MX2013007584A - Composiciones y metodos de vacuna de tipo ib de virus de diarrea viral de bovino. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones inmunogénicas que comprenden un tipi Ib de virus de diarrea viral vivo, modificado de bovino (BVDV-Ib), y métodos para su uso en la formulación y administración de agentes farmacéuticos terapéuticos y profilácticos. En particular, la invención proporciona composiciones inmunogénicas y métodos para prevenir, tratar, manejar, y/o mejorar una infección viral o microbiana, o uno o más síntomas de la misma, incluyendo, por ejemplo, aquellas infecciones que dan surgimiento a fiebre de embarque, complejo de enfermedad respiratoria de bovino, y/o diarrea viral de bovino, particularmente en animales susceptibles o infectados.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE VACUNA DE TIPO 1B DE VIRUS DE DIARREA VIRAL DE BOVINO Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas La presente solicitud se refiere a la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense co-pendiente Número de Serie 61/427,404, titulada "Composiciones y Métodos para Identificar y Diferenciar Componentes Virales de Vacunas de Fiebre del Embarque Multivalente" (presentada concurrentemente junta con esta el 27 de Diciembre de 2010, y específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta).

Declaración con respecto a investigación o desarrollo patrocinado federalmente No aplicable.

Nombres de las partes para un acuerdo de investigación conjunta No aplicable.

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a los campos de medicina veterinaria y vacunas animales. Más particularmente, está relacionada con composiciones inmunogénicas, métodos para elaborar tales composiciones, y métodos para prevenir, tratar, aliviar y/o manejar la infección viral o microbiana, o un síntoma de la misma, y particularmente infecciones respiratorias en ganado mamífero, que incluye enfermedades multifactoriales tales como complejo de enfermedad respiratoria en bovinos (pos sus siglas en inglés, BRDC). Se describen composiciones antigénicas y métodos para su uso en la formulación y administración de agentes profilácticos y terapéuticos para prevenir, tratar, y/o aliviar uno o más síntomas de infección por pestivirus, y particularmente aquellos pestivirus responsables de, o implicados en, la fiebre del embarque, BRDC, y diarrea viral bovina en animales susceptibles o infectados.

Antecedentes de la invención El BRDC es un complejo de enfermedad multifactorial que frecuentemente afecta a becerros de reproducción/engorda en canales de mercado y en destino de pastoreo o corrales de engorda. Los agentes etiológicos bacterianos primarios de esta enfermedad son Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni (anteriormente Haemophilus somnus) y Mycoplasma bovis. Los agentes virales que han sido asociados con la fiebre del embarque son Virus del Herpes Bovino Tipo 1 (BHV-1), Paraínfluenza 3 (Pl3), Virus Sincitial Respiratorio Bovino (BRSV) y Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV).

Virus de diarrea viral bovina (BVDV) El BVDV es ahora reconocido como un agente etiológico importante en el Complejo de Enfermedad Respiratoria Bovina (BRDC) (a menudo comúnmente referido como "fiebre del embarque."). La enfermedad, la cual infecta vacadas de todas las edades (incluyendo becerros lactantes), es caracterizada por respiración rápida, tos, depresión, pérdida del apetito, descarga nasal y ocular, y temperaturas elevadas. En un brote agudo, la muerte puede seguir dentro de 24 horas del comienzo de los síntomas. El tratamiento del BVDV es problemático dada la ausencia de terapéuticos antivirales, y la tasa de mortalidad a partir de la infección del pestivirus es alta. Sin embargo, el tratamiento de patógenos bacterianos involucrados en el BRDC es también complicado en muchos casos mediante resistencia antimicrobiana a fármacos terapéuticos.

Los Virus de Diarrea Viral Bovina son un grupo disparado de virus , que pueden ser clasificados tanto fenotípicamente (véase, por ejemplo, Baker, 1995) (citopático o no citopático) y genotipicamente (véase, por ejemplo, Ridpath et al., 1994; Vilcek et al., 2001; y Flores ef al., 2002). Establecer la inmunidad protectora contra el BVDV en ganado ha sido problemático por un número de razones. Como en algunas otras enfermedades viralmente mediadas, los niveles de anticuerpos del suero contra BVDV no se correlacionan necesariamente con la protección contra la enfermedad. Establecer la protección inmune en becerros lactantes presenta obstáculos adicionales, puesto que los anticuerpos maternales al BVDV pueden agotar el inmunógeno inyectado y neutralizar efectivamente la vacuna.

Un estudio por Fulton et al. (2006) evaluó 21,743 becerros que ingresan a los corrales de engorda Estadounidenses y determinó que 88 becerros fueron persistentemente infectados (Pl) con BVDV. De los 88 becerros Pl, 77.9% se infectaron con BVDV-1b; solamente 11.6% se infectaron con BVDV-1a, y solamente 10.5% se infectaron con BVDV-2a. Desafortunadamente, mientras estos datos demuestran claramente que el BVDV-1b es el subtipo predominante de vacas Pl que ingresan en corrales de engorda domésticos, actualmente no existen vacunas autorizadas por la USDA que son específicas para la infección del BVDV-1b.

De este modo, por estas y otras razones inherentes en la técnica anterior, existe una necesidad para formulaciones de vacunas del BVDV que provoquen una respuesta inmune vigorosa y multifacética, y particularmente aquellas que provocan una respuesta inmune contra la forma Tipo 1b del BVDV.- Debido al potencial para mayor pérdida económica en rebaños sin vacunar, existe una necesidad de vacunas redituables (y preferiblemente, de dosis única) que contienen virus del BVDV-1b vivo, modificado, que inducen profilaxis contra infecciones del BVDV en poblaciones de ganado mamífero.

Del mismo modo, debido a las vacunas polivalentes contemporáneas contra enfermedades multifactoriales tales como enfermedades relacionadas del BRDC y fiebre del embarque son ampliamente no efectivas en la prevención de la infección por BVDV-1b, existe también una necesidad de modalidades de vacunación mejoradas para efectuar mejor la profilaxis y control de brotes de enfermedad en ganado susceptible de BVDV-1b.

Breve descripción de la invención La presente invención abarca nuevas y útiles composiciones, así como también métodos para emplearlas que pueden ventajosamente mejorar el suministro de agentes profilácticos y/o terapéuticos a un animal en necesidad del mismo. La invención proporciona composiciones de vacunas que ofrecen ventajas sobre formulaciones convencionales, y específicamente proporciona formas para prevenir o controlar enfermedades causadas por uno o más pestivirus, y en particular, aquellas causadas por virus del BVDV que incluyen aquellas del subgenotipo del Tipo 1b (es decir, BVDV-1b).

En un sentido total y general, la presente invención abarca composiciones, métodos para elaborar tales composiciones, y métodos para su uso en la prevención, tratamiento y/o manejo, de infección viral y/o microbiana, patogénesis, y enfermedad. Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente, así como también métodos que emplean las mismas, encuentran uso particular en la prevención, tratamiento, y/o alivio de uno o más síntomas de fiebre del embarque/BRDC en mamíferos susceptibles usando las composiciones de vacuna inventivas y métodos que emplean las mismas que son superiores a tratamientos/preventivos de fiebre del embarque convencional actualmente disponibles en las técnicas médicas veterinarias.

En modalidades particulares, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden virus BVDV-1b vivos, modificados, así como también formulaciones farmacéuticas que los contienen, y métodos para elaborar tales vacunas en una variedad de regímenes profilácticos y/o terapéuticos. Tales composiciones y métodos encuentran uso particular en la prevención de enfermedades virales y multifactoriales en mamíferos tales como ganado mamífero que son susceptibles a la infección por BVDV.

En modalidades relacionadas, la invención también proporciona métodos para usar las composiciones de vacuna descritas para provocar una respuesta inmunologica víral-específica en un animal. En un sentido total y general, tales métodos en general involucran proporcionar a un animal seleccionado una o más de las composiciones inmunogénicas descritas en la presente en cantidad(es) y por un tiempo efectivo para provocar una respuesta inmunologica viral-específica en un animal, y en particular, una respuesta inmunologica específica del BVDV. En tales modalidades, el animal es preferiblemente un mamífero de pezuña hundida, y más preferiblemente, un miembro de la familia Bovidae.

La invención también proporciona un método para prevenir o controlar un brote de infección viral y/o microbiana(s) (e infecciones pestivirales causadas por el BVDV y especies relacionadas en particular) en una o más poblaciones de mamífero seleccionadas. El método en general involucra proporcionar a un miembro en riesgo o susceptible de tal población una cantidad efectiva de una o más de las composiciones de vacuna o inmunogénicas descritas, por un tiempo suficiente para retardar, disminuir, reducir, inhibir, y/o prevenir el brote de tal infección en la población general. Poblaciones de mamífero ejemplares incluyen, sin limitación, miembros de Bovinae y Caprinae, y particularmente aquellos de los géneros Bison, Bos, Bubalus, Capra, Oreamnos, Ovibos, Ovis, Syncerus, y tales como estos. En modalidades ilustrativas, estos métodos son particularmente deseables en el tratamiento de ganado comercial en los géneros Bison, Bos, Capra, y Ovis, que incluye, sin limitación, Bison bison, Bos taurus, Capra hircus y Ovis aries.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para estimular el sistema inmune de un animal para producir una respuesta inmune protectora contra una infección viral, y en particular, una infección de pestivirus virulento de Bovidae. Tal método en general involucra al menos administrar a un animal en necesidad del mismo, una cantidad inmunológicamente y profilácticamente efectiva de una o más de las composiciones de vacuna descritas en una cantidad y por un tiempo suficiente para estimular el sistema inmune del animal. En la práctica convencional de este método en una modalidad, la administración de una o más de las composiciones de vacuna inmunológicamente y profilácticamente activas descritas preferiblemente induce al menos una primera cantidad detectable de anticuerpos anti-pestivirus en el animal, y más preferiblemente todavía, induce al menos una primera cantidad detectable de anticuerpos anti-BVDV-1b en el animal. En modalidades preferidas, la administración de la composición preferiblemente inmuniza al animal contra la infección inicial, subsecuente, y/o recurrente por el virus BVDV-1b, y en ciertas modalidades, también preferiblemente inmuniza el animal contra la infección inicial, subsecuente, y/o recurrente por uno o más virus genéticamente similares o epitópicamente relacionados, que incluyen por ejemplo, uno o más tipos, cepas, y subtipos de virus del BVDV (que incluyen, sin limitación, BVDV-1a, BVDV-2, y otros pestivirus genéticamente similares.

En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una respuesta inmune protectora contra pestivirus en un animal. Tal método en general incluye proporcionar a un animal en necesidad del mismo una cantidad inmunológicamente y profilácticamente efectiva de una o más de las composiciones inmunogénicas del BVDV-1b descritas bajo condiciones y por un tiempo suficiente para producir tal respuesta inmune protectora contra una o más especies, subespecies o cepas de pestivirus, y preferiblemente, contra una o más especies, cepas, subtipos, o serotipos del BVDV.

Del mismo modo, la invención también proporciona un método para proporcionar una composición profiláctica o terapéutica a una primera célula en un hospedero de mamífero. Este método en general involucra proporcionar a un mamífero en necesidad del mismo una cantidad profilácticamente o terapéuticamente efectiva de una o más de las composiciones inmunogénicas especificas del BVDV descritas en la presente, bajo condiciones y por un tiempo efectivo para proporcionar la composición con al menos una primera célula, tejido, órgano, o sistema de órgano en tal mamífero.

La presente invención también proporciona un método para prevenir, tratar, y/o aliviar uno o más síntomas de la infección del BVDV en un mamífero. Tal método en general incluye proporcionar al mamífero en necesidad del mismo una cantidad inmunológicamente y profilácticamente efectiva de una o más de las composiciones inmunogénicas del BVDV-1b descritas bajo condiciones y por un tiempo suficiente para prevenir, tratar y/o aliviar uno o más síntomas de la infección del BVDV en el mamífero.

Del mismo modo, la presente invención también proporciona métodos para prevenir, tratar, y/o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad multifactorial tal como BRDC en un mamífero, y particularmente en aquellas enfermedades en las cuales la infección por al menos un primer BVDV está implicada como un agente causal o que contribuye con la enfermedad. Tales métodos en general involucran administrar a un mamífero seleccionado al menos una primera cantidad inmunológicamente o profilácticamente efectiva de al menos una primera composición de vacuna anti-BVDV-1b bajo condiciones y por un tiempo suficiente para prevenir, tratar y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad en el mamífero.

En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para prevenir, tratar, y/o aliviar uno o más síntomas of fiebre del embarque en un miembro de la familia Bovidae. Tal método en general incluye proporcionar al bóvido al menos una primera cantidad inmunológicamente o profilácticamente efectiva de una primera composición que comprende una población de virus BVDV-1b vivos, modificados bajo condiciones y por un tiempo suficiente para prevenir, tratar y/o aliviar uno o más síntomas of fiebre del embarque en el bóvido.

Composiciones inmunogénicas Con el fin de proporcionar protección más amplia contra uno o más pestivirus, y en particular, uno o más de los agentes virales implicados en el BRDC y fiebre del embarque en miembros de la familia Bovidae, los inventores han desarrollados formulaciones de vacunas seguras y efectivas que incluyen uno o más antigenos específicos del BVDV-1b. Se han descrito formulaciones de vacuna tanto monovalentes como polivalentes, que incluyen aquellas que contienen, en el caso de vacunas monovalentes, uno o más antígenos, epitopes, o virus vivos modificados que provocan una respuesta inmune específica para BVDV solo, o, en casos de vacunas polivalentes, uno o más antígenos, epitopes, o virus vivos modificados que provocan respuestas inmunes específicas no solamente para BVDV, sino también para uno o más patógenos adicionales.

En modalidades ilustrativas, una composición inmunogénica monovalente que comprende BVDV-1b vivo, modificado, ha sido desarrollada para proteger al ganado de la infección por BVDV-1b. Adicionalmente, composiciones inmunogénicas multivalentes específicas para BRDC y fiebre del embarque también han sido proporcionadas por la presente invención, que incluyen una formulación viral bovina viva, modificada de seis formas (es decir, "hexavalente") ejemplar, que incluye componentes antigénicos para inducir específicamente una respuesta inmune contra uno o más, preferiblemente dos o más, y más preferiblemente tres o más de BHV-1, Pl3, BRSV, dos subgenotipos de BVDV Tipo 1 (1a y 1b), y BVDV Tipo 2 en un animal. En una modalidad más preferida, la formulación induce una respuesta inmune contra cada uno de los anteriores, típicamente a niveles variantes.

En modalidades adicionales, la invención proporciona formulaciones de vacuna que contienen los inmunogenos mencionados antes, y métodos para su uso en la profilaxis, terapia, y/o alivio de uno o más síntomas de una infección de pestivirus en un animal, y en particular, una infección del BVDV-1b en ganado mamífero. La invención además abarca formulaciones de vacunas y métodos que emplean las mismas en la prevención, tratamiento, y/o alivio de uno o más síntomas de a fiebre del embarque, tales como BRDC, en bóvidos y otras especies de mamíferos relacionadas.

Formulaciones de vacunas La presente invención proporciona composiciones inmunogénicas y formulaciones de vacunas de las mismas para uso en la profilaxis de una o más infecciones virales, así como también composiciones para uso en la prevención o terapia de uno o más complejos de enfermedad multifactorial en un mamífero seleccionado. En particular, la invención se proporciona para el uso de una o más de las composiciones inmunogénicas descritas en la manufactura de medicamentos de vacunas para profilaxis, prevención, o terapia, y particularmente para uso en la manufactura de medicamentos veterinarios aceptables para prevenir, manejar, aliviar, y/o tratar una o más enfermedades, o uno o más síntomas de tales enfermedades, en mamíferos tales como infecciones del BVDV en ganado.

Las vacunas de la presente invención pueden ser administradas por cualquier ruta de administración adecuada para el mamífero seleccionado disponible para uno de habilidad ordinaria en la técnica, preferiblemente por inyección intramuscular o subcutánea o vía administración intranasal, oral, cutánea, percutánea o intracutánea. Preferiblemente, para vacunas contra BVDV-1b, las vacunaciones son administradas subcutáneamente, o por rutas intramusculares o intranasales, con suministro subcutáneo siendo más preferido. Las vacunas son típicamente administradas previo al destete, en uso, o al tiempo de entrada al pastoreo o corral de engorda. Como parte de una operación continua de ganado adulto, una o más dosis de "refuerzo" de tales vacunas también pueden ser rutinariamente empleadas, que incluyen por ejemplo como parte del esquema de mantenimiento/revacunación anual.

Aunque las formulaciones farmacéuticas y vacunas de la presente invención pueden ser preparadas en cualquier formulación veterinaria aceptable, adecuada, en modalidades particulares, la invención proporciona vacunas que están en la forma de una solución o suspensión lista para ser administrada, en una solución ase concentrada adecuada para dilución previo a la administración, o en una forma reconstituible tal como una preparación liofilizada, secada por congelamiento, o congelada, como se conoce por aquellos de habilidad ordinaria en las artes médicas veterinarias.

Tanto la preparación de las composiciones de pestivirus vivas, modificadas, como la formulación de las composiciones inventivas y vacunas con otros inmunogenos (con o sin uno o más adyuvantes), se basan en ta orientación convencional de la presente, e incluyen el mezclado del pestivirus atenuado, virus con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con otros inmunogenos y opcionalmente con un adyuvante.

Portadores, diluyentes, u otros componentes inertes o activos de las formulaciones farmacéuticas y vacunas pueden comprender uno o más estabilizadores, conservadores y/o amortiguadores, como puede ser empleado en las artes médicas veterinarias. Estabilizadores ejemplares incluyen, sin limitación, SPGA, y uno o más de los siguientes: carbohidratos (que incluyen, pero no se limitan a, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano, glutamato o glucosa), proteínas (que incluyen, pero no se limitan a, leche en polvo, albúmina de suero, caseína, o proteínas de otras fuentes tales como de plantas o microorganismos), o similares. Amortiguadores adecuados incluyen, sin limitación, uno o más fosfatos de metal álcali. Conservadores ejemplares útiles en la formulación de las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas incluyen, sin limitación, timerosal, mertiolate, gentamicina, neomicina, nistatina, anfotericina B, tetraciclina, penicilina, estreptomicina, polimixina B, y cualquier combinación de los mismos. Diluyentes ejemplares incluyen, sin limitación, agua estéril, uno o más amortiguadores acuosos (tales como salina amortiguada y similares), uno o más alcoholes (que incluyen un poliol por ejemplo, glícerol o similares), y cualesquiera combinaciones de los mismos.

Donde se desea, las composiciones de vacuna de la presente invención pueden también además incluir opcionalmente uno o más adyuvantes. Ejemplos no limitantes de compuestos y composiciones adecuados que tienen actividad adyuvante incluyen hidróxido de aluminio, -fosfato, u -óxido, aceite en agua, agua en aceite, agua en aceite en agua, emulsiones a base de, por ejemplo, un aceite mineral, tal como, tal como, sin limitación, Drakeol®, Bayol®, o Marcol®; un aceite vegetal, tal como sin limitación, aceite de semilla de algodón, aceite de maní, o aceite de maíz; acetato de vitamina E; saponinas; un aceite de pescado, tal como, sin limitación, escualeno o escualano; o cualesquiera combinaciones de los mismos.

Formulaciones de vacunas específicas del BVDV de conformidad con la presente invención pueden también además contener opcionalmente uno o más de otros inmunogenos específicos para uno o más virus y/o microorganismos adicionales que son también potencialmente patogénicos al animal a ser inmunizado. Para casos en vacas y bovinos relacionados, inmunogenos adicionales que pueden estar presentes en la composición se pueden derivar de una o más especies de virus patogénicos bovino, que incluyen sin limitación, rotavirus, Virus Sincitiales Respiratorios Bovinos, virus del herpes bovino (que incluyen tipo 1), coronavirus bovino, virus de parainfluenza (que incluyen tipo 3), paramixovirus bovinos, o similares, o alternativamente, aquellos que se derivan de una o más especies microbianas patogénicas de bovino tales como, sin limitación, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica (anteriormente Pasteurella haemolytica), Histophilus somni (anteriormente Haemophilus somnus), Mycoplasma bovis, y similares, o una combinación de cualquiera de los anteriores.

En algunas modalidades, cuando es relevante, como se podría entender por uno de habilidad ordinaria en la técnica, las composiciones inmunogénicas y vacunas de la presente invención pueden incluir la administración de una dosis única a un animal, o alternativamente, pueden incluir la administración de dosis múltiples, y/o sucesivas al animal con el tiempo. Alternativamente, las composiciones inmunogénicas de la presente invención también pueden ser coadministradas con uno o más compuestos anti-virales o antimicrobianos, ya sea solos o además en combinación con la administración de uno o más inmunogenos microbianos específicos o formulaciones de vacunas distintas.

Otro aspecto importante de la presente invención se refiere a métodos para usar las composiciones inmunogénicas descritas para suministrar uno o más agentes terapéuticos para tratar o aliviar uno o más síntomas(s) de una infección o enfermedad en un mamífero. Tales métodos en general involucran la administración a un mamífero en necesidad del mismo, una o más de las composiciones inmunogénicas descritas, en una cantidad y por un tiempo suficiente para tratar, aliviar o reducir la severidad, duración, o extensión de, tal enfermedad o infección en tal mamífero.

Los métodos y composiciones de la invención también pueden ser usados en la prevención, profilaxis, y/o vacunación de un animal que tiene, es sospechoso de tener, está en riesgo de desarrollar, o ha sido diagnosticado con una o más infecciones y/o enfermedades, ya sea antes, durante o después del diagnóstico o el comienzo de uno o más síntomas clínicos de la enfermedad, o la aparición de uno o más síntomas de los mismos.

Métodos para inducir una respuesta inmune La presente invención además incluye métodos para inducir una respuesta inmune detectable contra uno o más patógenos virales en un animal susceptible. Un método preferido incluye administrar a un animal en necesidad del mismo, o potencialmente en necesidad del mismo con base en, por ejemplo, factores de riesgo conocidos para una enfermedad o infección dada, una cantidad de una composición de vacuna como se describe en la presente suficiente para inducir una respuesta inmune detectable en el animal.

En algunas modalidades, la invención abarca métodos de vacunación de un sujeto contra una infección pestiviral, tal como BVDV, o contra una enfermedad multifactorial, tal como el BRDC, en la cual una infección pestiviral está ya sea implicada o causal. Tales métodos en general involucran administrar a un animal en necesidad del mismo, una cantidad profilácticamente y/o terapéuticamente efectiva de una composición de vacuna pestiviral específica, y uno o más portadores, amortiguadores, diluyentes, vehículos, farmacéuticamente o veterinariamente aceptables, o similares, para proporcionar una respuesta inmune detectable en el animal contra una infección pestiviral, o una enfermedad causada por o exacerbada por tal una infección pestiviral.

Con tal fin, la presente invención proporciona métodos para usar las composiciones inmunogénicas descritas y formulaciones de vacunas para la profilaxis, tratamiento, alivio o manejo de una o más enfermedades o infecciones virales o microbianas en un animal, o uno o más síntomas de los mismos.

La presente invención también proporciona el uso de una o más de las composiciones inmunogénicas descritas en la manufactura de un medicamento o vacuna veterinaria para la profilaxis o prevención de la enfermedad, incluyen, en la preparación de una o más vacunas adecuadas para administración profiláctica para prevenir o aliviar uno o más síntomas de una infección pestiviral, incluyen, por ejemplo, BVDV, en un animal.

La invención también proporciona métodos para proporcionar un compuesto terapéutico o profiláctico inmunogénico a una primera célula en un mamífero, con el método en general que incluye proporcionar a un mamífero en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de una composición inmunogénica del BVDV como se describe en la presente que incluye una pluralidad de partículas virales vivas modificadas como un ingrediente activo, por un tiempo efectivo para proporcionar la terapia y/o profilaxis deseada en el animal inmunizado o tratado.

Kits terapéuticos y profilácticos Kits que incluyen una o más de las composiciones ¡nmunogénicas como se describe o formulaciones farmacéuticas que incluyen a tales; e instrucciones para usar el kit en uno o más regímenes profilácticos o terapéuticos también representan aspectos ilustrativos de la presente descripción. Tales kits preferiblemente incluyen una o más de las composiciones ¡nmunogénicas como se describe o vacunas, ya sea sola, o en combinación con uno o más compuestos terapéuticos adicionales, farmacéuticos, y similares, e instrucciones para uso de los componentes en la prevención o tratamiento de la enfermedad en un animal. Los kits de conformidad con la invención pueden ser envasados para distribución comercial, y pueden también además incluir opcionalmente uno o más dispositivos de suministro (por ejemplo, jeringas, viales, inyectables, o similares) para administrar la(s) composición(es) al animal seleccionado.

El(los) contenedor(es) para tales kits pueden incluir típicamente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro contenedor, el cual la(s) composición(es) inmunogénica(s) o formulación(es) de vacuna(s) pueden ser colocados, y, preferiblemente, adecuadamente dispensados en una o más alícuota(s) para administración a un animal. Donde una segunda composición inmunogénica o un primer compuesto antiviral o antimicrobiano también se desea, el kit también puede contener la segunda composición inmunogénica o el primer compuesto antiviral o antimicrobiano en un segundo contenedor distinto, o en un contenedor único con una barrera rompible o no rompible para aislar los dos componentes hasta la preparación para administración. Alternativamente, una pluralidad de distintas composición(es) ¡nmunogénica(s) y/o distintos compuesto(s) antivirales o antimicrobianos pueden ser preparados en una formulación única, y pueden ser envasados en un contenedor único, vial, matraz, jeringa, catéter, cánula, botella, tubo de ensayo, ampolleta, u otro contenedor adecuado. El kit también puede incluir un contenedor más grande, tal como un estuche, que incluye los contenedores indicados anteriormente, junto con otro equipo y similares. Dosis múltiples pueden ser contenidas en recipientes adecuados dentro del contenedor, si se desea, preferiblemente junto con cualquier dispositivo de medición volumétrico o de peso adecuado para medir una dosis pre-seleccionada como sea necesario.

Composiciones para uso en la preparación de medicamentos Otro aspecto importante de la presente invención se refiere a métodos para usar las composiciones inmunogénicas como se describe (así como también formulaciones que las incluyen) en la preparación de medicamentos para prevenir, tratar o aliviar una enfermedad, o los síntomas de la misma, en un animal, tal como un mamífero vertebrado. El uso de las composiciones inmunogénicas como se describe también está contemplado en terapia y/o profilaxis de una o más enfermedades de origen microbiano o viral.

Tal uso en general involucra administración a un animal en necesidad del mismo de una o más de las composiciones inmunogénicas como se describe en una cantidad y por un tiempo suficiente para prevenir, tratar, o manejar una o más enfermedades o síntomas de la misma en el animal afectado. Composiciones que incluyen una o más de las formulaciones inmunogénicas descritas también forman parte de la presente invención, y particularmente aquellas composiciones que además incluyen al menos un primer excipiente farmacéuticamente aceptable para uso en la terapia o profilaxis de una o más enfermedades de origen viral y/o microbiano.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden ser preparadas como vacunas univalentes (es decir, monovalente), o alternativamente, como bivalente, trivalente o aún multivalente (es decir, polivalente). Por ejemplo, una vacuna monovalente preferiblemente incluirá una composición inmunogénica única de la presente invención (por ejemplo una población de virus BVDV-1b vivos, modificados) que es capaz de provocar una respuesta inmune anti-BVDV específica cuando se introduce en el cuerpo de un mamífero recipiente seleccionado, y particularmente mamíferos que son susceptibles a la infección del BVDV.

De manera similar, una composición de vacuna bivalente preferiblemente incluirá al menos una primera composición específica del BVDV-1b, y al menos un segundo inmunógeno viral o microbiano específico, cada uno siendo capaz de provocar una respuesta inmune específica en un mamífero. Composiciones de vacuna multivalentes (que incluyen trivalente o polivalente) preferiblemente incluirán tres o más inmunógenos virales o microbianos específicos, respectivamente. En una modalidad ilustrada en la presente, los inventores desarrollaron una formulación de vacuna viva, modificada hexavalente sorprendente e inesperadamente hexavalente (seis formas) que comprende inmunógenos específicos para BVDV-1b, BVDV Tipo 1a (BVDV-1a), BVDV Tipo 2 (BVDV-2), Pl3, Virus Sincitial Respiratorio Bovino (BRSV), y BHV-1, el agente causal de rinotraqueítis bovina infecciosa (IBR), para controlar la infección del BRDC en poblaciones de mamífero, y particularmente en ganado doméstico.

Descripción detallada de la invención Modalidades ilustrativas de la invención se describen abajo.

En el interés de claridad, no todas las características de una implementacíón actual se describen en esta especificación. Por supuesto se apreciará que en el desarrollo de tal modalidad actual, numerosas decisiones específicas de la implementacíón se deben hacer para lograr las metas específicas de los desabolladores, tales como cumplimiento con restricciones relacionadas con los negocios y relacionadas con el sistema, las cuales variarán de una implementacíón a otra. Más aún, se apreciará que tal esfuerzo de desarrollo debe ser complejo y agotador, pero podría ser un emprendimiento de rutina para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica teniendo el beneficio de esta descripción.

"FIEBRE DEL EMBARQUE" "Fiebre del embarque" es un término dado a un síndrome septicémico, altamente contagioso, agudo en vacas y ovejas que se caracteriza clínicamente por fiebre, inflamación aguda de las vías respiratorias, descarga nasal, anorexia, depresión, neumonía fibrinosa, y necrosis de los tejidos infectados. Muy frecuentemente encontrada en corrales de engorda después del embarque, la fiebre del embarque es la causa principal de muerte entre ganado joven, y es responsable de una pérdida anual estimada a la industria de más de la mitad a un billón de dólares. En 1991 solamente, la fiebre del embarque se estimó costar a la industria vacuna Estadounidense casi $624 millones de dólares, debido principalmente a los costos de tratamiento, pérdida de producción, y muerte.

La patogénesis de la fiebre del embarque es en general considerada por involucrar influencias externas adversas que predisponen al animal a una infección respiratoria viral inicial, la cual, a su vez, produce condiciones favorables para la proliferación de una o más infecciones bacterianas secundarias.

Complejo de enfermedad respiratoria bovina (BRD) (BRDC) El agente causativo primario de la fiebre del embarque es una condición multifactorial conocida como enfermedad respiratoria bovina (BRD) o Complejo de Enfermedad Respiratoria Bovina (BRDC). El BRDC, una causa principal de pérdida económica en la industria del ganado vacuno, se caracteriza por infección secuencial o simultánea concomitante por tanto los patógenos virales como bacterianos. Los patógenos virales implicados en el BRDC incluyen Virus del Herpes Bovino 1 (BHV-1), Pl3 Bovino, Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV), y Virus Sincitial Respiratorio Bovino (BRSV).

Después de la infección viral, los animales afectados después desarrollan una o más infecciones bacterianas subsecuentes (por ejemplo, Mannheimia [anteriormente Pasteurella] haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni [anteriormente Haemophilus somnus], Actinomyces pyogenes, y varios Mycoplasma spp.) los cuales a menudo se manifiestan en neumonía aguda.

El signo clínico más común y tempranamente reconocible de neumonía es depresión. Los becerros que presentan depresión tendrán orejas caídas, una cabeza alargada, una espalda inclinada y/o a menudo se aislarán ellos mismos de otras vacas. Conforme la salud de los becerros progresivamente se deteriora, detienen su alimentación, presentando una frecuencia respiratoria incrementada, y desarrollan una fiebre pronunciada (típicamente en el intervalo de 40°-42°C (104°-108°F).

Pestivirus Los pestivirus causan enfermedades económicamente importantes en animales alrededor del mundo. El género Pestivirus, dentro de la familia Flaviviridae, comprende tres especies de virus de RNA de sentido positivo de hebra única: Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV), virus de fiebre porcina clásica (CSFV), virus de enfermedad limítrofe (BDV). Recientemente, un cuarto grupo distinto de pestivirus ha sido identificado, que está genéticamente relacionado con el BVDV, y está referido en la literatura como el Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 2 (BVDV-2) (véase por ejemplo, Thiel ef al., 1996; y Becher et al., 1995; cada uno de los cuales se incorpora específicamente en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta). Consecuentemente, los textos contemporáneos ahora se refieren a las especies originales de BVDV como "BVDV-1" para distinguirlas entre las dos especies.

Virus de diarrea viral bovina (BVDV) Los tipos de especies de Pestivirus son BVDV Tipo 1 (BDVD-1), cuyo genoma es de aproximadamente 12.5-kb de longitud y contiene un marco lector abierto grande (ORF) (Collett et al., 1988, específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta). Los códigos ORF para una poliproteína grande de aproximadamente 450 kDa son procesados co- y post-traduccionalmente por proteasas hospederas o virales. El extremo N-terminal de poliproteína del BVDV estándar resulta en una proteína no estructural p20 (Npro), proteína cápsida p14 (C); glicoproteínas de envoltura gp48 (EO), gp25 (E1), gp53 (E2); proteínas no estructurales p125 (NS23), p10 (NS4A), p32 (NS4B), p58 (NS5A) y p75 (NS5B) (véase, por ejemplo, Tautz et al., 1997; Xu et al., 1997; Elbers ef al., 1996; y Wiskerchen eí al., 1991, cada una de las cuales está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta). El BVDV-1 existe en dos biotipos, citopático (designado "cp") o no citopático ("ncp"), los cuales difieren por la producción de un polipéptido único de 80-kDa (la proteína no estructural p80, NS3) en la variante citopática (véase, por ejemplo, Gillespie ef al., 1960, específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a ésta).

Con base en los análisis filogenéticos de un número de aislados del BVDV, el BVDV-1 ha sido mostrado por comprender al menos 13 subgenotipos distintos (designados BVDV-1a a BVDV-11), mientras dos subgenotipos (BVDV-2a y BVDV-2b) han sido identificados para BVDV-2 (véase, por ejemplo, Pellerin et al., 1994; Ridpath et al., 1994, y Xue et al., 2010; cada una de las cuales está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta).

Los BVDV-1 y BVDV-2 ambos causan infecciones agudas en vacas (diarrea, fiebre, síndrome hemorrágico) y, si la infección ocurre durante el embarazo, aborto, malformación del feto e infección persistente de los becerros. Los animales persistentemente infectados representan el principal depósito del virus, y tales animales pueden venirse abajo con la enfermedad mucosal fatal (MD).

El BVDV está estrechamente relacionado con virus que causan enfermedad limítrofe en ovejas y fiebre porcina clásica en porcinos. Las vacas infectadas típicamente presentan una "enfermedad mucosal" generalizada, la cual se caracteriza por temperatura elevada, diarrea, tos, y ulceraciones de la mucosa alimentaria (véase por ejemplo, Olafson eí al., 1946; y Ramsey et al., 1953, cada una de las cuales está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta).

El virus del BVD es capaz de cruzar la placenta de vacas preñadas y puede resultar en el nacimiento de becerros persistentemente infectados (Pl) que son inmunotolerantes a los virus y persistentemente virémicos por el resto de sus vidas. Estas vacas Pl, las cuales están altamente predispuestas a la infección con microorganismos causando neumonía o enfermedad entérica, proporcionan los depósitos virales necesarios para brotes de la enfermedad MD en vacas (véase por ejemplo, Liess et al., 1974; Barber et al., 1985; Malmquist, 1968; y Ross eí al., 1986, cada una de las cuales está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a ésta).

El BVDV es esparcido a través de un rebaño en una manera fecal-oral, y las estrategias para el control del virus varían de las prácticas de manejo más estrictas, en un esfuerzo por reducir simplemente la pérdida económica, para elaborar procedimientos de prueba para identificar animales infectados que, mientras sean efectivos, típicamente vinculan un nivel de costo inaceptable.

En los pasados treinta años, cerca de ciento cincuenta vacunas para el BVDV, tanto virus vivo modificado (MLV) como partículas de virus o virus atenuados inactivados han sido comercializadas para la industria vacuna siendo varios grados de éxito; los brotes del BVDV son todavía reportados en una base anual debido a la disponibilidad distribuida y uso de formulaciones comerciales de vacunas. Los procedimientos actuales para manejar la enfermedad involucran inoculación repetida anual con vacunas para vacas, y las etapas adicionales son tomadas en general en un intento por asegurar que ningún becerro nazca como portador de Pl. Varios diferentes métodos de prueba han sido desarrollados para la detección del BVDV, y/o detección de animales infectados con el BVDV, que incluyen reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR), inmunoensayo ligado a la enzima (ELISA), técnicas estándares de aislamiento del virus, y varios ensayos inmunohistoquímicos.

Definiciones ejemplares Los términos "alrededor" y "aproximadamente" como se usan en la presente, son intercambiables, y deben en general ser entendidos por referirse a un intervalo de números alrededor de un número dado, así como también a todos los números en un rango mencionado de números (por ejemplo, "aproximadamente 5 a 15" significa "aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15" a menos que se declare de otro modo). Más aún, todos los rangos numéricos de la presente deben ser entendidos por incluir cada número entero completo dentro del intervalo. Como se usa en la presente, el término "antígeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal hospedero. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza de fragmento de DNA capaz de inducir una respuesta inmune después de la presentación a un animal hospedero; una proteína, un polipéptido, un péptido, un epítope, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina. Un antígeno en general abarca cualquier sustancia inmunogénica, es decir, cualquier sustancia que provoca una respuesta inmune (por ejemplo, la producción de moléculas anticuerpo específicas) cuando se introducen en los tejidos de un animal susceptible, y que es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo que es producido en respuesta a la introducción del antígeno. Un antígeno es capaz de ser reconocido por el sistema inmune, induciendo una respuesta inmune humoral, y/o induciendo una respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o T. Un antígeno puede incluir un epítope único, o dos o más epítopes.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que se une a otras moléculas (antígenos) vía dominios variables de cadena pesada y ligera, VH y Vu, respectivamente. El término "anticuerpo" se refiere a cualquier molécula de inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, pero no se limita a, IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, y cualesquiera subclases de las mismas o combinación de las mismas. El término "anticuerpo" también significa un fragmento funcional de moléculas de inmunoglobulina, que incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', (Fab')2, Fv, Fd, scFv y sdFv a menos que se declare expresamente de otro modo.

Como se usa en la presente, un "polipéptido antigénico" o un "polipéptido inmunogénico" es un polipéptido el cual, cuando se introduce en un vertebrado, reacciona con las moléculas del sistema inmune del vertebrado, es decir, es antigénico, y/o induce una respuesta inmune en el vertebrado, es decir, es inmunogénico . Los pol ipéptidos antigénicos e inmunogénicos aislados de- la presente invención además de aquellos codificados por polinucleótidos de la invención , pueden ser proporcionados como una proteína recombinante , una subunidad purificada , un vector viral que expresa la proteína , o pueden ser proporcionados en la forma de una vacuna de virus inactivado, por ejemplo, una vacu na del virus atenuado vivo, una vacuna del virus eliminado por calor, etc.

Como se usa en la presente , a "vacuna viva modificada" es una vacuna que comprende un virus que ha sido alterado, típicamente pasando en células del cultivo de tejido, para atenuar su capacidad para causar la enfermedad , pero el cual retiene su ca pacidad para proteger contra la enfermedad o infección cuando se admin istra subsecuentemente a un animal .

Como se usa en la presente, un "adyuva nte" significa u na composición comprendida de u na o más sustancias que intensifican la inmunogenicidad y eficacia de un virus vivo modificado o antígeno, cuando se presenta en una composición de vacuna que contiene una población de ta les virus , o una plura lidad de tales antígenos.

Como se usa en la presente, una " un idad infecciosa" de un virus se define como una TC I D50, o la cantidad requerida para infectar o eliminar 50% de un cultivo de tej ido de células susceptibles.

Como se usa en la presente , el térm i no "portador" está propuesto para incluir cualquier solvente(s) , medio de dispersión, recubrimiento(s) , dil uyente(s) , amortig uador(es) , agente(s) isotónico(s), solución(es), suspensión(es), coloide(s), inerte(s) o similares, o una combinación de los mismos que es farmacéuticamente aceptable para administración al animal relevante. El uso de uno o más vehículos de suministro para compuestos químicos en general, e inmunógenos en particular, es bien conocido por aquellos de habilidad ordinaria en las artes farmacéuticas. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones de diagnóstico, profilácticas y terapéuticas. Uno o más ingrediente(s) activo(s) complementario(s) también pueden ser incorporados en, o administrados en asociación con, una o más de las composiciones inmunogénicas y formulaciones de vacunas de los mismos descritos.

Como se usa en la presente, los términos "inmuniza" o "inmunización" o términos similares se refieren a conferir la capacidad para montar una respuesta inmune detectable, o preferiblemente, sustancial contra un epítope o inmunógeno antigénico especifico. Estos términos no necesariamente interfieren con la inmunidad completa, sino preferiblemente que se puede producir una respuesta inmune que es sustancialmente mayor que el valor límite, por ejemplo, donde composiciones inmunogénicas de la invención no son administradas o donde se administra una vacuna convencional. Por ejemplo, un mamífero es considerado por ser inmunizado contra uno o más inmunógenos objetivo, si una respuesta inmune humoral y/o celular al(los) ¡nmunógeno(s) objetivo(s) ocurre (y preferiblemente una respuesta inmune sustancial) después de la administración de las composiciones de vacunas descritas en la presente.

Como se usa en la presente, el término "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna denota el desarrollo de una respuesta inmune mediada por el anticuerpo y/o celular en el animal hospedero. En general, una respuesta inmunológica incluye (pero no se restringe a) uno o más de los siguientes efectos: (a) la producción de anticuerpos; (b) la producción de células B; (c) la producción de células T auxiliadoras; y/o (d) la producción de células T citotóxicas, que son específicamente dirigidas a un antígeno o hapteno dado.

Como se usa en la presente, el término "inmunogénico" como se usa en la presente también se refiere a una sustancia, tal como una secuencia de aminoácido, una porción de una secuencia de aminoácido dentro de una proteína, polipéptido, o péptido, o un virus vivo o muerto atenuado o modificado que provoca una respuesta inmunológica en un animal hospedero. Como se usa en la presente, el término "proteína ¡nmunogénica," "péptido inmunogénico," o "polipéptido inmunogénico" se refiere a proteínas, péptidos, y polipéptidos que son inmunologicamente activos en el sentido que una vez administrados al hospedero, son capaces de evocar una respuesta inmune del tipo humoral y/o celular dirigido contra la proteína. El término epítope se refiere a un sitio de proteína capaz de inducir una reacción inmune del tipo humoral (células B) y/o tipo celular (células T).

El término "patógeno" se define en la presente como cualquier clase de agente infeccioso, que incluye por ejemplo, virus, priones, protozoarios, parásitos, así como también microbios tales como bacterias, levaduras, mohos, hongos, y similares.

Como se usa en la presente, el término "individual" (también intercambiablemente referido como "hospedero", "sujeto", "recipiente, "paciente", ere.) se refiere a cualquier animal que puede recibir una o más de las composiciones farmacéuticas o formulaciones de vacunas como se describe en la presente. Preferiblemente, el sujeto es un animal vertebrado, el cual está propuesto para denotar cualquier especie animal (y preferiblemente, especies de mamíferos). En ciertas modalidades, el individuo es preferiblemente cualquier hospedero mamífero, que incluye pero no se limita a, primates no humanos, bovinos, caninos, caprinos, cavinos, córvidos, epinos, equinos, felinos, hircinos, lapinos, leporinos, lupinos, ovinos, porcinos, racinos, vulpinos, y similares, que incluyen ganado, especímenes zoológicos, exóticos, así como también animales de compañía, mascotas, y cualquier animal bajo el cuidado de un practicante veterinario.

Las frases "veterinariamente aceptable" y "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o indeseada similar cuando se administran a un mamífero. Como se usa en la presente, "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retienen la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparte algún efecto toxicológico indeseado. Ejemplos de tales sales incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, y similares; y sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido pamoico (embónico), ácido alg ínico, ácido naftoico, ácido poliglutámico, ácidos naftalensulfónicos, ácidos naftalendisulfónicos, ácido poligalacturónico; sales con cationes de metal polivalente tales como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, y similares; sales formadas con un catión orgánico formado de ?, ?'-dibenciletilendiamina o etilendiamina; y combinaciones de los mismos.

Como se usa en la presente, una "respuesta inmune protectora" o "respuesta inmune terapéutica" se refiere a una respuesta CTL y/o HTL a un antigeno, la cual en alguna forma previene o al menos parcialmente detiene la enfermedad , o los síntomas, efectos secundarios o progreso de la misma. La respuesta inmune puede también incluir una respuesta de anticuerpo que ha sido facilitada por la estimulación de células T auxiliadoras.

Como se usa en la presente, el término "vacuna" se refiere a una composición o formulación que contiene una composición inmunogénica de la presente invención en una forma que es capaz de ser administrada a un vertebrado, y preferiblemente a un animal tal como un mam ífero. Típicamente, las vacunas de la presente invención incluirán una o más de las composiciones inmunogénicas (que incluyen uno o más partículas de virus vivas, modificadas, o pluralidades de las mismas) descritas en la presente, formuladas para administración a un animal en necesidad del mismo. Tales composiciones pueden ser de cualquier formulación adecuada, que incluye, sin limitación, aquellas preparadas en un vehículo acuoso, asi como también aquellas en forma congelada, secada por congelamiento, liofilizada o deshidratada que son entonces subsecuentemente rehidratadas o suspendidas en un vehículo farmacéuticamente aceptable convencional {por ejemplo, salina estéril o una solución acuosa amortiguada similar) previo a la administración. En tales formas, las composiciones de vacuna de la presente invención pueden ser manufacturadas en alícuotas de dosis únicas o múltiples convenientes que pueden ser fácilmente empleadas en uno o más de los métodos o regímenes de vacunación descritos en la presente para prevenir, manejar o de otro modo tratar una o más condiciones o uno o más síntomas de infección viral y/o microbiana en un animal susceptible.

Después de la introducción en el hospedero animal, las composiciones inmunogénicas y vacunas que las comprenden son capaces de provocar una respuesta inmune, y preferiblemente una respuesta inmune que es específica al antígeno(s) introducido, de manera que la respuesta inmune resultante es fácilmente detectable usando ensayos convencionales conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en las artes inmunológicas, que incluyen, pero no se limitan a, ensayos que detectan la producción de anticuerpos específicos, cítocinas y/o la activación de células T citotóxicas, células que presentan antígenos, células T auxiliadoras, células dendríticas y/u otras respuestas celulares dentro de las células y tejidos del animal vacunado. Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden incluir, o ser concomitantemente administradas en o con, uno o más adyuvantes solos, o en combinación con uno o más antígeno(s) adicionales o similares.

Las vacunas y composiciones inmunogénicas de la presente invención confieren una respuesta inmune a un animal después de la inmunización. Como se usa en la presente, el término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduce a la activación o proliferación de linfocitos B y/o T. En algunos casos, sin embargo, las respuestas inmunes pueden ser de baja intensidad y llegan a ser detectables solamente cuando se usan al menos una sustancia de conformidad con la invención, mientras otras pueden requerir administración repetida, un adyuvante, un segundo agente activo o adiciona, o una o más combinaciones de los mismos. El término "adyuvante" se refiere a un agente usado para estimular el sistema inmune de un organismo viviente, de manera que una o más funciones del sistema inmune son incrementadas y dirigidas hacia el agente inmunogénico.

Como se usa en la presente, los términos "tratamiento," "tratar," "tratado," o "tratando" se refiere a terapia o el alivio de uno o más síntomas de una enfermedad, o la reducción en la extensión o severidad de la enfermedad, o un síntoma de la misma, sea antes o después de que su desarrollo afecta a un animal susceptible. Cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, los términos se refieren a un tratamiento o régimen de tratamiento que reducen Ja severidad de la infección o reducen o disminuyen o retardan uno o más síntomas de los males atribuibles a la infección, así como también incrementar la capacidad del animal infectado para combatir la infección, que incluyen por ejemplo, la reducción y/o eliminación de la infección a partir del cuerpo del individuo tratado, o para disminuir o prevenir la enfermedad de llegar a empeorar, o de dispersarse a otros animales que entran en contacto con el animal afectado.

El término "cantidad inmunogénicamente efectiva" tiene su significado usual en la técnica, es decir, una cantidad de un inmunogeno que es capaz de inducir una respuesta inmune que acopla significativamente agentes patogénicos que portan características inmunológicas con el inmunogeno. Este término puede también abarcar cantidades efectivas ya sea terapéuticamente o profilácticamente, o ambas.

Como se usa en la presente, los términos "prevención", "previene", "prevenido", "previniendo", "vacunando", y "vacunación", se refieren a la profilaxis o a la inhibición parcial o completa de la infección, o a la reducción o retardo en el comienzo, de una o más enfermedades, o uno o más síntomas de la misma, en un animal que puede estar predispuesto a ésta, pero aún no ha sido expuesto a esta o ha sido diagnosticado por tenerla. Cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, los términos se refieren a una administración profiláctica de una o más de las composiciones inmunogénícas de la invención, las cuales tienden a incrementar la resistencia de un animal a la infección con uno o más patógenos virales o microbianos o, en otras palabras, disminuir la probabilidad que el sujeto llegará a infectarse con el(los) patógeno(s) o, si se infecta, retardará los síntomas, disminuirá la severidad de la infección, o disminuirá los síntomas del mal atribuible a la infección, o cualquier combinación de los mismos en el animal infectado.

Cada uno de "prevenir" y "tratar" incluyen manejar una infección, enfermedad, condición, o síntoma particular del mismo, en un animal, así como también cualquier modificación benéfica del estado candidato o el curso de la enfermedad o condición, o cualquiera de los síntomas del mismo. El manejo puede atender algunos o todos los síntomas del mismo con o sin afectar actualmente la infección fundamental o cualquier enfermedad o condición que resulta de esta.

El término "por ejemplo," como se usa en la presente, se usa solamente por medio del ejemplo, sin limitación propuesta, y no debe ser construido como referente solamente a aquellos puntos explícitamente enumerados en la especificación.

De conformidad con la convención de leyes de patente desde hace mucho tiempo, las palabras "un" y "uno" cuando se usan en esta solicitud, que incluyen las reivindicaciones, denotan "uno o más".

Ejemplos Los siguientes ejemplos están incluidos para demostrar modalidades ilustrativas de la invención. Se debe apreciar por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas para funcionar bien en la práctica de la invención, y de este modo pueden ser consideradas por constituir los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos de habilidad ordinaria en la técnica deben, en vista de la presente descripción, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas las cuales son descritas y todavía obtienen un resultado similar o igual sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1 - Producción de virus de BVDV, vivo, modificado El presente Ejemplo proporciona un método ilustrativo para producción a gran escala del virus vivo, modificado del BVDV-1b (MLV).

Materiales y métodos Virus y microorganismos La cepa TGAC del BVDV-1b se obtuvo del Departamento de Agricultura Estadounidense (USDA), Servicio de Inspección de Salud Animal y Vegetal (APHIS), Centro para Laboratorio Biológico Veterinario (CVB-L) (Ames, IA, USA). La Semilla Principal (MS) fue subsecuentemente denotada como "TVL-BVDV1b MS 04/27/2007 DW3-095," y como se indica en la solicitud de patente provisional Estadounidense copendiente del Solicitante no. 61/427,404, presentada actualmente junto con esta, ha sido depositada bajo condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos será disponible durante la dependencia de esta solicitud de patente a una determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas para ser titulada a esta bajo el 37 C.F. . § 1.14 y 35 U.S.C. § 122. El depósito está disponible como se requiere por las leyes de patente extranjeras en países en donde son presentadas las contrapartes de la presente solicitud, o su progenie. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención objeto en la derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental. El presente depósito de cultivo será almacenado y hecho disponible para el público de conformidad con las provisiones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, es decir, será almacenado con todo el cuidado necesario para mantenerlo disponible y descontaminado por un periodo de al menos cinco años después de la petición más reciente para el acabado de una muestra del depósito, y en cualquier caso, por un periodo de al menos 30 (treinta) años después de la fecha del depósito o por la vida ejecutable de cualquier patente la cual puede emitir la divulgación del cultivo depositado. El depositante reconoce el derecho a sustituir el depósito y el depositario debe ser incapaz de terminar una muestra cuando la solicite, debido a la condición del depósito. Todas las restricciones en la disponibilidad al público del depósito de cultivo objeto serán irrevocablemente removidas del otorgamiento de una patente que la describe. Un depósito del virus TVL BVDVIb MS 04/27/2007 DW3-095 se ingresó en la colección permanente del Depositario de Patentes del Laboratorio de Cultivo de Tipo Americano, localizado en 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209, USA, el 21 de Diciembre de 2010 bajo los términos del Tratado de Budapest, después de lo cual se asignó un número de acceso de ATCC PTA-11553 por el repositorio.

La identidad del virus S ( SV) se realizó usando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para identificar positivamente el virus MS como BVDV-1b. El protocolo para diferenciación del BVDV por PCR se desarrolló por Ridpath y Bolín, 1998 (específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta). La identificación positiva se realizó usando un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) (McNulty ef al., 1984). La replicación de estos virus en células de Riñon Bovino Texas Vet Lab (TVL-BK) producen cambios citopatológicos fácilmente reconocibles.

Frecuencia de identificación de microorganismos Previo a la inoculación de células TVL-BK con producción de virus de siembra, las células son microscópicamente visualizadas para confirmar que las células están exhibiendo la morfología previamente descrita. Previo a la recolección de cada lote del virus de producción, las células TVL-BK se observaron para confirma que están presentando efectos citopatológicos típicos (CPE) asociados con el virus.

Virulencia, mantenimiento e intervalo de cultivos o subcultivos La consistencia de la virulencia, potencia, y antigenicidad del BVDV-1b usada en esta vacuna se promovió por almacenaje en la condición liofilizada o congelada, y restricciones en el número de pasajes o subcultivos.

Intervalo: Producción de virus = MSV+10 (eficacia de pasaje serial), pero puede ser cualquier pasaje entre 5 y 10. Solución base celular de producción = MCS+20 (eficacia de pasaje serial), pero también puede ser cualquier pasaje abajo de 20.

Composición y reacción del medio usado en cultivos de producción y semilla La composición y reacción del medio usado en cultivos de producción y semillas fueron como sigue: Funcionamiento del inoculo del virus (MSV+1 a MSV+8) y producción del inoculo del virus (el cual fue típicamente, pero no exclusivamente en MSV+9), se propagaron en células TVL-BV; siempre que, el número de pasajes de células TVL-BK para propagación del virus no exceda 20 pasajes a partir del MCS. El medio de crecimiento (para tanto funcionamiento como producción de preparaciones celulares) fue Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM).

El MSV resultante puede ser almacenado liofilizado, en medio de criopreservación almacenado en nitrógeno líquido, o en medio de criopreservación almacenado de -70 a -85°C. El MCS puede ser almacenado en medio de criopreservación (en nitrógeno líquido), o en medio de criopreservación almacenado de -70 a -85°C.

Métodos para preparar suspensiones para sembrado e inoculación Crioviales que contienen células TVL-BK congeladas fueron rápidamente descongelados. Los matraces de cultivo se llenaron a la capacidad recomendada con medio y las células suspendidas fueron asépticamente transferidas de los crioviales al matraz de cultivo. Los recipientes de cultivo también se sembraron dividiendo cultivos activamente propagantes a una relación que varía desde 1:3 a 1:6 (cm2:cm2). El TVL-BK en matraz o botellas de rodillo, las cuales fueron propuestas para subcultivo, se liberaron de la superficie del cultivo removiendo asépticamente el medio de crecimiento y agregando una solución de tripsina-EDTA 1X. Después de la incubación (5 min, de 35 a 39°C) la monocapa se dispersó. La tripsina se inactivo agregando las células dispersadas en un recipiente de cultivo con medio de crecimiento. Alícuotas congeladas del virus se descongelaron rápidamente o resuspendieron en medio si la siembra fue liofilizada. Células TVL-BK (+20 o menos) se inocularon con virus. El virus que fue replicante en matraces o botellas de rodillo, las cuales se propusieron para subcultivo, se recolectó después del tiempo de incubación apropiado y/o se observó el CPE. Los fluidos virales se almacenaron entonces de 6 a -80°C o usaron inmediatamente para inocular otros recipientes de cultivo.

Se usaron técnicas de cultivo celular estándar para inocular tanto semilla como medio de producción. Las células TVL-BK en el pasaje 20 o menos fueron inoculadas. La producción del inoculo del virus congelada, la cual es típicamente en MSV+9, fue rápidamente descongelada. El volumen del virus del inoculo varió de 1 a 25 mL por 1600 cm2 del área de cultivo para lograr una multiplicidad de infección que varía de 0.01 a 1.0 virus por célula. El Título de inoculo mínimo fue como sigue: 105 0 TCID50 por mL para BVDV-1b. Los cultivos inoculados fueron incubados a 37 ± 2°C y 5 ± 1% C02 por 2 a 4 días.

Recolecta Al día de la recolección, los cultivos fueron examinados por CPE específico del virus y esterilidad. El tiempo de incubación mínimo típico fue 2 días después de la inoculación con BVDV-1b. El tiempo de incubación máximo típico fue 4 días después de la inoculación con BVDV-1b. Las suspensiones del virus fueron asépticamente recolectadas a partir de recipientes de producción. Las muestras se recolectaron para determinar el TCID5o de la recolección. El material recolectado se almacenó de 6 a -80°C. El material recolectado puede ser almacenado antes del congelamiento por hasta un mes, y congelado por hasta seis meses previo a la fabricación del producto final.

Los fluidos de recolección que presentan CPE atípico o evidencia de contaminación fueron desechados. Solamente los fluidos de recolección que presentan CPE típico y libre de contaminación fueron elegibles para uso de producción adicional. El Título de virus de recolección aceptable mínimo fue 106 TCID50/mL. La pluralidad de los fluidos de recolección se confirmó como sigue: Una muestra de 2 mL de fluido de recolección se agregó asépticamente a 38 mL de SCBD e incubó de 35 a 39°C junto con controles negativos (medio solo) y positivos por 46 a 50 horas. La ausencia de crecimiento macroscópico en los cultivos así como también el control negativo establece que los fluidos de recolección fueron puros y satisfactorios para uso de producción adicional. Los fluidos de recolección encontrados por no ser puros fueron desechados.

Formulación ejemplar de un virus BVDV vivo, modificado Todas las manipulaciones se condujeron usando técnica aséptica. Los antibióticos adecuados, tales como neomicina y Nistatina (Micostatina) se agregaron durante el montaje de una serie o subserie de vacunas a un intervalo de 15 pg y 15 Unidades/dosis, respectivamente. Los fluidos de recolección se diluyeron en DMEM como sea necesario para ajustar la concentración, y estabilizaron por la adición de una solución se sacarosa filtrada 0.2-pm, resultando en una concentración de sacarosa final de 20 ± 1%.

Los fluidos de recolección de virus fueron opcionalmente concentrados por ultrafiltración estéril usando un filtro de valor límite de peso molecular de 10-kDa. El grado de concentración típicamente no excede 50 veces.

Cada lote de fluidos virales recolectados se analizó para determinar el TCID50. Brevemente, las diluciones log (10"1 hasta 10"8) del material recolectado se usaron para inocular células TVL-BK en una placa de 96 cavidades. Las placas se incubaron a 37 ± 2°C y 5 ± 1% C02 por 96 ± 6 horas. Después de la incubación las placas se leyeron a amplificación 100*, y examinaron por CPE. Los Títulos se determinaron por el Método Spearman-Karber, ya modificado por Finney (1978). Los contenedores finales, los cuales han sido previamente esterilizados, fueron asépticamente llenados. Los contenedores finales fueron parcialmente tapados con un tapón de sello interno estéril. Los viales de producto final fueron transferidos a un secador por congelador y desecados. El tiempo de ciclo de secado varío desde 24 hasta 72 horas, con temperatura de producto máxima de 22°C. El contenido de humedad del producto final desecado típicamente no excede 5%, y la cantidad mínima del material antigénico por dosis en el contenedor final fue preferiblemente aproximadamente 8 ? 103 TCID5o por dosis.

Ejemplo 2 - Estudio de estimulación de ternera con vacuna monovalente BVDV-1b El presente ejemplo demuestra la eficacia de una vacuna monovalente BVDV-1b en la prevención de la infección en animales vacunados.

Materiales y métodos Animales Becerros novillones mezclados de cuatro a cinco meses de edad sanos se adquirieron de una fuente comercial, identificados por etiquetas en la oreja aleatoriamente tomados, y seleccionados serológicamente por susceptibilidad a BVDV. Todos los becerros recibieron una dosis de ácido libre cristalino ceftiofur (Excede®, Pfizer Animal Health, New York, NY, USA) después de la llegada. Los becerros tienen acceso a libre elección de agua, heno y una ración de alimentación pelletizada.

Vacuna La Vacuna BVDV-1b, del Virus Vivo Modificado, se preparó como se describe anteriormente. Brevemente, el Virus de Siembra Principal BVDV-1 se propagó en la línea de células TVL-BK (20avo paso), recolectada en el I0mo pasaje, estabilizado de conformidad con el contorno de la producción, llenado en botellas, y secado por congelamiento. La concentración de BVDV fue 8 * 103 TCID50 por dosis como se determina por el método Spearman-Karber (véase por ejemplo, Finney, 1978). El agua estéril se usó como un diluyente para rehidratar la vacuna.

Vacunación y estimulación de becerros Diecinueve (19) becerros negativos al BVDV se mezclaron en un aliado de clasificación. Cada ternera se colocó en uno de dos grupos (controles vacunados o no vacunados) usando un esquema de aleatorización de serie apareada (Tabla 1) proporcionado por CVB-Biometrics (Ames, IA, USA).

Tabla 1. Tabla de aleatorización de par apareado Sujeto de Grupo Ternera Prueba 1 A 53 2 B 12 3 A 54 4 B 2 5 A 50 6 A 74 7 B 32 8 A 77 9 B 3 10 A 67 11 B 22 12 A 72 13 B 71 14 B 1 15 A 69 16 B 58 17 A 39 18 A 65 19 B 68 Grupo A = Vacunados; Grupo B = controles No Vacunados.

Diez de los becerros serológicamente negativos se vacunaron con una dosis de vacuna BVDV-1b. Cada vacunación se dio a una dosis de 2 mL del producto por inyección subcutánea en el lado izquierdo del cuello al día 0. El resto de los becerros no recibió alguna vacuna viral. Después de la vacunación, los dos grupos de becerros se mantuvieron en corrales separados pero equivalentes hasta dos días previo a la estimulación.

Se recolectaron muestras de sangre al día de la llegada y probaron por Títulos BVDV. Las muestras de sangre también se recolectaron en el día de la vacunación y el día de la estimulación. Se determinaron Títulos de anticuerpo BVDV-1b por el método de neutralización de suero de disminución de virus constante (Schefers et al., 2008). Dos días previo a la estimulación grupos de control tanto vacunados como no vacunados se mezclaron con el propósito de observación clínica pre-estimulación. Catorce (14) días después de la vacunación, los becerros de control y vacunados se estimularon con un aislado virulento de BVDV-1b obtenido de los pulmones de una ternera muerta en corral. El virus ha sido pasado in vitro en células TVL-BK usando DMEM que contiene 10% de Suero equino. Una dosis de estimulación de 8 ? 107 TCID50 en 4 mL se administró a cada ternera, 2 mL en cada pasaje nasal durante la inspiración.

Las temperaturas rectales se registraron diariamente para cada ternera por dos días previo a la estimulación, el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulacíón.

Se determinaron conteos de células blancas de la sangre (WBC) para cada ternera por dos días previo a la estimulación, el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación. Las muestras se recolectaron en tubos de EDTA Vacutainer® y se realizaron conteos usando un contador WBC diferencial Hemavet 950™ de Drew Scientific (Waterbury, CT, USA).

Hisopos nasales y capas leucocitarías se recolectaron de cada ternera dos días previo a la estimulación, el día de la estimulación y por 14 días consecutivos posterior a la estimulación con el propósito del aislamiento del BVDV. Las hisopos nasales se recolectaron usando Hisopos de Cultivo BBL con Medio Stuart Líquido (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA). El medio de las muestras fue filtrado estéril y usado para inocular 80% de células TVL-BK confluentes en cultivo. Las capas leucocitarias se recolectaron de tubos vacutainer de EDTA y usaron para inocular 80% de células TVL-BK confluentes en cultivo. La capa leucocitaria se removió después de la incubación por una hora. Los cultivos se incubaron por 4 a 5 días en 5 ± 2% de C02 a 37 ± 3°C. Los sobrenadantes de todas las muestras de cultivo se sometieron a ensayo para determinar la presencia de BVDV-1b por RT-PCR usando una primera serie específica de BVDV-1b (BVDV-1b (primero)) desarrollada por los inventores con una sonda de detección adecuada: BVDV-1b (primero): Cebador delantero: 5'-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC- 3' (SEC ID NO:1); Cebador inverso: 5'-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3' (SEC ID NO:2); and Sonda de Detección de BVDV-1b: 5'-TCACCTGGACGACCC-3' (SEC ID NO:3).

BVDV-1b (segundo): Segundo Cebador delantero: 5'- GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO:19); Segundo Cebador inverso: 5'- GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO:20); y Segunda Sonda de Detección de BVDV-1b: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO:21).

Mientras el BVDV-1b (primero) proporciona resultados aceptables, el BVDV-1b (segundo) presenta mejores resultados.

Todas las observaciones clínicas se hicieron independientemente, y los observadores fueron cegados debido a tanto los grupos de control vacunados como no vacunados siendo mezclados con solamente la característica de diferenciación siendo el número de etiqueta en la oreja.

En ningún momento a través del estudio estuvieron los observadores dando conocimiento del estado de vacunación de un animal de prueba individual hasta que se concluyeron las evaluaciones clínicas.

Análisis estadísticos Leucopenia: Una media de leucocito de pre-estimulación se calculó para cada animal promediando los conteos de leucocitos por los Días -2 hasta 0. La relación de conteos de leucocitos diarios con relación a la media de pre-estimulación se calculó (conteo de leucocito como una proporción de la pre-estimulación) para cada pos-estimulación del día 1 hasta 14. Estos datos de proporción se analizaron para determinar si los animales individuales desarrollaron una leucopenia como se define por un 25% de disminución en conteos a partir del valor de referencia. Se calculó la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan (1993) para determinar si la vacunación previene el desarrollo de leucopenia en este estudio.

Diseminación Nasal: Los datos de aislamiento del virus a partir del análisis de hisopo nasal se basan en la proporción de vacunados que el BVDV se aisló del ya comparado con la proporción de controles que el BVDV se aisló de la post-estimulación. La fracción prevenible para la diseminación del BVDV-1b se calculó como se describe por Tanner y Morgan (1993).

Viremia: Los datos de aislamiento del virus a partir de capas leucocitarias de muestras de sangre se analizó con base en la proporción de vacunados que el BVDV-1b se aisló del ya comparado con la proporción de controles que el BVDV-1b se aisló de la postestimulación. Se calculó la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan (1993).

Títulos de Anticuerpo: Se analizaron las comparaciones del grupo de los Títulos ordinariamente a escala con la prueba U de Mann-Whitney.

Temperatura Rectal; Una temperatura rectal promedio pre-estimulación se determinó para cada animal. Este promedio se usó como una covarianza en un análisis de medidas repetidas de varianza (ANOVA) el cual incluye términos para Grupo, Día e interacciones de Grupo*Día.

Todos los análisis estadísticos se realizaron usando SAS Learning Edición v2.0 por Microsoft Windows® (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA).

Resultados Se detectó leucopenia en uno de los diez vacunados y ocho de nueve controles resultando en una fracción prevenible de 87%. Los datos brutos de leucocitos se registran en la Tabla 2.

Tabla 2. Conteos de leucocitos Vacunados Vacunados Día - Día Día Día Día Día Día Día Día 2 -1 0 1 2 3 4 5 6 3S 10.62 9, .24 8.56 6.42 7.60 8 .66 8 .48 9 .58 8.20 50 6.30 5. .94 5.00 4.68 6.58 5 .78 6 .22 9 .40 8.04 53 7.66 7. .10 6.90 7.14 7.00 8 .10 8 .14 8 .62 8.18 54 4.62 4. .00 4.38 4.98 5.14 5 .96 5 .54 6 .52 7.08 65 6.08 4. .56 5.26 4.90 5.06 4 .52 4 .14 5 .68 6.04 67 8.40 9. ,08 8.62 7.80 9.10 8 .40 8 .68 9 .06 9.96 69 7.20 6. .76 6.78 7.22 7.94 7 .52 7 .42 7 .20 6.76 72 7.22 6. ,98 6.52 5.94 5.94 5 .94 6 .22 7 .10 5.86 74 8.02 7. 32 7.46 7.96 11.00 8 .10 8 .26 7. .08 7.26 77 7.22 5. 90 5.10 4.72 4.76 4 .86 6 .22 6, .12 7.02 Tabla 2 (cont. ) Vacu nados Vacunados Día Día Día Día Día Día Día Día 7 8 9 10 11 12 13 14 39 8 .30 10 .62 6 .72 10.76 15.38 11.42 9.38 11.62 50 8 .88 6. 30 6 .54 6.44 6.22 5.92 7.24 6.04 53 9 .06 7. 66 8 .74 10.06 11.14 9.66 10.70 10.58 54 6 .94 4. 62 5 .40 5.72 7.62 8.46 8.02 9.26 65 5 .00 6. 08 4 .78 5.30 6.08 9.80 8.14 7.28 67 8 .56 8. 40 9 .60 9.60 9.54 11.24 11.38 9.38 69 6 .40 7. 20 7 .10 8.98 9.96 12.74 11.54 10.14 72 6 .08 7. 22 5 .64 7.24 7.22 7.76 7.12 12.94 74 6 .16 8. 02 8 .06 7.44 8.46 9.62 9.78 9.96 77 6 .44 7. 22 5 .94 6.00 7.92 8.04 9.78 8.42 Tabla 2 (cont. ) Controles Con- Día -2 Día - Día Día Día Día Día Día Día 1 11 .62 10 .90 11 .78 12 .28 11 .14 7. 66 8 .70 7 .76 9 .40 2 10 .40 9. 68 9. 68 10 .60 10 .22 8. 12 8 .84 7 .70 7 .96 3 8. 10 7. 68 8. 28 9. 82 7. 80 10 .26 5 .90 5 .02 5 .52 12 6. 76 7. 08 6. 98 7. 78 8. 42 7. 52 5 .60 4 .64 4 .98 22 10 .22 8. 82 8. 16 9. 84 9. 42 6. 28 5 .40 5 .28 5 .48 32 10 .40 11 .32 9. 54 8. 72 8. 84 7. 82 5 .96 5 .68 7 .18 58 6. 40 6. 00 6. 52 6. 64 7. 22 5. 24 2 .58 2 .56 3 .70 68 8. 72 8. 30 7. 06 8. 52 8. 28 6. 18 5 .38 4 .08 3 .93 71 5. 94 6. 28 6. 90 6. 22 7. 92 5. 90 8 .06 6 .08 6 .54 Tabla 2 (cont.) Controles Controles Día Día Día Día Día Día Día Día 7 8 9 10 11 12 13 14 1 8. 60 11 .62 9.00 8. 70 7. 66 4 .64 6. 54 5. 92 2 9. 12 10 .40 11.96 10 .10 9. 50 9 .56 9. 20 9. 86 3 6. 94 8. 10 10.62 3. 68 3. 64 4 .58 4. 02 5. 00 12 4. 00 6. 76 4.56 5. 80 6. 42 7 .22 8. 04 7. 96 22 5. 82 10 .22 9.42 7. 10 7. 44 7 .94 8. 36 8. 58 32 8. 04 10 .40 8.12 16 .52 6. 28 7 .20 8. 38 8. 94 58 4. 60 6. 40 5.08 9. 60 4. 48 7 .30 6. 74 6. 08 68 5. 10 8. 72 5.00 7. 18 5. 08 5 .90 5. 80 5. 48 71 9. 94 5. 94 9.20 6. 80 7. 18 6 .56 7. 00 6. 68 La proporción diaria del promedio de pre-estimulación para cada ternera individual se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3. Conteos de leucocitos - porcentaje de promedio pre-estimulado Vacunados Vacunados Día 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Día 5 Dia 6 Dia 7 Día 8 39 -0.322 -0.198 -0.086 -0.105 0. .011 -0.134 -0.124 0.121 50 -0.186 0.145 0.006 0.082 0. .636 0.399 0.545 0.096 53 -0.011 -0.030 0.122 0.127 0, .194 0.133 0.255 0.061 54 0.149 0.186 0.375 0.278 0. ,505 0.634 0.602 0.066 65 -0.075 -0.045 -0.147 -0.219 0. .072 0.140 -0.057 0.147 67 -0.103 0.046 -0.034 -0.002 0. 041 0.145 -0.016 -0.034 69 0.044 0.149 0.088 0.073 0. 041 -0.022 -0.074 0.041 72 -0.140 -0.140 -0.140 -0.099 0. 028 -0.152 -0.120 0.045 74 0.047 0.447 0.066 0.087 -0 .068 -0.045 -0.189 0.055 77 -0.223 -0.216 -0.200 0.024 0. 008 0.156 0.060 0.189 Tabla 3 (cont. ) Vacunados Vacunados Día 9 Día Día Día Día Día Leucopenia 10 11 12 13 14 39 -0291 0.136 0 .624 0.205 -0.010 0.227 + 50 0.138 0.121 0 .082 0.030 0 .260 0.051 - 53 0.211 0.393 0 .543 0.338 0 .482 0.465 - 54 0.246 0.320 0 .758 0.952 0 .851 1.137 - 65 -0.098 0.000 0 .147 0.849 0 .536 0.374 - 67 0.103 0.103 0 .097 0.292 0 .308 0.078 - 69 0.027 0.299 0 .441 0.843 0 .669 0.467 - 72 -0.183 0.048 0 .045 0.124 0 .031 0.874 - 74 0.061 -0.021 0 .113 0.266 0 .287 0.311 - 77 -0.022 -0.012 0 .304 0.324 0 .610 0.386 - Tabla 3 (cont. ) Controles Controles Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 1 0. 074 -0 .026 -0 .330 -0 .239 -0. .321 -0 .178 -0 .248 0.016 2 0. 069 0. 030 -0 .181 -0 .109 -0. .224 -0 .198 -0 .081 0048 3 0. 224 -0 .027 0. 279 -0 .264 -0. .374 -0 .312 -0 .135 0.010 12 0. 121 0. 213 0. 084 -0 .193 -0. .331 -0 .282 -0 .424 -0.026 22 0. 085 0. 039 -0 .307 -0 .404 -0. 418 -0 .396 -0 .358 0.127 32 -0 .163 -0 .152 -0 .250 -0 .428 -0. 455 -0 .311 -0 .228 -0.002 58 0. 053 0. 145 -0 .169 -0 .591 -0. 594 -0 .413 -0. .271 0.015 68 0. 061 0. 032 -0 .230 -0 .330 -0. 492 -0. .512 -0 .365 0.086 71 -0 .024 0. 243 -0 .074 0. 265 -0. 046 0. 026 0. 560 -0.068 Tabla 3 (cont.) Controles Controles Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Leucopenia 1 -0 .213 -0.239 -0 .330 -0 .594 -0 .428 -0 .482 + 2 0. 206 0.018 -0 .042 -0 .036 -0 .073 -0 .006 - 3 0. 324 -0.541 -0 .546 -0 .429 -0 .499 -0 .377 + 12 -0 .343 -0.164 -0 .075 0. 040 0. 159 0. 147 + 22 0. 039 -0.217 -0 .179 -0 .124 -0 .078 -0 .054 + 32 -0 .221 0.585 -0 .397 -0 .309 -0 .196 -0 .142 + 58 -0 .195 0.522 -0 .290 0. 158 0. 069 -0 .036 + 68 -0 .377 -0.105 -0 .367 -0 .265 -0 .277 -0 .317 + 71 0. 444 0.067 0. 127 0. 029 0. 098 0. 048 - El BVDV-1b se aisló de secreciones nasales de uno de diez vacunados y ocho de nueve controles resultando en una fracción prevenible de 90%. Estos datos se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Aislamiento del BVDV-1b de hisopos nasales Vacunados Vacunados Día Día Día Día Día Día Día Día Día 0 1 2 3 4 5 6 7 8 39 50 53 54 65 67 69 72 74 77 Tabla 4 (cont.) Vacunados Vacunados Día 9 Día Día Día 12 Día Día 14 Sumario 10 11 13 _ _ _ _ _ _ _ _ 50 - - - - - - 53 54 - - - - - - 65 _ _ _ _ _ _ 67 _ + _ _ _ _ + 69 _ _ _ _ _ _ 72 _ _ _ _ _ _ 74 _ _ _ _ _ _ 77 _ _ _ _ _ _ Tabla 4 (cont.) Controles Controles Día Día Día Día Día Día Día Día Día 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 - , - - - - - + + 2 - - - - - - - - 3 - - - + - + - 12 - - - - - + + + 22 - - - - - - + 32 - - - - + - + + 58 - - - - - + + 68 - - - - - - + 71 - - - - + - - + Tabla 4 (cont. ) Controles Controles Día 9 Día Día Día Día Día Sumario 10 11 12 13 14 + + + + + + + Denota un resu ltado positivo; - denotes un resultado negativo.

El BVDV-1 b se aisló de ca pas leucocitarias de dos becerros vacunados y todos los nueve becerros de control resultaron en una fracción preven ible de 80%. Estos datos se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Aislamiento del BVDV-1b de capas leucocitarias Vacunados Vacunados Día Día Día Día Día Día Día Día Día 0 1 2 3 4 5 6 7 8 39 ~ - - - - Z I Z Z~ 50 - 53 _ _ _ _ _ _ _ _ _ 54 _ _ _ _ _ _ _ _ _ 65 _ _ _ _ _ _ _ _ _ 67 _ _ _ _ _ _ _ _ _ 69 _ _ _ _ _ _ _ _ _ 72 _ _ _ _ _ _ _ __ _ 74 _ _ _ _ _ _ _ _ + Tabla 5 (cont.) Vacunados Vacunados Día 9 Día Día Día Día Día Sumario 10 11 12 13 14 39 1 1 1 1 1 1 1 50 _ __ _ _ _ _ 53 54 65 _ _ _ _ _ _ 67 _ _ _ _ _ _ + 69 _ _ _ _ _ _ 72 _ - _ _ - - 74 _ _ _ _ _ _ + 77 _ _ _ _ _ _ Tabla 5 (cont.) Controles Controles Día Día Día Día Día Día Día Día Día 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 - - - + - + + + - 2 - - - - - + + + + 3 - - - - + + + + - 12 - - - - - + + + + 22 - - - - + + + + + 32 - - - - + + + - + 58 - - - + + + + + 68 - - - - - + + + + 71 - - - - + + + + + Tabla 5 (cont.) Controles Controles Día 9 Día Día Día 12 Día Día 14 Sumario 10 11 13 2 + + - - - + 3 + + - - + 12 + + + - - + 22 - + - - - + 32 - + - - - + 58 + + - - - + 68 + + + - - + 71 - + - - - + La vacunación induce un incremento estadísticamente significativo (P < 0.05) en Títulos de anticuerpo BVDV-1b SN. La vacuna no causa un incremento significativo en Títulos BVDV-1a o BVDV-2 SN. Los Títulos de anticuerpo SN individuales son presentados en la Tabla 6.

Tabla 6. Títulos de anticuerpo de neutralización de suero Tipos la la Ib Ib 2 2 Vacunado Pre-Vac Pre- Pre- Pre- Pre- Pre- Estim Vac Estim Vac Estim 39 <2 <2 <2 16 <2 <2 50 <2 4 <2 16 <2 <2 53 <2 <2 <2 <2 <2 8 54 <2 <2 <2 8 <2 <2 65 <2 <2 <2 <2 4 2 67 <2 <2 <2 16 4 <2 69 <2 <2 <2 64 <2 <2 72 <2 <2 <2 128 <2 2 74 <2 8 <2 256 <2 <2 Tabla 6 (cont.) Tipos 1A 1A IB IB 2 2 Controles Pre-Vac Pre- Pre- Pre- Pre- Pre- Estim Vac Estim Vac Estim 1 <2 <2 <2 <2 <2 <2 2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 3 <2 <2 <2 <2 <2 <2 12 <2 <2 <2 <2 <2 <2 22 <2 <2 <2 <2 <2 <2 32 <2 <2 <2 <2 <2 <2 58 <2 <2 <2 <2 <2 <2 68 <2 <2 <2 <2 <2 <2 71 <2 <2 <2 <2 <2 <2 El análisis de datos de temperatura rectal no reveló algún efecto estadísticamente significativo de vacunación. Los datos de temperatura rectal se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Tem peraturas rectales Vacunados VacuDía Día Día Día Día Día Día Día Día nados 2 -1 0 1 2 3 4 5 6 39 103. 1 100. .8 102. 0 99. 5 100. 4 100. 7 101. 2 101. 7 102. 2 50 102. 5 101. 3 101. 6 99. 6 100. 6 100. 6 101. 5 101. 0 102. 6 53 103. 1 101. 2 102. 1 99. 4 101. 4 101. 0 101. 8 100. 4 102. 3 54 102. 1 101. 7 102. 1 100 .3 101. 4 101. 4 101. 2 101. 5 101. 0 65 102. 7 102. 8 104. 3 101 .1 100. 9 102. 4 101. 5 101. 4 101. 4 67 102. 8 101. 3 102. 0 101 .4 100. 5 101. 3 101. 1 101. 2 101. 5 69 101. 2 100. 6 101. 1 99. 3 100. 9 101. 8 1015 101. 4 101. 6 72 102. 6 102. 4 102. 3 101 .3 101. 4 100. 4 101. 9 101. 7 102. 0 74 103. 4 102. 2 102. 5 100 .4 101. 6 101. 2 101. 8 101. 4 103. 5 77 101. 5 101. 1 101. 7 100 .2 100. 4 101. 4 101. 6 102. 0 102. 0 Tabla 7 (cont. ) Vacunados Vacunados Día Día Día Día Día Día Día Día 7 8 9 10 11 12 13 14 39 101 .3 101 .3 101. .1 101 .0 102 .1 101 , .0 101 .7 101 .1 50 102 .4 102 , .0 102. .0 101 , .3 102 .0 102 , .5 101 .2 101 .2 53 101 .4 101 , .2 100. .4 100. .2 101 .3 101. .7 101 .3 100 .9 54 102 .0 101. .0 101. , 4 101, .0 101, .2 101. .2 101, .0 100 .4 65 102 .8 101. .7 101. .2 101. .4 101, .7 103. , 7 102, .5 101 .4 67 101 .6 101. .9 101. ,2 100. .5 101 , .2 101. .2 101 , .0 101 .3 69 101 .3 101. .3 103. ,3 99. 8 101. .1 101. .1 101. .4 99. 7 72 102 .4 102. , 0 102. .0 102. .0 102. .7 101. , 3 102. .2 102 .2 74 103 .0 100. ,8 101. 6 100. .3 101. .0 100. , 4 101. .0 100 .1 77 102 .0 101. ,0 101. 0 100. .5 100. ,4 101. 2 101. .8 101 .0 Tabla 7 (cont. ) Controles ControDía Día Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 les 2 1 1 101. .3 101 .0 101, ,5 100 .7 100 .3 101 .9 101. 6 101. 4 100. 2 2 101. .0 100 .7 102. .0 100 .2 101 .0 101 .1 101. 9 103. 8 101. 3 3 101. .4 101 .5 101. .4 101 .1 101 .0 101 .4 101. 6 101. 8 101. 7 12 100. , 4 100 .1 101. .4 98. 6 100 .9 101 .0 100. 8 100. 0 103. 2 22 101. , 9 99. 9 100. .9 99. 2 100 .2 99. 5 100. 3 100. 5 101. 2 32 102. , 1 102 .0 101. .3 100 .2 99. 5 100 .4 100. 1 100. 2 100. 7 58 102. .4 101 .5 101. ,9 99. 4 101 .0 100 .7 102. 2 101. 3 102. 6 68 102. , 1 100 .3 102. ,2 100 .4 101 .2 101 .4 100. 5 101. 3 101. 4 71 101. .3 100 .2 101. ,3 100 .2 101 .2 101 .3 101. 1 101. 2 101. 5 Tabla 7 (cont. ) Controles ConDía 7 Día 8 Día 9 Día Día Día Día Día troles 10 11 12 13 14 1 102 .2 103. 3 100 .7 101.2 101. 3 100. 6 101.5 101.2 2 100 .4 102. 1 102 .2 100.2 100. 5 101. 5 100.9 100.2 3 101 .4 103. 9 102 .2 102.5 101. 2 101. 6 101.6 100.3 12 101 .7 103. 0 100 .6 100.2 100. 6 100. 6 100.3 99.2 22 100 .7 103. 2 101 .0 100.5 100. 8 100. 6 100.5 99.8 32 102 .3 100. 7 99. 7 99.5 100. 5 101. 6 99.3 100.2 58 101 .5 101. 3 101 .9 102.4 101. 2 101. 9 99.5 99.5 68 101 .8 101. 0 100 .7 100.9 101. 0 101. 4 101.6 101.8 71 ' 101 .0 102. 8 100 .5 100.8 100. 7 101. 4 99.3 99.4 No existen signos cl ínicos de la infección del BVDV observada en cua lquiera de los becerros d ura nte el curso de este estudio.

La vacunación de becerros novillones de raza mixta sanos de cuatro a cinco meses de edad, con una dosis de Vacuna BVDV-1b (Virus Vivo, Modificado) proporcionó un estimado ajustado de eficacia de vacuna de 87% contra leucopenia, 90% contra diseminación nasal de BVDV-1b y 80% contra viremia. Los análisis serológicos también revelaron una respuesta antigénica en los becerros vacunados.

Ejemplo 3 - Evaluación de retropasaje viral BVDV-1b El presente ejemplo evalúa la estabilidad del TVL-BVDV-1b MSV, asegurando que no se revierte a virulencia cuando se administra a animales.

Una ampolleta del virus se congeló y usó para inocular células TVL-BK para producir TVL-BVDV-1b +1 (5 * 107 TCID50/mL). Este virus se usó para inocular intranasalmente la primera serie de diez becerros lecheros privados de calostro a una relación de 1 * 106 TCID50 por ternera. Los becerros en series de 2 hasta 5 son inoculados intranasalmente con secreciones nasales combinadas a partir de la serie precedente de becerros.

La serie uno consiste de diez becerros, con el número de becerros en series de dos hasta cinco que varían desde dos hasta cinco becerros dependiendo del número de becerros que disemina el virus a partir de la primera serie de 10 becerros. Cada ternera permanece en un corral aislado, y los resultados primarios del estudio son la carencia de signos clínicos de BVDV en becerros y la estabilidad genética del MS hasta al menos cinco pasajes sucesivos in vivo.

Las unidades experimentales son excluidas del estudio si tienen un Título de BVDV-1a, BVDV-1b o BVDV-2 de >2 al tiempo de la selección como se determina por el método de neutralización de suero de disminución de virus constante.

Las muestras de sangre para serología se recolectaron de becerros durante el proceso de selección, el día de la inoculación (día 0) y en la conclusión del estudio. Las secreciones nasales se recolectaron de cada ternera individual en conjunto en los días dos hasta ocho después de la inoculación. Alícuotas de secreciones nasales de cada ternera individual para cada uno de estos días son ensayadas para aislamiento de virus y congeladas almacenadas. El día con el número más grande de diseminación de becerros individuales con BVDV-1b (es decir, día de diseminación máxima) se determina y todas las muestras de secreción nasal de tal día son combinadas y usadas para inocular becerros en dos series. Las secreciones nasales son recolectadas de becerros en grupos subsecuentes en este día de diseminación máxima predeterminada. Estas muestras son entonces sometidas a ensayo para aislamiento del virus y congeladas almacenadas hasta que se ha confirmado la presencia del virus y las muestras son combinadas y usadas para inocular la siguiente serie de becerros o ningún virus adicional es aislado.

Los becerros son identificados por el número de etiqueta en la oreja y colocados en sustituto de leche por seis a ocho semanas usando prácticas y de cuidado y pecuarias generales estándares para la raza.

Los resultados variables incluyen signos clínicos de BVDV, diseminación del virus de muestras nasales y estabilidad genética de los virus hasta cinco pasajes sucesivos in vivo. Todos los becerros son observados por signos clínicos de la infección del BVDV, y el último grupo de retropasaje es observado por 21 días después de la administración del virus recuperado. Todos los signos clínicos son registrados y se hace una determinación en cuanto a la etiología de la enfermedad clínica.

Se toman especímenes de secreción nasal de becerros; se mantienen alícuotas individuales de cada muestra para aislamiento del virus y análisis. Las muestras son procesadas por filtración estéril hasta un filtro de 0.2-µ??. Cada cavidad de una placa de 12 cavidades que contiene TVL-MDBK (~80% confluente) es entonces inoculada con una muestra. Una cavidad por placa permanece no inoculada y sirve como el control negativo. Una cavidad de la placa es inoculada con una dilución del MS y sirve como el control positivo. Las placas son incubadas a 3-7% de C02 a una temperatura de 35-39°C por 5 a 7 días. Las muestras son sub-cultivadas sobre una palca secundaria por unos 5 a 7 días adicionales. El medio de las cavidades que presentan morfología citopática del BVDV-1b típica es además procesado para determinar la identidad del agente infeccioso por ensayo de PCR.

La estabilidad genética de la Siembra Principal se analizó comparando el pasaje más alto de BVDV recuperado de una ternera con la Siembra Principal. La carencia de diseminación de todos los diez becerros en conjunto en uno del estudio, o el aislamiento del virus el cual no se revertió a virulencia (como se demuestra por una carencia de signos clínicos definitivos de BVDV) es indicativa de un estudio de retropasaje exitoso, y estabilidad genética del MS.

Ejemplo 4 - Preparación de una vacuna de BRDC hexavalente (virus vivo, modificado) El presente ejemplo describe la preparación de una vacuna BRDC multivalente (de 6 formas) que incorpora el BVDV-1b MS descrito anteriormente.

Materiales y métodos Microorganismos usados BHV-1: El aislado de Cooper (Colorado) del BHV se aisló en 1956 de pulmones de un bóvido que tiene enfermedad del tracto respiratorio superior (York ef al., 1957). Este Virus de Siembra Principal se identificó como TVL-BHV (Cooper) PO, Agosto 5, 1997 DW-1 -21 -W.

BVDV-1a: La cepa Singer del BVDV-1a se obtuvo de APHIS. Esta Siembra Principal se identificó como TVL-BVD (Singer) PO, Diciembre 1998 DW4-29.

BVDV-1b: La cepa TGAC del BVDV-1b se obtuvo de APHIS. Esta Siembra Principal se identificó como TVL-BVDV 1b MS 04/27/2007 DW3-095.

BVDV-2: La cepa 125 del BVDV-2 se obtuvo de APHIS. Esta Siembra Principal se identificó como TVL-BVDV 2 Cepa 125 P0 11/01/01 DW3-90.

Pl3: La cepa SF4 de Reisinger de Pl3 se obtuvo de APHIS. Esta Siembra Principal se identificó como TVL- Pl3 (Reisinger SF-4P0, 2 Abril 2001 (SM-83) BRSV: La cepa N375 de BRSV se obtuvo de APHIS. Esta Siembra Principal se identificó como TVL-BRSV PO Julio 20, 2001 DW3-87.

Protocolo Previo a la inoculación de células TVL-BK con producción del virus de siembra, las células fueron microscópicamente visualizadas para confirmar que las células estuvieran presentando la morfología previamente descrita. Previo a la recolección de cada lote del virus de producción, las células TVL-BK se observaron por confirmar que están presentando efectos citopatológicos típicos (CPE) asociados con el virus.

La consistencia de la virulencia, potencia, y antigenicidad de los BHV-1, BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, Pl3, y BRSV usados en esta vacuna fueron fomentadas por almacenamiento en la condición liofilizada o congelada, y restricciones en el número de pasajes o subcultivos.

Producción de virus = MSV+10 (eficacia de pasaje serial), pero puede ser cualquier pasaje entre 5 y 10. Producción de solución base celular = MCS+20 (eficacia de pasaje serial), pero también pueden ser cualquier pasaje por debajo de 20.

El funcionamiento del inoculo del virus (MSV+1 a MSV+8) y producción del inoculo del virus (el cual fue típicamente, pero no exclusivamente, en MSV+9), fueron típicamente propagados en células TVL-BK; siempre que, el número de pasaje de células TVL-BK para la propagación del virus no exceda aproximadamente 20 pasajes del MCS.

El medio de crecimiento para funcionamiento y producción de preparaciones celulares fue DMEM que contiene 5-10% de suero equino. El MSV se preparó y almacenó como se describe anteriormente.

Se sembraron recipientes de cultivo dividiendo cultivos activamente propagantes a una relación que varía de 1:3 a 1:6 (cm2:cm2). El TVL-BK en el matraz o botellas de rodillo (las cuales estuvieron propuestas para subcultivo) se liberaron de la superficie del cultivo removiendo asépticamente el medio de crecimiento y agregando solución de tripsina-EDTA 1X como se describe en el Ejemplo 1. Después de la incubación por aproximadamente 5 min de 35 a 39°C, la monocapa se dispersó. La tripsina se inactivo agregando las células dispersadas en un recipiente de cultivo con medio de crecimiento. Alícuotas congeladas del virus se descongelaron rápidamente o suspendieron en medio si la siembra es liofilizada. Células TVL-BK (+20 o menos) se inocularon con el virus.

Los virus que se replicaron en matraces o botellas de rodillo, los cuales fueron propuestos para subcultivo, se recolectaron después que se ha observado el tiempo de incubación apropiado y/o CPE. Los fluidos virales pueden ser almacenados de 6°C a -80°C o ser usados inmediatamente para inocular otros recipientes de cultivo. Se usaron técnicas de cultivo celular estándar para inocular tanto siembra como medio de producción. Las células TVL-BK en el pasaje 20 o menos se inocularon. La producción del inoculo del virus congelado, la cual fue típicamente en MSV+9, fue rápidamente descongelada. El volumen del inoculo del virus típicamente varió de 1 a 25 mL por 1600 cm2 del área de cultivo para lograr una multiplicidad de infección que varía de 0.01 a 1 virus por célula.

Los Títulos de inoculo mínimo fueron como sigue: 1055 TCID50 por mL para BHV, 1050 TCID50 por mL para BVDV-1a, 1050 TCIDso por mL para BVDV-1b, 1050 TCID50 por mL para BVDV-2, 106° TCID50 por mL para Pl3 virus, y 104 5 TCID50 por mL para BRSV. Los cultivos inoculados se incubaron a 37 ± 2°C y 5 ± 1% C02. BHV y Pl3 se incubaron por 2 a 4 días, BVDV-1a, BVDV-1b, y BVDV-2 por 4 a 6 días, y BRSV por 5 a 8 días.

Recolección Al día de la recolección, el cultivo se examinó por CPE específico del virus y esterilidad. El tiempo de incubación mínimo fue 2 días después de la inoculación con BHV o Pl3, 4 días después de la inoculación con BVDV-1a, BVDV-1b o BVDV-2 y 5 días después de la inoculación con BRSV. El tiempo de incubación máximo fue 4 días después de la inoculación con BHV o Pl3, 6 días después de la inoculación con BVDV-1a, BVDV-1b, o BVDV-2, y 8 días después de la inoculación con BRSV.

Las suspensiones del virus fueron asépticamente recolectadas de recipientes de producción. Las muestras se recolectaron para determinar el TCID50 de la recolección. El material de recolección se almacenó a una temperatura de 6°C a -80°C. El material de recolección puede ser almacenado arriba del congelamiento por hasta un mes y congelado por hasta seis meses previo a la fabricación del producto final.

Todas las manipulaciones se condujeron usando técnicas asépticas estándares. Neomicina y nistatina (Mycostatin®, Bristol-Myers Squibb, New York, NY, USA) se agregaron durante el montaje de una vacuna serial o subserial a una relación de 15 jg y 15 Unidades/dosis, respectivamente.

Los fluidos de recolección se diluyeron en DMEM y estabilizaron por la adición de una solución de sacarosa filtrada 0.2-pm, la cual resultó en una concentración de sacarosa final de 10 ± 1%.

Los fluidos de recolección de virus podrían ser concentrados por ultrafiltración estéril usando un filtro de valor límite de peso molecular 10 kDa. El grado de concentración típicamente no excede 50 veces.

Los lotes de fluidos de recolección viral se analizaron para determinar el TCID50 (por ejemplo, Método de Spearman-Karber).

Ejemplo 5 - Estudios de eficacia para vacuna BRDC hexavalente (virus vivo, modificado) Los Ejemplos 5 hasta 10 demuestran la efectividad de la vacuna viva modificada, BRDC hexavalente en la prevención de la enfermedad causada por cada uno de los virus contenidos en esta. En este primer ejemplo, la vacuna se muestra por ser efectiva en la prevención de la enfermedad causada por el BVDV-1b.

Materiales La vacuna hexavalente (virus vivo, modificado), se preparó de conformidad con el método de producción descrito anteriormente. Brevemente, BHV-1 (cepa Cooper), BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TGAC), BVDV-2 (125), Pl3 (Reisinger SF-4), y BRSV (N375) se propagaron en la línea de células TVL-BK (20avo pasaje). Las fracciones individuales se recolectaron en el 10mo pasaje y combinaron juntas en el producto de seis formas. Se hicieron placebos suprimidos junto a cada uno de los seriales de eficacia. Por ejemplo, el placebo suprimido de BVDV contiene los mismos lotes de recolección BRSV, BHV, y Pl3 como el serial de eficacia correspondiente. El medio de cultivo se sustituyó para el componente BVDV para mantener el volumen equivalente entre el serial de eficacia y el placebo suprimido de BVDV. Los placebos suprimidos similares se construyeron para cada componente de la vacuna hexavalente MLV.

Métodos experimentales Para cada estudio, becerros de reproducción/engorda comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad se adquirieron, aleatorizaron e identificaron por etiqueta en la oreja. Estos becerros fueron desparasitados y vacunados contra pasteurelosis, micoplasmosis, y pata negra. Los becerros en los grupos vacunados y de control se mantuvieron en corrales separados, no adyacentes pero equivalentes hasta dos días previo a la estimulación (Día -2) en tal tiempo fueron mezclados en un corral. Todos los becerros se estimularon al Día 0 con un aislado virulento del virus de interés. Por ejemplo, el BVDV-1b virulento (obtenido de los pulmones de una ternera muerta en corral en Poky Feeders [Scott City, KS, USA]) se pasó in vitro en células TVL-BK usando D EM con 10% de suero equino. Una dosis de estimulación de aproximadamente 8 ? 107 de TCID50 en 4 mL se administró a cada ternera, 2 mL en cada pasaje nasal durante la inspiración. Los becerros tienen acceso a agua de elección libre, heno Bermuda de la costa y una ración de alimento mezclado que contiene un coccidiostato, pero no antibiótico.

Aleatorización Se usó un esquema de aleatorización apareado para alojar becerros en dos grupos de tratamiento (vacunado o control vacunado con placebo) usando una tabla de aleatorización proporcionada por CVB-Biometrics (Véase Tabla 1). Una secuencia de tres becerros que ingresan a la rampa se aleatorizó en los dos grupos de tratamiento en una relación 2:1. Las etiquetas de las orejas, aleatoriamente extraídas de un cubo al tiempo de la extracción de sangre inicial para evaluación serológica, identifican a los becerros. Los dos grupos de becerros se mantienen en corrales separados pero equivalentes previo a la estimulación. Los becerros se mezclaron en un corral, dos días previo a la estimulación (día -2).

Estudios ciegos Personal cegado no tiene conocimiento de la identidad de los controles o vacunados. Todo el personal de laboratorio y campo, con la excepción del cuidador del registro, se cegaron al estudio.

Resultado El resultado primario seleccionado fue leucopenia después de la estimulación. La leucopenia se define como un 25% de reducción de los conteos de WBC de valor de referencia. Otros resultados apoyan además la eficacia de la diseminación nasal incluida en la vacuna, viremia, pirexia, producción de anticuerpo y signos clínicos de infección viral.

Estimador Los conteos de células blancas de la sangre individuales (WBC) se convirtieron en un porcentaje del promedio pre-estimulado y medido en una escala de intervalo continuo. Estos porcentajes de conteo WBC convertidos se determinaron diariamente por al menos 14 días post-estimulación y sirven como el criterio primario para evaluación. La detección de leucopenia sirve como el criterio primario para determinar resistencia (no afectado) o susceptibilidad (afectado) a la estimulación. El grupo afectado y no afectado se comparó para determinar si la vacunación previene la leucopenia después de una exposición de estimulación viral. Los signos clínicos de enfermedad respiratoria y la detección de virus de muestras de capa leucocitaria/nasales sirve como un criterio secundario para determinar susceptibilidad a la estimulación. La duración de leucopenia y duración de diseminación (número de días que el virus se detectó de una ternera individual) se analizó para determinar si la vacunación tiene un efecto mitigante en estos parámetros. Todas las temperaturas rectales diarias individuales se analizaron usando la temperatura promedio pre-estímulada (valor de referencia) como una covarianza. Las unidades experimentales se excluyeron del estudio si tienen un Título viral de >2 en el inicio del estudio.

Estructuras de muestreo y métodos Se recolectaron muestras de sangre de becerros inmediatamente previo a la vacunación (día -28 a -21) con eficacia serial o el placebo suprimido correspondiente. Las muestras de sangre también se recolectaron inmediatamente previas a la estimulación (Día 0) y nuevamente 14 días post estimulación (Día 14). Las muestras de sangre para conteos WBC diferenciales y aislamiento de virus se recolectaron en el día -2 hasta al menos el día 14. Las muestras se recolectaron en tubos de EDTA Vacutainer® (Becton-Dickinson y Co., Franklen lakes, NJ, USA), y se realizaron conteos usando un contador WBC diferencial Hemavet 950 de Drew Scientific. Las hisopos nasales se tomaron para aislamiento del virus en el día -2 hasta al menos el día 14.

Observaciones y recolección de datos Las muestras nasales y muestras de sangre se recolectaron y se observaron los becerros para signos clínicos de infección viral en los días 2 hasta 14. Las temperaturas rectales se determinaron para cada ternera en el Día -2 hasta Día 14.

Los datos de conteos de WBC se analizaron para determinar las reducciones en el conteo post-estimulación. Se calculó una media de pre-estimulación para cada animal promediando los conteos de WBC para el Día -2 hasta Día 0. La relación de conteos de WBC diarios con relación a la media pre-estimulada se calculó (conteo de WBC como una proporción de pre-estimulación) para cada post-estimulación al día 1-14 o más a la discreción de los observadores. Sí la proporción disminuye por 25%, el individuo se clasifica como leucopénico. Las hisopos nasales se tomaron de cada ternera en el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación frotando ambas fosas nasales con un Cultivo BBL Swab® con un Medio Stuart Líquido. En el día de la recolección, las muestras se procesaron por filtración estéril a través de un filtro de 0.2-pm. Cada cavidad de una placa de 12 cavidades que contiene TVL-MDBK (~80% confluente) se inoculó entonces con una muestra. Una cavidad por placa permanece no inoculada y sirve como el control negativo. Una cavidad de la placa se inoculó con una dilución del virus estimulado y sirve como el control positivo. Las placas se incubaron a 3-7% de C02 a una temperatura de 35-39°C por 2 a 4 días. El medio de cada cavidad se recolectó y almacenó de -18°C a -22°C. El medio de todas las cavidades se sometió a ensayo por RT-PCR (Ridpath y Bolín 1998) para determinar si un virus particular está presente en el cultivo. Los individuos que fueron de cultivo positivo para los virus se clasificaron como "diseminados".

Capas leucocitarias de muestras de sangre se usaron para inocular cada cavidad de una placa de 12 cavidades que contiene TVL-MDBK (~80% confluente). Una cavidad por placa permanece inoculada y sirve como el control negativo. Una cavidad de la placa se inoculó con una dilución del virus estimulado y sirve como el control positivo. Las placas se incubaron a 3-7% de C02 a una temperatura de 35-39°C por 2 a 4 días. El medio de cada cavidad se recolectó y almacenó de -18 a -22°C. El medio de todas las cavidades se ensayó por RT-PCR (Ridpath y Bolín, 1998) para determinar si el virus estuvo presente en el cultivo. Los individuos que tienen cultivo positivo para un virus particular se clasificaron como "virémicos".

Las temperaturas rectales diarias para cada animal se registraron entre el Día -2 y Día 14 (2 días previo a la estimulación, el día de la estimulación y 14 días posteriores a la estimulación) del estudio. Se calculó una media de pre-estimulacíón para cada animal promediando los valores de temperatura para el Día -2 hasta Día 0. Las temperaturas diarias se analizaron usando valor de referencia como una covarianza.

Títulos de Anticuerpo BVDV-1b: En el caso de la eficacia del BVDV-1b, Títulos de anticuerpo de neutralización de suero contra BVDV-1b se determinaron por el método del suero de disminución de virus constante para cada animal en el día de la vacunación inicial (día -21), el día de la estimulación (día 0), y en la conclusión del estudio. Títulos de anticuerpo se determinaron usando una modificación del Perfil Especial A-17, Titulación del Anticuerpo Neutralizante del Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 1. El ensayo modificado usa un aislado de BVDV-1b citopático como el indicador de virus en lugar de un aislado de BVDV-1a. Los animales que desarrollaron un Título de anticuerpo >8 fueron considerados como sero-convertidos a BVDV-1b.

Las diferencias en la duración de leucopenia, diseminación, y viremia entre el grupo vacunado y de control se estimaron (fracción mitigada). Las temperaturas rectales se analizaron usando la temperatura promedio pre-estimada (valor de referencia) como una covarianza. El intervalo de confianza seleccionado fue 95%.

Leucopenia: El análisis de los datos de leucopenia se basan en la proporción de vacunados que fueron leucopénicos comparada con la proporción de controles vacunados con placebo que fueron leucopénicos después de la estimulación viral. Esta se evaluó determinando la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan (1993).

Diseminación y Viremia: Los análisis de datos de diseminación y viremia se basan en la proporción de vacunados que diseminan el virus o son virémicos comparados con la proporción de controles de placebo vacunados que diseminan o son virémicos después de la estimulación viral. Estos fueron evaluados determinando la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan (1993).

La diferencia media en duración of leucopenia entre los dos grupos se estimó y la fracción mitigada se calculó de conformidad con Fergen (2004). La diferencia media en duración de diseminación y la diferencia media en duración de viremia entre los dos grupos son estimadas y las fracciones mitigadas calculadas de conformidad con Fergen (2004).

Observaciones Clínicas: Los análisis de temperaturas rectales por días 1-14 se condujeron con un análisis de medidas repetidas de varianza (ANOVA) que incluyen términos para Grupo, Día e interacciones Grupo*Dia usando el valor de referencia como una covarianza. Donde las interacciones de Grupo*Día fueron significativas (p < 0.5), el grupo vacunado se comparó con el control hasta el efecto simple del Grupo para cada punto de tiempo. Estas comparaciones de efecto simple se obtuvieron de las interacciones Grupo*Día.

Análisis Estadístico: Las comparaciones del grupo de los Títulos de anticuerpo se analizaron con la Prueba U de Mann-Whitney U. Todos los análisis estadísticos se realizaron usando SAS Learning Edición v2.0 para MS-Windows® como se describe anteriormente.

Ejemplo 5a - Estudios de eficacia para vacuna BRDC hexavalente Los resultados de este estudio demuestran que el Virus de Diarrea Viral Bovina - Tipo 1b (BVDVIb) vivo modificado, Rinotraqueítis bovina - Virus de Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna del Virus Sincitial Respiratorio, Virus Vivo Modificado, es antigénico y eficaz como un auxiliar en la prevención de la enfermedad causada por el BVDVIb. Una dosis de la vacuna se administró a veintiún becerros sero-negativos BVDV. Diez becerros de control sero-negativos se vacunaron con una dosis de un producto de vacuna de placebo apareado. Todos los becerros se estimularon ¡ntranasalmente con BVDVIb. La vacunación resultó en un Título de anticuerpo BVDVIb incrementado y ya sea viremia inducida por BVDV1 prevenida o reducida, diseminación nasal, pirexia, signos clínicos de enfermedad y leucopenia. Consecuentemente, un BVDV1 b-TCID5o mínimo de 2 X 103 por dosis ha sido establecido para la fracción BVDVIb de esta vacuna. Esta vacuna contiene BHV-1, PI3, BRSV, dos subgenotipos de BVDV Tipo 1 (1a y 1b) y BVDV Tipo 2.

Vacunación, Estimulación y Recolección de Muestra: Treinta (31) becerros negativos BVDV se mezclaron en una clasificación aliada. Cada ternera se embarcó conforme estuvieron aleatoriamente en el rebaño, tres becerros a la vez, a través del corredor en uno de los dos grupos (Grupo A - vacunados o Grupo B - controles vacunados con placebo) usando un esquema de aleatorización de serie apareada.

Veintiún becerros se vacunaron con una dosis de Rinotraqueítís bovina - Virus de diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna sincitial respiratoria, Virus vivo modificado. Cada vacunación se dio a una dosis de 2 mi del producto por inyección subcutánea en el lado izquierdo del cuello en el día 0. Diez becerros se vacunaron con una vacuna de placebo apareada de producto (suprimido de BVDV). Dos días previo a la estimulación ambos grupos vacunados y de control se mezclaron con el propósito de pre-estimular la observación clínica y adquirir la temperatura corporal del valor de referencia y lecturas de WBC. Los becerros de control y vacunados se estimularon 21 días después de la vacunación con un aislado virulento de BVDVIb obtenido de los pulmones de una ternera muerta en el corral. El virus ha sido pasado in vitro en células TVL-BK usando Medio Eagle Modificado de Dulbecos con 10% de Suero Equino. Una dosis estimulada de 4X107 TCID50 en 4 mis se administró a cada ternera, 2 mis en cada pasaje nasal durante la inspiración.

Muestras de sangre para determinar Títulos de anticuerpo se recolectaron previo a la vacunación, el día de la estimulación (21 días post-vacunación), y 14 días post-estimulación. Títulos de anticuerpo del virus de diarrea viral bovina se determinaron por el método de neutralización de suero de disminución de virus constante.

Hisopos nasales para aislamiento de virus se recolectaron de becerros frotando ambas fosas nasales con un Cultivo BBL Swab® en Medio Stuart Líquido en el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación.

Muestras de sangre para aislamiento del virus de la capa leucocitaria se recolectaron de cada ternera por punción en la vena en un tubo vacutainer de EDTA en el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación.

Las temperaturas rectales se registraron diariamente para cada ternera por dos días consecutivos previo a la estimulación, el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación.

Se hicieron y registraron observaciones clínicas para cada ternera. Los observadores se cegaron debido a tanto los grupos vacunados como de control que son mezclados con la única característica de diferenciación siendo el número de etiqueta en la oreja. En ningún tiempo a través del estudio los observadores tuvieron conocimiento del estado de vacunación de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no tiene conocimiento del estado de vacunación de los becerros.

Muestras de sangre para determinar los conteos de WBC diferenciales se recolectaron por dos días consecutivos previo a la estimulación, el día de la estimulación, y 14 días consecutivos post-estimulación. Las muestras se recolectaron en tubos vacutainer de EDTA y se realizaron los conteos usando un contador WBC diferencial Hemavet 950 de Drew Scientific.

Detección de BVDV: Se utilizaron técnicas de PCR mejoradas de cultivo celular para detectar BVDVIb en muestras recolectadas. Brevemente, las muestras nasales se procesaron por filtración estéril (0.2µ??) en las células TVL-BK en cultivo. Las capas leucocitarias se colocaron directamente sobre células TVL-BK en cultivo por 45 - 75 minutos previo a ser lavadas de las células. Los cultivos se incubaron por 4 días a 37°C ± 2 °C y 5 ± 1% de C02. Los sobrenadantes de todas las muestras de cultivo fueron individualmente sometidos a ensayo para determinar la presencia/ausencia de BVDVIb usando metodología de qPCR RT convencional y la siguiente serie de sonda/cebador: Cebador delantero: CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC (SEC ID NO:1) Cebador inverso: TGCCCACAGCACATCTTAACC (SEC ID NO:2) Sonda TaqMan MGB: TCACCTGGACGACCC (SEC ID NO:3) Este método se desarrolló con base en la Diferenciación del Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV) tipos 1a, 1b y 2 por PCR, Julia F. Ridpath y Steven R. Bolin, Molecular and Cellular probes, Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148). Este método se basa en el Centro para el Protocolo de Pruebas de Laboratorio de Servicios de Veterinaria Nacionales y Biológicos Veterinarios - Genotipado de Virus de Diarrea Viral Bovina, Número BPPR02010.01. Ambos de estos métodos de diferenciación de genotipos y fenotipos de BVDV explotan las diferencias genéticas que existen en la Región No traducida al 5' (UTR) del genoma. Esta serie de sonda/cebador fue específicamente diseñada para amplificar una sección de la UTR al 5' en la cual una secuencia de BVDVIb únicamente pueda ser detectada por la sonda altamente especifica. La especificidad de la serie de sonda/cebador se confirmó en el alojamiento y no reaccionó cruzada con BHV.PI3, BRSV, BVDVIa, o BVDV2. Los ensayos de qPCR RT se realizaron usando ensayos a base de Taqman® en un Applied Biosystems 7500.

Análisis estadísticos: Títulos de anticuerpo: se analizaron comparaciones de grupo de los Títulos ordinariamente a escala con la Prueba U de Mann-Whitney.

Viremia: Los datos de aislamiento del virus a partir de capas leucocitarias de muestras de sangre se analizó con base en la proporción de vacunados que el BVDVIb se aisló del ya comparado con la proporción de controles que el BVDVIb se aisló de la postestimulación. La fracción prevenible para viremia del BVDV 1b se calculó como se describe por Tanner y Morgan (1993).

Diseminación Nasal: Los datos de aislamiento del virus a partir del análisis de isótopo nasal se basan en la proporción de vacunados que el BVDVIb se aisló del ya comparado con la proporción de controles que el BVDVIb se aisló de la post-estimulación. La fracción prevenible para diseminación del BVDV 1b se calculó como se describe por Tanner y Morgan (1993).

Temperatura rectal: Una temperatura rectal promedio pre-estimulación se determinó para cada animal. Este promedio se usó como una covarianza en un análisis de medidas repetidas de varianza (ANOVA) el cual incluye términos para Grupo, Día e interacciones de Grupo*Día.

Signos clínicos de la enfermedad: Los signos clínicos de la enfermedad se registraron diariamente por cada observador independientemente. Cualquier ternera que presenta signos por al menos una día de observación post-estimulación se consideró "afectado." La fracción prevenible para signos clínicos se calculó como se describe por Tanner y Morgan (1993).

Leucopenia: Una media de leucocito de pre-estimulación se calculó para cada animal promediando los conteos de leucocitos por los Días -2 hasta 0. La relación de conteos de leucocitos diarios con relación a la media de pre-estimulación se calculó (conteo de leucocito como una proporción de la pre-estimulación) para cada pos-estimulación del día 1-14. Este dato de proporción se analizó para determinar si animales individuales desarrollaron una leucopenia como se define por un 40% de disminución en conteos a partir del valor de referencia. Se calculó la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan (1993) para determinar si la vacunación previene el desarrollo de leucopenia en este estudio.

Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el SPSS versión 16 para Windows.

Resultados Títulos de anticuerpo de neutralización de suero: Todos los becerros en este estudio tienen un Título de anticuerpo de neutralización de suero del BVDV de pre-vacunación (BVDVIa, BVDVIb y BVDV2) de <1:2. Por el día de la estimulación (Día 21), el grupo vacunado tiene un Título de BVDV 1b promedio de 1:83 el cual fue significativamente (p£.05) mayor que aquel del grupo de control < 1:2. Los Títulos de anticuerpo de BVDV 1b incrementan 14 días postestimulación en tanto los becerros de control como vacunados indicando que los becerros han sido estimulados con BVDVIb.

Aislamiento BVDVIb de Capas leucocitarias: Todos los diez becerros de control en este estudio fueron virémicos durante la fase de post-estimulación en este estudio. Sin embargo, siete de los becerros de control fueron virémicos durante el marco de tiempo crítico que la viremia post-estimulación del BVDV es típicamente observada. Tres becerros de control (1, 14, 30) fueron virémicos en el día de la estimulación. Estos mismos tres becerros junto con la ternera 26 fueron virémicos al día después de la estimulación. Esta observación junto con los datos serológicos, aislamiento de hisopo nasal y temperatura rectal sugieren que estos becerros fueron naturalmente infectados tarde en la fase de vacunación del estudio, se volvieron virémicos, y comenzaron la diseminación tempranamente en la fase de estimulación de este estudio. Uno de estos cuatros becerros (ternera 30) llegó a ser vi rém ico y diseminó el virus durante el periodo de viremia/diseminación postestimulación típico. Ninguno de los 21 vacunados fueron virémicos durante el periodo post-estimulación. Una fracción prevenida se calculó usando una relación de 3/10 controles naturalmente protegidos y 21 /21 vacunados protegidos. Esto resulta en una fracción prevenible de 1 .0.

Aislamiento del BVDVI b de Hisopos nasales: Todos los diez becerros de control en este estudio diseminaron el BVDVI b durante la fase de post-estimulación de este estudio. Sin embargo, siete de los becerros de control fueron diseminados durante el marco de tiempo crítico que la diseminación post-estimulación del BVDV es típicamente observada. Dos becerros de control (26 y 30) fueron diseminados en el día de la estimulación. Tres becerros de control ( 1 , 14 y 30) fueron diseminados al día después de la estimulación. Esta observación junto con datos serológicos, aislamiento de la capa leucocitaria y temperatura rectal sugieren que estos becerros fueron naturalmente infectados después en la fase de vacunación del estudio, llegaron a ser virémicos, y comenzó la diseminación prontamente en la fase de estimulación de este estudio. Uno de estos cuatro becerros (ternera 30) llegó a ser virémico y diseminó el virus durante el periodo de diseminación/viremia post-estimulación típico. Solamente 1 de los 21 vacunados diseminaron el BVDVIb durante el periodo post-estimulación. Una fracción prevenida se calculó usando una relación de 3/10 controles naturalmente protegidos y 201/21 vacunados protegidos. Esto resulta en una fracción prevenible de 0.93.

Temperaturas rectales: El análisis de los datos indicó una interacción Grupo*Día significativa (p=.034). El análisis por el día indicó que las temperaturas en el grupo de control fueron significativamente (p<0.05) mayores que aquellas del grupo vacunado en los días 1, 4, 7 y 8 post-estimulación. En el día 12 las temperaturas rectales del grupo de control han caído y fueron significativamente (p<0.05) menores que aquellas del grupo vacunada.

Signos clínicos de BVDVIb: Ocho de diez (8/10 afectados) becerros en el grupo de control demostraron signos clínicos que podrían ser contribuidos a la infección por BVDVIb. Los signos clínicos incluyen diarrea, cantidades copiosas de descarga nasal, respiración rápida y descarga ocular. Ninguno (0/21 afectados) de los becerros en el grupo vacunado demostró cualquiera de estos signos clínicos durante la fase de post-estimulación del estudio. Una fracción prevenida se calculó usando una relación de 2/10 controles naturalmente protegidos y 21/21 vacunados protegidos. Esto resulta en una fracción prevenible de 1.0. No se observaron reacciones post-vacunación adversas en cualquiera de los becerros.

Leucopenia: Se detectó leucopenia en cuatro de los 21 vacunados y cinco de diez controles resultando en una fracción prevenible de 62%.

Conclusiones Lo precedente demuestra la antigenicidad y eficacia de la fracción del BVDVIb de Rinotraqueítis bovina - Virus de diarrea -Parainfluenza3 - Vacuna del virus sincitial respiratorio, Virus vivo modificado como un auxiliar en la prevención de la enfermedad causada por BVDVIb.

La antigenicidad y la eficacia de la fracción del BVDVIb de este producto combinado se atestigua por lo siguiente: 1) Un incremento significativo en Títulos de anticuerpo a BVDVIb en el grupo comparado con el grupo de control. Todos los becerros en el grupo vacunado desarrollaron Títulos de BVDVIb > 1:8 después de la administración de una dosis de 2 mi, cubre los requerimientos definidos en el 9CFR 113.311 (c) (5). 2) Los estudios de aislamiento de virus revelaron que la administración de una dosis resulta en una disminución significativa en viremia y diseminación nasal inducida por BVDVIb post-estimulación. 3) Becerros vacunados presentan significativamente menos fiebre cuando se compara con becerros de control y no muestran signos clínicos de la enfermedad. 4) La vacunación también disminuye la probabilidad de desarrollar una leucopenia inducida por BVDVIb.

Este estudio fue marginalmente afectado por el hecho de que al menos tres de los becerros en el grupo de control llegaron a infectarse con BVDVIb prontamente previo a la estimulación. Debido al hecho de que todos los becerros de control, que incluyen aquellos que fueron infectados, fueron todavía sero-negativos al tiempo de la estimulación, se concluyó que la exposición natural ocurre después en la fase de vacunación del estudio. No hubo evidencia clínica de exposición natural en el grupo vacunado probablemente debido a que se mantiene separadamente del grupo de control hasta 2 días previo a la estimulación. La exposición natural es una posibilidad inherente cuando se conducen estudios de estimulación en un ambiente de ternera de producción/de engorda típico. De conformidad con Tanner y Morgan, el estimado de la eficacia de la vacuna como se determina por la fracción prevenible considera la relación entre la protección observada y la efectividad de la vacuna por varios niveles de inmunidad natural.

Los hallazgos del estudio son tanto estadísticamente significativos como clínicamente relevantes, por lo tanto, demostrando la eficacia de la fracción del BVDVIb contenida en la vacuna.

Ejemplo 6 - Protocolo de eficacia del BRSV Este ejemplo demuestra que la fracción del Virus Sincitial Respiratorio Bovino (BRSV) de la vacuna MLV hexavalente ayuda en la prevención de la enfermedad causada por BRSV.

Materiales y métodos Un placebo suprimido de BRSV se preparó y usó junto con el serial de eficacia en una manera análoga a aquella descrita en el Ejemplo 5 para BVDV-1b. Este placebo suprimido de BRSV contiene los mismos lotes de recolección BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, BHV y Pl3 como el serial de eficacia, con el medio de cultivo sustituyendo el componente de BRSV para mantener el volumen equivalente entre el serial de eficacia y el placebo suprimido de BRSV. El diluyente estéril se usa para rehidratar tanto la vacuna MLV hexavalente como el placebo suprimido de BRSV como se describe en la presente Métodos experimentales Se usaron becerros de reproducción/engorda comerciales de aproximadamente 3-4 meses de una población relativamente homogénea que tiene aproximadamente el mismo origen, tipo, peso y edad. Los becerros son desparasitados y vacunados contra pasteurelosis, micoplasmosis, y pata negra. Se usaron números iguales de becerros de control y vacunados en el protocolo; los dos grupos de becerros se mantienen en corrales separados, no adyacentes pero equivalentes previo a la estimulación, y se mezclan en un corral, dos días previo a la estimulación (día -2). Los becerros tienen acceso al agua a elección libre, heno Bermuda de la costa y una ración de alimentación mezclada que contiene un coccidiostato, pero no antibiótico.

Aleatorización Se usó un esquema de aleatorización apareada para alojar becerros en dos grupos de tratamiento (vacunado o control vacunado con placebo) usando una tabla de aleatorización CVB-Biometrics, en la cual una secuencia de tres becerros que ingresa a la rampa se aleatorizó en los dos grupos de tratamiento en una relación 2:1. Las etiquetas de la oreja, aleatoriamente extraídas de un cubo al tiempo de la extracción de sangre inicial para evaluación serológica, identifican a los becerros.

Estudios ciegos Todo el personal son cegados al estudio (con la excepción del cuidador del registro), y no tienen conocimiento de la identidad de los controles o vacunados.

Resultados El resultado primario es la prevención de la diseminación nasal del virus BRSV después de la estimulación, lo cual se determina por la presencia o ausencia de BRSV en muestras nasales recolectadas diariamente de las fosas nasales de todos los becerros durante el protocolo. Otros resultados segundarios pueden incluir uno o más signos clínicos disminuidos de la infección del BRSV, reducción de pirexia, y/o reducción de la duración de diseminación en el BRSV de diseminación de becerros.

La diseminación de BRSV por los grupos de control y vacunados se determina diariamente por 14 días post-estimulación, con detección de BRSV que sirve como el criterio primario para determinar la resistencia (no afectado) o susceptibilidad (afectado) a la estimulación. Los grupos afectados y no afectados son comparados para determinar si la vacunación previene la diseminación de BRSV después de una exposición a la estimulación del BRSV. Los signos clínicos de la enfermedad respiratoria sirven como un criterio secundario para determinar la susceptibilidad o resistencia a la estimulación. La duración de diseminación (número de días que el BRSV se detectó de una ternera individual) se analizó para determinar si la vacunación tiene un efecto de mitigación en este parámetro. Todas las temperaturas rectales diarias individuales son analizadas contra la covarianza de temperatura promedio pre-estimulación (valor de referencia). Las unidades experimentales son excluidas si tienen un Título de BRSV SN de >2 en el inicio del estudio.

Marcos de muestreo y métodos Muestras de sangre son recolectadas de becerros inmediatamente previas a la vacunación (día -28 al día -21) con eficacia serial o placebo suprimido de BRSV, y nuevamente inmediatamente previo a la estimulación (Día 0) y nuevamente 14 días posteriores a la estimulación (Día 14).

Observaciones y recolección de datos Hisopos nasales se tomaron de cada ternera en el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación frotando ambas fosas nasales con un Cultivo BBL Swab® con Medio Stuart Líquido. El medio de las muestras es sometido a ensayo para determinar la presencia de BRSV por PCR en tiempo real usando una serie de sonda/cebador específicamente para detectar BRSV.

Cebador delantero: 5'-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3' (SEC ID NO:4); Cebador inverso: 5'-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3' (SEC ID NO:5); y Sonda BRSV TaqMan® MGB: 5'- AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3' (SEC ID NO:6).

Los datos de duración se analizan para demostrar que la vacunación tiene un efecto mitigante en la duración del tiempo en que el BRSV fue detectado en muestras nasales.

Observaciones Clínicas: Las temperaturas rectales diarias para cada animal se registraron entre el Día -2 y Día 14 (2 días previo a la estimulación, el día de la estimulación y 14 días post-estimulación), con una pre-estimulación media siendo calculada para cada animal promediando los valores de temperatura para el Día -2 hasta Día 0. Las temperaturas diarias son entonces analizadas usando valor de referencia como una covarianza.

Títulos de anticuerpo de neutralización de suero son determinados por el método del suero de disminución de virus constante para cada animal en el día de la vacunación, Día 0 y Día 14 del estudio (Schefers er al., 2008).

Los signos clínicos de BRSV en becerros novillones han sido previamente descritos por Baker (1986). Los signos clínicos incluyen, pero no se limitan a, descarga nasal y lagrimal, frecuencia respiratoria incrementada, temperatura rectal elevada, depresión leve, absorción de alimento disminuida, hipersalivación y disnea. Los signos clínicos de infección del BRSV son menos obvios en los modelos de estimulación tradicional debido a que el virus usado para estimular ha sido atenuado por propagación in vitro, y el único parámetro importante en la evaluación de estos modelos es la diseminación del virus (Wren, 2001). Consecuentemente, los signos clínicos se registraron dos días previo a la estimulación, el día de la estimulación y por catorce días post estimulación. La observación de signos clínicos de BRSV se toma en consideración durante el análisis de datos, pero no se considera como un resultado primario debido a que estos signos pueden ser indicativos de muchas enfermedades respiratorias comúnmente encontradas en vacas comerciales.

La proporción de controles vacunados y vacunados con placebo que son clasificadas como ya sea afectados o no afectados se estima (fracción prevenida), ya que es la diferencia en la duración de diseminación entre el grupo de control y vacunado (fracción mitigada).

La eficacia de la fracción del virus BRSV de la vacuna MLV hexavalente puede ser fácilmente evaluada determinando la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan (1993). Este análisis se basa en la proporción de vacunados que son resistentes a la estimulación del BRSV comparada con la proporción de controles vacunados con placebo que son resistentes.

Análisis Estadísticos: La diferencia media en duración de diseminación entre los dos grupos puede ser estimada y la fracción mitigada calculada de conformidad con el método de Fergen (2004). Las comparaciones del grupo de los Títulos de anticuerpo pueden ser analizadas con la Prueba U de Mann-Whitney. Todos los análisis estadísticos se realizaron usando SAS Learníng Edición 2.0 por Microsoft Windows® como se describe anteriormente.

Ejemplo 6A- Estudio de eficacia de BRSV Los resultados de este estudio demuestran que la fracción del Virus Sincitial Respiratorio Bovino (BRSV) vivo modificado de Rinotraqueítis bovina - Virus de diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna del virus sincitial respiratorio, Virus vivo modificado, es antigénica y eficaz como un auxiliar en la prevención de diseminación del Virus Sincitial Respiratorio Bovino en becerros de reproducción/engorda. Una dosis de la vacuna se administró a veintidós becerros sero-negativos BRSV. Once becerros sero-negativos de control se vacunaron con una dosis de una vacuna de placebo apareada de producto. Todos los becerros se estimularon intra-nasalmente con BRSV. La vacunación resultó en un Título de anticuerpo BRSV incrementado y diseminación BRSV prevenida después de la estimulación. Consecuentemente, un BRSV-TCID50 mínimo de 7X102 por dosis se ha establecido para la fracción de BRSV de esta vacuna.

Materiales y métodos Vacunación y Estimulación de Becerros: Treinta y tres (33) becerros negativos BRSV se mezclaron en una clasificación aliada. Cada ternera se embarcó conforme estuvieron aleatoriamente en el rebaño, tres becerros a la vez, hasta el corredor en uno de dos grupos (Grupo A - vacunados o Grupo B - controles vacunados con placebo) usando un esquema de aleatorización de serie apareada proporcionado por CVB-Biometrics.

Veintidós de los becerros serológicámente negativos se vacunaron con una dosis de Rinotraqueítis bovina - Virus de diarrea -Parainfluenza3 - Vacuna sincitial respiratoria, vacuna del Virus vivo modificado. Cada vacunación se dio una dosis de 2 mi del producto por inyección subcutánea en el lado izquierdo del cuello en el día 0. Once de los becerros se vacunaron con una vacuna de placebo apareada de producto (suprimido de BRSV). Hisopos nasales se recolectaron, los becerros se sangraron, y seleccionaron serológicámente para confirmar la susceptibilidad al BRSV por un ensayo de neutralización de suero de disminución de virus constante. Dos días previos a la estimulación ambos grupos vacunados y de control se mezclaron con el propósito de pre-estimular la observación clínica. Los becerros de control y vacunados se estimularon 32 días post-vacunación con 4 mi (2ml por nariz) de aislado N375, TVL-BRSV. El virus estimulado se tituló inmediatamente previo a la estimulación (TCID50 de 1066 / mi) y nuevamente inmediatamente después de la estimulación (TCID50 of 1062 / mi). El virus estimulado se mantuvo enfriado a través del proceso de estimulación.

Muestras de sangre se recolectaren el día de la vacunación, el día de la estimulación y 14 días post-estimulación. Títulos de anticuerpo del Virus Sincitial Respiratorio Bovino se determinaron por el método de neutralización de suero de disminución de virus constante.

Hisopos nasales se recolectaren el día de la vacunación, el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación.

Las temperaturas rectales se registraron diariamente para cada ternera por dos días previo a la estimulación, el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación.

Se hicieron observaciones clínicas. Los observadores se blindaron debido a tanto tos grupos de control y vacunados siendo mezclados con la única característica de diferenciación siendo el número de etiqueta en la oreja. En ningún tiempo a través del estudio los observadores tuvieron conocimiento del estado de vacunación de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no tiene conocimiento del estado de vacunación de los becerros.

Detección de BRSV. Hisopos nasales se recolectaron de becerros frotando ambas fosas nasales con un Cultivo BBL Swab® en Medio Stuart Líquido. La observación visual del CPE específico del BRSV junto con técnicas de PCR mejoradas de cultivo celular se utilizaron para detectar BRSV en muestras recolectadas. Brevemente, las muestras se procesaron por filtración estéril (0.2pm) en células TVL-BK en cultivo. Los cultivos se incubaron por 5 días a 37°C ± 2 °C y 5 ± 1% de C02. Los cultivos se observaron para CPE específico de BRSV y se registraron los resultantes. Los sobrenadantes de todas las muestras de cultivo (tanto CPE + como -) se sometieron individualmente para determinar la presencia/ausencia de BRSV usando la serie sonda/cebador descrita por M. Boxus et.al. (RT-PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del Virus Sincitial Respiratorio Bovino, M. Boxus, C. Letellier, P. Kerkhofs, Journal of Virological Methods, 125 (2005) 125-130). La especificidad de la seria sonda/cebador se confirmó en alojamiento y no reaccionó cruzado con BHV, PI3, BVDVIa, BVDVIb o BVDV2. Los ensayos de qPCR RT se realizaron usando ensayos a base de Taqman® en un Applied Biosystems 7500.

Todas las muestras que fueron positivas de CPE específicas de BRSV también fueron positivas a PCR. Hubo 10 muestras que fueron negativas para CEP específico de BRSV y positivas para BRSV por el ensayo de PCR. Esto es consistente con estudios locales que indican que los ensayos a base de PCR son más sensibles que los ensayos a base de la observación de CPE específico de BRSV. Las muestras que fueron negativas para BRSV después del cultivo primario fueron subcultivadas y los sobrenadantes de los fluidos subcultivados fueron sometidos a ensayo para determinar la presencia/ausencia de BRSV de conformidad con el mismo método.

Análisis estadísticos: La eficacia de la fracción BRSV de esta vacuna se basa principalmente en la proporción de vacunados que diseminan el BRSV comparado con la proporción de controles que diseminan BRSV post-estimulación. Se calculó la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan (1993). El número de días postestimulación que el BRSV se aisló de individual becerros en el estudio se evaluó. Los grupos se compararon para determinar si la frecuencia del aislamiento del BRSV (diseminación) fue significativamente reducida en el grupo vacunado comparado con el grupo de control después de la estimulación del BRSV.

Las comparaciones de grupo de los datos del Título ordinariamente a escala se compararon por la prueba U de Mann-Whitney. Las temperaturas rectales se analizaron usando la temperatura promedio pre-estimada como una covarianza. El análisis de la temperatura de post-estimulación para el día 1-14 se condujo en un análisis de medidas repetidas de varianza (ANOVA). Todos los análisis estadísticos se realizaron usando SAS para Windows.

Resultados Títulos de anticuerpo de neutralización de suero: Todos los becerros en este estudio tienen un Título de anticuerpo de neutralización de suero pre-vacunación de <1:2. Los Títulos de anticuerpo de neutralización de suero post-vacunación fueron significativamente (p< 05) mayor en el grupo vacunado comparado con aquellos del grupo de control. Veintiuno de los 22 becerros vacunados mostró un incremento en Títulos BRSV después de la vacunación, mientras, todos los once controles vacunados con placebo permanecen negativos a través del periodo de vacunación previo a la estimulación. El Título de anticuerpo promedio del grupo vacunado fue 8.5 mientras el Título promedio del grupo de control fue <2.

Aislamiento de BRSV: Todos los once becerros de control en este estudio diseminaron BRSV durante la fase de post-estimulación de este estudio. Solamente 3 de los 22 vacunados diseminaron BRSV durante este tiempo. Esto resulta en una fracción prevenible de 0.8636. Hubo también una diferencia significativa (p<0.05) en la frecuencia de diseminación. El grupo de control diseminó BRSV por una media de 6.00 días mientras los vacunados diseminaron por solamente 0.227 días. Esta es una diferencia de 5.773 días.

Temperaturas rectales: El análisis de temperatura rectal post-estimulación usando la temperatura promedio pre-estimada como una covarianza no reveló diferencias estadísticamente significativas entre grupos. No se consiguieron análisis adicionales de estos datos.

Signos clínicos de BRSV: Cada animal se examinó para signos clínicos de enfermedad respiratoria por dos días consecutivos previo a la estimulación, el día de la estimulación y por catorce días consecutivos post-estimulación. No se observaron signos clínicos que podrían ser definitivamente atribuidos a la infección del BRSV. Sin embargo, se registró la descarga nasal clara excesiva como un signo clínico para 7 de los 11 controles durante el mismo periodo de tiempo los becerros fueron activamente diseminando BRSV. No se registraron signos clínicos para el grupo vacunado durante el estudio. No se observaron reacciones post-vacunación adversas en cualquiera de los becerros.

Conclusiones Los reportes precedentes demuestran la eficacia de la fracción de BRSV de la Rinotraqueítis bovina - Virus de diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna del virus sincitial respiratorio, Virus vivo modificado, como un auxiliar en la prevención de diseminación de BRSV en becerros de reproducción/engorda.

La eficacia y la antigenicidad de la fracción del BRSV de este producto combinado es atestiguada por los siguiente: 1) Estudios de aislamiento de virus (BRSV) revelaron que la administración de una dosis de vacuna proporciona 86% (19/22) de protección en becerros vacunados comparado con 100% (11/11) de susceptibilidad en los controles (Fracción prevenible = 0.8636). 2) Una disminución significativa en la frecuencia de diseminación contra el grupo vacunado comparada con el grupo de control. Los becerros de control diseminan BRSV por 5.773 días más que lo que lo hacen los vacunados. 3) Una disminución significativa en Títulos de anticuerpo a BRSV del grupo vacunado comparado con el grupo de control.

Ejemplo 7 - Protocolo de eficacia de IBR (HBV-1) Este ejemplo demuestra que la fracción viral BHV-1 de la vacuna MLV hexavalente ayuda en la prevención de IBR.

Materiales y métodos La vacuna del virus vivo, modificado hexavalente se prepara como se describe anteriormente. Brevemente, BHV-1 (cepa Cooper), BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TGAC), BVDV-2 (125), Pl3 (Reisinger SF-4), y BRSV (N375) son propagadas en la línea de células TVL-BK (20avo paso). Las fracciones individuales son recolectadas en el 10mo pasaje y combinadas en conjunto en el producto de seis formas.

Una placebo suprimido de BHV-1 se hace junto con la eficacia serial. El placebo suprimido de BHV-1 contiene los mismos lotes de recolección BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, Pl3 y BRSV como la eficacia serial. El medio de cultivo se sustituyó por el componente BHV-1 para mantener el volumen equivalente entre la eficacia serial y placebo suprimido de BHV-1. El diluyente estéril se usó para rehidratar tanto vacunas como el placebo suprimido por BHV-1.

Becerros de reproducción/engorda comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad son aleatorizados como se describe anteriormente, después desparasitados y vacunados contra pasteurelosis, micoplasmosis y pata negra. Todos los becerros son dados con acceso a agua de elección libre, heno Bermuda de la costa y una ración de alimentación mezclada que contiene un coccidiostato, pero no antibiótico. La disponibilidad al heno puede ser subsecuentemente restringida después que los becerros son alimentados.

Aproximadamente veinte o más vacunados y diez o más becerros de control son usados en este estudio de nivel único. Los dos grupos de becerros se mantienen en corrales separados pero equivalentes previo a la estimulación. Los becerros son entonces mezclados en un corral, dos días previos a la estimulación (día -2).

Aleatorización Un esquema de aleatorización apareada de los becerros puede ser usada para alojar becerros en dos grupos de tratamiento (vacunado o control vacunado con placebo). Por ejemplo, una secuencia de tres becerros que entran a la rampa puede ser aleatorizada en los dos grupos de tratamiento en una relación 2:1. Las etiquetas de las orejas, aleatoriamente extraídas de un cubo al tiempo de la extracción de sangre inicial para evaluación serológica, son usados para identificar becerros.

Estudios ciegos Personal cegado no tiene conocimiento de la identidad de los controles o vacunados, y todo el personal de laboratorio y campo (con la excepción de los cuidadores del registro), son cegados por la duración del estudio.

Resultado El resultado primario para este estudio es una diferencia en lesiones nasales asociada con IBR. Esto es definido como la ausencia o presencia de lesiones nasales. Otros signos clínicos de IBR que incluyen duración y severidad de lesiones nasales, aislamiento de BHV-1 de las fosas nasales, y temperatura corporal, son todos considerados como resultados secundarios.

Los registros de lesiones nasales mismas son estimados como categorías ordinarias. La duración y severidad de las lesiones en la mucosa nasal visible características de IBR sirven ambas como un criterio para evaluación. Los signos clínicos de enfermedad respiratoria y diseminación nasal también pueden ser usados como criterio para determinar resistencia (no afectado) o susceptibilidad (afectado) a la estimulación. Las temperaturas rectales diarias individuales son rutinariamente analizadas usando la temperatura promedio pre-estimada (valor de referencia) como una covarianza .

Las unidades experimentales son excluidas del estudio si tienen un Título de BHV-1 SN de >2 en el inicio del estudio.

Muestras de sangre son recolectadas de becerros inmediatamente previo a la vacunación (día -28 a día -21 ) con eficacia serial o placebo suprimido de BHV-1 . Muestras de sangre también son tomadas inmediatamente previo a la estimulación (Día 0) y nuevamente 14 días post estimulación (Día 14).

Marcos de muestreo, recolección de datos y observaciones clínicas Se recolectaron muestras nasales, y los becerros se observaron para determinar lesiones en la mucosa nasal visible y signos clínicos de I BR en el día 0 hasta Día 14. Las temperaturas rectales son determinadas para cada ternera en el día -2 hasta Día 14.

Los resultados variables incluyen lesiones de la mucosa nasal visible consistentes con el I BR, las temperaturas rectales, aislamiento de virus, Títulos de anticuerpo y signos clínicos de IBR.

Las lesiones nasales fuertes de IBR han sido descritas por Rosner ( 1 968). Las lesiones típicas observadas incluyen inflamación y edema de los pasajes nasales con hemorragias y exudado fibronecrotico adherente al revestimiento mucoso. Se ha reportado por Rosner que el exudado necrótico a veces es así extensivo en los pasajes nasales que forman un exudado pseudomembranoso qué es desprendido del tejido subyacente. Rosner también reporta que estos hallazgos patológicos encontrados dan un alto grado de confianza en la elaboración de un diagnóstico presuntivo de IBR. Los registros de lesión nasal pueden ser asignados de conformidad con el criterio establecido, y se observaron los datos de duración analizados para demostrar si la vacunación tiene un efecto mitigante en la duración de tales lesiones.

Las evaluaciones de la temperatura rectal, aislamiento del virus, Títulos de anticuerpo, y métodos estadísticos son como se describe en ejemplos previos. Los signos clínicos de IBR han sido descritos por Rosner (1968), e incluyen, pero no se limitan a, respiración rápida, anorexia, pirexia, tos, descarga nasal, una pérdida de peso y condición. Los signos clínicos se registraron dos días previo a la estimulación, el día de la estimulación y por catorce días ppst-estimulación. La observación de signos clínicos de I BR se puede tomar en consideración durante el análisis de los datos pero no se considera como un resultado primario, debido a que estos signos también pueden ser indicativos de muchas otras enfermedades respiratorias encontradas comúnmente en vacas comerciales.

Análisis Estadístico: Se analizaron grupos de comparación de los Títulos de anticuerpo con la Prueba Mann-Whitney U . Todos los análisis estadísticos se realizaron usando SAS Learn ing Edición v2.0 para MS-Windows® como se describió anteriormente .

Ejemplo 7A - Estudio de eficacia IBR (HBV-1) Los resultados de este estudio demostraron que la fracción modificada del Virus del Herpes-1 de Bovino (BHV-1) vivo, Rinotraqueítis Bovina - Virus de la Diarrea - Para influenza3 - Vacuna del Virus Sincitial Respiratorio, Virus Vivo Modificado, es un antigénico y eficaz como un auxiliar en la reducción de Rinotraqueítis Bovina Infecciosa (IBR). Se administraron dos dosis de la vacuna a veintidós becerros cero negativo BHV-1. Se vacunaron doce becerros de control cero negativo con dos dosis de una vacuna de placebo apareada con el producto. Todos los becerros se estimularon intra-nasalmente con BHV-1. La vacunación resultó en un incremento del Título de anticuerpo BHV-1 y una reducción tanto en la duración como la severidad de lesiones nasales asociadas con IBR. La vacunación también disminuyó la duración de derrame y respuesta febril que la típica después de una estimulación con BHV en becerros. Consecuentemente, se ha establecido un TCID50 de BHV-1 mínimo de 5 X 103 por dosis para la fracción de BHV-1 de esta vacuna.

Materiales y métodos Vacunación y Estimulación de Becerros: Se mezclaron treinta y cuatro becerros negativos BHV-1 en una clasificación aliada. Cada ternera se embarcó conforme estuvieron aleatoriamente en el rebaño, tres becerros a la vez, a través del corredor en uno de dos grupos (Grupo A - vacunados o Grupo B - controles vacunados con placebo) usando un esquema de aleatorización de serie apareada proporcionado por CVB-Biometrics.

Veintidós becerros se vacunaron con una dosis de Rinotraqueítis bovina - Virus de la Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna Sincitial Respiratoria, Virus Vivo Modificado. Cada vacuna se proporciona a una dosis de 2 mi del producto por inyección subcutánea en el lado izquierdo del cuello en el día 0. Se vacunaron doce becerros con una vacuna de placebo apareada con el producto (BHV-1 suprimido). Se recolectaron hisopos nasales para aislamiento del virus BHV-1 y se extrajo sangre de todos los becerros para confirmación serológica de susceptibilidad a BHV-1. Al día 13 los becerros vacunados y de control recibieron una segunda dosis de 2 mi de la Serie Eficaz y el placebo apareado con el producto, subcutáneamente, en el lado derecho del cuello. Dos días antes de la estimulación, ambos grupos el vacunado y el de control se mezclaron para el propósito de observación clínica pre-estimulación y para adquirir lecturas de temperatura corporal del valor de referencia. Los becerros vacunados y de control se estimularon 15 días después de la segunda vacunación con 4 mi (2 mi para nariz) de Virus Estimulado BHV-1 proporcionado por la USDA-APHIS-CVB, cepa Coopers, Número de lote 05-08, Fecha de presentación 26 de Octubre de 2005. Se determinó el Título del virus de estimulación por CVB por ser 1082TCID50/2 mi. El virus de estimulación se tituló inmediatamente antes de la estimulación y se determinó ser 1080TCID50/4 mi y nuevamente inmediatamente después se estimuló y determinó ser 1074TCID50/4 mi. El virus de estimulación se mantuvo congelado a través de un proceso de estimulación. Ambas muestras se recolectaron el día de vacunación, el día de estimulación y 14 días después de la estimulación. Se determinaron Títulos de anticuerpo del virus de Herpes Bovino por el método de neutralización de suero de disminución de virus constante.

Hisopos nasales se recolectaron el día de vacunación, el día de estimulación y por 14 días consecutivos después de la estimulación.

Se registraron temperaturas rectales diariamente para cada ternera y por dos días antes de la estimulación, el día de la estimulación y por 14 días consecutivos después de la estimulación.

Se realizaron observaciones clínicas y se asignaron registros de lesión nasal. Se han descrito lesiones nasales graves causadas por BHV por S.F. Rosner, en JAVMA Vol 153, No. 12, Diciembre 1968, p. 1631-1638. Las lesiones típicas observadas incluyen inflamación y edema de los conductos nasales con hemorragias y exudados fibronectrónicos adherentes al revestimiento mucoso. Se ha reportado por Rosner que el exudado necrótico que a veces es extenso en los conductos nasales que se forma un exudado pseudomembranoso el cual es separado del tejido subyacente. Rosner también reporta que estos descubrimientos patológicos dan un alto grado de confidencia en la elaboración de un diagnóstico presuntivo de IBR.

Se señalaron registros de lesión nasal de acuerdo al criterio listado debajo: Registro Descripción 0. Ausencia de lesiones definitivas de la enfermedad del virus IBR 1. La presencia de lesiones características de enfermedad por IBR no debe exceder 10% de la membrana mucosa nasal visible. 2. La presencia de lesiones características de enfermedad por IBR que afecta el 11-25% de la membrana mucosa nasal visible. 3. La presencia de lesiones características de enfermedad por IBR que afecta el 26-50% de la membrana mucosa nasal visible. 4. La presencia de lesiones características de la enfermedad por IBR que afecta más del 50% de la membrana mucosa nasal visible.

Los observadores fueron cegados debido a ambos grupos vacunados como de control siendo mezclados con la única característica de diferenciación siendo el número de etiqueta de la oreja. En ningún momento a través del estudio los observadores proporcionan conocimientos del estado de vacunación de una prueba animal. El personal del laboratorio no tiene conocimiento del estado de vacunación de los becerros.

Detección del BHV-1: Se recolectaron hisopos nasales de los becerros frotando ambas fosas nasales con un Hisopo de Cultivo Swab® BBL en Medio Stuart Líquido. Se utilizaron observaciones visuales del CPE específico para BHV-1 junto con las técnicas PCR de cultivo celular intensificado para detectar BHV-1 en muestras recolectadas. Brevemente, las muestras son procesadas por filtración estéril (0.2 pm) en células TVL-BK en cultivo. Los cultivos se incubaron por 4 días a 37°C ± 2°C y 5 ± 1% de C02. Los cultivos se observaron por CPE específico para BHV-1 y los resultados se registraron. El sobrenadante de todas las muestras del cultivo (ambos + y - CPE) se sometieron individualmente a ensayo para la presencia/ausencia de BHV-1 usando metodología PCRq RT convencional y la siguiente serie sonda/cebador.

Cebador Delantero: CCATGTTAGCGCTCTGGAACC (SEC ID NO:16) Cebador Inverso: CGTCTTTACGGTCGACGACTCC (SEC ID NO.-17) Sonda MGB TaqMan: ACGGACGTGCGCGAA (SEC ID NO:18) La especificidad de la serie sonda/cebador se confirmó en alojamiento y no en reacción cruzada con PI3, BRSV, BVDVIa, BVDVIb o BVDV2. Los ensayos PCRq RT se realizaron usando ensayos a base de Taqman® en un Applied Biosystems 7500. Todas las muestras que son positivas para CPE específicas a BHV-1 también son positivas a PCR. Existen 8 muestras que son negativas para CPE específica a BHV-1 y positivas para BHV por el ensayo PCR. Esto es consistente con los estudios en alojamiento que indican que los ensayos a base de PCR son ligeramente más sensibles que los ensayos a base de la observación de CPE específico a BHV-1. Las muestras que son negativas para BHV-1 después del cultivo inicial se subclonaron y observaron para CPE. Lo sobrenadante de los fluidos subclonados se sometieron a ensayo para la presencia/ausencia de BHV-1 de acuerdo al mismo método.

Lesiones Nasales: El resultado primario del estudio tiene diferencias en lesiones nasales asociadas con BHV-1. La fracción de prevención se calculó como se describe por Tanner y Morgan (1993) en base a la presencia o ausencia de lesiones en una ternera individual. Se calculó una fracción mitigada condicional estimada de la severidad de las lesiones en becerros afectados de acuerdo con B.J. Fergen, Estimating an Intervention Effect on Outcome Severity, USDA, CVB. Se determinó la duración de lesiones (el número de días a partir del primero al último día que se observaron las lesiones) para cada becerro afectado y se estimó la diferencia en la duración de lesiones entre los dos grupos.

Temperatura Corporal: Un resultado secundario del estudio tiene diferencias en temperatura corporal entre becerros del grupo vacunado y de control. Se condujeron análisis de temperaturas rectales para los días 1-14 con un análisis de medidas repetidas de varianza (ANOVA) que incluye términos para Grupo, Día e interacciones Grupo*Día y usando las temperaturas de líneas base como una covarianza. Ya que las interacciones Grupo*Día son significativas (p<0.5), el grupo vacunado es comparado al de control a través del simple efecto de Grupo para cada punto de tiempo. Estas comparaciones de efecto simple se obtienen de las interacciones Grupo*Día.

Diseminación del Virus: Otro resultado secundario del estudio tiene la diferencia en diseminación de BHV post-estimulación entre los becerros vacunados y de control. Se calculó la fracción de prevención como se describe por Tanner y Morgan (1993) en base al aislamiento e identificación de BHV en muestras nasales a partir de un becerro individual. Se determinó la duración de la diseminación (el número de días a partir del primer día hasta el último día en que se detectó BHV-1) para cada ternera afectada y se estimó la diferencia en la duración de la diseminación entre los dos grupos.

Todos los análisis estadísticos se realizaron usando SPSS versión 17 para Windows.

Resultados Títulos de anticuerpo de neutralización en suero: Todos los becerros en este estudio tienen un Título de anticuerpo de neutralización en suero para BHV-1 de pre-vacunación de <1:2. Todos los 12 becerros en el grupo de control son aún cero negativo en el día de estimulación (Título de anticuerpo de <1:2). Veintiuno de los 22 becerros en el grupo vacunado tiene cero convertido con Títulos de = 1:2 para el día de estimulación (Título medio del grupo de 1:4). Para los 14 días después de la estimulación todos los becerros tienen cero convertido a BHV-1 (Título de vacuna media >256, Título de control medio 128).

Lesiones Nasales: Se observaron lesiones nasales en todos los 12 becerros de control (100%) y 20 de 22 becerros vacunados (91%). La fracción de prevención estimada para lesiones nasales es de 9%. Una fracción mitigada estimada en la severidad de becerros afectados es de 90% (95% de Cl:72%, 100%). Las lesiones entre los controles afectados son más severas que entre los vacunados afectados. La duración media de las lesiones nasales que se observaron es de 6 días para los vacunados y 10.5 días para los controles. El cambio estimado en duración entre los dos grupos es de 4.5 días.

Temperatura Rectal: El análisis de temperatura rectal postestimulación usando la temperatura promedio pre-estimulación como una covarianza reveló un grupo estadísticamente significativo (p<0.05) y grupo por día afectado. El análisis reveló que la temperatura del grupo de control es significativamente (p<0.05) incrementado del valor de referencia comparado al grupo vacunado en los días 3 hasta 9 y día 11 post-estimulación.

Aislamiento de BHV-1: Todos los becerros de control y vacunados se despojaron de BHV-1 durante la fase post-estimulación de este estudio. La duración media de aislamiento de BHV-1 a partir del grupo vacunado es de 6 días y 10.5 días para los controles. El cambio estimado en duración de la diseminación es de 4.5 días. Todas las muestras que exhiben CPE específico para BHV son confirmadas por PCR. Sin embargo, existen 8 muestras en las cuales el CPE no se observa aún si tienen señales PCR positivas débiles. Estas 8 muestras no están incluidas como positivas para este análisis.

Signos Clínicos de BHV-1: Cada animal se examinó para signos clínicos de enfermedad respiratoria pos dos días consecutivos antes de la estimulación, el día de la estimulación y por catorce días consecutivos post-estimulación. Se observaron los signos clínicos que pueden ser atribuidos a infección por BHV-1 y se registraron. No se observaron reacciones post-vacunación adversas en cualquiera de los becerros.

Conclusiones: El reporte precedente demuestra la eficacia de Rinotraqueítis bovina - Virus de la Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna del Virus Sincitial Respiratorio fracción BHV-1, Virus Vivo Modificado como un auxiliar en la reducción de enfermedad debido a BHV-1 en becerros para reproducción/engorda. La eficacia y la antigenicidad de la fracción BHV-1 de este producto combinado es atestiguado por lo siguiente: 1) Una disminución en la severidad y duración de lesiones nasales en el grupo vacunado cuando se compara al grupo de control. 2) Una disminución en pirexia en el grupo vacunado comparado al grupo de control. 3) Cero-conversión a BHV-1 del grupo vacunado comparado al grupo de control.

Ejemplo 8 - Protocolo de eficacia Pl3 Este ejemplo demuestra que la fracción Pl3 de la vacuna MLV hexavalente ayuda en la prevención de enfermedad causada por Pl3.

Materiales y métodos Se preparó la vacuna del virus vivo, modificado hexavalente como se describe anteriormente. Se elabora un placebo suprimido de Pl3 junto con la eficacia serial. El placebo suprimido de Pl3 contiene los mismos lotes recolectados BHV-1, BVDV-1b, BVDV-2, BVDV-1a, y BRSV como la eficacia serial. El medio de cultivo es sustituido por el componente Pl3 para mantener el volumen equivalente entre la eficacia serial y el placebo suprimido de Pl3. Se usa el diluyente estéril para rehidratar tanto la vacuna como el placebo suprimido de Pl3.

Los becerros para reproducción/engorda comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad se aleatorizaron como se describe anteriormente, entonces se desparasitaron y vacunaron contra pasteurelosis, micoplasmosis y pata negro. A todos los becerros se les deja acceso libre al agua, heno Bermuda costero y una ración de alimento mezclado que contiene un coccidiostato, pero no antibiótico. La disponibilidad al heno puede subsecuentemente ser restringida después que los becerros están alimentados.

Aproximadamente veinte o más becerros vacunados y diez o más becerros de control se usa en este estudio de nivel único. Los dos grupos de becerros son mantenidos en corrales separados pero equivalentes antes de la estimulación (día -2).

Aleatorización Se puede usar un esquema de aleatorización apareado de los becerros para asignar becerros en dos grupos de tratamiento (vacunado o de control vacunado con placebo). Por ejemplo, se puede aleatorizar una secuencia de tres becerros que ingresan a la rampa en los dos grupos de tratamiento en una relación 2:1. Se usan etiquetas en la oreja, extraídas al azar de un cubo al tiempo de inicio de extracción de sangre para evaluación serológica, para identificar a los becerros.

Estudio ciego El personal cegado no tiene conocimiento de la identidad de los controles o vacunados. Todo el personal de campo y laboratorio, con la excepción del encargado del registro, son cegados por la duración del estudio.

Resultados El resultado primario de este estudio es la prevención de la diseminación nasal del virus Pl3 después de la estimulación. Esto es determinado por la presencia o ausencia de Pl3 en muestras nasales recolectadas diariamente de la nariz de todos los becerros durante el curso del estudio. Otro resultado secundario anticipado incluye signos clínicos disminuidos de infección Pl3, reducción de pirexia reducción de la duración de la diseminación en Pl3 diseminado por becerros. Las unidades experimentales son excluidas del estudio si tienen un Título Pl3 de >2 al inicio del estudio.

Estructura de muestreo, recolección de datos y observaciones clínicas Se recolectaron muestras de sangre de becerros inmediatamente antes de la vacunación (día -28 a -21) con eficacia serial o placebo suprimido de Pl3. También son recolectadas muestras de sangre inmediatamente antes de la estimulación (Día 0) y nuevamente a los 14 días post-estimulación (Día 14). Se recolectaron muestras de sangre para conteo WBC diferencial en el día 2 hasta al menos el día 14. Todas las muestras se recolectaron en tubos Vacutainer® EDTA, y se realizó el conteo usando un contador WBC diferencial Hemavet 950, Drew Scientific. Se tomaron hisopos nasales para aislamiento de virus en el día 2 hasta al menos el día 14.

Se determinó la diseminación de Pl3 por los grupos vacunados o de control diariamente por 14 días post-estimulación. La detección de Pl3 sirve como el criterio primario para determinar la resistencia (no afectado) o susceptibilidad (afectado) a la estimulación. Se comparan los grupos afectado y no afectado para determinar si la vacunación previene la diseminación de Pl3 después de una exposición a la estimulación de Pl3. Los signos clínicos de enfermedad respiratoria sirven como un criterio secundario para determinación de susceptibilidad o resistencia a la estimulación. Se analizó la duración de la diseminación (se detectó el número de días Pl3 de un becerro individual) para determinar si la vacunación tiene un efecto mitigante en este parámetro. Se analizaron todas las temperaturas rectales diarias individuales usando la temperatura promedio de pre-estimulación (valor de referencia) como una covarianza.

Detección de Pl3: Se tomaron hisopos nasales de cada ternera en el día de estimulación y por 14 días consecutivos postestimulación limpiando ambas fosas nasales con un Cultivo Swab® BBL con Medio Stuart Líquido. El medio de las muestras se somete a ensayo por la presencia de Pl3 por PCR de Tiempo Real usando la serie sonda/cebador específico para Pl3 descrita en la presente.

Duración de diseminación: La duración de diseminación se define como el número de días que el Pl3 es detectado en los hisopos nasales de una ternera individual. Se analizaron los datos de duración recolectados para determinar si la vacunación tiene un efecto mitigante en la duración del tiempo en que se detecta Pl3 en las muestras nasales.

Temperatura rectal: Se registraron temperaturas rectales diarias para cada animal entre el Día 2 y Día 14 (2 días antes de la estimulación, el día de la estimulación y 14 días post-estimulación). Se calcula una media pre-estimulación para cada animal promediando valores de temperatura por los Días 2 hasta el Día 0. Se analizan las temperaturas diarias usando el valor de referencia como una covarianza.

Títulos de Anticuerpo: Se determinaron Títulos de anticuerpo de neutralización en suero por el método de suero que disminuye el virus constante para cada animal en el día de vacunación, Día 0 y Día 14 del estudio.

Signos Clínicos: Se han descrito signos clínicos de Pl3 por Bryson et al. (1989). Los Signos Clínicos incluyen pero no se limitan a embotamiento, respiración rápida, pirexia, ataque de tos, sonidos pulmonares espontáneos y/o severos. Los signos clínicos son registrados dos días antes a la estimulación, el día de estimulación y por catorce días post-estimulación. La observación de los signos clínicos de Pl3 se toman en consideración durante el análisis de los datos pero no es considerada como un resultado primario debido al hecho que estos signos pueden ser indicativos de muchas enfermedades respiratorias comúnmente encontradas en ganado comercial.

Ejemplo 8A - Estudio de eficacia de Pl3 Los resultados de este estudio demuestran que la fracción del Virus de Parainfluenza3 (PI3) de Bovino vivo modificado de Rinotraqueítis bovina - Virus de la Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna del Virus Sincitial Respiratorio, Virus Vivo Modificado, es antigénico y eficaz como y auxiliar en la prevención de la diseminación del Virus de Parainfluenza3 de Bovino en becerros para reproducción/engorda. Se administran dos dosis de vacuna a veinte becerros cero-negativo Pl3. Diez becerros de control cero-negativo se vacunaron con dos dosis de una vacuna de placebo apareado del producto. Todos los becerros son estimulados intra-nasalmente con Pl3. La vacunación resulta en un incremento del Título de anticuerpo Pl3 y prevención de la diseminación de PI3 después de la estimulación. Consecuentemente, se ha establecido un TCID50 de PI3 mínimo de 6 X 104 por dosis para la fracción PI3 de esta vacuna.

Materiales y métodos Vacunación y Estimulación de Becerros: Treinta (30) becerros negativos a PI3 son mezclados en una clasificación aliada. Cada ternera se embarcó conforme estuvieron aleatoriamente en el rebaño, tres becerros a la vez, a través del corredor en uno de los dos grupos (Grupo A - vacunados o Grupo B - controles vacunados con placebo) usando un esquema de aleatorización de serie apareada proporcionado por CVB-Biometrics.

Veintidós becerros se vacunaron con una dosis de Rinotraqueítis bovina - Virus de la Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna Sincitial Respiratoria, Virus Vivo Modificado. Cada vacuna se proporciona a una dosis de 2 mi del producto por inyección subcutánea en el lado izquierdo del cuello en el día 0. Se vacunaron diez becerros con una vacuna de placebo apareada con el producto (PI3 suprimido). Se recolectaron hisopos nasales para aislamiento del virus PI3 y se extrajo sangre de todos los becerros para confirmación serológica de susceptibilidad a PI3. Al día 25 los becerros vacunados y de control recibieron una segunda dosis de 2 mi de la Serie Eficaz y el placebo apareado con el producto, subcutáneamente, en el lado derecho del cuello. Dos días antes de la estimulación, ambos grupos el vacunado y el de control se mezclaron para el propósito de observación clínica pre-estimulación y para adquirir lecturas de temperatura corporal del valor de referencia. Los becerros vacunados y de control se estimularon 15 días después de la segunda vacunación con 4 mi (2 mi para nariz) de Virus Estimulado PI3 proporcionado por la USDA-APHIS-CVB, cepa Reisinger, Número de lote 05-07, Fecha de presentación 26 de Julio de 2005. Se determinó el Título del virus de estimulación por CVB por ser 1082TCID50/2 mi. El virus de estimulación se tituló inmediatamente antes de la estimulación y se determinó ser 108 3TCID50/4 mi y nuevamente inmediatamente después se estimuló y determinó ser 1082TCID50/4 mi. El virus de estimulación se mantuvo congelado a través de un proceso de estimulación.

Ambas muestras se recolectaron el día de vacunación, seis días después de la vacunación, el día de estimulación, seis días después de la estimulación y 14 días post-estimulación. Se determinaron Títulos de anticuerpo del virus de Parainfluenza3 Bovino por el método de neutralización de suero de disminución de virus constante.

Se recolectaron hisopos nasales el día de la vacunación, el día de estimulación y por 10 días consecutivos post-estimulación.

Se registraron temperaturas rectales diariamente para cada ternera por dos días antes de la estimulación, el día de estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación.

Se realizaron observaciones clínicas. Los observadores fueron cegados debido a que ambos grupos el vacunado y el de control son mezclados con la única característica de diferenciación siendo el número de etiqueta en la oreja. En ningún a través del estudio los observadores tienen conocimiento del estado de vacunación de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no tiene conocimiento del estado de vacunación de los becerros.

Detección de PI3: Se recolectaron hisopos nasales de cada becerro limpiando ambas fosas nasales con un Cultivo Swab® BBL con Medio Stuart Líquido. La observación visual del CPE específico a PI3 junto con técnicas PCR de cultivo celular intensificado se utilizan para detectar PI3 en muestras recolectadas. Brevemente, las muestras son procesadas por filtración estéril (0.2 µ??) en células TVL-B en cultivo. Los cultivos se incubaron por 4 días a 37°C + 2°C y 5 ± 1% de COz. Los cultivos se observaron para CPE específico a PI3 y se registraron los resultados. El sobrenadante de todas las muestras del cultivo (ambos + y - CPE) son sometidos a ensayo individualmente para la presencia/ausencia de PI3 usando metodología PCRq RT convencional y la siguiente serie de sonda/cebador: Cebador Delantero : GGAGACCAAGACCAAGGAGATG (SEC ID NO:13) Cebador Inverso: CGTCTGCCCATGCATAAGG (SEC ID NO:14) Sonda MGB TaqMan: ACCTCGGTCATCCATAG (SEC ID NO: 15) Este método se desarrolló en base al trabajo de A. Hu et al. (Desarrollado de un ensayo PCT RT de tiempo real para detección y cuantificación del virus 3 de para influenza. A. Hu, M. Colella, P. Zhao, F. L¡, J.S. Tam, R. Rappaport, S.M. Cheng. Journal of Virological Methods, 130 (2005) 145-148). La especificidad de la serie sonda/cebador se confirmó en alojamiento y no a través de reacción con BHV, BRSV, BVDVIa, BVDVIb o BVDV2. Se realizaron ensayos PCRq RT usando ensayos a base de Tacman® en un Applied Biosystems 7500.

Todas las muestras que son positivas para CPE específico a PI3 son también positivas a PCR. Existen 17 muestras que son negativas para CPE específica a PI3 y positiva para PI3 por el ensayo PCR. Esto es consistente con los estudios en alojamiento que indican que los ensayos a base de PCR son más sensibles que los ensayos a base de la observación de CPE específico a PI3. Las muestras que son negativas para PI3 después del cultivo inicial se subclonaron y observaron para CPE. Lo sobrenadante de los fluidos subclonados se sometieron a ensayo para la presencia/ausencia de PI3 de acuerdo al mismo método.

Análisis Estadístico: La eficacia de la fracción PI3 de esta vacuna es principalmente a base de la proporción de vacunados diseminaron PI3 comparados a la proporción de controles que diseminaron PI3 post-estimulación. Se calcula la fracción evitable como se describe por Tanner y Morgan (1993). Las comparaciones del grupo de los datos del Título ordinariamente escalados se compararon por la Prueba (J de Mann-Whitney. Se analizaron las temperaturas rectales usando el promedio de temperatura pre-estimulación como una covarianza. Se conduce el análisis de la temperatura post-estimulación para los días 1-14 con un análisis de mediciones repetidas de varianza (ANOVA). Se realizaron todos los análisis estadísticos usando SAS para Windows.

Resultados Títulos de anticuerpo de neutralización en suero: Todos los becerros en este estudio tienen un Título de anticuerpo de neutralización en suero de <1:2. Ninguno de los becerros vacunados demuestra una respuesta inmune de anamnésica a la vacuna. Para el día de estimulación, el grupo vacunado tiene un Título PI3 promedio de 1:16 el cual es significativamente (p =.05) mayor que del grupo de control a 1:3. Una ternera en el grupo de control, la ternera 7, desarrolla un Título de 1:16 durante el curso del estudio. Esta ternera también demuestra una respuesta anamnésica a la estimulación y tiene un Título de 1:128 seis días después de la estimulación. Los otros nueve becerros de control so cero-negativo en el día de estimulación y no demuestran una respuesta anamnésica a la estimulación.

Aislamiento PI3: Todos los diez becerros de control en este estudio diseminaron PI3 durante la fase post-estimulación de este estudio: Solamente 4 de los 20 vacunados diseminaron PI3 en este tiempo. Esto resulta en una Fracción Prevenible de 0.80. Todas las muestras que exhibieron CPE específico a PI3 se confirmaron por PCR. Sin embargo, existen 17 muestras en las cuales el CPE no se observa aún si tienen señales PCR positivas débiles. Estas 17 muestras se han incluido como positivas a PI3 por este ensayo.

Temperaturas Rectales: Los análisis de temperatura rectal post-estimulación usando la temperatura promedio pre-estimulación como una covarianza no revelaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. No se hizo seguimiento adicional del análisis de estos datos.

Signos Clínicos de PI3: Cada animal se examinó para signos clínicos de enfermedad respiratoria por dos días consecutivos antes de la estimulación, el día de estimulación y por catorce días consecutivos post-estimulación. No se observaron signos clínicos que pueden ser atribuidos definitivamente a infección por PI3. No se observaron reacciones post-vacunación adversas en cualquiera de los becerros.

Conclusiones El reporte precedente demuestra la eficacia de la fracción PI3 de Rinotraqueítis bovina - Virus de la Diarrea - Parainfluenza3 -Vacuna del Virus Sincitial Respiratorio, Virus Vivo Modificado como un auxiliar en la prevención de la diseminación de PI3 en becerros para reproducción/engorda.

La eficacia y la antigenicidad de la fracción PI3 de este producto combinado es atestiguada por lo siguiente: 1) Los estudios de aislamiento del virus (Pl 3) revelaron que la administración de dos dosis de la vacuna proporcionan 80% (16/20) de protección en becerros vacunados comparado al 100% (10/10) de susceptibilidad en los controles (Fracción Prevenible = 0.80). 2) Un incremento significativo en Títulos del anticuerpo a PI3 del grupo vacunado comparado al grupo de control.

Ejemplo 9 - Protocolo de eficacia BVDV-2 Este ejemplo demuestra que la fracción de BVDB tipo 2 de la vacuna MLV hexavalente ayuda en la prevención de la enfermedad causada por BVDV-2.

Materiales y métodos La vacuna del virus vivo, modificado hexavalente se prepara como se describe anteriormente. Se elabora el placebo suprimido de BVDV-2 junto con la eficacia serial. El placebo suprimido de BVDV-2 contiene los mismos lotes recolectados BHV-1, BVDV-1b, BVDV-1a, Pl3 y BRSV como la eficacia serial. El medio de cultivo es sustituido por el componente BVDV-2 para mantener un volumen equivalente entre la eficacia serial y el placebo suprimido de BVDV-2. Se usan diluyentes estériles para rehidratar tanto la vacuna como el placebo suprimido de BVDV-2.

Se aleatorizaron becerros para reproducción/engorda comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad como se describe anteriormente, entonces se desparasitaron y vacunaron contra pasteurelosis, micoplasmosis y pata negra. A todos los becerros se les da acceso libre al agua, heno Bermuda costero y una ración de alimento mezclado que contiene coccidiostato, pero no antibiótico. La disponibilidad del heno puede subsecuentemente ser restringida después que los becerros están alimentados.

Aproximadamente veinte o más becerros vacunados y diez o más becerros de control se usaron en este estudio de nivel único. Los dos grupos de becerros se mantuvieron por separado pero en corrales equivalentes antes de la estimulación. ,Los becerros entonces se mezclaron en un corral, dos días antes de la estimulación (día 2).

Aleatorización, ensayo ciego y resultado La aleatorización, estudio ciego y resultado son como se describen en el Ejemplo 10.

Estructura de muestreo, recolección de datos y observaciones clínicas Se recolectaron muestras de sangre de becerros inmediatamente antes a la vacunación (día 28 a 21) con eficacia serial o placebo suprimido de BVDV-2. Las muestras de sangre también se recolectaron inmediatamente antes de la estimulación (Día 0) y nuevamente a los 14 días post-estimulación (Día 14). Se recolectaron muestras de sangre para conteos WBC diferenciales en el día 2 hasta al menos el día 14. Todas las muestras se recolectaron en tubos Vacutainer® EDTA, y los conteos se realizaron usando un contador WBC diferencial Hemavet 950, Drew Scientific. Se tomaron hisopos nasales para aislamiento del virus en el día 2 hasta al menos el Día 14.

Resultados variables incluyen producción de anticuerpo que neutraliza leucopenia, pirexia, diseminación del virus nasal, viremia y signos clínicos. El resultado primario es la prevención de leucopenia inducida por BVDV-2 en el grupo vacunado comparado con el grupo de control después de la estimulación BVDV-2.

Leucopenia: Se analizaron los datos de conteo WBC para determinar si existe una reducción en el conteo post-estimulación. Se calculó una media pre-estimulación para cada animal promediando conteos WBC para los Días 2 hasta 0. Se calculó la relación de conteos WBC diarios en relación a la media pre-estimulación (conteo WBC como una proporción de pre-estimulación) para cada uno de los días 1-14 post-estimulación o más tiempo a la discreción de los observadores. Si la proporción disminuye por 25% el individuo es clasificado como leucopénico.

Diseminación: Se tomaron hisopos nasales de cada ternera en el día de la estimulación y por 14 días consecutivos post- estimulación limpiando ambas fosas nasales con un Cultivo Swab® BBL con Medio Stuart Líquido. El día de la recolección, las muestras se procesaron por filtración estéril a través de un filtro de 0.2 µp?. Cada cavidad de una placa de 12 cavidades que contiene TVL-MDBK (~80% confluyente) es entonces inoculada con una muestra. Una cavidad por placa permanece sin inocular y sirve como el control negativo. Una cavidad de la placa es inoculada con una dilución del virus estimulado y sirve como el control positivo. Las placas son incubadas a 3-7% de C02 a una temperatura de 35-39°C por 2 a 4 días. Se recolectó medio de cada cavidad y se almacenó a -80 hasta -22°C. El medio de las cavidades que exhiben morfología citopática BVDV-1a típica es procesado adicíonalmente para determinar la identidad del agente infeccioso. Los individuos que son cultivos positivos son clasificados como "diseminadores".

Viremia: Se usaron las capas leucocitarias de las muestras de sangre para inocular cada cavidad de una placa de 12 cavidades que contiene TVL-MDBK (~80% confluyente). Una cavidad por placa permanece sin inocular y sirve como el control negativo. Una cavidad de la placa se inocula con una dilución del virus estimulado y sirve como el control positivo. Las placas son incubadas a 3-7% de C02 a una temperatura de 35-39°C por 2 a 4 días. Se recolecta medio de cada cavidad y se almacena a -18 hasta -22°C. El medio de las cavidades que exhiben morfología citopática BVDV-2 típica son procesadas adicíonalmente para determinar la identidad del agente infeccioso. Los individuos que son cultivos positivos para BVDV-2 son considerados "virémicos".

Títulos de Anticuerpo: Se determinaron Títulos de anticuerpo de neutralización en suero contra BVDV-2 por el método de suero que disminuye el virus constante para cada animal en el d ía de inicio de la vacunación (día 21 ), el día de estimulación (día 0) y en la conclusión del estudio. Se determinaron los Títulos de anticuerpo de acuerdo al Resultado Especial A-1 7, Titulación del Anticuerpo que Neutraliza el Virus de la Diarrea Viral de Bovino Tipo 2. Los animales que desarrollan un Título de anticuerpo=8 son considerados como cero-convertidos a BVDV-2.

Signos Clínicos: Los signos cl ínicos de BVDV-2 pueden incluir, pero no se limitan a pirexia , leucopenia, disnea, descargas nasales y heces sueltas. Todos los signos clínicos relevantes de la infección BVDV son registrados dos días antes de la estimulación, el día de la estimulación y por 14 días post-estímulación . La observación de signos clínicos de BVDV-2 es tomada en consideración durante el análisis de los datos pero no considerada como un resultado primario porque estos signos pueden ser indicativos de otras enfermedades encontradas en esta clase de ganado.

Ejemplo 9A - Estudio de eficacia BVDV-2 Los resultados de este estudio demuestran que la fracción del Virus de Diarrea Viral de Bovino vivo modificado tipo 2 (BVDV-2) de Rinotraqueítis bovina - Virus de la Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna del Virus Sincitial Respiratorio, Virus Vivo Modificado, es antigénico y eficaz como un auxiliar en la prevención de la enfermedad causada por BVDV2. Se administra una dosis a veinte becerros cero-negativo BVDV. Se vacunaron diez becerros de control cero-negativos con una dosis de una vacuna de placebo apareada con el producto. Todos los becerros se estimularon intra-nasalmente con BVDV2 (cepa 1373). La vacunación resultó en un Título de anticuerpo BVDV2 incrementado (de un promedio de <2 a 24), relación de muerte post-estimulación reducida (muerte de controles 7/10, muerte de vacunados 0/20). Consecuentemente, se ha establecido un mínimo de TCID50 de BVDV2 de 3 X 103 TCDI50 por dosis para la fracción BVDV2 de esta vacuna.

Ejemplo 10 - Protocolo de eficacia BVDV-1A Este ejemplo demuestra que la fracción BVDV Tipo 1a de la vacuna MLV hexavalente ayuda en la prevención de la enfermedad causada por BVDV-1 a.

Materiales y métodos Se preparó la vacuna del virus vivo, modificado hexavalente como se describe anteriormente. Se elabora un placebo suprimido de BVDV-1a junto con la eficacia serial. El placebo suprimido de BVDV-1a contiene los mismos lotes recolectados BHV-1, BVDV-1b, BVDV-2, Pl3 y BRSV como la eficacia serial. El medio de cultivo es sustituido por el componente BVDV-1a para mantener el volumen equivalente entre la eficacia serial y el placebo suprimido de BVDV-1a. Se usa el diluyente estéril para rehidratar tanto la vacuna como el placebo suprimido de BVDV-1a.

Los becerros para reproducción/engorda comerciales de aproximadamente 3-4 meses de edad se aleatorizaron como se describe anteriormente, entonces se desparasitaron y vacunaron contra pasteurelosis, micoplasmosis y pata negro. A todos los becerros se les deja acceso libre al agua, heno Bermuda costero y una ración de alimento mezclado que contiene un coccidiostato, pero no antibiótico. La disponibilidad al heno puede subsecuentemente ser restringida después que los becerros están alimentados.

Aproximadamente veinte o más becerros vacunados y diez o más becerros de control se usa en este estudio de nivel único. Los dos grupos de becerros son mantenidos en corrales separados pero equivalentes antes de la estimulación. Los becerros entonces son mezclados en un corral, dos días antes de la estimulación (día 2).

Aleatorización Se puede usar un esquema de aleatorización apareado de los becerros para asignar becerros en dos grupos de tratamiento (vacunado o de control vacunado con placebo). Por ejemplo, se puede aleatorizar una secuencia de tres becerros que ingresan a la rampa en los dos grupos de tratamiento en una relación 2:1. Se usan etiquetas en la oreja, extraídas al azar de un cubo al tiempo de inicio de extracción de sangre para evaluación serológica, para identificar a los becerros.

Estudio ciego El personal cegado no tiene conocimiento de la identidad de los controles o vacunados; todo el personal de campo y laboratorio (con la excepción del encargado del registro), son cegados por la duración del estudio.

Resultados El resultado primario es leucopenia después de la estimulación. La leucopenia es definida como una diminución del 25% de los conteos WBC del valor de referencia. Los otros resultados que pueden además soportar la eficacia de la vacuna incluyendo diseminación nasal, viremia, pirexia, producción de anticuerpo y signos clínicos de BVDV.

Se excluyeron unidades experimentales del estudio si tienen un Título BVDV-1 de=2 al inicio del estudio.

Estructura de muestreo, recolección de datos y observaciones clínicas Se recolectaron muestras de sangre de becerros inmediatamente antes de la vacunación (día 28 a 21) con eficacia serial o placebo suprimido de BVDV. También son recolectadas muestras de sangre inmediatamente antes de la estimulación (Día 0) y nuevamente a los 14 días post-estimulación (Día 14). Se recolectaron muestras de sangre para conteos WBC diferencial en el día 2 hasta al menos el día 14. Todas las muestras se recolectaron en tubos Vacutainer® EDTA, y se realizó el conteo usando un contador WBC diferencial Hemavet 950, Drew Scientific. Se tomaron hisopos nasales para aislamiento de virus en el día 2 hasta al menos el día 14.

Los resultados variables incluyen producción de anticuerpo que neutraliza leucopenia, pirexia, diseminación de virus nasal, viremia y signos clínicos. El resultado primario es la prevención de leucopenia inducida por BVDV en el grupo vacunado comparado al grupo de control después de la estimulación por BVDV-1a.

Leucopenia, Diseminación y Viremia: Se analizaron los datos de conteo WBC como se describe en el Ejemplo 9; se tomaron hisopos nasales a partir de cada ternera en el día de estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación limpiando ambas fosas nasales con un Cultivo Swab® BBL con Medio Stuart Líquido para determinar la diseminación, también como se describe en el Ejemplo 9. Se usaron las capas leucocitarias de las muestras de sangre para inocular cada cavidad de una placa de 12 cavidades que contienen TVL-MDBK (~80% confluyente) y se sometió a ensayo como se describe en el Ejemplo 9.

Títulos de Anticuerpo: Se determinaron Títulos de anticuerpo de neutralización en suero contra BVDV-1a por el método "de suero que disminuye el virus constante" para cada animal en día de inicio de la vacunación (día 21), el día de estimulación (día 0), y en la conclusión del estudio. Se determinaron los Títulos de anticuerpo de acuerdo al Resultado Especial A-17, la Titulación del Anticuerpo que Neutraliza el Virus de Diarrea Viral Bovino Tipo 1a. Los animales que desarrollaron un Título de anticuerpo =8 son considerados como cero-convertidos a BVDV-1a.

Signos Clínicos: Signos clínicos de BVDV-1a pueden incluir, pero no se limitan a pirexia, leucopenia, disnea, descarga nasal y heces sueltas. Todos los signos clínicos relevantes de infección por BVDV se registraron dos día antes a la estimulación, el día de estimulación y por 14 días post-estimulación. La observación de signos clínicos de BVDV-1 se toma en consideración durante el análisis de los datos pero no es considerada como un resultado primario porque estos signos pueden ser indicativos de otras enfermedades comúnmente encontradas en esta clase de ganado.

Ejemplo 10A - Estudio de eficacia BVDV-1 A Los resultados de este estudio demuestran que la fracción del Virus de Diarrea Viral de Bovino vivo modificado tipo 1a (BVDVIa) de Rinotraqueítis bovina - Virus de la Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna del Virus Sincitial Respiratorio, Virus Vivo Modificado, es antigénico y eficaz como un auxiliar en la prevención de la infección causada por BVDVIa. Se administra una dosis de vacuna a veinte becerros cero-negativo BVDV. Se vacunaron diez becerros de control cero-negativos con una dosis de una vacuna de placebo apareada con el producto. Todos los becerros se estimularon intra-nasalmente con BVDVIa. La vacunación resultó en un Título de anticuerpo BVDVIa incrementado y ya sea previene o reduce viremia inducida por BVDVIa, diseminación nasal, pirexia, linfopenia y leucopenia. Consecuentemente, se ha establecido un mínimo de TCID50 de BVDVIa de 5 X 103 TCDI50 por dosis para la fracción BVDVIa de esta vacuna.

Materiales y métodos Vacunación, Estimulación y Recolección de Muestra: Se mezclaron treinta becerros negativos BVDV en una clasificación aliada. Cada ternera se embarcó conforme estuvieron aleatoriamente en el rebaño, tres becerros a la vez, a través del corredor en uno de dos grupos (Grupo A - vacunados o Grupo B - controles vacunados con placebo) usando un esquema de aleatorización de serie apareada proporcionado por CVB-Biometrics.

Se vacunaron veinte becerros con una dosis de Rinotraqueítis bovina - Virus de la Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna Sincitial Respiratoria, Virus Vivo Modificado. Cada vacuna se proporciona a una dosis de 2 mi del producto por inyección subcutánea en el lado izquierdo del cuello en el día 0. Se vacunaron diez becerros con una vacuna de placebo apareada con el producto (BVDV suprimido). Dos días antes a la estimulación ambos grupos el vacunado como en del control se mezclaron para el propósito de observación clínica pre-estimulación y para adquirir el valor de referencia de la temperatura corporal y lecturas WBC. Los becerros vacunados y de control se estimularon 21 días después de la vacunación con un aislado virulento de BVDVIa obtenido de los pulmones de una ternera muestra en el corral en la Granda Ruff en Hanston, Kansas. Los virus se han pasado in vitro en las células TVL-BK usando Medio Eagle Modificado de Dulbecco con Suero Equino al 10%. El virus estimulado se tituló inmediatamente antes de la estimulación y se determinó ser 1078 de TCID50/4 mi e inmediatamente después de la estimulación y se determinó ser 1073 de TCDI50/4 mi. Se administraron dos mi del virus estimulado en cada cavidad nasal durante la inspiración. El virus estimulado se mantuvo congelado hasta el proceso de estimulación.

Se recolectaron muestras de sangre para determinar Títulos de anticuerpo antes de la vacunación, el día de estimulación (21 días post-vacunación), y 14 días post-estimulación. Se determinaron Títulos de anticuerpo del Virus de Diarrea Viral de Bovino por el método de neutralización en suero que disminuye el virus constante.

Se recolectaron hisopos nasales para aislamiento del virus de los becerros limpiando ambas fosas nasales con un Cultivo Swab® BBL en Medio Stuart líquido en el día de estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación.

Se recolectaron muestras de sangre para aislamiento del virus en la capa leucocitaria de cada ternera por venopunción en un tubo vacutainer EDTA en el día de estimulación y por 14 días consecutivos post-estimulación.

Se registraron temperaturas rectales diariamente para cada ternera y por dos días antes de la estimulación, el día de la estimulación y por 14 días consecutivos después de la estimulación.

Se realizaron observaciones clínicas y se registraron. Los observadores están ciegos debido a que ambos grupos el vacunado y el de control son mezclados con la única característica de diferenciación siendo el número de etiqueta en la oreja. En ningún momento a través del estudio los observadores tienen conocimiento del estado de vacunación de un animal de prueba individual. El personal de laboratorio no tiene conocimiento del estado de vacunación de los becerros. Se recolectaron muestras de sangre para determinar los conteos WBC diferenciales por dos días consecutivos antes de la estimulación, el día de estimulación y 14 días consecutivos post-estimulación. Se recolectaron muestras en tubos vacutainer EDTA y se realizaron los conteos usando el contador WBC diferencial Hemavet 950, Drew Scientific.

Detección de BVDV. Se utiliza la observación de CPE y técnicas PCR de cultivo celular intensificado para detectar BVDVIa en muestras recolectadas. Brevemente, las muestras nasales son procesadas por filtración estéril (0.2 µ??) en las células TVL-BK en cultivo. Se colocaron capas leucocitarias en células TVL-BK en cultivo por 45-75 minutos antes de que las células sean lavadas. Los cultivos se incubaron por 4 días a 37°C ± 2°C y 5 ± 1% de C02. Cada cultivo se observó para la presencia/ausencia de CPE específico para BVDV y lo sobrenadante de cada cultivo se sometió a ensayo individualmente para la presencia/ausencia de BVDVIa usando metodología PCRq RT convencional y la siguiente serie de sonda/cebador: Cebador Delantero: GGTCGCCCAGGTAAAAGCA (SEC ID NO:7) Cebador Inverso: GCCTCTGCAGCACCCTATCA (SEC ID NO:8) Sonda MGB TaqMan MGB: AACCGACTGTTACGAATAC (SEC ID NO:9) Este método se desarrolló en base (Diferenciación de virus de diarrea viral de bovino tipos 1a, 1b y 2 (BVDV) por PCR, Julia F. Ridpath y Steven R. Bolín, Molecular and Cellular probes, Journal of Virologícal Methods, 130 (2005) 145-148). Este método también se basa en el Center for Veterinary Biologics and National Veterinary Services Laboratories Test Protocol - Genotyping Bovine Viral Diarrhea Virus, Número BPPR02010.01. Ambos de los métodos de diferenciación de genotipos y subgenotipos de BVDV sacan provecho de las diferencias genéticas que existen en la Región sin Traducir 5' (URT) del genoma. Esta serie sonda/cebador es específicamente diseñada para amplificar una sección de la URT 5' en la cual una secuencia de BVDVIa única se puede detectar por la sonda altamente específica. La especificidad de la serie sonda/cebador se confirmó en alojamiento y no inter reacciona con BHV.PI3, BRSV, BVDVIb, o BVDV2. Se realizaron ensayos PCRq RT usando ensayos a base de Taqman® en un Applied Biosystems 7500.

Análisis Estadístico. Títulos de Anticuerpo: Se analizaron las comparaciones del grupo de los Títulos ordinalmente escalados con la Prueba U de Mann-Whitney.

Diseminación Nasal: Los datos de aislamiento del virus del análisis de hisopos nasales se basan en la proporción de vacunados con BVDVIa comparados a la proporción de controles del BVDVIa aislado de la post-estimulación. Las fracciones prevenibles se calcularon en base a la observación de CPE y en la detección por PCR independientemente. La fracción prevenible para diseminación de BVDVIa se calculó por Tanner y Morgan (1993).

Viremia: Se analizaron los datos de aislamiento de virus de la capa leucocitaria de muestras de sangre en base a la proporción de vacunas de BVDVIa aisladas de lo comparado a la proporción de controles de BVDVIa aisladas de la post-estimulación. Las fracciones prevenibles se calcularon en base a la observación de CPE y en la detección por PCR independientemente. La fracción prevenible para viremia de BVDVIa se calculó por Tanner y Morgan (1993).

Temperatura Rectal: Se determinó una temperatura rectal media pre-estimulación para cada animal. Este promedio se usó como una covarianza en un análisis de mediciones repetidas de varianza (ANOVA) el cual incluye términos por Grupo, Día e interacciones Grupo*Día.

Signos Clínicos de la Enfermedad: Se registraron signos clínicos de la enfermedad diariamente por cada observador independientemente.

Linfopenia: Se calculó una media de linfocito pre-estimulación para cada animal por conteos de linfocito promediados por los Días 2 hasta 0. Se calculo la relación de conteos de linfocito diarios en relación a la media pre-estimulación (conteo de linfocito como una proporción de pre-estimulación) para cada día 1-14 post-estimulación. Se analizaron estos datos de proporción para determinar si los animales individuales desarrollan una linfopenia como se define por un 25% de disminución en conteos del valor de referencia. Se calculó la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan (1993) para determinar si la vacunación previene el desarrollo de linfopenia en este estudio.

Leucopenia: Se calculó una media de leucocito pre-estimulación para cada animal por conteos de leucocito promediados para los días 2 hasta 0. Se calculó la relación de conteos de leucocito diarios en relación a la media pre-estimulación (conteo de leucocito como una proporción de pre-estimulación) para cada día 1 -14 postestimulación. Se analizaron estos datos de proporción para determinar si los animales individuales desarrollaron una leucopenia como se define por el 25% de disminución en conteos del valor de referencia. Se calculó la fracción prevenible como se describe por Tanner y Morgan ( 1993) para determinar si la vacunación previene el desarrollo de leucopenia en este estudio.

Todos los análisis estadísticos se realizaron usando SPSS versión 16 para Windows.

Resultados Títulos de anticuerpo de Neutralización en Suero: Todos los becerros en este estudio tienen un Título de anticuerpo de neutralización en suero BVDV de pre-vacunación (BVDVI a , BVDVI b y BVDV2) de < 1 :2. Para el día de estimulación (Día 21 ), el grupo vacunado tiene un Título BVDVI a promedio de 1 : 21 el cual es significativamente (p =.05) mayor que el del g rupo control <1 :2. Los Títulos de anticuerpo BVDVI a se incrementan a los 14 días postestimulación en ambos becerros el de control y el vacunado indicando que los becerros se han estimulado con BVDVI a .

Aislamiento del BVDVI a de H isopos Nasales: En base a las observaciones de CPE específico a BVDV, todos los diez becerros de control en este estudio diseminaron BVDVIa durante la fase postestimulación de este estudio. Solamente 3 de los 20 vacunados diseminaron BVDVIa durante el periodo post-estimulación. Se calculó una fracción de prevención usando una relación de 1/10 controles naturalmente protegidos y 17/20 protegidos por vacunas. Esto resulta en una Fracción Prevenible de 0.85.

En base a la detección PCR de cultivo celular intensificado de BVDVIa, todos los diez becerros de control en este estudio diseminaron BVDVIa durante la fase post-estimulación de este estudio. Solamente 5 de 20 vacunados diseminaron BVDVIa durante el periodo post-estimulación. Se calculó una fracción de prevención usando una relación de 0/10 controles naturalmente protegidos y 15/20 protegidos por vacunas. Esto resulta en una Fracción Prevenible de 0.75.

Aislamiento del BVDVIa de la Capa Leucocitaria: En base a las observaciones de CPE específico a BVDV, seis de los diez becerros de control en este estudio son virémicos durante la fase postestimulación de este estudio. Nueve de los 20 vacunados son virémicos durante el periodo post-estimulación. Se calculó una fracción de prevención usando una relación de 4/10 controles naturalmente protegidos y 20/20 protegidos por vacunas. Esto resulta en una Fracción de Prevención de 1.0.

En base a la detección de PCR de cultivo celular intensificado de BVDVIa, siete de los diez controles en este estudio son virémicos durante la fase post-estimulación de este estudio. Dos de los 20 vacunados son virémicos durante el periodo post-estimulación. Se calculó una fracción de prevención usando una relación de 3/10 controles naturalmente protegidos y 18/20 proteg idos por vacunas. Esto resulta en una Fracción Prevenible de 0.86.

Temperatura Rectal: El análisis de temperatura rectal postestimulación usando la temperatura promedio pre-estimulación como una covarianza reveló un grupo estadísticamente significativo (p <0.05) y grupo para efecto diarios. El análisis reveló que la temperatura del grupo de control es significativamente mayor que la del grupo vacunado en los días 6, 8 y 14 y significancia aproximada en los días 5 y 1 1 .

Signos Clínicos de BVDVI a : Un becerro en el grupo de control demostró signos clínicos que pueden ser atribuidos a la infección por BVDVI a. El signo clínico observado del becerro 21 es una cantidad copiosa de descarga nasal mucopurulenta . N ing uno de las becerros en el grupo vacunado demostró cualquiera de los signos clínicos de la infección por BVDVI a durante la fase post-estimulación del estudio. No se observaron reacciones post-vacunación adversas en cualquiera de los becerros.

Linfopenia: Se detectó linfopenia en dos de los 20 vacunados y cinco de los diez controles resultando en una fracción prevenible del 80% . Promedios diarios de los datos de proporción revelaron una respuesta típica de los becerros de control a estimulación de BVDV (linfopenia seguido con un pico de rebote). Los becerros vacunados no responden de manera similar.

Leucopenia: Se detectó leucopenia en cinco de los 20 vacunados y cuatro de los diez controles resultando en una fracción prevenible de 37%. Los promedios diarios de los datos de proporción son gráficamente representados en la Figura 3.

Conclusiones El reporte precedente demuestra la antigenicidad y eficacia de la fracción BVDVI a de Rinotraqueítis bovina - Virus de Diarrea -Parainfluenza3 - Vacuna del Virus Sincitial Respiratorio, Virus Vivo Modificado como un auxiliar en la prevención de infección causada por BVDVI a .

La antigenicidad y la eficacia de la fracción BVDVI a de este producto combinado son detenidas por lo siguiente: 1 ) Un incremento significativo en Títulos de anticuerpo para BVDVI a en el grupo vacunado comparado al grupo de control. Diecinueve de los 20 becerros en el grupo vacunado desarrollaron Títulos de BVDVI a = 1 :8 después de la administración de una dosis de 2 mi de vacuna, cubriendo los requerim ientos definido en 9CFR 1 1 3.31 1 (c)(5). 2) Estudios de aislam iento del virus revelaron que la administración de una dosis de BVDVI a disminuida induce dispersión nasal y viremia en becerros post-estimulación. 3) Los becerros vacunados exhiben sig nificativamente menos fiebre cuando se compara a becerros de control. 4) La vacunación también dism inuye la linfopenia y leucopenia inducida por BVDVI a en bece rros post-esti m u lados .

Los hallazgos del estudio son tanto estadísticamente significativo como clínicamente relevantes, por lo tanto, demostrando la eficacia de la fracción del BVDVIa contenida en inotraqueítis Bovina -Virus de Diarrea - Parainfluenza3 - Vacuna del Virus Sincitíal Respiratorio, Virus Vivo Modificado.

Ejemplo 11 - Protocolo de ensayo de potencia para vacunas de fiebre del embarque En el Número de Solicitud de Patente Estadounidense co-pendiente .61/427,404, titulada "Composiciones y Métodos para Identificar y Diferenciar Componentes Virales de Vacunas de Fiebre del Embarque Multivalente" (presentada concurrentemente junto con esta el 27 de Diciembre de 2010, y específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta), los presentes inventores reportaron el desarrollo de un protocolo de ensayo de base genéticamente modificado útil en la obtención de una cuantificación viral directa (es decir, "potencia") de cada componente viral individual en una vacuna multivalente. La invención reemplaza ensayos FA/IFA convencionales (tales como aquellos descritos en el ensayo actual SAM 101) con un ensayo RT-qPCR para determinar la presencia o ausencia de especies de virus particular, tipos, o subtipos en cavidades de ensayo individuales (es decir, diluciones).

Las pruebas de potencia para los componentes individuales de una vacuna multivalente, tal como la vacuna MLV hexavalente descrita en la presente, también pueden ser elaboradas más objetivas sustituyendo análisis RT-qPCR/qPCR de cavidades individuales para observación visual de CPE. Por ejemplo, la observación de CPE en ensayos de titulación viral puede ser preferentemente subjetiva, y es a menudo considerada por ser la fuente de diferencias en los Títulos de vacuna MLV entre las instalaciones de pruebas. Disminuyendo la objetividad del ensayo, sin embargo, la capacidad reproductiva entre los laboratorios también puede incrementar.

Las pruebas de potencia para Pl3 se pueden conducir usando un Método de Ensayo Complementario modificado para la Titulación de las Vacunas del Virus de Parainfluenza 3 (MVSAM102.01 ). Las pruebas de potencia para BRSV pueden ser conducidas usando un Método de Ensayo Complementario modificado para Titulación del Virus Sincitial Respiratorio Bovino en Vacunas (MVSAM0129.01). Estos ensayos son modificados sustituyendo análisis de qPCR en tiempo real de cavidades individuales para la observación visual de CPE. La titulación de la fracción del BHV se conduce usando un Método de Ensayo Complementario modificado para la Titulación del Virus de Rinotraqueítis Bovina Infecciosa en Vacunas (MVSAM0105.01 ). En este ensayo, un formato de 96 cavidades puede ser usado en lugar del formato de 6 cavidades estándar, con el fin de estandarizar los ensayos para análisis de vacunas multivalentes. De manera importante, este protocolo incluye sustituir análisis de qPCR de cavidades individuales para observación visual y conteo de placas BHV para proporcionar un ensayo más exacto y robusto.

El presente ejemplo demuestra el uso de las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) (tiempo real) expuestas en la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense co-pendiente del inventor No. 61/427,404, para determinar exitosamente la potencia de cada uno de los seis componentes virales individuales de la vacuna MLV hexavalente descrita en la presente. Los inventores mostraron que el ensayo es particularmente ventajoso sobre las metodologías existentes en la determinación de las potencias individuales de cepas genéticamente relacionadas en un ejemplo multivalente. Usando la vacuna BRDC MLV hexavalente como un modelo, el ensayo se demostró por cuantificar efectivamente las potencias individuales de los tres subgenotipos genéticos de BVDV-1a, BVDV-1b, y BVDV-2 contenidos en esta Materiales y métodos Cultivo celular Todos los cultivos se prepararon usando técnicas convencionales y suministradas como se describe por Freshney (1987).

La Línea de Células de Riñon Bovino TVL, la cual presenta una morfología similar epitelial típica en cultivo, se usó para todos los ensayos de cultivo.

Especificidad de series de cebador/sonda El RNA es extraído de fluidos virales de cada uno de las siguientes siembras virales aprobadas por el Departamento de Agricultura Estadounidense (USDA): BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TGAC), BVDV-2 (125), Pl3 (Reisinger SF-4), y BRSV (N375) (no se realizó proceso de extracción en BHV-1 [cepa Cooper] puesto que es un virus de DNA). Las extracciones son realizadas usando RNAqueous®-4PCR (Ambion; Austin, TX, USA).

Cada una de las muestras virales de RNA se usó como plantilla (muestra) en reacciones de RT-qPCR separadas para cada una de las seis series de cebador/sonda usando química de RT-PCR de una etapa TaqMan®. El virus de DNA (BHV-1) también se usó como una plantilla (muestra) en reacciones de qPCR separadas con cada una de las seis series de cebador/sonda descritas anteriormente. Los análisis de la serie de sonda/cebador de BRSV contra todas las seis fracciones virales de la vacuna hexavalente indican que no existe reactividad cruzada para cada una de las series de sonda/cebador con cualquiera de las otras fracciones virales.

Ensayos de qPCR Se condujeron ensayos de qPCR usando un Sistema de PCR en Tiempo-Real de Applied Biosystems 7500.

Cebadores de oligonucleótido y sondas moleculares etiquetadas Se fabricaron los siguientes pares de cebadores inverso y delantero específicos del virus y sondas habituales de TaqMan® por Applied Biosystems (Foster City, CA, USA).

BVDV-1b (primero): Cebador delantero: 5'-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3' (SEC ID NO:1); Cebador inverso: 5'-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3' (SEC ID NO:2); y Sonda MGB DEL BVDV-1b TaqMan®: 5'- TCACCTGGACGACCC-3' (SEC ID NO:3).

BVDV-1b (segundo): Segundo cebador delantero: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO:19); Segundo cebador inverso: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO.-20); y Segunda sonda de detección del BVDV-1b: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO:21).

BRSV: Cebador delantero: 5'-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3' (SEC ID NO:4); Cebador inverso: 5'-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3' (SEC ID NO:5); y Sonda MGB DEL BRSV TaqMan®: 5'-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3' (SEC ID NO.6).

BVDV-1a: Cebador delantero: 5'-GGTCGCCCAGGTAAAAGCA-3' (SEC ID NO:7); Cebador inverso: 5'-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3' (SEC ID NO:8); y Sonda MGB del BVDV-1a TaqMan®: 5'-AACCGACTGTTACGAATAC-3' (SEC ID N0.9).

BVDV-2: Cebador delantero: 5'-GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3' (SEC ID NO:10); Cebador inverso: 5'-GACGAGTCCCCTGTACTCAGG-3' (SEC ID NO:11); y Sonda MGB del BVDV-2 TaqMan®: 5'-CAGTGAGTCCATTGGATGG-3' (SEC ID NO.12).

Pl3: Cebador delantero: 5'-GGAGACCAAGACCAAGGAGATG-3' (SEC ID NO:13); Cebador inverso: 5'-CGTCTGCCCATGCATAAGG-3' (SEC ID NO:14); y Sonda MGB del Pl3 TaqMan®: 5'-ACCTCGGTCATCCATAG-3' (SEC ID NO:15).

BHV-1: Cebador delantero: 5'-CCATGTTAGCGCTCTGGAACC-3' (SEC ID NO:16); Cebador inverso: 5'-CGTCTTTACGGTCGACGACTCC-3' (SEC ID NO:17); y Sonda MGB del BHV-1 TaqMan®: 5'-ACGGACGTGCGCGAA-3' (SEC ID NO:18).

Ensayo de potencia para vacunas monovalentes Los protocolos para cada uno de los siguientes ensayos utilizan metodología de Ciclo de Umbral Comparativo (CT) de Biosystems 7500 para determinar si una cavidad individual de una placa de titulación contiene una mayor cantidad de virus que la cavidad de referencia equivalente. La mayoría de las muestras virales contiene algunas partículas virales no viables que podrían ser detectadas por el ensayo de PCR, de este modo dando resultados potencialmente falso-positivos. Este problema es resuelto por el uso de una placa de referencia sin células. La muestra es diluida en la placa de referencia exactamente como tal en la placa de ensayo pero sin células como para eliminar la posibilidad para replicación viral. La placa de referencia se usa para generar como valor de referencia o valor antecedente de CT para cada una de las cavidades en cada ensayo. Si una cavidad en la placa de ensayo tiene un valor CT superior que la cavidad antecedente correspondiente, la replicación viral ha ocurrido y la cavidad es considerada positiva. Si no se determina el valor de CT para una cavidad, o el valor CT es equivalente al valor CT antecedente, entonces la cavidad es considerada negativa.

Ensayo de potencia para vacunas multivalentes Una serie piloto de vacuna hexavalente IBR/BVDV-1 a, -1b, -2/PI3/RSV, virus vivo modificado, se preparó como se describe en la presente. Brevemente, BHV-1 (cepa Cooper), BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TGAC), BVDV-2 (125), Pl3 (Reisinger SF-4), y BRSV (N375) se propagaron en la línea de células TVL-BK (20a o paso). Las fracciones individuales se recolectaron en el 10mo pasaje y combinaron en conjunto en el producto de seis formas. Una prueba de potencia para cada fracción de la vacuna de 6 formas puede ser conducida como se describe en la presente con la adición de antisueros neutralizantes apropiados. El TCID50 de cada fracción viral se determina con base en los resultados CPE/FA/IFA y compara con aquellos con base en el RT-qPCR/qPCR.

Pruebas de potencia BVDV-1a, -1b y -2 Muestras BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2 monovalentes pueden ser tituladas separadamente de conformidad con el Método de Ensayo Complementario para la Titulación del Virus de Diarrea Viral Bovina en Vacuna (SAM 101). Brevemente, el ensayo se conduce por duplicado con una de las placas siendo usada para el cálculo de titulación con base en el CPE y/o FA/IFA como se describe. La otra placa se usa para determinar un Título con base en el RT-qPCR. Una placa de referencia deficiente de la célula se incluye como se describe anteriormente para cada uno de los virus.

Prueba de potencia Pl3 Las pruebas de potencia para Pl3 se condujeron por duplicado con una de las placas siendo usada para cálculos de titulación con base en el CPE. La otra placa se usó para determinar un Título con base en los valores comparativos de CT de Pl3 como se determina por RT-qPCR. Una placa de referencia deficiente de células se incluyó como se describe anteriormente.

Prueba de potencia del BRSV La prueba de potencia para el BRSV se condujo por duplicado con una de las placas siendo usada para el cálculo de Título con base en CPE como se describe anteriormente, con la placa restante siendo usada para determinar un Título con base en los valores CT comparativos de BRSV como se determina por RT-qPCR. Como se discute anteriormente, una placa de referencia deficiente de células también se incluye en el ensayo.

Ensayos de potencia de BHV Las pruebas de potencia para BHV se conducen en un formato de 96 cavidades, sustituyendo análisis de qPCR de cavidades individuales para observación visual convencional y conteo de placas. El ensayo se realizó por duplicado, con una de las placas siendo usada para cálculos de titulación con base en la presencia o ausencia de CPE en una cavidad individual (dilución), mientras la placa restante se usa para calcular un Título con base en los valores CT comparativos de BHV como se determina por QPCR. Una placa de referencia deficiente de célula se incluye como se describe anteriormente.

Referencias Las siguientes referencias, en la extensión en que son procedimientos ejemplares proporcionados u otros detalles complementarios a aquellos expuestos en la presente, están específicamente incorporadas en la presente en su totalidad por referencia expresa a estos: Patente Estadounidense No. 4,415,732 por Caruthers et al.

Patente Estadounidense No. 4,458,066 por Caruthers et al. Patente Estadounidense No. 4,683,195 por Mullís et al.

Patente Estadounidense No. 4,683,202 por Mullís et al.

Patente Estadounidense No.4,725,677 por Koster et al.

Patente Estadounidense No. 4,973,679 por Caruthers et al.

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Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados en la presente pueden ser elaborados y ejecutados sin experimentación indebida en vista de la presente descripción. Mientras las composiciones y métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades ejemplares, será aparente para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que las variaciones pueden ser aplicadas a la composición, métodos y en la secuencia de etapas de los métodos descritos en la presente sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será aparente que ciertos agentes que son tanto químicamente como fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente mientras se pueden lograr los mismos o similares resultados. Todas los sustitutos y modificaciones similares aparentes para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica son considerados por estar dentro del espíritu, campo y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, los derechos exclusivos deben ser patentados como se describe en las reivindicaciones siguientes.

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende: un Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 1b (BVDV-1b) vivo, modificado, y un portador veterinario aceptable.

2. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el Virus de Diarrea Viral Bovina vivo, modificado es un virus BVDV-1b citopático.

3. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende uno o más de un virus de parainfluenza Tipo 3 ( P 13) , un Virus Sincitial Respiratorio Bovino (BRSV), un virus del herpes bovino (BHV-1), un Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 1a (BVDV-1a), un Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 2 (BVDV-2), o un virus de rinotraqueítis bovina infecciosa (IBR), o cualquier combinación de los mismos; o uno o más antígenos específicos virales obtenidos a partir de estos.

4. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un IBRV vivo, modificado, un BRSV vivo, modificado, un BHV-1 vivo, modificado, un BVDV Tipo 1a vivo, modificado, un BVDV Tipo 2 vivo, modificado, o un Pl3 vivo, modificado o una combinación de los mismos.

5. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un adyuvante.

6. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de al menos un primer antigeno

7. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque al menos un primer antigeno es específico para un organismo seleccionado del grupo que consiste de Actinobacillus, Actinomyces, Bacillus, Bordetella, Brachyspira, Campylobacter, Clostridium, Ehrlichia, Erysipelothrix, Escherichia, Histophilus, Leptospira, Listeria, Mannheimia, Moraxella, Mycobacterium, Mycoplasma, Pasteurella, Salmonella, y Streptococcus, o una combinación de los mismos.

8. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque al menos un primer antigeno es inactivado.

9. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es formulada como una vacuna para mamífero.

10. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque es formulada como una vacuna para bovino.

11. Una vacuna caracterizada porque comprende una cantidad profilácticamente efectiva de la composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, y un adyuvante.

12. La vacuna de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque además comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de al menos un antigeno específico del patógeno microbiano.

13. Un método para inducir una respuesta inmune específica del Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 1b (BVDV-1b) en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende una pluralidad de virus vivos, modificados de BVDV Tipo 1b, y un portador veterinario aceptable.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la composición es administrada al mamífero profilácticamente.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la administración de la composición proporciona un efecto terapéutico en el mamífero.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la composición se administra oralmente, subcutáneamente, parenteralmente, intramuscularmente, o intranasalmente, o una combinación de los mismos.

17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la composición contiene desde aproximadamente 102 hasta aproximadamente 1010 TCID50 por dosis de virus vivos, modificados.

18. Un método para prevenir fiebre del embarque en un animal, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad profilácticamente efectiva de una composición que comprende un virus BVDV-1b vivo, modificado y un portador veterinario aceptable.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición además comprende un adyuvante.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el animal es infectado por, o susceptible a infección de, un pestivirus.

21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el animal es un bóvido.

22. Un método para prevenir, tratar, manejar, o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad causada por un pestivirus en un animal susceptible a infección por pestivirus, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad profilácticamente o terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un virus BVDV-1b vivo, modificado y un portador farmacéuticamente aceptable.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la composición además comprende un adyuvante.

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la composición además comprende un inmunogeno derivado de uno o más de rotavirus bovino, BRSV, BHV- , coronavirus bovino, Pl3, paramixovirus bovino, virus de la enfermedad de boca y pata, BRV, BVDV-1a, BVDV-2, Mannheimia haemolytica tipo A1, Mannheimia haemolytica tipo A6, Pasteurella multocida, Histophilus somni, y Mycoplasma bovis.

25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el animal es un bóvido.

26. Un método para proteger un animal contra una enfermedad causada por BVDV-1b, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad profilácticamente efectiva de una composición que comprende un virus BVDV-1b vivo, modificado y un portador farmacéuticamente aceptable.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la composición contiene desde aproximadamente 102 hasta aproximadamente 101° unidades TCID50 por dosis de virus BVDV-1b vivo, modificado.

28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la cantidad de la composición administrada al animal es desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 5.0 mL por dosis.

29. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque además comprende la co-administración de un Virus de Rinotraqueítis bovina, un Virus Sincitial Respiratorio Bovino, o un Virus de Parainfluenza 3, o una combinación de los mismos.

30. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la enfermedad es fiebre del embarque, complejo de enfermedad respiratoria bovina, o diarrea viral bovina.