MX2013001399A - Composicion nematocida que comprende bacillus subtilis y bacillus licheniformis. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición que comprende Bacillus subtilis (DSM 17231) y Bacíllus licheniforrnis (DSM 17236) con efecto nematicida contra fitonemátodos sobre plantas y/o su hábitat, a su uso y proceso para su preparación, uso de Bacíllus subtilis (DSM 17231) y Bacillus licheniformis (DSM 17236), procesos para controlar, combatir y conferir resistencia específica a fitonemátodos, y un equipo.

Description

COMPOSICION NEMATOCIDA QUE COMPRENDE BACILLUS SUBTILIS Y BACILLUS LICHENIFORMIS Campo de la Invención La presente invención se refiere a una composición que comprende Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis con efecto nematicida contra fitonemátodos en plantas y/o su hábitat, a su uso, a un proceso para su preparación, al uso de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis; a procesos para controlar, combatir y/o conferir resistencia específica a fitonemátodos , y a un equipo. Particularmente, la invención se refiere a Bacillus subtilis (DSM 17231) y Bacillus licheniformis (DSM 17236) .

Antecedentes de la Invención La intensificación de la actividad agrícola ha causado un desequilibrio ecológico, haciendo necesario el uso de productos selectivos que no afecten el equilibrio entre las plagas y sus predadores, parasitoidés y patógenos, responsables por mucho del control biológico natural, puesto que retienen los niveles de población de plagas aceptables (DENT, D., insect pest management. Cambridge: Cabi Bioscience 2000) .

Con el fin de revertir esta situación, se recomienda desarrollar programas para el manejo de plagas integrado, definido como un sistema de decisión para el uso Ref. 238802 de tácticas de control, individualmente o combinadas armoniosamente en una estrategia de manejo en base a costo / beneficio que toma en cuenta el interés y/o impacto sobre los agricultores, sociedad y medio ambiente. Entre las medidas de control disponibles para estos sistemas de manejo están los nematodos entomopatogénicos y parasitoides de insectos, que cubren diferentes áreas del control de plagas biológico.

En el contexto actual de una sociedad moderna y ecológica, que está relacionada con preservar el ambiente, el control biológico se considera una alternativa y/o suplemento atractivo a los métodos convencionales de control. El control biológico es el uso de un organismo (predador, parásito o patógeno) que ataca a otro organismo que está ocasionando daño económico a los cultivos. Esta es una estrategia muy común en los sistemas agro ecológicos, , así como en la agricultura convencional que depende del Manejo de Plaga Integrado (MIP) .

Aunque el control biológico origina respuestas positivas en la reducción o retiro del uso de pesticida y el mejoramiento de la entrada o utilidad del agricultor, el análisis del conjunto de experimentos mundialmente, muestra que los resultados todavía se concentran en solamente unos cuantos cultivos. Todavía hay mucho por desarrollar en las áreas de control de plagas y enfermedades .

Ha existido un gran énfasis sobre la investigación en el control biológico con el uso de bacterias que colonizan las raíces de las. plantas, llamadas rizobacterias . Las rizobacterias benéficas para promover el crecimiento y/o actuar en el control biológico de bacterias patogénicas de plantas se llaman rizobacterias promovedoras del crecimiento de las plantas o (PGPR, por siglas en ingles) . Las PGPR incrementan la disponibilidad de los nutrientes a la planta y puede producir combinaciones y concentraciones de sustancias que promueven el crecimiento. Sin embargo, el efecto mayor de estas rizobacterias es suprimir los patógenos de las plantas perjudiciales al crecimiento de estas plantas. La inhibición de bacterias perjudiciales es a través de la producción de sideróforas, sustancias que actúan bajo condiciones de baja disponibilidad de fósforo al reducir el fósforo disponible a otros microorganismos de rizosfera o la producción de antibióticos .

La presión de la sociedad para reemplazar los nematicidas con productos ambientalmente aceptables o técnicas ecológicas . ha favorecido la investigación por métodos alternativos para controlar nemátodos . En este contexto, el control biológico se ha considerado como una de las alternativas dentro de un procedimiento integrado, en el cual se busca asegurar el desarrollo sostenible de la agricultura. El uso de enemigos naturales ha llegado a ser un campo de investigación, que pueden actuar para reducir las poblaciones de neraátodos abajo del nivel de umbral del daño económico .

Los riesgos a humanos y los ambientes presentados al utilizar pesticidas sintéticos hacen énfasis de la necesidad por herramientas tal como el control biológico en optimizar los sistemas agrícolas sostenibles.

La Solicitud de Patente Europea EP 0705807A1 se refiere a una preparación bacteriana para acondicionar el suelo que comprende bacterias que pertenecen al género Bacillus, tales como Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis . La preparación puede prevenir las lesiones a las raíces de los cultivos causadas por los nemátodos .

La Solicitud de Patente de Brasil BR PI 0604602-9A se refiere al uso de Bacillus subtilis en conjunción con Bacillus licheniformes para el control de fitonemátodos .

Siddiqui y Mahmood (1999) describen la función de las bacterias en el manejo de nemátodos parasíticos de plantas que muestran que Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis puede ser útil contra fitonemátodos, tales como Meloidogyne spp. , Heterodera spp. y Rotylenchulus .

Breve Descripción de la Invención Los inventores de la presente invención han procedido con la clasificación e investigación extensivas con el fin de resolver el objetivo de proporcionar métodos biológicos para controlar nemátodos en base a la identificación de dos cepas de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis de tipo silvestre, que son particularmente capaces de reducir las lesiones a las raíces de los cultivos causadas por los nemátodos .

Breve descripción de las figuras Figura 1 - Flujo de las condiciones de operación de los procesos de fabricación del mezclado.

Figuras 2A-2C Porcentaje de inhibición del movimiento de los microorganismos juveniles después del efecto de los productos biológicos. Figura 2A: Meloidogyne incógnita, Figura 2B: M. javanica, Figura 2C: M. paranaensís .

Figuras 3A-3C Porcentaje de inhibición de la incubación después del efecto de los productos biológicos . Figura 3A: Meloidogyne incógnita, Figura 3B: M. javanica, Figura 3C: M. paranaensís .

Figura 4 - Número promedio de microorganismos juveniles de segunda etapa de Meloidogyne exigua penetrados, porcentajes de penetración e inhibición de la penetración en raíces de tomate. 'Santa Cruz Kada Gigante', tres semanas después de la inoculación.

Descripción detallada de la invención Rizobacterias Los suelos o tierras son hogares para una comunidad biológica compleja, de los cuales los microorganismos, procariotas y eucariotas forman una mayoría, tanto en número como en diversidad. Algunas procariotas tienen nichos ecológicos como la rizósfera y/o el rizoplano de plantas, donde se multiplican, sobreviven y se protegen por si mismos del resto de la acción antagonística de la microflora del suelo. Estos microorganismos se han llamado genéricamente rizobacterias .

En la asociación con las plantas, la rizobacterias puede tener un efecto perjudicial, nulo o benéfico. Aquellos quienes ejercen un efecto benéfico - promoción del crecimiento y control biológico de- la enfermedad - son llamados PGPR (siglas en inglés para "Rizobacterias que Promueven el Crecimiento de Platas"). Se estima que solamente 0.6% de rizobacterias tienen algún efecto benéfico para la planta con la cual están asociados.

PGPR como agentes de biocontrol PGPR se ha utilizado para el control biológico de enfermedades de plantas y de esta manera incrementar la productividad de cultivos. Cómo y porqué este control biológico es ejercido, es todavía un tema que necesita estudios complementarios.

En algunas situaciones, es posible, que el control biológico se presente mediante el antagonismo directo ejercido por PGPR contra el patógeno, con involucramiento de los mecanismos conocidos de antibiosis: producción de sustancias antimicrobianas, parasitismo directo, competición por nutrientes y nichos ecológicos. La investigación ha mostrado que ciertos PGPR se presentan para actuar como un inductor de ISR (por sus siglas en ingles) (resistencia sistémica inducida) , en el sentido de que la planta llega a ser sistémicamente protegida contra más de un patógeno, distinto al control biológico clásico, que se dirige a implementar el control más específicamente.

Cuando PGPR coloniza el sistema de raíces, las moléculas constituyentes de la célula bacteriana o sintetizada por este actúan como inductores de una señal bioquímica. Esta señal es localizada a sitios distantes del sitio de su origen. Los genes que codifican para la síntesis de los componentes de la distancia dinámica son deshabilitados y expresados en la resistencia sistémica inducida.

Algunas rizobacterias producen metabolitos tóxicos que afectan el movimiento de los nemátodos in vi tro, mientras que otros inhiben la incubación de microorganismos juveniles y el proceso mediante el cual penetran a las raíces.

Efecto de la rizobacterias sobre nemátodos parasíticos de plantas El control que la rizobacterias ejercen sobre los nemátodos se puede implementar en varias maneras y puede afectar diferentes fases del ciclo de vida del nematodo: - Huevecillo: los antibióticos y toxinas producidas por las bacterias en la rizosfera se difunden en el suelo y se pueden absorber por los huevecillos de los nemátodos, para exterminar las células y prevenir su desarrollo embriónico. - Incubación: las rizobacterias degradan los exudados de la raíz que actúan como factor de incubación para muchas especies de nemátodos y por lo tanto hay la posibilidad de que los compuestos absorbidos por el huevecillo del nematodo se inactiven o causen deformación durante el desarrollo que previene la incubación.

- Dirección y movilidad: La transformación de los exudados de las raíces en los subproductos metabólicos de rizobacterias puede causar que los nemátodos simplemente no reconozcan el estímulo quimiotrópico, de esta manera continuarían moviéndose aleatoriamente, y eventualmente para agotar sus reservas de energía y morirían sin entrar a la raíz. Si el nematodo reconoce los exudados de la raíz y se mueve hacia las raíces, algunos productos bacterianos pueden presentar características nematostáticas y reducir la movilidad del nematodo para impedir que alcance la raíz .

- Reconocimiento del huésped: las sustancias producidas por la rizobacterias se absorben por las raíces y puede alterar su composición química, lo que causa que los nemátodos no reconozcan su huésped. También se cree que la rizobacterias enlazan a la lectinas sobre la superficie de las raíces, caracterizadas por ser el sitio de enlace entre el nematodo y su huésped de planta, para de esta manera prevenir el reconocimiento.

- Penetración en la raíz: la toxina o repelente producido por rizobacterias en alta concentración en la región del rizoplano o en el contenido celular de la .epidermis de las raíces, pueden desfavorecer la penetración de los nemátodos en la planta huésped.

- Alimento: las rizobacterias, o sus productos metabólicos, se pueden absorber por la planta y posteriormente percibir la presencia del nemátodo, activar una reacción de hipersensibilidad en las células gigantes, que es el mecanismo principal de la resistencia del huésped a los nemátodos tal como el género Meloidogyne. Esta resistencia, llamada resistencia sistémica, no es intrínseca a la planta, es decir, una reacción que es inducida en está por la presencia de PGPR.

- Reproducción: Algunas rizobacterias tienen un efecto mas grande sobre la reducción de los huevecillos que en la reducción del número de agallas, este puede ser uno de los mecanismos de operación.

El ambiente de la rizosfera Uno de los métodos más convenientes de introducir una rizobacteria en el ambiente de la raíz es a través de la aplicación en las semillas antes del sembrado. El proceso de germinación de las semillas libera carbohidratos y aminoácidos en abundancia en la forma de exudados de la semilla. Así, estos microorganismos introducidos con las semillas en el suelo utilizan los exudados como una fuente de nutrición y colonizan las raíces a medida que emergen. Los aislados de Rizobacterias que tienen habilidad más grande para utilizar los exudados de raíz de las semillas pueden tener ventaja selectiva en la colonización de las raíces.

Las rizobacterias del género Bacillus se han asociado con el control del nemátodo. Sikora, R.A. (Interrelationship between plant health promoting rhizobacteria, plant parasitic nematodes and soil microorganisms . Medicine Faculty Landbouww Rijksuniv Gent, Landbouww, v.53, n.2b, p. 867-878, 1988) observaron reducciones en la infección de Meloidogyne arenaria, M. incógnita y Rotylenchulus reniformis alrededor de 60-65% con el tratamiento de semilla de varios cultivos con una cepa de Bacillus .

Ventajas de la rizobacterias para aplicación comercial Las rizobacterias tienen un número de ventajas sobre los nematicidas o aún en otros agentes de control biológicos: son fáciles de producir en masa, son fáciles de almacenar, son adaptables a la tecnología dé la formulación y no requieren manipulación genética.

Las rizobacterias se pueden aplicar al tratar el substrato, al sumergir los sistemas de raíz de plántulas en suspensiones bacterianas, al suministrar agua a la planta con suspensión bacteriana al sumergir las semillas en suspensión de rizobacterias o al aplicar PGPR con la formación de pelotillas de semillas en alginato.

Bacterias del género Bacillus Las especies de Bacillus son bacterias Gram-positivas caracterizadas por tener paredes celulares gruesas y la ausencia de membranas exteriores, que difieren de las bacterias Gram-negativas . Muchas de las paredes de las bacterias Gram-positivas están compuestas de peptidoglicano .

Las especies Gram-positivas se dividen en dos grupos de acuerdo con sus características morfológicas y bioquímicas. El género Bacillus es perteneciente al grupo de bacterias esporuladas. Las especies con la estructura formadoras de esporas que son resistentes a los cambios ambientales, sostienen el calor seco y ciertos desinfectantes químicos durante períodos moderados de tiempo. Persisten por años en tierra seca.

Uso de Bacillus spp. en el control de nemátodos Los nemátodos son responsables para. varias pérdidas en la producción agrícola. Las pérdidas estimadas están alrededor de $ 100 billones por año mundialmente en cultivos económicamente importantes.

El uso de variedades de cultivo resistentes a nemátodos no siempre es posible debido a la carencia de fuentes de resistencia para reproducción, falta de adaptabilidad de las variedades de cultivo resistentes a ciertas regiones y estaciones de plantación, o la ruptura de la resistencia en las condiciones de campo. El control químico de los nemátodos generalmente no se recomienda debido a que no es muy efectivo, es costoso, debido a que el desecho se deja en el alimento y causa la contaminación ambiental. Debido a estas desventajas, hay una presión incrementada de la sociedad para restringir el uso de sustancias químicas que de por resultado una demanda por los agricultores para productos que sean al mismo tiempo, no tóxicos a humanos y animales, baratos y de control muy efectivo de nemátodos.

Muchos microorganismos del suelo son conocidos como parásitos o predadores de nemátodos. La acción de estos microorganismos puede resultar de efecto directo o indirecto a través de la interferencia con las etapas en el ciclo de vida del patógeno.

Bacillus subtilis El efecto beneficioso de B. subtilis, cuando se aplica cerca de la semilla o el suelo, no es solamente debido al antagonismo proporcionado a los patógenos. La bacteria tiene una influencia positiva sobre la germinación, desarrollo y rendimiento de cultivo debido a también la producción de sustancias que promueven el crecimiento y el mejoramiento en la nutrición de plantas mediante la solubilizaclón de fósforo.

Género Meloidogyne Los nemátodos del género Meloidogyne (neraátodos de nudo de raíz) exhiben gran diversidad sobre los huéspedes de plantas y se presentan en varias regiones del globo, lo que causa pérdidas en diferentes cultivos. El síntoma principal es la presencia de agallas sobre las raíces de la planta. Estas agallas son malformaciones o engrosamiento del sistema de raíz. Las plantas afectadas muestran gran debilidad, tienen baja producción, desfoliación temprana y declinación prematura, y ocasionalmente pueden ser la muerte de la planta, con síntomas potencializados bajo condiciones de estrés de nutrientes y sequía.

Inicialmente los microorganismos juveniles de segunda etapa (J2) de Meloidogyne penetran en la raíz y establecen un sitio de alimentación en la región del cilindro central de las raíces. A través del desarrollo de los nemátodos, los J2 se diferencian en adultos machos o hembras. Los machos adultos, dejan el sistema de raíz y las hembras permanecen en las raíces. Durante el desarrollo de Meloidogyne hembra aproximadamente 500 huevecillos son depositados. Ellos se depositan en una matriz gelatinosa fuera de las raíces de la cual incuba el J2, y de esta manera re-infectar en el sistema de raíz. El ciclo de vida de los nemátodos de nudo de raíz son aproximadamente cuatro semanas y puede prolongarse bajo condiciones de temperatura menos favorables. Las temperaturas abajo de 20 °C o arriba de 35 °C y las condiciones de sequía o carencia de agua del suelo reducen el desarrollo y supervivencia del nematodo.

El control de Meloidogyne incógnita y M. javanica se puede hacer con el uso de sustancias químicas que contienen ciertos ingredientes activos tal como carbofurano, etoprofos, aldicarb, metam-sodio o fenamifos, entre otros, dependiendo del cultivo en cuestión. La práctica de rotación de cultivos también es importante en el control debido al despliegue de cultivos no huéspedes tales como cacahuetes, piña, arroz o uso de especies de plantas a medida que la tierra cubre también al no huésped tales como avenas .

El nematodo Meloidogyne exigua es muy agresivo y es muy difundido en las plantaciones. Diferentes métodos de control químico en áreas infestadas por . exigua, incluyen el uso de sustancias químicas que contienen cualquiera de los ingredientes activos terbufos o carbofurano, dependiendo de la clase de cultivo. Entre los cultivos no huéspedes, se encuentran el algodón, cacahuates, arroz y avena.

Similar a M. exigua, M. paranaensis se difunde en el cultivo de café, pero no es mucho de un problema en otros cultivos. En cuanto a su control, resultados positivos se han obtenido por el hongo Paecilomyces lilacinus, y esto redujo la población de nemátodos en las raíces del tomate "Santa Clara" en el invernadero.

El uso de rizobacterias con relación al control biológico ya es conocido. Sin embargo, el solicitante actualmente desarrolló una composición que ' comprende dos especies de Bacillus, específicamente: Bacillus subtilis DSM 17231 (también conocido como DSM 5750) o un mutante del mismo y Bacillus licheniformis DSM 17231 (también conocido como DSM 5749) a un mutante del mismo con efecto nematicida contra fitonemátodos en un cultivo de planta.

Así, el primer aspecto de la invención se refiere a las cepas novedosas descritas en la presente o mutantes de las mismas.

Es claro para la persona experta que al usar cepas depositadas como material de partida, el lector experto puede mediante las técnicas de mutagénesis convencional o técnicas de aislamiento rutinariamente obtener mutantes adicionales o derivados de los mismos que retienen en la presente las características y ventajas relevantes descritas. Por consiguiente, el término "un mutante del mismo" del primer aspecto se refiere a cepas mutantes obtenidas al utilizar la cepa depositada como material de partida.

Los fitonemátodos se consideran ampliamente a cualquier nemátodo que tiene un impacto negativo sobre los cultivos comerciales . Los nemátodos que se pueden combatir utilizando la composición de la presente invención incluyen nemátodos del género: Meloidogyne, Pratylenchus, Heterodera, Globodera, Ditylenchus, Tylenchulus, Xiphinema, Radopholus, Rotylenchulus, Helicotylenchus y Belonolaimus . Las especies del género Meloidogyne se consideran de relevancia particular ya que son responsables de alrededor del 95% de todas las infecciones en cultivo lo que causa aproximadamente 5% de todas las pérdidas de cultivo mundialmente . La composición de la presente invención, además de los componentes activos, puede contener excipientes aceptables agroquímicos y/o vehículos de los mismos. La composición de la invención además comprende portadores, vehículos y/o adyuvantes agroquímicamente aceptables.

La composición de esta invención particularmente sirve para combatir nemátodos en plantas de cultivo.

Entre los cultivos principales de plantas están la caña de azúcar, café, sojas, algodón, maíz, papas, tomates, tabaco, plátano, arroz, trigo, aguacate, piña, calabaza, cacao, coco, avena, cebolla, lechuga, betabel, zanahoria, casaba, frijoles, girasol, pimiento, ajo, manzana, fresa, okra, rábano y cebolla.

Con respecto a la fruticultura: los cítricos, uva, guayaba, papaya, higo, durazno, ciruela y néspera son de relevancia particular y con respecto a la horticultura: la berenjena y cruciferas.

Con respecto a la floricultura: rosa, crisantemo, lisiantus, gerbera, amaryllis, begonias y celosía.

La presente invención se refiere a una composición que comprende Bacillus subtilis DSM 17231 o un mutante del mismo y Bacillus licheniformis DSM 17236, un mutante del mismo, y a un kit que comprende la composición, o preparado por el proceso para preparar la composición, así como instrucciones en un recipiente adecuado.

Un proceso para preparar una composición que comprende Bacillus subtilis DSM 17231 o un mutante del mismo, y Bacillus licheniformis DSM 17236 o un mutante del mismo, junto con portadores, vehículos y/o adyuvantes agroquímicamente aceptables, y el uso de la composición para controlar, combatir y/o conferir resistencia específica a fitonemátodos también es proporcionado.

Además, la invención se refiere al uso de cantidades efectivas de Bacillus subtilis DSM 17231 o un mutante del mismo y Bacillus licheniformis DSM 17236 o un mutante del mismo, en la elaboración de una composición agroquímica con efecto nematicida contra fitonemátodos en un cultivo de plantas, así como procesos para controlar, combatir y/o conferir resistencia específica a fitonemátodos .

Los ejemplos ilustrativos presentados enseguida, sirven para mejor describir la presente invención. Sin embargo, las formulaciones descritas meramente se refieren a algún medio de algunas modalidades de la presente invención y no se deben tomar como limitantes del alcance de la misma. EJEMPLOS Composición de la invención Bacillus subtilis (DSM 17231) : 1.6 x 1010 ufc/g Bacillus licheniformis (DSM 17236): 1.6 x 1010 ufc/g composición se puede emplear como pol humectable. Sin embargo, la composición también se puede proveer en cualquier otra forma, por ejemplo, como un polvo, solución, suspensión, granulos, etc.

Condiciones de operación de los procesos de elaboración por mezclado ·.

Ingredientes / materiales de primer plano: La recepción se lleva a cabo por el personal entrenado para la verificación y chequeo de los artículos recibidos. De acuerdo con los objetivos de producción, una lista de ingredientes y sus cantidades se expide y la información se envía a la f brica .

Pesaje de ingredientes / materiales: los • ingredientes se reciben en la fábrica, se pesan y se colocan en un mezclador de acero inoxidable.

Mezcla : Los ingredientes se mezclan al seguir el tratamiento descrito en SOP, por sus siglas en inglés (procedimiento de Operaciones Estándar) .

Análisis : Las muestras se recolectan para el conteo del número de colonias en CFU / g.

Colocación en frasco: El producto se empaqueta en bolsas con papel kraft de protección interna que contiene 20 kg o macetas de plástico de polietileno que contienen 1.0 o 5.0 kg.

Cerramiento : Las bolsas se sellan y se fijan con grapas. .Las macetas se sellan con una tapa y se pasan a través de la inducción magnética.

Colocación en tarimas : Aún en el empaquetamiento en la fábrica se colocan en tarimas de madera esperando la revisión por el Control de Calidad (QC, por sus siglas en inglés) .

Acumulación: El producto final se almacena, se sella y se identifica apropiadamente. Cada lote se registra en un programa electrónico, disponible a todos los operadores en cada sector de interés .

Despacho : Una vez liberada por el QC, el producto permanece almacenado en el almacén de despacho al momento de la venta.

Este flujo se muestra en la Figura 1.

Pruebas in vitro: Prueba 1 Obj etivo : evaluar el efecto in vitro de los productos biológicos en base a la bacteria Bacillus en el control de nemátodos, específicamente, Meloidogyne incógnita, M. javanica, M. y paranaensis .

Material y Métodos : Los inventores estudiaron tres especies de fitonemátodos del género Meloidogyne: M. incógnita, M. javanica, M. paranaensis y dos productos biológicos en dos diferentes dosis: un producto Japonés en base a una especie de Bacillus y el producto Nemix® compuesto de Bacillus subtilis y Bacillus lichenifor is lactosa al 97.8% y dióxido de silicio. El nematicida utilizado como un estándar de efectividad fue 150G Temik® (aldicarb) , cuyas características son : - Marca comercial: Temik® 150 - Registrante: Bayer CropScience Ltda.

- Grado (s) : Miticida - insecticida -. nematicida - Formulación: GR - Granular - Ingrediente (i. a) (es decir) aldicarb - Concentración de i. a..: 150 g/Kg.

- Método de Aplicación: terrestre - Modo de Empleo: suelo - Clasificación Toxicológica : I - Extremadamente tóxico El experimento tuvo seis tratamientos: - Agua: control absoluto; - P1D2 : producto Japonés en una dosis de 2 kg. ha"1; 5 - P1D4 : producto Japonés en una dosis de 4 kg. ha"1; - Producto Nemix en una dosis de 2 kg. ha"1; - Producto Nemix en una dosis de 4 kg. ha"1; - Nematicida aldicarb (Temik® 150G) en una dosis de 15 kg. ha"1.. !0 Prueba para evaluar los productos en la actividad del nemátodo : Obtención de microorganismos juveniles de 2a etapa de Meloidogyne Raíces de café y de tomate infectadas por la !5 especie Meloidogyne se lavaron para remover el exceso de tierra adherida a estos, se cortaron y se procesaron por la técnica del mezclador (BONETI, J.I.S. & FERRAZ, S.: Modifica áo de método de Hussey e Barker párrafo extragao de ovos de Meloidogyne exigua de Raizes de cafeeiro. 20 Fitopatología Brasileira, Brasilia, DF, v.6, n.3, 553p, 1981) .

Las raíces se cortaron en fragmentos de aproximadamente 1 cm de largo, se colocaron en una mezcladora, se rellenaron con una solución de hipoclorito de 25 sodio 0.5% de cloro activo para cubrir el material. La mezcladora se puso en funcionamiento en su velocidad más baja durante 40 segundos en promedio. Luego la suspensión obtenida se pasó a través de un tamiz de malla 100 sobrepuesto sobre una malla 500. El desecho se recolectó de un tamiz de malla 500 con la ayuda de chorro de agua de una compresión para un vaso de Becker, cuidadosamente de modo que el volumen final es tan concentrado como sea posible.

Las suspensiones se centrifugaron durante 5 min a una velocidad de 650 gravedades. Cuidadosamente, el sobrenadante se desechó y la pared interior del tubo de centrifuga se limpió para remover las impurezas orgánicas.

Al residuo de cada tubo se adicionó una solución de sacarosa (de una concentración de 454 g de azúcar a un litro de agua) , se mezcló bien y la centrífuga se puso en funcionamiento a la misma velocidad durante 1 minuto como es descrito en lo anterior.

El sobrenadante se vació a través de un tamiz de malla 500, se lavó con agua para remover la sacarosa en exceso y se recolectó con la ayuda de chorros de agua desde una piseta en un vaso de Becker.

Cajas Petri con un diámetro de 5 cm tuvieron dentro una capa contenedora de nylon de papel de seda facial. La suspensión de huevecillos se adicionó sobre la capa de papel de seda y las cajas Petri se colocaron en una incubadora a 30°C durante 24 horas. Después de 24 horas la criba con el papel de seda se suspendió mediante la ayuda de fórceps y el fluido dentro de la caja Petri se removió a una placa Becker y se lavó con agua. La criba se reemplazó con una placa de papel y se adicionó agua. Las placas permanecieron en la incubadora durante 48 horas.

Después de 48 horas, las cribas se removieron y el líquido recolectado con la ayuda de chorros de agua de una piseta para un vaso de Becker. La suspensión se calibró para contener 250, 50, 20 y 100 microorganismos juveniles de segunda etapa / mL de Meloidogyne incógnita, M. javanica, M. y paranaensis para el ensamblaje de la prueba in vitro, respectivamente .

Instalación y evaluación in vitro Las cajas . Petri con un diámetro de 11 cm que contienen una capa de agua-agar 2% recibieron 1 mL de la suspensión de microorganismos juveniles de segunda etapa y 1. mL de cada tratamiento que es probado: solución de agua destilada Temik® 150G (nematicida) ; solución de producto Japonés basado en Bacillus en dos concentraciones; solución Nemix del producto en dos concentraciones. Con giro, los dos mL se mezclaron completamente. Las placas se mantuvieron en la incubadora a 30 °C durante 7 días.

Después de 7 días, cada placa se examinó bajo un vidrio de aumento para la verificación y el conteo de partidas de nematodos .

Prueba para evaluar la inhibición de la incubación de Meloidogyne juvenil de segunda etapa Raíces de tomate y café se prepararon para la mezcladora (BONETI, J. I. S.; FERRAZ , S.: Modificagáo de método de Hussey e Barker para extragao de ovos de Meloidogyne exigua de raizes de cafeeiro. Fitopatología Brasileira, Brasilia, DF, v.6, n.3, 553p., 1981), previamente descrita en la sección "Obtención de microorganismos juveniles de segunda etapa de Meloidogyne" .

Las suspensiones se calibraron para contener 1500 huevecillos / mL, 100 huevecillos / mL, 500 huevecillos / mL y 200 huevecillos / mL de M incógnita, M. javanica, M. y paranaensis respectivamente.

Instalación y evaluación in vitro Cajas Petri con un diámetro de 5 cm, que contienen en su interior tela de nylon con una capa de papel de seda humedecida, recibieron 1 mL de cada tratamiento que es probado y 1 mL de la suspensión de huevecillos. Las placas se mantuvieron en una incubadora a 30 °C durante 7 Días.

Después de 7 días, las cribas se removieron y el líquido de cada placa se recolectó, utilizando chorros de agua desde una piseta a un cristal.

Cada suspensión se examinó bajo el microscopio con la ayuda de una cámara de conteo para la verificación y conteo de J2 de Meloidogyne.

Diseño y análisis estadístico El experimento fue un diseño completamente aleatorio con seis tratamientos y cinco replicas para cada nematodo. Cada caja Petri fue la unidad experimental.

Los datos se sometieron al programa de procedimientos estadísticos Sisvar (FERREIRA, D.F: Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows Versáo 4.0. In: REUNIÁO ANUAL DA REGIÁO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45, 2000, Sao Carlos: UFSCar, 2000, p. 255-258, 2000) . En el análisis estadístico, los datos se sometieron al análisis de variación y las medias comparadas por la prueba de Scott-Knott en 5% de probabilidad. (Los resultados que no muestran diferencia estadísticamente significante se marcan con letras minúsculas idénticas en las figuras) .

En la evaluación del efecto de los pesticidas o plaguicidas en el control de nematodos, se calcularon el porcentaje de inhibición de movimiento y el porcentaje de inhibición de incubación de los microorganismos juveniles. La fórmula utilizada en calcular estos porcentajes fue como sigue : (B-A) x 100 donde: B A = número de nemátodos activos o incubados en cada repetición de cada tratamiento.

B = número de nemátodos utilizados en el ensayo para evaluar la inhibición de movimiento o la inhibición de la incubación. Resultados y Discusión Las Figuras 2A-2C y 3A-3C ilustran el efecto inhibidor de diferentes nematocidas sobre los movimientos (Figuras 2A-2C) e incubación (Figuras 3A-3C) de los nemátodos M. incógnita (A) , M. javanica (B) y M. paranaensis (C) .

Los datos presentados en la Figura 2A ilustran que solamente el nematicida Temik® difirió significantemente de otros tratamientos que caracterizan el mejor efecto de mortalidad e inhibición de incubación de M. incógnita juvenil. Al considerar la inhibición de incubación de los juveniles, se observó que el tratamiento no difirió del control y solamente al tratamiento químico con Temik® redujo la incubación.

Para la inhibición de Meloidogyne javanica no se observó . diferencia significante entre los productos biológicos probados y Temik®, lo que muestra que los productos biológicos tuvieron efecto satisfactorio en la inhibición del movimiento del nemátodo (Figura 2B) . El efecto en la incubación no fue significante y solamente el producto químico Temik inhibió la incubación (Figura 3B) .

Para la inhibición de Meloidogyne paranaensis la dosis de Nemix de 4 kg ha-1 dio un resultado significativamente igual al nematicida (Figura 2C) . Después, están los productos Japoneses en dosis de 2 y 4 kg ha-1 y Nemix tiene una dosis de 2 kg ha-1, y todos los productos orgánicos tuvieron efecto más grande que el tratamiento de control. Al considerar la inhibición de la incubación de microorganismos juveniles, el producto Nemix con, dos dosis tuvo efectos similares que muestran los mejores resultados entre los productos biológicos probados (Figura 3C) . Todos los productos probados difirieron del control absoluto y el efecto nematicida fue superior a todos los otros tratamientos .

Los productos Temik® y Nemix en una dosis de 4 kg ha-1 fueron los más efectivos y no difirieron significantemente con respecto a la mortalidad de M. parananensis . Al considerar la inhibición de incubación, Temik® difirió significantemente de los otros tratamientos que son superiores a estos. Sin embargo, el producto Nemix fue más efectivo que el producto Japonés (Figura 3C) .

Así, la composición Nemix mostró una inhibición significante de los nemátodos M. javanica y M. paranaensis con una inhibición comparable al producto químico Temik.

Prueba 2 Objetivo: evaluar la penetración de Meloidogyne javanica en raíces de tomate en relación a diferentes dosis del producto biológico Nemix que comprende Bacillus subtilis y Bacillus lichenifor is, bajo condiciones de invernadero. Obtención del inoculo La obtención del inoculo se hizo del procesamiento de las muestras de raíces de café infectadas por M. javanica . Las muestras se tomaron del Laboratorio de Nematología Agrícola del Instituto de Ciencias Agrícolas y para el procesamiento, las raíces se desmenuzaron en fragmentos de 2 cm y se colocaron en un vaso mezclador domestico que contiene solución de hipoclorito de sodio (1 parte de blanqueador: 4 partes de agua) .

La solución se giró durante 20 segundos. Después de este período, la suspensión pasó a través de un conjunto de tamices, de malla 200 y 500, respectivamente, sobrepuestos. El residuo del tamiz de malla 500 se recolectó, con la ayuda de un exprimidor con agua a un vaso de laboratorio . La suspensión obtenida se calibró para contener 800 huevecillos de nemátodo . mL"1.

Instalación y prueba de impulsión El diseño experimental fue el diseño completamente aieatorizado con cinco tratamientos y cinco réplicas.

La variedad de cultivo de tomate utilizada fue 'Santa Cruz Kada Gigante' , con las dosis utilizadas con el producto biológico Nemix de 4, 6 y 8 kg ha-1. El nematicida aldicarb (TEMIK® 20 G 150 kg ha-1) se utilizó como una verificación y control estándar sin ningún producto de tomate y el nemátodo parasítico de planta M. javanica para la penetración estándar.

Las semillas de la variedad de cultivo de tomate 'Santa Cruz ada Gigante' se sembraron en charolas de estiroespuma de 128 celdas llenadas con ' el sustrato Plantmax®. Para la inoculación, tres agujeros se abrieron con profundidad de 2 cm y se espaciaron 2 cm desde el tallo de la plántula. En estos tres agujeros se distribuyeron la suspensión de 5 mi del inoculo calibrado en suspensión de 5 mi (4000 nemátodos / vaso de plástico) . Poco tiempo después, las dosis de los productos se adicionaron en vasos de plástico pequeños en perforaciones abiertas alrededor de cada plántula.

Evaluación de la penetración del microorganismo juvenil de segunda etapa de M. ja.va.nica en raíces de tomate La evaluación se hizo después de 3 semanas de inoculación, donde las raíces después de cortar los retoños y la separación de la tierra, se prepararon para el manchado de los nemátodos en tejidos de planta (Byrd Jr . Y colaboradores, An improved technique for clearing and staining plant for detection of nemátodos. Jounal of Nematology, Lakeland, v. 5, n. 1, p. 142-143, 1983) . Las raíces se fracturaron en piezas de 1-2 cm, y se transfirieron a un vaso Becker 50 mL de agua al cual se adicionaron 20 mL del blanqueador comercial (NaOCl a 5.25%), que dio por resultado una concentración final de NaOCl a 1.5%. Los segmentos de raíz permanecieron durante 6 min en esta solución, para promover una agitación manual de 10 s intervalos de 1 min. Las raíces se lavaron bajo agua fluyente durante 30 a 45s y. se mantuvo en reposo durante 15s en agua para remover el hipoclorito de sodio residual.

Luego, hubo el drenado completo y se adicionaron 30 mL de agua destilada más 1 mL de solución de tinte (3.35 g de ácido fuchsin + 25 mL de ácido acético glacial + 75 mL de agua style) . Las raíces de esta solución se calentaron al punto de ebullición, dejándolo durante 30 segundos en ebullición, y prontamente después de que el recipiente se colocó en el contador para alcanzar la temperatura ambiente. Subsecuéntemente, la solución de tinte se removió, lo que permaneció, y el material se lavó en agua potable y se colocó en 20-30 mL de glicerina acidificada con pocas gotas de HC1 5N. Los segmentos de raíz se prensaron entre las platinas de microscopio y se observaron en microscopio óptico. Los microorganismos de segunda etapa juveniles que penetraron las raíces se contaron.

Análisis estadístico Los datos se sometieron al programa de procedimientos analísticos SISVAR (FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows versáo 4.0. In: REUNIÁO ANUAL DA REGIÁO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA. , 45, 2000, Sao Carlos: UFSCar, 2000, p. 255-258, 2000) . En el análisis 'estadístico, las medias se compararon mediante la prueba de Tukey en 5% de probabilidad.

Resultados y Discusión A partir de los datos presentados en la Tabla 3 se presenta que la penetración de microorganismos juveniles de segunda etapa de M. javanica fue afectada en todos los tratamientos cuando se comparó con el control sin ningún producto. El tratamiento con el producto aldicarb a 20 kg ha-1 mostró la penetración más baja. De las diferentes dosis de Nemix, la mejor fue 8 kg ha-1, que proporcionó la inhibición más grande que las otras dosis probadas.

Tabla -3 - Número de microorganismos juveniles de segunda etapa de Meloidogyne javanica que penetraron y el porcentaje de penetración en las raíces de la variedad de cultivo de raíces de tomate. 'Santa Cruz Kada Gigante', 3 semanas después de la inoculación. Uberlándia, UFU, 2007.

Productos Penetrado % de % de Penetración inhibición de Penetración Aldicarbe 88.00 (Temik 150 G ® 20 kg. 0.26***a ha"1) 10.2*a** Bacillus spp. 28.80b 0.72b 66.12 (NEMIX 8 kg. ha"1) Bacillus spp. 50.40c (?????' 6 kg. ha'1) Bacillus spp. 62.20d (NEMIX 4 kg. ha"1) Control (aplicación de producto) 2.13e C.V (%) = 12,5 * Promedio de cinco repeticiones ** Las medias seguidas por la misma letra en la columna no difieren entre sí por la prueba de Tukey en 5% de probabilidad ***% de penetración = N° de J2/4,000 huevecillos Se encontró que el porcentaje de penetración de nemátodos varió de 0.26 para la dosis de aldicarb y 2.13 para el control sin aplicación de producto.

Al considerar el producto biológico, este puede haber actuado en la orientación de los microorganismos juveniles de la segunda etapa de M. javanica lo que causa dispersión de los microorganismos juveniles, impidiendo la penetración de los mismos, o tal reducción puede haber sido causada por la interferencia en el proceso de emergencia de microorganismos juveniles de M. javanica. Todavía la posibilidad de que los compuestos absorbidos por el nemátodo inactivo de huevecillo o causar la deformación durante el desarrollo que previene la incubación.

Entre las tres dosis evaluadas el producto biológico basado en Bacillus spp. , La dosis de 8 kg ha-1 mostró mejores resultados en reducir la penetración de los microorganismos juveniles de segunda etapa de M. javanica en raíces de la variedad de cultivo de tomate 'Santa Cruz Kada Gigante' con penetración de 0.72 por ciento.

Prueba 3 Objetivo: Evaluar la penetración de ' Melodogyne exigua en las raíces de tomate expuestas a diferentes dosis del producto biológico basado en Bacillus spp. bajo condiciones de invernadero.

Obtención del inoculo La obtención del inoculo se hizo del procesamiento de muestras de raíces de café infectadas por M. exigua. Las muestras se tomaron de Laboratorio de Nematología Agrícola de la Ciencias Agrícolas y para el procesamiento, las raíces se desmenuzaron en fragmentos de 2 cm y se colocaron en un vaso de mezcladora domestica que contiene solución de hipoclorito de sodio (1 parte de blanqueador: 4 partes de agua) .

Ha existido molienda en el giro inferior durante 20 segundos. Después de este período, la suspensión pasó a través de un conjunto de tamices de malla 200 y 500, respectivamente, sobrepuestos. El residuo del tamiz de malla 500 se recolectó, con la ayuda de un exprimidor con agua a un becker (BONETI, J. I. S.; FERRAZ, S. Modifica ao de método de Hussey e Barker para extragáo de ovos de Meloidogyne exigua de raizes de cafeeiro. Fitopatología Brasileira, Brasilia, DF, v.6, n.3, 553p., 1981) . La suspensión obtenida se calibró para contener 800 huevecillos de nemátodos / mL.

Instalación y prueba de impulsión El diseño experimental fue el diseño completamente aleotorizado con cinco tratamientos y cinco replicas. El genotipo del tomate utilizado fue el 'Santa Cruz Kada Gigante' , con la dosis utilizada en el producto basado en Bacillus (NEMIX®) que fueron 4, 6 y 8 kg ha-1, nematicida Aldibarbe (Temik® 150 G) a una dosis de 20 kg de producto comercial por hectárea como una verificación y control estándar de las plantas de tomate sin ningún producto con la penetración estándar.

Las semillas ( de la variedad de cultivo de tomate 'Santa Cruz Kada Gigante' se sembraron en charolas de estiroespuma a 128 células y después de 8 días, las plántulas se trasplantaron en vasos de plástico con capacidad de 500 mL rellenadas con el sustrato Plantmax®. Para la inoculación, tres agujeros se abrieron con profundidad de 2 cm y se espaciaron 2 era del tallo de la plántula. En estos tres agujeros se distribuyeron el inoculo calibrado de suspensión de 5 mi (4000 nemátodos / vaso de plástico) . Prontamente después, las dosis del producto basado en Bacillus spp. se adicionaron en vasos de plástico con un exprimidor. El nematicida aldicarb también se adicionó inmediatamente después de la inoculación, acanaladura abierta alrededor de cada plántula.

Evaluación en la penetración de los microorganismos juveniles de segunda etapa de M. exigua en la raíz La evaluación se hizo después de 3 semanas de inoculación, donde las raíces después del corte de los retoños y la separación de la tierra, se prepararon para el manchado de nemátodos en tejidos de planta (Byrd Jr., y colaboradores., An improved technique for clearing and staining plant tissues for detection of nematodes . Journal of Nematology, Lakeland, v. 5, n. 1, p. 142-143, 1983). Las raíces se fracturaron en piezas de 1-2 cm, y se transfirieron a un vaso Becker que contiene 50 mi de agua al cual se adicionaron 20 mL de blanqueador comercial (NaOCl al 5.25%), que dio por resultado una concentración final de NaOCl al 1.5%. Los segmentos de raíz permanecieron durante 6 min en esta solución, al promover una agitación manual durante 10 s en intervalos de 1 min. Las raíces se lavaron bajo agua fluyente durante 30 a 45s, se mantuvieron en reposo durante 15 s en agua para remover el hipoclorito de sodio residual.

Luego, hubo el drenaje completo y se adicionaron 30 mL de agua destilada más 1 mL de solución de tinte (3.35 g fuchsin ácido + 25 mL de ácido acético glacial + 75 mL de agua style) . Las raíces de esta solución se calentaron al punto de ebullición, dejándolos durante 30 segundos en ebullición, y prontamente después en el recipiente se colocó en el contador para alcanzar la temperatura ambiente. Subsecuentemente, los inventores removieron el tinte que es dejado, y el material se lavó en agua potable y se colocaron en 20-30 mi de glicerina acidificada con unas pocas gotas de HC1 5N. Los segmentos de raíz se prensaron entre platinas de microscopio que se observaron en el microscopio óptico. Los inventores observaron los fragmentos de raíz y determinaron el número de microorganismos juveniles de segunda etapa que penetraron las raíces de tomate.

Las temperaturas máxima y mínima del aire dentro del invernadero Las temperaturas máxima y mínima diariamente del aire dentro del invernadero se registraron para los propósitos del cálculo de promedios para el período del experimento .

Las temperaturas máxima y mínima promedios del aire fueron 35.9°C y 15.3°C, respectivamente.

Análisis estadístico Los datos se sometieron al programa de procedimientos estadísticos SISVAR (FERREIRA, D. F. Analises estatisticas por meio do Sisvar para Windows versao 4.0. In: REUNIAO ANUAL DA REGIAO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA. , 45, 2000, Sao Carlos. Anais. Sao Carlos: UFSCar, 2000, p. 255-258, 2000), verificando la homogeneidad de variación y normalidad de los errores. En el análisis estadístico, las medias se compararon mediante la prueba de Tukey en 5% en nivel de probabilidad.

Resultados y Discusión A partir de los datos presentados en la Tabla 4 ilustrados en las Figuras 3A-3C, se presenta que la penetración de los microorganismos juveniles de segunda etapa de M. exigua fue significativamente afectada en todos los tratamientos cuando se comparó con el control sin algún producto. El tratamiento con el producto de aldicarb (TEMIX) a 20 kg ha"1 fue la penetración mucho más afectada. Entre las dosis del producto NEMIS, el mejor fue 8 kg ha"1, que mostró el porcentaje más alto de inhibición 54.13% comparado con el nematicida aldicarb que mostró una inhibición significante de 81.95%.

Tabla 4 - Número de microorganismos juveniles de segunda etapa de Meloidogyne exigua penetrados, el porcentaje de penetración y el porcentaje de inhibición en las raíces de tomate. 'Santa Cruz Kada Gigante', tres semanas después de la inoculación. Uberlandia, UFU, Productos N° de J2 de ff. Porcentaje exigua penetrados Penetración Inhibición de penetración Aldicarbe 19.40* a** 0.48*** 81.95*** (Temik® 150 G 20 kg. Ha"1) Bacillus sp . 49-00 b . 1.22 54.13 (NEMIX 8 kg.

Ha"1) Bacillus spp. 66.20 C 1.65 37.97 (NEMIX 6 kg.

Ha"1) Bacillus spp. 81.00 C 2.02 24.06 (NEMIX 4 kg.

Ha"1) 106.60 Control (son d 2.66 aplicación) C.V (%) 13.04 * Promedio de cinco repeticiones ** Medias seguidas por la misma letra en la columna no difieren entre si por la prueba de Tukey a 5% de probabilidad ***% de penetración = N° de J2 / 4.000 huevecillos *** Valores comparados con la población inicial de 4.000 huevecillos de M. exigua.

También se observó que no hubo diferencia en el efecto entre las dosis 4 y 6 kg ha-1 del producto Nemix con porcentajes de penetración de 1.65% y 2.02, respectivamente. El porcentaje de penetración de nemátodos varió entre 0.48 y 2.66% en el control y el patrón de control de penetración, respectivamente, para la población inicial.

El efecto de los pesticidas sobre la migración de M. exigua muestra que hay interferencia en la dirección que causa la dispersión de los microorganismos juveniles. La reducción en la presencia de microorganismos juveniles penetró las raíces de tomate en relación al control, pero también puede haber sido debido a la interferencia en los procesos de incubación y orientación de M. exigua, juvenil.

La hipótesis de reducción en la penetración de nemátodos en las raices se puede poner en claro como la habilidad de la bacteria, que comprende el producto, para acoplarse o conectarse a las lectinas superficiales, que en este caso puede ser mínima debido a las bacterias gram-positivas.

Las temperaturas dentro del invernadero también pueden influenciar la penetración de microorganismos juveniles en las raíces. Algunos autores reportan que la acción antagonista de algunos microorganismos ' sobre poblaciones de Meloidogyne spp. es más grande en temperaturas que varían de 23-25°C que 18-32°C (AL-HAZMI, A. S.; SCHIMITT, D. P.; SASSER, J. N. The effect of Arthrobotrys conoides on Meloidogyne incógnita populations densities in corn as influenced by temperature, fungus inoculum density and of fungus introduction in the soil. Journal of Nematology, DeLeon Springs, v. 14, n. 2, p. 168-174, Apr.', 1982).

Entre las tres dosis probadas del producto basado en Bacillus spp. , la dosis de 8 kg ha-1 se probó más efectiva en reducir la penetración de los microorganismos juveniles de segunda etapa de M. exigua en raíces de la variedad de cultivo de tomate 'Santa Cruz Kada Gigante' con el porcentaje de penetración de 1.22% y 54.13% de inhibición.

En conclusión La combinación específica de una cepa de Bacillus subtilis con cepas de Bacillus licheniformis tal como por ejemplo Bacillus subtilis (DSM 17231) y Bacillus licheniformis (DSM 17236) se prueba que es una alternativa fuerte a los productos nematocidas químicos y también una composición mejorada como es comparado con los productos biológicos disponibles. El efecto combinado de las dos cepas es benéfico para la inhibición de los nemátodos que causan pérdidas a los cultivos .

DEPÓSITOS Y SOLUCIÓN DEL EXPERTO El solicitante establece que una muestra de los microorganismos depositados establecidos enseguida solamente puede ser hecha disponible a un experto, hasta la fecha en la cual se otorga la patente.

La cepa Bacillus subtilis se depositó el 07-04-2005 en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, D- 38124 Braunschweig (DSMZ) y se le dio el No. de acceso: DSM 17231.

La cepa de Bacillus licheniformis se depositó el 07-04-2005 en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig (DSMZ) y se le dio el No. de acceso DSM 17236.

Los depósitos se hicieron de acuerdo con el tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los propósitos de procedimiento de patente. REFERENCIAS EP 0705807 BR PI 0604602-9 Siddiqui y Mahmood (1999) . Bioresource Technology 69; 167-179.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una composición, caracterizada porque comprende como ingredientes activos un Bacillus subtilis que tiene las características de la cepa depositada en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con No., de acceso DSM 17231 o un mutante del mismo, en donde el mutante se obtiene al utilizar la cepa depositada como material de partida, y en donde el mutante ha retenido o mejorado adicionalmente las propiedades nematicidas de DSM 17231, y un Bacillus licheniformis que tiene las características de la cepa depositada en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con No. de acceso DSM 17236 o un mutante del mismo, en donde el mutante se obtiene al utilizar la cepa depositada como material de partida, y en donde el mutante ha retenido o mejorado adicionalmente las propiedades nematicidas de DSM 17236, y excipientes y/o portadores agroquímicamente aceptables de los mismos .

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende el Bacillus subtilis y el Bacillus licheniformis en una mezcla de maltodextrina y dióxido de silicio, en donde los componentes están presentes en una tasa mínima de 2.4 (%) , 2.4 (%) , 94.2 (%) y 1.0 (%) , respectivamente, y en una tasa máxima de 3.0 (%) , 3,0 (%) , 93.0 (%) y 1.0 (%) , respectivamente.

3. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque está en la forma de un polvo humectable.

4. Proceso para preparar una composición, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende mezclar, en relaciones deseadas, cantidades efectivas de Bacillus subtilis y el Bacillus lichenifor is para aplicación, junto con portadores, vehículos y/o adyuvantes agroquímicamente aceptables.

5. Uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , u obtenible de un proceso de conformidad con la reivindicación 4, para controlar, combatir y/o conferir resistencia específica a los fitonemátodos .

6. Uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde los fitonemátodos se seleccionan del grupo que consiste de Meloidogyne, Pratylenchus, Heterodera, Globodera, Ditylenchus, Tylenchulus, Xiphinema, Radopholus, Rotylenchulus, Helicotylenchus y Belonolaim s .

7. Uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el fitonemátodo se selecciona del grupo que consiste de Meloidogyne incógnita, Meloidogyne javanica, Meloidogyne exigua, Meloidogyne paranaensis, Heterordera glycines y Pratylenchus zeae.

8. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el cultivo de planta se selecciona del grupo que consiste de caña de azúcar, soja, papa, zanahoria, café y plátano.

9. Proceso para controlar y/o combatir fitonemátodos en plantas y/o su habitat, .en donde la composición es de conformidad con cualquiera de las . reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se deja actuar sobre los fitonemátodos y/o su hábitat.

10. Proceso para conferir resistencia específica a fitonemátodos , caracterizado porque comprende aplicar una cantidad eficaz de una composición, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, sobre plantas y/o su hábitat.

11. Kit, caracterizado porque comprende la composición, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, u obtenible de proceso de conformidad con la reivindicación 4, instrucciones y un recipiente adecuado .