MX2013001939A - Composiciones de radiorastreador de peptido. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones de un agente de formación de imágenes que comprende péptidos de enlace c-Met radioetiquetados para formación de imágenes de tomografia por emisión de positrón (PET) in vivo. Los péptidos de enlace c-ET son etiquetados con el radioisótopo 18F. También se describen composiciones farmacéuticas, métodos de preparación de los agentes y composiciones, más métodos de formación de imágenes in vivo utilizando las composiciones, especialmente para el uso en el manejo de cáncer.

Description

COMPOSICIONES DE RADIO RASTREADOR DE PÉPTIDO Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones de un agente de formación de imágenes que comprende péptidos de enlace c-Met radioetiquetados para formación de imágenes de tomografía por emisión de positrón (PET) in vivo. Los péptidos de enlace c-MET son etiquetados con el radioisótopo 18F. También se describen composiciones farmacéuticas, métodos de preparación de los agentes y composiciones, más métodos de formación de imágenes in vivo utilizando las composiciones, especialmente para el uso en el diagnóstico de cáncer.

Antecedentes de la Invención El factor de crecimiento de hepatocito (HGF), también se conoce como un factor de rastreo (SF), es un factor de crecimiento, el cual está involucrado en diversos procesos fisiológicos, tales como la curación de heridas y la angiogénesis. La interacción de afinidad alta de la interacción HGF con su receptor (c-Met) está implicada en el crecimiento de tumor, la invasión y la metástasis.

Knudsen y asociados han revisado el papel de HGF y c-Met en el cáncer de próstata, con las implicaciones posibles para la formación de imágenes y terapia [Adv. Cáncer Res., 91, páginas 31 a 67 (2004)]. Los anticuerpos anti-met etiquetados para el diagnóstico y terapia se describen en el documento WO 2003/057155.

El c-Met ha demostrado estar involucrado en el crecimiento de tumor, la invasión y metástasis en muchos cánceres humanos de origen epitelial. El c-Met es expresado por la mayoría de los carcinomas y su expresión elevada en relación con el tejido normal se ha detectado en cánceres de: pulmón, ceno, colorectal, pancreático, cabeza y cuello, gástrico, hepatocelular, ovárico, renal, glioma, melanoma y una cantidad de sarcomas. En el carcinoma colorectal (CRC), la sobreexpresión de c-Met se ha detectado en un centro de depresión aberrante displástica, las lesiones neoplásticas más tempranas de la enfermedad. En cáncer de célula escamosa de la cabeza y cuello, c-Met es expresado o sobre expresado en forma reportada en aproximadamente el 80% de los tumores primarios. En la metástasis a hueso de cáncer de próstata, c-Met se ha reportado sobreexpresado en más del 80% de la metástasis de hueso.

Bajo condiciones normales, c-Met es expresado sobre las células epiteliales y es activado en una forma paracrina, mediante el HGF derivado del mesenterio. La activación de c-Met en células normales es un evento transitorio y está regulado estrechamente. Sin embargo, en células de tumor, c-Met puede ser activo en forma constitutiva. En el cáncer, la estimulación de c-Met aberrante puede lograrse a través de la amplificación/sobreexpresión de c-Met, que activa las mutaciones de c-Met (por ejemplo, las alteraciones estructurales) y la adquisición de un control de crecimiento autónomo a través de la creación de circuitos de señalización autocrina. Además, una sub-regulación deficiente del receptor c-Met también contribuirá a la expresión de c-Met aberrante en la membrana celular. Aunque la sobreexpresión de c-Met es dependiente de HGF (autocrina/paracrina), las alteraciones estructurales producidas por las mutaciones, son independientes de HGF (por ejemplo, la pérdida de dominio extracelular).

El documento WO 2004/078778 describe polipétidos o construcciones de péptidos multiméricos, los cuales enlazan a c-Met o un complejo que comprende c-Met y HGF. Se describen aproximadamente 10 clases estructurales diferentes de péptidos El documento WO 2004/078778 describe que los péptidos pueden ser etiquetados con una etiqueta que se puede detectar para las aplicaciones in vitro e in vivo, o con un fármaco de aplicaciones terapéuticas. La etiqueta que se puede detectar puede ser: una enzima, un compuesto fluorescente, un tinte óptico, un ion metálico paramagnético, un agente de contraste de ultrasonido o un radionuclido. Las etiquetas preferidas del documento WO 2004/078778 son establecidas para ser radioactivas o paramagnéticas, y más preferentemente comprenden un metal el cual es quelado por un quelador metálico. El documento WO 2004/078778 establece que los radionúclidos de la presente pueden ser seleccionados de 18F, 124, 125, 131 , 123, 77ß |. 76ß |. 99™-^ 51 ^ 67^ 67Q a 68 3 47^ 167Tm, 141Ce, 111ln, 168Yb, 175Yb, 140La, 90Y, 88Y, 153Sm, 166Ho, 165Dy, 66Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 86Re, 203Pb, 21 Bi, 212B¡ i 213B j 214B ¡ ) 214^ 105R h ) 109pd i 149pm ] 161-^ 177,_u i98Au y i99Au E, documento WO 2004/078778 establece (página 62) que los radionúclidos preferidos para propósitos de diagnóstico son: 6 CU, 67Ga, 68Ga, 99mTc y "??, con 99mTc siendo particularmente preferido.

El documento WO 2008/139207 describe los péptidos cíclicos de enlace c-Met de 17 a 30 aminoácidos, los cuales son etiquetados con una porción de formación de imagen de reportero óptico adecuada para la formación de imagen del cuerpo mamario ¡n vivo, utilizando luz de longitud de onda verde hasta cercana a infrarroja de 600 a 1200 nm. Los péptidos de enlace c-Met comprenden la secuencia de aminoácidos: Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6; en donde X1 es Asn, His o Tyr; X2 es Gly, Ser, Thr o Asn; X3 es Thr o Arg; x4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser; X5 es Ser o Thr; X6 es Asp o Glu; y Cysa d son cada uno residuos de cisteína, de manera que los residuos a y b, así como c y d, son ciclados para formar dos enlaces de disulfuro separados. El reportero óptico del documento WO 2008/139207 preferentemente es tinte de cianuro.

El documento WO 2009/016180 describe péptidos cíclicos de enlace c-Met análogos a aquellos del documento WO 2008/139207, en donde el reportero óptico es un tinte de benzopirilio. Los agentes de los documentos WO 2008/139207 y WO 2009/016180 son establecidos por ser útiles para las aplicaciones ópticas in vitro e in vivo, especialmente la formación de imágenes ópticas in vivo, del cuerpo humano. La formación de imágenes de cáncer colorectal es una aplicación preferida.

La Presente Invención La presente invención se refiere a composiciones de un agente de formación de imágenes que comprende péptidos de enlace c-Met radioetiquetados por 18F-para formación de imágenes de tomografía por emisión de positrón (PET) in vivo. Los péptidos de enlace c-Met son etiquetados por medio de un residuo de lisina (Lys).

Las composiciones de agente de formación de imagen, preferentemente suprimen el nivel de péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado Eso es ventajoso debido a que el cMBP etiquetado por 18F es un radiorastreador, presente en y administrado en una concentración química extremadamente baja - por lo tanto, si no es removido, el cMBP no etiquetado, de otra manera podría estar presente en un exceso químico grande. Ese ha sido establecido por ser importante para aplicaciones de formación de imágenes in vivo de PET, debido a que de otra forma, el cMBP no etiquetado compite de manera efectiva con el cMBP etiquetado por 18F para los sitios de enlace c-Met in vivo. Por consiguiente, tiene un efecto nocivo sobre la extracción y por consiguiente, la proporción de señal a fondo in vivo. Esta cuestión no fue reportada en la técnica anterior, debido a que, por ejemplo, cuando los péptidos de enlace c-Met son etiquetados con tintes reporteros ópticos, las cantidades químicas del péptido etiquetado involucradas son su bstancial mente mayores que para PET, y por lo tanto, no surge la cuestión de competencia.

Las composiciones de agente de formación de imagen de la presente invención, también superan un problema no reconocido anteriormente, en donde, los péptidos cMBP radioetiquetados padecen de problemas de adhesión a diversos materiales, incluyendo los filtros. Se proporcionan composiciones solubilizadas, lo cual significa que los radiorastreadores cMBP etiquetados por 18F- y sometidos a filtración estéril sin pérdida significativa del radiorastreador debido a la adsorción al filtro.

Descripción Detallada de la Invención En un primer aspecto, la presente invención proporciona un agente de formación de imagen, el cual comprende un péptido cíclico de enlace d-Met radioetiquetado por 18F, en donde dicho péptido cíclico de enlace c- et es un péptido cíclico de 18 a 30 mer de la fórmula I: Z1-[cMBP]-Z2 (1) en donde: cMBP es de la Fórmula II: -(A)x-Q-(A')y- (II) en donde Q es la secuencia de aminoácido (SEQ-1): -Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6; en donde X1 es Asn, His o Tyr; X2 es Gly, Ser, Thr o Asn; X3 es Thr o Arg; x4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser; X5 es Ser o Thr; X6 es Asp o Glu; y Cysa d son cada uno residuos de cisteína, de manera que los residuos a y b, así como c y d, son ciclados para formar dos enlaces de disulfuro separados.

A y A' son independientemente cualquier aminoácido diferente de Cys, siempre que por lo menos uno de A y A' esté presente y sea Lys; x y y, son independientemente enteros de un valor de 0 a 13, y son elegidos de manera que [x + y] = 1 a 13; Z1 está unido al término N de cMBP, y es H o MIG; Z2 está unido al término C de cMBP, y es OH, OBc o MIG; en donde BC es un catión biocompatible; cada MIG es independientemente un grupo de inhibición del metabolismo el cual es un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido cMBP; en donde cMBP es etiquetado en el residuo Lys de los grupos A o A' con l8F.

El término "agente de formación de imagen" significa un compuesto adecuado para la formación de imágenes en un cuerpo de mamífero. Preferentemente, el mamífero es un cuerpo de mamífero intacto in vivo, y más preferentemente es un sujeto humano. Preferentemente, el agente de formación de imagen puede ser administrado al cuerpo del mamífero en una forma invasiva en forma mínima, es decir, sin un riesgo sustancial en la salud del sujeto mamífero cuando se lleva a cabo bajo la experiencia médica profesional. Dicha administración invasiva en forma mínima, preferentemente es de administración intravenosa en una vena periférica de dicho sujeto, sin la necesidad de anestesia local o general.

El término "formación de imágenes in vivo" como se utiliza en la presente, se refiere a aquellas técnicas que producen imágenes de manera no invasiva de todos o parte de un aspecto interno de un sujeto mamífero.

El término "péptido cíclico de enlace c-M'et" significa un péptido el cual se enlaza al receptor del factor de crecimiento de hepatocito, también conocido como c-Met (o simplemente MET). Dichos péptidos adecuados de la presente invención péptidos cíclicos de 18 a 30 aminoácidos de la fórmula I.

Dichos péptidos tiene un KD aparente para c-Met de menos de aproximadamente 20 nM. La secuencia cMBP de dichos péptidos comprende residuos de prolina, y se sable que dichos residuos pueden exhibir isomerización cis/trans del enlace de amida de columna. Los péptidos cMBP de la presente invención incluyen a cualquiera de dichos isómeros.

El grupo Z1 sustituye el grupo amina de por lo menos un residuo de aminoácido del cMBP, es decir, el término amino. Por consiguiente, cuando Z1 es H, el término amino de los terminados cMBP en un grupo NH2 libre del último residuo de aminoácido. El grupo Z2 sustituye el grupo carbonilo del último residuo de aminoácido del cMBP, es decir, el término carboxi.

Por consiguiente, cuando Z2 es OH, el término carboxi de los terminados cMBP en el grupo de C02H libre del último residuo de aminoácido, y cuando Z2 es OB°, ese grupo carboxi terminal es ionizado como un grupo C02B°.

El término "catión biocompatible" (BC), significa un contraión cargado positivamente, el cual forma una sal con un grupo cargado en forma negativa ionizado, en donde dicho contraión cargado en forma positiva, también es no tóxico y por consiguiente, es adecuado para la administración al cuerpo de mamífero, especialmente al cuerpo humano. Los ejemplos de cationes biocompatibles adecuados incluyen: sodio o potasio de metales alcalinos; calcio y magnesio de metales tórreos alcalinos; y el ion de amonio. Los cationes biocompatibles preferidos son sodio y potasio, más preferentemente sodio.

El término "grupo de inhibición de metabolismo" (MIG) significa un grupo compatible, el cual inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido cMBP ya sea en el término amino (Z1) o el término carboxi (Z2). Dichos grupos son bien conocidos por aquellos expertos en la materia y son elegidos en forma adecuada de entre, para el péptido de término amina: grupos N-acilados -NH(C = 0)RG en donde el grupo acilo -(C = 0)RG tiene RG elegido de: grupos C -6 alquilo, o C3-10 arilo, o comprende un bloque de construcción de polietilénglicol (PEG). Para el péptido de término carboxi: carboxamida, éster ter-butílico, éster bencílico, éster de ciclohexilo, alcohol amino o un bloque de construcción de polietilénglicol (PEG). Dichos grupos PEG preferidos son los biomodificadores de la Fórmula IA o IB: (IA) ácido 17-amino-5-oxo-6-aza-3,9,12,15-tetraoxaheptadecanóico de la Fórmula IA en donde p es un entero de 1 a 10. De manera alternativa, se puede utilizar una estructura similar a PEG basada en un derivado de ácido propiónico de la fórmula IB: en donde p es como se definió para la fórmula IA y q es un entero de 3 a 15.

En la Fórmula IB, preferentemente p es 1 o 2, y q es preferentemente de 5 a 12.

Dichos grupos MIG de término amino preferido son acetilo, benciloxicarbonilo o trifluoroacetilo, más preferentemente acetilo.

El término, "radioetiquetado por 18F" significa que el péptido cíclico de enlace c-Met tiene conjugado al mismo de manera covalente el radioisótopo 18F. El 18F está unido de manera adecuada por medio de un enlace de fluoroalquilo o fluoroarilo C-F, debido a que dichos enlaces son relativamente estables in vivo, y por lo tanto confieren resistencia a la división metabólica del 18F radioetiquetado del péptido cMBP. El 18F, preferentemente está unido por medio de un enlace fluoroarilo C-F. El 18F puede estar unido directamente a uno de los aminoácidos del cMBP, aunque preferentemente es conjugado como parte de un sustituyente radiofluorado en el cMBP. Dichos sustituyentes, preferentemente son de la fórmula: en donde: L es un grupo de enlace sintético de fórmula -(A)m- en donde cada A es independientemente -CR2- , -CR = CR- , -C = C- , -CR2C02-, -C02CR2-, -NR(C = 0)-, -(C = 0)NR- , -NR(C = 0)NR-, -NR(C = S)NR-, -SO2NR- , -NRS02-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, -CR2-0-N = , -CR2-0-NR-, -CR2-0-N H(CO)- , un grupo C4_8 cyd oheteroalquileno, un grupo C4.8 cicloalquileno, un grupo C5-i2 arileno, o un grupo C3. 2 heteroarileno, un aminoácido, una azúcar o un bloque de construcción de polietilénglicol (PEG) monodisperso; cada R es seleccionada independientemente de R, C1-4 alquilo, C2-4 alquenilo, C2-4 alquinilo, C1-4 alcoxialquilo o C1-4 hidroxialquilo; m es un entero de valor de 1 a 20; n es un entero de valor de 0 o 1.

El término "aminoácido" significa un aminoácido L o D, un análogo de aminoácido (por ejemplo, naftilalanina) o un mimético de aminoácido, el cual puede ser de ocurrencia natural o de origen meramente sintético, y puede ser ópticamente puro, es decir, un enantiómero único, y por lo tanto, quiral, o una mezcla de enantiómeros. En la presente, se utilizan las abreviaturas convencionales de tres letras o una sola letra para los aminoácidos. Preferentemente, los aminoácidos de la presente invención son ópticamente puros. El término "mimético de aminoácido" significan análogos sintéticos de aminoácidos de ocurrencia natural los cuales son isoésteres, es decir, han sido diseñados para imitar la estructura estérica y electrónica del compuesto natural.

Dichos isoésteres son bien conocidos por aquellos expertos en la materia e incluyen, sin limitación, depsi péptidos, péptidos retro-inversos, tioamidas, cicloalcanos o tetrazoles 1 , 5-disubstituidos [véase la publicación de . Goodman, "Biopolímeros" (Biopolymers), 24, página 137 (1985)].

El término "péptido" significa un compuesto que comprende dos o más aminoácidos, como los que se definieron anteriormente, enlazados por un enlace de péptido (es decir, un enlace de amida que enlaza la amina de un aminoácido al carboxilo del otro).

El término "azúcar" significa un mono, di o trisacárido. Las azúcares adecuadas incluyen: glucosa, galactosa, maltosa, mañosa y lactosa. Opcionalmente, el azúcar puede ser funcionalizada para permitir el acoplamiento fácil a los aminoácidos. Por consiguiente, por ejemplo, un derivado de glucosamina de un aminoácido, puede ser conjugado con otros aminoácidos por medio de los enlaces de péptidos. El derivado de glucosamina de asparagina (disponible comercialmente de NovaBiochem) es un ejemplo de esto: Cuando A y A' son "cualquier aminoácido diferente de Cys", significa que el aminoácido adicional de los grupos A y A' carecen de grupos tiol libres, en particular, los residuos Cys. Esto se debe a que un residuo Cys adicional podría arriesgar el puente de disulfuro de mezclarse con los puentes de bisulfuro de Cysa-Cysb y Cysc-Cysd de la secuencia Q, con la pérdida o reducción en consecuencia de la afinidad de enlace c-Met.

Características preferidas Los péptidos cMBP preferidos de la presente invención tienen un KD para enlace de c-Met para el complejo c-Met/HGF de menos de aproximadamente 10 nM (con base en las mediciones del ensayo de polarización de fluorescencia), más preferentemente dentro del intervalo de 1 a 5 nM, con menos de 3nM siendo lo ideal.

El péptido cMBP de las fórmulas I y II, preferentemente es de la Fórmula HA.

-(A)x-Q-(A')Z-I_ys- (IIA) en donde A, es como se definió para la Fórmula II, z es un entero de valor 0 a 12, y [x + z] = 0 a 12, y cMBP comprende únicamente un residuo Lys.

Por consiguiente, en la Fórmula lia, el residuo Lys único está localizado de manera específica en el término C del cMBP. Eso, a su vez, significa que la radioetiqueta 8F, preferentemente está localizada en la posición del término C.

Q, comprende preferentemente la secuencia de aminoácido ya sea de la SEQ-2 o la SEQ-3: Ser-Cysa-X'-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6 (SEQ-2); Ala-Gly-Ser-Cysa-X'-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-Gly-Thr (SEQ-3).

En la SEQ-1, SEQ-2 y SEQ-3, X3, preferentemente es Arg. En la Fórmula I y la Fórmula II, los grupos -(A)x- o (A')y-, comprenden preferentemente un péptido enlazador, el cual es elegido de -Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4), -Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5) o -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6).

El péptido cMBP del primer aspecto, preferentemente tiene la secuencia de aminoácido (SEQ-7): Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

Los agentes de formación de imagen preferidos de la presente invención tienen ambos términos de péptido cMBP protegidos por los grupos MIG, es decir, preferentemente, tanto Z1 como Z2 son MIG, los cuales normalmente serán diferentes. Es importante tener ambos términos de péptido protegidos de esta manera para las aplicaciones de formación de imágenes in vivo, debido a que de otra manera, el metabolismo de péptido rápido podría esperarse con la pérdida consecuente de afinidad de enlace selectivo para el c-Met. Cuando, tanto Z1 como Z2 son MIG, preferentemente Z1 es acetilo y Z2 es una amida primaria. Más preferentemente, Z1 es acetilo y Z2 es una amida primaria si la porción 18F está unida al epsilón de la cadena lateral de amina del residuo lisina de cMBP.

El sustituyente radiofluorado -(L)n- 8F puede ser unido al grupo amino alfa del término N del péptido de enlace c-Met, o alternativamente a la amina de cadena lateral de cualesquiera aminoácidos aminoácidos amino sustituidos (por ejemplo, los residuos Lys). Preferentemente, éste está unido al epsilón (E) del grupo amina del residuo Lys del cMBP.

Los sustituyentes radiofluorados preferidos -(L)n-18F tienen n = 1 , es decir, está presente un grupo de enlace sintético como el que se definió anteriormente. Dichos sustituyentes más preferidos comprenden el enlace radioetiquetado 18F a un grupo fenilo, es decir, el sustituyente es de la fórmula: -(A)XC6H4-18F en donde: A es como se definió anteriormente, x es un entero de valor de 1 a 5.

Dichos sustituyentes más preferidos surgen ya sea de la N-acilación del residuo de amina Lys con un éster activo fluorado, o de la condensación del derivado amino-oxi del residuo de amina Lys con un benzaldehído fluorado, y son de la fórmula: Los agentes de formación de imagen del primer aspecto pueden ser preparados como se describe en el quinto aspecto (más adelante) En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición de agente de formación de imagen la cual comprende: (i) el péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 8F del primer aspecto; (ii) un péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado: en donde: dicho péptido cíclico de enlace c-Met tiene la misma secuencia de aminoácido en (i) y en (ii) y en donde, el péptido cMBP no etiquetado está presente en dicha composición en no más de 50 veces la cantidad molar de dicho péptido cMBP etiquetado por 18F.

Las modalidades preferidas del péptido cíclico de enlace c-MET radioetiquetado por 8F en el segundo aspecto, son como se describieron en el primer aspecto (anterior).

El término "composición" tiene su significado convencional, es decir, una mezcla de los componentes especificados. La composición puede estar en la forma sólida o líquida/solución.

El término "no etiquetado" significa que el péptido cíclico de enlace c-Met no es radioactivo, es decir, no está radioetiquetado con 8F, o cualquier otro radioisótopo. Uno o más de dichos péptidos pueden estar presentes en la composición, y dichos péptidos no etiquetados principalmente incluyen a los precursores no radioactivos del cuarto aspecto (más adelante). El término "no etiquetado" excluye el péptido cíclico de enlace c-Met etiquetado con 19F, en donde dicho 19F está presente en el fluoruro 18F utilizado para radioetiquetar dicho péptido cíclico de enlace c-Met y por consiguiente es un producto de la misma reacción de radioetiquetado. Como es conocido en la materia, si dos compuestos sustituidos de flúor difieren únicamente en los isótopos del átomo de flúor, éstos podrían comportarse químicamente casi en una forma idéntica, y por consiguiente, su separación podría ser extremadamente difícil. El péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado o precursor, preferentemente tiene los grupos Z y/o Z2 ya unidos.

Los inventores presentes han descubierto que, cuando se utiliza un aldehido etiquetado por 18F para conjugar a un precursor de péptido cMBP funcionalizado por aminooxi, que las impurezas aldehídicas no radiactivas son las fuentes principales de productos derivados. Una de dichas impurezas aldehídicas importantes en el 8F-benzaldeh ido es DMAP (es decir, 4-dimetilamino)benzaldehido. Por lo tanto, los productos de conjugación de los aldehidos no radioactivos (tales como DMAP) con péptido cMBP funcionalizado por aminooxi también están dentro del alcance del término "péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado".

Preferentemente, el péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado está presente en dicha composición hasta en 30, más preferentemente hasta 20, todavía más preferentemente menor que 10 veces la cantidad molar del péptido etiquetado por 18F correspondiente.

La composición del segundo aspecto, preferentemente está en forma de solución, en donde, los componentes (i) y (ii) están presentes ambos en la solución. Más preferentemente, la solución es un solvente biocompatible, o una mezcla de dos o más de dichos solventes. Dichos solventes biocompatibles preferidos se describen en el tercer aspecto (a continuación), y preferentemente comprenden un solvente acuoso.

Los presentes inventores han descubierto que, en las concentraciones de radiorastreador - un rango de concentración aproximado de 1 a 50 pg/ml, los péptido cMBP etiquetados por 18F de la presente invención, exhiben un enlace no deseado a una variedad de materiales. Debido a que el radiorastreador está presente en dicha concentración muy baja, incluso una cantidad química pequeña de adsorción puede representar un porcentaje significativo del radioisótopo presente. Esa concentración de radiorastreador será comparada con, por ejemplo, los péptidos de enlace c-Met etiquetados por tinte de cianuro correspondiente, en donde la concentración podría ser aproximadamente de 2 a 10 mg/ml - un factor de casi un millar superior. En dichos casos, la pérdida de cantidades en pg de material para adsorción, podrían ser un porcentaje insignificante de los péptidos etiquetados por tinte que todavía permanecen en la solución. Los materiales en donde se ha observado la adhesión de radiorastreador incluyen plásticos, vidrio y sílice. En el caso de los filtros, pueden significar un porcentaje alto en pérdidas de radioactividad cuando se lleva a cabo la filtración estéril.

Los presentes inventores han descubierto que el fenómeno de adhesión anterior es el resultado de que el péptido cMBP se precipita bajo condiciones acídicas (particularmente a temperaturas bajas). Por consiguiente, es preferible mantener la composición en o por debajo de un pH de 7.5, más preferentemente un pH de 8.0 o superior con el objeto de mantener el péptido de enlace c-Met etiquetado por 18F deseado en la solución, y de esta manera evitar la pérdida de material. Como una alternativa a, o además del uso del pH controlador, un solubilizador puede estar incluido.

El término "solubilizador" significa un aditivo presente en la composición, el cual incrementa la solubilidad del agente de formación de imágenes en el solvente. Uno de dichos solventes preferidos es un medio acuoso, y por lo tanto, el solubilizador, preferentemente mejora la solubilidad en agua. Dichos solubilizadores adecuados incluyen: alcoholes de C1-4; glicerina, polietilénglicol (PEG); propilénglicol; monooleato de sorbitán de polioxietileno; monooleato de sorbitán; polisorbatos; copolímeros de bloque de poli(oxietileno)poli(oxipropileno)poli(olietileno) (Pluronics™); ciclodextrinas (por ejemplo, alfa, beta o gama ciclodextrina, hidroxipropil- -ciclodextrina o hidroxipropil-Y-ciclodextrina) y lecitina.

Los solubilizadores preferidos son ciclodextrinas, alcoholes de C1-4 y Pluronics™, más preferentemente ciclodextrinas y alcoholes de C2-4- Cuando el solubilizador es un alcohol, éste preferentemente es etanol o propanol, más preferentemente etanol. El etanol tiene un papel dual potencial, debido a que también funciona como un radioprotector. Cuando el solubilizador es una ciclodextrina, ésta preferentemente es una ciclodextrina, más preferentemente, hidroxipropil-ß-ciclodextrina (HPCD) La concentración de ciclodextrina puede ser desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 40 mg/mL, preferentemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 35 mg/mL, más preferentemente de 20 a 30 mg/ml, el más preferido de aproximadamente 25 mg/ml. Cuando se utiliza el solubilizador único, este preferentemente es etanol o hidroxlpropil- -ciclodextrina, más preferentemente etanol. Cuando se utiliza una combinación de solubilizadores, ésta preferentemente es etanol e hidroxipropil-p-ciclodextrina.

Preferentemente, la composición del segundo aspecto se mantiene en un pH de o por encima de 7.5, opcionalmente con de 5 a 10% v/v de etanol como el solubilizador.

La composición de agente de formación de imagen del segundo aspecto, preferentemente comprende adicionalmente uno o más radioprotectores. El término "radioprotector" significa un compuesto, el cual inhibe las reacciones de degradación, tales como los procedimientos redox, atrapando los radicales libres altamente reactivos, tales como radicales libres que contienen oxígeno que surgen de la radiolisis del agua. Se puede utilizar una combinación de dos o más radioprotectores diferentes. Los radioprotectores de la presente invención son elegidos de manera adecuada entre: etanol; ácido ascórbico; ácido para-aminobenzóico (es decir, ácido 4-aminobezóico o pABA); ácido gentísico (es decir, ácido 2,5-dihidrobenzóico), y en donde se puede aplicar, sales de dichos ácidos con un catión biocompatible tal como el que se definió anteriormente.

El radioprotector de la presente invención, comprende preferentemente ácido para-aminobenzóico o para-amonobenzoato de sodio.

Una composición de agente de formación de imágenes preferida de la presente invención, comprende el péptido cMBP de la SEQ-7 que tiene Z = Z2 = MIG unido, y una combinación de radioprotector de ácido para-aminobenzóico y radioprotector/solubilizador de etanol en regulador acuoso. Un péptido preferido de la SEQ-76 en dichas composiciones preferidas es el péptido 1, y un péptido cMBP etiquetado por 18F preferido es el Compuesto 3. La concentración radioactiva, preferentemente es menor que 350 MBq/ml, con una concentración pABA de 2 mg/ml, y etanol aproximadamente a 5 a 10% vol/vol, preferentemente 6.5 a 7.5% vol/vol.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende al agente de formación de imagen del primer aspecto, o la composición de agente de formación de imagen del segundo aspecto, junto con un portador biocompatible, en una forma estéril adecuada para administración en mamíferos.

Los aspectos preferidos del agente de formación de imagen y la composición en el tercer aspecto, son como se definieron en el primer y segundo aspectos, respectivamente.

El "portador biocompatible" es un fluido, especialmente un líquido, en el cual, el agente de formación de imagen puede ser suspendido o disuelto preferentemente, de manera que la composición se puede tolerar fisiológicamente, es decir, pueden ser administradas al cuerpo del mamífero sin toxicidad o incomodidad indebida. El portador biocompatible de manera adecuada es un líquido portador que se puede inyectar, tal como agua estéril, libre de pirógeno para inyección; una solución acuosa, tal como una solución salina (la cual puede ser equilibrada de manera ventajosa de manera que el producto final para inyección es isotónico); una solución de regulador acuoso que comprende un agente regulador biocompatible (por ejemplo, regulador de fosfato); una solución acuosa de una o más sustancias de ajuste de tonicidad (por ejemplo, sales de cationes de plasma con contraiones biocompatibles), azúcares (por ejemplo, glucosa o sucrosa), alcoholes de azúcar (por ejemplo, sorbitol o manitol), glicoles (por ejemplo, glicerol), u otros materiales de poliol no iónicos (por ejemplo, polietilénglicoles, propilénglicoles, y los similares). Preferentemente, el portador biocompatible es agua libre de pirógeno para inyección, solución salina isotónica o regulador de fosfato. El uso de un regulador es preferido con el objeto de controlar el pH.

Los agentes de formación de imagen y portador biocompatible, son suministrados cada uno en frascos adecuados o recipientes que comprenden un contenedor sellado, el cual permite el mantenimiento de la integridad estéril y/o la seguridad radioactiva, más opcionalmente un gas superior inerte (por ejemplo, nitrógeno o argón), mientras que permiten la adición y extracción de soluciones mediante una jeringa o cánula. Dicho contenedor preferido es un frasco sellado por un septo, en donde el cierre hermético al gas está corrugado con un sobre-sello (normalmente de aluminio). El cierre es adecuado para perforación única o múltiple con una aguja hipodérmica (por ejemplo, un cierre de sello de septo corrugado) mientras que mantienen la integridad estéril. Dichos contenedores tienen la ventaja adicional de que el cierre puede soportar el vacío, si se desea (por ejemplo, para cambiar el gas o soluciones de desgaseo del espacio superior), y soportar los cambios de presión tales como las reducciones en la presión sin permitir el ingreso de gases atmosféricos externos, tales como oxígeno o vapor de agua.

Los contenedores de dosis múltiples preferidos comprenden un frasco de volumen único (por ejemplo, de 10 a 30 cm3 de volumen) el cual contienen dosis para pacientes múltiples, mediante lo cual, las dosis de paciente único pueden de esta manera ser extraídos en jeringas de grado clínico en diversos intervalos de tiempo durante la vida útil admisible de la preparación para adecuarse a la situación clínica. Las jeringas llenas previamente están diseñadas para contener una dosis humana única, o "dosis unitaria" y por consiguiente, preferentemente son una jeringa desechable u otra jeringa adecuada para uso clínico. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, preferentemente tienen una dosificación adecuada para un paciente único y son provistas en una jeringa adecuada o contenedor, como se describió anteriormente.

La composición farmacéutica puede contener excipientes opcionales adicionales tales como: un conservador antibacterial, un agente para ajuste del pH, un material de relleno, un radioprotector, un solubilizador o un agente de ajuste de osmolaridad. El término "radioprotector" y "solubilizador" y las modalidades preferidas del mismo son como se describieron en el segundo aspecto (anterior). El término "conservador antibacterial" significa un agente, el cual inhibe el crecimiento de micro-organismos potencial mente dañinos, tales como bacterias, levaduras o mohos. El conservador antibacterial también puede exhibir algunas propiedades bactericidas dependiendo de la dosificación empleada. El papel principal del conservador(es) antibacterial de la presente invención es inhibir el crecimiento de cualquiera de dichos micro-organismos en la composición farmacéutica. El conservador antibacterial puede, sin embargo, también ser utilizada opcionalmente para inhibir el crecimiento de micro-organismos potencial mente dañinos en uno o más componentes de los equipos utilizados para preparar dicha composición antes de la administración. El conservador anti-bacterial adecuado incluye: los parabenos, es decir, metilo, etilo, propileno parabeno butilo o mezclas de los mismos; alcohol bencílico; fenol; cresol; cetrimida y triomersal. Los conservadores antibacteriales preferidos son los parabenos.

El término "agente de ajuste de pH" significa un compuesto o mezcla de compuestos útiles para asegurar que el pH de la composición está dentro de los límites aceptables (aproximadamente un pH de 4.0 a 10.5) para administración a humanos o mamíferos. Dichos agentes de ajuste de pH adecuados incluyen, reguladores farmacéuticamente aceptables, tales como tricina, fosfato o TRIS [es decir, tris(hidroximetil)aminometano], y bases farmacéuticamente aceptables tales como carbonato de sodio, bicarbonato de sodio o mezclas de los mismos. Cuando se emplea la composición en forma de equipo, el agente de pH de ajuste opcionalmente puede ser provisto en un frasco o contenedor separado, de manera que el usuario del equipo puede ajustar el pH como parte de un procedimiento de pasos múltiples.

El término "material de relleno" significa un agente de adición de volumen farmacéuticamente aceptable, el cual puede facilitar el manejo del material durante la producción o liofilización . Los materiales de relleno adecuados incluyen sales inorgánicas, tales como cloruro de sodio, y azúcares solubles en agua o alcoholes de azúcares, tales como sucrosa, maltosa, manitol o trehalosa.

Las composiciones farmacéuticas del tercer aspecto pueden ser preparadas bajo condiciones de fabricación asépticas (es decir, cuarto limpio) para producir el producto no pirogénico, estéril deseado. Se prefiere que los componentes clave, especialmente los reactivos asociados más aquellas partes del aparato que están en contacto con el agente de formación de imagen (por ejemplo, frascos) son estériles. Los componentes y reactivos pueden ser esterilizados mediante los métodos conocidos en la materia: filtración estéril, esterilización de terminal utilizando, por ejemplo, irradiación gamma, autoclave, calor seco o tratamiento químico (por ejemplo, con óxido de etileno). Se prefiere esterilizar algunos componentes por adelantado, de manera que tiene que realizarse la cantidad mínima de manipulación. Sin embargo, como una precaución, se prefiere incluir por lo menos un paso de filtración estéril como el paso final en la preparación de la composición farmacéutica.

Como se observó anteriormente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención, preferentemente se mantienen a un pH de 7.5 o superior y/o comprenden un solubilizador, de manera que el paso de filtración estéril puede utilizarse sin una pérdida indebida de radioactividad adsorbida hacia el material del filtro. Las condiciones similares se aplican a las manipulaciones de las composiciones farmacéuticas en jeringas de grado clínico, o utilizando tuberías de plástico, en donde la adsorción puede producir una pérdida de radioactividad sin el uso de un solubilizador.

La composición farmacéutica, preferentemente es preparada como se describe en el sexto aspecto (a continuación).

La composición farmacéutica del tercer aspecto, opcionalmente puede ser preparada a partir de un equipo. Dicho equipo comprende un péptido de enlace c-Met de la Fórmula I, como se describió en el primer aspecto o el precursor del cuarto aspecto en forma estéril, apirogénica, de manera que, a partir de la reacción con un suministro estéril del radioisótopo 18F en un solvente adecuado, ocurre el radioetiquetado para proporcionar el péptido de enlace c-Met etiquetado por 18F.

Para el equipo, el péptido de enlace c-Met o el precursor, más otros excipientes opcionales como los que se describieron anteriormente, son provistos preferentemente como un polvo liofilizado en un frasco o contenedor adecuado. El agente es diseñado entonces para ser reconstituido ya sea con 18F en un portador biocompatible directamente (es decir, como una reconstitución), o la primera reconstitución del equipo con un portador biocompatible, seguido por la reacción con un suministro de 18F.

Una forma estéril preferida del péptido de enlace c-Met o precursor es un sólido liofilizado. La forma estéril, sólida, preferentemente es suministrada en un contenedor de grado farmacéutico, como se describió para la composición farmacéutica (anteriormente). Cuando el equipo es liofilizado, la formulación opcionalmente puede comprender un crioprotector elegido de un sacárido, preferentemente manitol, maltosa o tricina.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un precursor, útil en la preparación del péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F del tercer aspecto, o la composición del primer o segundo aspectos, la cual comprende: (i) el péptido cíclico de enlace c-Met de la Fórmula I como se definió en el primer aspecto, en donde Z1 = Z2 = MIG; o (i¡) un péptido cíclico de enlace c-Met funcionalizado amino-oxi: El término "péptido cíclico de enlace c-Met funcionalizado amino-oxi" significa el péptido cíclico de enlace d-Met de la Fórmula I que tiene conjugado de manera covalente al mismo un grupo funcional amino-oxi. Dichos grupos amino-oxi son de la fórmula -0-NH2, preferentemente -CH2O-NH2 y que tiene la ventaja de la amina del grupo amino-oxi es más reactiva que un grupo amina Lys en las reacciones de condensación con los aldehidos para formar los éteres de oxima. Dichos grupos amino-oxi son unidos en forma adecuada en el residuo Lys del cMBP, como se describe más adelante.

El precursor no es radioactivo, y está diseñado de manera que puede ser obtenido en un grado alto de pureza química. Éste también está diseñado de manera que, a partir de la reacción con una fuente adecuada de 8F, la reacción ocurre de manera eficiente con pureza radioquímica satisfactoria (RCP).

La "fuente adecuada de 18F" depende de la naturaleza del precursor. Cuando el precursor comprende el péptido de enlace c-Met no etiquetado de la Fórmula I, el grupo amina del residuo lisina (Lys) del péptido no etiquetado está diseñada para ser el sitio de radioetiquetado. El término del péptido c BP es protegido, debido a que Z = Z2 = MIG. Dichos péptidos de enlace c-Met preferidos, y los grupos Z1/Z2 preferidos son como se describió en el primer aspecto. Por consiguiente, la fuente adecuada de 18F está diseñada para reaccionar de manera tan eficiente como sea posible con el grupo amina de lisina, preferentemente la amina epsilón Lys.

Para la preparación de la composición farmacéutica del tercer aspecto, el precursor, preferentemente están en forma estéril, más preferentemente un sólido liofilizado.

El precursor del cuarto aspecto, preferentemente es un péptido de enlace c-Met funcionalizado amino-oxi.

Los péptidos de enlace c-Met de la Fórmula I, es decir, Z -[cMBP]-Z2 de la presente invención puede ser obtenido mediante un método de preparación, el cual comprende: (i) la síntesis de péptido de fase sólida de un péptido lineal, el cual tiene la misma secuencia de péptido que el péptido cMBP deseado y en el cual, el Cysa y Cysb están desprotegidos, y los residuos Cys y Cysd tienen grupos de protección tiol; (ii) tratamiento del péptido a partir del paso (i) con base acuosa en solución para proporcionar un péptido monocíclico con un primer enlace de bisulfuro que enlaza Cysa y Cysb; (iii) remoción de los grupos de protección tiol Cysc y Cysd y la ciclación para producir un segundo enlace de disulfuro que enlaza Cys° y Cysd, el cual es el producto de péptido bicíclico deseado Z1-[cMBP]-Z2.

El término "grupo de protección" significa un grupo, el cual inhibe o suprime las reacciones químicas indeseables, aunque el cual está diseñado para ser suficientemente reactivo que puede ser separado a partir del grupo funcional en cuestión bajo condiciones suficientemente suaves, que no modifican el resto de la molécula. Después de la desprotección se obtiene el producto deseado. Los grupos amina son bien conocidos por aquellos expertos en la materia y son elegidos en forma adecuada de entre: Boc (en donde Boc es ter-butiloxicarbonilo), Fmoc (en donde Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo), trifluoroacetilo, aliloxicarbonilo, Dde [es decir, 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etilo] o Npys (es decir, 3-nitro-2-piridina sulfenilo). Los grupos de protección tiol adecuados son Trt (Tritilo), Acm (acetamidometilo), t-Bu (terbutilo), ter-Butiltio, metoxibencilo, metilbencilo o Npys (3-nitro-2-piridina sulfenilo). El uso de los grupos de protección adicionales son descritos en la publicación "Grupos de protección en síntesis orgánica" (Protective Groups in Organic Synthesis), 4a Edición, Theorodora W. Greene y Peter G. M . Wuts, [Wiley Blackwell, (2006)]. Los grupos de protección amina preferidos son Boc y Fmoc, más preferentemente Boc. Los grupos de protección amina preferidos son Trt y Acm.

Los ejemplos 1 y 2, proporcionan detalles específicos adicionales. Los detalles adicionales de síntesis de péptido de fase sólida se describen en la publicación de Lloyd-Williams, F. Albericio y E. Girald; "Métodos químicos para la síntesis de péptidos y proteínas" (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins), CRC Press, 1997. Los péptidos cMBP son almacenados mejor bajo atmósfera inerte y mantenidos en un congelador. Cuando son utilizados en solución, es mejor evitar el pH por encima de 7, debido a los riesgos de mezclado de los puentes de bisulfuro.

Los péptidos de enlace c-Met funcionalizados amino-oxi pueden ser preparados mediante los métodos de la publicación de Poethko y asociados [L. Nucí. Med., 45, páginas 892 a 902 (2004)], la publicación de Schirrmacher y asociados [Bioconj. Chem., 18, páginas 2085 a 2089 (2007)], la publicación de Solbakken y asociados [Bioorg. Med. Chem. Lett, 16, páginas 6190 a 6193 (2006)] o la publicación de Glaser y asociados [Bioconj. Chem., 19, páginas 951 a 957 (2008)]. El grupo amino-oxi puede ser conjugado opcionalmente en dos pasos. En primer lugar, el ácido carboxílico amino-oxi N-protegido o el éster activado de amino-oxi N-protegido está conjugado para el péptido de enlace c-Met. En segundo lugar, el péptido de enlace c-Met funcionalizado amino-oxi N-protegido está desprotegido para producir el producto deseado [véanse los documentos de Solbakken y Glaser anteriores]. Los ácidos carboxilicos amino-oxi N-protegidos tales como Boc-NH-0-CH2(C = 0)OH están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Novabiochem.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación del péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado 18F del primer aspecto, el cual comprende: (i) provisión del precursor del cuarto aspecto; (ii) cuando dicho precursor comprende un péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado de la Fórmula I, en donde Z = Z2 = MIG, la reacción, ya sea con un éster activado etiquetado por 18F o un ácido carboxílico etiquetado por 8F en la presencia de un agente de activación, para producir el péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F conjugado por medio de un enlace de amida en el residuo Lys del cMBP de dicho péptido cíclico. (iii) cuando dicho precursor comprende un péptido cíclico de enlace c-Met funcionalizado amino-oxi, la reacción con cualquiera de: (a) un éster activado etiquetado por 18F, o un ácido carboxílico etiquetado por 18F en la presencia de un agente de activación, para producir el péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F conjugado por medio de un enlace de amida en la posición amino-oxi de dicho péptido funcionalizado; o (b) un aldehido etiquetado por 18F para producir el péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F conjugado por medio de un enlace de éter oxima en la posición amino-oxi de dicho péptido funcionalizado.

El término "éster activado" o "éster activo" significa un derivado de éster del ácido carboxílico asociado, el cual está diseñado para ser un mejor grupo de partida, y por lo tanto, permite una reacción más fácil con el nucleófilo, tales como aminas. Los ejemplos de los ésteres activos adecuados son: N-hidroxisuccinimida (NHS); éster sulfo-succinimidilo; pentafluorofenol; pentafluorotiofenol; para-nitrofenol; hid roxibenzotriazole y PyBOP (es decir, hexafluorofosfato de benzotriazol- 1 -il-oxitripirrolidinofosfonio). Los ésteres activos preferidos son ésteres de N-hidroxisuccinimida o pentafluorofenol, especialmente los ésteres de N-hidroxisuccinimida.

El término "agente de activación" significa un reactivo utilizado para facilitar el acoplamiento entre una amina y un ácido carboxílico para generar una amida. Dichos agentes de activación adecuados son conocidos en la materia, e incluyen carbodiimidas, tales como EDC [N-(3-dimetilaminopropil)-N -etilcarbodiimida y N , N-dialquilcarbodiimidas tales como diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida; y triazoles tales como HBTU [O-íbenzotriazol-l-i -N.N.N'.N1-tetrametiluronio hexafluorofosfato], HATU [0-(7-azabenzotr¡azol-1-il)-N,N,N\N'-tetrarnet¡luronio hexafluorofosfato], y PyBOP [benzotriazol-1 - ¡loxi)tr¡p¡rrolidinofosfonio hexafluorofosfato]. Los detalles adicionales son provistos en la publicación "Química orgánica avanzada de March" (March 's Advanced Organic Chemistry), 5a Edición, páginas 508 a 510, Wiley Interscience (2001). Dicho agente de activación preferido es ADC.

Los ésteres activados etiquetados por 18F, tales como [18F]SFB pueden ser preparados mediante el método de Glaser y asociados, y las referencias en el mismo [J. Lab. Comp. Radiopharm., 52, páginas 327 a 330 (2009)], o el método automatizado de Marik y asociados [Appl. Rad. Isot., 65(2), páginas 199 a 203 (2007)]: Los ácidos carboxílicos etiquetados por 18F pueden obtenerse mediante el método de Marik y asociados, citado anteriormente. Los aldehidos alifáticos etiquetados por 8F de la fórmula 18F(CH2)20[CH2CH20]qCH2CHO, en donde q es 3, se puede obtener mediante el método de Glaser y asociados [Bioconj. Chem., 19(4), páginas 951 a 957 (2008)]. El 8F-fluorobenzaldehído se puede obtener mediante el método de Glaser y asociados [J. Lab. Comp. Radiopharm., 52, páginas 327 a 330 (2009)]. El precursor Me3N+-C6H4-CHO. CF3SO3- se obtiene mediante el método de Haka y asociados [J. Lab. Comp. Radiopharm., 27, páginas 823 a 833 (1989)].

La conjugación de aldehidos etiquetados por 18F con péptidos c-Met funcionalizados amino-oxi, preferentemente se realiza en la presencia de un catalizador de anilina como el que se describió en la publicación de Plavell y asociados [J. Am. Chem. Soc, 130 (28), páginas 9106 a 9112 (2008)]. Mientras que es posible utilizar los péptidos c-Met amino-oxi protegidos (tal como el compuesto 1) como precursores, el derivado de amino-oxi libre (tal como el Compuesto 2) es el preferido. Esto se debe a que la síntesis completa es más sensible a la automatización, mientras que con el precursor protegido, normalmente se requiere un paso de desprotección manual.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de la composición de agente de formación de imagen del segundo aspecto, o la composición farmacéutica del mismo del tercer aspecto, la cual comprende: (i) preparar un péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado 8F como está definido en el método de preparación del quinto aspecto; (ii) separación eromatográfica del péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado a partir del péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F.

Los aspectos preferidos del agente de formación de imagen y la composición farmacéutica en el sexto aspecto, son como se describió en el segundo y tercer aspectos, respectivamente.

La separación eromatográfica del paso (ii) puede ser llevada a cabo por HPLC o SPE (extracción de fase sólida) utilizando uno o más cartuchos SPE. El SPE es preferido cuando se utiliza un sintetizador automatizado, y el DPLC es preferido en otras circunstancias. El Ejemplo 5 proporciona un método HPLC adecuado para el Compuesto 3 de la presente invención.

El método del sexto aspecto se utiliza preferentemente para obtener la composición farmacéutica del tercer aspecto. Cuando se utiliza el método para proporcionar la composición farmacéutica del tercer aspecto, el método de preparación preferentemente es llevado a cabo utilizando un aparato sintetizador automatizado.

El término "sintetizador automatizado" significa un módulo automatizado basado en el principio de las operaciones unitarias como se describen en la publicación de Satyamurthy y asociados [Clin. Positr. I mag . , 2(5), páginas 233 a 253 (1999)].

El término "operaciones de unidad" significa que los procedimientos complejos son reducidos a una serie de operaciones o reacciones simples, los cuales pueden ser aplicados a un rango de materiales. Dichos sintetizadores automatizados son preferidos para el método de la presente invención, especialmente cuando se desea una composición farmacéutica. Éstos están comercialmente disponibles de una serie de proveedores [Satyamurthy y asociados, anterior, que incluye: GE Healthcare; CTI Inc; Ion Beam Applications S.A. (demin du cyclotron 3, B-1348 Louvain-La-Neuve, Bélgica); Raytest (Alemania) y Bisocan (E.U.A.).

Los sintetizadores automatizados comerciales también proporcionan contenedores adecuados para el desecho radioactivo líquido generado como resultado de la preparación radiofarmacéutica. Los sintetizadores automatizados, normalmente no son provistos con protección de radiación, debido a que están diseñados para ser empleados en una célula de trabajo radioactiva configurada de manera adecuada. La célula de trabajo radioactiva proporciona protección de radiación adecuada para proteger al operador de la dosis de radiación potencial, así como también la ventilación para remover los vapores químicos y/o radioactivos. El sintetizador automatizado comprende preferentemente un cásete. El término "cásete" significa una pieza del aparato diseñado para ajustarse de manera que se puede remover e intercambiar sobre un aparato sintetizador automatizado (como se define más adelante), de tal manera que el movimiento mecánico de las partes móviles del sintetizador controlan la operación del cásete desde el exterior del cásete, es decir, en forma externa. Los casetes adecuados comprenden un arreglo lineal de válvulas, cada una enlazada a un puerto en donde los reactivos o frascos pueden estar unidos, ya sea por perforación con aguja de un frasco sellado por septo invertido, o mediante uniones de enlace hermético al gas. Cada válvula tiene una unión machóhembra, la cual hace ¡nterfase con un brazo en movimiento correspondiente del sintetizador automatizado. La rotación externa del brazo controla de esta manera la abertura o cierre de la válvula, cuando el cásete está unido al sintetizador automatizado. Las partes en movimiento adicionales del sintetizador automatizado están diseñadas para sujetarse sobre las puntas del émbolo de la jeringa, y de esta manera elevan u oprimen los barriles de la jeringa.

El cásete es versátil, normalmente tiene varias posiciones en donde los reactivos pueden estar unidos, y varios adecuados para unión de los frascos de jeringa de los reactivos o cartuchos de cromatografía (por ejemplo, SPE). El cásete siempre comprende un recipiente de reacción. Dichos recipientes de reacción, preferentemente son de 1 a 10 cm3, más preferentemente de 2 a 5 cm3 en volumen y son configurados de manera que 3 o más puertos del cásete son conectados al mismo, para permitir la transferencia de reactivos o solventes desde varios puertos en el cásete. Preferentemente el cásete tiene de 15 a 40 válvulas en un arreglo lineal, más preferentemente de 20 a 30, y con 25 siendo lo especialmente preferido. Las válvulas del cásete, preferentemente son idénticas cada una, y más preferentemente son válvulas de 3 vías. Los casetes están diseñados para ser adecuados para la fabricación radiofarmacéutica y por consiguiente son fabricados a partir de materiales, los cuales son de grado farmacéutico e idealmente también son resistentes a la radiolisis.

Los sintetizadores automatizados preferidos de la presente invención son aquellos que comprenden un cásete de uso desechable o único, el cual comprende todos los reactivos, recipientes de reacción y aparatos necesarios para llevar a cabo la preparación de un lote determinado de radiofarmacéutico radiofluorado. El cásete significa que el sintetizador automatizado tiene la flexibilidad para tener la capacidad de elaborar una variedad de radiofarmacéuticos diferentes con riesgo mínimo de contaminación cruzada, cambiando simplemente el cásete. El método de cásete también tiene las ventajas de: configuración simplificada, por lo tanto, riesgo reducido de error del operador; GMP mejorado (Buena práctica de fabricación); cumplimiento; capacidad de rastreador múltiple; cambio rápido entre corridas de producción; verificación diagnóstica automatizada previa a la corrida del cásete y los reactivos; verificación cruzada del código de barras automatizado de reactivos químicos contra la síntesis a ser llevada a cabo; capacidad de rastreo del reactivo; uso único y por lo tanto sin riesgo de contaminación cruzada, resistencia al mal uso y abuso.

En este aspecto de la presente invención está incluido el uso de un aparato sintetizador automatizado para preparar la composición farmacéutica del segundo aspecto.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para la formación de imagen del cuerpo de mamífero in vivo para obtener imágenes de los sitios de sobre-expresión c-Met o localización, cuyo método comprende la formación de imágenes de dicho cuerpo al cual el agente de formación de imágenes del primer aspecto, la composición de agente de formación de imágenes del segundo aspecto o la composición farmacéutica del tercer aspecto, han sido administradas previamente.

Los aspectos preferidos del agente de formación de imagen, la composición de agente de formación de imagen y la composición farmacéutica en el séptimo aspecto, son como se describió en el primer, segundo y tercer aspectos, respectivamente.

Preferentemente, el mamífero es un cuerpo de mamífero intacto in vivo, y más preferentemente es un sujeto humano. Preferentemente, el agente de formación de imagen puede ser administrado al cuerpo del mamífero en una forma invasiva en forma mínima, es decir, sin un riesgo sustancial en la salud del sujeto mamífero incluso cuando se lleva a cabo bajo la experiencia médica profesional. Dicha administración invasiva en forma mínima, preferentemente es de administración intravenosa en una vena periférica de dicho sujeto, sin la necesidad de anestesia local o general.

Preferentemente, se utiliza la composición farmacéutica del tercer aspecto. En el método de formación de imágenes del séptimo aspecto, el sitio de sobre-expresión o localización c-Met preferentemente es un tumor canceroso o metástasis. Se visualiza que el agente podría ser útil para la formación de imágenes de expresión c-Met, tanto en tumores precancerosos como cancerosos o metástasis, permitiendo potencialmente la selección de terapia. Además, la formación de imagen repetida con dicho agente de formación de imagen también tiene el potencial para monitorear de manera rápida y efectiva de una respuesta de sujeto individual a los regímenes terapéuticos establecidos y novedosos, permitiendo de esta manera la discontinuación del tratamiento no efectivo. Adicionalmente, una sobreexpresión de c-Met es un atributo potencial de tumores agresivos, se anticipa que el agente de formación de imágenes c-Met tiene el potencial para discriminar entre los cánceres agresivos y menos agresivos en una etapa temprana de su desarrollo.

En este aspecto se incluye un método de diagnóstico de los sitios de sobre-expresión y localización c-Met dentro del cuerpo del mamífero in vivo, el cual comprende el método de formación de imágenes del séptimo aspecto.

La presente invención está ilustrada mediante los ejemplos no limitantes detallados más adelante. El Ejemplo 1, proporciona la síntesis de un péptido cMBP de la presente invención que tiene grupos de inhibición de metabolismo (Z = Z2 = MIG) en ambos términos (Péptido 1) El Ejemplo 2 proporciona la síntesis de un precursor protegido de la presente invención (compuesto 1). El Ejemplo 3, proporciona la síntesis de la contraparte no radioactiva, fluorada (es decir, 9F) del péptido c-Met etiquetada por flúor (Compuesto 3A). El Ejemplo 4 proporciona la síntesis de un péptido c-Met radiofluorado por 18F de la presente invención (Compuesto 3B). El Ejemplo 5, proporciona las condiciones HPLC para la separación de péptidos de enlace c-Met etiquetados y no etiquetados.

El Ejemplo 6, proporciona la biodistribución de un péptido etiquetado por 18F de la presente invención (Compuesto 3B) en un modelo de tumor animal. Los resultados muestran el enlace al receptor c-Met de humano expresado en los tumores HT-29, y por lo tanto, la utilidad para la formación de imágenes del tumor. El Ejemplo 7, demuestra que la extracción de tumor del Ejemplo 6 es específica, debido a la extracción puede ser inhibida por la co-administración del péptido de enlace c-Met etiquetado por 19F no radioactivo (Compuesto 3A). El Ejemplo 8, también demuestra una extracción de hígado reducida de aproximadamente el 40% en primates, cuando el péptido de enlace c-Met etiquetado por 19F es co-administrado. La co-administración de una versión mezclada etiquetada por 9F del péptido, el cual no tiene afinidad para el receptor c-Met, no redujo de manera significativa la extracción de hígado. El hígado tiene un nivel alto de expresión c-Met, y la reducción en la extracción después de la competencia con cMBP etiquetada por 19F por consiguiente, se considera que representa la evidencia del enlace c-Met específico in vivo.

El Ejemplo 9, muestra que el solubilizador de ciclodextrina no tiene efecto significativo en la distribución del Compuesto 3B in vivo. El Ejemplo 10, compara la síntesis completamente automatizada del Compuesto 3B (partiendo del compuesto 2), con la síntesis parcialmente automatizada empezando a partir del Compuesto 1. El uso del Compuesto 2 se prefiere debido a que proporciona producciones más altas, y la desprotección del Compuesto 1 tiene las desventajas de: (i) dificultad para establecer el grado de desprotección antes del radioetíquetado; (ii) el TPA utilizado para desproteger el péptido no es compatible con el plástico del aparato sintetizador automatizado.

El Ejemplo 11, proporciona la síntesis automatizada del Compuesto 3B, que incluye adicionalmente el uso automatizado de la purificación del cartucho SPE. Los resultados muestran que el Compuesto 3B puede ser obtenido en alta pureza y una producción radioquímica satisfactoria utilizando este método. El Ejemplo 12, proporciona el secado por congelación de un precursor de la presente invención. El Ejemplo 13, demuestra el efecto del pH sobre el agente de formación de imágenes de la presente invención. El Ejemplo 14, describe la formación de imágenes humanas utilizando un agente de formación de imágenes de la presente invención.

Abreviaturas Se utilizan las abreviaturas de aminoácidos de una letra única o 3 letras convencionales. % id: Porcentaje de dosis inyectada Ac: Acetilo Acm: Acetamidometilo ACN: Acetonitrilo Boc: Ter-butiloxicarbonilo DCM: Diclorometano DIPEA: N, N-diisopropieltilamina DMF: Dimetilformamida DMSO: Dimetilsulfóxido EDC: N-3-dimetilaminopropil)-N -etilcarbodiimida Fmoc: 9-Fluorenilmetoxicarbonílo HBTU: O-Benzotriazol-1 -il-?,?,?,? -tetrametiluronio hexafluorofosfato HPLC: Cromatografía líquida de alto desempeño HSPyU: 0-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametilenouronio hexafluorofosfato NHS: N-hidroxi-succinimida NMM: N-Metilmorfolina NMP: 1 -Metil-2-pirrolidinona pABA: Ácido para-aminobenzóico Pbf: 2,2,4,6,7-Pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo PBS: Solución salina regulada por fosfato p.l.: posterior a la inyección PyBOP: ter-butilo de benzotriazol- 1 -il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato tBu: Ter-butilo TFA: Ácido trif luoroacético TIS: Triisopropilsilano Trt: Tritilo Compuestos de la Invención en donde: los Compuestos 1, 2 y 3, son funcionalizados en el grupo amina epsilón de la terminal carboxi Lys del péptido 1; Boc = ter-butiloxicarbonilo Ejemplo 1: Síntesis de Péptido 1 Paso (a): Síntesis de Péptido Lineal Precursor Protegido El péptido lineal precursor tiene la estructura: Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-N H2 La resina peptidilo H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbt)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)Glu(OtBu)-Thr^e,Me epro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-polimérica se ensambló en un sintetizador de péptido Applied Biosystems 433A, utilizando química Fmoc que empieza con 0.1 mmol de resina Rink Amide Novagel resin. Un exceso de 1 mmol de aminoácidos previamente activados (utilizando HBTU) se aplicó en los pasos de acoplamiento. Se incorporó en la secuencia, pseudoprolina Glu-Thr (Novabiochem 05-20-1122). La resina fue transferida a un aparato de sifón de nitrógeno y fue tratado con una solución de anhídrido acético (1 mmol) y NMM (1 mmol) disuelto en DCM (5 mL) durante 60 minutos. La solución de anhídrido se removió mediante filtración y la resina se lavó con DCM y se secó bajo una corriente de nitrógeno.

La remoción simultánea de los grupos de protección de cadena lateral y la división del péptido a partir de la resina se llevó a cabo en TFA (10 mL) que contiene el 2.5% de TIS, 2.5% de 4-tiocresol y el 2.5% de agua durante 2 horas y 30 minutos. La resina fue removida mediante filtración, se removió el TFA al vacío y se agregó éter dietílico al residuo. El precipitado formado se lavó con éter dietílico y se secó con aire para producir 264 mg de péptido crudo.

La purificación mediante HPLC preparativo (gradiente: 20-30 % B durante 40 minutos en donde A = H2O/0.1% de TFA y B = ACN/0.1% de TFA, índice de flujo: 10 mL/min, columna: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250 x 21.20 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 30 minutos) del péptido crudo produjo 100 mg del precursor lineal de péptido 1 puro. El producto puro fue analizado mediante HPLC analítico (gradiente: 10-40% de B durante 10 minutos en donde A = H2O/0.1% de TFA y B = ACN/0.1% de TFA, índice de flujo: 0.3 mL/min, columna: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 50 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 6.54 min). La caracterización adicional del producto fue llevada a cabo utilizando espectrometría de masa por electrorocío (MH22" calculado: 1464.6, MH22+ encontrado: 1465.1).

Paso (b): Formación de Puente de Disulfuro Cvs4-16 onocíclico Cys4-16; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro- Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2.

El precursor lineal del paso (a) (100 mg) se disolvió en 5% de DMSO/agua (200 mL) y la solución se ajustó a un pH de 6 utilizando amonio. La mezcla de reacción se agitó durante 5 días. La solución fue ajustada entonces a un pH de 2 utilizando TFA y más del solvente se removió mediante evaporación al vacío. El residuo (40 mL) se inyectó en porciones sobre una columna de HPLC preparativo para la purificación del producto.

La purificación mediante HPLC preparativo (gradiente: 0% de B durante 10 minutos, entonces del 0 al 40% de B durante 40 minutos, en donde A = H2O/0.1% de TFA y B = ACN/0.1% de TFA, índice de flujo: 10 mL/min, columna: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250 x 21.20 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 44 minutos) del residuo produjo 72 mg del Compuesto 1 puro de precursor monocíclico.

El producto puro (como una mezcla de los isómeros P1 a P3) se analizó mediante HPLC analítico (gradiente: 10-40% de B durante 10 minutos en donde A = H2O/0.1% de TFA y B = ACN/0.1% de TFA, índice de flujo: 0.3 mL/min, columna: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 5.37 minutos (Pl); 5.61 minutos (P2); 6.05 minutos (P3)). La caracterización adicional del producto fue llevada a cabo utilizando espectrometría de masa por electrorocío (MH22" calculado: 1463.6, MH22" encontrado: 1464.1 (Pl); 1464.4 (P2); 1464.3 (P3)).

Paso (c): Formación de Segundo Puente de Disulfuro Cvs6-14 (Péptido 1 ) El precursor monocíclico del paso (b) (72 mg) se disolvió en 75% de AcOH/agua (72 mL) bajo una manta de nitrógeno. 1 M HCI (7.2 mL) y 0.05 M l2 en AcOH (4.8 mL) se agregaron en ese orden y la mezcla se agitó durante 45 minutos. Se agregó 1 M de ácido ascórbico (1 mL) para proporcionar una mezcla incolora. La mayoría de los solventes fueron evaporados al vacío y el residuo (18 mL) se diluyó con agua/0.1% de TFA (4 mL) y el producto fue purificado utilizando HPLC preparativo.

La purificación mediante HPLC preparativo (gradiente: 0% de B durante 10 minutos, entonces del 20 al 30% de B durante 40 minutos, en donde A = H2O/0.1% de TFA y B = ACN/0.1% de TFA, índice de flujo: 10 mL/min, columna: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250 x 21.20 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 43 a 53 minutos) del residuo produjeron 52 mg de Péptido 1 puro.

El producto puro fue analizado mediante HPLC analítico (gradiente: 10-40% de B durante 10 minutos en donde A = H2O/0.1% de TFA y B = ACN/0.1% de TFA, índice de flujo: 0.3 mL/min, columna: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50 x 2 mm, detección: UV 214 nm, tiempo de retención del producto: 6.54 min). La caracterización adicional del producto fue llevada a cabo utilizando espectrometría de masa por electrorocío (MH22" calculado: 1391.5, H22+ encontrado: 1392.5).

Ejemplo 2: Síntesis del Compuesto 1 Ácido (Boc-aminooxi)acético (Sigma-Aldrich; 138 mg, 0.72 mmol), EDC (138 mg, 0.72 mmol) y N-hidroxisuccinimida (83 mg, 0.72 mmol) se disolvieron en DMF (1 mi). La solución fue agitada durante 25 minutos, y entonces se agregó a una solución del Péptido 1 (1.0 g, 0.36 mmol) en DMF (5 mi). La mezcla de reacción se agitó durante 2 minutos. Sym.- Colidina (239 pL, 1.80 mmol) se agregaron entonces, y la mezcla de reacción se agitó durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua (5 mi) y el producto fue purificado mediante RP-HPLC preparativo.

Condiciones de HPLC: Sistema Waters Prep 4000, Solvente A = H2O/0.1% de TFA y Solvente B = ACN/0.1% de TFA; gradiente del 20 al 40% B durante 60 minutos; índice de flujo = 50 ml/min; columna: Phenomenex Luna 10 µ?t? C18 (2) 250 x 50mm; detección: uv 214 nm. Producción del Compuesto 1 purificado 690 mg (65%) Encontrado m/z: 1478.4, esperado MH22 + : 1478.1.

Ejemplo 3: Síntesis del Compuesto 3A Paso (a): Preparación de Ácido N-(4-fluorobencilideno)aminooxiacético Ácido (Boc-aminooxi)acético (96 mg, 0.50 mmol) y 4-f luorobenzaldeh ido (53 pL, 0.50 mmol) se disolvieron en ácido fórmico (0.5 mi), y la mezcla de reacción fue agitada durante 135 minutos. La mezcla de reacción se diluyó entonces con 20% de ACN/agua 0.1% de TFA (7 mi) y el producto fue purificado mediante RP-HPLC semi-preparativo.

Condiciones de HPLC: Sistema Beckman Gold; Solvente A = H2O/0.1% de TFA y Solvente B= ACN/0.1% de TFA; gradiente del 25 al 35% B durante 40 minutos; índice de flujo = 10 m1/min; columna: Phenomenex Luna 5 pm C18 (2) 250 x 21.2 mm; detección: uv 214 nm. Producción de 92 mg (93%).

Paso (b): Preparación del Compuesto 3A El ácido N-(4-fluorobencilideno)aminooxiacético [del paso (a), 43 mg, 0.22 mmol] y PyBOP (112 mg, 0.22 mmol) se disolvieron en DMF (2 mi). Una solución de DI PEA (157 µ?, 0.90 mmol) en DMP (10 ML) se agregó, y la mezcla se agitó durante 1 minuto. La solución se agregó entonces a una solución del Péptido 1 (500 mg, 0.18 mmol) en DMF (10 mi), y la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos. La mezcla de reacción se diluyó entonces con agua (20 mi) y el producto fue purificado mediante HPLC preparativo.

Las condiciones HPLC fueron como para el Ejemplo 2, excepto: Solvente A = H2O/0.1% de acetato de amonio y Solvente B = ACN. Producción de 291 mg (55%) de material puro: Encontrado m/z: 988.6, esperado MH33 + : 987.7.

Ejemplo 4: Síntesis del Compuesto 3B a partir del Compuesto 1 Paso (a): desprotección del Compuesto 1 para producir el Compuesto 2.

El Compuesto 1 (7 mg, 2.37 µ ) en un frasco de reacción de 5 mi se trató con agua (10 pL) y ácido trifluoroacético (190 pL), y posteriormente se sumergió dentro de un frasco sellado en un baño sónico durante 10 minutos. El TPA acuoso, fue entonces removido al vacío (aproximadamente 30 minutos), y el residuo fu reconstituido en regulador de citrato (pH 2.6, 1.7 mL) y cargado en un cásete de sintetizador automatizado (PastLab™, GE Healthcare Ltd) en la posición 14.

Paso (b) Síntesis v Purificación de 8F-benzaldehído [ 8F]fluoruro se produjo utilizando un ciclotrón GEMS PETtrace con un objetivo de plata mediante la reacción nuclear [18OJ(p. n)[ 8F]. Se utilizaron los volúmenes objetivo totales de 1.5 a 3 ml_. El radiofluoruro fue atrapado en el cartucho Waters QMA (acondicionado previamente con carbonato), y el fluoruro se eluyó con una solución de Kyptof 1x2.2.2· (4 mg, 10.7 µ?) y carbonato de potasio (0.56 mg, 4.1 µ?) en agua (10 µ?_) y acetonitrilo (320 µ?). El nitrógeno se utilizó para llevar la solución fuera del cartucho QMA para el recipiente de reacción. El [18F]fluoruro se secó durante 9 minutos a una temperatura de 120°C bajo un flujo constante de nitrógeno y vacío. Se agregó triflato de benzaldehído de trimetilamonio, [Haka y asociados, J. Lab. Comp. Radiopharm., 27, páginas 823 a 833 (1989)] (3.3 mg, 10.5 µ?), en dimetilsulfóxido (1.1 ml_) al [18F]fluoruro, y la mezcla se calentó a una temperatura de 105°C durante 7 minutos para producir 4-[18F]fluorobenzaldehído. La eficiencia de etiquetado fue de 69 ± 3% de descomposición corregida.

La mezcla de etiquetado crudo se diluyó entonces con una solución de hidróxido de amonio y se cargó en un cartucho MCX + SPE (acondicionado previamente con agua como parte de la secuencia PASTIab). El cartucho se lavó con agua, se secó con gas de nitrógeno antes de la elución de 4-[18F]fluorobenzaldehído de regreso al recipiente de reacción en etanol (1 mL). Aproximadamente el 13% (descomposición corregida) de [18F]fluorobenzaldeh ido permaneció atrapado en el cartucho.

Paso (c): Condensación de Aldehido con Derivado de Amino-oxi (Compuesto 2) El Compuesto 2 (5 mg, 1.8 pmol) fue transferido al recipiente de reacción PASTIab antes de la elución de 4-[ 8F]fluorobenzaldehído que es devuelta del MCX + cartucho. La mezcla se calentó entonces a una temperatura de 70°C durante 17 minutos). El HPLC analítico confirmó que el RCP del producto de compuesto 3B fue de 63 ± 9%. La mezcla de reacción cruda se diluyó con agua (10 mL) y se cargó en el HPLC preparativo. Un sistema de 10 mM de acetato de amonio vs acetonitrilo produjo la separación completa entre los 3 componentes radioactivos posibles de la mezcla de reacción cruda, particularmente, [18F]fluoruro (TR = 0.5 minutos), [18F]Compuesto 3B (TR = 6 minutos), y 4-[18F]fluorobenzaldehído (TR = 9 minutos). La recuperación de radioactividad a partir del sistema HPLC fue buena, con una eficiencia de recuperación del 97%. El producto purificado se obtuvo recolectando los aproximadamente 6 minutos de tiempo de retención.

Ejemplo 5: Separación HPLC de Péptido Cíclico c-Met Etiquetado por "F a Partir del Péptido no Etiquetado El Compuesto 3A se preparó de acuerdo con el Ejemplo 3. (i) Condiciones de HPLC analítico Columna: Protección de Puente X RP18 (4.6 x 50 mm), 2.5 Fase móvil acuosa A: 10 mM de H4Ac (regulador) pH ca. 6.8; Fase móvil orgánica B: Acetonitrilo.

Temperatura de columna Flujo: 1.2 ml/min.

Gradiente: (ii) Condiciones de HPLC preparativo Columna: Protección de Puente X RP18 (10 x 100 mm), 5 µ m , Fase móvil acuosa A: 10 mM de NH4Ac (regulador) pH ca. 6.8; Fase móvil orgánica B_ Etanol (90%) fase móvil A (10%). Temperatura de columna: 25°C Flujo: 4 m 1 /min.

Gradiente: (ii¡) Resultados de HPLC analítico y preparativo.

Ejemplo 6: Distribución de Péptido c-Met Etiquetado por 1SF (Compuesto 3B) en Ratón sin Piel Portador de Tumor Los ratones sin piel macho CD-1 (ca. 20g) fueron alojados en jaulas ventiladas individuales, con acceso libre a alimentos y agua. Las células HT-29 (ATCC, No. de cat. HTB-38) se cultivaron en medio MeCoy's 5a (Sigma # 8403) complementado con el 10% de suero bobino fetal y penicilina/estreptomicina. Las células se separaron 1:3 dos veces por semana, en cofluente del 70 al 80% utilizando el 0.25% de tripsina y se incubó en 5% de C02 a una temperatura de 37°C. Los ratones fueron inyectados s.c. bajo anestesia de gas ligero (Isoflurano) con la suspensión de células HT-29 en un sitio (nuca del cuello) con una dosis nominal de 106 células por inyección en un volumen de 100 µ? utilizando una aguja de orificio fino (25 G). Los tumores se dejaron entonces desarrollar durante 20 días, o hasta un volumen de por lo menos 200 mm3 (para la inclusión en el estudio).

Después de un tiempo de crecimiento de 20 días, los animales fueron inyectados con el Compuesto 3B (0.1 mi, 1-5 MBq/animal) en la forma de un bolo intravenoso por medio de la vena de la cola. En diversos momentos después de la inyección, se realizó la eutanasia a los animales, fueron disectados y se removieron los siguientes órganos y tejidos: La extracción del tumor fue de 2.3% id/g a los 2 minutos, teniendo un pico a los 30 minutos (3.8% ¡d/g), disminuyendo entonces con el tiempo a 1.9% de id/g a los 120 minutos pi. La retención general dentro del tumor fue del 83%. Se presentó un despeje de sangre razonablemente rápido con el tiempo (la sangre en los dos minutos iniciales fue de 9.2% id/g disminuyendo a 0.81% id/g a los 120 minutos pi). El tejido de fondo clave (por ejemplo, los pulmones e hígado) siguió el perfil de despeje de sangre con el tiempo, con la extracción a los 120 minutos p.i. del 1.1% id/g (hígado) y 1.56% id/g (pulmones).

Ejemplo 7: Estudio de Bloqueo de Receptor del Compuesto 3B en Ratón sin Piel Portador de Tumor El estudio del Ejemplo 6 se repitió con la co-inyección de exceso de 100 y 1000 dobleces del análogo no radioactivo, el Compuesto 3A (-1.5 \ig y 15 pg de exceso por animal), con animales disectados a los 120 minutos después de la inyección. Todos los animales en este estudio tenían un peso corporal similar (rango de 25 a 30 g). Los datos demostraron que una reducción estadísticamente significativa (p<0.01) en la extracción del tumor del Compuesto 3B, se logró con un exceso de 1000 dobleces de péptido no etiquetado (extracción del tumor HT-29 se desprendió de 1.9 a 1.1% id/g; una reducción del 40%).

Ejemplo 8: Formación de imágenes PET de Primate del Compuesto 3B.

La biodistribución del Compuesto 3B en tres monos cinomolgus hembra, se midió mediante PET. Dos inyecciones de rastreador se realizaron en cada ocasión: (a) rastreador solo (Compuesto 3B) 3 MBq/kg (estudio de línea de base); (b) rastreador 9 MBq/kg con la co-inyección con 0.15 mg/kg del Compuesto 3A (estudio de bloqueo) cuatro horas después de la inyección de línea de base.

El rastreador fue inyectado en la forma de una dosis de bolo en 1-3 ml_ seguido por 1 ml_ de solución salina. Las muestras de sangre (0.2 mi) para la determinación de radioactividad fueron tomadas en intervalos de 210 minutos después de la administración. En los estudios dinámicos, las regiones de interés fueron extraídas en huesos, corazón, riñon, pulmón, hígado y músculo. En los estudios de cuerpo entero, las regiones de interés fueron extraídas en huesos, cerebro, colon, corazón, riñon, pulmón, hígado, músculos, páncreas, intestino delgado, bazo y vejiga. Los datos de tiempo-actividad se generaron expresados como los valores de extracción estándar (SUV).

El enlace específico (-40%) se observó en el hígado de monos Rhesus in vitro utilizando autoradiografía de sección congelada. No se observó que el músculo de monos Rhesus tuviera sitio de enlace específico alguno. Los estudios in vivo de mono cinomolgus mostraron una extracción rápida en el hígado, la cual se redujo en un >40% después de la coinyección de 0.15 mg/kg del compuesto 3A.

Se observó el enlace no específico al músculo in vivo.

Ejemplo 9: Efecto de Ciclodextrina en la Biodistribución del Compuesto 3B La biodistribución del Compuesto 3B y el Compuesto 3B formulado con el solubilizador de hidroxipropil-3-cyc1 odextrina (HPCD) se compararon. No se descubrieron diferencias significativas.

Ejemplo 10: Síntesis Completamente Automatizada del Compuesto 3B La síntesis análoga al Ejemplo 4, se llevó a cabo utilizando el Compuesto 2, disuelto en un regulador o solución de anilina y cargado sobre el cásete PastLab para uso inmediato.

El cuadro a continuación resume la cantidad de cada uno de los constituyentes radioetiquetados principales, como fue calculado mediante la pureza radioquímica del HPLC analítico.

Ejemplo 11: Síntesis Automatizada del Compuesto 3B Utilizando Purificación SPE La síntesis del Ejemplo 4, se realizó utilizando un aparato sintetizador automatizado FastLab™ (GE Healthcare Ltd). El cásete fue configurado con reactivos, jeringas y cartuchos SPE como se muestran en la figura 1.

Los cartuchos QMA (tratamiento de agua de metilamonio cuaternario), MCX + (intercambio de catión mezclado) y C2 (hidrofobicidad baja) SPE, todos se obtuvieron de Waters.

Durante la secuencia FASTIab, los cartuchos fueron (a su vez) acondicionados con Etanol. Inmediatamente antes del uso, los cartuchos fueron cebados con dilución (0.2% de ácido fosfórico). La mezcla de reacción cruda se diluyó con 1% de ácido fosfórico y se cargó sobre el SPE. El SPE se lavó con agua antes de que el producto fuera extraído en 6 mL de agua (80% de etanol), y la pureza radio química (RCP) fue analizada mediante HPLC analítico.

Los resultados, con base en la cantidad de partida de 18F-fluoruro, fueron de la siguiente manera: Ejemplo 12: Formulación y Secado por congelación del Precursor El precursor de péptido de Compuesto 2 (2.5 o 5 mg) se mezcló con un regulador de formulación (dihidrato de fosfato de hidrógeno disódico y monohidrato de ácido cítrico, pH 2.8) y se agitó hasta que se obtuvo una suspensión homogénea. Los frascos de 13 mm de un aparato sintetizador automatizado Fastlab™ (GE Healthcare Ltd) con tapones de secado por congelación, se llenaron cada uno con 1 ml_ de suspensión. Los frascos fueron congelados entonces en la unidad de secado por congelación y se sometieron a un ciclo de secado por congelación de 4 días.

Todos los frascos con contenido de péptido produjeron pasteles liofilizados satisfactorios. El precursor liofilizado se descubrió que se disuelve mucho más rápido que el Compuesto suministrado seco 2.

Ejemplo 13: Efecto del pH en la Solubilidad El Compuesto 3B se preparó en un sintetizador FASTIab™, y eluyendo de producto (~6 mL) se colectó en un frasco que contiene 2 mL de regulador de formulación (pABA, regulador cítrico, pH 7). Se observó una solución nebulosa. La solución (8 mi) se filtró fácilmente a través de un filtro previo (Pall 25 mm, filtro con membrana Supor de 0.2 µ?? con banda de repelente hidrófobo, parte no. 6124211) para producir una solución clara.

La solución filtrada se dividió en muestras de 4 x 2 mL y el pH en las 4 muestras se ajustó con fosfato (sólido, de manera que no cambia de volumen) de la siguiente manera: Frasco 1 pH de 7.5 (solución original, sin ajustes) Frasco 2 pH de 6.1 Frasco 3 pH de 8.6 Frasco 4 pH de 9.1 Todas las muestras fueron almacenadas en la oscuridad a temperatura ambiente. Para evaluar la adición/precipitación potencial, las 4 muestras fueron seguidas por dispersión de luz estática durante 28 días. Se observó lo siguiente: - pH de 6.1 mostró un precipitado visual en el día 10; - no hubo indicación de adición en el pH de 2: Se observó 7.5 después de 28 días.

Ejemplo 14: Estudios en Humanos La formación de imágenes con el Compuesto 3B se estudió en 6 pacientes humanos, diagnosticados previamente con carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello. El agente fue bien tolerado (sin efectos secundarios) 5 de los 6 pacientes tuvieron una extracción moderada/alta del rastreador, y 1 paciente la tuvo baja (similar al lado contralateral). Esto es consistente con los reportes en la literatura del 80% de dichos pacientes de sobreexpresan el c-Met.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un agente de formación de imagen, el cual comprende un péptido cíclico de enlace c-Met rad ioetiquetado por 18F, en donde dicho péptido cíclico de enlace c-Met es un péptido cíclico de 18 a 30 mer de la Fórmula I: Z1-[cMBP]-Z2 (1) en donde: cMBP es de la Fórmula II: -(A)X-Q-(AV (II) en donde Q es la secuencia de aminoácido (SEQ-1): -Cysa-X'-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6- en donde X1 es Asn, His o Tyr; X2 es Gly, Ser, Thr o Asn; X3 es Thr o Arg; x4 es Ala, Asp, Glu, Gly o Ser; X5 es Ser o Thr; X6 es Asp o Glu; y Cysa d son cada uno residuos de cisteína, de manera que los residuos a y b, así como c y d, son ciclados para formar dos enlaces de bisulfuro separados. A y A' son independientemente cualquier aminoácido diferente de Cys, siempre que por lo menos uno de A y A' esté presente y sea Lys; x y y, son independientemente enteros de un valor de 0 a 13, y son elegidos de manera que [x + y] = 1 a 13; Z está unido al término N de cMBP, y es H o IG; Z2 está unido al término C de cMBP, y es OH, OBc o MIG; en donde Bc es un catión biocompatible; cada MIG es independientemente un grupo de inhibición del metabolismo el cual es un grupo biocompatible que inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido cMBP; en donde cMBP es etiquetado en el residuo Lys de los grupos A o A' con l8F.

2. El agente de formación de imagen tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado además porque el cMBP es de la fórmula NA: -(A)x-Q-(A')Z-Lys (HA) en donde: z es un entero de valor 0 a 12, y [x + z] = 0 hasta 12, y cMBP comprende únicamente un residuo Lys.

3. La composición de agente de formación de imagen tal y como se describe en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada además porque Q comprende la secuencia de aminoácido de ya sea la SEQ-2 o la SEQ-3: Ser-Cysa-X'-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cys-Trp-Cysb-Tyr-X -X5-X6 (SEQ-2); Ala-Gly-Ser-Cysa-X'-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd- Trp-Cysb-TyrX4-X5-X6-Gly-Thr (SEQ-3).

4. El agente de formación de imagen tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque X3 es Arg.

5. El agente de formación de imagen tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque cualquiera de los grupos -(A)x- o -(A')y- comprende un péptido enlazador, el cual es elegido de entre: -Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4), -Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5) o -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6).

6. El agente de formación de imagen tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado además porque el cMBP tiene la secuencia de aminoácido (SEQ-7): Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cys°-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

7. El agente de formación de imagen tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque Z1 y Z2 son independientemente IG.

8. El agente de formación de imágenes tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado además porque Z1 es acetilo y Z2 es una amida primaria.

9. Una composición de agente de formación de imágenes, el cual comprende: (i) el péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F tal y como se describe en cualquiera de las rei indicaciones 1 a 8; (ii) un péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado: en donde: dicho péptido cíclico de enlace c-Met tiene la misma secuencia de aminoácido en (i) y en (ii) y en donde, el péptido cMBP no etiquetado está presente en dicha composición en no más de 50 veces la cantidad molar de dicho péptido cMBP etiquetado por 18F.

10. La composición de agente de formación de imágenes tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada además porque es mantenida en o sobre un pH de 7.5 y/o comprende adicionalmente un solubilizador.

11. La composición de agente de formación de imagen tal y como se describe en la reivindicación 9 o la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende adicionalmente uno o más radioprotectores.

12. Una composición farmacéutica, la cual comprende el agente de formación de imágenes tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de agente de formación de imágenes tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, junto con un portador biocompatible, en una forma estéril adecuada para administración en un mamífero.

13. Un precursor, útil en la preparación del péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque comprende: (i) el péptido cíclico de enlace c-Met de la Fórmula 1, tal y como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde Z1 = Z2 = MIG; o (ii) un péptido cíclico de enlace c-Met funcionalizado amino-oxi:

14. Un método para la preparación del péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque comprende: (i) la provisión del precursor tal y como se describe en la reivindicación 13; (ii) cuando dicho precursor comprende un péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado de la Fórmula I, en donde Z = Z2 = MIG, la reacción, ya sea con un éster activado etiquetado por 8F o un ácido carboxílico etiquetado por 18F en la presencia de un agente de activación, para producir el péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F conjugado por medio de un enlace de amida en el residuo Lys del cMBP de dicho péptido cíclico. (¡ii) cuando dicho precursor comprende un péptido cíclico de enlace c-Met funcionalizado amino-oxi, la reacción con cualquiera de: (a) un éster activado etiquetado por 18F, o un ácido carboxílico etiquetado por 18F en la presencia de un agente de activación, para producir el péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F conjugado por medio de un enlace de amida en la posición amino-oxi de dicho péptido funcionalizado; o (b) un aldehido etiquetado por 18F para producir el péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F conjugado por medio de un enlace de éter oxima en la posición amino-oxi de dicho péptido funcionalizado.

15. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado además porque se utiliza el péptido cíclico de enlace c-Met amino-oxi funcionalizado.

16. Un método para la preparación de la composición de agente de formación de imágenes tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o la composición farmacéutica del mismo tal y como se describe en la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende: (i) preparar un péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F utilizando el método tal y como se describe en la reivindicación 14 o la reivindicación 15; (ii) separación cromatográfica del péptido cíclico de enlace c-Met no etiquetado a partir del péptido cíclico de enlace c-Met radioetiquetado por 18F.

17. El método tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizado además porque la composición farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 12 se obtiene y dicho método es llevado a cabo utilizando un aparato sintetizador automatizado.

18. Un método para la formación de imágenes del cuerpo de un mamífero in vivo para obtener imágenes de los sitios de sobreexpresión o localización c-Met, cuyoO método comprende la formación de imágenes de dicho cuerpo al cual el agente de formación de imágenes tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la composición del agente de formación de imágenes tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o la composición farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 12, se han administrado con anterioridad.

19. El método de formación de imágenes tal y como se describe en la reivindicación 18, caracterizado además porque el sitio de sobre-expresión o localización c-Met es un tumor canceroso o metástasis.