MX2013003341A

MX2013003341A - Formulaciones para el factor estimulante de colonia de granulocito de bovino y sus variantes.

Info

Publication number: MX2013003341A
Application number: MX2013003341A
Authority: MX
Inventors: Juan Davagnino; Catherine Ngan Kha; Alan Voskamp Klotz
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2010-09-23
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2013-10-01
Also published as: KR20150061030A; PH12013500538A1; US12138296B2; KR20130055665A; SI2618830T1; WO2012040421A1; EA026073B1; RS53962B1; CL2013000771A1; DK2618830T3; EP2618830A1; JP2013538828A; TW201305194A; CN103096916A; HRP20150476T1; MY161665A; US11273202B2; IL224848A; US20220152155A1; ES2540862T3

Abstract

Esta invención proporciona formulaciones acuosas estables que comprenden un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo una sustancia amortiguadora y un excipiente, en donde la formulación está sustancialmente libre de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán. La invención también proporciona métodos de uso, una forma liofilizada o en polvo de, y un proceso para, preparar la formulación.

Description

FORMULACIONES PARA EL FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIA DE GRANULOCITO DE BOVINO Y SUS VARIANTES El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos (G-CSF) es un elemento de la familia de supergene de la hormona de crecimiento. G-CSF estimula la proliferación de células precursoras de la médula ósea específicas y su diferenciación en granulocitos. Además, G-CSF es un potente estímulo para proliferación de neutrófilo y maduración in vivo (Cohén et al., Proc Nati. Acad. Sci. 1987; 84: 2484-2488; véase también Heidari ef al., Vet. Immol. Imunopathol. 2001; 81:45-57). G-CSF también es capaz de inducir activación funcional o "cebado" de neutrofilos maduros in vitro (Weisbart, R.H. ef al., Annals of Interna! Medicine 1989; 110:297-303). G-CFS se ha mostrado por cebar granulocitos humanos e intensificar la liberación de superóxido estimulada por el N-formil-metíonil-leucil-fenilalanina de péptido quimiotáctico (S. Kitagawa, ef al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987; 144:1143-1146 y C.F. Nathan, Blodd 1989; 74:301-306), y para activar fagocitosis mediada por neutrófilo IgA humano (Weisbart, R.H., ef al., Nature 1988; 332: 647-649).

G-CSF se ha encontrado por ser útil en el tratamiento de indicaciones en donde un incremento en neutrofilos puede proporcionar beneficios. G-CSF también es útil solo, o en combinación con otros compuestos (tales como otras citocinas) para crecimiento o expansión de células en cultivo, por ejemplo, para transplantes de médula ósea.

El cDNA de clonación y expresión de G-CSF humano recombinante (hG-CSF) se ha descrito, y el hG-CSF recombinante exhibe la mayoría, si no toda de las propiedades biológicas de la molécula nativa (Souza, L. et al., Science 232, 61-65 (1986)). El análisis de secuencia del cDNA y clones de DNA genómico ha permitido la deducción de la secuencia de aminoácido y revela que la proteína es 204 aminoácidos junto con una secuencia de señal de 30 aminoácidos. La proteína madura es 174 aminoácidos juntos y no poseen potencial a sitios de glicosilación enlazada a N pero varios sitios posibles para glicosilación enlazada a O.

Se conocen preparaciones farmacéuticas que contienen hG- CSF en la técnica T incluyen numerosas formulaciones. Por ejemplo, se describen varias formulaciones de hG-CSF en Piedmonte et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 60: 50-58 (2008). Hermán et al., in Formulation, Characterization and Stability of Protein Drugs, Rodney Pearlman y Y. Joh-n Wang, eds., Plenum Press, New York (1996), Patente Estadounidense No. 5,919,757 por Michaelis et al., y Patente Estadounidense No. 6,908,610 por Sato et al. Tradicionalmente, se incluyen surfactantes en las formulaciones hG-CSF y pueden proteger a hG-CSF a interfaces potencialmente desestabilizantes, contra superficies encontradas durante el procesamiento, y contra la alteración de su estabilidad conformacional.

También se ha descrito el cDNA de clonación y expresión de G-CSF bovino recombinante (bG-CSF). Por ejemplo, la secuencia polinucieotido y polipéptido de bG-CSF maduro está presentada en la Patente Estadounidense No. 5,849,883, la cual también describe métodos para clonar, aislar y purificar el polipéptido y análogos de los mismos. El bG-CSF maduro es de 174 aminoácidos de longitud y tiene el 82% de homología a hG-CSF. Heidari ef al., supra, describe la expresión, purificación y actividades biológicas de bG-CSF.

La administración de bG-CSF al ganado puede proporcionar beneficios terapéuticos. Por lo tanto, es deseable una formulación farmacéutica que contiene bG-CSF para utilizar su potencial terapéutico. Sin embargo, las formulaciones farmacéuticas de bG-CSF desarrolladas de conformidad con métodos tradicionales conocidos en la técnica resultan en propiedades del producto indeseable, tal como agregación y desestabilización del polipéptido bG-CSF y/o la formulación.

Por lo tanto, existe una necesidad para una formulación farmacéutica de bG-CSF estable con propiedades deseables, tal como propiedades de agregación y desestabilización del producto mínimas. Por lo tanto, la presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas acuosas estables con un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo el cual exhibe propiedades deseables y también proporciona ventajas relacionadas.

Esta invención proporciona formulaciones acuosas estables que comprenden un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, una sustancia amortiguadora y un excipiente, en donde la formulación está sustancialmente libre de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán. La invención también proporciona métodos de uso, una forma liofilizada o en polvo de, y procesos para preparar la formulación.

Las formulaciones acuosas estables del factor estimulante de colonias de granulocitos bovino ("bG-CSF") de conformidad con la invención, contiene un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo. Como se usa en la presente, "polipéptido G-CSF bovino" (alternativamente referido como "polipéptido bG-CSF", G-CSF bovino" o "bG-CSF") y variantes del mismo puede incluir aquellos polipéptidos y proteínas que tienen al menos una actividad biológica de un CSF, análogos de bG-CSF, mutantes de bG-CSF, bG-CSF glicosilados alterados, bG-CSF conjugados con PEG, isoformas de bG-CSF, miméticos de bG-CSF, fragmentos de bG-CSF, proteínas de bG-CSF híbridas, proteínas de fusión, oligómeros y multímeros, homólogos, variantes del patrón de glicosilación, variantes, variantes de empalme, y muteínas del mismo, con respecto a la actividad biológica del mismo, y además con respecto al método de síntesis o manufactura del mismo, que incluye, pero no se limita a, recombinante (si es producido de cDNA, DNA genómico, DNA sintético y otra forma de ácido nucleico), in vitro, in vivo, por microinyección de moléculas de ácido nucleico, métodos sintéticos, transgénicos y activados por gene. Adicionalmente, el término polipéptido bG-CSF o una variante del mismo abarca polipéptidos bG-CSF que comprende una o más sustituciones de aminoácidos, adiciones o supresiones. Véase, Patente Estadounidense No. 5,849,883 para ejemplos de análogos de G-CSF bovino. La secuencia del polipéptido bG-CSF maduro es 174 aminoácidos en longitud es como sigue: T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P Además, el polipéptido bG-CSF con un residuo de aminoácido de metionina inicial es como sigue: T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P Se han descrito sustituciones en una amplia variedad de posiciones de aminoácido en bG-CSF. Las sustituciones que incluyen pero no se limitan a aquellos que modulan la estabilidad farmacéutica, incrementan la actividad agonista, incrementan la resistencia a proteasa, convierten el polipéptido en un antagonista, etc., se abarcan por el término polipéptido bG-CSF o una variante del mismo.

El término polipéptido bG-CSF o una variante del mismo también incluye bG-CSF glicosilado, tal como pero no se limita a polipéptidos glicosilados en cualquier posición de aminoácido, formas glicosiladas enlazadas a N del polipéptido, o formas glicosiladas enlazadas a O del polipéptido. Las variantes que contienen cambios de nucleótido único también se consideran como variantes biológicamente activas del polipéptido bG-CSF. Las variantes que contienen cambios de nucleótido único también se consideran como variantes biológicamente activas de bG-CSF. Además, también se incluyen las variantes de empalme. El término polipéptido bG-CSF o una variante del mismo también incluye heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros u homomultímeros bG-CSF de cualquiera de uno o más bG-CSF o cualquier otro polipéptido, proteína, carbohidrato, polímero, molécula pequeña, enlazador, ligando u otra molécula activa de cualquier tipo, enlazado por medios químicos o expresado como una proteína de fusión (véanse, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,261 , 550; 6, 1 66, 183; 6,204, 247; 6,261 ,550 y 6,01 7,876) , así como análogos de polipéptido que contienen, por ejemplo, supresiones específicas u otras modificaciones aún manteniendo la actividad biológica (véanse, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,261 , 550; 6,004,548 y 6,632,426). Los polipéptidos bG-CSF y variantes del mismo se describen, por ejemplo en la Solicitud de Patente Estadounidense 12/507,237 (ahora Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 201 0/0035812) , incorporada en la presente por referencia. En algunas modalidades, se incorporan uno o más aminoácidos que no se codifican naturalmente en una o más de las siguientes posiciones en bG-CSF: 8, 62, 69, 1 25, 1 33, 1 36 y cualquier combinación de los mismos (polipéptido bG-CSF maduro o los am inoácidos correspondientes en el polipéptido bG-CSF con un residuo de aminoácido de metionina inicial).

En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina de aminoácido codificado no naturalmente (pAF) es sustituido por el aminoácido codificado naturalmente en una de las siguientes posiciones: S8, S62, L69, G125, T133, A136, y en cualquier combinación de los mismos (polipéptido bG-CSG maduro o los aminoácidos correspondientes en polipéptido bG-CSF con un residuo de aminoácido de metionina inicial).

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es S8pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en posición S8.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es S62pAF de bG-CSF, la cual tiene una secuencia de: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en la posición S62.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF ó una variante del mismo es L69pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en la posición L69.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es G125pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina única (pAF) en posición G125.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es T133pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en posición T133.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es A136pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: T P L G P A R S L P Q S F L L C L E Q V R I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en posición A1 36.

La formulación de la presente invención puede incluir un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo que está enlazado a un enlazador, un polímero o una molécula biológicamente activa. Los enlazadores, polímeros y molécula biológicamente activa se describen en la Solicitud de Patente Estadounidense 1 2/507, 237 (ahora, Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2010/0035812). El término "enlace" o "enlazador" se usa en la presente para referirse a grupos o uniones que normalmente se forman como el resultado de una reacción química y típicamente son enlaces covalentes. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, que incluyen, pero no se limitan a, bajo condiciones fisiológicas por un periodo de tiempo prolongado, quizás aún indefinidamente. Enlaces hidrolíticamente inestables o degradables significa que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, que incluyen , por ejemplo, sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables significa que el enlace puede ser degradado por una o más enzimas. Como se entenderá en la técnica, PEG y polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en el armazón del polímero o en el grupo enlazador entre el armazón de polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula polimérica. Por ejemplo, enlaces de éster formados por la reacción de ácidos carboxílicos PEG o ácidos carboxílicos PEG activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo generalmente hidroliza bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrópicamente degradables incluyen, pero no se limitan a, enlaces de carbonato; enlaces de imina resultandos de reacción de una imina y un aldeh ido; enlaces de éster de fosfato formados haciendo reaccionar un a lcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona los cuales son producto de reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces acetal que son el producto de reacción de un aldeh ido y un alcohol; enlaces de ortoésteres que son el producto de reacción de un formiato y un alcohol; enlaces de péptido formados por un grupo amina, que incluyen pero no se limitan a, en y final de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces de oligonucleótido formado por un grupo fosforamidita, que incluye pero no se limita a, en y final de un pol ímero, y un grupo 5'-hidroxilo de un oligonucleótido.

En algunas modalidades, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo se enlaza a un polímero soluble en agua. Como se usa en la presente, el término "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero que es soluble en solventes acuosos. Enlaces de pol ímeros solubles en agua a un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo puede resultar en cambios que incluyen, pero no se limitan a, vida media del suero incrementada o modulada, vida media terapéutica incrementada o modulada en relación a la forma no modificada, inmunogenicidad modulada, características de asociación física modulada tal como agregación y formación de multímero, unión del receptor alterada, unión alterada a uno o más patrones de enlace y dimerización o multimerización del receptor alterada. El polímero soluble en agua puede o no puede tener su propia actividad biológica, y puede ser utilizado como un enlazador para unir bG-CSF a otras sustancias, que incluyen pero no se limitan a uno o más polipéptidos bG-CSF o variantes de los mismos, o una o más moléculas biológicamente activas. Pol ímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol, propionaldehído de polietilen glicol, monoalcoxi C 1 -C 1 0 o derivados de ariloxi del mismo (descritos en la Patente Estadounidense No. 5,252,714), monometoxi-polietilen glicol, polivinil pirrolidona, alcohol polivin ílico, ácidos de poliamino, anhídrido de diviniléter maleico, N-(2-H idroxipropi l)-metacril a m ida , dextrano , derivados de dextrano que incluye sulfato de dextrano , polipropilen glicol , copolímero óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glicanos, celulosa y derivados de celulosa, que incluyen pero no se limitan a metil celulosa, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, polialquilen glicol y derivados del mismo, copol ímeros de polialquilen glicoles y derivados de los mismos, polivinil etil éteres y alfa-beta-poli(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, y similares, o mezclas de los mismos. Ejemplos de los polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a , polietilen glicol y albúmina en suero. Los documentos WO 03/074087 y WO 03/074088 describen la conjugación de proteínas y moléculas pequeñas a almidón de hidroxialquilo (HAS). Ejemplos de almidones de hidroxialquilo, incluyen pero no se limitan a, almidón de hidroxietilo. Conjugados de almidón de hidroxialquilo y otras moléculas, por ejemplo, puede comprender un enlace covalente entre grupos aldehido terminal del HAS y grupos reactivos de la otra molécula.

En algunas modalidades, el polímero soluble en agua es una porción de poli(etilen glicol). En algunas modalidades, la porción de poli(etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. En otra modalidad, el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa hasta aproximadamente 50 kDa. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 30 kDa. En otra modalidad, el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 15 kDa hasta aproximadamente 25 kDa. En aún otra modalidad, el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa. Una persona experta en la técnica puede entender que un polímero soluble en agua con un peso molecular de "aproximadamente 20 kDa" incluye variabilidad en el peso molecular de aproximadamente 15% (es decir, aproximadamente 17 kDa hasta aproximadamente 23 kDa) en base a la especificación y polidispersión de la porción.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o un variante del mismo es S8pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C AA H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D VT D FA T N I W L Q M E D L G AA P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilalanina (pAF) única en posición S8 y se enlaza a una porción de poli(etilen glicol). Por ejemplo, si la porción de poli(etilen glicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kSa, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo en esta modalidad puede ser identificado como "S8pAF-20K PEG de bG-CSF", indicando que una porción poli(etilen glicol) de 20 kDa se enlaza a la sustitución pAF hecha en la posición S8.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es S62pAF de bG-CSF, la cual tiene una secuencia de: T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en posición S62 y se enlaza a una porción poli(etilen glicol). Por ejemplo, si la porción de poli(etilen glicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa, el polipéptido bG-CSF o variante del mismo en esta modalidad se puede identificar como "S62pAF-20K PEG de bG- CSF", indicando que una porción p o i i ( e t i I e n glicol) de 20 kDa se enlaza a la sustitución pAF hecha en la posición S62.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es L69pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R LC AA H K L C H P E E L L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en posición L69 y se enlaza a una porción poli(etilen glicol). Por ejemplo, si la porción de poli(etilen glicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa, el polipéptido bG-CSF o variante del mismo en esta modalidad se puede identificar como "L69pAF-20K PEG de bG-CSF", indicando que una porción poli(etilen glicol) de 20 kDa se enlaza a la sustitución pAF hecha en la posición L69.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es G125pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: M T P L G P A R S L P Q S F L L C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C AA H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L VA S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en posición G125 y se enlaza a una porción poli(etilen glicol). Por ejemplo, si la porción de poli(etilen glicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa, el polipéptido bG-CSF o variante del mismo en esta modalidad se puede identificar como "G125pAF-20K PEG de bG-CSF", indicando que una porción poli(etilen glicol) de 20 kDa se enlaza a la sustitución pAF hecha en la posición G125.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es T133pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: M T P L G P A R S L P Q S F L L C L E Q V R I Q A D G A E L Q E R L C AA H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L VA S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en posición T133 y se enlaza a una porción poli(etilen glicol). Por ejemplo, si la porción de poli(etilen glicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa, el polipéptido bG-CSF o variante del mismo en esta modalidad se puede identificar como "bG-CSF-T133pAF-20K PEG", indicando que una porción poli(etilen glicol) de 20 kDa se enlaza a la sustitución pAF hecha en la posición T133.

En una modalidad, el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo es A136pAF de bG-CSF, el cual tiene una secuencia de: M T P L G PA R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C AA H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A P T F T S A F Q R R A G G V L VA S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P en la cual se hace una sustitución de para-acetilfenilalanina (pAF) única en posición A136 y se enlaza a una porción poli(etilen glicol). Por ejemplo, si la porción de poli(etilen glicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa, el polipéptido bG-CSF o variante del mismo en esta modalidad se puede identificar como "A136pAF-20K PEG de bG-CSF", indicando que una porción poli (eti len glicol) de 20 kDa se enlaza a la sustitución pAF hecha en la posición A136.

Como se usa en la presente, los términos "estabilidad" y "estable" en el contexto de una formulación que comprende un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo se refiere a despliegue, agregación, degradación, desnaturalización, fragmentación o desestabilización térmica y química del polipéptido bG-CSF o variante del mismo bajo condiciones de manufactura, preparación, transportación y almacenaje proporcionadas. Las formulaciones "estables" de la invención mantienen integridad estructural , lo cual resulta en una retención de actividad biológica, deseablemente más del 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99.5% bajo condiciones de manufactura, preparación , transporte y almacenaje proporcionadas. La estabilidad de las formulaciones se puede valorar por el grado de ag regación, despegilación , degradación, desnaturalización o fragmentación por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen adicionalmente en la presente.

Como se usa en la presente, el término "acuoso" en el contexto de una formación que comprende un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo se refiere a agua, o uno o más solventes orgánicos solubles en agua, o una mezcla del mismo. El término "solvente orgánico" se usa en la presente en su sentido convencional para referirse a un compuesto orgánico líquido, típicamente un material orgánico monomérico en la forma de un líquido, preferiblemente un líquido relativamente no viscoso, la estructura molecular la cual contiene átomos de hidrógeno, átomos de carbono y opcionalmente otros átomos también, y la cual es capaz de disolver sólidos, gases o líquidos.

Las formulaciones de la invención pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular a ser administrada, como también por el método particular usado para administrar la composición (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Ed. 1985)). Portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen pero no se limitan a sustancias amortiguadoras y excipientes, tales como aquellas que contienen salina, salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y/o combinaciones de los mismos. Los portadores adecuados pueden ser sustancias amortiguadoras que contienen succina, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, ¡midazol, acetato bicarbonato y otros ácidos orgánicos. Los portadores adecuados pueden ser excipientes que contienen alcoholes de azúcar polihídricos, aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, aspargina, histidina, alanina, ornitina, leucina, fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicas o alcoholes de azúcar, tal como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinistol, galactitol, glicerol y similares, que incluyen ciclitoles tales como inisitol; polietilen glicol; polímeros de aminoácido; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de peso molecular bajo (es decir, <10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero humana, albúmina de suero de bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrof ílicos tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos tales como xilosa, mañosa, fructuosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa y polisacáridos tal como dextrano Se pueden usar citrato, histidina, maleato, succinato, fosfato o una combinación de los mismos de conformidad con la invención como sustancias amortiguadoras. En algunas modalidades, se usan citrato o succinato como una sustancia amortiguadora en las formulaciones acuosas estables. En algunas modalidades, la sustancia amortiguadora tiene una molaridad de entre aproximadamente 1 0 mM y aproximadamente 50 mM. En una modalidad, la sustancia amortiguadora tiene una molaridad de aproximadamente 30 mM. Las sustancias amortiguadoras pueden ya sea estar presentes en la forma del ácido libre correspondiente o en la forma de sales alcalinas, alcanilo térreas o de amonio. La formulación puede además contener sustancias auxiliares farmacéuticas comunes adicionales. La secuencia de la adición de varias sustancias auxiliares o de la sustancia activa durante la producción de las formulaciones farmacéuticas líquidas es ampliamente independiente del efecto estabilizante en almacenaje encontrado de conformidad con la invención y está en la discreción de la persona experta en la técnica.

Se puede usar cloruro de sodio, trehalosa , sorbitol, arginina o una combinación de los m ismos como excipientes de conformidad con la invención . En una modalidad, el excipiente es arginina. En algunas modalidades, la arginina tiene una molaridad entre aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 500 mM. En otras modalidades, la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 300 mM. En algunas modalidades, la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 250 mM.

Tradicionalmente, las formulaciones farmacéuticas de proteínas incluyen surfactantes. La inclusión de surfactantes puede proteger proteínas a interfaces potencialmente desestabiliza ntes , contra superficies encontradas durante el procesamiento y contra la alteración de su estabilidad conform acional termodinámica. Son bien conocidos surfactantes en la técnica, por ejemplo surfactantes de polisorbato . Un ejemplo de un surfactante de polisorbato es monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán, también conocido por el nombre de la marca Tween 20®. Sin embargo, estudios de una formulación bG-CSF que contiene restos de niveles de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán indican que los agregados se incrementaron hasta 3.2% (como se mide por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)) después de 5 d ías de incubación a 25°C . Así , las formulaciones de la presente invención están sustancialmente libres de un surfactante, un surfactante de polisorbato y/o monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán . Como se usa en la presente , el término "sustancialmente libre" de un surfactante , un surfactante de polisorbato y/o monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán se refiere a una form ulación que contiene menos del 0.033% , menos del 0.001 %, menos del 0.0005%, menos del 00003% o menos del 0.0001 % del surfactante, surfactante de polisorbato y/o monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán. Las form ulaciones de la presente invención están susta ncialmente li bres de surfactante, surfactante de polisorbato y/o monola urato de polioxietilen (20) sorbitán para lograr una formulación estable con propiedades desea bles , tales como m ínima agregación y m ínima desestabil ización del producto, y, en donde es aplica ble, despeg ilación reducida El térm in o " molécula biológ icamente activa" como se usa en la presente, se refiere a cualquier sustancia la cual puede afectar cualquiera de las propiedades físicas o bioquímicas de un sistema biológico, trayectoria, molécula, o interacción que se relaciona a un organismo, que incluye pero no se limita a, virus, bacterias, bacteriófagos, transposones, priones, insectos, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se usa en la presente, moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, cualquier sustancia planeada para diagnosis, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades en humanos u otros animales, o para de otra manera intensificar el bienestar físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequeñas, vacunas, ¡nmunógenos, fármacos duros, fármacos suaves, carbohidratos, átomos inorgánicos o moléculas, tintes, lípidos, nucleósidos, radionúclidos, oligonucleótidos, toxoides, toxinas, células procarióticas y eucarióticas, virus, polisacáridos, ácidos nucleicos y porciones de los mismos obtenidos o derivados de virus, bacterias, insectos, animales o cualquier otra célula o tipo celular, liposomas, micropartículas y micelas.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención incluyen aquellas que también opcionalmente contienen uno o más de otros ingredientes activos, además de un poiipéptido bG-CSF o una variante del mismo. Como se usa en la presente, el término "ingrediente activo" o "ingrediente terapéutico" se refiere a un compuesto terapéuticamente activo, así como también a cualquiera de los profármacos del mismo y, sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables, del compuesto y los profármacos. Otros ingredientes activos se pueden combinar con un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo y puede ser ya sea administrado separadamente o en la misma formulación farmacéutica. La cantidad de otros ingredientes activos para ser proporcionados puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica en base a terapia con bG-CSF.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención incluyen aquellos que también opcionalmente contienen uno o más otros ingredientes inactivos, además de un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo. Como se usa en la presente, el término "ingrediente inactivo" se refiere a un compuesto terapéuticamente inactivo, así como también a cualquiera de los profármacos del mismo y, sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto y los profármacos. Otros ingredientes inactivos se pueden combinar con un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo y puede ser ya sea administrado separadamente o en la misma formulación farmacéutica. La cantidad de otros ingredientes inactivos a ser proporcionada puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica en base a terapia con bG-CSF.

La cantidad del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo en las formulaciones acuosas estables es adecuada para lograr un efecto terapéutico. Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad la cual proporciona el beneficio deseado a un animal e incluye administración para tanto tratamiento como profiláctica. La cantidad puede variar de un individuo a otro y puede depender de un número de factores, que incluyen la condición física completa del paciente y la causa fundamental de la condición a ser tratada. La cantidad de polipéptido bG-CSF o variante del mismo usada para terapia proporciona una proporción aceptable de respuesta de cambio y mantenimiento deseado a un nivel benéfico. Una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones puede ser fácilmente valorada por uno de experiencia ordinaria en la técnica usando materiales y procedimientos públicamente disponibles. Por ejemplo, la cantidad del polipéptido bG-CSF o variante del mismo puede estar presente en la formulación en una cantidad de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 12 gramos/litro, preferiblemente aproximadamente 5 gramos/litro.

De conformidad con la presente invención, las formulaciones acuosas estables de un polipéptido bG-CSF o variante del mismo se puede formular a varios valores de pH. En algunas modalidades, la formulación acuosa estable puede tener un valor de pH de entre aproximadamente 5.7 hasta aproximadamente 6.6. En algunas modalidades, la formulación acuosa estable tiene un pH de entre aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 6.3. El valor de pH deseado de la formulación se ajusta agregando base tal como hidróxidos alcalinos, hidróxidos alcalinotérreos o hidróxido de amonio. Se usa preferiblemente hidróxido de sodio para ajustar el pH. El ajuste del valor de pH deseado puede en principio ser logrado agregando soluciones básicas. En general, se pueden usar sales de bases fuertes con ácidos débiles, tales como acetato de sodio, citrato de sodio, fosfato hidrógeno de di-sodio o di-potasio o carbonato de sodio. Si la solución farmacéutica de la sustancia auxiliar tiene un valor de pH básico, se ajusta por titulación con un ácido hasta que se alcanza el intervalo de pH deseado de 4-5 o 7-8. Ácidos inorgánicos u orgánicos fisiológicamente tolerados llegan en consideración como ácidos tales como por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico o soluciones convencionales de sustancias las cuales tienen un valor pH acídico. A este respecto, algunos ejemplos de sustancias son sales de ácidos fuertes con bases débiles tales como por ejemplo, fosfato dihidrógeno de sodio o fosfato dihidrógeno de potasio.

Como se demuestra en los ejemplos posteriores, las formulaciones bG-CSF de la presente invención muestran concentraciones de agregados deseablemente bajas de polipéptido bG-CSF o una variante del mismo en condiciones de almacenaje bajo estrés y en condiciones de almacenaje aceleradas. Como se usa en la presente, condiciones de almacenaje bajo estrés se evalúan después que las muestras de formulación se incuban a 25°C por 5 días. Como se usa en la presente, se evalúan las condiciones de almacenaje aceleradas después que las muestras de formulación se incuban a 40°C por 1 d ía. También las condiciones de almacenaje se pueden evaluar a otras temperaturas y duraciones variadas para los propósitos de la presente invención. Por ejemplo, las condiciones de almacenaje se pueden evaluar después que las muestras de formulación se incuban a 25°C por 28 d ías o después que las muestras de formulación se incuban a 40°C por 3 días.

Se analizan la concentración de agregado del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo siguiendo las condiciones de almacenaje bajo estrés y condiciones de almacenaje aceleradas. En algunas modalidades, las formulaciones bG-CSF de la presente invención tienen una concentración de agregado del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de menos de aproximadamente 2.1 % (porcentaje en peso/peso) en condiciones de almacenaje bajo estrés. En otras modalidades, las formulaciones bG-CSF de la presente invención tiene una concentración de agregado del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de menos de aproximadamente 1 .5% (porcentaje peso/peso) en condiciones de almacenaje bajo estrés. En algunas modalidades, las formulaciones bG-CSF de la presente invención tienen una concentración de agregado del polipéptido bG-CS F o una variante del mismo de menos de aproximadamente 1 .5% (porcentaje peso/peso) en condiciones de almacenaje aceleradas. En otras modalidades, las formulaciones bG-CSF de la presente invención tienen una concentración de agregado del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de menos de aproximadamente 1 .5% (porcentaje peso/peso) en condiciones de almacenaje bajo estrés. - Además, se pueden utilizar estudios de agitación forzada o estudios de congelamiento-descongelamiento para valorar las propiedades de estabilidad de una formulación de la presente invención. Por ejemplo, un estudio de agitación forzada puede consistir de mezclar una muestra de la formulación en un vaso de precipitado de vidrio a una velocidad fija, tal como 60 rpm, usando un agitador magnético. La agitación puede ocurrir por un periodo de tiempo determinado, tal como dos horas, para determinar las características de la muestra de formulación. Un ciclo congelamiento-descongelamiento puede consistir de congelar una muestra de la formulación por 1 hora a aproximadamente -75°C y descongelarla a temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora hasta que no se observa hielo.

Más aún , como se demuestra en los ejemplos posteriores, las formulaciones bG-CSF de la presente invención pueden mostrar propiedades de desestabilización y/o despegilación deseables del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo en condiciones de a l m acenaje baj o estrés y e n con d i ci ones de a l macenaje aceleradas. Como se usa en la presente, el término "despegilación" puede referirse a la estabilidad de la unión de porciones pegiladas unidas a un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, es decir si las porciones pegiladas permanecen unidas al polipéptido por un tiempo, por ejemplo durante el almacenaje en una solución acuosa, o si tienden a separarse, por ejemplo como un resultado de hidrólisis unida a éster.

En algunas modalidades, las formulaciones acuosas estables de un polipéptido bG-CSF o variante del mismo pueden ser formuladas usando citrato como una sustancia amortiguadora y arginina como un excipiente. En una modalidad, la formulación acuosa se puede preparar usando ácido cítrico monohidratado (Fisher, C/6200/60 o equivalentes) como una sustancia amortiguadora y L-Arginina (Sigma, A8094 o equivalente) como el excipiente. La formulación acuosa se puede preparar agregando 1 .6 ± 0.1 gramos de ácido cítrico monohidratado y 109 ± 0.1 gramos de L-arginina a 200 mL de agua de alta calidad. Por lo tanto, el pH se puede ajustar a 6.0 ± 0.1 usando ácido clorhídrico y la mezcla se puede diluir a 250 mL usando agua de alta calidad. La formulación resultante puede comprender 30 mM de citrato, 250 mM de arginina y un polipéptido bG-CSF o variante del mismo a un pH de 6.0.

Las preparaciones acuosas de conformidad con la invención se pueden usar para producir liofilizados por liof ¡lización convencional o polvos. Las preparaciones de conformidad con la invención se obtienen nuevamente disolviendo el liofilizado en agua u otras soluciones acuosas. El término "liofilización", también conocido como secado por congelamiento, es una técnica comúnmente empleada para presentar proteínas las cuales sirven para remover agua de la preparación de proteína de interés. La liofilización es un proceso por el cual el material a ser secado primero se congela y después el hielo o solvente congelado se remueve por sublimación en un ambiente a vacío. Se puede incluir un excipiente en las formulaciones pre-liofilizadas para mejorar la estabilidad durante el proceso de secado por congelamiento y/o para mejorar la estabilidad del producto liofilizado en almacenaje. Por ejemplo, véase Pikal, M. Biopharm, 3(9)26-30 (1990) y Arakawa eí al., Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991).

También se conoce el secado por atomización de ingredientes farmacéuticos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, véase Broadhead, J. eí al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals", in Drug Dev. Ind. Pharm. 18(11 & 12), 1169-1206 (1 992). En adición a farmacéuticos de molécula pequeña, se han secado por atomización una variedad de materiales biológicos que incluye: enzimas, suero, plasma , microorganismos y levaduras. El secado por atomización es una técnica útil debido a que puede convertir una preparación farmacéutica líquida en un polvo fino, aglomerado o sin polvo en un proceso de una etapa. La técnica básica comprende las siguientes cuatro etapas: a) atomización de la solución alimentada en un atomizador; b) poner en contacto con el aire para atom izar; c) secar lo atomizado; y d) separa el producto seco del aire de secado. Por ejemplo, las Patentes Estadounidense Nos. 6 ,235,71 0 y 6,001 ,800 describen la preparación de eritropoyetina recom binante secada por atomización También se abarcan por la presente invención , métodos para usar una formulación que contiene un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo. El bG-CSF tiene una variedad de actividades biológicas que incluyen, pero no se limitan a enlazar a su receptor, causando dimerización de su receptor, estimulación de producción de neutrófilo, y estimulación de proliferación y diferenciación celular. Ejemplos de algunas de las actividades biológicas del factor estimulante de colonias de granulocitos y bG-CSF se describen anteriormente y en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,676,947 ; 6,579,525; 6, 531 , 121 ; 6,521 ,245; 6,489,293; 6,368,854; 6,316,254; 6,268,336; 6,239, 1 09; 6, 165,283; 5,986,047; 5,830,851 ; 5,043, 1 56; y 5, 773, 569. Las formulaciones que contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la invención son útiles para tratar o prevenir un intervalo amplio de trastornos. "Prevenir" se refiere a reducir la probabilidad de que el receptor pueda incurrir o desarrollar cualquiera de las condiciones patológicas descritas en la presente e incluye administración profiláctica . El término "prevenir" es particularmente aplicable a un paciente que es susceptible a la condición patológica particular. "Tratar" se refiere a mediar una enfermedad o condición y prevenir, revertir los efectos clínicos de la enfermedad o mitigar su progreso adicional o mejorar los síntomas asociados con la enfermedad o condición.

La administración de productos G-CSF resulta en formación de glóbulos blancos. Así, la administración de una formulación que contiene polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la presente invención puede ser útil para prevenir infección en animales que están en riesgo de infección . Una formulación que contiene polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la presente invención puede ser administrada a animales que tienen una infección. Infecciones que se pueden tratar con una formulación que contiene polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la invención incluyen , pero no se limitan a, mastitis y fiebre del transporte. Una formulación que contiene un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la presente invención puede ser administrada a un animal, por ejemplo, entre dos semanas y un día antes de dar a luz y opcionalmente se puede dar una administración adicional en el d ía de dar a luz o hasta una semana después de dar a luz. En algunas modalidades, el animal que es administrado con la formulación que contiene un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la presente invención es una vaca y dar a luz se refiere a "parto". En una modalidad , una formulación que contiene polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la presente invención se puede administrar a vacas periparturientas para la prevención de mastitis.

De conformidad con la invención, se puede administrar una formulación que contiene polipéptido bG-CSF o una variante del mismo por cualquier ruta convencional adecuada para proteínas o péptidos, que incluyen, pero no se limitan a, parenteralmente, por ejemplo, inyecciones que incluyen, pero no se limitan a, subcutánea o intravenosa o cualquier otra forma de inyecciones o infusiones. Se pueden administrar formulaciones que contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo por un número de rutas que incluyen , pero no se lim itan a medios oral, intravenoso, intraperitoneal , intramuscular, transdermal, subcutáneo, tópico, sublingual, intravascular, intramamario o rectal. También se pueden administrar formulaciones que contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo por medio de liposomas. Estas rutas de administración y formulaciones apropiadas son generalmente conocidas por aquellos de experiencia en la técnica. Formulaciones que contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, solo o en combinación con otros componentes adecuados, también se pueden elaborar en formulaciones de aerosol (es decir, pueden ser "nebulizadas") para ser administradas por medio de inhalación. Las formulaciones en aerosol se puede colocar en impulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluormetano , propano, nitrógeno y similares.

Formulaciones que contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo adecuadas para administración parenteral, tal como, por ejemplo, por rutas intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones de inyección estéril isotónica, acuosas y no acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos y solutos que proporcionan la formulación isotónica con la sangre del receptor planeado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores y conservadores. Las formulaciones que contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo se pueden presentar en un contenedor sellado de dosis única o dosis múltiples, tal como ampolletas y viales. Las formulaciones q ue contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo también se pueden presentar en jeringas, tal como jeringas pre-rellenadas.

La administración parenteral y administración intravenosa son métodos de administración posibles de las formulaciones de la presente invención. En particular, las rutas de administración ya en uso para terapéuticos homólogos de aminoácido natural (que incluye pero no se limita a, aquellos típicamente usados por EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, INFs, interleucinas, anticuerpos, FGFs y/o cualquier otra proteína farmacéuticamente suministrada), junto con formulaciones actualmente en uso, se proporcionan rutas de administración posibles y formulaciones que contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la invención.

En algunas modalidades, las formulaciones de la presente invención que contienen polipéptido bG-CSF o una variante del mismo en una cantidad entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 12 gramos/litro. La dosis administrada a un animal, en el contexto de la presente invención, es suficiente para tener una respuesta terapéutica benéfica en el animal durante un tiempo, u otra actividad apropiada, dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia del vector particular, o formulación, y la actividad, estabilidad o vida media del suero del polipéptido de aminoácido no natural empleado y la condición del animal, así como también el peso corporal o área de superficie del animal a ser tratado. El tamaño de la dosis también se determina por la existencia, naturaleza y extensión de cualquiera de los efectos secundarios adversos que acompañan la administración de un vector particular, formulación o similares en un animal particular.

La dosis administrada a un animal en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para provocar una respuesta benéfica en el sujeto durante un tiempo. Generalmente, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la presente invención administrada parenteralmente por dosis en el intervalo de aproximadamente 0.01 pg/kg/día hasta aproximadamente 100 pg/kg, o aproximadamente 0.05 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, del peso corporal animal, a pesar que se somete a discreción terapéutica. Alternativamente, la cantidad farmacéuticamente efectiva del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la presente invención administrada parenteralmente por dosis es aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 25 mg, o aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 20 mg . Por ejemplo, la cantidad farmacéuticamente efectiva del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo de la presente invención administrada parenteralmente por dosis puede ser aproximadamente 14 mg . La frecuencia de dosificación también se somete a discreción terapéutica .

La cantidad farmacéuticamente efectiva del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo se puede administrar a animales como una dosis única o como parte de un esquema de dosis múltiple. Por ejem plo , e l polipéptido bG-C SF o un a vari a nte del mismo se puede administrar en un esquema de dosis múltiples en donde el esquema es al menos un régimen de dos dosis. E n una modalidad, el esquema de dosis múltiples es un régimen de dos dosis.

En una modalidad , el esquema de dosis múltiple comprende una primera dosis administrada a un animal por aproximadamente 1 d ía hasta aproximadamente 14 días antes que el animal dé a luz y la segunda dosis se administra al animal aproximadamente 4 días antes hasta aproximadamente 7 días después que el animal dio a luz. En otra modalidad, el esquema de dosis múltiples comprende una primera dosis administrada a un animal aproximadamente 7 d ías antes que el animal dé a luz y la segunda dosis se administra al an imal en el día que da a luz.

También se contemplan las siguientes modalidades: 1 . Una formulación acuosa estable que comprende un polipéptido o la variante del mismo, una sustancia amortig uadora , y un excipiente, en donde la formulación está sustancialmente libre de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán . 2. La formulación de la cláusula 1 en donde el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un enlazador, un pol ímero, o una molécula biológicamente activa. 3. La formulación de la cláusula 1 o cláusula 2 en donde el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un pol ímero soluble en agua. 4. La formulación de la cláusula 3 en donde el polímero sol uble e n ag ua comprende u na porción de poli(etilen glicol) . 5. La formulación de la cláusula 3 o cláusula 4 en donde el pol ímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa . 6. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 3 a 5 en donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 50 kDa. 7. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 3 a 6 en donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa. 8. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 7 en donde el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG. 9. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 8 en donde el polipéptido bG-CSF o variante del mismo está presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 12 gramos/litro. 1 0. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 9 en donde el polipéptido bG-CSF o variante del mismo está presente en una cantidad de aproximadamente 5 gramos/litro. 1 1 . La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 10 en donde la sustancia amortiguadora es citrato, histidina, maleato, succinato, fosfato, o una combinación de los mismos. 12. La formulación de cualquiera de algunas de las clá usu las 1 a 1 1 e n donde la sustancia amortiguadora es citrato o succinato. 1 3. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 12 en donde la sustancia amortiguadora es citrato. 14. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 12 en donde la sustancia amortiguadora es succinato. 15. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 14 en donde la sustancia amortiguadora tiene una molaridad entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM . 16. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 1 5 en donde la sustancia amortiguadora tiene una molaridad de aproximadamente 30 mM. 17. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 16 en donde el excipiente es cloruro de sodio, trehalosa, sorbitol, arginina, o una combinación de los mismos. 18. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 17 en donde el excipiente es arginina. 1 9. La formulación de la cláusula 18 en donde arginina tiene una molaridad de entre aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 500 mM. 20. La formulación de la cláusula 18 o cláusula 19 en donde la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 300 m M. 21 . La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 8 a 20 en donde la arginina tiene una molaridad de aproximadame nte 250 m M . 22. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 21 en donde la formulación tiene un pH de entre aproximadamente 5.7 hasta aproximadamente 6.6. 23. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 22 en donde la formulación tiene un pH de entre aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 6.3. 24. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 23 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio del polipéptido bG-CSF o variante del mismo de menos de aproximadamente 2. 1 % en peso/peso después de un periodo de incubación de cinco días en condiciones de almacenaje bajo estrés. 25. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 24 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio del polipéptido bG-CSF o variante del mismo de menos de aproximadamente 1 .5% % en peso/peso después de un periodo de incubación de un día en condiciones de almacenaje acelerado. 26. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 25 opcionalmente que incluye uno o más de otros ingredientes terapéuticos. 27. Un liofilizado o polvo de la formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 26. 28. Una solución acuosa producida disolviendo el liofilizado o polvo de la cláusula 27 en agua. 29. U n proceso para preparar la form ulació n de cua lq uiera de algunas de las cláusulas 1 a 26 que comprende formar una solución acuosa estable que comprende el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, una sustancia amortiguadora, y un excipiente, en donde la formulación está sustancialmente libre de monolaurato de polioxietiien (20) sorbitán. 30. Un método para tratar a un animal que tiene un trastorno modulado por bG-CSF que comprende administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 1 a 26. 31 . El método de la cláusula 30 en donde el trastorno es una infección . 32. El método de la cláusula 31 en donde la infección es mastitis y en donde el animal es una vaca periparturienta. 33. Una formulación acuosa estable que comprende el polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, un citrato o amortiguador de succinato, arginina, y opcionalmente un contraión para arginina. 34. La formulación de la cláusula 33 en donde la formulación está sustancialmente libre de un surfactante de polisorbato. 35. La formulación de la cláusula 33 o cláusula 34 en donde el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un enlazador, un polímero, o una molécula biológicamente activa . 36. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 33 a 35 en donde el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un polímero soluble en ag ua. 37. La formulación de la cláusula 36 en donde el polímero soluble en agua comprende una porción de poli(etilen glicol). 38. La formulación de la cláusula 36 o cláusula 37 en donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 39. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 36 a 38 en donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 50 kDa. 40. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 36 a 39 en donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa. 41 . La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 34 a 40 en donde el surfactante de polisorbato es un polioxietíleno derivado de monolaurato sódico. 42. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 34 a 41 en donde el surfactante de polisorbato es monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán. 43. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 33 a 42 en donde el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T133pAF-20K PEG. 44. La formulación de la cláusula 43 en donde bG-CSF-T133pAF-20K PEG está presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 12 gramos/litro, el amortiguador de citrato tiene una molaridad de aproximadamente 30 mM, la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 250 mM, y en donde la formulación tiene un valor de pH de aproximadamente 6.0. 45. La formulación de la cláusula 43 o cláusula 44 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de menos de aproximadamente 1.6% % en peso/peso después de un periodo de incubación de 28-días a 25° C. 46. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 43 a 45 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de menos de aproximadamente 2.8% % en peso/peso después de un periodo de incubación de 3-días a 40° C. 47. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 43 a 46 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de aproximadamente 1.6% % en peso/peso o menor después de un estudio de agitación forzada. 48. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 43 a 47 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG de menos de aproximadamente 1 .6% % en peso/peso después de cinco ciclos congelamiento-descongelamiento. 49. La formulación de cua lquiera de algunas de las cláusulas 33 a 48 en donde el contraión para arginina es cloruro o sulfato. 50. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 33 a 49 opcionalmente que incluye uno o más de otros ingredientes terapéuticos. 51 . Un liofilizado o polvo de la formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 33 a 50. 52. Una solución acuosa producida disolviendo el liofilizado o polvo de la cláusula 51 en agua . 53. Un proceso para preparar la formulación de cualq uiera de algunas de las cláusulas 33 a 50 que comprende formar una solución acuosa estable que comprende el polipéptido bG-CSF o variante del mismo, un amortiguador de citrato, arginina, y opcionalmente un contraión para arginina. 54. El proceso de la cláusula 53 en donde la formulación está sustancialmente libre de un surfactante de polisorbato. 55. El proceso de la cláusula 53 o cláusula 54 en donde el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG . 56. Un método para tratar a un animal que tiene un trastorno modulado por bG-CSF que comprende administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 33 a 50. 57. El método de la cláusula 56 en donde el trastorno es una infección. 58. El método de la cláusula 57 en donde la infección es mastitis y en donde el animal es una vaca periparturienta. 59. Una formulación acuosa estable que consiste esencialmente del polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, un citrato o amortiguador de succinato, arginina, y opcionalmente un contraión para arginina . 60. La formulación de la cláusula 59 en donde la formulación está sustancialmente libre de un surfactante. 61 . La formulación de la cláusula 59 o cláusula 60 en donde el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un enlazador, un polímero, o una molécula biológicamente activa . 62. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 59 a 61 en donde el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un pol ímero soluble en agua. 63. La formulación de la cláusu la 62 en donde el polímero soluble en agua comprende una porción de poli(etilen glicol). 64. La formulación de la cláusula 62 o cláusula 63 en donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 4 65. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 62 a 64 en donde el pol ímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 50 kDa. 66. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 62 a 65 en donde el pol ímero soluble en agua tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa. 67. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 60 a 66 en donde el surfactante es un surfactante de polisorbato. 68. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 60 a 67 en donde el surfactante es un polioxietileno derivado de monolaurato sódico. 69. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 60 a 68 en donde el surfactante es monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán. 70. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 59 a 69 en donde el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG. 71 . La formulación de la cláusula 70 en donde bG-CSF- T1 33pAF-20K PEG está presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 1 2 gramos/litro, el amortiguador de citrato tiene una molaridad de aproximadamente 30 rnlvl, la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 250 m , y en donde la formulación tiene un valor de pH de aproximadamente 6.0. 72. La formulación de la cláusula 70 o cláusula 71 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de menos de aproximadamente 1.6% % en peso/peso después de un periodo de incubación de 28-días a 25° C. 73. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 70 a 72 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de menos de aproximadamente 2.8% % en peso/peso después de un periodo de incubación de 3-días a 40° C. 74. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 70 a 73 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de aproximadamente 1.6% % en peso/peso o menor después de un estudio de agitación forzada. 75. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 70 a 74 en donde la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de menos de aproximadamente 1.6% % en peso/peso después de cinco ciclos congelamiento-descongelamiento. 76. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 59 a 75 en donde el contraión para arginina es cloruro o sulfato. 77. La formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 59 a 76 opcionalmente que incluye uno o más de otros ingredientes terapéuticos. 78. Un liofilizado o polvo de la formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 59 a 77. 79. Una solución acuosa producida disolviendo el liofilizado o polvo de la cláusula 78 en agua. 80. Un proceso para preparar la form ulación de cualquiera de alg unas de las cláusulas 59 a 77 que comprende formar una solución acuosa estable que consiste esencialmente del poli péptido bG-CSF o variante del mismo, un amortiguador de citrato, arginina, y opcionalmente un contraión para arginina . 81 . El proceso de la cláusula 80 en donde la formulación está s usta ncia l me nte li bre de u n su rfactante. 82. El proceso de la cláusula 80 o cláusula 81 en donde el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T133pAF-20K PEG. 83. Un método para tratar a un animal que tiene un trastorno modulado por bG-CSF que comprende adm inistrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación de cualquiera de algunas de las cláusulas 59 a 77. 84. El método de la cláusula 83 en donde el trastorno es una infección. 85. El método de la cláusula 84 en donde la infección es mastitis y en donde el animal es una vaca periparturienta. 86. Una formulación acuosa estable que consiste esencialmente de bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG, un amortiguador de citrato en donde el amortiguador de citrato tiene una molaridad de aproximadamente 30 mM, arginina en donde la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 250 mM, y opcionalmente un contraión para arginina.

Ejemplo 1 Estudio de Selección de Amortiguador y Excipiente Se pueden seleccionar formulaciones T133-20K PEG de bG-CSF sin monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán en el antecedente, para valorar la estabilidad del producto usando amortiguadores y excipiente múltiples (cloruro de sodio, trehalosa y arginina). El pH objetivo para todos los amortiguadores de diálisis es pH 6.0. Por comparación , se puede preparar una formulación que contiene 10 mM de fosfato, 180 mM de manitol y 60 mM de trehalosa a pH 6.0. Las formulaciones se pueden eva lua r para efectos en agregación y despegilación de proteína en la presencia y ausencia de oxígeno.

Las muestras se pueden preparar dializando 1 mi de T1 33- 20 K PEG de bG-CSF a 2-8°C en cada formulación. La concentración de proteína de las muestras dializadas se puede determinar antes de normalizar la concentración de proteína a 5 mg/ml . Después de la diálisis y normalización de concentración, se puede rellenar aproximadamente 3x 1 mi de la combinación post-dializada y diluida en viales de vidrio de 5 mi. Una serie de muestras se pueden probar para proporcionar condiciones de inicio. Una segunda serie se puede almacenar a 25°C/60% de HR durante 5 d ías antes de someterla a prueba. La tercera serie de muestra se puede desgasificar en la cámara de liofilización , encerrada bajo una atmósfera inerte (nitrógeno) y después almacenada a 25°C/60% HR durante 5 días antes de someterla a prueba. Si el nivel de agregado como se mide por SEC después de 5 días es = 2.0%, tanto las muestras desgasificadas como no desgasificadas se pueden incubar a 40°C por un día.

Después de cinco días de incubación, se puede medir la concentración de proteína de cada muestra. La Tabla 1 muestra las concentraciones de proteína.

Tabla 1. Concentración de Proteína del Estudio de Selección Amortiguador y Excipiente La Tabla 2 muestra el resultado de pH para cada muestra.

Tabla 2. Resultados de pH del Estudio de Selección de Amortiguador y Excipiente Se pueden analizar los niveles de agregación y despegiiacion de proteína en cada formulación por SEC. La Tabla 3 muestra los resultados de SEC e indica que los niveles de agregación y despegiiacion son similares a través de todas las muestras.

Tabla 3. Resultados SEC del Estudio de Selección de Amortiguador y Excipiente (Incubaciones después de 5 días) La tabla 4 muestra los resultados de SEC para muestras incubadas a 40°C por un día. La comparación de la composición de agregado indica que las formulaciones que contienen arginina tienen la agregación del producto más baja. Además, la formulación de referencia 1 0 mM de fosfato, 180 m M de Manitol y 60 m M de trehalosa a pH 6 tiene el nivel de agregación más alto si se compara con todas las otras formulaciones en el estudio de selección .

Tabla 4. Resultados de SEC del Estudio de Selección de Amortiguador y Excipiente (Incubación después de 1 d ía) Los resultados de este estudio de selección ind ican que las formulaciones de succinato, histidina, maleato y citrato sin monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán todos tienen incremento de agregado insignificante (menos del 1 % por SEC) después de 5 días de incubación a 25°C. También, no existe diferencia en estabilidad de proteína entre las muestras desgasificadas y no desgasificadas. Además, los resultados de SEC de muestras bajo estrés a 40°C por un d ía muestran que las formulaciones que contienen 0.1 M de arginina tienen menos agregación comparadas con las formulaciones que contienen cloruro de sodio y excipientes de trehalosa .

Ejem p lo 2 Efecto de Monolaurato de Polioxietilen (20) sorbitán en Formulaciones bG-CSF Se puede evaluar el efecto de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán en agregación para determinar el impacto en formulaciones futuras para estudios de agitación. Las muestras se pueden preparar dializando 4 mi de T133-20k PEG de bG-CSF a 2-8°C en 10 m de Fosfato y 150 mM de NaCI a pH 6.0. Después de la diálisis, los combinados dializados se pueden adicionar con una solución base de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán al 1% y después se puede diluir con 10 mM de Fosfato y 150 mM de NaCI a pH 6.0 a una concentración de proteína final de 5 mg/ml. Las muestras de cada formulación se puede dividir en alícuotas 2 x 1 mi rellenadas en viales de vidrio de 1 mi para formar dos series de muestras. Una serie se puede almacenar a 2-8°C y probar en las condiciones iniciales; una segunda serie se puede almacenar a 40°C por un día.

La Tabla 5 muestra los datos de integración de SEC e indica que el nivel de agregación se incrementa con el incremento de la concentración de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán. El análisis SEC de las muestras indica que la agregación de T133-20K PEG de bG-CSF se incrementa con la concentración de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán. Como un resultado, el monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán se puede excluir de la prueba de formulación futura para T133-20K PEG de bG-CSF.

Tabla 5. Resultados de SEC del Estudio de Monolaurato de Polioxietilen (20) Sorbitán (Después de 1 d ía de incubación) I Inicial 1 Día <le incubación a 40'C % Prom. del % Prom. de % Prom. de !% Prom. del % Prom. de % Prom.

Buffer I Agregado PEG-bGCSF bGCSF i Agregado PEG-bGCSF bGC3F i Combinación N8J0901 -04-04 pre-dializada 0.7 S9.0 0.3 N/A ; 10m Fosfato , 150mM NaCí o.a 98.2 1.0 2.6 96.6 o.a ¡ 10roM Fosfato , 150mM NaCt, 0.0033% Twaan 20 0.8 98.1 1.1 3.7 95.6 0.7 lOmM Fosfato , 150mM NaCI, 0.05% T sen-20 0.T 98.0 1 D.2 0O.1 0.7 Ejem plo 3 Diseño de Superficie a la Respuesta Box-Behnken (DOE #1 ) Se puede valorar el efecto de varias concentraciones de arginina junto con otros parámetros de formulación histórica clave para eva l u a r l os efectos principales a s í como también sus interacciones. El diseño experimental puede ser una superficie de respuesta Box-Behnken en donde cada factor numérico es variado en el nivel bajo, central y alto. Además, el tipo de amortiguador puede ser u n factor categórico. La combinación de parámetro se puede duplicar por citrato y succinato, cada uno con tres punto centrales. El pH se puede fijar a 6.0 para todas las condiciones. Se puede incluir una condición de control que comprende 10 mM de Fosfato, 150 mM de NaCI y 0.0033% de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán a pH 6 para comparación con resultados históricos.

Se pueden preparar todos los amortiguadores de diálisis a pH 6.0 ± 0. 1 . El PEG-bGCST se puede dializar en 1 8 condiciones de amortiguadores que representan todas las condiciones de amortiguador del estudio DOE #1 . La recuperación de la proteína a través de la etapa de diálisis puede ser generalmente = 78% y, así, es consistente con la 5 serie de muestra de diálisis. Después de la diálisis, la concentración de proteina de la combinación dializada se puede ajustar con el amortiguador de diálisis para el valor objetivo mostrado en el diseño de superficie de respuesta Box-Behnken . Esto puede resultar en 24 combinaciones de formulación más tres puntos centrales en citrato y tres puntos centrales en succinato. Cada formulación se puede dividir en alícuotas 3 x 1 mi rellenadas en viales de vidrio de 1 mi para formar tres series de muestras : una serie se puede probar como condiciones iniciales y después almacenar a 2-8°C, una segunda se puede almacenar a 25°C por dos semanas, y la tercera serie se puede almacenar a 40°C po r un día.

Se pueden analizar cambios en producto para valorar la estabilidad del producto. La Tabla 6 muestra la concentración del producto de muestras antes y después de la incubación. Las muestras a 10 mM de Citrato, 300 mM de Arginina (8 mg/ml) y 10 mM de Succinato, 300 mM de Arginina (8 mg/ml) tienen el incremento mayor (0.5-0.6 mg/ml) mientras la diferencia es menor para todas las otras muestras.

Tabla 6. Sumario de Concentración de Proteína del Estudio DOE (Inicial y 1 día a 40°C) Se pueden analizar cambios en pH para valorar la estabilidad de pH de las muestras. Todos los pH de la muestra pueden estar dentro del intervalo de 6.0 - 6.3. La Tabla 7 muestra los valores de pH y las diferencias del tiempo cero. El pH de la muestra es estable por la duración total del estudio DOE #1 .

Tabla 7. Sumario del pH del Estudio DOE #1 (Inicial y 1 día a 40°C) Se pueden analizar cambios en niveles de agregado, monómero y despegilación en SEC para valorar la estabilidad de la proteína. Las Tablas 8, 9 y 10 muestran las composiciones de agregación, monómero y despegilación en cada composición de muestra , respectivamente.

Tabla 8. Resultados del Agregado de SEC del Estudio DOE #1 lOmM Fosfato , 150mM NaCI, 0.0033% T een- Inicial = 0.8 40°C por 1 día = 3.7 20 íSms/mLj Diferencia = 2.8 Tabla 9. Resultados de Monómero de SEC del Estudio DOE #1 lOmM Fosfato . teOmM NaCl. 0.0033% TV/aon.

Inicial = 38.1 40°C por 1 Día = SS.6 Diferencia¦ -2.3 20 (Smg/wl) Tabla 10. Resultados de Despegilación de SEC del Estudio DOE #1 Los resultados de SEC indican que el nivel del agregado en muestras de citrato está relativamente sin cambio. Las muestras de succinato también tienen niveles de agregado bajos excepto para las muestras con 100 m de arginina, sugiriendo que los amortiguadores a base de succinato puede requerir más de 1 00 m M de arginina para mantener baja agregación de proteína. La condición de control (1 0 mM de Fosfato, 1 50 mM de NaCI y 0.0033% (p/v) de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán a pH 6 y en 5 mg/ml) tiene un 3.7% de agregado después de un dia de incubación a 40°C (véase Tabla 8).

La despegilación es otra trayectoria de degradación de proteína. La Tabla 10 muestra resultados de SEC para el producto despegilado e indica que el nivel de despegilación en muestras de succinato es mayor (0-4%-0.8%) que aquellos en muestras de citrato (<0.3%). El nivel de despegilación en el control de fosfato es mayor que en todas las muestras de formulación de citrato y es ligeramente mayor que en la mayoría las formulaciones de succinato.

Puesto que los resultados de SEC para muestras de citrato incubadas a 40°C por un día tienen un agregado m ínimo, una subserie de las muestras de DOE #1 se pueden incubar a 25°C por 28 d ías. Las siguientes condiciones de muestras se pueden analizar por SEC: 1 . 30mM Citrato, 1 00mM Arginina a 2mg/mL 2. 30mM Citrato, 500mM Arginina a 2mg/ml_ 3. 30mM Citrato, 100mM Arginina a 8mg/mL 4. 30mM Citrato, 500mM Arginina a 8mg/mL 5. 30m M Citrato , 300mM Argin ina a 5mg/ml_ La Tabla 1 1 muestra los resultados de SEC del experimento de 28 d ías. Sin embargo, se puede realizar en análisis por RP-H PLC en las muestras incubadas a 28 días para aseg urar la carencia de degradación del producto. La Tabla 12 muestra estos resultados.

Tabla 1 1 . Resultados de SEC del Estudio DOE #1 Incubado por 28 días a 25°C Tabla 12. Resultados de RP-HPLC del Estudio DOE #1 Incubado por 28 días a 25°C Ejem plo 4 Evaluación de Compatibilidad de Contraión y Jeringa Se puede evaluar una comparación de cloruro y sulfato como contraiones para arginina. La condición de muestra puede ser 30 mM de citrato y 300 mM de arginina en 5 mg/ml (pH 6.0). Además, se puede comparar la compatibilidad del producto en una jeringa de polipropileno de 3 mi MONOJECT para contener el producto fármaco a viales de vidrio de 1 mi. Se puede preparar el amortiguador con 30 mM de citrato, 300 mM de arginina a pH 6 (Cloruro) usando citrato de sodio y arginina-HCI , y la solución se puede titular con HCI 6N . Se puede preparar el amortiguador con 30 mM de citrato, 300 mM de arginina a pH 6 (Sulfato) usando ácido cítrico monohidratado, citrato de sodio y base de arginina, y la solución se puede titular con ácido sulfúrico concentrado . Se puede dializar T1 33-20 K PEG de bG-CSF en dos amortiguadores. Las muestras se pueden analizar por SEC al tiempo cero. Una serie de muestras se puede colocar en un vial de liofilización de vidrio de 1 mi y una segunda en jeringas de 3 m i antes de la incubación a 40°C por hasta 3 días.

La Tabla 13 muestra los resultados SEC. Los resultados SEC indican que la formación de agregado es dos hasta tres veces mayor en las muestras almacenadas en jeringas que en viales de vidrio. La despegilación del producto permanece igual como en las muestras del tiempo cero. Para ambos contraiones, las muestras en viales de vidrio tienen un cambio mínimo en agregado después de 3 días a 40°C. Se podrá usar cloruro en lugar de sulfato como un contraión sin impactar la formación de agregado.

Tabla 13. Resultados SEC de la Evaluación de Compatibilidad Contraión y Jeringa Ejemplo 5 2-Nivel Factorial Completo de Tres Parámetros (DOE #2) Se puede realizar un segundo estudio para evaluar el efecto de pH, concentración de arginina y concentración de proteína en amortiguador de citrato. La Tabla 14 muestra las condiciones de formulación usadas en DOE #2.

Tabla 14. Condiciones de Formulación Usadas para el Estudio DOE #2 OGCSF-T133-20K PEG se puede dializar en 5 condiciones amortiguadoras. Las muestras 1 y 2 pueden ser dializadas en un amortiguador que contiene 30mM de citrato y 200mM de arginina a pH 5.0. Las muestras 3 y 4 se pueden dializar en un amortiguador que contiene 30mM de citrato y 200mM de arginina a pH 5.0. Las muestras 5 y 6 se pueden dializar en un amortiguador que contiene 30mM de citrato y 250mM de arginina a pH 6.0. Las muestras 7 y 8 se pueden dializar en un amortiguador que contiene 30mM de citrato y 300mM de arginina a pH 6.0. Las muestras 9 y 10 se pueden dializar en un amortiguador que contiene 30mM de citrato y 300mM de arginina a pH 5.5. Cada muestra post-dializada se puede ajustar a la concentración de producto final objetivo y después dividir en alícuotas de 2 x 1 mL en viales de vidrio de liofilización para formar dos series de muestras: una serie se puede almacenar a 2-8°C como controles y una segunda serie se puede almacenar a 40°C por tres días.

La Tabla 15 muestra resultados SEC. El cambio en agregado es entre -0.1% y 2.1%. El agregado superior se correlaciona fuertemente con la concentración superior del producto. La despegilación delta es entre 0.1 % y 0.8%. La despegilación ligeramente superior se correlaciona con baja concentración de producto a pH bajo. Como el pH reduce, la pegilación incrementa , y esta tendencia es consistente con observaciones históricas en estudios de pre-formulación .

Tabla 1 5. Sumario de resultados SEC para el Estudio DOE #2 Ejemplo 6 Estudio de Agitación Se puede realizar un estudio de agitación forzada para valorar la estabilidad de la proteína en las formulaciones. Las muestras se pueden preparar dializando bGCSF-T1 33-20K PEG ( 16.6 mg/mL de proteína en 1 0 mM de acetato de sodio, 5% de sorbitol pH 4.0) contra 30 mM de Citrato y 250 mM de Arginina a pH 6.0. Una porción del material dializado se puede diluir a una concentración objetivo de 5 mg/mL usando amortiguador 30mM de Citrato y 250mM de Arginina a pH 6.0. Las combinaciones pueden entonces ser filtradas a través de un filtro de 0.22 micrones y después ser sometidos a agitación forzada en un vaso de precipitado de vidrio mezclando a 60 rpm usando un agitador magnético por dos horas a temperatura ambiente. Las muestras pueden ser tomadas cada 30 minutos.

Todas las muestras pueden ser transparentes, incoloras y libres de partículas visibles por todos los puntos de tiempo. La concentración de proteína, absorbancia a 550 nm, y medición de pH para cada punto de tiempo se muestran en la Tabla 16.

Tabla 16. Sumario de Resultados de Concentración de Proteína, A55o, y pH a partir del Estudio de Agitación (Mezclado) La concentración de proteína permanece estable a través de la duración del mezclado. El pH permanece consistente a través del experimento. La composición del producto por SEC también es consistente a través del estudio, como se muestra en la Tabla 17. En total, los resultados de este estudio indican que la proteína es estable por la duración completa de la agitación forzada.

Tabla 17. Sumario de Resultados SEC a partir del Estudio de Agitación (Mezclado) Ejemplo 7 Estudio de Congelación-Descongelación Se puede realizar un estudio de congelación-descongelación para determinar la concentración de proteína y pH de varias muestras. La proteína en la muestra puede ser sometida hasta cinco ciclos de congelación y descongelación. Las muestras pueden ser filtradas a través de filtros de 0.22 micrones y dispensadas en viales de 15 mL. Se puede dejar de lado una alícuota como el control. Para las tres alícuotas restantes, cada ciclo de congelación-descongelación podría consistir de congelamiento de la solución de proteína por una hora a -75±5°C y descongelamiento a temperatura ambiente por aproximadamente una hora hasta que no se observa hielo. El vial de la muestra puede ser agitado vigorosamente tres veces para mezclar la muestra. Una alícuota se puede dejar de lado después del primero, segundo y quinto ciclos de congelación y descongelación para pruebas.

Todas las muestras son transparentes, incoloras y libres de partículas visibles para todos los puntos de tiempo . La concentración de proteína, absorbancia a 550 nm y medición de pH para cada punto de tiempo se muestran en la Tabla 18.

Tabla 18. Sumario de Resultados de Concentración de Proteína, A550 ) y pH a partir del Estudio de Congelación-Descongelación La concentración de proteína permanece estable después de cada ciclo de congelación-descongelación Además, el pH permanece consistente a través de los cinco ciclos de congelación-descongelación. La composición del producto por SEC es un cruce similar todos los puntos de tiempo y se muestra en la Tabla 19.

Tabla 1 9. Sumario de Resultados a partir del Estudio de Congelación-Descongelación

Claims

REIVI N DICACIO NES

1 . Una formulación acuosa estable, caracterizada porque comprende un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, una sustancia amortiguadora, y un excipiente, en donde la formulación está sustancialmente libre de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán .

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un enlazador, un pol ímero, o una molécula biológicamente activa.

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porq ue el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un polímero soluble en agua.

4. La formulación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polímero soluble en agua comprende una porción de poli(etilen glicol).

5. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0. 1 kDa y aproximadamente 1 00 kDa.

6. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 50 kDa.

7. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa.

8. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T133pAF-20K PEG.

9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o variante del mismo está presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 12 gramos/litro.

10. La formulación de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o variante del mismo está presente en una cantidad de aproximadamente 5 gramos/litro.

1 1 . La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la sustancia amortiguadora es citrato, histidina, maleato, succinato, fosfato, o una combinación de los mismos.

12. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada porque la sustancia amortiguadora es citrato o succinato.

13. La formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la sustancia amortiguadora es citrato.

14. La formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la sustancia amortiguadora es succinato.

1 5. La formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la sustancia amortiguadora tiene una molaridad entre aproximadamente 10 mM de y aproximadamente 50 mM .

16. La formulación de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la sustancia amortiguadora tiene una molaridad de aproximadamente 30 mM.

1 7. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el excipiente es cloruro de sodio, trehalosa , sorbitol, arginina, o una combinación de los mismos.

18. La formulación de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el excipiente es arginina.

1 9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 8, caracterizada porque la arginina tiene una molaridad de entre aproximadamente 1 00 m M de hasta aproximada mente 500 m M .

20. La formulación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 300 mM.

21 . La formulación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 250 mM.

22. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la formulación tiene un pH de entre aproximadamente 5.7 hasta aproximadamente 6.6.

23. La formulación de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la formulación tiene un pH de entre aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 6.3.

24. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la formulación tiene una concentración de agregado promedio del polipéptido bG-CSF o variante del mismo menor de aproximadamente 2.1 % en peso/peso después de un periodo de incubación de cinco días en condiciones de almacenaje bajo estrés.

25. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la formulación tiene una concentración de agregado promedio del polipéptido bG-CSF o variante del mismo menor de aproximadamente 1 .5% en peso/peso después de un periodo de incubación de un día en condiciones de almacenaje aceleradas.

26. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque opcionalmente incluye uno o más de otros ingredientes .

27. Un liofilizado o polvo de la formulación, caracterizado porque es de conformidad con la reivindicación 1 .

28. Una solución acuosa, caracterizada porque se produce disolviendo el liofilizado o polvo de conformidad con la reivindicación 27 en ag ua .

29. Un proceso para preparar la formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende formar una solución estable porque comprende polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, una sustancia amortiguadora, y un excipiente, en donde la formulación está sustancialmente libre de monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán.

30. Un método para tratar a un animal que tiene un trastorno modulado por bG-CSF, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación de conformidad con la reivindicación 1 .

31 . El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno es una infección.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado porque la infección es mastitis y en donde el animal es una vaca periparturienta.

33. Una formulación acuosa estable, caracterizada porque comprende un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, un citrato o amortiguador de succinato, arginina, y opcionalmente un contraión para arginina .

34. La formulación de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la formulación está sustancialmente libre de un surfactante de polisorbato.

35. La formulación de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a u n enlazador, un polímero, o una molécula biológicamente activa.

36. La formulación de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o la variante del m ismo se enlaza a un polímero soluble en agua.

37. La formulación de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el polímero soluble en agua comprende una porción de poli(etilen glicol) .

38. La formulación de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el pol ímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0. 1 kDa y aproximadamente 1 00 kDa.

39. La formulación de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 50 kDa.

40. La formulación de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa.

41 . La formulación de conformidad con la reivindicación 34, ca racterizada po rq ue e l surfactante de polisorbato es un polioxietileno derivado de monolaurato de sodio.

42. La formulación de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el surfactante de polisorbato es monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán .

43. La formulación de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o variante del m ismo es bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG.

44. La formulación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG está presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 12 gramos/litro, el amortiguador de citrato tiene una molaridad de aproximadamente 30 mM , la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 250 mM, y en donde la formulación tiene un valor de pH de aproximadamente 6.0.

45. La formulación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG menor de aproximadamente 1 .6% en peso/peso después de un periodo de incubación de 28 días a 25° C.

46. La formulación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG menor de aproximadamente 2.8% en peso/peso después de un periodo de incubación de 3 días a 40° C.

47. La formulación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la form ulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG de aproximadamente 1 .6% en peso/peso o menor después de un estudio de agitación forzada.

48. La formulación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG menor de aproximadamente 1 .6% en peso/peso después de cinco ciclos de congelamiento-descongelamiento.

49. La formulación de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el contraión para arginina es cloruro o sulfato.

50. La formulación de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque opcionalmente incluye uno o más de otros ingredientes.

51 . Un liofilizado o polvo de la formulación, caracterizada porque es de conformidad con la reivindicación 33.

52. Una solución acuosa, caracterizada porque se produce disolviendo el liofilizado o polvo de conformidad con la reivindicación 51 en agua.

53. Un proceso para preparar la formulación de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende formar una solución estable en donde un polipéptido bG-CSF o variante del mismo, un amortiguador de citrato, arginina, y opcionalmente un contraión para arginina.

54. El proceso de conformidad con la reivindicación 53, ca racterizado porque la form u lació n está susta nci a l mente libre de un surfactante de polisorbato.

55. El proceso de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG .

56. Un método para tratar a un animal que tiene un trastorno modulado por bG-CSF, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación de conformidad con la reivindicación 33.

57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el trastorno es una infección .

58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la infección es mastitis y en donde el animal es una vaca periparturienta .

59. Una formulación acuosa estable, caracterizada porque consiste esencialmente de un polipéptido bG-CSF o una variante del mismo, un citrato o amortiguador de succinato, arginina, y opeionalmente un contraión para arginina.

60. La formulación de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque la formulación está sustancialmente libre de un surfactante.

61 . La formulación de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un enlazador, un polímero, o una molécula biológicamente activa.

62. La formulación de conform idad con la reivindicación 59, caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o la variante del mismo se enlaza a un polímero soluble en agua.

63. La formulación de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque el polímero soluble en agua comprende una porción de poli(etilen glicol) .

64. La formulación de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0. 1 kDa y aproximadamente 1 00 kDa.

65. La formulación de conform idad con la reivindicación 63, caracterizada porque el polímero soluble en ag ua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 50 kDa.

66. La formulación de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa.

67. La formulación de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el surfactante es un surfactante de polisorbato.

68. La formulación de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque el surfactante es un polioxietileno derivado de monolaurato de sodio.

69. La formulación de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque el surfactante es monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán .

70. La formulación de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG .

71 . La formulación de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG está presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 1 2 gramos/litro, el amortiguador de citrato tiene una molaridad de aproximadamente 30 mM, la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 250 mM, y en donde la formulación tiene un valor de pH de aproximadamente 6.0.

72. La formulación de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T 1 33pAF-20 PEG menor de aproximadamente 1 .6% en peso/peso después de un periodo de incubación de 28 días a 25° C.

73. La formulación de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG menor de aproximadamente 2.8% en peso/peso después de un periodo de incubación de 3 días a 40° C.

74. La formulación de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la formulación tiene una concentración de agregado promedio de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de aproximadamente 1 .6% en peso/peso o menor después de un estudio de agitación forzada.

75. La formulación de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porq ue la form ulació n tiene una co n ce ntració n de agregado promedio de bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG menor de aproximadamente 1 .6% en peso/peso después de cinco ciclos de congelamiento-descongelamiento.

76. La formulación de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque el contraión para arg inina es cloruro o sulfato.

77. La formulación de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque opcionalmente incluye uno o más de otros ingredientes.

78. Un liofilizado o polvo de la formulación , caracterizado porque es de conformidad con la reivindicación 59.

79. Una solución acuosa, caracterizada porque se produce disolviendo el liofilizado o polvo de conformidad con la reivindicación 78 en agua.

80. Un proceso para preparar la formulación de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque comprende formar una solución estable que consiste esencialmente de un polipéptido bG-CSF o variante del mismo, un amortiguador de citrato, arginina, y opcionalmente un contraión para arginina.

81 . El proceso de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la formulación está sustancialmente libre de un surfactante.

82. El proceso de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el polipéptido bG-CSF o variante del mismo es bG-CSF-T1 33pAF-20K PEG.

83. Un método para tratar a un animal que tiene un trastorno modulado por bG-CSF , caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación de conformidad con la reivindicación 59.

84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el trastorno es una infección.

85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la infección es mastitis y en donde el animal es una vaca periparturienta.

86. Una formulación acuosa estable caracterizada porque consiste esencialmente de bG-CSF-T133pAF-20K PEG, un amortiguador de citrato, en donde el amortiguador de citrato tiene una molaridad de aproximadamente 30 mM, la arginina en donde la arginina tiene una molaridad de aproximadamente 250 mM, y opcionalmente un contraión para arginina.