MX2013004351A - Metodo para determinar riesgo de arritmia. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para determinar el riesgo de arritmia inducida por fármaco utilizando cardiomiocitos derivados de célula madre en un ensayo de arreglo de impedancia o multi-electrodo de alto rendimiento.

Description

METODO PARA DETERMINAR RIESGO DE ARRITMIA I CAMPO DE LA INVENCION ! La presente invención se refiere a un determinar el riesgo de arritmia inducida i utilizando células madre derivadas de cardiomiocitos en una i impedancia de alto rendimiento o en un ensayo de arritmia de multi-electrodo . j I ANTECEDENTES DE LA INVENCION | i Las taquicardias ventriculares polimorfas Torsades de Pointes (TdP, por sus siglas en inglés) , inducidas por i fármaco, una taqui-arritmia ventricular polimórfic'a I amenazante de la vida ha conducido al retiro y a la severa I limitación del uso de un número de fármacos (Journal of I Pharmacological and Toxicological Methods 52: 46-59, 2005)'. i La causa típica de TdP es la inhibición del canal de potasio i de rectificación interna, hERG (gen relacionado con el éterj a-go-go humano codificado por KCÑH2) , que da como resultado i un intervalo QT prolongado. El método estándar, actualmente! i es clasificar candidatos de fármaco para inhibición hERGj i utilizando líneas celulares no cardiacas que sobre-expresanj hERG. Sin embargo, la clasificación de hERG es subóptima, yaj que no todos los componentes que inhiben el canal hERG da j como resultado la prolongación QT o inducen TdP | (Cardiovascular Research 58: 32-45, 2003). Además, las Ref. 240251 arritmias pueden ser inducidas en humanos a través j de i fármacos que no se exhiben en la inhibición hERG in vi tro o i no causan la prolongación QT en modelos de animal preclínicos. Por ejemplo, verapamil, un inhibidor hERG j potente, no causa la prolongación QT o TdP en pacientes y ise i utiliza . de manera segura y efectiva. A pesar de es^ta discordancia, se gasta un tiempo excesivo y esfuerzos en ¡el descubrimiento del fármaco en la investigación de los efectps I refinadas. j Las tecnologías tales como los arreglos muíti -electrodo (MEA, por sus siglas en inglés) pueden utilizarse i para medir el potencial de campo y, cuando se examina una j población homogénea y eléctricamente acoplada de células, imitan los electrocardiogramas in vivo (Journal cif Electrocardiology 37 Supl: 110-116, 2004) . Los MEA se han i utilizado previamente para evaluar las propiedades generale!s del potencial de acción de los cardiomiocitos derivados dje célula madre y los cambios electrofisológicos pueden utilizarse como una medida de reemplazo de arritmia. Sin embargo, las limitaciones técnicas restringen el rendimiento y la duración de los estudios MEA (Stem Cell Research 4: 107† 116; Stem Cell Research 4: 189-200)) . Más allá de Los sistemas in vitro mejorados para pronosticar toxicidades inducidas por fármaco son necesarias a través de las industrias farmacéuticas y biotecnológicas para disminuir el desgaste del fármaco en etapa tardía. Específicamente, i existe la necesidad de modelos in vitro de alto rendimiento i que vayan más allá de la prolongación QT y ahonden BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION j —— — En la presente, se describe el primer ensayo funcional de alto rendimiento que utiliza cardiomiocitos ¡ derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos ( detectan fármaco. Se utilizan dos métodos independientes, uno dej I placas de 96 cavidades con arreglos de sensor de electrodo] interdigitalizados que miden la impedancia y un segundoj método utilizando arreglos multi-electrodos . La impedanciaj debido al iPSC-C s adherente se muestreó cada 12.9 j i milisegundos, dando una medición continua no destructiva del i ¦ acoplamiento físico de las células a la placa. Los rastros !de la a i pedancia revelaron contracciones rítmicas del iPSC- .

. El tratamiento con un amplio intervalo de fármacos se sabe que altera la función cardiaca induciendo cambios en el ritmo i cardiaco y la contractilidad detectada por la impedancia. Se i recolectaron resultados similares de los efectos del fármaco I en arreglos micro-electrodo de esta forma se confirma ía I validez del modelo. Las arritmias inducidas por fármacos se detectaron, cuantificaron y se calculó una potencial pro-arrítmico (PPS; puntuación i pronosticada) , ilustrando esta habilidad del sistema para i interrogar las propiedades funcionales de iPSC-CM en una i forma previamente no posible, proporcionando una nueva , oportunidad de una seguridad cardiovascular predictiva. 1 I La presente solicitud proporciona un método para. determinar el riesgo de arritmia inducida por fármacos comprende : I a) proporcionar cardiomiocitos; ! i b) poner en contactos los cardiomiocitos con el fármaco ; j c) detectar la irregularidad del ritmo cardiacoj monitoreando ya sea la contracción de la célula o elj i potencial de campo. I La presente solicitud proporciona el método'j anterior, en donde los cardiomiocitos son de origen humano.¡ La presente solicitud proporciona los anteriores, en donde los cardiomiocitos se producen fuente de células madre pluripotentes .

La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde la fuente de células madre es una fuen'te i de células madre pluripotentes inducida. ' ¡ i La presente solicitud proporciona los métodos i anteriores, en donde la incidencia de la arritmia es i detectada por el monitoreo de cambios en el potencial del campo celular. ¡ i La presente solicitud proporciona los métodos ? anteriores, en donde la contracción celular se monitorea ¡a través de la medición de la impedancia. j La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde la contracción celular se monitorea |a ! través de la medición de la impedancia a una frecuencia de I velocidad de captura de datos capaz de identificar el r movimiento de cardiomiocitos durante la contracción. ¡ I La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde la detección de la arritmia comprende monitorear aumentos, disminuciones o irregularidades ritmo cardiaco. ¡ i La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde además comprende: ' d) calcular el IBR.

La presente solicitud proporciona los anteriores, en donde un IBR menor que o igual a utiliza para designar un bajo riesgo de arritmia.

La presente solicitud proporciona los métod'os anteriores, en donde el método anterior, además comprende: ¡ e) calcular la proporción de IB20 con relación a Cmax/ dando como resultado un PPS o calcular la propor IB2o con relación a Cmax, dando como resultado un PPS.

La presente solicitud proporciona los anteriores, en donde un PPS menor que o igual a 100 se utiliza para designar un bajo riesgo de arritmia. j I La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde el método para determinar el riesgo dé arritmia inducida por fármaco se conduce en un formato de i alto rendimiento. I i La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde el método para determinar el riesgo dé arritmia inducida por fármaco se conduce para clasificar I moléculas en una configuración de desarrollo de fármacos. j DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION ¡ I La presente solicitud proporciona un método para! determinar el riesgo de arritmia inducida por fármaco quej comprende : j a) proporcionar cardiomiocitos ; | b) poner en contacto los cardiomiocitos con tal i fármaco; ' i I c) detectar la irregularidad del ritmo cardiaco monitoreando cualquier contracción celular o potencial !de ¦I campo . ¡ i La presente solicitud proporciona el métojdo anterior, en donde los cardiomiocitos son de origen de perro, I mono, rata, conejo, o humano. I i La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde los cardiomiocitos son de origen humanó.

La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde los cardiomiocitos se producen de una fuente de células madre. ¡ La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde la fuente de células madre fuentes de células madre embrionarias.

La presente solicitud proporciona los anteriores, en donde los cardiomiocitos se producen fuente de células madre pluripotentes . ¡ I La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde la fuente de células madre es una fuente ¡ de células madre pluripotentes inducidas. j La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde la incidencia de la arritmia detectada por el monitoreo de cambios en el potencial campo celular.

I La presente solicitud proporciona los métodos I anteriores, en donde la contracción celular se monitoreaj a través de la medición de la impedancia. ¡ La presente solicitud ¦ proporciona los métodps anteriores, en donde la contracción celular se monitoreaii a través de la medición de la impedancia a una frecuencia ele velocidad de captura de datos capaz de identificar el movimiento de cardiomiocitos durante la contracción. ' I La presente solicitud proporciona los métodos I anteriores, en donde la detección de la arritmia comprende monitorear aumentos, disminuciones o irregularidades del ritmo cardiaco. lj I La presente solicitud proporciona los métodos í anteriores, en donde la irregularidad del ritmo cardiaco es indicativa de Torsades de Pointes . ! I La presente solicitud proporciona los método's anteriores, en donde la irregularidad del ritmo cardiaco ejs indicativa de la prolongación de QT. j La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde la irregularidad del ritmo card debe a la alteración de un canal de ión cardiaco.

La presente solicitud proporciona los anteriores, en donde la impedancia se mide con una velocidad de muestreo de aproximadamente cada 12.9 milisegundos . ¡ La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde además comprende: J d) calcular IB20- ¡ La presente solicitud proporciona los anteriores , en donde un IBR menor que o igual a utiliza para designar un bajo riesgo de arritmia. ' La presente solicitud proporciona los métodos i anteriores, en donde el método anterior, además comprende: j e) calcular la proporción de IB20 con relación j a Cma / dando como resultado un PPS o calcular la proporción de i IB2o con relación a Craax, dando como resultado un PPS. | La presente solicitud proporciona los métodos .i anteriores, en donde además comprende: | e) calcular la proporción de Cmax con relación ¡a IB20/ dando como resultado un PPS. J La presente solicitud proporciona los método's i anteriores, en donde la proporción de IB20 con relación a Cm¿x ' í menor de o igual a 100 se utiliza para designar un bajo i I riesgo de arritmia. I I La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, además comprende: ' ! f) comparar el resultado del paso e) con el de uni I fármaco inductor de arritmia conocido. ¡ La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde el canal de ión cardiaco es un canal dé 1 potasio. I I La presente solicitud proporciona los métodos I anteriores, en donde el canal de potasio es el canal hERG. j La presente solicitud proporciona los métodos i anteriores, en donde el canal de ión cardiaco es un canal (de i calcio. j La presente solicitud proporciona los métodos anteriores, en donde el canal de ión cardiaco es un canal de sodio.

La presente solicitud proporciona anteriores, en donde el método para determinar arritmia inducida por fármaco se conduce en un formato de i alto rendimiento. ' i La presente solicitud proporciona los métodos i anteriores, en donde el método para determinar el riesgo de arritmia inducida por fármaco se conduce para clasificar moléculas en una configuración de desarrollo de fármacos. j Se entiende que los métodos provistos en la ! presente son métodos in vitro, es decir no se llevan a cabo ! en el cuerpo humano o de animal. | i La capacidad para directamente diferenciar . las células madre pluripotentes (PSC) en cardiomiocitos en maduración latentes permite una nueva trayectoria para estudiarla biología cardiovascular in vitro (Trends in Pharmacologicaí Sciences 30: 536-545, 2009) . Además, los ensayos de toxicidad I ii predictivos a base de PSC humano pueden ayudar a calibrar los i aspectos de seguridad potenciales en candidatos de fármacos . 1 prometedores antes del proceso de desarrollo y proporcionan ¡el I entendimiento de los mecanismos de toxicidad de órgano induci'do I por fármaco, mientras todos reducen, refinan y reemplazan la I confianza en las pruebas animales. Utilizando tejidos derivados I de PSC humanos normales cariotípicos , ya que los métodos I tradicionales se basan fuertemente en modelos de animales que predicen marginaimente respuestas habilidad limitada para revertir l ToxiCOl. Pharmacol . 32: 56-67, 2000) . Además , un panel de PCjS con variaciones alélicas humanas definidas ayudaría a identificar las subpoblaciones de pacientes respuestas a fármaco variables, auxiliando en la del criterio de inclusión y exclusión claves para ¦ . ensayo clínico exitoso.

El método descrito en la presente utiliza placas dé cultivo tisular de 96 cavidades con un arreglo de sensor dej electrodo interdigitalizado de muestreo rápido de impedancia. j I Los usos previamente publicados de mediciones de impedancia en cultivo celular se basan en una velocidad de muestreo más lenta y generalmente se limitaron a la medición de efectos celulares generales tales como citotoxicidad o mortalidad (Nature 366: 591-592, 1993, Biotechnology Journal 3: 484-495, 2008). Al aumentar la velocidad de muestreo a 12.9 milisegundos, el movimiento físico de los cardiomiocitos contrayéndose puede observarse. Esto permite el monitoreo sin marcaciones, en tiempo real de la contracción rítmica de I cardiomiocitos derivados de iPSC humanos. La medición directa de la contracción funcional de' cardiomiocitos humanos posible la clasificación in vitro de alto rendimiento del potencial pro-arrítmico de nuevas entidades moleculares. j I Debido a que el uso de un muestreo de impedancia i rápida no se ha aplicado para detectar los latidós i espontáneos de los cardiomiocitos, primero se buscó I caracterizar completamente el sistema. El ritmo cardiaco ¿le iPSC-CMs sin tratar consistentemente de un latidos por minuto (BMP, por sus siglas en de las cavidades y las placas individuales i través de tanto MEA como impedancia. Para establecer que las rápidas lecturas de la impedancia reflejan la contracción física de las células según opuestas a . los cambicjs i eléctricos, los aspectos del inhibidor de miosina II,, blebistania, se examinaron. Después del tratamiento con blebistatina no se observó ningún latido de cardiomiocitos utilizando impedancia, y aún la electrofisiología de los cardiomiocitos detectados por ME permaneció sin cambios, confirmando- que la impedancia i ciertamente mide directamente el movimiento físico de los cardiomiocitos durante la contracción y no mide los artefactos relacionados con el campo eléctrico del potencial i de acción cardiaca dependiendo del potasio. I Enseguida se buscó sistemáticamente examinar jos efectos de diferentes clases de fármacos cardioactivos (Tablas I-II) . " I IBR significa "ritmo cardiaco irregular" calculajdo como el número de latidos irregulares divididos por los i latidos totales durante 1 minuto (= latidos i irregulares/latidos totales) . IBR será un valor entre (o 0-100% si se utiliza el porcentaje como la unidad) igual a la concentración más baja que produce un val > 0.2 (> 20% de latidos irregulares durante 1' minut esta aplicación, PPS se calcula en dos diferentes forma 1) Cmax/IB2o/ la proporción de Cmax con relación ja IB2o y el recorte es de >100 como un nivel de preocupación (Tabla I) : Tabla I.

Fármaco Cmax (nM) IB20 (µ?)* PPS hERG QT TdP ! 1 i 1 Ouabaina 170 0.03 5667 (-) (-) (+) ! j Aconitina 77 0.03 2567 (-) (-) <+> I Quinidina 21,578 10 2158 ( + ) ( + ) (+) Dofetilida 6 0.003 2000 ( + ) ( + ) (+> Fármaco Q-ax (nM) IB20 (µ?)* PPS hERG QT TdP Flecainida 1, 931 1931 (+) (+) (+) Eritromicina 34, 064 30 1135 (+) (+) (+) Terfenadina 300 0.3 1000 (+) (+) (+) Tioridazina 1781 594 (+) (+) R05657 5, 548 10 555 + ( + ) ( + ) Sotalol 14,733 30 491 + ( + ) ( + ) E-4031 13 0.03 433 + ( + ) ( + ) Cisaprida 129 0.3 429 + ( + > ( + ) As emizol 8 0.03 262 + ( +> ( +) Ranolazina 6, 009 100 60 + ( + ) Alfuzosina 56 56 ( + ) Moxifloxacina 10, 276 >100 <103 + ( + ) (±) Nifedipina 194 >3 <65 (-) Amiodarona 3874 >100 <39 + ( + ) (±) Verapamil 815 >30 <27 (±) Captop il 2, 466 >100 <25 (-) Amoxicilina 17, 036 >1, 000 <17 (-) Fluoxetina 485 >30 <16 ( + ) Rofecoxib 1021 >100 <10 (-) Aspirina 10, 000 >1,000 <10 (-) 2) IB20 Cmax, la proporción de IB20 con relación a Cmax con el recorte de <10 como el nivel de preocupación (Tabla II) : . ! Fármaco (nM) IB20 (µ?)* PPS hERG QT TdP Ouabaina 170 30 0.2 ( + ) Aconitina 77 30 0.4 ( + ) Quinidina 21,578 10, 000 0.5 ( + ) ( + ) Dofetilida 6 3 0.5 + ( + ) ( + ) Flecainida 1, 931 1, 000 0.5 + ( + ) ( + ) Eritromicina 34, 064 30, 000 0.9 + ( + ) ( + ) Terfenadina 300 300 1.0 + ( + ) ( +) Tioridazina 1781 3, 000 1.7 + ( + ) ( +) R05657 5, 548 10, 000 1.8 + ( + ) ( + ) Sotalol 14, 733 30, 000 2.0 + ( + ) ( + ) E-4031 13 30 2.3 + ( + ) ( + ) Cisaprida 129 300 2.3 + ( + ) ( + ) Astemizol 8 30 3.8 + ( + ) ( + ) Ranolazina 6, 009 100, 000 17 + ( + ) (-) Alfuzosina 56 1, 000 18 ( + ) (-) Moxifloxacina 10,276 >100, 000 >10 ( + ) (±) Nifedipina 194 ' >3, 000 >16 .(-) Amiodarona 3874 >100, 000 >26 + ( + ) (±) Captopril 2, 466 >100, 000 >41 (-) (-) (-) i ! 1 Amoxicilina 17,036 >1, 000, 000 >59 (-) (-) ( ) j Fluoxetina 485 >30,000 >62 ( +) ( +) ofecoxib 1021 >100, 000 >98 (-) (-) ( } 1 Aspirina 10, 000 >1, 000, 000 >100 (-) (-) (- i La segunda forma de cálculo (IB2o/Cmax) comúnmente se í utiliza en el campo de la evaluación segura y denominad "Margen de Seguridad" , que indica que tan cerca está lja concentración que causa la concentración de la Entre mayor es el margen de seguridad, menor es riesgo de toxicidad con fármacos. Inversamente, utilizando la primera i proporción (Craax/IB2o) / entre mayor es valor PPS, mayor es el i riesgo de una toxicidad con fármacos. j Tetrodotoxina, ún bloqueador de canal de Na+ puro Isoproterenol, un agonista . del receptor ß-? adrenérgico aumentó ambos el ritmo cardiaco y la amplitud MEA acoplado con un aumento en ritmo cardiaco. Como controlés negativos, los compuestos tales como aspirina, amoxicilina jy i captopril, que carecen de efectos secundarios ¡ cardiovasculares in vivo, no mostraron ninguna alteración en ' I los patrones de latidos dentro de iPSC-CMs. Tomados juntos¡, estos resultados demuestran que la rápida medición de la I impedancia de iPSC-CMs puede detectar las respuestas i I apropiadas y esperadas para la modulación del I receptor/transportador y la inhibición del canal de ión. j Después del tratamiento . con el inhibir hERG, E4031,¡ í una reducción dependiente de la dosis en el ritmo cardiaco así las instancias de cambios de impudencia erráticos se observaron, asemejándose después de polarización y de I arritmias (Figura 1) . Como los latidos arrítmicos! ventriculares se consideran que se inician a través de una! í ciclacion de C alterada en cardiomiocitos , ya sea a través] de despolarizaciones posteriores tempranas (EAD, mediada porj la re-activación del canal de Ca2+ de tipo L inactivado) oj despolarizaciones posteriores retrazadas (DAD, mediadas corriente de intercambio de Na+/Ca2+ más aumentada) hipotetizó, que las alteraciones del tráfico de rescatarían verdaderamente las arritmias inducidas por fármacos . Para confirmar las propiedades mecanísticas de arritmia inducida por E4031, se condujo un experimento de Jp- i administración con nifedipina, un inhibidor del canal de Ca2+. i .

La observación de que nifedipina es capaz de rescatar las in vitro, se examinó un amplio panel de compuesto'.s i clínicamente asociados con TdP, incluyendo cisapridaj, 1 eritromicina, flecainida, ouabaina, quinidina, sotalol y I tioridazina. Los patrones de latidos irregulares . se I observaron para cada compuesto en una forma dependiente dé i dosis y de tiempo. En comparación, los latidos arrítmicos causados por ouabaina carecen de irregularidad de amplitud, más bien induciendo la arritmia de . tipo . fi ventricular "fasciculaciones" . Terfenadina, que retirado del mercado debido a la inducción de TdP los canales de ión cardiaco múltiples (hERG, Na+ y en detección in vitro de la prolongación QT que ha sido! elusiva. A pesar de que la inhibición hERG de terferiadina I probablemente contribuye sustancialmente a su responsabilidad i torsadogénica, los efectos electrofisiológicos se enmascaran por la inhibición del canal de Ca2+ y Na+ y de esta forma no se manifiestan fácilmente en modelos electrofisiológicosja corto plazo. El efecto arrítmico se observó solamente en un I tratamiento de fármaco extendido (más de 12. horas) .

Tioridazina, otro bloqueador de canal de ion múltiple, también arritmia de la utilizando dispositivos MEA debido a la corta duración de lcjs i experimentos MEA y resalta la importancia de una más larga i evaluación del riesgo arrítmico. Adicionalmente, un compuesto i de etapa tardía interno que causa TdP en primares no humanos se invirtió por el tratamiento con nifedipina, de nuevo1 soportando estas observaciones in vitro como las arritmias', i verdaderas. Como un control negativo, compuestos tales comoj amoxicilina, aspirina y captropril, que carecen de efectosl i secundarios cardiovasculares in vivo, no mostraron ninguna! ¡ alteración en los patrones de los latidos o latidos | arrítmicos, en iPSC-CMs humanos.

La habilidad para distinguir compuestos que inhiben i hERG en aislamiento, aún no inducen clínicamente TdP que |se examinaron utilizando compuestos tales como verapamil alfuzosina. Estos compuestos exhibieron resultados in vitjro similares a la experiencia clínica, que incluye la i prolongación QT, pero no TdP. Sin embargo, a concentraciones i sustancialmente más altas que las utilizadas in vivo I alfuzosina causó una reducción en el ritmo cardiaco y la í aparición de latidos arrítmicos, similares a los de otros I bloqueadores hERH. De esta forma, las rápidas mediciones de la impedancia de iPSC-CMs humanos proporcionan una mejora sustancial en la predicción TdP sobre la afinidad hERG básica í y ofrecen un nuevo paradigma para describir TdP relevante humano in vitro en una etapa muy temprana en la tubería. ! La habilidad de detectar arritmias utilizando iPScj- I CMs humanas controlados en cuanto a calidad, comercialmentjs disponibles con el sistema de presente abriría nuevas cardiovascular humana in vitro. Sin embargo, si tal sistema es para obtener una utilidad máxima dentro de las tuberías del descubrimiento de fármacos de las biotecnológica y farmacéutica, debe ser capaz de datos cuantitativos que pueden utilizarse para clasificar el orden de nuevos candidatos de fármaco a través de su riesgo i pronosticado de causar arritmias cardiacas. Por consiguiente,! como un esfuerzo inicial para determinar si las mediciones ¡de i i la impedancia de las arritmias inducidas por fármaco podrían i proporcionar una medición cuantitativa del riesgo pro- i arrítmico, se visualiza un método para calcular una í "Puntuación Pro-arrítmica Pronosticada" (PPS, por sus siglas en inglés) . En primer lugar, la concentración más baja del fármaco que dio como resultado latidos irregulares mayores i del 20% (IB2o) durante 1 minuto se determinó. Este umbral se seleccionó empíricamente para optimizar la sensibilidad jy especificidad. Después, el IB2o se dividió por el valor publicado para una concentración en plasma eficaz clínica máxima del fármaco Cmax para llegar al PPS. De esta forma, el de preocupación para riesgo de arritmia inducida. j Alternativamente, el PPS puede calcularse dividiendo el Ritmo Cardiaco Regular (IBR, por sus siglas enj i inglés) a través de Cmax. Utilizando esta proporción, y* i basándose en la incidencia TdP clínica y nuestros datos, unj I PPS >100 se selecciono empíricamente como el umbral dej I preocupación de arritmogénesis . Los compuestos cardioactivos j 1 de tipo flecainida, ouabaina, terfenadina, aconitina y ¡ i quinidina mostraron arritmia a concentraciones menores de la ¡ concentración eficaz, y de esta produjeron un alto PPS. los otros compuestos con un alto PPS se asociaron con TdP y!/0 arritmia inducida a concentraciones de 5 veces la exposición eficaz. Los compuestos de bajo riesgo tienen un PPS ba'jo (<100) . Esos incluyen compuestos carentes de prolongación t y conflabilidad TdP (amoxicilina, aspirina, captopril, nifedipina, rofecoxib, verapamil) , prolongaron la duración de QT pero sin TdP (alfuzosina y ranolazina) o se asociaron con un muy bajo riesgo de TdP (fluoxetina y amiodarona, j Cardiovascular Research 58: 32-45, 2003.). El sistema del modelo descrito en la presente demuestra una precisión mejorada, en particular la falta de falsos positivos, cuando se compara ya sea con la clasificación hERG y la prolongación i QT. Específicamente la ranolazina, verapamil, y moxifloxacina inhiben hERG, y alfuzosina, ranolazina, y moxifloxacina induce prolongación QT, pero no torsadogénico en nuestro modelo o en humanos. De esta forma la cuantificación incidencia y riesgo de pro-arritmia (con base en el contra eficacia) de los compuestos cardioactivos conocidos revelan medio para pronosticar los efectos clínicos potenciales . La combinación de tecnologías avanzadas en iPSG- CMs de microelectrodo, bio-sensibilización y humanos juntos i i crea una oportunidad única para evaluar un efecto de candidato de fármaco en la función cardiaca en altio rendimiento y para el estudio de biología cardiovascular humana. El análisis de impedancia de rápida velocidad muestreo revela que iPSC-CMs recapitula la contracción i cardiaca y la relajación del miocardio y confirma los efectos I esperados de fármacos cardioactivos conocidos. Los fármacos anti-arritmogénicos indujeron una identificación de 'la impedancia de arritmia de manera robusta y reproducible | a concentraciones relevantes para la exposición de la eficacia clínica. Los fármacos carentes de TdP y otra arritmia severa, no provocaron ninguna arritmia hasta 10 veces la exposición clínica máxima independientemente de si los compuestos inhiben hERG o QT prolongado in vivo, demostrando la aumentada precisión dé iPSC-CMs humano para pronosticar él riesgo arritmogén'ico de candidatos de fármaco comparado con las estrategias actuales que utilizan la inhibición hERG con QT prologado como reemplazo. La clasificación de los candidatos de fármaco para cambios arrítmicos en iPSC-CMs i humanos facilitarán el perfilamiento completo de la I evaluación segura cardiaca y mejoraran el enfoque primario de la evaluación de seguridad cardiaca: detección de i arritmogenicidad. j Definiciones i La frase "uno" o "una" entidad com la presente se refiere a uno o mas de e ejemplo, un compuesto se refiere a uno o más menos un compuesto. Es decir, los términos í "uno o más" , "por lo menos uno" pueden utilizarse de manera intercambiable en la presente . j I Como se utiliza en esta descripción, si alguna frase transicional , o en el cuerpo de la replicación, los términos "comprende" y "que comprende" se interpretarán como teniendo un significado final abierto" . Es decir, los i términos se interpretarán a manera de sinónimos con la frase "que tiene al menos" o "que incluye al menos" . Cuando se utilizan en el contexto de un proceso, el término "que comprende" significa que el proceso incluye por pasos mencionados, pero pueden incluir pasos Cuando se utiliza en el contexto de un compuesto o composi .ci.ó.n, el te.rmino "que comprende" significa que eli compuesto o la composición incluyen por características o compuestos mencionados, incluyen características o componentes adiciona Como se' utiliza en la presente, a indique específicamente lo contrario, la palab utiliza en el sentido "inclusivo" de "y/o" y e "exclusivo" de "cualquiera/o".

El término "opcional" o "opcionalmente" como se utilizan en la presente significa que un evento o circunstancia subsecuentemente descrita puede, pero no necesita, ocurrir, y que la descripción incluye instancias en donde el evento o circunstancia ocurre y las instancias en I las cuales no ocurre .

El término "aproximadamente" se utiliza en !la presente para significar aproximadamente, en la región de,j a grandes rasgos o alrededor de . Cuando el término "aproximadamente" se utiliza junto con un intervalo numérico, í modifica el intervalo por la extensión de los límites por arriba y por debajo de los valores numéricos establecidos. En general, el término "aproximadamente" se utiliza en la presente para modificar un valor numérico por arriba y por debajo del valor manifestado a través de una variación del 20%.

El término "arritmia" como se utiliza en presente en general se refiere a una condición en la cuál existe una actividad eléctrica anormal en el corazón causando I que el corazón lata demasiado rápido o demasiado lento, ejn donde el ritmo cardiaco puede ser regular o irregular!. Algunas arritmias son amenazadoras de la vida y pueden dar i como resultado un paro cardiaco y la muerte repentina|, mientras otras arritmias son menores y pueden ser referidas como variantes normales. La arritmia puede clasificarse por los grados, por ejemplo, normal, taquicardia (mayor de 100 latidos/minuto) , y bradicardia (menor de 60 latidos/minuto)ji o mecanismo, por ejemplo, automaticidad, reentrada y fibrilación. Los latidos arrítmicos ventriculares consideran que se inician por el ciclaje. de Ca2+ alterado cardiomiocitos, ya sea a través de polarizaciones posteriores tempranas (EAD, mediada por la re-activación del canal Ca2+ del tipo L inactivado) o despolarizaciones posteriores retrasadas (DAD, mediadas por una corriente del intercambiador Na+/Ca2+ aumentado)".

El término "pro-arritmia" como se utiliza en presente se refiere a una nueva o más. frecuente aparición arritmia preexistente y se precipita a través de la tera anti-arrítmica. Es decir, puede ser un efecto secundario la terapia anti-arrítmica con, por ejemplo, una glicos cardiaca .

El término "arritmia inducida por fármaco" como utiliza en la presente significa arritmia causada, inducida lo i precipitada por o que se cree que es causada, inducida lo I precipitada por un fármaco o medicamento. I El término "cardiomiocito" o "cardiomiocitos" como i se utiliza aquí ampliamente se refiere a una o más células I i musculares del corazón. El término cardiomiocito incluye I células del músculo liso del corazón, así como células del músculo cardiaco, que incluyen también células del músculoi I estriado así como células del músculo de latido espontáneo i del corazón. ! I El término "potencial de campo" significa laj medición de la diferencia potencial entre un par electrodos} i que se eleva del cambio de "potencial de membrana" de un grupo de cardiomiocitos durante el ciclo de contracciónj y relajación. El "potencial de membrana" es algunas veces utilizado de manera intercambiable con un potencial de célula pero se aplica a cualquier bicapa o membrana lípida. jEl potencial de membrana (también denominado potencial ¡de transmembrana o diferencia de potencial de transmembrana cjon gradiente de potencial de transmembrana) es la diferencia potencial eléctrica (medida por voltaje) a través de una membrana plasmática de la célula. El potencial de membrana se eleva de la acción de los transportadores de ión embebidos en la membrana que mantienen las concentraciones de ión viables dentro de la célula. Potencial de membrana tipico de una célula surge de la separación de iones de sodio de aniones inmóviles intracelulares a través de la membrana de la célula. Esta separación resulta de un gradiente de concentración de iones de potasio mediante las bombas i o transportes. A pesar que existe un potencial eléctrico través de la membrana debido a la separación de carga, existe una diferencia mensurable actual en la concentración i global de iones positivos y negativos a través de la membrana. De esta forma, no existe un exceso de carga mensurable en ningún lado. Las membranas celulares son típicamente permeables a solamente un subgrupo de especies iónicas, incluyendo pero no limitándose a iones de potasio, iones de cloro, iones de bicarbonato, y otros. I El término "célula madre pluripotente" como |se célula para diferenciarse en múltiples tipos celulares. También se entiende que las células multipotentes pueden estar más restringidas en su habilidad para diferenciarse que las células pluripotentes . El término "iSCs", como se utiliza en la presente se refiere a los iPSCs o las células madre multipotentes inducidas (iMSCs, por sus siglas en inglés)!.

Algunas veces, el término "iPS" o "célula iPS" puede utilizarse en lugar de "iPSC"; similarmente, algunas veces l término "iMS" o "célula iMS" puede utilizarse en lugar de i .1 "iMSC" . Los métodos y composiciones descritos en la presente que son aplicables a iPSCs también son aplicables para ¡ células madre inducidas (iSCs, por sus siglas en inglés) e i iMSCs. I El término "impedancia" se utiliza en su sentidó más amplio para indicar cualquier valor recolectado, medido y/o determinado que puede incluir uno o ambos de los componentes resistivos y reactivos. j Loa datos de impedancia pueden incluir valores de parámetro eléctricos que pueden utilizarse para determinar la impedancia (tales como valores de corriente y/o voltaje) . I| El término "MEA" como se utiliza en la presente significa utilizarse examina una acoplada, imita los electrocardiogramas in vivo. Los MEA se han utilizado previamente generales del potencial de derivados de la célula madre y los cambios electrofisiológicos pueden utilizarse como una medición d Ie reemplazo de las arritmias. j El término "TdP" como se utiliza en la presente sé refiere a Torsades de Pointe. | El término "intervalo QT" como se utiliza en l ¡ presente se refiere a la medición del tiempo entre el inició de la onda Q y el término de la onda T en el ciclo eléctrico; del corazón. El intervalo QT de cardiaco (entre más rápido es el el intervalo QT) . Si es anormalmente prolongado o acostado, ¡ existe un riesgo de desarrollar arritmias ventriculares . La j prolongación del intervalo QT puede medirse utilizando ¡ ensayos que miden la alteración de los canales del ión. Un ! ejemplo de tal tipo de ensayo es un ensayo de canal hERG. El ! ensayo de canal hERG se describe en la presente como asociado ! como una indicación de la prolongación del intervalo QT, y. i tal ensayo también es un indicador primario del bloqueo del canal de K(+) . hERG (que significa Gen Relacionado con "Et r- i a-go-go Humano") codifica un canal de ión de potasjio responsable de la repolarización de la corriente 1 [laquo] en el potencial e acción cardiaca. Este canal es sensible | a I la unión del fármaco, que puede resultar en una función ' i disminuida del canal y el denominado síndrome QT largo i adquirido. A pesar que existen otros objetivos potenciales i para efectos cardiacos adversos, la vasta mayoría de l s i fármacos asociados con la prolongación QT adquirida se sabe que interactúa con el canal de potasio hERG. Una de lJs razones principales para este fenómeno es el vestíbulo interno más grande del canal hERG, de esta forma proporcionando más espacio para que muchas diferentes clases i i de fármaco se unen y bloqueen este canal de potasio. 1 i El término "concentración clínicamente eficaz" o í "Craax" , como se utiliza en la presente significa la i i concentración de plasma a obtener la eficacia terapéutica en i la clínica. La concentración en plasma terapéutica máxima, ¡ Cmax . i i El término "IBR" o "ritmo cardiaco irregular" como! se utiliza en la presente significa el grado de incidencia de] latidos irregulares o arrítmicos y se calcula como el número de latidos irregulares/latidos totales en 1 minuto. IBR será un valor entre 0-1 (o 0-100% sí se utiliza el % como la i unidad) La concentración del compuesto en donde IBR > 0.2 i se i determinó (IB2o) · IB20 es igual a la concentración más baja que produce un valor IBR > 0.2 (> 20% de latidos irregulares durante 1 minuto) . Este umbral se seleccionó empíricamente para optimizar la sensibilidad y la especificidad. Pajra estimar la eficacia son las concentraciones eficaces clínicas í máximas (Cmax) . En esta solicitud, la Puntuación de Pro-arritmia Pronosticada (PPS) se calcula a través de dos formas i diferentes: 1) el riesgo pro-arrítmico general sé calculó dividiendo el Cmax por IB2o/ que da una proporción de ía exposición in vivo humana con relación a la incidencia de arritmia observada, para crear un PPS. Con el recorte de >100 i utilizado como un nivel de preocupación (Tabla I) y 2) él riesgo pro-arrítmico general se calculó dividiendo el IB2o por i el Cmax, que da una proporción de la incidencia de arritmia ¡ observada con relación a la exposición in vivo humana para i crear un PPS, con el recorte de < 10 utilizado como un nivejl de preocupación (Tabla II). Utilizando Cmax/IB20, con- base en la incidencia TdP clínica, un compuesto con un PPS>100. debería ser un signo de un riesgo in vivo significativo. Por ejemplo, los compuestos cardioactivos como ouabaina y i quinidina mostraron latidos arrítmicos a concentraciones I menores de la concentración eficaz y de esta forma tienen un I PPS alto. El segundo método de cálculo (IB20/Cmax) comúnmente se utiliza en el campo de evaluación de la severidad y denomina "Margen de Seguridad" , que indica que tan cerca jes i la concentración que causa la preocupación de seguridad a jla i concentración de la eficacia terapéutica en la clínica. Entre mayor es el margen de seguridad, menor es el riesgo de la toxicidad por . fármaco. Inversamente, utilizando el primer método, (Cmax/IBáo) / entre mayor es el valor PPS, mayor es el i riesgo de una toxicidad con fármacos. i i I El término "alto rendimiento" como se utiliza .en la presente significa un diseño de ensayo que ermite la fácil clasificación de múltiples muestras simul capacidad de manipulación robótica. Otra deseada de los ensayos de alto rendimiento ensayo que se optimiza para reducir el uso minimizar el número de manipulaciones con el fin de obtener el análisis deseado. | i Los ejemplos de formatos de ensayos incluyen placas í de 96 cavidades .o. 384 cavidades. Es bien conocido en l i técnica que como la miniaturización de moldes de plástico y ¡ los dispositivos de manejo líquidos están avanzados, o como los dispositivos de ensayo mejorados se diseñan, mayoresi i números de muestras pueden llevarse a cabo utilizando el diseño de la presente invención. En una modalidad, las¡ j células , se cultivan y analizan en placas de micro-titulación que contienen una pluralidad de cavidades tales como placas'! i de 96 ó 386 cavidades. 1 El término "instalación de descubrimiento ¡de i fármaco" como se utiliza en la presente significa cualquier instalación en donde el propósito de utilizar los métodos i descritos en la presente es para identificar fármacos farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, cualquier i instalación en donde los métodos descritos en la presente se utilizan para identificar posibles moléculas de fármacos que tienen bajo riesgo de inducir cardiotoxicidad según medido i por la incidencia de la arritmia inducida por el fármaco. j Los términos técnicos y científicos utilizados la presente tienen el significado comúnmente entendido por experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención, a menos que se defina lo contrario.

Se hace referencia a la presente a varias metodologías y materiales conocidos por el experto en la técnica. Los trabajos de referencia estándar establecen los I principios generales de la farmacología e incluyen Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics , 10 Ed. , McGraw Hill Companies Inc., New York (2001). Cualquier! I material y/o método adecuado conocido por el experto en lai técnica puede utilizarse para llevar a cabo la presente invención. Sin embargo, se prefieren los materiales y métodos preferidos. Los materiales, reactivos y similares a los cuales se hace referencia en la siguiente descripción y los ejemplos se pueden obtener *de fuentes comerciales, a menos que se observe lo contrario.

EJEMPLOS METODOS Químicos Los reactivos in vitro se compraron de Signa Chemical Co. (St Louis MO) . j I Métodos ! Cultivo Celular. Los cardiomiocitos derivados de hiPSC (iCélulas) de Cellular Dynamics International (CDI) se descongelaron en Medio de Plaqueo (CDI y plaqueado como células individuales recubiertas con 0.1% de Gelatina (Sigma) , placas de cultivo tisular de 6 cavidades (Corning) una densidad de 2.2 - 2.7 x 106 células por cavidad. Las i células se cultivaron por 3-5 d a 37 °C, 7% de C02 antes de I re-plaquear en e-placas cardio de 96 cavidades xCELLigence® (ACEA/Róche Applied Sciences) o arreglos de microelectrodp (MEA, Sistemas Multicanal) . El medio se cambió cada 2 d después del plaqueo utilizando Medio de Mantenimiento (CDI)', j precalentado a 37°C para minimizar el choque de temperatura en las células.

Introducción El nuevo sistema cardio RTCA permite el de experimentos celulares sobre un mayor marco de tiempo se mide en paralelo a la contracción (latidos) de las células j E cada punto en el tiempo de medición el Indice Celular y lá Frecuencia y Amplitud subyacentes de la contracción se miden.

I Sistema j I La Estación Cardio xCELLigence® RTCA se coloca !en la incubadora prestablecida a 7% de C02 | Placas e cardio xCELLigence y el replaqueo MEA.j Las iCélulas cultivadas en placas de 6 cavidades cosecharon dos veces lavando en dPBS (GIBCO) , después recolectaron con 0.5% de Tripsina-EDTA (GIBCO) , incubaron a 37°C, 7% de C02. La tripsina se extinguió con Medio de Mantenimiento y las células se centrifugaron colectivamente a 69g por 5 minutos y se volvieron j a i suspender en Medio de Mantenimiento para producir la densidad objetivo. Para el re-sembrado en la e cardio, las células se plaquearon a una densidad objetivo' de 5 x 104 por cavidad, estimando una eficiencia de 80%· en el sembrado. Las placas e cardio se cubrieron con 0.1% de i Gelatina por 3 h a 37°C. Las mediciones de impedancia de fondo para e-placas cardio se hicieron con el volumen i final de medio equilibrado a 37°C pero sin las células, inmediatamente antes de volver a sembrar las células. Las células se monitorearon cada 1 h mediante una duración dje barrido, de 20 s por medio del sistema cardio xCELLigencef® i RTCA a su velocidad de muestreo máxima (77 Hz) antes iniciar la experimentación.

Los MEA se prepararon de acuerdo con las i instrucciones del fabricante. En resumen, los i microelectrodos en placas MEA de 6 cavidades se cubrieron i con 2 µ? de Fibronectina (Sigma) diluido 1:20 y se i incubaron a 37°C por 3 h. Las células se volvieron & sembrar a la densidad objetivo de 3 x 104 células en unj I suministro de 2 µ? a los microelectrodos y se incubaron a| i 37°C, 7% C02 por 3 h antes de llenar cada cavidad con el' i i i Medio de Mantenimiento. El medio de las e -placas cardio' y los MEA se cambiaron cada 2 días en lo sucesivo, utilizando Medio de Mantenimiento calentado a 37 °C. lias células se cultivaron por 3-7 d antes de conducir í¡un experimento en las e-placas cardio o MEA. J Experimentación xCELLigence® y MEA. Las reservas i del compuesto se prepararon en DMSO o dH20 a 1000 veces la í concentración ensayada más alta. xCELLigence®, las reservas del serialmente en Medio de Mantenim cultivo tisular de 96 cavidades ( concentración objetivo. La placa de dilución se incubó jy equilibró a 37°C antes de la exposición de la célula. L'a mitad del volumen medio se removió de la e-placa cardio y i reemplazó con un volumen igual de 2x más la concentración del compuesto, produciendo la concentración objetivo final en la cavidad respectiva. Todos los compuestos se ensayaron como n > 3 en múltiples e-placas cardio xCELLigence® monitoreó los cambios en los latidos por duraciones de barrido de 20 s periódicas a 77 Hz . ¡ Para la experimentación MEA, las reservas del compuesto se diluyeron serialmente en Medio de í Mantenimiento en tubos eppendorf a 20x las concentraciones, i objetivo. Las cavidades de los MEA tuvieron la mitad del volumen en cada cavidad reemplazado con Medio de I i I Mantenimiento caliente fresco, inmediatamente antes de ! la I experimentación para así ser consistente con el reemplazo i del medio para la experimentación xCELLigence®. Los MEA ise dejaron un período de equilibrio de 15 min en el sistema de registro MEA (Multichannel Systems) , antes de jla i exposición del compuesto. La temperatura se mantuvo a 37i°C I y un flujo de aire constante de 95% de 02, 5% de C02, se bombeó sobre los MEA. Las adiciones del compuesto se i hicieron en adiciones serialmente en aumento, registrando por 125 min a cada concentración. Todos los compuestos se ensayaron a n = 4 cavidades. Cada MESA de 6 cavidades poseyó al menos una cavidad como el control de vehículo ! comparado con el tiempo (DMSO o dH20) . j i Análisis de Datos. Los datos primero se i analizaron mediante los módulos de análisis integrados de i los sistemas xCELLigence® y MEA, los resultados iniciales I después se exportaron en plantillas de Microsoft Excel desarrolladas internamente para el análisis semij-automático adicional Las contracciones/latidos arrítmicos I arrítmica Pronosticada" (PPS) , primero se determinó una "Proporción de Latido Irregular" (IBR) . La IBR se define como la proporción de conteos de latidos arrítmicos jal número total de latidos durante un minuto. Los valores IBR para cada concentración en cada punto en el tiempo seleccionado se promediaron de 3 a 5 placas. jLa concentración más baja del fármaco, que generó un valor IBR = 0.2 se determinó y denominó "IB2o" · Finalmente, lia concentración en plasma terapéutica máxima (Cmax) |se dividió entre IB20 para llegar al PPS . Un PPS > 100 es jun nivel preocupante para arritmia inducida por fármaco. I estadística de las diferencias se analizó utilizando la I prueba i de student (Excel 2003 SP3) , asumiendo variaciones iguales, con un valor p de < 0.05. j i Protocolo y Criterio de Funcionamiento j Protocolo: j 1. Las iCélulas se dejaron acoplar en placas de j6 cavidades en medio de plaqueo j 2. El primer cambio de medio ocurre a las 48 ! horas después del acoplamiento y las células se reabastecieron con Medio de Mantenimiento iCélula. I 3. Las células se disociaron y plaquearon en |e-placas cubiertas con fibronectina a 50K células/cavidád . Las células se raonitorearon durante hasta 3 dias con una velocidad de medición de 1 medición/hora. A continuación las células se lavaron y volvieron a monitorear durante 2-3 días con una velocidad de medición de ' 1 medición/hora. 4. Los compuestos se aplicaron a las cavida por triplicado a las 24 horas o más después del sembra hasta que se obtuvo un latido estable en todas ¦ ' cavidades . ¡ 5. La medición de la impedancia inició después lie la finalización del sembrado de células con un intervalo I de medición de 30 segundos en todo el experimento. La velocidad de medición después de la adición del compuesto es de 60 mediciones/hora durante la primera hora después del tratamiento y 12 mediciones/hora por la segunda jy i tercera hora después del tratamiento y 2 mediciones/horja durante las siguientes 24 horas. Para el monitoreo de 24 ¡a 72 horas después del tratamiento, la velocidad de la medición es de 1/h. j 6. Después de la aplicación del compuesto, lja contracción y la viabilidad se midieron hasta por 7¡2 horas. En los ejemplos seleccionados, los compuestos pueden estudiarse durante un período de tiempo más largo. j Diseño de la Cardio-placa : 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Comentarios Cardioraiocitos iCélula en gelatina 1.1: compuesto 1 en concentración 1 , 2.1: compuesto 2 en concentración 2 x.y: compuesto x en concentración y 1 D: DMSO S : solvente i N: control negativo Métodos/Instrumentos de Referencia: Los compuestos utilizados para los experimentos Cardio RTCA se clasificaron con el Arreglo de Microelectrodo I (MEA) y para citotoxicidad utilizando ATP como el estándar dé comparación.

La invención anterior ha sido descrita con algo de detalle a manera de ilustración y ejemplo, para propósitos jde j claridad y entendimiento. Será obvio para un experto en lia técnica dentro tanto, ilustra lo tan descripción anterior, sino más bien determinarse referencia a las siguientes reivindicaciones anexas, j con el completo alcance de equivalentes a los cuales se intitulan tales reivindicaciones. j Todas las patentes, solicitudes ¦ de patente, jy publicaciones citadas en esta solicitud se incorporan por i referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada patente, solicitud de patente 'O publicación individua se denotara individualmente. ¡ Se hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención.

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES I I Habiéndose descrito la invención como antecede, reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: | 1. Un método para determinar el riesgo de arritmia inducida por fármaco caracterizado porque comprende: ^ a) proporcionar cardiomiocitos; j b) poner en contacto los cardiomiocitos con 'el í fármaco; | c) detectar la irregularidad del ritmo cardiaco monitoreando cualquier contracción celular o potencial cié campo . I I 2. El método de conformidad c.on la reivindicación ¡ 1, caracterizado porque los cardiomiocitos son de origen de i ¦ perro, mono, rata, conejo, o humano. ¦ 3. El método de conformidad con la reivindicación I 1 ó 2, caracterizado porque los cardiomiocitos son de origen humano . ' I . El método de conformidad con cualquiera de las i reivindicaciones 1-3, caracterizado porque los cardiomiocitos í se producen de una fuente de células madre. ¡ I 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la fuente dé I células madre es una fuente de células madre embrionarias. i I í 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque los cardiomiocitos se producen de una fuente de células madre pluripotentes . j 7. El método de conformidad con la reivindicacijón 6, caracterizado porque la fuente de células madre es una fuente de células madre pluripotentes inducida. j 8. El método de conformidad con cualquiera de las I reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la incidencia de la arritmia es detectada por el monitoreo de cambios en el potencial del campo celular. · | 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la contracc celular se monitorea a través de la medición de impedancia. j 10. El método de conformidad con la reivindicación I 9, caracterizado porque la contracción celular se monitorea |a i través de la medición de la impedancia a una f ecuencia de velocidad de captura de datos capaz de identificar e¡l movimiento de los cardiomiocitos durante la contracción. ' 11. El reivindicaciones 9 ó se mide con una veloc 12.9 milisegundos . 12. El método de conformidad con cualquiera de las ¡ reivindicaciones 1-11, caracterizado porque la detección dé ? la arritmia comprende monitorear aumentos, disminuciones j o irregularidades del ritmo cardiaco. j 13. El método de conformidad con la reivindicacijón 12, caracterizado porque la irregularidad del ritmo cardiaco es indicativa de Torsades de Pointes . ! • I 1 . El método de conformidad con la reivindicación ¦ I 12, caracterizado porque la irregularidad del ritmo cardiaco es indicativa de la prolongación de QT. 15. El método de conformidad con la reivindicación i 12, caracterizado porque la irregularidad del ritmo cardiaco • I se debe a la alteración de un canal de ión cardiaco. | 16. El método de conformidad con la reivindicación I 15, caracterizado porque el canal de ión cardiaco es un canal de potasio. j 17. El método de conformidad con la reivindicación I I 16, caracterizado porque el canal de potasio es el canal hERG . ! 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el canal de ión cardiaco es un canal de calcio. 19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el canal de ión cardiaco es un canal de sodio. ! 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones.1-19, caracterizado porque además comprended d) calcular el IBR. 21. El método de conformidad con la 20, caracterizado porque un IBR menor que o utiliza para designar un bajo riesgo de arritmia. j 22. El método de conformidad con la reivindicacilón 20 ó 21, caracterizado porque además comprende: j I e) calcular la proporción de IB20 con relación | a Cmax/ dando como resultado un. PPS o calcular la proporción 'de 1 IB2o con relación a Cmax, dando como resultado un PPS. j 23. El método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque además comprende: 1 e) calcular la proporción de Cmax con relación a IB2o, dando como resultado un PPS. 24. El método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque un PPS menor que o igual a 100 se utiliza para designar un bajo riesgo de arritmia. | 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-24, caracterizado porque además comprende : ¦ j f) comparar el resultado del paso e) con el de un fármaco inductor de arritmia conocido. j 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizado porque el método para determinar el riesgo de arritmia inducida por fármaco se conduce en un formato de alto rendimiento. i 27. El método de conformidad con cualquiera de las i reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el método para determinar el riesgo de arritmia inducida por fármaco ise conduce para clasificar moléculas en una configuración de desarrollo de f rmacos.