MX2012014990A - Polipeptido que tiene actividad suolenina y sus usos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, o un polipéptido variante o polinucleótido variante del mismo, en el que el polipéptido variante tiene al menos un 73% de identidad de la secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o el polinucleátido variante tiene al menos un 73% de identidad de la secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 2. La invención presenta la secuencia de codificación de longitud completa del gen novedoso así como la secuencia de aminoácidos del polipéptido funcional de longitud completa y los equivalentes funcionales del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención se refiere también a los procedimientos para utilizar el polipéptido en procesos industriales. Se incluyen también en la presente invención las células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la presente invención adecuadas para producir estas proteínas.

Description

POLIPÉPTIDO QUE TIENE ACTIVIDAD SUOLENINA Y SUS USOS DECLARACIÓN DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO FINANCIADOS CON FONDOS FEDERALES Esta invención se ha llevado a cabo con la financiación del Gobierno de los Estados Unidos y la Beca n° DE-FC36-08G018079, otorgada por el Departamento de Energía. El Gobierno de los Estados Unidos puede tener determinados derechos sobre la presente invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a genes que comprenden secuencias que codifican polipéptidos que tienen o que ayudan la actividad de degradación del material de carbohidrato. La invención se caracteriza por la secuencia de longitud completa que codifica el gen novedoso así como por la secuencia de aminoácidos de la proteína funcional de longitud completa, y las variantes y fragmentos del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención se refiere también a los procedimientos para utilizar estas proteínas en procesos industriales. Se incluyen también en la presente invención las células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la presente invención adecuada para producir estas proteínas. La presente invención se refiere también a la expresión satisfactoria de los genes que codifican los polipéptidos que tienen actividad de degradación del material de carbohidrato en un hospedador. El hospedador puede ser cualquier hospedador adecuado, por ejemplo, Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger o Talaromyces, por ejemplo, Talaromyces emersonii.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los carbohidratos constituyen los compuestos orgánicos más abundantes del planeta. Sin embargo, muchos de estos carbohidratos están secuestrados en polímeros complejos, que incluyen almidón (el almacenamiento principal de carbohidratos en semillas y grano) , y una gama de carbohidratos y lignina conocida como lignocelulosa. Los principales carbohidratos componentes de la lignocelulosa son la celulosa, la hemicelulosa, y las pectinas. Estos polímeros complejos se denominan a menudo colectivamente como lignocelulosa.

La bioconversion de la biomasa lignocelulósica renovable a un azúcar fermentable que se fermenta posteriormente para producir alcohol (por ejemplo, etanol) como una alternativa a los combustibles líquidos ha atraído mucha atención de los investigadores desde la década de los 70, cuando comenzó la crisis del petróleo debido a la disminución de las exportaciones de petróleo de la OPEP. En las, dos últimas décadas se ha utilizado ampliamente el etanol como una mezcla al 10% con gasolina en los Estados Unidos o como¦ combustible puro para vehículos en Brasil. Más recientemente, se ha implementado el uso de E85, una mezcla de etanol al 85% especialmente para las aplicaciones de limpieza de las ciudades. La importancia del bioetanol combustible aumentará en paralelo con el aumento de los precios del petróleo y el gradual agotamiento de sus fuentes. Adicionalmente , se están utilizando azúcares fermentables para producir plásticos, polímeros y otros productos biológicos, y se espera que esta industria crezca sustancialmente aumentando por tanto la demanda de abundantes azúcares fermentables a bajo coste que se puedan utilizar como materia prima en lugar de materias primas basadas en petróleo.

El secuestro de estas grandes cantidades de los mencionados carbohidratos en la biomasa vegetal proporciona una abundante fuente potencial de energía en la forma de azúcares, azúcares tanto de cinco carbonos como de seis carbonos que podrían utilizarse para numerosos procesos industriales y agrícolas. Sin embargo, la enorme energía potencial de estos carbohidratos está actualmente infrautilizada debido a que los polímeros están bloqueados en polímeros complejos, y por tanto, no son fácilmente accesibles para la fermentación. Los procedimientos que generan azúcares a partir de la biomasa vegetal proporcionarían abundantes materias primas económicamente competitivas para la fermentación en productos químicos, plásticos, tales como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles , que incluyen combustibles líquidos sintéticos de etanol, metanol, butanol y biogás .

Sin tener en cuenta el tipo de materia prima celulósica, el coste y la eficacia hidrolítica de las enzimas son factores principales que restringen la comercialización de los procesos de bioconversión de la biomasa. Los costes de producción de las enzimas producidas de forma microbiana están estrechamente vinculados a la productividad de la cepa productora de la enzima y al rendimiento de la actividad final en el caldo de fermentación.

A pesar de la investigación continuada de las últimas décadas para entender la degradación enzimática de la biomasa lignocelulósica y la producción de celulasa, sigue siendo deseable descubrir, o diseñar mediante ingeniería genética nuevas celulasas y hemicelulasas muy activas. Sería muy deseable también construir composiciones de enzimas muy eficaces capaces de llevar a cabo una biodegradación rápida y eficaz de los materiales lignocelulósicos , en particular, de dichas celulasas y hemicelulasas que tengan una termoestabilidad aumentada.

Dichas enzimas pueden utilizarse para producir azúcares para su fermentación en productos químicos, plásticos, tales como, por ejemplo, ácido succínico y (bio) combustibles , que incluyen combustibles líquidos sintéticos de etanol, metanol, butanol, y biogás , para ensilado, y también como en enzimas en otros procesos industriales, por ejemplo, en las industrias de alimentos o de piensos, textiles, de pulpas o papel o de detergentes, y en otras industrias.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la capacidad de degradar (es decir, colaborar en la degradación de) , un carbohidrato (por ejemplo, polisacáridos) , en particular, lignocelulosa . Los polinucleótidos de la presente invención codifican normalmente un polipéptido que tiene actividad suolenina.

La presente invención proporciona también polipéptidos que se producen de forma natural y recombinante que tienen dicha actividad, así como líneas celulares recombinantes que producen las mencionadas enzimas. Se proporcionan también los procedimientos para preparar y utilizar los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona de esta manera un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de núcleótidos de la SEQ ID NO: 1, o una de sus variantes de polipéptido o una de sus variantes de polinucleótido, en la que la variante de polipéptido tiene al menos una identidad de la secuencia del 73% con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o la variante de polinucleótido que codifica un polipéptido tiene al menos una identidad de la secuencia del 73% con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 2.

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención tienen propiedades favorables, en particular una actividad de degradación de la celulosa. En una realización, el polipéptido de acuerdo con la presente invención tiene actividad suolenina.

El polipéptido de la presente invención tiene actividad suolenina (véase Salheimo y col., Eur. J. Biohem. 269 , 4202-4211, 2002) . Se ha propuesto que las suoleninas rompen el enlace de hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin que exista actividad hidrolítica. De esta forma, se cree que permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y el alargamiento de la pared celular. La suolenina, una proteína de tipo expansina contiene un dominio del extremo N de la familia 1 de unión a carbohidratos (CBD) y un dominio de tipo expansina. Para los fines de la presente invención, una proteína de tipo expansina o una proteína de tipo suolenina puede comprender uno o ambos de dichos dominios y/o perturbar la estructura de las paredes celulares (tal como interrumpir la estructural de la celulosa) , opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores .

Además, los polipéptidos pueden tener una elevada termoestabilidad . Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden retener una actividad relativa elevada (% de actividad inicial) como una función del tiempo de incubación (h) , de por ejemplo, 2 horas, 3 horas, 4 horas, cinco horas, seis horas, ocho horas, nueve horas, 10 h o más, 20 h o más, 30 h o más, en particular a elevadas temperaturas, por ejemplo a 60° C o más, a 65° C o más, o a 70° C o más, por ejemplo, 8 horas a 65° C o 72 horas a 60.° C.

La invención proporciona también un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1; O (b) una secuencia de nucleótidos que se híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento. inverso de la SEQ ID NO: 1; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente una identidad de la secuencia del 78% con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; o (d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos tal como se define en (a) , (b) o (c) que tiene al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud; o (e) una secuencia que está degenerada como resultado del código genético de una secuencia tal como se define en uno cualquiera de (a) , (b) , (c) o. (d) ;o (f) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos tal como se define en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

Se proporciona también de acuerdo con la presente invención un vector, tal como un vector de expresión, que incorpora una secuencia de polinucleótidos de la presente invención y una célula que comprende un polipéptido, un polinucleótido o un vector de la presente invención.

La invención proporciona también: un procedimiento para la preparación de un polipéptido que tiene actividad suolenina, dicho procedimiento comprende cultivar una célula de la presente invención en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado; un polipéptido que se puede . obtener mediante dicho procedimiento; y una composición que comprende: (i) un polipéptido de la presente invención y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa; Los polipéptidos de la presente invención que tienen actividad suolenina se pueden " utilizar en procesos industriales. De esta manera, la presente invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de un sustrato que comprende material de carbohidrato, procedimiento que comprende poner en contacto el sustrato con un polipéptido o una composición de la presente invención.

En particular, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un azúcar o azúcares a partir de material lignocelulósico, dicho procedimiento comprende poner en contacto el material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la presente invención.

Los azúcares producidos de esta forma se pueden utilizar en un proceso de fermentación. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un producto de fermentación, dicho procedimiento comprende: producir un azúcar fermentable utilizando lo anteriormente descrito; y fermentar el azúcar fermentable .resultante, para producir, por tanto, un producto de fermentación.

Se puede utilizar también un polipéptido o una composición de la presente invención, por ejemplo, en la preparación de un producto alimenticio, en la preparación de un detergente, en la preparación de un pienso animal, en el tratamiento de la pulpa o en la fabricación de papel o en la preparación de un tejido o de un producto textil o en su limpieza .

La invención proporciona también: un material, procesado que se puede obtener poniendo en contacto un material vegetal o material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la presente invención; un alimento o pienso que comprende un polipéptido o una composición de la presente invención,- y una planta o una de sus partes que comprende un polinucleótido, un polipéptido, un vector o una células de acuerdo con la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fig 1: Cartografía de pGBTOP para la expresión de los genes en A. niger. Se representan gráficamente los genes de interés (GOI) expresados procedentes del promotor de la glucoamilasa (PglaA) . Además, se representa gráficamente el flanco de la glucoamilasa (3'glaA) del cásete de expresión. En esta solicitud, un gen de interés es la secuencia que codifica TEMER08806 tal como se define a partir de ahora en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de codificación optimizada de la pareja de codones deTEMERO8806; ' La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de TEMER08806; La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia señal de TEMER08806; DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de la presente memoria y de las reivindicaciones que la acompañan, las palabras "comprende" e "incluye" y variaciones tales como "comprenden", "que comprende", "incluyen" y "que incluye" se deben interpretar de forma inclusiva. Esto es, se pretende que estas palabras expresen la posible inclusión de otros elementos o números enteros no específicamente enumerados, cuando el contexto lo permita.

Los artículos "uno/a" y "unos/as" se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Por medio de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos , por ejemplo, enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo, degradar, un material de carbohidrato. Un material de carbohidrato es un material que comprende, consiste de o consiste sustancialmente en uno o más carbohidratos. Las enzimas son, en el presente documento, un subtipo de polipéptidos.

El sustrato (denominado también materia prima) en el presente documento, se utiliza para referirse a una sustancia que comprende material de carbohidrato, que se puede tratar con enzimas de acuerdo con la presente invención, de tal manera que el material de carbohidrato del anterior se vea modificado. Además del material de carbohidrato, el sustrato puede contener cualquier otro componente, incluyendo, pero sin limitarse a material no de carbohidrato y almidón.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos , por ejemplo, enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo, degradar, un material de carbohidrato. Un material de carbohidrato es un material que comprende, consiste o consiste sustancialmente en uno o más carbohidratos. Las enzimas son en el presente documento un subtipo de polipéptidos.

Normalmente, un polipéptido de la presente invención codifica un polipéptido que tiene al menos actividad suolenina, denominado provisionalmente TEMERO8806 , que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, o una secuencia que es una de sus variantes, normalmente, funcionalmente equivalente al polipéptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia que es un fragmento de cualquiera de las anteriores .

En una realización, un polipéptido de ' la presente invención puede tener una o más actividades alternativas y/o adicionales diferentes de la actividad suolenina mencionada anteriormente, por ejemplo, una de las diferentes actividades degradadoras de los carbohidratos y/o hidrolizantes de los carbohidratos mencionadas en el presente documento.

Carbohidrato, en este contexto, incluye todos los sacáridos, por ejemplo, polisacáridos , oligosacáridos , disacáridos o monosacáridos .

Un polipéptido de acuerdo con la presente invención puede modificar y/o degradar un material de carbohidrato degradando químicamente o degradando físicamente dicho material o hidrolizando el carbohidrato. La modificación física incluye, por ejemplo, la interrupción . de la interacción entre las microfibrillas de celulosa y/o la apertura de la estructura de la fibra de celulosa. La modificación química del material de carbohidrato puede dar como resultado la degradación de dicho material, por ejemplo, mediante hidrólisis, oxidación u otra modificación química tal como mediante la acción de una liasa. La modificación física puede ir acompañada, o no, por una modificación química..

Materiales de carbohidrato adecuados Un carbohidrato sin almidón adecuado para la modificación mediante un polipéptido de la presente invención es la lignocelulosa. Los diferentes restos lignocelulósicos que comprenden los polisacáridos principales, que pueden considerarse como una materia prima renovable potencial son la celulosa (glucanos) , hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos) . Además, algo de hemicelulosa puede estar presente como glucomanano, por ejemplo, en materias primas derivadas de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, por ejemplo, glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, ácido D-galacturónico y otras hexosas y pentosas se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto .

Además, las pectinas y otras sustancias peptínicas tales como los arabinanos pueden constituir normalmente una considerable proporción de las paredes celulares de los tejidos vegetales no leñosos (aproximadamente, de un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas) .

La celulosa es un polisacárido lineal compuesto por restos de glucosa unidos por enlaces ß-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, así como la estequiometría de la glucosa con enlaces ß (con respecto a los enlaces a) genera estructuras más propensas al puente ,de hidrógeno intercadena que las estructuras con enlace a muy ramificadas del almidón. De esta manera, los polímeros de celulosa son generalmente menos solubles y forman fibras más estrechamente unidas que las fibras que se encuentran en el almidón.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición varía a menudo ampliamente de organismo a organismo, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es la xilosa con enlace ß-1,4, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa está a menudo ramificada en 0-3 y/u 0-2 y puede sustituirse con enlaces a la arabinosa, galactosa, mañosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o mediante esterificación con ácido acético (y esterificación de ácido ferúlico con arabinosa) . La hemicelulosa puede contener también glucano, que es un término general para los azúcares de seis carbonos ß unidos (tales como los ß-(1,3) (1,4) glucanos y heteroglucanos mencionados anteriormente) y adicionalmente glucomananos (en los que la glucosa y la mañosa están presentes en la estructura lineal, unidas entre sí por enlaces ß) .

La composición, naturaleza de la sustitución, y grado de ramificación de la hemicelulosa son muy diferentes en las plantas dicotiledóneas (dicotiledóneas, es decir, plantas cuyas semillas tienen dos cotiledones u hojas de la semilla tales como habas, cacahuetes, almendras, guisantes, habichuelas) en comparación con las plantas monpcotiledóneas (monocotiledóneas ; es decir, plantas que tienen un único cotiledón u hoja de la semilla tales como maíz, trigo, arroz, herbáceas, cebada) . En las dicotiledóneas, la hemicelulosa está compuesta principalmente por xiloglucanos que son cadenas de glucosa con enlace 1,4-ß con cadenas secundarias de xilosilo con enlace 1,6-ß. En las monocotiledóneas, que incluyen la mayor parte de los cultivos de grano, los componentes principales de la hemicelulosa son los heteroxilanos . Estos están principalmente comprendidos por polímeros con esqueleto de xilosa con enlace 1,4-ß unidos mediante enlaces 1,3 a arabinosa, galactosa, mañosa y ácido glucurónico o ácido 4-O-metil-glucurónico así como a xilosa modificada por ácidos acéticos unidos con enlace éster. También se encuentran los ß glucanos constituidos por cadenas de glucosilo con enlace 1,3-ß y 1,4-ß. En las monocotiledóneas, la celulosa, los heteroxilanos y los ß-glucanos pueden estar presentes en cantidades aproximadamente iguales, comprendiendo cada una aproximadamente.15-25% de la materia seca de las paredes de las células. También, diferentes plantas pueden comprender diferentes cantidades y diferentes composiciones de sustancias pectínicas. Por ejemplo, el azúcar de la remolacha contiene aproximadamente 19% de pectina y aproximadamente 21% de arabinano sobre una base de peso seco.

De acuerdo con esto, una composición de la presente invención puede adaptarse en función de la materia prima concreta (denominada también sustrato) que se va a usar. Es decir, el espectro de actividades en una composición de la presente invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.

Se pueden administrar combinaciones de enzimas o tratamientos físicos simultánea o secuencialmente . Se pueden producir las enzimas de cualquier forma tanto exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, a continuación aislarse y añadirse a la materia prima lignocelulósica . Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de la masa celular bruta, o el material vegetal (tal como el rastrojo de maíz) , y similares se añaden a la materia prima. Alternativamente, la masa celular bruta o el medio de producción de la enzima o el material vegetal, se pueden tratar para evitar el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, mediante calentamiento o la adición de agentes antimicrobianos) , añadiéndose a continuación a la materia prima. Estas mezclas de enzimas brutas pueden incluir el organismo que produce la enzima. De forma alternativa, la enzima se puede producir en una fermentación que utilice la materia prima (tal como el rastrojo de , almidón) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una(s) enzima(s) . De esta manera, las plantas que producen las enzimas pueden servir como materia prima lignocelulósica y se pueden agregar a la materia prima lignocelulósica.

Actividad enzimática Las endo-1, 4^-glucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de la celulosa insoluble en celooligosacáridos (celobiosa como producto principal) , mientras que las ß -glucosidasas (BGL) convierten los oligosacáridos , principalmente la celobiosa y la celotriosa en glucosa.

Las xilanasas, junto con otras enzimas adjuntas, por ejemplo a-L- arabinofuranosidasas , esterasas de feruloílo y acetilxilano, glucuronidasas , y ßt xilosidasas) catalizan la hidrólisis de parte de las hemicelulosas .

Las sustancias pectínicas incluyen pectina, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos . Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la pared de la célula vegetal. Se desarrollan alrededor de una cadena nuclear de unidades de ácido D-galacturónico OÍ (1,4) unidas entremezcladas en algún grado con L-ramnosa. En una pared celular cualquiera existen numerosas unidades estructurales que se ajustan a esta descripción y que se han considerado generalmente una única molécula pectínica, las cadenas nucleares de diferentes Unidades estructurales son continuas entre sí.

Las pectinasas incluyen, por ejemplo una endo poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endogalactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endopectina liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exogalacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una a-arabinofuranosidasa .

Los principales tipos de unidades estructurales son: galacturonano (homogalacturonano) , que puede estar sustituida con metanol en el grupo carboxilo y acetato en 0-2- y 0-3; ramnogalacturonano I (RGI) , en el que unidades de ácido galacturónico alternan con unidades de ramnosa que transportan galactano con enlace (1,4) y cadenas secundarias de arabinano con enlace (1,5) unido. Las cadenas secundarias de arabinano pueden estar unidas directamente a ramnosa o indirectamente mediante cadenas de galactano; xilogalacturonano, con unidades de xilosilo individuales en 0-3 del ácido galacturónico (estrechamente asociadas con ramnogalacturonano II (RGII) , una unidad menor particularmente compleja que contiene azúcares no usuales, por ejemplo, apiosa. Una unidad RGII puede contener dos restos apiosilo que, en condiciones iónicas adecuadas, pueden formar de manera reversible ésteres con borato.

Tal como se ha indicado anteriormente, un polipéptido de la presente invención tendrá normalmente actividad suolenina. Sin embargo, un polipéptido de la presente invención puede tener una o más de las actividades que se han mostrado anteriormente de forma adicional o alternativa a dicha actividad. También, una composición de la presente invención tal como se describe en el presente documento puede tener una o más de las actividades mencionadas anteriormente además de las proporcionadas por un polipéptido de la presente invención que tiene actividad suolenina.

Secuencia de polinucleótidos La invención proporciona secuencias de polinucleótidos genómicos que comprenden el gen que codifica TEMER08806 así como su secuencia de codificación. De acuerdo con esto, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos genómicos de acuerdo con la secuencia de nucleótidos que codifica la; SEQ ID NO: 1 y las variantes, tales como los equivalentes funcionales, de cualquiera de los anteriores .

En particular, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que es capaz de hibridarse selectivamente, por ejemplo, en condiciones de restricción, preferiblemente en condiciones de elevado restricción, con el complemento inverso de un polinucleótido que comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 1.

Más específicamente, la presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

La invención se refiere también a un polinucleótido aislado que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia que codifica al menos un dominio funcional de un polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o una de sus variantes, tal como un equivalente funcional, o un fragmento cualquiera del mismo.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que se pueden aislar a partir de ADN cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína, por ejemplo, la proteína suolenina de acuerdo con la presente invención.

Un gen puede incluir secuencias de codificación, secuencias no de codificación, intrones y/o secuencias reguladoras. Además, el término "gen" puede referirse a una molécula de ácido nucleico aislada tal como se define en el presente documento.

Puede aislarse una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: l o una de sus variantes tal como un equivalente funcional, utilizando técnicas de biología molecular normalizadas y la información de la secuencia proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, utilizando toda o una parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 como sonda de hibridación, se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención utilizando técnicas de hibridación y clonación normalizadas (por ejemplo, tal como se describe en Sambrook, J. , Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .

Además, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una parte de la SEQ ID NO: 1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados basándose en la información de la secuencia contenida en la SEQ ID NO: 1.

Se puede amplificar un ácido nucleico de la presente invención utilizando ADNc, ARNm o, alternativamente, ADN genómico como molde y cebadores de oligonucleótidos adecuados de acuerdo con las técnicas normalizadas de amplificación mediante la PCR. El ácido nucleico amplificado de esta manera se puede clonar en un vector adecuado y caracterizarse mediante el análisis de la secuencia de ADN.

Además, se pueden preparar oligonucleótidos que corresponden o que se pueden hibridar con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención mediante técnicas sintéticas normalizadas utilizando, por ejemplo, un sintetizador de ADN automatizado.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una molécula de ácido nucleico que es el complemento inverso de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de dicha secuencia de nucleótidos.

Una molécula de ácido nucleico que es complementaria de otra secuencia de nucleótidos es una molécula que es lo suficientemente complementaria con la otra secuencia de nucleótidos para que pueda hibridarse con la otra secuencia de nucleótidos formando de este modo un duplete estable.

Un aspecto de la presente invención corresponde a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la presente invención o una variante, tal como uno de sus equivalentes funcionales, por ejemplo, un fragmento o dominio biológicamente activo, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para usarse como sondas de hibridación para identificar las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la presente invención y los fragmentos de dichas moléculas de ácido nucleico adecuadas para el uso como cebadores de la PCR para la amplificación o la mutación de las moléculas de ácido nucleico.

Se puede "aislar" un polinucleótido de acuerdo con la presente invención. En el contexto de la presente invención, un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no se encuentra inmediatamente contiguo con una o ambas secuencias de codificación con las que se encuentra inmediatamente contiguo (una en el extremo 5', y una en el extremo 3') en el genoma que se produce naturalmente en el organismo a partir del cual se deriva. De esta manera, en una realización, un ácido nucleico aislado incluye alguna o todas las secuencias 5' no codificantes (por ejemplo, el promotor) que se encuentran inmediatamente contiguas a la. secuencia de codificación. El término incluye, por tanto, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora a un vector, un plásmido o virus que se replica de forma autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producida mediante la PCR o tratamiento con la endonucleasa de restricción) independiente de las otras secuencias. Esta incluye también un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente exento de material celular, material vírico, o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante) , o precursores químicos u otros agentes químicos (cuando se sintetiza químicamente). Además, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no se produce naturalmente como un fragmento y que no se encontraría en el estado natural .

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que los términos "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" incluyan moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o del ARN generados utilizando análogos de nucleótidos . La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. Se puede sintetizar el ácido nucleico utilizando análogos o derivados de oligonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos de inosina o fosforotioato) . Se pueden utilizar dichos oligonucleótidos , por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tengan alterada la capacidad de emparejamiento de bases o una resistencia aumentada a las nucleasas.

Otra realización de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es de sentido contrario a una molécula de ácido nucleico de TEMER08806, por ejemplo, la hebra que codifica una molécula de ácido nucleico de TEMER08806. Se encuentran también incluidas en el alcance de la presente invención las hebras complementarias de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento .

A no ser que se indique de otra manera, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por la secuenciación de una molécula de ADN en el presente documento, se determinaron utilizando un secuenciador de ADN automatizado y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN determinadas en el presente documento se predijeron mediante la traducción de una secuencia de ADN determinada como anteriormente. Por tanto, tal como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante esta solución automatizada, toda secuencia de nucleótidos determinada en el presente documento puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas mediante un dispositivo automático son al menos aproximadamente un 90% idénticas, más normalmente, al menos aproximadamente un 95% a al menos aproximadamente un 99,9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada.

Se puede determinar con más precisión la secuencia real mediante otras soluciones que incluyen los procedimientos manuales de secuenciación del ADN, bien conocidos en la técnica. Tal como se conoce en la técnica, una inserción o deleción única en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia real producirá un cambio de marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos de tal manera que la secuencia de aminoácidos prevista codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de ADN secuenciada, que comienza en el punto de dicha inserción o deleción.

La persona experta en la técnica es capaz de identificar dichas bases erróneamente identificadas y se sabe cómo corregir dichos errores.

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender solo una parte o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 (o de una variante de cualquiera de -las anteriores) , por ejemplo, un fragmento que se puede utilizar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de un polipéptido TE ER08806.

La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen TEMER08806 y del ADNc permite la generación de sondas y cebadores diseñados para el uso en la identificación y/o la clonación de los diferentes miembros de la familia TEMER08806, así como los homólogos de TEMER08806 procedentes de otras especies.

La sonda/cebador comprende normalmente un oligonucleótido sustancialmente purificado que comprende usualmente una región de la secuencia de nucleótidos que se híbrida preferiblemente en condiciones de elevada restricción con al menos entre aproximadamente 12 a aproximadamente 15, preferiblemente entre aproximadamente 18 a aproximadamente 20, preferiblemente entre aproximadamente 22 a aproximadamente 25, de forma más preferible aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, o aproximadamente 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o de una variante, tal como un equivalente funcional, o cualquiera de los anteriores.

Se pueden utilizar sondas basadas en las secuencias del nucleótido TEMER08806 para detectar los transcritos o las secuencias genómicas de TEMER08806 que codifican el mismo polipéptido o sus homólogos, por ejemplo, en otros organismos. En las realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo marcado unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzima. Dichas sondas se pueden usar también como parte de un kit de ensayo diagnóstico para identificar células que expresan un polipéptido TEMER08806.

Los polinucleótidos del presente documento pueden ser polinucleótidos sintéticos. Los polinucleótidos sintéticos pueden optimizarse en el uso del codón, preferiblemente de acuerdo con los procedimientos descritos en los documentos WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943 , que se incorporan en el presente documento por referencia. El documento PCT/EP2007/055943 se dirige a la optimización de la pareja de codones. La optimización de la pareja de codones es un procedimiento en el que se ha modificado la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con respecto a su utilización del codón, en particular las parejas de codones que se utilizan, para obtener una mejora de la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y/o la mejora de la producción del polipéptido codificado. Las parejas de codones se definen como un conjunto de dos tripletes posteriores (codones) en una secuencia de codificación .

La presente invención se refiere además a una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido tal como se ha descrito anteriormente. "Construcción de ácido nucleico" se define en el presente documento como una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenaria como bicatenaria, que se aisla a partir de un gen que se produce naturalmente o que se ha modificado para contener segmentos de ácido nucleico que se combinan y yuxtaponen de una manera que no podría existir de otra forma en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo es sinónimo del término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene todas las secuencias control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación. El término "secuencia de codificación" tal como se define en el presente documento es una secuencia que se transcribe en ARNm y se traduce en un activador transcripcional de un promotor de una proteasa de la presente invención. Los límites de la secuencia de codificación se determinan generalmente mediante el codón de inicio ATG en el extremo 5' del ARNm y la secuencia del codón de detención de la traducción que finaliza el marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, ADN, ADNc, y secuencias de ácido nucleico recombinante . Preferiblemente, el ácido nucleico tiene un elevado contenido de GC. En el presente documento, el contenido de GC indica el número de nucleótidos G y C en la construcción, dividido por el número total de nucleótidos, expresado en % . El contenido de GC es preferiblemente del 56% o más, 57% o más, 58% o más, 59% o más, 60% o más, o en el intervalo del 56-70% o el intervalo del 58-65%.

Preferiblemente, la construcción de ADN comprende una secuencia de ADN promotora una secuencia de codificación en asociación operativa con dicha secuencia de ADN promotora y secuencias control tales como: -una secuencia de terminación de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada entre la siguientes lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, preferiblemente TAAA, y/o -una secuencia de codificación iniciadora de la traducción orientada en la dirección 5' a 3' seleccionada entre la siguiente lista de secuencias: GCTACCCCC,- GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC; GCTCCCCTC; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTC; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC; y GCTTCCTTC, preferiblemente GCT TCC TTC, y/o -una secuencia iniciadora de la traducción seleccionada entre la siguiente lista de secuencias: 5 ' -mwChkyCAAA-3 ' ; 5'-mwChkyCACA-3 ' o 5 ' -mwChkyCAAG-3 ' , que utiliza códigos de ambigüedad para los nucleótidos: m (A/C) ; w (A/T) ; y (C/T) ; k (G/T) ; h (A/C/T) , preferiblemente 5 ' -CACCGTCAAA-3.' o 5'-CGCAGTCAAG-3 ' .

En el contexto de la presente invención, el término "secuencia de codificación iniciadora de la traducción" se define como los nueve nucleótidos inmediatamente en la dirección 3' del codón iniciador o de Inicio del marco de lectura abierto de una secuencia que codifica el ADN. El codón iniciador o de Inicio codifica el AA metionina. El codón iniciador es normalmente ATG, pero puede ser también cualquier codón de Inicio funcional tal como GTG.

En el contexto de la presente invención, el término "secuencia de terminación de la traducción" se define como los cuatro nucleótidos que comienzan desde el codón de detención de la traducción en el extremo 3' del marco de lectura abierto o la secuencia de codificación del nucleótido y orientada en la dirección 5' a 3' .

En el contexto de la presente invención, el término "secuencia iniciadora de la traducción" se define como los diez nucleótidos inmediatamente en la dirección, 5' del codón iniciador o de Inicio del marco de lectura abierto de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido. El codón iniciador o de inicio codifica el AA metionina. El codón iniciador es normalmente ATG, pero puede ser también cualquier codón de inicio funcional tal como GTG. Es bien sabido en la técnica que el uracilo, U, sustituye al desoxinucleótido timina, T, en el ARN.

Homología e identidad Se dice que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son homologas cuando presentan un determinado nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolutivo común. Cuando dos secuencias homologas están estrechamente relacionadas o menos relacionadas esto se indica mediante el "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo respectivamente. Aunque sea discutible, para indicar "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", se utiliza con frecuencia indistintamente el "nivel de homología" o el "porcentaje de homología" .

Los términos "homología", "porcentaje de homología", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se usan indistintamente en el presente documento. Para los fines de la presente invención, se define aquí que con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias completas a fines comparativos. Con el fin de optimizar la alineación entre las dos secuencias, se pueden introducir huecos en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Dicha alineación se lleva a cabo sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Alternativamente, la alineación se puede llevar a cabo sobre una longitud más corta, por ejemplo, sobre aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/basados en aminoácidos. La identidad es el porcentaje de correspondencias idénticas entre las dos secuencias sobre la región alineada notificada.

Se puede llevar a cabo una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático. La persona experta será consciente del hecho de que se encuentran disponibles diversos programas informáticos diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre las dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison en D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, p . 1-44 Addison Wesley) . Se puede determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch para la alineación de las dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453) . El algoritmo alinea las secuencias de aminoácidos así como las secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Para los fines de la presente invención, se utilizó el programa NEEDLE que formaba parte del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http : //emboss . bioinformatics . ni/ ) . Para las secuencias de polipéptidos, se utilizó BLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para las secuencias de nucleótidos, se utilizó EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros, opcionales utilizados para la alineación de las secuencias de aminoácidos son una penalización por apertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. La persona experta apreciará que todos estos parámetros diferentes darán como ' resultado resultados ligeramente diferentes pero que el porcentaje global de identidad de las dos secuencias no se verá significativamente alterado cuando se utilicen diferentes algoritmos.

Definición de la homología global La homología o identidad es el porcentaje de correspondencias idénticas entre las dos secuencias completas sobre la región alineada total incluyendo cualquier hueco o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calculó como sigue: número de posiciones correspondientes en la alineación que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total de la alineación incluyendo los huecos. La identidad definida como en el presente documento se puede obtener a partir de NEEDLE y se etiquetó en la salida del programa como "IDENTITY" .

Definición de la mayor identidad La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calculó como sigue: número de posiciones correspondientes en la alineación que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total de la alineación después de la sustracción del número total de huecos en la alineación. La identidad definida como en el presente documento se puede obtener a partir de NEEDLE utilizando la opción NOBRIEF y se etiquetó en la salida del programa como "mayor identidad" . Para los fines de la presente invención, el nivel de identidad (homología) entre dos secuencias (aminoácidos o nucleótidos) se calculó de acuerdo con la definición de "mayor identidad" como se puede llevar a cabo utilizando el programa NEEDLE .

Se pueden utilizar adicionalmente las secuencias de polipéptidos de la presente invención como una "solicitud de secuencia" para llevar a cabo una búsqueda en las bases de datos de secuencias, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando los programas BLAST. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov) . Se utilizó BLASTP para las secuencias de aminoácidos y BLASTN para las secuencias de nucleótidos. El programa BLAST utiliza como valores por defecto: - Coste de .apertura de huecos: valores por defecto = 5 para nucleótidos/ 11 para polipéptidos Coste de extensión de huecos: valores por defecto = 2 para nucleótidos/ 1 para polipéptidos Penalización por correspondencia incorrecta de nucleótidos: valor por defecto = -3 Recompensa por correspondencia de nucleótidos: valor por defecto = 1 Valor esperado: valor por defecto = 10 -Tamaño de palabra: valor por defecto = 11 para nucleótidos/ 28 para megablast/ 3 para polipéptidos Además, se determinó el grado de identidad local (homología) entre la consulta de la secuencia de aminoácidos o la consulta de la secuencia de ácidos nucleicos y las secuencias homologas recuperadas mediante el programa BLAST. Sin embargo, solo se compararon aquellos segmentos de la secuencia que proporcionan una correspondencia por encima de un determinado umbral. De acuerdo con esto, el programa calcula únicamente la identidad de estos segmentos correspondientes. Por tanto, la identidad calculada de esta manera se denomina identidad local.

Hibridación Tal como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión "hibridar selectivamente", "híbrida selectivamente" y expresiones similares describan las condiciones para la hibridación y el lavado bajo las cuales las secuencia de nucleótidos permanécen ' normalmente hibridadas entre sí con al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, de forma más preferible al menos aproximadamente 85%, incluso de forma más preferible al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos 95%, de forma más preferible, al menos aproximadamente 98% o de forma más preferible, al menos aproximadamente 99% de homología. Es decir, dichas secuencias de hibridación pueden compartir al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, de forma más preferible, al menos aproximadamente 85%, incluso de forma más preferible, al menos aproximadamente 90%, más preferiblemente, al menos 95%, más preferiblemente, al menos 98% o de forma más preferible, al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia.

Un ejemplo preferido no limitante de dichas condiciones de hibridación es la hibridación en 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45o C, seguido por uno o más lavados en 1 X SSC, SOS. al 0,1% a aproximadamente 50o C, preferiblemente a aproximadamente 55o C, preferiblemente a aproximadamente 60o C e incluso de forma más preferible a aproximadamente 65o C.

Las condiciones muy restrictivas incluyen, por ejemplo, la hibridación a aproximadamente 68o C en 5x SSC/5x de solución de Denhardt / SDS al 1,0% y lavado en 0,2x de SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente. Alternativamente, se puede llevar a cabo el lavado a 42oC.

El técnico experto sabrá qué condiciones aplicar para obtener condiciones de hibridación restrictivas y muy restrictivas. Se encuentran fácilmente disponibles en la técnica directrices adicionales con respecto a dichas condiciones, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y col. (eds.), 1995,· Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) .

Por supuesto, un polinucleótido que se híbrida únicamente con una secuencia poli A (tal como el tramo poli (A) del extremo 3 ' de los AR m) , o con un tramo complementario de restos de T (o U) , no estaría incluido en un polinucleótido de la presente invención utilizado para hibridarse específicamente con una porción del ácido nucleico de la presente invención, debido a que dicho polinucleótido se hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera un tramo poli (A) o su complemento (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario) .

En una solución típica, se pueden cribar las bibliotecas de ADNc construidas a partir de otros organismos, por ejemplo, hongos filamentosos, en particular, a partir de microorganismos de la familia Trichomaceae , por ejemplo, a partir del género Penicillium, tal como; Penicillium decumbens .

Por ejemplo, se pueden cribar cepas de Penicillium para los polinucleótidos TEMER08806 homólogos mediante el análisis de la transferencia Northern. Tras la detección de los transcritos homólogos de los polinucleótidos de acuerdo con la presente invención, se pueden construir bibliotecas de ADNc construidas a partir de ARN aislado procedente de la cepa adecuada, utilizando técnicas normalizadas bien conocidas de los expertos en la técnica. Alternativamente, se puede cribar una biblioteca de ADN genómico total utilizando una sonda capaz de hibridarse a un polinucleótido TEMER08806 de acuerdo con la presente invención.

Se pueden aislar secuencias homologas del gen, por ejemplo, llevando a cabo la PCR utilizando dos combinados de cebadores de oligonucleótidos degenerados diseñadas sobre la base de las secuencias de nucleótidos enseñadas en el presente documento.

El molde para la reacción puede ser ADNc obtenido mediante transcripción inversa del ARNm preparado a partir de cepas conocidas o sospechosas de expresar un polinucleótido de acuerdo con la presente invención. Se puede subclonar el producto de la PCR y secuenciarse para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico de TEMER08806, o uno de sus equivalentes funcionales.

A continuación, se puede usar el fragmento de la PCR para aislar un clon de ADNc de longitud completa mediante una variedad de procedimientos conocidos. Por ejemplo, se puede etiquetar el fragmento amplificado y utilizarse para cribar una biblioteca de ADNc de bacteriófagos o cósmidos. Alternativamente, el fragmento etiquetado se puede utilizar para cribar una biblioteca genómica.

Se puede utilizar también la tecnología de la PCR para aislar secuencias de ADNc de longitud completa a partir de otros organismos. Por ejemplo, se puede aislar ARN, siguiendo los procedimientos normalizados, a partir de una fuente celular o tisular adecuada. Se puede llevar a cabo una reacción de transcripción inversa sobre el ARN utilizando un cebador de oligonucleótidos específico de la mayor parte del extremo 5' del fragmento amplificado para el cebado de la síntesis de la primera hebra.

A continuación se puede "agregar una cola" al híbrido de ARN/ADN resultante (por ejemplo, con guaninas) utilizando una reacción de la transferasa en el extremo normalizada, el híbrido se puede digerir con ARNasa H, y a continuación se puede cebar la síntesis de una segunda hebra (por ejemplo, con un cebador poli-C) . De esta manera, se pueden aislar fácilmente secuencias de ADNc en la dirección 5' del fragmento amplificado. Para una revisión de las estrategias de clonación útiles, véanse, por ejemplo, Sambrook y col., más arriba; y Ausubel y col., más arriba.

Vectores Otro aspecto de la presente invención corresponde a los vectores, incluyendo los vectores de clonación y expresión que comprenden un polinucleótido de la presente invención que codifica un polipéptido TEMER08806 o uno de sus equivalentes funcionales y los procedimientos de crecimiento, transformación o transfección de dichos vectores en una célula hospedadora adecuada, por ejemplo, en condiciones en las que se produzca la expresión de un polipéptido de la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de trasportar otro ácido nucleico al cual se ha unido .

Se pueden incorporar los polinucleótidos de la presente invención a un vector replicable recombinante, por ejemplo, un vector de clonación o expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. De esta manera, en una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento de preparación de polinucleótidos de la presente invención mediante la introducción de un polinucleótido de la presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y haciendo crecer la célula hospedadora en condiciones que provoquen la replicación del vector. Se puede recuperar el vector a partir de la célula hospedadora. A continuación se describen las células hospedadoras adecuadas.

El vector en el que se inserta el cásete de expresión o el polinucleótido de la presente invención puede ser cualquier vector que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante , y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedadora en la que se va a introducir .

Un vector de acuerdo con la presente invención puede ser un vector que se replica de forma autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el (los) cromosoma (s) en el (los) que se ha integrado .

Un tipo de vector es un "plásmido" , que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario al que se pueden unir segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, al que se pueden unir segmentos de ADN adicionales del genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en la célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamíferos) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y se replica por tanto junto con el genoma hospedador. . Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se unen de manera operativa. Dichos . vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos . Los términos "plásmido" y "vector" se pueden utilizar de forma indistinta en el presente documento debido a que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, se pretende que la presente invención incluya otras de las mencionadas formas de vectores de expresión, tales como cósmidos, vectores víricos (por ejemplo, retrovirus defectivos para la replicación, adenovirus y virus adenoasociados) y vectores de fagos que sirven con funciones equivalentes.

Para la mayoría de hongos filamentosos y levaduras, el vector o la construcción de expresión se integran preferiblemente en el genoma de la célula hospedadora con el fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para determinadas levaduras están disponibles también vectores episómicos adecuadas en los que se puede incorporar la construcción de expresión para una expresión estable y de elevado nivel, los ejemplos de la misma incluyen vectores derivados de los plásmidos 2µ y pKDl de Saccharomyces y Kluyveromyces , respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus) . En el caso de que las construcciones de expresión se integren en el genoma de las células hospedadoras , las construcciones se integran tanto como en loci aleatorios en el genoma, como en loci diana predeterminados utilizando la recombinación homologa, en cuyo caso, los loci diana comprenden preferiblemente un gen muy expresado.

De acuerdo con esto, los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos , episómicos, y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacterióf gos, episomas de levaduras, elementos cromosómicos de levaduras, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus vaccinia, adenovirus , virus de la viruela aviar, virus de la seudorrabia y retrovirus, y los vectores derivados de sus combinaciones, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos .

Se pueden usar vectores de acuerdo con la presente invención in vitro, por ejemplo, para la producción de AR o utilizarse para transfectar o transformar una célula hospedadora . El vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, utilizando, por ejemplo, secuencias reguladoras del promotor T7 y la polimerasa T7.

Un vector de la presente invención puede comprender dos o más, por ejemplo, tres, cuatro o cinco, polinucleótidos de la presente invención, por ejemplo para la expresión en exceso.

Los vectores de expresión recombinante de la presente invención comprenden un ácido nucleico de la presente invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospedadoras que se van a utilizar para la expresión, que se une de manera operable a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar.

Para un vector, tal como un vector de expresión, se pretende que "unido de manera operable" signifique que la secuencia del nucleótido de interés este unida a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de una manera que permita la expresión de la secuencia del nucleótido (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora) , es decir, el término "unido de manera operable" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación tal que les permite actuar en su manera prevista. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de la expresión "unida de manera operable" a una secuencia de codificación se sitúa de tal manera que se alcanza la expresión de la secuencia de codificación en condiciones compatibles con las secuencias control o las secuencias se disponen de tal manera qué funcionan en concierto para su fin previsto, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y continúa a lo largo de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

Un vector o construcción de expresión destinado a una célula hospedadora dada puede comprender de esta manera los siguientes elementos unidos de manera operable entre sí en un orden consecutivo desde el extremo 5' al extremo 3' con respecto a la hebra codificante de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en una célula hospedadora dada; (2) opcionalmente , una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido a partir de la célula hospedadora dada en un medio de cultivo; (3) una secuencia de ADN de la presente invención que codifica una forma madura y preferiblemente activa de un polipéptido que tiene actividad suolenina; y preferiblemente también (4) una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de finalizar la transcripción en la dirección 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.

En la dirección 3' de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención puede existir una región 3' sin traducir que contenga uno o más sitios de terminación de la transcripción (por ejemplo, un terminador) . El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede ser, por ejemplo, propio de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, se utiliza preferiblemente un terminador de levadura en las células hospedadoras de levaduras y se utiliza un terminador de hongo filamentoso en las células hospedadoras de hongos filamentosos. De forma más preferible, el terminador es endógeno para la célula hospedadora (en la que se va a expresar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido) . En la región transcrita, puede estar presente un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresada por las construcciones incluirá un codón AUG iniciador de la traducción al comienzo y un codón de terminación adecuadamente situado al extremo del polipéptido que se va a traducir.

Se puede conseguir también el potenciamiento de la expresión del polinucleótido de la presenté invención mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, regiones líderes de la secreción y/o regiones terminadoras , que pueden server para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción del polipéptido de interés a partir del hospedador de la expresión y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de un polipéptido de la presente invención.

Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores, tales como los vectores de expresión de la presente invención, se pueden introducir en células hospedadoras para producir, por tanto, proteínas o péptidos codificados por ácidos nucleicos tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, los polipéptidos TEMER08806, formas mutantes de polipéptidos TEMER08806, fragmentos, variantes o sus equivalentes funcionales. Los vectores, tales como los vectores de expresión recombinante de la presente invención se pueden diseñar para la expresión de los polipéptidos TEMER08806 en células procariotas o eucariotas.

Por ejemplo, se pueden expresar polipéptidos TEMER08806 en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus) , hongos filamentosos, células de levaduras o células de mamíferos. Se describen además células hospedadoras adecuadas en Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Se describen a partir de ahora ejemplos representativos de hospedadores adecuados .

Se conocen en la técnica los medios y condiciones de cultivo adecuados para las células hospedadoras anteriormente descritas .

Se define en el presente documento la expresión "secuencias control" o "secuencias reguladoras" para incluir al menos cualquier componente que pueda ser necesario y/o ventajoso para la expresión de un polipéptido. Cualquier secuencia control puede ser natural o extraña respecto de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido. Dichas secuencias control pueden incluir, pero no se limitan a, un promotor, un líder, secuencias óptimas de inicio de la traducción (tal como se describe en Kozak, 1991, J. Biol . Chem. 266: 19867-19870), una secuencia señal de la secreción, una secuencia propeptídica, una secuencia de poliadenilación, un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias control incluyen normalmente un promotor, y señales de detención de la transcripción y de la traducción. Tal como se muestra anteriormente, el término "unido de manera operable" se define en el presente documento como una configuración en la que una secuencia control se coloca de forma adecuada en una posición, con respecto a la secuencia de codificación de la secuencia de ADN, de tal manera que, la secuencia control dirige la producción de un polipéptido.

Se pueden proporcionar secuencias control con enlazadores a fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias control con la región de codificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido. El término "unido de manera operable" se define en el presente documento como una configuración en la que una secuencia control se coloca adecuadamente en una posición con respecto a la secuencia de codificación de la secuencia de ADN de tal manera que la secuencia control dirige la producción de un polipéptido.

La secuencia control puede ser una secuencia promotora adecuada, una secuencia de ácido nucleico, que es reconocida por una célula hospedadora para la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia promotora contiene secuencias control de la transcripción, que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula, incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares tanto homólogos como heterólogos en la célula.

La secuencia control puede ser también una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula de un hongo filamentoso que finalice la transcripción. La secuencia terminadora está unida de manera operable al extremo 3 ' de la ' secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Se puede utilizar cualquier terminador, que sea funcional en la célula en la presente invención.

La secuencia control puede ser también un terminador.

Los terminadores preferidos para las células de los hongos filamentos se obtuvieron de los genes que codificaban la amilasa TAKA de A. oryzae, la glucoamilasa de A. niger (glaA) , la antranilato sintasa de A. nidulans, la alfa-glucosidasa de A. niger, la proteasa de tipo tripsina del gen trpC de Fusarium oxysporum.

La secuencia control puede ser también una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula del hongo filamentoso. La secuencia líder se une de manera operable al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Se puede utilizar en la presente invención cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula. Los líderes preferidos para las células de los hongos filamentosos se obtuvieron de genes que codificaban la amilasa TAKA de A. oryzae TAKA y la triosa fosfato isomerasa de A. nidulans y glaA de A. niger.

Se pueden aislar otras secuencias control del gen ???? de Penicillium, o del gen pcbC, el gen de la beta tubulina. Todas las secuencias control citadas en el documento O 01/21779 se incorporan adjuntas por referencia.

La secuencia control puede ser también una secuencia de poliadenilación, una secuencia que está unida de manera operable al extremo 3' de la secuencia del ácido nucleico y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula del hongo filamentoso como una señal para añadir restos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede utilizar en la presente invención cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula. Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células de los hogos filamentosos se obtuvieron a partir de los genes que codificaban la amilasa TAKA de A. oryzae, la glucoamilasa de A. niger, la antranilato sintasa de A. nidulans, la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum y la alfa-glucosidasa de A. niger.

Cuando el polipéptido de acuerdo con la presente invención se va a secretar desde la célula hospedadora al medio de cultivo, se puede añadir una secuencia señal adecuada al polipéptido con el fin de dirigir el polipéptido sintetizado de novo hacia la ruta de secreción de la célula hospedadora. La persona experta en la técnica sabe seleccionar una secuencia señal adecuada para la célula hospedadora. La secuencia señal puede ser natural para la célula hospedadora, o puede ser extraña para la célula hospedadora. Como ejemplo, se puede utilizar una secuencia señal procedente de un polipéptido natural para la célula hospedadora. Preferiblemente, dicho polipéptido natural es un polipéptido fuertemente secretado, es decir, un polipéptido que se secreta en cantidades mayores de un 10% de la cantidad total del polipéptido que se está secretando. Las secuencias señal utilizadas preferiblemente de acuerdo con la presente invención son por ejemplo: pmeA.

Como alternativa a una secuencia señal, el polipéptido de la presente invención puede fusionarse con un polipéptido portador secretado, o con una parte del mismo. Dicha construcción quimérica se dirige a la ruta de secreción por medio de la secuencia señal del polipéptido portador, o parte del mismo. Además, el polipéptido portador proporcionará un efecto estabilizador al polipéptido de acuerdo con la presente invención y/o puede potenciar la solubilidad. Dicho polipéptido portador puede ser cualquier polipéptido. Preferiblemente, se utiliza como polipéptido portador un polipéptido fuertemente secretado. El polipéptido portador puede ser un polipéptido natural o extraño para el polipéptido de acuerdo con la presente invención. El polipéptido portador puede ser natural o puede ser extraño para la célula hospedadora. Los ejemplos de dichos polipéptidos portadores son la glucoamilasa, la preprosecuencia del factor de unión a alfa, el dominio de unión a la celulosa de la proteína A de unión a la celulosa de Clostridium cellulovorans , la glutatión S-transferasa, el dominio de unión a la quitina de la quitinasa Al de Bacillus circulans, el dominio de unión a la maltosa codificado por el gen malE de E. coli K12 , la beta-galactosidasa, y la fosfatasa alcalina. Un polipéptido portador preferido para la expresión de dicha construcción quimérica en células de Aspergillus es la glucoamilasa . La proteína y el polipéptido portadores pueden contener un motivo de aminoácidos específico para facilitar el aislamiento del polipéptido; el polipéptido de acuerdo con la invención se puede liberar mediante un agente de liberación especial. El agente de liberación puede ser una enzima proteolítica o un agente químico. Un ejemplo de dicho motivo de aminoácidos es el sitio de escisión de la proteasa KEX, que es bien conocido por las personas expertas en la técnica.

Se puede utilizar una secuencia señal para facilitar la secreción y el aislamiento de una proteína o polipéptido de la presente invención. Las secuencias señal se caracterizan normalmente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos, que se escinde de la proteína madura durante la secreción en uno o más acontecimientos de escisión. Dichos péptidos señal contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia señal de las proteínas maduras a medida que pasan por la ruta secretora. La secuencia señal dirige la secreción de la proteína, tal como un hospedador eucariota en la que se ha transformado el vector de expresión, y la secuencia señal se escinde posterior o simultáneamente. A continuación, la proteína se puede purificar fácilmente a partir del medio extracelular mediante procedimientos conocidos. Alternativamente, la secuencia señal se puede unir a la proteína de interés utilizando una secuencia que facilite la purificación, tal como el dominio GST. De esta manera, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido, lo que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En determinadas realizaciones preferidas de este aspecto de la presente invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Tal como se describe, por ejemplo, en Gentz y col, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989) , la hexahistidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta HA es, por ejemplo, otro péptido útil para la purificación, que corresponde a un epítopo derivado de la hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrito por Wilson y col., Cell 37:767 (1984) .

Preferiblemente, se produce una proteína de fusión TEMER08806 de la presente invención mediante técnicas normalizadas de ADN recombinante . Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se unen juntos en un marco, de acuerdo con las técnicas convencionales, empleando por ejemplo, términos con extremos enromados, o extremos escalonados para la unión, la digestión con la enzima de restricción proporciona los extremos adecuados, rellenándolos de extremos cohesivos según sea adecuado, el tratamiento con la fosfatasa alcalina evita una unión indeseable y la unión enzimática. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificación mediante la PCR de los fragmentos del gen utilizando cebadores de anclaje, que proporcionan un aumento de los salientes complementarios entre dos fragmentos consecutivos del gen que se pueden hibridar y volver a amplificar posteriormente para generar una secuencia de un gen quimérico (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel y col. John Wiley & Sons: 1992). Además, están comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican u resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Se puede clonar un ácido nucleico que codifique TEMER08806 en dicho vector de expresión de tal manera que un resto de fusión se una en marco con la proteína TEMER08806.

Preferiblemente, la eficacia de la integración dirigida en el genoma de la célula hospedadora, es decir, la integración en un locus diana predeterminado, se ve aumentada por las mayores capacidades de recombinación homologa de la célula hospedadora. Dicho fenotipo de la célula implica preferiblemente una deficiencia en el gen hdfA o hdfB, tal como se describe en el documento WO2005/095624. El documento WO2005/095624 da a conocer un procedimiento preferido para obtener una célula de hongo filamentoso que comprende un aumento de la eficacia de la integración dirigida.

Opcionalmente , la célula hospedadora comprende una elevada respuesta a la proteína no plegada (UPR) , en comparación con la célula natural, para potenciar la producción de las capacidades del polipéptido de interés. La UPR puede aumentarse mediante las técnicas descritas en los documentos US2004/0186070A1 y/o US2001/0034045A1 y/o WO01/72783A2 y/o O2005/123763. Más específicamente, se ha modulado el nivel de proteína de HAC1 y/o IRE1 y/o PTC2 , y/o la proteína SEC61 se ha diseñado mediante ingeniería genética con el fin de obtener una célula hospedadora que tenga una elevada UPR.

Alternativamente, o en combinación con una elevada UPR, la célula hospedadora se modifica genéticamente para obtener un fenotipo que presente una menor expresión de la proteasa y/o secreción de la proteasa en comparación con la célula natural, con el fin de potenciar las capacidades de producción de un polipéptido de interés . Se puede obtener dicho fenotipo mediante la deleción y/o modificación y/o inactivación de un regulador transcripcional de la expresión de las proteasas. Dicho regulador de la transcripción es, por ejemplo, prtT. Se puede llevar a cabo la disminución de la expresión de las proteasas mediante la modulación de prtT mediante las técnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.

Alternativamente, o en combinación con una elevada UP y/o un fenotipo que presenta una menor expresión de la proteasa y/o secreción de la proteasa, la célula hospedadora presenta un fenotipo deficiente en oxalato con el fin de potenciar la reducción de la producción del polipéptido de interés. Se puede obtener un fenotipo deficiente en oxalato mediante las técnicas descritas en el documento WO2004/070022A2.

Alternativamente, o en combinación con una elevada UPR y/o un fenotipo que presenta menor expresión de la proteasa y/o secreción de la proteasa y/o deficiencia en oxalato, la célula hospedadora presenta una combinación de diferencias fenotípicas en comparación con la célula natural para potenciar el rendimiento de la producción del polipéptido de interés. Estas diferencias pueden incluir, pero no limitarse a, la disminución de la expresión de la glucoamil'asa y/o una alfa-amilasa A neutral y/o alfa-amilasa B neutra, proteasa, y ácido oxálico hidrolasa. Se pueden obtener diferencias fenotípicas presentadas por la célula hospedadora mediante la modificación genética, de acuerdo con las técnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.

Alternativamente, o en combinación con una elevada UPR y/o un fenotipo que presenta una menor expresión de la proteasa y/o secreción de la proteasa y/o deficiencia en oxalato y una combinación de diferencias fenotípicas en comparación con la . célula natural para potenciar el rendimiento de la producción del polipéptido de interés, la célula hospedadora presenta una deficiencia en los genes de toxinas, lo que obstaculiza la capacidad de la célula hospedadora del hongo filamentoso para expresar toxinas. Dichas toxinas incluyen, pero no se limitan a, ocratoxinas, fumonisinas, ácido ciclapiazónico, ácido 3 -nitropropiónico, emodina, malformina, aflatoxinas y ácidos secalónicos . Dicha deficiencia es preferiblemente tal como se describe en el documento WO2000/039322.

Expresión (en exceso) En una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención, tal como se describe en el presente documento, se pueden expresar en exceso en una cepa microbiana de la presente invención en comparación con la cepa microbiana progenitora en la que dicho gen no se expresa en exceso. La expresión en exceso de una secuencia del polinucleótido se define en el presente documento como la expresión de dicha secuencia del gen, lo que da como resultado una actividad de la enzima codificada por dicha secuencia en una cepa microbiana que es al menos aproximadamente 1,5 veces la actividad de la enzima en la cepa microbiana progenitora; preferiblemente, la actividad de dicha enzima es al menos de aproximadamente 2 veces, más preferiblemente al menos de aproximadamente 3 veces, más preferiblemente al menos de aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos de aproximadamente 5 veces, incluso de forma más preferible al menos de aproximadamente 10 veces y lo más preferible al menos de aproximadamente 20 veces la actividad de la encima en el organismo microbiano progenitor.

El vector puede incluir además secuencias que flanquean el polinucleótido que proporcionan un aumento del ARN que comprenden secuencias homologas a las secuencias genómicas eucariotas . Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la presente invención en el genoma de la célula hospedadora.

Un vector de clonación integrador puede integrar un locus diana aleatorizado o predeterminado en el (los) cromosoma (s) de la célula hospedadora en la que se va a integrar. En una realización preferida de la presente invención, un vector de clonación integrador puede comprender un fragmento de ADN que es homólogo de una secuencia de ADN en un locus diana predeterminado en el genoma de la célula hospedadora, para dirigir la integración del vector de clonación en este locus predeterminado. Con el fin de promover la integración dirigida, se puede linealizar el vector de clonación preferiblemente antes de la transformación en la célula hospedadora. La linealización se puede llevar a cabo preferiblemente de tal manera que al menos uno, pero preferiblemente cualquier extremo del vector de clonación esté flanqueado por secuencias homologas en el locus diana. La longitud de las secuencias homologas que flanquean el locus diana es preferiblemente al menos aproximadamente de 0,lkb, tal como al menos aproximadamente de 0,2kb, de forma más preferible al menos aproximadamente de 0,5 kb, incluso de forma más preferible al menos aproximadamente de 1 kb, lo más preferible al menos aproximadamente de 2 kb. Preferiblemente, las cepas hospedadoras progenitoras pueden modificarse para mejorar la frecuencia de integración del ADN dirigido, tal como se describe en los documentos WO05/095624 y/o WO2007/115886.

El ejemplo de deleción proporcionado en la presente invención utiliza el promotor del gen como flanco 5' y el gen como flanco 3' para insertar un marcador de selección entre el promotor y el gen, interrumpiendo de esta manera (es decir, inactivando funcionalmente) la transcripción del gen. Se pueden utilizar las secuencias del gen proporcionadas anteriormente para preparar genes inactivados funcionalmente similares. Los genes pueden dividirse en dos, dando como resultado un flanco 5' y un flanco 3', pero el gen puede utilizarse también para clonar un elemento más grande del ADN genómico que contiene las regiones promotoras y terminadoras del gen, que pueden funcionar entonces como flancos 5' y flancos 3 ' .

El sistema del vector puede ser un único vector, tal como un único plásmido, o dos o más vectores, tal como dos o más plásmidos, que contienen conjuntamente el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora.

El vector puede contener un polinucleótido de la presente invención orientado en una dirección de sentido contrario para facilitar la producción de ARN de sentido contrario.

Se puede introducir el vector de ADN en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfeccion convencionales. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que los términos "transformación" y "transfeccion" se refieran a una variedad de técnicas reconocidas en la materia para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, entre los que se incluyen la precipitación simultánea con fosfato de calcio o con cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónicos o electroporación . Se pueden encontrar los procedimientos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras en Sambrook, y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) , Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de las células de mamíferos, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizados, soló una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionáble (por ejemplo, resistencia a los antibióticos) , en las células hospedadoras, junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que confieren resistencia a los fármacos o que complementan un defecto en la célula hospedadora. Incluyen, por ejemplo, genes marcadores versátiles que se pueden utilizar para la transformación de la mayor parte de los hongos filamentosos, tales como los genes de la acetamidasa o de los ADNc (los genes amdS, niaD, facA o de los ADNc de A. nidulans, A. oryzae o A. niger) , o los genes que proporcionan resistencia a los antibióticos del tipo G418, resistencia a la higromicina, bleomicina, kanamicina, metotrexato, fleomicina o benomilo (benA) . Alternativamente, se pueden utilizar marcadores de selección específicos tales como marcadores auxotróficos que requieran las correspondientes cepas hospedadoras mutantes: por ejemplo, URA3 (procedente de S. cerevisiae o genes análogos procedentes de otras levaduras) , pyrG o pyrA (procedentes de A. nidulans o A. niger) , argB (procedente de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferida, el marcador de selección se elimina de la célula hospedadora transformada tras la introducción de la construcción de expresión de tal manera que se obtienen células hospedadoras transformadas capaces de producir el polipéptido que se encuentran exentas de genes marcadores de selección.

Otros marcadores incluyen la ATP sintetasa, la subunidad 9 (oliC) de la orotidina- 5 ' -fosfatodecarboxilasa (pvrA) , el gen bacteriano G418 de la resistencia (este se puede utilizar también en levaduras, pero no en hongos) , el gen de resistencia a la ampicilina (E. coli) , el gen de resistencia a la neomicina (Bacillus) , el gen natl de resistencia a la nurseotricina procedente de Streptomyces nursei, el gen ptrA de resistencia a la piritiamina de Aspergillus oryzae y el gen uidA de E. coli, que codifica la ß-glucuronidasa (GUS) . Se pueden utilizar vectores in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o usarse para transfectar o transformar una célula hospedadora .

Frecuentemente se lleva a cabo la expresión de proteínas en procariotas en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión tanto de proteínas de fusión como de no fusión. Los vectores de fusión añaden numerosos aminoácidos a una proteína codificada de la anterior, por ejemplo al extremo amino de la proteína recombinante . Dichos vectores de fusión sirven normalmente a tres fines: 1) para aumentar la expresión de una proteína recombinante; 2) para aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de la fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión, posterior a la purificación de la proteína de fusión.

Tal como se ha indicado, los vectores de expresión contendrán preferiblemente marcadores seleccionables . Dichos marcadores incluyen la resistencia a la dihidrofolato reductasa o a la neomicina en cultivos de células eucariotas y la resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en cultivos de E. coli y otras bacterias.

Los vectores preferidos para uso en bacterias se dan a conocer, por ejemplo, en el documento WO-A1-2004/074468 , que se ha incluido en el presente documento por referencia.

Para la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno celular, se puede incorporal una señal de secreción adecuada en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterologas.

El polipéptido TEMER08806 se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solo señales de la secreción sino también regiones funcionales heterologas adicionales. De esta manera, por ejemplo, se puede añadir una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al extremo N del polipéptido, para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación o durante la posterior manipulación y . almacenamiento. También, se pueden añadir restos de péptidos al polipéptido para facilitar la purificación.

La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos que se puede obtener mediante la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 en un hospedador adecuado. También, está comprendido en la presente invención, un péptido o polipéptido que comprende una variante de los anteriores polipéptidos , tal como un equivalente funcional. Los anteriores polipéptidos están comprendidos conjuntamente en el término "polipéptido de acuerdo con la presente invención" .

El término "péptido variante" o "polipéptido variante" se define en el presente documento como un péptido o polipéptido, respectivamente, que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncamientos . de uno o más restos de aminoácidos específicos en una o más 'posiciones específicas en el péptido o polipéptido, respectivamente. De acuerdo con esto, un péptido señal variante es un péptido señal que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncamientos de uno o más restos de aminoácidos específicos en una o más posiciones específicas en el péptido señal.

El término "polinucleótido" es idéntico al término "molécula de ácido nucleico" y se puede leer en el presente documento de forma indistinta. El término se refiere a una molécula de polinucleótido, que es una molécula de ácido' ribonucleico (ARN) o de ácido desoxirribonucleico (ADN) , tanto monocatenario como bicatenario. Un polinucleótido puede estar presente tanto en forma aislada, como estar comprendido en moléculas o vectores de ácido nucleico recombinante o estar comprendido en una célula hospedadora.

El término "polinucleótido variante" se define en el presente documento como un polinucleótido que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncamientos de uno o más nucleótidos en una o más posiciones en el polinucleótido.

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como se reconoce comúnmente) y cada término se puede utilizar indistintamente, según requiera el contexto, para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados mediante enlaces peptidilo. La palabra "polipéptido" se utiliza en el presente documento para cadenas que contienen más de siete restos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos en el presente documento se escriben de izquierda a derecha y en la dirección desde el extremo amino al término carboxilo. Se conoce comúnmente en la técnica el código de una letra de los aminoácidos utilizados en el presente documento y se puede encontrar en Sambrook, y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .

Por polipéptido o proteína "aislado" se pretende un polipéptido o proteína fuera de su entorno natural. Por ejemplo, los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células hospedadoras se consideran aislados para el fin de la invención ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han purificado sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el procedimiento de purificación paso a paso dado a conocer en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988) .

El polipéptido TEMER08806 con actividad suolenina de acuerdo con la invención se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos conocidos en la técnica. Lo más preferible, se emplea la cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") para la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota, que incluyen, por ejemplo, células bacterianas, de levaduras, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante , los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden incluir también un resto inicial de metionina modificada, en algunos casos, como resultado de procesos mediados por el hospedador.

La invención caracteriza también fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de acuerdo con la presente invención.

Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER08806 (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2), que incluye menos aminoácidos que el polipéptido de longitud completa pero que presenta al menos una actividad biológica del polipéptido de longitud completa correspondiente. Normalmente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad del polipéptido TEMER08806.

Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más aminoácidos de longitud o al menos aproximadamente 100 aminoácidos, al menos 150, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos de longitud, o de una longitud hasta el número total de aminoácidos del polipéptido de la presente invención.

Además, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas, en las que se eliminan otras regiones del polipéptido, mediante técnicas recombinantes y evaluarse para una o más de las actividades biológicas de la forma natural de un polipéptido de la presente invención.

La invención caracteriza también fragmentos de ácido nucleico que codifican los anteriores; fragmentos biológicamente activos del polipéptido TEMER08806.

Polipéptidos En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan polipéptidos TEMER08806 mejorados. Los polipéptidos TEMER08806 mejorados son polipéptidos en los que al menos una actividad biológica se encuentra mejorada. Se pueden obtener dichos polipéptidos introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación de TEMER08806, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden expresar de forma recombinante y cribarse por su actividad biológica.

Las variantes mejoradas de las secuencias de aminoácidos de la presente invención conducen a una mejora de la función suolenina que se puede obtener mediante los genes correspondientes de la presente invención. Entre dichas modificaciones se incluyen: 1. PCR propensa a error para introducir mutaciones aleatorias, seguida por un cribado de las variantes obtenidas y el aislamiento de variantes con propiedades cinéticas mejoradas 2. Reproducción aleatoria de la familia: de variantes relacionadas de los genes que codifican la enzima suolenina, seguida por un cribado de las variantes obtenidas y aislamiento de las variantes con propiedades cinéticas mejoradas Las variantes de los genes que conducen a un aumento del nivel del ARNm y/o el polipéptido dan como resultado que se pueda obtener más actividad suolenina por las secuencias de polinucleótidos de dichos genes. Entre dichas modificaciones se incluyen: 1. Mejorar la utilización del codón de tal manera que los codones se adapten (óptimamente) al hospedador microbiano progenitor . 2. Mejorar la utilización de la pareja de codones de tal manera que los codones se adapten (óptimamente) al hospedador microbiano progenitor. 3. Adición de secuencias estabilizantes de la información genómica que codifica el polipéptido con actividad suolenina dando como resultado moléculas de ARNm con un aumento de la semivida.

Se describen en los documentos O03/010183 y WO03/01311 los procedimientos preferidos para aislar variantes con propiedades catalíticas mejoradas o niveles aumentados de ARNm o polipéptido. Se describen en el documento PCT/EP2007/05594 los procedimientos preferidos para optimizar la utilización del codón en las cepas microbianas progenitoras . Se describen en el documento WO2005/059149 los procedimientos preferidos para la adición de elementos estabilizantes de los genes que codifican el polipéptido con actividad suolenina de la presente invención.

En una realización, el polipéptido TEMER08806 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ JD NO: 2. En otra realización, el polipéptido TEMER08806 es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 y retiene al menos una actividad biológica de un polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, tal como se describe, difiere además en la secuencia de aminoácidos debido a la variación natural o a la mutagénesis.

En una realización adicional preferida, el polipéptido TEMER08806 tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado capaz de hibridarse con un ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, preferiblemente en condiciones de hibridación muy restrictivas.

De acuerdo con esto, el polipéptido TE ER08806 es preferiblemente un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 73%, al menos un 74%, al menos un 75%, al menos un 76%, al menos un 77%, al menos un 78%, al menos un 79%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un. 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%; al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o más homologa a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2 y, normalmente, retiene al menos una actividad funcional del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

Se pueden identificar también los equivalentes funcionales de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, cribando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, truncamiento de mutantes, del polipéptido de la presente invención para la actividad suolenina. En una realización, se generó una biblioteca variegada de mutantes mediante mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico. Se puede producir una biblioteca variegada de variantes, por ejemplo, uniendo enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de tal manera que sea expresable un conjunto degenerado de potenciales polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la expresión en fago) . Existen diferentes de procedimientos que se pueden utilizar para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la presente invención a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. Se conocen en la técnica procedimientos . para sintetizar oligonucleótidos degenerados (véanse, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura y col. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura y col. (1984) Science 198: 1056; Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477) .

Además, se pueden utilizar bibliotecas de fragmentos de la secuencia de codificación de un polipéptido de la presente invención para generar una población variegada de polipéptidos para cribar una posterior selección de variantes. Por ejemplo, se puede generar una biblioteca de fragmentos de la secuencia1 de codificación tratando un fragmento de la PCR bicatenario de la secuencia de codificación de interés con una nucleasa en condiciones en las que se produce un mellado solo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir parejas de sentido directo/sentido contrario de diferentes productos mellados, eliminar porciones monocatenarias de los dupletes reformados mediante tratamiento con la nucleasa SI y unir la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Mediante este procedimiento, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica un extremo N y fragmentos internos de diversos tamaños de la proteína de interés.

Se conocen en la materia diversas técnicas para el cribado de los productos génicos de las bibliotecas combinatorias preparados mediante mutaciones puntuales de truncamiento, y para el cribado de bibliotecas de ADNc de productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que son sensibles a un análisis de alto rendimiento, para cribar grandes genotecas incluyen normalmente la clonación de la genoteca en vectores de expresión replicables, transformar las células adecuadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresar los genes de forma combinatoria en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilite el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Se puede usar la mutagénesis de conjunto recurrente (REM) , una técnica que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, en combinación con los ensayos de cribado para identificar las variantes del polipéptido de la presente invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 89: 7811-7815; Delgrave y col. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331) .

Además de la secuencia del gen TEMER08806 que se muestra en la SEQ ID NO: 1, será evidente para la persona experta en la técnica que pueden existir polimorfismos en la secuencia de ADN dentro de una población dada, que pueden conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos, del polipéptido TEMER08806. Dichos polimorfismos genéticos pueden existir en las células de diferentes poblaciones o dentro ' de una población debido a la variación alélica natural. Las variantes alélicas pueden incluir también ; equivalentes funcionales .

Los fragmentos de un polinucleótido de la presente invención pueden comprender también polinucleótidos que no codifican polipéptidos funcionales. Dichos polinucleótidos pueden funcionar como sondas o como cebadores para una reacción de la PCR.

Se pueden utilizar ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención como sondas de hibridación o cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) sin tener en cuenta si codifican polipéptidos funcionales o no funcionales. Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene una actividad TEMER08806 incluyen, entre otros, (1) aislar el gen que codifica el polipéptido TEMER08806, o sus variantes alélicas a partir de una biblioteca de ADNc, por ejemplo, procedente de los microorganismos adecuados; (2) hibridación in situ (por ejemplo, FISH) para : diseminar la metafase cromosómica para proporcionar la localización cromosómica precisa del gen TEMER08806 tal como se describe en Verma y col., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988) ,· (3) análisis de Transferencia Northern para detectar la expresión del ARNm de TEMER08806 en tejidos y/o células específicos y 4) sondas y cebadores que se pueden utilizar como herramienta diagnóstica para analizar la presencia de un ácido nucleico que se puede hibridar con la sonda TEMER08806 en una muestra biológica dada (por ejemplo, de tejido) .

Está también abarcado por la presente invención un procedimiento para obtener un equivalente funcional del gen TEMER08806. Dicho procedimiento implica obtener una sonda etiquetada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica toda o una porción de la secuencia del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o una de sus variantes; cribando una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico con la sonda etiquetada en condiciones que permitan la hibridación de la sonda con los fragmentos de ácido nucleico de la biblioteca, formando por tanto dupletes de ácido nucleico y preparando una secuencia del gen de longitud completa procedente de los fragmentos de ácido nucleico en cualquier duplete etiquetado para obtener un gen relacionado con el gen TEMER08806.

En una realización, un ácido nucleico de TEMER08806 de la presente invención es al menos un 78%, al menos un 79%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o más homólogo con una secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma.

Se proporcionan además : células hospedadoras que comprenden un polinucleótido o vector de la presente invención. El polinucleótido puede ser heterólogo para el genoma de la célula hospedadora. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula hospedadora, significa que el polinucleótido no se produce naturalmente en el genoma de la célula hospedadora o que el polipéptido no se produce naturalmente por la célula.

En otra realización, la presente invención caracteriza células, por ejemplo, células hospedadoras transformadas o células hospedadoras recombinantes que contienen un ácido nucleico abarcado por la presente invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la cual (o en un antecesor de la cual) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Las células procariotas y eucariotas incluyen, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, y similares, se prefieren especialmente las células de hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger o Talaromyces emersonii.

Se puede seleccionar una célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto del gen de una manera específica deseada.

Dichas modificaciones (por ejemplo, la glicosilación) y el procesamiento (por ejemplo, la escisión) de los productos de la proteína pueden facilitar el óptimo funcionamiento de la proteína .

Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento posterior a la traducción y la modificación de las proteínas y de los productos del gen Las personas expertas pueden seleccionar líneas celulares o sistemas hospedadores con las que estén familiarizados que sean adecuadas en la técnica de la biología molecular y/o la microbiología, para asegurar la modificación y el procesamiento deseados y correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, se pueden utilizar células hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular adecuada para el procesamiento del transcrito principal, la glicosilación y la fosforilación del producto del gen. Son bien conocidas en la técnica dichas células hospedadoras .

Si se desea, se puede utilizar una célula tal como se ha descrito anteriormente para la preparación de un polipéptido de acuerdo con la presente invención. Dicho procedimiento comprende normalmente cultivar una célula hospedadora (por ejemplo, transformada o transfectada con uii vector de expresión tal como se ha descrito anteriormente) en condiciones que proporcionen la expresión (por el vector) de una secuencia de codificación que codifique el polipéptido, y recuperar, opcionalmente , el polipéptido expresado. Se pueden incorporar los polinucleótidos de la presente invención a un vector replicable recorabinante, po ejemplo, un vector de expresión. Se puede utilizar el vector para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. De esta manera, en una realización adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un polinucleótido de la presente invención introduciendo un polinucleótido de la presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y haciendo crecer la célula hospedadora en condiciones que provoquen la replicación del vector. Se puede recuperar el vector a partir de la célula hospedadora.

Preferiblemente, el polipéptido se producé en forma de proteína secretada, en cuyo caso, la secuencia del nucleótido que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de la expresión se une de manera operable a una secuencia del nucleótido que codifica una secuencia señal. Preferiblemente, la secuencia señal es natural (homologa) respecto de la secuencia del nucleótido que codifica el polipéptido. Alternativamente, la secuencia señal es extraña (heteróloga) a la secuencia del nucleótido que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferiblemente endógena para la célula hospedadora en la que se expresa la secuencia del nucleótido de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de secuencias señal adecuadas para las células hospedadoras de levaduras son las secuencias señal derivadas de los genes del factor a de levadura. De forma similar, una secuencia señal adecuada para las células hospedadoras de hongos filamentosos es, por ejemplo, una secuencia señal derivada del gen de la amiloglucosidasa (AG) de hongo filamentoso, por ejemplo, el gen glaA de A. niger. Se puede utilizar este en combinación con el promotor de la amiloglucosidasa (denominado también (gluco) amilasa) por sí mismo, así como en combinación con otros promotores. Se pueden utilizar también secuencias señal híbridas en el contexto de la presente invención.

Las secuencias líderes de la secreción heterólogas preferidas son aquellas que se originan a partir del gen de la amiloglucosidasa (AG) fúngica (ambos glaA, las . versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus) , el gen del factor- (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de la a-amilasa (Bacillus) .

Los vectores se pueden transformar o transfectar en células hospedadoras adecuadas, tal como se, ha descrito anteriormente, para proporcionar la expresión de un polipéptido de la presente invención. Este procedimiento puede comprender cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión, tal como se ha descrito anteriormente, en condiciones que proporcionen la expresión por el vector de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido.

Células hospedadoras La presente invención proporciona de esta manera células hospedadoras transformadas o transfectadas con, o que comprenden un polinucleótido o vector de la presente invención. Preferiblemente, el polinucleótido se transporta en un vector para la replicación y la expresión del polinucleótido. Las células se escogerán para ser compatibles con dicho vector y pueden, por ejemplo, ser células procariotas (por ejemplo, bacterianas) fúngicas, de levaduras o vegetales .

Se puede escoger también un hospedador heterólogo en el que se produzca el polipéptido de la presente invención en una forma que esté sustancialmente exenta de otras enzimas degradadoras de la celulosa o degradadoras de la hemicelulosa. Esto se puede conseguir seleccionando un hospedador que no produzca normalmente dichas enzimas.

La presente invención abarca procedimientos para la producción del polipéptido de. la presente invención por medio de la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este fin, se puede utilizar la secuencia de ADN de la presente invención para la amplificación del gen y/o el intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias señal de la secreción, a fin de permitir la producción económica del polipéptido en una célula hospedadora homologa o heteróloga adecuada. Una célula hospedadora homologa es una célula hospedadora que es de la misma especie o que es una variante dentro de las mismas especies que la especie de la cual se deriva el ADN.

Las células hospedadoras adecuadas son preferiblemente microorganismos procariotas tales como bacterias, o más preferiblemente organismos eucariotas, por ejemplo, hongos, tales como levaduras, hongos filamentosos, o células vegetales. En general, se prefieren las células de levaduras sobre las células de hongos debido a que son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se segregan mal a partir de levaduras, o, en algunos casos, no se procesan adecuadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levaduras). En estos casos, debería seleccionarse un organismo hospedador fúngico.

La célula hospedadora puede expresar en exceso el polipéptido, y son bien conocidas las técnicas, para diseñar mediante ingeniería genética la expresión en exceso. El hospedador puede, de esta manera, tener dos o más copias del polinucleótido codificante (y, de acuerdo con esto, el vector puede tener de esta manera dos o más copias) .

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como hospedadores heterólogos debido a su capacidad para secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospedadores son las procedentes de los géneros Streptomyces y Pseudomonas . Una célula hospedadora de levadura preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido pertenece a los géneros Saccharomyces , Kluyveromyces , Hansenula, Pichia, Yarrowia, y Schizosaccharomyces .

De forma más preferible, una célula hospedadora de levadura se selecciona entre el grupo que consiste en las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (conocida también como Kluyveromyces marxianus var. lactis) , Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica y Schizosaccharomyces pombe.

Se prefieren más, sin embargo, las células hospedadoras de hongos (por ejemplo, filamentosos) . Las células hospedadoras de hongos filamentosos preferidas se seleccionan entre el grupo que consiste en los géneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Therraoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces .

De forma más preferible, una célula hospedadora de hongo filamentoso pertenece a las especies que incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans , Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, Trichoderma reesei/Hypocrea jecorina, Fusarium graminearum, Talaromyces emersonii, Penicillium decumbens, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri , Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum, Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus y Thielavia terrestris.

Las células hospedadoras de acuerdo con; la presente invención incluyen células vegetales y la presente invención abarca por tanto organismos transgénicos , tales como plantas y sus partes, que contienen una o más células de la presente invención. Las células pueden expresar de forma heteróloga el polipéptido de la presente invención o pueden contener de forma heteróloga uno o más de los polinucleótidos de la presente invención. La planta transgénica (o genéticamente modificada) puede por tanto, tener insertado en su genoma (por ejemplo, de forma estable) una secuencia que codifica uno o más de los polipéptidos de la presente invención. La transformación de las células vegetales puede llevarse a cabo utilizando técnicas conocidas, por ejemplo, utilizando un plásmido Ti o Ri procedente de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede contener de esta manera las secuencias necesarias para infectar una planta, y pueden emplearse derivados de los plásmidos Ti y/o Ri .

Alternativamente, se puede efectuar la infección directa de una parte de la planta, tal como una hoja, raíz o tallo. En esta técnica se puede hacer una herida en la planta que se va a infectar, por ejemplo, cortando la planta con una cuchilla o pinchando la planta con una aguja o frotándola con un abrasivo. A continuación se inocula la herida con el Agrobacterium. La planta o la parte de la planta se puede hacer crecer a continuación en un medio de cultivo adecuado y dejarse desarrollar hasta una planta madura. Se puede conseguir la regeneración de las células transformadas en plantas genéticamente modificadas utilizando técnicas conocidas, seleccionando, por ejemplo, retoños transformados utilizando un antibiótico y subcultivando los retoños en un medio que contenga los nutrientes, hormonas vegetales y similares adecuados.

La invención incluye también células que se han modificado para expresar el polipéptido suolenina de la presente invención o una de sus variantes . Dichas células incluyen líneas celulares de eucariotas superiores transitorias, o preferiblemente estables, tales como células de mamíferos o insectos, células de eucariotas inferiores, tales como levaduras y células de hongos (por ejemplo, filamentosos) o células procariotas tales como células bacterianas .

Es también posible que los polipéptidos de la presente invención se expresen transitoriamente en una línea celular o en una membrana tal como, por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus . Dichos sistemas, que se adaptan para expresar los polipéptidos de acuerdo con la presente invención, se incluyen también dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la presente invención puede efectuarse cultivando hospedadores de expresión microbianos, que se han transformado con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio convencional de fermentación de nutrientes.

Producción de polipéptidos/enzimas Las células hospedadoras recombinantes de acuerdo con la presente invención se pueden cultivar utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Para. cada combinación de un promotor y una célula hospedadora, están disponibles condiciones de cultivo que conducen a la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular deseada o título del polipéptido, se para el cultivo y se recupera el polipéptido utilizando los procedimientos conocidos.

El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo, glucosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa, xilano, pectina, hidrolizado de biomasa lignocelulósica, etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo, sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes inorgánicos (por ejemplo, fosfato, magnesio, potasio, cinc, hierro, etc.). Opcionalmente , se puede incluir un inductor (por ejemplo, celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano) .

La selección del medio adecuado puede estar basada en la elección del hospedador de expresión y/o basarse en los requerimientos regulatorios de la construcción de expresión. Los expertos en la técnica conocen dichos medios . El medio puede, si se desea, contener componentes adicionales que favorezcan los hospedadores de expresión transformados sobre los microorganismos potencialmente contaminantes.

Se puede llevar a cabo la producción del polipéptido por el hospedador transformado (fermentación) de acuerdo con cualquier procedimiento conocido. El tiempo de producción puede alargarse a un periodo de entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 días. Puede ser un procedimiento discontinuo, continuo o de alimentación discontinua adecuado, a una temperatura en el intervalo de 0-100° C o 0-80° C, por ejemplo, entre aproximadamente 0 a aproximadamente 60o C y/o a un pH, por ejemplo, entre aproximadamente 2 a aproximadamente 10, o entre aproximadamente 3 a aproximadamente 9. Las condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el intervalo de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 55o C y/o a un pH de entre aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Las condiciones adecuadas se seleccionan usualmente basándose en la elección del hospedador de expresión y del polipéptido que se va a expresar .

Tras la fermentación, si es necesario, se pueden eliminar las células del caldo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después que se ha detenido la fermentación o después de la eliminación de las células, se puede recuperar a continuación el polipéptido de la presente invención y, si se desea, purificarse y aislarse por medios convencionales .

Composiciones de polipéptidos/enzimas La invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la presente invención y una celulasa y/o hemicelulasa y/o una pectinasa.

Cuando el polipéptido de la presente invención es una celulasa, una composición . de la presente invención comprenderá normalmente una hemicelulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la presente invención.

Cuando el polipéptido de la presente invención es una hemicelulasa, una composición de la presente invención comprenderá normalmente una celulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la presente invención.

Cuando el polipéptido de la presente invención es una pectinasa, una composición de la presente invención comprenderá normalmente una celulasa y/o una hemicelulasa además del polipéptido de la presente invención.

Una composición de la presente invención puede comprender uno, dos o tres o más tipos de celulasa, por ejemplo una, dos o todas de una endo-1, ?-ß-glucanasa (EG) , una exo-celobiohidrolasa (CBH) y una (3- glucosidasa (BG) .

Una composición de la presente invención puede comprender un polipéptido que tiene la misma actividad enzimática, por ejemplo, el mismo tipo de actividad celulasa, hemicelulasa y/o pectinasa que la proporcionada por un polipéptido de la presente invención.

Una composición de la presente invención puede comprender un polipéptido que tiene un tipo diferente de actividad celulasa y/o actividad hemicelulasa y/o actividad pectinasa que la proporcionada por un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, una composición de la presente invención puede comprender un tipo de actividad celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionada por un polipéptido de la presente invención y un segundo tipo de actividad celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionada por una hemicelulasa/pectinasa adicional .

En el presente documento, una celulasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar la 'celulosa. Un polipéptido que es capaz de degradar la celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la celulosa en unidades pequeñas, tanto de forma parcial, por ejemplo, en celodextrinas , como completamente, en monómeros de glucosa. Una celulasa de acuerdo con la presente invención puede proporcionar el aumento de una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se pone en contacto con la celulasa. Dicha degradación tendrá lugar normalmente por medio de una reacción de hidrólisis.

En el presente documento, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar la hemicelulosa . Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar uno o más de xilano, glucuronoxilano, glucomanano y xi.loglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, tanto de forma parcial, por ejemplo, en oligosacáridos , como completamente, en monómeros de azúcar, por ejemplo, monómeros de azúcar hexosa o pentosa. Una hemicelulasa de acuerdo con la presente invención puede proporcionar un aumento de una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la hemicelulasa. Dicha degradación tendrá lugar normalmente por medio de una reacción de hidrólisis.

En el presente documento, una pectinasa es cualquier documento que es capaz de degradar una pectina. Un polipéptido que es capaz de degradar la pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la pectina en unidades más pequeñas, tanto de forma parcial, por ejemplo, en oligosacáridos, como completamente, en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la presente invención puede proporcionar un aumento en una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Dicha degradación tundra lugar normalmente por medio de una reacción de hidrólisis .

De acuerdo con esto, una composición de la presente invención puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo- ß-1 , 4 -glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß-(1,3) ( 1 , 4 ) -glucanasa .

En el presente documento, una celobiohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los enlaces 1, 4 - ß-D-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa a partir de los extremos de las cadenas. Esta enzima puede denominarse también celulasa 1, 4^-celobiosidasa, 1, 4^-celobiohidrolasa, 1, 4 - ß-D-glucano celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1 , 4 - ß-D-glucanasa, exo-glucanasa o exoglucanasa . Puede tener el código EC, EC 3.2.1.91. Las celobiohidrolasas se pueden subdividir en celobiohidrolasa I (CBH I) y celobiohidrolasa II (CBH II) . Las CBH I se definen como celobiohidrolasas que hidrolizan predominantemente la celulosa a partir de los extremos reductores, escindiendo la celobiosa. Las CBH II se definen como celobiohidrolasas que hidrolizan la celulosa a partir, predominantemente, de los extremos no reductores escindiendo la celobiosa.

En el presente documento, una endo- ß-1, 4 -glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1, 4- -D-glucosídicos en la celulosa, liquenina o los ß-D-glucanos de los cereales. Dicho polipéptido puede ser capaz también de hidrolizar los enlaces 1,4 en los ß-D-glucanos que contienen también enlaces 1,3. Esta enzima puede denominarse también celulasa, avicelasa, ß-1, 4-endoglucanohidrolasa, ß-1/ 4-glucanasa, carboximetilcelulasa, celudextrinasa, endo-1, 4 -ß-D-glucanasa, endo-1 , 4 - ß-D-glucanohidrolasa, endo-1 , 4 - ß-glucanasa o endoglucanasa . CEA es, en el presente documento, una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que, basándose en.su estructura 3D, se clasificó en la familia 5 de la glucosil hidrolasa (GH5) . Las actividades conocidas de los miembros de la familia GH5 incluyen la quitosanasa (EC 3.2.1.132); ß-manosidasa (EC 3.2.1.25),- celulasa (EC 3.2.1.4); glucano 1 , 3 - ß-glucosidasa (EC 3.2.1.58); liqueninasa (EC 3.2.1.73); glucano endo-1, 6-ß-glucosidasa (EC 3.2.1.75); mañano endo-ß-?, 4-manosidasa (EC 3.2.1.78); endo- ß-1 , 4 -xilanasa (EC 3.2.1.8); celulosa ß-1,4-celobiosidasa (EC 3.2.1.91); endo- ß-1 , 6-galactanasa (EC 3.2.1.-); ß-l, 3-mananasa (EC 3.2.1.-); endo- ß-l, 4-glucanasa específica de xiloglucano (EC 3.2.1.151); mañano transglucosilasa (EC 2.4.1.-) . CEB es, en el presente documento, una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que, basándose en su estructura 3D, se clasificó en la familia 7 de la glucosil hidrolasa (GH7) . Las actividades conocidas de los miembros de la familia GH7 incluyen la endo-ß-?, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4); [que actúa en el extremo reductor] celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-); quitosanasa (EC 3.2.1.132); endo-ß-?, 3-1, 4-glucanasa (EC 3.2.1.73).

En el presente documento, una ß-glucosidasa (en forma abreviada BG) (EC 3.2.1.21) es cualquier . polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis de los restos de ß-D-glucosa terminal, no reductores, con liberación de la ß-D-glucosa. Dicho polipéptido puede tener una amplia especificidad por los ß-D-glucósidos y puede también hidrolizar uno o más de los siguientes: una ß-D-galactosida, un a-L-arabinósido, un ß-D-xilósido o un ß-D-fucósido . Esta enzima puede denominarse también amigdalasa, ß-D-glucósido glucohidrolasa, celobiasa o gentiobiasa.

En el presente documento una ß- ( 1 , 3 ) ( 1 , 4 ) -glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los enlaces 1, 4^-D-glucosídicos en los ß-D-glucanos que contienen enlaces 1,3 y 1,4. Dicho polipéptido puede actuar sobre la liquenina y los ß-D-glucanos de cereales, pero no sobre los ß-D-glucanos que contienen solo enlaces 1,3 o 1,4. Esta enzima se puede denominar también liqueninasa, 1 , 3 - 1 , 4 - ß-D-glucano 4 -glucanohidrolasa , ß-glucanasa, endo-ß-?, 3-1, 4 glucanasa, liquenasa o enlaces ß-glucanasa mixtos. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1 , 3 (4 ) -beta-glucanasa . Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1,3 o 1,4 en beta-D-glucanos cuando el resto de glucosa cuyo grupo reductor está implicado en el propio enlace que se va a hidrolizar se sustituye en C-3. Los nombres alternativos incluyen endo-1, 3-beta-glucanasa, laminarinasa, 1 , 3 - ( 1 , 3 ; 1 , 4 ) -beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa; los sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereales.

Una composición de acuerdo con la invención puede comprender una enzima de la familia GH61 o cualquier otra enzima que tenga actividad potenciadora de la celulasa.

La celulasa potenciadora de la actividad se define en el presente documento como potenciadora de la actividad de al menos una celulasa. Cuando la proteína suolenina de la invención está presente en una mezcla con una o más celulasas, por ejemplo, en una mezcla con celobiohidrolasa (CBH) y beta-glucosidasa (BG) , esta potenciará la actividad de estas celulasas, lo que dará como resultado una mayor actividad de la mezcla para degradar la glucosa. Las enzimas en la familia GH61 se clasificaron originalmente como una familia glucósido hidrolasa basándose en la medida de la actividad muy débil de la endo-1, 4 -b-D-glucanasa en un miembro de la familia (endoglucanasa (EC 3.2.1.4)). La estructura y el modo de acción de estas enzimas son ciertamente no generales y no se pueden considerar de buena fe como glucosidasas . Sin embargo, se mantienen en la clasificación disponible en la página web CAZy sobre la base de su capacidad para potenciar la rotura de la lignocelulosa cuando se utiliza junto con una celulasa o una mezcla de celulasas . Se proporciona una visión general de los miembros de la familia GH61 conocidos en la figura 5 de Harris, PV y col, Biochemistry 2010, 49, 3305-3316.

Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una a-L-arabinofuranosidasa, una -D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, a cumaroil esterasa, una -galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidas .

En el presente documento, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1 , 4 - ß-D-xilósidicos en xilanos. Esta enzima se puede denominar también endo-1, 4-p-xilanasa o l , 4- ß-D-xilano xilanohidrolasa . Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar los enlaces 1,4 xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos .

En el presente documento, una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los 1 , 4 - ß-D-xilanos , para eliminar los sucesivos restos de D-xilosa procedentes de los términos no reductores. Dichas enzimas pueden también hidrolizar la xilobiosa. Esta enzima puede también denominarse xilano 1,4-ß-xilosidasa, 1 , 4 - ß-D-xilano xilohidrolasa, e??-1,4-ß-xilosidasa o xilobiasa.

En el presente documento, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos , a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima puede denominarse también -N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

En el presente documento, una -D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronosida + H(2)0 = una alcohol + D-glucuronato . Esta enzima puede también denominarse alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa . Estas enzimas pueden también hidrolizar el ácido glucurónico 4 -O-metilado, que puede estar también presente como un sustituyente en xilanos . La alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1, 2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa-1, 2- (4-O-metil) glucuronosilo .

En el presente documento, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos . Dicho polipéptido puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo a partir de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo o acetato de p-nitrofenilo pero, normalmente, no a partir de triacilglicerol . Dicho polipéptido no actúa normalmente sobre el mañano acetilado o la pectina.

En el presente documento, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido + H(2)0 ferulato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido . Puede catalizar normalmente la hidrólisis del grupo 4 -hidroxi-3 -metoxicinamoílo (feruloílo) a partir de un azúcar esterificado, que es usualmente la arabinosa en los sustratos 'naturales1. Acetato de p-nitrofenol y ferulato de metilo son normalmente sustratos peores. Esta enzima se puede denominar también cinamoil éster hidrolasa, ácido ferúlico esterasa o hidroxicinamoil esterasa. Se puede denominar también enzima auxiliar de la hemicelulasa, debido a que puede ayudar a las xilanasas y pectinasas es romper la hemicelulosa y la pectina de la célula vegetal.

En el presente documento, una cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de catalizar una reacción de la forma: cumaroil-sacárido + H(2)0 = cumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima puede denominarse también trans-4 -coumaroil esterasa, trans-p-cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o ácido p-cumárico esterasa. Esta enzima se encuentra también comprendida en EC 3.1.1.73 de tal manera que se puede denominar también feruloil esterasa.

En el presente documento, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos -D-galactosa terminales, no reductores en a-D-galactósidos , que incluyen oligosacáridos de galactosa, galactomananos , galactanos y arabinogalactanos . Dicho polipéptido puede ser también capaz de hidrolizar a-D-fucósidos . Esta enzima se puede denominar también melibiasa.

En el presente documento, una ß-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos ß-D-galactosa terminales no reductores. Dicho polipéptido puede ser también capaz de hidrolizar -L-arabinósidos . Esta enzima puede denominarse también exo- (l->4) - ß -D-galactanasa o lactasa.

En el presente documento, una ß-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1 , 4 - ß-D-manosídicos en mananos, galactomananos y glucomananos . Esta enzima puede denominarse también mañano endo-1, 4- -manosidasa o endo-1,4-mananasa .

En el presente documento, una ß-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos ß-D-manosa terminales, no reductores ß-D-manósidos. Esta enzima puede ser también una mananasa o manasa.

Una composición de la presente invención puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo, una endo poligalacturonasa, a pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, una pectato liasa, una alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exo-poligalacturonato liasa, a ramnogalacturonano hidrolasa, a ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturono hidrolasa o una xilogalacturonasa .

En el presente documento, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de los enlaces 1,4-a-D-galactosidurónicos en pectatos y otros galacturonanos . Esta enzima puede denominarse también poligalacturonasa pectina depoliraerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a-1,4-galacturónido glucanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli ( 1 , 4 -a-D-galacturónido) glucanohidrolasa.

En el presente documento, una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que es capaz de catalizar la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato. La enzima se ha conocido también como pectinesterasa, pectina demetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.

En el presente documento, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1, 4- -D-galactosídicos en arabinogalactanos . La enzima puede conocerse también como arabinogalactano endo-l, 4-p-galactosidasa, endo-1, 4-ß-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4 - ß-D-galactanohidrolasa .

En el presente documento, se define una pectina acetil esterasa como cualquier enzima que tiene una actividad acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de los restos GalUA de la pectina.

En el presente documento, una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminadora del éster metílico del (1?4) - -D-galacturonano para proporcionar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-0-metil-a-D-galact-4 -onuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima puede conocerse también como pectina liasa, pectina trans-eliminasa; endo-pectina liasa, polimetilgalacturónico transeliminasa, pectina metltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o ( 1?4 ) - 6 -O-metil-a-D-galacturonano liasa.

En el presente documento, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminadora de ( 1?4 ) -a-D-galacturonano para proporcionar oligosacáridos con grupos 4-desoxi- -D-galact-4-onuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima puede conocerse también como poligalacturónico transeliminasa, ácido pectínico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido pectínico liasa, liasa pectínica, ácido a-1, 4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-a-1 , 4 -poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa o (1?4) -a-D-galacturonano liasa.

En el presente documento, una alfa ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos a-L-ramnosa terminales no reductores en a-L-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano .

Esta enzima puede conocerse también como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósido ramnohidrolasa .

En el presente documento, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de la hidrólisis del ácido pectínico a partir del extreme no redactor, liberando digalacturonato . La enzima puede conocerse también como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa .

En el presente documento, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1,4-a-D-galacturónido) n + H20 = ( 1 , 4 -a-D-galacturónido) n- 1 + D-galacturonato . La enzima puede conocerse también como galacturano 1 , 4 -a-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli (galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli (1, 4-a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa .

En el presente documento, exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión eliminadora del 4- (4 -desoxi:-a-D-galact-4 -enuronosilo) -D-galacturonato a partir del extremo reductor del pectato, es decir, la pectina desesterificada . Esta enzima puede conocerse como pectato disacárido-liasa, pectato exo-liasa, ácido exopectínico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o el extremo redactor de la (l?4)-a-D-galacturonano disacárido- liasa .

En el presente documento, la ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar el enlace entre el ácido galactosilurónico y el ramnopiranosilo de una manera endo en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes, que consisten en el disacárido [ácido ( 1 , 2 -alfa-L-ramnoil- ( 1 , 4 ) -alfa-galactosilurónico] .

En el presente documento, la ramnogalacturonano liasa es cualquier polipéptido que es capaz de escindir unos enlaces a-L-Rhap- (l-*4 ) -oí-D-GalpA de una manera endo en ramnogalacturonano por beta-eliminación.

En el presente documento, la ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipéptido que cataliza " la desacetilación de restos de ramnosa y ácido; galacturónico alternantes en ramnogalacturonano.

En el presente documento, la ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar ácido galacturónico a partir del extremo no reductor de las estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes de una manera exo.

En el presente documento, xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúa sobre el xilogalacturonano escindiendo el ácido galacturónico sustituido con ß-xilosa de una manera endo. Esta enzima puede conocerse también como xilogalacturonano hidrolasa.

En el presente documento, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre los -L-arabinofuranósidos , los a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), los arabinoxilanos y los arabinogalactanos . Esta enzima puede denominarse también a-?-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

En el presente documento, endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1 , 5- -arabinofuranosídicos en 1 , 5 -arabinanos . La enzima puede conocerse también como endo-arabinasa, arabinano endo-1 , 5-oí-L-arabinosidasa, endo-l,5-cx-L-arabinanasa, endo-a- 1 , 5 -arabanasa ; endo-arabanasa o 1,5- -L-arabinano- 1 , 5 -a-L-arabinanohidrolasa .

Una composición de la presente invención comprenderá al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (ona de las cuales es un polipéptido de acuerdo con la presente invención) . Una composición de la presente invención puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una ß-glucosidas . Dicha composición puede comprender una o más hemicelulasas y/o una o más; pectinasas .

Puede estar presente una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o todas) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa o una glucuronidasa en una composición de la presente invención.

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos (peptidasas) , así como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otros restos, tales como azúcares (glucopeptidasas) . Muchas proteasas se caracterizan según EC 3.4, y son adecuadas para el uso en la presente invención y se incorporan en el presente documento por referencia. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteína proteasas que incluyen pepsina, papaína y serina proteasas que incluyen quimotripsinas , carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas .

"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos, y acilglicéridos , que incluyen fosfoglicéridos , lipoproteínas , diacilgliceroles , y similares. En las plantas, los lípidos se utilizan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o romper la estructural de los polímeros de lignina. Las enzimas que pueden romper la lignina incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en la técnica conocidas por despolimerizar o romper de otra manera los polímeros de lignina. Incluidas también están las enzimas capaces de hidrolizar los enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (de forma notable, arabinasa) y la lignina. Las ligninasas incluyen, pero no se limitan a, el siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.14), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) Incluye enzimas que son •capaces de transferir grupos glucosilo, más específicamente grupos hexoxilo. Además, para la transferencia de un grupo glucosilo a partir de un donante que contiene glucosilo a otro compuesto que contiene glucosilo, el aceptor, las enzimas pueden también transferir el grupo glucolilo al agua como un aceptor. Esta reacción es conocida también como reacción de hidrólisis, en vez de una reacción de transferencia. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que se puede utilizar en la presente invención es una ß- glucanosiltransferasa . Dicha enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1,3) (1,4) glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de la celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronósido, por ejemplo ß-glucuronósido para dar como resultado un alcohol. Se han caracterizado muchas glucuronidasas y pueden ser adecuadas para uso en la presente invención, por ejemplo ß-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirrizinato ß-glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139).

Una composición de la presente invención puede comprender una expansina o proteína de tipo expansina, tal como una suolenina (véase Salheimo y col., Eur. J. Biohem. 269 , 4202-4211, 2002) o una proteína tipo suolenina.

Las expansinas están implicadas en la pérdida de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de la célula vegetal. Se ha propuesto que las expansinas rompen el enlace hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin actividad hidrolítica. De esta forma, se cree que permiten el deslizamiento de las fibras de la celulosa y el alargamiento de la pared celular. La suolenina, una proteína de tipo expansina, contiene un dominio de la familia 1 de unión al carbohidrato del extremo N (CBD) y un dominio del extremo C de tipo expansina. Para los fines de esta invención, una proteína de tipo expansina o una proteína de tipo suolenina puede comprender uno o ambos de dichos dominios y/o puede perturbar la estructura de las paredes celulares (tales como perturbar la estructura de la celulosa, opcionalmente, sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

Una composición de la presente invención puede comprender el producto polipeptídico de una proteína que integra la celulosa, la escafoldina o una proteína de tipo escafoldina, por ejemplo, CipA o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum, respectivamente.

Las proteínas que integran las escafoldinas y la celulosa son subunidades de integración multifuncional que pueden organizar las subunidades celulolíticas en un complejo multienzima. Esto se lleva a cabo mediante la interacción de dos tipos complementarios de dominio, es decir, un dominio de cohesión sobre la escafoldina y un dominio de acoplamiento sobre cada unidad enzimática. La subunidad de acoplamiento soporta también un módulo de unión a la celulosa (CBM) que media en la unión del celulosoma a su sustrato. Una proteína de integración a la escafoldina o a la celulosa para los fines de la presente invención puede comprender uno o ambos de dichos dominios.

Una composición de la presente invención puede comprender una proteína inducida por celulosa o una proteína moduladora, por ejemplo, codificada por el gen cipl o cip2 o genes similares procedentes de Trichoderma reesei / Hypocrea jecorina (véase Foreman y col., J. Biol . Chem. 278 (34 ) , 31988-31997, 2003). El producto polipeptídico de estos genes son las proteínas bimodulares, que contienen un módulo de unión a la celulosa y un dominio cuya función o actividad no se puede relacionar con las familias de la glucosil hidrolasa conocidas. Además, la presencia de un módulo de unión a la celulosa y la regulación simultánea de la expresión de estos genes con componentes de las celulasas indica actividades anteriormente no reconocidas con un potencial papel en la degradación de la biomasa.

Una composición de la presente invención puede estar compuesta por un miembro de cada uno de los tipos de los polipéptidos mencionados anteriormente, algunos miembros de un tipo de polipéptido o cualquier combinación de estos tipos de polipéptidos .

Una combinación de la presente invención puede estar compuesta por polipéptidos, por ejemplo, enzimas, procedentes de (1) suministradores comerciales; (2) polipéptidos que expresan genes clonados, por ejemplo, enzimas,- (3) caldo complejo tal como el resultante del crecimiento de una cepa microbiana en medios, en los que las cepas secretan proteínas y enzimas en los medios; (4) lisados celulares de cepas que crecen como en (3); y/o (5) polipéptidos que se expresan en el material vegetal, por ejemplo, enzimas. Diferentes polipéptidos , por ejemplo, se pueden obtener enzimas en una composición de la presente invención a partir de diferentes fuentes .

Uso de los polipéptidos Los polipéptidos y composiciones polipeptídicas de acuerdo con la . presente invención se pueden utilizar en muchas aplicaciones diferentes. Por ejemplo, se pueden utilizar para producir azúcares fermentables . Los azúcares fermentables pueden, a continuación, como parte del proceso de los biocombustibles , convertirse en biogás o etanol, butanol, isobutanol, 2-butanol u otras sustancias adecuadas. Alternativamente, los polipéptidos y sus composiciones se pueden utilizar como enzimas, por ejemplo, en la producción de productos alimenticios, en composiciones detergentes, en la industria del papel y la industria y en 'formulaciones bacterianas, en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, dentífricos, enjuagues bucales. Algunos de los usos se ilustrarán con más detalle a continuación.

En los usos y procedimientos descritos a continuación, los componentes de las composiciones descritas anteriormente se pueden proporcionar simultáneamente (es decir, como una composición única se) o separada o secuencialmente .

La invención se refiere también al uso del polipéptido con actividad suolenina de acuerdo con la presente invención y a las composiciones que comprenden dicha enzima en procesos industriales .

A pesar de la experiencia prolongada adquirida con estos procedimientos, el polipéptido con actividad suolenina de acuerdo con la presente invención puede presentar numerosas ventajas significativas sobre las enzimas actualmente utilizadas. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos . tales como costes de producción más bajos, mayor especificidad hacia el sustrato, antigenicidad reducida, actividades secundarias menos indeseables, mayores rendimientos cuando se producen en un microorganismo adecuado, pH e intervalos de temperatura más adecuados, sin inhibición por compuestos hidrófobos, productos derivados de lignina o una inhibición inferior del producto o, en el caso de la industria alimentaria un mejor sabor o textura de un producto final así como la calidad alimentaria y los aspectos kosher.

En principio, un polipéptido o composición con actividad suolenina de la presente invención se puede usar en cualquier procedimiento que requiera el tratamiento de un material que comprende un polisacárido . De esta manera, se puede utilizar un polipéptido o composición de la presente invención en el tratamiento del material polisacárido. En el presente documento, el material polisacárido es un material que comprende o consiste de forma esencial en uno o, más típicamente, más de un polisacárido.

Normalmente, las plantas y el material derivado de las anteriores comprenden cantidades significativas de material polisacárido no de almidón. De acuerdo con esto, se puede utilizar un polipéptido de la presente invención en el tratamiento de una planta o material fúngico o material derivado de la anterior.

Lignocelulosa Un importante componente del material polisacárido vegetal sin almidón es la lignocelulosa (denominada también en el presente documento biomasa lignocelulolítica) . La lignocelulosa es un material vegetal que comprende celulosa y hemicelulosa y lignina. Los polímeros de' carbohidrato (celulosa y hemicelulosas) están estrechamente unidos a la lignina por enlaces de hidrógeno y covalentes. De acuerdo con esto, se puede usar un polipéptido de la presente invención en el tratamiento del material lignocelulolítico . En el presente documento, el material lignocelulolítico es un material que comprende o consiste de forma , esencial en lignocelulosa. De esta manera, en un procedimiento de la presente invención para el tratamiento de un polisacárido no de almidón, el polisacárido no de almidón puede ser un material/biomasa lignocelulósico .

De acuerdo con esto, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de un sustrato que comprende un polisacárido no de almidón, en el cual el tratamiento comprende la degradación y/o la hidrólisis y/o la modificación de la celulosa y/o la hemicelulosa y/o una sustancia pectínica.

La degradación en este contexto indica que el tratamiento da como resultado la generación de productos de la hidrólisis de la celulosa y/o la hemicelulosa y/o una sustancia pectínica, es decir, como resultado del tratamiento están presentes sacáridos de longitud más corta en un polisacárido no de almidón, no tratado similar. De esta manera, la degradación en este contexto puede dar como resultado la liberación de oligosacáridos y/o monómeros de azúcar.

Todas las plantas contienen polisacáridos no de almidón, tal como, virtualmente , todos los materiales polisacáridos derivados de plantas. De acuerdo con esto, en un procedimiento de la presente invención para el tratamiento del sustrato que comprende un polisacárido no de almidón, se puede proporcionar dicho sustrato en la forma de, una planta o de un material derivado de planta o de un material que ' comprende una planta o un material derivado de planta, por ejemplo, pasta vegetal, un extracto de planta, un comestible o ingrediente, por tanto, un tejido, una tela, o una prenda de vestir.

La biomasa lignocelulolítica adecuada para el uso en la invención incluye la biomasa y puede incluir biomasa virgen y biomasa no virgen tal como biomasa no agrícola, productos orgánicos comerciales, residuos de construcción y demolición, residuos sólidos urbanos, residuos del papel y residuos madereros. Las formas comunes de la biomasa incluyen árboles, arbustos y hierbas, trigo, paja de trigo, residuos de la caña de azúcar, maíz, cascaras de maíz, mazorcas de maíz, granos de maíz, incluyendo la fibra de los granos, productos y subproductos de la molienda de los granos, tales como maíz, trigo y cebada (incluyendo la molienda en húmedo y la molienda en seco) denominada a menudo "salvado o fibra" así como residuos sólidos urbanos, residuos del papel y residuos de la madera. La biomasa puede ser también, pero sin limitarse a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos, residuos del papel, y residuos de la pasta y de la molienda del papel. La "biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, maíz. y cáscaras de maíz, cultivos energéticos, bosques, frutos, flores, granos, hierbas, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, leños, raíces, arbolillos, cultivos leñosos de rotación corta, arbustos, hierbas aciculares, árboles, vegetales, cascaras de frutas, vainas, pasta de remolacha azucarera, trigo molido, cascarilla de avena, y maderas duras y blandas (no se incluyen maderas con materiales perjudiciales) . Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados a partir de procedimientos agrícolas que incluyen actividades agropecuarias y forestales, que incluyen específicamente residuos madereros forestales. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de la anteriormente mencionada individualmente o en cualquiera de sus combinaciones o mezclas. Los ejemplos adicionales de la biomasa adecuaos son los residuos hortícolas, de chaparral, residuos de molienda, residuos madereros urbanos, residuos urbanos, residuos procedentes de la explotación forestal, aclareos forestales, cultivos madereros de rotación corta, residuos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cascarilla de soja, cascarilla de arroz, paja de arroz, gluten alimentario de maíz, cascarilla de avena, caña de azúcar, rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cascarilla de maíz, hierba de praderas, maicillo, avena alta; pasta de remolacha azucarera, pulpa de frutos de cítricos, cascarillas de semillas, residuos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas, árboles, arbustos, céspedes, trigo, paja de trigo, bagazo de la caña de azúcar, almidón, cascarilla de maíz, restos de las quemas del maíz, granos del maíz, fibra de los granos, productos y subproductos de la molienda de los granos, residuos sólidos urbanos, pasta de papel, residuos madereros, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos, residuos del papel, pasta, residuos de la molienda del papel, ramas, matorrales, cañas, maíz, cascarillas de maíz, un cultivo energético, material forestal, frutos, flores, granos, hierbas, un cultivo herbáceo, hojas, cortezas, agujas, leños, raíces, arbolillos, arbustos, hierbas aciculadas, árboles, vegetales, cortezas de frutas, vainas, pasta de remolacha azucarera, trigo molido, cascarilla de avena, madera dura o blanda, material de residuos orgánicos generado a partir de procedimientos agrícolas, residuos madereros forestales, o una combinación de dos cualquiera o más de los mismos.

Además de la biomasa virgen o de las materias primas ya procesadas en los alimentos y piensos o en las industrias papeleras y de la fabricación de la pulpa, la biomasa/materia prima puede pretratarse adicionalmente de forma térmica, mecánica y/o mediante modificación química o cualquier combinación de dichos procedimientos a fin de potenciar la degradación enzimática.

Pretratamiento Antes del tratamiento enzimático, la materia prima puede pretratarse opcionalmente de forma térmica, mecánica y/o mediante modificación química o cualquier combinación de dichos procedimientos con el fin de potenciar la accesibilidad del sustrato a la hidrólisis enzimática y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o la celulosa y/o la lignina, de cualquier manera conocida en la técnica. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico al agua (caliente) , vapor (explosión de vapor) , un ácido, una. base, un solvente, calentamiento, un peróxido, ozono, trituración mecánica, desmenuzamiento, molienda o despresuración rápida, o una combinación de dos cualquiera o más de los anteriores. Un pretratamiento químico se combina a menudo con un pretratamiento térmico, por ejemplo, entre 150-220o C durante 1 a 30 minutos.

Presacarificación Tras la etapa de pretratamiento, se puede utilizar una etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación que implica la incubación con una enzima o una mezcla de enzimas. La etapa de presacarificación se puede llevar a cabo a muchas temperaturas diferentes, pero se prefiere que la etapa de presacarificación se produzca a la temperatura más adecuada para la mezcla de enzimas que se está aplicando, o el óptimo de enzima previsto de las enzimas que se van a aplicar. La temperatura de la etapa de presacarificación puede variar desde aproximadamente 10o C a aproximadamente 95o c, aproximadamente 20o C a aproximadamente 85o c, aproximadamente 30o C a aproximadamente 70o c, aproximadamente 40o C a aproximadamente 60o c, aproximadamente 37o C a aproximadamente 50o C, de forma preferible aproximadamente 37o C a aproximadamente 80o C, de forma más preferible aproximadamente 60 -70o C incluso de forma más preferible alrededor 65o C. El pH de la mezcla de presacarificación puede variar desde aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, pero es, de forma preferible de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0, de forma más preferible 4,0 a aproximadamente 6,0, incluso de forma más preferible de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0. De nuevo, se puede ajustar el pH para maximizar la actividad de la enzima y se puede ajustar con la adición de la enzima.

La reacción de la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación puede producirse desde algunos minutos a algunas horas, tales como desde aproximadamente 1 hora a aproximadamente 120 horas, de forma preferible desde aproximadamente 2 a aproximadamente 48 horas, lo más preferible desde aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas . El tratamiento con la celulasa puede producirse desde algunos minutos a algunas horas, tal como desde aproximadamente 6 horas a aproximadamente 120 horas, de forma preferible de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, de forma preferible de aproximadamente 24 a 48 horas.

Sacarificación La presente invención proporciona un procedimiento para producir un azúcar a partir de un material lignocelulósico procedimiento que comprende poner en contacto un polipéptido de la presente invención con el material lignocelulósico.

Dicho procedimiento permite generar azúcares libres (monómeros) y/u oligosacáridos que se van a generar a partir de la biomasa lignocelulósica . Estos procedimientos implican convertir la biomasa lignocelulósica en azúcares libres y oligosacáridos pequeños con un polipéptido o composición de la presente invención.

El procedimiento de convertir un carbohidrato complejo tal como lignocelulosa en azúcares permite, preferiblemente, la conversión en azúcares fermentables . Dicho procedimiento puede denominarse "sacarificación". De acuerdo con esto, Un procedimiento de la presente invención puede dar como resultado la liberación de uno o más azúcares de hexosa y/o pentosa, tal como uno o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, ma osa, ramnosa, ribosa y fructosa.

De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención incluye procedimientos que utilizan el polipéptido de la composición de la presente invención descrito anteriormente junto con enzimas adicionales o tratamientos físicos tales como temperatura y pH para convertir la biomasa vegetal lignocelulósica en azúcares y oligosacáridos .

Aunque se ha descrito la composición como una mezcla única, se reconoce que se pueden añadir secuencialmente las enzimas, donde se pueden alterar la temperatura, el pH, y otras condiciones para aumentar la actividad de cada enzima individual. De forma alternativa, se puede determinar un óptimo de pH y temperatura para la mezcla de enzimas.

Las enzimas se hacen reaccionar con el sustrato en cualquier condición adecuada. Por ejemplo, se pueden incubar las enzimas a aproximadamente 25o C, aproximadamente 30o C, aproximadamente 35o C, aproximadamente 37o C, aproximadamente 40o C, aproximadamente 45o C, aproximadamente 50o C, aproximadamente 55o C, aproximadamente 60o C, aproximadamente 65o C, aproximadamente 70o C, aproximadamente 75o C, aproximadamente 80o C, aproximadamente 85o C, aproximadamente 90o C o superior. Esto es, se pueden incubar a una temperatura de entre aproximadamente 20o C a aproximadamente 95o C, por ejemplo, en tampones de baja a media fuerza iónica y/o de pH bajo a neutro. Por "fuerza iónica del medio" se pretende que el tampón tenga una concentración iónica de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menos para cualquier componente iónico individual. El pH puede variar desde aproximadamente pH 2,5, aproximadamente pH 3,0, aproximadamente pH 3,5, aproximadamente pH 4,0, aproximadamente pH 4,5, aproximadamente pH 5, aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 6 , aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, a aproximadamente pH 8,5. Generalmente, el intervalo de pH estará entre aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente pH 7. Para la producción de etanol, se prefiere un medio ácido, por ejemplo pH=4, mientras que para la producción de biogás, se prefiere un pH neutro, por ejemplo, es deseable un pH=7. La incubación de combinaciones de enzimas en estas condiciones da como resultado la emisión o liberación de cantidades sustanciales del azúcar procedentes de la lignocelulosa . Por cantidad sustancial se pretende al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más del azúcar disponible.

Los polipéptidos , tales como las enzimas, se pueden producir tanto de forma exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, a continuación aislarse y añadirse, por ejemplo, a la materia prima lignocelulósica . Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aislan, y se pueden añadir al caldo de fermentación de la masa celular bruta, o a la material vegetal (tal como el rastrojo del maíz) , y similares, para, por ejemplo, la materia prima. Alternativamente, la masa celular bruta o el medio de producción de la enzima o el material vegetal se pueden tratar para evitar el crecimiento microbiano (por ejemplo, mediante el calentamiento o la adición de agentes antimicrobianos) , añadiéndose a continuación a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas de enzimas brutas pueden incluir el organismo productor de la enzima. Alternativamente, se puede producir la , enzima en una fermentación que utilice materia prima (tal como el rastrojo del maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una(s) enzima (s) . De esta manera, las plantas que producen las enzimas pueden por sí mismas servir como materia prima lignocelulósica y añadirse en la materia prima lignocelulósica .

Fermentación de azúcares Los azúcares fermentables se pueden convertir en productos de fermentación útiles con valor añadido, los ejemplos no limitantes de los cuales incluyen aminoácidos, vitaminas, compuestos farmacéuticos, suplementos de piensos animales, especialmente suplementos químicos, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, que incluye el etanol combustible. En particular, se pueden utilizar los azúcares como materias primas para la fermentación en compuestos químicas, plásticos, tales como, por ejemplo, ácido succínico y (bio) combustibles, que incluyen combustibles líquidos sintéticos de etanol, metanol, butanol y biogás .

Por ejemplo, en el procedimiento de la presente invención, una enzima o combinación de enzimas actúa sobre un sustrato lignocelulósico o biomasa vegetal, que sirve como materia prima, de tal manera que convierte este sustrato complejo en azúcares y oligosacáridos sencillos para la producción de etanol u otros productos de fermentación útiles .

Los azúcares liberados a partir de la biomasa se pueden convertir en productos de fermentación útiles tales como uno de aquellos que incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas, compuestos farmacéuticos, suplementos de piensos animales, especialmente suplementos químicos, materias primas químicas, plásticos, y etanol, que incluye el etanol combustible .

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de un producto de fermentación, dicho procedimiento comprende: a. degradar la lignocelulosa utilizando un procedimiento tal como se describe en el presente documento; y b. fermentación del material resultante, para preparar por tanto un producto de fermentación.

La fermentación puede llevarse a cabo en condiciones aerobias o anaerobias. Preferiblemente, el procedimiento se lleva a cabo en condiciones microaerófilas o limitantes del oxígeno.

En el presente documento, se define un procedimiento de fermentación anaerobia como un procedimiento de fermentación que se desarrolla en ausencia de oxígeno o en el que no se consume sustancialmente oxígeno, de forma preferible aproximadamente 5 o menos , aproximadamente 2,5 o menos o aproximadamente 1 mmol/l/h o menos, y en el que las moléculas orgánicas sirven como donantes de electrones y aceptores de electrones .

Un procedimiento de fermentación en condiciones limitantes del oxígeno es un procedimiento en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno desde el gas al líquido. El grado de limitación del oxígeno se determina por la cantidad y composición del caudal de gas que entra así como por las propiedades de mezcla/transferencia de masa reales del equipo de fermentación utilizado. Preferiblemente, en un procedimiento en condiciones limitantes del oxígeno, la tasa de consumo de oxígeno es al menos de aproximadamente 5,5, de forma más preferible al menos de aproximadamente 6 e incluso de forma más preferible al menos de aproximadamente 7 mmol/L/h.

Un procedimiento para la preparación de un producto de fermentación puede opcionalmente comprender la recuperación del producto de fermentación.

SSF La fermentación y la sacarificación se pueden ejecutar también en un modo simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF) . Una de las ventajas de este modo es la reducción de la inhibición del azúcar en la hidrólisis enzimática (se describe la inhibición del azúcar sobre celulasas en Caminal B&B Vol XXVII Pp 1282-1290) .

, Productos de la fermentación Los productos de la fermentación que se pueden producir de acuerdo con la presente invención incluyen1 aminoácidos, vitaminas, compuestos farmacéuticos, suplementos de piensos animales, especialmente suplementos químicos, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, que incluye etanol combustible (entendiéndose que el término "etanol" incluye alcohol etílico o las mezclas de alcohol etílico y agua) .

Los productos específicos con valor añadido que se pueden producir mediante los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, biocombustibles (que incluyen etanol y butanol y biogás) ; ácido láctico; un plástico, especialmente uno químico; un ácido orgánico, que incluye ácido cítrico, ácido succínico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético; 1 , 3 -propanodiol ; etileno, glicerol; un solvente, un suplemento de piensos animales, un compuesto farmacéutico, tal como un antibiótico con ß-lactama o una cefalosporina; vitaminas; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina, y ácido aspártico; una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, unas oxidorreductasas , una transferasa o una xilanasa; y una materia prima química.

Biogás La presente invención proporciona también el uso de un polipéptido o composición tal como se describe en el presente documento en un procedimiento para la preparación de biogás . El biogás se refiere normalmente a un gas producido mediante la rotura biológica de la materia orgánica, por ejemplo, material que contiene carbohidratos sin almidón, en ausencia de oxígeno. El biogás se origina a partir del material biogénico y es un tipo de biocombustible . Se produce un tipo de biogás mediante la digestión o fermentación anaerobia de materiales biodegradables tales como biomasa, estiércol o aguas residuales, residuos urbanos, y cultivos energéticos. Este tipo de biogás está comprendido principalmente por metano y dióxido de carbono. El gas metano puede someterse a combustión u oxidarse con oxígeno. El aire contiene un 21% de oxígeno. La liberación de esta energía permite el utilizar el biogás como combustible. Se puede utilizar el biogás como un combustible de bajo coste en cualquier país para cualquier fin de calentamiento, tal como cocinar. Se puede utilizar también en las modernas instalaciones de gestión de residuos en las que se puede utilizar para hacer funcionar cualquier tipo de motor térmico, para generar energía tanto mecánica como química.

La primera etapa en la producción de biogás microbiano consiste en la degradación enzimática de ' polímeros y sustratos complejos (por ejemplo, carbohidratos sin almidón) .

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de un biogás en el que el sustrato que comprende el carbohidrato sin almidón se pone en contacto con un polipéptido o composición de la presente invención para dar, por tanto, como resultado, un material fermentable que se puede convertir en un biogás por un organismo, tal como un microorganismo. En dicho procedimiento, se puede proporcionar un polipéptido de la presente invención por medio de un organismo, por ejemplo, un microorganismo que exprese dicho polipéptido.

Uso de enzimas en los productos alimenticios Se pueden utilizar los polipéptidos y las composiciones de la presente invención en un procedimiento de procesamiento del material vegetal para degradar o modificar la celulosa o la hemicelulosa, o los constituyentes de las sustancias pectínicas de las paredes celulares de la planta o del material fúngico. Dichos procedimientos pueden ser útiles en la preparación de un producto alimenticio. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un producto alimenticio procedimiento que comprende incorporar un polipéptido o composición de la presente invención durante la preparación del producto alimenticio.

La presente invención proporciona también un procedimiento de procesamiento de un material vegetal procedimiento que comprende poner en contacto el material vegetal para degradar o modificar la celulosa en el material (la planta) . Preferiblemente, el material vegetal es una pasta vegetal o un extracto vegetal, tal como jugos.

La planta y los materiales que contienen la celulosa/hemicelulosa y sustancias pectínicas incluyen la pasta vegetal, partes de la planta y extractos vegetales. En el contexto de la presente invención, un extracto procedente de un material vegetal es cualquier sustancia que se puede derivar del material vegetal mediante extracción (mecánica y/o química) , procesamiento, o mediante otras técnicas de separación. El extracto puede ser un jugo, néctar, base, o concentrados preparados a partir de los anteriores. El material vegetal puede comprender o derivarse de vegetales, por ejemplo, zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soya, soja, guisantes) o frutos, por ejemplo, pomos o frutas con semillas (manzanas, peras, membrillo, etc.), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina), melones, ciruelas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas, frambuesas, fresas, arándanos, piña y otras frutas tropicales, árboles y sus partes (por ejemplo, polen, de coniferas), o cereales (avenas, cebada, trigo, maíz, arroz) . El material (que se va a hidrolizar) puede ser también de residuos agrícolas, tales como pasta de remolacha azucarera, mazorcas de maíz, paja de trigo, cascaras de nuez (del suelo), o materiales reciclables, por ejemplo, papel. (residuos) .

Los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar de esta manera para tratar el material vegetal incluyendo la pasta vegetal y los extractos vegetales . Se pueden utilizar también para tratar comestibles líquidos o sólidos o ingredientes de alimentos comestibles, o se pueden utilizar en la extracción de aceites vegetales, almidón o como espesantes alimentarios.

Normalmente, los polipéptidos de la presente invención se utilizan como una composición preparación de enzimas tal como se ha descrito anteriormente. La composición se añadirá generalmente a la pasta vegetal que se puede obtener mediante, por ejemplo, procesamiento mecánico tal como material vegetal triturado o molido. La incubación de la composición con la planta se llevará a cabo normalmente durante un tiempo de entre 10 minutos a 5 horas, tal como 30 minutos a 2 horas, de forma preferible durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es de forma preferible de aproximadamente 10o C a aproximadamente ejemplo. De aproximadamente 15 aproximadamente 25o C, de forma óptima aproximadamente 20o C y se puede usar entre aproximadamente 10 g a aproximadamente 300 g, de forma preferible de aproximadamente 30 g a aproximadamente 70 g, de forma óptima aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material que se va a tratar.

Todas las enzima(s) o sus composiciones utilizadas se pueden añadir secuencialmente o al mismo tiempo que la pasta vegetal. Dependiendo de la composición de la preparación de la enzima, el material puede, en primer lugar, macerarse (por ejemplo, hasta un material puro) o licuarse. Utilizando los polipéptidos de la presente invención, se pueden mejorar los parámetros de procesamiento, tales como el rendimiento de la extracción, la viscosidad del extracto y/o la calidad del extracto.

Alternativamente, o además de lo anterior, se puede añadir un polipéptido de la presente invención al jugo bruto obtenido procedente de la presión o la licuefacción de la pasta vegetal. El tratamiento del jugo bruto se llevará a cabo de una manera similar a la de la pasta vegetal con respecto a la dosificación, temperatura y tiempo de espera. De nuevo, se pueden incluir otras enzimas tales como las descritas anteriormente. Las condiciones de incubación típicas son tal como se describe en el párrafo anterior.

Una vez que el jugo bruto se ha incubado con los polipéptidos de la presente invención, el jugo se centrifuga, a continuación, o se (ultra) filtra para producir el producto final .

Tras el tratamiento con el polipéptido de la presente invención, el producto (final) se puede tratar mediante calentamiento, por ejemplo, a aproximadamente 100o C durante un tiempo de entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, en condiciones que inactivan parcial o completamente el (los) polipéptido (s) de la presente invención.

Se puede utilizar también una composición que contiene un polipéptido de la presente invención durante la preparación de purés de frutas o vegetales.

Durante el horneado se puede mejorar la estructura de la masa del polipéptido, modificar su adherencia o la flexibilidad, mejorar el volumen del pan de molde y/o la estructura de la miga o impartir mejores características de textura tales como las de la calidad del pan o del desmenuzamiento o de la miga.

La presente invención se refiere de esta manera a los procedimientos para preparar una masa o un producto alimenticio basado en cereales que comprende incorporar en la masa un polipéptido o composición de la presente invención. Esto puede mejorar una o más propiedades de la masa o del producto alimenticio basado en cereales obtenido a partir de la masa con respecto a una masa o producto alimenticio basado en cereales en el que no se incorpora el polipéptido.

La preparación del producto alimenticio basado en cereales de acuerdo con la presente invención puede comprender además las etapas conocidas en la técnica tales como hervido, secado, fritura, cocción a vapor u horneado de la masa obtenida.

Los productos que se preparan a partir de una masa que se ha hecho hervir son, por ejemplo, tallarines hervidos, albóndigas, los productos que se preparar a partir de una masa frita son, por ejemplo rosquillas, churros, tallarines fritos, los productos que se preparan a partir de una masa vaporizada son, por ejemplo, bollos de pan al vapor y tallarines al vapor, los ejemplos de productos preparados a partir de masa seca son pasta * y tallarines secos y los ejemplos de productos preparados a partir de masa horneada son pan, galletas, bizcocho.

El término "propiedad mejorada" se define en el presente documento como cualquier propiedad de la masa y/o el producto obtenido de la masa, particularmente un producto alimenticio basado en cereales, que está mejorada por la acción del polipéptido de acuerdo con la presente invención con respecto a la masa o al producto en el que no se incorpora el polipéptido de acuerdo con la invención. La propiedad mejorada puede incluir, pero no limitarse a, un aumento de la resistencia de la masa, un aumento de la elasticidad de la masa, un aumento de la estabilidad de la masa, un aumento de la maquinabilidad de la masa, una mejora de la resistencia a la prueba de la masa, una reducción de la adherencia de la masa, una mejora de la extensibilidad de la masa, un aumento del volumen del producto alimenticio basado en cereales, una mejora de la miga del producto horneado, una mejora de la suavidad del producto alimenticio basado en cereales, una mejora del sabor del producto alimenticio basado en cereales, una mejora para no echar a perder el producto alimenticio basado en cereales. Mejoras de las propiedades del tipo de pasta y los tallarines de los productos basados en cereales son por ejemplo una mejora de la firmeza, una reducción de la adherencia, una mejora de la cohesividad y una reducción de la pérdida por cocción.

Se puede determinar la mejora de la propiedad mediante la comparación de una masa y/o del producto alimenticio basado en cereales preparado con y sin adición de un polipéptido de la presente invención. Se pueden evaluar las cualidades organolépticas utilizando los procedimientos bien establecidos en la industria del horneado, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un panel de probadores formados sobre el gusto . [ El término "masa" se define en el presente documento como una mezcla de harina de cereales y otros ingredientes con la suficiente firmeza para amasarse o extenderse con el rodillo. Ejemplos de cereales son el trigo, centeno, maíz, maíz silvestre, cebada, arroz, sémolas, alforfón y avena. El trigo es aquí, y a partir de aquí se pretende que abarque, todas las especies conocidas del género Triticum, por ejemplo, aestivum, durum y/o spelta. Los ejemplos de los otros ingredientes adecuados son: el polipéptido con actividad suolenina de acuerdo con la presente invención, enzimas adicionales, aditivos químicos y/o adyuvantes del procesamiento. La masa puede ser fresca, congelada, preparada, o prehorneada. Se conoce bien en la técnica la preparación de una masa a partir de los ingredientes descritos anteriormente y comprende la mezcla de dichos ingredientes y el procesamiento de los adyuvantes y una o más etapas de moldeo y, opcionalmente , fermentación. Kulp y Lorenz , en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters, describen la preparación de la masa congelada.

El término "producto alimenticio basado en cereales" se define en el presente documento como cualquier producto preparado a partir de una masa, de un carácter tanto blando como crujiente. Los ejemplos de productos alimenticios basados en cereales, de tipo tanto blanco, claro u oscuro, que se pueden producir ventajosamente mediante la presente invención son, pan (en particular blanco, de harina integral o pan de centeno) , normalmente en la forma de hogazas o panecillos, pan de tipo baguette francesa, pasta, tallarines, rosquillas, panecillos en forma de rosquillas, bizcochos, pan de pita, tortillas, tacos, bizcochos, tortitas, magdalenas, galletas, masas de tarta, pan al vapor, y pan tostado, y similares .

El término "producto horneado" se define en el presente documento como cualquier producto alimenticio basado en cereales preparado mediante horneado de la masa.

Los polisacáridos no de almidón (NSP) pueden aumentar la viscosidad del bolo alimenticio, que puede, a la vez, disminuir la disponibilidad de nutrientes y el comportamiento en el animal. El uso del polipéptido con actividad suolenina de la presente invención puede mejorar la utilización del fósforo así como de los minerales catiónicos y del polipéptido durante la digestión del bolo alimenticio.

La adición de nutrientes específicos al pienso mejora la digestión del animal y reduce por tanto los costes de la alimentación con pienso. Actualmente se está utilizando un lote de aditivos para pienso y se están desarrollando de forma continua nuevos conceptos . El uso de enzimas específicas del tipo de las enzimas que degradan los carbohidratos sin almidón podría romper la fibra liberando energía así como aumentar la digestibilidad de la proteína debido a una mejor accesibilidad de la proteína cuando la fibra se rompe. De esta manera, el coste del pienso podría disminuir, así como, se podrían reducir también los niveles de proteínas en el pienso.

Los polisacáridos no de almidón (NSP) están también presentes en, virtualmente, todos los ingredientes del pienso de origen vegetal. Los NSP se han utilizado mal y pueden, cuando se solubilizan, ejercer efectos adversos sobre la digestión. Las enzimas exógenas pueden contribuir a una mejor utilización de estos NSP y, como consecuencia reducir los efectos antinutritivos. Las enzimas que degradan los carbohidratos sin almidón de la presente invención se pueden utilizar a este fin en las dietas basadas en cereales para las aves y, en una menor extensión para los credos y otras especies.

Un polipéptido/enzima que degrada los carbohidratos sin almidón de la presente invención (de una composición que comprende el polipéptido/enzima de la presente invención) se puede utilizar en la industria de los detergentes, por ejemplo, para eliminar de la ropa sucia las manchas basadas en carbohidratos. Una composición detergente puede comprender un polipéptido/enzima de la presente invención y, además, una o más de una celulasa, una hemicelulasa, una pectinasa una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa o una carbohidrasa .

Uso de enzimas en composiciones detergentes Una composición detergente que comprende un polipéptido o composición de la presente invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una pasta, un gel, un polvo o un líquido. Un detergente liquido puede ser acuoso, conteniendo normalmente hasta aproximadamente un 70% de agua y entre aproximadamente 0 y aproximadamente 30% de solvente orgánico o material no acuoso.

Dicha composición detergente puede, por ejemplo, formularse como una composición detergente para lavado manual o para lavadora que incluye una composición aditiva para el lavado adecuada para el pretratamiento de los tejidos manchados y una composición suavizante del tejido que se añade en el enjuagado, o que se formula como una composición detergente para uso en las operaciones de limpieza de las superficies duras domésticas básicas o en las operaciones de limpieza de un lavavaj illas .

En general, las propiedades de la enzima deben ser compatibles con el detergente seleccionado (por ejemplo, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y la(s) enzima (s) deben estar presentes en una cantidad eficaz.

Una composición detergente puede comprender un tensioactivo, por ejemplo, un tensioactivo aniónico o no iónico, un potenciador del detergente o un agente complejante, uno o más polímeros, un sistema blanqueador (por ejemplo, una fuente de H202) o un estabilizante de la enzima. Una composición detergente puede comprender también cualquier otro ingrediente convencional del detergente tal como, por ejemplo, un acondicionador que incluya una arcilla, un reforzador de la espuma, un supresor de la espuma, un agente anticorrosión, un agente suspensor de la suciedad, un agente antirredeposición de la suciedad, un colorante, un bactericida, un abrillantador óptico, un hidrotropo, un inhibidor del deslustrado o un perfume.

Uso de enzimas en el procesamiento del papel y de la pasta de papel Se puede utilizar un polipéptido o composición de la presente invención en la industria del papel y de la pasta de papel, entre otros, en el procedimiento de blanqueamiento para potenciar el brillo de las pastas blanqueadas mientras que se puede reducir la cantidad de cloro utilizada en las etapas del blanqueado, y para aumentar el índice de liberación de las pastas en el procedimiento del papel reciclado (Eriksson, K. E. L . , Wood Science and Technology 24 (1990): 79-101; Paice, y col., Biotechnol . and Bioeng. 32 (1988): 235-239 y Pommier y col., Tappi Journal (1989): 187-191) . Además, se puede utilizar un polipéptido o composición de la presente invención para el tratamiento de la pasta lignocelulósica de tal manera que mejore su blanqueabilidad. Por tanto, se puede reducir la cantidad de cloro necesaria para obtener un blanqueamiento satisfactorio de la pasta.

Se puede utilizar un polipéptido o composición de la invención en un procedimiento para reducir el índice al cual los tejidos que contienen celulosa se vuelven ásperos o de reducir la aspereza de los tejidos que contienen celulosa, comprendiendo el procedimiento tratar los tejidos que contienen la celulosa con un polipéptido o composición tal como se ha descrito anteriormente. La presente invención se refiere además a un procedimiento que proporciona la clarificación del color de los tejidos coloreados que contienen celulosa con un polipéptido o composición tal como se ha descrito anteriormente, y un procedimiento para proporcionar una variación localizada en los tejidos de color o coloreados que contienen celulosa coloreada, comprendiendo el procedimiento tratar los tejidos coloreados que contienen celulosa con un polipéptido o composición tal como se ha descrito anteriormente. Se pueden llevar a cabo los procedimientos de la presente invención tratando los tejidos que contienen celulosa durante el lavado. Sin embargo, si se desea, se puede llevar a cabo el tratamiento de los tejidos durante el remojado o el enjuagado o simplemente mediante la adición del polipéptido o composición tal como se ha descrito anteriormente al agua en el que se sumergen o sumergirán los te idos .

Otros usos de las enzimas Además, se puede utilizar un polipéptido o composición de la presente invención en una formulación antibacteriana así como en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, dentífricos, y enjuagues bucales.

Los siguientes Ejemplos ilustran la presente invención: EJEMPLOS Materiales y Procedimientos Procedimientos de ADN Se llevaron a cabo procedimientos de ADN normalizados tal como se describe en otro sitio (Sambrook y col., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2a Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) a no ser que se indique otra cosa. Se amplificó el ADN utilizando la enzima correctora polimerasa Physion (Finnzymes) . Las enzimas de restricción fueron de Invitrogen o New England Biolabs .

Preparación de las muestras de celulasa Celulasas originadas a partir de Talaromyces emersonii se expresaron en Aspergillus niger. Se produjeron filtrados concentrados de las enzimas tal como se describe en el documento WO2004/030468. Tras hacer crecer Aspergillus niger adecuados, se prepararon los sobrenadantes libres de células que contenían los plásmidos de expresión mediante centrifugación del caldo de fermentación a 5000 x g durante 30 minutos a 4°C. Opcionalmente , se puede ajustar el sobrenadante a pH=5 con KOH 4 N y filtrarse de forma estéril sobre un filtro de 2 pm (acoplable a frascos) con succión, para eliminar cualquier material fúngico. Además se pueden filtrar los sobrenadantes sobre un filtro GF/A de microfibra de vidrio de Whatmann (150mm 25) para eliminar cualquier sólido. Los sobrenadantes se ultrafiltraron, concentraron, y almacenaron hasta el uso a 4°C o se congelaron a -20°C.

Procedimiento para la determinación de la proteína total El procedimiento era una combinación de la precipitación de proteínas que utilizaba el ácido tricloroacético (TCA) para eliminar las sustancias, perturbadoras y permitir la determinación de la concentración de proteínas con la reacción colorimétrica del Biuret. En la reacción del Biuret, un ion de cobre (II) se reduce a cobre (I) , que forma un complejo con los nitrógenos y carbonos de · los enlaces peptídicos en una solución alcalina. Un color violeta indica la presencia de proteínas. La intensidad del color, y por tanto, la absorción a 546 nm, es directamente proporcional a la concentración de proteínas, de acuerdo con la ley de Beer-Lambert. Se llevó a cabo la normalización utilizando BSA (albúmina de suero bovino) y el contenido de proteínas se expresó en g de proteína como equivalentes/1 de BSA o en mg de proteína como equivalente/ml de BSA. Se calculó el contenido de proteínas utilizando los protocolos normalizados de cálculo conocidos en la técnica, representado gráficamente la D0546 frente a la concentración de las muestras con la concentración conocida, seguido por el cálculo de la concentración de las. muestras desconocidas utilizando la ecuación generada a partir de la línea de calibración.

Preparación del sustrato de paja de trigo pretratado lavado Se puede obtener paja de trigo pretratada con ácido diluido tal como se describe en Linde, M. y col, Biomass and Bioenergy 32 (2008), 326-332 y se puede utilizar el equipo que se describe en Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol . 105-108, pp 69-85. La paja de trigo pretratada se lavó con agua hasta que la solución con paja de trigo tuvo pH 6.0 o superior. El agua del lavado se eliminó mediante filtración.

Hidrólisis de la celulosa Se llevaron a cabo incubaciones de las combinaciones de enzimas sobre la solución sustrato de materia seca (dm) de paja de trigo pretratada con un lavado de ácido al 2% (PWS) en tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 4,5, a una escala de 10 mi. Se añadieron las combinaciones de enzimas a una dosis de proteína fija por gramo de sustrato de materia seca. Se tomaron muestras a lo largo del tiempo, hasta las 24 horas de incubación a 65°C. Se finalizaron las reacciones en el tiempo dado, centrifugando el residuo, pipeteando del sobrenadante y congelando las muestras hasta el análisis.

Se llevó a cabo el análisis de la cantidad de glucosa liberada utilizando la medición de flujo por RMN. Se registraron los espectros de RMN 1H en un sistema de RMN AVANCE II BEST de Bruker que funcionaba a una frecuencia de resonancia del protón de 500MHz y 27° C de temperatura de la sonda .

Ejemplo 1 1.1. Construcción de los plásmidos de expresión La secuencia que tenía la SEQ ID NO: 1 se clonó en el vector pGBTOP (Fig. 1) utilizando los sitios EcoRI y SnaBI, que comprenden el promotor de la glucoamilasa y la secuencia de terminación. Se eliminó la parte de E.coli mediante la digestión de Notl antes de la transformación de A. niger CBS 513.88. 1.2. Transformación de A. niger A. niger WT-1: Esta cepa de A. niger es CBS513.88 que comprende las deleciones de los genes que codifican la glucoamilasa (glaA) , la amilasa fúngica y la amilasa ácida. Se construyó A. niger WT 1 utilizando el enfoque "EXENTO DE GEN MARCADOR" tal como se describe en el documento EP 0 635 574 Bl.

Las construcciones de expresión se transformaron simultáneamente con la cepa A. niger WT-1 de acuerdo con el procedimiento descrito por Tilburn, J. y col. (1983) Gene 26, 205-221 y Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 con las siguientes modificaciones: Se hicieron germinar las esporas y se cultivaron durante 16 horas a 30 grados Celsius en un matraz con agitación colocado en un agitador rotatorio a 300 rpm en medio mínimo de Aspergillus (100ml) . El medio mínimo de Aspergillus contiene por litro: 6 g de NaN03 , 0,52 g de KC1, 1,52 g de KH2P04, 1,12 mi de KOH 4 M, 0,52 g de MgS04.7H20, 10 g de glucosa, 1 g de casaminoácidos , 22 mg de ZnS04.7H20, 11 mg de H3B03, 5 mg de FeS04.7H20, 1,7 mg de CoC12.6H20, 1,6 mg de CuS04.5H20, 5 mg de MnC12.2H20, 1,5 mg de Na2Mo04.2H20, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de clorhidrato de tiamina, 2 mg de nicotinamid , 1 mg de clorhidrato de piridoxina, 0,2 rag de ácido pantoténico, 4 g de biotina, 10 mi de penicilina (5000 IU/ml) solución de estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco) .

Se utilizó Novozym 234TM (Novo Industries) en vez de helicasa para la preparación de los protoplastos; - Tras la formación de los protoplastos (60-90 minutos), se añadió tampón KC (KC1 0,8 M, ácido cítrico 9,5 mM, pH 6,2) hasta un volumen final de 45 mi, la suspensión de protoplastos se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor flotante. Los protoplastos se volvieron a suspender en 20 mi de tampón KC y posteriormente se añadieron 25 mi de tampón STC (sorbitol 1,2 , Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaC12 50 mM) . La suspensión de protoplastos se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor flotante, se lavó en tampón STC y se volvió a suspender en tampón STC a una concentración de 10E8 protoplastos/ml ; - Para 200 microlitros de la suspensión de protoplastos., se disolvió el fragmento de ADN en 10 microlitros de tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM) y se añadieron 100 microlitros de solución PEG (PEG 4000 al 20% (Merck), sorbital 0,8 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaC12 50 mM ) ; - Tras la incubación del ADN-suspensión de protoplastos durante 10 minutos a temperatura ambiente, se añadieron lentamente 1,5 mi de solución PEG (PEG 4000 al 60% (Merck), Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM) , con mezcla repetida de los tubos. Tras incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, se diluyeron las suspensiones con 5 mi de sorbitol 1,2 M, se mezclaron mediante inversión y se centrifugaron durante 10 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. Los protoplastos se volvieron a suspender suavemente en 1 mi de sorbitol 1,2 M y se plaquearon en medio sólido de regeneración selectiva consistente en cualquier medio mínimo de Aspergillus sin riboflavina, clorhidrato de tiamina, nicotinamida, piridoxina, ácido pantoténico, biotina, casaminoácidos y glucosa. En el caso de la selección de acetamida, el medio contiene acetamida 10 mM como una única fuente de nitrógeno y sacarosa 1 M como fuente de C y del agente osmótico. Alternativamente, se plaquearon los protoplastos sobre PDA (Agar de Patata Dextrosa, Oxoid) suplementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina y sacarosa 1 M como agente osmótico. Para la regeneración, se solidificaron las placas utilizando agar al 2% (agar N° 1, Oxoid Lll) . Tras la incubación durante 6-10 días a 30 grados Celsius, se transfirieron conidioesporas de los transformantes a las placas consistentes en medio selectivo de Aspergillus (medio mínimo que contiene acetamida como única fuente de nitrógeno en el caso de la selección de la acetamida o PDA suplementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina en el caso de la selección de la fleomicina) con glucosa al 2% y agarosa al 1,5% (Invitrogen) y se incubaron durante 5-10 días a 30 grados Celsius. Se aislaron los transformantes individuales y se repitió esta etapa de purificación selectiva una vez, tras lo cual se almacenaron los transformantes purificados.

Después de la transformación, se seleccionaron los transformantes en medios que comprendían acetamida como única fuente de nitrógeno y se purificaron las colonias. Se estimaron los números de copias mediante la PCR cuantitativa y se seleccionaron los transformantes con alto y bajo número de copias. Los transformantes con alto número de copias se cultivaron en matraces con agitación en 100 mi de medio CSM-MES tal como se describe en el documento EP 635 574 a 34° C a 170 rpm en un incubador agitador utilizando un matraz con agitación con deflectores de 500 mi. Tras 3 ' y 4 días de fermentación, se cosecharon muestras de los sobrenadantes para determinar la expresión mediante SDS-PAGE. 1.3 Contenido de proteínas Se analizaron los sobrenadantes ultrafiltrados y concentrados de las fermentaciones de los matraces con agitación de los transformantes que expresaban actividad de tipo suolenina (TEMER08806) para el contenido de proteína. Se determinó que el contenido de proteína era de 7 mg de proteínas como equivalente /mi de BSA.

Ejemplo 2 2.1 Preparación de muestras de celulasa Se prepararon una proteína potenciadora de la celulasa, TEMER07589 (Tal como se describe en la solicitud de patente de titularidad compartida DSM Caso 27666, presentada el mismo día que esta solicitud) y dos exoglucanasas , que eran CBHI tal como se describe en la solicitud de patente EP09158739.4 y CBHII (tal como se describe en la solicitud de patente de titularidad compartida DSM Caso 27829, presentada el mismo día que esta solicitud) , y una beta-glucosidasa conocida a partir de Murray y col., Protein expression and Purification, 2004, 38, 248-257, procedentes todas de Talaromyces emersonii , tal como se describe en el Ejemplo 1 para TEMER08806. Se determinaron los contenidos de proteínas de estas muestras y variaron de 20 a 60 mg de proteínas como equivalente /mi de BSA. 2.2 Hidrólisis de la celulasa de la mezcla de celulasas con suplemento de suolenina Las 4 proteínas celulolíticas , que eran la beta-glucosidasa (BG) , CBHI, CBHII y la proteína potenciadora de la celulasa TEMER07589, se mezclaron a las cantidades relativas del 9% de BG, 37% de TEMER07589, 30% de CBHI y 24% de CBHII, de la proteína total en la mezcla. Esta mezcla se aplicó en hidrólisis extendida a una escala de 10 mi con paja de trigo pretratada procedente de DM al 2%, a un pH de 4,5 y 65° C, a una dosis de proteína de 2,5 o 5 mg de proteína de paja de trigo pretratada procedente de materia seca como equivalente por gramo de BSA. Se aplicó también la mezcla a estas mismas dosis de proteína en incubaciones separadas en las que se añadieron 2 mg de proteína TEMER08806 de paja de trigo pretratada procedente de materia seca como equivalente por gramo de BSA. Como comparación, se incubó también Filtrasa NL, un clásico producto de la celulasa de Talaromyces e ersonii a la misma concentración, pH y temperatura del sustrato, también a una dosis de proteína de 2,5 o 5 mg de proteína de paja de trigo pretratada procedente de materia seca como equivalente por gramo de BSA, con y sin la adición de 2 mg de proteína TEMER08806 de paja de trigo pretratada procedente de materia seca como equivalente por gramo de BSA. Las incubaciones duraron 24 horas y se tomaron muestras a diversos intervalos de tiempo. Las muestras se eliminaron mediante centrifugación, y se \ congeló el sobrenadante hasta el análisis por RMN. En la Tabla 1 se muestra la liberación de la glucosa en el tiempo.

Tabla 1. Liberación de la glucosa, expresada como mmol/L, durante la incubación de paja de trigo pretratada lavada procedente de DM al 2%, a un pH de 4,5 y 65° C, en una mezcla de 4 enzimas (=4E) que contenía 1 BG, 1 CBHI, 1 CBHII y 1 una proteína potenciadora de la celulasa (TEMER07589) , a las cantidades relativas del 9%, 30%, 24% y 37% de la proteína total de la mezcla, y Filtrase® NL, ambas a una dosis por g de 2 , 5 y 5 mg de proteína de paja de trigo pretratada procedente de la DM, con o sin adición de 2 mg de proteína de tipo suolenina (TEMER08806) por g de paja de trigo pretratada procedente de la DM.

Glc (ramol/L) Dosis Dosis de 2,5 mg de 5 mg h 4 h h 4 h 4E ,4 5,2 ,6 1,4 4E + TEMER08806 ,3 6,5 ,9 4,5 Filtrase® NL 0,1 3,4 2,6 0,3 Filtrase® NL + TE ER08806 ,5 6,0 4,2 0,4 A partir de este experimento, resulta evidente que a una dosis baja de una mezcla de enzimas celulolíticas , la adición de la proteína TEMER08806 de tipo suolenina, da como resultado un aumento de la liberación de glucosa en un plazo de 24 h.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 1 , o un polipéptido variante o polinucleótido variante del mismo, en el que el polipéptido variante tiene al menos un 73% de identidad de la secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o el polipéptido variante codifica un polipéptido que tiene al menos un 73% de identidad de la secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 2 .

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene actividad suolenina.

3. Un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1 ; O (b) una secuencia de nucleótidos que se híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento inverso de la SEQ ID NO: 1; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 78% de identidad de la secuencia con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1; o (d) un fragmento que tiene al menos aproximadamente 100 nucleotidos de longitud de una secuencia de nucleotidos tal como se define en (a) , (b) o (c) que tiene al menos aproximadamente 100 nucleotidos de longitud; o (e) una secuencia que está degenerada como resultado del código genético de una secuencia tal como se define en una cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleotidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleotidos tal como se define en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

4. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

5. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 o que es una secuencia de ADN.

6. Una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el contenido de GC es del 56% o más, del 58% o más, o del 58-65%.

8. Un vector que incorpora una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

9. Una célula que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 o un vector de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la célula es una célula eucariota.

11. Una célula de acuerdo con la reivindicación 10 en la que la célula es una célula fúngica.

12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 11 en la que la célula fúngica se selecciona entre el grupo que consiste en los géneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces .

13. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la célula fúngica es de las especies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, o • Aspergillus niger.

14. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en la que se eliminan, se inactivan o se perturban uno o más genes de forma completa o parcial, en la que, opcionalmente , el gen codifica una proteasa.

15. Una planta transgénica o una de sus partes que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, un vector de acuerdo con la reivindicación 8 o una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en la que, opcionalmente, la planta es una planta de maíz, una planta de sorgo, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta oleaginosa, una planta de colza, una planta de soja, una planta de cebada, una hierba, o una planta de tabaco; o una planta de los géneros Anacardium, Arachis, Ragus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Ferae, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Ocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, alus , Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Eolus, Pistachio, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna o Zea.j

16. Un procedimiento para la preparación de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que tiene actividad degradadora de material de carbohidrato y/o actividad hidrolizante de carbohidratos, procedimiento que comprende cultivar una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado.

17. Una composición que comprende: (i) un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa y/o un polipéptido miembro de la familia GH61.

18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17, en la que la celulasa es una celobiohidrolasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, una endo- -l,4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß- (1,3) (1,4) -glucanasa.

19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, en la que la hemicelulasa es una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, a a-L-arabinofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una -galactosidasa, a ß-galactosidasa, a ß-mananasa o una ß-manosidasa .

20. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en la que la pectinasa es una endo poligalacturonasa, a pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, una pectato liasa, una alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una alfa-arabinofuranosidasa o una endo-arabinanasa .

21. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 que comprende una ligninasa, una expansina, un polipéptido de tipo expansina, una suolenina o el producto polipeptídico de un gen que codifica una proteína integradora de la celulosa o una proteína inducida por celulosa .

22. Un procedimiento para el tratamiento de un sustrato que comprende material de carbohidratos, opcionalmente , un material vegetal, procedimiento que comprende poner en contacto el sustrato con un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 y/o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21.

23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el sustrato es un material vegetal y se proporciona el material vegetal en la forma de una planta, pasta vegetal, extracto vegetal, un comestible o un ingrediente derivado del anterior o un tejido, tela o prenda de vestir que comprende un material vegetal.

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22 y/o la reivindicación 23, en el que el tratamiento comprende la degradación y/o la modificación de la celulosa y/o la hemicelulosa y/o una sustancia pectínica.

25. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicaciónl o 2 y/o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 para producir un azúcar procedente de un material lignocelulósico.