MX2013006833A - Uso combinado de vip3ab y de cry1ab para el control de los insectos resistentes. - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye los métodos y las plantas para controlar los insectos lepidópteros, dichas plantas comprenden una proteína insecticida Vip3Ab en combinación con una proteína CrylAb para retrasar o para prevenir el desarrollo de la resistencia por los insectos - particularmente del gusano del maíz.

Description

USO COMBINADO DE VIP3AB Y DE CRY1AB PARA EL CONTROL DE LOS INSECTOS RESISTENTES Antecedentes de la Invención Los humanos cultivan maíz para aplicaciones alimenticias y energéticas. Los humanos también cultivan muchas otras cosechas, que incluyen la soya y el algodón. Los insectos comen y dañan las plantas y por lo tanto, obstaculizan estos esfuerzos humanos. Billones de dólares se gastan cada año para controlar las plagas de insectos y billones adicionales se pierden debido al daño que infligen. Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido las herramientas primarias usadas para controlar las plagas de insectos pero los insecticidas biológicos, como las proteínas insecticidas derivadas del Bacillus thuringiensis (Bt, por sus siglas en inglés), han desempeñado una función importante en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticidas Bt ha revolucionado la agricultura moderna y ha aumentado la importancia y el valor de las proteínas insecticidas y sus genes.

Varias proteínas Bt se han usado para crear las plantas transgénicas resistentes a los insectos que se han registrado y comercializado exitosamente hasta la fecha. Éstas incluyen CryIAb, CryIAc, CryIF y Cry3Bb en el maíz, CryIAc y Cry2Ab en el algodón, y Cry3A en la papa.

Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una sola proteína excepto en el caso donde el espectro insecticida combinado de 2 proteínas se desee (por ejemplo, CryIAb y Cry3Bb en el maíz combinado para proporcionar resistencia a las plagas de lepidópteros y gusano de la raíz, respectivamente) o donde la acción independiente de las proteínas las hace útiles como una herramienta para retrasar el desarrollo de la resistencia en las poblaciones de insectos susceptibles (por ejemplo, CryIAc y Cry2Ab en el algodón combinadas para proporcionar el control de resistencia para el gusano tabacalero). Ver también el documento US 2009 0313717, que se relaciona con una proteína Cry2 más una Vip3Aa, una CryIF, o una CryIA para el control de la Helicoverpa zea o armígera. El documento WO 2009 132850 se relaciona con CryIF o CryIA y Vip3Aa para el control de la Spodoptera frugiperda . El el documento US 2008 0311096 se relacionan en parte con CryIAb para el control de BCE resistente a CryIF.

Es decir, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a insectos que han llevado a la adopción rápida y extensa de esta tecnología también dan lugar a la preocupación de que las poblaciones de plagas desarrollen resistencia a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Varias estrategias se han sugerido para preservar la utilidad de los atributos de resistencia los insectos a base de Bt que incluyen el uso de proteínas en una alta dosis en combinación con un refugio, y alternación con, o el uso conjunto, de diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16: 144-146).

Las proteínas seleccionadas para su uso en una pila de IRM necesarias para ejercer su efecto insecticida independientemente, de manera que la resistencia desarrollada a una proteína no confiere resistencia a la segunda proteína (es decir, no hay resistencia cruzada a las proteínas). Si, por ejemplo, una población de plaga seleccionada para resistencia a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", uno concluiría que no hay resistencia cruzada y que una combinación de la Proteína A y de la Proteína B sería efectiva en el retraso de la resistencia a la Proteína A individual.

En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, se pueden hacer las evaluaciones basadas en otras características presumidas para ser relacionadas con el mecanismo de acción y potencial de resistencia cruzada. La utilidad de unión mediada por el receptor en la identificación de proteínas insecticidas probablemente para no exhibir resistencia cruzada se ha sugerido (Van Mellaert et al. 1999). El indicador esencial de la falta de resistencia cruzada inherente a este proceso es que las proteínas insecticidas no compiten por los receptores en una especie de insectos sensibles En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, entonces si este receptor muta en ese insecto de manera que una de las toxinas ya no se una a este receptor y por lo tanto ya no sea insecticida contra el insecto, que podría ser el caso donde el insecto también será resistente a la segunda toxina (que une competitivamente al mismo receptor). De tal manera, se dice que el insecto tiene resistencia cruzada a ambas toxinas Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos diferentes receptores, esto podría ser una indicación que el insecto no sería simultáneamente resistente a estas dos toxinas.

La CryIFa es útil en el control de muchas especies de plagas de lepidópteros incluyendo el barrenador de maíz europeo (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) y el gusano cogollero (FAW; Spodoptera frugiperda) , y es activa contra el barrenador de la caña de azúcar (SCB; Diatraea saccharalis). La proteína CryIFa, puesto que se produce en las plantas de maíz que contienen el elemento TCI507, es responsable de un atributo de resistencia a los insectos líder en la industria para el control de FAW. La CryIFa se utiliza además en los productos Herculex®, SmartStax™, y WideStrike™.

Las toxinas Cry adicionales son enumeradas en el sitio de Internet del comité de nomenclatura de B.t. oficial (Críckmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Existen actualmente casi 60 grupos principales de las toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con toxinas Cyt adicionales y toxinas VIP y similares. Muchos de cada grupo numérico tienen subgrupos en letra mayúscula, y los subgrupos en letra mayúscula tienen subgrupos secundarios en letras minúsculas. (Cry1 tiene A-L, y CryIA tiene a-i, por ejemplo).

Breve Descripción de la Invención La invención objeto se relaciona en parte al descubrimiento que Vip3Ab y CryIAb no compiten entre sí para la unión a los receptores intestinales a partir de Helicoverpa zea (gusano de la mazorca de maíz; CEW). La invención objeto también se relaciona en parte al descubrimiento sorpresivo que Vip3Ab es activo contra las polillas diamondback (DBM, por sus siglas en inglés) que son resistentes a CryIAb.

Como el experto en la técnica reconocerá con el beneficio de esta descripción, las plantas que expresan Vip3Ab y CryIAb, o porciones insecticidas de las mismas, serán útiles en el retraso o la prevención del desarrollo de la resistencia a cualquiera de estas proteínas insecticidas solamente.

Así, la invención objeto se relaciona en parte al uso de una proteína Vip3Ab en combinación con una proteína CryIAb. Las plantas (y superficies en acres plantada con tales plantas) que produce Vip3Ab más CryIAb son incluidas dentro del alcance de la invención objeto.

La invención objeto también se relaciona en parte a los apilados triples o las "pirámides" de tres (o más) toxinas, con Vip3Ab y CryIAb que son el par base. Tales apilados triples pueden proporcionar tres proteínas que proporcionan acción no competitiva contra CEW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar además el requerimiento para el área cultivada de refugio.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Mortalidad de respuesta a dosis de Vip3Abl de longitud completa contra Plutella xylostella (Linnaeus) (DBM), y CryIA resistente a Plutella xylostella (rDBM), Heliothis zea (CEW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), (FAW) y Ostrinia nubllalis (Hübner), larvas (BCE) cuando la toxina purificada se aplica tópicamente a una dieta del insecto artificial. El porcentaje de mortalidad se basa sobre una lectura tomada 5 días después de exponer a la toxina en 8 insectos por dosis.

Figura 2. Respuesta a dosis de inhibición del crecimiento de Vip3Abl de longitud completa contra Plutella xylostella (Linnaeus) (DBM), y CryIA resistente a Plutella xylostella (rDBM), Heliothis zea (CEW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), (FAW) y Ostrinia nubilalis (Hübner), larvas (BCE) cuando la toxina purificada se aplica tópicamente a una dieta artificial del insecto. El porcentaje de inhibición del crecimiento se basa en la comparación del peso promedio de 8 larvas tratadas con amortiguador solamente al peso de larvas expuestas a la toxina durante 5 días.

La Figura 3. Las curvas de desplazamiento competitivo para la unión de 125l CryIAb a la proteina de BBMV se preparó a partir de H. zea. La concentración de BBMV fue de 0.10 mg de proteína/ml, y 125l CryIAb fue de 0.25 nM. 100% de porcentaje de unión específica del 125l CryIAb se midió como la unión total en ausencia de CryIAb no etiquetado menos la unión no específica medida en presencia de 500 nM de CryIAb. Se probó Vip3Abl en concentraciones de hasta 1,000 nM (4,000 veces mayor que el ligando de desplazamiento radioetiquetado) y no desplazó la unión de 125l CryIAb. El 125l CryIAb desplazado no radioetiquetado 50% a aproximadamente 2 nM.

Breve Descripción de las Secuencias La SEC ID NO: 1 es una proteína insecticida CryIAb del fragmento de terminal N.

SEC ID NO: 2 es la proteína Vip3Ab de longitud completa que, como se usa en los estudios de unión, fue la tripsina procesada a un fragmento central (200-788 residuos).

SEC ID NO: 3 es la proteína CryIAb de longitud completa que, como se usa en los estudios de unión, fue la tripsina procesada a un fragmento central (29-612 residuos).

Descripción Detallada de la Invención La invención objeto es soportada en parte por el descubrimiento de que Vip3Ab y CryIAb no compiten entre sí por unir a los receptores intestinales Helicoverpa zea (gusano de la mazorca de maíz; CEW).

La invención objeto incluye el uso de Vip3Ab y de CryIAb para proteger el maíz y otras especies de plantas económicamente importantes contra el daño y la pérdida de producción causada mediante la alimentación de CEW y para prevenir que las poblaciones de CEW desarrollen la resistencia a cualquiera de estas proteínas.

La presente invención proporciona composiciones para controlar plagas de lepidóptero que comprenden células que producen una proteína que contiene la toxina base CryIAb y una proteína que contiene la toxina base Vip3Ab.

La invención adicionalmente comprende un anfitrión transformado para producir una proteína insecticida CryIAb y una proteína insecticida Vip3Ab, donde dicho anfitrión es un microorganismo o una célula de planta. En algunas modalidades, las células de planta son células de no propagación/no totipotentes. Los polinucleótidos objetivos están preferiblemente en una construcción genética bajo control de (operablemente ligados a/que comprenden) un promotor no Bacillus-thuringiensis. Los polinucleótidos objetivo pueden comprender el codón de planta usado para la expresión mejorada en una planta.

Se propone adicionalmente que la invención proporciona un método para controlar las plagas de lepidóptero que comprenden poner en contacto dichas plagas o el ambiente de dichas plagas con una cantidad efectiva de una composición que contenga una proteína que contiene la toxina base CryIAb y además contenga además una proteína que contiene la toxina base Vip3Ab.

Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen expresable en planta que codifica una proteína que contiene la toxina base Vip3Ab y un gen expresable en planta que codifica una proteína que contiene la toxina base CryIAb, y la semilla de tal planta.

Una modalidad adicional de la invención comprende una planta de maíz donde un gen expresable en planta que codifica una proteína que contiene la toxina base Vip3Ab y un gen expresable en planta que codifica una proteína que contiene la toxina base CryIAb ha sido introgresado en dicha planta de maíz, y la semilla de tal planta.

Como se describe en los Ejemplos, los estudios de unión al receptor competitivo que usan el CryIAb radioetiquetado muestran que la proteína de la toxina base de CryIAb no compite por la unión en los tejidos de insecto CEW a los cuales Vip3Ab se une. Estos resultados también indican que la combinación de proteínas CryIAb y Vip3Ab es un medio efectivo para atenuar el desarrollo de resistencia en poblaciones de CEW a CryIAb (y del mismo modo, el desarrollo de resistencia a Vip3Ab), y probablemente aumentaría el nivel de resistencia a esta plaga en plantas de maíz que expresan ambas proteínas. Así, basado en parte en los datos descritos en la presente, se propone que la coproducción (apilado) de las proteínas Vip3Ab y CryIAb se puede usar para producir un apilado de IRM de alta dosis para CEW.

Otras proteínas se pueden agregar a este par para expandir el espectro del control de insectos. Otra opción de implementación sería usar proteínas las CryIAb y Vip3Ab en combinación con otra, la tercera toxina/gen, y para usar este triple apilado para atenuar el desarrollo de la resistencia en CEW a cualquiera de estas toxinas. Así, otra opción de implementación de la invención objeto sería usar dos, tres, o más proteínas en las regiones de crecimiento de cultivos donde CEW puede desarrollar poblaciones resistentes.

Por consiguiente, la invención objeto también se relaciona en parte a triples apilados o "pirámides" de tres (o más) toxinas, con las toxinas CryIAb y Vip3Ab que son los pares base. En algunas modalidades de pirámide preferidas, las proteínas seleccionadas proporcionan la acción no competitiva contra CEW.

Las plantas (y la extensión en acres plantada con tales plantas) que producen cualquiera de las combinaciones objetos de proteínas son incluidas dentro del alcance de la invención objeto. Las toxinas/genes adicionales se pueden también agregar, pero los apilados particulares discutidos antes ventajosamente y sorpresivamente proporcionan múltiples modos de acción contra CEW. Esto puede ayudar a reducir o a eliminar el requerimiento para la extensión en acres de refugio. Un campo así plantado sobre 10 acres es así incluido dentro de la invención objeto.

GENBANK se puede también usar para obtener las secuencias para cualquiera de los genes y las proteínas descritas o mencionadas en la presente.

Las combinaciones de proteínas descritas en la presente se pueden usar para controlar plagas de lepidópteros. Los lepidópteros adultos, por ejemplo, mariposas y polillas, sobre todo la alimentación en el néctar de flor y son un efector significante de la polinización. Casi todas las larvas de lepidóptero, es decir, orugas, se alimentan de plantas, y muchas son plagas serias. Las orugas se alimentan en o dentro del follaje o en las raíces o el tallo de una planta, privando la planta de nutrientes y a menudo destruyen la estructura de soporte físico de la planta. Adicionalmente, las orugas se alimentan de la fruta, los tejidos, y los granos almacenados y las harinas, arruinando estos productos para la venta o disminuyendo seriamente su valor. Como se usa en la presente, la referencia a las plagas de lepidóptero se refiere a varias etapas de vida de la plaga, incluyendo las etapas larvales.

Algunas toxinas quiméricas de la invención objeto comprenden una porción de toxina base de terminal N completa de una toxina Bt y, en un cierto punto más allá del extremo de la porción de la toxina base, la proteína tiene una transición a una secuencia de protoxina heteróloga. La porción de toxina insecticidamente activa de terminal N de una toxina Bt se menciona como la toxina "base". La transición del segmento de toxina base al segmento de protoxina heteróloga puede ocurrir en aproximadamente la unión de toxina/protoxina o, alternativamente, en una porción de la protoxina nativa (que se extiende más allá de la porción de toxina base) se puede conservar, con la transición a la porción de protoxina heteróloga que ocurre corriente abajo.

Como un ejemplo, una toxina quimérica de la invención objeto, es una porción de toxina base completa de CryIAb (aproximadamente los primeros 600 aminoácidos) y una protoxina heteróloga (el resto de la molécula de terminal C). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina se deriva de otra toxina de proteína CryIAb.

Un experto en esta técnica apreciará que las toxinas Bt, incluso dentro de cierta clase como CryIA, variarán hasta cierto punto en longitud y la localización exacta de la transición desde la porción de toxina base a la porción de protoxina. Comúnmente, las toxinas CryIAb son de aproximadamente 1150 a aproximadamente 1200 aminoácidos en longitud. La transición desde la porción de toxina base a la porción de protoxina comúnmente ocurrirá de entre aproximadamente 50% a aproximadamente 60% de la toxina de longitud completa. La toxina quimérica de la invención objeto incluirá la extensión completa de esta porción de toxina base de terminal N. Así, la toxina quimérica comprenderá por lo menos aproximadamente 50% de la longitud completa de la proteína de la toxina CryIAb Bt. Esto será comúnmente de por lo menos aproximadamente 590 aminoácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la extensión completa de la porción de protoxina CryIAb se extiende desde el extremo de la porción de toxina base a la terminal C de la molécula.

Genes v toxinas. Los genes y las toxinas útiles de acuerdo con la invención objeto incluyen no solamente las secuencias de longitud completa descritas sino también los fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes, y proteínas de fusión que conservan la actividad pesticida característica de las toxinas ejemplificadas específicamente en la presente. Como se usa en la presente, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican las toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Como se usa en la presente, el término "toxinas equivalentes" se refiere a las toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas objetivo como las toxinas reivindicadas.

Como se usa en la presente, los límites representan aproximadamente 95% (CryIAb y Vip3Ab), 78% (CryIF y Vip3A), y 45% (Cry1 y Vip3) de identidad de secuencia, por "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology y Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos cortes se pueden también aplicar a las toxinas base solamente (para CryIAb, por ejemplo). Las proteínas para uso de acuerdo con la invención objeto pueden ser, por ejemplo, por lo menos 75%, 85%, 90%, 95%, o 99% (y cualquier incremento de número entero dentro de este intervalo) idénticas (identidad del aminoácido) con una proteína ejemplificada o sugerida específicamente en la presente. Esto incluye las proteínas codificadas por polinucleótidos/ADN para uso de acuerdo con la invención objeto.

Debe ser evidente para un experto en la técnica que los genes que codifican las toxinas activas se pueden identificar y obtener a través de varios medios. Los genes o las porciones de genes específicas ejemplificadas en la presente se pueden obtener de los aislados depositados en un depósito de cultivo. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también se pueden construir sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de gen. Las variaciones de genes se pueden construir fácilmente al usar las técnicas estándar para hacer mutaciones de punto. También, los fragmentos de estos genes se pueden hacer al usar exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de acuerdo con los procedimientos estándar. Por ejemplo, las enzimas como Bal31 o la mutagénesis dirigida al sitio se pueden usar para cortar sistemáticamente los nucleótidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos se pueden también obtener al usar una variedad de enzimas de restricción. Las proteasas se pueden usar para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteína.

Los fragmentos y los equivalentes que conservan la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro del alcance de la invención objeto. También, debido a la redundancia del código genético, una variedad de diferentes secuencias de ADN puede codificar las secuencias de aminoácidos descritas en la presente. Está dentro de la experiencia de un experto entrenado en la técnica crear estas secuencias de ADN alternativa que codifican las mismas, o esencialmente las mismas, toxinas. Estas secuencias de ADN variante están dentro del alcance de la invención objeto. Como se usa en la presente, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a las secuencias que tienen sustituciones, supresiones, adiciones, o inserciones del aminoácido que no afecten materialmente la actividad pesticida. Los fragmentos de los genes que codifican las proteínas que conservan la actividad pesticida también se incluyen en esta definición.

Un método adicional para identificar los genes que codifican las toxinas y las porciones de genes útiles de acuerdo con la invención objeto es a través del uso de sondas de oligonucleótido. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de una etiqueta apropiada o se pueden hacer intrínsecamente fluorescentes como se describe en el Número de Solicitud Internacional WO93/16094. Como es bien conocido en la técnica, si la molécula de sonda y la muestra de ácido nucleico hibridizada mediante la formación de un enlace fuerte entre las dos moléculas, puede razonablemente ser asumido que la sonda y la muestra tienen homología sustancial.

Preferiblemente, la hibridación es conducida bajo condiciones rigurosas mediante las técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Keller, G. FL, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones de sal y de combinaciones de temperatura son como sigue (en orden creciente de rigurosidad): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42°C; 0.1X SSPE o SSC a 42°C; 0.1X SSPE o SSC a 65°C. La detección de la sonda proporciona los medios para determinar de una manera conocida si ha ocurrido la hibridación. Tal análisis de sonda proporciona un método rápido para identificar genes que codifican toxinas de la invención objeto. Los segmentos de nucleótidos que se usan que como sondas de acuerdo con la invención se pueden sintetizar al usar un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Estas secuencias de nucleótidos se pueden también usar como cebadores de PCR para amplificar genes de la invención objeto.

Toxinas variantes. Ciertas toxinas de la invención objeto se han ejemplificado específicamente en la presente. Puesto que estas toxinas son simplemente ejemplares de las toxinas de la invención objeto, debe ser fácilmente evidente que la invención objeto comprende toxinas variantes o equivalentes (y las secuencias de nucleótidos que codifican las toxinas equivalentes) que tienen la misma o similar actividad pesticida de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología del aminoácido con una toxina ejemplificada. Esta homología del aminoácido será comúnmente mayor del 75%, preferiblemente será mayor del 90%, y más preferiblemente será mayor del 95%. La homología del aminoácido será mayor en las regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o están implicadas en la determinación de la configuración tridimensional que es en última instancia responsable de la actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones del aminoácido son aceptables y pueden ser esperadas si estas sustituciones son en las regiones que no son críticas para actividad o son las sustituciones del aminoácido conservadoras que no afectan a la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden colocar en las siguientes clases: polar, básica no polar, ácida no cargadas. Las sustituciones conservadoras por lo cual un aminoácido de una clase es sustituido con otro aminoácido del mismo tipo cae dentro del alcance de la invención objeto siempre y cuando la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. A continuación esta un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

A veces, las sustituciones no-conservadoras pueden también hacerse. El factor crítico es que estas sustituciones no deben disminuir significativamente la actividad biológica de la toxina.

Anfitriones recombinantes. Los genes que codifican las toxinas de la invención objeto se pueden introducir en una amplia variedad de anfitriones microbianos o de plantas. La expresión del gen de toxina da lugar, directamente o indirectamente, en la producción y mantenimiento intracelular del pesticida. La transferencia conyugal y la transferencia recombinante se pueden usar para crear a una cepa Bt que exprese ambas toxinas de la invención objeto. Otros organismos hospedadores se pueden también transformar con uno o ambos genes de toxina después usados para lograr el efecto sinérgico. Con los anfitriones microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden ser aplicados al lugar de la plaga, donde proliferarán y serán injeridos. El resultado es el control de la plaga. Alternativamente, el microbio que aloja el gen de toxina puede ser tratado bajo condiciones que prolonguen la actividad de la toxina y estabilicen la célula. La célula tratada, que conserva la actividad tóxica, después se puede aplicar al ambiente de la plaga objetivo.

Donde el gene de toxina Bt se introduce a través de un vector adecuado en un anfitrión microbiano, y dicho anfitrión se aplica al ambiente en un estado vivo, es esencial que se usen ciertos microbios hospedadores. Se seleccionan los anfitriones de microorganismos que se conocen por ocupar la "fitósfera" (filoplano, filósfera, rizósfera, y/o rizoplano) de una o más cosechas de interés. Estos microorganismos se seleccionan por ser capaces de competir satisfactoriamente en el ambiente particular (cosecha y otros hábitats de insecto) con microorganismos tipo silvestre, proporcionados para el mantenimiento y la expresión estables del gen que expresa el pesticida de polipéptido, y, deseablemente, proporcionan la protección mejorada del pesticida de la degradación e inactivación ambientales.

Un gran número de microorganismos se conocen para habitar el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizósfera (las raíces de la planta circundantes del suelo) de una amplia variedad de cosechas importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. De interés particular son los microorganismos, como bacterias, por ejemplo, los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, particularmente levadura, por ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium . De interés particular son tales especies bacterianas de fitósfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, y Azotobacter vinlandii; y especies de levaduras como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. De interés particular son los microorganismos pigmentados.

Una amplia variedad de métodos está disponible para introducir un gen Bt que codifica una toxina en un anfitrión de microorganismo bajo condiciones que permitan el mantenimiento y la expresión estables del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el Número de Patente Norteamericana 5,135,867, que se incorpora en la presente por referencia.

Tratamiento de células. El Bacillus thuringiensis o células recombinantes que expresan las toxinas Bt pueden ser tratadas para prolongar la actividad de la toxina y para estabilizar la célula. La microcápsula de pesticida se forma para comprender la toxina o las toxinas Bt dentro de una estructura celular que se ha estabilizado y protegerá la toxina cuando la microcápsula se aplica al ambiente de la plaga objetivo. Las células hospedadoras adecuadas pueden incluir procariotas o eucariotas, normalmente siendo limitadas a las células que no produzcan sustancias tóxicas a organismos mayores, como mamíferos. Sin embargo, los organismos que producen sustancias tóxicas a organismos mayores podrían ser usados, donde están inestables las sustancias tóxicas o el nivel de aplicación suficientemente bajo en cuanto a evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un anfitrión mamífero. Como anfitriones, de interés particular serán las procariotas y las eucariotas inferiores, como hongos.

La célula estará intacta y estará generalmente sustancialmente en la forma proliferativa cuando se tratada, en lugar de una forma de espora, aunque a veces las esporas pueden ser empleadas.

El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene el gen o los genes de la toxina B.t., puede ser mediante el producto químico o medios físicos, o por una combinación de producto químico y/o medios físicos, siempre y cuando la técnica no afecte deletéreamente las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad celular de proteger la toxina. Los ejemplos de reactivo químicos son agentes de halogenación , particularmente halógeno de número atómico 17-80. Más particularmente, el yodo se puede usar bajo condiciones ligeras y por suficiente tiempo para alcanzar los resultados deseados. Otras técnicas adecuados incluyen el tratamiento con aldehidos, como glutaraldehído glutárico; antiinfecciosos, como cloruro de zefirán y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes, como isopropilo y etanol; varios fijadores histológicos, como yodo de Lugol, fijador de Bouin, varios ácidos y fijador de Helly (Ver: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se administra al ambiente del anfitrión. Los ejemplos de los medios físicos son radiación de longitud de onda corta como radiación de rayos gamma y radiación de rayos X, congelación, radiación UV, liofilización, y similares. Los métodos para el tratamiento de células microbianas se describen en los Números de Patentes Norteamericanas 4,695,455 y 4,695,462, que sr incorporan en la presente por referencia.

Las células generalmente tendrán una estabilidad estructural mejorada que mejorará la resistencia a las condiciones ambientales. Donde el pesticida está en una proforma, el método de tratamiento de la célula se debe seleccionar para no inhibir el proceso de la proforma a la forma madura del pesticida medíante el patógeno de plaga objetivo. Por ejemplo, el formaldehído reticulará las proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida de polipéptido. El método de tratamiento debe conservar por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o la bioactividad de la toxina.

Las características de interés particular en seleccionar una célula hospedadora con el propósito de producción incluyen la facilidad de introducir el gen o genes B.t. en el anfitrión, la disponibilidad de los sistemas de expresión, la eficacia de expresión, la estabilidad del pesticida en el anfitrión, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para uso como una microcápsula de pesticida incluyen calidades protectoras para el pesticida, como paredes celulares gruesas, pigmentación, y empaquetamiento o formación intracelular de cuerpos de inclusión; supervivencia en ambientes acuosos; carencia de toxicidad mamífera; atracción a plagas para ingestión; facilidad de eliminación y de fijación sin daño a la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen la facilidad de la formulación y el manejo, economía, estabilidad de almacenamiento, y similares.

Crecimiento de células. El anfitrión celular que contiene el gene o los genes insecticidas B.t. se puede hacer crecer en cualquier medio nutriente adecuado, donde el constructo de ADN proporciona una ventaja selectiva, previendo un medio selectivo de manera que sustancialmente todo o todas las células conserve el gen B.t. Estas células se pueden entonces cosechar de acuerdo con maneras convencionales. Alternativamente, las células se pueden tratar antes de la cosecha.

Las células B.t. que producen las toxinas de la invención se pueden cultivar al usar los medios de la técnica y las técnicas de fermentación estándar. Al finalizar el ciclo de fermentación las bacterias pueden ser cosechadas primero separando las esporas y cristales de B.t. a partir del caldo de fermentación mediante los medios bien conocidos en la técnica. Las esporas y cristales de B.t. recuperadas se pueden formular en un polvo humectable, un concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones mediante la adición de tensioactivos, dispersantes, portadores inertes, y otros componentes para facilitar el manejo y aplicación para las plagas objetivo particulares. Estas formulaciones y procedimientos de aplicación todos son bien conocidos en la técnica.

Formulaciones. Los gránulos de cebo formulados que contienen un atrayente y esporas, cristales, y toxinas de los aislados de B.t., o microbios recombinantes que comprenden los genes obtenibles de los aislados de B.t. descritos en la presente, se pueden aplicar al suelo. El producto formulado se puede también aplicar como un tratamiento de recubrimiento de semillas o de raíz o tratamiento de planta total en etapas posteriores del ciclo de cosecha. Los tratamientos de planta y del suelo de las células B.t. se pueden emplear como polvos humectables, gránulos o polvo, mediante la mezcla con varios materiales inertes, como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz, cáscaras de arroz, cáscaras de nuez pulverizados, y similares). Las formulaciones pueden incluir los adyuvantes adhesivos esparcidores, agentes estabilizadores, otros aditivos pesticidas, o tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser a base acuosa o no acuosa y empleadas como espuma, geles, suspensiones, concentrados emulsionables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes, o polímeros.

Como sería apreciado por un experto en la técnica, la concentración pesticida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o ser usado directamente. El pesticida estará presente en por lo menos 1% en peso y puede ser 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán de aproximadamente 1-95% en peso del pesticida mientras que las formulaciones líquidas serán generalmente de aproximadamente 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán generalmente de aproximadamente 102 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones serán administradas de aproximadamente 50 mg (líquidas o secas) a 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones se pueden aplicar al ambiente de la plaga de lepidóptero, por ejemplo, el follaje o el suelo, mediante pulverización, espolvoreo, aspersión, o similares.

Transformación de la planta. Un anfitrión recombinante preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la invención objeto es una planta transformada. Los genes que codifican las proteínas de la toxina Bt, como se describe en la presente, se pueden insertar en células de planta al usar una variedad de técnicas que sean bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación comprende un sistema de replicación en Escherichia Coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas están disponibles para la preparación, para la inserción de genes extranjeros en plantas mayores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, inter alia. Por consiguiente, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína de la toxina Bt se puede insertar en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para la transformación en E. coli. Las células E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, después se cosechan y lisan. Se recupera el plásmido. El análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis, y otros métodos biológicos bioquímicos-moleculares se realizan generalmente como los métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada se puede dividir y unir a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido se puede clonar en los mismos u otros plásmidos. Dependiendo del método de inserción de genes deseado en la planta, otras secuencias de ADN pueden ser necesarias. Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri se usa para la transformación de la célula de planta, después por lo menos el extremo derecho, pero a menudo extremo derecho e izquierdo del plásmido Ti o Ri de ADN-T, tiene que ser unido como la región de flanqueo de los genes que se insertarán. El uso de T-DNA para la transformación de células de planta se ha investigado intensivamente y se ha descrito suficientemente en EP 120 516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), y An et al., (1985), y está establecido en la técnica.

Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma de planta, es relativamente estable. El vector de transformación contiene normalmente un marcador seleccionable que confiera a la resistencia de células de planta transformadas a un biocida o un antibiótico, tal como Bialaphos, kanamicina, G418, Bleomicina, o Higromicina, ínter alia. El marcador individualmente empleado debe permitir por consiguiente la selección de células transformadas en lugar de las células que no contienen el ADN insertado.

Un gran número de técnicas están disponibles para insertar el ADN en una célula hospedadora de planta. Esas técnicas incluyen la transformación con ADN-T al usar Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como el agente de transformación, fusión, inyección, biolístico (bombardeo de micropartícula), o electroporación así como otros métodos posibles. Si las agrobacterias se usan para la transformación, el ADN que se insertará tiene que ser clonado en plásmidos especiales, a saber, ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios pueden ser integrados en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga debido a las secuencias que son homologas a las secuencias en el ADN-T.

El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse en Agrobacterias. El vector intermedio se puede transferir en Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse en E. coli y en Agrobacterias. Comprenden un gen marcador de selección y un enlazador o un polienlazador que son enmarcados por las regiones de extremo del ADN-T derechas e izquierdas. Pueden ser transformados directamente en Agrobacterias (Holsters et al., 1978). La Agrobacterium usada como la célula hospedadora es para comprender un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula de planta. El ADN-T adicional puede ser contenido. La bacteria así transformada se usa para la transformación de células de planta. Los explantes de planta se pueden cultivar ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula de planta. Las plantas enteras se pueden entonces regenerar a partir del material de planta infectado (por ejemplo, piezas de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también de protoplastos o de células cultivadas por suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así que obtenidas se pueden entonces probar para la presencia de ADN insertado. No se hacen ningunas demandas especiales de los plásmidos en el caso de la inyección y la electroporación. Es posible usar plásmidos ordinarios, como, por ejemplo, derivados de pUC.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera habitual. Pueden formar células germinales y transmitir los rasgos transformados a las plantas de progenie. Tales plantas se pueden crecer de la manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.

En una modalidad preferida de la invención objeto, las plantas serán transformadas con los genes donde el uso del codón se ha optimizado para las plantas. Ver, por ejemplo, el Número de Patente Norteamericana 5380831, que se incorpora por este medio por referencia. Mientras que algunas toxinas truncadas se ejemplifican en la presente, es bien conocido en la técnica de Bt que las toxinas tipo kDa 130 (longitud completa) tiene una mitad de terminal N que es la toxina base, y una mitad de terminal C que es la protoxina "cola". Así, las "colas" apropiadas se pueden usar con las toxinas truncadas/base de la invención objeto. Ver por ejemplo el Número de Patente Norteamericana 6218188 y el Número de Patente Norteamericana 6673990. Además, los métodos para crear los genes Bt sintéticos para uso en plantas se conocen en el técnica (Stewart and Burgin, 2007). Un ejemplo no limitante de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen expresable de planta que codifica una proteína CryIAb, y adicionalmente comprende un segundo gen expresable de planta que codifica una proteína Vip3Ab.

La transferencia (o introgresión) de los rasgos determinados por CryIAb y Vip3Ab en líneas de maíz innato se puede alcanzar mediante la crianza de selección recurrente, por ejemplo, mediante retrocruzamiento. En este caso, madre recurrente deseada primero se cruza a un donante endogámico (la madre no recurrente) que lleve los genes apropiados para los rasgos determinados por CryIF y Vip3Ab. Entonces la progenie de esta cruza de entones de nuevo de acoplan a la madre recurrente seguido por la selección en la progenie resultante para los rasgos deseados que serán transferidos de la madre no recurrente. Después de tres, preferiblemente cuatro, preferiblemente cinco o más generaciones de retrocruza con la madre recurrente con la selección para los rasgos deseados, la progenie será heterocigótica para los lugares que controlan los rasgos que son transferidos, pero serán como la madre recurrente para la mayoría o casi todos los otros genes (ver, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4a Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376).

Estrategias de Manejo de Resistencia del Insecto (IRM, por sus siglas en inglés). Roush et al., por ejemplo, describe estrategias de dos toxina, también llamadas "piramidales" o "apilado", para el control de cosechas transgénicas insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

En su sitio Web, United States Environmental Protection Agency (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requerimientos para proporcionar refugios no transgénicos (es decir, sin B.t.) (Una sección de cosechas/maíz sin BT) para uso con cosechas transgénicas que producen una sola proteína activa Bt contra plagas objetivo.

"Los requerimientos estructurados específicos para productos de maíz Bt protegidos contra barrenador de maíz (CryIAb o CryIF) son como sigue: Refugios estructurados: 20% de Refugio de maíz Bt sin Lepidóptero en Correa de Maíz; 50% de Refugio de Bt sin Lepidóptero en correa de Algodón Bloques Interno (es decir, dentro del campo de Bt) Externo (es decir, campos separados dentro ½ milla (¼ de milla si es posible) del campo de Bt para maximizar el acoplamiento al azar) Tiras en el Campo Las tiras deben ser por lo menos 4 filas de de ancho (preferiblemente 6 filas) para reducir los efectos del movimiento larval" Además, la Asociación de Cultivadores de Maíz Nacional, en su sitio Web: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) también proporciona la guía similar con respecto a los requerimientos de refugio. Por ejemplo: "Requerimientos del IRM del Barrenador de Maíz: - Planta por lo menos 20% de sus acres de maíz a los híbridos de refugio - En regiones de producción de algodón, el refugio debe ser 50% - Debe ser plantado dentro de 1/2 milla de los híbridos de refugio - El refugio se puede plantar como tiras dentro del campo de Bt; las tiras de refugio deben ser por lo menos 4 filas de ancho El refugio se puede tratar con los pesticidas convencionales solamente si los umbrales económicos se alcanzan para el insecto objetivo - los insecticidas fumigables basados en Bt no se pueden usar en el maíz de refugio - El refugio apropiado se debe plantar en cada granja con maíz Bt" Como se indica por Roush et al. (en las páginas 1780 y 1784 columna derecha, por ejemplo), el apilado o pirámide de dos diferentes proteínas cada una efectiva contra las plagas objetivo y con poco o nada de resistencia cruzada pueden permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para un apilado acertado, un tamaño de refugio de menos del 10% de refugio, puede proporcionar el manejo de resistencia comparable de aproximadamente 50% de refugio para un solo rasgo (no piramidal). Para los productos de maíz Bt piramidales actualmente disponibles, la Agencia de Protección Ambiental de los E.E.U.U. requiere significativamente menos refugio estructurado (generalmente 5%) de maíz sin Bt se plantó que para los productos de un solo rasgo (generalmente 20%).

Existen varias maneras de proporcionar los efectos de IRM de un refugio, que incluyen varios patrones de plantación geométricos en los campos (como se menciona anteriormente) y las mezclas de semilla en bolsa, como se discute más detalladamente por Roush et al. (supra), y el Número de Patente Norteamericana 6,551,962.

Los porcentajes anteriores, o las relaciones de refugio similares, se pueden usar para los apilados o las pirámides dobles o triples objetivo. Para los apilados triples con tres modos de acción contra una sola plaga objetivo, una meta sería el refugio cero (o refugio menor del 5%, por ejemplo). Esto es particularmente real para la extensión en acres comercial - de sobre 10 acres por ejemplo.

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales, y publicaciones referidas o citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad al grado que no son contrarias con las enseñanzas explícitas de esta especificación.

A menos que se indique específicamente o implicados, los términos "un", "uno" y "el" se entiende "por lo menos uno" como se usa en la presente.

Los siguientes son ejemplos que ilustran los procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitantes. Todos los porcentajes están en peso y todas las proporciones de mezcla de solventes están en volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas están en grados centígrados.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Resumen de los Ejemplos Los siguientes ejemplos demuestran que Vip3Abl tiene actividad sin resistencia cruzada con CryIAb contra el gusano de la mazorca de maíz (CEW, por sus siglas en inglés), por lo tanto mostrando que estas dos proteínas pueden contrariar el desarrollo de la resistencia en CEW a cualquiera de estas proteínas solamente.

Demostramos además que Vip3Abl es activo contra larvas Plutella xylostella (Linnaeus) (polilla dorso diamantado) y contra larvas Plutella xylostella (Linnaeus) resistentes a CryIAb. En un bioensayo de incorporación de dieta, Vip3Abl es tóxico contra ambas cepas de este insecto.

El soporte adicional para este manejo de resistencia es proporcionado mediante estudios de unión de competición radioetiquetados la usar 125l CryIAb. Los datos se presentan mostrando que el 125l CryIAb radioetiquetado fuertemente y específicamente une a un conjunto particular de proteínas receptoras localizadas en preparaciones de la vesícula de membrana de extremo de cepillo (BBMV, por sus siglas en inglés) del intestino medio de larvas Heliothis zea. La unión del CryIAb radioetiquetado a sus receptores puede ser competitivamente desplazado al usar CryIAb no radioetiquetado en BBMV de este insecto. Sin embargo, Vip3Abl, o en su forma de longitud completa de kDa 85, o cuando es procesado enzimáticamente por la tripsina a un peso molecular más pequeño procesó la proteína, no desplaza la unión de 125l CryIAb de sus receptores de ese insecto. Estos resultados muestran que Vip3Ab ejerce su afecto biológico en un sitio diferente de donde CryIAb se une.

Ejemplo 2 - Purificación y procedimiento de la tripsina de proteínas CryIAb y Vip3Abl.

Los genes que codifican las protoxinas CryIAb y Vip3Abl se expresaron en cepas de expresión de Pseudomonas fluorescens y las proteínas de longitud completa aisladas como cuerpos de inclusión insolubles. Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizados mediante agitación a 37°C en el amortiguador que contiene 20 mM de amortiguador de CAPS, pH 11, + 10 mM de DDT, + 0.1% de 2-mercaptoetanol, durante 2 horas. Se centrifugó la solución a 27,000 x g durante 10 min. a 37°C y se trató el sobrenadante con 0.5% (p/v) de tripsina tratada con TCPK (Sigma). Se incubó esta solución con la mezcla durante 1 hora adicional a temperatura ambiente, se filtró, después se cargó sobre una columna Pharmacia Mono Q 1010 equilibrada con 20 mM de CAPS pH 10.5. Después de lavar la columna cargada con 2 volúmenes de columna de amortiguador, se eluyó la toxina truncada al usar un gradiente lineal de 0 a 0.5 M de NaCI en 20 mM de CAPS a 15 volúmenes de columna a un caudal de 1.0 ml/min. Se eluyeron las proteínas Cry truncadas con tripsina purificada a aproximadamente 0.2-0.3 M de NaCI. Se comprobó la pureza de las proteínas mediante SDS PAGE y con visualización al usar el tinte azul brillante de Coomassie. En algunos casos, se concentraron las fracciones combinadas de la toxina purificada y se cargaron sobre una columna Superóse 6 (1.6 cm de diámetro, 60 cm de largo), y además se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaños. Se combinaron las fracciones que comprenden un solo máximo del peso molecular monomérico, y se concentraron, dando por resultado una preparación mayor del 95% homogéneo para una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 60,000 kDa.

Se alcanzó el procedimiento de Vip3Abl de una manera similar que inicia con la proteína de longitud completa purificada de 85 kDa (DIG-307). Se dializó la proteína (12 mg) en 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio, pH 8.4, después se procesó mediante la adición de 1 mg de tripsina sólida e incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se cargó la solución sobre una columna de intercambio de aniones MonoQ (1 cm de diámetro, 10 cm. de largo), y se eluyó con un gradiente lineal de NaCI a partir de 0 a 500 mM en 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio, pH 8.4 sobre 7 volúmenes de columna. Se supervisó la elución de la proteína mediante SDS-PAGE. La banda procesada principal tenía un peso molecular de 65 kDa, como se determinó mediante SDS-PAGE al usar los estándares de peso molecular para comparación .

Ejemplo 3 - Bioensayo del insecto.

Se probaron las proteínas purificadas para la actividad insecticida en bioensayos conducidos con larvas Plutella xylostella (Linnaeus) neonatas y Heliothis zea en dieta del insecto artificial. Se desarrolló la P. xylostella resistente a CryIA a trasvés de un régimen de prueba de dieta al usar un producto de Bt comercial (DiPel®) y derivado de la cepa NO-QA (Tabashnik et al, 1996; Tabashnik et al, 1997).

Se condujeron los bioensayos del insecto en 128 bandejas de bioensayo de plástico de 128 pozos (C-D International, Pitman, NJ). Cada pozo contuvo 0.5 mi de dieta de multiespecies de lepidópteros (Southland Products, Lake Village, AR). Una alícuota de 40 µ? de la proteína Cry o Vip3Abl purificada se diluyó a varias concentraciones en 10 mM de CAPS, pH 10.5, o se liberó la solución de control mediante la pipeta sobre la superficie de dieta de 1.5 cm2 de cada pozo (26.7 µ?/cm2). Se probaron dieciséis pozos por muestra. El control negativo fue una muestra preliminar de solución amortiguadora que no contenía ninguna proteína. Los controles positivos incluyen preparaciones de CryIAc, o CryIF. Se mantuvieron las bandejas tratadas en una campana de extracción hasta que el líquido en la superficie de dieta se hubiera evaporado o fuera absorbido en la dieta.

Dentro de algunas horas de eclosión, las larvas individuales se recogieron con un cepillo de pelo de camello humedecido y se depositaron en la dieta tratada, una larva por pozo. Los pozos infestados entonces se sellaron con las hojas adhesivas de plástico transparente que son ventilados para permitir el intercambio de gases (C-D International, Pitman, NJ). Las bandejas de bioensayo se mantuvieron bajo condiciones ambientales controladas (28°C, -40% de RH, 16:8 [L:D] fotoperíodo). Después de 5 días, se registraron el número total de insectos expuestos a cada muestra de proteína, el número de insectos muertos, y el peso de insectos de supervivencia.

Ejemplo 4 - Yodación de las toxinas CrIAb.

La toxina base CryIAb truncada de tripsina purificada se yodó al usar Gránulos de Yodo (Pierce). Brevemente, dos Gránulos de Yodo se lavaron dos veces con 500 µ? de PBS (20 mM de fosfato de sodio, 0.15 M de NaCI, pH 7.5), y se colocaron en un tubo de centrífuga de 1.5 mi detrás de la protección de plomo. A este se agregaron 100 µ? de PBS se agregaron al gránulo de yodo. En una capilla y a través del uso de técnicas de manipulación radiactivas apropiadas, se agregaron 0.5 mCi de Na125l (17.4 Ci/mg, Perkin Elmer) a la solución de PBS con el gránulo de yodo. Los componentes se dejaron reaccionar durante 5 minutos a temperatura ambiente, después se agregaron 5 g de CryIAb truncado altamente puro a la solución y se dejó reaccionar durante 3-5 minutos adicionales. Se terminó la reacción al eliminar la solución del gránulo de yodo y aplicándola a una columna de centrifugación para desalación (G-20, GE biosciences) equilibrada en 10 mM de CAPS, pH 10.5. Se lavó el gránulo de yodo dos veces con 50 µ? de PBS y la solución lavada también se aplicó a la columna de desalación. Se eluyó la solución radiactiva a través de la columna de desalación mediante centrifugación a 1,000 x g durante 2 min. Se contó el yodo-CrylAb radioetiquetado 125l en un contador gamma para la cantidad de radiactividad, y la actividad específica se determinó basada sobre una recuperación del 80% presunta de la toxina de entrada.

Ejemplo 5 - Preparación y Fraccionamiento de BBMV Solubilizado.

Los métodos estándar de cuantificación de proteína y la electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida se emplearon como se enseñó, por ejemplo, en Sambrook et al. (Sambrook and Russell, 2001) y sus actualizaciones. Las larvas H. zea instar se hicieron ayunar durante la noche y después se disecaron después de congelar en hielo durante 15 minutos. Se eliminó el tejido del intestino medio de la cavidad corporal, dejando atrás el intestino posterior unido al tegumento. El intestino medio se colocó en un volumen 9X de amortiguador de homogeneización frío (300 mM de manitol, 5 mM de EGTA, 17 mM de base Tris, pH 7.5), complementado con Coctel de Inhibidor de Proteasa (Sigma-Aldrich P-2714) diluido como se recomienda por el proveedor. Se homogeneizó el tejido con 15 pulsaciones de un homogeneizador de tejido de cristal. Se prepararon los BBMV mediante el método de precipitación de MgCI2 de Wolfersberger (Wolfersberger, 1993). Brevemente, se mezcló un volumen de una solución de MgCI2 de 24 mM en 300 mM de manitol con el homogenado del intestino medio, se agitó durante 5 minutos y se dejó reposar en hielo durante 15 min. Se centrifugó la solución a 2,500 x g durante 15 min a 4°C. Se guardó el sobrenadante y se suspendió la pelotilla en el volumen original de 0.5X de amortiguador de homogeneización diluido y se centrifugó de nuevo. Se combinaron los dos sobrenadantes y se centrifugaron a 27,000 x g durante 30 min a 4°C para formar la fracción de BBMV. Se suspendió la pelotilla en amortiguador de BBMV Storage (10 mM de HEPES, 130 mM de KCI, 10% de glicerol, pH 7.4) a una concentración de aproximadamente 3 mg/ml de proteína. Se determinó la concentración de proteína al usar BSA como el estándar.

Se determinó la actividad de la L-leucina-p-nitroanilida aminopeptidasa (una enzima marcadora para la fracción de BBMV) antes de congelar las muestras. Brevemente, se agregaron 50 µ? de L-leucina-p-nitroanilida (1 mg/ml en PBS) a 940 mi 50 mM de HCI de Tris en una cubeta estándar. Se colocó la cubeta en un espectrofotómetro Cary 50 Bio, puesto a cero para la lectura de absorbencia a 405 nm, y se inició la reacción al agregar 10 µ? de homogenado del intestino medio de insecto o la preparación de BBMV de insecto. Se supervisó el aumento en absorbencia a 405 nm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se determinaron la actividad específica del homogenado y las preparaciones de BBMV basadas sobre la cinética del aumento de absorbencia durante el transcurso del tiempo durante un aumento lineal en absorbencia por unidad de proteína total agregada al ensayo basado sobre la siguiente ecuación: AOD/(min*mg) = Proporción de Aminopeptidasa (AOD/ml*min)/[proteína] (mg/ml) La actividad específica de esta enzima aumentó comúnmente comparado 7 veces a la encontrada en la fracción del homogenado del intestino medio de inicio. Se dividieron en alícuotas los BBMV en 250 µ? de muestras, se congelaron instantáneamente en N2 líquido y almacenó a -80°C.

Ejemplo 6 - Electroforesis.

Se condujo el análisis de proteínas mediante SDS-PAGE bajo condiciones reducidas (es decir, en 5% de ß-mercaptoetanol, BME) y desnaturalizantes (es decir, calentado 5 minutos a 90° en presencia de 4% de SDS). Se cargaron las proteínas en pozos de un gel de poliacrilamida de tris-glicina de 4% a 20% (BioRad; Hercules, CA) y se separaron a 200 voltios durante 60 minutos. Se detectaron las bandas de proteínas mediante el manchando con Azul Brillante de Coomassie R-250 (BioRad) durante una hora, y se destiñeron con una solución de 5% de metanol en ácido acético al 7%. Se visualizaron los geles y se analizados al usar un BioRad Fluro-S Multi Imager™. Se determinaron los pesos moleculares relativos de las bandas de proteína mediante la comparación a las movilidades de las proteínas de peso molecular conocidas observadas en una muestra de BenchMark™ Protein Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) cargada en un pozo de gel.

Ejemplo 7 - Unión del CryIAb 125l etiquetado a BBMV de larvas H. zea.

Se generó una curva de saturación para determinar la cantidad óptima de proteína de BBMV para uso en los ensayos de unión a la proteína de la toxina base Cry. Se incubaron 0.5 nM de proteína de la toxina base CryIAb 125l radioetiquetable durante 1 hora a 28° en amortiguador de unión (8 mM de NaHP04, 2 m de KH2P04, 150 mM de NaCI, 0.1% de BSA, pH7.4) con cantidades de proteína de BBMV que oscila de 0 g/ml, a 500 g/ml (volumen total de 0.5 mi). Se separó la proteína de la toxina base Cry 12Sl-etiquetada unida a las proteínas de BBMV de la fracción no unida mediante muestrear 150 µ? de la mezcla de reacción en triplicado en los tubos de centrífuga de 1.5 mi separados y se centrifugaron las muestras a 14,000 x g durante 8 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante suavemente y se lavó la pelotilla tres veces con amortiguador de unión frío. Se cortó la parte inferior del tubo de centrífuga que contenía la pelotilla, se colocó en un tubo de cultivo de cristal de 13 x 75-mm y se contaron las muestras durante 5 minutos cada una en el contador gamma. El CPM (cuentas por minuto) obtenido menos el CPM antecedente (reacción sin la proteína de BBMV) se trazó contra la concentración de proteína de BBMV. Se determinó la concentración óptima de la proteína de BBMV para usar en el análisis de unión para ser 150 pg/ml.

Se condujeron los ensayos de unión de competición homologa y heteróloga al usar 150 pg/ml de proteína de BBMV y 0.5 nM de la proteína de la toxina base Cry radioetiquetable 25l. Las concentraciones de la proteína de la toxina base Cry no radioetiquetable competitiva a la mezcla de reacción agregadas se extendieron de 0.045 nM a 1000 nM y se agregaron al mismo tiempo que la proteína de la toxina base Cry radioetiquetable, para asegurar la competición de unión verdadera. Se realizaron las incubaciones durante 1 hora a 28° y se midió la cantidad de la proteína de la toxina base Cry etiquetada con 125l unida al BBMV (unión total) como se describe anteriormente. Se representó la unión no específica por las cuentas obtenidas en presencia de 1,000 nM de la proteína de la toxina base Cry no radioetiquetable homologa. Se midió la unión específica al restar el nivel de unión no específica obtenida de la unión total. Se consideró una unión específica en ciento por ciento ser la cantidad de unión obtenida en ausencia de cualquier ligando competidor menos la cantidad de unión obtenida en presencia de 1,000 nM de la proteína de la toxina base Cry no radioetiquetable homologa. Se comparó la cantidad de desplazamiento por los ligandos heterólogos a 100% d,e unión específica de 125l CryIAb a su receptor.

Ejemplo 8 - Resumen de Resultados Se probaron los resultados de mortalidad de los bioensayos de la proteína Vip3Abl de longitud completa en una variedad de dosis contra larvas P. xylostella resistentes a tipo natural y Cry A, y las larvas H. zea se muestran en la Figura 1. El porcentaje de inhibición de crecimiento que resulta de los bioensayos se trazó en la Figura 2. Las concentraciones se Vip3Abl probadas fueron 9,000, 3,000, 1,000, 333, 111, 37, y 12 ng/cm2. La toxina fue más activa contra las larvas P. xylostella, que muestra una respuesta a dosis de mortalidad equivalente para las larvas resistentes al tipo silvestre y CryIAb. El LC-50 para P. xylostella fue aproximadamente 200 ng/cm2. Se observó la inhibición del crecimiento contra larvas H. zea, aunque concentraciones mayores se requieren para dar lugar a la mortalidad en el período de tiempo del ensayo. El de alto nivel de inhibición del crecimiento observado contra larvas H. zea sugiere que estos insectos progresarían muy probablemente a la mortalidad si se dejan durante un período de tiempo más largo.

Se condujeron los ensayos de unión de competición radioetiquetable para determinar si Vip3Abl truncado de tripsina compite con la unión de las proteínas del receptor CryIAb radioetiquetable 125l contenidas en H. zea de BBMV.

Se condujeron los experimentos que comparan la capacidad de Vip3Abl de competir con la unión de 125l CryIAb en BBMV preparados a partir de larvas H. zea (Figura 3). En las preparaciones de BBMV, se mostró el CryIAb no radioetiquetado para efectivamente competir fuera de la unión de 125l CryIAb de las proteínas de BBMV de H. zea, pero Vip3Abl no dio lugar a ningún desplazamiento del ligando CryIAb radioetiquetado de estas preparaciones de BBMV. Estos tres estudios demuestran que Vip3Abl no compite con la unión de CryIAb en larvas H. zea.

Los insectos pueden desarrollar resistencia a la toxicidad de las proteínas Cry a través de un número de diferentes mecanismos bioquímicos, pero el mecanismo más común es debido a una reducción en la capacidad de la proteína de la toxina Cry para unir a su receptor específico en el intestino del insecto (Heckel et al, 2007; Tabashnik et al., 2000; Xu et al, 2005). Esto puede ser llevado sobre el pensamiento de pequeñas mutaciones de punto, supresiones de gen grandes, o sin embargo otros mecanismos genéticos o bioquímicos.

Vip3Abl complementa la actividad de CryIAb, en que tiene actividad biológica contra insectos similares, sin embargo, no se une a los mismos sitios del receptor, ya que estas proteínas Cry, y así no son afectadas por los mecanismos de resistencia que implicarían la reducción de la unión de la toxina Cry. Concluimos de estos estudios que Vip3Abl es una excelente toxina de insecto a combinar con CryIAb como un proceso de manejo de resistencia del insecto para proporcionar actividad biológica contra los insectos que pudieron haber desarrollado resistencia a cualquiera de estas proteínas, y también para prevenir la supervivencia de los insectos resistentes a CryIA. Puesto que Vip3Abl es tóxico a los insectos resistentes a CryIA, esta toxina sería un socio de apilado excelente a combinar con CryIAb para suministrar la actividad contra los insectos resistentes y naturales.

Lista de Referencias Heckel.D.G., Gahan.L.J., Baxter, S.W., Zhao.J.Z., Shelton.A.M., Gould.F., and Tabashnik.B.E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 95, 192-197.

Luo, K., Banks, D., y Adang, M.J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four bacillus thuringiensis cryl delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol. 65, 457-464.

Palmer, M . , Buchkremer, M, Valeva, A, y Bhakdi, S.

Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide. Analytical Biochemistry 253, 175-179. 1997. Ref Type: Journal (Full) Sambrook, J. y Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory).

Schlenz, M. L., Babcock, J. M., y Storer, N. P. Response of CrylF-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry 1A.105 and Cryl2Ab2. DAI 0830, 2008. Indianapolis, Dow AgroSciences. Derbi Report.

Sheets, J. J. and Storer, N. P. Analysis of CryIAc Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae (Heleothis zea). Interactions with Cry IF Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianapolis, Dow AgroSciences.

Tabashnik, B.E., Liu, Y.B., Finson, N., Masson, L., y Heckel, D.G. (1997). One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 94, 1640-1644.

Tabashnik, B.E., Malvar, T., Liu, Y.B., Finson, N., Borthakur, D., Shin, B.S., Park, S.FL, Masson, L., de Maagd, R.A., y Bosch, D. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2839-2844.

Tabashnik, B.E., Roush, R.T., Earle, E.D., y Shelton, A.M. (2000). Resistance to Bt toxins. Science 287, 42.

Wolfersberger, M.G. (1993). Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth (Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 24, 139-147.

Xu, X., Yu, L., y Wu, Y. (2005). Disruption of a cadherin gene associated with resistance to CrylAc {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armígera. Appl Environ icrobiol 71, 948-954.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Una planta transgénica que comprende el ADN que codifica una proteína insecticida Vip3Ab y el ADN que codifica una proteína insecticida CryIAb.

2. La semilla de una planta de la reivindicación 1.

3. Una planta de la reivindicación 1, donde dicho ADN se introgresó en dicha planta.

4. La semilla de una planta de la reivindicación 3.

5. Un campo de plantas que comprenden plantas de refugio sin Bt y una pluralidad de plantas de la reivindicación 1, donde dichas plantas de refugio comprenden menos del 40% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

6. El campo de plantas de la reivindicación 5, donde dichas plantas de refugio comprenden menos del 30% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

7. El campo de plantas de la reivindicación 5, donde dichas plantas de refugio comprenden menos del 20% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

8. El campo de plantas de la reivindicación 5, donde dichas plantas de refugio comprenden menos del 10% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

9. El campo de plantas de la reivindicación 5, donde dichas plantas de refugio comprenden menos del 5% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.

10. El campo de plantas de la reivindicación 5, donde dichas plantas de refugio están en bloques o tiras.

11. Una mezcla de semillas que comprenden las semillas de refugio de las plantas de refugio sin Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 2, donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 40% de todas las semillas en la mezcla.

12. La mezcla de semillas de la reivindicación 11, donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 30% de todas las semillas en la mezcla.

13. La mezcla de semillas de la reivindicación 11, donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 20% de todas las semillas en la mezcla.

14. La mezcla de semillas de la reivindicación 11, donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 10% de todas las semillas en la mezcla.

15. La mezcla de semillas de la reivindicación 11, donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 5% de todas las semillas en la mezcla.

16. Un método para manejar el desarrollo de la resistencia mediante insectos Helicoverpa zea a una proteína insecticida derivada de un Bacillus thuringiensis, dicho método que comprende plantar las semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 5.

17. Una composición para controlar insectos Helicoverpa zea, dicha composición que comprende células que expresan cantidades efectivas de una proteína insecticida CryIAb y una proteína insecticida Vip3Ab.

18. Una composición de la reivindicación 17 que comprende un anfitrión transformado para expresar una proteína insecticida CryIAb y una proteína insecticida Vip3Ab, donde dicho anfitrión es un microorganismo o una célula de planta.

19. Un método para controlar insectos Helicoverpa zea, dicho método que comprende presentar a dichos insectos una cantidad efectiva de una composición de la reivindicación 17.

20. Un campo de la reivindicación 5, donde dichas plantas ocupan más de 10 acres.

21. Una planta de la reivindicación 1, donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, sojas, y algodón.

22. Una planta de la reivindicación 1, donde dicha planta es una planta de maíz.

23. Una célula de planta de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 21, y 22, donde dicha célula de planta comprende dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryIAb y dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida Vip3Ab, donde dicha proteína insecticida CryIAb es por lo menos 95% idéntica con la SEC ID NO: 1 y/o SEC ID NO: 3, y dicha proteína insecticida Vip3Ab es por lo menos 95% idéntica con la SEC ID NO: 2.

24. Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 21, y 22, donde dicha proteína insecticida CryIAb comprende la SEC ID NO: 1 y/o la SEC ID NO: 3, y dicha proteína insecticida Vip3Ab comprende la SEC ID NO: 2.

25. Una célula de planta que comprende el ADN que codifica una proteína insecticida Vip3Ab y el ADN que codifica una proteína insecticida CrylAb.