MX2012013098A - Uso de marcadores especificos de gen midrib-3 cafe en maiz para introgresion de rsgo. - Google Patents

Abstract

Esta descripción concierne a composiciones y métodos para determinar la cigosidad de plantas de maíz conteniendo una o más mutaciones de midrib café (BMR). La descripción también concierne a métodos que son útiles para intensificar el proceso de cultivo para maíz BMR. En ciertas modalidades, composiciones y métodos para determinar la cigosidad de plantas de maíz con respecto al alelo bm3.

Description

USO DE MARCADORES ESPECÍFICOS DE GEN MIDRIB-3 CAFÉ EN MAÍZ PARA INTROGRESIÓN DE RASGO RECLAMACION DE PRIORIDAD Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud de patente provisional estadounidense serial número 61/334,073, presentada el 12 de mayo de 2010, para "USE OF BROWN MIDRIB-3 GENE SPECIFIC MARKERS IN MAIZE FOR TRAIT INTROGRESSION" (Uso de marcadores específicos de gen midrib-3 café en maíz para introgresión de rasgo).

Campo técnico La presente descripción se refiere de manera genera a cultivo de plantas. Los métodos son provistos para determinar la cigosidad de plantas conteniendo mutaciones midrib 3 café (bm3). Los métodos de la descripción son útiles adicionales para intensificar el proceso de cultivo para líneas de plantas conteniendo BMR.

Antecedentes Las ligninas son componentes universales en plantas que forman reticulaciones con carbohidratos, tales como hemicelulosas en la pared celular. Los polímeros de lignina baja la digestión de fibra en rumiantes y el grado de lignificaciones puede ser inversamente proporcional a la digestibilidad de cosechas de forraje. Cherney et al. (1991) Adv. Argron. 46:157-98. El maíz conteniendo mutación midrib café (BMF) exhibe una pigmentación café rojiza de la nervadura central de hoja que es asociada con contenido de lignina significativamente reducido, composición de lignina alterada y digestibilidad mejorada. Al menos cuatro mutaciones de BMR independientes han sido identificadas en el maíz. Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7:1435-6. Estas mutaciones, llamadas "bm1, bm2, bm3 y bm4" exhiben todas contenido de lignina disminuido cuando se comparan con maíz de control. Las mutaciones bm3 dentro del gen de ácido cafeteo O-metiltransferasa (COMT, por ejemplo, GenBank Acceso no. M73235). Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3:351-7; Vignols et al. (1995) Plant Cell 7:407-16.

El gen COMT controla las actividades de enzimas involucradas en la biosíntesis de lignina. COMT utiliza S-adenilsilmetionina para transmetilar ácido cafeico, lo cual resulta en la producción de ácido ferúlico. El alcohol coniferílico y alcohol sinapílico son generados por último a partir del ácido ferúlico. La combinación de alcoholes coniferílico, ferúlico y sinapílico en la presencia de radicales libres resulta en la producción de lignina. Las mutaciones bm3 han sido caracterizadas y se piensa que inhiben la transmetilación de ácido cafeico mediante inactivación de gen. Guillet-Claude et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 110:126-35; Piquemal et al. (2002) Plant Physiology 130:1-11; He et al. (2003) Crop Sci. 43:2240-51; Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3:351-7; Vignols et al. (1995) Plant Cell 7:407-16. Sin embargo, un método rápido para detectar específicamente y probar la cigosidad de una planta particular en el sitio bm3 que no ha sido desarrollada.

Descripción de la invención Se describen en la presente métodos para caracterización molecular basada en PCR de alto rendimiento de variedades de maíz BMR (por ejemplo, mutantes bm3) que pueden intensificar enormemente el proceso de cultivo para líneas conteniendo BMR. Se describen métodos para determinar la cigosidad de una muestra de tejido de planta, y de ahí la planta a particular de la cual se preparó, al determinar la presencia o ausencia de un mutante de bm3 y los alelos de COMT tipo natural. De esta manera, se proporciona un ensayo de cigosidad basado en PCR de sonda de hidrólisis de punto final (el cual es referido como un ensayo TaqMan® en la presente) que detecta y prueba específicamente el estado de cigosidad en el sitio bm3. Se describen ensayos que utilizan un biplex de oligonucleótidos específicos a un mutante bm3 y a secuencias tipo natural correspondientes en el mismo ensayo.

Breve descripción de los dibujos La FIG. 1 incluye una representación esquemática de gen COMT con mutaciones bm3 y oligonucleótidos diseñados para amplificación parcial de gen COMT (~1.8 kbp).

La FIG. 2 incluye una representación de la amplificación de secuencia de gen COMT parcial a partir de doce líneas bm3 y tres líneas no de bm3 (líneas tipo naturales). Los productos de PCR fueron visualizados en un 2% E-Gel® y se extrajo a través de un 0.8% E-Gel® Clone Well para clonación subsecuente en el vector pCR4-TOPO®.

La FIG. 3 incluye una alineación de secuencias de consenso a partir de genes COMT tipo natural y mutantes bm3. Tres mutaciones de supresión/inserción previamente descritas son subrayadas.

Las FIGs. 4a y 4b incluyen una presentación esquemática de gen COMT con iniciadores específicos para mutación bm3 y gen COMT INTACTO. (FIG. 4a) El gen COMT con líneas punteadas representa supresión de bm3. Los iniciadores específicos de gen COMT están dentro del sitio de supresión. (FIG. 4b) Gen mutante bm3. Los oligonucleótidos específicos de bm3 están en la unión donde los oligonucleótidos delanteros e inversos que flanquean el sitio de supresión y la sonda se expanden a la región suprimida.

Las FIGs. 5a y 5b incluyen gráficas de amplificación de PCR de tiempo real donde las unidades de fluorescencia relativa (RFU) son mostradas para bm3 (Fig. 5a) con FAM y (Fig. 5b) COMT tipo natural con VIC (reemplazado con Hex debido a la limitación de la máquina de PCR de tiempo real). La fase de amplificación exponencial fue observada a partir del ciclo 22 a 36 para ambos genes COMT tipo natural y bm3.

La FIG. 6 incluye determinaciones de genotipo hechas usando un ensayo de discriminación aléiica basada en unidades de fluorescencia relativa de FAM como alelo 1 (bm3 homocigo) y VIC (reemplazado con Hex debido a la limitación de la máquina) como alelo 2 (COMT tipo natural homocigo) en el ciclo 30.

La FIG. 7 incluye determinaciones de cigosidad bm3 hechas con un ensayo TaqMan® de punto final. Sobre la terminación de las lecturas de PCR y fluorescencia, se generó una gráfica de distribución como se describe a continuación: SOB1 = Señal sobre el soporte de FAM (señal de muestra sobre promedio de señal de soporte a 535 nm), SOB2 = Señal sobre soporte de VIC (señal de muestra sobre promedio de señal de soporte a 560 nm). Las determinaciones de genotipo fueron hechas con SOB1/SOB2 < 1 para tipo natural, 1 < SOB1/SOB2> 5 para hemicogotos, y SOB1/SOB2 > 5 para homocigotos con una escala logarítmica.

La FIG. 8 incluye determinaciones de cigosidad bm3 hecha con un ensayo TaqMan® de punto final. Los datos de intensidad de fluorescencia cruda directamente del lector de placa fueron analizados en KLIMS (sistema de manejo de información de laboratorio KBioscience). Se generó una gráfica con RFU (unidades de fluorescencia relativa) de FAM graficado en el eje x y VIC graficado en el eje y. Las determinaciones de cigosidad se hicieron con base en la separación de agrupamiento en una visión de agrupamiento.

Listado de secuencias Las secuencias de ácido nucleico listadas en el listado de secuencias acompañante son mostradas usando las abreviaturas de letras estándares para bases de nucleótidos, como se define en 37 C.F.R. § 1.822. Solo un filamento de cada secuencia de ácido nucleico es mostrado, pero se entiende que el filamento complementario es incluido por cualquier referencia al filamento desplegado. En el listado de secuencias acompañante: SEQ ID NO: 1 muestra una secuencia de iniciador delantera (BM35_F) usada para amplificar un gen parcial COMT de maíz: TACTCTACTGGCTGCGGCTAGC.

SEQ ID NO: 2 muestra una secuencia de iniciador inverso (BM35_R) usada para amplificar un gen parcial COMT de maíz: TAACCTTGATTGTTATTACTCGCACATGG.

SEQ ID NO: 3 muestra una secuencia de oligonucleótidos (BM1234R) del gen COMT usado para secuenciar un gen parcial COMT de maíz: ATCAGCATCAGCCAGGCAGG.

SEQ ID NO: 4 muestra una secuencia de iniciador inverso (BM3_F) usada para identificar el alelo bm3 muíante: AAAAAGAACGAGGTTGCAAAAGATA.

SEQ ID NO: 5 muestra una secuencia de iniciador inverso (BM3_R) usada para identificar el alelo bm3 mutante: TTAGAATCCACGACATGCAAGAG.

SEQ ID NO: 6 muestra una secuencia de sonda (BM3_Sonda) usado para identificar el alelo bm3 mutante, con FAM en el extremo 5' y MGBNFQ en el extremo 3': FAM-ACAAACCAAAGGATGTCG-MGBNFQ.

SEQ ID NO: 7 muestra una secuencia de iniciador delantero (COMT_F) usada para identificar el alelo COMT tipo natural: CGCACTCGACGACGATGAC.

SEQ ID NO: 8 muestra una secuencia de iniciador inverso (COMT_R) usada para identificar el alelo COMT tipo natural: CACGCTGCTCAAGAACTGCTA.

SEQ ID NO: 9 muestra una secuencia de sonda (COMT_Sonda) usada para identificar el alelo COMT tipo natural, con VIC en el extremo 5', y GBNFQ en el extremo 3': VIC-CATTTTCCGGCAGCGC-MGBNFQ.

SEQ ID NO: 10 muestra una secuencia de nucieótidos bm3.

SEQ ID NO: 11 muestra una secuencia de nucieótidos COMT parcial.

Modos para realizar la invención I. Revisión de varias modalidades Se describen en la presente métodos para caracterización molecular basada en PCR de alto rendimiento de variedades de maíz bm3 que pueden intensificar enormemente el proceso de cultivo para líneas de plantas conteniendo BMR. En modalidades particulares, el método puede comprender obtener una muestra de DNA genómico aislado a partir de una planta de maíz, contactar el DNA genómico aislado con al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucieótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 bajo condiciones de alta severidad y al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucieótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:11 bajo condiciones de alta severidad, y determinar la cigosidad de una mutación bm3 en el DNA genómico aislado a partir de la planta de maíz. En modalidades particulares, al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucieótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 bajo condiciones de alta severidad y al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucieótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:11 bajo condiciones de alta severidad están entre 10 y 35 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 bajo condiciones de alta severidad es al menos 95% idéntica a entre 10 y 35 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:10. En algunas modalidades, al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:11 bajo condiciones de alta severidad es al menos 95% idéntica a entre 10 y 35 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:11. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:11 bajo condiciones de alta severidad no es capaz de hibridar a SEQ ID NO:100 bajo condiciones de alta severidad. En ciertas modalidades, al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO: 11 es seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1-9.

También se describen métodos para identificar una mutación de B R en plantas de maíz. En algunas modalidades, el método puede comprender exponer DNA genómico de una planta de maíz a una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 bajo condiciones de alta severidad. En modalidades particulares, una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar a SEQ ID NO: 10 bajo condiciones de alta severidad puede ser seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6.

Se describen además métodos para introgresar de manera confiable y predecible un rasgo para bajo contenido de lignina (por ejemplo, a través de introgresión de un alelo bm3) en germoplasma de planta. En algunas modalidades, el método puede comprender retrocruzar una planta teniendo una mutación en el gen COMT con otra planta, obteniendo una muestra de DNA genómico aislado a partir de una planta de progenie producida mediante la cruza, contactar la muestra de DNA genómico aislado con al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:11 bajo condiciones de alta severidad, y seleccionar progenie de la cruza que comprenden una mutación en el gen COMT al reproducir una planta a partir de la cual se obtuvo una muestra de DNA genómico aislado que se une con alta severidad a al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:11 bajo condiciones de alta severidad, produciendo por ello una planta genéticamente diseñada, en donde un rasgo para bajo contenido de lignina ha sido introgresado en el germoplasma de la planta genéticamente diseñada.

También se describen plantas de maíz con genotipo y/o cigosidad determinados de acuerdo con métodos moleculares basados en PCR de alto rendimiento de la descripción, sí como plantas de maíz genéticamente diseñadas que exhiben un rasgo para bajo contenido de lignina que son producidos de acuerdo con los métodos de la descripción para introgresar de manera confiable y predecible un rasgo para bajo contenido de lignina en germoplasma de planta de maíz.

II. Abreviaturas BMR midrib café MGBNFQ Minor Grove Binding Non Fluorescence QuencherMR I FAM 6-carboxi-fluoresceína PCR reacción en cadena de polimerasa RFU unidades de fluorescencia relativa VIC 6-carboxi-rodamina III. Términos En la descripción y tablas que siguen, se usa una variedad de términos. Con el fin de proporcionar un entendimiento claro y consistente de la especificación y reivindicaciones, incluyendo el alcance a ser dado a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones: Retrocruzado. El retrocruzado es un proceso en el cual un cultivador cruza repetidamente la progenie híbrida nuevamente a uno de los padres, por ejemplo, un híbrido de primera generación con uno de los genotipos padres del híbrido F^ Maíz BMR: Como se usa en la presente, el término "maíz BMR" se refiere a variedades de maíz que contienen una mutación midrib café, tales como las mutaciones caracterizadas como bm1, bm2, bm3 y bm4. Las variedades de maíz BMR exhiben normalmente una pigmentación café rojiza de la nervadura media de hoja. Maíz BMR también es caracterizado normalmente por menor contenido de lignina, mayor digestibilidad de fibra, y mayor captación de materia seca. Ejemplos no limitantes de variedades de maíz BMR incluyen F2F297, F2F383, F2F488, F2F449, F2F566, F2F610, F2F622, F2F665, F2F633, F2F682, F2F721 , F2F700 y F2F797.

Hibridación: Los oligonucleótidos y sus análogos hibridan mediante unión de hidrógeno, lo cual incluye unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteeen o Hoogsteen inversa, entre bases complementarias. En general, las moléculas de ácido nucleico consisten de bases nitrogenosas que son ya sea pirimidinas (citosina (C), uracilo (U) y timina (T)) o purinas (adenina (A) y guanina (G)). Estas bases nitrogenosas forman enlaces de hidrógneo entre una pirimidina y una purina, y la unión de la pirimidina a la purina es referida como "emparejado de bases". De manera más específica, A se unirá a hidrógeno a T o U , y G se unirá a C. "Complementario" se refiere al emparejado de bases que ocurre entre dos secuencias de ácido nucleico distintas o dos regiones distintas de la misma secuencia de ácido nucleico.

"Específicamente hibridable" y "específicamente complementario" son términos que indican un grado suficiente de complementaridad, de manera que la unión estable y específica ocurre entre el oligonucleótido y el objetivo de DNA o RNA. El oligonucleótido no necesita ser 1 00% complementario a su secuencia objetivo para ser específicamente hibridable. Un oligonucleótido es específicamente hibridable cuando la unión del oligonucleótido a la molécula de DNA o RNA objetivo interfiere con la función normal del DNA o RNA objetivo, y existe suficiente grado de complementaridad para evitar una unión no específica del oligonucleótido a secuencias no objetivo bajo condiciones donde se desea la unión específica, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos o sistemas in vivo. Tal unión es referida como hibridación específica.

Las condiciones de hibridación que resultan en grados particulares de severidad variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación elegido y la composición y longitud de las secuencias de ácido nucleico de hibridación. En general, la temperatura de hibridación y la fuerza iónica (especialmente la concentración de Na+ y/o Mg2+) del amortiguador de hibridación contribuirán a la severidad de hibridación, aunque los tiempos de lavado también influencian la severidad. Los cá lcu los con respecto a las condiciones de hibridación requeridas para alcanzar grados particulares de severidad son discutidos en Sambrook et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2a ed . , vol. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, cap. 9 y 1 1 .

Para fines de la presente descripción, "condiciones severas" abarcan condiciones bajo las cuales la hibridación ocurrirá si existe menos de 25% de desigualdad entre la molécula de hibridación y la secuencia objetivo. "Condiciones severas" pueden ser definidas adicionalmente en niveles particulares de severidad. Así, como se usa en la presente, condiciones de "severidad moderada" son aquéllas bajo las cuales las moléculas con más de 25% de desigualdad no se hibridarán. Las condiciones de "severidad media" son aquéllas bajo las cuales las moléculas con más de 1 5% de desigualdad no hibridarán, y las condiciones de "alta severidad" son aquéllas bajo las cuales la secuencia con más de 10% de desigualdad no hibridará. Las condiciones de "muy alta severidad" son aquéllas bajo las cuales son secuencias con más de 6% de desigualdad no hibridarán.

En modalidades particulares, las condiciones severas pueden incluir hibridación a 60°C en mezcla maestra de genotipado TaqMsn® (Applied Biosystems, Foster City, CA, Catálogo #4371 355) , diluido de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislado: un Componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína) ha sido substancialmente separado, producido aparte, o purificado lejos de otros componentes biológicos en la célula del organismo, en los cuales el componente ocurre de manera natural, es decir, otros DNA y RNA cromosómicos y extra-cromosómicos, y proteínas. Las moléculas de ácido nucleico y proteínas que han sido "aisladas" incluyen moléculas de ácido nucleico y proteínas purificadas mediante métodos de purificación estándares. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparadas mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como moléculas de ácido nucleico químicamente sintetizadas, proteínas y péptidos.

Oligonucleótido: Un oligonucleótido es un pol ímero de ácido nucleico corto. Los oligonucleótidos pueden ser formados mediante corte de segmentos de ácido nucleico más largos, o al polimerizar precursores de nucleótidos individuales. Los sintetizadores automatizados permiten la síntesis de oligonucleótidos hasta varios cientos de pares de bases de longitud. Debido a que los oligonucleótidos pueden unirse a una secuencia de nucleótidos complementaria, pueden ser usados como sondas para detectar DNA o RNA. Los oligonucleótidos compuestos por DNA (oligodesoxiribonucleótidos) pueden ser usados en PCR, una técnica para la amplificación de pequeñas secuencias de DNA. En PCR, el oligonucleótido es referido normalmente como un "iniciador" , lo cual permite que una DNA polimerasa extienda el oligonucleótido y replique el filamento complementario.

Cigosidad : Como se usa en la presente, el término "cigosidad" se refiere a la similitud, o falta de la misma, de alelos de un gen para un rasgo heredado en un organismo. Si ambos alelos son iguales, el organismo es "homocigo" para el rasgo. Si ambos alelos son diferentes, el organismo es "heterocigo" para el rasgo. Si un alelo está faltando, es "hemicigo". Si ambos alelos están faltando, es "nulicigo".

A menos que se explique específicamente de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta descripción. Las definiciones de términos comunes en biolog ía molecular pueden encontrarse en, por ejemplo, Lewin B. , Genes V (Genes V), Oxford University Press, 1 994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al . (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology (La enciclopedia de biolog ía molecular), Blackwell Science Ltd. , 1 994 (ISBN 0-632-021 82-9); y Meyers R.A. (ed . ), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Biolog ía molecular y biotecnología: una exhaustiva referencia de escritorio), VCH Publishers; Inc. , 1995 (ISBN 1 - 56081-569-8).

IV. Método de alto rendimiento para determinaciones de genotipo y cigosidad de maíz bmr A. Revisión Se describe en la presente un ensayo de PCR TaqMan® de punto final, de gen específico, generalmente útil para análisis de cigosidad de maíz BMR o maíz BMR putativo. Ejemplos particulares utilizan un biplex de oligonucleótidos específico a una supresión bm3, y a las secuencias de tipo natural correspondientes en el mismo ensayo. En estos ejemplos, la cigosidad puede ser determinada por la presencia/ausencia del mutante bm3 y los alelos COMT de tipo natural. El ensayo ha sido sometido a grupo de análisis genómico de alto rendimiento para implementación adicional y puede intensificar enormemente el proceso de cultivo para proyectos de introgresión de BMR.

B. Maíz de midrib café Plantas de maíz midrib café (BMR) son caracterizadas mediante pigmentación café en la nervadura central de hoja en la etapa V4 a V6 y una coloración café clara de la médula después de la formación de borlas. El maíz híbrido midrib café contiene una mutación de gen que provoca menor contenido de lignina en tejido de planta de maíz, por ejemplo, una mutación bm2 o una mutación bm3. El gen midrib3 café está ubicado en el brazo corto del cromosoma 4, y el alelo bm3 es recesivo. El gen midrib2 café está ubicado en el brazo largo del cromosoma 1 y el alelo bm2 también es recesivo. Los polímeros de lignina limitan la digestibilidad de la fibra en la planta de maíz. La lignina reducida en maíz midrib café resulta en ensilaje con fibra que es más digestible que el maíz normal. Las pruebas de alimentación de animales han mostrado aproximadamente 10 por ciento mayor captación y producción de leche incrementada con ensilaje de maíz BMR, como se compara con ensilaje normal.

Se proporcionan métodos que identifican mutaciones bm3. Los métodos de la descripción pueden ser útiles, por ejemplo, en la identificación de una planta de maíz particular, o variedad de maíz particular, como maíz BMR. También pueden ser útiles los métodos descritos en la introgresión confiable y predecible de un rasgo de BMR en germoplasma de maíz al cruzar maíz de BMR con otras variedades de maíz, o al reticular maíz BMR conteniendo una primera mutación BMR con maíz BMR conteniendo una segunda mutación de BMR (por ejemplo, cruzar una variedad de maíz bm1 con una variedad de maíz bm3). Muchas mutaciones BMR son conocidas por aquéllos de habilidad en la técnica, y algunas mutaciones BMR han sido caracterizadas (por ejemplo, mapeadas y secuenciadas). Los métodos de la descripción pueden ser usadas para identificar una mutación de BMR, determinan el genotipo y/o cigosidad de una planta o variedad de maíz BMR, y para la introgresión de cualquier mutación BMR en germoplasma de maíz.

C. Ensayo de detección de PCR de punto final Se describe un ensayo de PCR TaqMan® de punto final específico de gen, generalmente útil para análisis de cigosidad de maíz BMR o maíz BMR putativo. En modalidades particulares, un ensayo de PCR TaqMan® de punto final específico de gen puede ser usado para analizar la cigosidad de maíz para una mutación bm3.

Los iniciadores y sondas para uso en un ensayo de PCR TaqMan® de punto final específico de gen puede ser diseñado con base en una mutación conocida en el gen de interés. Por ejemplo, los iniciadores y sondas para un ensayo específico de bm3 pueden ser diseñados con base a una supresión de 978 bp en el extremo 3' del gen de ácido cafeico O-metiltransferasa {COMT). En reacciones biplex, en donde los oligonucleótidos específicos a la mutación (por ejemplo, bm3) y el gen tipo natural no roto (por ejemplo, COMT) son usados en el mismo ensayo, los oligonucleótidos específicos amplificarán selectivamente la secuencia de cualquiera o ambos del gen mutado y/o el gen tipo natural que está presente en una muestra de DNA genómico.

En algunas modalidades, un ensayo específico de bm3 amplifica un fragmento que es 71 bp de longitud, el cual es único al sitio de unión donde 978 bp de secuencia de nucleótidos fue suprimido del gen COMT tipo natural. En ciertas modalidades, una sonda de oligonucleótido de objetivo específico (por ejemplo, BM3_Sonda (SEQ IE NO:6)) híbrida bajo condiciones de alta severidad a una secuencia objetivo en una muestra de DNA genómico entre dos iniciadores de PCR (por ejemplo, BM3_F (SEQ ID NO:4)), y BM3_R (SEQ ID NO:5)).

En algunas modalidades, un ensayo específico de gen COMT tipo natural amplifica un fragmento de gen COMT que es de 65 bp de longitud y el cual está ubicado dentro de exón 2 (suprimido en los mutantes bm3), de manera que secuencias no de bm3 en el sitio COMT pueden no ser amplificados. En ciertas modalidades, una sonda de oligonucleótido de objetivo específico (por ejemplo, COMT_sonda (SEQ ID NO:9)) híbrida bajo condiciones de alta severidad a una secuencia objetivo en una muestra de DNA genomico entre dos iniciadores de PCR (por ejemplo, COMT_F (SEQ ID NO:7) y COMT_R (SEQ ID NO:8)).

Los oligonucleótidos de objetivo específico pueden ser etiquetados, por ejemplo, con tintes fluorescentes (por ejemplo, FAM, VIC y MGBNFQ), los cuales pueden permitirá una rápida cuantificación de una señal fluorescente de objetivo específico. Los productos de PCR pueden ser medidos después de un número pre-determínado de ciclos, por ejemplo, cuando la reacción está en la fase exponencial temprana. Muestras de control negativo pueden comprender DNA genomico de cualquier variedad de maíz, por ejemplo, sin una mutación de bm3. Las muestras de control positivo pueden comprender DNA genomico a partir de una variedad de maíz con una mutación de BMR, tal como mutación de supresión de bm3 en el gen COMT\. Las muestras hemicigas de control pueden comprender ya sea DNA genomico a partir de una variedad de maíz predeterminada como hemiciga para una mutación bm3; o una muestra hemiciga puede comprender proporciones ¡guales de DNA de control negativo a DNA a partir de una variedad de maíz predeterminada como homociga para bm3.

El DNA puede ser aislado (por ejemplo, extraído y purificado) a partir de tejido de planta de maíz mediante métodos conocidos para aquéllos de habilidad en la técnica. Los kits comerciales para aislamiento de DNA están disponibles, por ejemplo, de Qiagen, Inc. En algunas modalidades, los discos de hoja de una planta particular son perforados y transferidos en tubos de recolección. El perforador puede ser limpiado después de cada muestreo con alcohol al 70%, enjuagando con agua y secando. Los amortiguadores de extracción de DNA pueden ser preparados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El DNA puede ser aislado entonces usando el kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Finalmente, la concentración del DNA aislado puede ser determinada usando, por ejemplo, un kit de cuantificación Quant-iT R PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y un espectrofotómetro, o mediante cualquier otra técnica adecuada.

Una vez que los iniciadores, sondas y muestras de DNA genómico han sido preparadas o hechas disponibles de otra manera, una reacción de PCR puede ser conducida para identificar las secuencias de ácido nucleico de interés (por ejemplo, secuencias particulares a una mutación BMR) en la o las muestras de DNA genómico. En modalidades particulares, se preparan mezclas de reacción de PCR individuales que contengan todos los componentes de reacción, excepto la o las muestras de DNA genómico. Para una reacción biplex comprendiendo iniciadores y sondas de genes específicos para muíante bm3 y maíz COMT tipo natural, la mezcla de reacción pueden comprender enzima, amortiguador de reacción, iniciadores delanteros e inversos para la mutación bm3, iniciadores delanteros e inversos para el gen COMT tipo natural, una sonda específica de gen para la mutación bm3, una sonda específica de gen para el gen COMT y agua. En algunos sistemas de ensayo de PCR (por ejemplo, ensayos de PCR TaqMan®), pueden estar presentes enzima y amortiguador en un componente de kit simple (por ejemplo, mezcla maestra de genotipado TaqMan®; Applied Biosystems, Foster City, CA, Catálogo # 4371355).

Una vez que la mezcla de reacción es preparada de otra manera, la o las muestras de DNA genómico pueden ser adicionadas y la reacción comenzó. No es necesario normalizar las cantidades de DNA genómico en una muestra. Sin embargo, el técnico experto puede alcanzar mejores resultados al usar muestras de DNA genómico con concentraciones relativamente iguales.

En algunas modalidades, un ensayo de PCR (por ejemplo, un ensayo de PCR TaqMan®) puede ser establecido con controles apropiados. Por ejemplo, una reacción en una placa de múltiples-cavidades puede ser realizada con cavidades de control comprendiendo: (1) control o controles negativos con reactivos pero sin muestra de DNA; (2) control o controles positivos homocigos comprendiendo DNA genómico de maíz bm3; (3) y control o controles positivos hemicigos, como se describe antes. El DNA es entonces amplificado por PCR bajo condiciones de ciclo adecuadas. Por ejemplo, en algunas modalidades que usan un GenAmp® PCR System 9700, puede haber un ciclo de desnaturalización inicial simple a 95°C durante 15 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturalización (92°C durante 15 segundos) y templado/extensión (60°C durante 60 segundos). Aquéllos de habilidad en la técnica entienden que las condiciones de ciclo de PCR pueden variarse de acuerdo con la discreción del practicante, y se obtienen resultados comparables.

D. Determinación de genotipo y/o cigosidad Un ensayo de PCR (por ejemplo, un ensayo de PCR TAqMan® de punto final) puede ser usado para análisis de genotipo y/o cigosidad de maíz de BMR o maíz BMR putativo. En algunas modalidades, una sonda de oligonucleótido específica de gen puede ser etiquetada con un reportador (por ejemplo, una porción fluorescente) . Para ensayos usando detección fluorométrica, productos de reacción de PCR pueden ser analizados en un espectrofluorómetro (por ejemplo, Tecan GENiosMR; Mánnedorf, Suiza) usando ajustes de longitud de onda de emisión y excitación apropiados para la detección de la o las sondas. Por ejemplo, el tinte fluorescente, FAM, pueden medirse con una longitud de onda de excitación de 485 nm, y una longitud de onda de emisión de 535 nm. De manera alternativa, el tinte fluorescente, VIC, puede medirse con una longitud de onda de excitación de 525 nm, y una longitud de onda de emisión de 560 nm .

Siguiendo la terminación de la detección de sonda y reacción de PCR, pueden generarse una tabla y gráfica de distribución usando, por ejemplo, cualquier programa de cómputo de gráfico por computadora adecuado. Los resultados obtenidos con DNA tipo natural , hemicigo y homocigo de soporte genotípico similar, pueden servir como controles negativos y positivos. En una población de segregación, tres agrupamientos de puntos de datos pueden ser obtenidos permitiendo que la determinación visual de un resultado de muestra que probablemente pertenece a uno de los agrupamientos segregados. De manera alternativa, el programa de 'computo de análisis de datos puede ser usado para calcular la probabilidad de que un resultado de muestra pertenezca a cada agrupamiento segregado, con el agrupamiento más probable sirviendo como la designación de muestra. Cuando una determinación visual es hecha, el límite de cada agrupamiento puede ser arbitrario, por ejemplo, cuando tres agrupamientos de puntos de datos son claramente visibles.

Los datos de intensidad de fluorescencia cruda también pueden ser analizados directamente a partir de un lector de placa usando un paquete de análisis adecuado, tal como KLI MS (sistema de manejo de información de laboratorio KBioscience). Una gráfica con las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de señal de fluorescencia generada por una sonda específica para un alelo mutante graficado en un eje, y el RFU de una señal de fluorescencia generada por una sonda específica para el alelo tipo natural graficado en el otro eje pueden ser generados. Las determinaciones de cigosidad pueden hacerse entonces con base en la separación de agrupamiento en un despliegue gráfico de los datos.

Las muestras que no contienen DNA genómico mutante (por ejemplo, una mutación de BMR) pueden solo resultar en lecturas de fluorescencia del producto de PCR tipo natural . Las muestras que contienen DNA genómico mutante hemicigo u homocigo puede resultar en lecturas de RFU para la sonda específica de mutante mayor que aquélla de un control de soporte negativo. Si una muestra no produce resultados adecuados, el DNA genómico en la muestra puede no ser de cualidad y/o cantidad adecuadas, y una nueva preparación de DNA y/o nueva reacción de PCR debería realizarse. De preferencia, una muestra de control negativo que no contiene muestra de DNA, muestra muy baja detección de sonda o sondas específicas de gen. También es preferible que controles homocigos conocidos muestren solo alta detección del DNA muíante o tipo natural en el control, y que los controles hemicigos conocidos muestren alta detección del DNA mutante y tipo natural.

Una "corrida de prueba" del método de PCR y determinación de genotipo y/o cigosidad pueden realizarse con todos los controles apropiados antes de la clasificación de muestras. La optimización adicional de los métodos puede ser deseable para componentes que pueden diferir entre usos (por ejemplo, método de preparación de DNA genómico, Taq DNA polimerasa, oligonucleótidos, equipo de laboratorio, etc.). Las condiciones de ciclización térmica y PCR pueden establecerse de manera que amplifiquen tanto secuencias mutantes y/o de tipo natural en una plantilla de DNA genómico con niveles aceptables de detección de sonda (por ejemplo, RFU aceptable para sondas de oligonucleótidos etiquetadas de manera fluorescente).

E. Intogresión de un rasgo para bajo contenido de lignina en germoplasma de planta Se describen en la presente métodos para producir una planta de maíz con bajo contenido de lignina (por ejemplo, maíz BMR), a través de cultivo de plantas convencional que involucra reproducción sexual. Los métodos pueden comprender cruzar una primera planta de maíz padre que comprende en su genoma al menos una copia de una mutación BMR (por ejemplo, bm3, bm3-1, bm3-2) a una segunda planta de maíz padre, con el fin de producir la progenie F,. La primera planta puede ser cualquier planta de maíz BMR incluyendo, por ejemplo, variedad de maíz BMR F2F297, F2F383, F2F488, F2F449, F2F566, F2F610, F2F622, F2F665, F2F633, F2F682, F2F721, F2F700 y F2F797. La segunda planta de maíz padre puede ser cualquier planta de maíz que sea capaz de producir plantas de maíz de progenie viable (es decir, semillas) cuando se cruza con la primera planta de maíz. La primera y segunda plantas de maíz padres pueden ser de la misma especie de maíz (por ejemplo, Zea mays (maíz)). Los métodos pueden involucrar además autofecundación de la progenie Fi para producir la progenie F2. Los métodos pueden involucrar además una o más generaciones de retrocruzado de las plantas de progenie F, o F2 a una planta de la misma línea o genotipo como ya sea la primera o segunda planta de maíz padre. De manera alternativa, la progenie F^ de la primera cruza, o cualquier cruza subsecuente, puede ser cruzada con una tercera planta de maíz que sea de una línea o genotipo diferente a cualquiera de la primera o segunda planta.

En algunas modalidades, las plantas de progenie son sometidas a una determinación de genotipo y/o cigosidad de la descripción. Una vez que las plantas han sido genotipadas, y/o su cigosidad ha sido determinada, el técnico experto puede seleccionar aquéllas plantas de progenie que tengan una composición genética deseada. Tales plantas de progenie seleccionadas pueden ser usadas en cruzas adicionales, autofecundación o cultivo. Los métodos de introgresión de una mutación BMR que son dirigidas de acuerdo con métodos de la descripción reducen o eliminan el cultivo y/o reproducción de plantas que no tienen una composición genética deseada, y por ello proporcionan confiabilidad y previsibilidad deseables (a lo largo de los patrones de herencia mendelianos esperados).

Los siguientes ejemplos son provistos para ilustrar ciertas características y/o modalidades particulares. Los siguientes Ejemplos no deberían ser interpretados como limitantes de la descripción a las características o modalidades particulares descritas.

Ejemplos Ejemplo 1: Materiales y métodos Planta y material genético. Las muestras de hoja de maíz conteniendo alelos bm3 homocigos y alelos COMT tipo natural homocigos fueron proporcionadas.

Aislamiento de DNA genómico total y cuantificación. Se perforaron ocho discos de hoja por muestra, y se molieron a un polvo fino usando Genogrinder® 2000. El DNA fue extraído con el kit de 96 cavidades Qiagen DNeasyMR (Valencia, CA). Antes de PCR, las muestras de DNA fueron cuantificadas con el kit de cuantificación Quant-iTMR PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando las instrucciones del fabricante.

La clonación y secuenciación de gen COMT parcial. Los fragmentos de DNA genómico de maíz de un gen COMT parcial fueron amplificados de doce líneas bm3 y tres muestras no de bm3 (ver Tabla 1) con oligos MB35_F (5'-TACTCTACTGGCTGCGGCTAGC-3'; SEQ ID NO:1) y BM34_R (5'-TAACCTTGATTGTTATTACTCGCACATGG-3'; SEQ ID NO:2) usando ABI GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosysems, Foster City, CA) en reacciones conteniendo 2.5 unidades de TaKaRa LA TaqMR (Takara Bio Inc., Shiga, Japón), 400 nM dNTP, 200 nM iniciador delantero (BM35_F) e inverso (BM34_R) y 30 ng de DNA genómico. El programa de PCR comenzó con dos minutos de desnaturalización a 94°C, seguido por 30 ciclos de 94°C durante 45 segundos, 55°C durante 45 segundos y 72°C durante dos minutos. Los productos de PCR fueron visualizados en un 2% E-Gel® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y entonces se extrajeron en 0.8% E-Gel® CloneWellsMR. Los productos de PCR purificados fueron clonados entonces en vector pCR4-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con la instrucción del fabricante. Las colonias seleccionadas fueron cultivadas durante la noche en medio de congelador 1X conteniendo 2.5% LB (1 g triptona, 10 g NaCI, y 5 g de extracto de levadura para 1L medio LB), 36 mM K2HP04, 13 mM KH2P04, 1.7 mM citrato de sodio, 6.8 mM (NH4)2S04, 4.4% glicerol, 0.4 mM MgS047H20, 12.5 pg/ml cloranfenicol (adicionado justo antes de usarse), y 50 µg/ml canamicina. Las colonias seleccionadas fueron enviadas entonces a Cogenics® (Houston, TX para secuenciar con promotor T7 y T3, así como BM1234R (5'-ATCAGCATCAGCCAGGCAGG-3'; SEQ ID NO:3), el cual está ubicado dentro del gen COMT. Las secuencias fueron analizadas usando el programa de cómputo Sequencher® 4.8. Las mutaciones Bm3 fueron identificadas al comparar secuencias de consenso de las líneas bm3 a muestras de COMT tipo natural.

Tabla 1: Lista de doce líneas innatas de bm3 y tres no de bm3 usadas para clonar y secuencias de genes COMT Diseño y validación de ensayo de PCR TaqMan®. Con base en las secuencias de consenso de DNA de las líneas bm3, los iniciadores (BM3_F; SEQ ID N0:4 y BM3_R; SEQ ID N0:5), y sonda (BM3_Sonda; SEQ ID NO:6) específica para la unión donde las secuencias parciales de gen COMT en el extremo 3' se suprimió para identificar el alelo mutante; se diseñaron iniciadores (COMT_F y COMP_R) y sonda (COMT_sonda) dentro de la región suprimida para identificar los alelos tipo natural. Se usó el iniciador Express 30 para diseño de ensayo TaqMan®. Todos los iniciadores y las sondas etiquetadas duales con tintes FAM o VIC y Minor Grove Binding Non Flourescence QuencherMR I (MGBNFQ), fueron sintetizados por Applied Biosystems (Foster City, CA). Todos los iniciadores y sondas fueron disueltos en 1X Tris-EDTA a 100 µ?. La mezcla maestra de genotipado TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA, Catálogo #4371355) fueron usados para todas las reacciones de PXR.

Las reacciones de PCR de tiempo real en volumen de 20 µ? se establecieron de acuerdo con la Tabla 2 usando una placa de 96 cavidades en un sistema óptico iCycler® (BioRad, Hercules, CA), iniciando con 15 minutos de desnaturalización a 95°C, seguido por 50 ciclos de 92°C durante 15 segundos, y 60°C durante 1 minuto. Las señales de fluorescencia fueron registradas al final de cada ciclo.

Tabla 2: Mezclas de PCR para cada reacción de biplex con volumen final de 20 µ? Los ensayos de PCR TaqMan® de punto final en volumen de 10 µ? fueron establecidos de acuerdo con la Tabla 3 usando placas de 384- cavldades. Se usó ABI GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) para amplificación, iniciando con 15 minutos de desnaturalización a 95°C, seguido por 30 ciclos de 92°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Los productos de PCR fueron medidos mediante un espectrofluorómetro (Tecan GENiosMR, Mánnedorf, Suiza después de un número óptimo de ciclos, cuando las reacciones estuvieron en la fase exponencial temprana con ajustes de instrumentos recomendados (FAM (muíante bm3): Excitación -485 nm; Emisión-535 nm; VIC (COMT tipo natural): Excitación- 525 nm, Emision- 560 nm).

Mezclas de PCR para cada reacción biplex con volumen final Análisis de datos. Para PCR de tiempo real, el umbral de fluorescencia fue calculado automáticamente con su valor ligeramente por arriba del soporte por programa de cómputo iCycler®. El ciclo de umbral (valor Ct) fue determinado por el número de ciclos necesarios para generar fluorescencia por arriba del umbral establecido. Un ensayo de discriminación alélico fue usado entonces para determinar genotipos.

Siguiendo la terminación de la PCR TaqMan® de punto final y lectura de fluorescencia, se calcularon la señal sobre el soporte de tinte de reporte 1 (SOB1 ) y señal sobre soporte de tinte de reporte 2 (SOB2).

Se generaron una gráfica de distribución entre números de muestra y proporciones absolutas de SOB1/SOB2 en una escala logarítmica. Las muestras de plantas tipo natural, hemicigas y homocigas de soporte genotípico similar fueron usadas como controles. Se hicieron determinaciones de genotipo basadas en las separaciones de agrupamiento.

Los datos de intensidad de fluorescencia cruda directamente del lector de placa también fueron analizados usando KLIMS (sistema de manejo de información de laboratorio KBioscience). Se generaron gráficas con RFU (unidades de fluorescencia relativa) de FAM graficadas sobre el eje x y VIC graficadas sobre el eje y. Se hicieron determinaciones de cigosidad con base en la separación de agrupamientos en una visión de agrupamientos.

Ejemplo 2: Análisis de secuencias de mutaciones bm3 parciales del gen COMT Para diseñar un ensayo TaqMan® específico de gen para mutantes bm3, se necesitó información de secuencia precisa. Por lo tanto, se diseñaron dos oligonucleótidos para amplificar el gen COMT parcial (FIG. 1) a partir de DNA genómico de doce líneas de bm3 y tres no de bm3. FIG. 2. Estos fragmentos fueron clonados en vector pCR4-TOPO® y enviados a Cogenics, Inc. para secuenciación con promotor T7 y T3, así como BM1234R (SEQ ID NO:3). BM1234R es ubicado en medio del gen COMT y se usó para alcanzar la información de secuencia de longitud completa. Secuencias de alta calidad de nueve líneas bm3 fueron analizadas y alineadas usando Sequencher® 4.8. Las secuencias de consenso de líneas bm3 fueron comparadas con muestras de tipo natural. Múltiples mutaciones de supresión/inserción en el extremo 3' del gen COMT fueron identificadas. Por ejemplo, se confirmaron y subrayaron tres mutaciones. FIG. 3.

Diseño y validación de ensayo específico de gen. Todas las líneas bm3 que probamos contienen una mutación de supresión grande en el exón 3' del gen COMT. Esta mutación fue usada entonces para diseño de ensayo TaqMan® específico de gen. La FIG. 4 incluye una representación esquemática que muestra las ubicaciones de oligonucleótidos. Los iniciadores y sondas específicos de gen COMT tipo natural están ubicados dentro del sitio de supresión de 978 bp. Los iniciadores y sondas específicos de bm3 están ubicados en la unión donde los oligonucleótidos delanteros e inversos flanquean el sitio de supresión y la sonda expanden la región suprimida.

Las doce líneas bm3 conocidas y las tres líneas no de bm3 fueron usadas para probar el ensayo TaqMan® específico de gen. Se hicieron seis muestras hemicigas al combinar cantidades iguales de DNA de las líneas bm3 con líneas no de bm3. Se usó PCR de tiempo real para probar la eficiencia del ensayo. Oligonucleótidos específicos para los mutantes bm3 y para las secuencias tipo natural correspondientes fueron combinadas en el mismo ensayo. FAM se usó para monitorear el amplicón de bm3 y se usó VIC para monitorear el amplicón para COMT tipo natural. La fase de amplificación exponencial fue observada del ciclo 22 a 36 para ambos genes bm3 y COMT tipo natural. FIGS. 5a y 5b. Se generaron determinaciones de genotipo correctas usando un ensayo de discriminación alélica con base en FAM como alelo 1 y VIC como alelo 2 en el ciclo 30. FIG. 6.

Validación de análisis de cigosidad TaqMan® de punto final. Una placa de 96 cavidades de muestras de DNA conteniendo poblaciones de bm3 segregando como homocigas, hemicigas y nulas (tipo natural) se usó para probar y validar un ensayo de PCR TaqMan® de punto final. Una ventaja de PCR TAqMan® de punto final es la facilidad de uso. La PCR TaqMan® de punto final no requiere una máquina de PCR de tiempo real más costosa. Cualquier ajuste de máquina de PCR regular para placas de 96 o 384 cavidades y un lector de placa capaz de leer la señal fluorescente relevante es suficiente para realizar el ensayo.

Con base en los resultados de PCR de tiempo real, 30 ciclos de reacción de PCR pueden separar eficientemente los genes bm3 de los genes COMT tipo natural. La reacción de PCR fue terminada en el ciclo 30. Siguiendo la terminación de la PCR TaqMan® y lectura de fluorescencia, las señales de fluorescencia de FAM {bm3) sobre soporte (H20) como señal sobre soporte 1 (SOB1); y VIC (COMT tipo natural) sobre soporte 2 (SOB2) fueron calculados. Una gráfica de distribución fue generada usando SOB1/SOB2 en una escala logarítmica. FIG. 7. Los controles tipo natural, hemicigo y homocigo de soporte genotípico similar sirvieron como controles negativos y positivos. En una población segrégate, tres agrupamientos de puntos de datos fueron obtenidos, permitiendo que los puntos de corte sean visualmente determinados. Para el ejemplo en la FIG. 7, tres agrupamientos de puntos de datos fueron claramente visibles. Los puntos de datos para tipo natural son menores que 1, aquéllos para las muestras hemicigas varían desde 1 hasta 5, y aquéllos para homocigas están por arriba de 5.

Los datos de intensidad de fluorescencia cruda directamente del lector de placa también fueron analizados en KLIMS (sistema de manejo de información de laboratorio KBioscience). Se generó una gráfica con RFU (unidad de fluorescencia relativa) de FAM graficado en el eje x y VIC graficado en el eje y. Se hicieron determinaciones de cigosidad con base en la separación de agrupamientos en una visión de agrupamientos. FIG. 8. Debido a que se usó FAM para monitorear la amplificación de bm3 y se usó VIC para monitorear la amplificación de COMT tipo natural, muestras con señales fuertes de FAM, y poca o ninguna señal de VIC, son bm3 homocigas; muestras con fuertes señales de VIC y poca o nada de FAM, son COMT tipo natural (nulas); y muestras con fuertes señales tanto de FAM como VIC son hemicigas.

Las determinaciones de genotipo y cigosidad a partir de este ensayo de PCR TaqMan® de punto final específico de gen bm3 100% con datos fenotípicos se recolectaron en el campo. Este ensayo proporciona una manera fácil y precisa para caracterizar el estado de cigosidad bm3 en una manera de alto rendimiento.

Ejemplo 3: Introgresión de mutación bm3 La cigosidad de una planta de maíz con respecto a la mutación bm3 es determinada como se describe, supra. Se determina que la planta de maíz es homociga para la mutación bm3. La planta es cruzada a través de cu ltivo de planta convencional con u na planta de maíz conocida como homociga para el gen CO T tipo natural, y u na planta de ma íz homociga para la m utación. bm3. La progenie F ! de la cruza es producida . La progenie de la cruza es autofecundada entonces para producir la progenie F2. Las m uestras de DNA genóm ico de la progenie F2 son preparadas y la cigosidad de las plantas de progenie F2 son determ inadas como se describe, supra.

Las plantas de progenie F2 que son seleccionadas son homocigas para la m utación bm3. La progenie seleccionada es ensayada entonces para baj o contenido de ligni na y esa progenie que exhibe niveles de lignina deseablemente bajos son reprod ucidas ad icionalmente mediante cruza y autofecundación , y la progenie resultante es cultivada .

Aunque la presente invención ha sido descrita en la presente con respecto a ciertas moda lidades preferidas , aq uél los de habil idad ordinaria en la técnica reconocerán y apreciarán que no está limitada de esa manera . En su lugar, muchas adiciones, supresiones y modificaciones a las modalidades preferidas pueden hacerse sin apartarse del alcance de la invención como se reclama en lo sucesivo. Además, las características de una modal idad pueden combinarse con características de otra modalidad , al tiem po q ue todavía está abarcada dentro del alcance de la invención como es contemplado por los inventores.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la cigosidad y/o presencia/ausencia de un alelo usando un tejido de planta de maíz, comprendiendo el método: obtener una muestra de DNA genómico aislado a partir del tejido de planta de maíz; contactar el DNA genómico aislado con al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleotidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 bajo condiciones de alta severidad y al menos una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar a SEQ ID NO:11 bajo condiciones de alta severidad; y determinar la cigosidad de una mutación bm3 en el DNA genómico aislado.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además: contactar el DNA genómico aislado con dos moléculas de ácido nucleico, comprendiendo cada una, una secuencia de nucleotidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 bajo condiciones de alta severidad, y dos moléculas de ácido nucleico capaces de hibridar a SEQ ID NO:11 bajo condiciones de alta severidad; amplificar la secuencia de nucleotidos del DNA genómico aislado entre secuencias de nucleotidos del DNA genómico aislado que hibridan a las dos moléculas de ácido nucleico comprendiendo cada una un secuencia de nucleotidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 bajo condiciones de alta severidad; amplificar la secuencia de nucleotidos del DNA genómico aislado entre secuencias de nucleotidos del DNA genómico aislado que hibridan las dos moléculas de ácido nucleico, comprendiendo cada una, una secuencia de nucleotidos capaz de hibridar a SEQ I D NO: 1 1 bajo condiciones de alta severidad; incluir en la reacción de amplificación al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleotidos capaz de hibridar a SEQ I D NO: 1 0 bajo condiciones de alta severidad que es etiquetada con un primer reportador, y al menos una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar a SEQ I D NO: 1 1 bajo condiciones de alta severidad que es etiquetada con un segundo reportador; y detectar los niveles del primero y segundo reportador.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el primer reportador y el segundo reportador son tintes fluorescentes con espectros de excitación/emisión distinguibles.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el primer reportador es FMA y el segundo reportador es VIC.

5. El método de la reivindicación 1 , en donde la al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleotidos capaz de hibridar a SEQ ID NO: 1 0 está entre 10 y 35 nucleotidos de longitud.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleotidos capaz de hibridar a SEQ ID NO: 1 0 está entre 1 5 y 30 nucleotidos de longitud.

7. El método de la reivindicación 5, en donde una de la al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ I D NO: 1 0 es al menos 95% idéntica a entre 10 y 35 nucleótidos contiguos de SEQ I D NO: 10.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO: 10 es seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO:4, SEQ I D NO: 5 y SEQ I D NO:6.

9. El método de la reivindicación 1 , en donde al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ I D NO: 1 0 bajo condiciones de alta severidad es etiquetada con un tinte fluorescente, y al menos una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar a SEQ I D NO: 1 1 bajo condiciones de alta severidad es etiquetada con un segundo tinte fluorescente con espectros de excitación/emisión distinguibles.

1 0. El método de la reivindicación 9, en donde al menos una molécula de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a SEQ I D NO: 1 0 bajo condiciones de alta severidad es etiquetada con FAM, y al menos una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar a SEQ I D NO: 1 1 bajo condiciones de alta severidad es etiquetada con VIC.

1 1 . El método de la reivindicación 1 , en donde la amplificación de la secuencia de nucleótidos comprende amplificar en una reacción de PCR.

12. El método de la reivindicación 1 , en donde la amplificación de la secuencia de nucíeótidos comprende amplificar en una reacción no basada en PCR.

13. Un método para identificar una mutación de COMT en Zea mays, comprendiendo el método exponer ácido nucleico de Zea mays a una molécula de ácido nucleico comprendiendo SEQ ID NO:6.

14. Un método para introgresar de manera confiable y predecible un rasgo para bajo contenido de lignina en germoplasma de planta, comprendiendo dicho método: cruzar una planta teniendo una mutación en el gen COMT con otra planta; obtener una muestra de DNA genómico aislado de una planta de progenie producida por la cruza; contactar el ácido nucleico aislado con al menos una molécula de ácido nucleico teniendo una secuencia de nucíeótidos capaz de hibridar a SEQ ID NO:10 bajo condiciones de alta severidad; y seleccionar progenie de la cruza que incluye una mutación en el gen COMT al reproducir una planta a partir de la cual una muestra fue obtenida que une la al menos una molécula de ácido nucleico con alta severidad, produciendo por ello una planta genéticamente diseñada en donde se ha introgresado un rasgo para bajo contenido de lignina en el germoplasma de la planta genéticamente diseñada.

15. Una planta de maíz con una cigosidad determinada mediante el método de la reivindicación 1.

16. Una planta de maíz con una cigosidad determinada por el método de la reivindicación 2.

17. Una planta genéticamente diseñada que exhibe bajo contenido de lignina producido mediante el método de la reivindicación 14.

18. Una planta de maíz con una prueba de detección de alelo específico determinada mediante el método de la reivindicación 14.

19. Una planta de maíz con una prueba de detección de alelo específico determinada mediante el método de la planta de la reivindicación 14.