MX2013005044A - Preparaciones de yogurt para beber que contienen micro-organismos probioticos no replicantes. - Google Patents
Preparaciones de yogurt para beber que contienen micro-organismos probioticos no replicantes.Info
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Abstract
La presente invención se refiere al campo de las composiciones de yogurt para beber. En particular, la presente invención provee composiciones de yogurt para beber que comprenden micro-organismos probióticos no replicantes. Por ejemplo, estos micro-organismos probióticos no replicantes pueden ser micro-organismos probióticos bioactivos tratados térmicamente. La presente invención también se refiere a los beneficios a la salud que proporcionan estos micro-organismos probióticos no replicantes.
Description
PREPARACIONES DE YOGURT PARA BEBER QUE CONTIENEN MICROORGANISMOS PROBIÓTICOS NO REPLICANTES
La presente invención se refiere al campo de las composiciones de yogurt para beber o bebible. En particular, la presente invención provee composiciones de yogurt para beber que comprenden micro-organismos probióticos no replicantes. Por ejemplo, estos micro-organismos probióticos no replicantes pueden ser micro-organismos probióticos bioactivos tratados térmicamente. La presente invención también se refiere a los beneficios a la salud que proveen estos micro-organismos probióticos no replicantes.
Los beneficios a la salud de los probióticos son por su parte bien aceptados en el estado del arte y se resumieron por, por ejemplo, Blum et al. en Curr. Issues Intest. Microbiol. 2003 Sep; 4(2):53-60. A menudo los probióticos son administrados junto con prebióticos en formulaciones simbióticas las que incluso pueden tener beneficios mejorados para la salud.
Por ejemplo, generalmente los probióticos son comercializados en el marco de los productos de yogurt y los productos de yogurt para beber.
Las composiciones de yogurt para beber parecen ser particularmente preferidas, ya que ellas pueden ser fácilmente consumidas en la mañana y/o a lo largo del día como un snack delicioso y saludable.
Se sabe que las bacterias probióticas son capaces de adherirse a las células intestinales humanas y de excluir las bacterias patógenas sobre las células intestinales humanas. Para tener esta actividad, las bacterias probióticas deben permanecer viables en el producto hasta que sea consumido. Esto es un desafío para la industria y transforma la adición de los probióticos a los productos alimenticios en un asunto no trivial.
En particular, para los productos que son calentados durante la producción, y/o que pueden tener períodos de almacenamiento superiores antes de que sean consumidos, tal como los productos estables en el almacenamiento, es comúnmente considerado difícil poder asegurar que los probióticos se mantienen viables en el producto hasta el consume y además asegurar, que estos también llegan viables al tracto intestinal.
Sería deseable tener una composición de yogurt para beber disponible que sea capaza de entregar beneficios de probiótico incluso luego de tiempos de almacenamiento más largos bajo condiciones críticas para los probióticos, y que a la vez sea simple de preparar. Sería preferible si esto se pudiese lograr usando ingredientes naturales que sean seguros de administrar sin efectos secundarios y que sean fáciles de incorporar en la composición de yogurt para beber usando las técnicas industriales del estado del arte.
También sería deseable proveer composiciones que comprendan probióticos con efectos inmuno estimuladores mejorados.
También sería deseable proveer composiciones que comprendan probióticos con efectos anti-inflamatorios mejorados.
Los inventores de esta solicitud han abordado esta necesidad. Por lo cual es un objetivo de la presente invención mejorar el estado del arte y proveer composiciones de yogurt para beber que satisfacen las necesidades arriba expresadas.
Los inventores de esta solicitud se han sorprendido, al observar que ellos pudieron lograr este objetivo a través de la materia de las clausulas independientes. Además, las clausulas dependientes desarrollan la idea de la presente invención.
En consecuencia, los inventores de la presente invención, proveen una composición de yogurt para beber que comprende micro-organismos probióticos no replicantes.
Una ventaja de agregar micro-organismos probióticos no replicantes a un producto es que si en el producto hay - otros probióticos no viables - ellos no tienen influencia sobre la textura de las fibras, de modo que la sensación en la boca de la composición se mantiene inalterada en el tiempo.
Además, los inventores de la presente invención fueron capaces de mostrar que los probióticos no replicantes pueden proveer los beneficios para la salud de los probióticos e incluso pueden tener beneficios mejorados.
Por lo cual, las medidas complicadas para la mantención de los probióticos vivos en el producto final y que permiten asegurar que estos llegan en forma viva al intestino parecen no ser necesarias. Además, el uso de probióticos no replicantes en una composición de yogurt para beber también permite tener probióticos y prebióticos juntos en una preparación sin el riesgo de tener una destrucción prematura no deseada de las fibras durante la preparación y el almacenamiento del producto.
La cantidad de micro-organismos no replicantes en la composición de yogurt para beber de la presente invención puede corresponder a una cantidad de alrededor de 106 a 1012 ufe por porción o ración.
Obviamente, los micro-organismos no replicantes no forman colonias, en consecuencia, este término se debe entender como la cantidad de micro-organismos no replicantes que se obtienen a partir de 104 y 1012 ufe/g de bacterias replicantes. Esto incluye micro-organismos que están inactivados, que son no viables o están muertos o están presentes como fragmentos tales como ADN o paredes celulares o compuestos citoplasmáticos. En otras palabras, la cantidad de micro-organismos que la composición contienen es expresada en términos de la capacidad de formar colonias (ufe) a partir de esa cantidad de micro-organismos como si todos los micro-organismos estuviesen vivos independiente de si lo están, de hecho, no replicantes, tal como inactivados o muertos, fragmentados o una mezcla de cualquiera de todos estos estados.
La composición de yogurt para beber de acuerdo con la presente invención puede comprender alrededor de 80 a 90% en peso de agua, alrededor de 3 a 15% en peso de azúcar, y alrededor de 2,5 a 5% en peso de leche descremada en polvo.
La composición de yogurt para beber además puede comprender alrededor de 0,3 a 0,5% en peso de pectina.
La composición de yogurt para beber puede ser almacenada bajo condiciones frías. Las condiciones frías por lo general poseen temperaturas en el rango de 2°C a 15°C, preferentemente de 4°C a 8°C.
La composición de yogurt para beber también puede ser almacenada bajo condiciones ambiente. Las condiciones ambientes por lo general poseen temperaturas en el rango de 16°C a 25°C, preferentemente de 18°C a 23°C. Mantener los probióticos viables bajo condiciones ambiente por períodos prolongados de tiempo es particularmente desafiante. De modo que, una forma prometedora de impartir beneficios adicionales para la salud al producto es la adición de micro-organismos probióticos no replicantes en particular para composiciones de yogurt para beber que se almacenan en condiciones ambiente.
La composición de yogurt para beber también puede comprender prebióticos.
El término "prebiótico", representa sustancias alimenticias que promueven el crecimiento de los probióticos, en los intestinos. Estos no son degradados en el estómago y/o en el intestino delgado o superior o son absorbidos en el tracto Gl (gastro intestinal) de la persona que los ingiere, pero ellos son fermentados por la microflora gastrointestinal y/o por los probióticos. Por ejemplo, los prebióticos son definidos por los autores Glenn R. Gibson y Marcel B. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125: 1401 -1412.
Los prebióticos que se pueden usar de acuerdo con la presente invención no están particularmente limitados e incluyen todas las sustancias alimenticias que promueven el crecimiento de los probióticos en los intestinos. Preferentemente, se pueden seleccionar del grupo que consiste de oligosacáridos, opcionalmente que contiene fructosa, galactosa, mañosa; fibras dietarias, en particular fibras solubles, fibras de soya; inulina; o mezclas de los mismos. Los prebióticos preferidos son los fructo-oligosacáridos (FOS), galacto-oligosacáridos (IOS), isomalto-oligosacáridos, xilo-oligosacáridos, oligosacáridos de soya, glicosilsacarosa (GS), lactosacarosa (LS), lactulosa (LA), palatinosa-oligosacáridos (PAO), malto-oligosacáridos (MOS), gomas y/o hidrolizados de las mismas, pectinas y/o hidrolizados de las mismas.
Ejemplos típicos de prebióticos son la oligofructosa y la inulina.
La cantidad de prebióticos en la composición de yogurt para beber de acuerdo a la invención depende de su capacidad de promover el desarrollo de bacterias de ácido láctico.
La composición de yogurt para beber puede comprender una cantidad de probióticos que corresponde a una cantidad de al menos 103 ufe por g de prebiótico, por ejemplo, preferentemente de 104 a 107 ufe/g de prebiótico.
Los inventores de esta solicitud se han sorprendido de observar que, por ejemplo, en términos de un efecto inmuno- estimulante y/o en términos de un efecto antiinflamatorio, los microorganismos probióticos no replicantes pueden incluso ser más efectivos que los microorganismos probióticos replicantes.
Esto es sorprendente, porque a menudo los probióticos se definen como "microorganismos vivos" que cuando son administrados en cantidades adecuadas proporcionan beneficios a la salud del huésped (Directrices FAO/WHO). La gran mayoría de la literatura publicada se relaciona con probióticos vivos. Además, varios estudios investigaron los beneficios para la salud, que se entrega a través de las bacterias no replicantes, y la mayoría de ellos indico que la inactivación de los probióticos, por ejemplo, mediante el tratamiento térmico, genera una pérdida de sus supuestos beneficios para la salud (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43:197-204; Gilí, H. S. and K. J. Rutherfurd, 2001 , Br. J. Nutr. 86:285-289; Kaila, ., et al., 1995, Aren. Dis. Child 72:51 -53.). Algunos estudios mostraron que los probióticos muertos pueden retener algunos efectos sobre la salud ((Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Gilí, H. S. and K. J. Rutherfurd, 2001 , Br. J. Nutr. 86:285-289), pero claramente en el estado del arte, se consideró que los probióticos vivos se consideraron en el arte los de mayor rendimiento.
Los microorganismos probióticos "no replicantes" incluyen bacterias probióticas que han sido tratadas térmicamente. Esto incluye microorganismos que se encuentran inactivados, muertos, que no son viables y/o que están presentes como fragmentos, tales como ADN, metabolitos, compuestos citoplasmáticos y/o materiales de paredes celulares.
La expresión "no replicantes" significa que no se detectan células viables y/o unidades formadoras de colonias a través de los métodos clásicos de siembra o de plaqueo. Tales métodos clásicos de siembra se resumen en el texto de microbiología: James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology.7ma edición, Springer Science, New York, N.Y.790 p. Por lo general, la ausencia de células viables se puede demostrar como sigue: no hay colonias visibles en
las placas de agar o no hay una turbidez que aumente en el medio de crecimiento líquido después de la inoculación con diferentes concentraciones de preparaciones bacterianas (muestras "no replicantes") y la incubación bajo condiciones apropiadas (atmósfera aeróbica y/o anaeróbica por al menos 24 horas).
Para el propósito de la presente invención, los probióticos se definen como "preparaciones de células microbianas o componentes de células microbianas, que tienen un efecto beneficioso sobre la salud o el bienestar del huésped". (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probióticos: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).
Las composiciones de la presente invención comprenden microorganismos probióticos y/o microorganismos probióticos no replicantes en una cantidad suficiente para al menos generar parcialmente un beneficio para la salud. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "una dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este propósito dependerán de un número de factores, que son conocidos por aquellos expertos en el arte, tales como el peso y el estado de salud general del consumidor y del efecto de la matriz alimentaria.
En las aplicaciones profilácticas, las composiciones de acuerdo con la invención se administran a un consumidor susceptible o al menos en riesgo de padecer un desorden, en una cantidad que es suficiente para reducir al menos parcialmente el riesgo de desarrollar dicho desorden. Dicha cantidad se define por corresponder a una "dosis profilácticamente eficaz". Nuevamente, las cantidades precisas dependen de un número de factores, tales como el estado de salud y del peso del consumidor y del efecto de la matriz alimentaria.
Aquellas personas expertas en el arte, serán capaces de ajustar de forma adecuada, la dosis terapéuticamente eficaz y/o la dosis profilácticamente eficaz.
En general, la composición de la presente invención contiene microorganismos probióticos no replicantes en una dosis terapéuticamente eficaz y/o en una dosis profilácticamente eficaz.
Por lo general, la dosis terapéuticamente eficaz y/o la dosis profilácticamente eficaz está en el rango de alrededor de 0,005 a 1 .000 mg de microorganismos probióticos no replicantes por dosis diaria.
Preferentemente, los microorganismos no replicantes están presentes en una cantidad equivalente a 104 a 109 ufe/ gramo de composición seca incluso, más preferentemente, en una cantidad equivalente a la comprendida entre 105 a 109 ufe/ gramo de composición seca.
Los probióticos se pueden convertir en no replicantes a través de cualquier método que sea conocido en el del arte.
Las tecnologías disponibles en la actualidad para originar cepas de probióticos no replicantes, generalmente son, el tratamiento con calor, la irradiación ?, la luz UV o el uso de agentes químicos (formalina, paraformaldehído).
En términos de cantidades numéricas, por ejemplo, los micro-organismos no replicantes tratados con "alta temperatura por tiempo breve" pueden estar presentes en la composición en una cantidad que corresponde a entre 104 y 1012 equivalentes de ufe/g de la composición seca.
Sería preferible utilizar una técnica que transforme los probióticos no replicantes, la cual sea relativamente fácil de aplicar a nivel industrial, en la industria de los alimentos.
Por ejemplo, los probióticos pueden ser llevados a no -replicantes y pueden ser agregados a la composición de yogurt para beber como probióticos no replicantes.
En la actualidad, la mayoría de los productos que hay en el mercado que contienen probióticos, son tratados térmicamente durante su producción. Por lo cual, sería conveniente ser capaz de tratar térmicamente a los probióticos, ya sea junto con el producto generado o, al menos, en un modo similar, mientras que los probióticos mantengan o mejoren sus propiedades beneficiosas o incluso adquieran una nueva propiedad que sea de beneficio para el consumidor.
Por lo cual, los probióticos también se pueden agregar a la composición de yogurt para beber en una forma viable y pueden ser generados no replicantes durante una etapa de tratamiento térmico en el proceso de producción normal del yogurt para beber.
Mientras que la inactivación de los microorganismos probióticos por medio de tratamientos térmicos, por lo general está asociada en la literatura, a una perdida al menos parcial de la actividad probiótica; sorprendentemente, los inventores de la presente invención han observado que al llevar los microorganismos probióticos a no replicantes, por ejemplo, mediante tratamiento térmico, no resulta en la pérdida de los beneficios para la salud de los probióticos, sino que - por el contrario - puede aumentar los beneficios para la salud existentes e incluso generar nuevos beneficios.
Por ello, una modalidad de la presente invención es una composición de yogurt para beber, donde los microorganismos probióticos no replicantes fueron generados como no replicantes mediante un tratamiento térmico.
Dicho tratamiento térmico se puede llevar a cabo, al menos, a 71 ,5°C, durante al menos 1 segundo.
Se pueden utilizar tratamientos térmicos de largo o corto plazo.
En la actualidad, por lo general a escala industrial, se prefieren los tratamientos térmicos de corto plazo, tales como los tratamientos térmicos tipo UHT. Este tipo de tratamiento térmico reduce las cargas bacterianas y reduce el tiempo de procesamiento, disminuyendo así el deterioro de los nutrientes.
Los inventores han demostrado por primera vez que los microorganismos probióticos, tratados térmicamente a altas temperaturas durante cortos periodos de tiempo, exhiben perfiles inmunológicos antinflamatorios, independientemente de sus propiedades iniciales. En particular, mediante el tratamiento térmico se desarrolla un nuevo perfil anti-inflamatorio, o a través de este tratamiento se mejora el perfil antiinflamatorio existente.
Por lo cual, actualmente es posible generar microorganismos probióticos no replicantes con perfiles inmunes antinflamatorios, a través del uso de parámetros de tratamiento térmico específico, que corresponden a tratamientos térmicos generalmente aplicables de manera industrial, incluso si las contrapartes vivas no son cepas antiinflamatorias.
De modo que, el tratamiento térmico puede corresponder a un tratamiento a alta temperatura, desde alrededor de 71 ,5 a 150°C, por alrededor de 1 a 120 segundos. El tratamiento a alta temperatura puede ser un tratamiento a alta temperatura/ breve periodo de tiempo (HTST, por su sigla en inglés), o un tratamiento a temperatura ultra elevada (UHT, por su sigla en inglés).
Los microorganismos probióticos pueden ser sometidos a un tratamiento a alta temperatura de alrededor de 71 ,5 a 150°C, por un breve periodo de tiempo de alrededor de 1 a 120 segundos.
Más preferentemente, los microorganismos pueden ser sometidos a un tratamiento a alta temperatura de alrededor de 90 a 140°C, por ejemplo de 90° a 120°C, por un breve periodo de tiempo de alrededor de 1 a 30 segundos.
Este tratamiento a alta temperatura, al menos parcialmente, da como resultado microorganismos no replicantes.
El tratamiento a alta temperatura se puede llevar a cabo bajo presión atmosférica normal, pero también se puede realizar bajo presión elevada. Los rangos de presión típicos fluctúan entre 1 hasta 50 bar, preferentemente entre 1 a 10 bar e incluso más preferentemente entre 2 y 5 bar. Obviamente, se prefiere que los probioticos sean tratados térmicamente en un medio que sea líquido o sólido, cuando se aplica el calor. Por lo tanto, una presión ideal para ser aplicada, dependerá de la naturaleza de la composición en la cual son proporcionados los microorganismos y de la temperatura utilizada.
El tratamiento a alta temperatura se puede llevar a cabo en un rango de temperatura de entre 71 ,5 a 150°C, preferentemente de alrededor de 90 a 120°C, muy preferentemente de alrededor de 120 a 140°C.
El tratamiento a alta temperatura se puede realizar por un periodo de tiempo breve, desde alrededor de 1 hasta 120 segundos, preferentemente desde alrededor de 1 hasta 30 segundos, incluso más preferentemente desde alrededor de 5 hasta 15 segundos.
Este espacio de tiempo determinado se refiere al tiempo durante el cual los microorganismos probioticos se someten a una temperatura determinada. Cabe señalar que dependiendo de la naturaleza y de la cantidad de composición donde se proveen los microorganismos y del diseño del aparato de calentamiento utilizado, podría diferir el tiempo de aplicación de calor.
Sin embargo, por lo general la composición de la presente invención y/o los microorganismos son tratados mediante un tratamiento a alta temperatura por un periodo de tiempo breve (HTST), por pasteurización ultra-rápida o por un tratamiento a temperatura ultra elevada (UHT).
Un tratamiento UHT es un procedimiento a temperatura ultra elevada o un tratamiento ultra-térmico (ambos abreviados como UHT, por su sigla en inglés) lo que involucra una esterilización al menos parcial de una composición, por medio de su calentamiento durante un breve periodo de tiempo, alrededor de 1 a 10 segundos, a una temperatura que excede los 135°C (275°F) que es la temperatura requenda para matar las esporas bacterianas en la leche. Por ejemplo, al procesar la leche de esta forma, utilizando temperaturas que exceden los 135°C, permite una reducción de la carga bacteriana en el tiempo de permanencia necesario (de 2 a 5 segundos) permitiendo una operación de flujo continuo.
Existen dos tipos principales de sistemas UHT: Los sistemas directo e indirecto. En el sistema directo, los productos son mediante inyección o infusión de vapor, mientras que en el sistema indirecto los productos se tratan con calor mediante el uso de intercambiador de calor de placas, intercambiador de calor tubular o intercambiador de calor con superficie raspada. Las combinaciones de los sistemas UHT se pueden aplicar en cualquier etapa o en varias etapas, en el procedimiento de preparación del producto.
Un tratamiento HTST se define de la siguiente forma (alta temperatura/breve periodo de tiempo): Método de pasteurización diseñado para lograr una reducción de 5-log, matando 99,9999% del número de microorganismos viables en la leche. Esto se considera adecuado para destruir casi todas las levaduras, mohos y bacterias comunes causantes del deterioro y también asegura la adecuada destrucción de los organismos patógenos comunes, resistentes al calor. En el proceso HTST, la leche se calienta a 71 ,7°C (161°F) por 15 a 20 segundos.
La pasteurización ultra-rápida es un método de pasteurización térmica de bebidas perecibles como jugos de frutas y verduras, cervezas y productos lácteos. Esto se realiza en forma anterior al vaciado en sus envases para así matar los microorganismos causantes del deterioro, para hacer que los productos sean más seguros y así poder extender su vida en el almacenamiento. El líquido se desplaza en un flujo continuo controlado, mientras se somete a temperaturas de 71 ,5°C (160°F) a 74°C (165°F) por alrededor de 15 a 30 segundos.
Para el propósito de la presente invención, el término "tratamiento a alta temperatura por un periodo de tiempo breve" debe incluir, por ejemplo, los tratamientos a alta temperatura por un periodo de tiempo breve HTST, tratamientos UHT y la pasteurización ultra-rápida.
Debido a que dicho tratamiento térmico provee probióticos no replicantes con un mejor perfil antinflamatorio, la composición de la presente invención se puede utilizar en la prevención o en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
Las enfermedades inflamatorias que se pueden tratar o prevenir mediante la composición de la presente invención no se encuentran particularmente restringidas. Por ejemplo, se pueden seleccionar del grupo que consiste de inflamaciones agudas, tales como sepsis, quemaduras e inflamación crónica, como la enfermedad inflamatoria intestinal, por ejemplo, la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pouchitis, enterocolitis necrotizante; inflamación de la piel, tal como la inflamación de la piel inducida por químicos o rayos UV, eczema, piel reactiva; síndrome del intestino irritable, inflamación ocular, alergia, asma, y combinaciones de las mismas.
Si se utilizan tratamientos térmicos de periodos prolongados de tiempo para obtener los microorganismos probióticos no replicantes, dicho tratamiento se puede
realizar en el rango de temperatura que fluctúa entre 70 a 150°C por alrededor de 3 minutos a 2 horas, preferentemente en el rango de 80 a 140°C, de 5 a 40 minutos.
Mientras que el arte previo generalmente enseña que las bacterias obtenidas como no replicantes por tratamientos térmicos de periodos prolongados de tiempo son usualmente menos eficaces que las células vivas, en términos de ejercer sus propiedades probióticas, la presente invención ha demostrado que los probióticos tratados con calor son superiores en la estimulación del sistema inmune, en comparación con sus contrapartes vivas.
La presente invención también se relaciona con una composición que comprende microorganismos probióticos que se obtuvieron como no replicantes mediante un tratamiento térmico a al menos 70°C, por al menos 3 minutos.
Los efectos de estimulación inmunológica de los probióticos no replicantes fueron confirmados por elaboración de perfiles inmunes in vitro. El modelo in vitro utilizado emplea perfiles de citoquinas de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC por su sigla en inglés) y es bien aceptado en el arte como modelo estándar para los ensayos de compuestos inmunomoduladores (Schultz et al., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor et al., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235; Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1 192-1203)
El ensayo PBMC in vitro ha sido utilizado por múltiples autores / grupos de investigación, por ejemplo, para clasificar los probióticos según su perfil inmune, es decir, sus características anti- o pro-inflamatorias (Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1 192-1203). Por ejemplo, este ensayo ha demostrado que permite la predicción de un efecto anti-inflamatorio de los candidatos probióticos en modelos de colitis intestinal de ratones (Foligne, B., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243). Además, este ensayo se utiliza regularmente como lectura en los ensayos clínicos y se
demostró que conduce a resultados coherentes con los resultados clínicos (Schultz et al., 2003, Journal oí Dairy Research 70, 165-173; Taylor et al., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235).
Las enfermedades alérgicas han aumentado constantemente durante las últimas décadas y actualmente la OMS las considera como epidemia. De modo general, la alergia se considera como el resultado de un desequilibrio entre las respuestas Th1 y Th2 del sistema inmune, que lidera una fuerte tendencia hacia la producción de mediadores Th2. Por lo tanto, la alergia puede ser mitigada, regulada a la baja o prevenirse mediante la restauración de un equilibrio adecuado entre las vertientes Th1 y Th2 del sistema inmune. Esto implica la necesidad de reducir las respuestas Th2 o de mejorar, al menos transitoriamente, las respuestas Th1. Estas últimas serían características de una respuesta inmune de estimulación, a menudo acompañadas de, por ejemplo, niveles más altos de IFNy, TNF-a e IL-12. (Kekkonen et al, 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1 192-1203; Viljanen M. et al, 2005, Allergy, 60, 494-500.)
Por ello, la composición de yogurt para beber de la presente invención permite tratar o prevenir desórdenes relacionados con una defensa inmuno-comprometida.
En consecuencia, los desórdenes que se asocian a una defensa inmuno-comprometida que se pueden tratar o prevenir mediante la composición de la presente invención no se encuentran particularmente restringidos.
Por ejemplo, se pueden seleccionar del grupo que consiste de infecciones, en particular, infecciones bacterianas, virales, fúngicas y/o parasitarias; deficiencias de fagocitos; niveles de inmunodepresión bajo a severo, tales como los inducidos por fármacos inmunodepresores o estrés, quimioterapia o radioterapia; estados naturales de sistemas inmunes menos inmunocompetentes, tales como los de los recién nacidos; alergias y combinaciones de los mismos.
La composición de yogurt para beber descrita en la presente invención permite también aumentar la respuesta a las vacunas, en particular a las vacunas orales.
Cualquier cantidad de microorganismos no replicantes será eficaz. Sin embargo, generalmente se prefiere que al menos 90%, al menos 95%, más preferentemente al menos 98%, mucho más preferentemente al menos 99%, idealmente al menos 99,9% y muy idealmente todos los probióticos sean no replicantes.
En una modalidad de la presente invención, todos los microorganismos son no replicantes.
En consecuencia, en la composición de la presente invención, al menos 90%, preferentemente al menos 95%, más preferentemente al menos 98%, mucho más preferentemente al menos 99%, idealmente al menos 99,9%, muy idealmente todos los probióticos son no replicantes.
Todos los microorganismos probióticos se pueden utilizar para el objetivo de la presente invención.
Por ejemplo, los microorganismos probióticos se pueden seleccionar del grupo compuesto por bifidobacterias, lactobacilos, propionibacterias o mezclas de los mismos, por ejemplo, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli /o mezclas de los mismos.
La composición de acuerdo con la presente invención puede, por ejemplo, comprender microorganismos probióticos no replicantes seleccionados del grupo que consiste de Bifidobacterium longum NCC 3001 , Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1 , Lactobacillus paracasei NCC 2461 , Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM 17983, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287, o combinaciones de los mismos.
Todas estas cepas han sido depositadas bajo el Tratado de Budapest y/o se encuentran disponibles en el comercio.
Las cepas que han sido depositadas bajo el Tratado de Budapest son las siguientes:
Bifidobacterium longum NCC 3001: ATCC BAA-999
Bifidobacterium longum NCC 2705: CNC 1-2618
Bifidobacterium breve NCC 2950: CNC I-3865
Bifidobacterium lactis NCC 2818: CNCM I-3446
Lactobacillus paracasei NCC 2461: CNCM 1-21 16
Lactobacillus rhamnosus NCC 4007: CGMCC 1.3724
Streptococcus thermophilus NCC 2019. CNCM 1-1422
Streptococcus thermophilus NCC 2059: CNCM 1-4153
Lactococcus lactis NCC 2287: CNCM 1-4154
Lactobacillus casei NCC 4006: CNCM 1-1518
Lactobacillus casei NCC 1825: ACA-DC 6002
Lactobacillus acidophilus NCC 3009: ATCC 700396
Lactobacillus bulgaricus NCC 15: CNCM 1-1 198
Lactobacillus johnsonii La1 CNCM 1-1225
Lactobacillus reuteri DSM 17983: DSM17983
Lactobacillus reuteri ATCC55730: ATCC55730
Escherichia coli Nissle 1917: DSM 6601
Las cepas denominadas ATCC fueron depositadas con la autoridad de depósito para patentes ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 201 10, USA.
Las cepas nombradas CNCM fueron depositadas con la institución COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM), 25 rué du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, Francia.
Las cepas denominadas CGMCC fueron depositadas con la institución China General Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Chínese
Academy of Sciences, Zhongguancun, P. O. Box 2714, Beijing 100080, China.
Las cepas denominadas ACA-DC fueron depositadas con la institución Greek Coordinated Collections of Microorganisms, Dairy Laboratory, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, 75, lera odos, Botanikos, Athens, 1 18 55, Grecia.
Las cepas denominadas DSM fueron depositadas con la institución DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania.
Aquellas personas expertas en el arte entenderán que pueden combinar libremente todas las características de la presente invención descritas aquí, sin apartarse del espectro de la invención tal como ha sido descrito.
A partir de los siguientes ejemplos y figuras se vuelven aparentes las ventajas y características adicionales de la presente invención.
Las figuras 1A y 1 B muestran la mejora de los perfiles inmunes antiinflamatorios de probióticos tratados con "altas temperaturas de corta duración".
La figura 2 muestra cepas probióticas no anti-inflamatorias que se transforman en anti-inflamatorias, es decir, que exhiben perfiles inmunes antinflamatorios pronunciados in vitro después de ser tratadas con "altas temperaturas de corta duración".
Las figuras 3A y 3B muestran cepas probióticas que se usan en productos comercialmente disponibles que exhiben perfiles inmunes antinflamatorios mejorados o nuevos in vitro después de ser tratados con "altas temperaturas de corta duración".
Las figuras 4A y 4B muestran cepas lácteas iniciadoras (es decir, cepas iniciadoras Lc1 ) que exhiben perfiles inmunes antinflamatorios mejorados o nuevos in vitro frente al tratamiento a altas temperaturas.
La figura 5 muestra una cepa probiótica no anti-inflamatoria que exhibe perfiles inmunes antinflamatorios in vitro luego de ser sometida a tratamientos HTST.
La figura 6 muestra el análisis de componentes principales en datos PBMC (IL-12p40, IFN-?, TNF-a, IL-10) generados con cepas probióticas y lácteas iniciadoras en sus formas viva y tratadas térmicamente (140°C durante 15 segundos). Cada punto representa una cepa ya sea viva o tratada térmicamente identificada por su número NCC o por su nombre.
La figura 7 muestra las relaciones IL-12p40/IL-10 de cepas vivas y tratadas térmicamente (85°C, 20 minutos). En general, el tratamiento térmico a 85°C durante 20 min conduce a un aumento de las proporciones IL-12p40/IL-10 al contrario de los tratamientos con "alta temperatura de corta duración" de la presente invención (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A, 4B y 5).
La figura 8 muestra el aumento de la secreción de citoquina in vitro a partir de células PBMC de humanos estimulados con bacterias tratadas térmicamente.
La figura 9 muestra el porcentaje de la intensidad de diarrea en ratones sensibilizados a OVA desafiados con suero salino (control negativo), ratones sensibilizados a OVA desafiados con OVA (control positivo) y ratones sensibilizados a OVA desafiados con OVA y tratados con Bifidobacterium breve NCC 2950 vivo o tratado térmicamente. Los resultados se entregan como el porcentaje de la intensidad de diarrea (Media ± SEM calculado a partir de 4 experimentos independientes) con un 100% de intensidad de diarrea que corresponde a los síntomas desarrollados por el grupo control positivo (sensibilizados y desafiados por el alérgeno).
Ejemplo 1 :
Metodología
Preparaciones bacterianas:
En general, los beneficios para la salud proporcionados por los probióticos vivos sobre el sistema inmune del huésped, son considerados específicos de cada cepa. Los probióticos que inducen elevados niveles de IL-10 y/o que inducen bajos niveles de citoquinas pro-inflamatorias in vitro (ensayo de PBMC) han demostrado ser potentes cepas antiinflamatorias in vivo (Foligné, B., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
Se utilizaron diversas cepas de probióticas para investigar las propiedades anti-inflamatorias de los probióticos tratados térmicamente. Estos fueron Bifidobacterium longum NCC 3001 , Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461 , Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), y Escherichia coli Nissle. Diversas cepas de cultivo iniciadoras, que incluyen algunas cepas comercialmente utilizadas para producir los productos fermentados de Nestlé LC1 , también fueron ensayadas: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus bulgaricus NCC 15 y Lactococcus lactis NCC 2287.
Se cultivaron las cepas bacterianas en condiciones optimizadas para cada cepa en biorreactores de 5 a 15 litros. Se pueden utilizar todos los medios de cultivo bacterianos típicos. Estos medios son conocidos por aquellas personas expertas en el arte. Cuando se ajustó el pH a 5,5, se agregó continuamente solución de base al 30% (ya sea NaOH o Ca(OH)2). Cuando fue adecuado, se mantuvieron las condiciones aeróbicas gasificando el espacio de cabeza con C02. Se cultivó E. coli bajo condiciones aeróbicas estándar.
Las células bacterianas se recolectaron por centrifugación (5.000 x g, 4°C) y se resuspendieron en tampón salino de fosfato (PBS) en volúmenes adecuados para poder alcanzar una concentración final de alrededor de 109 - 1010 ufc/ml. Parte de la preparación se congeló a -80°C con 15% de glicerol. Otra parte de las células se trató térmicamente mediante:
- Temperatura Ultra Alta: 140°C durante 15 segundos; mediante inyección de vapor indirecto.
- Temperatura elevada por periodo corto (HTST): 74°C, 90°C y 120°C durante 15 segundos mediante inyección de vapor indirecto.
- Baja temperatura por tiempo prolongado (85°C, 20 minutos) en baño de agua.
Luego del tratamiento térmico, se mantuvieron las muestras congeladas a -80°C hasta su uso.
Preparación in vitro de los perfiles de las preparaciones bacterianas:
Fueron evaluados los perfiles inmunológicos de las preparaciones bacterianas vivas y tratadas térmicamente (es decir, la capacidad de inducir la secreción de citoquinas especificas a partir de células sanguíneas humanas in vitro). Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de filtrados sanguíneos. Luego de la separación mediante gradiente de densidad de células, se recolectaron las células mononucleares se lavaron dos veces con solución salina balanceada de Hank. Luego se resuspendieron las células en medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM, Sigma) complementado con 10% de suero fetal de bovino (Bioconcept, París, Francia), 1 % de L-glutamina (Sigma), 1 % de penicilina/estreptomicina (Sigma) y 0, 1 % de gentamicina (Sigma). Los PBMC (7 x I05 células/pocilio) fueron entonces incubados con bacterias vivas y bacterias tratadas térmicamente (con un equivalente de 7 x I06 ufc/pocillo) en placas de 48 pocilios durante 36 horas. Los efectos de las bacterias vivas y tratadas térmicamente se ensayaron sobre los PBMC a partir de 8 donantes individuales separados en dos experimentos. Luego de 36 horas de incubación, las placas de cultivo se congelaron y se mantuvieron a -20°C hasta la medición de citoquinas. La obtención de los perfiles de citoquina se realizó en paralelo (es decir, en el mismo experimento en el mismo lote de los PBMC) para bacterias vivas y para sus contrapartes tratadas térmicamente.
Se determinaron mediante ELISA los niveles de citoquinas (IFN-?, IL-12p40, TNF-a e IL-10) en los sobrenadantes de los cultivos celulares luego de 36 horas de incubación (IL-10 humano de R&D DuoSet, IL12p40 humano de BD OptEIA, TNFa humano de BD OptEIA, IFN-? humano de BD OptEIA) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las citoquinas IFN-?, IL-12p40 y TNF-a son citoquinas pro-inflamatorias, mientras que IL-10 es un potente mediador antiinflamatorio. Los resultados se expresan como las medias (pg/ml) +/- SE de 4 donantes individuales y son representativas de los dos experimentos individuales, realizados con 4 donantes cada uno. La proporción de IL-12p40/IL-10 se calcula para cada cepa como un valor predictivo del efecto antiinflamatorio in vivo (Foligné, B., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
Los valores numéricos de citoquinas (pg/ml) determinados mediante ELISA (véase arriba) para cada cepa fueron transferidos al programa BioNumerics v5.10 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Un análisis del componente principal (PCA, técnica de dimensionamiento) se realizó sobre este conjunto de datos. En este análisis se incluyeron la sustracción de los promedios sobre los caracteres y la división por las varianzas sobre los caracteres.
Resultados
Perfiles antinflamatorios generados por los tratamientos con temperatura ultra elevada (UHT)/temperatura elevada por periodo corto (HTST).
Las cepas de probióticos bajo investigación, fueron sometidas a una serie de tratamientos térmicos (ultra alta temperatura (UHT), alta temperatura por periodo corto (HTST) y 85°C por 20 minutos) y se compararon sus perfiles inmunológicos in vitro con aquellos de las células vivas. Los microorganismos vivos (probióticos y/o cultivos iniciadores de lácteos) indujeron diferentes niveles de la producción de citoquinas cuando se incubaron con PBMC humanos (figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A, 4B y 5). El tratamiento térmico de estos microorganismos modificó los niveles de citoquinas producidas por los PBMC de una manera dependiente de la temperatura. Los tratamientos con "temperatura elevada por periodos cortos" (120°C o 140°C por 15 segundos) generaron bacterias no
replicantes con perfiles inmunológicos antinflamatorios (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A y 4B). Ciertamente, las cepas tratadas con el tipo UHT (ultra alta temperatura) (140°C, 15 segundos) indujeron menos citoquinas pro-inflamatorias (TNF-a, IFN-?, IL-12p40) mientras que se mantuvieron o indujeron la producción adicional de IL-10 (comparado con las contrapartes vivas). Las relaciones resultantes de IL-12p40/IL-10 fueron menores para cualquiera de las cepas tratadas con el tratamiento tipo UHT comparado con las células vivas (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A y 4B). Esta observación también fue válida para las bacterias tratadas por los tratamientos tipo HTST, es decir, sometidas a 120°C por 15 segundos (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A y 4B), o 74°C y 90°C durante 5 segundos (Figura 5). Los tratamientos térmicos (tratamientos UHT o tratamientos HTST) tuvieron un efecto similar sobre los perfiles inmunológicos in vitro de las cepas probióticas (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B y 5) y los cultivos iniciadores lácteos (Figuras 4A y 4B). Los análisis de componente principal sobre los datos de PBMC generados con las cepas probióticas vivas y con las iniciadoras lácteas tratadas térmicamente (140°C, 15 segundos) revelaron que las cepas vivas se distribuyen todas a lo largo del eje x, ilustrando que las cepas exhiben perfiles inmunológicos muy diferentes in vitro, desde bajos inductores (lado izquierdo) hasta altos inductores (lado derecho) de citoquinas pro-inflamatorias. El agrupamiento de cepas tratadas térmicamente en el lado izquierdo del gráfico, muestra que las citoquinas pro-inflamatorias son mucho menos inducidas por las cepas tratadas térmicamente (Figura 6). Por el contrario, las bacterias tratadas térmicamente hacia 85°C durante 20 minutos indujeron más citoquinas pro-inflamatorias y menos IL-10 que las células vivas que resultaron en mayores proporciones de IL-12p40/IL-10 (Figura 7).
Los perfiles antinflamatorios se mejoran o se generan por medio de los tratamientos tipo UHT y tipo HTST.
Las cepas tratadas por UHT y HTST exhiben perfiles antinflamatorios independientemente de sus respectivos perfiles inmunológicos iniciales (células vivas). Se demostró que en las cepas probióticas que se sabe que son antiinflamatorias in vivo, y que exhiben perfiles anti-inflamatorios in vitro (B. longum NCC 3001 , B. longum NCC 2705, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818) exhiben perfiles antinflamatorios aumentados in vitro después de tratamientos a "temperaturas elevadas por periodos cortos". Tal como se muestra en las Figuras 1A y 1 B, las razones IL-12p40/IL-10 de cepas de Bifidobacterium tratadas con el tipo UHT fueron menores que aquellos provenientes de las contrapartes vivas, mostrando de este modo perfiles antinflamatorios mejorados de las muestras tratadas con el tipo de tratamiento UHT. Más sorprendentemente, la generación de perfiles anti-inflamatorios por medio de los tratamientos UHT y tipo HTST también se confirmó para las cepas vivas no anti-inflamatorias. Ambas cepas vivas de L. rhamnosus NCC 4007 y L. paracasei NCC 2461 exhiben elevadas proporciones de IL-12p40/IL-10 in vitro (Figuras 2 y 5). Las dos cepas vivas mostraron que no son protectoras contra la colitis inducida por TNBS en ratones. Las razones de IL-12p40/IL-10 inducida por L. rhamnosus NCC 4007 y L. paracasei NCC 2461 se vieron dramáticamente reducidas luego de los tratamientos con "alta temperatura por periodos cortos" (UHT o HTST) alcanzando niveles tan bajos como aquellos obtenidos con las cepas de Bifidobacterium. Estas bajas razones de IL-12p40/IL-10 se deben a los bajos niveles de la producción de IL-12p40 combinados con la falta de cambio (L. rhamnosus NCC 4007) o una inducción dramática de la secreción de IL-10 (L. paracasei NCC 2461 ) (Figura 2).
Como consecuencia:
- Se pueden mejorar los perfiles anti-inflamatorios de microorganismos vivos mediante los tratamientos tipo UHT y tipo HTST (por ejemplo B. longum NCC 2705, B. longum NCC 3001, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818)
- Se pueden generar perfiles anti-inflamatorios a partir de microorganismos vivos no anti-inflamatorios (por ejemplo L. rhamnosus NCC 4007, L paracasei NCC 2461, los iniciadores lácteos S. thermophilus NCC 2019) por medio de los tratamientos térmicos tipo UHT y tipo HTST.
- También se demostraron perfiles anti-inflamatorios para las cepas aisladas provenientes de productos comercialmente disponibles (Figuras 3A y B), incluyendo una cepa probiótica de E. coli.
El impacto de los tratamientos tipo UHT/HTST fue similar para todos los probióticos probados y para todos los iniciadores lácteos, por ejemplo lactobacilos, bifidobacterias y estreptococos.
Se aplicaron tratamientos tipo UHT/HTST a diversos lactobacilos, bifidobacterias y estreptococos que exhiben diferentes perfiles inmunológicos in vitro. Todas las cepas indujeron menos citoquinas pro-inflamatorias luego de los tratamientos tipo UHT/HTST con relación a sus respectivas contrapartes vivas (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A, 4B, 5 y 6) demostrando que el efecto de los tratamientos tipo UHT/HTST sobre las propiedades inmunes de las bacterias resultantes no replicantes puede ser generalizado para todos los probióticos, en particular para lactobacilos y bifidobacterias y para cepas de E. coli específicas y para todos los cultivos iniciadores lácteos, en particular, para estreptococos, lactococos y lactobacilos.
Ejemplo 2:
Metodología
Preparaciones bacterianas:
Se utilizaron cinco cepas probióticas para investigar las propiedades de inmunoestimulantes de probióticos no replicantes: 3 bifidobacterias (B. longum NCC3001, B. lactis NCC 2818, B. breve NCC 2950) y 2 lactobacilos (L paracasei NCC 2461, L. rhamnosus NCC 4007).
Las células bacterianas se hicieron crecer en MRS con fermentación en lote a 37°C durante 16 a 18 horas sin control de pH. Las células bacterianas se centrifugaron (5.000 x g, 4°C) y se resuspendieron en solución de tampón salina de fosfato antes de ser diluidas, en agua salina para poder alcanzar una concentración final de alrededor de 1010 ufc/ml. Se trataron térmicamente las cepas B. longum NCC 3001 , B. lactis NCC 2818, L. paracasei NCC 2461 , L. rhamnosus NCC 4007 a 85°C durante 20 minutos en un baño de agua. Se trató térmicamente B. breve NCC 2950 a 90°C durante 30 minutos en un baño de agua. Las suspensiones bacterianas tratadas térmicamente fueron alicuotadas y se mantuvieron congeladas a -80°C hasta su uso. Se almacenaron las bacterias vivas a -80°C en PBS-glicerol 15% hasta su uso.
Obtención in vitro de los perfiles inmunológicos de las preparaciones bacterianas.
Fueron evaluados los perfiles inmunológicos de las preparaciones bacterianas vivas y tratadas térmicamente (es decir, la capacidad para inducir secreción de cltoquinas especificas a partir de células sanguíneas humanas in vitro). Se aislaron células sanguíneas periféricas mononucleares de humano (PBMC) a partir de filtros sanguíneos. Luego de la separación mediante gradiente de densidad celular, se recolectaron las células mononucleares y se lavaron dos veces con solución salina balanceada de Hank. Luego se resuspendieron las células en medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM, Sigma) complementado con 10% de suero bovino fetal (Bioconcept, París, Francia), 1 % de L-glutamina (Sigma), 1 % de penicilina/estreptomicina (Sigma) y 0,1 % de gentamicina (Sigma). Luego se incubaron los PBMC (7 x I05 células/pocilio) con bacterias vivas y bacterias tratadas térmicamente (con un equivalente de 7 x I06 ufc/pocillo) en placas de 48 pocilios durante 36 horas. Los efectos de las bacterias vivas y las tratadas térmicamente se evaluaron sobre los PBMC provenientes de 8 donantes individuales divididos en dos experimentos separados. Luego de 36 horas de incubación, se congelaron las placas de cultivo y se mantuvieron a -20°C hasta la medición de las citoquinas. Se realizó el perfilamiento de citoquinas en paralelo (es decir, en el mismo experimento y en el mismo lote de los PBMC) para las bacterias vivas y para sus contrapartes tratadas térmicamente.
Se determinaron los niveles de citoquinas (IFN-y, IL-12p40, TNF-a e IL-10) en los sobrenadantes de cultivos celulares luego de 36 horas de incubación mediante ELISA (IL-10 humana de R&D DuoSet, IL12p40 humana de BD OptEIA, TNF-a humano de BD OptEIA, IFN-? humano de BD OptEIA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El IFN-?, IL-12p40 y TNF-a son citoquinas pro- inflamatorias, mientras que IL-10 es un potente mediador antiinflamatorio. Se expresaron los resultados como medias (pg/ml) +/-SEM de 4 donantes individuales y son representativos de los dos experimentos individuales realizados con 4 donantes cada uno.
Efecto in vivo de Bifidobacterium breve NCC 2950 vivo y tratado térmicamente en la prevención de la diarrea alérgica.
Se utilizó un modelo de diarrea alérgica en ratón para probar el efecto de B. breve NCC 2950 como promotor de Th1 (Brandt et al EB JCI 2003; 1 12 (1 1 ): 1666-1667). Luego de la sensibilización (2 inyecciones intraperitoneales de ovoalbúmina (OVA) y sulfato de aluminio potasio a un intervalo de 14 días; días 0 y 14) se desafió por vía oral a los ratones macho Balb/c con OVA por 6 veces (en los días 27, 29, 32, 34, 36, 39) resultando en síntomas clínicos transitorios (diarrea) y cambios en los parámetros inmunes (concentración plasmática de IgE total, IgE específica para OVA, proteasa 1 de mastocitos de rata, es decir MMCP-1 ). Se administró Bifidobacterium breve NCC 2950 vivo o tratado térmicamente a 90°C durante 30 minutos, mediante sonda, 4 días antes de
la sensibilización con OVA (día -3, -2, -1 , 0 y día 1 1 , 12, 13 y 14) y durante el período del desafío (días 23 a 39). Se utilizó una dosis bacteriana diaria de alrededor de 109 unidades formadoras de colonias (ufe) o el equivalente de ufe/rata.
Resultados
Inducción de la secreción de citoquinas "pro-inflamatorias" luego del tratamiento térmico.
Se evaluó in vitro la capacidad de secretar citoquinas por parte de las células sanguíneas mononucleares periféricas de humano (PBMC), por medio del estímulo con las cepas bacterianas tratadas térmicamente. Se compararon los perfiles inmunológicos basados en cuatro citoquinas, frente a la estimulación de los PBMC mediante bacterias tratadas térmicamente, con aquellos inducidos por células bacterianas vivas, en el mismo ensayo in vitro.
Los preparaciones tratadas térmicamente fueron plaqueadas o sembradas y evaluadas para verificar la ausencia de cualquier recuento de viables. Las preparaciones bacterianas tratadas térmicamente no produjeron colonias luego de la siembra o plaqueo.
Los probióticos vivos indujeron niveles de producción de citoquinas diferentes y dependientes de células, cuando se incubaron con PBMC de humano (Figura 8). El tratamiento térmico de los probióticos, modificó los niveles de citoquinas producidos por los PBMC al compararlos con sus contrapartes vivas. Las bacterias tratadas térmicamente indujeron más citoquinas pro-inflamatorias (TNF-a, IFN-?, IL-12p40), respecto de lo que hicieron sus contrapartes vivas. Por el contrario, las bacterias tratadas térmicamente indujeron cantidades similares o inferiores de IL-10 comparado con las células vivas (Figura 8). Estos datos muestran que las bacterias tratadas térmicamente son más capaces de estimular el sistema inmune que sus contrapartes vivas y por lo tanto
son más capaces de despertar defensas inmunológicas debilitadas. En otras palabras los datos in vitro ilustran un efecto inductor inmunológico mejorado por parte de las cepas bacterianas luego del tratamiento térmico.
Para poder ilustrar el efecto aumentado de B. breve NCC 2950 tratado térmicamente (comparado con las células vivas) sobre el sistema inmune, ambos B. breve NCC 2950 (cepa A) vivo y tratado térmicamente fueron probados en un modelo animal de diarrea alérgica.
Al compararlo con el grupo control positivo, la intensidad de la diarrea se vio significativamente y consistentemente disminuida luego del tratamiento con B. breve NCC 2950 tratado térmicamente (41 ,1 % ± 4,8), mientras que la intensidad de la diarrea disminuyo solamente en un 20 ± 28,3% luego del tratamiento con S. breve NCC 2950 vivo. Estos resultados demuestran B. breve NCC 2950 tratado térmicamente exhibe un efecto protector aumentado frente a la diarrea alérgica respecto de su contraparte viva (Figura 9).
Como consecuencia, la capacidad de los probióticos para aumentar las defensas inmunes demostró que es mejorado luego del tratamiento térmico.
Ejemplos Adicionales:
Se puede preparar la siguiente composición de yogurt para beber para ser almacenada a temperaturas frías (4o a 8°C) usando técnicas estándar:
Se puede preparar la siguiente composición de yogurt para beber para almacenada a temperaturas ambientes (15° a 23°C) usando técnicas estándar:
Claims (15)
1. Composición de yogurt para beber, caracterizada porque comprende micro-organismos probióticos no replicantes.
2. Composición de yogurt para beber de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende micro-organismos probióticos no replicantes en una cantidad que corresponde a desde 106 hasta 1012 ufe por ración.
3. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende desde 80 a 90% en peso de agua, de 3 a 15% en peso de azúcar, y de 2,5 a 5% en peso de leche descremada en polvo.
4. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque además comprende de 0,3 a 0,5% en peso de pectina.
5. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la composición es para ser almacenada a temperatura fría o a temperatura ambiente.
6. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque además comprende prebióticos, por ejemplo oligofructosa e inulina.
7. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los microorganismos probióticos no replicantes se convierten en no replicantes mediante tratamiento térmico, preferentemente mediante un tratamiento a alta temperatura al menos a 71 ,5°C durante al menos 1 segundo.
8. Composición de yogurt para beber de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque el tratamiento térmico es un tratamiento de alta temperatura de 71 ,5 hasta 150°C por 1 a 120 segundos, y preferentemente es un tratamiento de alta temperatura/tiempo breve (HTST) o un tratamiento de ultra alta temperatura (UHT).
9. Composición de yogurt para beber de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque sirve para la prevención o el tratamiento de desórdenes inflamatorios.
10. Composición de yogurt para beber de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque el tratamiento térmico se lleva a cabo en el rango de temperatura de 70 a 150°C por 3 minutos hasta 2 horas, preferentemente en el rango de 80 a 140°C desde 5 minutos hasta 40 minutos.
11 . Composición de yogurt para beber de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque se usa en la prevención o tratamiento de los trastornos de relacionados con una defensa inmuno comprometida.
12. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque al menos el 90 %, preferentemente, al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 98 %, más preferentemente al menos el 99%, aún más preferentemente al menos 99,9%, mucho más preferentemente todos los probióticos son no replicantes.
13. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los microorganismos probióticos son seleccionados del grupo que consiste de bifidobacteria, lactobacilos, propionibacterias, o combinaciones de los mismos, por ejemplo Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgarícus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli lo mezclas de los mismos.
14. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los microorganismos probióticos se seleccionan del grupo que consiste de Bifidobacterium longum NCC 3001 , Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1 , Lactobacillus paracasei NCC 2461 , Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM 17983, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgarícus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287, o combinaciones de los mismos.
15. Composición de yogurt para beber de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene 0,005 mg - 1 .000 mg de microorganismos no replicantes por dosis diaria. La presente invención se refiere al campo de las composiciones de yogurt para beber. En particular, la presente invención provee composiciones de yogurt para beber que comprenden micro-organismos probioticos no replicantes. Por ejemplo, estos micro-organismos probioticos no replicantes pueden ser micro-organismos probioticos bioactivos tratados térmicamente. La presente invención también se refiere a los beneficios a la salud que proporcionan estos micro-organismos probioticos no replicantes.
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