MX2013001349A - Virus de laringotraqueitis infecciosa (iltv) modificado y sus usos. - Google Patents
Virus de laringotraqueitis infecciosa (iltv) modificado y sus usos.Info
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Abstract
En la presente se proporcionan virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) modificados y métodos para utilizarlos. Por ejemplo, se proporcionan ILTV atenuados. Los ILTV atenuados pueden ser utilizados para suscitar respuestas inmunitarias en especies aviares. Opcionalmente, los ILTV atenuados pueden ser utilizados para vacunar un sujeto aviar o a una población de sujetos aviares. Opcionalmente, se administra un ILTV atenuado in ovo a un huevo de ave. Una o más de dichas administraciones in ovo pueden ser utilizadas para aumentar la inmunidad de una manada de aves.
Description
VIRUS DE LARINGOTRAQUEITIS INFECCIOSA (ILTV) MODIFICADO Y SUS USOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con la modificación de un virus causante de enfermedades en aves, y su uso para incrementar la inmunidad en las mismas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La laringotraqueitis infecciosa (ILT) es una enfermedad respiratoria altamente contagiosa de los pollos que causa graves pérdidas de producción a la industria avícola. El agente etiológico para la ILT es el virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV).
Los sitios principales donde se reproduce la ILTV son la laringe, tráquea y conjuntiva. Los signos clínicos graves se observan como manifestaciones respiratorias tales como jadeo, tos, expectoración de mucosidad con sangre y sofocación. Otros signos clínicos son la conjuntivitis y la baja de peso corporal así como la disminución en la producción de huevos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En la presente se proporcionan virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) modificado y métodos para utilizarlos. Por ejemplo, se proporcionan ILTV atenuados. Los ILTV atenuados pueden ser utilizados para suscitar respuestas ¡nmunitarias en especies aviares. Opcionalmente, los ILTV atenuados pueden ser utilizados para vacunar un sujeto aviar o a una población de sujetos aviares. Opcionalmente, se administra un ILTV atenuado in ovo a un huevo de ave. Una o más de dichas administraciones in ovo pueden ser utilizadas para aumentar la inmunidad de una manada de aves.
Una composición de ejemplo comprende un virus de laringotraqueitis infecciosa (ILTV) atenuado que comprende una mutación de la glicoproteína J. Opcionalmente, la mutación inhibe la expresión de la proteína de la "glicoproteína J. Por ejemplo, la mutación puede comprender una mutación del elemento del promotor de la glicoproteína J, donde la mutación inhibe una función del elemento del promotor. Las mutaciones de ejemplo también pueden comprender una eliminación parcial o completa de una secuencia de nucleotidos de glicoproteína J tal como una eliminación de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de nucleotidos 1-2291 de la SEC ID N°: 1. Un cásete de expresión de la proteína indicadora puede ser insertada en la eliminación. La proteína indicadora puede ser proteína fluorescente verde. Se puede insertar un cásete de expresión de la proteína viral en la deleción. El cásete de proteína viral puede ser la proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle.
Opcionalmente, una mutación de la glicoproteína J puede comprender una sustitución de la glicoproteína J. La sustitución puede, por ejemplo, comprender una secuencia reorganizada de ILTV.
Se proporcionan adicionalmente- vacunas que comprenden un virus de laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV) que están configurados para uso in ovo. Por ejemplo, se proporcionan vacunas que comprenden un virus de laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV) que comprende una mutación de la glicoproteína J. Opcionalmente, se proporciona una preparación de vacuna in ovo que comprende un genoma de virus de laringotraqueitis infecciosa recombinante que tiene una deleción en el gen de la glicoproteína J. También se proporcionan kits que pueden incluir un virus de laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV), medios para administrar el ILTV atenuado en un huevo en incubación e instrucciones para la administración in ovo de los ILTV atenuados en un huevo de ave.
Los métodos para utilizar virus de la laringotraqueitis infecciosa modificada incluyen un método para prevenir la infección del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) en un sujeto o población que comprende administrar a uno p más sujetos un virus de la laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV), donde el ILTV atenuado se administra in ovo. El ILTV atenuado puede comprender opcionalmente una mutación de la glicoproteína J. Por ejemplo, la mutación puede inhibir la expresión de la proteína de la glicoproteína J. La mutación también puede comprender una mutación del elemento del promotor de la glicoproteína J, donde la mutación inhibe una función del elemento del promotor. Las mutaciones de ejemplo también pueden comprender una eliminación de una secuencia de nucleótidos de la glicoproteína J tal como una eliminación de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una deleción de nucleótidos 1-2291 de la SEC ID N°: 1. Un cásete de expresión de la proteína indicadora puede ser insertado en la deleción. La proteína indicadora puede ser proteína fluorescente verde. Un cásete de expresión de la proteína viral puede ser insertado en la deleción. El cásete de proteína viral puede ser la proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle. Opcionalmente, una mutación de la glicoproteína J puede comprender una sustitución de la glicoproteína J. La sustitución puede, por ejemplo, comprender una secuencia reorganizada de ILTV.
Los métodos para suscitar una respuesta inmunitaria en un sujeto incluyen administrarle al sujeto un virus de la laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV), donde el ILTV atenuado se administra in ovo. También se proporcionan métodos para aumentar la inmunidad de la manada de una población de sujetos aviares contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), que comprende administrar in ovo un ILTV atenuado a uno o más huevos que dan lugar a uno o más sujetos de la población. El ILTV atenuado puede comprender una mutación de la glicoproteina J.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A a 1 H son ilustraciones esquemáticas de mutantes ' de ILTV. 1A) Esquema del genoma de ILTV de 150 kilobase (kb). 1B) Segmento corto flanqueado por repeticiones invertidas. Se indican las posiciones y la dirección de la transcripción de genes relevantes. 1C) Fragmento de Sphl de 7958 pares de base (pb) de la región Us que comprende las ORF US4, US5, US6 y US7. 1 D) La eliminación parcial de 2291 pb de US5 que codifica a gJ se indica con líneas punteadas. 1 E) Estructura del muíante por deleción de gJ ADgJ4.1 con un cásete de expresión GFP que reemplaza los primeros 2291 pB de US5. 1F) Se eliminó un fragmento de 2188 pb del extremo 5' de US5 para generar el mutante por deleción de gJ BDgJ3.2. 1G) Estructura de BDgJ3.2. 1 H) El fragmento genómico de 5498 pb utilizado para la generación del mutante por recuperación de gJR.
La Figura 2 es una fotografía que muestra un SDS-PAGE y un Western blot que ilustra una expresión de baculovirus y purificación de la glicoproteina J. Tinción con azul de Coomassie en SDS-PAGE (carril 1 ) y Western blot con un MAb anti-RGS-6xHis(carril 2) de gJ purificado. Western blot de gJ purificado probado con ya sea el MAb anti-ILTV gJ; (carril 3) o un suero reconvalescente de pollos infectados con ILTV (carril 4). Se muestra un marcador (M) para el peso molecular de las proteínas en el lado izquierdo de la Figura.
Las Figuras 3A a 3E son fotografías de geles que muestran fragmentos de ADN amplificados por PCR de ADN genómico viral de ADgJ4.1 y BDgJ que confirman el genotipo. (3A) Las amplificaciones por PCR en los carriles 1 y 2 realizadas con el par de cebadores gGupf/CMVprev y amplificaciones en los carriles 3 y 4 realizados con el par de cebadores EGFP578fe/Clalglrev. Carriles 1 y 3: control de agua, carriles 2 y 4: ADN de ADgJ4.1 , (3B) amplificación por PCR realizada con el par de cebadores BamHlgGfw/gJ2381rev. Carriles 1 y 3: control de agua, carril 2: ADgJ4.1 , carril 4: USDA-ch. (3C) incubación de fragmentos de PCR de (3B) con BamHI, carril 1 : ADgJ4.1 y carril 2: USDA-ch. (3D) Amplificaciones por PCR llevadas a cabo con el par de cebadores BamHlgGfw/gJ2381rev. Carril 1 : BDgJ1.1 , carril 2: BDgJ 3.1 , carril 3: BDgJ 3.2 y carril 4: USDA-ch. (3E) Las amplificaciones por PCR fueron llevadas a cabo con el par de cebadores BamHlgGfw/gJ2381rev. Carriles 1 y 5: control de agua, carril 2: gJR1.3, carril 3: gJR2.4; carril 4: gJR4.3, carril 6: USDA-ch. Los productos de reacción fueron analizados en un gel al 0.7%. Se muestra un marcador de ADN en cada gel en el lado izquierdo.
Las Figuras 4A a 4C son fotografías que muestran doble inmunofluorescencia de células LMH infectadas con el virus de ILTV de tipo salvaje USDA-ch, el mutante por deleción de gj ADgJ4.1 y el mutante por recuperación gJR4.3. Las células se fijaron y se procesaron por ¡mmunofluorescencia 72 horas luego de la infección (p.i.). (4A) Las células infectadas con el virus USDA-ch de tipo salvaje (wt) muestran una señal positiva luego incubarse con anticuerpos monoclonales (MAb) dirigidos ya sea contra gJ o gC. La especificidad de la reacción se confirmó al utilizar un suero anti-ILTV policlonal de un pollo. (4B) El ADgJ4.1 que expresa GFP fue utilizado para infectar células LMH. Las células infectadas mostraron una señal positiva luego de la incubación con el MAb anti-gC mientras que no se observó ninguna señal luego de la incubación con el MAb anti-gJ. La infección exitosa de las células inspeccionadas fue confirmada al utilizar el suero anti-ILTV de pollo. (4C) La restauración de la expresión de gJ fue investigada luego de infectar células LMH con el mutante por recuperación gJR4.3. Las células infectadas, tal como se indica por la presencia de la expresión de gC, también reaccionaron con un suero policlonal de conejo anti-gJ. Se diluyeron los sueros de MAbs y policlonal en todos los ensayos 1:100 y 1 :500, respectivamente. La unión de los MAbs se visualizaron utilizando anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados con Cy-5. Se detectó la presencia de anticuerpos de pollo así como de conejo mediante el uso de anticuerpos de cabra conjugados con FITC de especies específicas. Los núcleos de las células se visualizaron mediante el uso de yoduro de propidio (4A y 4B) o 4',6-diamidino-2-fenilindol. (4C) Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio confocal de barrido láser LSM 510.
Las Figuras 5A a 5E son fotografías que muestran el análisis de Western blot para la detección de gJ y gC en viriones y células infectadas de mutantes de ILTV y la cepa USDA-ch de tipo salvaje. (5A y 5B) Los viriones purificados del mutante por deleción de gJ ADgJ4.1 (carril 1 ) y la cepa USDA-ch de tipo salvaje fueron testeados mediante el uso del MAb anti-gJ (5A) y del MAb anti-gC (5B). (5C) Los viriones de USDA-ch (carriles 1 y 3) y los viriones del mutante por deleción de gJ ADgJ4.1 (carriles 2 y 4) fueron incubados ya sea con suero preinmune de conejo (carriles 1 y 2) o el suero anti-gJ de conéjo (carriles 3 y 4). (5D) Los viriones USDA-ch (carril 1 ), las células CK no infectadas (carril 2), las células CK infectadas con ya sea el virus USDA-ch de tipo salvaje (carril 3) o los mutantes del virus gJR4.3 (carril 4), BDgJ3.2 (carril 5) y el ADgJ41 (carril 6) se incubaron con MAb anti-gJ. (5E) Se incubaron los mismos viriones y preparaciones de células CK tal como se muestran en (5D) con MAb anti-gC. Las muestras de proteína en los cuatro geles se separaron en un SDS-7.5%PAGE. Se visualizó la unión de los anticuerpos apropiados por quimioluminiscencia mediante el uso de anticuerpos conjugados HRP antiespecies.
Las Figuras 6A y 6B son gráficas que muestran que la replicación del virus pero la entrada viral no se vio afectada en mutantes por deleción de gJ ILTV. (6A) Cinética de replicación en células CK infectadas con USDA-ch, ADgJ4.1 , BDgJ3.2 y gJR4.3 a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 0.01. Se determinaron los títulos virales (TCID5o) de los sobrenadantes a 0, 24, 48 y 72 horas p.i. (6B) Para la cinética de entrada viral se adsorbieron en hielo 500 unidades formadoras de placa (pfu) de virus a células LMH por 60 minutos. La temperatura se cambió a 39 °C para diferentes momentos (eje de x) para permitir la entrada de partículas de virus adsorbidas. Se inactivaron los virus que permanecen fuera de las células y las células fueron superpuestas con medio semisólido para un ensayo de placa. Cinco días p.i; se contaron las placas. La cantidad de placas a 60 minutos se estableció como 100% y la cantidad de placas de virus se expresó, como porcentaje del valor a los 60 minutos. Se graficaron los porcentajes de entrada con las horas de entrada. Se muestran los promedios de tres experimentos diferentes. Las barras de error indican desviaciones estándar.
Las Figuras 7A y 7B son gráficos que muestran resultados de signos clínicos en pollos inoculados con mutantes por deleción de gJ ADgJ y BDgJ, que luego se sometieron a prueba con la cepa USDA-ch. (7A) Los pollos fueron inoculadas por vía nasal/conjuntival a 4 semanas de edad con mutantes por deleción gJ ADgJ4.1 y BDgJ3.2. A un grupo de control se le realizó inoculación simulada. Tres semanas luego de la inoculación, los pollos se expusieron a la cepa USDA-ch y se obtuvieron signos clínicos a partir de los días 1 a 6 luego de dicha exposición. (7B) Embriones SPF (libres de agentes patógenos específicos) de dieciocho días de edad fueron inoculados in ovo con mutantes por deleción de gJ ADgJ4.1 y BDgJ3.2. A un grupo de control se le realizó inoculación simulada. A los 35 días de edad, los pollos se expusieron a la cepa USDA-ch y se obtuvieron signos clínicos a partir de los días 1 a 7 luego de dicha exposición. Se clasificaron los signos clínicos para ambos experimentos (7A y 7B) en una escala de 1-5. El resultado clínico promedio para cada día se muestra en el eje y.
La Figura 8 muestra un esquema de la generación de una construcción nueva de ILTV con deleción
de gJ (NAdJ ILTV).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN ·
í
La laringotraqueitis infecciosa (ILT) es una infección del tracto respiratorio de pollos, faisanes y pavos reales. Puede extenderse rápidamente entre los pájaros y causa grandes pérdidas por muerte en aves susceptibles. Pavos, patos y gansos no contraen la enfermedad, pero pueden propagar el virus.
El agente etiológico para esta enfermedad es el virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), sistemáticamente llamada Gallid herpesvirus 1. Los sitios principales donde se reproduce el ILTV son la laringe, tráquea y conjuntiva. Los signos clínicos graves se observan como manifestaciones respiratorias tales como jadeo, tos, expectoración de mucosidad con sangre y sofocación. Otros signos clínicos son la conjuntivitis y peso corporal reducido así como disminución en la producción de huevos.
i
El ILTV ha sido clasificado como el miembro prototipo del género lltovirus de la subfamilia
Alphaherpesvirinae de la familia Herpesviridae. En los últimos 50 años, la enfermedad fue mayormente controlada a través de bioseguridad y vacunación con vacunas vivas atenuadas por pasajes consecutivos ya sea en embriones de pollo (de origen en embrión de pollo, vacuna CEO) o cultivo de tejido (de origen de cultivo de tejidos, vacuna TCO). >
Las vacunas CEO, aunque han demostrado ser efectivas para controlar brotes en el campo, poseen virulencia residual que puede aumentar durante pasajes en los pollos. En el campo, el uso no restringido de vacunas CEO y la mala vacunación de la manada por pulverización gruesa o a través del agua que beben ha permitido que las cepas de vacunas recuperen virulencia, y que causen graves brotes de ILT.
Más recientemente, el uso de vectores de virus tal como el virus herpes del pavo y el virus atenuado de la viruela aviar que lleva genes de glicoproteína de ILTV ha proporcionado una vacunación alternativa más segura debido a su falta de transmisión y no reversión a la virulencia. Sin embargo, la expresión de uno o dos genes ILTV puede que no proporcione la inmunidad completa necesaria1 para soportar una exposición grave. Además, ninguno de estos virus recombinantes se replica en el epitelio respiratorio, el lugar de infección principal de ILTV. Es posible que la inmunidad mucosa en el sitio 1 principal de la infección viral juegue un papel importante en la protección contra esta enfermedad.
Otra estrategia para el desarrollo de vacunas más efectivas contra el ILTV es diseñar vacunas vivas atenuadas de ILTV con eliminaciones definidas de genes no esenciales. Se busca eliminar los genes virales que codifican glicoproteínas estructurales porque son proteínas inmunogénicas y se encuentran involucradas en procesos de unión viral, entrada, morfogénesis y propagación de célula a célula, consecuentemente, es probable que su eliminación tenga como resultado una disminución.
Además, un ILTV mutante atenuado al que. le falta una o más glicoproteínas puede ser utilizado como una vacuna marcadora que permite la diferenciación serológica entre los animales infectados y los animales vacunados. La eliminación de genes que codifican el ILTV homólogos de gE y gl llevó a virus recombinantes no replicativos, que indican que las dos glicoproteínas son esenciales para la replicación de ILTV. Sin embargo, los genes de ILTV que codifican gC, gG, gJ, gM y gN fueron eliminados con éxito del genoma del virus lo cual generó mutantes con grados variados de defectos de replicación in vitro y diferentes niveles de disminución en los pollos.
De las 12 glicoproteínas previstas de ILTV, solo gC y gJ fueron reconocidos por anticuerpos monoclonales (MAbs) específicos ILTV. Un grupo de MAbs reconoció una proteína 60-kDa que demostró ser el homólogo de ILTV del virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1 ) de glicoproteína C. Otro grupo de MAbs reconocieron el homólogo posicional de HSV-1 gJ codificado por el marco abierto de lectura (ORF) 5 ubicado dentro de la región del genoma corto único del genoma ILTV y, por lo tanto, denominado US5.
El ILTV gJ se expresa en diferentes formas que varía en peso molecular de 85, 115, 160, a 200 kDa a partir de ARNm empalmado y no empalmado. Durante infecciones experimentales, se detectaron anticuerpos a las glicoproteínas J y C antes y en cantidades relativamente más altas que los anticuerpos a gB y gE. Se construyeron virus recombinantes sin los genes codificantes gJ y gC que indican que estas dos grandes glicoproteínas que inducen anticuerpos no son esenciales para la replicación in vitro del virus.
La replicación in vitro del mutante gC fue similar a la cepa parental de tipo salvaje y al virus de recuperación de gC. In vivo el virus mutante gC retuvo cierta virulencia, indujo protección efectiva contra la enfermedad y redujo de forma considerable la descamación viral luego de la provocación. Un mutante gJ construido de la cepa virulenta ILTV (Fuchs ef á/., (2005) J. Virol. 79(2): 705 716) mostró una reducción importante en los títulos (logio 5.7 pfu/ml) cuando se compararon con el virus de tipo salvaje (log10 6.5 pfu/ml) y con el virus de recuperación gJ (log10 6.8 pfu/ml). En los pollos, el mutante gJ se atenuó de forma considerable y se le indujo una protección completa sin descamación del virus de provocación. Sin embargo, el mutante de eliminación gJ tuvo que ser inoculado intratraquealmente con una dosis elevada para inducir una protección completa.
En la presente se proporcionan virus de la laringotraqueitis infecciosa modificada (ILTV) y métodos para utilizarlos. Por ejemplo, se proporcionan ILTV atenuados. Los ILTV atenuados pueden ser utilizados para suscitar respuestas inmunitarias en especies aviares. Opcionalmente, los ILTV atenuados pueden ser utilizados para vacunar un sujeto aviar o a una población de sujetos aviarés. Opcionalmente, un ILTV atenuado se administra in ovo a un huevo de ave del cual nacerá un individuo de la población aviar. Una o más de dichas administraciones in ovo pueden ser utilizadas para aumentar la inmunidad de una manada de aves.
El sujeto aviar puede ser cualquier especie de ave. Por ejemplo, el sujeto puede ser un pollo, pavo, pato, ganso, faisán, codorniz, perdiz, cobayo, avestruz, emú o pavo real, así como cualquier otra ave comercialmente procesada y/o cualquier ave, o un huevo o huevos de estas.
Un virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) atenuado puede comprender una mutación de la glicoproteína J, donde la mutación inhibe la expresión de la glicoproteína J. Opcionalmente, la mutación puede inhibir la expresión de la proteína de la glicoproteína J. Por ejemplo, la mutación comprende una mutación del elemento del promotor de la glicoproteína J, donde la mutación inhibe una función del elemento del promotor. Mutaciones de ejemplo también pueden comprender una eliminación completa o parcial de una secuencia de nucleótidos de glicoproteína J tal como una eliminación de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de nucleótidos 1-2291 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de nucleótidos 1-2188 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de al menos nucleótidos 1-145 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación no comprende los nucleótidos 2185-2190 de la SEC ID N°: 1. Un cásete de expresión de la proteína indicadora puede ser insertada en la deleción. La proteína indicadora puede ser, por ejemplo, proteína fluorescente verde. Un cásete de expresión de la proteína viral puede ser insertado en la deleción. El cásete de proteína viral puede ser la proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle. Opcionalmente, una mutación de la glicoproteína J puede comprender una sustitución de la glicoproteína J. La sustitución puede, por ejemplo, comprender una secuencia reorganizada de ILTV. Por una secuencia de ILTV reorganizada, se refiere a que la sustitución contiene solo secuencias de ILTV que han sido manipuladas por métodos conocidos en la técnica para mover porciones del genoma de modo que el mismo número de nucleótidos se encuentren presentes como un tipo salvaje, los nucleótidos por lo tanto se encuentran en un orden diferente a la secuencia de ILTV de tipo salvaje. Esto tiene como resultado una falta de expresión de la glicoproteína J donde no se introduce ADN extraño en el ILTV atenuado.
Se proporcionan adicionalmente vacunas que comprenden un virus dé laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV), donde la vacuna está configurada para uso in ovo. Cuando se utiliza la administración in ovo, las composiciones pueden ser introducidas en cualquier región de un huevo de ave, que incluye de forma no taxativa la cámara de aire, la albúmina, la membrana corioalantoidea, el saco vitelino, la yema, el alantoides, el amnión o de forma directa en un ave embrionaria.
Vacunas de ejemplo comprenden un virus de laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV) que comprende una mutación de la glicoproteína J. Opcionalmente, se proporciona una preparación de vacuna in ovo que comprende un genoma de virus de laringotraqueitis infecciosa recombinante que tiene una deleción en el gen de la glicoproteína J. También se proporcionan kits que pueden incluir un virus de laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV), medios para administrar el ILTV atenuado en un huevo que ya rompió el cascarón e instrucciones para la administración in ovo de los ILTV atenuados en un huevo de ave.
Los métodos para utilizar el virus de la laringotraqueitis infecciosa modificado incluyen un método para prevenir la infección del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) en un sujeto o población, método que comprende administrar a uno o más sujetos un virus de la laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV), donde el ILTV atenuado se administra in ovo. El ILTV atenuado puede comprender opcionalmente una mutación completa o parcial de la glicoproteína J. Por ejemplo, la mutación puede inhibir la expresión de la proteína de la glicoproteína J. La mutación también puede comprender una mutación del elemento del promotor de la glicoproteína J, donde la mutación inhibe una función del elemento del promotor. Mutaciones de ejemplo también pueden comprender una eliminación de una secuencia de' nucleótidos de la glicoproteína J tal como una eliminación de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de nucleótidos 1-2291 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de nucleótidos 1-2188 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de al menos nucleótidos 1-145 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación no comprende los nucleótidos 2185-2190 de la SEC ID N°: 1. Un cásete de expresión de la proteína indicadora puede ser insertada en el punto de la eliminación. La proteína indicadora puede ser, por ejemplo, proteína fluorescente verde. Un cásete de expresión de la proteína viral puede ser insertado en la eliminación. El cásete de proteína viral puede ser la proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle. Opcionalmente, una mutación de la glicoproteína J puede comprender una sustitución de la glicoproteína J. La sustitución puede, por ejemplo, comprender una secuencia reorganizada de ILTV.
Los métodos para suscitar una respuesta inmunitaha en un sujeto incluyen administrarle al sujeto un virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) atenuado, donde el ILTV atenuado se administra in ovo. También se proporcionan métodos para aumentar la inmunidad de la manada de una población de sujetos aviares contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), que comprende administrar in ovo un ILTV atenuado a uno o más huevos que dan lugar a uno o más sujetos de la población. El ILTV atenuado puede comprender una mutación de la glicoproteína J. Mutaciones de ejemplo también pueden comprender una eliminación parcial o completa de una secuencia de nucleótidos de glicoproteína J tal como una eliminación de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de nucleótidos 1 -2291 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de nucleótidos 1 -2188 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación comprende una eliminación de al menos nucleótidos 1-145 de la SEC ID N°: 1. Opcionalmente, la mutación no comprende los nucleótidos 2185-2190 de la SEC ID N°: 1.
También se proporcionan en la presente mutantes de eliminación de glicoproteínas J que aumentan hasta títulos adecuados en células CK y embriones de pollo e inducen una protección completa contra la exposición luego de la inoculación in ovo de los huevos embrionados SPF de 18 días de edad.
Las composiciones y vacunas descritas pueden comprender un portador adecuado y una cantidad eficaz de cualquiera de los virus de la laringotraqueitis infecciosa modificada (por ejemplo, recombinante) descritos. Los compuestos y vacunas pueden contener el virus recombinante ya sea inactivo o vivo. Los portadores adecuados para los virus recombinantes son bien conocidos en la técnica e incluyen proteínas, azúcares, etc. Un ejemplo de dicho portador adecuado es un medio de cultivo balanceado fisiológicamente que contiene uno o más agentes estabilizadores tales como proteínas hidrolizadas, lactosa, etc. Un adyuvante también puede ser parte del portador de la vacuna.
Se puede crear una vacuna viva tomando fluidos de cultivo de tejido y agregando agentes estabilizadores tales como proteínas estabilizadores e . hidrolizadas. Una vacuna inactivada puede utilizar fluidos de cultivo de tejido directamente después de la inactivación del virus.
Las composiciones y vacunas descritas en la presente pueden ser administradas por cualquier vía adecuada. Por ejemplo, las composiciones y vacunas pueden ser administradas in ovo, de forma oral, de forma parenteral (por ejemplo, de forma intravenosa), por inyección intramuscular, por inyección intraperitoneal, por inyección directa en un órgano, de forma transdérmica, extracorporal, tópica o similares, que incluye de forma intranasal tópica y' de forma intratraqueal. Las vacunas y composiciones pueden ser aplicadas en cualquier sistema de órganos tales como el sistema respiratorio o el ojo.
La administración o vacunación in ovo incluye administrar una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) a un huevo de ave que contiene un embrión vivo y en desarrollo mediante la penetración de la cascara del huevo por cualquier modo para luego introducir la composición inmunogénica. Dichos medios de administración incluyen, de modo no taxativo, la inyección in ovo de la composición inmunogénica. , .
Cualquier método adecuado puede ser utilizado para introducir las composiciones descritas in ovo, que incluye la inyección in ovo, pulverización de alta presión a través de una cáscara de huevo y bombardeo balístico del huevo con micropartículas que llevan la composición. En algunos ejemplos, las composiciones descritas pueden ser administradas al depositar una solución acuosa farmacéuticamente aceptable en un tejido de ave, tal como músculo, cuya solución contiene la composición a ser depositada.
Donde se utiliza la inyección in ovo, el mecanismo de inyección no es crítico, pero se prefiere que el método no dañe excesivamente los tejidos y órganos del embrión o las membranas extraembrionarias que lo rodean para que el tratamiento no disminuya el índice de nacimiento. Se pueden utilizar dispositivos adecuados para la administración in ovo que pueden comprender opcionalmente un inyector que contiene un ILTV modificado, con el inyector posicionado para inyectar un huevo con el IL V. Además, si se desea, se puede proporcionar un aparato para sellar asociado de forma operativa con el aparato de inyección para sellar el hueco en el huevo luego de la inyección en este.
El volumen y dosificación apropiados de una composición que comprende un ILTV modificado para ser administrado puede ser determinado fácilmente por los expertos en la técnica. El tratamiento terapéutico, tal como la vacunación, implica administrarle a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones descritas en la presente. Los términos "cantidad eficaz" y "dosificación eficaz" se usan indistintamente. El término "cantidad eficaz" se define como cualquier cantidad necesaria para producir una respuesta fisiológica deseada (por ejemplo, protección parcial o total contra la laringotraqueitis infecciosa, o suscitar una respuesta inmunitaria en el sujeto). Las cantidades y los cronogramas eficaces para administrar las composiciones pueden determinarse de forma empírica. Los intervalos de dosificación para la administración son aquellos lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado. La dosificación no debería ser tan grande que cause efectos secundarios adversos graves. Cuando se utiliza la administración
in ovo, la dosificación puede ajustarse dependiendo de factores como el tamaño del huevo, dado que huevos más grandes generalmente reciben un volumen y dosificación mayor en comparación con huevos más pequeños. Otros factores que pueden afectar la dosificación o volumen para la administración in ovo y otras vías incluyen, de modo no taxativo, las especies de aves que se vacunan.
Los métodos para prevenir la laringotraqueitis infecciosa y los métodos de vacunación incluyen reducir los efectos de la laringotraqueitis infecciosa o uno o más síntomas de lá laringotraqueitis infecciosa (por ejemplo, uno o más síntomas respiratorios, o transmisión de pájaro en pájaro de ILTV) en un pájaro o población de pájaros. La eficacia se puede referir a un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o un 100% de reducción en la gravedad de la laringotraqueitis infecciosa establecida o uno o más síntomas de la laringotraqueitis infecciosa, o a la velocidad a la cual una sola ave o una población de aves es infectada con ILTV o manifiesta síntomas de laringotraqueitis infecciosa luego de la exposición a ILTV.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se establecen para proporcionarle a los, expertos en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo se realizan y evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en la presente y se pretende sean ' meramente ejemplos de la invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención, excepto y en la medida en que estén incluidos en las reivindicaciones adjuntas. ¡
Se generaron dos ILTV recombinantes gJ negativos. Estos virus se analizaron in vitro e in vivo en comparación con el virus de tipo salvaje USDA-ch y el mutante de recuperación gJ correspondiente. Para el análisis de la expresión de gJ, se generó un suero hiperinmune de conejo anti-gJ contra gJ expresada en baculovirus. El ILW se codifica con US5 ubicado en el segmento corto del genoma y lleva el nombre de su homólogo posicional en el genoma HSV-1. La secuencia de aminoácidos deducida de ILTV US5 es idéntica en un 18 % con el gen homólogo respectivo sORF2 del virus del Herpes Psittacid 1 (PsHV-1).
El ILTV y el PsHV-1 están estrechamente relacionados y representan las dos especies de los genes lltovirus dentro de la subfamilia Alphaherpesvirinae de la familia Herpesviridae. El ILTV gJ comparte una homología de secuencia limitada con su contraparte en el virus de herpes equino (EHV)-1 y EHV-4, en el cual a gJ se le llama gp-2. Se demostró que gp-2 juega un papel importante . en la virulencia de EHV-1. El ILTV gJ ha sido identificado como una glicoproteína que se traduce de un ARNm empalmado y uno no empalmado, y aparece como cuatro proteínas de peso molecular elevado en el SDS-PAGE. El gJ está
expresado en células de CK infectadas en cuatro formas (aproximadamente 85, 115, 160 y 200 kDa). EL gJ es prescindible para la replicación de la cepa virulenta A489 y esos mutantes negativos gJ derivados de la cepa A489 fueron capaces de infectar pollos cuando se inocularon intratraqueaímente a una dosis alta. Los pollos desarrollaron solo signos leves de la enfermedad y fueron protegidos contra una infección por exposición. Esto fue un descubrimiento importante a la luz de la observación de que gJ representa un antígeno fundamental que induce anticuerpos de ILTV.
ILTV gJ fue elegido como objetivo para el desarrollo de una vacuna marcadora por deleción de gen contra el ILT. Se generaron dos mutantes por deleción de gJ, uno que expresa la proteína fluorescente verde bajo el control del promotor temprano inmediato del CMV, el otro libre de cualquier inserción de ADN extraño. También se generó un mutante por recuperación gJ con un gen gJ reconstituido como un control para los mutantes de virus recombinantes. La deleción parcial de US5 tuvo como resultado una eliminación total de expresión de gJ en ambos mutantes por deleción (ADgJ4.1 y BDgJ 3,2) y la reintroducción de wt US5 en el genoma del mutante ADgJ4.1 reconstituyó la expresión gJ en el mutante por recuperación gJR4.3. La ausencia de reactividad en los ensayos de inmunofluorescencia y Western blots délos MAb anti-gJ y el suero de conejo anti-gJ, descartaron la expresión de formas truncadas de gJ del remanente de US5 de 668 pb que fue retenido en estos mutantes. Se ensayó la expresión de gC como un control para monitorear la presencia de expresión de glicoproteínas virales que no sean gJ en los virus mutantes. Tal como se observó en la Figura 5E, el gC expresado en cualquiera de los mutantes ADgJ4.1 y BDgJ3.2 (Fig. 5E, carriles 5 y 6) mostró una movilidad electroforética levemente disminuida en comparación con la gC expresado por las células infectadas gJR4.3 y USDA-ch (Fig. 5E, carriles 3 y 4). Como el gJR4.3 fue derivado de ADgJ4.1 y la gC está codificado por UL44 ubicada en el segmento grande del genoma, es poco probable que la movilidad alterada de gC en los mutantes por deleción gJ haya sido causada durante el evento de recombinación homóloga en el único segmento corto del genoma.
Experimentos de cinética de. replicación indicaron que los mutantes por deleción de gJ ADgJ4.1 y BDgJ3.2 se replicaron menos eficientemente que los virus que expresan gJ (cepa USDA-ch, mutante por recuperación gJR4.3). Se detectó un virus infeccioso en los sobrenadantes de las células infectadas con los mutantes por deleción de gJ en títulos 100 veces menores que el virus principal USDA-ch y el mutante por recuperación gJR en todas las veces que se testeó durante los experimentos de cinética de replicación. Comparado con el mutante por recuperación gJ, los mutantes por deleción gJ no mostraron impedimento en la cinética de entrada celular, lo cual índica que la glicoproteína J no juega un papel importante en la entrada viral de ILTV. Los mutantes por deleción de gJ ADgJ y BDgJ no se vieron afectados en su capacidad para expandirse de célula a célula dado que los tamaños de placa promedio de los mutantes por deleción de gJ no eran más pequeños que los tamaños de placa promedio de los virus USDA-ch o gJR.
De forma similar a la replicación de ADgJ4.1 y BDgJ3.2 en cultivo celular, la replicación de mutantes por deleción de gJ en huevos embrionados de gallina se vio afectada en comparación con el USDA-ch y el mutante por recuperación gJR4.3. Mientras que gJR4.3 alcanzó título 10 a 50 veces más altos que en células de CK, la replicación de ADgJ4.1 fue inicialmente menos eficiente pero mejoró luego de alcanzar en cuatro pasajes títulos solo diez veces menores (106 TCID50/ml) que el mutante por recuperación gJR4.3 (107 TCID50/ml). Por otra parte, la replicación de BDgJ3.2 en CAM fue muy ineficiente.
Los mutantes por deleción de gJ mostraron una fuerte atenuación tal como lo indica la ausencia de ADN viral en la conjuntiva y en la tráquea cuando se administró por vía conjuntiva/nasal a pollos de tres semanas de edad. Ningún mutante por deleción de gJ afectó la capacidad de que se rompiera el cascarón a causa del nacimiento al compararlo con el control de inoculación simulada, a pesar de la replicación eficiente en embriones de pollo de ADgJ4.1. Ambos mutantes fueron capaces de protegerse contra la enfermedad cuando se les administró in ovo tal como lo indica la considerable reducción en signos clínicos luego de una exposición grave al ILTV.
Ejemplo 1 : Generación de mutantes por deleción de la glicoproteína J del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV): Características de crecimiento in vitro y eficiencia de la protección luego de la administración in ovo.
Materiales y métodos
Células y virus. Se prepararon células primarias de riñón de pollo (CK) como se describió anteriormente (Tripathy (1998), A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, 4a ed.) y se utilizaron para la propagación del virus y la determinación de títulos como dosis infecciosa en cultivo de tejido 50 (TCID50). Se cultivó la línea celular de tumor de hígado de pollo LMH (Kawaguchi eí él., (1987) Cáncer Research, 47, 4460-4464) en medio de cultivo mínimo esencial (Dulbecco's Minimal Essential Médium (DMEM) complementado con suero fetal bovino al 10% y utilizado para la transfección y purificación de placa.
Las células LMH infectadas o transfectadas se incubaron en DMEM que contenía FBS al 2% y
antibiótico/antimicótico (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Las células se incubaron en una incubadora humidificada a 39 °C/CC>2 al 5 %. Las cepas de virus utilizadas fueron la cepa de referencia USDA (USDA-ch) y el aislante de campo 63140/C/08/BR previamente caracterizado como genotipo V (OIdoni eí él., (2008) Avian Dis. 52:59-63). La línea celular de ovario Spodoptera frugiperda Sf-9 fue utilizada para la generación de baculovirus recombinante así como para la producción de las proteínas recombinantes. Se cultivaron las células Sf-9 en un medio HyClone SFX® (Fisher, Pittsburg, PA) que contenía penicilina y estreptomicina a 28 °C.
Generación y purificación de glicoproteína J recombinante. Todos los oligonucleótidos utilizados fueron sintetizados por Integrated DNA technologies (IDT, Coralville, IA, EUA) y se enumeran en la Tabla 1.
A Enzimas de restricción utilizadas para el procedimiento de clonación.
^ Las secuencias de escisión de enzima de restricción están subrayadas. La secuencia que codifica la secuencia RGS-6xHis se muestra en minúscula. Los codones de inicio y terminación para la ORF de gJ están en negrita.
El US5 de marco de lectura abierto (ORF) que codifica a gJ (SEC ID N°: 1 ) se amplificó a partir de ADN viral purificado de ILTV 63140 por PCR de alta fidelidad mediante el uso de Pfx polimerasa (Invitrogen, Carisbad, CA) y los cebadores gJfw (SEC ID NO:2)/gJrev (SEC ID N°: 3) (Tabla 1 ).
El marco de lectura abierto de ILTV US5 (glicoproteína J codificada) es la SEC ID N°: 1.
El producto de PCR que codifica una secuencia de marcador RGS-6xHis ubicado en el extremo C se clonó en el vector de expresión eucariota pcDNA3® (Invitrogen, Carisbad, CA) y en el vector de transferencia de baculovirus pFastBacDual® (Invitrogen, Carisbad, CA). El baculovirus recombinante se generó utilizando el sistema Bac-to-Bac® (Invitrogen, Carisbad, CA) conforme a las recomendaciones del fabricante. Brevemente, el ADN plásmido pFastBacDual® recombinante se transformó en E.coli DHIOBac® (Invitrogen, Carisbad, CA) que contiene un vector transportador y un plásmido auxiliar necesario para la transposición del cásete de expresión de pFastBacDual® (Invitrogen, Carisbad, CA) al ADN de bacmid de baculovirus.
Se seleccionaron bacmids de baculovirus recombinantes tal como lo recomendó el fabricante y se identificaron por PCR utilizando GoTaq® polimerasa (Promega, adison, Wl). Una vez que se selecciona, el ADN de bacmid de baculovirus recombinante se transfecta en células Sf-9 utilizando el reactivo de transfección Mirus TransIT-Insecta (Roche, Basilea, Suiza).
Se recupera el baculovirus recombinante, se purificó por placa y se analiza por ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y por Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal a RGS-6xHis (Qiagen, Hilden, Alemania) y un anticuerpo anti-ratón conjugado con FITC (SIG A, St. Louis, MO). Para la propagación del baculovirus recombinante, se cultivaron las células Sf-9 en medios para cultivos por agitación y se infectaron a una multiplicidad dé infección (m.o.i) de 1 y a una densidad celular de 4x106 células/ml durante 72 horas a 28 °C. La glicoproteína J de ILTV se purificó de cultivos infectados Sf-9 por cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) mediante el uso del kit de Talón® (Clontech, Mountain View, CA) conforme a las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Brevemente, las células fueron sedimentadas por centrifugación a 3000 rpm, 4 °C durante 15 minutos, se descartó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en amortiguador de lisis que contiene Igepal 630 al 2% (p/v) (SIGMA, St. Louis, O) en amortiguador regulador (pH 8.0, kit Talón®) que contiene 1x inhibidores de proteasa completos (Roche, Basilea, Suiza). Luego de una incubación en hielo durante 15 minutos, el lisado se centrifugó tal como se describe anteriormente. Se agregó resina Talón® de pre lavado al sobrenadante y se incubó en una plataforma de oscilación durante 1 hora a temperatura ambiente. El lavado y la elución de las proteínas marcadas con His fue realizado tal como lo recomienda el fabricante. Se determinó la concentración de proteina de las proteínas eluídas mediante el Micro BCA Protein Kit (Pierce, Waltham, MA). La identidad y la pureza de las preparaciones se analizaron mediante SDS-PAGE y Western blot.
Generación de suero hiperinmune de glicoproteína J recombinante. Se produjo un suero hiperinmune en la Instalación de Anticuerpos Policlonales en la Universidad de Georgia (Athens, GA). Brevemente, a un conejo blanco de Nueva Zelanda (SPF) se le inyectó 400 9 de glicoproteína J purificada resuspendida en 500 µ? de PBS y un volumen equivalente de adyuvante completo de Freund. Se realizaron inyecciones de refuerzo con volumen adyuvante incompleto de Freund. El conejo fue desangrado luego de dos inyecciones de refuerzo y el suero se guardó a -20 °C.
Construcción de recombinación homologa y expresión de plásmidos. Para ¡nactivar la expresión de la glicoproteína J (gJ) se amplificaron fragmentos de ADN viral mediante PCR de alta fidelidad utilizando Pfx polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Los cebadores gJdel5'FW/gJdel5'REV (Tabla 1 , Figura 1c) que contienen sitios de escisión en la enzima de restricción (RE) EcoRI y Xmal, respectivamente, fueron utilizados para amplificar un fragmento de 1375 pb ubicado corriente arriba de US5. Dado que la región de codificación 3' de gJ se superpone parcialmente con la región codificante corriente abajo US6 de la glicoproteína D (gD), la secuencia codificante de gJ no fue eliminada por completo para evitar la inactivación de la expresión gD (Figura 1A a 1 H).
Los cebadores gJdel3'FW/gJdel3'REV (Tabla 1, Figura 1c) que contienen los sitios de escisión Sphl y Hindlll en RE se utilizaron para amplificar un fragmento de 1844 pb que contiene 658 pb en el extremo 3' de US5 (2958 pb) y 1191 pb en el extremo 5' de US6 (1305 pb). El ORF de EGFP se escindió del plásmido pEGFPI (Clontech, Mountain View, CA, EUA) mediante la digestión de la enzima de restricción con BamHI y Notl y se subclonó en pcDNA3 adecuadamente digerido (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) para obtener pcEGFP. La funcionalidad de pcEGFP se testeó por transfección transitoria en células LMH y por microscopía fluorescente.
El cásete de expresión de EGFP que consiste en el promotor de CMV, la EGFP, el ORF y la
secuencia de señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, se amplificó con Pfx polimerasa mediante los cebadores EGFPexFW/EGFPexREV que contienen un sitio de escisión en la RE Xmal (Tabla 1 ). El producto de PCR 5' de 1375 pb se escindió con EcoRI y Xmal, el cásete de expresión de EGFP se escindió con Xmal y Sphl y el producto de PCR del extremo 3' de 1844 pb se escindió con Sphl y HindIII. Se purificaron los fragmentos en gel y se ligaron al ADN de pUC19 escindido cón EcoRI/HindIII. Se clonó y analizó mediante digestión de restricción, transfección transitoria y microscopía de fluorescencia el plásmido recombinante pU-EGFPdeltagJ que contiene el inserto combinado de 4898 pb.
Para generar el mutante por recuperación de gj se amplificó un fragmento de 5483 pb de la región US que comprende US4, US5 y US6 (Figura 1A a 1 H) mediante PCR de alta fidelidad con Pfx polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los cebadores gJrescFW y gJrescREV (Tabla 1 , Figura 1c) de ADN viral y se clonó en pUC19 escindido con Xmal luego de la digestión de restricción con Xmal y purificación en gel de agarosa. Se analizó el plásmido recombinante mediante análisis de restricción de enzima y se confirmó la secuencia (pU-gJresc).
Para generar un mutante por deleción de gJ carente de secuencias de ADN externas insertadas se amplificó un fragmento de 1384 pb corriente arriba de US5, incluyendo US4, mediante PCR de alta fidelidad con cebadores de gJrescFW y gGrev (Tabla 1 , Figura 1f) con sitios de escisión en las RE Xmal y EcoRI, respectivamente. En segundo lugar se amplificó un fragmento de 1937 pb que comprende la parte 3' de US5 y US6 parcial con los cebadores gDpfw y gJrescREV (Tabla 1 , Figura 1f) que contienen EcoRI y Xmal.
Los dos fragmentos de PCR fueron escindidos con Xmal y EcoRI, ligados a pUC19 escindido con Xmal y NEB5alfa de E. coli (New England Biolabs, Ipswich, MA). Se analizaron los plásmidos recombinantes mediante digestión de restricción y secuenciación, y se seleccionó un plásmido (pU-deltagJ).
Se amplificó el marco abierto de lectura (ORF) que codifica el homólogo UL48 de ILTV a partir de ADN viral purificado mediante PCR de alta fidelidad con los cebadores UL48fw y UL48rev (Tabla 1 ) especificando los sitios de restricción de BamHI y Notl, respectivamente, para su uso como proteína auxiliar en la recuperación de virus luego de la cotransfección con ADN viral. El producto de PCR de 1211 pb fue incubado con BamHI y Notl y clonado en pcDNA3 adecuadamente escindido. Se analizó el plásmido recombinante pcUL48 mediante digestión de restricción y secuenciación. Se empleó un plásmido de expresión eucariota que codifica ICP4 de ILTV (pRclCP4).
Generación de mutantes por deleción de gJ de ILTV. Se sedimentaron viriones de la cepa de
provocación de USDA (USDA-ch) a partir de sobrenadantes de cultivos celulares de CK infectados mediante centrifugación a 82667x g y 4°C, durante 1 hora. Se preparó ADN viral mediante el método estándar de extracción con fenol-cloroformo y se analizó mediante digestión de restricción de enzimas con EcoRI. Las células LMH fueron cotransfectadas con 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 pg de ADN viral, 0.5 pg de cada uno de los plásmidos auxiliares (pRclCP4, pcUL48) y 1 pg del plásmido de recombinación (ya sea pU-EGFPdelta gJ, pU-gJresc o pU-deltagJ) con el kit de transfección de ARNm Mirus® (Mirus®mRNA transfection kit) (Roche, Basilea, Suiza).
Se rasparon los cultivos transfectados que presentaron efecto citopático (CPE) en el medio y se emplearon para infectar las células LMH en diferentes diluciones. Se inspeccionaron los cultivos con un microscopio de fluorescencia invertida (Axiovert® 40 CFL, Cari Zeiss Microlmaging, Inc. Thornwood, NY, EUA) y se aspiraron placas verdes fluorescentes con control visual por medio de una pipeta de 100 µ?. Las placas seleccionadas fueron resuspendidas en 100 µ? de DMEM/FBS al 2 % y utilizadas para infectar las células LMH. Se repitieron las purificaciones de las placas hasta que no se observaron más placas sin fluorescencia en los dos pasajes siguientes. Se preparó el análisis de ADN por PCR a partir de cultivos celulares infectados con el mini kit QiAmp® DNA Blood (Qiagen, Hilden, Alemania).
Ensayo de inmunofluorescencia indirecta. Se llevó a cabo doble inmunofluorescencia de las células LMH infectadas con anticuerpos monoclonales, suero de pollo y/o conejo para confirmar la ausencia de expresión de gJ por los mutantes por deleción y la reconstitución de la expresión de gJ en el mutante por recuperación. Las células LMH fueron sembradas en cámaras portaobjeto e infectadas con USDA-ch, ADgJ4.1 y gJR4.3 en una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 0.05. A 72 p.i., se fijaron las células con etanol helado y se procesaron para determinar inmunofluorescencia mediante anticuerpos monoclonales específicos para gJ (mab 25-5) o gC (mab 28-5).
El suero reconvalescente de pollos infectados con ILTV o el suero hiperinmune de gJ de conejos fueron empleados como anticuerpos de segunda especie para la inmunofluorescencia doble. Se diluyeron los MAbs anti gJ y gC a 1 :100 y el suero policlonal (ILTV, pollo, suero reconvalescente, suero hiperinmune de gJ de conejo) a 1:200 en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Luego de la incubación con los anticuerpos primarios, las células fueron lavadas con PBS tres veces y se visualizó la unión de MAbs con un anticuerpo secundario de cabra anti ratón conjugado con Cy5 mientras que los anticuerpos de pollo y/o conejo unidos fueron visualizados mediante la incubación con anticuerpos de cabra antiespecies conjugados con FITC (SIGMA). Los anticuerpos secundarios antiespecies fueron diluidos en PBS con azul de Evans al 0.001 % e incubados durante 1 hora. Se lavaron las células y se enjuagaron brevemente con agua destilada antes de secarlas al aire, y se montaron en 1 ,4 diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) al 2.5 %/glicerol al 90 %. Se revisaron los portaobjetos, ya sea mediante microscopía convencional de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia Axiovert ® 40 CFL (Cari Zeiss Microlmaging GmbH, Jena, Alemania) o mediante microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser LSM 510 (Cari Zeiss Microlmaging GmbH, Jena, Alemania).
Western bllot. Se infectaron las células de CK con la cepa USDA-ch o el mutante ADgJ4.1 a una m.o.i. de 0.01. El medio se clarificó a partir de desechos de células por centrifugación a baja velocidad (2000 x g, 10 minutos, 4 °C) tres a 4 días p.i., cuando la mayoría de las células se encontraban separadas. Se sedimentaron viriones a partir de los sobrenadantes por ultracentrifugación a 82667 x g, 4 °C durante 60 minutos. Se determinó la concentración de proteína mediante el Micro BCA Protein Kit (Pierce, Waltham, MA). Se lisó el sedimento en Tris-CI 20 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM, NaCI 150 mM que con 1 x inhibidor total de proteasa (Roche, EJasilea, Suiza) y 0.5 vol de N-laurilsarcosinato al 3%, Tris-CI 75 mM pH 8.0, EDTA 25 mM. Se cargaron treinta µg de proteína por carril y se separaron en condiciones dé reducción con eiectroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 10% (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia semi seca en Tris 25 mM, glicina 150 mM, metanol al 10% mediante una célula de transferencia Transblot SD (BioRad, Hercules, CA, EUA) a 22 V durante 80 minutos.
Se bloquearon las membranas en leche descremada en polvo al 5 % en TBS-T (3.0 g de Tris, 8.8 g de NaCI, 0.2 g de KCI por L, pH 7.4) durante la noche a 4 °C. Se diluyeron los MAbs a 1 :500 y el suero hiperinmune de conejo anti-gj se diluyó a 1 :1000 en TBS-T y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego de la incubación, se lavaron las membranas tres veces durante 10 minutos con TBS-T y se bloquearon nuevamente con leche en polvo al 5 % en TBS-T antes de la incubación con anticuerpos antiespecies (SIGMA) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluidos en TBS-T durante 2 horas a temperatura ambiente.
Luego de tres lavados con TBS-T se detectó HRP inmovilizada mediante quimioluminiscencia con el sustrato Immobilon Western HRP (Millipore, Billerica, MA, EUA). Se visualizó la quimioluminiscencia con Kodak Gel Logic Imaging System (Carestream Health, New Haven, CT, EUA). También se analizó mediante Western blot la ausencia de gJ en células infectadas por mutantes, así como la reconstitución de la
expresión de gJ en las células infectadas por mutantes por recuperación. En pocas palabras, las células de CK fueron infectadas a una m.o.i. de 0.1 con USDA-ch, gJR4.3, BDgJ3.2 y ADgJ4.1. Las células infectadas se lisaron en solución amortiguadora de muestra de SDS-PAGE 48 horas p.i. Se separaron cantidades similares mediante SDS-PAGE (poliacrilamida al 10 % para gC y al 7.5 % para gJ) y se electrotransfirieron a membranas nitrocelulosa. Se sondearon las transferencias con suero hiperinmune de conejo anti gJ o con Abs específicos para gJ y gC.
Replicador) y cinética inicial de mutantes y virus de tipo salvaje. Se llevó a cabo cinética de replicación en dos etapas para determinar si la falta de expresión de gJ influenció la replicación in vitro de los mutantes virales. En pocas palabras, las células de CK se infectaron con USDA-ch, ADgJ4.1 , BDgJ3.2 y gJR4.3 a una m.o.i. de 0.01. Luego de la adsorción durante 60 minutos a 39 °C, se retiraron los inóculos de las células, se lavaron con el medio y las células se superpusieron con D EM/FBS al 2 %/antibiótico y se incubaron a 39 °C. Se recolectaron sobrenadantes y se determinaron títulos de virus como TCIDso en células de CK 0, 24, 48 y 72 horas después de la infección. Para evaluar si existía un defecto en la entrada viral para mutantes por deleción de gJ en comparación con USDA-ch y el mutante por recuperación de gJ, se adsorbieron 500 unidades formadoras de placas (pfu) de cada uno de los tres virus mutantes y del virus parental USDA-ch a células L H en placas de 6 pocilios durante 60 minutos en hielo. Se retiraron los inóculos y las células se superpusieron con medio tibio y se incubaron a 39 °C. Se inactivó el virus extracelular a 5, 10, 20, 40 y 60 minutos mediante incubación con solución ¡ amortiguadora citrato (ácido cítrico 40 m , KCI 10 mM, NaCI 135 mM) pH 3.0 durante 1 minuto a temperatura ambiente, se lavó una vez con DMEM/FBS al 2 %/antibiótico y finalmente se superpuso con MEM con metilcelulosa al 0.5 %, FBS al 2 % y antibiótico. Las células se fijaron con formaldehído al 5 % en PBS y se tiñeron con cristal violeta al 1 % en etanol al 50 %, 5 días p.i. Se contaron las placas, se expresaron las cantidades en diferentes momentos como porcentaje de la cantidad de placas respectivas a 60 minutos y se graficaron en función de los diferentes momentos de tiempo.
Propagación de virus mutantes y de tipo salvaje en embriones de pollo. Se inocularon las membranas corioalantoideas (CAM) de embriones de pollo de 9 días con 100 µ? de ADgJ4.1 y BDgJ3.2 que contiene 10" de TCID50, para evaluar la replicación de los mutantes de gJ ADgJ4.1 y BDgJ3.2 en huevos embrionados, respectivamente. Se incubaron los huevos a 37 °C durante 5 días, se recolectaron CAM y se homogeneizaron en medio de cultivo celular con el sistema FastPrep® (MPbiomedical, Solón, OH). Se
determinaron los títulos en el sobrenadante como TCID50 en células de CK primarias. Se utilizaron los restos de los sobrenadantes en pasajes en serie en CAM de embriones de pollo de 9 días tal como se describe anteriormente.
Inoculación conjuntival/nasal de mutantes y experimento de provocación. Se inocularon gallinas Leghorn blanca de cuatro semanas libres de agentes patógenos ' específicos (SPF) por vía conjuntiva/nasal con 104 TCID50 de los mutantes ADgJ4.1 y BDgJ3.2 y cepa de USDA de tipo salvaje (USDA-ch) para evaluar la virulencia de los mutantes del virus. Se realizó inoculación simulada con el medio de cultivo celular como control a un grupo en incubación. Se monitorearon los signos clínicos a diario y se califican tal como se describió anteriormente en una escala de 0-5 (Oldoni ef él.,' (2009) Avian Dis. 52:59-63) del día 1 al día 6 luego de la inoculación. Tres semanas después de la inoculación los pollos inoculados con mutantes de ILTV fueron expuestos a 104 TCID50 de la cepa USDA por cada ave por vía conjuntiva o nasal para determinar si se encontraban protegidos contra una infección provocada. Se monitorearon los signos clínicos hasta seis días luego de la exposición y se calificaron tal como se describe anteriormente.
PC cuantitativa. Se recolectaron muestras con hisopo cuatro días después de la primera inoculación y se procesaron por medio del kit QiAmp® DNA Blood Mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania). Se cuantificaron las copias del genoma viral mediante PCR en tiempo real tal como se describió (Callison et él., (2007) Avian Dis. 50:50-54).
Inoculación in ovo de mutantes y experimento de provocación. Se inocularon veinticinco embriones SPF de 18 días (Sunrise Farmas, Catskill, NY, EUA) con ADgJ4.1 o BDgJ3.2 para determinar el nivel de atenuación de los mutantes de gJ en huevos embrionados. Se realizó inoculación simulada a un tercer grupo de embriones con medio de cultivo celular estéril. Los huevos inoculados fueron incubados adicionalmente y se determinó su capacidad de ruptura del cascarón. Se exponen los pollos a la cepa USDA-ch a una dosis de 105 TCID50 por pollo inoculado mediante la vía conjuntiva o nasal 35 días después de que rompan el cascarón. Se evaluaron los signos clínicos conforme a una escala de 0 a 5 tal como lo describieron anteriormente Odloni et él. (2009) Avian Dis. 52:59-63 hasta 7 días después de la exposición.
RESULTADOS
Expresión de glicoproteína J recombinante. Se separó la gJ purificada expresada a partir de un baculovirus recombinante en células Sf-9 mediante SDS-7.5%PAGE y se analizó mediante tinción con azul de Coomassie y Western blot (Figura 2). Se observaron varias proteínas de alto peso molecular en el gel
teñido con azul de Coomassie (Figura 2, carril 1 ). En un Western blot paralelo los MAb anti-RGS-6xHis se unen a proteínas similares y confirman la presencia de la secuencia RGS-6xHis (carril 2). Tanto los MAb anti-gJ (carril 3) como los sueros reconvalescentes de pollos infectados con ILTV (carril 4) se unieron a cuatro proteínas de aproximadamente 80, 100, 140 y 180 kDa. Adicionalmente, el suero de pollo reconoció proteínas a aproximadamente 60 kDa y 40 kDa. Aunque la glicoproteína J recombinante fue suficientemente enriquecida durante el proceso de purificación, las proteínas celulares aún son detectadas mediante tinción con Coomassie en los geles (carril 1 ). Sin embargo, tres inmunizaciones con la preparación de proteína gJ recombinante resultaron en un suero hiperinmune de ratón especifico que fue empleado en inmunofluorescencia y Western blot para caracterizar los mutantes por deleción de gJ (Figura 2).
Generación de mutantes por deleción de gJ. Se contransfectó ADN de la cepa de provocación de
USDA (USDA-ch) con plásmido pU-EGFPdeltagJ y los plásmidos auxiliares pRclCP4 y pcUL48. Cinco días después de la transfeccion, varias placas individuales que mostraron fluorescencia verde fueron aisladas utilizando el microscopio de fluorescencia inverso. Se purificaron por placas tres placas en forma secuencial dos veces en células LMH. Solo fueron seleccionadas y luego propagadas placas que produjeron una progenie exclusivamente de placas de fluorescencia verde. Se analizó el ADN de células infectadas con el clon ADgJ4.1 que codifica EGFP mediante PCR para confirmar la precisión de la recombinación homóloga (Figura 3A a 3E). Se utilizó ADN de ILTV de tipo salvaje como control.
Un cebador inverso unido al promotor de CMV (CMVprev) y el cebador directo (gGupfw) complementario a una secuencia ubicada corriente arriba del orf de gG de US4 produjeron el producto esperado de 2378 pb (Figura 1A a 1 H y Figura 3A), un cebador directo complementario al ORF de EGFP (EGFP578fw) y un cebador inverso (Clalglrev) complementario a la región corriente abajo de US7 (Figura 1 A a 1 H y Figura 3A) amplificaron un producto de 2480 pb, tal como se esperaba. Este resultado indicó que la inserción del cásete de expresión de EGFP ocurrió en el sitio diana del genoma.
Se llevó a cabo análisis PCR con cebadores que se unen a ambos genomas virales pero fuera de la secuencia de recombinación para comprobar la ausencia de ADN de virus de tipo salvaje en la preparación de mutante del virus ADgJ4.1. Los cebadores de BamHIgGfw y gJ2381rev (Figura 1A a 1 H, Tabla 1 ) amplificaron un fragmento de 3015 pb y 2215 pb cuando se emplearon ADN de USDA-ch y ADgJ4.1 como plantillas, respectivamente (Figura 3B). Este resultado demostró que una secuencia de ADN más corta se encontraba presente en el sitio diana tal como lo indicaba el fragmento de PCR más corto. Ambos
fragmentos de PCR fueron digeridos con BamHI con el fin de comprobar la identidad del inserto diana. Se escindió el producto de PCR de 2215 pb obtenido a partir de ADgJ4.1 en el sitio de BamHI ubicado entre el promotor de CMV y el ORF de EGFP, lo que resulta en dos fragmentos de 1346 y 869 pb, mientras que el producto de PCR amplificado a partir de ADN de USDA-ch permaneció intacto (Figura 3C).
Los cebadores empleados para PCR también fueron utilizados para secuenciar parcialmente el producto de PCR a partir de ADgJ4.1 y el ADN de tipo salvaje con el fin de confirmar las secuencias del ADN mutante y de tipo salvaje. Se propagó el mutante ADgJ4.1 por deleción de gJ que expresa EGFP en células de CK, se purificaron viriones y se preparó ADN genómico viral para generar un mutante de ILTV con un gen de gJ ¡nactivado que no porta ADN extraño. Luego de la cotransfección de células L H con plásmidos auxiliares y el plásmido de recombinación pU-deltagJ, se aislaron, se purificaron y se propagaron muchas placas no fluorescentes. En este caso, el criterio de selección fue la ausencia^ de fluorescencia verde. Tres de estas placas de virus fueron purificadas y denominadas BDgJ1.1 , BDgJ3.1 o BDgJ3.2. Se preparó y se analizó mediante PCR el ADN viral de los clones de BDgJ. Los cebadores BamHIgGfw y gJ2381rev produjeron fragmentos de 830 pb con ADN viral de BDgJ y un fragmento de 3015 pb con ADN de USDA-ch de tipo salvaje (Figura 1G y Figura 3D). Las secuencias obtenidas a partir dé ambos fragmentos de ADN mediante cebadores de PCR confirmaron la identidad de ambos fragmentos.
A continuación se generó un mutante por recuperación en el que la expresión de gJ fue restaurada. Se empleó el ADN viral de ADgJ4.1 para la cotransfección con pU-gJresc y plásmidos auxiliares. Se esperaba que la recombinación del ADN viral mutante con el inserto de pU-gJresc reparara la sección mutada en el segménto Us y restaurara completamente US5, lo que resultaría en un mutante idéntico al virus de tipo salvaje. Nuevamente se seleccionaron las placas no fluorescentes, se purificó con ellas el virus y se propagó. >
Se preparó y analizó mediante PCR ADN viral de tres de las placas denominadas gJR1.3, gJR2.4 o gJR4.3. Las amplificaciones con cebadores BamHIgGfw y gJ2381rev produjeron fragmentos de 3015 pb a partir del clon gJF( 4.3 y ADN de USDA-ch tal como se esperaba (Figura 1G y Figura 3E), lo que indica la correcta inserción a partir del plásmido recombinante pU-gJresc. No se obtuviéron productos de PCR a partir del ADN de los clones 1.3 y 2.4, y, como consecuencia, estos virus fueron descartados.
Deleción parcial de US5 elimina la expresión de gJ. Se evaluaron la falta de expresión de gJ por ADgJ4.1 y la reconstitución de la expresión de gJ en el mutante gJR4.3 por recuperación mediante
¡nmunofluorescencia y microscopía de fluorescencia confocal de barrido láser (Figura 4A a 4C). Las células LMH fueron infectadas con USDA-ch como control positivo.
Las células infectadas mostraron señalización positiva (fluorescencia-Cy5) con el MAb anti-gC y el Ab anti-gJ. La especificidad de la fluorescencia fue confirmada dado que la fluorescencia-Cy5 solo se encontraba presente en aquellas células que reaccionaron con el suero policlonal anti-ILTV de pollo (Figura 4A). Las células infectadas con el mutante ADgJ4.1 por deleción de gJ también unieron anticuerpos de pollos infectados con ILTV, así como el MAb de gC, pero no unieron el MAb de gJ (Figura 4B), que indica la presencia de un ILTV recombinante incapaz de expresar gJ. A continuación se investigó la presencia o ausencia de la expresión de gJ luego de infectar células LMH con el mutante por recuperación gJR4.3.
La reconstitución de la expresión de gJ en células infectadas (Figura 4C) fue confirmada por doble inmunofluorescencia con el MAb anti-gC (fluorescencia-Cy5) y el antisuero de conejo anti-gJ (fluorescencia-FITC). Además, se determinó la ausencia de gJ en viriones ADgJ4.1 mediante Western blot (Figura 5A a 5E). El MAb anti-gJ reaccionó con proteínas de alto peso molecular de los viriones de USDA-ch de aproximadamente 85, 115 y 160 kDa (Figura 5A). En contraste con un informe previo en el que se identificaban las proteínas de aproximadamente 85, 115 y 200 kDa en viriones de la cepa 489 de ILTV,
i
inicialmente la forma de 200 kDa de gJ no fue detectada en viriones purificados de la cepa USDA-ch.
El MAb anti-gJ no reaccionó con ninguna de las proteínas del virión ADgJ4.1. En contraste el MAb anti-gC reaccionó con una proteína de aproximadamente 65 kDa en preparaciones de virión de la cepa USDA-ch y del mutante ADgJ4.1 por deleción de gJ (Figura 5B). La falta de unión del MAb anti-gJ a las preparaciones de virión de ADgJ4.1 demuestra que el epítopo correspondiente estaba ausente. Por lo tanto, también se sondaron los Western blots de preparaciones de virión de USDA-ch y ADgJ4.1 con un suero policlonal, el suero hiperinmune de conejo anti-gJ. No se detectó unión a proteínas de virión de ADgJ4.1 , pero en contraste se observaron reacciones fuertes con las tres especies de gJ de 85, 115 y 160 kDa en la preparación de virión de USDA-ch (Figura 5C). La incubación con suero preinmune del mismo conejo como control de especificidad tuvo como resultado reacciones inespecíficas muy leves. También fueron analizados los Western blots de preparaciones de virión de USDA-ch y cultivos de células de CK infectadas con USDA-ch, ADgJ4.1 , BDgJ3.2 y el virus gJR4.3 de recuperación de gJ para determinar la presencia de gJ con un suero policlonal de conejo anti-gJ (Figura 5D). Las células de CK no infectadas sirvieron como control negativo. El ajuste de las condiciones de electroforesis y de transferencia para favorecer la detección de proteínas de alto peso molecular fue exitoso para determinar la apariencia de las diferentes formas de gJ.
El suero policlonal de conejo reconoció proteínas de peso molecular de aproximadamente 85, 115, 160 y 200 kDa en viriones de USDA-ch purificados (Figura 5D, carril 1 ) y en cultivos celulares infectados con USDA-ch y el mutante por recuperación gJR4.3 (Figura 5D, carriles 3 y 4). Se observó una banda a aproximadamente 45 kDa (Figura 5D, carriles 2-6) en cultivos de células no infectadas e infectadas que indica reactividad del suero de conejo con una proteína celular.
Se llevó a cabo Western blot paralelo mediante incubación de lo transferido con suero preinmune de conejo y el análisis tuvo como resultado reacciones muy leves que indican que las proteínas reconocidas por el suero policlonal de conejo de gJ eran, de hecho, de ILTV específicas para gJ. Estos resultados confirmaron la ausencia de expresión de gJ en los mutantes por deleción de gJ. Todas las muestras fueron también sondadas en paralelo con el MAb anti-gC como control (Figura 5E). Se detectó una proteína de 65 kDa con el MAb anti-gC en todas las muestras que contenían ya sea células infectadas (Figura 5E, carriles 3-6) o viriones (Figura 5E, carril 1 ), que no se encontró en células no infectadas (Figura 5E, carril 2). Esto demuestra la presencia de cantidades comparables de proteínas virales en las muestras de células infectadas.
Replicación de mutantes de ILTV por deleción de gJ en cultivo celular y embriones de pollo.
Se redujeron los títulos virales en los sobrenadantes de las células de CK infectadas con ADgJ4.1 y BDgJ3.2 en 1.5 a 2 log10 en comparación con USDA-ch y el mutante por recuperación gJR4.3 24, 48 y 72 horas p.i. (Figura 6A). Es posible atribuir el fenotipo observado a la ausencia de expresión de gJ, dado que la eficiencia de replicación se restauró completamente en el mutante gJR4.3 por recuperación del virus (Figura 6A). Es posible impedir la replicación viral mediante la ausencia de expresión de gJ en cualquier etapa durante el proceso que abarca desde la entrada hasta la salida. Los experimentos para investigar si se impide la entrada del virus no demostraron diferencias significativas en la capacidad de USDA-ch, los mutantes por deleción de gJ (ADgJ4.1.and BDgJ3.2) y el mutante por recuperación (gJR4.3) de entrar en las células LMH (Figura 6B). Esto indicó que la entrada viral no fue afectada en forma significativa por la falta de expresión de gJ.
Uno de los métodos estándar para propagar ILTV es por medio de la membrana corioalantoica (CAM) de los embriones de pollo (CE). Se evaluó la capacidad de replicación de los mutantes por replicación en CAM y se comparó con los títulos virales obtenidos en células de CK. Los títulos virales para el mutante
por recuperación gJR4.3 (TCID50 7.4 log10) y USDA-ch de tipo salvaje (TCID50 8.0 log10) fueron de 10 a 50 veces más elevados en CAM de CE (Tabla 2) que en células de CK (Figura 6A), respectivamente. El mutante ADgJ4.1 por deleción de gJ que expresa EGFP alcanzó un titulo de 6.40 lóg10 luego de cuatro pasajes consecutivos por CAM, mientras que los títulos del mutante BDgJ3.2 de gJ en CAM variaron entre 2.50 y 1.75 luego de tres pasajes consecutivos (Tabla 2). !
Tabla 2. Títulos TCID50 de mutantes de ILTV por deleción de gJ luego del pasaje en CAM de embriones SPF:
A Títulos expresados como Iog10 de TCID50 en células de riñón de pollo, 8 No realizado.
Atenuación de mutantes de gJ en pollos y su eficiencia de protección. Tal como se esperaba, los pollos inoculados con cepa USDA-ch de tipo salvaje y gJR desarrollaron signos característicos de la enfermedad entre los días 3 y 6 p.i. luego de la infección de pollos SPF dé 4 semanas. Los signos de enfermedad más prominentes fueron la conjuntivitis grave y la depresión. En contraste, pocos de los pollos inoculados con ADGJ4.1 mostraron conjuntivitis muy leve los días 4 y 5 p.i.¿ y los pollos inoculados con
BDgJ no mostraron signos clínicos, en forma similar al grupo de control.
Se realizaron ensayos de replicación viral mediante PCR cuantitativa (qPCR) de muestras recogidas con hisopo de la conjuntiva y la tráquea 4 días p.i. (Tabla 3) ;
Tabla 3. Detección de ADN viral en el día 4 después de la infección.
A Se investigaron muestras de las muestras tomadas con hisopos mediante qPCR (Callison et él., (2003) Avian Dis. 50:50-54. 8 Cantidad de copias de ADN.
Dado que el límite de detección del ensayo de qPCR es de 25 copias de ADN viral, se considera que las muestras de pollos con simulación de infección e infectados por muíante por deleción de gJ son negativas para la presencia de ADN viral. En contraste, en el caso de muestras de pollos infectados por USDA-ch de tipo salvaje o el mutante por recuperación gJR4.3 se detectaron; cantidades comparables de ADN viral.
las aves inoculadas con los mutantes por deleción de gJ y las aves dé control no infectadas fueron expuestas al virus USDA-ch de tipo salvaje. Se observaron signos clínicos de enfermedad en aves infectadas con los mutantes por deleción de gJ ADgJ4.1 y BDgJ3.2 y en las aves de control no infectadas. El pico de signos clínicos se observó entre los días 4 y 5 luego de la infección provocada. Los signos de enfermedad más prevalentes fueron conjuntivitis y depresión. No se observaron diferencias significativas en la gravedad de los signos clínicos detectados en los grupos de pollos no vacunados/expuestos y los pollos inoculados con ADgJ4.1 y BDgJ3.2 (Figura 7A).
Los mutantes de gJ proporcionan protección luego de la vacunación in ovo. En el momento del nacimiento no se observaron diferencias significativas en los índices de nacimientos entre los grupos inoculados con ADgJ4.1 y BDgJ3.2 en comparación con los embriones a los que se realizó inoculación simulada, lo que indica la atenuación adecuada de los mutantes por deleción de gJ en la inoculación in ovo.
No se observaron diferencias significativas durante el período de crianza en el grupo al que se realizó inoculación simulada. ;
El día 35 los pollos fueron expuestos a inoculación por 105 TCID50/pollo conjuntiva y nasalmente. Luego de la exposición, se observaron signos clínicos del día 1 al día 7 y 100 % de los pollos no vacunados presentaron signos clínicos graves que indican una exposición válida. El 39 % de los pollos inoculados con el mutante BDgJ mostró signos clínicos, mientras que el resto de los pollos no presentó signos clínicos en momento alguno. El 14 % de los pollos inoculados in ovo con ADgJ4.1 presentó signos clínicos, mientras que 86 % se mantuvo sano a lo largo del experimento (Figura 7B). Estos datos muestran que los mutantes por deleción de GJ, en particular ADgJ4.1 , fueron capaces de inducir protección contra ILT luego de una infección por exposición a dosis elevadas, cuando se inocularon in ovo.
Ejemplo 2: Reemplazo del cásete de proteína fluorescente verde (GFP) en ILTV-AgJgreen con una secuencia que no codifica las proteínas de ILTV.
Diseño del ADN recombinante para la generación de una nueva ILTV con eliminación de gJ.
Se predijo que la secuencia que codifica (CDS) la glicoproteína D (gD) US6 abarcaba del nucleótido 132675 al 133808, con una superposición de 12 nucleótidos con la CDS (129739 a 132696) de la glicoproteína J, US5, a partir de la secuencia de nucleótidos de ILTV tal como fue almacenada en Genbank con el número de acceso NC_006623.1. Dado que el sitio de inicio de la transcripción no ha sido mapeado para gD de ILTV, se consideró una CDS más larga que inicia en el nucleótido 132504. En ese caso, US6 tendría una superposición de 192 pb con US5. No se modificaron las secuencias de promotor corriente arriba de US6 en el diseño del mutante de gJ de ILTV delta novedoso para asegurar la expresión de US6. Con el fin de modificar el ORF (US5) de gJ se alteró en forma significativa la secuencia del extremo 5" (2357 pb) de US5 mediante cortes de secciones de aproximadamente 10 pb que se insertaron diez pb corriente abajo. Esto se llevó a cabo 50 veces y tuvo como resultado una secuencia sin sentido sin cambiar el contenido de GC. De manera adicional, se introdujeron al azar aproximadamente 50 intercambios de CG y AT. El fragmento de 321 nucleótidos del extremo 3' de US5, que incluye el primer codón de inicio de US6 posible, además de 130 nucleótidos corriente arriba de la región promotora potencial no sufrieron modificaciones. Se agregaron secuencias originales a los extremos 5' y 3' de US5 manipulado para la recombinación honmóloga en el genoma viral. En el extremo 5' se agregó un fragmento de 479 pb corriente arriba del codón de inicio de US5 destruido, que comprende 270 nucleótidos del extremo 3' de US4 y una secuencia de 209 nucleótidos entre el codón de parada de US4 y el anterior codón de inicio de US5. Se agregó un fragmento de 450 pb de la parte no superpuesta de US6 en el extrémo 3'. El fragmento de'ADN de 3876 pb fue sintetizado y clonado en el plásmido bacterial pUC57 (GenScript, Piscataway, NJ).
Generación de ILTV NAgJ recombinante
Se digirió por restricción el plásmido recombinante que contenía la secuencia de ADN (3876 pb) con
Hindlll y EcoRI para liberar el inserto y se separó mediante electroforesis en gel de agarosa. Se eluyó el inserto de 3876 pb del gel y se utilizó para la cotransfección con ADN viral del mutante GAgJ por deleción de gJ verde fluorescente. Las células LMH fueron transfectadas a un 80 % de confluencia con el kit de transfección TransIT mRNA (Roche, Indianápolis, IN). Se lavaron las células en el sobrenadante cinco días después de la transfección y se almacenaron a -80 °C. Se emplearon diluciones seriales para infectar células LMH en placas de 6 pocilios. Se identificaron las placas no fluorescentes mediante microscopía de fluorescencia viva y las placas no fluorescentes fueron aspiradas mientras eran controladas visualmente e inoculada en nuevos cultivos celulares LMH. Se repitió la purificación de placas una vez para excluir la contaminación con virus verde fluorescente parental. Se inocularon aislados NAgJ purificados de placas en cultivos celulares de riñon de pollo principales y fueron incubados durante 3 días a 39 °C. Se lavaron las células infectadas en el sobrenadante y se almacenaron alícuotas a -80 °C. Se utilizó una alícuota de cada aislado de placa para preparar ADN con el mini kit QiAmp DNA Blood. Se analizaron los genotipos de aislados de placas mediante PCR. Se obtuvieron productos de PCR de 5591 pb a partir de tres aislados diferentes de placas de NAgJ, así como a partir del ADN del virus de control de USDA, y se obtuvo un fragmento de 4901 pb con ADN viral del virus parental GDgJ, utilizando los cebadores 25upUS4FW/Clalglrev (Figura 8). Los cebadores se unen a regiones en el genoma viral que se encuentra fuera de la región recómbinante. Los sitios de unión en el mutante NAgJ deben ser idénticos a los del virus USDA de tipo salvaje original y también son idénticos en el virus GDgJ parental, que originalmente se derivó de USDA. La amplificación del fragmento de 5591 pb demostró que los sitios de unión del cebador se encuentran presentes y que la región genómica entre ellos es de la longitud esperada, lo que no difiere de la de USDA, pero es diferente a la del GDgJ parental. Se eluyeron los productos de PCR de aislados de NAgJ del gel de agarosa para clonación y secuenciación. Con el fin de confirmar la presencia de la secuencia artificial de gJ sin sentido en los aislados de placas, se llevó a cabo otra PCR con los cebadores NgJ1390fw/NgJ2483rev, que se unen exclusivamente a la secuencia de gJ sin sentido y no al ADN de USDA o del virus GAgJ. Tal como se esperaba, solo se amplificaron productos de 1112 pb (Figura 8) de los aislados de placa de NAgJ y no se obtuvieron productos utilizando ADN del virus USDA como plantilla.
A continuación se clonaron y se secuenciaron los productos de PCR de 5591 pb que comprenden US4, US5 sin sentido y US6 de los aislados de placas de NDgJ. Se purificó el nuevo virus delta gJ (NAgj) que no expresa la proteína fluorescente verde y que carece de ADN extraño dos veces y se confirmaron los genotipos de tres aislados individuales mediante PCR diferentes con cebadores que permiten la diferenciación de ILTV parental o de tipo salvaje. El NAgJ se propagó en células de riñón de pollo. Se han obtenido tres virus purificados por placas a través de 3 pasajes en células de CK, y los virus purificados por placas tienen títulos que varían de logio 5.5 a log10 6.4. Los títulos son mayores que aquellos obtenidos con el GAgJ.
Se analiza la capacidad de atenuación y protección de las preparaciones sin virus de la cepa NAgJ en pollos broiler y gallinas ponedoras. En un principio la cepa NAgJ se aplica en gotas oculares a las dos y seis semanas de edad. Luego se analiza la eficacia de protección cuando se aplica este virus en aerosol a pollos de 1 día e in ovo.
Generación y propagación de FAGj
Se generó un mutante por deleción de gJ recombinante con la proteína de fusión (F) de la cepa LaSota del virus de la enfermedad de Ne castle con base en el mutante por deleción de gJ que expresa GFP (GAgJ) previamente generado. Se eliminó el cásete de expresión de GFP y se reemplazó con el gen de fusión de la cepa LaSota del NDV. Se recuperó el FAgJ luego de la cotransfección con ADN viral de GAgJ, los plásmidos auxiliares pRclCP4 y pcUL48 y un fragmento de ADN recombinante. Se purificaron por placas los virus que no expresaban GFP dos veces y se confirmaron los genotipos de tres aislados individuales que permiten la diferenciación de ILTV parental o de tipo salvaje mediante PCR. Dos de los virus identificados mediante purificación por placas fueron pasados dos veces en células de riñón de pollo y alcanzaron títulos de log10 4.6 y log10 5.12 TCID5o por ml.
Se presentan materiales, composiciones y componentes que pueden ser empleados para, en conjunción con, en la preparación de o que son productos de los métodos y composiciones descritos. Estos y otros materiales se describen en la presente, y se entiende que cuando se describen combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, mientras que la referencia específica de cada combinación y permutación individual y colectiva de las varias de estos compuestos puede no describirse explícitamente, cada uno se contempla específicamente y se describe en la presente. Por ejemplo, si se describe y plantea un método y se plantea una variedad de modificaciones que se pueden realizar a una cantidad de moléculas que incluye el método, se contemplan específicamente toda y cada combinación y permutación del método y las modificaciones que son posibles salvo que se indique específicamente lo contrario. Asimismo, también se contempla y se describe específicamente cualquier subconjunto o combinación de estos. Este concepto se aplica a todos los aspectos de la presente solicitud que incluyen, de modo no taxativo, las etapas en los métodos para utilizar las composiciones descritas. Por lo tanto, si existe una variedad de etapas que pueden ser llevadas a cabo, se entiende que cada una de estas etapas adicionales puede ser realizada con cualquier etapa específica del. método o combinación de etapas del método de los métodos descritos, y que cada combinación o subconjunto de combinaciones se encuentra específicamente contemplado y debe ser considerado como descrito.
Las publicaciones citadas en la presente y el material por el que fueron citadas se incorporan en la presente específicamente mediante esta referencia en su totalidad.
Claims (46)
- I . Una composición que comprende un virus de laringotraqueitis infecciosa (ILTV) atenuado que comprende una mutación de la glicoproteína J, donde la mutación inhibe la expresión de la glicoproteína J.
- 2. La composición de la reivindicación 1 , donde el ILTV atenuado comprende la cepa de provocación de USDA, USDA-ch.
- 3. La composición de las reivindicaciones 1 o 2, donde la mutación inhibe la expresión de la proteína glicoproteína J.
- 4. La composición de la reivindicación 3, donde la mutación comprendé una mutación del elemento del promotor de la glicoproteína J y donde la mutación inhibe una función del elemento del promotor.
- 5. La composición de las reivindicaciones 1 o 2, donde la mutación comprende la eliminación de una secuencia de nucleótidos de la glicoproteína J.
- 6. La composición de la reivindicación 5, donde la mutación comprende una eliminación total o parcial dé la SEC ID N°: 1.
- 7. La composición de la reivindicación 6, donde la mutación comprende una eliminación de los nucleótidos 1 -2291 de la SEC ID N°: 1.
- 8. La composición de la reivindicación 6, donde se inserta un cásete de expresión de proteína indicadora en el punto de la eliminación.
- 9. La composición de la reivindicación 8, donde la proteína indicadora es proteína fluorescente verde.
- 10. La composición de la reivindicación 6, donde la mutación comprende una eliminación de los nucleótidos 1-2183 de la SEC ID N°: 1.
- I . La composición de la reivindicación 10, donde se inserta un cásete de expresión de proteina indicadora en el punto de la eliminación.
- 12. La composición de la reivindicación 1 1 , donde la proteína indicadora es proteína fluorescente verde.
- 13. La composición de la reivindicación 10, donde se inserta un cásete de expresión de proteína viral en el punto de eliminación.
- 14. La composición de la reivindicación 13, donde el cásete de expresión de proteína viral es la proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle.
- 15. La composición de la reivindicación 6, donde la mutación comprende una eliminación de al menos los nucleótidos 1-145 de la SEC ID N°: 1.
- 16. La composición de la reivindicación 6, donde la eliminación incluye los nucleótidos 2185-2190 de la SEC ID N°: 1.
- 17. La composición de las reivindicaciones 1 o 2, donde la mutación comprende una sustitución de la secuencia de nucleótidos de la glicoproteína J.
- 18. La composición de la reivindicación 17, donde la sustitución comprende una secuencia de ILTV reordenada.
- 19. Un método para prevenir la infección con el virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) en un sujeto o población que comprende administrar a uno o más sujetos un virus de la laringotraqueitis infecciosa atenuado (ILTV), donde el ILTV atenuado se administra in ovo.
- 20. El método de la reivindicación 19, donde el ILTV atenuado comprende la cepa de provocación de USDA, USDA-ch.
- 21. El método de la reivindicación 19, donde el ILTV atenuado comprende una mutación de la glicoproteína J.
- 22. El método de la reivindicación 21 , donde la mutación inhibe la expresión de la proteína glicoproteína J.
- 23. El método de la reivindicación 22, donde la mutación comprende una mutación del elemento del promotor de la glicoproteína J, donde la mutación inhibe una función del elemento del promotor.
- 24. El método de la reivindicación 21 , donde la mutación comprende una eliminación de una secuencia de nucleótidos de una glicoproteína J.
- 25. El método de la reivindicación 24, donde la mutación comprende una eliminación total o parcial dé la SEC ID N°: 1.
- 26. El método de la reivindicación 25, donde la mutación comprende una eliminación de los nucleótidos 1-2291 de la SEC ID N°: 1.
- 27. El método de la reivindicación 24, donde se inserta un cásete de expresión de proteína indicadora en el punto de la eliminación.
- 28. El método de la reivindicación 27, donde la proteína indicadora es proteína fluorescente verde.
- 29. El método de la reivindicación 24, donde se inserta un cásete de expresión de proteína viral en el punto de eliminación.
- 30. El método de la reivindicación 29, donde el cásete de expresión de proteína viral es la proteina de fusión (F) del virus de la enfermedad de Ne castle.
- 31. El método de la reivindicación 25, donde la mutación comprende una eliminación de los nucleótidos 1-2188 de la SEC ID N°: 1.
- 32. El método de la reivindicación 24, donde se inserta un cásete de expresión de proteína indicadora en el punto de la eliminación.
- 33. El método de la reivindicación 32, donde la proteína indicadora es proteína fluorescente verde.
- 34. El método de la reivindicación 25, donde la mutación comprende una eliminación de al menos los nucleótidos 1 -145 de la SEC I D N°: 1.
- 35. El método de la reivindicación 25, donde la eliminación incluye los nucleótidos 2185-2190 de la SEC ID N°: 1.
- 36. El método de la reivindicación 21 , donde la mutación comprende una sustitución de la secuencia de nucleótidos de la glicoproteína J.
- 37. El método de la reivindicación 36, donde la sustitución comprende una secuencia de ILTV reordenada.
- 38. Ún método para suscitar una respuesta ¡nmunitaria en un sujeto, el método comprende administrarle al sujeto un virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV) atenuado, donde el ILTV atenuado se administra in ovo.
- 39. Una vacuna que comprende un virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV) atenuado que comprende una mutación de la glicoproteína J, donde la vacuna es una vacuna in ovo.
- 40. Una vacuna que comprende un virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV) atenuado, donde la vacuna es una vacuna in ovo.
- 41. Un método para aumentar la inmunidad de la manada de una población de sujetos aviares contra el virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) que comprende administrar in ovo un ILTV atenuado a uno o más huevos que dan lugar a uno o más sujetos de la población.
- 42. El método de la reivindicación 40, donde el ILTV atenuado comprende una mutación de la glicoproteína J.
- 43. Un genoma del virus de laringotraqueitis infecciosa recombinante que comprende una mutación de glicoproteína J, donde la mutación es una eliminación de los nucleótidos 1-2291 de la SEC ID N°: 1.
- 44. Un genoma del virus de laringotraqueitis infecciosa recombinante que comprende una eliminación de al menos los nucleótidos 1-145 de la SEC ID N°: 1.
- 45. Un genoma del virus de laringotraqueitis infecciosa recombinante que no comprende los nucleótidos 2185-2190 de la SEC ID N°: 1.
- 46. Una preparación de vacuna in ovo que comprende un genoma de virus de laringotraqueitis infecciosa recombinante que tiene una eliminación parcial o total en el gen de la glicoproteína J.
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