MX2013001325A

MX2013001325A - Formulacion de microparticulas para la administracion pulmonar de farmacos de moleculas anti-infecciosas para el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Info

Publication number: MX2013001325A
Application number: MX2013001325A
Authority: MX
Inventors: Sivaramakrishnan Hariharan; Geetanjali Chandrashekhar Chimote; Girish Badrinath Mahajan; Aravindan Vasudevan
Original assignee: Piramal Entpr Ltd
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2013-10-28
Also published as: ZA201301662B; IN2013MN00329A; RU2013109384A; AU2011287205A1; WO2012017405A1; CN103442694B; US20130125879A1; EP2600842A1; TW201208716A; US8697653B2; KR20130109106A; CA2807357A1; CN103442694A; BR112013002641A2; JP2013532722A

Abstract

La presente invención se relaciona con una formulación de macropartículas biodegradable, inhalable, que comprende un compuesto de la fórmula I obteniendo por la fermentación de un microorganismo de la especie Streptomyces (PM0626271/MTCC5447), como se describe en la publicación de solicitudes PCT WO2011027290, y un lípido biodegradable para la administración de fármacos, en donde la proporción del fármaco (compuesto de la fórmula I) a lípido es 1:15 a 1:25. La presente invención también se relaciona con el proceso de preparación de la formulación y con el método de tratamiento de la tuberculosis pulmonar, tuberculosis resistente a múltiples fármacos (MDRTB por sus siglas en inglés), neumonías por Staphylococus aureus resistente a la meticilina (MRSA por sus siglas en inglés), y neumonías por Staphylococus aureus sensible a la meticilina (MSSA por sus siglas en inglés) mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación a un mamífero en necesidad de la misma. La presente invención se relaciona, además, con un método para la administración de la formulación de macropartículas a un mamífero en necesidad de la misma, en donde la formulación es administrativa por inhalación o instilación intratraqueal para administración pulmonar.

Description

FORMULACION DE MICROPARTICULAS PARA LA ADMINISTRACION PULMONAR DE FÁRMACOS DE MOLÉCULAS ANTI-INFECCIOSAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una formulación biodegradable, inhalable de micropartículas que comprende un compuesto obtenido por la fermentación de un microorganismo de la especie de Streptomyces (PM0626271/MTCC5447) , como se describió en la publicación de solicitud PCT WO 2011027290, en adelante referida como el compuesto de la fórmula I, y un l pido biodegradable para la administración de fármacos en donde la proporción del fármaco (compuesto de la fórmula I) a lipido es de 1:15 a 1:25. La presente invención también se relaciona con un método para el tratamiento de tuberculosis pulmonar, tuberculosis resistente a fármacos múltiples (MDRTB por sus siglas en inglés), neumonías por Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA por sus siglas en inglés) y neumonías por Staphylococcus aureus sensibles a la meticilina (MSSA por sus siglas en inglés) mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación a un mamífero en necesidad de la misma. La presente invención también se relaciona con el uso de la formulación de microparticulas para el tratamiento de tuberculosis pulmonar, MDRTB, neumonías MRSA y neumonías MSSA.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tuberculosis puede afectar a cualquier órgano del cuerpo y se manifiesta en diversas formas diferentes, pero el sitio de infección principal es el pulmón. La tuberculosis que afecta los pulmones es conocido como tuberculosis pulmonar. La tuberculosis pulmonar es la forma de ocurrencia más predominante de la tuberculosis (Tuberculosis, 2005, 85, 227-234) . El régimen quimioterapéutico actual para el tratamiento de la tuberculosis pulmonar consiste de la co-administración de fármacos antituberculares de primera línea (iosinazida, rifampicina, etambutol, y/o pirizinamida) durante un periodo de cuatro meses seguido por dos meses de tratamiento con iosinazida, rifampicina y/o etambutol, pero dependiendo del tipo de tuberculosis, el tratamiento puede ser aún más extendido hasta un periodo que va de 9 meses a 2 años. Este régimen quimioterapéutico actual se da en la forma de dosificación oral una vez al día, lo cual está asociado con media vida plasmática baja (International Journal of Pharmaceutics , 2004, 276, 41-49) y una plétora de efectos adversos relacionados con la dosis {Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2004 54, 761-766) . Estos efectos adversos se atribuyen a un perfil de biodistribución indeseado. Más aún, con respecto a los fármacos oralmente administrados, se ha observado que sólo una pequeña fracción del fármaco alcanza el sitio de acción, ej . , los pulmones, y se limpia en horas (Tuberculosis , 2005, 85, 227-234) . Los problemas anteriores están asociados con mal cumplimiento por parte del paciente, y resultan en el desarrollo de tuberculosis resistente a múltiples fármacos (MDRTB por sus siglas en inglés) .

La MDRTB es una forma de tuberculosis que es resistente a al menos dos de los mejores fármacos antituberculares , iosinazida y rifampicina {Multidrug resistant tuberculosis fact sheet, Center for Disease Control, 2008) . La MDRTB es tratada con fármacos antituberculares de segunda línea como fluoroquinolonas , aminoglicosidas como amikacina, kanamicina, capreomicina, ácido para-aminosalicílico y tioacetazona (Treatment of drug resistant tuberculosis, fact sheet, Center for Disease Control, 2007) . Los fármacos de tuberculosis de segunda línea están asociados con efectos adversos relacionados con la dosis, baja biodisponibilidad en los pulmones, lo que es perjudicial para la erradicación de la enfermedad.

Análogo al problema de la tuberculosis pulmonar, los problemas de la baja biodisponibilidad de los fármacos y los efectos adversos inducidos por dosis más altas, también se encuentran en el tratamiento de las neumonías MRSA y MSSA. Las neumonías nosocomiales y las neumonías asociadas con ventiladores que resultan de la MRSA, están asociadas con altas tasas de mortalidad (International Journal of Antimicrobial Agents, 2007, 30, 19-24), la razón para lo anterior siendo el tratamiento inadecuado.

Los fármacos de primera línea que se usan para tratar la neumonía MRSA incluyen vancomicina y linezolid. La vancomicina, el fármaco de elección para el tratamiento de la neumonía MRSA, está asociada con un perfil farmacocinético insatisfactorio en el tejido pulmonar y tiene concentraciones pulmonares, que son sólo el 20% de las concentraciones plasmáticas (Antimicrob. Agentes Chemother., 1999, 37, 281-286). Más aún, la administración a largo plazo de la vancomicina está asociada con la nefrotoxicidad, que es un factor limitante de la dosis (Clin. Microbiol Infect., 2006, 12, 92-95). El linezolid, que es aceptado para terapia en la neumonía MRSA, muestra buena biodisponibilidad oral (administrada como 600 mg oral dos veces al día) pero está asociada con efectos gastrointestinales adversos, trombocitopenia y anemia reversible (Clinical Infect. Dis . , 2003, 37, 1609-1616). En raras ocasiones, la administración de linezolid también está asociada con neuropatía óptica y periférica (J". Antimicrob. Chemother., 2004, 53, 1114-1115).

Los agentes beta lactámicos (tales como ampicilina y cefolosporinas ) son muy efectivos contra la neumonía MSSA como la primera línea de la terapia. Aunque la vancomicina es considerada como la siguiente línea de la terapia, no es tan efectiva como los agentes beta lactámicos en infecciones provocadas por MSSA. También, la vancomicina es excretada en la orina por filtración glomerular y no es metabolizada . La penetración en el tejido pulmonar de la vancomicina también es relativamente baja (US Respiratory Disease, 2006, 62-64). En resumen, la terapia para la neumonía MRSA/MSSA tiene diversas desventajas tales como la baja biodisponibilidad pulmonar de los fármacos, la toxicidad inducida por la dosificación del fármaco, etc.

Para sobrepasar los problemas asociados con el régimen de tratamiento estándar actual y el no cumplimiento del paciente, es esencial el desarrollo de un sistema de administración de fármacos que alcance directamente el sitio de acción, tenga el potencial para enfocar los macrófagos pulmonares en los que residen las microbacterias y reduzca la toxicidad sistémica asociada con el fármaco.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una formulación biodegradable,. inhalable de micropartículas que comprende el compuesto de la fórmula I (como se describe aquí) obtenido por la fermentación de un microorganismo de la especie Strepto/nyces (PM0626271/MTCC5447 ) , y un lípido biodegradable para la administración de fármacos en donde la proporción del fármaco (compuesto de la fórmula I) a lípido, es de 1:15 a 1:25.

La presente invención también se relaciona con el proceso de preparación de la formulación de micropartículas .

La presente invención se relaciona, además, con el método de tratamiento de la tuberculosis pulmonar, neumonías MDRTB, MRSA y neumonías MSSA al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación de micropartículas a un mamífero en necesidad de la misma.

La presente invención también se relaciona con un método para la administración de la formulación de micropartículas a un mamífero en necesidad del mismo, en donde la formulación es administrada por inhalación o instilación intratraqueal para adminis ración pulmonar.

La presente invención se relaciona, además, con el uso de la formulación de micropartículas que comprende el compuesto de la fórmula I y un lipido biodegradable para la administración del fármaco, en donde la proporción del fármaco (compuesto de la fórmula I) a lipido es de 1:15 a 1:25 para el tratamiento de la tuberculosis pulmonar, neumonías MDRTB, MRSA y neumonías MSSA.

La presente invención se relaciona, además, con el. uso de la formulación de micropartículas que comprende el compuesto de la fórmula I y un lipido biodegradable para la administración del fármaco, en donde la proporción del fármaco (compuesto de la fórmula I) a lipido es 1:15 a 1:25 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la tuberculosis pulmonar, neumonías MDRTB, MRSA y neumonías MSSA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la presente invención a detalle, se debe entender que esta invención no está limitada a modalidades particulares. También debe entenderse que la terminología aquí usada es para fines de descripción de modalidades particulares únicamente, y no pretende ser limitativa.

Como se usa en la descripción y reivindicaciones, las formas singulares "un" , "una", "uno", "el" y "la", incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí usados, tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por una persona de conocimientos ordinarios en la materia a la que pertenece la invención.

Definiciones Eficiencia de Encapsulación: La eficiencia de encapsulación es la fracción del fármaco asociada y encapsulada físicamente en la formulación de micropartículas relativa a la cantidad total inicial de fármaco en la solución.

Fármaco: Un fármaco se define como cualquier sustancia pretendida para su uso en el diagnóstico, la cura, el alivio, el tratamiento o la prevención de enfermedad o que pretenda afectar la estructura o función del cuerpo. Como se usa aquí, el compuesto de la fórmula I es un fármaco.

Balance de masa: Un balance de masa (también llamado un balance de materia) es una aplicación de conservación de masa al análisis de sistemas físicos. Al contar el material que entra y sale de un sistema, se pueden identificar los flujos de masa que puedan haber sido desconocidos, o difíciles de medir sin esta técnica.

Osmolalidad: La osmolalidad es una medida de concentración de solutos, definida como el número de osmoles (mOsm) de solutos por kilogramo de solvente (mosmol/kg o mOsm/kg) .

Transición de Fase: Una transición de fase es la transformación de un sistema termodinámico de una fase o estado de materia a otra. Una fase de un sistema termodinámico y los estados de la materia tiene propiedades físicas esencialmente uniformes. Durante una fase de transición de un medio dado, ciertas propiedades del cambio medio, frecuentemente discontinuamente, como un resultado de alguna condición externa, tal como temperatura, presión y otros . La medición de las condiciones externas en las que la transformación sucede, se denomina como el punto de transición de fase.

Aerosolización: La aerosolización es la producción de un aerosol - un vapor o rocío fino que contiene partículas minutas .

Nebulización: La nebulización involucra el proceso de transformación de medicaciones líquidas en vapores inhalados de rápida acción. La nebulización se usa para tratar condiciones respiratorias, tales como asma o fibrosis quística. Los nebulizadores administran efectivamente la medicina directamente al tracto respiratorio de un individuo para que pueda llegar a los pulmones rápidamente. Un ejemplo no limitativo de un nebulizador es una máquina equipada con un compresor y una boquilla o mascarilla.

Tamaño de Partícula: El tamaño de partícula es una noción introducida para la comparación de dimensiones de partículas sólidas, partículas líquidas (gotas) . Para las gotas y los aerosoles, se usan términos tales como "diámetro aerodinámico" y "diámetro aerodinámico de masa media (MMAD por sus siglas en inglés)". Las definiciones se proporcionan enseguida.

Diámetro aerodinámico: El diámetro de una esfera de densidad de unidad que tiene la misma velocidad de establecimiento terminal que la partícula en cuestión. Se usa para predecir en qué parte del tracto respiratorio se depositarán dichas partículas.

Diámetro Aerodinámico de Masa Media: El diámetro aerodinámico Geométrico Medio. El cincuenta por ciento de las partículas por peso serán más pequeñas que el MMAD, el 50% será más grande.

Durante el experimento del tamaño de las partículas, las suspensiones contienen un número innumerable de partículas de varios tamaños en movimiento. Cuando la máquina de tamaño de partículas analiza estas partículas, forma una curva de distribución de partículas, que cubre todo el rango de tamaño de partículas empezando desde la partícula más pequeña, , que podría ser de 1 nm, a la más grande, que podría ser de 100 micrones. En la curva de la granulometría, se calcula una frecuencia acumulativa para las partículas. Dio se refiere a ese diámetro de partícula en particular en donde el 10% de las partículas tienen un diámetro más pequeño o igual al del diámetro de partícula en particular.

D50: Similar al Dio, D50 es el diámetro de corte para el 50% de la población de partículas en la formulación, y se refiere a ese diámetro de partículas en particular en donde el 50% de las partículas en la suspensión tienen un diámetro más pequeño o igual al del diámetro de partículas en particular.

D90: D9o es el diámetro de corte para el 90% de la población de partículas en la formulación, y se refiere a ese diámetro de partículas en particular en donde el 90% de las partículas en la suspensión tienen un diámetro más pequeño o igual al del diámetro de partículas en particular.

Retención de Fármaco Encapsulado en la Nebulización: Durante el proceso de nebulización, debido a la fuerza inducida por el nebulizador, algunos liposomas se rompen y el fármaco se filtra de la formulación y es retenido en la taza de nebulización misma. El fármaco que no se filtra de la formulación durante el proceso de nebulización, es la cantidad real de fármaco retenida en la formulación durante la nebulización, y es designada como "retención de fármaco encapsulado" . El fármaco que se pierde/filtra durante el proceso de nebulización es recuperado de la taza de nebulización. La taza de nebulización es lavada con un solvente adecuado (en este caso metanol) y el fármaco retenido en la taza es cuantificado por HPLC o LC-MS .

Fase Cristalina Líquida: Es una fase diferente de la materia observada entre los estados cristalino (sólido) e isotrópico (líquido) .

Fase de Gel Propagado: Es un estado metaestable entre la fase cristalina líquida y la fase de gel.

Instilación intratraqueal : Es un método de administración de fármacos en donde el fármaco es administrado a través de un tubo endotraqueal o por inyección percutánea en la tráquea para la administración de fármacos en los pulmones .

Soporte Ventilatorio: En la medicina, la ventilación mecánica es un método para ayudar o reemplazar mecánicamente la respiración espontánea. Esto se logra fijando un tubo endotraqueal del paciente afectado con la enfermedad al ventilador que está diseñado para los fines anteriormente mencionados. Los ventiladores trabajan alterando la presión de las vías respiratorias del paciente a través de un tubo endotraqueal o de traqueotomía . Los pacientes con neumonía fulminante, incluyendo neumonía MRSA, son sujetos a traqueotomía para que la oxigenación de su tejido se mantenga.

Lípido Biodegradable : El lípido biodegradable se refiere a un lípido que es susceptible a degradación química in vivo (en el cuerpo humano) ya sea por acción enzimática o por proceso biológico de ocurrencia innata en los que la molécula del lípido se rompe a sus componentes constitutivos básicos.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de fármaco suficiente para tratar y eliminar el organismo infeccioso de interés en las condiciones in vivo. La cantidad terapéutica del compuesto de la fórmula I presente en las formulación de micropartículas está en el rango de 1% a 5% (p/p) .

Método de tratamiento no invasivo: El método de tratamiento no invasivo se refiere a métodos como la nebulización o la instilación intratraqueal en los individuos con pre-traqueotomía . El procedimiento es sin dolor y no requiere de intervenciones médicas adicionales que incluyan la administración de agentes anestésicos para aliviar el dolor o sus componentes asociados.

La presente invención se relaciona con una formulación de micropartículas que comprende el compuesto de la fórmula I, y un lípido biodegradable para la administración del fármaco, en donde la proporción del fármaco (compuesto de la fórmula I) a lípido es de 1:15 a 1:25 y la formulación de micropartículas es una formulación biodegradable e inhalable.

De acuerdo con un aspecto de la invención, el compuesto de la fórmula I constituye del 1% al 5% (p/p) de la formulación.

El compuesto de la fórmula I está representado estructuralmente por la siguiente fórmula: Fórmula I El microorganismo, que puede ser utilizado para la producción del compuesto de la fórmula I es una cepa de especies de Streptomyces (PM0626271/MTCC 5447), en adelante denominada como el cultivo No. PM0626271, aislada de una muestra de tierra recolectada de Oasis Schirmacher en la región antártica. El cultivo no. PM0626271 se ha depositado en la Microbial Type Culture Collection (MTCC) , Institute of Microbial Technology, Sector 39-A, Chandigarh -160 036, India, una Autoridad Depositaría Internacional (IDA por sus siglas en inglés) reconocida por la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) con número de acceso MTCC 5447.

El compuesto puede ser producido a partir del cultivo no. PM0626271, sus mutantes y variantes, comprendiendo las etapas de: crecimiento del cultivo no. PM0626271 en condiciones aeróbicas sumergidas en un medio nutriente que contiene una o más fuentes de carbono y una o más de nitrógeno y opcionalmente sales inorgánicas nutrientes y/u oligoelementos ; aislar el compuesto de la fórmula I del caldo de cultivo; y purificar el compuesto de la fórmula I, usando procedimientos de purificación utilizados generalmente en la materia.

Además del microorganismo específico que se describe en el presente documento, se debe entender que los mutantes del microorganismo, tales como los producidos por el uso de mutágenos químicos o físicos, incluyendo rayos X, rayos UV, etc., y organismos cuya composición genética ha sido modificada por técnicas de biología molecular, también pueden ser cultivados para producir el compuesto.

El medio y/o medio de nutriente utilizado para el aislamiento y crecimiento del cultivo no. PM0626271, que produce el compuesto de la fórmula I, preferiblemente contiene fuentes de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas nutrientes. Las fuentes de carbono son, por ejemplo, una o más de almidón, glucosa, sacarosa, dextrina, fructosa, melaza, glicerol, lactosa, o galactosa. Las fuentes de carbono preferidas son almidón soluble y glucosa. Las fuentes de nitrógeno son, por ejemplo, una o más de harina de soya, harina de cacahuate, extracto de levadura, extracto de carne, peptona, extracto de malta, licor de maíz escarpado, gelatina o casaminoácidos . Las fuentes de nitrógeno preferidas son peptona y extracto de levadura. Las sales inorgánicas nutrientes son, por ejemplo, una o más de cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro férrico, cloruro de estroncio, cloruro de cobalto, bromuro de potasio, fluoruro de sodio, fosfato de hidrógeno de sodio, fosfato de hidrógeno de potasio, fosfato de hidrógeno dipotásico, fosfato de magnesio, carbonato de calcio, bicarbonato de sodio, silicato de sodio, nitrato de amonio, nitrato de potasio, sulfato ferroso, sulfato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de magnesio, citrato férrico, ácido bórico o solución de sal de rastreo tal como sulfato de cobre, cloruro de manganeso o sulfato de zinc. El carbonato de calcio, cloruro de sodio, y cloruro de magnesio son las sales inorgánicas nutrientes preferidas.

El mantenimiento del cultivo No. P 0626271 se puede llevar a cabo a una temperatura que varía de 22 °C a 36°C y un pH de aproximadamente 7.5 a 8.0. Por lo general, el cultivo No. PM0626271 se mantiene a 25°C a 27°C y a un pH de aproximadamente 7.4 a 7.8. Los cultivos bien desarrollados se pueden conservar en el refrigerador a 4°C a 8°C.

La producción de cultivo de semillas del cultivo No. PM0626271 se puede llevar a cabo a una temperatura que varía de 25°C a 36°C y a un pH de aproximadamente 7.5 a 8.0 durante 66 horas a 75 horas a 200 rpm (revoluciones por minuto) a 280 rpm. Por lo general, la semilla del cultivo No. PM0626271 se cultiva a 29°C a 31°C y a un pH de aproximadamente 7.4 a 7.8, durante 72 horas a 230 rpm a 250 rpm.

La producción del compuesto de la fórmula I puede llevarse a cabo mediante el cultivo del cultivo No. PM0626271 por fermentación a una temperatura que varía de 26°C a 36°C y a un pH de aproximadamente 6.5 a 8.5, durante 24 horas a 96 horas a 60 rpm a 140 rpm y 100 lpm (litros por minuto) para una aireación de 200lpm. Por lo general, el cultivo no. PM0626271 se cultiva a 30°C a 32°C y a pH de 7.4 a 7.8 durante 40 horas a 96 horas a 90 rpm y a aireación de 110 lpm.

El progreso de la fermentación y la producción del compuesto se puede detectar por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC por sus siglas en inglés) y midiendo la bioactividad del caldo de cultivo contra estafilococos y/o especies de enterococos por el método de ensayo conocido de placa de difusión de agar microbiano. El cultivo preferido es el Staphylococcus aureus E710, que es una cepa resistente a la meticilina, un antibiótico ß-lactámico reportado en la literatura, y Enterococcus faecium R2 (VRE) , que es resistente a la vancomicina. En el caldo de cultivo resultante, el compuesto puede estar presente en el filtrado del cultivo, así como en la masa de células y se puede aislar usando técnicas conocidas de separación tales como la extracción con solvente y cromatografía de columna. El compuesto de la fórmula I se puede recuperar del filtrado del cultivo por extracción a un pH de aproximadamente 5 a 9 con un solvente inmiscible en agua tal como éter de petróleo, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo, éter dietílico o butanol, o por cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando resinas poliméricas tales como "Diaion HP-20®" {Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japón) , "Amberlite XAD®" (Rohm and Haas Industries, E.U.A.), carbón activado, o por cromatografía de intercambio iónico a pH de 5 a 9. El material activo se puede recuperar de la masa celular por extracción con un solvente miscible en agua tal como metanol , acetona, acetonitrilo, n-propanol, o iso-propanol o con un solvente inmiscible en agua tal como éter de petróleo, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo o butanol . Otra opción es la de extraer todo el caldo con un solvente seleccionado de éter de petróleo, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo, metanol, acetona, acetonitrilo, n-propanol, iso-propanol, o butanol. Típicamente, el material activo se extrae del caldo completo con acetato de etilo. La concentración y liofilización de los extractos da el material activo bruto.

El compuesto de la fórmula I puede recuperarse a partir del material crudo por fraccionamiento utilizando cualquiera de las siguientes técnicas : cromatografía en fase normal (usando alúmina o gel de sílice como fase estacionaria; y eluyentes tales como éter de petróleo, acetato de etilo, diclorometano, acetona, cloroformo, metanol o sus combinaciones) , cromatografía de fase inversa (usando gel de sílice de fase inversa como gel de sílice de dimetiloctadecilsilo (RP-18) o gel de sílice dimetiloctilsililo (RP-8) como fase estacionaria y eluyentes tales como agua, tampones [por ejemplo, fosfato, acetato, citrato (pH 2 a 8)], y solventes orgánicos (por ejemplo, metanol, acetonitrilo, acetona, tetrahidrofurano , o combinaciones de estos solventes) , cromatografía de permeación en gel (usando resinas tales como Sephadex LH-20® {Pharmacia Chemical Industries , Suecia) , TSKgel® Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japón) en solventes tales como metanol, cloroformo, acetona, acetato de etilo, o sus combinaciones, o Sephadex® G-10 y G-25 en agua) , o por cromatografía en contracorriente (usando un sistema eluyente bifásico constituido por dos o más solventes tales como agua, metanol, etanol, iso-propanol , n-propanol, tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, acetato de etilo, éter de petróleo, benceno y tolueno) . Estas técnicas se pueden utilizar repetidamente, solos o en combinación. Un método típico es la cromatografía sobre fase normal usando gel de sílice .

El compuesto de la fórmula I y sus isómeros, se puede convertir en sus sales farmacéuticamente aceptables y derivados, como esteres y éteres, los cuales están contemplados por la presente invención.

El lípido biodegradable usado en la formulación es dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) , que es un fosfolípido natural del sistema surfactante pulmonar endógeno. Otros ejemplos no limitantes de lípidos biodegradables que pueden ser utilizados en combinación con DPPC incluyen DPPG (dipalmitoil fosfatidil glicerol), DPPE (dipalmitoilfosfatidiletanolamina) , colesterol, fosfatidil inositol, serina y fosfotidilo.

En otro aspecto de la invención, el tamaño de las micropartículas de la formulación oscila entre 0.5 micrones y 10 micrones .

En aún otro aspecto de la invención, el 90% de las micropartículas de la formulación son de tamaño inferior a 10 micrones.

En aún otro aspecto de la invención, la formulación es una dispersión liposomal acuosa.

En un aspecto de la invención, el pH de la formulación es de 6 a 7.

En otro aspecto, la osmolalidad de la formulación es de 300 mOsmol/kg a 400 mOsmol/kg. En aún otro aspecto de la invención, la temperatura de transición de fase de la formulación es de 41°C a 43 °C. En otro aspecto de la invención, la formulación puede ser rociada a un diámetro aerodinámico de masa media de 1 um a 10 um mediante el uso de un nebulizador.

Los tipos de nebulizadores que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, nebulizadores de chorro, nebulizadores de ondas ultrasónicas y nebulizadores de malla vibratoria.

La presente invención también se refiere al procedimiento para la preparación de la formulación de micropartículas .

En un aspecto de la invención, el proceso para la preparación de la formulación implica el uso de "método de evaporación de solvente", que incluye los siguientes pasos: (a) disolver el compuesto de la fórmula I y DPPC (proporción 1:15 a 1:25) en 3 mL a 15 mL de cloroformo para obtener una solución; (b) añadir 20 mL a 45 mL de metanol a la solución del paso (a) y mezclar bien hasta obtener una solución homogénea; (c) añadir 20 mL a 50 mL de fluido pulmonar simulado (SLF) a la solución del paso (b) ; (d) evaporar los solventes; (e) crear el volumen obtenido en el paso (d) a 30 mL con SLF y centrifugación a 15000 g a 35000 G, a 4°C durante diez minutos para obtener un comprimido; (f) volver a suspender el comprimido obtenido en el paso (e) en SLF para obtener una suspensión de concentración de 0.5 mg/ml a 10 mg/ml; (g) filtrar la suspensión obtenida en el paso (f) a través de un filtro de policarbonato de 0.5 um - 5um para obtener el tamaño de partícula uniforme de las micropartículas formadas .

El "método de evaporación de solvente" que se usa aquí es una modificación del método descrito en la patente Estadounidense 4,877,561.

En una modalidad de la invención, en el paso (a) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas , el compuesto de la fórmula I, y DPPC se disolvieron en una proporción de 1:20.

En otra modalidad de la invención, en el paso (a) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, el compuesto de la fórmula I, y DPPC se disolvieron en 5 a 10 mi de cloroformo para obtener una solución.

En una modalidad de la invención, en el paso (b) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, se añaden de 30 a 40 mL de metanol.

En otra modalidad de la invención, en el paso (c) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, 25 a 35 mL de SLF se añaden. En otra modalidad de la invención, en el paso (e) del procedimiento para la preparación de la formulación de micropartículas, se realiza la centrifugación a 20,000 a 30,000 G.

En otra modalidad de la invención, en el paso (f) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, el comprimido se resuspende en SLF para obtener una suspensión de la concentración de 1 a 5 mg/ml.

En otra modalidad de la invención, en la etapa (g) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, la suspensión obtenida en el paso (f) se filtra a través de un filtro de policarbonato de 2 um a 5 µ??.

En otro aspecto de la invención, el proceso para la preparación de la formulación es un "Método de Auto Ensamblaje de Lípido Libre de Solvente", que incluye los siguientes pasos: (i) añadir 20 mi a 45 mi de SLF a una mezcla del compuesto de la fórmula I y DPPC (proporción de 1:15 a 1:25) ; (ii) someter la mezcla del paso (i) a rotación de 100 rpm a 200 rpm a 42°C a 45°C durante una hora para obtener una suspensión; (iii) centrifugar la suspensión obtenida en el paso (ii) a 15000 G - 35000 G a 4°C durante diez minutos para obtener un comprimido; (iv) resuspender el comprimido obtenido en el paso (iii) en SLF para obtener una suspensión de concentración de 0.5 mg/ml a 10 mg/ml; y (v) filtrar la suspensión obtenida en el paso (iv) a través de filtro de policarbonato de 0.5 - 5 para obtener un tamaño de partícula uniforme de las micropartículas formadas.

En una modalidad de la invención, en el paso (i) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas , 30 mi a 40 mi de SLF se añaden a una mezcla del compuesto de la fórmula I y DPPC.

En otra modalidad de la invención, en el paso (i) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, el compuesto de la fórmula I y DPPC se disuelven en proporción de 1:20.

En una modalidad de la invención, en el paso (iii) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, la suspensión obtenida en el paso (ii) es centrifugada a 20,000 G a 35,000 G a 4°C durante diez minutos para obtener un comprimido .

En otra modalidad de la invención, en el paso (iv) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, el comprimido obtenido en el paso (iii) es resuspendido en SLF para obtener una suspensión de concentración de 1 mg/ml a 5 mg/ml .

En otra modalidad de la invención, en el paso (v) del proceso para la preparación de la formulación de micropartículas, la suspensión obtenida en el paso (iv) es filtrada mediante filtro de policarbonato de 2 um a 5 um.

La presente invención se refiere además a la utilización de la formulación en un método de tratamiento de la tuberculosis pulmonar, neumonías MDRTB, MRSA y neumonías MSSA por la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la formulación a un mamífero en necesidad de la misma.

La presente invención se refiere, además, al uso del compuesto de la formulación de micropartículas que comprende la fórmula I y un lípido biodegradable para la administración de fármacos en el que la proporción de fármaco a lípido (compuesto de la fórmula I) es de 1:15 a 1:25 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la tuberculosis pulmonar, neumonías MDRTB, MRSA y neumonías MSSA.

En un aspecto de la invención, el método de tratamiento está dirigido a los macrófagos alveolares, que pueden albergar las microbacterias resistentes a la meticilina, así como el Staphylococcus aureus sensible a meticilina .

La presente invención se refiere también a un método de administración de la formulación de micropartículas a un mamífero en necesidad de la misma, en el que la formulación se administra por inhalación o instilación intratraqueal para la administración pulmonar.

En un aspecto de la invención, el método de administración de la formulación de micropartículas es por inhalación .

En otro aspecto de la invención, el método de inhalación es nebulización en la que el compuesto de la fórmula I está encapsulado en las micropartículas.

Con respecto a la formulación de micropartículas de la presente invención, se ha observado que cuando se administra por inhalación, una concentración significativa del compuesto de la fórmula I contenida en la formulación se detecta en los pulmones de los ratones. Sin embargo, ninguna concentración significativa del compuesto de la fórmula i se detectó en los pulmones de los ratones que recibieron el compuesto no formulado de la fórmula I. Esto es indicativo del aumento de la biodisponibilidad del compuesto de la fórmula I en la formulación de micropartículas. Además, se ha observado que el fármaco (compuesto de la fórmula I) es retenido en los pulmones durante un período de 24 horas cuando la formulación de micropartículas de la presente invención se administra por inhalación.

En otro aspecto de la invención, la retención del compuesto encapsulado de la fórmula I es mayor a 30%. En particular, la retención del compuesto encapsulado de la fórmula I puede variar de 30% a 70%.

La dosificación del compuesto de la fórmula I para inhalación varía entre 0.05 y 10 mg/kg peso corporal /día.

En otro aspecto de la invención, el método de administración de la formulación de micropartículas es la instilación intratraqueal en un paciente en sistema de soporte ventilatorio .

En otro aspecto de la invención, la administración por nebulización ayuda a reducir la cantidad de compuesto de la fórmula I requerida para el tratamiento de la tuberculosis pulmonar, neumonías MDRTB, MRSA y neumonías MSSA.

En aún otro aspecto de la invención, el método ayuda al compuesto de la fórmula I a alcanzar los pulmones .

La eficacia de la formulación de micropartículas se ha establecido mediante ensayos biológicos que se describen a detalle en los ejemplos subsecuentes. Estos ejemplos se proporcionan en el presente documento para fines ilustrativos únicamente y no están destinados a limitar el alcance de la invención.

EJEMPLOS Los siguientes términos/abreviaturas/fórmulas químicas se usan en los Ejemplos: NaCl : Cloruro de Sodio CaCl2 : Cloruro de Calcio NaOH : Hidróxido de Sodio SLF : Fluido Pulmonar Simulado HPLC : Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento DPPC : 1 , 2-dipalmitol-sn-glicero-3-fosfocolina DMSO : Sulfóxido de Dimetilo Matraz RB : Matraz de fondo redondo rpm : Rotaciones por Minuto DSC : Calorímetro de Barrido Diferencial TSI : Impactor de Doble Etapa MSSA : S. aureus Sensible a la Meticilina MRSA : S. aureus Resistente a la Meticilina VRE : Enterococci Resistente a la Meticilina TSA : Agar de Soya Triptosa CFU : Unidades Formadoras de Colonias HBSS : Solución de Sal Tamponada de Hanks MTS : (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-ilo) -5- (3- carboximetoxifenilo) -2- (4-sulfofenilo) -2H- tetrazolio GC-HS : Cromatografía de Gas con Fijación de Espacio de Cabezal CPCSEA : Comité para Fines de Control y Supervisión de Experimentos en Animales IAEC : Comité Institucional de Ética Animal API : Ingrediente Farmacéutico Activo Ejemplo 1 Aislamiento del Cultivo No. PM0626271 de tierra recolectada de la región Antártica. a) Composición del medio de aislamiento: Agar de agua de mar artificial modificado: Peptona 1 .5 g, extracto de levadura 0.5 g, cloruro férrico 0.007 g, 1.0 1 de agua (750 mL de agua de mar artificial + 250 mL de agua desmineralizada), agar en polvo 15.0 g, pH final (a 25 ° C) 7.4 a 7.8.

Composición del agua de mar artificial: Cloruro de sodio 24.6 g, cloruro de potasio 0.67 g, cloruro de calcio.2H20 1 0,36 g, sulfato de magnesio .7H20 6.29 g, cloruro de magnesio .6H20 4.66 g, bicarbonato sódico 0.18 g, agua desmineralizada 1.0 1, pH final (a 25 s C) 7.8 a 8.2. b) Procedimiento: De la región del Oasis Schirmacher en el área de la Antártida, se recolectó tierra a nivel de superficie y se almacenó a -20°C durante todo el viaje a Piramal Life Sciences Limited, Goregaon, Mumbai, India. La muestra se almacenó a -20°C a -22°C y después se descongeló a temperatura ambiente (25±2°C) para el aislamiento de los microbios. La muestra de tierra (~1 g) se suspendió en 25 mi de agua estéril de peptona al 1% en un matraz de 100 mi esterilizado. El matraz se agitó con vórtice durante 30 segundos. Las diluciones en serie de hasta 10"5 se prepararon en agua estéril de peptona al 1%. 100 µ? de dilución de 10~5 fueron extendidos sobre la superficie de agar de agua de mar artificial modificada. La placa se incubó a temperatura ambiente (25±2°C) hasta que se observaron colonias . Después de la incubación durante un mes y medio, la colonia que apareció en este medio se sembró en placas de petri que contenían agar de aislamiento de actinomicetos [Hi Media] preparado en 75% de agua de mar artificial [Accumix (AS-AIA) . El aislado se purificó y se le proporcionó el número ID de cultivo PM0626271. El cultivo no. PM0626271 fue aislado, por lo tanto, de entre los microorganismos en crecimiento como un sólo aislado.

Ejemplo 2 i Purificación del Cultivo No. PM0626271 a) Composición del medio de purificación (Agar de Aislamiento de Actinomicete, agarificado por 1.5% de agar agar) : Glicerol 5.0 mi, caseinato de sodio 2.0 g, L-asparagina 0.1 g, propionato de sodio 4.0 g, fosfato dipotásico 0.5 g, sulfato de magnesio 0.1 g, sulfato ferroso 0.001 g, 1.0 1 de agua (750 mi de agua marina artificial + 250 mi de agua desmineralizada) , polvo de agar 15.0 g, pH final (a 25°C) 7.4 a 7.8.

Composición del agua de mar artificial: Cloruro de sodio 24.6 g, cloruro de potasio 0.67 g, cloruro de calcio.2H20, 1.36 g, sulfato de magnesio .7H20 6.29 g, cloruro de magnesio .6H20 4.66 g, bicarbonato sódico 0.18 g, agua desmineralizada 1.0 1, pH final (a 25°C) 7.8 a 8.2. b) Procedimiento: El cultivo no. PM0626271 se sembró en placa de petri de agar de aislamiento de actinomiceto (que contiene un 75% de sales de agua de mar artificial) . La placa de petri se incubó durante 10 días a 25°C. Una de las colonias aisladas de la placa de petri se transfirió a tubos inclinados de agar de aislamiento de actinomiceto preparados 75% de agua de mar artificial. Los cultivos inclinados se incubaron durante 10 días a 25°C.

Ejemplo 3 Mantenimiento de cepa productora - cultivo No.

PM0626271 a) Composición del medio (Agar de Aislamiento de Actinomicete) : Glicerol 5.0 mi, caseinato de sodio 2.0 g, L-asparagina 0.1 g, propionato de sodio 4.0 g, fosfato dipotásico 0.5 g, sulfato de magnesio 0.1 g, sulfato ferroso 0.001 g, 1.0 L de agua (750 mi de Agua de Mar Artificial + 250 mL de agua desmineralizada) , polvo de agar 15.0 g, pH final (a 25°C) 7.4 a 7.8.

Composición del agua de mar artificial: Cloruro de sodio ,24.6 g, cloruro de potasio 0.67 g, cloruro de calcio.2H20, 1.36 g, sulfato de magnesio. 7H20 6.29 g, cloruro de magnesio. 6H20 4.66 g, bicarbonato de sodio 0.18 g, agua desmineralizada 1.0 L, pH final (a 25°C) 7.8 a 8.2. b) Después de disolver los ingredientes vigorosamente mediante calentamiento, la solución resultante fue distribuida en tubos de ensayo y esterilizada a 121°C durante 30 minutos. Los tubos de ensayo se enfriaron y se les permitió solidificarse en una posición inclinada. Los inclinados de agar se trazaron con el crecimiento del cultivo no. PM0626271 por un circuito cableado y se incubaron a 27°C a 29°C hasta que se observó un buen crecimiento. Los cultivos bien crecidos se almacenaron en el refrigerador a 4°C a 8°C.

Ejemplo 4 Fermentación del cultivo no. PM0626271 en matraz de agitación. a) Composición del medio simiente [AS-274 (1)]: Glucosa 15 g, licor de maíz escarpado 5 g, peptona 7.5 g, extracto de levadura 7.5 g, carbonato de calcio 2.0 g, cloruro de sodio 5.0 g, volumen hecho con 750 mi de agua de mar artificial y 250 mi de agua desmineralizada . b) El medio anterior fue distribuido en cantidades de 40 mi en matraces de Erlenmeyer con capacidad de 500 mi y autoclivados a 121°C durante 30 minutos. Los matraces fueron enfriados a temperatura ambiente (25°C ± 2°C) y cada matraz fue inoculado con un asa completa de la cepa productora bien cultivada (cultivo no. PM0626271) en la inclinación y agitado en un agitador giratorio durante 72 horas a 230 rpm a 250 rpm a 30°C±°C para arrojar un cultivo simiente. c) Composición del medio de producción [AS 36P (1)]: Almidón soluble 20 g, glucosa 15 g, extracto de levadura 2 g, peptona 3 g, carbonato de calcio 2 g, sulfato de amonio 0.5 g, licor de maíz escarpado 2 g, cloruro de sodio 2 g, fosfato de magnesio 5 g, cloruro de cobalto 1 mL/L del concentrado de 1 g/L, solución de sal de trazo 1 mL/L, volumen creado para 1 L de uso con 75% de agua de mar artificial y 25% de agua desmineralizada. d) 40 mL del medio de producción en matraces de Erlenmeyer de 500 mL de capacidad se autoclivaron a 121°C durante 30 minutos, enfriados a 29 °C a 30°C, y sembrados con 5% (v/v) del cultivo simiente mencionado en el Ejemplo 4b. e) Parámetros de Fermentación: Los matraces de producción fueron incubados en un agitador a 29°C y 220 rpm durante 96 horas.

Los matraces de producción se cosecharon y todo el caldo de cada matraz de medio fue extraído con volumen igual de metanol bajo condiciones de agitación durante una hora a 29°C y centrifugados a 3500 rpm durante hora y media. El sobrenadante fue usado para ensayo de difusión de pocilio de agar antibacteriano para monitorear la actividad.

Ejemplo 5 Preparación de cultivo simiente en matraces de agitación para fermentación. a) Composición del medio [AS-274 (1)]: Glucosa 15 g, licor de maíz escarpado 5 g, peptona 7.5 g, extracto de levadura 7.5 g, carbonato de calcio 2.0 g, cloruro de sodio 5.0 g, volumen hecho con 750 mi de agua de mar artificial y 250 mi de agua desmineral zada . b) El medio anterior fue distribuido en cantidades de 200 mL en matraces de Erlenmeyer de 1000 mL y autoclivados a 121°C durante 30 minutos. Los matraces se enfriaron a temperatura ambiente (25±2°C) y cada matraz fue inoculado con un asa completa de la cepa productora bien cultivada (PM0626271) en la inclinación y agitado en un agitador giratorio durante 70 a 74 horas a 230 rpm a 250 rpm a 29°C a 30°C para arrojar el cultivo simiente.

Ejemplo 6 Cultivación del cultivo no. P 0626271 en el termentador. a) Composición del medio de producción: Agua de Mar Artificial (sal de agua de mar artificial 28.32 g) (75%), almidón soluble 20 g, glucosa 15 g, extracto de levadura 2 g, peptona 3 g, carbonato de calcio 2 g, sulfato de amonio 0.05 g, licor de maíz escarpado 2 g, cloruro de sodio 2 g, fosfato de magnesio 5 g, cloruro de cobalto (cloruro de cobalto 1 g, agua desmineralizada 1.0 L) lmL/L, solución de sal de trazo (sulfato de cobre 7 g, sulfato ferroso 1 g, cloruro de manganeso 8 g, sulfato de zinc 2 g, agua desmineralizada 1.0 L) 1 mL/L, agua desmineralizada 1.0 L, pH 6.5 a 7.5 (antes de la esterilización) . b) 100 L del medio de producción en 150 L de termentador junto con 30 mL de desmofen como agente antiespumante se esterilizaron in situ durante 30 minutos a 121°C, se enfriaron a 29°C a 30°C y se sembraron con 2.5 L a 3.5 L del cultivo simiente obtenido anteriormente (Ejemplo 5) . c) Parámetros de fermentación: La fermentación se llevó a cabo a una temperatura de 29°C a 30°C, agitación de 100 rpm, aireación de 60 lpm y se cosecharon a 70 horas a 74 horas. La producción del compuesto de la fórmula I en el caldo de fermentación fue detectado cualitativamente al probar la bioactividad contra S. aureus E710 (cepa MRSA) y/o Enterococcus faecium R2 (VRE) usando el método de difusión de pocilios de agar. El pH cosechado del caldo de cultivo fue de 7.5 a 8.0. Después de la cosecha, todo el caldo se sometió a extracción de solvente.

Ejemplo 7 Aislamiento y purificación del compuesto.

Todo el caldo (lote de 10 L) fue extraído usando acetato etílico (1:1) . Las capas orgánica y acuosa se separaron. La capa orgánica fue procesada para evaporar el solvente para obtener extracto crudo de acetato etílico (1.5 g) . El extracto crudo fue procesado aún más por cromatografía flash (gel de sílice, 30 g, solvente: etapa gradiente de metanol /cloroformo, flujo: 15 mL/minuto) . El compuesto activo eluido con 1% de metanol a 5% de metanol en cloroformo, el cual se concentró para obtener el compuesto semipuro (250 mg) . Se llevó a cabo una mayor purificación mediante HPLC preparativo de fase normal repetida .

Condiciones Preparativas de HPLC: Columna Sílice Eurospher (10 µ, 20x250 mm) Eluyente metanol : cloroformo (5:95) Tasa de Flujo 20 mL/minuto Detección (UV) 245 nm Tiempo de retención: (5 a 6 minutos) . La pureza de las fracciones fue revisada por bioensayo contra E. faecium R2 y/o S. aureus 3066 y/ HPLC analítico. Los agentes de elución se agruparon y concentraron bajo presión reducida para remover el solvente para obtener el compuesto.

Condiciones Analíticas de HPLC: Columna : Eurospher RP-18 (3µ, 1.6x125 mm) Sistema de solvente: Gradiente (0% acetonitrilo a 100% en 15 minutos contra agua, seguido por 100% acetonitrilo durante 5 minutos) . Tasa de Flujo : 1 mi/minuto Detección (UV) : 245 nm Tiempo de retención : compuesto de la fórmula I (12 a 13 minutos ) propiedades físicas y espectrales del compuesto la fórmula I : Apariencia Polvo Blanco Punto de fusión 240°C (se descompone) Solubilidad Soluble en cloroformo, acetato etílico, metanol, e insoluble en agua.

HR-ESI 1650.4858 (M+H) Peso Molecular (SI 1650.5 (M+H) Fórmula Molecular C7iHg3 i90l8S5 IR (KBr) 3386, 2927, 1648, 1507, 1206, 756, 666 cirf1 ¾ RMN Refiérase a- la Tabla 1 13 RMN : Refiérase a la Tabla 2 TABLA 1 MN del compuesto de la fórmula I en CDC13:CD30D (4:1) a MHz TABLA 2 C RMN del compuesto de la fórmula I en CDC13:CD30D (4:1) a 0 MHz Ejemplo 8 Cálculo de la solubilidad del compuesto fórmula I en SLF (pH 7.4) Materiales usados : NaCl : RFCL Limited, India CaCl2 : RFCL Limited, India NaOH : RFCL Limited, India Procedimiento : El SLF se preparó por método basado Respiratory Physiology & Neurobiology, 2008, 162, 73-79.

Preparación de SLF: 9 g de cloruro de sodio, 0.220 g de cloruro de calcio y 6.5 g de lactosa se disolvieron en 1000 mL de agua. El pH de la solución resultante fue ajustado a 7.4. La solubilidad del compuesto de la fórmula I en SLF se midió a dos temperaturas, 45°C y 60°C. Para esto, 1 mg del compuesto de la fórmula I se añadió a 3 mL de SLF (en duplicado) y después de someter a vórtice durante unos pocos segundos, se incubó en un baño de agua establecido a las temperaturas requeridas. La solubilidad se midió en intervalos de una hora durante tres horas. La solución fue filtrada a través de un filtro de 0.22 um y el filtrado fue inyectado en HPLC. La solubilidad fue calculada con respecto a la curva de calibración apropiada.

Los resultados obtenidos se dan en la Tabla 3.

TABLA 3 Conclusión: El compuesto de la fórmula I muestra baja solubilidad en SLF a 45°C y a 60°C. La solubilidad tampoco depende del tiempo. El compuesto de la fórmula I es un compuesto insoluble en agua, por lo tanto, la solubilidad se midió en el tampón de SLF.

Ejemplo 9 Preparación de la formulación de micropartículas del compuesto de la fórmula I.

Materiales usados : DPPC : Avanti Polar Lipids, Canadá Metanol : RFCL Limited, India Cloroformo : RFCL Limited, India DMSO : RFCL Limited, India NaCl : RFCL Limited, India CaCl2 : RFCL Limited, India NaOH : RFCL Limited, India Monohidrato de lactosa : Signet Chemical Corporation Prívate Ltd, E.U.A.

Vidriería : Merck Limited, India Perlas de vidrio : N.M. Enterprises, India Filtros de Membrana de : ISOPORE™, Millipore, E.U.A. policarbonato Retenedores de Filtros : SWINNEX®, Millipore, E.U.A. de polipropileno Jeringa de vidrio Hamilton Company, E.U.A. hermética a gases con seguro metálico Medidor de pH : Eutech Instruments, E.U.A.

Procedimiento : Método A Método de Evaporación de Solvente El ensayo se llevó a cabo con base en la referencia US 4877561.

El compuesto de la fórmula I y DPPC, en proporciones de 1:1, 1:10 y 1:20 p/p, se disolvió en 5 mi de cloroformo en un vaso de vidrio. 30 mi de metanol se añadieron y la mezcla fue transferida a un matraz de fondo redondo de 250 mi. 30 mi de SLF se vertieron en la mezcla lentamente. Los solventes se evaporaron usando un evaporador giratorio (Buchi GMBH, Suiza) . El baño de agua se estableció a 45°C y la rotación se estableció a 100 rpm. El controlador de vacío se estableció a una presión de 400 mBar. Los solventes evaporados se recolectaron en un recolector de solvente de vidrio. La solución remanente en el matraz RB se volvió lechosa, indicando la formación de liposomas. El volumen de la suspensión del matraz RB se hizo hasta 30 mi con SLF, centrifugado a 25,000 G a 4°C durante 10 minutos. El comprimido obtenido fue resuspendido en SLF, sometido a vórtice y filtrado a través de filtro de policarbonato de 1.2 um once veces para asegurar un tamaño uniforme de partículas y almacenado a 4°C. La formulación de micropartículas fue analizada por microscopía óptica y microscopía de electrones.

Método B Método de Auto-Montaje de Lípido Libre de Solvente El objetivo es desarrollar un proceso de fabricación libre de solventes para la formulación. 20 mg del compuesto de la fórmula I y 20 mg de DPPC (1:20 p/p) se añadieron a un matraz de RB con contenido de 20 a 30 perlas de vidrio y 30 mi de SLF. La mezcla fue sometida a rotación de 100 rpm a una temperatura de 45°C durante una hora. La formulación obtenida fue sometida a centrifugación y filtración como se describió en el Método A.

La formulación fue analizada por microscopía óptica .

Observaciones : Para las micropartículas en la formulación preparada por el Método A. (i) La formulación de micropartículas que contienen un compuesto de la fórmula I y DPPC en la proporción de 1:1 p/p y 1:10 p/p mostró suspensión no homogénea, inestable con agregados de fármacos cuando se observó bajo microscopio óptico. Las micropartículas se establecieron en el fondo del tubo. (ii) La formulación de micropartículas que contienen un compuesto de la fórmula I y DPPC en la proporción de 1:20 p/p, mostraron suspensión homogénea sin agregados de fármacos cuando se observó bajo el microscopio óptico. Las micropartículas no se establecieron en el tubo. (iii) La formulación de micropartículas que contienen el compuesto de la Fórmula I y DPPC en la proporción de 1:20 p/p mostró micropartículas de tamaño de 2 um a 3 um cuando se observó bajo el microscopio de electrones .

Resultado : La formulación de partículas que contienen el compuesto de la fórmula I y DPPC es formada óptimamente usando proporción de fármaco : lipido de 1:20 p/p.

Ejemplo 10 Determinación de eficiencia de encapsulamiento y balance de masa del compuesto de la fórmula I en la formulación del Ejemplo 9 Método A y la formulación del Ejemplo 9 Método B.

Materiales Usados : Metanol RFCL Limited, India DMSO RFCL Limited, India Vidriería Merck Limited, India Autopipetas Eppendorf GMBH, Alemania Procedimiento : La eficiencia del encapsulamiento del compuesto de la fórmula I en la formulación del Ejemplo 9 Método A y Ejemplo 9 Método B se analizó por HPLC (Agilent, E.U.A.) . Las condiciones de HPLC son las siguientes: Columna : Lichrosphere® 100, RP-18e, 150x4.6 mm, 5µ?? Fase Móvil : (a) 0.01 M de acetato de amonio + 0.5 % de trietilamina en 1000 mL de agua; pH ajustado a 6.5 con ácido acético glacial (b) acetonitrilo Composición : (a) : (b) : :50:50 Tiempo de Operación : 5 minutos Temp. de Columna : 25°C Vol . De Inyección : 20 \ih Tiempo de Retención : ~ 3.5 minutos Solvente : 20% de DMSO en metanol El compuesto de la fórmula I se disolvió en 20% de DMSO para obtener 200 ug/ml de concentración y se usó como estándar de referencia. 100 uL de la formulación del Ejemplo 9 Método A y 100 pL de la formulación del Ejemplo 9 Método B se pipetearon separadamente en tubos centrífugos de 2 mL y 900 uL de 20% de DMSO se añadieron a cada tubo. Los tubos fueron sometidos a vórtice, lo que llevó a la ruptura de la matriz de micropartículas y la liberación de todo el contenido del compuesto de la fórmula I encapsulado dentro de la matriz. Las muestras inyectadas independientemente en la HPLC fueron las siguientes: estándar de referencia, formulación del Ejemplo 9 Método A (después de la ruptura de la matriz de micropartículas ) y la formulación del Ejemplo 9 Método B (después de la ruptura de la matriz de micropartículas) . La media de las áreas pico se consideró para el cálculo.

La eficiencia de encapsulación fue determinada por la fórmula: % encapsulación = W x 100 w en donde: W = cantidad del fármaco (compuesto de la fórmula I) asociado/encapsulado dentro de la micropartícula. w = cantidad inicial del compuesto de la fórmula i .

Para el cálculo del balance de masa, el compuesto de la fórmula I fue recuperado de la vidriería, filtros, todo el demás material de laboratorio que se usó en el proceso de preparación de la formulación (Ejemplo 9 Método A y Ejemplo 9 Método B) y su contenido se calculó. Los filtros de policarbonato (Ejemplo 9 Método A y Ejemplo 9 Método B) se lavaron con 5 mi de 20% de DMSO en metanol . Esta muestra fue inyectada en HPLC como "residuo de membrana" .

El matraz RB usado para preparar la formulación fue lavado con 10 mL de 20% de DMSO en metanol. Esta muestra fue inyectada en HPLC como "residuo de matraz" .

El estándar de referencia fue inyectado seis veces en el HPLC y las áreas pico fueron notadas . La desviación estándar relativa de seis inyecciones del estándar fue menor a 2.0 %. Las muestras se inyectaron en duplicado en el HPLC y la media de las áreas pico se calcularon para su cálculo.

Los resultados obtenidos se dan en la Tabla 4.

TABLA 4 Conclusión : La eficiencia de encapsulacion de la formulación es comparativamente mejor cuando se prepara con el Método A del Ejemplo 9 que cuando se prepara con el Método B del Ejemplo 9.

Ejemplo 11 Determinación del tamaño de partículas de las micropartículas de la formulación del Ejemplo 9 Método A.

Procedimiento : El diámetro hidrodinámico y la granulometría de las micropartículas de la formulación del Ejemplo 9 Método A fue determinado usando Espectroscopia de Correlación de Fotones (DELSA Nano, Beckmann Couter, E.U.A.). 1 mL de la formulación fue diluido a 10 mi con SLF. 1 mL de esta solución se usó para la determinación del tamaño de partículas .

Resultado : El tamaño de partículas medio de las micropartículas de la Formulación del Ejemplo 9 Método A es de 2 um a 3 µp. Para cada población individual, la dispersión del tamaño de partículas alrededor de la media es de alrededor de 0.45 - 0.47.

La Tabla 5 proporciona los tres diámetros de corte. Dio, D50 y D90 indican el diámetro promedio del 10%, 50% y 90% de la población de partículas, respectivamente.

TABLA 5 Conclusión : El método de evaporación de solvente (Ejemplo 9 Método A) para el compuesto de las micropartículas de base lípida de la fórmula I ha llevado a la generación de partículas de tamaño de micrones en el rango de 1 µp? a 10 pm (como se ilustra en la Tabla 5) , con más de 99% partículas teniendo tamaño de partículas menor a 10 um (ilustrado en la Tabla 6) .

TABLA 6 Ejemplo 12 Determinación del pH de la formulación del Ejemplo 9 Método A Procedimiento : El medidor de pH (Eutech, E.U.A.) fue estandarizado electrónicamente contra los tampones estándares de pH de pH 4, 7 y 9. El pH de la formulación del Ejemplo 9 Método A fue determinado mediante el uso del mismo medidor de pH.

Resultado : El pH de la formulación del Ejemplo 9 Método A es 6.14.

Conclusión: El pH de la formulación del Ejemplo 9 Método A es fisiológicamente compatible con la administración del fármaco (compuesto de la fórmula I) durante un periodo corto de hasta 30 minutos de nebulización o instilación intratraqueal de una vez.

Ejemplo 13 Determinación de osmolalidad de la formulación del Ejemplo 9 Método A Materiales : Solución de referencia : Wheecon Instruments Prívate Limi ted Osmómetro : Wheecon Ins ruments Prívate Limited Procedimiento : Osmolalidad de la formulación del Ejemplo 9 Método A fue determinado por el uso del osmómetro. El osmómetro fue estandarizado usando la solución de referencia de 290 mOsmol/kg .

Resultado : La osmolalidad de la formulación del Ejemplo Método A es 340 mOsmol/kg.

Conclusión : La osmolalidad fisiológica de los fluidos corporales es de 300 mOsmol/kg. Cualquier cambio significativo en esta osmolalidad tiene implicaciones patológicas. La administración de grandes volúmenes de soluciones hipertónicas (osmolalidad significativamente mayor) o soluciones hipotónicas (osmolalidad significativamente menor) provoca su excesiva pérdida/ganancia de fluido, llevando a condiciones patológicas de edema o deshidratacion pulmonar y de tejido. La introducción de pequeñas cantidades de fluidos, en forma de aerosol a concentraciones normales de osmolalidad, excluye el desarrollo de las patologías mencionadas anteriormente. La formulación del Ejemplo 9 Método A tiene la osmolalidad de 340 mOsmo/kg y por lo tanto está dentro de los límites seguros.

Ejemplo 14 Evaluación de la compatibilidad del excipiente del compuesto de la fórmula I en la formulación del Ejemplo 9 Método A Materiales : Ollas de sellado hermético: Perkin Elmer India Limited con juntas tóricas DSC : Perkin Elmer, E.U.A.

Procedimiento: 50 µ? de la formulación del Ejemplo 9 Método A se pipetearon en olla de DSC. La mezcla y la olla de referencia vacía (estándar de referencia) fueron herméticamente selladas y colocadas en DSC híper y el programa de temperatura se llevó a cabo como sigue: Programa de Temperatura 0°C a 50°C Tasa de Calentamiento 5°C/minuto Gas de Purga Nitrógeno Tasa de Flujo 30 mL/minuto Resultado : Los liposomas preparados sin el compuesto de la fórmula I mostraron un endotermo con un establecimiento a 41.1°C. Este endotermo puede ser atribuido a la transición del gel propagado a la fase cristalina líquida. La formulación de micropartículas mostró un endotermo a aproximadamente 42.5°C. Este cambio en las temperaturas de establecimiento puede deberse a la interacción física del compuesto de la fórmula I con liposomas DPPC . El cambio en la transición principal marca la transición de la bicapa de fosfolípido de un estado empacado de cadena de hidrocarbono bien organizada altamente bloqueada a un estado en el que algunas cadenas de acilo muestran presencia de pliegues.

Conclusión: Los resultados muestran relación de compatibilidad de fármaco-excipiente entre el compuesto de la fórmula I y DPPC. Hay una ausencia de cambio significativo en la temperatura de establecimiento del endotermo, así como ausencia de abolición de pico.

Ejemplo 15 Cálculo de contenido de solvente en la formulación del Ejemplo 9 Método A Materiales : Metanol (grado HPLC) : RFCL Limited, India Cloroformo (grado HPLC) : RFCL Limited, India DMSO (grado HPLC) : RFCL Limited, India Ampolletas de vidrio GC-HS: Perkin Elmer India Limited Vidriería Merck Limited, India Procedimiento : El experimento se hizo para estudiar el contenido de solvente residual en la formulación del Ejemplo 9 Método A usando GC-HS. Este experimento evalúa la viabilidad de uso del método de evaporación de solvente (Ejemplo 9 Método A) para que se use para la producción comercial a gran escala de la formulación del Ejemplo 9 Método A.

Preparación en bruto: 5 mi de DMSO se añadieron a una ampolleta de vidrio GC-HS de 20 mi. La ampolleta fue prensada con un tapón de teflón y tapa de aluminio. Dichas dos ampolletas fueron preparadas para la inyección en bruto.

Preparación estándar: 10 mg de cloroformo y 100 mg de metanol fueron exactamente pesados en un matraz volumétrico estándar de 100 mi. Los solventes se disolvieron y se hizo el volumen hasta 100 mi con DMSO. 5 mi de solución concentrada fueron pipeteados en una ampolleta de vidrio GC-HS de 20 mi. La ampolleta fue plegada con un tapón de teflón y tapa de aluminio. Seis de esas ampolletas se prepararon para inyección estándar.

La tabla 7 proporciona las condiciones cromatográficas y método para el cálculo de contenido solvente en la formulación del Ejemplo 9 Método A.

TABLA 7 Resultado : La Tabla 8 proporciona un desglose del efecto del tiempo de evaporación sobre el contenido de solvente y la encapsulación de la formulación del Ejemplo 9 Método A.

TABLA 8 Observación: Se ha observado que el tiempo de evaporación de 2 horas proporciona un contenido menor de solvente y las calidades de encapsulacion y balance de masa deseadas de la formulación del Ejemplo 9 Método A. También, el contenido de solvente residual tal como se detectó por GC-HS está por debajo del límite permisible para cada solvente individual (el límite de exposición diaria permitido para el cloroformo es de 60 ppm y para el metanol es de 3000 ppm -(ICH Quality · Guidelines, Impurities : Guidelines for Residual Solventes, Q3C(R5), Feb. 2011) para el contenido de solvente de API y el límite de exposición diaria permitido para el producto farmacéutico.

Conclusión: El método de evaporación del solvente (Ejemplo 9 Método A) se puede considerar como un método adecuado para desarrollar esta formulación.

Ejemplo 16: Nebulización de la formulación del Ejemplo 9 Método A Materiales : Unidad Impactora de Doble Etapa : Copley Scientific, Reino Unido Nebulizador : DeVILBISS®, Sunrise Medical, E.U.A.

Metanol : RFCL Limited, India DMSO : RFCL Limited, India HPLC : Agilent, E.U.A.

Balanza Electrónica : Denver Instruments, E.U.A.

Procedimiento: La unidad de TSI se utilizó para este estudio y fue montada según el manual de instrucciones. El TSI es un modelo in vi tro de vidrio del tracto pulmonar humano y se usa para cuantificar in vitro el potencial de deposición pulmonar del fármaco.

La bomba de vacío de la TSI se encendió y el medidor de flujo se utilizó para comprobar con precisión el flujo del sistema. La válvula de flujo en la bomba de vacío se ajustó para garantizar una especificación exacta del flujo (28.3 1/min) . Después de la calibración del flujo de aire, la unidad entera se desmontó. 7 mi de metanol se añadieron al impactor superior y 20 mi de metanol se añadieron al impactor inferior. La unidad de TSI fue montada de nuevo según el manual de instrucciones . 5 mi de la formulación del Ejemplo 9 Método A se añadieron a la taza de medicación del nebulizador. La boquilla del nebulizador se adjuntó a la boquilla del TSI. Se aseguró que todas las piezas estuvieran en condiciones de evitar cualquier pérdida de vacio.

La bomba de vacío del TSI se inició para garantizar el flujo de aire uniforme. Después de 30 segundos el nebulizador se inició y la hora de inicio se señaló. Después de exactamente 5 minutos, el nebulizador se detuvo. La bomba se dejó funcionar durante otros 30 segundos después de que se desconectó. La cámara de impacto superior imita la garganta y las vías respiratorias superiores e inferiores y la cámara de impacto inferior imita los alvéolos.

El metanol se usó como solvente de lavado y el contenido de la cámara de impacto superior e inferior se recogió en matraces volumétricos estándar apropiados. 20% de DMSO se añadió para asegurar la disolución del compuesto de la fórmula I . Los volúmenes finales de los matraces volumétricos estuvieron compuestos por metanol. El experimento anterior se repitió con seis lotes de formulación y dos lotes de compuesto no formulado de la fórmula I .

Las muestras se evaluaron en varias concentraciones a partir de: 0.5 mg de compuesto de la fórmula I en la formulación de 5 mi del Ejemplo 9 Método A - muestra 1; 1 mg de compuesto de la fórmula I en la formulación de 5 mi del Ejemplo 9 Método A - Muestra 2; 2.5 mg de compuesto de la fórmula I en la formulación de 5 mi del Ejemplo 9 Método A Muestra-3; 5 mg de compuesto de la fórmula I en la formulación de 5 mi del Ejemplo 9 Método A - Muestra 4; y 100 mg/ml de compuesto de la fórmula I no formulado (sólo compuesto de la fórmula I) -Muestra 5.

Este estudio se realizó para comprender el efecto de la concentración en el depósito de fármacos in vi tro. El estudio se continuó adicionalmente para estimar la cantidad de fármaco (compuesto de la fórmula I) perdido en el proceso de nebulización y por lo tanto dejado atrás en la taza del nebulizador.

El compuesto de la fórmula I depositado en la parte superior e inferior de la cámara de impacto del TSI se analizó por HPLC con una bomba de gradiente y el muestreador automático. Las condiciones cromatográficas utilizadas en el análisis de HPLC se proporcionan en la Tabla 9.

TABLA 9 100 ug/mL del compuesto de la fórmula I (2.5 mg del compuesto de la fórmula I se disolvieron en 20% de DMSO en metanol) se usaron como estándar de referencia.

El estándar de referencia fue inyectado seis veces en el HPLC y las áreas pico fueron marcadas . La desviación estándar relativa de seis inyecciones del estándar fue menor a 2.0%. Las muestras fueron inyectadas por duplicado en el HPLC y la media de las áreas pico fue considerada para su cálculo.

Resultado : El % del compuesto de la fórmula I depositado por las varias muestras (muestras 1 a 6) en el impactor superior e inferior del TSI se proporciona en la Tabla 10.

TABLA 10 (B) La cantidad (ug) del compuesto de la Fórmula I perdido (durante el proceso de nebulización) en la taza de nebulización se proporciona en la Tabla 11.

TABLA 11 Observaciones : La formulación cuando se nebulizó a una concentración de 1 mg/ml y 2.5 mg/mL deposita alrededor de 16% y 10% de la cantidad inicial de compuesto de la fórmula I introducido en el recipiente del nebulizador. La concentración mínima inhibitoria del compuesto de la fórmula I está en el intervalo de 0.125 g/ml a 5 g/ml (publicación de solicitud PCT WO2011027290 ) . La cantidad de compuesto de la fórmula I depositada es suficiente y por encima de la concentración mínima inhibitoria en el modelo in vi tro. Los resultados sugieren que concentraciones de formulación de 1 mg/ml y 2.5 mg/ml del compuesto de la fórmula I, podrían ser las concentraciones que deben ser evaluadas en los estudios in vivo. A concentraciones inferiores a 1 mg/ml, el porcentaje del compuesto de la fórmula I depositado es mayor, pero la cantidad no es. significativa, mientras que a una concentración de 5 mg/ml, una cantidad significativa de compuesto de la fórmula I es retenida de nuevo en el recipiente del nebulizador que conduce a un desperdicio de compuesto de la fórmula I.

Conclusión : Los resultados demuestran claramente que la formulación del Ejemplo 9 Método A es capaz de depositar una cantidad significativa del compuesto de la fórmula I en el modelo de pulmón in vi tro del TSI, mientras que el compuesto de la fórmula I no formulado no se deposita en el TSI en nebulización. Así, la formulación del Ejemplo 9 Método A se puede utilizar para su administración basada en inhalación del compuesto de la fórmula I.

EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LA FORMULACIÓN DE MICROPARTICULÁS Ensayos In Vitro Ejemplo 17: Ensayo Microbiano El ensayo se llevó a cabo con base en la referencia; Nathan P et al., 1978, Laboratory Methods for Selection of Topical Antimicrobial Agents to Treat Infected Burn Wounds, Burns 4: 177-187.

(A) Modelos de prueba bacteriana usados en el ensayo: Staphylococcus aureus 209P (MSSA) Staphylococcus aureus ATCC 33591 (MRSA) Enterococcus faecium R-2 (VRE) (B) Preparación del Inoculo Cultivos de crioampolletas fueron trazados en inclinación de TSA e incubados a 37 °C durante 18 h a 24 horas. Usando el crecimiento en la suspensión salina inclinada se prepararon, y la densidad óptica se ajustó a 0.3 unidades a 560 nm (~ 108 CFU/ml) .

(C) Preparación de Muestras Las muestras probadas en el ensayo son: (i) Muestra 1: Suspensión no filtrada de la formulación del Ejemplo 9 Método B. (ii) Muestra 2: Suspensión filtrada de la formulación del Ejemplo 9 Método B (después de filtración a través de filtro de 0.22 um) . (iii) Muestra 3: Muestra preparada por el método de interrupción del metanol : La Muestra 2 fue mezclada con volúmenes iguales de metanol e incubada durante una hora. Las diluciones de esta solución- fueron preparadas en metanol y usadas para evaluar la eficacia del compuesto liberado de la Fórmula I. (iv) Muestra.4: El compuesto no formulado de la fórmula I (compuesto de la fórmula I disuelto en metanol cloroformo en una proporción de 1:80) .

Las concentraciones de las muestras 1, 2, 3 y 4 evaluadas en el ensayo fueron: 100, 50, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78, 0.39 y 0.195 ug/mL.

(D) Procedimiento del ensayo: 40 µ? de suspensión de inoculo del cultivo de prueba obtenido de (B) se pusieron en cada una de las culatas de TSA fundido de 40 mi (mantenidas a 38°C a 39°C) en matraces cónicos estériles de 100 mi de capacidad y se removieron para un mezclado uniforme. Las culatas sembradas se vertieron en placas de petri (150 ram de diámetro exterior) permitiéndoles establecerse durante alrededor de 30 minutos. Las placas se mantuvieron a 4°C a 8°C para un establecimiento completo. Los números requeridos de pocilios (de diámetro de 6 mm) se perforaron del medio de establecimiento. 50 µ? de la muestra 1, muestra 2 y muestra 3, se añadieron en los pocilios correspondientes en las placas. Las placas se pre-incubaron a baja temperatura (2°C-8°C) durante alrededor de 30 minutos para permitir la difusión. Las placas fueron incubadas después de 37°C durante 18 a 24 horas. Vancomicina a 20 ug/ml se usó como antibiótico estándar. Los resultados de la actividad de varias muestras se interpretaron como el tamaño de zona de inhibiciones en mm.

Resultado : La muestra 3 mostró zonas claras de 100 ug/ml a 0.78 pg/ml mientras que la muestra 4 mostró zonas claras de 100 µ/ml a 0.39 ug/ml .

La actividad (con respecto al tamaño de la zona) de la muestra 2 es mejor que la muestra 1, ya que la muestra 2 mostró clara zona de inhibición a 12.5 pg/ml mientras que la muestra 1 mostró zonas claras a 25ug/ml .

En el caso de la muestra 3, el tamaño de la zona del compuesto de la fórmula I es menor al compuesto no formulado de la fórmula I (muestra 4) . Esto puede deberse a la lenta liberación del compuesto de la fórmula I de la formulación de lípidos .

Conclusión: La actividad del compuesto de la fórmula I liberado de la formulación del Ejemplo 9 Método B (muestra 3) es comparable con el compuesto no formulado de la fórmula I (muestra 4) y por lo tanto puede llevarse a cabo para pruebas y evaluación in vivo.

Ejemplo 18 Ensayo de compatibilidad in vitro El ensayo se llevó a cabo con base en la referencia Journal of Biomedical Materials Research, 2009, 89A, 281-292.

Este ensayo se llevó a cabo para evaluar la citocompatibilidad de la formulación del Ejemplo 9 Método A con las líneas celulares relevantes y las células estándar que son especificadas por las agencias regulatorias .

Líneas celulares evaluadas : MRC5 (línea celular de fibroblasto pulmonar) A549 (línea celular alveolar Tipo II aislada de tumor maligno) L929 (línea celular de fibroblasto de ratón, es un estándar de ASTM) .

Detalles experimentales : Densidad celular: 10 , 000 /pocilio para MRC 5 y L292, y 3000/pocillo para A549 Puntos de Tiempo: 24 horas y 48 horas Concentraciones evaluadas : 1, 0.7, 0.3, 0.1 mg/ml para las micropartículas de la formulación del Ejemplo 9 Método B- Muestra 1 0.3, 0.1 mg/ml para las micropartículas sin el compuesto de la fórmula I, DPPC - Muestra 2 0.1, 0.01 mg/ml para únicamente el compuesto de la fórmula I - Muestra 3 Procedimiento : La evaluación toxicológica fue hecha usando el Ensayo CellTiter 96 Aqueous One Solution de Promega (Cat. No. G3582). El ensayo es un método colorimétrico estándar para determinar el número de células viables en ensayos de proliferación o citotoxicidad. El MTS usado en el ensayo es bio-reducido por las células en un producto de formazano con color que es soluble en medio de cultivo de tejido. La cantidad de producto de formazano como se mide por la cantidad de absorbancia de 490 nm es directamente proporcional al número de células vivas en el cultivo.

Brevemente, las lineas celulares fueron emplacadas en trío con placa de 96 pocilios y se les permitió adherirse y proliferarse durante un periodo de 24 horas. 24 horas después de la adhesión celular, se añadieron los compuestos. 48 después del emplacado celular, el ensayo se terminó al reemplazar el medio con 100 µ? de medio fresco, y la adición de 20 µ? de CellTiter 96 Aqueous One Solution (Promega, Cat . No. G3582). Una configuración en trío de control "sin células" con contenido de 100 µ? de medio de cultivo y 20 µ? de "One Solution" también fue mantenida como control en el ensayo. La placa fue incubada durante 30 minutos a 4 horas para el color a desarrollar. La placa de 96 pocilios de ELISA fue sometida después a registros de absorbancia a 490 nm (450-540 nm) con un lector de placa de 96 pocilios. La absorbancia promedio de 490 nm del control "sin células" fue restada de todos los otros valores de absorbancia y la absorbancia correcta fue usada para más cálculos. (El antecedente de la absorbancia de control "sin células" es típicamente de 0.2 a 0.3 unidades de absorbancia después de 4 horas de incubación) .

Resultado : La viabilidad de todas las líneas celulares evaluadas en la presencia de la Muestra 1 fue de más de 98%. La morfología de las líneas celulares no fue alterada y la confluencia de la monocapa estuvo presente. Esto muestra que a las concentraciones evaluadas, la muestra 1 no mostró ninguna toxicidad en el ensayo basado en células. El compuesto de la fórmula I en su forma no formulada, sin embargo, mostró citotoxicidad en todas las diferentes líneas celulares evaluadas. Por lo tanto, la formulación tiene una ventaja adicional de limitar la toxicidad manifestada por el compuesto de la fórmula I. Los resultados se resumen en la Tabla 12.

TABLA 12 Conclusión : La muestra 3 tiene el potencial para resultar o expresar efectos adversos y toxicidad in vivo. Sin embargo, la muestra 1 que incluye el uso de DPPC, el potencial tóxico del compuesto de la fórmula I, están enmascarada y la eficiencia biológica se observa en ausencia de toxicidad.

Ejemplo 19 Ensayo de ingesta de macrófagos in vitro El ensayo se llevó a cabo con base en la referencia Respiratory Research, 2009, 10, 44.

Aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de rat .

Los lavados broncoalveolares de las ratas se tomaron después del permiso ético apropiado. Salina caliente estéril se introduje en el pulmón y después se removió por succión. El fluido de lavado broncoalveolar fue transportado en paquetes de hielo (generalmente de 100 a 200 mi de fluido de lavado broncoalveolar por donante es lo deseado) . El fluido fue sometido a centrifugación a 250 g durante 10 minutos, y las células fueron recolectadas. Los comprimidos celulares se agruparon al resuspender las células en un total de 10 mi de HBSS. Una alícuota de 100 µ? fue removida y teñida con tinte Wright-Giemsa para hacer un conteo celular diferencial. El conteo celular fue ajustado y se emplacaron las células en medio de cultivo de macrófagos (medio HAM F12, Amimed, Suiza). 0.5 mi de la suspensión celular se añadieron a cada una de las placas de cultivo de tejido de 6 pocilios con 0.5 mi del medio de cultivo de macrófagos. Las células se incubaron durante 24 horas a 37°C y 5% de C02. La adherencia celular y el crecimiento celular se evaluaron y trataron con la formulación del Ejemplo 9 Método A marcado con tinte de sulforhodamina . Después del tratamiento, las células se evaluaron para fluorescencia. Esta fluorescencia resulta en la ingesta selectiva de la formulación por los macrofagos alveolares .

Resultado : Las micropartículas de la formulación del Ejemplo 9 Método A fueron tomadas selectivamente por los macrofagos alveolares, empezando 1 hora después del tratamiento. El tinte muestra saturación gradual en intensidad a las 3 horas. Esto es indicativo de la ingesta activa y un punto de saturación de la ingesta. Las microbacterias residen y sobreviven en los macrofagos alveolares, por lo tanto es muy crítico asegurar que el fármaco alcanza los macrofagos. Por la formulación de micropartículas designada del Ejemplo 9 Método A, es evidente que no sólo el compuesto de la fórmula I está alcanzando los macrofagos, sino que está siendo ingerido activamente por los mismos, lo que es deseable para que la terapia sea exitosa in vivo.

La formulación del Ejemplo 9 Método A es ingerida activamente (incremento gradual en la concentración del compuesto) y metabolizada por los macrofagos (reducción en la concentración del compuesto) como es evidente de los valores en la tabla 12. El fármaco libre (compuesto de la fórmula I) no muestra ingesta activa (evidente de las concentraciones saturadas del fármaco libre) .

TABLA 12 Ensayo in vivo Los animales usados en los experimentos fueron albergados y cuidados, de acuerdo con los lineamientos vigentes publicados por CPCSEA, Tamil Nadu, India. Los procedimientos que usan animales de laboratorio, fueron aprobados por la IAEC de Piramal Life Sciences Limited, Goregaon, Mumbai, India.

Ejemplo 20 Estudios de descarga pulmonar El ensayo se hizo como se reportó en The AAPS Journal, 2005, 7(1), E20-E41.

Un estudio de descarga pulmonar in vivo se llevó a cabo según la referencia mencionada. Se dividieron conejillos de indias en tres grupos. El grupo 1 recibió la formulación del Ejemplo 9 Método A, el grupo 2 recibió el compuesto no formulado de la fórmula I y el grupo 3 se dejó sin tratar (grupo sin tratamiento) . 10 mg/kg de la formulación se rociaron y se permitió que los animales respiraran pasivamente. Después de la administración de la formulación del Ejemplo 9 Método A, los animales se sacrificaron en el punto de tiempo de 30 minutos. Los pulmones fueron recolectados y analizados por HPLC . Las condiciones de HPLC se muestran en la Tabla 13.

TABLA 13 Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla TABLA 14 Observaciones : En la nebulización, el compuesto no formulado de la fórmula I es incapaz de alcanzar los pulmones . La formulación del Ejemplo 9 Método A fue capaz de alcanzar los pulmones en respiración pasiva. La mayor exposición de los animales llevará a niveles incrementados del compuesto de la fórmula I en los pulmones .

Conclusión: La formulación del Ejemplo 9 Método A es capaz de alcanzar los pulmones.

Ejemplo 21 Determinación de la biodisponibilidad pulmonar de la formulación del Ejemplo 9 Método A.

El ensayo se hizo como se reportó en el AAPS Journal, 2005, 7(1), E20-E41.

Un estudio descarga pulmonar in vivo de exposición nasal únicamente fue llevado a cabo según la referencia mencionada. Los conejillos de indias se dividieron en dos grupos. El grupo 1 recibió el compuesto no formulado de la fórmula I (3 mg/kg) y el grupo 2 recibió la formulación del Ejemplo 9 Método A (3 mg/kg) . El compuesto no formulado de la fórmula I y la formulación del Ejemplo 9 Método A se rociaron y la exposición únicamente nasal fue llevada a cabo usando nebulizador de chorro en donde el periodo de nebulización fue de una hora. Después de la administración del aerosol, los animales fueron sacrificados a 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas y 24 horas después de la exposición al aerosol y los pulmones fueron recolectados y analizados para cuantificar la cantidad de compuesto de la fórmula I (mg/g) depositada en el pulmón por LC-MS. Las condiciones de LC-MS se especifican más adelante: Condiciones . Cromatográficas : TABLA 16 Parámetros de Fuente/Gas : TABLA 17 Parámetros MS-MS Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla TABLA 18 Observaciones : En la nebulización, el compuesto no formulado de la fórmula I fue incapaz de alcanzar los pulmones. La formulación del Ejemplo 9 Método A fue capaz de alcanzar los pulmones y fue retenido durante 24 horas.

Conclusión : La formulación del Ejemplo 9 Método A fue capaz de sobrepasar el bajo perfil de biodisponibilidad del compuesto no formulado de la fórmula I. Además, el perfil de retención pulmonar de la formulación del Ejemplo 9 Método A, también lo puede hacer adecuado para inhalación una vez al día.

Ejemplo 22 Evaluación de acumulación creciente de la formulación del Ejemplo 9 Método A después de dosificación una vez al día durante 5 días para periodo de exposición a nebulización de 1 hora/día.

El ensayo se hizo como se reportó en el AAPS Journal, 2005, 7(1), E20-E41.

Un estudio de descarga pulmonar de exposición únicamente nasal in vivo fue llevado a cabo según la referencia mencionada. Los conejillos de indias se dividieron en dos grupos. El grupo 1 recibió compuesto no formulado de la fórmula I (3 mg/kg) y el grupo 2 recibió la formulación del Ejemplo 9 Método A (3 mg/kg) . El compuesto no formulado de la fórmula I y la formulación del Ejemplo 9 Método A se roció y la exposición únicamente nasal se llevó a cabo usando nebulizador de chorro en donde el periodo de nebulización fue de una hora al día durante cinco días consecutivos y los animales fueron sacrificados en el sexto día. Los pulmones se recolectaron y analizaron para cuantificar la cantidad de compuesto de la fórmula I (ng/g) depositado en el pulmón por LC-MS. Las condiciones de LC-MS son como se proporciona en las Tablas 15, 16 y 17 del Ejemplo 21.

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 19.

TABLA 19 Observaciones : En la nebulización, el compuesto no formulado de la fórmula I fue incapaz de alcanzar los pulmones . La formulación del Ejemplo 9 Método A fue capaz de alcanzar los pulmones y mantenerse durante 24 horas y también mostró el compuesto de la fórmula I después de la exposición crónica diaria durante 5 días.

Conclusión: La capacidad de los pulmones para retener el compuesto de la fórmula I como la formulación (formulación del Ejemplo 9 Método A) durante cinco dias, se puede usar como cinco días de nebulización como un régimen terapéutico .

Ejemplo 23 Evaluación de la programación de la dosis de la formulación del Ejemplo 9 Método A.

El ensayo se hizo como se reportó en el AAPS Journal, 2005, 7(1), E20-E41.

Un estudio de descarga pulmonar de exposición únicamente nasal in vivo fue llevado a cabo según la referencia mencionada. Los conejillos de indias se dividieron en tres grupos. El grupo 1 recibió el compuesto no formulado de la fórmula I (3 mg/kg) ; el grupo 2 recibió formulación del Ejemplo 9 Método A (3 mg/kg) una vez al día durante un día y el grupo 3 recibió la formulación del Ejemplo 9 Método A (3 mg/kg) dos veces al día durante un día. El compuesto no formulado de la fórmula I y la formulación del Ejemplo 9 Método A fueron rociados y la exposición únicamente nasal fue llevada a cabo usando nebulización de chorro. Los animales fueron sacrificados y los pulmones fueron recolectados y analizados para cuantificar la cantidad de compuesto de la fórmula I (ng/g) depositada en los pulmones por LC-MS. Las condiciones LC-MS son como se proporcionan en las Tablas 15, 16 y 17 del Ejemplo 21.

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 20.

TABLA 20 Observaciones : En la nebulización, el compuesto no formulado de la fórmula I fue incapaz de alcanzar los pulmones . La formulación del Ejemplo 9 Método A fue capaz de alcanzar los pulmones y la cantidad de compuesto de la fórmula I absorbida por los pulmones se incrementó a medida que la dosis fue duplicada en un día.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de micropartículas que comprende un compuesto de la fórmula I ; y un lípido biodegradable para la administración de fármacos en donde la proporción del compuesto de la fórmula I al lípido es de 1:15 a 1:25; caracterizada porque dicha formulación es una formulación biodegradable e inhalable .

2. La formulación de micropartículas según la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto de la fórmula I constituye del 1% al 5% (p/p) de la formulación.

3. La formulación de micropartículas según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el lípido biodegradable es dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) .

4. La formulación de micropartículas según la reivindicación 1, caracterizada porque el tamaño de partículas de las micropartículas varía entre 0.5 y 10 micrones .

5. La formulación de micropartículas según la reivindicación 4, caracterizada porque al menos el 90% de las micropartículas tienen un tamaño de partículas menor a 10 micrones.

6. La formulación de micropartículas según la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación es una dispersión liposomal acuosa.

7. La formulación de micropartículas según la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación tiene un pH que varía de 6 a 7.

8. La formulación de micropartículas según la reivindicación 1, caracterizada porque para dicha formulación, la temperatura de transición de fase varía de 41°C a 43°C.

9. Un proceso para la preparación de una formulación de micropartículas que comprende el compuesto de la fórmula I como se define en la reivindicación 1 y dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) en donde la proporción del compuesto de la fórmula I a DPPC es de 1:15 a 1:25, caracterizado porque dicho proceso comprende los pasos de: (a) disolver el compuesto de la fórmula I y DPPC en 3 mL a 15 mL de cloroformo para obtener una solución; (b) añadir 20 mL a 45 mL de metanol a la solución del paso (a) y mezclar bien hasta obtener una solución homogénea,- (c) añadir 20 mL a 50 mL de fluido pulmonar simulado (SLF) a la solución del paso (b) ; (d) evaporar los solventes; (e) crear el volumen obtenido en el paso (d) a 30 mL con SLF y centrifugación a 15000 g a 35000 G, a 4°C durante diez minutos para obtener un comprimido; (f) volver a suspender el comprimido obtenido en el paso (e) en SLF para obtener una suspensión de concentración de 0.5 mg/ml a 10 mg/ml ; y (g) filtrar la suspensión obtenida en el paso (f) a través de un filtro de policarbonato de 0.5 um - 5um para obtener el tamaño de partícula uniforme de las micropartículas formadas.

10. El proceso según la reivindicación 9, caracterizado porque el tamaño de partículas de las micropartículas varía entre 0.5 y 10 micrones.

11. El proceso según la reivindicación 9, caracterizado porque al menos 90% de las micropartículas son menores a 10 micrones.

12. Un proceso para la preparación de la formulación de micropartículas que comprende el compuesto de la fórmula I según la reivindicación 1 y dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) en donde la proporción del compuesto de la fórmula I a DPPC es de 1:15 a 1:15, caracterizado porque dicho proceso comprende los pasos de: (i) añadir 20 mi a 45 mi de fluido pulmonar simulado (SLF) a una mezcla del compuesto de la fórmula I y dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ; (ii) someter la mezcla del paso (i) a rotación de 100 rpm a 200 rpm a 42°C a 45°C durante una hora para obtener una suspensión; (iii) centrifugar la suspensión obtenida en el paso (ii) a 15000 G - 35000 G a 4°C durante diez minutos para obtener un comprimido; (iv) resuspender el comprimido obtenido en el paso (iii) en SLF para obtener una suspensión de concentración de 0.5 mg/ml a 10 mg/ml; y (v) filtrar la suspensión obtenida en el paso (iv) a través de filtro de policarbonato de 0.5 p - 5 p para obtener un tamaño de partícula uniforme de las micropartículas formadas.

13. El uso de la formulación de micropartículas comprendiendo un compuesto de la fórmula I y un lípido biodegradable para la administración del fármaco, caracterizado porque la proporción del compuesto de la fórmula I a lípido es de 1:15 a 1:25 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tuberculosis pulmonar, tuberculosis resistente a múltiples fármacos, neumonías por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, y neumonías por Staphylococcus aureus sensible a la meticilina.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porgue dicho uso del medicamento está enfocado a los macrófagos alveolares.

15 . El uso de la formulación de micropartículas comprendiendo el compuesto de la fórmula I y un lipido biodegradable para la administración de fármacos, caracterizado porque la proporción del compuesto de la fórmula I a lipido es de 1 : 15 a 1 : 25 para la fabricación de un medicamento en donde dicho medicamento es administrado a un mamífero por inhalación o instilación intratraqueal para su administración pulmonar.

16 . El uso de conformidad con la reivindicación 15 , caracterizado porque el medicamento es administrado por inhalación .

17 . El uso de conformidad con la reivindicación 16 , caracterizado porque la administración del medicamento por inhalación se hace por nebulización, en la que el compuesto de la fórmula I contenido en el medicamento está encapsulado en micropartículas.

18 . El uso de conformidad con la reivindicación 17 , caracterizado porque el compuesto de la fórmula I contenido en el medicamento administrado por inhalación, es retenido en los pulmones durante un periodo de 24 horas.

19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la retención del compuesto encapsulado de la fórmula I varía del 30% al 70%.

20. El uso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la dosis para los rangos de inhalación varía entre 0.05 y 10 mg/kg peso corporal/día .