MX2012011272A - Preparacion derivada de un cultivo in vitro de celulas de argan no evocadas desdiferenciadas, su uso para el tratamiento del envejecimiento, la inflamacion y curacion de la piel, y metodo para su obtencion. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una preparación derivada de un cultivo in vitro de células de argán no evocadas, desdiferenciadas.

Description

PREPARACIÓN DERIVADA DE UN CULTIVO IN VITRO DE CÉLULAS DE ARGÁN NO EVOCADAS DESDIFERENCIADAS, SU USO PARA EL TRATAMIENTO DEL ENVEJECIMIENTO. LA INFLAMACIÓN Y CURACIÓN DE LA PIEL. Y MÉTODO PARA SU OBTENCIÓN El propósito de esta invención es una preparación derivada de un cultivo in vitro de células de argán no evocadas desdiferenciadas, una composición cosmética o dermatológica que comprende dicha preparación, y sus usos para el tratamiento del envejecimiento, la inflamación y curación de la piel.

El argán es un árbol que pertenece a la familia botánica de las Sapotáceas, y su denominación científica es Argania spinosa (L.) Scelles.

Su hábitat es similar al del árbol de olivo, y posee un tronco corto y retorcido. La madera es muy dura y densa; las ramas son muy espinosas, y tienen pequeñas hojas lanceoladas, alternadas, cortas (de alrededor de 2 cm de longitud) y angostas, que, a menudo, se agrupan en racimos. Las hojas son siempre verdes, aunque mueren y se caen en tiempos de sequía severa. Las flores son hermafroditas y pentámeras, se agrupan en glomérulos, y se abren en mayo y junio. Tienen un color amarillo verdoso.

El árbol de argán puede producir frutos a partir de los 5 años de edad. El fruto es una baya ovalada sésil, de color amarillo, de aproximadamente 4 a 5 cm de largo. Se compone de la pulpa que rodea una nuez que contiene 2 a 3 semillas planas pegadas entre sí, donde cada una de ellas encierra una almendra rica en aceite.

El argán es endémico de Marruecos, y se ubica principalmente en el sudoeste de Marruecos, entre Essaouira y Agadir. El bosque de arganes cubre aproximadamente 830.000 ha.

Las poblaciones marroquíes explotaron el argán, en primer lugar, por su madera particularmente dura como un suministro de combustible. El otro uso tradicional principal es el aceite, extraído inícialmente en forma manual, si bien, en la actualidad, es extraído con una prensa. El primer uso de este aceite es en los alimentos; otra aplicación importante ahora es en la cosmética. La pulpa y la torta residual que derivan de la producción de este aceite normalmente se usan para alimento animal. *¦ Se han desarrollado muchos productos cosmetológicos a partir del argán. Ha habido varias patentes de invención para aceite derivado de las semillas, por ejemplo, aceite obtenido mediante solvente (Patente Fr 2.553.788), aceite de argán enriquecido con materia no saponificable (Patente Fr 2.724.663).

Se han patentado además sustancias diferentes del aceite, por ejemplo, péptidos derivados de la torta de semillas luego de la extracción del aceite; una combinación de aceite y péptidos de la torta para el tratamiento de problemas relacionados con el envejecimiento de la piel (Patente Fr 2.756.183). Existe también una patente de invención para las hojas de argán, las proteínas y saponinas de la torta, a decir, extractos de hojas (Patente EP 1.213.025), proteínas de la torta (Patente EP 1.213.024), saponinas de la torta (Patente EP 1.430.900). Más recientemente, se presentó la solicitud de patente EP 1.968.536, que revela el uso de un extracto de pulpa del fruto de argán en cosméticos contra el envejecimiento.

Por lo tanto, la composición del árbol de argán entero es interesante para uso dermatológico y cosmético.

El argán es una importante planta de recursos, en primer lugar, desde el punto de vista ecológico, debido a que es una planta del "ecosistema". Se adapta perfectamente a áreas con sequías, protege el suelo contra la erosión del agua y el viento y, en consecuencia, evita el avance del desierto en Marruecos. Asimismo, es importante desde el punto de vista económico, ya que es un árbol con múltiples usos.

El argán es el cultivo más importante de Marruecos. En consecuencia, el bosque de arganes fue protegido por un dahir (decreto) publicado en 1925, que establecía que la nación posee los derechos superiores sobre el bosque de arganes, si bien las poblaciones locales tenían usufructo (de los frutos, la madera muerta y los cultivos de los árboles de argán). La UNESCO ha clasificado recientemente el bosque de arganes como una reserva de la biósfera.

Esta es la razón por la cual el uso de la madera o de las hojas del argán para la cosmética podría tener graves consecuencias sobre esta planta protegida.

Otro medio para la obtención de moléculas de interés de una planta es la preparación de cultivos de células desdiferenciadas, totipotenciales. El uso de células de plantas desdiferenciadas también puede evitar algunos problemas de industrialización hallados durante el desarrollo de productos cosméticos. Con el cultivo de células, la diferencia en la concentración de sustancias de interés entre las cosechas o los lotes de plantas diferentes desaparece. Además, es una técnica no destructiva relativamente fácil y económica. Finalmente, elimina la necesidad de extracción, ya que las células se presentan en un medio de cultivo, y los compuestos activos se presentan o bien en el medio de cultivo, o en el líquido intracelular. Por lo tanto, estos compuestos pueden obtenerse con la simple molienda.

La solicitud de patente WO 03077881 revela una composición para aplicación tópica que contiene por lo menos un homogenado de células de plantas evocadas y desdiferenciadas en un cultivo in vitro, de manera de sintetizar por lo menos una fitoalexina. El material de planta, preferentemente, deriva de la vid.

Por lo tanto, este documento revela la aplicación cosmética de células de plantas que podrían ser desdiferenciadas y evocadas, donde la evocación conduce a una cantidad suficiente de metabolitos secundarios de modo de permitir la actividad biológica en el uso tópico.

De manera sorprendente e inesperada, el solicitante ha demostrado que una preparación derivada de un cultivo in vitro de células de argán desdiferenciadas, aunque no evocadas, tiene buena actividad cosmética y dermatológica en los campos de antienvejecimiento, inflamación y curación.

Los resultados obtenidos muestran que, en el caso específico del argán, es posible otra aplicación de cultivos de células de argán (células no evocadas, en este caso), dentro del contexto mencionado con anterioridad.

Además, la obtención de la preparación revelada en esta invención puede eliminar la necesidad del paso de evocación, que es un paso industrialmente difícil y costoso; la evocación conduce a un rendimiento de biomasa mucho menor, debido al enlentecimiento del crecimiento celular.

La solicitud WO 03077881 menciona diversas maneras de efectuar esta evocación; por ejemplo, con radiación UV, durante 3 días; dióxido de carbono, durante 24 horas a 2 días; radiación UV y dióxido de carbono, durante 5 días.

El proceso realizado dentro del marco de esta invención consiste en la desdiferenciación celular de material de planta derivado de argán, y luego, el cultivo de las células en suspensión puede lograr con rapidez una biomasa fina, abundante, homogénea y estéril de esta planta. El cultivo de células hace posible la aplicación de vías para la biosíntesis de esta planta directamente en una escala celular.

Por lo tanto, esta invención se dirige a una preparación derivada de un cultivo in vitro de células de argán desdiferenciadas, no evocadas; una composición cosmética o dermatológica que incluye dicha preparación; y sus usos en cosmetología y dermatología, y, preferencialmente, para el tratamiento del envejecimiento, la inflamación y la curación de la piel.

Más en general, los cultivos in vitro de tejidos de plantas en suspensión proporcionan un medio para la producción de compuestos orgánicos activos derivados directamente del metabolismo primario o secundario de las células.

Las células de plantas en suspensión se encuentran en un estado de desdiferenciación similar al estado de las células madre para cultivos de células de animales. Por lo tanto, estas células de plantas son teóricamente capaces de producir todos los metabolitos observados en la planta entera. La desdiferenciación causa una alteración genética o epigenética de las vías de biosíntesis, de modo que los perfiles químicos son cuantitativa y cualitativamente diferentes entre la planta entera y las cepas celulares resultantes. En consecuencia, en teoría, pueden aparecer intermediarios de reacción no observados en la planta entera, en la suspensión de células. Esto proporciona una nueva oportunidad, para poder acceder a la biodiversidad química "latente".

En el estado actual de arte, en general, las evocaciones (química, física, biológica) de cultivos de células pueden estimular y producir más metabolitos secundarios. En nuestro proceso de acuerdo con la invención, mostraremos que, a diferencia de la mayoría de los casos, y de modo sorprendente, la evocación no es necesaria, y es nociva para el crecimiento de la biomasa y para las actividades biológicas requeridas.

Uno de los propósitos de esta invención se refiere a la preparación derivada del cultivo in vitro de células de argán desdiferenciadas no evocadas.

"Células de plantas desdiferenciadas" se refieren a cualquier célula de planta sin ninguna naturaleza especializada particular; en otras palabras, en un estado fisiológico similar a los tejidos meristemáticos de la planta en el estado natural. Estas células son capaces de vivir por sí mismas, y no dependientes de otras células.

Las células desdiferenciadas de Argania spinosa se obtienen de material de planta vivo recogido del árbol o de un brote joven, que consiste en hojas, tallos de hojas, tronco, corteza, raíz, fruto, semilla, flor y órganos de flores, o del retoño, y más en particular, de las hojas.

El proceso para la obtención de los cultivos de células desdiferenciadas se obtiene in vitro por cualquier método conocido por los expertos en el arte; por ejemplo, ver las referencias de Murashige, T., Skoog, F., 1962. "A revised médium for rapid growth and bio assays with tobáceo tissue cultures". Physiol. Plant, 15: 473-496. Plant Culture Media, Vol-1 Formulations and Uses, E. F. George, D. J. M. Puttock, and H. J. George (1987), Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA134QG England.

La preparación de acuerdo con esta invención puede obtenerse realizando los siguientes pasos, en forma sucesiva: a) la esterilización del material de planta; b) la desdiferenciación de las células; c) la colocación en suspensión celular con un medio de cultivo sin agente evocador; d) la propagación de biomasa y producción de cultivo con un medio de cultivo sin agente evocador; y la obtención de la preparación.

La preparación puede efectuarse en un matraz de Erlenmeyer, si el objetivo es la producción de pequeñas cantidades de biomasa, o en un biorreactor, para cantidades mayores. Por ejemplo, la cantidad promedio recogida en un matraz de Erlenmeyer con 500 mi de suspensión celular es 100 g de biomasa desecada (a decir, 200 g de biomasa/l de suspensión celular), mientras que la biomasa desecada promedio recogida en un biorreactor de 10 I es de 3000 g (300 g/l de biomasa).

Existen tres modos principales para el cultivo de células de plantas en un biorreactor: 1. cultivo discontinuo o en lotes; 2. recarga/recolección o cultivo de alimentación por lotes; y 3. cultivo continuo. a. Paso de esterilización de material de planta.

Se obtienen explantaciones de Argania spinosa, y más en particular, explantaciones de hojas, y se descontaminan con soluciones de hipoclorito sódico o cálcico o con soluciones de cloruro de mercurio, a temperatura ambiente durante varios minutos. Los tejidos se enjuagan con agua destilada estéril y luego se lavan por lo menos una vez con agua destilada estéril al final de la descontaminación. b. Paso de desdíferenciación celular.

Las explantaciones descontaminadas se colocan bajo una capucha de flujo laminar en contacto con un medio nutriente de agar de Murashige & Skoog, al cual se han agregado sacarosa y factores de crecimiento (u hormonas). Estas hormonas de crecimiento controlarán la maquinaria celular de las explantaciones, de manera de provocar divisiones celulares y producir racimos celulares o callos desdiferenciados (callogénesis). Los callos obtenidos se transferirán a un nuevo medio nutriente de desdiferenciación cada 3 a 4 semanas. Algunos constituyentes ricos en agar de este medio pueden ser metabolizados por los callos, o degradados por la acción del aire.

En general, se evaluó con éxito una composición hormonal a base de auxina (ácido 2-4-dicloro-fenoxiacético) y citoquinina (quinetina) a fin de obtener la rápida y completa desdiferenciación de tejidos en forma de callos friables (callogénesis) y de facilitar la transferencia a un medio líquido. Las explantaciones de hojas estériles pueden depositarse sobre la cara adaxial en contacto con el medio de agar, compuesto por un medio de Murashige and Skoog (Murashige, T., Skoog, F. 1962. "A revised médium for rapid growth and bio assays with tobáceo tissue cultures". Physiol. Plant, 15: 473-496), con 30 g/l de sacarosa, 8 g/l de agar, con aditivos de 0,5 mg/l de quinetina y 0,75 mg/l de ácido 2-4-dicloro-fenoxiacético (24D) y ajustado a un pH de 6 antes de los 20 minutos en el autoclave a 121 °C (0,1 MPa (1 bar)). Los discos de Petri que contienen las explantaciones se dejan incubar en la oscuridad a 28°C. Los primeros callos aparecen luego de 2 semanas. Los callos obtenidos se transfieren a un nuevo medio cada 3-4 semanas, mediante la división de los callos con un bisturí de modo de mantener un tamaño de 2 a 3 cm. Estas transferencias continúan durante 2 a 6 meses hasta obtener callos friables. c. Paso para crear una suspensión celular en un medio de cultivo sin agente evocador.

La desdiferenciación celular para las sucesivas transferencias de callos a un medio de agar conduce a la formación de callos friables. Esta caída en la cohesión entre las células es una consecuencia de la desdiferencíación que puede producirse entre los dos y seis meses, de acuerdo con la planta. Este estado es favorable para la transferencia a un medio líquido, ya que garantiza la desintegración de los callos en la suspensión celular, y a la vez, minimiza las tensiones mecánicas inducidas. En consecuencia, se introduce un grupo de callos friables (10-20% en volumen) en el medio nutriente líquido preparado usando la misma formulación que el medio de diferenciación de agar, pero sin agente gelificante.

Los callos friables, por lo tanto, son desintegrados en un medio líquido por la acción de una mesa de agitación, durante 2 a 3 días, y la suspensión celular obtenida es liberada de todas las partes de callo no desintegradas, para formar una suspensión celular homogénea. Esta suspensión se mantiene en cultivo, de manera de obtener una población celular suficientemente densa. En esta etapa, la suspensión es subcultivada o diluida en el nuevo medio nutriente, y se inicia el cultivo de la misma manera.

Puede iniciarse una suspensión celular inicial mediante el depósito de alrededor de 20 a 40 g de callos friables en un matraz de 500 mi de Erlenmeyer que contiene 200 mi de medio. Los callos friables, por lo tanto, son desintegrados en un medio líquido por la acción de una mesa de agitación durante 2 a 3 días a 1 15 r. p. m., en la oscuridad, a 29°C. La flotación celular entonces se recoge usando una pipeta, de modo de apartar los racimos de callos residuales no desintegrados. La flotación celular, en consecuencia, forma una suspensión celular homogénea. Esta suspensión se mantiene en cultivo, a fin de obtener una población celular "suficientemente" densa. La suspensión celular obtenida se cultiva durante 15 días, y luego se propaga mediante la dilución a 1 :5 en un nuevo medio, durante el mismo tiempo. Se han hecho ajustes a la composición del medio de cultivo (nutrientes, factores de crecimiento, etc.), de modo de maximizar la productividad de la biomasa. El resultado es el medio de propagación de biomasa ARGMS (ver tabla 1 ) optimizado para la suspensión celular líquida. Este medio es una versión modificada del medio de Murashige & Skoog para la callogénesis. Este medio se ajusta hasta pH 6 mediante la adición de KOH, seguida de 20 minutos en el autoclave a 121 °C (p = 0,1 MPa (1 bar)), o una filtración de esterilización a 0,2 µ?t?.

Tabla 1 : Medio ARGMS que es una versión modificada del medio de Murashige & Skoog (ARGMS) utilizado para el cultivo de células de argán en suspensión en un matraz de Erlenmeyer o en un biorreactor en condiciones óptimas.

Medio ARGMS - optimizado para el crecimiento celular d. Propagación de biomasa y producción de cultivo con un medio de cultivo sin agente evocador.

Después de tomar varios de dichos subcultivos, la suspensión celular es estabilizada cuando la densidad celular obtenida durante el período es constante. Entonces son posibles ajustes de la composición del medio de cultivo (nutrientes, factores de crecimiento, etc.) a fin de maximizar la productividad de la biomasa. En una realización particular de la invención, el medio optimizado que se usa como el medio de producción de biomasa es el medio que se describe en la tabla 1.

La suspensión celular se filtra a fin de separarla del medio extracelular o de la flotación de cultivo, y la biomasa recogida se coloca nuevamente en suspensión en agua destilada y se tritura a 0°C. El producto homogenado obtenido se seca por congelación, o se centrifuga, de modo de clarificarlo antes del secado por congelación.

El cultivo de células en condición "óptima" creado de este modo se estabiliza y se mantiene en un matraz de Erlenmeyer (cultivo de propagación) con una dilución de 1 :5 de la suspensión celular cada 15 días. Esto es equivalente a un cultivo celular de aproximadamente 60 g/l de biomasa fresca inoculada que produce una suspensión de células de alrededor de 300 g/l luego de 15 días en cultivo, o inoculada en un biorreactor, de acuerdo con las necesidades.

La preparación obtenida o bien en el matraz de Erlenmeyer o en un biorreactor puede consistir en: - una suspensión de células (para los propósitos de esta invención, una "suspensión de células" se refiere a células (a decir, biomasa) en su medio de cultivo); - biomasa (para los propósitos de esta invención, la "biomasa" significa un racimo celular separado del medio de cultivo, a decir, la suspensión de células luego de la filtración); - biomasa triturada luego de la nueva colocación (o sin la nueva colocación) en suspensión en agua destilada; - un jugo clarificado o una flotación de biomasa triturada mediante la centrifugación o mediante la filtración; - una flotación de cultivo (para los propósitos de esta invención, una "flotación de cultivo" es el medio de cultivo en el cual las células permanecen en residencia durante el cultivo, o medio extracelular).

Sin consideración de si se trata de la suspensión de células, la biomasa o la flotación de biomasa triturada, estos pueden mantenerse sin cambios en forma congelada o mediante la adición de agentes de conservación tales como fenoxi-2-etanol, alcohol bencílico o cualquier otro producto de conservación que aparece en el Apéndice VI de la directiva EU sobre productos cosméticos, titulada "Lista de agentes de conservación que pueden presentarse en cosméticos". Además, pueden ser diluidos en un medio cosmetológicamente aceptable tal como glicol (propilenglicol, butilenglicol, polietilenglicoles, etc.) en proporciones que varían de 10 a 60%. La suspensión de células o la biomasa además pueden triturarse y luego conservarse como tales en forma congelada, o mediante la adición de agentes de conservación o medio como se describe con anterioridad.

En forma triturada o sin triturar, la suspensión de células, la biomasa o la flotación de biomasa también pueden secarse mediante el secado por congelación o la atomización, y mantenerse como tales o secados en un medio de tipo maltodextrina, lactosa o sílice, o cualquier otro medio cosmetológicamente aceptable.

Finalmente, la suspensión celular puede enriquecerse con compuestos útiles mediante la cromatografía de afinidad:absorción en resina (copolímeros de poliestireno de tipo Amberlite® XAD®-2la, etc.) y la elución con un solvente apropiado tal como etanol.

La biomasa fresca obtenida con el proceso de acuerdo con esta invención representa alrededor de 100 a 500 g por litro de suspensión, y más preferentemente, entre 200 y 350 g por litro de suspensión, en la fecha de recolección óptima (a decir, aproximadamente 15 días en promedio).

La siguiente tabla expresa los rendimientos obtenidos (rendimiento en gramos de producto obtenido/I de suspensión de células): ?? o n Esta invención se refiere además a una composición cosmética o dermatológica que comprende una preparación derivada de un cultivo de células de argán no evocadas desdiferenciadas como el constituyente activo, como se describe con anterioridad.

Preferentemente, la cantidad de dicha preparación es entre 0,1 y 10% del peso total de la composición. Aun más preferentemente, dicha cantidad de extracto es entre 0,2% y 5%.

La composición cosmética de acuerdo con esta invención puede presentarse de modo conveniente en cualquier forma farmacéutica empleada normalmente en los cosméticos para aplicación tópica u oral, y preferentemente, para la aplicación tópica. Para la administración por vía tópica, la forma farmacéutica puede ser una crema, un gel, un ungüento o una pulverización. La fórmula oral se selecciona del grupo que comprende comprimidos, cápsulas y polvos para suspensiones bebibles.

La composición cosmética de acuerdo con la invención además comprende los excipientes habituales cosméticamente compatibles.

Los excipientes habituales compatibles con la composición cosmética pueden ser cualquier excipiente de aquellos conocidos por los expertos en el arte, de modo de obtener una composición cosmética para la aplicación tópica en formas como aquellas descriptas anteriormente.

La composición cosmética o dermatológica de acuerdo con la invención, en particular, puede contener aditivos y auxiliares de formulación tales como agentes emulsionantes, de limpieza, surfactantes de tipo espumantes, etc.; agentes formadores de complejos, espesadores, agentes gelificantes, estabilizadores, agentes conservantes que incluyen antimicrobianos y antioxidantes, acondicionadores, acidificantes, agentes alcalinizantes, ablandantes, solventes, agentes colorantes y fragancias.

Los inventores han demostrado, además, que las preparaciones derivadas de células de argán no evocadas desdiferenciadas pueden tener las siguientes actividades: - actividad antioxidante y antirradicales, a fin de limitar el proceso de oxidación relacionado con el envejecimiento intrínseco y extrínseco y el proceso inflamatorio. - actividad sobre la matriz extracelular a fin de mejorar las propiedades mecánicas de la piel madura (firmeza, elasticidad, tonicidad), a través de la inhibición de metaloproteasas degradantes del colágeno.

Finalmente, esta invención se refiere a una composición revelada en esta solicitud, para el tratamiento del envejecimiento, la inflamación y la curación de la piel.

Los siguientes ejemplos se proporcionan como ejemplos no limitativos.

Ejemplos para la producción de la preparación de acuerdo con esta invención.

Ejemplo 1. Biomasa fresca/proceso efectuado en un matraz de Erlenmever.

Se esterilizan hojas de argán, preferentemente, de 3 a 4 meses de edad, mediante varios baños sucesivos: alcohol al 70% durante 1 minuto; hipoclorito sódico al 2%, durante 3 minutos; y luego, se enjuagan con dos baños de agua desmineralizada sucesivos de una duración de 8 minutos y 10 minutos.

Las explantaciones de hojas esterilizadas se depositan sobre una cara adaxial en contacto con el medio de agar compuesto por un medio de Murashige and Skoog (Murashige, T., Skoog, F. 1962. "A revised médium for rapid growth and bio assays with tobáceo tissue cultures". Physiol. Plant, 15: 473-496), con 30 g/l de sacarosa, 8 g/l de agar, complementado con 0,5 mg/l de quinetina y 0,75 mg/l de ácido 2- -dicloro-fenoxiacético (2,4-D), y ajustado a pH 6 antes de los 20 minutos de autoclave a 121 °C (0,1 MPa (1 bar)). Los discos de Petri que contienen las explantaciones se dejan incubar en la oscuridad a 28°C y se propagan hasta obtener" callos friables y estabilizados.

La suspensión celular inicial se crea mediante el depósito de alrededor de 40 g de callos friables en un matraz de Erlenmeyer de 500 mi que contiene 200 mi de medio sometido al autoclave, cuya composición se describe en la tabla 1 mencionada anteriormente.

El cultivo se deja durante una semana sobre una mesa de agitación a 1 15 r. p. m., en la oscuridad, a 29°C. La flotación de células luego se recoge con la pipeta, para dejar los racimos residuales de callos. La suspensión celular obtenida se cultiva durante 15 días, y luego se propaga mediante la dilución a 1 :5 en el nuevo medio durante la misma cantidad de tiempo.

La suspensión entonces se filtra bajo un vacío, y se recupera la biomasa. El rendimiento de biomasa fresca obtenido es de 168 g/l.

La biomasa se mantiene a -20°C.

Ejemplo 2. Biomasa seca.

Ejemplo 2a. Biomasa seca/proceso efectuado en un biorreactor en cultivo de lotes.

Cuatro matraces de Erlenmeyer de 500 mi de suspensión celular obtenida como se describe en el Ejemplo 1 se colocan juntos en un dispositivo de inoculación, y forman un inoculo de 2 I que se vierte estéril en un biorreactor de 10 I. Este biorreactor se llena con 8 I de medio óptimo (ver tabla 1), suplementado con 30 mg/l de antiespumante previamente esterilizado; luego se enfría y se mantiene a 29,5°C mediante una circulación de agua con control de temperatura, en un circuito cerrado en la caja del biorreactor.

Se calibra una sonda de oxígeno mediante la saturación, y se ingresa la información en un dispositivo de regulación de p02 computarizado, en tiempo real. Este dispositivo mantiene el p02 al 80% mediante la inyección de oxígeno puro estéril en el sistema de aireación. Este biorreactor además está equipado con un dispositivo de medición de C02 en línea, en los gases efluentes (espacio de cabeza), que, al mismo tiempo, ingresa la información en un dispositivo de regulación de pC02 computarizado a fin de mantener el pC02 al 6%. Esto se realiza por medio de la inyección de aire atmosférico estéril en el dispositivo de aireación, mezclado con oxígeno. El biorreactor además está equipado con un sistema de agitación de tipo propulsor que gira a 75 r. p. m., de modo de agitar la suspensión celular y evitar su sedimentación. Se instala un dispositivo automático en el lateral de salida del biorreactor, a fin de permitir la toma de muestras estériles y el control de la biomasa.

El cultivo en lotes se mantiene en estas condiciones de temperatura constante y gas disuelto durante 15 a 17 días, a fin de lograr una densidad celular de 280 a 320 g/l de biomasa fresca. El biorreactor se vacía luego de completarse este cultivo de lotes, y se recoge la biomasa mediante la filtración en un filtro, usando un embudo Büchner.

La biomasa fresca recogida disuelta en el mismo volumen de agua destilada se tritura en frío usando un "limpiador ultrasónico", y luego se seca por medio de la congelación.

Ejemplo 2b. Biomasa seca/proceso efectuado en biorreactor en cultivo de alimentación de lotes 10.0.0.1 .

Se usan cuatro matraces de Erlenmeyer de 500 mi de suspensión celular como inoculo, según se describe en el Ejemplo 2a. El biorreactor se prepara conforme a lo indicado en el Ejemplo 2a. Los sistemas de regulación de gas disuelto, temperatura y agitación se preparan según se indica en el Ejemplo 2a.

El cultivo inicial se mantiene en estas condiciones de temperatura constante y gas disuelto durante 15 a 17 días, hasta lograr una densidad celular de 280 a 320 g/l de biomasa fresca. Se extrae el 80% del contenido del biorreactor de 10 I luego de completarse este cultivo inicial. Luego se recogen 8 I de suspensión celular. La biomasa en esta suspensión se recoge mediante la filtración en un filtro, usando un embudo Büchner. Se recogen 2240 g a 2560 g de biomasa fresca. La biomasa fresca recogida disuelta en el mismo volumen de agua destilada se tritura en frío usando un limpiador ultrasónico, y luego se seca mediante la congelación. Se obtienen 100 a 130 g de biomasa desecada congelada.

Al mismo tiempo que se realiza la recolección parcial del 80%, se vierten 8 I de medio ARGMS previamente sometido al autoclave y enfriado, en el biorreactor, que entonces contiene 2 I de suspensión celular, de modo de restaurar el volumen de cultivo a 10 I. El cultivo de alimentación de lotes se mantiene en estas condiciones de temperatura constante y gas disuelto durante 5 a 7 días, hasta lograr una densidad celular de 280 a 320 g/l de biomasa fresca. Este cultivo es más veloz (mayor productividad) que el cultivo inicial, debido a que la biomasa se encuentra en un estado de división celular fisiológica sostenida, de modo que el vertido de nuevo medio nutriente se caracteriza por una fase de latencia de menos de 24 horas y una expansión inmediata de la biomasa. Al final de este cultivo de alimentación de lotes, se extrae el 80% del biorreactor de 10 I. Luego se recogen 8 I de suspensión celular. La biomasa de esta suspensión se recoge mediante la filtración en un filtro usando un embudo Büchner. El cultivo luego se reinicia como con anterioridad.

Ejemplo 2c. Biomasa seca/proceso llevado a cabo en un biorreactor de cultivo continuo.

Se usan cuatro matraces de Erlenmeyer de 500 mi de suspensión celular como inoculo, según se describe en el Ejemplo 2a. El biorreactor se prepara conforme a lo indicado en el Ejemplo 2a. Los dispositivos de regulación de gas disuelto, temperatura y agitación se preparan según se describe en el Ejemplo 2a.

El cultivo inicial se mantiene en estas condiciones de temperatura constante y gas disuelto durante 10 días, hasta lograr una densidad celular de 150 g/l y un índice de crecimiento de biomasa fresca instantánea de 0,2 d~ . En esta etapa, se extrae el 1 ,2% del contenido del biorreactor de 10 I, cada 1 hora 20 min. Estas muestras se compensan automáticamente mediante el vertido del mismo volumen de nuevo medio ARGMS en el biorreactor. Este método mantiene las células en un estado fisiológico y densidad celular constantes.

Luego se recogen 100 a 120 mi de suspensión celular. La biomasa en esta suspensión se recoge mediante la filtración en un filtro, usando un embudo Büchner. Se recogen 15 g a 18 g de biomasa fresca para cada muestra. La biomasa fresca recogida disuelta en el mismo volumen de agua destilada se tritura en frío usando un limpiador ultrasónico, y luego se seca mediante la congelación. El resultado obtenido es de 0,71 a 0,85 g de biomasa desecada congelada para cada extracción. El cultivo se mantiene así durante por lo menos 60 días. Es teóricamente posible el mantenimiento sin límite de tiempo.

La ventaja del cultivo continuo sobre los modos previos es que no hay necesidad de preparar el biorreactor nuevamente, lo que requiere limpieza y esterilización, y no hay fase de latencia celular. La extracción de 1 a 1 ,5% de la suspensión celular, seguida automáticamente de la compensación con un nuevo medio en el biorreactor causa mínimas variaciones en la composición del medio de cultivo en progreso en el biorreactor. Por lo tanto, la población celular no hace ningún reajuste metabólico para la fase de latencia responsable de una pérdida de productividad de volumen de biomasa, observada en otros modos de cultivo.

Ejemplo 3. Flotación de biomasa fresca, donde dicha biomasa se obtiene como se describe en el Ejemplo 2a.

Se centrifugan 20 g de biomasa triturada fresca, obtenida como se describe en el Ejemplo 2a, a 10.000 g, durante 15 minutos, y se recoge la flotación. Luego se seca mediante la congelación.

El rendimiento promedio es de 30 mg de flotación secada por congelación por g de biomasa fresca.

Ejemplos de composiciones cosméticas.

E em lo 5. Fórmula E/H Ejemplo 6. Evaluación de la actividad antioxidante.

Quimiluminiscencia.

Este método genera radicales libres (radical superóxido 02°~) por una señal fotoquímica. La intensidad de oxidación es 1000 veces mayor que aquella obtenida en condiciones normales. La detección se realiza mediante la quimiluminiscencia y se usa para evaluar extractos o moléculas lipo o hidrosolubles. Los resultados se expresan como una cantidad equivalente de vitamina C o Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico). La sensibilidad es del orden de un nanomol.

El análisis de los resultados depende de dos criterios, a decir, la forma de la curva (integración) y el valor numérico proporcionado por el programa informático en nanomoles (Igor Popov and Gudrun Lewin. Methods in enzymology [44] vol 300. 437-456; Maibach I Howard and col. Journal of Cosmetic Dermatology, Vol 7 (2) 96-100 (2008)).

Los resultados se expresan en pg de muestra necesarios para obtener una actividad equivalente a la actividad detectada para 1 µg de estándar (= Trolox). (ACL Kit).

Resultados.

La actividad antioxidante estudiada en este ensayo representa la capacidad para atrapar específicamente aniones de superoxido mediante la quimiluminiscencia.

Tabla 2. Evaluación y cuantificación del polvo antioxidante en equivalente de Trolox.

La biomasa secada por congelación preparada de acuerdo con el Ejemplo 2a y la flotación de biomasa secada por congelación triturada preparada de acuerdo con el Ejemplo 3 tienen una actividad de atrapado antirradicales globalmente equivalente.

Son necesarios 278 pg de biomasa secada por congelación para obtener una actividad equivalente a la actividad detectada para 1 pg de Trolox: actividad equivalente a la coenzima Q10, la molécula antioxidante de referencia.

Son necesarios 171 pg de flotación de biomasa secada por congelación triturada para obtener una actividad equivalente a la actividad detectada para 1 pg de Trolox.

Los radicales libres, cuya producción se incrementa como consecuencia de las agresiones externas (frío, contaminación, tabaco, rayos UV), son responsables del daño al ADN celular de la piel, y además, al ADN de la membrana celular y mitocondrial. Estos radicales libres además juegan un rol muy importante en el proceso de inflamación. Estos metabolitos muy reactivos son mensajeros secundarios de la señalización del estrés oxidativo celular y, por lo tanto, son mediadores tempranos de la inflamación (A. Van Der Vliet and col., Chem. Biol. Interaction, 85: 95-1 16, 1992).

La actividad contra los radicales de las preparaciones descriptas en los Ejemplos 2a y 3 ayuda a resistir la inflamación y el envejecimiento intrínseco y extrínseco.

Ejemplo 7. Evaluación de la inhibición de la actividad de las metaloproteasas sobre el colágeno que forma la matriz extracelular.

La matriz extracelular (MEC) es una estructura dinámica con un rol estructural y regulador de los tejidos. Proporciona a la piel la turgencia y las propiedades mecánicas. En la epidermis, ocupa el espacio intercelular y proporciona soporte para la estructura epidérmica. Además, controla los intercambios entre las células de la epidermis, y cumple una función en la actividad celular. Se compone de fibras, en particular, colágeno y sustancias fundamentales (agua, sales, glicoproteínas, glicosaminoglicanos). Los colágenos son proteínas fibrosas, formadas por tres cadenas de polipéptidos que pueden ser idénticas o diferentes, conectadas por enlaces de hidrógeno covalentes. Los colágenos forman el componente esencial de la red fibrosa, y cumplen un rol mecánico que proporciona resistencia y elasticidad a la piel.

Cuando una célula es senescente, la mayoría de los componentes de la MEC son degradados por enzimas de tipo endopeptidasas ricas en zinc, denominadas metaloproteinasas de matriz (MMP, según su sigla en inglés) (Hideaki Nagase § and J. Frederick Woessner., J. Biol. Chem,. Vol. 274, Fascículo 31 , 21491-21494, 30 de julio de 1999). Las MMP son membranosas o secretadas. Todas las MMP tienen una fuerte homología de secuencia y estructura, si bien difieren en la especificidad del sustrato. La MMP1 o "colagenasa intersticial" degrada principalmente el colágeno tipo I (80% del contenido en la dermis de la piel normal), y además, degrada colágenos de los tipos II, VII, VIII y X.

En un modelo de enzima recombinada humana que usa un sustrato péptido específico, Mea - Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA- Ala-Arg-NH2, hemos analizado el efecto de los extractos sobre la actividad enzimática directa mediante la cuantificación fluorimétrica (David Leppertd and col., Analytical Biochemistry, 328 (2004) 166-17).

La enzima activada es preincubada con las diferentes preparaciones, y luego es colocada en presencia del sustrato. La enzima disocia el péptido, separando el fluoróforo Mea ((7-metoxicumarina-4-il) acetilo) del templador Dpa (N-3-(2,4-Dinitrofenil)-L-2,3 diaminopropionilo). El péptido entonces emite fluorescencia con una longitud de onda de 405 nm, cuando se excita a 320 nm. En consecuencia, se mide la actividad enzimática de MMP-1 , que es proporcional a la fluorescencia emitida.

Con este ensayo in vitro, podemos detectar potenciales inhibidores de la actividad de MMP1 , una enzima con un rol crucial en la iniciación de la degradación del colágeno. Medimos los porcentajes de inhibición de la actividad de MMP1 .

Cálculo del porcentaje de inhibición enzimática relacionado con el inhibidor o el producto: % inhibición = 00 x (Actividad enzimática neta máxima . Actividad enzimática neta en presencia de inhibidor Actividad enzimática neta máxima Resultados.

La flotación preparada de acuerdo con el Ejemplo 3 inhibe de manera significativa la actividad de MMP1 de manera dependiente de la dosis, de 60 a 500 pg/ml.

Tabla 3: Flotación de biomasa triturada secada por congelación (preparada de acuerdo con el Ejemplo 3), resultados de la inhibición de la MMP1 en porcentaje (%).

La biomasa secada por congelación preparada de acuerdo con el ejemplo 2a se evaluó en una dosis de 60 a 1000 pg/ml. Debido a la interferencia fisicoquímica de la biomasa en su totalidad, no pudimos medir la actividad de inhibición. Sin embargo, se evaluó un extracto muy similar, que mostró inhibiciones significativas de 60 pg/ml a 1000 g/ml.

El extracto preparado de acuerdo con el Ejemplo 3 puede resistir la mayor actividad de las MMP cuando se produce la senescencia, y puede contribuir al mantenimiento del rol mecánico del colágeno, de modo de proporcionar resistencia y elasticidad a la piel.

Ejemplo 8. Medición de la síntesis de TGF-B1 en queratinocitos HaCaT.

TGF-ß? (factor beta 1 de crecimiento de transformación) pertenece a la superfamilia de TGF-ß secretada por diferentes tipos celulares, y cumple un importante rol en el control del crecimiento celular y la regulación de múltiples respuestas celulares y procesos biológicos. Las principales actividades de las citoquinas de esta superfamilia son la modulación de la proliferación de la mayoría de las células, la estimulación de la proliferación de fibroblastos y el aumento de la formación de la matriz extracelular (Lawrence, 1996). TGF-ß? además participa en la reparación de lesiones, en procesos de curación (Cullen et al., 1997), en particular, mediante la inducción de la reorganización del citoesqueleto celular (actina) y la promoción de la migración de células epiteliales (Boland et al., 1996). La población celular más representada en el tejido cutáneo es la población de queratinocitos, que forma una fuente importante de factores de crecimiento que podrían controlar y afectar el comportamiento de las células cutáneas, a decir, los fibroblastos (Ghahary et al., 2001 ).

Aparato y métodos- Producción de biomasa no evocada: de acuerdo con el Ejemplo 2a.

Preparación de biomasa evocada.

Se prepara medio de Murashige & Skoog sin factores de crecimiento (quinetina y 24D). Este medio se ajusta hasta pH 6 mediante la adición de KOH, seguida de 20 minutos de autoclave a 121°C (0,1 MPa (1 bar)). Este medio luego se inocula a 1 :5 del volumen, usando una suspensión celular derivada de un cultivo de propagación. Las condiciones de evocación se crean inmediatamente después mediante la adición estéril de una solución concentrada de 6-bencilaminopurina (BAP o (N-(fenilmetil)-7H-purin-6- amina) y agentes evocadores (ácido acetilsalicílico y metil-jasmonato) en la quinetina DMSO. El resultado es un medio de evocación EMS (sigla en inglés de "medio de Murashige & Skoog de evocación") (ver tabla 4). El cultivo evocado entonces se mantiene durante 15 días sobre una mesa de agitación en la oscuridad, a 115 r. p. m., y a 29°C. Entonces se recoge la biomasa fresca, y se seca en un embudo Buchner, antes de la trituración y la centrifugación, y la flotación se estabiliza mediante el secado por congelación.

Tabla 4. Medio EMS, a decir, el medio de Murashige & Skoog modificado utilizado para el cultivo en condiciones evocadas de células de argán en sus ensión en un matraz de Erlenmeyer.

Se tratan queratinocitos HaCaT durante 5 h con los diferentes extractos, y las células luego se incuban durante 24 h en DMEM a 37°C. Se dosifica TGF-ß1 en las flotaciones de cultivo, con un equipo de ELISA (sigla en inglés de: ensayo inmunosorbente ligado a enzima).

Los efectos de la biomasa de argán no evocada preparada de acuerdo con el Ejemplo 2a y la biomasa de argán obtenida luego de la evocación en la síntesis de TGF-ß? en queratinocitos HaCaT humanos se muestran en la figura 1 adjunta. Estos efectos muestran que en los queratinocitos HaCaT, la biomasa de argán no evocada preparada de acuerdo con el Ejemplo 2a (50 pg/ml) estimula la síntesis de TGF-ß? el 48%, mientras que la biomasa de argán evocada inhibe la síntesis de TGF-ß? el 26%.

Ejemplo 9. Medición de la proliferación y la migración celular de queratinocitos humanos- Ejemplo 9.a. Medición de la proliferación celular de queratinocitos humanos.

La curación de lesiones es un proceso biológico complejo y dinámico que involucra la interacción de muchos factores locales y sistémicos en la reparación normal de los tejidos. El avance de la curación comprende cuatro fases interdependientes: hemostasis, inflamación, proliferación y remodelación. La proliferación implica tres procesos claramente visibles, a decir, la granulación, la contracción y la reepitelialización.

Durante la granulación, se observa la proliferación de células que participarán en el resto del proceso de reparación, con la migración de estas células hacia el lecho de la lesión. Estas células incluyen macrófagos, fibroblastos y células endoteliales. Los macrófagos liberan en forma continua factores quimiotácticos y factores de crecimiento. Los fibroblastos construyen la nueva matriz celular necesaria para el crecimiento de las células en la base de la lesión. Esta estructura facilita la migración celular.

La contracción de la lesión es un mecanismo para la reducción del tamaño de la lesión, y los fibroblastos cumplen un rol principal en esta contracción.

La reepitelización consiste en la regeneración de una epidermis que cubre una lesión, a fin de reformar una barrera eficaz contra el entorno externo, capaz de ser pigmentada y de restaurar sus funciones sensoriales e inmunitarias. Por lo tanto, implica procesos de proliferación y migración celular de queratinocitos, aunque, además, la diferenciación de este neoepitelio y la restauración de una membrana basal que reconecta la dermis y la epidermis. Cuando la migración de células básales hacia el centro de la lesión permite que los dos lados de la lesión se junten, se produce una ola de mitosis celular que llena los espacios dejados por la migración, y que provee células para el tejido epitelial en una regeneración tridimensional.

Los pasos de proliferación de células queratinocitos, fibroblastos y células endoteliales pueden considerarse uno de los fenómenos funcionales que confirma la actividad de curación de un constituyente activo. Un aumento en la proliferación de fibroblastos o de células endoteliales participará en la curación de la dermis, mientras que un aumento en la proliferación de queratinocitos participará en la reepitelización.

Aparato y métodos: proliferación celular.

La técnica utilizada mide la incorporación de un nucleótido, 5-bromo-2'-desoxiuridlna (BrdU), un análogo de la timidina, en el ADN de células en fase S.

Los queratinocitos, aislados de piel desechada luego de la cirugía, son cultivados en un medio completo KSFM (sigla en inglés de: medio libre de suero de queratinocitos) (BPE, 25 pg/ml; EGF, 1 ,5 mg/ml). Las células se incuban en presencia de moléculas por ser evaluadas durante 48 h a 37°C, en una atmósfera con 5% de CO2.

La incorporación de BrdU, proporcional al índice de proliferación celular, se evalúa por medio de un sistema de anticuerpos anti-BrdU acoplados a peroxidasa. La adición de un sustrato de peroxidasa desarrolla una reacción coloreada (sistema Biotrak Elisa System). Se mide la correspondiente absorbancia (DO) a 450 nm. Por lo tanto, esta información es proporcional al índice de proliferación celular.

Luego se determina el porcentaje de proliferación empleando la siguiente fórmula: % proliferación = DO (tratada) - DO (t control min) X 100 DO (t control max) - DO (t control m¡n) Observación: Control min = células incubadas con el medio mínimo Control max = células incubada con el medio completo Por lo tanto, Control m¡n corresponde a 0% de proliferación, y Control max, a 100% de proliferación.

Los resultados sobre la proliferación celular se muestran en la figura 2, que ilustra el efecto de la biomasa de argán preparada de acuerdo con el Ejemplo 2a, sobre la proliferación de queratinocitos humanos.

Estos resultados muestran que la biomasa de argán preparada de acuerdo con el Ejemplo 2a en una concentración de 0,1 pg/ml estimula la proliferación de queratinocitos humanos el 25%. No se mide efecto cuando la biomasa es evaluada en una concentración de 0,01 pg/ml.

Ejemplo 9.b. Medición de la migración celular de queratinocitos humanos- Aparato v métodos: migración celular de queratinocitos HaCaT.

El protocolo empleado para el estudio de la migración celular se basa en el uso de un equipo de 96 receptáculos. El principio de este ensayo consiste en el estudio de la migración de células hacia el centro del receptáculo (placa de 96 receptáculos). A fin de lograr este objetivo, se coloca un obturador en el centro de cada receptáculo, de manera de crear una zona de detección de 2 mm de diámetro. Luego se siembran las células HaCaT alrededor de este obturador. Se retira el obturador una vez que las células están bien enlazadas a la superficie alrededor del obturador, y las células, en consecuencia, pueden migrar a la zona de detección. Las placas sin el obturador y con constituyentes activos se incuban a 37°C durante 24 horas en DMEM, 0% SVF. Entonces se analiza la cantidad de células ubicadas en la zona en la cual se ubicó el obturador, a fin de evaluar la migración de células. Las células se marcan con Hoechst 33342, y se usa un hueco para visualizar y contar solo las células ubicadas en esta zona. Se realiza un promedio de ocho receptáculos para cada condición.

Los resultados se expresan como: - intensidad de fluorescencia (IF - proporcional a la cantidad de células que han migrado) - porcentaje de actividad en relación con el control, 0% SVF: IF tratada - IF O% miq X 100 IF t control 0% SVF - IF 0% mig Observación: IF (0% mig) corresponde a la IF (intensidad de fluorescencia) de los receptáculos que contienen los obturadores, y por lo tanto, al ruido de fondo.

La Figura 3 muestra los resultados de la migración celular, e ilustra el efecto de la biomasa de argán preparada de acuerdo con el Ejemplo 2a sobre la migración de queratinocitos HaCaT.

Los resultados muestran que la biomasa de argán preparada de acuerdo con el Ejemplo 2a, en una concentración de 0,01 o 0,03 pg/ml, estimula la migración de queratinocitos HaCaT el 79% y el 73%, respectivamente.

Claims (7)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1 . Una preparación derivada de un cultivo in vitro de células de argán no evocadas desdiferenciadas, para su uso en el tratamiento del envejecimiento, la inflamación y la curación de la piel.

2. La preparación de acuerdo con la reivindicación 1 , en forma de una suspensión celular, biomasa, biomasa triturada, flotación de biomasa triturada o flotación de cultivo.

3. Una composición cosmética o dermatológica que comprende una preparación derivada de un cultivo de células de argán no evocadas, disdiferenciadas, como se define en la reivindicación 1 o 2, como el constituyente activo, junto con un excipiente cosmética o dermatológicamente aceptable.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada porque la cantidad de la preparación es entre 0,1 y 10% del peso total de la composición.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, para su uso en el tratamiento del envejecimiento, la inflamación y la curación de la piel.

6. Un proceso para la obtención de la preparación, caracterizado porque incluye los siguientes pasos: a) la esterilización del material de planta; b) la desdiferenciación de las células; c) la colocación en suspensión celular con un medio de cultivo sin agente evocador; d) la propagación de la biomasa y la producción de cultivo con un medio de cultivo sin agente evocador; y la obtención de la preparación.

7. Un proceso para el tratamiento cosmético del envejecimiento de la piel, que comprende el uso de una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.