (2 ig) o ConA (1 pg, no mostrado) o se dejaron sin estimular, y los sobrenadantes de cultivos celulares se analizaron por duplicado en el día 3 para la producción de citocina IFN-? (**P < 0.01 , ***P < 0.001 al utilizar una ANOVA de dos factores con prueba posterior de Bonferroni).

La Figura 20 muestra un procedimiento ejemplar para preparar OMV de Burkholderia de acuerdo con la invención.

La Figura 21 es una ilustración de la estrategia de inmunización con OMV ejemplar, empleada y descrita en el Ejemplo 9.

La Figura 22 demuestra que los ratones inmunizados s e. con Bps OMVs se protegieron significativamente de la melioidosis neumónica y septicémica. Los ratones que se inmunizaron con 2.5 µg de OMVs s.c., pero no i.n., se protegieron significativamente del desafío con aerosoles. Los ratones que se inmunizaron s.c. con 5 pg de OMVs se protegieron significativamente del desafio i.p. y la protección se mejoró por la adición de adyuvante CpG. ** p < 0.01 ; *** p < 0.001.

La Figura 23 demuestra que los ratones inmunizados s.c. con Bps OMVs produjeron concentraciones significativamente superiores de IgG sérica específica de LPS y CPS. Placas de microtitulación se recubrieron con LPS de Bth (A) o CPS de Bps (B) purificados, y la IgG sérica se midió por ELISA. ** p <0.01 ; ***p <0.001.

La Figura 24 demuestra que las células T CD8+ productoras de IFÑ-? se incrementan significativamente en ratones inmunizados s.c. con Bps OMVs. Células T CD4+ (A) y células T CD8+ (B) esplénicas purificadas se estimularon nuevamente con Bps OMVs y la frecuencia de células productoras de IFN-? se enumeró por ELIspot. *** p <0.001.

La Figura 25 proporciona la confirmación por transferencia Western de la presencia de antígenos de reactividad cruzada en Bm y Bps al utilizar sueros de ratones inmunizados con Bps OMVs.

La Figura 26 ilustra una estrategia representativa de inmunización con OMV contra Bcc, como se describe en el Ejemplo 10 en este documento.

La Figura 27 demuestra que el adyuvante CpG mejoró la protección mediada por vacunas de OMV contra Bps. Los ratones (n = 10 por grupo) se desafiaron con 5 LD50 de Bps K96243 por inyección IP. Los ratones inmunizados con 5 pg de OMVs (derivadas de la cepa 1026b) o 5 pg de OMVs mezcladas con 10 pg de CpG ODN se protegieron significativamente en comparación con ratones control (ratones que recibieron CpG solamente o ratones sin contacto previo) (***P < 0.001; **P <0.01 al utilizar un análisis de supervivencia Mantel-Cox de rango logarítmico). Nota: Dos ratones en el grupo OMV/CpG se sacrificaron debido a la formación de abscesos en el sitio de inyección y no sucumbieron a la infección.

La Figura 28 demuestra que la inmunización SC con OMVs indujo células T de memoria CD4+ y CD8+. Células T CD4+ y CD8+ esplénicas purificadas de ratones inmunizados (n = 5 por grupo) se estimularon nuevamente con OMVs y el número de células productoras de IFN-? se enumeró por ELIspot.

Células sin estimular y células estimuladas con PMA/ionomicina se utilizaron como controles negativo y positivo, respectivamente. *** P < 0.001 al utilizar una ANOVA de un solo factor.

La Figura 29 ¡lustra un diseño experimental ejemplar para evaluar la eficacia de vacunas de OMV de S. pseudomallei en primates no humanos, como se describe en el Ejemplo 11 en este documento.

La Figura 30 ilustra primates expuestos por aerosol a B. pseudomallei 1026b en tres dosis objetivo (A), con bacterias significativas en la sangre en +1d Pl (B), y en BAL (C) a +1d y +7d Pl. Los pulmones mostraron signos de hemorragia de un animal que sucumbió a la enfermedad a +7d Pl (D). Un animal expuesto a aproximadamente <1 logaritmo en la dosis de desafio muestra menos trauma al pulmón (E). El análisis histopatológico indica necrosis traqueal focal (F), hiperplasia linfoide (G), e inflamación focal en el hígado (H).

La Figura 31 ilustra un análisis de SDS-PAGE de 2.5 microgramos de OMV de B. pseudomallei purificada de acuerdo con el Ejemplo modelo 12. El carril de extrema Izquierda en los paneles (A) - (F) es un marcador de pesos moleculares de proteínas en el cual las seis bandas azules predominantes indican los siguientes pesos moleculares: 1- 250 kilodaltones (kD), 2- 150 kD, 3- 100 kD, 4- 50 kD, 5- 20kD, 6- 15kD. Los carriles a la derecha que contienen bandas púrpura son las OMVs purificadas. Los paneles (A) - (F) se refieren a lotes variables de OMV de B. pseudomallei purificada de acuerdo con el Ejemplo modelo 12.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de que la descripción objeto se describa posteriormente, se entenderá que la descripción no se limita a las modalidades particulares de la descripción descrita a continuación, dado que pueden hacerse variaciones de las modalidades particulares y permanecer aún dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. También se entenderá que la terminología empleada es para el propósito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante. En lugar de ello, el alcance de la presente descripción se establecerá por las reivindicaciones adjuntas.

Además de los ejemplos operativos, o donde se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, etcétera, utilizados en la especificación y reivindicaciones, se entenderán como modificados en todos los casos por el término "alrededor de". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la actual especificación y reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar, lo que depende de las propiedades deseadas que se busca obtener. Al menos, y no como intento para limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico por lo menos debe interpretarse en vista del número de dígitos significativos reportados y al aplicar técnicas ordinarias de redondeo.

No obstante que los intervalos numéricos y parámetros que exponen el amplio alcance de la actual descripción son aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se reportan tan precisamente como es posible. Cualquier valor numérico, sin embargo, contiene ciertos errores de manera inherente que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.

También se entenderá que cualquier intervalo numérico indicado en este documento pretende incluir todos los subintervalos incluidos en el mismo. Por ejemplo, un intervalo de 2.54 cm (1") a 25.4 cm (10") pretende incluir todos los subintervalos entre, e incluir el valor mínimo indicado de 2.54 (1 ) y el valor máximo indicado de 25.4 (10), es decir, tener un valor mínimo igual a o mayor a 2.54 (1 ) y un valor máximo de igual a o menor a 25.4 ( 0).

En esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la/los/las" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto lo dicte claraménte de otra manera. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece esta descripción.

Con respecto a la presente descripción, la frase "cantidad efectiva", como se utiliza en este documento, pretende referirse a una cantidad de composición de acuerdo con la actual descripción, la cual es suficiente para conferir protección contra una infección por bacterias Gram negativas, particularmente la infección por Burkholderia. Tal cantidad puede variar dentro de un amplio intervalo, lo que depende del organismo bacteriano Gram negativo a controlarse, el estatus inmune del animal que se inmuniza, la ruta por la cual la composición de inmunización se administra, y los compuestos incluidos en la composición de acuerdo con la actual descripción.

Con respecto a la presente descripción, la frase "composición inmunogénica", como se utiliza en este documento, pretende referirse a composiciones que suscitan, resultan en, activan una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas presentadas en este documento pueden suscitar anticuerpos contra por lo menos una especie de Burkholderia. En una modalidad preferida, las composiciones inmunogénicas presentadas en este documento comprenden por lo menos una vesícula purificada de membrana externa, derivada de por lo menos una especie de Burkholderia.

Con respecto a la presente descripción, el término "derivado de", como se utiliza en este documento, pretende referirse a sustancias, componentes y/o composiciones que se originan (en su totalidad o en parte), aumentan en, aislan de, y/o comprenden características sustancialmente similares con un organismo indicado particular. Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas presentadas en este documento comprenden por lo menos una vesícula purificada de membrana externa, derivada de por lo menos una especie de Burkholderia.

La composición de la presente descripción comprende una composición de vesículas de membrana externa de Burkholderia, para su uso como vacuna. La composición actual además comprende lipopolisacárido, y carece de adyuvante.

La presente descripción comprende un método para proteger a un mamífero contra la infección ocasionada por Burkholderia, el método comprende administrar una composición de vesículas de membrana externa de Burkholderia.

La composición de la presente descripción comprende una composición para su uso como vacuna, producida por el proceso de a) hacer crecer un cultivo de bacterias Gram negativas; b) someter opcionalmente el cultivo a estrés durante el crecimiento; c) sedimentar bacterias completas a partir del cultivo por centrifugación para obtener un sedimento de células y una fracción de sobrenadante; d) recolectar vesículas de membrana externa a partir del sobrenadante; y e) purificar posteriormente las vesículas de membrana externa por centrifugación en gradientes. En una modalidad, las composiciones de la presente descripción se producen por procesos en donde la etapa (b) comprende opcionalmente someter el cultivo a estrés oxidante durante el crecimiento.

En una modalidad de la presente descripción, la composición para su uso como vacuna, producida por el proceso de a) hacer crecer un cultivo de bacterias Gram negativas; además comprende someter el cultivo en crecimiento de bacterias Gram negativas a estrés oxidante durante el crecimiento, y en donde el estrés oxidante comprende ionización, irradiación UV, privación de oxigeno, y/o agentes químicos que generan oxígeno intracelular. En una modalidad, las composiciones de la presente descripción se producen por procesos en donde la etapa (b) comprende opcionalmente someter el cultivo a estrés oxidante durante el crecimiento.

Agentes ambientales tales como ionización, radiación cercana a la UV, o numerosos compuestos que generan 02 intracelular - (agentes de ciclo de óxido-reducción tales como menadiona y paraquat) pueden dar lugar a estrés oxidante, el cual surge cuando la concentración de oxígeno activo se incrementa a un nivel que excede la capacidad de defensa de la célula. Otras fuentes de estrés incluyen la exposición a temperatura, (por ejemplo, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C, etc., y combinaciones de las mismas con el paso del tiempo), pH (por ejemplo, alrededor de 5 a alrededor de 9, alrededor de 5.5 a alrededor de 8.5, alrededor de 6 a alrededor de 8, alrededor de 6.5 a alrededor de 7.5, alrededor de 5 a alrededor de 6, alrededor de 5.5 a alrededor de 6.5, alrededor de 8 a alrededor de 9, y alrededor de 7.5 a alrededor de 8.5), privación de nutrientes (por ejemplo, limitación de carbono, nitrógeno, azufre, magnesio, vitaminas (incluyendo vitaminas B), etc. y combinaciones de las mismas), exposición a antibióticos (por ejemplo, ampicilina, kanamicina, espectinomicina, estreptomicina, higromicina, etc., y combinaciones de las mismas), y combinaciones de los mismos.

Composición de vacunación Las vacunas pueden desarrollarse en diferentes formas, por ejemplo, al utilizar bacterias vivas o virus que se han alterado a fin de que no puedan dar lugar a enfermedad, bacterias muertas o virus inactivados, toxoides (toxinas bacterianas que se han hecho inocuas), o partes purificadas de bacterias o virus. Las vacunas usualmente contienen agua estéril o solución salina, asi como el germen muerto o debilitado, y otros componentes purificados que se incluyen en las vacunas dado que estimulan el sistema inmune (por ejemplo, adyuvantes). Algunas vacunas se preparan con un conservante o antibiótico (por ejemplo, para evitar el crecimiento bacteriano y fúngico). Algunas vacunas también se preparan con sustancias conocidas como estabilizantes (por ejemplo, para ayudar a que la vacuna mantenga su efectividad durante el almacenamiento). Otro componente de ciertas vacunas es un adyuvante, tal como el aluminio (para ayudar a estimular la producción de anticuerpos contra los ingredientes de la vacuna para hacerla más efectiva).

Una "vacuna", como se refiere en este documento, se define como composición farmacéutica o terapéutica utilizada para inocular a un animal con el fin de inmunizar al animal contra la infección por un organismo, típicamente una organismo patogénico. Una vacuna típicamente comprenderá uno o más antlgenos derivados de uno o más organismos que, con la administración a un animal, estimularán la inmunidad activa y protegerán a ese animal contra la infección con estos organismos patogénicos o los relacionados.

En una modalidad de la invención, las composiciones inmunogénicas presentadas en este documento comprenden emulsiones adyuvantes. El término "emulsión" como se utiliza en el contexto de la frase "emulsión adyuvante" en este documento pretende referirse a adyuvantes tipo emulsión. El uso ejemplar de emulsiones adyuvantes es para optimizar la formulación del adyuvante de vacunación. Los adyuvantes tipo emulsión exhiben diversas propiedades de dispersión, tal como con los tipos aceite en agua o agua en aceite, y pueden prepararse al utilizar emulsionantes con diversos valores de equilibrio hidrofílico— hidrofóbico (HLB). Las propiedades fisicoquímicas de las emulsiones, incluyendo la conductividad y viscosidad, y las tasas de liberación de antlgenos, pueden evaluarse fácilmente para determinar el efecto mejorador de la inmunogenicidad de diversos adyuvantes en emulsión reconocidos. Véase, por ejemplo, Yang, Ya-Wun et al., Vaccine, 23(20): 2665-2675 (Abril 2005), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia.

Las composiciones de vacunación que se formulan como productos farmacéuticos típicamente comprenderán un portador. Si se encuentran en solución o en suspensión líquida en aerosol, los portadores adecuados pueden incluir solución salina, solución de sacarosa, u otras soluciones reguladoras farmacéuticamente aceptables. Una formulación en aerosol típicamente comprenderá adicionalmente un surfactante.

Actualmente no hay una vacuna efectiva contra S. pseudomallei, y los intentos de vacunas tradicionales han sido en gran medida ineficaces en prevenir la forma de inhalación ; de la enfermedad en modelos animales. Por lo tanto, las estrategias alternativas de vacunación que incorporan avances recientes en biología de adyuvantes e inmunología de mucosas merecen investigación. La estrategia actual emplea vesículas de membrana externa para lograr una protección por vacunación.

Con respecto a la presente descripción, el término "sensibilización", como se utiliza en este documento, pretende referirse a la primera administración de las presentes composiciones inmunogénicas a un sujeto. La frase "refuerzo único", como se utiliza en este documento, pretende referirse a la segunda administración de las presentes composiciones inmunogénicas a un sujeto. El refuerzo único se administra después de la administración de sensibilización. La frase "segundo refuerzo", como se utiliza en este documento, pretende referirse a la tercera administración de las presentes composiciones inmunogénicas a un sujeto. El segundo refuerzo se administra después del refuerzo único, el cual es después de la administración de sensibilización. Se sabe bien que el período de tiempo después de la administración de sensibilización, cuando el refuerzo único y/o segundo refuerzo se suministra al sujeto, puede variar con la edad, estado de salud, y estado inmunitario del sujeto, así como la especie particular de Burkholderia de la cual se derivan las OMVs purificadas.

En una modalidad de la invención, las presentes composiciones inmunogénicas se administran como sensibilización a un sujeto. En esa modalidad, la administración de sensibilización de las presentes composiciones inmunogénicas es suficiente para conferir protección del sujeto contra la infección ocasionada por al menos uña especie de Burkholderia.

En otra modalidad de la invención, un refuerzo único de las presentes composiciones inmunogénicas se administra a un sujeto. En esa modalidad, el refuerzo único de las presentes composiciones inmunogénicas es suficiente para conferir protección del sujeto contra la infección ocasionada por al menos una especie de Burkholderia.

Todavía en otra modalidad de la invención, un segundo refuerzo de las presentes composiciones inmunogénicas se administra a un sujeto. En esa modalidad, el segundo refuerzo de las presentes composiciones inmunogénicas es suficiente para conferir protección del sujeto contra la infección ocasionada por al menos una especie de Burkholderia.

Todavía en otra modalidad de la invención, un tercer refuerzo de las presentes composiciones inmunogénicas se administra a un sujeto. En esa modalidad, el tercer refuerzo de las presentes composiciones inmunogénicas es suficiente para conferir protección del sujetó contra la infección ocasionada por al menos una especie de Burkholderia.

Métodos de inmunoproteómica permitieron la identificación de proteínas que pueden utilizarse como antígenos de vacunas de subunidades y se suministraron por mucosas. De las 11 proteínas identificadas, tres (EF-Tu, AhpC, y DnaK) se reconocieron previamente por Harding et al. [Harding SV, Sarkar-Tyson M, Smither SJ, Atkins TP, Oyston PC, et al. (2007) The Identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine 25: 2664-2672] al utilizar una estrategia similar con sueros en estado convaleciente de pacientes con melioidosis. El coreconocimiento de estos antígenos particulares de S. pseudomallei por dos laboratorios independientes refuerza su valor potencial como inmunógenos de vacunación. Uno de los tres, EF-Tu, de esta manera se seleccionó como el primer antígeno de prueba dado que tanto AhpC como DnaK han recibido considerable atención en algún otro sitio para agentes biológicamente peligrosos relacionados.

La función citoplásmica tradicional de EF-Tu en la síntesis de proteínas podría hacerlo un candidato poco probable para una vacuna de subunidades protectora. Sin embargo, EF-Tu es una de las proteínas bacterianas más abundantes y conservadas (100% de identidad de amino ácidos entre B. thailandensis, B. mallei, y cinco diferentes depas de S. pseudomallei— Tabla 1 , Figura 11 , y Figura 12 — y es un componente principal del citoesqueleto de la membrana bacteriana. EF-Tu comprende tanto como 5-10% de la proteína citoplásmica en todas las bacterias investigadas, y puede ser funcionalmente análogo a la actina dado que puede polimerizar a filamentos en haces y unirse a DNasa 1. Evidencia reciente demuestra que EF-Tu puede desempeñar una función previamente no apreciada como factor de virulencia bacteriano. Por ejemplo, EF-Tu traslocada a superficie media la unión a fibronectina y otras proteínas del hospedador para Mycoplasma pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa, y EF-Tu puede facilitar la invasión de las células hospedadoras por Francisella tularensis mediante la interacción con la nucleojina. Adicionalmente, estrategias basadas en inmunoproteómica para descubrimiento de antígenos contra otros patógenos bacterianos intracelulares han identificado a EF-Tu como proteína inmunodominante. Tomados en conjunto, estos estudios apoyan a las observaciones actuales del EF-Tu inmunogénico en la membrana de B. thailandensis, y lo reportado en otro sitio para B. pseudomallei.

Vesículas de membrana externa (OMV) Las bacterias Gram negativas producen vesículas de membrana externa (OMVs) que contienen proteínas biológicamente activas y realizan diversos procesos biológicos. A diferencia de otros mecanismos de secreción, las OMVs hacen posible que las bacterias secreten moléculas insolubles además de y en complejo con material soluble. Las OMVs permiten que las enzimas alcancen objetivos distantes en una forma concentrada, protegida y orientada. Las OMVs también desempeñan funciones en la supervivencia bacteriana: Su producción es una respuesta al estrés bacteriano y es importante para la adquisición de nutrientes, desarrollo de biopellculas, y patogénesis. Las características clave de la biogénesis de OMVs incluyen el abultamiento hacia fuera de áreas que carecen de enlaces membrana-péptidoglicano, la capacidad para regular positivamente la producción de vesículas sin perder también la integridad de la membrana externa, enriquecimiento o exclusión de ciertas proteínas y lípidos, y la fisión de membrana sin energía directa de la hidrólisis de ATP/GTP.

La liberación de vesículas de membrana externa (OM) se ha observado para todas las bacterias Gram negativas estudiadas a la fecha. Las vesículas nativas son estructuras redondeadas con componentes periplásmicos luminares rodeados por una capa externa de proteínas de membrana externa (Omps) y lípidos. Estudios de microscopía electrónica revelaron el abultamiento de la OM y subsecuente fisión de vesículas que contenían material electrodenso. Estas observaciones bioquímicas y microscópicas sugieren que las vesículas de OM se forman a partir de proyecciones que se estrangulan a partir de la OM en una forma que conduce a la inclusión de material periplásmico. La gran diversidad de cepas y diversidad de ambientes para los cuales se ha observado la formación de vesículas sugieren una función importante para la producción de vesículas en el crecimiento y supervivencia de bacterias Gram negativas. La producción de vesículas varía con la fase de crecimiento y disponibilidad de nutrientes, y las enzimas asociadas a vesículas pueden ayudar al rastreo y captura de nutrientes. La transferencia mediada por vesículas de componentes tóxicos a otras bacterias puede eliminar las especies competentes. Además, las interacciones entre células eucarióticas y vesículas de bacterias patogénicas sugieren una función para las vesículas en la patogénesis. (Journal of Bacteriology, Agosto 2006, p. 5385-5392, Vol. 188, No. 15). Estas interacciones también sugieren que las OMVs pueden ser "útiles como agentes inmunogénicos y pueden conferir resistencia a infecciones bacterianas.

Aunque el solicitante no fue capaz de demostrar a EF-Tu en la superficie de B. thailandensis, EF-Tu se observó en las OMVs secretadas de B. pseudomallei durante el crecimiento in vitro. Esto puede contribuir parcialmente a la generación de anticuerpos del hospedador contra EF-Tu dado que se ha observado que las OMVs activan células B [Amano A, Takeuchi H, Furuta N Outer membrane vesicles function as offensive weapons in host-parasite interactions. Microbes Infect.] La presente descripción proporciona OMVs purificadas a partir de Burkholderia y da a conocer su uso para proporcionar protección inmunitaria contra infecciones por Burkholderia en mamíferos.

La presente descripción proporciona un método de purificación de O Vs, el método comprende hacer crecer un cultivo de bacterias Gram negativas; someter opcionalmente el cultivo a estrés oxidante durante el crecimiento; sedimentar bacterias completas a partir del cultivo por centrifugación para obtener un sedimento de células y una fracción de sobrenadante; recolectar vesículas de membrana externa a partir del sobrenadante; y purificar posteriormente las vesículas de membrana externa por centrifugación en gradientes.

Uso de la vacuna La presente descripción proporciona un método para proteger a un mamífero contra la infección ocasionada por Burkholderia, el método comprende administrar una composición de vacunación que comprende vesículas de membrana externa (OMVs) de Burkholderia.

La inmunización activa de ratones con EF-Tu generó altas concentraciones de IgG específica de antígeno que reconoció las formas, tanto recombinante como nativa de EF-Tu. Este trabajo representa la primera aplicación y evaluación de EF-Tu como inmunógeno de vacunación para un patógeno bacteriano. Como los antígenos bacterianos flagelina y LPS (ambos altamente evaluados como constituyentes de vacunas), EF-Tu se presenta de manera abundante y altamente inmunogénica durante la infección por B. pseudomallei en humanos [Harding SV, Sarkar-Tyson M, Smither SJ, Atkins TP, Oyston PC, et al. (2007) The Identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine 25: 2664-2672.] y modelos animales de melioidosis y, de esta manera, merece investigación. Adicionalmente, el EF-Tu bacteriano y EF2 humano comparten sólo 17% de identidad al nivel de aminoácidos y no son intercambiables funcionalmente (Figura 11A.-11 D) [Jonak J (2007) Bacterial elongation factors EF-Tu, their mutants, chimeric forms, and domains: isolation and purification. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 849: 141-153]. No se observó reactividad cruzada del anticuerpo específico de EF-Tu con el tejido de mamífero por transferencia Western (Figura 8). De esta manera, el potencial para el EF-Tu bacteriano para inducir la enfermedad autoinmune en individuos vacunados parece insignificante.

Los estudios de inmunización de sensibilización/refuerzo heterólogos y homólogos compararon la ruta parenteral tradicional de inmunización con hidróxido de aluminio como el adyuvante con una formulación intranasal de rEF-Tu mezclado con oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN), un adyuvante capaz de polarizar la respuesta inmunitaria a células T-cooperadoras 1 (Th1 ) y mejorar la IgA de mucosas, anticuerpos sistémicos, e inmunidad de células T [Freytag LC, Clements JD (2005) Mucosal adjuvants. Vaccine 23: 1804-1813; Klinman DM, Klaschik S, Sato T, Tross D (2009) CpG oligonucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases. Adv Drug Deliv Rev 61 : 248-255]. Se ha propuesto que S. pseudomallei puede utilizar el tejido linfoide asociado a nariz (NALT) como puerta de entrada en la melioidosis múrida [Owen SJ, Batzloff M, Chehrehasa F, Meedeniya A, Casart Y, et al. (2009) Nasal-Associated Lymphoid Tissue and Olfactory Epithelium as Portáis of Entry for Burkholderia pseudomallei in Murine Melioidosis. J Infect Dis 199: 1761-1770]. Por lo tanto, la ruta intranasal (i.n.) de inmunización puede evitar mejor las infecciones en mucosas a través de la sensibilización y activación de inmunidad antimicrobiana local. Para probar esta hipótesis, ratones inmunizados en forma parenteral y por mucosas se desafiaron con 5 x 105 cfu de S. thailandensis al utilizar una cámara de exposición a inhalación sólo por nariz. La infección por aerosoles de ratones BALB/c con B. thailandensis se ha demostrado previamente como un excelente modelo sustituto para la forma neumónica aguda de la enfermedad ocasionada por B. pseudomallei y es capaz de reproducir la patología pulmonar principal de la melioidosis múrida [West TE, Frevert CW, Líggitt HD, Skerrett SJ (2008) In alation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonía in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg 102 Suppl 1 : S119-126; Moríci LA, Heang J, Tate T, Didier PJ, Roy CJ Differential susceptibility of inbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection. Microb Pathog 48: 9-17]. Adicionalmente, hay una correlación directa entre la carga bacteriana pulmonar y la progresión de enfermedad en el modelo mundo [West TE, Frevert CW, Líggitt HD, Skerrett SJ (2008) Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonía in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg 102 Suppl 1 : S1 19-126; Moríci LA, Heang J, Tate T, Didier PJ, Roy CJ Differential susceptibility of inbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection. Microb Pathog 48: 9-17]. Las cifras bacterianas reducidas observadas sólo en los pulmones de ratones que se inmunizaron por mucosas con EF-Tu/CpG sugiere que la inmunización con EF-Tu puede influir en la protección y que la ruta de inmunización puede ser critica. Más aún, la reducción temprana en la carga bacteriana en el grupo i.n. + i.n. no puede atribuirse exclusivamente a la capacidad immunoprotectora del CpG [Wongratanacheewin S, Kespichayawattana W, Intachote P, Pichyangkul S, Sermswan RW, et al. (2004) Immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide confers protection in a murine model of infection with Burkholderia pseudomallei. Infect Irnmun 72: 4494-4502] dado que los ratones inmunizados i.n. con CpG ODN 1826 solo tuvieron cifras similares, o incluso ligeramente superiores, de bacterias en comparación con los ratones sin contacto previo que se desafiaron (Figura 6).

Los intentos anteriores de vacunación contra B. pseudomallei no pudieron conferir una protección completa, a pesar de la inducción de una robusta respuesta de anticuerpos; sin embargo, la inmunidad humoral probablemente debe ser un componente esencial de cualquier vacuna contra esta organismo [Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED (2005) Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholderia pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Immun 73: 5945-5951 ]. Trabajo previo demostró una tasa de supervivencia de 0% en ratones inmunizado con células dendrtticas expuestas en pulsos a B. pseudomallei, aunque la inmunización generó una respuesta inmunitaria mediada por células sustancial [Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED (2005) Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholderia pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Immun 73: 5945-5951 ]. La protección pudo lograrse cuando los ratones se reforzaron con bacterias inactivadas por calor, y correlacionó con la producción de altos títulos de anticuerpos específicos de 8. pseudomallei [[Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED (2005) Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholderia pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Immun 73: 5945-5951 ]. La inmunización con EF-Tu produjo altas concentraciones de IgG específica de antlgenos en los sueros y lavado broncoalveolar (BAL) por los regímenes de inmunización parenteral y por mucosas. Sin embargo, los niveles de IgG específica de EF-Tu no correlacionan con las diferencias observadas en las cargas bacterianas pulmonares en ratones inmunizados en el actual estudio. Además de la IgG, la IgA secretoria puede desempeñar una función en la protección contra patógenos por inhalación tal como se demostró previamente para Bordetella pertussis [Watanabe M, Nagai M (2003) Role of systemic and mucosal immune responses in reciprocal protection against Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis in a murine model of respiratory infection. Infect Immun 71 : 733-738]. Niveles indetectables a muy bajos de IgA especifica de EF-Tu se observaron en los sueros de ratones inmunizados independientemente de la ruta de inmunización. En contraste, la IgA específica de EF-Tu se elevó significativamente en el BAL de ratones inmunizados en comparación con ratones sin contacto previo, pero no hubo diferencia estadística entre ninguno de los grupos inmunizados. Por lo tanto, las concentraciones de IgA tampoco pueden contribuir a las diferencias observadas en las cargas bacterianas pulmonares en el punto en el tiempo examinado.

Aunque los anticuerpos contribuyen a la protección contra B. pseudomallei [Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED (2005) Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholderia pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Immun 73: 5945-5951] una robusta respuesta CMI probablemente se requiere para la eliminación final de las bacterias internadas [Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED (2005) Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholderia pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Immun 73: 5945-5951 ; Haque A, Easton A, Smith D, O'Garra A, Van Rooijen N, et al. (2006) Role of T cells in innate and adaptive ¡mmunity against murine Burkholderia pseudomallei infection. J Infect Dis 193: 370-379]. Las células T específicas de antigenos, particularmente células T CD4+, son fuentes importantes de interferón gamma (IFN-?) y son esenciales para la resistencia del hospedador a la infección aguda y crónica con B. pseudomallei [Haque A, Easton A, Smith D, O'Garra A, Van Rooijen N, et al. (2006) Role of T cells in innate and adaptive ¡mmunity against murine Burkholderia pseudomallei infection. J Infect Dis 193: 370-379.]. Se demostró recientemente que EF-Tu suscita células T CD4+ de memoria en ganado inmunizado con preparaciones de proteínas de membrana externa del patógeno ricketsia, Anaplasma margínale [López JE, Beare PA, Heinzen RA, Norimine J, Lahmers KK, et al. (2008) High-throughput Identification of T-lymphocyte antigens from Anaplasma margínale expressed using in vítro transcription and translation. J Immunol Methods 332: 129-141 ]. La actual descripción corrobora esos hallazgos dado que demuestra la producción de citocínas Th1 (IFN-?) y Th2 (IL-5) en esplenocitos estimulados de nuevo con EF-Tu reflejaron tanto el adyuvante utilizado como la ruta de inmunización. En otras palabras, la estrategia.de inmunización parenteral que incorporó hidróxido de aluminio como adyuvante promovió respuestas Th2 al rEF-Tu, mientras que la administración por mucosas de rEF-Tu con CpG polarizó la respuesta inmunitaria hacia Thl Esto también se soporta por las relaciones lgG1 :lgG2a observadas en los sueros y BAL que demostraron una polarización Th1 in ratones inmunizados por mucosas (TABLA 2). Es plausible que la respuesta Th1 específica de anttgeno suscitada por la inmunización por mucosas con rEF-Tu/CpG sea responsable de la carga bacteriana reducida observada antes en los pulmones del grupo i.n. + i.n. Considerando la predominancia de EF-Tu en la célula bacteriana, un análisis posterior de células T de memoria CD4+ específicas de EF-Tu está claramente garantizado.

El solicitante fue capaz de demostrar que EF-Tu, identificado como inmunógeno candidato, produce una robusta respuesta de IgG y algo de IgA, produce la estímulo de células Th1 y Th2 (cuando se mide por IFN-? e IL-5, respectivamente), y reduce la carga bacteriana (Figura 6), aún cuando la inmunización con EF-Tu no confiere protección de B. pseudomallei (Figura 9).

El solicitante fue capaz de demostrar la protección de ratones inmunizados de manera subcutánea con 2.5 g de Bp OMVs purificadas, resuspendidas en 100 µ? de solución salina en los días 0, 21 , y 42 (Figura 10). Los ratones inmunizados simuladamente recibieron 100 µ? de solución salina de manera subcutánea. Todos los ratones se desafiaron al día 70 con una dosis letal de B. pseudomallei (500 cfu) por aerosol, y la supervivencia se monitoreó durante 14 días. Cien por ciento (100%) de los ratones inmunizados simuladamente sucumbieron al desafío dentro de 4 días, al mismo tiempo que el 80% de los ratones inmunizados con OMV sobrevivieron hasta el punto final del estudio y perecieron haberse recuperado completamente cuando se determina por comportamiento/actividad normales y habiendo confirmado la ausencia de bacterias en los pulmones (Figura 10).

La falta de un adecuado tratamiento y prevención contra melioidosis necesita el desarrollo de una vacuna contra B. pseudomallei [Bondi SK, Goldberg JB (2008) Strategies toward vaccines against Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. Expert Rev Vaccines 7: 1357-1365]. La inhalación de S. pseudomallei es una ruta natural de infección, y representa la ruta principal de exposición en un ataque biológico intencionado. Una vacuna de B. pseudomallei por lo tanto debe ser eficaz contra esta ruta de infección. EF-Tu, una proteína mejor reconocida por su función en la síntesis de proteínas bacterianas, se identificó como vacuna de subunidades candidata contra la Burkholderia patogénica. Los datos presentados aquí indican que el EF-Tu recombinante es inmunogénico, que induce respuestas de anticuerpos y CMI específicas de antígeno, y aún la Figura 9 demuestra que la inmunización con EF-Tu no confiere una protección completa contra Burkholderia. Más bien, las OMV preparadas a partir de Burkholderia confirieron protección contra Burkholderia en aerosol.

Burkholderia mallei, el agente etiológico de la enfermedad del muermo, es una bacteria intracelular facultativa Gram negativa inmóvil. La mayor parte de los miembros conocidos de la familia Burkholderiaceae son residentes del suelo; ski embargo, S. mallei es un patógeno obligado de mamíferos. Los caballos son altamente susceptibles a la infección y se consideran el reservorio natural para la infección, aunque las muías y asnos son susceptibles también (Neubauer H. et al., J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 52: 201-205 (2005), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia). La identificación del agente etiológico B. mallei se describió en 1882 al aislar un organismo del hígado y bazo infectados de un caballo Clínicamente, los solípedos infectados con B. mallei pueden presentarse con la forma crónica (caballos) o una aguda (muías y asnos). Aunque la erradicación ha sido exitosa en Estados Unidos, el muermo es endémico entre los animales domésticos en África, Asia, el Oriente Medio y América Central y del Sur. La ruta principal de la infección equina muy probablemente es el consumo de alimento o agua contaminados con descargas nasales de animales infectados, aunque una forma cutánea también existe, conocida como muermo. Los animales crónicamente infectados presentan una diversidad de signos y síntomas dependientes de la ruta de infección, incluyendo descarga nasal mucopurulenta, lesiones y nódulos pulmonares que implican el hígado y bazo. La infección aguda resulta en alta fiebre y emaciación, con ulceración del septo nasal, acompañada por descarga mucopurulenta a hemorrágica. Los cambios patológicos se limitan en los tejidos linfáticos asociados a intestino, con la mayor parte de la patología presentándose en los pulmones y vías respiratorias En una modalidad de la invención, las presentes composiciones inmunogénicas se utilizan en métodos para proteger a un sujeto caballo, muía o asno contra la infección ocasionada por al menos una especie de Burkholderia, en donde la administración de la composición inmunogénica proporciona protección contra la infección.

En otra modalidad de la invención, las presentes composiciones inmunogénicas se utilizan en métodos para inducir una respuesta inmunitaria para por lo menos una especie de Burkholderia en un sujeto caballo, muía o asno, el método comprende administrar la composición inmunogénica en una cantidad efectiva para suscitar la producción de anticuerpos específicos para la o las especies de Burkholderia.

Todavía en otra modalidad de la invención, las presentes composiciones inmunogénicas se utilizan en métodos para prevenir la infección respiratoria en un sujeto caballo, muía o asno, en donde la infección respiratoria se ocasiona por al menos una especie de Burkholderia, en donde la administración de la composición inmunogénica previene por lo menos un síntoma de la infección respiratoria.

Todavía en otra modalidad de la invención, las presentes composiciones inmunogénicas se utilizan en métodos para prevenir la melioidosis en un sujeto, en donde la melioidosis se ocasiona por al menos una especie de Burkholderia, en donde la administración de la composición inmunogénica produce inmunidad en el sujeto cuando el sujeto se expone de manera subsecuente a la o las especies de Burkholderia, y en donde la administración de la composición inmunogénica evita por lo menos un síntoma de la melioidosis. Componentes de vacunación opcionales La presente descripción proporciona una composición de vacunación que comprende vesículas de membrana externa sin componentes de vacunación adicionales tradicionalmente utilizados en estrategias de inmunización. Sin embargo, opcionalmente pueden agregarse componentes que funcionan para estabilizar la composición o para proporcionar un reacción inmune equilibrada. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, lipopolisacárido (LPS), CpG, adyuvante de hidróxido de aluminio, y solución salina.

Métodos experimentales Electroforesis en gel bidimensional La electroforesis en gel bidimensional (2D) se realizó al utilizar 100 de lisado de células completas de B. thailandensis solubilizado en urea 7 M, tiourea 2 M, 4% (p/v) de 3-[3-(colamidopropil)dimetilamonio]-1-proanesulfonato (CHAPS), 20% de glicerol, Tris 30 mM, pH 8.5. Cincuenta µg (50 µg) del lisado sin purificar se utilizaron para re idratar una tira de 18 cm de gradiente de pH inmovilizado (IPG), pH 3-10 no lineal (NL) durante la noche. Al día siguiente, las proteínas en la tira rehidratada se sometieron a enfoque isoeléctrico a 50 µ?/tira. La tira entonces se equilibró 15 min con 20 mg/ml de ditiotreitol (DTT) y 25 mg/ml de yodoacetamida antes de cargarse en un gel de SDS-poliacrilamida al 12.5% (Invitrogen). El gel se corrió durante 30 min a 5 Watts/gel y luego durante 5 h a 18 Watts/gel. La transferencia Western se realizó como se describe posteriormente con unas cuantas modificaciones: la membrana se bloqueó con 5% de leche descremada en TBS que contenía 0.05% de Tween 20 (TBST); una dilución 1:200 de suero policlonal de conejos New Zealand White que se inmunizaron de manera subcutánea con B, mallei ATCC 23344 irradiada se utilizó como el anticuerpo primario; y una dilución 1 :2000 de un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con HRP se utilizó como el secundario. Véase, por ejemplo, la Figura 1.

Espectrometría de masas de desorción por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo de ionización (MALDI-TOF) El análisis de MALDI-TOF se realizó en un 4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF-TOF (Applied Biosystems, Foster City, CÁ). Un espectro de masas simple y espectros de masas en tándem promediados de los cinco péptidos más abundantes (que excluye autolisis por tripsina) de cada muestra se adquirieron e inspeccionaron manualmente en Data Explorer. Global Proteome Server (Applied Biosystems) se utilizó para buscar las bacterias de la base de datos de proteínas Uniprot. Se permitió una escisión perdida por péptido, y la ventana de tolerancia de masa iónica fragmentada se ajustó a 100 ppm. Un acierto de protelna con una calificación total de 75 o superior, con por lo menos un péptido sobre 20, se consideró una coincidencia probable. Las similitudes de proteínas se obtuvieron al utilizar Basic Local Alignment Search Tools (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) y la base de datos no redundante del NCBI.

Clonación, expresión y purificación de EF-Tu Con base en la secuencia de genoma publicada de B. pseudomallei cepa K96243, el marco abierto de lectura (ORF) completo de EF-Tu se amplificó por PCR a partir de DNA genómico de B. pseudomallei cepa 286 (BEI Resources, anassas, VA) al utilizar el cebador de avance 5'-GCATGCGCCAAGGAAAAGTTTGAGCGGACC-3' (SEQ ID NO: 1 ) y el cebador inverso 5'-AAGCTTTTACTCGATGATCTTGGCGACGACG -3' (SEQ ID NO: 2) lo cual produce sitios Sphl y Hindlll (subrayados) en los extremos 5' y 3' del ORF de EF-Tu respectivamente. El fragmento se ligó al sitio de clonación múltiple del vector de expresión de proteínas pQE30 (Qiagen, Valencia, CA) que contenía una etiqueta de 6X-hist¡dina N-terminal, y se transformó en E. coli depa DH-5a para secuenciación automatizada al utilizar los cebadores de secuenciación de avance e inverso pQE (Qiagen). El EF-Tu clonado de la cepa 286 shares 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con EF-Tu de B. pseudomallei cepa K96243 (Uniprot Swiss prot # Q63PZ6) y B. thailandensis E264 (Uniprot Swiss prot # Q2SU25) y 79.4% de identidad con E. coli K12 (Uniprot/Swiss prot # P0CE48). Para la sobre expresión de la proteína EF-Tu, la construyen se transformó en E. coli cepa M15 (Qiagen) y las transformantes se cultivaron durante la noche a 37 °C en caldo Luria-Bertani (LB) complementado con ampicilina (100 ig/m\) y kanamicina (50 g/ml). Una dilución 1 :100 se utilizó para inocular caldo LB recién preparado complementado con ampicilina (50: pg/ml) y kanamicina (25 g/ml) y se dejó crecer a fase logarítmica media antes de la inducción con ¡sopropil-P-d-tiogalactósido 1 mM (IPTG) durante 4 h. Las células se recolectaron por centrifugación y el sedimento de células se almacenó a -80 °C durante la noche. Las células se resuspendieron en regulador de lisis (NaH2P04 50 mM, NaCI 300 mM, imidazol 10 mM), y se sometieron a sonicación tres veces durante 30 s. El sobrenadante que contenía la proteína EF-Tu recombinante (rEF-Tu) se recolectó después de centrifugación, y la purificación simple por lotes se logró al utiíizar cuentas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) bajo condiciones nativas. Las cuentas de agarosa se lavaron tres veces con regulador que contenía imidazol 20 mM, cinco veces con 0.5% de amidosulfobetaína-14 (ASB-14) para remover lipopolisacárido (LPS), cinco veces con Tris-HCI 20 mM, y se eluyó con imidazol 250 mM. Las fracciones de proteínas eluidas se concentraron por centrifugación (Amicon, MW cutoff 10,000 kDa), y el imidazol se removió por intercambio de regulador con agua libre de LPS. La contaminación por LPS se determinó menor a 25 EU/ml al utilizar el ensayo de lisado de limulo de amebocito (LAL) (Lonza, Suiza). La concentración de protelna se determinó al utilizar el ensayo de protelna de Bradford (BioRad). Véase, por ejemplo, las Figuras 2A-2D.

Extracción de protelna de membrana total, SDS-PAGE y transferencia Western.

Una sola colonia de B. thailandensis o E. coli se utilizó para inocular caldo LB e incubar durante la noche. Cada cultivo se diluyó de manera reciente 1 :100 en caldo LB a la mañana siguiente. Las células bacterianas se hicieron crecer a fase logarítmica y se recolectaron por centrifugación (6,000 x g, 10 min, 4 °C). El sedimento bacteriano se resuspendió en volumen de 1/50 de regulador de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (10 mM, pH 7.4). Se agregó lisozima a una concentración final de 10 mg/ml y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. La suspensión bacteriana se sometió a sonicación cinco veces (50-Watts) durante 30 s cada vez en hielo. Benzonasa (Novagen, Gibbstown, NJ) se agregó a una concentración final de 1 µ?/p??, y el lisado se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Los restos celulares intactos se removieron por centrifugación (12,000 x g, 10 min, 4 °C). Una muestra del sobrenadante que consiste en el Usado de células completas se almacenó a -80 °C hasta su uso. El sobrenadante restante se centrifugó (50,000 x g, 60 min, 4 °C), y el sedimento resultante se resuspendió en 0.5% de Sarkosyl (Sigma) .y se incubó 30 min a temperatura ambiente. La suspensión que consiste en proteínas de membrana totales (membrana interna y externa) se distribuyó en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

La electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) se realizó al utilizar un gel de poliacrilamida al 4-20 % (Bio-Rad). rEF-Tu o proteínas del lisado de células completas o fracciones de membrana total de B. thailandensis o E. coli se separaron bajo condiciones reductoras, y las proteínas se transfirieron de manera subsecuente a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con 1.5% de BSA en TBST durante la noche a 4 °C y luego se lavaron dos veces con TBST. Las membranas entonces se incubaron durante la noche a 4 °C con sueros combinados (dilución 1 :200) de ratones inmunizados con rEF-Tu; sueros combinados (dilución 1 :200) obtenidos a partir de ratones 2 semanas después del desafío intraperitoneal (i.p.) con 107 cfu de B. thailandensis cepa E264 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA); sueros combinados (pre-inmunes) (dilución 1 :200) de ratones sin contacto previo; o con un anticuerpo monoclonal (dilución 1 :1000) para la subunidad ß de RNA polimerasa de E. coli (Neoclone, Madison, Wl). El anticuerpo a RNA polimerasa no reconoció B. thailandensis y por lo tanto se utilizó sólo en fracciones celulares de E. coli para determinar la pureza de las preparaciones de membrana total. Las membranas se lavaron de manera subsecuente tres veces con TBST y se incubaron con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con HRP (dilución 1 : 1000) (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron dos veces con TBST y se desarrollaron con Opti-4CN Substrate (BioRad, Hercules, CA).

Preparación de vesículas de membrana externa (OMV) Las O Vs se prepararon como se describe previamente [Moe GR, Zuno-Mitchell P, Hammond SN, Granoff DM (2002) Sequential immunization with vesicles prepared from heterologous Neisseria meningitidis strains elicits broadly protéctive serum antibodies to group B strains. Infect Immun 70: 6021-6031 ; Bauman SJ, Kuehn MJ (2006) Purification of outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa and their activation of an IL-8 response. Microbes Infect 8: 2400-2408] con modificaciones menores. B. pseudomallei cepa 1026b (BEI Resources) se hizo crecer en caldo LB a 37 °C hasta la fase logarítmica tardía (16-18 h). Las bacterias intactas se sedimentaron por centrifugación a 6,000 x g durante 10 min a 4 °C, y el sobrenadante se removió y se filtró dos veces a través de un filtro de poliétersulfoha (PES) de 0.22 µ?? (Millipore) con el fin de remover cualquier bacteria restante o grandes fragmentos bacterianos. Para asegurar que el sobrenadante estaba libre de bacterias viables, 1 mi de sobrenadante se sembró en agar PIA y se incubó 48-72 h a 37 °C. El sobrenadante filtrado restante se incubó a 4 °C. Las OMVs se recolectaron al agregar lentamente sulfato de amonio sólido 1.5 M (Fisher Scientific) mientras se agitaba suavemente y se incubó durante la noche a 4 °C. Las OMVs se recolectaron por centrifugación a 11 ,000 x g durante 20 min a 4 °C. El sedimento resultante, que consiste en vesículas sin purificar, se resuspendió en 45% de OptiPrep (Sigma) en HEPES 10 mM/0.85% de NaCI, pH 7.4, se esterilizó por filtración a través de un filtro de PES de 0.22 µ?? y se depositó sobre la parte inferior de un tubo de centrifuga. Un gradiente OptiPrep se preparó al depositar lentamente 40%, 35%, 30%, 25%, y 20% de OptiPrep en HEPES-NaCI (p/v) sobre la preparación de OMV sin purificar. Las vesículas de membrana se recolectaron por ultracentrifugación a 1 11 ,000 x g durante 2 h a 4 °C. Fracciones iguales se removieron en secuencia de la parte superior y se almacenaron a 4 °C. Para determinar la pu'reza de las fracciones, 250 µ? de cada una se precipitó con 20% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA). El sedimento resultante se resuspendió en 10 µ? de solución salina regulada de fosfatos (PBS) y 10 µ? de regulador de carga de Laemmli (Bio-Rad), se sometió a ebullición durante 10 min y se cargó en un gel de poliacrilamida SDS-PAGE (4-20% Mini Protean, Bio-Rad) que operó a 200 V. La preparación de OMV de trabajo se recuperó al combinar las fracciones pico (las que contenían la mínima cantidad de fragmentos y contaminantes insolubles) en HEPES 50 mM, pH 6.8 seguido por centrifugación a 111 ,000 x g por 2 h a 4 °C. El sedimento resultante que contenía OMVs se resuspendió en agua libre de LPS (Lonza) y se almacenó a -20 °C. Las OMVs se cuantificaron con un Bradford Protein Assay (Bio-Rad). La microscopía electrónica de crio-transmisión se realizó al utilizar un microscopio electrónico de transmisión JEOL 2010 para confirmar visualmente la presencia de OMVs.

Animales Ratones hembra BALB/c de 8 a 10 semanas de edad se adquirieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y se mantuvieron 5 por jaula en unidades microaisiantes de poliestireno bajo condiciones libres de patógenos. Los animales se alimentaron con alimento de roedores y agua estéril ad libitum y se dejaron aclimatar 1 semana antes de este estudio. Los ratones se sacrificaron por sobredosis de dióxido de carbono.

Desafíos bacterianos Con respecto a la presente descripción, la frase "dosis letal", como se utiliza en este documento, pretende referirse a cualquier cantidad de dosificación que puede ocasionar muerte en un sujeto. En una modalidad preferida de la invención, las presentes composiciones inmunogénicas se utilizan para protegen a un sujeto contra dosis letales de por lo menos una especie de Burkholderia. Se sabe bien que la cantidad de dosificación exacta depende de una diversidad de factores, incluyendo, la especie particular de Burkholderia, la ruta de infección, y el estado inmune y/o de salud del sujeto. Por ejemplo, se sabe bien que la exposición por aerosoles a Burkholderia es más letal para un sujeto humano que cuando Burkholderia se ingiere en el mismo sujeto humano. De esta manera, la dosis letal de Burkholderia en aerosol será inferior a la dosis letal para Burkholderia ingerida en el mismo sujeto humano. Asimismo, se sabe bien que los sujetos comprometidos inmunemente sucumbirán a dosis inferiores de la misma Burkholderia en comparación con sujetos sanos non comprometidos inmunemente. Cantidades ejemplares de dosis letales de Burkholderia varían de 1 c.f.u. a alrededor de de 108 c.f.u.

Desafíos bacterianos— Intraperitoneal (i.p.) Antes del desafio en múridos, B. thailandensis se hizo crecer de manera reciente a partir de reserva congelada en glicerol en caldo LB durante la noche y se diluyó de manera reciente 1 :100 en caldo LB a la mañana siguiente. Las bacterias se hicieron crecer a fase logarítmica y se recolectaron por centrifugación y se diluyeron en 0.9% de NaCI a 1 x 108 unidades formadoras de colonias (cfu)/ml. A cada ratón (N = 6) se administró 100 µ? de bacterias (107 cfu) mediante la ruta i.p. Los ratones se monitorearon para sintomas de malestar dos veces diariamente durante 14 días y los sobrevivientes se sacrificaron al final del estudio. Muestras de sangre se recolectaron mediante punción cardiaca después de la eutanasia. La sangre se dejó coagular durante 30 min a temperatura ambiente y luego se centrifugó a 2300 x g; el suero se recolectó y almacenó a -80 °C hasta su uso. ' Desafíos bacterianos— Aerosol Ratones BALB/c se-desafiaron con 5 x 105 cfu (-LD50) de B. thailandensis o 500 cfu (LD100) de B. pseudomallei al utilizar una cámara de exposición a inhalación sólo por nariz como se describe previamente [West TE, Frevert CW, Liggitt HD, Skerrett SJ (2008) Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonía in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg 102 Suppl 1 : S119-126; orici LA, Heang J, Tate T, Didier PJ, Roy CJ Differential susceptibility of ¡nbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection. Microb Pathog 48: 9-17]. Para la determinación de carga bacteriana pulmonar, los ratones se sacrificaron a las 24 h postdesafío.

Inmunizaciones de EF-Tu Ratones BALB/c (N = 70) se sensibilizaron de manera subcutánea (s.c.) en el día 0 con 25 µg de rEF-Tu purificado en agua libre de LPS adsorbida 1 :1 con adyuvante de hidróxido de aluminio (Alhydrogel 2%, Brenntag, Alemania) en un volumen final de 100 µ? o en forma intranasal (i.n.) con 25 g de rEF-Tu en agua libre de LPS mezclada con 5 pg de adyuvante de oligodesoxinucleótido CpG (ODN) 1826 (Coley, Wellesley, MA) en un volumen final de 9 µ?/fosa nasal. Antes de la inmunización intranasal, los ratones se anestesiaron mediante la ruta i.p. con 0.88 mg/kg de ketamina/xilazina en solución salina en un volumen final de 100 µ?. Los ratones se reforzaron en el día 21 con las mismas formulaciones al utilizar una estrategia de sensibilización/refuerzo homóloga (s.c. + s.c. o i.n. + i.n.) o heteróloga (s.c. + i.n.).

Inmunizaciones de OMV Los ratones se inmunizaron de manera subcutánea con 2.5 µg de OMVs de 8. pseudomallei (Bp) purificadas, resuspendidas en 100 µ? de solución salina en los días 0, 21 , y 42. Los ratones inmunizados simuladamente recibieron 100 µ? de solución salina de manera subcutánea en el mismo calendario. Todos los ratones se desafiaron al día 70 con una dosis letal de' S. pseudomallei (500 cfu) por aerosol, y la supervivencia se monitoreó durante 14 días. Cien por ciento (100%) de los ratones inmunizados simuladamente sucumbieron al desafío dentro de 4 días, al mismo tiempo que el 80% de los ratones inmunizados con OMV sobrevivieron hasta el punto final del estudio y perecieron haberse recuperado completamente cuando se determina por comportamiento/actividad normales y habiendo confirmado la ausencia de bacterias en los pulmones.

Análisis de respuesta de anticuerpos Muestras de sangre de ratones inmunizados y sin contacto previo se recolectaron mediante punción cardiaca después de la eutanasia para la determinación de la concentración de anticuerpos séricos específicos de rEF-Tu. La sangre se dejó coagular durante. 30 min a temperatura ambiente y luego se centrifugó a 2300 x g; el suero se recolectó y almacenó a -80 °C hasta su ensayo. El fluido de lavado broncoalveolar (BAL) se recolectó para la determinación de la concentración de anticuerpos en BAL específicos de rEF-Tu. El fluido de BAL se obtuvo al exponer la tráquea y hacer una pequeña incisión en la cual se insertó y aseguró una aguja de calibre 18. Los pulmones se lavaron de manera repetida al inyectar y retirar lentamente 1 mi de solución salina regulada de fosfatos (PBS) complementada con coctel inhibidor de proteasas Complete (Roche Laboratories, Mannheim, Alemania). El fluido de BAL se almacenó a -80 °C hasta su ensayo. Las concentraciones de IgG, lgG1 , lgG2a, e IgA totales específicas de rEF-Tu en suero y fluido de BAL se analizaron por ensayo inmunoabsorbente asociado a enzimas (ELISA). Placas de microtitulación de 96 pozos se recubrieron con 0.5 µ9 por pozo de rEF-Tu purificado en regulador de recubrimiento (bicarbonato de sodio 0.1 M, carbonato de sodio 0.2 M) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía 0.05% de Tween-20 (PBST). Para la' medición de IgA, las placas se bloquearon adicionalmente con 2% de BSA durante 1 h seguido por tres lavados con PBST. Todas las placas se incubaron con diluciones dos veces en serie de muestras de sueros o BAL durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBST y luego se incubaron con IgG, lgG1 , lgG2a de rata anti-ratón conjugadas con fosfatasa alcalina (AP) (dilución 1 :300 en PBST) (BD Pharmingen) o IgA de cabra anti-ratón conjugada con AP (1 :2000) (Invitrogen) por 1 h a temperatura ambiente. Al final de la incubación, las placas se lavaron tres veces con PBST y se desarrollaron con tabletas de fosfato de p-Nitrofenilo SIGMAFAST (Sigma, St. Louis, MO) disueltas en regulador de dietanolamina (1 mg/ml). Después de 15-30 min de incubación, las soluciones de reacción se detuvieron con NaOH 2 M y se leyeron a 405 nm al utilizar un lector de microplacas Quant y se analizaron con el software Gen5 (BioTek, Winooski, VT). Las concentraciones de anticuerpos se determinaron por regresión no lineal a partir de una curva estándar de lgG1 , lgG2a, e IgA de mieloma de ratón (Sigma) diluidas en serie como estándar en cada placa de ELISA [Glynn A, Freytag LC, Clements JD (2005) Effect of homologous and heterologous prime-boost on the immune response to recombinant plague antigens. Vaccine 23: 1957-1965.]. Los resultados obtenidos se expresan como la concentración media ± el error estándar de la media (SEM).

Ensayo de reestimulación por antlgenos Los ensayos de reestimulación se realizaron con esplenocitos de ratones inmunizados y sin contacto previo para el análisis de respuestas de células T. Los bazos se removieron asépticamente y suspensiones unicelulares de esplenocitos de cada ratón se obtuvieron al hacer pasar los bazos a través de tamices celulares estériles de 40 µ?? (Fisher Scientific; Pittsburgh, PA). Las células se lavaron dos veces con regulador de lavado (medio Advanced RPMI 1640 complementado con 1% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibiótico-antimicótico) (Invitrogen). Los sedimentos de células se resuspendieron en regulador de lavado y se depositaron sobre Histopaque-1119 (Sigma) para el aislamiento de leucocitos mononucleares esplénicos por centrifugación a 300 x g por 15 min. Los leucocitos se recuperaron en la interfase y se lavaron dos veces con regulador de lavado y se resuspendieron en medio Advanced RPMI 1640 complementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico-antimicótico. Las células se cultivaron en placas en una placa de microtitulaclón de 96 pozos a 4 x 105 células /pozo. Los cultivos celulares se estimularon con 1 pg de rEF-Tu, 1 µg de concanavalina A (ConA) (Sigma), o se dejaron sin estimular como controles negativos. Los cultivos se incubaron a 37 °C en 5% de C02, y los sobrenadantes de cultivo celular de cada grupo de tratamiento se recolectaron después de 72 h y se almacenaron a -80° hasta sú uso.

Recuperación de CFU Homogenizados de tejido pulmonar se utilizaron para determinar la carga bacteriana en ratones infectados con aerosoles. Los pulmones se removieron asépticamente, se pesaron y se colocaron individualmente en 1 mi de 0.9% de NaCI y se homogenizaron con un Power Gen 125 (Fisher Scientific). Diluciones en serie diez veces de homogenizados de pulmón se cultivaron en agar LB. Las colonias se contaron después de la Incubación por 2-3 días a 37 CC y se reportaron como cfu por gramo de tejido.

Análisis estadísticos Todos los análisis se realizaron al utilizar GraphPad Prism versión 5.0 (GraphPad Software, Inc. , La Jolla, CA). El análisis estadístico de la producción de citocinas se realizó al utilizar un ANOVA de dos factores, y los análisis de concentraciones de anticuerpos y cargas bacterianas se realizaron al utilizar la prueba de Mann-Whitney. Los valores de P < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

Protocolo detallado de purificación de OMV El propósito de este protocolo es extraer OMV de B. pseudomallei y eliminar otros contaminantes tales como LPS, células bacterianas completas y fragmentos celulares con la ayuda del regulador de gradientes OptiPrep. La esterilización por filtración se utilizó para eliminar células bacterianas completas o grandes fragmentos bacterianos. La precipitación con sulfato de amonio se utilizó como el método preferido para precipitar OMVs de la solución. El protocolo se adaptó de Moe, et al. 2002 (Infect. Immun. Vol. 70 No 1 1 ), Bauman and Khuen 2006 (Microbes and Infection 8 2400e2408) y Horstman and Khuen 2000 (J Biol. Chem. Vol. 275 No. 17).

Este protocolo pretende un sobrenadante de cultivo de 500 mi, el cual debe producir ~0.2 mg/ml de OMV en un volumen total de 300 µ? a 500 µ?. El mejor rendimiento de OMVs se logró con un total de 1 I de sobrenadante de cultivo.

Día 1 : Hacer crecer un cultivo de 5 mi de B. pseudomallei (Bp) durante la noche. Obtener una colonia de B. pseudomallei hecha crecer en una placa de PIA (sembrada a partir de reserva en glicerol) para inocular 5 mi de caldo LB. Hacer crecer durante la noche (O/N), 37 °C, 233 rpm.

Día 2: Hacer una dilución 1 : 100 del cultivo O/N de Bt en 495 mi de caldo LB. Hacer crecer durante 16 horas a fase logarítmica tardfa - fase estacionaria temprana (OD ~6.0), 37 °C, 233 rpm.

Día 3: (a) Sedimentar las células completas de B. pseudomallei al centrifugar a 6,000 x Q (6,300 rpm), 10 min, 4 °C; almacenar los sedimentos bacteriano a -80 °C (según se requiera) para la extracción de WCL, TMP y OMP como se describe previamente; el sobrenadante contiene las OMV; repetir esta etapa (a) una vez más para asegurar que no hay bacterias en el sobrenadante.

Día 3: (b) Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de PES de 0.22 (filtración estéril) Millipore (Cat # SCGPU10RE) para remover cualquier bacteria restante o grandes fragmentos bacterianos. Repetir una vez para asegurar que no hay bacterias en el sobrenadante.

Día 3: (c) Recolectar las vesículas de membrana en el sobrenadante filtrado al agregar lentamente sulfato de amonio sólido 1.5 M ((NH2)4S04) mientras se agita lentamente. Incubar a 4 °C durante la noche.

Las vesículas precipitarán en conjunto con otros contaminantes (el precipitado es de color café oscuro). Obtener 1 mi de la etapa (c) del Día 3 y cultivar en agar PIA. Incubar O/N, 37 °C. No debe haber crecimiento. Permitir que la placa permanezca en la incubadora hasta 48 h (en caso necesario) con el fin de probar que no hay crecimiento bacteriano.

Día 4: (a) Tener la seguridad de que no hay crecimiento en la placa de PIA. El crecimiento bacteriano es un indicador de contaminación bacteriana. (Si no hay crecimiento, proceder con la extracción de OMV).

Día 4: (b) Sedimentar las OMVs por centrifugación a 11 ,000 x g (8,500 rpm), 20 min, 4 °C al utilizar un rotor SLA-1500 (Sorvall); resuspender suavemente los gránulos café oscuro y la mancha de OMV a lo largo del lado del tubo de centrífuga en 45% de OptiPrep (Sigma) en HEPES 10 m /0.85% de NaCI, pH 7.4 (HEPES-NaCI peso/volumen) en un volumen total de 4 mi.

Día 4: (c) Para remover cualquier grumo del sedimento, esterilizar por filtración a través de un filtro de 0.45 um (Millipore, sistema de filtración de tubos cómicos de 50 mi) como se describe previamente. Esta es la preparación de vesículas sin purificar.

Día 4: (d) Para obtener preparación de OMV libres de restos: Un gradiente OptiPrep se prepara de la siguiente manera: Depositar en la parte inferior de una botella de centrífuga de 26.3 mi (Beckman Coulter, 355618) los 4 mi de OMV sin purificar de la etapa d. Entonces depositar muy suave y lentamente sobre 4 mi de 40%, 4 mi de 35%, 6 mi de 30%, 4 mi de 25%, y 4 mi de 20% de OptiPrep en HEPES-NaCI (p/v). Las diferencias en los gradientes reflejan la optimización en la separación de flagelos y otro material soluble de las vesículas. Ultracentrifugar los gradientes para recolectar las vesículas de membrana, al utilizar una Beckman Coulter Ultracentrífuge, Rotor Type 52.1 Ti, 111 ,000 x g (35,000 rpm) por 2 h,;4 °C.

Día 4: (e) Fracciones de cuatro mi (4 mi) se remueven suavemente y en secuencia de la parte superior, y se almacenan en tubos de 15 mi a 4 °C (o continuar a las siguientes etapas: Analysis de fracciones de OMV para pureza, y Protocolo TCA).

Analysis de fracciones de OMV para pureza Una porción de cada fracción de OMV (~1 mi de cada fracción del protocolo de purificación de OMV, anterior) se tomó para precipitar las OMVs con 20% de ácido tricloroacético (TCA). Las OMVs precipitadas pueden visualizarse por transferencia western, con los geles teñidos con Coomasie o plata.

Protocolo de TCA Soluciones de reserva: 20% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA); 1) Agregar 1 volumen de 20% de TCA a 4 volúmenes de muestra de proteína (es decir, en tubo de 1.5 mi con vol. máximo, agregar 125 µ? de 20% de TCA a muestra de 1.5 mi mientras se trabaja en hielo); 2) Incubar 10 min a 4 °C; 3) Centrifugar tubo en micro-centrifuga a 13,000 rpm, 5 min, TA; 4) Remover sobrenadante, dejando el sedimento intacto. El sedimento debe formarse a partir de ppt esponjosas blanquecinas; 5) Lavar sedimento con 200 µ? de acetona fría; 6) Centrifugar tubo en micro-centrifuga a 13,000 rpm, 5 min; 7) Repetir etapas 4-6 para un total de 2 lavados de acetona; 8) Secar el sedimento por 5-10 min para evaporar la acetona. El sedimento blanco puede volverse translúcido; 9) Para SDS-PAGE, Resuspender el sedimento en 20 µ? de regulador de muestra de carga de Laemlli que contiene beta-mercapto-etanol (o DTT 100 mM) y hervir la muestra por 7 min. Permitir que la muestra se enfrie, hacer una rápida centrifugación y cargar los 20 µ? en un gel de poly-acrilamida como se describe previamente para la tinción de Coomasie; 10) Recoger las fracciones con la mínima cantidad de contáminantes o material insoluble. Las fracciones deseadas se combinaron y concentraron en una columna de desalación de 100 kD (Milipore) al centrifugar a 2300 x g, 25 min, 4 °C. Una centrifugación final se realizó al utilizar 2 mi de agua libre de LAL LPS para remover cualquier reactivo residual de Opti-Prep. La preparación de vacunación de O V final se encuentra en agua libre de LPS y se almacena a -20 °C en alícuotas para evitar ciclos frecuentes de congelación/descongelación.

EJEMPLO 1 Identificación de EF-Tu como candidato de vacunación potencial para B. pseudomallei Una estrategia de inmunoproteómica [Rappuoli R (2000) Reverse vaccinology. Curr Opin Microbiol 3: 445-450] se empleó para identificar novedosas proteínas inmunogénicas de Burkhplderia que pudieran seleccionarse posteriormente por su capacidad para suscitar respuestas de anticuerpos y de CMI. Para ese momento, los antisueros contra B. pseudomallei no estaban disponibles. Por lo tanto, antisueros combinados de conejos inmunizados con 6. mallei se utilizaron para examinar un lisado de células completas de B. thailandensis que se separó por electroforesis en gel 2D (Figura 1A, que muestra gel teñido con rubí SYPRO). Estaba la hipótesis de que las proteínas compartidas por B. mallei, B. pseudomallei, y B. thailandensis podrían detectarse por esta estrategia debido a la extensa homología entre las tres especies [Kim HS, Schell MA, Yu Y, Ulrich RL, Sarria SH, et al. (2005) Bacterial genome adaptation to niches: divergence of the potential virulence genes in three Burkholderia species of different survival strategies. BMC Genomics 6: 174]. La inmunotransferencia reveló más de 100 proteínas inmunoreactivas de las cuales se seleccionaron en forma aleatoria 16 puntos para identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF (Figura 1 B, que muestra transferencia Western realizada al utilizar sueros policlonales de conejo anti-S. mallei (dilución 1 :200), seguido por IgG de cabra anti-conejo conjugada con HRP (1 :2000) y detectado con sustrato Opti-4CN (BioRad)). Ninguno de los puntos seleccionados se detectó al utilizar antisueros de conejos sin contacto previo. Once proteínas se identificaron con éxito y comparten 96-100% de identidad de aminoácidos entre las tres especies de Burkholdería (Tabla 1). La TABLA 1 muestra la función putativa y porcentaje de identidad para B. pseudomallei K96243 y B. mallei ATCC 23344 al nivel de aminoácidos. Las proteínas mostradas en negritas en la TABLA 1 también se identificaron por Harding et al. al utilizar una estrategia similar; "*" indica sin identificar por espectrometría de masas; "No presente" indica que no se acotó ortólogo conocido en la base de datos de genómica del NCBI.

Tres de las proteínas, EF-Tu, AhpC, y DnaK, se reconocieron previamente como antfgenos potenciales de B. pseudomallei al utilizar una estrategia similar con suero humano en estado convaleciente [Harding SV, Sarkar-Tyson M, Smither SJ, Atkins TP, Oyston PC, et al. (2007) The Identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine 25: 2664-2672]. De manera sorprendente, una de las proteínas inmunogénicas identificadas por ambos estudios fue EF-Tu. EF-Tu se conoce mejor por su función en la síntesis de proteínas bacterianas, donde funciona como GTPasa para catalizar la transferencia de aminoacil-tRNAs al ribosoma [Yokosawa H, Inoue-Yokosa a N, Arai Kl, Kawakita M, Kaziro Y (1973) The role of guanosine triphospüate hydrolysis in elongation factor Tu-promoted binding of aminoacyl transfer ribonucleic acid to ribosomes. J Biol Chem 248: 375-377]. Sin embargo, evidencia convincente soporta funciones adicionales para EF-Tu, incluyendo funciones como adhesina e invasina bacteriana para varias bacterias patogénicas [Kunert A, Losse J, Gruszin C, Huhn M, Kaendler K, et al. (2007) Immune evasión of the human pathogen Pseudomonas aeruginosa: elongation factor Tuf is a factor H and plasminogen binding protein. J Immunol 179: 2979-2988; Balasubramanian S, Kannan TR, Baseman JB (2008) The surface-exposed carboxyl región of Mycoplasma pneumoniae elongation factor Tu interacts with fibronectin. Infect Immun 76: 31 16-3123; Balasubramanian S, Kánnan TR, Hart PJ, Baseman JB (2009) Amino acid changes in elongation factor Tu of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium influence fibronectin binding. Infect Immun 77: 3533-354.1 ; Barel M, Hovanessian AG, Meibom K, Briand JP, Dupuis M, et al. (2008) A novel receptor - ligand pathway for entry of Francisella tularensis in monocyte-like THP-1 cells: interaction between surface nucleolin and bacterial elongation factor Tu. BMC Microbiol 8: 145].

EJEMPLO 2 EF-Tu de Burkholderia se asocia a membrana y se reconoce durante la infección natural.

Trabajo anterior sugiere que EF-Tu de B. pseudomallei se presenta en la superficie bacteriana y se reconoce por sueros en estado convaleciente de pacientes humanos con melioidosis [Harding SV, Sarkar-Tyson M, Smither SJ, Atkins TP, Oyston PC, et al. (2007) The Identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine 25: 2664-2672]. De esta manera, la hipótesis fue que EF-Tu puede representar un novedoso antígeno inmunoprotector. Para determinar si EF-Tu se reconoce durante la infección en el modelo múrido de melioidosis, un grupo de ratones BALB/c (N = 6) se infectó de manera intraperitoneal (i.p.) con 107 cfu de B. thailandensis y se recolectaron sueros de los sobrevivientes dos semanas después. Los sueros combinados de ratones infectados reconocieron la preparación purificada recombinante de EF-Tu (rEF-Tu) (Figuras 2A y B), mientras los sueros de ratones sin infectar no lo hicieron (no mostrado). La Figura 2A es un gel teñido con coomassie de afinidad de rEF-Tu purificada bajo condiciones nativas por purificación por lotes de agarosa Ni-NTA (MW = marcador de pesos moleculares BenchMark Pre-stained; lisado de células completas (WCL) = 5 µg; Flujo directo (FT) = 5 g¡ Lavados 1 , 3, y 5 con imidazol 20 mM (W1 , W2, W3); Eluciones 1 y 2 con imidazol 250 mM (E1 , E2) = 5 g). La Figura 2B es una transferencia Western - de 10 µg de rEF-Tu examinado con sueros combinados de ratones BALB/c infectados i.p. con 107 cfu de B. thailandensis (1o Ac, 1 :200; 2o Ac 1 : 1000; MW = marcador de pesos moleculares BenchMark Pre-stained). Esto indica que EF-Tu se expresa durante la infección y se reconoce por el anticuerpo hospedador en el modelo de ratón. Adicionalmente, estas observaciones indican que el anticuerpo del hospedador generado para EF-Tu nativo durante la infección bacteriana reacciona cruzado con rEF-Tu. Para determinar si rEF-Tu puede inducir anticuerpos que reconocen el EF-Tu nativo, un grupo de ratones BALB/c (N = 6) se inmunizó de manera subcutánea con 25 g de rEF-Tu adsorbido a adyuvante de hidróxido de aluminio y se reforzaron con la misma formulación en el día 21. En el día 35, los sueros se recolectaron, combinaron y purificaron por afinidad para inmunotransferencia de rEF-Tu, así como fracciones de células completas y proteínas de membrana totales de B. thailandensis. Sueros combinados de ratones inmunizados con rEF-Tu reconocieron la forma recombinante de 47 kDa de EF-Tu, así como EF-Tu nativa en el lisado de células completas y fracción de membrana total (Figura 2C: transferencia Western de 0.5 de rEF-Tu, fracciones de 15 g de lisado de células completas (WCL) de B. thailandensis y 15 µg de proteína de membrana total (TMP) de B. thailandensis examinadas con antisueros combinados de ratones inmunizados con rEF-Tu (1o Ac, 1 :200; 2o Ac, 1 :1000); MW = marcador de pesos moleculares SeeBlue Plus2). Las bandas se cortaron, digirieron y analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF para confirmar su identidad. Ninguna de las proteínas EF-Tu se detectó por transferencia Western al utilizar sueros combinados de ratones BALB/c sin contacto previo (no mostrado). Para descartar contaminación con EF-Tu citoplásmico en la fracción de membrana, un anticuerpo monoclonal contra la subunidad ß de RNA polimerasa de E. coli (NeoClone) se utilizó para examinar fracciones celulares de E. coli preparadas exactamente en la misma forma que B. thailandensis. Una banda a 150 kDa correspondiente a la subunidad ß se observó en el lisado de células completas y estuvo ausente en la preparación de membrana total (Figura 2D: transferencia Western de 0.5 µg de rEF-Tu, fracciones de 15 µg de WCL de E. coli y 15 µg de TMP de E. coli examinadas con anticuerpo monoclonal para la subunidad ß de RNA Polimerasa de E. coli (1o Ac, 1 :1000; 2? Ac, 1 :1000); MW = marcador de pesos moleculares SeeBlue Plus2), lo que indica que la preparación de membrana se encuentra libre de contaminación citoplásmica.

EJEMPLO 3 EF-Tu de Burkholderia se secreta en vesículas de membrana externa.

Se ha demostrado EF-Tu en la superficie de varias bacterias patogénicas, incluyendo B. pseudomallei y la Pseudomonas aeruginosa estrechamente relacionada [Harding SV, Sarkar-Tyson M, Smither SJ, Atkins TP, Oyston PC, et al. (2007) The Identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine 25: 2664-2672; Kunert A, Losse J, Gruszin C, Huhn M, Kaendler K, et al. (2007) Immune evasión of the human pathogen Pseudomonas aeruginosa: elongation factor Tuf is a factor H and plasminogen binding protein. J Immunol 179: 2979-2988]. Sin embargo, los intentos para demostrar EF-Tu en la superficie de Burkholderia thailandensis al utilizar etiquetado por inmuno oro y microscopía inmunofluorescente no tuvieron éxito. EF-Tu carece de una secuencia señal reconocible y el mecanismo por el cual EF-Tu se transporta a la superficie bacteriana sigue siendo un enigma. Trabajo reciente con OMVs bacterianas ha demostrado que las OMVs contienen numerosos factores de virulencia, incluyendo constituyentes citoplásmicos, periplásmicos y de membrana externa [Amano A, Takeuchi H, Furuta N Outer membrane vesicles function as offensive weapons in host-parasite interactions. Microbes Infect]. Por lo tanto, se consideró la posibilidad de que EF-Tu, una proteína bacteriana abundante, pudiera secretarse en las OMVs. Las OMVs se prepararon a partir de un cultivo logarítmico tardío de B. pseudomallei cepa 1026b (Figura 3A: Microfotografía electrónica de crio-transmisión de OMVs purificadas preparadas a partir de un cultivo logarítmico tardío de B. pseuodomallei cepa 1026b, donde la barra indica 100 nm; y Figura 3B: Gel teñido con Coomassie de preparación de OMVs (5 pg); MW = marcador de pesos moleculares SeeBlue plus2) y examinado con anticuerpos purificados por afinidad para EF-Tu. La presencia? de EF-Tu en OMVs de B. pseudomallei se detectó (Figura 3C: transferencia Western de preparación de OMV al utilizar anticuerpo para EF-Tu purificado por afinidad (1 :1000)), el cual puede contribuir parcialmente a la exportación de EF-Tu desde el citoplasma bacteriano.

EJEMPLO 4 La inmunización por mucosas y parenteral con EF-Tu produce IgG e IgA específicas de antígeno. La capacidad de rEF-Tu para generar IgG específica de antígeno que reconoce la forma nativa de EF-Tu indica su uso potencial como inmunógeno de vacunación. Por lo tanto, una estrategia de inmunización por mucosas y parenteral se diseñó para medir y comparar las respuestas de anticuerpos y CMI suscitadas por la inmunización con rEF-Tu. Grupos de ratones BALB/c (n = 12) se sensibilizaron ya sea de manera subcutánea (s.c.) con 25 g de rEF-Tu adsorbido a hidróxido de aluminio, o en forma intranasal (i.n.) con 25 µ? de rEF-Tu y 5 g de CpG ODN 1826. CpG ODN es un ligando de TLR9 bien caracterizado que puede administrarse en forma parenteral o por mucosas para activar respuestas inmunitarias de tipo 1 [Freytag LC, Clements JD (2005) Mucosal adjuvants. Vaccine 23: 1804-1813; Klinman DM, Klaschik S, Sato T, Tross D (2009) CpG oligonucíeotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases. Adv Drug Deliv Rev 61 : 248-255] y puede incrementar la eficacia de vacunación contra B. pseudomallei [Harland DN, Chu K, Haque A, Nelson M, Walker NJ, et al. (2007) Identification of a LolC homologue in Burkholderia pseudomallei, a novel protective antigen for melioidosis. Infect Immun 75: 4173-4180; Chen YS, Hsiao YS, Lin HH, Liu Y, Chen YL (2006) CpG-modified plasmid DNA encoding flagellin improves immunogenicity and provides protection against Burkholderia pseudomallei infection in BALB/c mice. Infect Immun 74: 1699-1705; Elvin SJ, Healey GD, Westwood A, Knight SC, Eyles JE, et al. (2006) Protection against heterologous Burkholderia pseudomallei strains by dendritic cell immunization. Infect Immun 74: 1706-171 1]. Adyuvante solo (n = 5) y ratones sin contacto previo (n = 12) se incluyeron como controles. Los ratones se reforzaron en el día 21 con las mismas formulaciones al utilizar estrategias de sensibilización/refuerzo homóloga (s.c. + s.c; i.n. + i.n.) y heteróloga (s.c. + i.n.). Sueros y fluido de BAL de la mitad (n = 6) de los animales en los grupos inmunizado y sin contacto previo se recolectaron en el día 35 y se analizaron para reactividad con rEF-Tu por ELISA.

Las concentraciones séricas de IgG e IgA especificas de antígeno fueron significativamente superiores en todos los grupos inmunizados en comparación con sueros de ratones sin contacto previo (Figuras 4A y 4B; P < 0.OOT IgG (A) e IgA (B) séricas medidas por ELISA). Los ratones s.c. + s.c. produjeron las concentraciones más altas de IgG sérica específica de EF-Tu, mientras los ratones i.n. + i.n. produjeron las concentraciones más bajas entre los grupos inmunizados. En contraste, la inducción de IgA sérica especifica de EF-Tu sólo se observó en los ratones i.n. + i.n. (Figura 4B). La IgG e IgA específicas de antígeno en el BAL fueron significativamente superiores en todos los grupos inmunizados en comparación con BAL de ratones sin contacto previo (P < 0.001 ). El grupo s.c. + s.c. produjo las mayores concentraciones de IgG de BAL específica de EF-Tu (Figura 4C- IgG de BAL medida por ELISA). La IgA especifica de EF-Tu fue más de 100 veces superior en el BAL que en el suero de animales inmunizados independientemente de la ruta de inmunización. La concentración media de IgA de BAL específica de EF-Tu fue la más alta en el grupo s.c. + i.n., aunque no fue estadísticamente diferente de los otros grupos inmunizados (Figura 4D- IgA de BAL medida por ELISA). La IgG (Figura 4A) e IgA (Figura 4B) séricas e IgG (Figura 4C) e IgA (Figura 4D) de BAL se midieron por ELISA. SC = inmunización subcutánea con 25 µg de rEF-Tu adsorbido 1 :1 con adyuvante de hidróxido de aluminio. IN = inmunización intranasal con 25 ig de rEF-Tu mezclado con 5 pg de adyuvante CpG. La línea horizontal representa el valor, medio para cada grupo (N = 6). Los valores medios se proporcionan en paréntesis para grupos IN + IN y sin contacto previo en los paneles A y C. (*P < 0.05, **P < 0.01 , ***P < 0.001 al utilizar la prueba de ann-Whitney).

Además, lgG1 e lgG2a en el suero y BAL se analizaron para comprobar alguna diferencia en las respuestas inmunitarias tipo 1 y tipo 2 suscitadas en cada grupo. Los ratones inmunizados s.c. + s.c. demostraron relaciones lgG1 :lgG2a de 5.6 y 140 en los sueros y BAL, respectivamente (TABLA 2). lgG1 e lgG2a se midieron por ELISA al utilizar sueros y BAL de ratones inmunizados (N = 6). Las relaciones lgG1 :lgG2a > 1 indican una respuesta inmunitaria humoral tipo 2, mientras las relaciones < 1 indican un respuesta inmunitaria celular tipo 1.

La predominancia de lgG1 es más característica de una respuesta inmunitaria tipo 2 [DuBois AB, Freytag LC, Clements JD (2007) Evaluation of combinatorial vaccines against anthrax and plague in a murine model. Vaccine 25: 4747-4754]. Los ratones inmunizados s.c. + i.n. e i.n. + i.n. mostraron relaciones de lgG1 :lgG2a séricas de 1.5 y 0.004, respectivamente, y demostraron un cambio de lgG1 a lgG2a en el BAL también (Tabla 2). Estos resultados indican la generación de una respuesta inmunitaria tipo 1 más fuerte en los grupos inmunizados por mucosas versus los inmunizados en forma parenteral.

EJEMPLO 5 Respuestas de citocinas Th1 y Th2 en esplenocitos reestimulados con EF-Tu Una respuesta CMI impulsada por T , a la par de la producción de anticuerpos específicos, probablemente es esencial para la eficacia de vacunación contra B. pseudomallei [Haque A, Chu K, Easton A, Stevens MP, Galyov EE, et al. (2006) A live experimental vaccine against Burkholderia pseudomallei elicits CD4+ T cell-mediated immunity, priming T cells specific for 2 type III secretion system proteins. J Infecí Dis 194: 1241-1248; Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED (2005) Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholderia pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Inimun 73: 5945-5951]. Para valorar las respuestas de células T específicas de antígenos en ratones inmunizados con rEF-Tu, se recolectaron bazos en el día 35 (2 semanas post-inmunización) y se restimularon in vitro con rEF-Tu. Los sobrenadantes de cultivos celulares se analizaron en el día tres para producción de IFN-? e IL-5 como indicación de respuestas Th1 y Th2, respectivamente. Los ratones que se inmunizaron s.c + s.c. produjeron niveles significativamente superiores de IL-5 en comparación con animales sin contacto previo (Figura 5A; P < 0.05) con la reestimulación con rEF-Tu. En contraste, los ratones que recibieron una dosis de rEF-Tu s.c. y ambos grupos de ratones reforzados por mucosas (s.c. + i.n. e i.n. + i.n.) produjeron niveles similares de IL-5 en comparación con ratones sin contacto previo (FIG. 5A). Ambos grupos que se reforzaron por mucosas (s.c. + i.n. e i.n. + i.n.) produjeron niveles superiores de IFN-? que los ratones que se inmunizaron en forma parenteral (s.c. solamente y s.c. + s.c.) y ratones sin contacto previo (Figura 5B), aunque este incremento no fué estadísticamente significativo. Para los datos de las Figuras 5A y B, los esplenocitos de ratones individuales en cada grupo de tratamiento (N = 6) se reestimularon por triplicado con rEF-Tu (1 pg) o ConA (Vpg) o se dejaron sin estimular, y los sobrenadantes de cultivo celular se analizaron por duplicado en el día 3 para producción de citocinas IL-5 (Figura 5A) e IFN-? (Figura 5B) al utilizar un ensayo multiplex. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) para cada grupo (*P < 0.05 al utilizar una ANOVA de dos factores).

EJEMPLO 6 La inmunización por mucosas con EF-Tu reduce la carga bacteriana en el pulmón Ratones inmunizados con EF-Tu se desafiaron con B. thailandensis como medida preliminar de capacidad protectora en un sistema de prueba in vivo. B. thailandensis no se considera un patógeno de humanos, sin embargo, es letal en cepas consanguíneas de ratones (BALB/c y C57BI/6) en dosis de desafío con aerosoles de 1 x 105 cfu o superiores [West TE, Frevert CW, Liggitt HD, Skerrett SJ (2008) Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonía in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg 102 Suppl 1: S119-126; Morici LA, Heang J, Tate T, Didier PJ, Roy CJ Differential susceptibility of inbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection. Microb Pathog 48: 9-17]. Por lo tanto, los ratones (N = 5-6) se desafiaron en grupos inmunizado, adyuvaníe solamente, y sin contacto previo con 5 x 105 cfu (~LD50) de B. thailandensis por aerosol en el día 35. Todos los ratones se sacrificaron 24 h después para valorar las cargas bacterianas pulmonares dado que hay una correlación directa entre la carga bacteriana pulmonar y progresión de enfermedad en este modelo de neumonía aguda [West TE, Frevert CW, Liggitt HD, Skerrett SJ (2008) Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonía in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg 102 Suppl 1 : S119-126; Morid LA, Heang J, Tate T, Didier PJ, Roy CJ Differential susceptibility of inbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection. Microb Pathog 48: 9-17]. Los ratones que se sensibilizaron s.c. y reforzaron s.c. o i.n. (s.c. + s.c, s.c. + i.n.) tuvieron cifras similares de bacterias en los pulmones en comparación con los ratones control (Figura 6). Cargas bacterianas significativamente inferiores en los tejidos pulmonares se observaron en los ratones i.n. + i.n. en comparación con los grupos de adyuvante solo (CpG) y sin contacto previo (P < 0.05; Figura 6). Para la Figura 6, las cargas bacterianas pulmonares (cfu/g de tejido) se determinaron en ratones sin contacto previo (N = 6), adyuvante solo (N = 5), e inmunizados (N = 6) 24 h post-desafío con aerosoles con 5 x 105 cfu (~LD50) de B. thailandensis. SC = inmunizado de manera subcutánea; IN = inmunizado en forma intranasal. La linea horizontal representa la media geométrica para cada grupo. (*P < 0.05 al utilizar la prueba de Mann-Whitney). No obstante, los ratones BALB/c inmunizados con EF-Tu/CpG (n=4) no se protegieron del desafío letal con aerosoles con B. pseudomallei (500 cfu), como se muestra por la Figura 9.

EJEMPLO 7 Las inmunizaciones subcutánea y por mucosas con OMVs de B. pseudomallei inducen una robusta respuesta de IgG Los ratones se inmunizaron de manera subcutánea (SC) o en forma intranasal (IN) con 2.5 pg de OMVs purificadas de B. pseudomallei (Bp) o 2.5 pg de OMV de E. coli, administradas en forma intranasal— "Ec IN" en los días 0, 21 (primer refuerzo), y 42 (segundo refuerzo). Los ratones sin contacto previo no se trataron. Antes de la inmunización intranasal, los ratones se anestesiaron mediante la ruta i.p. con 0.88 mg/kg de ketamina/xilazina en solución salina en un volumen final de 100 µ?. Como se muestra in Figura 7, los ratones inmunizados con Bp OMVs ya sea de manera subcutánea o en forma intranasal demostraron robustas respuestas de IgG especifica de Bp OMV después del el primer refuerzo (columnas a la izquierda) que se incrementaron aproximadamente 1 logaritmo después del segundo refuerzo (columnas a la derecha). En contraste, los ratones sin contacto previo y ratones inmunizados con Ec OMVs no produjeron ninguna IgG detectable que reconociera las Bp OMVs. Esto demuestra que la producción de anticuerpos para las Bp OMVs es altamente específica y no parece tener reacción cruzada con OMVs de otras bacterias Gram negativas tal como E. coli.

Con el fin de determinar si las OMVs puede suscitar la protección, los ratones se inmunizaron de manera subcutánea con Bp OMV o simulación (solución salina solamente) y se desafiaron en el día 70 con una dosis letal de B. pseudomallei (500 cfu) por aerosol, y la supervivencia se monitoreó por 14 días. Cien por ciento (100%) de los ratones inmunizados simuladamente (n = 7) sucumbieron al desafío dentro de 4 días, al mismo tiempo que (inesperadamente) el 80% de los ratones inmunizados con OMV sobrevivieron hasta el punto final del estudio y perecieron haberse recuperado completamente cuando se determina por comportamiento/actividad normales y habiendo confirmado la ausencia de bacterias en los pulmones (Figura 10).

De esta manera, las OMVs preparadas a partir de por lo menos una Burkholderia spp. representan un inmunógeno útil que puede conferir protección contra infecciones por Burkholderia, y la inmunización con estas OMVs representa un método útil para evitar y posiblemente prevenir infecciones por Burkholderia en animales (incluyendo humanos).

EJEMPLO 8 Burkholderia pseudomallei, y otros miembros de Burkholderia, se encuentran entre las especies bacterianas más resistentes a antibióticos encontradas en las infecciones en humanos. Las tasas de mortalidad asociadas con la infección severa por B. pseudomallei se aproximan a 50% a pesar del tratamiento terapéutico. Una vacuna protectora contra S. pseudomallei puede reducir dramáticamente la morbilidad y mortalidad en áreas endémicas y proporcionar una medida preventiva para E.U. y otros países contra un ataque biológico con este organismo.

Este estudio ejemplar investiga la inmunogenicidad y eficacia protectora de vesículas de membrana externa (OMVs) derivadas de B. pseudomallei Las vesículas se producen por bacterias Gram negativas y Gram positivas y contienen muchos de los productos bacterianos reconocidos por el sistema inmune del hospedador durante la infección. Este estudio ejemplar demuestra que la inmunización subcutánea (SC) con OMVs proporciona una protección significativa contra un desafio con aerosoles de B. pseudomallei de otra manera letal en ratones BALB/c. Los ratones inmunizados con OMVs de B. pseudomallei mostraron respuestas de anticuerpos séricos y memoria de células T especificas de OMV. Adicionalmente, la inmunidad mediada por OMV parece específica de especie dado que no se generaron anticuerpos y células T de reacción cruzada en ratones inmunizados con OMVs derivadas de Escherichia coli. Estos resultados proporcionan la primera evidencia convincente de que las OMVs representan una formulación de vacunación sin viabilidad que es capaz de producir inmunidad protectora humoral y celular contra una bacteria intracelular en aerosol. Esta plataforma de vacunación constituye una estrategia de inmunización segura y poco costosa contra B. pseudomallei que puede explotarse para otros patógenos respiratorios intracelulares, incluyendo otras Bur holderia y bacterias capaces de establecer una infección persistente.

Introducción El género Burkholderia abarca un gran grupo de bacterias Gram negativas ubicuas, patogénicas para plantas y animales. Los miembros de Burkholderia responsables de enfermedad humana incluyen el complejo oportunista Burkholderia cepacia (Bcc), incluyendo S. cenocepacia y B. multivorans, que han emergido como causas significativas de infección pulmonar fatal en individuos con fibrosis qulstica en Estados Unidos, Canadá, y Europa [1]. Burkholderia mallei, el agente etiológico del muermo, es un patógeno obligado de mamíferos que infecta principalmente animales ungulados, pero se han documentado severos casos en humanos [2]. Por último, la bacteria intracelular facultativa B. pseudomallei es el agente causante de la melioidosis, una enfermedad emergente responsable de una morbilidad y mortalidad significativas en el sureste de Asia y norte de Australia [3,4]. Aunque la mayor parte de los casos reportados de infección por B. pseudomallei se restringen a estas regiones geográficas, el organismo tiene una distribución global mucho mayor y los casos humanos probablemente no están reportados por completo [5], La infección natural con Burkholderia puede presentarse a través de de inoculación subcutánea, ingestión o inhalación de la bacteria. Las manifestaciones clínicas pueden ser inespectficas, ampliamente variables, y a menudo dependen de la ruta de inoculación y el estatus inmune del hospedador [3]. Las infecciones por Burkholderia de manera inherente son difíciles de tratar debido a su resistencia a múltiples antibióticos, formación de biopelículas, y establecimiento de infección intracelular y crónica en el hospedador. Medidas preventivas tal como la inmunización activa pueden reducir dramáticamente la incidencia global de enfermedad; sin embargo actualmente no hay una vacuna comercialmente disponible contra ningún miembro de Burkholderia [6].

En años recientes, una serie de estrategias de vacunación contra B. pseudomallei y B. mallei se han explorado debido a la amenaza potencial de estos organismos como agentes para armas biológicas. No ha surgido un candidato ideal a partir de estudios pre-cltnicos [7]. Para B. pseudomallei, las preparaciones de células completas inactivadas y cepas vivas atenuadas son altamente ¡nmunogénicas y demuestran protección parcial a total en modelos múridos [7-10]. Sin embargo, problemas de seguridad y la contraindicación para su uso en individuos inmunocomprometidos limita la utilidad de tales vacunas para uso humano. Estrategias más seguras alternativas a la vacunación incluyen el uso de preparaciones purificadas de lipopolisacárido (LPS), polisacárido capsular (CPS), o vacunas de subunidades basadas en proteínas. Estudios con LPS y CPS de B. pseudomallei han demostrado altos grados de protección de corto plazo mediada por anticuerpos con inmunización activa y pasiva [11-14]. Sin embargo, la incapacidad de estos antígenos independientes de células T para conferir inmunidad esterilizante es problemática. Vacunas conjugadas polisacárido-protelna que promueven las respuestas inmunitarias dependientes de células T pueden mejorar la eficacia, pero el alto costo y habilidad técnica asociados con tales vacunas puede explicar la actual ausencia de estudios de inmunización activa en la literatura [7]. Estrategias de subunidades de proteínas han producido grados variables de protección contra la infección sistémica por B. pseudomallei pero han probado ser ineficaces o no se han probado contra un desafío por inhalación [15-18]. La infección pulmonar con B. pseudomallei es altamente letal en humanos y modelos animales y ha sido difícil particularmente prevenir por vacunación hasta el momento [7,19]. Una vacuna exitosa contra B. pseudomallei, como con otras bacterias intracelulares, probablemente requerirá la inducción de respuestas humoral e inmune mediada por células (CMI) para una protección y erradicación completa de las bacterias persistentes [20]. Adicionalmente, la vacuna debe ser segura y eficaz contra la infección en múltiples rutas.

En este documento se reporta una estrategia de inmunización contra B. pseudomallei que utiliza vesículas de membrana externa (OMVs) derivadas de bacterias. Las OMVs se producen en forma constitutiva por bacterias Gram negativas in vivo e in vitro y a menudo se enriquecen en factores de virulencia y agonistas de receptores similares a Toll (TLR) [21-23]. La producción de vesículas también se ha observado en hongos y bacterias Gram positivas lo que destaca la conservación de este proceso entre los microbios, aunque los mecanismos de secreción difieren probablemente [21]. El uso de vacunas basadas en vesículas de membrana gana interés rápidamente, y la protección mediada por vesículas contra el desafio bacteriano por mucosas y sistémico se ha demostrado para Neisseria meningitides [24], Bordetella pertussis [25], Salmonella typhimurium [26], Vibrio cholerae [27], y más recientemente Bacillus anthracis [28]. En estudios en ratones, la eficacia de las vacunas de vesículas ha variado de 33% de protección contra B. anthracis [28] a casi 100% de protección contra V. cholerae [27]. Las OMVs de N. meningitidis serogrupo B adsorbidas a adyuvante de aluminio están aprobadas para uso humano y proporcionan 80% de eficacia protectora contra la enfermedad invasiva severa [24]. En este caso, la protección está mediada por anticuerpos bactericidas séricos dirigidos contra antígenos de superficie de Neisseria lo que de esta manera promueve la opsonización bacteriana y eliminación mediada por complemento [29].

Este estudio ejemplar demuestra que la inmunización con OMVs de B. pseudomallei proporciona una protección significativa contra un desafío con aerosoles letal en un modelo múrido de melioidosis. Las vesículas de membrana representan una plataforma de vacunación eficaz contra otros patógenos ¡ntracelu lares en aerosol, incluyendo los que establecen una infección persistente.

Cepas bacterianas y cultivo B. pseudomallei cepa 1026b se obtuvo de BEI Resources. Escherichia coli cepa M15 se obtuvo de Qiagen. Las bacterias se cultivaron a partir de reservas en glicerol inmediatamente antes de su uso y colonias únicas se seleccionaron a partir de placas de agar LB recién cultivadas. Cultivos de toda la noche se diluyeron 1 :100 en LB reciente y se incubaron con agitación a 37 °C hasta que la OD600 alcanzó 0.75 para experimentos de desafío.

Preparación y caracterización de vesículas de membrana externa (OMV) Las OMVs se purificaron como se describe previamente por ejemplo en Nieves, W. et al., PLoS One, 5(12):314361 (2010), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Un procedimiento ejemplar para preparar y purificar OMVs de acuerdo con la invención se ilustra en la Figura 20 y se describe, por ejemplo, en Kulp, A. et al., Annu. Rev. Microbiol., 64: 163-184 (2010), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. OMVs combinadas se desalaron y concentraron al utilizar una columna de desalación de 100 kDa Amicon (Millipore) siguiendo el protocolo del fabricante. Las OMVs entonces se lavaron y resuspendieron en agua libre de LPS. Las OMVs se cuantificaron con un Bradford Protein Assay (Bio-Rad). La microscopía electrónica de crio-transmisión se realizó al utilizar un microscopio electrónico de transmisión JEOL 2010 para confirmar visualmente la presencia y pureza de OMVs. Para análisis de LC-MS, 100 g de OMVs se separaron por SDS-PAGE y las bandas del gel se cortaron manualmente en piezas y se enjuagaron dos veces con bicarbonato de amonio 25 mM en 50% de acetonitrilo por 20 min. Las proteínas se digirieron con tripsina (~1 g por banda) en bicarbonato de amonio 25 mM a 37 °C durante la noche (-16 h). Los péptidos se extrajeron al agregar 100 µ? de regulador de extracción (0.1% de ácido fórmico en 50% de solución acuosa de acetonitrilo), incubar por 20 min, y recolectar el sobrenadante. Esta etapa se repitió una vez, seguida por incubación en 100% de acetonitrilo. Los sobrenadantes combinado se secaron en una Eppendorf Vacufuge. Antes del análisis de LC-MS, los péptidos se resuspendieron en 10 (I de 0.1 % de ácido fórmico/2% de acetonitrilo. Todos los espectros se adquirieron en un espectrómetro de masas de trampa iónica lineal Thermo-Fisher LTQ-XL (Waltham, MA) que se acopla con un Eksigent nanoLC 2D (Dublin, CA). Los péptidos se cargaron en una columna de trampa Dionex PepMap C18 (300 µ?? de diámetro interno * 5 mm, 5 µ?? de tamaño de partícula) y luego se separaron por una columna/emisor de fase inversa New Objective C18 Picofrit (75 (m id, 10 cm de largo, 5 (m tamaño de partícula, Woburn, NJ). Una elución en gradientes a 250 nl/min al iniciar a partir de 5% a 40% de regulador B en 40 min, seguido por 40-80% de regulador B en 20 min, entonces 80% de regulador B por 10 min. El Regulador A es 0.1 % de solución acuosa de ácido fórmico y el Regulador B es 0.1 % de acido fórmico en acetonitrilo. Un vacío se insertó entre dos muestras para reducir la contaminación cruzada. Los datos sin procesar se buscaron contra el proteoma de Burkholderia pseudomallei K96243 (2009-12-06) descargado de Burkholderia Genome Datábase (http://www.Burkholderia.com). El motor de búsqueda Bioworks 3.3.1 (Thermo-Fisher) se utilizó con Protein-Prophet y Trans Proteomic pipeline, como se describe por ejemplo, en Keller A. et al., Mol Syst Biol, 1 :0017 (2005) and Keller A. et al., Anal Chem, 74(20): 5383-92 (2002), cuyas descripciones de cada uno de los cuales se incorporan por la presente para referencia. Las coincidencias de proteínas se reportan con una tasa de error de 2.5% pronosticada por ProteinProphet as el umbral.

Determinación de LPS y CPS La cantidad de LPS en OMVs de B. pseudomallei se determinó por ELISA de captura. Inmunoplacas Maxisorp (Nunc) se recubrieron durante la noche a 4 °C con 100 µ? de 5 µg/ml de anticuerpo monoclonal anti-LPS de B. pseudomallei (Mab) (de J. Prior y S. Ngugi, Dstl, RU) en PBS. Después de lavar con PBS/0.05% de Tween 20 (PBST), las placas se bloquearon con 3% de leche descremada en PBS. Las placas entonces se incubaron por 1 h a 25 °C con diluciones 1 :2 de OMVs o LPS de B. thailandensis purificado, al iniciar en 400 µg /mi, en 3% de leche/PBS/0.05% de Tween/0.8% de polivinilpirrolidona (PVP). El Mab anti-LPS de B. pseudomallei se biotiniló al utilizar el kit EZ-link micro sulfo-NHS-LCbiotinylation (Thermo-Pierce), al seguir el protocolo recomendado del fabricante. El Mab anti-LPS de B. pseudomallei biotinilado en 3% de leche/PBS/0.05% de tween/0.8% de PVP se agregó a placas a una concentración de 1 µg/ml y se incubó por 1 h. Las placas se lavaron en PBS T y luego se incubaron por 1 h a 25 °C con un conjugado de polímero de estreptavidina peroxidasa (Sigma), diluido 1 :1000 en 3% de leche/PBS/0.05% de tween/0.8% de PVP. Las placas entonces se lavaron antes del desarrollo con el reactivo 1-step Ultra TMB ELISA (Thermo Scientific). Las placas se leyeron a 450 nm después de la adición de H2S04 2 M para detener la reacción. Una curva estándar de A450 vs. concentración de LPS se graficó y utilizó para determinar el contenido de LPS de las muestras de OMV.

La presencia de CPS en las OMVs se determinó por transferencia Western al utilizar el anticuerpo monoclonal 3C5, especifico para CPS de B. pseudomallei como se describe, por ejemplo, en Nuti D. et al., mBio, 2(4), e00136-11 (2011 ), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Diez g de OMVs, lisado de B. pseudomallei 1026b, y lisado de B. thailandensis se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al utilizar un gel de poliacrilamida al 7.5% (Bio-Rad). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon en 1 .5% de BSA en TBS-T por 1 h. La membrana se incubó con 3C5 lgG3 (dilución 1 : 1000) durante la noche a 4 °C, se lavó 3 veces con TBS-T, y se incubó con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con HRP (Pierce, dilución 1 :1000) por 1 h a temperatura ambiente. La membrana se lavó y desarrolló al utilizar sustrato Opti-4CN (BioRad).

Animales Ratones hembra BALB/c de 8 a 10 semanas de edad se adquirieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y se mantuvieron 5 por jaula en unidades microaislantes de poliestjreno bajo condiciones libres de patógenos. Los animales se alimentaron con alimento de roedores y agua estéril ad libitum y se dejaron aclimatar 1 semana antes de su uso. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones en Guide for the Care and Use of Laboratory Animáis of the National Institutes of Health (NIH). Los protocolos se aprobaron por Tulane University Health Sciences Center y Tulane National Primate Research Center Institutional Animal Care and Use Committeés.

Inmunizaciones Dos experimentos independientes de inmunización se realizaron al utilizar lotes preparados de manera separada de OMVs purificadas. En el primer experimento, ratones BALB/c (n = 10 por grupo) se sensibilizaron de manera subcutánea (SC) en el dia 0 con 2.5 de OMVs de B. pseudomallei en un volumen final de 100 µ? de solución salina estéril, o en forma intranasal (IN) con 2.5 yg de OMVs de B. pseudomallei o E. coli en un volumen final de 7.5 µ?/fosa nasal. Antes de la inmunización IN, los ratones se anestesiaron brevemente con Isoflurane (VetOne). Los ratones sin contacto previo no recibieron tratamiento. Los ratones inmunizados se reforzaron en los días 21 y 42 con las mismas formulaciones. No se agregó adyuvante a las preparaciones de OMVs. Un mes después de la última inmunización, un subconjunto de ratones (n = 5 por grupo) se utilizó para la medición de respuestas de anticuerpos y grupos separados de ratones (n = 5 ratones por grupo) se desafiaron con B. pseudomallei por aerosol. En el segundo experimento, ratones BALB/c (n = 15 por grupo) se inmunizaron exactamente como se describe anteriormente. Cinco ratones por grupo se utilizaron para determinar la correlación inmune de protección, y diez ratones por grupo se desafiaron con B. pseudomallei por aerosol.

Desafíos con aerosoles Los ratones se desafiaron con B. pseudomallei cepa 1026b mediante aerosol en pequeñas partículas como se describe previamente, por ejemplo, en Mori L.A. et al., Microb Pathog, 48(1 ): 9-17 (2010), cuya descripción se-incorpora en este documento para referencia. Grupos de animales se agruparon aleatoriamente para la infección experimental; la capacidad animal para cada operación discreta del sistema de inhalación fue 23; el número total de operaciones requeridas fue tres. Un sistema dinámico de exposición a inhalación de sólo nariz (CH Technologies, Westwood, NJ) se empleó para las exposiciones. El aparato de inhalación se alojó en un gabinete de seguridad biológica Clase III (GermFree Laboratories, Ormond Beach, FL) dentro de un ambiente de laboratorio de contención BSL-3. El sistema de sólo nariz se mantuvo a 11 Ipm de flujo total, durante las exposiciones. Los aerosoles se generaron en el espacio central de la cámara al utilizar un nebulizador de colisión de tres chorros (BGI Inc., Waltham, MA). La atmósfera experimental se muestreó de manera continua al utilizar un borbollador todo de vidrio (AGI-4, Ace Glass, Vineland, NJ) insertado en una de las entradas de sólo nariz del espacio de exposición. El contenido del borbollador se cultivó inmediatamente después de cada operación discreta del sistema y los conteos de colonias bacterianas se utilizaron para calcular una concentración de aerosol (Ca) de B. pseudomallei dentro del espacio del aparato de exposición de sólo nariz. La Ca resultante para cada operación se aplicó a un ritmo respiratorio calculado de los ratones para alcanzar un volumen respiratorio total durante la exposición. La dosis inhalada resultante se expresó en CFU/animal. La dosis inhalada media en todos los grupos experimentales fue 5.35 * 103 ± 3.64 ?103 CFU. Los ratones se desafiaron con una dosis objetivo de 5LD50 (-1000 CFU para B. pseudomallei 1026b cuando se determina en experimentos piloto). Dos ratones sin contacto previo se incluyeron en cada operación de exposición y se sacrificaron inmediatamente después del desafio. Los pulmones se cultivaron para la determinación de CFU bacterianas para confirmar el inóculo.

Recuperación de CFU Homogenizados de tejido de pulmón, bazo, e hígado se utilizaron para determinar la carga bacteriana a 14 y 30 días post-infección en ratones que sobrevivieron al desafío con aerosoles. Los tejidos se removieron asépticamente, se pesaron y se colocaron individualmente en 1 mi de 0.9% de NaCI y se homogenizaron con trituradores de tejido desechables estériles (Fisher Scientific). Diluciones en serie diez veces de homogenizados de pulmón se cultivaron en agar para aislamiento de Pseudomonas (PIA). Las colonias se contaron después de la incubación por 3 días a 37 °C y se reportaron como CFU por órgano.

Análisis de respuesta de anticuerpos Los ratones inmunizados y sin contacto previo se anestesiaron y la sangre se recolectó por sangrado retro-orbital antes de cada inmunización. Un mes después de la última inmunización, muestras de sangre de ratones inmunizados y sin contacto previo se recolectaron después de la eutanasia para la determinación de concentraciones de anticuerpos séricos específicos de antígeno. La sangre se dejó coagular durante 30 min a temperatura ambiente y luego se centrifugó a 2300 ? g; el suero se recolectó y almacenó a -80 °C hasta su ensayo. Las concentraciones de IgG, lgG1 , lgG2a, e IgA totales específicas de OMV en suero se analizaron por ensayo ¡nmunoabsorbente asociado a enzimas (ELISA). Placas de microtitulación de 96 pozos se recubrieron con 0.5 por pozo de OMVs de B. pseudomallei purificadas en regulador de recubrimiento (bicarbonato de sodio 0.1 M, carbonato de sodio 0.2 M) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía 0.05% de Tween-20 (PBST). Para la medición de IgA, las placas se bloquearon adicio'nalmente con 2% de BSA durante 1 h seguido por tres lavados con PBST. Todas las placas se incubaron con diluciones dos veces en serie de muestras de sueros durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBST y luego se incubaron con IgG, lgG1 , lgG2a de rata anti-ratón conjugadas con fosfatasa alcalina (AP) (dilución 1 :300 en PBST) (BD Pharmingen) o IgA de cabra anti-ratón conjugada con AP (1 :2000) (Invitrogen) por 1 h a temperatura ambiente. Al final de la incubación, las placas se lavaron tres veces con PBST y se desarrollaron con tabletas de fosfato de p-Nitrofenilo SIGMAFAST (Sigma, St. Louis, MO) disueltas en regulador de dietanolamina (1 mg/ml). Después de 15-30 min de incubación, las soluciones de reacción se detuvieron con NaOH 2 M y se leyeron a 405 nm al utilizar un lector de microplacas pQuant y se analizaron con el software Gen5 (BioTek, Winooski, VT). Los resultados obtenidos se expresan como los títulos de extremos recíprocos medios para IgG total; concentraciones para IgG e IgA; y relaciones de lgG1 a lgG2a con base en concentraciones totales. El titulo de extremo se define como la dilución más grande que produjo una densidad óptica (OD450) mayor a tres desviaciones estándar por arriba de la OD450 media para títulos pre-inmunes. Las concentraciones se determinaron por comparación con una curva estándar como se describe previamente, por ejemplo, en Nieves W. et al., PLoS One, 5(12):e14361 (2010), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia.

Ensayo de reestimulación por antígenos Los ensayos de reestimulación se realizaron con esplenocitos de ratones inmunizados y sin contacto previo para el análisis de respuestas de células T. Los bazos' se removieron asépticamente y suspensiones unicelulares de esplenocitos de cada ratón se obtuvieron al hacer pasar los bazos a través de tamices celulares estériles de 40 µ?t? (Fisher Scientific). Las células se lavaron dos veces con solución salina regulada de Hank (HBSS) (ATCC). Los sedimentos de células se resuspendieron en HBSS y se depositaron sobre regulador ACK Lysing (Gibco) por 4 min. El aislamiento de leucocito mononucleares esplénicos se logró por centrifugación a 1500 ? g por 10 min. Los leucocitos se recuperaron en la interfase, se lavaron dos veces con HBSS y se resuspendieron en medio Advanced RP I 1640 (ATCC) complementado con 10% de FBS (Atlanta Biologicals) y 1 % de antibiótico-antimicótico (Gibco). Las células se cultivaron en placas en una placa de microtitulación de 96 pozos a 1.5 * 106 células /pozo. Los cultivos celulares se estimularon con 2 pg de OMVs de B. pseudomallei, 1 pg de ConA (Sigma), o se dejaron sin estimular como ..controles negativos. Los cultivos se incubaron a 37 °C en 5% de C02, y los sobrenadantes de cultivo celular de cada grupo de tratamiento se recolectaron después de 72 h y se almacenaron a -80' hasta su uso.

Análisis estadísticos Todos los análisis se realizaron al utilizar GraphPad Prism versión 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Los análisis estadísticos se realizaron al utilizar una ANOVA de uno o dos factores con prueba posterior de Bonferroni. Los valores de P < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos. Para análisis de supervivencia, se utilizó la prueba Mantel-Cox de rango logarítmico.

Resultados (1) Las OMVs de B. pseudomallei contienen LPS, CPS, y antígenos de proteínas Se demostró previamente que las OMVs se secretan de manera abundante por S. pseudomallei crecida en caldo y pueden recolectarse de sobrenadantes de cultivo al utilizar ultra-centrifugación de densidad, como se describe, por ejemplo, en Nieves W. et al. (2010). Las vesículas purificadas de B. pseudomallei varían en tamaño de 50 a 250 nm y contienen entre 1 y 1.5 mg de protefna por litro de cultivo (Figura 13).

Al utilizar análisis de LC-MS, numerosas proteínas en las OMVs se detectaron, incluyendo 17 proteínas periplásmicas putativas y 12 proteínas pronosticadas de membrana externa o extraceluláres (Tabla 3). Varias de las proteínas identificadas eran proteínas inmunogénicas caracterizadas previamente (Tabla 3; proteínas destacadas en negras). Véase, por ejemplo, Nieves W. et al. (2010) y Harding, S.V. et al., Vaccine, 25(14):2664-72 (2007), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Aunque no se desea limitar por alguna teoría particular, parece que las OMVs secretadas por S. pseudomallei crecida en caldo poseen un cargamento antigénico similar a las de las expresadas durante la infección in vivo. Este efecto se demostró en el presente estudio, el cual utilizó sueros en estado convaleciente de un macaco rhesus que se había recuperado de la infección por aerosol experimental con B. pseudomallei. Como se muestra en la Figura 14, las bacterias crecidas en caldo producen OMVs que contienen numerosos antígenos inmunoreactivos expresados y reconocido durante la infección por S. pseudomallei en un modelo de primates no humanos de melioidosis. Debido a la naturaleza de la biogénesis de las OMVs, este estudio además investigó la capacidad de las OMVs para albergar LPS y CPS, los cuales estimulan respuestas de anticuerpos protectores contra B. pseudomallei. Véase, por ejemplo, Jones S.M. et al., J Med Microbiol, 51 (12): 1055-62 (2002); Nelson, M. et al., J Med Microbiol, 53(12): 1177-82 (2004); Ngugi, S.A. et al., Vaccine, 28(47):7551-5 (2010), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. El ensayo de limulo confirmó la presencia de LPS en las OMVs; las OMVs contenían 200 µ?/?t?? de LPS cuando se determina por ELISA de captura. Al utilizar un anticuerpo monoclonal dirigido contra el CPS de B. pseudomallei, como se describe, por ejemplo, en Nuti, D. et al., mBio, 2(4), e00136-11 (2011 ), este estudio demostró por transferencia Western que este antígeno de superficie también es abundante en las OMVs (Figura 13B). La presencia de numerosas proteínas inmunoreactivas, así como LPS y CPS, en las OMVs de B. pseudomallei es una propiedad propicia que puede utilizarse en una vacuna potencial. (2) Las OMVs de S. pseudomallei inducen respuestas de anticuerpos específicos sin requerimiento de adyuvante La biogénesis de OMV genera vesículas que contienen grandes cantidades de LPS con la endotoxicidad inherente. De esta manera, las preparaciones de vacunación que utilizan OMVs de bacterias Gram negativas en la mayor parte de los casos requerirán extracción de LPS o destoxificación de lípido A antes de la administración. Véase, por ejemplo, Koeberling O. et al., J Infect Dis., 198(2):262-70 (2008) y van de Waterbeemd B. et al., Vaccine, 28(30):4810-6 (2010), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Adicionalmente, la eliminación de LPS de las OMVs a menudo necesita la adición de adyuvante para restaurar la ¡nmunogenicidad de las OMV. El LPS de B. pseudomallei es hasta 1000 veces menos tóxico que el LPS de E. coli, como se describe, por ejemplo, en Utaisincharoen P. et al., Clin Exp lmmunol, 122(3): 324-9 (2000) y Matsuura M. et al., FEMS Microbiol Lett,137(1 ):79-83 (1996), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. No se observó citotoxicidad en este estudio en macrófagos múridos cocultivados con 5 µg de OMVs de S. pseudomallei por 72 h. Este estudio explotó la capacidad adyuvante natural y baja toxicidad del LPS de B. pseudomallei como componente nativo de la preparación de OMVs.

Dos grupos de ratones se inmunizaron con 2.5 pg de OMVs sde S. pseudomallei por la ruta intranasal (IN) o SC y se reforzaron en los días 21 y 42. Con el fin de examinar la especificidad de la respuesta de anticuerpos a las OMVs, también se purificaron OMVs de una cepa no patogénica de E. coli como antígeno de control. Las OMVs de E. coli se prepararon exactamente en la misma forma que las OMVs de S. pseudomallei y contenían LPS. Por esta razón, los ratones se inmunizaron con OMVs de E. coli sólo por la ruta IN debido a la endotoxicidad significativa asociada con el LPS de E. coli administrado SC, como se describe, por ejemplo, en Schaedler R.W. et al., J Exp Med, 113:559-70 (1961 ), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. No se agregó adyuvante adicional a ninguna preparación de OMVs. Las OMVs de B. pseudomallei administradas SC o IN indujeron altos títulos de IgG sérica específica de OMV después de un solo refuerzo. Más aún, los títulos de IgG sérica se incrementaron en aproximadamente 1 logaritmo después de un segundo refuerzo y fueron significativamente superiores a los títulos pre-inmunes (Figura 15). La inmunización con OMV generó respuestas de IgG contra múltiples antlgenos proteicos en la preparación de OMVs (Figura 16). Adicionalmente, la respuesta de IgG a las OMVs de B. pseudomallei parece específica dado que los ratones inmunizados con OMVs de E. coli no generaron IgG que reconociera las OMVs de B. pseudomallei. Esto no se debió a la tolerancia inmune dado que los ratones inmunizados con OMV de E. coli produjeron anticuerpos que reconocieron sus OMVs conocidas (Figuras 18C y 18D). Los ratones sin contacto previo tampoco tenían anticuerpo que reconociera a los antígenos de OMV de S. pseudomallei (Figura 15 y Figura 16). (3) La inmunización con OMVs de B. pseudomallei proporciona una protección significativa contra el desafio letal con aerosoles.

Con el fin de determinar si la inmunización con OMVs de B. pseudomallei puede proporcionar protección contra la infección por inhalación, grupos de ratones se inmunizaron como antes y se desafiaron por aerosol con B. pseudomallei virulenta cepa 1026b. Dos experimentos independientes de inmunización y desafio se realizaron con dos lotes preparados de manera separada de vacuna de OMVs para demostrar la reproducibilidad. Los ratones sin contacto previo mostraron 100% de mortalidad al día 7 (Figura 17). En contraste, los ratones inmunizados SC con OMVs de B. pseudomallei se protegieron significativamente contra el desafio letal con aerosoles (P < 0.001 ). No se observó protección significativa en ratones inmunizados IN con OMVs de B. pseudomallei o OMVs de E. coli aunque un pequeño porcentaje de animales sobrevivió. Se muestran datos de combinados de sobrevivencia por un periodo de 2 semanas dado que ningún animal sucumbió después del día 7. Además, una porción de animales sobrevivientes se sacrificó 2 semanas post-desafío para la determinación de carga, bacteriana. (4) La inmunización con OMV de S. pseudomallei reduce, pero no elimina completamente, la persistencia bacteriana Tejidos conocidos por albergar B. pseudomallei persistente (pulmón, hígado y bazo) se recolectaron de los sobrevivientes después de 14 y 30 días de observación y se cultivaron para la determinación de cargas bacterianas. Ambos grupos de ratones inmunizados con OMVde S. pseudomallei (SC e IN) demostraron ausencia de bacterias en los pulmones en 14 días post-desafío con aerosoles (Tabla 4). En contraste, los ratones inmunizados con OMV de E. coli que sobrevivieron al desafío contenían hasta 106 CFU en sus pulmones en el día 14. Dos de tres ratones inmunizados con OMVs de B. pseudomallei SC no mostraron evidencia de B. pseudomallei en el bazo, y muy bajos números de bacterias se detectaron en el hígado (<30 CFU). Tal como se observa en el pulmón, los ratones inmunizados con OMVs de E. coli tuvieron números superiores de B. pseudomallei en el bazo e hígado én comparación con animales inmunizados con OMVs de B. pseudomallei a 14 días post-desafío. A los 30 días post-desafío, se observó un resultado similar en cuanto a que el animal inmunizado con OMVs de E. coli tuvo CFU superiores en todos los tejidos en comparación con ratones inmunizados con OMVs de B. pseudomallei. También se observaron bajas cifras de bacterias en los pulmones de ratones inmunizados con OMVs de B. pseudomallei que contrasta con la falta de colonización observada a los 14 días en estos grupos. Estos ratones también se colonizaron con bajas cantidades de bacterias en el bazo y/o hígado. La recolonización bacteriana del pulmón a partir de órganos distantes puede haber ocurrido después de un período prolongado de infección, dado que B. pseudomallei posee un tropismo por el pulmón como se describe, por ejemplo, en Cheng A.C. et al., Clin Microbiol Rev, 18(2):383-416 (2005), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. (5) La inmunización con OMVs de B. pseudomallei induce altos títulos de IgG e IgA séricas específicas de OMV Las respuestas de anticuerpos se midieron en suero obtenido de grupos separados de ratones un mes después de la última inmunización con el fin de valorar las correlaciones inmunes de protección. La IgG sérica específica de OMVs de B. pseudomallei fue significativamente superior en los animales inmunizados con OMVs de B. pseudomallei SC e IN que en los controles (Figura 18A). Las concentraciones de IgG específica de OMVs no fueron significativamente diferentes entre ratones inmunizados SC e IN con OMVs de B. pseudomallei. Además, las concentraciones de lgG1 e lgG2a no fueron significativamente diferentes entre ratones inmunizados SC e IN con OMVs de B. pseudomallei (Tabla 5). Los grupos inmunizados SC e IN con OMVs de B. pseudomallei demostraron una respuesta inmunitaria Tipo 2 con relaciones lgG1 :lgG2a iguales a 7.5 y 12.2, respectivamente (Tabla 5). La IgA sérica especifica de OMVs de B. pseudomallei fue significativamente superior en ratones inmunizados IN con OMVs de B. pseudomallei en comparación con los grupos control (Figura 18B). Como se indica en los estudios iniciales de inmunogenicidad, las respuestas de anticuerpos a OMVs de B. pseudomallei fueron específicas dado que los ratones inmunizados con OMV de E. coli no producen anticuerpos que reconocen las OMVs de B. pseudomallei, aunque produjeron altos títulos de IgG e IgA séricas especificas de OMVs de E. coli (Figuras 18C y 18D). Por el contrario, los ratones inmunizados con OMVs de B. pseudomallei no generaron un respuesta de anticuerpos significativa a OMVs de E. coli (Figuras 18C y 18D).

Tabla 4. Los ratones inmunizados con OMVs de B. pseudomallei demuestran cargas bacterianas reducidas.

Las cargas bacterianas en tejidos (CFU/órgano) se determinaron en ratones inmunizados con OMVs de E. coli (Ec IN), inmunizados en forma intranasal con OMVs de B. pseudomallei (Bp IN), e inmunizados de manera subcutánea con OMVs de B. pseudomallei (Bp SC) a 14 y 30 días post-infección (p.i.). Tres ratones por grupo se utilizaron cuando fue posible. El número de ratones (n) examinados en cada grupo se indica en paréntesis. El intervalo en CFU recuperadas de ratones en réplica se reporta arriba, a Sólo 1 ratón de 3 se colonizó en el bazo, por lo tanto no se proporciona intervalo, b Sólo 1 ratón de 3 se colonizó en el pulmón, por lo tanto no se proporciona intervalo.

Tabla 5. Concentraciones medias de lgG1 e lgG2a séricas específicas de OMVs de B. pseudomallei ( g/ml) y relaciones de lgG1 :lgG2a Las relaciones > 1 indican una respuesta inmunitaria humoral tipo 2, mientras las relaciones < 1 indican un respuesta inmunitaria celular tipo 1. ND = no detectable. (6) La inmunización con OMVs de B. pseudomallei induce respuestas de memoria de células T Una respuesta CMI impulsada por Th1 , a la par de la producción de anticuerpos específicos, probablemente es esencial para la eficacia de vacunación contra B. pseudomallei. Véase, por ejemplo, Haque, A. et al., J Infecí Dis, 194(9):1241-8 (2006) y Healey, G.D. et al., Infect Immun, 73(9):5945-51 (2005), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Para valorar las respuestas de células T específicas de antígenos en ratones inmunizados con OMVs, se recolectaron bazos un mes después de la última inmunización y se reestimularon ex vivo con OMVs de B. pseudomallei. Los sobrenadantes de cultivos celulares se analizaron en el día tres para producción de IFN-? como indicación de una respuesta de memoria Th1. Ambos grupos de ratones inmunizados con OMVs de B. pseudomallei (SC e IN) produjeron cantidades significativamente superiores de IFN-? en comparación con los grupos control (Figura 20). Similar a lo observado para las respuestas de anticuerpos, las respuestas de memoria de células T a la inmunización con OMVs de B. pseudomallei pareció especifica ya que los esplenocitos de ratones inmunizados con OMVs de E. coli no produjeron IFN-? con la reestimulación con OMVs de B. pseudomallei.

Discusión La morbilidad y mortalidad significativas asociadas con la infección pulmonar por Burkholderia en humanos demanda el desarrollo de una vacuna segura y eficaz contra la enfermedad por inhalación. Adicionalmente, una vacuna que proporciona inmunidad estéril puede ser especialmente útil dado que muchos miembros de Burkholderia dan lugar a una infección persistente. En este estudio, se demostró que una vacuna de OMV derivada naturalmente proporciona capacidad adyuvante, inmunogenicidad y eficacia protectora inherentes contra un desafío pulmonar con B. pseudomallei. Ratones inmunizados SC con OMVs de B. pseudomallei demostraron casi 60% de supervivencia contra el desafío con aerosoles en comparación con 0% de supervivencia en animales sin contacto previo. Esté estudio presenta la mejor protección mediada por vacunas lograda hasta el momento contra la melioidosis neumónica letal en el modelo de ratón. Estos resultados sugieren las vesículas de membrana como estrategia de vacunación promisoria contra otros patógenos respiratorios, incluyendo los que establecen una infección pulmonar persistente tales como Mycobacterium tuberculosis o el complejo de B. cepacia. En efecto, se demostró recientemente que M. tuberculosis produce vesículas que modulan las respuestas inmunitarias y potencian lá virulencia bacteriana mediante señalización por TLR2. Véase, por ejemplo, Prados-Rosales R. et al., J Clin lnvest,121(4):1471-83 (2011 ), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia.

Las vacunas basadas en vesículas de membrana ofrecen numerosas ventajas comparadas con las estrategias de vacunación tradicionales. Por ejemplo, son fáciles y baratas de producir - particularmente vesículas nativas que no requieren tratamiento químico u otros modos artificiales de preparación. Las vesículas de membrana son inviables y aún comparten muchos de los antlgenos de superficie presentados por una cepa inactivada o viva atenuada sin presentar los mismos problemas de seguridad. Las vesículas también contienen numerosos antígenos que pueden influir en las respuestas ¡nmunitarias, como se describe, por ejemplo, en Kulp, A. et al., Annu Rev Microbiol, 64:163-84 (2010) y Amano, A. et al., Microbes Infect, 12(11):791— 8 (2010), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Este atributo puede superar las limitaciones asociadas con el uso de un solo antígeno (es decir, LPS o subunidad de protelna) y la falla en vacunación debido a la variación antigénica entre cepas bacterianas heterogéneas, mutantes de escape, y restricción por haplotipos de leucocito humanos (HLA). Véase, por ejemplo, Sirisinha, S. et al., Microbiol Immunol, 42(11):731-7 (1998); Anuntagool, N. et al., Southeast Asían J Trop Med Public Health, 31(suppl. 1):146-52 (2000); Gal-Tanamy, M. et al., Proc Nati Acad Sci USA, 105(49):19450-5 (2008); Quenee, L.E. et al., Infect Immun., 76(5):2025-36 (2008); y Ovsyannikoa, I.G. et al., J Infect Dis,193(5):655-€3 (2006), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia.

Al utilizar un análisis sensible de LC-MS, numerosos antlgenos proteicos en las vesículas purificadas se identificaron (Tabla 3).

TABLA 3. Composición de proteínas de OMVs de B. pseudomallei cuando se determina por análisis de LC-MS. Las proteínas destacadas en negras son proteínas inmunogénicas previamente identificadas [30, 35].

Varias proteínas parecen ser altamente abundantes e inmunogénicas cuando se determina por SDS- PAGE y transferencia Western, respectivamente (Figuras 14A, 14C y 16B).

La Figura 14 demuestra que las OMVs secretadas por B. pseudomallei cultivada en caldo contenían antígenos inmunoreactivos. (14A) SDS-PAGE y tinción de Coomassie de 5 mg de OMVs purificadas. (14B) OMVs examinadas con suero preinmune de un macaco rhesus o (14C) con suero de fase convaleciente obtenido del macaco 6 semanas postinfección con 1 x 106 cfu de B. pseudomallei 1026b (dilución 1 :100; 2o anticuerpo = IgG anti-mono de cabra - conjugado con HRP, dilución 1 :1000). MW = marcador de pesos moleculares de proteínas La Figura 16 demuestra que los anticuerpos dirigidos contra múltiples proteínas se inducen por inmunización con OMV. Las OMVs de B. pseudomallei se examinaron con sueros combinados obtenidos de ratones sin contacto previo' (16A) e inmunizados con OMV SC (16B) (n = 5 por grupo) (dilución 1 : 100; 2o anticuerpo = IgG de cabra anti-ratón - conjugado con H P, dilución 1 : 1000). MW = marcador de pesos moleculares de proteínas Adicionalmente, múltiples lotes independientes de OMVs a lo largo de un período de un año se han purificado, y se observaron perfiles idénticos de proteína e ínmunogenicidad con cada preparación, lo cual avala la reproducibilidad del producto.

La seguridad y eficacia protectora ofrecida por una vacuna de OMV contra cepas de N. meningitidis (Nm) serogrupo B establece un precedente para el uso de tales vacunas en la población humana. Véase, por ejemplo, 12 (2009); Oster, P. ef al., Vaccine, 23(17-18):2191-6 (2005); Oster, P. ef al., Vaccine, 25(16):3075-9 (2007); y Boutriau D. ef al., Clin Vaccine Immunol, (B:4:p1.19,15 and B:4:p1.7-2,4), 14(1 ):65-73 (2007), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Sin embargo, a diferencia de OMVs de B. pseudomallei, la producción de OMVs derivadas de Nm requiere la eliminación del lipooligosacárido extremadamente tóxico que necesita la adición de adyuvante de hidróxido de aluminio a la preparación de OMVs para restaurar la ínmunogenicidad, como se describe, por ejemplo, en van de Waterbeemd, B. ef al. (2010). La alúmina polariza la respuesta inmunitaria hacia humoral y CMI Th2, como se describe, por ejemplo, en Lindblad, E.B. ef al., Immunol Cell Biol, 82(5):497-505 (2004), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia, que soporta la producción de altos títulos de anticuerpos bactericidas necesarios para la protección contra meningococo. Tanto la humoral como CMI Th1 son probablemente esenciales para la protección contra B. pseudomallei. Dado que las OMVs de B. pseudomallei poseen baja toxicidad y retienen capacidad adyuvante, las OMVs de B. pseudomallei en su forma nativa se utilizaron sin extracción de LPS o adición de un adyuvante exógeno. Aunque no se desea limitar a una teoría particular, el reconocimiento inmune innato de OMVs de B. pseudomallei puede imitar aquel del organismo intacto dado que se ha mostrado que las OMVs contienen LPS, lipoproteínas, y CpG DNA y activan TLRs. Véase, por ejemplo, Kulp, A. ef al., Annu Rev Microbiol, 64:163-84 (2010); Amano, A. ef al. , Microbes Infecí, 12(1 1 ):791-8 (2010); Deatherage, B.L. ef al., Mol Microbiol, 72(6): 1395-407 (2009); y Bergman, M.A. ef al., Infect lmmun,73(3):1350-6 (2005), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Adicionalmente, la naturaleza en partículas de las OMVs hace posible el suministro de agonistas intrínsecos de TLR y cargamento antigénico a la misma célula presentadora de antígenos, lo cual conduce a una presentación de antígenos más eficiente. Véase, por ejemplo, Blander, J.M. et al., Nature, 440(7085):808-12 (2006), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia.

La inmunización homóloga de sensibilización-refuerzo en el presente estudio comparó la ruta parenteral tradicional de inmunización con el suministro intranasal. Dado que se ha propuesto que B. pseudomallei puede utilizar el NALT como puerta de entrada en la melioidosis múrida, se esperaba que la ruta IN de inmunización pudiera prevenir mejor las infecciones por mucosas a través de la sensibilización y activación de la inmunidad antimicrobiana local. Véase, por ejemplo, Owen, S.J. eí al., J Infect Dis, 199(12):1761-70 (2009), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia.

Este estudio encontró sorprendente e inesperadamente que una protección significativa se observó en ratones inmunizados SC con OMVs de B. pseudomallei, pero no los inmunizados IN. Estas diferencias en la protección no pueden atribuirse a las respuestas de IgG sérica específica de OMVs dado que las concentraciones no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos. Este estudio demostró que las OMVs purificadas de B. pseudomallei contienen LPS y CPS lo cual puede contribuir a la eficacia protectora de la vacuna de OMV. La capacidad protectora de anticuerpos dirigidos hacia el antígeno O del LPS y CPS de B. pseudomallei se ha demostrado en múltiples estudios. Véase, por ejemplo, Jones S.M. ef al., J Med Microbiol, 51 (12):1055-62 (2002); Nelson M. et al., J Med Microbiol, 53(Pt 12):1177-82 (2004); Ngugi, S.A. ef al, Vaccine, 28(47):7551-5 (2010); Zhang, S. ef al. , Clin Vaccine Immunol, 18(5):825-34 (2011 ), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. En especial, además de 47 anticuerpos monoclonales generados para epítopos de proteína, glicoproteína y polisacárido de B. pseudomallei, sólo los dirigidos contra LPS y CPS fueron fuertemente bactericidas y altamente efectivos en proteger contra la infección intranasal por B. pseudomallei. Ninguno de los anticuerpos monoclonales que reaccionan a proteínas bacterianas mostraron una actividad opsónica prominente, lo que sugiere que los epítopos de proteína fueron menos accesibles en las bacterias intactas, como se describe, por ejemplo, en Zhang S. ef al. (2011 ). Aunque las respuestas de IgG, lgG1 , e lgG2a séricas específicas de OMV fueron similares para ratones inmunizados IN y SC, el anticuerpo específico de LPS o CPS inducido por la vacuna de OMV puede variar entre rutas de inmunización. En apoyo de esto, el LPS purificado de Brucella melitensis administrado SC a ratones indujo niveles superiores de IgG e lgG3 séricas específicas de LPS, en comparación con el suministro IN y proporcionó protección contra la infección por Brucella en el pulmón. Véase, por ejemplo, Bhattacharjee, A.K. eí al., Infect Immun, 74(10):5820-5 (2006), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. De esta manera, las diferencias en las concentraciones de anticuerpos o subtipos específicos para los subcomponentes de LPS y/o CPS de las OMVs pueden contribuir a las diferencias observadas en la eficacia de vacunación. Estos escenarios pueden ayudar a explicar las diferencias entre grupos resistentes y susceptibles de ratones inmunizados y en última instancia proporcionan una idea de los mecanismos de inmunidad a B. pseudomallei.

Las respuestas CMI también son un componente esencial de la protección por vacunación contra B. pseudomallei, particularmente una vez que el organismo establece una residencia intracelular, como se describe, por ejemplo, en Raque, A. eí al., J Infect Dis,193(3):370-9 (2006) y Healey, G.D. eí al., Infect Immun, 73(9):5945-51 (2005), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Los análisis histológicos demuestran B. pseudomallei dentro de macrófagos en el pulmón, hígado y bazo. Véase, por ejemplo, Wong K.T. et al., Pathology, 28(2): 188-91 (1996) y Wong K.T. et al., Histopathology, 26(1 ):51-5 (1995), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Una inmunidad estéril inducida por vacunas ha sido difícil de lograr, como se describe, por ejemplo, en Sarkar-Tyson M. eí al. , Clin Ther, 32(8):1437-45 (2010). A pesar del pequeño número de animales disponibles para la valoración de carga tisular, los ratones inmunizados SC e IN con OMVs de B. pseudomallei demostraron una reducción en la carga tisular de B. pseudomallei en comparación con ratones control inmunizados con OMVs de E. coli que sobrevivieron al desafío. Aunque no se desea limitar por alguna teoría particular, esto puede reflejar la producción significativa de IFN-? observada en esplenocitos reestimulados en animales inmunizados con OMV de B. pseudomallei. Véase, por ejemplo, Healey G.D. eí al., Infect Immun, 73(9):5945-51 (2005) y Santanirand, P. eí al., Infect Immun, 67(7):3593-600 (1999), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Las células T específicas de antígenos, particularmente células T CD4+, son fuentes importantes de IFN-? y son esenciales para la resistencia del hospedador a la infección aguda y crónica con B. pseudomallei. Véase, por ejemplo, Haque A. eí al., J Infect Dis, 193(3):370-9 (2006), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. En especial, la protección no puede atribuirse a la producción de IFN-? sola dado que el grupo IN sucumbió al desafío. Se ha mostrado que la frecuencia de células T que producen múltiples citocinas (IFN-?, TNF e IL-2), en lugar de IFN-? solo, correlaciona con respuestas protectoras de vacunación contra varios patógenos intracelulares incluyendo M. tuberculosis, Leishmania major, y Plasmodium falciparum. Véase, por ejemplo, Lindenstrom, T. ef al., J Immunol, 182(12):8047-55 (2009); Darrah P.A. er a/, Nat Med , 13(7):843-50 (2007); y Roestenberg . et al., N Engl J Med, 361 (5):468-77 (2009), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Las OMVs pueden suministrar factores de virulencia directamente al citoplasma del hospedador mediante fusión de OMVs con las balsas lipfdicas en la membrana plasmática del hospedador, como se describe, por ejemplo, en Bomberger J.M. ef al., PLoS Pathog, 5(4):e1000382 (2009), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Más aún, la degradación de OMVs en compartimientos lisosómicos también se ha observado. Véase, por ejemplo, Amano A. ef al., Microbes lnfect,12(11 ):791-8 (2010), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Estos atributos pueden facilitar la presentación de antfgenos del cargamento de OMVs mediante MHC Clase I y Clase II, respectivamente. De esta manera, la definición de la función de las células T CD8+ y CD4+ productoras de una sola y múltiples citocinas en respuesta a la vacuna de OMVs de B. pseudomallei puede proporcionar una idea útil. Véase, por ejemplo, Lertmemongkolchai, G. ef al., J Immunol, 166(2):1097-105 (2001 ), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia.

La inhalación de S. pseudomallei es una ruta natural de infección, y representa la ruta principal de exposición en un ataque biológico intencionado. Una vacuna de B. pseudomallei sería eficaz contra esta ruta de infección. La inmunización con OMVs proporcionó una protección significativa en el modelo de ratón BALB/c de la melioidosis neumónica aguda. Este estudio demuestra que las OMVs derivadas naturalmente son una estrategia de vacunación segura, económica y multi-antigénica contra S. pseudomallei que promueve respuestas humorales y CMI. La estrategia utilizada en este trabajo proporciona una base para mejorar además la vacuna de OMVs de B. pseudomallei a través de, por ejemplo, estudios de optimización que examinan la dosis, suministro y formulaciones adyuvantes. Adicionalmente, el éxito logrado con OMVs de B. pseudomallei nativas no optimizadas en este estudio proporciona una oportunidad para extender las vacunas basadas en vesículas a otros patógenos intracelulares clínicamente significativos que han evadido los esfuerzos tradicionales de vacunación.

Referencias: 1. Drevinek P, Mahenthiralingam E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin Microbiol Infect 2010;16(7):821-30. 2. Whitlock GC, Estes DM, Torres AG. Glanders: off to the races with Burkholderia mallei. FEMS Microbiol Lett 2007;277(2):1 15-22. 3. Cheng AC, Currie BJ. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management.Clin Microbiol Rev 2005;18(2):383-^16. 4. Wiersinga WJ, van der Poli T, White NJ, Day NP, Peacock SJ. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat Rev Microbiol2006;4(4):272-82. 5. Dance DA. Melioidosis as an emerging global problem. Acta Trop 2000;74(2-3):115-9. 6. Bondi SK, Goldberg JB. Strategies toward vaccines against Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. Expert Rev Vaccines 2008;7(9): 1357-65. 7. Sarkar-Tyson M, Titball RW. Progress toward development of vaccines against melioidosis: a review. Clin Ther 2010;32(8):1437^5. 8. Atkins T, Prior RG, Mack K, Russell P, Nelson M, Oyston PC, et al. A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis. Infect Immun 2002;70(9):5290— 4. 9. Haque A, Chu K, Easton A, Stevens MP, Galyov EE, Atkins T, et al. A live experimental vaccine against Burkholderia pseudomallei elicits CD4+ T cell-mediated immunity, priming T cells specific for 2 type III secretion system proteins. J Infect Dis 2006; 194(9):1241-8. 10. Barnes JL, Ketheesan N. Development of protective immunity in a murine model of melioidosis is influenced by the source of Burkholderia pseudomallei antigens. Immunol Cell Biol 2007;85(7):551-7. 11. Jones SM, Ellis JF, Russell P, Griffin KF, Oyston PC. Passive protection against Burkholderia pseudomallei infection in mice by monoclonal antibodies against capsular polysaccharide, lipopolysaccharide or proteins. J Med Microbiol 2002;51 (12): 1055-62. 12. Nelson M, Prior JL, Lever MS, Jones HE, Atkins TP, Titball RW. Evaluation of lipopolysaccharide and capsular polysaccharide as subunit vaccines against experimental melioidosis. J Med Microbiol 2004;53(Pt 12): 1 177-82. 13. Ngugi SA, Ventura W, Qazi O, Harding SV, Kitto GB, Estes DM, et al. Lipopolysaccharide from Burkholderia thailandensis E264 provides protection in a murine model of melioidosis. Vaccine 2010;28(47):7551-5. 14. Zhang S, Feng SH, L¡ B, Kim HY, Rodríguez J, Tsai S, et al. In vitro and in vivo studies of monoclonal antibodies with prominent bactericidal activity against Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. Clin Vaccine Immunol 2011 ;18(5):825-34. 15. Harland DN, Chu K, Haque A, Nelson M, Walker NJ, Sarkar-Tyson M, et al. Identification of a LolC homologue in Burkholderia pseudomallei, a novel protective antigen for melioidosis. Infect Immun 2007,75(8):4173-80. 16. Druar C, Yu F, Barnes JL, Okinaka RT, Chantratita N, Beg S, et al. Evaluating Burkholderia pseudomallei Bip proteins as vaccines and Bip antibodies as detection agents. FEMS Immunol Med Microbiol 2008;52(1 ):78-87. 17. Hará Y, Mohamed R, Nathan S. Immunogenic Burkholderia pseudomallei outer membrane proteins as potential candidate vaccine targets. PLoS One 2009;4(8):e6496. 18. Su YC, Wan KL, Mohamed R, Nathan S. Immunization with the recombinant Burkholderia pseudomallei outer membrane protein Omp85 induces protective immunity in mice. Vaccine 2010;28(31 ):5005-11. 19. Jeddeloh JA, Fritz DL, Waag DM, Hartings JM, Andrews GP. Biodefense-driven murine model of pneumonic melioidosis. Infect Immun 2003;71 (1 ):584-7. 20. Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED. Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholderia pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Immun 2005;73(9):5945-51. 21. Kulp A, Kuehn MJ. Biological functions and biogénesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu Rev Microbiol 2010;64:163-84. 22. Amano A, Takeuchi H, Furuta N. Outer membrane vesicles function as offensive weapons in host-parasite interactions. Microbes Infect 2010;12(11 ):791— 8. 23. Deatherage BL, Lara JC, Bergsbaken T, Rassoulian Barrett SL, Lara S, Cookson BT. Biogénesis of bacterial membrane vesicles. Mol Microbiol 2009;72(6): 1395-407. 24. Holst J, Martin D, Arnold R, Huergo CC, Oster P, O'Hallahan J, et al. Properties and clinical performance of vaccines containing outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis. Vaccine 2009;27(suppl. 2):B3-12. 25. Fransen F, Stenger RM, Poelen MC, van Dijken HH, Kuipers B, Boog CJ, et al. Differential effect of TLR2 and TLR4 on the ¡mmune response after immunization with a vaccine against Neisseria meningitidis or Bordetella pertussis. PLoS One 2010;5(12):e15692. 26. Alaniz RC, Deatherage BL, Lara JC, Cookson BT. Membrane vesicles are immunogenic facsímiles of Salmonella typhimuríum that potently actívate dendritic cells, prime B and T cell responses, and stimulate protective immunity in vivo. J Immunol 2007; 179(11):7692-701. 27. Schild S, Nelson EJ, Camilli A. Immunization with Vibrio cholerae outer membrane vesicles induces protective immunity in mice. Infect Immun 2008,76(10):4554-63. 28. Rivera J, Cordero RJ, Nakouzi AS, Frases S, Nícola A, Casadevall A. Bacillus anthracis produces membrane-derived vesicles containing biologically active toxins. Proc Nati Acad Sci USA 2010; 107(44): 19002-7. 29. Wedege E, Bolstad K, Aase A, Herstad TK, McCallum L, Rosenqvist E, et al. Functional and specific antíbody responses in adult volunteers in New Zealand who were given one of two dífferent meningococcal serogroup B outer membrane vesicle vaccines. Clin Vaccine Immunol 2007;14(7):830-8. 30. Nieves W, Heang J, Asakrah S, Honer zu Bentrup K, Roy CJ, Morici LA. Immunospecific responses to bacterial elongation factor Tu during Burkholderia infection and immunization. PLoS One 2010;5(12):e14361. 31. Keller A, Nesvizhskii Al, Kolker E, Aebersold R. Empirical statistical model to estímate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and datábase search. Anal Chem 2002;74(20):5383-92. 32. Keller A, Eng J, Zhang N, L¡ XJ, Aebersold R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol Syst Biol 2005; 1 :0017, 2005. 33. Nuti D, Crümp R, Handayani F, Chantratita N, Peacock S, Bowen R, et al. AuCoin. Identification of circulating bacterial antigens by in vivo microbial antigen discovery. mBio 2011 ;2(4), e00136-11. 34. Morici LA, Heang J, Tate T, Didier PJ, Roy CJ. Differential susceptibility of inbred mouse strains to Burkholderia thailandensis aerosol infection. Microb Pathog 2010;48(1):9-17. 35. Harding SV, Sarkar-Tyson M, Smither SJ, Atkins TP, Oyston PC, Brown KA, et al. The Identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine 2007;25(14):2664-72. 36. Koeberling O, Seubert A, Granoff DM. Bactericidal antibody responses elicjted by a meningococcal outer membrane vesicle vaccine with overexpressed factor H-binding protein and genetically attenuated endotoxin. J Infect Dis 2008;198(2):262-70. 37. van de Waterbeemd B, Streefland M, van der Ley P, Zomer B, van Dijken H, Martens D, et al. Improved OMV vaccine against Neisseria meningitidis using genetically engineered strains and a detergent-free purification process. Vaccine 2010;28(30):4810-6. 38. Utaisincharoen P, Tangthawornchaikul N, Kespichayawattana W, Anuntagool N, Chaisuriya P, Sirisinha S. Kinetic studies of the production of nitric oxide (NO) and tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in macrophages stimulated with Burkholderia pseudomallei endotoxin. Clin Exp Immunol 2000; 122(3): 324-9. 39. Matsuura M, Kawahara K, Ezaki T, Nakano M. Biological activities of lipopolysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei. FEMS Microbiol Lett 1996;137(1 ):79-83. 40. Schaedler RW, Dubos RJ. The susceptibility of mice to bacterial endotoxins. J Exp Med 1961 ;113:559-70. 41. Prados-Rosales R, Baena A, Martínez LR, Luque-Garcia J, Kalscheuer R, Veeraraghavan U, et al. Mycobacteria reléase active membrane vesicles that modulate immune responses in a TL 2-dependent manner in mice. J Clin lnvest 2011;121(4):1471-83. 42. Sirisinha S, Anuntagool N, Intachote P, Wuthiekanun V, Puthucheary SD, Vadivelu J, et al. Antigenic differences between clinical and environmental isolates of Burkholderia pseudomallei. Microbiol Immunol 1998;42(11):731-7. 43. Anuntagool N, Aramsri P, Panichakul T, Wuthiekanun VR, Kinoshita R, White NJ, et al. Antigenic heterogeneity of lipopolysaccharide among Burkholderia pseudomallei clinical isolates. Southeast Asian J Trop Med Public Health 2000;31(suppl. 1): 146-52. 44. Gal-Tanamy M, Keck ZY, Yi M, McKeating JA, Patel AH, Foung SK, et al. In vitro selection of a neutralization-resistant hepatitis C virus escape mutant. Proc Nati Acad Sci USA 2008;105(49):19450-5. 45. Quenee LE, Cornelius CA, Ciletti NA, Elli D, Schneewind O. Yersinia pestis cafl variants and the limits of plague vaccine protection. Infect Immun 2008;76(5):2025-36. 46. Ovsyannikova IG, Pankratz VS, Vierkant RA, Jacobson RM, Poland GA. Human leukocyte antigen haplotypes in the genetic control of immune response to measles-mumps-rubella vaccine. J Infect Dis 2006;193(5):655-63. 47. Oster P, Lennon D, O'Hallahan J, Mulholland K, Reid S, Martin D. MeNZB: a safe and highly immunogenic tailor-made vaccine against the New Zealand Neisseria meningitidis serogroup B disease epidemic strain. Vaccine 2005;23(17-18):2191-6. 48. Oster P, O Hallarían J, Aaberge I, Tilman S, Ypma E, Martin D. Immunogenicity and safety of a strain-specific MenB OMV vaccine delivered to under 5-year olds in New Zealand. Vaccine 2007;25(16):3075-9. 49. Boutriau D, Poolman J, Borrow R, Findlow J, Domingo JD, Puig-Barbera J, et al. Immunogenicity and safety of three doses of a bivalent (B:4:p1.19, 15 and B:4:p1.7-2,4) meningococcal outer membrane vesicle vaccine in healthy adolescents. Clin Vaccine Immunol 2007; 14(1 ):65-73. 50. Lindblad EB. Aluminium compounds for use in vaccines. Immunol Cell Biol 2004;82(5):497-505. 51. Bergman MA, Cummings LA, Barrett SL, Smith KD, Lara JC, Aderem A, et al. CD4+ T cells and toll-like receptors recognize Salmonella antigens expressed in bacterial surface organelles. Infect Immun 2005;73(3): 1350-6. 52. Blander JM, Medzhitov . Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature 2006;440(7085):808-12. 53. Owen SJ, Batzloff M, Chehrehasa F, Meedeniya A, Casart Y, Logue CA, et al. Nasal-associated lymphoid tissue and olfactory epithelium as portáis of entry for Burkholderia pseudomallei in Murine Melioidosis. J Infecí Dis 2009; 199(12):1761-70. 54. Bhattacharjee AK, Izadjoo MJ, Zollinger WD, Nikolich MP, Hoover DL. Comparison of protective efficacy of subcutaneous versus intranasal immunization of mice with a Brucella melitensis lipopolysaccharide subunit vaccine. Infect Immun 2006;74(10):5820-5. 55. Haque A, Easton A, Smith D, O'Garra A, Van Rooijen N, Lertmemongkolchai G, et al. Role of T cells in innate and adaptive immunity against murine Burkholderia pseudomallei infection. J Infect Dis 2006;193(3):370-9. 56. Wong KT, Vadivelu J, Puthucheary SD, Tan KL. An immunohistochemical method for the diagnosis of melioidosis. Pathology 1996;28(2): 188-91. 57. Wong KT, Puthucheary SD, Vadivelu J. The histopathology of human melioidosis. Histopathology 1995;26(1 ):51-5. 58. Santanirand P, Harley VS, Dance DA, Drasar BS, Bancroft GJ. Obligatory role of gamma interferon for host survival ¡n a murihe model of infection with Burkholderia pseudomallei. Infect Immun 1999;67(7): 3593-600. 59. Lindenstrom T, Agger EM, Korsholm KS, Darrah PA, Aagaard C, Seder RA, et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells. J Immunol 2009; 182(12):8047-55. 60. Darrah PA, Patel DT, De Luca PM, Lindsay RW, Davey DF, Flynn BJ, et al. Multifunctionaln TH1 cells define a correlate of vaccine-mediated protection against Leishmania major. Nat Med 2007;13(7):843-50. 61. Roestenberg M, McCall M, Hopman J, Wiersma J, Luty AJ, van Gemert GJ, et al. Protection against a malaria challenge'by sporozoite inoculation. N Engl J Med 2009;361 (5):468-77. 62. Bomberger JM, Maceachran DP, Coutermarsh BA, Ye S, O'Toole GA, Stanton BA. Long-distance delivery of bacterial virulence factors by Pseudomonas aeruginosa outer membrane vesicles. PLoS Pathog 2009;5(4):e1000382. 63. Lertmemongkolchai G, Caí G, Hunter CA, Bancroft GJ. Bystander activation of CD8+ T cells contributes to the rapid production of IFN-gamma in response to bacterial pathogens. J Immunol 2001 ;166(2):1097-105.

EJEMPLO 9 La bacteria B. pseudomallei (Bps) es el agente causante de melioidosis, una enfermedad endémica en partes del sureste de Asia y norte de Australia. Bps se lista como agente selecto categoría B debido a su alta letalidad, resistencia innata a antibióticos, y amenaza histórica como arma biológica. Actualmente no hay vacuna efectiva contra este organismo. Las bacterias Gram negativas, incluyendo Bps, secretan vesículas de membrana externa (OMVs), los cuales se enriquecen con ácidos nucleicos, lípidos y proteínas. Las OMVs se han utilizado con éxito como vacuna contra Neissería meningitidis serogrupo B. La inmunogenicidad y eficacia protectora de OMVs nativas derivadas de Bps (nOMVs) se describe en el siguiente estudio ejemplar al utilizar ratones BALB/c y un modelo de desafío con aerosoles.

B. pseudomallei (Bps) es una bacteria intracelular Gram negativa, y el agente causante de melioidosis. La enfermedad puede manifestarse como septicemia aguda, neumonía y/o infección crónica y se asocia con morbilidad y mortalidad significativas. Bps es naturalmente resistente a la mayor parte de los antibióticos y actualmente no hay vacuna aprobada contra la infección sistémica o por inhalación. Previas estrategias de vacunación contra Bps incluyeron preparaciones de células completas inactivadas, cepas vivas atenuadas, vacunas de subunidades y DNA, entre otras, pero ninguna ha logrado una inmunidad estéril contra el desafío en dosis elevadas. También ha sido extremadamente difícil proteger contra la infección transmitida por aire. Las respuestas inmunitarias consideradas como protectoras contra la infección de Bps incluyen inmunidad por anticuerpos y mediada por células.

En este ejemplo, nOMVs preparadas a partir de cultivo liquido de Bps se demostraron como un novedoso candidato a vacuna contra melioidosis neumónica y septicémica. En este trabajo ejemplar, se probó la inmunogenicidad y eficacia protectora de OMVs nativas derivadas de Bps (nOMVs) al utilizar ratones BALB/c y un modelo de desafio con aerosoles.

Métodos: nOMVs de Bps y E. coli se purificaron al utilizar centrifugación en gradientes de densidad y se confirmaron visualmente por análisis de SDS-PAGE y microscopía electrónica de crio-transmisión. Grupos de ratones BALB/c (n=20) se inmunizaron de manera subcutánea (s.c.) o en forma intranasal (i.n.) con 2.5 g de Bps nOMV o E. coli nOMVs (i.n. solamente) sin adyuvante exógeno y se reforzaron en los días 21 y 42. Sangrados en serie se realizaron en el transcurso de la inmunización para medición de títulos de anticuerpos séricos. Los ratones se desafiaron en el día 70 con 5 LD50 (1000 cfu) de Bps depa 1026b por aerosol. La supervivencia se monitoreó estrechamente por 2 semanas y los tejidos se recolectaron de los sobrevivientes para determinar las cargas bacterianas. Una ilustración de la estrategia de inmunización con OMV ejemplar, empleada en este ejemplo, se proporciona en la Figura 21.

En un experimento separado, los ratones se inmunizaron s.c. con 5 pg de Bps nOMVs +/- 10 pg de CpG ODN y se desafiaron de manera intraperitoneal (i.p.) con 5 LD50 (105 cfu) de Bps cepa K96243.

Resultados: Bps nOMVs fueron altamente inmunogénicas en ratones BALB/c e indujeron altos títulos de IgG sérica específica de antígerio después de un solo refuerzo. No se detectó anticuerpo de reactividad cruzada en el suero de ratones inmunizados con E. coli nOMVs. Una protección significativa contra melioidosis neumónica se logró en ratones vacunados s.c. con Bps nOMVs. La protección contra el desafío con una cepa heteróloga de Bps también se logró y s mejoró por la adición de CpG. La IgG sérica especifica de LPS y CPS y las células T de memoria CD8+ especificas de OMV fueron significativamente superiores en los grupos protegidos de ratones y representan correlaciones inmunes de protección para la vacuna de OMVs.

Los ratones inmunizados s.c. con Bps OMVs se protegieron significativamente de la melioidosis neumónica y septicémica. En la Figura 22, la gráfica demuestra que los ratones inmunizados con 2.5 mg de OMVs s.c, pero no i.n., se protegieron significativamente del desafío con aerosoles. Los ratones que se inmunizaron s.c. con 5 mg de OMVs se protegieron significativamente del desafio i.p. y la protección se mejoró por la adición de adyuvante CpG. ** p < 0.01 ; *** p < 0.001.

Los ratones inmunizados con OMVs i.n. (Bp IN) y s.c. (Bp SC) produjeron niveles similares de IgG e IgA específicas de OMVs. Placas de microtitulación se recubrieron con Bps OMVs y los anticuerpos séricos se midieron por ELISA. Los sueros de ratones sin contacto previo y los inmunizados con E. coli OMVs (Ec IN) no reaccionaron con Bps OMVs. *p < 0.05 La Figura 23 demuestra que los ratones inmunizados s.c. con Bps OMVs produjeron concentraciones significativamente superiores de IgG sérica específica de LPS (véase la Figura 23A) e IgG sérica específica de CPS (véase la Figura 23B). Placas de microtitulación se recubrieron con LPS de Bth o CPS de Bps purificados, y la IgG sérica se midió por ELISA. ** p <0.01 ; ***p <0.001.

La Figura 24 demuestra que las células T CD8+ productoras de IFN-? de los ratones se incrementan significativamente en ratones inmunizados s.c. con OMVs de Bps. Células T CD4+ (véase la Figura 24A) y células T CD8* (véase la Figura 24B) esplénicas purificadas se estimularon nuevamente con Bps OMVs y la frecuencia de células productoras de IFN-? se enumeró por ELIspot. *** p <0.001.

Las nOMVs de B. pseudomallei representan una vacuna segura, económica y eficaz contra la melioidosis neumónica y septicémica. La protección en el grupo inmunizado con Bps OMV s.c. se asocia con altos títulos de IgG sérica específica de LPS y CPS y células T CD8+ productoras de IFN-? significativamente superiores. El estudio anterior demuestra que las respuestas inmunitarias de anticuerpos y celulares a Bps nOMVs son especificas. Además, este estudio demuestra que la adición de CpG ODN a la vacuna de OMVs mejoró la protección.

EJEMPLO 10 Prevención de infección pulmonar de Burkholderia al utilizar vesículas de membrana externa derivadas de bacterias El complejo de Burkholderia cepacia (Bcc) de oportunistas, incluyendo B. cenocepacia y B. multivorans, ha emergido como una causa significativa de infección pulmonar rápidamente fatal en individuos con fibrosis quística (CF) en Europa, Canadá y E.U. Medidas preventivas tal como la inmunización activa pueden reducir dramáticamente la incidencia de enfermedad, y aún actualmente no hay una vacuna comercjalmente disponible contra ningún miembro de Burkholderia. Tal como se demuestra en los Ejemplos anteriores, la inmunización con vesículas de membrana externa (OMVs) derivadas de Burkholderia pseudomallei proporcionó una protección significativa contra la infección pulmonar altamente letal lo cual se asoció con una rápida eliminación de las bacterias de los pulmones. Este Ejemplo describe a las OMVs como constituyentes de una plataforma de vacunación multi-antigénica, segura y económica que puede desarrollarse rápidamente para prevenir la infección pulmonar por Bcc en individuos con CF. Es imperativo que estrategias innovadoras de vacunación, tales como ciertas modalidades descritas en este documento, se utilicen para detener la Bcc epidémica en la población con CF.

A diferencia de la mayor parte de las infecciones bacterianas en pacientes con CF, la infección con la Bcc puede conducir a una neumonía necrotizante rápidamente progresiva conocida como "síndrome de cepacia". Debido a su letalidad, los individuos colonizados con Bcc pueden privarse de asistir a eventos sociales de CF o recibir un trasplante de pulmón. Considerando la virulencia de Bcc en individuos con CF y su profundo impacto en su bienestar mental y físico, se justifican las estrategias de prevención orientadas a Bcc. En efecto, la inherente multirresistencia a fármacos de la Bcc resalta la necesidad de opciones . preventivas en lugar de terapéuticas para reducir la morbilidad y mortalidad en la CF.

B, pseudomallei (Bps), el agente causante de melioidosis, es un pariente cercano del complejo Burkholderia cepacia (Bcc), que incluye B. cenocepacia y B. multivorans. Los Ejemplos anteriores describen estrategias de vacunación ejemplares contra Bps que utiliza vesículas de membrana externa (OMVs). Las OMVs se secretan en forma constitutiva de la superficie de bacterias Gram negativas y contienen numerosos antígenos protectores, incluyendo polisacáridos y proteínas. La inmunización de ratones con OMVs proporcionó protección significativa contra la infección pulmonar con Bps (véase la Figura 17; (1 )) y se asoció con una rápida eliminación de las bacterias de los pulmones (1 ). La protección mediada por vacunas descrita en los Ejemplos en este documento es superior de manera sorprendente en comparación con otros candidatos conocidos de vacunación inviables contra la infección pulmonar letal de Bps en un modelo de ratón. Los Ejemplos anteriores proporcionan una base para utilizar OMVs en estrategias de vacunación contra otras Burkholderia patogénicas. Abajo se describen OMVs derivadas de B. multivorans (Bm) que proporcionarán protección contra la infección pulmonar con Bm y mediarán protección cruzada contra otras Bcc, tal como B. cenocepacia (Be).

Las O Vs se purificaron de Bm y la presencia de antigenos de reactividad cruzada en Bm y Bps al utilizar sueros de ratones inmunizados con Bps OMVs se confirmó por transferencia Western (Figura 25, flechas). La presencia de antlgenos conservados en las OMVs de estas dos especies de Burkholdería soporta la probabilidad de antlgenos conservados en otras Bcc también y el potencial de una protección cruzada mediada por OMVs.

Este Ejemplo describe la eficacia protectora de OMVs derivadas de Bm contra la infección pulmonar por Bm a evaluarse. Las OMVs purificadas de Bm se utilizarán para inmunizar ratones BALB/c. Los ratones se desafiarán con Bm por la ruta intranasal (i.n.) y la eficacia de vacunación se valorará por la supervivencia, carga bacteriana e histopatologla. Se medirán respuestas de anticuerpos específicos de OMV y Bm en mucosas y sistémicos.

Este Ejemplo también describe la eficacia protectora de OMVs derivadas de Bm contra la infección pulmonar por Be. Los ratones se inmunizarán con Bm OMVs como se describe anteriormente, pero se desafiarán con Be para valorar la protección cruzada.

Métodos: El diseño experimental se ilustra en la Figura 26. Los ratones (n=20) se inmunizarán de manera subcutánea con 5 g de OMVs derivadas de Bm suspendidas en 100 µ? de PBS en el día 0 y se reforzarán en los días 21 y 42. Los ratones inmunizados simuladamente (n = 20) recibirán sólo PBS. No se usará adyuvante exógeno dado que las OMVs son altamente ¡nmunogénicas por sí mismas. Véase, por ejemplo, Nieves ef al., Vaccine, 29(46):8381 -9 (2011), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Cuatro semanas después de la última inmunización, 10 ratones de cada grupo se infectarán por la ruta i.n. con 5 LD50 de Bm o Be. Los 10 ratones restantes en cada grupo no se desafiarán pero se utilizarán para la medición de respuestas de anticuerpos específicos de antlgenos. Los ratones infectados se monitorearán para la supervivencia por un período de dos semanas.

Las cargas bacterianas sistémicas y tisulares se determinarán animales sacrificados y en sobrevivientes sacrificados en el punto final del estudio por cultivos de diluciones en serie de homógenizados de sangre y tejido. La producción de citocinas se medirá en homógenizados de sangre y pulmón al utilizar un ensayo de multi-citocinas Luminex. La histopatologla se realizará por un patólogo de Tulane "ciego" que calificará las secciones en una escala graduada como se describe previamente, por ejemplo, en Morici, L. et al., Microbial pathogenesis', 48(1):9-17 (2010), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Los anticuerpos específicos de antígenos se medirán en los sueros y fluido de lavado broncoalveolar (BAL) de animales inmunizados con O V y control en los días 0 (pre-inmune), 21 , 42, y 70 para valorar las respuestas de anticuerpos en el transcurso de la inmunización y antes del desafío. Las IgG, IgGI , lgG2a, lgG3, e IgA específicas de antígenos se medirán por ELISA como se describe previamente, por ejemplo, en Nieves et al. (2011 ). Con el fin de determinar la capacidad de los anticuerpos generados para la vacuna de OMVs para promover la eliminación bacteriana, la actividad opsono-fagocítica y eliminación mediada por complemento de Bm y Be se analizará ex vivo como se describe, por ejemplo, en Ho et al., Infect Immun., 65(9):3648-53 (1997), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia.

Resultados: La inmunización con OMVs proporcionará protección significativa contra Be y/o Bm lo cual se asociará con rápida eliminación bacteriana, histopatología e inflamación reducidas, y altos títulos de anticuerpos sistémicos y en mucosas específicos de OMVs. Se conducirá un estudio de eficacia a mayor escala en ratones inactivados en CFTR y un modelo de primates no humanos de infección por Burkholderia.

Los Ejemplos previos presentados en este documento describen la purificación de OMVs a partir de Bm, Bps, y otras numerosas bacterias Gram negativas y además muestran que estas están libres de contaminación bacteriana con el fin de proceder con los estudios de inmunización. Si la inmunización de ratones con OMVs derivadas de Bm muestra eficacia reducida contra el desafío heterólogo con Be, entonces las OMVs de Be se purificarán y utilizarán para estudios de inmunización y desafío con Be. Una mezcla de OMVs derivadas de diversos miembros de Bcc puede utilizarse como fórmula de vacunación única para lograr una protección de amplio espectro contra Burkholderia.

Referencias 1. Nieves et al., Vaccine, 29(46):8381-9 (2011 ) 2. Morid, L. et al., Microbial pathogenesis, 48(1):9-17 (2010) 3. Ho et al., Infect Immun., 65(9):3648-53 (1997) EJEMPLO 11 Este Ejemplo describe el uso de vacunas de OMV en un modelo de primate no humano (NHP) de melioidosis neumónica que se describió en los Ejemplos modelo anteriores. La inmunización con OMVs de macacos rhesus inducirá respuestas protectoras de anticuerpos y CMI contra Bps.

Este Ejemplo describe respuestas inmunitarias protectoras a la inmunización con Bps OMVs en el macaco rhesus. Los anticuerpos específicos de antígenos, células T CD4+ y CD8+ se cuantificarán y compararán en animales inmunizado con O Vs y simulados (n = 2 por grupo). Ensayos bactericidas de anticuerpos y células T efectoras también se realizarán ex vivo como medida cualitativa de las respuestas inmunitarias.

Este Ejemplo también describe la protección de macacos inmunizados con OMV contra el desafio con aerosoles con Bps. Cuatro semanas después de la inmunización, los animales se desafiarán con una dosis letal de Bps por aerospl. La supervivencia y progresión de enfermedad se monitorearán estrechamente por 21 días. Las cargas bacterianas sistémica y por mucosas, histopatología y respuestas inmunitarias se determinarán en animales sacrificados y en sobrevivientes en el punto final del estudio.

La inmunización con OMVs de macacos rhesus inducirá respuestas protectoras de anticuerpos y células T similares a las observadas previamente en ratones. La eficacia protectora de la vacuna de OMVs en el modelo que semeja más es estrechamente la melioidosis humana también se determinará.

Antecedentes Bps es un problema principal de salud pública en las regiones endémicas del sureste de Asia y norte de Australia, y aún el organismo tiene un distribución mundial y los casos probablemente no se reportan de manera adecuada (1 ). En el noreste de Tailandia, la tasa de mortalidad asociada con la infección de Bps está por arriba de 40%, lo que la hace la 3a causa más común de muerte a partir de enfermedad infecciosa en esa región después del HIV/AIDS y TB (2). La resistencia inherente de Bps a múltiples antibióticos impide el tratamiento, lo que promueve una profilaxis agresiva por hasta 6 meses con recaldaicomún (3-5). Más allá de su significancia en salud pública, Bps se considera potencial como agente bioterrorista por U.S. DHHS y recientemente se recomendó para la clasificación Tier 1 , un estatus también asignado a Yersinia pestis y Bacillus anthracls, entre otros. Una vacuna protectora contra Bps es la mejor opción para reducir la morbilidad y mortalidad en áreas endémicas y para proporcionar una medida preventiva contra un ataque biológico con este organismo dado que un agresivo tratamiento de antibióticos a menudo falla, pero no ha emergido un candidato ideal contra Bps a partir de estudios precllnicos.

Una cepa de vacuna viva atenuada, 2D2, induce respuestas inmunes humoral y mediada por células (CMI) y confiere una protección significativa contra el desafío sistémico de Bps en ratones (6), pero la capacidad de Bps para establecer una infección latente plantea problemas de seguridad para aplicaciones de vacunas vivas. Las formulaciones de vacunas que utilizan polisacáridos purificados, proteínas recombinantes (es decir sistema de secreción Tipo 3 o proteínas de membrana externa) y vacunas de DNA han mostrado sólo éxito limitado, particularmente contra el desafio con aerosoles (7-9). Adicionalmente, ninguna de estas vacunas logró inmunidad esterilizante contra el desafío en altas dosis con este patógeno persistente (10). En contraste, los Ejemplos representativos anteriores en este documento demostraron que la inmunización de ratones con OMVs derivadas naturalmente proporcionó una protección significativa contra el desafío con aerosoles con Bps. Los datos proporcionados in los Ejemplos representativos anteriores demuestran que se logró la eliminación bacteriana significativa en tejidos conocidos por albergar Bps persistente, lo cual puede asociarse con la inducción observada de respuestas de células T CD4+ y CD8+ a las OMVs. Esta observación es significativa dado que las formulaciones de vacunación inviables a menudo no suscitan respuestas robustas de células T CD8+ y aún las OMVs parecen ser capaces de hacerlo. La persecución de vesículas como plataforma de vacunación se soporta además por el trabajo reciente que muestra el suministro mediado por vesículas de factores de virulencia por M. tuberculosis (11 ) y B. anthracis (12), un proceso que no es aleatorio ni pasivo sino selectivo y dirigido por la bacteria (13). Los Ejemplos representativos en este documento proporcionan una estrategia de vacunación innovadora contra Bps que es segura, económica, y eficaz contra la infección por aerosol - una proeza no lograda por ningún otro candidato a vacuna.

Las plataformas de vacunación que son efectivas contra patógenos bacterianos intracelulares siguen siendo de alta prioridad. Además del impacto global de las infecciones bacterianas intracelulares sobre la salud pública, el alarmante incremento en cepas multirresistentes a fármacos, tales; como Mycobactenum tuberculosis, y la amenaza potencial de ataque biológico con agentes selectos, tales como B. pseudomallei (Bps) y B. mallei, destacan la urgente necesidad de vacunas seguras y efectivas contra este grupo colectivo de patógenos. Una vacuna que puede suscitar una variedad de respuestas inmunitarias, incluyendo anticuerpos, células T cooperadoras CD4+ y CD8+ citotóxicas es especialmente deseable para bacterias que establecen una infección intracelular. Los Ejemplos representativos anteriores demuestran que la inmunización con vesículas de membrana externa (OMVs) derivadas naturalmente puede proporcionar protección contra una bacteria intracelular en aerosol, Bps. Adicionalmente, las vacunas 'de OMVs proporcionadas en los Ejemplos representativos anteriores proporcionan protección superior a cualquier otro candidato a vacuna de Bps probado hasta el momento.

Las OMVs se secretan en forma constitutiva por las bacterias gram negativas y a menudo se enriquecen con numerosos factores de virulencia y agonistas de receptores similares a Toll, lo que las hace candidatos ideales a vacunas multi-antigénicas. En apoyo a esto, los datos de los Ejemplos representativos anteriores demuestran que: (1 ) las Bps OMVs contenían los antígenos independientes T, lipopolisacárido y polisacárido capsular, así' como múltiples proteínas inmunogénicas que pueden haber contribuido colectivamente a la protección; (2) la inmunización con OMV indujo respuestas inmunes humoral y mediada por células (CMI) específicas de antígeno en ratones; y (3) la inmunización con OMV protegió a ratones BALB/c altamente susceptibles del desafío letal intraperitoneal y con aerosoles con Bps.

El trabajo de vacunación con OMVs presentado en este documento representa una divergencia de lo establecido con respecto a la mayor parte de los estudios de vacunas de OMV a la fecha. Estudios de inmunización que utilizan vesículas han abordado predominantemente patógenos extracelulares, tales como N. meningitides (14), Vibrio cholerae (15), y B. anthracis (12) y de esta manera han enfatizado en gran medida la protección mediada por anticuerpos. Otros estudios que utilizaron OMVs para expresar antígenos heterólogos o como vehículos de suministro de vacunas también se orientaron a la inmunidad humoral (16-18). En contraste, en un aspecto de la invención, los Ejemplos representativos presentados en este documento confirman que las OMVs constituyen una formulación de vacunación inviable multi-antigénica que puede inducir respuestas de anticuerpos y células T específicas de antígenos a un patógeno intracelular. Las OMVs pueden suministrar factores de virulencia directamente en el citoplasma del hospedador mediante fusión de OMVs con balsas lipídicas en la membrana plasmática del hospedador (19) pero la degradación de OMVs en los compartimientos lisosómicos también se ha observado (20). Estos atributos pueden facilitar la presentación de antígenos del cargamento de OMVs mediante MHC Clase I y Clase II, respectivamente. Aunque otros han mostrado que OMVs de S. typhimurium suscitan respuestas robustas de células B y T CD4+ durante la infección (21 , 22), los Ejemplos representativos presentados en este documento demuestran la inducción de OMV de células T CD8+. La presentación por MHC Clase I y Clase II del cargamento de OMV es sorprendente, y un beneficio altamente favorable para su uso en una plataforma de vacunación contra bacterias intracelulares. El uso de OMVs para suscitar inmunidad celular es una contribución novedosa e inventiva al campo de las OMVs, y puede aplicarse a otras bacterias persistentes intracelulares, tales como M. tuberculosis, al utilizar sus propias vesículas homólogas (11). Alternativamente, los estudios al utilizar vesículas nativas pueden guiar un diseño de vacuna racional de nanopartículas sintéticas o liposomas diseñados para expresar antígenos protectores esenciales. : A pesar de los esfuerzos en investigación y vacunas mejoradas en años recientes, las estrategias tradicionales de vacunación que emplean cepas bacterianas atenuadas, proteínas recombinantes, o lipo o polisacárido capsular purificado han fallado en suscitar una completa protección contra el desafio con aerosoles con Bps (23). La inhalación representa la ruta primaria de infección en un ataque biológico deliberado y es imperativo que los candidatos a vacunas sean eficaces contra esta ruta de desafío. Los Ejemplos representativos anteriores han demostrado que los ratones BALB/c altamente susceptibles inmunizados con OMVs por la ruta subcutánea (SC) mostraron 60% de supervivencia contra el desafio con aerosoles letal de Bps (5 LD50, aproximadamente 1000 cfu/pulmón) en comparación con 0% de supervivencia en animales sin contacto previo (véase la Figura 17; (24)). Esto representa la mejor protección mediada por vacunas lograda hasta el momento por un candidato a vacuna inviable contra la melioidosis neumónica letal en el modelo de ratón.

Como se describe en los Ejemplos anteriores, las modalidades de las formulaciones de vacunación de OMVs presentadas en este documento no contienen adyuvante exógeno adicional y utilizan una muy baja cantidad de antlgeno (2.5 pg de proteína de OMV). Se evaluaron los efectos de agregar un adyuvante exógeno, CpG ODN, y/o incrementar la cantidad de antígeno para potenciar la capacidad protectora de las OMVs. Ratones inmunizados SC con 5 pg de OMVs se protegieron significativamente contra el desafío intraperitoneal (IP) con 5 LD50 (aproximadamente 8 x 105 cfu) de Bps 96243, mientras 20 de 20 ratones control sucumbieron dentro de 72 h del desafío (véase la Figura 27). La incorporación de adyuvante CpG a la fórmula de OMV mejoró significativamente la protección (véase Fig. 27). Estos datos indican que la incorporación de adyuvante CpG mejora la protección mediada por la vacuna de OMVs proporcionan evidencia de que las OMVs derivadas de Bps cepa 1026b proporcionan protección contra una cepa heteróloga de Bps (K96243).

La Figura 27 demuestra que el adyuvante CpG mejoró la protección mediada por vacunas de OMV contra Bps. Los ratones (n = 10 por grupo) se desafiaron con 5 LD50 de Bps K96243 por inyección IP. Los ratones inmunizados con 5 pg de OMVs (derivadas de la cepa 026b) o 5 pg de OMVs mezcladas con 10 pg de CpG ODS se protegieron significativamente en comparación con ratones control (ratones que recibieron CpG solamente o ratones sin contacto previo) (***P < 0.001 ; **P <0.01 al utilizar un análisis de supervivencia Mantel-Cox de rango logarítmico). Nota: Dos ratones en el grupo OMV/CpG se sacrificaron debido a la formación de abscesos en el sitio de inyección y técnicamente no sucumbieron a la infección.

A diferencia de los ratones inmunizado SC, los ratones inmunizado en forma intranasal (IN) con OMVs no se protegieron contra el desafio con aerosoles de Bps (véase la Figura 17; (24)). Véase, por ejemplo, Nieves, W. et al., Vaccine, 29:8381-8389 (2011), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Las diferencias en protección entre ratones inmunizados SC e IN no pudo discriminarse con base en las respuestas de anticuerpos específicos de OMV totales. Nieves, W. et al. (2011 ) mostraron que las Bps OMVs contienen los antígenos protectores, lipopolisacárido (LPS) y polisacárido capsular (CPS), lo cual sugiere que estos antígenos bacterianos T-independientes pueden contribuir a la protección por vacunación mediada por OMVs. En apoyo de esto, los ratones inmunizado SC generaron concentraciones significativamente superiores de IgG sérica específica de LPS y CPS, en comparación con los controles, así como concentraciones significativamente superiores de IgG sérica específica de CPS, en comparación con ratones inmunizados IN (véase la Figura 28). Estas observaciones pueden contribuir a las diferencias en protección observadas en ratones inmunizados SC e IN con Bps OMVs.

La Figura 28 demuestra que la inmunización con OMV indujo anticuerpos protectores específicos de LPS y CPS. Los ratones se inmunizaron IN (3 x i.n.) o SC (3 x s.c.) con 2.5 de Bps OMVs. Los controles no recibieron (sin contacto previo) o recibieron 2.5 µg de OMVs derivadas de E. coli (3 x i.n.). Se obtuvo suero 1 mes después de la última inmunización y se utilizó para medir IgG específica de LPS o CPS por ELISA. ***p< 0.001 ; **p<0.01 al utilizar una ANOVA de un solo factor.

Además, los ratones inmunizados SC exhibieron cifras significativamente superiores de células T CD8+ específicas de OMV y productoras de IFN-? en comparación con los grupos no protegidos (véase la Figura 29). Aunque no se desea limitar por alguna teoría en particular, las diferencias en la supervivencia observada entre animales inmunizados SC y IN pueden indicar que el anticuerpo específico de LPS y CPS y/o células T CD8+ de memoria representan correlaciones inmunes de protección a la vacuna de OMV. Esto se examinará y caracterizará además en el macaco rhesus.

La Figura 29 demuestra que la inmunización SC con OMVs indujo células de memoria T CD4+ y CD8+ de ratones inmunizados (n = 5 por grupo) que se estimularon nuevamente con OMVs y el número de células productoras de IFN-? se enumeró por ELIspot. Células sin estimular y células estimuladas con PMA/ionomicina se utilizaron como controles negativo y positivo, respectivamente. *"p< 0.001 al utilizar una ANOVA de un solo factor Parte 1 - Evaluación de respuestas inmunitarias protectoras a la inmunización con Bps OMVs en el macaco rhesus.

Se ha mostrado previamente que la protección mediada por la vacuna de OMVs está en gran medida mediada por anticuerpos lo cual puede ser porque los patógenos bacterianos extracelu lares se han orientado predominantemente hasta el momento. Véase, por ejemplo, las referencias (15, 16, 25), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Este atributo de las OMVs es favorable contra Bps dado que las respuestas de anticuerpos a la par de las respuestas CMI proporcionan una mejor protección contra Bps que la CMI sola. Véase, por ejemplo, la referencia (26), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Además de la activación del complemento, la orientación lisosómica mediada por el receptor Fe puede potenciar la protección contra Bps tal como se demuestra para otras bacterias intracelulares. Véase, por ejemplo, la referencia (27), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia, De esta manera, las respuestas de anticuerpos inducidas por la inmunización con OMVs pueden desempeñar una función significativa en la protección contra Bps, especialmente durante las primeras fases de la enfermedad. Esto se soporta por estudios de inmunización pasiva y activa que han mostrado que el anticuerpo especifico para LPS o CPS puede mediar la protección a la infección aguda con Bps (7, 28-30).

Tal como se demuestra en los Ejemplos representativos anteriores, las OMVs también pueden estimular respuestas de células T de memoria en ratones inmunizados, pero las funciones respectivas de las células T CD4+ y CD8+ en la protección mediada por vacunación contra Bps pueden elucidarse posteriormente para entender mejor los elementos esenciales de la inmunidad adquirida. Aunque no se desea limitar por ninguna teoría particular, los anticuerpos producidos contra LPS y CPS pueden conferir inmunidad protectora de corto plazo mientras las proteínas de OMV promueven una inmunidad esterilizante dependiente de células T, lo cual da cuenta de la efectividad de la vacuna de OMVs. Este Ejemplo evalúa la capacidad de las OMVs para inducir respuestas humorales y de CMI en macacos rhesus.

Métodos: Cuatro macacos rhesus se utilizarán en este estudio piloto. Dos animales se ¡inmunizarán con 100 g de OMV mezcladas con 400 pg de CpG ODN 2395 y a dos animales se les dará 4Ó0 µ?? de CpG solamente. Otros en el campo han mostrado que el CpG potencia la protección por vacunación contra Bps. Véase, por ejemplo, las referencias (8, 31, y 32), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. La cantidad de vacuna de OMVs administrada a los macacos se incrementa a partir de la cantidad utilizada en ratones debido a 1) el incremento en masa corporal y 2) cantidades similares de antfgeno proteico/CpG han mostrado inducir respuestas inmunitarias humoral y celular robustas en macacos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en la referencia (33), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. La cantidad total de LPS administrado como parte de la vacuna de OMVs es 20 g/dosis, muy por debajo de los límites de endotoxina para NHP en investigación pre-clínica como se describe, por ejemplo, en la referencia (34), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Sin embargo, la seguridad y toxicidad de la vacuna de OMVs se monitoreará por química sanguínea y por observaciones diarias de estado de salud. El diseño experimental para el estudio se ilustra en la Figura 30. Los animales se inmunizarán en el día 0 y reforzarán en el día 28.

Los anticuerpos específicos de antígenos se medirán en los sueros de animales inmunizados con OMV y control en los días 0 (pre-inmune), 14, 28, 42 y 56 para valorar las respuestas de anticuerpos en el transcurso de la inmunización y antes del desafío. La IgM, IgG, e IgA séricas especificas de antígeno se medirán de manera separada por ELISA como se describe previamente, por ejemplo, en las referencias (24 y 35), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. Placas de microtitulación se recubrirán con bacterias completas inactivadas, OMV, LPS, o CPS purificados, y los títulos de anticuerpos específicos de antígeno se medirán por dilución en serie de los sueros. Para determinar la capacidad de los anticuerpos generados para la vacuna de OMVs para promover la eliminación bacteriana, la actividad opsono-fagocltica y eliminación mediada por complemento de Bps se analizarán in vitro al utilizar sueros obtenidos en los días 0, 28, 42, y 56 como se describe previamente, por ejemplo, en la referencia-(36), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. Se conducirán tres experimentos individuales, cada uno realizado por triplicado.

Las respuestas de células T específicas de antígenos a la vacuna de OMVs se medirán en los días 0, 28, y 56 al utilizar PBMCs aislados de sangre. Los PBMCs obtenidos de animales inmunizados y control se reestimularán con bacterias completas inactivadas o OMVs purificadas, y el número y frecuencia de células T CD4+ y CD8+ productoras de una sola y multi-citocinas (IFN-y, TNF-a, IL-2) se determinarán por tinción intracelular de citocinas y citometría de flujo con la ayuda del TNPRC Immunology Core. En un experimento paralelo, los PBMCs se ordenarán al utilizar un clasificador celular FACS-Aria para aislar células T CD4+ y CD8+. Las células T aisladas se cocultivarán con macrófagos de primate (derivados de PBMCs del día 0) que se han infectado con Bps y la eliminación de bacterias intracelulares se medirá para valorar las respuestas de células T efectoras como se describe previamente, por ejemplo, en (37). Se conducirán tres experimentos individuales, cada uno realizado por triplicado.

La inmunogenicidad y seguridad de O Vs en NHPs se demostrará para corroborar que las respuestas inmunitarias humoral y celular se suscitan por la vacuna de OMVs. Específicamente, altos títulos (>1 :1000) de IgG específica de OMV, LPS y CPS en el suero de animales inmunizados con OMV en el día 42 ser detectarán. Esto indicará una respuesta inmunitaria humoral robusta en estos animales la cual puede proporcionar protección contra el desafío con aerosoles subsecuente con Bps.

La inmunización con OMV también estimulará las respuestas inmunitarias celulares específicas de antígeno por el día 56. Específicamente, se observará un incremento en el número de células T CD4+ y CD8+ productoras de IFN-? o de triple citocina en respuesta a la inmunización con OMV. Evidencia reciente ha sugerido que las células T cooperadoras capaces de producir múltiples citocinas antimicrobianas y proliferativas (IFN-?, TNF-a, IL-2) en la misma célula son la mejor correlación de protección para una vacunación efectiva contra una diversidad de patógenos intracelulares incluyendo Leishmania major, M. tuberculosis, y Plasmodium' falciparum. Véase, por ejemplo, las referencias (38-40), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia. La inducción por OMV de células T efectoras de memoria eliminará las bacterias intracelulares cuando se valora en el ensayo de colcultivo ex vivo y por conteo de cargas bacterianas tisulares.

Cuatro sangrados antes del desafío se implementarán para valorar las respuestas de anticuerpos a la vacuna de OMVs. Si una respuesta de IgG significativa no se observa al día 42, un segundo refuerzo se administrará en el día 56. Adicionalmente, la cantidad de antígeno se incrementará si no se ha observado toxicidad con las primeras dos dosis de vacuna y/o se incorporará hidróxido de aluminio como adyuvante con el fin de reforzar los títulos de anticuerpos, con el fin de incrementar la probabilidad de protección.

Parte 2 - Evaluación de la protección de macacos inmunizados con OMV contra el desafío con aerosoles con Bps.

La preparación de vacunación de multi-antígenos de OMV descrita en los Ejemplos representativos en este documento inesperada y sorprendentemente proporciona protección superior contra el desafío con aerosoles de Bps en comparación con otras vacunas conocidas probadas en el modelo múrido. Véase, por ejemplo, la referencia (24), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia. La vacunación con OMV conferirá protección contra la melioidosis neumónica aguda en macacos rhesus. Además, la inmunización con OMV reducirá o eliminará la persistencia bacteriana y patología in los pulmones, hígado, y bazo de animales infectados.

Un estudio con seis macacos rhesus se realizó para establecer la dosis letal para Bps cepa 1026b en aerosol en estos animales. Los macacos rhesus se desafiaron con 104 - 106 cfu de Bps en aerosol (véase la Figura 31A). Los macacos que recibieron 10s cfu mostraron signos y síntomas de infección aunque en última instancia sobrevivieron al desafio. En contraste, los macacos que recibieron 106 cfu tuvieron un rápido comienzo de enfermedad y sucumbieron dentro de los 7-10 días de desafío. Todos los animales tuvieron números similares de bacterias en la sangre y fluido de lavado broncoalveolar (BAL) dentro de 7 días post-exposición (Figura 31 B y 31 C), pero sólo los animales desafiados con 106 cfu desarrollaron hemorragia pulmonar y patología sistémica (Figura 31 D-H). La progresión de enfermedad y patología macroscópica observadas en los macacos rhesus experimentalmente infectados es consistente con lo reportado para un macaco naturalmente infectado y estrechamente semeja la melioidosis humana, lo que de esta manera proporciona un modelo animal altamente relevante para evaluar la eficacia de vacunación. Véase, por ejemplo, las referencias (4) y (41 ), cuyas descripciones se incorporan en este documento para referencia.

La Figura 31 demuestra los efectos de primates expuestos por aerosol a B. pseudomallei 1026b en tres dosis objetivo: (A) con bacterias significativas en la sangre; en +1 d Pl (B); y en BAL (C) a +1d y +7d Pl. Los pulmones muestran signos de hemorragia de un animal que sucumbió a la enfermedad a +7d Pl (D). Un animal expuesto a aproximadamente <1 logaritmo en la dosis de desafio muestra menos trauma al pulmón (E). El análisis histopatológico indica necrosis traqueal focal (F), hiperplasia linfoide (G), e inflamación focal en el hígado (H).

Métodos: Cuatro semanas después de la última inmunización, los animales de la Parte 1 de este Ejemplo se desafiarán con Bps por aerosol. Los macacos se desafiarán con 2 x 106 cfu con el fin de lograr la letalidad in los animales control dentro de 10 días (día 66 en la Figura 31 anterior). La progresión de enfermedad y supervivencia se monitorearán por 21 días. Las cargas bacterianas sistémicas y tisulares se determinarán animales sacrificados y en Sobrevivientes sacrificados en el punto final del estudio por cultivos de diluciones en serie de homogenizados de sangre, fluido de BAL y tejido. La necropsia completa (RBL) se realizará por un patólogo veterinario de TNPRC. La producción de citocinas se medirá en homogenizados de sangre, BAL y pulmón de los animales sacrificados y en sobrevivientes al final del estudio al utilizar un ensayo de multi-citocinas Luminex. El punto final primario para el establecimiento de eficacia de vacunación protectora es la supervivencia de animales inmunizados en comparación con los controles. Los puntos finales secundarios incluyen tiempo medio incrementado a la muerte y/o reducción en la patología tisular y carga bacteriana. Mediciones cualitativa y cuantitativa de anticuerpos y células T específicos para Bps se realizarán en la Parte 1 de este Ejemplo para valorar el potencial para protección y para ajustar los regímenes de inmunización por consiguiénte.

La inmunización con OMV proporcionará cierto nivel de protección en macacos, lo cual puede manifestarse como supervivencia, tiempo retardado a la muerte, patología reducida, y/o reducción en las cargas bacterianas. Adicionalmente, el resultado para cada animal ser evaluará en el contexto de sus respuestas ¡nmumtarias individuales lo que ayudará a elucidar las correlaciones inmunes de resistencia versus susceptibilidad.

Referencias: 1. Currie BJ, Fisher DA, Howard DM, Burrow JN, Selvanayagam S, Snelling PL, et al. The epidemiology of melioidosis in Australia and Papua New Guinea. Acta Trop. 2000;74(2-3):121-7. PubMed PMID: 10674639. 2. Limmathurotsakul D, Wongratanacheewin S, Teerawattanasook N, Wongsuvan G, Chaisuksant S, Chetchotisakd P, et al. Increasing incidence of human melioidosis in Northeast Thailand. Am J Trop Med Hyg. 2010;82(6):1113-7. Epub 2010/06/04. doi: 10.4269/ajtmh.2010.10-0038. PubMed PMID: 20519609; PubMed Central PMCID: PMC2877420. 3. Limmathurotsakul D, Wuthiekanun V, Wongsuvan G, Pangmee S, Amornchai P, Teparrakkul P, et al. Repeat blood culture positive for B. pseudomallei indicates an increased risk of death from melioidosis. Am J Trop Med Hyg. 2011 ;84(6):858-61. Epub 2011/06/03. doi: 10.4269/ajtmh.2011.10-0618. PubMed PMID: 21633019; PubMed Central PMCID: PMC3110378. 4. Limmathurqtsakul D, Peacock SJ. Melioidosis: a clinical overview. Br Med Bull. 20T1 ;99:125- 39. Epub 2011/05/12. doi: 10.1093/bmb/ldr007. PubMed PMID: 21558159. 5. Chaowagul W, Chierakul W, Simpson AJ, Short JM, Stepniewska , Maharjan B, et al. Open-label randomized trial of oral trimethoprim-sulfamethoxazole, doxycycline, and chloramphenicol compared with trimethoprim-sulfamethoxazole and doxycycline for maintenance therapy of melioidosis.

Antimicrob Agents Chemother. 2005;49(10):4020-5. PubMed P ID: 16189075. 6. Atkins T, Prior RG, ack , Russell P, Nelson M, Oyston PC, et al. A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis. Infect Immun. 2002;70(9):5290-4. PubMed PMID: 12183585. 7. Nelson M,- Prior JL, Lever MS, Jones HE. Atkins TP, Titball RW. Evaluation of Hpopolysacchande and capsular polysaccharide as subunit vaccines against experimental melioidosis. J Med Microbiol. 2004;53(Pt 12): 1177-82. PubMed PMID: 15585494. 8. Harland DN, Chu K, Haque A, Nelson M, Walker NJ, Sarkar-Tyson M, et al. Identification of a LolC homologue in Burkholderia pseudomallei, a novel protective antigen for melioidosis. Infect Immun. 2007;75(8):4173-80. PubMed PMID: 17517877. 9. Chen YS, Hsiao YS, Lin HH, Yen CM, Chen SC, Chen YL. Immunogenicity and anti-Burkholderia pseudomallei activity in Balb/c mice immunized with plasmid DNA encoding flagellin. Vaccine. 2006;24(6):750-8. PubMed PMID: 16169637. 10. Sarkar-Tyson M, Titball RW. Progress toward development of vaccines against melioidosis: A review. Clin Ther. 2010;32(8): 1437-45. Epub 2010/08/24. doi: 10.1016/j.clinthera.2010.07.020. PubMed PMID: 20728758. 11. Prados-Rosales R, Baena A, Martínez LR, Luque-Garcia J, Kalscheuer R, Veeraraghavan U, et al. Mycobacteria reléase active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. J Clin Invest. 2011 ;121(4):1471-83. Epub 2011/03/03. doi: 10.1172/JCI44261. PubMed PMID: 21364279; PubMed Central PMCID: PMC3069770. 12. Rivera J, Cordero RJ, Nakouzi AS, Frases S, Nicola A, Casadevall A. Bacillus anthracis produces membrane-derived vesicles containing biologically active toxins. Proc Nati Acad Sci U S A. 2010; 107(44): 19002-7. Epub 2010/10/20. doi: 10.1073/pnas.1008843107. PubMed PMID: 20956325; PubMed Central PMCID: PMC2973860. 13. Haurat MF, Aduse-Opoku J, Rangarajan M, Dorobantu L, Gray MR, Curtís MA, et al.

Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J Biol Chem. 2011,286(2) 1269-76. Epub 2010/11/09. doi: 10.1074/jbc.M110.185744. PubMed PMID: 21056982; PubMed Central PMCID: PMC3020734. 14. Holst J, Martin D, Arnold R, Huergo CC, Oster P, O'Hallahan J, et al. Properties and clinical performance of vaccines containing outer membrane vesicles from Neisseria meningitidis. Vaccine. 2009;27 Suppl 2:B3-12. PubMed PMID: 19481313. 15. Schild S, Nelson EJ, Camilli A. Immunization with Vibrio cholerae outer membrane vesicles induces protective immunity in mice. Infect Immun. 2008;76(10):4554-63. PubMed PMID: 18678672. 16. Muralinath M, Kuehn MJ, Roland KL, Curtiss R, 3rd. Immunization with Salmonella entérica serovar Typhimurium-derived outer membrane vesicles delivering the pneumococcal protein PspA confers protection against challenge with Streptococcus pneumoniae. Infect Immun. 2011 ;79(2):887-94. Epub 2010/12/01. doi: 10.1128/IAI.00950-10. PubMed PMID: 21115718; PubMed Central PMCID: PMC3028854. 17. Chen DJ, Osterrieder N, Metzger SM, Buckles E, Doody AM, DeLisa MP, et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proc Nati Acad Sci U S A. 2010;107(7):3099-104. Epub 2010/02/06. doi: 10.1073/pnas.0805532107. PubMed PMID: 20133740; PubMed Central PMCID: PMC2840271. 18. Kim JY, Doody AM, Chen DJ, Cremona GH, Shuler ML, Putnam D, et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J Mol Biol. 2008;380(1):51-66. PubMed PMID: 18511069. 19. Bomberger JM, Maceachran DP, Coutermarsh BA, Ye S, O'Toole GA, Stanton BA. Long-distance delivery of bacterial virulence factors by Pseudomonas aeruginosa outer membrane vesicles. PLoS Pathog. 2009;5(4):e1000382. PubMed PMID: 19360133. 20. Amano A, Takeuchi H, Furuta N. Outer membrane vesicles function as offensive weapons in host-parasite interactions. Microbes Infect. 2010;12(11):791-8. Epub 2010/08/06. doi: 10.1016/j.micinf.2010.05.008. PubMed PMID: 20685339. 21. Alaniz RC, Deatherage BL, Lara JC, Cookson BT. Membrane vesicles are immunogenic facsímiles of Salmonella typhimurium that potently actívate dendritic cells, prime B and T cell responses, and stimulate protective immunity in vivo. J Immunol. 2007; 179(11)7692-701. PubMed PMID: 18025215. 22. Bergman MA, Cummings LA, Barrett SL, Smith KD, Lara JC, Aderem A, et al. CD4+ T cells and toll-like receptors recognize Salmonella antigens expressed in bacterial surface organelles. Infect Immun. 2005;73(3): 1350-6. PubMed PMID: 15731032. 23. Bondi SK, Goldberg JB. Strategies toward vaccines against Burkholderia mallei and Burkholderia pseüdomallei. Expert Rev Vaccines. 2008;7(9): 1357-65. PubMed PMID: 18980539. 24. Nieves W, Asakrah S, Qazi O, Brown KA, Kurtz J, Aucoin DP, et al. A naturally derived outer-membrane vesicle vaccine protects against lethal pulmonary Burkholderia pseudomallei infection. Vaccine. 2011. Epub 2011/08/30. doi: 10.1016/j.vaccine.2011.08.058. PubMed PMID: 21871517. 25. Oster P, Lennon D, O'Hallahan J, Mulholland K, Reid S, Martin D. MeNZB: a safe and highly immunogenic tailor-made vaccine against the New Zealand Neisseria meningitidis serogroup B disease epidemic strain. Vaccine. 2005;23(17-18):2191-6. PubMed PMID: 15755593. 26. Healey GD, Elvin SJ, Morton M, Williamson ED. Humoral and cell-mediated adaptive immune responses are required for protection against Burkholderia pseudomallei challenge and bacterial clearance postinfection. Infect Immun. 2005;73(9):5945-51. PubMed PMID: 16113315. 27. Joller N, Weber SS, Muller AJ, Sporri R, Selchow P, Sander P, et al. Antibodies protect against intracellular bacteria by Fe receptor-mediated lysosomal targeting. Proc Nati Acad Sci U S A. 2010;107(47):20441-6. Epub 2010/11/05. doi: 10.1073/pnas.1013827107. PubMed PMID: 21048081 ; PubMed Central PMCID: PMC2996673. 28. Jones SM, Ellis JF, Russell P, Griffin KF, Oyston PC. Passive protection against Burkholderia pseudomallei infection in mice by monoclonal antibodies against capsular polysaccharide, lipopolysaccharide or proteins. J Med Microbiol. 2002;51 (12): 1055-62. PubMed PMID: 12466403. 29. Ngugi SA, Ventura W, Qazi O, Harding SV, Kitto GB, Estes DM, et al. Lipopolysaccharide from Burkholderia thailandensis E264 provides protection in a murine model of melioidosis. Vaccine. 2010;28(47):7551-5. Epub 2010/09/15. doi: 10.1016/j.vaccine.2010.08.058. PubMed PMID: 20837078. 30. Zhang S, Feng SH, Li B, Kim HY, Rodríguez J, Tsai S, et al. In Vitro and In Vivo studies of monoclonal antibodies with prominent bactericidal activity against Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. Clin Vaccine Immunol. 201 1 ;18(5):825-34. Epub 2011/04/01. doi: 10.1128/CVI.00533-10. PubMed PMID: 21450976; PubMed Central PMCID: PMC3122519. 31. Chen YS, Hsiao YS, Lin HH, Liu Y, Chen YL. CpG-modified plasmid DNA encoding flagellin improves immunogenicity and provides protection against Burkholderia pseudomallei infection in BALB/c mice. Infect Immun. 2006;74(3):1699-705. PubMed PMID: 16495541. 32. Elvin SJ, Healey GD, Westwood A, Knight SC, Eyles JE, Williamson ED. Protection against heterologous Burkholderia pseudomallei strains by dendritic cell immunizátion. Infect Immun. 2006;74(3): 1706-11. PubMed PMID: 16495542. 33. Cheng C, Pal S, Bettahi I, Oxford KL, Barry PA, de la Maza LM. Immunogenicity of a vaccine formulated with the Chlamydia trachomatis serovar F, native major outer membrane protein in a nonhuman primate model. Vaccine. 2011 ;29(18):3456-64. Epub 2011/03/08. doi: 10.1016/j.vaccine.201 1.02.057. PubMed PMID: 21376796; PubMed Central PMCID: PMC3084512. 34. Málvala P, Singh M. Endotoxin limits in formulations for preclinical researc . Journal of pharmaceutical sciences. 2008;97(6):2041-4. Epub 2007/09/12. doi: 10.1002/jps.21152. PubMed PMID: 17847072. 35. Nieves W, Heang J, Asakrah S, Honer zu Bentrup K, Roy CJ, Morid LA. Immunospecific responses to bacterial elongation factor Tu during Burkholderia infection and immunization. PLoS One. 2010;5(12):e14361. Epub 2010/12/24. doi: 10.1371/journal.pone.0014361. PubMed PMID: 21179405; PubMed Central PMCID: PMC3003680. 36. Ho M, Schollaardt T, Smith MD, Perry MB, Brett PJ, Chaowagul W, et al. Specificity and functional activity of anti-Burkholderia pseudomallei polysaccharide antibodies. Infecí Immun. 1997;65(9):3648-53. PubMed PMID: 9284132. 37. Collazo CM, Meier'ovics Al, De Pascalis R, Wu TH, Lyons CR, Elkins KL. T cells from lungs and livers of Francisella tularensis-immune mice control the growth of intracellular bacteria. Infect Immun. 2009;77(5):2010-21. PubMed PMID: 19237526. 38. Darrah PA, Patel DT, De Luca PM, Lindsay RW, Davey DF, Flynn BJ, et al. Multifunctional TH1 cells define a correlate of vaccine-mediated protection against Leishmania major. Nat Med. 2007;13(7):843-50. PubMed PMID: 17558415. 39. Lindenstrom T, Agger EM, Korsholm KS, Darrah PA, Aagaard C, Seder RA, et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells. J Immunol. 2009; 182(12):8047-55. PubMed PMID: 19494330. 40. Roestenberg M, McCall M, Hopman J, Wiersma J, Luty AJ, van Gemert GJ, et al. Protection against a malaria challenge by sporozoite inoculation. N Engl J Med. 2009;361 (5):468-77. PubMed PMID: 19641203. 41. Fritz PE, Miller JG, Slayter M, Smith TJ. Naturally occurring melioidosis in a colonized rhesus monkey (Macaca mulatta). Laboratory animáis. 1986;20(4):281-5. Epub 1986/10/01. PubMed PMID: 3773432.

EJEMPLO 12 Purificación de OMVs En este documento se describe un protocolo ejemplar que se utilizó para extraer vesículas de membrana externa derivadas naturalmente (n-OMV) de B. thailandensis (Bt) o B. pseudomallei (Bp) y eliminar otros contaminantes tales como LPS monomérico (30 kD), células bacterianas completas y fragmentos celulares con la ayuda del regulador de gradientes OptiPrep. La esterilización por filtración se utilizó en este protocolo ejemplar para eliminar células bacterianas completas o grandes fragmentos bacterianos. La precipitación con sulfato de amonio se utilizó para precipitar OMVs de la solución. Véase, por ejemplo, Moe et al., Infect. Immun., Vol. 70 No. 1 1 (2002); Bauman and Khuen, Microbes and Infection, 8 2400e2408 (2006); y Horstman and Khuen, J. Biol. Chem., Vol. 275 No. 17 (2000), cuyas descripciones se incorporan por la presente para referencia.

Este protocolo de procedimiento ejemplar tiene formato de un sobrenadante de cultivo de 500 mi, el cual produce aproximadamente 0.45 mg/ml de n-OMV en un volumen total de 300 µ? a 500 µ?. En una modalidad preferida, los rendimientos de OMVs se lograron con un total de 1 I de sobrenadante de cultivo.

Día 1 : 5 mi de cultivo de B. thailandensis (Bt) o B. pseudomallei (Bp) 1026b se hicieron crecer durante la noche. Una colonia de Bt se hizo crecer en una placa de PIA (sembrada a partir de reserva en glicerol) se obtuvo para inocular 5 mi de caldo LB. Se hizo crecer durante la noche (O/N), 37 °C, 233 rpm.

Día 2: Se realizó una dilución 1 : 100 del cultivo O/N de Bt en 495 mi de caldo LB. Se hizo crecer durante 16 horas a fase logarítmica tardía - fase estacionaria temprana (OD -6.0), 37 °C, 233 rpm.

Día 3: (1 ) Se sedimentaron las células completas de Bt al centrifugar 6,000 x g (6,300 rpm), 10 min, 4 °C (Usando el rotor SLA-1500 para la centrífuga Sorvall). (1 )(a) Se llenaron tubos a 80% evitando sobrellenar o derramar el sobrenadante que puede dan lugar a que el rotor de desequilibre durante la centrifugación. (1 )(b) Sé almacenaron sedimentos bacterianos a -80 °C para la extracción de lisado de células completas (WCL), proteína de membrana total (TMP) y proteína de membrana externa (OMP) como se describe en este documento. (1) (c) El sobrenadante contenía las n-O V. Se repitió esta etapa una vez más para asegurar que no hay bacterias en el sobrenadante. (2) Se filtró el sobrenadante a través de un filtro de PES de 0.22 µ?t? (filtración estéril) Millipore (Cat # SCGPU10RE) para remover cualquier bacteria restante o grandes fragmentos bacterianos. Se repitió esta etapa una vez más para asegurar que no hay bacterias en el sobrenadante. (2)(a) Para evitar obstrucción de los filtros debido a grandes cantidades de bacterias en el sobrenadante, el sobrenadante en 500 mi se filtró en dos recipientes de filtro de 250 mi. (2) (b) Se obtuvo 1 mi de la etapa (b) y se cultivó en agar PIA. Se incubó O/N, 37 °C donde no hubo crecimiento. De dejó que la placa permaneciera en la incubadora hasta 48 h (en caso necesario) para corroborar además que no hubiera crecimiento bacteriano como etapa de control de calidad (QC). (3) Se recolectaron las vesículas de membrana en el sobrenadante filtrado al agregar lentamente sulfato de amonio sólido 1.5 M mientras se agita lentamente ((NH2)4S04 es de Fisher # A702-3). Se incubó a 4 "C durante la noche (por un máximo de 48 h). Las vesículas precipitaron en conjunto con otros contaminantes (el precipitado fue de color café claro). Se obtuvo 1 mi de la etapa (c) y se cultivó en agar PIA. Se incubó O/N, 37 °C. No hubo crecimiento. De dejó que la placa permaneciera en la incubadora hasta 48 h (en caso necesario) para corroborar además que no hubiera crecimiento bacteriano como etapa de control de calidad.

Día 4: (1) La falta de crecimiento garantizada en la placa de PIA como crecimiento bacteriano es un indicador de la contaminación bacteriana. Dado que no hubo crecimiento, se procedió con la extracción de n-O Vs. (2) Las OMVs se sedimentaron por centrifugación a 11 ,000 x g (8,500 rpm), 20 min, 4 °C usando el rotor SLA-1500 para la centrífuga Sorvall. Durante esta centrifugación, se prepararon los gradientes Opti-Prep (recientes). (3) El precipitado (una mancha clara delgada) se resuspendió en 2 mi de HEPES 10 mM/0.85% de NaCI, pH 7.4 (HEPES-NaCI peso/volumen). Esta fue la preparación de vesículas sin purificar. (4) Al utilizar las OMVs sin purificar, 45% de OptiPrep (Sigma) u otro gradiente de densidad (es decir, sacarosa) se agregó en HEPES 10 mM/0.85% de NaCI a aproximadamente 4 mi de volumen total. (5) Para obtener una preparación de OMV libre de restos, se preparó un gradiente de densidades de la siguiente manera: se depositó en la parte inferior de una botella de centrifuga de 26.3 mi (Beckman Coulter, 355618) los 4 mi de OMV sin purificar de la etapa (4) anterior; y se depositó muy suave y lentamente sobre 4 mi de 40%, 4 mi de 35%, 6 mi de 30%, 4 mi de 25%, y 4 mi de 20% de OptiPrep en HEPES-NaCI (p/v). Las diferencias en los gradientes reflejaron la optimización en la separación de flagelos y otro material soluble de las vesículas. (6) Se centrifugó a 200,000 x g (-40,600 rpm), 1.5 h, 4 °C al utilizar el rotor Beckman Type 50.2 Ti. (7) fracciones de 4 mi se removieron suavemente y en secuencia de la parte superior, y se almacenaron en tubos cónicos de 15 mi a 4 °C (o se continuó a las siguientes etapas).

Análisis de pureza de fracciones: Una porción de cada fracción (~1 mi de cada fracción) se usó para precipitar las OMVs con 20% de ácido tricloroacético (TCA). Las OMVs precipitadas se utilizaron para transferencia western en la cual se usaron geles teñidos con Coomasie o plata con un gel de 4-20% de SDS-PAGE (Bio- ad). Las fracciones más consistentes se combinaron, y las fracciones que contenían patrones de bandas inusuales indicativas de contaminantes se desecharon.

Purificación de vesículas: Las vesículas se recuperaron al combinar las fracciones pico en una botella de policarbonato Beckman como se describe previamente en este documento. Para constituir el resto del volumen, se utilizó HEPES 10 mM, pH 6.8. Las n-OMVs se sedimentaron por centrifugación a 200,000 x g (-40,600 rpm), 1.5 h, 4 °C al utilizar el rotor Beckman Type 50.2 Ti como se describe previamente en este documento. (1 ) Resultó un pequeño sedimento que contenía OMVs puras. El sedimento similar a gel café claro se resuspendió en agua libre de LPS de Lonza (dependiendo del tamaño del sedimento). Esta fue la preparación final de OMVs. (2) Las placas se salpicaron con por lo menos 10% de las OMVs extraídas (-10 ul) en agar PIA y agar LB para asegurar la no contaminación bacteriana en la preparación final de OMVs. (3) En una modalidad alternativa, las fracciones se combinaron en un tupo de 15 mi (capacidad máx) 100 kD Amicon para desalar el Opti-Prep y para concentrar las OMVs combinadas. Se centrifugó 2300 x g, 25 min, 4 °C hasta que todas las fracciones se combinaron. Las 2 sedimentaciones finales fueron con 2 mi de agua libre de LPS. (4) El ensayo de Bradford se realizó para cuantificar las OMVs finales. Los experimentos se combinaron, desalaron, y las fracciones concentradas (~5 ug) se analizaron en un gel de SDS-PAGE y se tiñeron con Coomasie (véase TIF adjunto con análisis de SDS-PAGE análisis de lotes de OMV A-F. Cada lote de OMV se produjo independientemente durante un periodo de 1 año para confirmar la reproducibilidad del método de purificación).

Almacenamiento: Las OMVs resuspendidas se distribuyeron en alícuotas en 50-100 ul y se almacenaron a -20 °C. En una modalidad alternativa, las OMVs se liofilizaron para almacenamiento a 4 °C o a temperatura ambiente. Las vesículas se verificaron para limpieza (libres de flagelos y restos celulares) al realizar microscopía electrónica de crio transmisión (TEM) como se describe, por ejemplo, en Nieves ef al. (2010), cuya descripción se incorpora en este documento para referencia.

Claims (51)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende vesículas de membrana externa cíe por lo menos una bacteria Gram negativa.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , en donde las vesículas de membrana externa además comprenden lipopolisacárido, y carecen de adyuvante.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , en donde las vesículas de membrana externa se derivan de por lo menos una Burkholdería spp.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , que además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , para proteger un mamífero contra la infección ocasionada por bacterias Gram negativas.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, en donde la bacteria Gram negativa es una especie de Burkholdería y las vesículas de membrana externa se derivan de la especie de Burkholdería.

7. Una composición producida por el proceso de: a. hacer crecer un cultivo de bacterias Gram negativas; b. someter opcionalmente el cultivo a estrés oxidante u otro estrés ambiental durante el crecimiento; c. someter el cultivo a centrifugación, con lo que en consecuencia se obtiene un sedimento de células y una fracción de sobrenadante; d. recolectar las vesículas de membrana externa a partir de la fracción de sobrenadante; e. purificar además las vesículas de membrana externa por centrifugación en gradientes; y f. recolectar las vesículas de membrana externa.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, en donde las bacterias Gram negativas son Burkholdería.

9. Una composición inmunogénica que comprende: por lo menos una vesícula purificada de membrana externa, derivada de por lo menos una especie de Burkholdería.

10. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, en donde las vesículas de membrana externa purificadas además comprenden lipopolisacárido (LPS) y polisacárido capsular (CPS).

1 1. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, en donde las vesículas de membrana externa purificadas se derivan de por lo menos Burkholderia pseudomallei y/o Burkholderia mallei.

12. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, en donde la composición inmunogénica se formula como vacuna.

13. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, en donde la composición inmunogénica además comprende por lo menos un adyuvante.

14. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 13, en donde el o los adyuvantes se seleccionan del grupo que consiste en oligodesoxinucleótidos de CpG (CpG ODN) metilados, hidróxido de aluminio (alumbre), Kpido A de MPL-monofosfato, flagelina, citocinas y toxinas.

15. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 14, en donde la toxina es enterotoxina termolábil de £. coli y/o toxina del cólera.

16. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 13, en donde el o los adyuvantes son emulsiones.

17. Una composición inmunogénica que comprende vesículas de membrana externa purificadas derivadas de por lo menos una especie de Burkholderia para proteger a un sujeto contra la infección ocasionada por al menos una especie de Burkholderia, en donde la administración de la composición inmunogénica proporciona protección contra la infección.

18. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 17, en donde la composición inmunogénica- se administra de manera subcutánea, en forma intranasal, y/o de manera intramuscular.

19. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 17, en donde la administración de la composición inmunogénica produce inmunidad protectora humoral y celular para por lo menos una especie de Burkholderia.

20. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 19, en donde la inmunidad humoral protectora en el sujeto comprende la producción de IgG y/o IgA especificas para las vesículas de membrana externa administradas.

21. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 20, en donde la producción de IgG específiga para las vesículas de membrana externa administradas se incrementa en por lo menos alrededor de 1 logaritmo cuando la composición inmunogénica se administra de manera subsecuente.

22. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 20, en donde la IgG específica para las vesículas de membrana externa administradas comprende lgG1 y/o lgG2a.

23. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 19, en donde la inmunidad celular protectora en el sujeto comprende la activación de células T de memoria en respuesta a las vesículas de membrana externa administradas.

24. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 23, en donde la activación de células T de memoria comprende la producción de interferón gamma (IFN-?) por parte de células de memoria Th1.

25. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 19, en donde la administración de la composición inmunogénica proporciona protección cuando el sujeto se expone de manera subsecuente a un desafío con aerosoles que comprende por lo menos una especie de Burkholderia.

26. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 25, en donde el desafío con aerosoles comprende una dosis letal de la o las especies de Burkholderia.

27. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación Í9, en donde el sujeto se protege contra la infección ocasionada por Burkholderia pseudomallei y/o Burkholderia mallei, y : en donde la composición inmunogénica comprende las vesículas de membrana externa purificadas, derivadas de por lo menos Burkholderia pseudomallei y/o Burkholderia mallei.

28. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9 para inducir una respuesta inmunitaria a por lo menos una especie de Burkholderia en un sujeto, en donde la composición inmunogénica se administra a un sujeto en una cantidad efectiva para suscitar la producción de anticuerpos específicos para la o las especies de Burkholderia.

29. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 28, en . donde la composición inmunogénica se produce al: a. hacer crecer un cultivo de bacterias Gram negativas; b. someter el cultivo a centrifugación, con lo que en consecuencia se obtiene un sedimento de células y una fracción de sobrenadante; c. recolectar las vesículas de membrana externa a partir de la fracción de sobrenadante; d. purificar las vesículas de membrana externa recolectadas de la etapa (c) por centrifugación en gradientes; y e. recolectar las vesículas de membrana externa purificadas a partir de la etapa (d).

30. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 29, en donde la centrifugación en gradientes de la etapa (d) comprende centrifugación de alta velocidad seguida por centrifugación en gradientes de densidad.

31. Una composición inmunogénica que comprende vesículas de membrana externa purificadas, derivadas de por lo menos una especie de Burkholdería para prevenir la infección respiratoria en un sujeto, en donde la infección respiratoria se ocasiona por al menos una especie de Burkholdería, en donde la composición inmunogénica se administra al sujeto, y en donde la administración de la composición inmunogénica previene por lo menos un síntoma de la infección respiratoria.

32. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 31 , en donde la composición inmunogénica se administra de manera subcutánea, en forma intránasal, y/o de manera intramuscular.

33. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 31 , en donde la infección respiratoria se ocasiona por Burkholdería pseudomallei y/o Burkholdería mallei, y en donde la composición inmunogénica comprende las vesículas de membrana externa purificadas, derivadas de por lo menos Burkholdería pseudomallei y/o Burkholdería mallei.

34. Una composición inmunogénica que comprende vesículas de membrana externa purificadas, derivadas de por lo menos una especie de Burkholdería para prevenir la melioidosis en un sujeto, en donde la melioidosis se ocasiona por al menos una especie de Burkholdería, en donde la composición inmunogénica se administra al sujeto, y en donde la administración de la composición inmunogénica produce inmunidad a la o las especies de Burkholdería.

35. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la composición inmunogénica se administra de manera subcutánea, en forma intra asal, y/o de manera intramuscular.

36. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la inmunidad en el sujeto es inmunidad protectora humoral y celular.

37. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la inmunidad humoral protectora en el sujeto comprende la producción de IgG y/o IgA especificas para las vesículas de membrana externa administradas cuando el sujeto se expone a por lo menos una especie de Burkholderia después de la administración de la composición inmunogénica.

38. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la inmunidad celular protectora en el sujeto comprende la activación de células T de memoria en respuesta a las vesículas de membrana .externa administradas.

39. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 38, en donde la activación de células T de memoria comprende la producción de interferón gamma (IFN-?) por parte de células T CD4+ y/o CD8+.

40. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la administración de la composición inmunogénica proporciona protección cuando el sujeto se expone de manera subsecuente a un desafío con aerosoles que comprende la o las especies de Burkholderia.

41. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la melioidosis es melioidosis neumónica y/o melioidosis septicémica.

42. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la melioidosis se ocasiona por Burkholderia pseudomallei, y en donde la composición inmunogénica comprende las vesículas de membrana externa purificadas, derivadas de por lo menos Burkholderia pseudomallei.

43. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 34, en donde la composición inmunogénica además comprende por lo menos un adyuvante.

44. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 43, en donde el o los adyuvantes se seleccionan del grupo que consiste en oligodesoxinucleótidos de CpG (CpG ODN) metilados, hidróxido de aluminio (alumbre), lípido A de MPL-monofosfato, flagellna, citocinas y toxinas.

45. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 44, en donde la toxina es enterotoxina termolábil de E. coli y/o toxina del cólera.

46. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 43, en donde el o los adyuvantes son emulsiones.

47. Una composición inmunogénica que comprende vesículas de membrana externa purificadas derivadas de por lo menos una especie del complejo de Burkholderia cepacia para prevenir la infección respiratoria en un sujeto, en donde la infección respiratoria se ocasiona por al menos una especie del complejo de Burkholderia cepacia, en donde la composición inmunogénica se administra al sujeto, en donde la administración de la composición inmunogénica produce inmunidad a la o las especies del complejo Burkholderia cepacia, y en donde la administración de la composición inmunogénica previene por lo menos un síntoma de la infección respiratoria.

48. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 47, en donde la inmunidad en el sujeto es inmunidad protectora humoral y/o celular.

49. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 47, en donde la infección respiratoria es infección pulmonar rápidamente fatal.

50. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 47, en donde el sujeto está enfermo de fibrosís quística.

51. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 47, en donde la infección respiratoria se ocasiona por Burkholderia cenocepacia y/o Burkholderia multivorans, y en donde la composición inmunogénica comprende las vesículas de membrana externa purificadas, derivadas de Burkholderia cenocepacia y/o Burkholderia multivorans.