MX2013000651A - Metodo para la identificacion de moduladores de catecol o-metiltransferasa. - Google Patents
Metodo para la identificacion de moduladores de catecol o-metiltransferasa.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para la identificación de moduladores de la actividad de la enzima de catecol 0-metiltransferasa (COMT).
Description
METODO PARA LA IDENTIFICACION DE MODULADORES DE CATECOL 0- METILTRANSFERASA
Descripción de la Invención
La presente invención se refiere a un método para la identificación de moduladores de la actividad enzimática de catecol O-metiltransferasa .
Catecol O-metiltransferasa (COMT) cataliza la 0-metilación de sustratos que tienen una fracción de catecol. El donador de metilo en la me ilación a través de COMT es S-adenosilmetionina (SAM) . COMT juega un papel importante en el catabolismo de neurotransmisores de catecolamina endógena, catecolestrogenos y moléculas xenobióticas. La inhibición de COMT es un método importante para desarrollar nuevos tratamientos terapéuticos en la enfermedad de Parkinson.
W.F. Herblin (Analytical Biochemistry 51, 19-22, 1973) describe un ensayo colorimétrico para la actividad de COMT. El ensayo utiliza nitrocatecol como aceptor de metilo para COMT. El nitrocatecol existe como una solución amarilla en el agua a un pH ácido con una absorción máxima a 350 nm. Una ionización con un pH ligeramente alcalino de para-hidroxilo convierte la solución en color naranja (kmax = 430 nm) . En una ionización alcalina más fuerte el metahidroxilo conduce a una solución rojo cereza (kmax = 520 nm) . El ensayo se basa en las observaciones de que el nitrocatecol se metila
ef . 237859 a través de COMT y que el nitrocatecol metilado ya no exhibe el color rojo cereza que resulta de la segunda ionización. En este ensayo el sustrato (nitrocatecol) y SAM tienen que estar en un intervalo de concentración µ que está por arriba de Km que es el límite de la sensibilidad.
G. Ziircher y M. Da Prada (Journal of Neurochemistry, Vol. 38, No. 1, 1982) describen un ensayo radioquímico de un solo paso para la actividad de COMT. En este ensayo, el catecol se convierte en guajacol titulado un compuesto de muy baja polaridad, mediante la incubación de COMT con [3H]metil SAM, Mg2+ y adenosina desaminasa. Guajacol se extrae utilizando un medio de baja polaridad, por ejemplo, tolueno, y se cuenta en el contador de cintilación.
Los ensayos antes descritos no son adecuados para la clasificación automatizada de grandes números de compuestos por su actividad moduladora COMT debido a la limitada sensibilidad (ensayo colorimétrico) o debido a la configuración del ensayo (el paso de extracción en el ensayo radioquímico) .
Por consiguiente, existe la necesidad de un método de ensayo sensible, homogéneo adecuado para clasificar grandes números de compuestos para su actividad de modulación de COMT.
En un primer objeto la presente invención proporciona un método para la identificación de un modulador de la actividad de una enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT) que comprende los pasos de:
a) proporcionar un sustrato COMT covalentemente enlazado a un colorante fluorescente,
b) poner en contacto la molécula del paso a) con la enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT) , una S-adenosilmetionina (SAM) y un compuesto candidato y
c) medir la lectura de la fluorescencia de la mezcla del paso b) , en donde una lectura de fluorescencia alterada en la presencia del compuesto candidato comparada con un espacio en blanco indica un modulador de la enzima de catecol O-metil transferasa (COMT) .
En una modalidad preferida, el método es un método para la identificación de un inhibidor COMT, en donde una lectura de fluorescencia disminuida en el paso c) comparada con un espacio en blanco indica un inhibidor de COMT.
En una modalidad preferida adicional el sustrato COMT es 4 -nitrocatecol .
En una modalidad preferida adicional el tinte fluorescente es Alexa Fl or® 488
En una modalidad preferida adicional la lectura de la fluorescencia en el paso c) es una lectura cinética.
En una modalidad preferida adicional el COMT es COMT humano.
En una modalidad preferida adicional el método es un método de clasificación de Alto Rendimiento.
En una modalidad preferida adicional el método se lleva a cabo en una placa de microtitulación.
En una modalidad preferida adicional la concentración final de COMT es de aproximadamente 25 nM.
En una modalidad preferida . adicional la concentración final del sustrato COMT es de aproximadamente 200 nM.
En una modalidad preferida adicional la concentración final de SAM es de aproximadamente 500 nM.
En un segundo objeto, la presente invención proporciona un método para la identificación de un sustrato de un enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT) que comprende los pasos de:
a) proporcionar una mezcla que comprende un sustrato COMT covaléntemente enlazado a un tinte fluorescente y S-adenosilmetionina (SAM) ,
b) poner en contacto la mezcla del paso a) con diferentes concentraciones de un compuesto candidato,
c) poner en contacto las mezclas del paso b) con la enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT) y
d) medir la lectura de fluorescencia cinética de las mezclas del paso c) , en donde una disminución del nivel de la lectura de fluorescencia como una función de una concentración en aumento del compuesto candidato indica un sustrato de una enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT) .
En una modalidad preferida el sustrato COMT es 4-nitrocatecol .
En una modalidad preferida adicional el tinte fluorescente es Alexa Fluor" 488.
La Figura 1 muestra la estructura química de Alexa Fluor 488 covalentemente acoplada a 4 -Nitrocatecol ;
La Figura 2 muestra una gráfica Stern Volmer para nitrocatecol (azul), 2-metoxi-5-nitrofenol (rojo) y 1,2-dimetoxi-4-nitrobenceno (verde) ; 20 nM libres de Alexa Fluor 488 con altas concentraciones de hasta 25 mM de nitrocatecol, 2-metoxi-5-nitrofenol y 1 , 2-dimetoxi-4 -nitrobenceno, respectivamente. Solamente para el nitrocatecol se observó un cambio en la intensidad de, la fluorescencia (I) de Alexa Fluor* 488, los productos metilados no tuvieron influencia en la intensidad de fluorescencia de Alexa Fluor8 488.
La Figura 3 muestra las cinéticas enzimáticas de la metilación catalizada COMT de Alexa Fluor 488 -Nitrocatecol en el ensayo de fluorescencia de la presente invención;
La Figura 4a muestra una medición cinética del cambio de la intensidad de la fluorescencia en la presencia de varias concentraciones del inhibidor COMT Tolcapona ;
La Figura 4b muestra la curva de respuesta a la dosis para Tolcapona calculada de los declives de la medición cinética de la Figura 4a,·
La Figura 5 muestra el ensayo fluorescente en la presencia de dopamina, un sustrato natural de COMT. El nivel en disminución se obtuvo con concentraciones de dopamina en aumento. Como la dopamina es un sustrato se metila así como el sustrato Alexa Fluor*- itrocatecol . La disponibilidad de SAM está limitada (500 nM) de tal forma que a altas concentraciones de dopamina el sustrato Alexa Fluor 488-Nitrocatecol ya no puede mutilarse completamente.
La Figura 6 muestra las curvas de respuesta a la dosis para un sustrato con una baja (500 nM) y una alta (200 µ?) concentración de SAM y para cada concentración SAM con o sin una hora de pre- incubación del compuesto y SAM antes de agregar el sustrato Alexa Fluor* 488-Nitrocatecol . La pre-incubación con bajo SAM cambia la curva de la respuesta a la dosis a un IC50 inferior debido a que el compuesto utiliza SAM. A concentraciones de SAM altas no existe una diferencia entre con y sin pre- incubación debido a que SAM no es limitante y la curva de la respuesta a la dosis cambia a un IC50 mayor comparado con SAM bajo debido a que el compuesto se consume .
La Figura 7 muestra las curvas de respuesta a la dosis con bajas (500 nM) y altas (200 µ?) concentraciones SAM de nuevo con y sin una hora de pre- incubación del compuesto SAM de un compuesto competitivo SAM. El compuesto competitivo SAM con y sin pre- incubación no afecta el IC50 para cada concentración a SAM pero con una alta concentración SAM en IC50 cambia a valores mayores.
El ensayo de la presente invención se basa en los hallazgos de que un tinte fluorescente covalentemente acoplado a un sustrato COMT, por ejemplo, Alexa Fluor* 488 covalentemente enlazado a nitrocatecol , muestra una disminuida fluorescencia debido a la extinción intramolecular y a la metilación del sustrato COMT en el complejo del sustrato COMT-tinte fluorescente por COMT que elimina la extinción de la fluorescencia, es decir, la metilación del sustrato COMT en el complejo de sustratos COMT-tinte fluorescente que conduce a una fluorescencia aumentada comparada con un complejo no metilado.
El término "COMT" se utiliza en la presente para referirse a un COMT de secuencia nativa de cualquier animal, por ejemplo, mamífero, especies, incluyendo humanos y variantes COMT (que además se definen a continuación) . Los polipéptidos COMT pueden aislarse de una variedad de fuentes, incluyendo tipos tisulares humanos o preparados a través de métodos recombinantes y/o sintéticos .
Los COMT naturales o producidos recombinantemente pueden utilizarse en este ensayo. Una "proteína recombinante" es una proteína aislada, purificada, o identificada en virtud de la expresión en una célula heteróloga, tal célula habiendo sido traducida o transíectada, ya sea temporal o establemente, con un vector de expresión recombinante modificado para conducir la expresión de la proteína en la célula hospedera. COMT recombinante puede producirse en células procariotas, por ejemplo, E. coli, en levadura, por ejemplo, S. po be o en células eucariotas, por ejemplo, HEK 293, células de insecto Sf9. Preferiblemente, las células de insecto Sf9 se utilizan pora la alta expresión de COMT recombinante. El COMT utilizado en los ensayos puede purificarse. El término "purificado" como se utiliza en la presente se refiere a polipéptidós , que se remueven' de su entorno natural o del origen de la producción recombinante, se aislan o se separan, y están al menos 60%, y más preferiblemente al menos 80% libres de otros componentes, por ejemplo, membranas, y microsomas, con las cuales están naturalmente asociados .
"COMT de secuencia nativa" se refiere a un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácido como un polipéptido COMT, que existe en la naturaleza independientemente de su modo de preparación. Una secuencia nativa COMT puede aislarse de la naturaleza, o prepararse a través de métodos recombinantes y/o sintéticos. El término "COMT de secuencia nativa" específicamente abarca formas truncadas o secretadas de existencia natural, formas variantes de existencia natural (por ejemplo, formas alternativamente divididas) y variantes alélicas de existencia natural de CO T. El identificador del polipéptido COMT humano en la base de datos NCBI es AAA68927 (Sec. Id. No. 1).
El término "variante COMT" se refiere a las variantes de la secuencia de aminoácido de una secuencia COMT nativa, que contiene una o más sustituciones y/o eliminaciones y/o inserciones de aminoácido en la secuencia nativa. Las variantes de la secuencia de aminoácido generalmente tienen al menos aproximadamente 75%, preferiblemente al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido de la COMT de secuencia nativa.
El término "compuesto" se utiliza en la presente en el contexto de un "compuesto de prueba" o un "compuesto candidato de fármaco" descrito en conexión con los ensayos de la presente invención. Es decir, estos compuestos comprenden compuestos orgánicos o inorgánicos, derivados sintéticamente o de fuentes naturales. Los compuestos incluyen compuestos inorgánicos u orgánicos tales como polinucleótidos , lípidos o análogos de hormonas que se caracterizan por pesos moleculares relativamente bajos. Otros compuestos de prueba orgánicos biopoliméricos incluyen péptidos que comprenden de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 aminoácidos y polipéptidos más grandes que comprenden de aproximadamente 40 a aproximadamente 500 aminoácidos, tales como los anticuerpos, o los conjugados de anticuerpo.
El término "lectura cinética" se refiere a la diferencia de la señal fluorescente medida en dos ciertos puntos en el tiempo en la parte lineal de una reacción enzimática. Una medición se hace al inicio de la reacción enzimática (punto de partida) y después de un tiempo de incubación se lleva a cabo una segunda lectura (punto final) . La señal final después se calcula en rfu/min como (rfu (punto final) -rfu (punto de partida) /tiempo de incubación, (rfu: unidades de fluorescencia' relativas).
El método de la presente invención puede utilizarse para identificar compuestos que inhiben la enzima Catecol O-metiltransferasa (COMT) . De esta forma, los inhibidores COMT identificados por el método de la presente invención pueden utilizarse en métodos para el tratamiento, prevención, o control de enfermedades en donde una desactivación de las catecolaminas extraneuronales a través de COMT juega un papel, por ejemplo, en la prevención de un control de depresiones. En este caso los compuestos de la invención pueden utilizarse como compuestos individuales o en combinación con otras sustancias terapéuticamente activas con favorable influencia sobre el curso de la enfermedad. Los compuestos de la invención también pueden utilizarse como co-medicamentos con otras sustancias terapéuticamente activas.
El método de la presente invención puede utilizarse para determinar la actividad de COMT en muestras tisulares de animales que han sido tratados con un compuesto de prueba. Por ejemplo, el ensayo es adecuado para determinar la actividad de COMT en el cerebro y muestras tisulares del hígado de animales, por ejemplo, ratones y ratas, que han sido tratados con un compuesto de prueba (modulador COMT) .
Parte Experimental
Síntesis de 4 -Nitrocatecol - Alexa Fluor8 488
Una solución de 10 mM de aminoetil-nitro-brenzcatequina [1] en DMSO conteniendo 1% de Trietilamina se mezcló con una solución de 10 mM de Alexa Fluor® 488 de éster succinimidílico de ácido carboxílico [2] (Invitrogen Corporation, 5791 Van Alien Way, Carlsbad, California 92008) en DMSO con 1% de Trietilamina en una proporción estequiométrica de 1:1. La mezcla de reacción se mezcló ligeramente durante la noche a temperatura ambiente y se íi
purificó en una HPLC de fase inversa Akta Explorer 100. producto se liofilizó y se volvió a suspender en DMSO.
4-Nitrocatecol - Alexa Fluor 488
Protocolo del ensayo de fluorescencia
El siguiente protocolo del ensayo, de reactivos y materiales se utilizó en los ejemplos de la presente invención. Los resultados de los ejemplos se describen en las Figuras 1-7
Placas de microtitulación:
Placa de microtitulación de 384 cavidades, Corning megras con un fondo transparente plano, sin superficie de unión, poliestireno (ref. 3655)
Reactivo y soluciones concentradas del regulador de
PHJ_
• Soluciones concentradas del regulador de pH:
- Regulador de pH de M fosfato 7.6 (Na2HP04 Fluka 71644, NaH2P04 Merck 6346.0500) almacenados a 4°C
- 580 mM de MgCl2 (Merck 1.0833.0250) , almacenado a temperatura ambiente
- 1 M de . CaCl2 almacenado a 4°C
- 65 mM de DTT (Sigma D-0632) , almacenado a -20°C
• COMT humano recombinante : preparado internamente, almacenado a -80°C
4-Nitrocatecol-Alexa Fluor 488: preparado internamente, 1.3 mM en DMSO, almacenado a. temperatura ambiente en la oscuridad
• S-Adenosil-metionina : 10 mM en H20 (Sigma-Aldrich A2804) , almacenado a -20°C
Reactivo y soluciones reguladoras del pH:
• Regulador del pH del ensayo (concentraciones finales) :
- 40 mM de regulador de pH de fosfato 7.6 - 2.88 mM de MgCl2
- O .9 mM de DTT
- 0.25 mM de CaCl2
• Diluciones del compuesto: diluciones en 100% de DMSO (Sigma 41640), 6.25% de concentración de ensayo final de DMSO
• COMT humano recombinante : 80 nM en regulador de pH de ensayo, 25 mM de concentración de ensayo final
• 4-Nitrocatecol- Alexa Fluor* 488: 320 nM en regulador de pH de ensayo, 200 mM.de concentración de ensayo final
• S-Adenosil-metionina: 800 nM en regulador de pH de ensayo, 500 nM de concentración de ensayo final
Método de ensayo:
10 µ? de hCOMT (COMT humano)
2 µ? del compuesto de prueba
1 min en el agitador
20 µ? de Sustrato-SAM-Mezcla
5 min en el agitador
Lecturas: medición de los cinéticos en la placa: lector TM visión (exc. 475(40) nm, em. 535(45) nm, intensidad 7.5%, tiempo de exposición ls.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (14)
1. Un método para la identificación de un modulador de la actividad de una enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT) caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar un sustrato COMT covalentemente enlazado a un tinte fluorescente, b) poner en contacto la molécula del paso a) con una enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT), una S-adenosilmetionina (SAM) y un compuesto candidato y c) medir la lectura de la fluorescencia de la mezcla del paso b) , en donde una lectura de fluorescencia alterada en la presencia del compuesto candidato comparada con un espacio en blanco indica un modulador de la enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT) .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un método para la identificación de un inhibidor COMT y una lectura de fluorescencia disminuida en el paso c) comparada con un espacio en blanco es indicativo de un inhibidor COMT.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el sustrato COMT es 4-nitrocatecol .
4. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el tinte fluorescente es Alexa Fluor° 488.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lectura de la fluorescencia en el paso c) es una lectura cinética.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el COMT es COMT humano.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el método es un método de clasificación de Alto Rendimiento.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque . el método se lleva a cabo en una placa de microtitulación.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración final de COMT es de aproximadamente 25 nM.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración final del sustrato COMT es de aproximadamente 200 nM.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración final de SAM es de aproximadamente 500 nM.
12. Un método para la identificación de un sustrato de una enzima de catecol O-metiltransferasa (COMT) caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar una mezcla que comprende un sustrato COMT covalentemente enlazado a un tinte fluorescente y S-adenosilmetionina (SAM) , b) poner en contacto la mezcla del paso a) con diferentes concentraciones de un compuesto candidato, c) poner en contacto las mezclas del paso b) con una enzima de catecol-O-metiltransferasa (COMT) y d) medir la lectura de fluorescencia cinética de las mezclas del paso c) , en donde una disminución del nivel de la lectura de fluorescencia como una función de una concentración en aumento del compuesto candidato indica un sustrato de una enzima de catecol-O-metiltransferasa (COMT) .
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el sustrato COMT es 4 -nitrocatecol .
14. El método de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el tinte fluorescente es Alexa Fluor" 488.
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