MX2012012528A - Proceso de cultivo celular mejorado. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso de cultivo celular para la producción de polipéptidos en células CHO de mamífero, caracterizado por una o más modificaciones de temperatura y pH, los cuales se ajustan con respecto al tiempo y magnitud, para reducir la muerte celular, incrementar el rendimiento de producto y mejorar la calidad del mismo.

Description

PROCESO DE CULTIVO CELULAR MEJORADO Campo Técnico La presente invención se relaciona con el campo general de la biotecnología, particularmente el cultivo de células y su uso para la producción de polipéptidos a escala industrial.

La presente invención proporciona procesos de cultivo celular caracterizados por al menos un cambio de temperatura y al menos un cambio de pH. Estos procesos son adecuados para el cultivo de células con una alta viabilidad celular, de preferencia células de mamífero similares a células CHO. Los procesos de cultivo celular de conformidad con la presente invención, además permiten obtener altas productividades de polipéptidos cuando se utilizan para la producción de un polipéptido, en particular mediante la expresión recombinante de polipéptidos en sistemas de cultivo de células de mamífero, en particular a escala industrial.

Antecedentes de la Invención La preparación de polipéptidos utilizando la tecnología recombinante, ha desarrollado un procedimiento normalizado durante los últimos veinte años. El acceso a polipéptidos recombinantes mediante la clonación de genes que codifican para el respectivo polipéptido, seguido por una transformación subsecuente de huéspedes de expresión adecuados con el gen por ser expresado y la producción final y purificación del polipéptido recombinante obtenido, ha proporcionado acceso a toda una nueva clase de agentes terapéuticos biológicamente diseñados y producidos.

La industria farmacéutica prepara cada vez más compuestos farmacéuticamente activos utilizando la tecnología de ADN recombinante, seguida por procesos de producción desarrollados en el campo de la bioingeniería.

Tales productos biológicos incluyen anticuerpos monoclonales, que se han desarrollado como opciones importantes de tratamiento en varios campos médicos, incluyendo enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios, inmunosupresión, oncología o similares.

El desarrollo de tales agentes terapéuticos de origen biológico, requiere una producción a escala industrial, proporcionando de esta manera acceso a grandes cantidades del polipéptido recombinante. Los sistemas de expresión preferidos son cultivos de células de mamífero, que son superiores a la mayoría de los demás sistemas eucarióticos basados en células de insecto, de levadura o similares, o incluso los tradicionales sistemas de expresión en procariotes.

Sin embargo, el cultivo de células de mamífero incluye grandes desafíos, especialmente a escala industrial. Las instalaciones de producción para los cultivos de células de mamífero requieren una completa optimización de numerosas condiciones del proceso.

En particular, los procesos de cultivo celular para la producción de polipéptidos en células de mamífero requieren una optimización continua de las condiciones de cultivo y su adaptación a líneas de células específicas o productos, con el fin de alcanzar un alto rendimiento volumétrico del producto, en combinación con una calidad óptima del producto.

Muchos esfuerzos previos se han concentrado en los parámetros básicos de los medios de cultivo celular, incluyendo sus composiciones relacionadas por ejemplo a clases y concentraciones de iones, aminoácidos, vitaminas o elementos traza, o a la osmolaridad del medio. Otros parámetros importantes, que han sido el foco de la investigación, son por ejemplo la composición de alimentación o programas de alimentación para alcanzar el crecimiento celular óptimo.

También, la temperatura y pH como parámetros fisiológicos básicos se sabe que tienen influencia significativa en el cultivo de células de mamífero. La temperatura en general, afecta de manera considerable el estado de crecimiento y la viabilidad de las células. Además de esto, sin embargo, también puede tener influencia más específica en el producto polipeptídico y sus características, alterando por ejemplo la glucosilación (Solicitud de Patente Norteamericana US 2003/0190710 A1; Patente Europea EP 1 373547 A1; Solicitud de Patente Norteamericana US 2004/0214289 A1).

El pH en el cual el medio de crecimiento y las células se mantienen, también puede influenciar y alterar el crecimiento celular y la producción polipeptidica de una manera específica, que dependa de la línea de células y el producto particulares (Sauer et al. Biotechnology and Bioengineering 2000, Vol. 67, pág. 586-597; Yoon etal., Biotechnology and Bioengineering 2004, Vol. 89, pág. 346-356; Kuwae et al., Journal of Bioscience and Bioengineering 2005, Vol. 100, pág.502-510).

En el transcurso del cultivo, los requerimientos de las células pueden cambiar. Mientras que al inicio es ventajoso optimizar las condiciones hacia un crecimiento celular mejorado, en las últimas etapas se vuelve importante el mejoramiento de supervivencia celular y el mantenimiento de la densidad de células viables en relación con la obtención de altos títulos del producto. A este respecto, se ha sugerido la introducción de uno o más cambios de temperatura durante el cultivo celular (Chen et al., J Biosci Bioeng. 2004; 97 (4):239-43). Para esto, las células de mamífero se cultivan al menos a dos diferentes temperaturas, en donde la primera temperatura más elevada es optimizada para el crecimiento, en tanto que la segunda o tercer temperaturas más bajas son seleccionadas para mejorar la productividad de las células (por ejemplo Weidemann et al., Cytotechnology. 1994; 15(1-3): 111-6; WO 00/36092; EP 0 764 719 A2, US 2005/019859, EP 1 575 998, US 2008/081356). Otros documentos describen el uso de los cambios de temperatura en combinación con características de medios específicos adicionales. La Patente Europea EP 1 757 700 A2, por ejemplo, describe un cambio de temperatura en combinación con la presencia de sales butirato como un componente de los medios, en tanto que la Patente Europea EP 1 789 571 A1, describe un cambio de temperatura combinado con un contenido de aminoácido definido.

También, se han cambiado otras condiciones del cultivo celular.

La Patente Norteamericana US 5 856 179 ha presentado un método para producir polipéptidos en un cultivo celular por lotes con alimentación, en donde durante el cultivo, la osmolaridad del medio se ve considerablemente alterada en aproximadamente de 280 a 330 mOSm en la fase principal del crecimiento, a aproximadamente 400-600 mOSm durante la fase de producción.

La Publicación de Patente Internacional WO 02/101019 ha tomado en cuenta a muchos componentes específicos de los medios tales como la glutamina y concentraciones de glucosa, incluyendo cambios en la temperatura y el pH. Sin embargo, se encontró que un cambio en el pH en los medios con glucosa elevada tiene un impacto negativo sobre el cultivo, y que no se recomienda reducir el pH durante el crecimiento o la fase de producción.

La Publicación de Patente Internacional 2006/026445 describe un método para la producción de polipéptidos, en donde las condiciones del cultivo celular son cambiadas de un conjunto de condiciones de cultivo a un segundo conjunto, y en donde este cambio se combina con características específicas de los medios relacionadas con el contenido de aminoácidos específicos. El cambio en las condiciones específicamente se refiere a cambios en la temperatura. Otros cambios en las condiciones, tales como el pH o la osmolaridad, generalmente se mencionan como opciones adicionales; sin embargo, no se especifican ajustes en parámetros particulares.

Considerando los desafíos anteriores y las desventajas existentes, hay una necesidad continua en el campo de la biotecnología industrial, para mejorar los procesos de cultivo que permitan la producción de polipéptidos recombinantes a una escala industrial con incluso rendimientos mayores; es decir, una productividad específica y general mejorada, y un incremento en la calidad del producto.

Un objetivo técnico específico de los procesos de producción de polipéptidos, es mantener una alta viabilidad celular y maximizar el rendimiento final del polipéptido, optimizando los parámetros de los procesos de cultivo celular generales.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a una combinación de cambios en la temperatura y el pH en un proceso para la producción de polipéptidos recombinantes. Adaptadas a las necesidades de células recombinantes, en particular células CHO, combinaciones específicas de estos dos parámetros dan como resultado una mejor productividad de las células, así como una mejor calidad del producto de los polipéptidos producidos de manera recombinante. En particular, la presente invención ha encontrado efectos positivos basándose en el tiempo y programa particulares, de los cambios en la temperatura y pH, en términos absolutos y relativos, referentes a la magnitud particular de los cambios.

De conformidad con un aspecto de la invención, se describe un proceso para la producción de un polipéptido recombinante, que comprende el cultivo de células CHO en un medio, y la expresión del poli péptido recombi nante, en donde la temperatura y el pH son cambi ados durante el proceso.

En parti cul ar, el proceso de conformi dad con la presente invención i nvol ucra al menos un cambio de temperatura y al menos un cambi o de pH. En una modalidad de l a presente invenci ón, un cambi o a parti r de una primera temperatura más alta a una segunda temperatura más baja, se lleva a cabo después de que las células primero se hacen crecer y son mantenidas durante al menos 3 días , alternativamente al menos 4 días, o al menos 5 días a una pri mera temperatura. La segunda temperatura más baja es de aproxi madamente 1 a aproxi madamente 8°C menor que la pri mera temperatura. En una modalidad alternativa de la presente invención , el cambio de temperatura está por ejemplo entre aproxi madamente 2 y aproximadamente 5°C, en particul ar entre aproximadamente 4°C o aproximadamente 3.5°C. La segunda temperatura, entonces, es mantenida durante al menos dos días. La segunda temperatura puede ser manteni da hasta la cosecha.

De conformidad con una modalidad de la presente i nvención, l a primera temperatura de preferencia se encuentra en el rango de entre aproximadamente 33°C y aproximadamente 38°C, y la segunda temperatura de preferencia se encuentra en el rango de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 37°C.

Además del cambio en la temperatura, también se cambia el pH de un pri mero a un segundo pH . Por lo tanto, el proceso de conformidad con la presente i nvención comprende al menos un cambio de pH . En particular, las células se hacen crecer a un primer valor de pH durante al menos 2 días, y el pH posteriormente es cambiado a un segundo valor de pH , el cual está entre aproxi madamente 0.05 y aproximadamente 1 unidades de pH más bajo que el primer pH , y las cél ulas se hacen crecer a el segundo pH durante al menos 1 día, alternativamente durante al menos 2 días. En al gunas modalidades, el segundo pH se mantendrá hasta la cosecha.

El pri mer val or de pH de preferencia se encuentra en el rango de entre aproxi madamente pH 6.8 y aproximadamente pH 7.5. El segundo valor de pH de preferenci a se encuentra en el rango de entre aproxi madamente pH 6.0 y aproximadamente pH 7.1 .

De esta manera, una modalidad de l a presente i nvención es un proceso para la producción de un polipéptido recombi nante, que comprende el cultivo de células CHO en un medio, bajo condiciones que comprenden a menos un cambio en la temperatura y al menos un cambio del pH , y la expresión del poli péptido recombinante, en donde las cél ul as se hacen crecer a una primera temperatura durante al menos 3 días, y la temperatura posteriormente se cam bia a una segunda temperatura, l a cual es entre aproxi madamente 1 y aproxi madamente 8°C más baj a que la primera temperatura, y las cél ulas son mantenidas en dicha segunda temperatura durante un periodo de al menos otros 2 días; - las células se hacen crecer a un primer valor de pH durante al menos 2 días, y el pH posteriormente es cambiado a un segundo valor de pH, el cual se encuentra entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 1 unidades de pH más bajo que el primer pH, y las células se hacen crecer a el segundo pH durante al menos 1 día.

El proceso de conformidad con la presente invención opcionalmente puede comprender un segundo cambio de pH, el cual sigue al primer cambio de pH después de al menos 1 día. Si el primer cambio de pH es seguido por un segundo cambio de pH después de al menos 1 día, entonces el tercer valor de pH es de aproximadamente 0.05 unidades de pH a aproximadamente 1 unidad de pH mayor que el segundo valor de pH. El tercer valor de pH puede ser mantenido hasta la cosecha.

El proceso de cultivo celular de la presente invención, incluye cambios de pH activos y/o pasivos; es decir, el pH es alterado "activamente" mediante un cambio en el punto de ajuste del pH, a un valor nuevo, y/o alterado "pasivamente" permitiendo un cambio del pH del medio mediante la acumulación de productos metabólicos, siguiendo así un perfil de pH metabolico específico del cultivo celular dentro de un rango de pH predefinido. En una modalidad preferida de la invención, el cambio activo es inducido haciendo el cambio de pH respectivo y agregando agentes reguladores conocidos por los técnicos en la materia, tales como ácidos, por ejemplo HCI; o bases, por ejemplo NaOH. En una modalidad adicional preferida del proceso, esto se logra definiendo un punto de ajuste del pH y una banda inactiva, en donde se permita cambiar el pH. En contraste al cambio activo, el cambio pasivo o modificación de pH no es inducido agregando los respectivos agentes modificadores de pH.

En un aspecto adicional, el proceso de conformidad con la presente invención se lleva a cabo utilizando un medio que está libre de proteína y libre de suero. De preferencia, el medio se caracteriza por un contenido de aminoácidos totales de entre aproximadamente 40 mM y aproximadamente 100 m , alternativamente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 mM.

Un proceso preferido como el definido anteriormente se lleva a cabo en una modalidad de lotes con alimentación, que comprende alimentar al menos dos soluciones nutrientes que son agregadas al cultivo. En tal proceso, por ejemplo, una de las soluciones de alimentación agregada al medio de cultivo, es un alimento que comprende el dipéptido cistina y el aminoácido tirosina. Además, se prefiere que el alimento comprenda el dipéptido cistina y el aminoácido tirosina a concentraciones respectivas en el rango de aproximadamente 6.5 g/L y aproximadamente 8.0 g/L, y en el rango de aproximadamente 9 g/L y aproximadamente 11 g/L en una solución acuosa a un pH básico por arriba de 10. En particular, las concentraciones pueden ser de aproximadamente 7.25 g/L para cistina, y de aproximadamente 10.06 g/L para tirosina. En una modalidad preferida, la solución de alimentación que comprende cistina y tirosina es agregada al medio de cultivo en el rango de aproximadamente 0.2 y aproximadamente 0.8% en peso con respecto al peso del medio de cultivo inicial por día, o alternativamente a aproximadamente 0.4% en peso con respecto al peso del medio de cultivo celular inicial por día.

El proceso de conformidad con la invención de preferencia se utiliza para la producción de un polipéptido recombinante que es glucosilado. De conformidad con modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

Breve Descripción de los Dibujos La presente invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes Ejemplos y Figuras. Los Ejemplos, sin embargo, no pretenden limitar los alcances de la invención.

La Fig. 1 es una ilustración de la implementación del cambio en un paso de un cambio activo en el pH con un cambio del pH de 7.00 a 6.80.

La Fig. 2A muestra un perfil de pH obtenido mediante una implementación de cambio pasivo de pH. El cambio de pH de 7.00 a 6.80 en el biorreactor de producción se logró ajustando el punto de ajuste a 6.90, y definiendo una banda inactiva de 0.10. Después de un primer cambio de pH a 6.80, el pH es mantenido activamente a 6.80 hasta el final del cultivo.

La Fig. 2B muestra un perfil de pH con un segundo cambio de pH. En este ejemplo, el límite superior de pH (previo) no se alcanzó.

La Fig. 2C muestra un perfil de pH con un segundo cambio de pH, pero aquí el pH alcanza de nuevo el límite más alto de pH y se mantiene ahí.

La Fig. 3 muestra el efecto de una temperatura constante versus un cambio de temperatura en la densidad de células viables de una clona de células CHO productora de mAb1, como función del tiempo de cultivo, en cultivos en matraces en agitación (véase el Ejemplo 1).

La Fig. 4 muestra el efecto de una temperatura constante versus un cambio de temperatura en la viabilidad de una clona de células CHO productora de mAb1 (véase el Ejemplo 1).

La Fig. 5 muestra el título de producto como función del tiempo de cultivo para cultivos en matraces en agitación de una clona de células CHO productora de mAb1, con y sin un cambio de temperatura (véase el Ejemplo 1).

La Fig. 6 muestra la concentración de lactato a lo largo del tiempo de cultivo en una clona productora de mAb2 (véase el Ejemplo 2)· La Fig. 7 muestra la densidad de células viables como función del tiempo de cultivo en un biorreactor de 300 L con una clona de células CHO. Las condiciones del cultivo incluyeron un cambio de temperatura (día 5) y dos cambios de pH, debido a la regulación de pH con un punto de ajuste y una banda inactiva (véase también el Ejemplo 2).

La Fig. 8 muestra el título de producto como función del tiempo de cultivo en un biorreactor de 300 L, con una clona de células CHO. El proceso combinó una temperatura con cambios de pH (véase también la Fig.7 y el Ejemplo 2).

La Fig. 9 muestra para tres experimentos independientes, la concentración de mAb3 obtenida por un proceso de lotes con alimentación con cultivos de células CHO cultivadas en un biorreactor de vidrio como una función de la integral de células viables. Las condiciones del cultivo incluyeron un cambio de temperatura idéntico para los tres experimentos, y un cambio de pH adicional sólo en un experimento.

Descripción Detallada de la Invención De conformidad con la presente invención, un proceso para la preparación de un polipéptido recombinante comprende el cultivo de células CHO y la expresión del polipéptido recombinante, en donde la temperatura y el pH son cambiados durante el proceso. La presente invención busca mejorar el proceso de la producción a gran escala de polipéptidos en el cultivo de células CHO, mediante la adaptación dinámica de las condiciones del cultivo celular durante el transcurso del cultivo, incluyendo cambios en la temperatura y el pH.

El término "producción a gran escala" de polipéptidos, se refiere a las cantidades típicamente requeridas para la producción industrial de polipéptidos recombinantes utilizados para la preparación de productos biofarmacéuticos terapéuticamente activos. Los cultivos celulares con volúmenes de medios de cultivo celular de al menos 500 L, o al menos 1,000 L, o alternativamente al menos 5,000 L, o incluso volúmenes mayores, típicamente representan aplicaciones de producción a gran escala.

El término "medio de cultivo celular" tal como se utiliza en la presente, se refiere a una solución acuosa de nutrientes que pueda ser utilizada para hacer crecer células durante un periodo prolongado de tiempo. Típicamente, los medios de cultivo celular incluyen los siguientes componentes: una fuente de energía, la cual generalmente será un compuesto carbohidrato, de preferencia glucosa, aminoácidos, de preferencia el conjunto básico de aminoácidos, incluyendo todos los aminoácidos esenciales, vitaminas y/u otros compuestos orgánicos que son requeridos a concentraciones bajas, ácidos grasos libres, y compuestos inorgánicos, incluyendo elementos traza, sales inorgánicas, compuestos amortiguadores y nucleósidos y bases.

El uso de los medios de cultivo celular en el campo de la industria farmacéutica, por ejemplo para la producción de polipéptidos recombinantes terapéuticamente activos, generalmente no permite el uso de ningún material de origen biológico, debido a aspectos de seguridad y contaminación. Por lo tanto, el medio de cultivo celular de conformidad con la presente invención, de preferencia es un medio libre de suero y/o libre de proteínas. El término "libre de suero y/o libre de proteínas" representa un medio químicamente definido en su totalidad, que no contiene aditivos de ninguna fuente animal, tales como hidrolizados de tejidos, por ejemplo suero fetal bovino o similares. Además, de preferencia no se agregan proteínas, especialmente factores de crecimiento tales como la insulina, transferrina o similares, al cultivo celular, de conformidad con la presente invención. Preferiblemente, el medio de cultivo celular de conformidad con la presente invención, tampoco es suplementado con una fuente de proteína hidrolizada tal como peptona de soya, trigo o arroz, o hidrolizado de levadura o similares.

El término "cambio de temperatura" tal como se utiliza en la presente, se refiere a un cambio en la temperatura del cultivo en un biorreactor/recipiente de cultivo, alterando activamente el punto de ajuste de la temperatura a un valor más bajo. La temperatura primero es controlada y estabilizada a una temperatura definida durante un periodo de tiempo, y después el cambio en el punto de ajuste entonces es estabilizado a otra temperatura definida durante un periodo de tiempo. El cambio de temperatura no se refiere a pequeñas fluctuaciones espontáneas de temperatura en el cultivo.

El término "cambio del pH" tal como se utiliza en la presente, se refiere a un cambio en el pH del cultivo en un biorreactor/recipiente de cultivo, alterando activamente el punto de ajuste del pH a un valor más bajo o más alto, o permitiendo que ocurra un cambio del pH entre el límite de pH más alto y más bajo.

Dependiendo del tamaño del reci piente/biorreactor de cultivo y el volumen del cultivo, el cambio en el parámetro respectivo tal como se mide en el medio, puede tomar de unos minutos hasta varias horas.

El pH puede ser cambiado de dos diferentes formas, mediante un enfoque activo y/o pasivo, como se describe con más detalle en lo sucesivo.

El término "cambio activo" en el pH, se define por un cambio en el punto de ajuste del pH a un nuevo valor. En una modalidad preferida de la invención, el cambio activo es inducido aplicando cambio de pH respectivo y agregando el o los agentes reguladores conocidos por un técnico en la materia.

El término "cambio pasivo", indica que durante un cambio pasivo en el pH, a las células por sí mismas se les permite cambiar el pH del medio, mediante la acumulación de productos metabólicos, siguiendo así un perfil de pH metabólico específico del cultivo celular dentro de un rango de pH predefinido. En una modalidad del proceso, esto se logra definiendo un punto de ajuste de pH y una banda inactiva, en donde se permite que cambie el pH. En contraste con el cambio activo, el cambio pasivo o modificación del pH no es inducido agregando los respectivos agentes de cambio de pH.

Se agregan agentes reguladores de pH a los cultivos, con el fin de mantener el pH a un punto de ajuste específico, o para cambiar el pH durante una modificación de pH. Los agentes reguladores de pH típicos utilizados para los propósitos del cultivo celular incluyen bases líquidas o soluciones ácidas tales como NaOH o HCI. Estos agentes reguladores de pH se agregan a los medios en el recipiente/biorreactor de cultivo. Alternativamente, el medio de cultivo celular puede ser gasificado con C02, para ajusfar el pH.

De conformidad con un primer aspecto de la invención, se describe un proceso para la preparación de un polipéptido recombinante que comprende el cultivo de células CHO, y la expresión del polipéptido recombinante, en donde la temperatura y el pH se cambian durante el proceso. Más particularmente, un cambio de una primera temperatura más elevada a una segunda temperatura más baja ocurre después de que las células se hacen crecer primero y son mantenidas durante al menos tres días, alternativamente al menos 4 días, o al menos 5 días a una primera temperatura. Esta segunda temperatura más baja es de aproximadamente 1 a aproximadamente 8°C meno que la primera temperatura. En otra modalidad de la invención, el cambio de temperatura puede ser entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5°C, en algunas aplicaciones es de aproximadamente 4°C o aproximadamente 3.5°C. Esta segunda temperatura entonces es mantenida durante al menos dos días. Además del cambio en la temperatura, también se cambia el pH de un primer a un segundo pH.

Los parámetros exactos con relación al cambio en la temperatura y el pH se determinan de antemano y se adaptan basándose en las necesidades de la línea celular que ha sido transfectada con una o más construcciones génicas particulares, que codifican el polipéptido respectivo que es producido. Alternativamente, las necesidades se pueden satisfacer dependiendo de los parámetros metabólicos que son determinados durante el cultivo para la producción a gran escala en un biorreactor.

Un cambio de temperatura de una temperatura más elevada a una temperatura más baja, es útil debido a que la primera temperatura es óptima para el crecimiento celular, en tanto que la temperatura más baja reduce el índice de muerte celular. Una reducción de temperatura, por lo tanto, permitirá un mantenimiento más prolongado de una alta densidad de células viables. La productividad específica de células del polipéptido de interés con respecto a esta reducción de temperatura, generalmente no se reduce drásticamente con respecto a la temperatura inicial, algunas veces la productividad específica de células, puede ser la misma o algunas veces incluso superior. Un mantenimiento más prolongado de la alta densidad de células viables puede además proporcionar la ventaja de minimizar la formación de un producto con calidad inadecuada. La combinación de estos factores permite una alta productividad volumétrica y el logro de títulos altos del producto de interés de calidad adecuada al momento de la cosecha. En una modalidad, la primera temperatura se encuentra en el rango de entre aproximadamente 33°C y aproximadamente 38°C. En otro ejemplo, la primera temperatura se encuentra entre aproximadamente 36°C a aproximadamente 38°C. La segunda temperatura alcanzada después del cambio de temperatura, puede estar en el rango de entre aproximadamente 30 a aproximadamente 37°C, o entre aproximadamente 32 a aproximadamente 34°C, o alternativamente entre aproximadamente 30 a aproximadamente 32°C.

El tiempo del cambio de temperatura es importante para maximizar la productividad. Si el cambio de temperatura se lleva a cabo demasiado temprano, no se alcanzará una alta densidad de células, o tomará más tiempo en alcanzarse. Si el cambio de temperatura se realiza demasiado tarde, no se podrá prevenir de manera efectiva una declinación en la densidad de células viables. De preferencia, el tiempo del cambio de temperatura se define en días después de la inoculación del biorreactor utilizado para la producción a gran escala de los polipéptidos recombinantes. En otra modalidad de la invención, el tiempo puede definirse por la densidad celular, la cual es alcanzada en el biorreactor de producción a gran escala. Por ejemplo, el cambio de temperatura se inicia durante la fase de crecimiento lineal o logarítmica de las células, o cuando se alcanza del 40 al 90% de la densidad celular máxima. Una densidad celular dependiente del punto de ajuste, se puede expresar en términos relativos (% de densidad celular máxima que puede ser alcanzada) o en términos absolutos (células viables/mL). En un ejemplo específico, la densidad celular se selecciona para que sea de entre 60 a 90%.

El tiempo entre la inoculación del biorreactor/recipiente de crecimiento y el cambio de temperatura puede estar en el rango de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 14 días, dependiendo del biorreactor/recipiente de crecimiento específico y la línea celular utilizada. Alternativamente, el cambio se presenta entre los días 3 a 8. Como alternativa a un criterio único como se señaló anteriormente, también se puede ajustar un criterio dual, combinando dos de las variables antes mencionadas, de tal forma que las condiciones seleccionadas concernientes al tiempo y/o densidad celular deban cumplirse.

Si es necesario para el crecimiento y producción óptimos, también se puede utilizar más de una modificación de temperatura, por ejemplo al menos 2 modificaciones, cada uno consistiendo de un cambio de temperatura de al menos aproximadamente 1°C, alternativamente al menos aproximadamente 2°C, en donde cada temperatura es mantenida durante al menos un día. Así, las temperaturas pueden incluso ser reducidas adicionalmente y se puede seguir un perfil de temperatura más complejo.

De conformidad con la invención, las células se hacen crecer a un primer valor de pH, antes del cambio dé pH durante al menos 2 días, alternativamente durante al menos 3 días, por ejemplo durante al menos 4 días o incluso durante al menos 5 días. El pH para los primeros días después de iniciar el cultivo, se selecciona para que sea favorable para la expansión rápida de la densidad celular en el biorreactor. Durante este tiempo, el pH del biorreactor es controlado a un cierto punto de ajuste que sea óptimo para el crecimiento celular. Una vez que se ha alcanzado cierta densidad celular, es ventajoso modificar el pH del cultivo. El pH es cambiado después de este primer periodo de tiempo a un segundo valor de pH, el cual se es entre aproximadamente 0.05-1 unidades de pH más bajo que el primer pH. Las células se hacen crecer a dicho segundo pH durante al menos 2 días. En algunas modalidades de la presente invención, el segundo valor de pH puede ser de aproximadamente 0.15 a aproximadamente 1 unidad de pH más bajo que el primer pH. Este cambio en el pH generalmente se logra cambiando el punto de ajuste del pH del biorreactor/recipiente de cultivo. Se selecciona el segundo valor de pH para reducir la muerte celular (apoptosis) y permitir mantener índices de producción celular altamente específicos de polipéptidos con una calidad adecuada. Como consecuencia, en una primera modalidad, el tiempo del cambio del pH se define en días después de la inoculación del biorreactor que se utiliza para la producción a gran escala del polipéptido recombinante. En una segunda modalidad, el tiempo se puede definir mediante la densidad celular que se alcanza en el biorreactor a gran escala. De conformidad con una alternativa adicional, el tiempo también puede depender de los parámetros metabólicos específicos que son medidos durante el cultivo en el medio de cultivo celular. En un ejemplo no limitante, el tiempo puede depender de la concentración de lactato. También, se pueden utilizar parámetros no directos que reflejen el estado metabólico del cultivo, tal como por ejemplo la dosificación de CO2 requerida o el control de ácido por tiempo, para mantener el pH al punto de ajuste del pH más elevado, o la dosificación requerida de NaOH, o controlando el agente cáustico para mantener el pH a un punto de ajuste de pH más bajo. En vez de utilizar sólo un criterio para el cambio de pH, alternativamente, se puede establecer un criterio combinado, al combinar parámetros tales como por ejemplo días después de la inoculación y la densidad celular.

Los beneficios de la estrategia del cambio de pH también involucran el hecho de que las concentraciones de bióxido de carbono disuelto y la adición de una base, se puede reducir durante el transcurso del cultivo, lo cual, por consiguiente, evita sus efectos negativos. Al inicio del cultivo, es ventajoso tener un valor de pH más elevado (por ejemplo de 7.0) en el recipiente o biorreactor de cultivo, ya que un valor de pH más bajo (por ejemplo de 6.8), requeriría de concentraciones más elevadas de bióxido de carbono, con el fin de mantener el pH. Estas altas concentraciones de bióxido de carbono, sin embargo, pueden causar efectos negativos sobre las células, y reducir la tasa de crecimiento. En contraste, en las últimas etapas del cultivo, mantener un pH elevado (por ejemplo de 7.0), requiere más adición de base, que mantener un pH bajo (por ejemplo de 6.8). Esto se debe a que se forma ácido láctico y la acidez resultante debe ser compensada mediante la adición de una base. Mientras más alto el punto de ajuste del pH, mayor será la cantidad de base requerida. La adición de una base incrementa la osmolaridad del cultivo, lo cual puede ser desfavorable para el crecimiento y mantenimiento de una alta densidad de células viables.

Los beneficios potenciales de la estrategia del cambio de pH, también pueden ser descritos a partir de la perspectiva de minimizar la formación de ácido láctico. Las células CHO generalmente producen menos ácido láctico a valores de pH más bajos (por ejemplo de 6.8) que a valores más elevados (por ejemplo de 7.0). Menos producción de ácido láctico da como resultado el agregar menos base, lo cual es benéfico tal como se describió anteriormente.

En una modalidad, el primer pH se selecciona para que se encuentre en el rango de entre pH 6.8 y 7.5. En otra modalidad, el primer pH se selecciona para que se encuentre en el rango de entre pH 6.8 y 7.2. En una modalidad adicional, se selecciona el primer pH para que sea como máximo pH 7, o alternativamente por debajo de pH 7. El segundo valor de pH que se alcanza después del cambio de pH, se encuentra en el rango de entre pH 6.0 y pH 7.5, o entre pH 6.5 y 6.8.

El tiempo relativo de temperatura y cambio de pH se selecciona con el fin de alcanzar el resultado más óptimo. El tiempo óptimo de la temperatura y el cambio de pH se seleccionan sobre una base especifica del proceso y puede depender del estado de crecimiento o estado metabólico del cultivo. El cambio de temperatura en principio puede ser implementado en un momento del cultivo, independiente del momento de cambiar el pH. En una modalidad de la invención, el cambio de temperatura puede ocurrir antes o al mismo tiempo que el cambio de pH. En una modalidad de la invención, el cambio de temperatura ocurre antes del cambio de pH. Por ejemplo, el cambio de temperatura se puede iniciar entre 1 a 5 días antes que ocurra el cambio en el pH. En otra segunda modalidad de la invención, el cambio de temperatura se inicia al mismo tiempo que el cambio de pH. El término "al mismo tiempo", en la presente se refiere a un cambio simultáneo de ambos parámetros respectivos de un primer valor a un segundo valor. Tales cambios simultáneos pueden presentarse cuando el punto de ajuste de la temperatura y el punto de ajuste del pH han sido cambiados, y ambos parámetros no hayan alcanzado aún su segundo valor estable. Alternativamente, tal escenario puede ocurrir cuando el punto de. ajuste en la temperatura se cambia durante la fase de un cambio de pH pasivo. Esto ocurre en el caso de una regulación del pH mediante un punto de ajuste y una banda inactiva que definan un límite de pH más elevado y más bajo (también véase más adelante). En una modalidad adicional de la presente invención, el cambio de temperatura puede ocurrir después del cambio de pH. Por ejemplo, el cambio de temperatura se puede iniciar entre 1 a 5 días después del cambio de pH.

En un aspecto adicional de la presente invención, el pH es cambiado activa o pasivamente entre dicho primer a dicho segundo valor de pH. Existe un número de posibles formas para controlar el pH de los cultivos y para implementar un cambio de pH. En un aspecto de la invención, el pH se modifica activamente de un primer a un segundo valor de pH, cambiando el punto de ajuste del pH (sin una banda inactiva) del controlador de pH a un nuevo valor.

Como resultado, el cambio del primer valor de pH al segundo valor de pH es casi inmediato (cambio en un paso) en el cultivo. La Fig. 1 ilustra tal ¡mplementación de modificación en un paso del cambio de pH, con un cambio de pH de 7.00 a 6.80, en este ejemplo particular. En esta ¡mplementación de la invención, el pH es mantenido primero a un valor de pH más elevado, dosificando agentes reguladores del pH de conformidad con ello (por ejemplo C02 o NaOH), y posteriormente se cambia a un valor más bajo, cambiando activamente el punto de ajuste (sin una banda inactiva). El pH del punto de ajuste más bajo se puede alcanzar ya sea dosificando/añadiendo activamente un agente acidificante al cultivo, dando como resultado un cambio rápido, u omitiendo un agente que mantenga el pH en el valor del primer pH más básico. Basándose en el tamaño del biorreactor y el método anteriormente mencionado de influenciar el pH, el cambio de pH se puede concluir desde en algunos minutos hasta en 24 horas.

En un aspecto adicional de la invención, el pH se deja modificar pasivamente (variación) de un primer a un segundo valor de pH que corresponde a un límite de pH superior y un límite de pH inferior y así seguir un perfil metabólico específico de cultivo celular. Como resultado, el cambio del primer valor de pH al segundo valor de pH es gradual. Esta forma alternativa de controlar el pH del medio de cultivo celular y la implementación de un cambio de pH, se logra programando el controlador de pH del biorreactor con un punto de ajuste y una banda inactiva. Esto define un rango de pH permisible para el proceso, en donde el controlador de pH no participa. Por ejemplo, un punto de ajuste de pH de 6.90 con una banda inactiva con unidades de pH de 0.10, definirá el pH de 7.00 como el límite de pH más elevado, y el pH de 6.80 como el límite de pH inferior. En un biorreactor de producción de cultivo celular, el pH típicamente estará en el límite alto al inicio del cultivo (primeros días), en donde el controlador previene un aumento del pH que surge de la dosificación de bióxido de carbono al cultivo. Debido a la acumulación progresiva de ácido láctico producido por las células, el pH eventualmente disminuirá continuamente de por ejemplo 7.00 a 6.80, típicamente en unas pocas horas. Una vez que se alcanza el límite de pH inferior de por ejemplo 6.80, el controlador previene la disminución del pH más allá de ese valor, dosificando una solución básica al cultivo. Basándose en el tamaño del biorreactor, la línea de células específica, la densidad celular o las condiciones de los medios, puede ocurrir el cambio gradual del pH en unas pocas horas o llevarse hasta un día.

En un aspecto adicional de la invención, el segundo pH del cultivo es mantenido activamente después del cambio de pH al segundo pH, durante el tiempo de cultivo restante hasta la cosecha. Esto se logra cambiando el punto de ajuste del pH a dicho segundo valor de pH, y dosificando los agentes reguladores de pH de conformidad con ello.

En un aspecto adicional de la invención, el primer cambio de pH es seguido por un segundo cambio. El segundo cambio de pH ocurre al menos 1 día después de que el primer y tercer valor de pH que se alcanza es al menos 0.05 unidades de pH mayor que el segundo pH.

En un aspecto adicional de la invención, el segundo cambio de pH también puede ocurrir de manera activa o pasiva, para alcanzar dicho tercer valor de pH. En la primera modalidad, esto se puede realizar cambiando de manera activa el punto de ajuste de pH, como ya se señaló para el primer cambio de pH (véase lo anterior). El momento del segundo cambio de pH se puede definir en días después del primer cambio de pH y/o de nuevo hacerlo dependiendo de los parámetros metabólicos, tal como por ejemplo la concentración de lactato. Tal cambio típicamente puede ocurrir entre 1 y 10 días después del primer cambio en el pH. Un cambio activo es iniciado cambiando el punto de ajuste del pH del cultivo. Los agentes reguladores de pH serán dosificados de conformidad con ello.

En la segunda modalidad, el pH también se puede dejar que cambie de forma pasiva y seguir su perfil de pH metabólico. Esto puede ser implementado, por ejemplo, definiendo un límite de pH inferior y un límite de pH superior, como ya se señaló anteriormente. El límite de pH superior, en este caso, puede corresponder al mismo límite de pH superior definido para el primer cambio de pH, o puede ser alterado a un nuevo valor más bajo o más alto. De preferencia, tal límite de pH más bajo y más alto puede lograrse programando el controlador de pH del biorreactor con un punto de ajuste y una banda inactiva. Tal cambio pasivo en el pH puede ocurrir por remetabolización de ácido láctico de manera tardía en el cultivo por las células, lo cual causa que el pH se incremente de nuevo a los valores anteriormente mencionados de dicho límite más bajo del rango de pH. En algunos ejemplos, es posible que el pH alcance de nuevo el límite superior del rango, en otros casos también puede permanecer por debajo de ese límite. La magnitud del segundo cambio de pH puede incluir valores entre 0.05 y 1 unidades de pH. La duración de tal cambio de pH pasivo no se define con exactitud, ya que la tasa de modificación/cambio, depende de la actividad metabólica y la remetabolización del ácido láctico por las células.

Típicamente, se puede llevar de medio hasta 2 días para alcanzar el límite de pH superior, pero en el caso de un cambio pasivo, el pH también puede permanecer por debajo del umbral superior definido hasta el final del cultivo.

La elección de la estrategia a implementar, dependerá de diversos factores, tales como la sensibilidad de las células al C02 y el pH óptimo para la formación del producto. Se pueden obtener perfiles de pH diferentes, definiendo dos o más puntos de ajuste específicos durante el transcurso del cultivo, o simplemente definiendo un punto de ajuste y una banda inactiva (lo cual opcionalmente también podría ser cambiado durante el cultivo). Diferentes perfiles de pH que se pueden obtener ajustando un punto de ajuste y una banda inactiva, se ilustran en la Fig. 2, para un punto de ajuste de pH de 6.90 con una banda inactiva de 0.10 como valores de ejemplo.

En un aspecto adicional de la invención, la cantidad total del polipéptido producido por un proceso que comprende una temperatura y uno o más cambios de pH, es mayor que sin la combinación de una modificación de temperatura con uno o más cambios de pH. El combinar al menos una modificación de temperatura con al menos una modificación de pH, que se adapten en términos de tiempo y tamaño a las necesidades de la línea de células transfectadas particular, ha dado como resultado un rendimiento mucho mejor del producto.

En todavía un aspecto más de la invención, un proceso que comprende una temperatura y uno o más cambios de pH, tiene el potencial de dar como resultado un producto de calidad mejorada en comparación con la calidad obtenida, sin combinar el cambio de temperatura con una o más modificaciones en el pH. Una posible razón para el efecto benéfico de una modificación de pH a valores de pH más bajos en el cultivo durante la fase de producción, puede ser la siguiente: que el amoniaco típicamente se acumule en el medio de cultivo celular en el transcurso del tiempo de cultivo y se sepa que potencialmente afecta la glucosilación del producto, con el posible resultado de una disminución en la calidad del producto. Se supone que el amoniaco entra a las células en forma de NH3, en donde éste puede influenciar el pH intracelular capturando iones H30+. El incremento resultante en el pH intracelular puede afectar la glucosilación. Modificar el pH de un cultivo a un valor más bajo, disminuirá la concentración de NH3 extracelular a través de un incremento en la protonación de NH3 a NH4\ al cual las células son impermeables.

El proceso de cultivo celular que comprende una temperatura y uno o más cambios de pH de conformidad con la presente invención, se puede llevar a cabo utilizando varios medios de cultivo celular. Los medios de cultivo celular comúnmente utilizados que se pueden emplear son, por ejemplo, D-MEM (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco), D-MEM/F-12, Mema, Medio de Fischer, RPMI 1640BME, BGJb, pero no se limitan a estos ejemplos. Estos medios además pueden ser suplementados con componentes adicionales tales como por ejemplo nutrientes, vitaminas o carbohidratos.

Los medios adecuados que principalmente son optimizados para el crecimiento celular, de preferencia contienen concentraciones iniciales de aminoácidos, de conformidad con los siguientes rangos.

Los medios que contienen aminoácidos como los definidos en la tabla anterior, pueden utilizarse de manera favorable en los procesos mejorados de cultivo celular, de conformidad con la presente invención.

Un aspecto adicional de la invención incluye el uso de medios de producción diseñados para la producción a gran escala de polipéptidos recombinantes. Estos medios de producción opcionalmente pueden contener cantidades incrementadas de componentes, por ejemplo aminoácidos. En una modalidad preferida de la invención, se utiliza un contenido de aminoácidos inicial en estos medios en un rango de entre aproximadamente 40 mM y aproximadamente 100 mM, alternativamente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 mmol/L. En una modalidad alternativa de la invención, tales medios de producción contienen concentraciones iniciales de aminoácidos de conformidad con los siguientes rangos.

Los medios de producción que contienen aminoácidos como los definidos en la tabla anterior, se pueden utilizar de manera favorable en los procesos mejorados de cultivo celular, de conformidad con la presente invención.

El cultivo de células se puede llevar a cabo en un cultivo adherente, por ejemplo en un cultivo en monocapa o de preferencia en un cultivo en suspensión.

El cultivo de células a gran escala se puede utilizar, por ejemplo, por los diversos procesos de fermentación establecidos en la biotecnología industrial. Se pueden aplicar procesos de cultivo celular continuos y discontinuos, empleando los medios de cultivo celular de conformidad con la presente invención. Otras tecnologías de reactor conocidas, por ejemplo las tecnologías de perfusión o similares, también se pueden utilizar. Los procesos por lotes son una modalidad preferida.

El cultivo celular por lotes incluye el cultivo por lotes con alimentación, o el cultivo por lotes individuales. El término "cultivo celular por lotes con alimentación" se refiere al cultivo celular en el que las células de mamífero y el medio de cultivo celular son suplementados al recipiente de cultivo inicialmente, y se alimentan nutrientes adicionales de manera continua o en incrementos discretos, al medio de cultivo durante el proceso de cultivo, con o sin la cosecha periódica de células y/o producto antes de terminar el cultivo. El término "cultivo por lotes individuales", se refiere a un procedimiento en el cual todos los componentes del cultivo celular, incluyendo las células de mamífero y el medio de cultivo celular, son suministrados al recipiente de cultivo al inicio del proceso de cultivo.

En un aspecto adicional de la invención, la alimentación de los cultivos se realiza en un proceso por lotes con alimentación, cuya alimentación consiste de dos soluciones de nutrientes que se agregan al cultivo. Ambas soluciones nutrientes son agregadas al recipiente de cultivo ya sea basándose en un programa predeterminado para la línea de células en particular y el producto, o de conformidad con las necesidades metabólicas que son determinadas midiendo el consumo de por ejemplo glucosa o aminoácidos en el recipiente de cultivo. Ambas soluciones nutrientes se pueden agregar de manera independiente ya sea como una alimentación en bolo o de manera continua. Típicamente las soluciones de alimentación nutrientes comprenden aminoácidos, al menos un carbohidrato como fuente de energía, elementos traza, vitaminas o iones específicos. Es particularmente ventajoso utilizar soluciones de alimentación concentradas, con el fin de evitar un gran incremento en el volumen y la dilución del producto. En algunas modalidades, también puede ser útil tener al menos dos diferentes soluciones de alimentación. Esto permite la dosificación independiente de dos o más diferentes grupos de nutrientes y componentes para las células, y así obtener un mejor ajuste de las condiciones de alimentación relacionadas con el suministro óptimo de ciertos nutrientes.

En otra modalidad de la presente invención, una de las dos soluciones de alimentación agregadas al medio de cultivo celular, es una alimentación concentrada que comprende el dipéptido cistina y el aminoácido tirosina a concentraciones respectivas en el rango de aproximadamente 6.5 g/L y aproximadamente 8.0 g/L, y en el rango de aproximadamente 9 g/L y aproximadamente 11 g/L, en una solución acuosa a pH alcalino mayor de 10. En una modalidad particular, la solución de alimentación concentrada comprende el dipéptido cistina y el aminoácido tirosina, a concentraciones respectivas de 10.06 g/L de L-tirosina y 7.25 g/L de cistina, a un pH mayor de 10.

El medio de alimentación que comprende cistina y tirosina como el anteriormente descrito, puede ser agregado ya sea basándose en el consumo medido de los respectivos aminoácidos, o de acuerdo con un programa fijo, por ejemplo de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.8% en peso con respecto al peso inicial del medio de cultivo, por día, o a aproximadamente 0.4% en peso con respecto al peso inicial del medio de cultivo celular, por día.

En algunos ejemplos, la otra solución de alimentación contiene todos los demás aminoácidos que también están presentes en el medio básico, excepto tirosina y cistina. En algunos ejemplos, esta solución de alimentación adicional puede consistir de componentes selectos particulares, tales como aminoácidos o carbohidratos. En una modalidad adicional de la presente invención, este medio de alimentación concentrado de preferencia contiene aminoácidos selectos de conformidad con los siguientes rangos de concentración.

De preferencia, también se agregan carbohidratos tales como glucosa a este medio de alimentación concentrado, estando las concentraciones preferidas entre aproximadamente 1200 y aproximadamente 1400 mmol/L, o alternativamente entre aproximadamente 1300 y aproximadamente 1395 mmol/L.

El medio de alimentación tal como se acaba de describir, que de preferencia incluye un carbohidrato tal como glucosa, se puede agregar ya sea con base en el consumo medido de los respectivos aminoácidos, o de conformidad con un programa fijo, por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 4% en peso con respecto al peso inicial del medio de cultivo celular, por día, por ejemplo a aproximadamente 2% en peso con respecto al peso inicial del medio de cultivo celular, por día.

Los polipéptidos que se pueden producir a partir de los cultivos celulares y medios de cultivo celular de conformidad con la presente invención, no están limitados. Los polipéptidos pueden ser recombinantes o no recombinantes. El polipéptido puede ser homólogo a la célula huésped, o de preferencia, puede ser de origen exógeno. El término "polipéptido" tal como se utiliza en la presente, abarca moléculas comprendidas de una cadena de más de dos aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos; moléculas que contienen dos o más de tales cadenas; moléculas que comprenden una o más de tales cadenas, siendo adicionalmente modificadas, por ejemplo, por glucosilación. El término "pol i péptido" se pretende que abarque proteínas. Los polipéptidos de interés pueden ser de cualquier origen. Los polipéptidos preferidos de interés son de origen humano, y más preferiblemente, las proteínas de interés son proteínas terapéuticas.

La clase preferida de polipéptidos producidos por los cultivos celulares y los medios de cultivo celular de conformidad con la presente invención, son anticuerpos recombinantes.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), nanocuerpos, anticuerpos modificados, subunidades de anticuerpos, derivados de anticuerpos, anticuerpos artificiales, combinaciones de anticuerpos con proteínas y fragmentos de anticuerpo suficientemente grandes como para desplegar la actividad biológica deseada. Los anticuerpos monoclonales tal como se utilizan en la presente, pueden ser anticuerpos humanos.

Sin embargo, también se pueden producir polipéptidos diferentes de anticuerpos, utilizando los cultivos celulares y medios de cultivo celular de conformidad con la presente invención; por ejemplo, polipéptidos tales como proteínas transmembranales, receptores, hormonas, factores de crecimiento, proteasas, proteínas de coagulación y anticoagulantes, proteínas inhibidoras, interleucinas, factores de transporte, proteínas de fusión y similares.

Los productos obtenidos a partir de tales procesos de cultivo celular, se pueden emplear para la preparación de preparaciones farmacéuticas. Además, la o las proteínas de conformidad con la presente invención, se pueden administrar junto con otros componentes de agentes biológicamente activos, tales como tensoactivos, receptores, diluyentes c y vehículos farmacéuticamente aceptables.

La invención además se ilustra por los siguientes Ejemplos. Ejemplos En los Ejemplos que se describen a continuación, se utilizan los medios de cultivo celular químicamente definidos 1 y 2, que tienen la composición como se detalla en la siguiente Tabla 1. Los componentes individuales de estos medios de cultivo celular están disponibles en fuentes comerciales normales.

Tabla 1 La Tabla 2 que se presenta a continuación, muestra la composición de un medio de alimentación concentrado, que contiene L-tirosina y cistina. El medio de alimentación se puede agregar ya sea basándose en el consumo medido de los respectivos aminoácidos, o de acuerdo con un programa fijo, por ejemplo a razón de 0.4% en peso, por día.

Tabla 2 La Tabla 3 que se presenta a continuación, muestra la composición de un medio de alimentación concentrado de ejemplo. El medio de alimentación puede ser agregado ya sea basándose en el consumo medido de aminoácidos, o de acuerdo con un programa fijo, por ejemplo a razón de 2% en peso por día.

Tabla 3 Para los experimentos de los ejemplos, se utilizó una línea de células CHO progenitora derivada de la línea celular dhfr (+) CHO-K1, ATCC CCL-61 (Kao et al., Genetics, 1967, 55, 513-524; Kao etal., PNAS, 1968, 60, 1275-1281; Puck etal., J. Exp. Med., 1958, 108, 945-959), mediante la adaptación a las condiciones de medio de cultivo libre de suero, libre de proteína. Tres alícuotas de esta línea celular progenitora fueron transfectadas para expresar tres diferentes anticuerpos monoclonales, el mAb1, mAb2 y mAb3 respectivamente. Ejemplo 1 En el Ejemplo 1, dos cultivos en matraces en agitación que contenían el medio 1 fueron inoculados en paralelo con una clona de células CHO productora de mAb1. Los cultivos en matraces en agitación se incubaron en una incubadora de bióxido de carbono a 37°C. En el día 3, un matraz en agitación fue transferido a una incubadora de bióxido de carbono puesta a 33°C. Ambos matraces en agitación fueron alimentados de manera similar con dos soluciones de alimentación. La alimentación fue suplementada de conformidad con un programa fijo, agregando 0.4% de la primera solución de alimentación (Tabla 2) y 2% de la segunda solución de alimentación (Tabla 3) al día, iniciando en el día 5 y terminando hasta el final del cultivo.

El cambio de temperatura a 33°C, hace posible un mantenimiento más prolongado de la densidad de células viables y de la viabilidad del cultivo con el tiempo (Figs. 3 y 4), y también alcanzar un título de producto más alto (Fig. 5), en comparación con el cultivo que se mantuvo a 37°C durante todo el transcurso del experimento. Este ejemplo ilustra el beneficio de implementar un cambio de temperatura a 33°C durante un proceso de producción de cultivo celular, basándose en una línea celular CHO.

Ejemplo 2 En este ejemplo, un biorreactor de 300 L que contenía el medio 2, fue inoculado con una clona de células CHO productora de mAb2. En el día 5, la temperatura del biorreactor fue cambiada de 36.5°C a 33°C. El punto de pH establecido es 6.90 y la banda inactiva es 0.10. Como resultado, el cultivo inicia a pH 7.00, el pH disminuye a 6.80 entre el día 2 y el día 4, y después progresivamente regresa a 7.00, debido al consumo de ácido láctico por las células (Fig. 6). La modificación a pH 6.80 hace posible reducir la adición de una base, en comparación con un caso en el que se mantuviera un pH constante de 7.00. El regreso a pH 7.00 hace posible reducir la concentración de C02 en el medio, en comparación con un caso en el que el pH se dejara a 6.80 después de la primera modificación. En este proceso que combina modificaciones de temperatura y pH, se alcanza una alta densidad de células viables y se minimiza la disminución de la densidad de células viables con respecto al tiempo (Fig. 7), lo cual permite alcanzar en el día 14 un alto título (Fig. 8) del producto con una calidad adecuada. La alimentación se aplicó de manera similar que en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 En este ejemplo, se llevaron a cabo tres procesos de cultivo de lotes con alimentación independientes en un biorreactor de vidrio, utilizando una clona de células CHO productora de mAb3 y el medio 2 (véase la Tabla 1). El programa de alimentación del Ejemplo 1 se aplicó de nuevo. Dos cultivos independientes incluyen una modificación de temperatura sin un cambio de pH adicional; es decir, el pH en ambos cultivos celulares es mantenido a un valor de pH de 7.0 durante todo el tiempo del cultivo. El tercer cultivo experimental difiere de los primeros dos experimentos por un cambio de pH adicional de pH 7.0 a pH 6.8, aplicado en el día 3 del cultivo. El cambio de temperatura llevado a cabo en los tres experimentos ocurrió a una densidad celular de 4-6 x 106 células viables/mL, respectivamente. En la Fig. 9, la concentración de mAb3 obtenida como el producto de expresión de la clona de células CHO correspondiente, se ilustra como función de la integral de células viables (ICV), la cual es una integral de todas las células vivas calculada a partir de la concentración de células/mL de la DCV en un mililitro de cultivo celular. La inclinación y/x es la productividad específica de las células qp [pg/CV/h], que indica la cantidad de producto de mAB3 recombinante que una célula viva por sí sola puede producir en una hora. En consecuencia, la Fig. 9 ilustra un incremento de la productividad específica de células en un cultivo celular cuando se somete a un cambio adicional de pH. Debido al cambio adicional de pH, las células crecen más lentamente, pero muestran un incremento en la productividad.

Claims (18)

Reivindicaciones

1. Un proceso para la producción de un polipéptido recombinante, comprende el cultivo de células CHO en un medio, bajo condiciones que comprendan al menos un cambio de temperatura y al menos un cambio de pH, y la expresión del polipéptido recombinante, caracterizado porque - las células se hacen crecer a una primer temperatura durante al menos 3 días, y la temperatura posteriormente se cambia a una segunda temperatura, la cual es entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8°C más baja que la primer temperatura, y las células son mantenidas en dicha segunda temperatura durante un periodo de al menos otros 2 días; las células se hacen crecer a un primer valor de pH durante al menos 2 días, y el pH posteriormente es cambiado a un segundo valor de pH, el cual es entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 1 unidades de pH más bajo que el primer pH, y las células se hacen crecer a dicho segundo pH durante al menos 1 día.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el pH es cambiado de manera activa entre el primer y el segundo valor de pH.

3. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el pH es cambiado de manera pasiva entre el primero y el segundo valores de pH.

4. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera temperatura se encuentra en el rango de entre aproximadamente 33°C y aproximadamente 38°C.

5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la segunda temperatura se encuentra en el rango de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 37°C.

6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el primer valor de pH se encuentra en el rango de entre aproximadamente pH 6.8 y aproximadamente pH 7.5.

7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el segundo valor de pH se encuentra en el rango de entre aproximadamente pH 6.0 y aproximadamente pH 7.1.

8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el segundo pH es mantenido de manera activa hasta el término del cultivo.

9. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el primer cambio de pH es seguido por un segundo cambio de pH, después de al menos 1 día, en donde el tercer valor de pH es de aproximadamente 0.05 unidades de pH a aproximadamente 1 unidad de pH más alto que el segundo valor de pH.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el pH se cambia de manera activa del segundo al tercero valor de pH.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el pH se cambia de manera pasiva del segundo al tercero valor de pH.

12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medio está libre de proteína y libre de suero, y está caracterizado por un contenido total de aminoácidos de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100 mM.

13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo se realiza en una modalidad por lotes con alimentación que comprende alimentar al menos dos soluciones nutrientes que son agregadas al cultivo.

14. El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque una de las soluciones de alimentación agregada al medio de cultivo, es una alimentación que comprende el dipéptido cistina y el aminoácido tirosina.

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la alimentación comprende el dipéptido cistina y el aminoácido tirosina, a concentraciones respectivas en el rango de aproximadamente 6.5 g/L y aproximadamente 8.0 g/L, y en el rango de aproximadamente 9 g/L y aproximadamente 11 g/L, en una solución acuosa a pH básico por arriba de 10.

16. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15, caracterizado porque la cantidad de la solución de alimentación que comprende cistina y tirosina, se agrega al medio de cultivo en el rango de aproximadamente 0.2 y aproximadamente 0.8% en peso con respecto al peso del medio de cultivo inicial por día.

17. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido producido es glucosilado.

18. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. RESU EN La presente invención se refiere a un proceso de cultivo celular para la producción de polipéptidos en células CHO de mamífero, caracterizado por una o más modificaciones de temperatura y pH, los cuales se ajustan con respecto al tiempo y magnitud, para reducir la muerte celular, incrementar el rendimiento de producto y mejorar la calidad del mismo.