MX2012011164A - Compuesto de purina usados como agonistas de cb2. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula (I) y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de dolor (Ver Formula).

Description

COMPUESTOS DE P U RINA USADOS COMO AGONISTAS DE CB2 Los receptores canabinoides CB! y CB2 pertenecen a la clase de receptores acoplados a la proteína-G (GPCRs). Los receptores CBi son expresados tanto centralmente como periféricamente, mientras los receptores CB2 son predominantemente expresados periféricamente, principalmente en células y tejidos inmunes.

El potencial farmacológico y terapéutico del receptor CB2 ha sido revisado recientemente (Br. J. Pharmacol. (2008) 1 53, 319-334) identificando el CB2 como un objetivo terapéutico para el tratamiento del dolor, en particular, dolor inflamatorio y neuropático.

Los agonistas de CB2, en particular agonistas selectivos de CB2, proporcionan un objetivo para tratar dolor con efectos secundarios centralmente mediados limitados.

El documento WO 2004/037823 se dirige a compuestos de purina y usos de los mismos como ligandos del receptor canabinoide, en particular como antagonistas del receptor CB! .

Como una consecuencia de los efectos secundarios asociados con los agentes farmacológicos orales actuales, sigue existiendo una necesidad para el desarrollo de terapias alternativas para el tratamiento del dolor.

La presente invención proporciona un compuesto de la fórmula: en donde; R1 es Cl o CH3; R2 es C=N, -CH2S02CH3, -CONHCH3, -CH2NR R5, o - CH2C=N; R3 es alquilo C -C2, fluoroalquilo d-C2 o C(0)CH3; R4 es H, C(0)CH3, C02CH3 o S02CH3; y R5 es H o se combina con R4 para formar pirrolidin-2-ona; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de la presente invención se han encontrado por ser agonistas del receptor CB2 in vitro. Ciertos compuestos de la presente invención presentan mayor potencia que los agonistas de CB2 existentes. Ciertos compuestos de la presente invención son agonistas selectivos de CB2. Ciertos compuestos de la presente invención presentan mayor selectividad a CB2 que los agonistas de CB2 existentes.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención , o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más ingredientes terapéuticos.

La presente invención proporciona un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en terapia. La presente invención también proporciona un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de dolor, en particular dolor osteoartritico o migraña. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de dolor, en particular dolor osteoartritico o migraña.

La presente invención proporciona un método para el tratamiento de dolor, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, a un humano o animal en necesidad del mismo. La presente invención también proporciona un método para el tratamiento de dolor osteoartritico o migraña, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, a un humano o animal en necesidad del mismo.

Se prefiere que los compuestos de la presente invención sean usados en el tratamiento de dolor, en particular dolor osteoartrítico o migraña.

Los agonistas del receptor CB2 también han sido identificados por tener potencial terapéutico en el tratamiento de esclerosis múltiple (Br. J. Pharmacol. (2008) 1 53, 216-225 y J. Biol. Chem . (2008) 283, 1 3320-1 3329) .

Especies preferidas de la presente invención son compuestos de la fórmula: o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde R2, R3, R4 y R5 son como se definen en la presente.

Ciertas clases de compuestos de Fórmula I ó I I son preferidas. Las siguientes secciones enumeradas describen tales clases preferidas: 1 ) R2 es -CH2S02CH3, -CH2NR4R5 o -CH2C=N; 2) R2 es -CH2S02CH3; 3) R3 es metilo, etilo, 2-fluoroetilo o C(0)CH3¡ 4) R3 es metilo o etilo; 5) R4 es C(0)CH3 o C02CH3; 6) R5 es H; 7) R5 es H y R4 es C(0)CH3 o C02CH3; 8) R2 es -CH2S02CH3, -CH2NR4R5 o -CH2C=N; R5 es H y R4 es C(0)CH3 o C02CH3; 9) R2 es -CH2S02CH3, -CH2NR4R5 o -CH2C=N; R5 es H; R4 es C(0)CH3 o C02CH3; y R3 es metilo, etilo, 2-fluoroetilo o C(0)CH3; 10) R2 es -CH2S02CH3; R3 es metilo, etilo, 2-fluoroetilo o C(0)CH3; 11) R2 es -CH2S02CH3; R3 es metilo o etilo Sales farmacéuticamente aceptables de cada uno de los compuestos de la presente invención están contempladas dentro del alcance de la presente solicitud.

Como se usa a través de esta especificación, se entiende que donde un grupo es calificado por "definido en la presente" o "definido aquí", tal grupo abarca el que se origina primero y la definición más amplia así como también cada una y todas las definiciones particulares de tal grupo.

Como se usa anteriormente y a través de la descripción de la invención, los siguientes términos, a menos que se indiquen de otro modo tendrán los siguientes significados: Como se usa en la presente el término alquilo Ci-C2 se refiere a metilo o etilo.

Como se usa en la presente el término fluoroalquilo C C2 se refiere a un grupo alquilo C^-C2 como se define en la presente, en donde uno o más hidrógenos son reemplazados por fluoro e incluyen, trifluorometilo, 2-fluoroetilo, 2,2-difluoroetilo y 2,2,2-trifluoroetilo. Un grupo fluoroalquilo C,-C2 preferido es 2-fluoroet¡lo.

Como se usa en la presente el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales de los compuestos de la presente invención las cuales son sustancialmente no tóxicas a organismos vivos. Tales sales y metodolog ía común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl, et al. , Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH , 2002); y J . Pharm. Sci. 66, 2-1 9 (1977). Sales farmacéuticamente aceptables preferidas son el clorhidrato .

Modalidades de la invención incluyen los ejemplos proporcionados aquí, y aunque los ejem plos proporcionados pueden ser de una forma conformacional o quiral, o una sal del mismo, modalidades adicionales de la invención incluyen todas las otras formas conformacionales y/o estereoisoméricas de los ejemplos descritos, así como también sales de los mismos farmacéuticamente aceptables.

Como se usa en la presente el término "agonistas selectivos de CB2" o "selectividad de CB2" se refiere a compuestos que tienen mayor potencia a CB2 que CB Í . Preferiblemente los compuestos de la presente invención presentan > 50 veces selectividad a CB2. Más preferiblemente los compuestos de la presente invención presentan = 100 veces selectividad a CB2. Muy preferiblemente los compuestos de la presente invención presentan = 500 veces selectividad a CB2.

Los compuestos de la presente invención son preferiblemente formulados como composiciones farmacéuticas administradas por una variedad de rutas. Preferiblemente, tales composiciones son par administración oral. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para preparar las mismas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 19a ed., Mack Publishing Co., 1995).

Los siguientes Esquemas de reacción, Preparaciones y Ejemplos se proporcionan para dilucidar mejor la práctica de la presente invención. Condiciones de reacción adecuadas para las etapas de estos Esquemas de reacción, Preparaciones y Ejemplos son bien conocidas en la técnica y la modificación apropiada de condiciones de reacción, que incluyen sustitución de solventes y co-reactivos está dentro de la capacidad de la persona experta.

Además, el experto en la técnica apreciará que en algunas circunstancias, el orden en el cual se introducen las porciones no es crítico. El orden particular de etapas requeridas para producir los compuestos de Fórmula I es dependiente del compuesto particular a ser sintetizado, el compuesto de partida, y la labilidad relativa de las porciones sustituidas, como es bien apreciado por el químico experto. El experto en la técnica apreciará que no todos los sustituyentes son compatibles con todas las condiciones de reacción. Estos compuestos pueden ser protegidos o modificados en un punto conveniente en la síntesis por métodos bien conocidos en la técnica.

Grupos protectores adecuados incluyen aquellos descritos en T.W. Greene, "Protective Groups in Qrganic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, N.Y. , 1 991 , posteriormente referido como "Greene". Greene indica condiciones apropiadas para "protección" y "desprotección" de grupos protectores adecuados para ser usados por el experto en la técnica.

Los intermediarios y productos finales de la presente invención pueden ser además purificados, si se desea por técnicas comunes tales como recristalización o cromatografía sobre soportes sólidos tales como gel de sílice o alúmina.

Los nombres para los compuestos de la presente invención son generados usando Symyx Versión 3.1 . NET con la funcionalidad de nombramiento I UPAC.

Las abreviaturas usadas aqu í son definidas como sigue: "Salmuera" significa una solución acuosa saturada de cloruro de sodio; "BSA" significa albúmina de suero bovino; "DDQ" significa 2,3-dicloro-5,6-diciano-1 ,4-benzoquinona; "EDTA" significa ácido etilendiaminatetraacético; "GDP" significa guanosina difosfato; "HEPES" significa ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinetansulfónic; "MCPBA" significa ácido meía-cloroperoxibenzoico; "MeOH" significa metanol; "THF" significa tetrahidrofurano; "ÍBOC" significa ter-butoxicarbonilo.

Esquema de reacción 1 Un compuesto de Formula (I) puede ser preparado de conformidad con reacciones como se representa en el Esquema de reacción 1 .

En la Etapa 1 , 4,6-dicloro-2-metil-pirimidin-5-ilamina se hace reaccionar con una amina ( 1 ) en una reacción de desplazamiento para proporcionar una diamino pirimidina (2). La reacción puede proceder en la presencia de una base adecuada, tal como trietilamina o diisopropiletilamina, en un solvente tal como etanol o isopropanol, a una temperatura elevada tal como aproximadamente 90 a 160 °C, preferiblemente en un tubo sellado. Alternativamente la reacción se puede realizar usando irradiación de microondas.

En la Etapa 2, se forma una imina de la diamino pirimidina (2) y un benzaldehído (3) en la presencia de un catalizador ácido tal como cloruro férrico en sílice, o ácido p-toluensulfónico. La reacción toma lugar en un solvente adecuado tal como 1 ,4-dioxano o tolueno, a una temperatura elevada tal como aproximadamente 70 °C a 110 °C. En la ausencia de sílice, se pueden agregar tamices moleculares para remover agua de la reacción. Después de la filtración para remover los sólidos y concentración, la ciclización oxidativa de la imina puede ser realizada en un solvente adecuado tal como diclorometano, en la presencia de un oxidato tal como DDQ, a una temperatura adecuada tal como aproximadamente -30 a 40 °C para dar una 6-cloropurina (4).

En la Etapa 3, una 6-cloropurina (4) se somete a una reacción de desplazamiento con una piperazina (5) para proporcionar un compuesto de Formula (I). La reacción puede proceder en la presencia de una base adecuada, tal como trietilamina o düsopropiletilamina, en un solvente tal como metanol, etanol, o isopropanol, a una temperatura elevada tal como aproximadamente 50 a 100 °C. Alternativamente la reacción se puede realizar usando irradiación de microondas.

Se reconocerá por un experto en la técnica que la funcionalidad amina presente en la porción piperazinilo, puede ser protegida con un grupo protector adecuado tal como tBOC. Después del desplazamiento en la Etapa 3, el grupo protector puede ser subsecuentemente removido y la amina acilada o alquilada para además hacer los compuestos de Fórmula (I). Del mismo modo, cuando R2 incluye funcionalidad amina, la amina puede ser protegida con un grupo protector adecuado tal como un grupo tBOC en las secuencias mencionadas antes. Puede ser subsecuentemente desprotegido y acilado o sulfonilado para hacer los compuestos adicionales de la invención.

Además, algunos grupos funcionales pueden someterse a reacciones adicionales en varias etapas en la ruta sintética. Por ejemplo, un intermediario de acetamída (en donde R2 = C(0)NH2) puede ser convertido a un nitrilo con un cloruro de fosforilo.

Esquema de reacción 2 En el Esquema de reacción 2 se representan métodos para elaborar un compuesto de formula (9).

En la Etapa 1 , 6-cloro-2-metil-N4-(2-metilsulfaniletil)pirimidina-4,5-diamina (6) se hace reaccionar con un benzaldeh ído (3) esencialmente como se describe para el Esquema de reacción 1 , Etapa 2 , anterior para proporcionar una alquiltio purina (7) En la Etapa 2, una alquiltio purina (7) es oxidada a una alquilsulfonil purina (8). La reacción procede en la presencia de un agente oxidante adecuado tal como MCPBA en un solvente adecuado tal como diclorometano, a una temperatura adecuada tal como aproximadamente 0 a 40 °C.

En la Etapa 3, una cloro alquilsulfonil purina (8) se somete a una reacción de desplazamiento con una piperazina (5) apropiadamente sustituida para proporcionar una piperazinil purina (9) esencialmente como se describe en el Esquema de reacción 1 , Etapa 3, anterior.

Esquema de reacción 3 En el Esquema de reacción 3 se representa una ruta alternativa para sintetizar compuestos de Fórmula (9).

En la Etapa 1 , 6-cloro-2-metil-N4-(2-metilsulfaniletil)pirimidina-4, 5-diamina (6) se combina junto con un benzaldeh ído (3) y una piperazina (5) en un solvente adecuado, tal como anisol, a una temperatura elevada tal como aproximadamente 120 a 1 50 °C, por un periodo de aproximadamente 3 a 6 d ías, para proporcionar una alquiltio piperazinil purina ( 1 0).

En la Etapa 2, una alquiltiopiperazinil purina ( 10) es oxidada a la sulfona de fórmula (9). La reacción toma lugar en un solvente adecuado, por ejemplo, una mezcla de THF y MeOH , usando una solución acuosa de peroximonosulfato de potasio (Oxone®) a una temperatura adecuada tal como aproximadamente 0 a 60 °C. Alternativamente el alquiltio puede ser oxidado usando MCPBA.

Preparación 1 6-Cloro-2-metil-N4-(2-metilsulfaniletil)pirimidin-4, 5-diamina Se calentó una solución de 4,6-dicloro-2-metil-pirimidin-5-amina (46.0 g , 0 258 mol), 2-(met¡ltio)etil amina (40.05 g, 0.439 mol) y trietilamina (53.3 g, 0.517 mol) en isopropanol (500 ml_) a 90 °C por 30 h. Se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se concentró. Se disolvió el residuo en diclorometano (2 L) y se lavó con agua (2 ? 500 mL) y salmuera (500 mL). Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio sólido, se filtró y evaporó para proporcionar un sólido marrón. Se purificó el residuo en una columna de gel de sílice eluyendo con acetato de etilo para dar el compuesto del título (56 g) . ES/MS (m/z) 233 (M+ 1 ).

Se prepararon las diamino pirimidinas en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento como se describe en la Preparación 1 , usando la amina apropiada y 4,6-dicloro-2-metil-pirimidin-5-amina. Se purificó usando cromatografía en gel de sílice con un eluyente de diclorometano/metanol , acetato de etilo/hexano (Preparación 6), o acetona/hexanos (Preparación 8) .

Preparación 9 6-Cloro-8-(2-clorofenil)-2-metil-9-(2-metilsulfaniletil)pu calentó una mezcla de 6-cloro-2-metil-N4-(2- met¡lsulfanilet¡l)pirimid¡n-4,5-d¡am¡na (1 .63 g , 0.007 mol), 2-clorobenzaldehído (1 .96 g, 0.014 mol), y 1 5% FeCI3 en S¡02 (4.89 g) en 1 ,4-dioxano (1 5 mL) a 1 00°C por 16 h . Se enfrió la reacción y se removió el sílice por filtración a través de tierra diatomácea. Se concentró lo filtrado bajo presión reducida para dar un residuo. Se disolvió el residuo en diclorometano seco ( 1 0 mL) y se agregó 2,3-dicloro-5,6-diciano-1 ,4-benzoquinona (1 .58 g, 0.007 mol) a 0°C. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente por 2 h . Se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano, y se lavó con solución de hidróxido de sodio acuoso 1 N , agua y salmuera. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró para dar un residuo. Se purificó el residuo en una columna de gel de sílice eluyendo con acetato de etilo: hexano ( 1 5:85) para dar el compuesto del título ( 1 .9 g). ES/MS m/z 353 (M + 1 ).

Se prepararon las fenilpurinas en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento como se describe en la Preparación 9, usando la diamino pirimidina apropiada y benzaldehído apropiado. Se purificó por cromatografía en gel de sílice con un eluyente de acetato de etilo:hexano, diclorometano: metanol, o hexano: acetona.

Preparación 15 2-[6-Cloro-8-(2-clorofenil)-2-metil-purin-9-il]acetamida Se calentó una mezcla de 2-[(5-amino-6-cloro-2-metil-pirimidin-4-il)amino]acetamida (2.2 g, 0.01 mol), 2-clorobenzaldehído (2.86 g , 0.02 mol), ácido p-toluen sulfónico (0.2 g) y tamices moleculares (1 .0 g) en tolueno (50 mL) a reflujo por 16 h. Se enfrió y se removieron los tamices por filtración a través de tierra diatomácea. Se concentró lo filtrado bajo presión reducida para proporcionar un residuo. Se disolvió el residuo en diclorometano seco (50 m L) y se agregó 2,3-dicloro-5,6-diciano-1 ,4-benzoquinona (2.3 g, 0.01 mol) a 0 °C. Se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó por 2 h. Se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano, se lavó con solución de hidróxido de sodio acuoso 1 N, agua, y salmuera. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró para dar un residuo. Se purificó el residuo en una columna de gel de sílice eluyendo con diclorometano: metanol (98:2) para proporcionar el compuesto del título (0.3 g). ES/MS m/z 336 (M+ 1 ).

Se preparó la fenilpurina en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento como se describe en la Preparación 1 5, usando la diamino pirimidina apropiada y 2-clorobenzaldehído.

Preparación 17 2-[6-Cloro-8-(2-clorofenil)-2-metil-purin-9-il]acetonitrilo Se calentó una solución de 2-[6-cloro-8-(2-clorofenil)-2-metil-purin-9-il]acetamida (0.3 g, 0.8 mmol) y cloruro de fosforilo (2.5 mL) a 110°C por 16 h. Se apagó la reacción con solución de bicarbonato de sodio acuoso y se extrajo con diclorometano. Se lavaron los orgánicos con agua y salmuera. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró para dar el compuesto del título (0.2 g). ES/MS m/z 318 (M+1).

Preparación 18 6-Cloro-8-(2-clorofenil)-2-metil-9-(2-metilsulfoniletil)p Se agregó ácido mefa-cloroperbenzoico (2.4 g , 0.014 mol) a una solución de 6-cloro-8-(2-clorofenil)-2-metil-9-(2-metilsulfaniletil)purina (1 .98 g , 5.0 mmol) en diclorometano ( 1 5 mL) y se calentó a reflujo por 6 h. Se enfrió la mezcla de reacción , se apagó con solución de bicarbonato de sodio acuoso, y se extrajo con acetato de etilo. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró bajo presión reducida para dar un residuo. Se purificó el residuo en una columna de gel de sílice eluyendo con diclorometano: metanol (98:2) para proporcionar el compuesto del título (1 .95 g). ES/MS m/z 385 (M + 1 ) .

Preparación 19 Diclorhidrato de 1 -(2-Fluoroetil)piperazina Se cargó un recipiente de reacción con N-ter-butoxicarbonilpiperazina (1 .600 g, 8.590 mmol), carbonato de potasio (3.56 g, 25.77 mmol), yoduro de sodio (catalítico) ( 10 mg, 66.7 Mmol), 1 ,4-dioxano (20 ml_) , y 1 -bromo-2-fluoroetano (704.0 µ ?_ 9.45 mmol) . La mezcla se calentó con agitación a temperatura de reflujo durante la noche. Al término de la reacción, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró bajo presión reducida. Se dividió el residuo resultante con acetato de etilo y agua. Se separó la capa orgánica y se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró bajo presión reducida para proporcionar éster ter-butílico del ácido 4-(2-fluoro-etil)-piperazina-1 -carboxílico puro. GC-MS m/z 232 (M).

Se agregó HCI 4 N en 1 ,4-dioxano (21 .52 ml_, 86. 1 mmol) a una solución agitada de éster ter-butílico del ácido 4-(2-f luoro-etil)-piperazina- 1 -carboxílico (2.00 g, 8.61 mmol) en diclorometano seco (60 ml_) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se agitó durante la noche bajo nitrógeno. Se concentró la reacción bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título ( 1 .78 g). ES/MS m/z 1 33 (M+ 1 ).

Ejemplo 1 Clorhidrato de 8-(2-Clorofenil)-6-(4-metilpiperazin-1 -il)-2-metil-9-(2- metilsulfoniletil)purina Se calentó una solución de 6-cioro-8-(2-clorofenil)-2-metil-9- (2-metilsulfoniletil)purina (0.3 g , 0.0007 mol), N-metilpiperazina (0.08 g , 0.0008 mol) y trietilamina (0.08 g , 0.0008 mol) en etanol ( 1 5 mL) a 90°C por 16 h. Se enfrió y se concentró la mezcla de reacción bajo presión reducida. Se disolvió el residuo en diclorometano seco y se lavó con solución de bicarbonato de sodio acuoso, agua, y salmuera. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró para dar un residuo. Se purificó el residuo en una columna de gel de sílice usando diclorometano: metanol (96:4) como eluyente para proporcionar a 8-(2-clorofenil)-6-(4-metilpiperazin-1 -il)-2-metil-9-(2-metilsulfoniletil)purina (0.24g). ES/MS m/z 449 (M + 1 ) .

Se agregó HCI (solución 2.0 M en éter) (0.018 g , 0.0005 mol, 1 .0 eq) a una solución de 8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1 -il)-9-(2-(metilsulfonil)etil)-9H-purina (0.24 g, 0.0005 mol) en éter (4 mL) a 0°C y se agitó por 2 h a temperatura ambiente. Se filtró lo precipitado y se lavó con éter y se secó bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (0.1 5 g) como un sólido blanco. ES/MS m/z 449 (M+ 1 ).

Se prepararon las fenil piperazinilpurinas en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento como se describe en el Ejemplo 1 , usando la piperazina apropiadamente sustituida y 6-cloropurina sustituida.

Preparación 24 8-(2-Clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1 - metilsulfanilet¡l)purina Se disolvió 6-cloro-2-metil-N4-(2-(metiltio)etil)pirim idin-4,5-diamina (28.1 g, 120.7 mmol), y N-metil piperazina ( 14.76 mi, 1 32.81 mmol) en metoxibenceno en un matraz de fondo redondo de 2 I. Se agregó 2-clorobenzaldehído (20.38 mL, 1 81 .1 mmol) en una porción y se elevó la temperatura a 140°C y se mantuvo a esta temperatura por 4 días. Se enfrió la mezcla de reacción y se concentró bajo presión reducida. Se diluyó el aceite resultante con cloruro de hidrógeno acuoso 2 N (200 mL) y se lavó con diclorometano (500 m L) . Se desechó la capa orgánica. Se trató la capa acuosa con una solución de hidróxido de sodio hasta que pH = 14 es alcanzado. Se extrajo en diclorometano. Se secaron los orgánicos sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron, y se concentraron para dar el compuesto del título como un aceite marrón (43 g). ES/MS m/z 417 (M + 1 ).

Ejemplo 1 1 Clorhidrato de 8-(2-Clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1 -il)-9-(2- metilsulfoniletil)purina Se disolvió 8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1 -il)-9-(2-metilsulfaniletil)purina (38.5 g, 92.3 mmol) en una solución de tetrahidrofurano (277 ml_) y metanol (277 ml_). Se preparó a solución de peroximonosulfato de potasio (Oxone®) (79.5 g , 1 29.3 mm ol) en agua (554 mL). Se agregó la solución peroximonosulfato de potasio (300 mL) durante un periodo de 5 minutos y se agitó por 30 min. Después se agregó solución peroximonosulfato de potasio adicional ( 150 mL, seguido por 50 mL después de 30 min). Se agitó la mezcla de reacción por 30 min después de la adición final. Se agregó metabisulfito de sodio sólido (49.1 g, 258.5 mmol) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó solución de bicarbonato de sodio acuoso (400 mL) y se extrajo en acetato de etilo (3 ? 1 L). Se secó la capa orgánica combinada sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró para proporcionar un residuo anaranjado. Se purificó el residuo en una columna de gel de sílice usando 5-50 % de etanol en 1 : 1 diclorometano-hexano como eluyente. Se combinaron y evaporaron las fracciones apropiadas para proporcionar a sólido. Se trituró lo sólido con éter y se secó bajo vacío para proporcionar 8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4- metilpiperazin-1-il)-9-(2-metilsulfoniletil)purina (11.4 g). ES/MS m/z 449 (M+1).

Se suspendió 8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1 -il)-9-(2-metilsulfoniletil)purina (11.3 g, 25.2 mmol) en etanol (150 ml_) y se agregó solución cloruro de hidrógeno acuoso 1 N (6.29 mL, 25.2 mmol, 1 eq). La mezcla se dejó agitar durante la noche y se concentró bajo presión reducida. Se recolectaron los sólidos precipitados por filtración, se lavaron con acetona, y se secaron bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (10.6 g). ES/MS m/z 449 (M+1).

Ejemplo 12 Clorhidrato de 2-[8-(2-Clorofenil)-6-(4-etilpiperazin-1 -il)-2-metil-purin-9- iljetanamina Se agregó ácido trifluoroacético (3 mL) a una solución de N-[2-[8-(2-clorofenil)-6-(4-etilpiperazin-1-il)-2-metil-purin-9-il]etil]carbamato de ter-Butilo (0.6 g, 1.2 mmol) en diclorometano (3 mL) a 0 °C y se agitó por 2 h a temperatura ambiente. Se apagó la mezcla de reacción con solución saturada de bicarbonato de sodio acuoso, y se extrajo con diclorometano. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró para dar un residuo. Se purificó el residuo en una columna de gel de sílice usando diclorometano-metanol (96:4) como eluyente para dar 2-[8-(2-clorofenil)-6-(4-etilpiperazin-1 -il)-2-metil-purin-9-il]etanamina (0.3 g). ES/MS m/z 400 (M+1 ).

Se agregó HCI (solución 2.0 M en éter) (0.027 g , 0.7 mmol) a una mezcla de 2-[8-(2-clorofenil)-6-(4-etilpiperazin-1 -il)-2-metil-purin-9-¡l]etanamina (0.3 g , 0.7 mmol) en éter (5 mL) a 0°C y se agitó por 2 h a temperatura ambiente. Se recolectó lo precipitado por filtración y se lavó con éter. Se secó bajo vacío para dar el compuesto del título (0.25 g) como un sólido blanco. ES/MS m/z 400 (M + 1 ).

Ejem plo 1 3 Clorhidrato de N-[2-[8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1 - il)purin-9-il]etil]carbamato de metilo Se agregó ácido trifluoroacético (5 m L) a una solución de N-[2-[8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin- 1 -il)purin-9- il]etil]carbamato de ter-Butilo (0.51 g, 0.001 mol) en diclorometano (5 mL) a 0 °C. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó por 2 h. Se apagó la mezcla de reacción con solución saturada de bicarbonato de sodio acuoso y después se extrajo con diclorometano. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró para dar 2-[8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1 -il)purin-9-il]ethanamina (0.39 g). ES/MS m/z 386 (M + 1).

Se agregó cloroformiato de metilo (0.25 g, 0.0027 mol) a una solución de 2-[8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1-il)purin-9-il]etanamina (0.39 g, 0.0010 mol) y piridina (4.0 mL) en diclorometano seco (4 mL) a 0°C. Se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó por 2 horas. Se apagó la mezcla de reacción con solución saturada de bicarbonato de sodio acuoso y después se extrajo con diclorometano. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró para dar un residuo. Se purificó el residuo en una columna de gel de sílice usando diclorometano.metanol (97:3) como eluyente para proporcionar N-[2-[8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1-il)purin-9-il]eti!]carbamato de metilo (0.3 g). ES/MS m/z 444 (M + 1).

Se agregó HCI (solución 2.0 M en éter) (0.024 g, 0.0006 mol) a una solución de N-[2-[8-(2-clorofenil)-2-metil-6-(4-metilpiperazin-1-il)purin-9-il]etil]carbamato de metilo (0.3 g, 0.0006 mol) en éter (6 mL) a 0°C y se agitó por 2 h a temperatura ambiente. Se filtró lo precipitado, se lavó con éter, y se secó bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (0.28 g) como un sólido blanco. ES/MS m/z 444 (M+1).

Se prepararon los Ejemplos en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimientos como se describe en el Ejemplo 13, partiendo con N-[2-[8-(2-clorofenil)-6-[4-(2-fluoroetil)piperazin-1 -il]-2-metil-purin-9-il]etil]carbamato de ter-Butilo o N-[2-[6-(4-acetilpiperazin-1-il)-8-(2-clorofenil)-2-metil-purin-9-¡l]etil]carbamato de ter-Butilo. Se desprotegió e hizo reaccionar con cloroformiato de metilo, cloruro de metansulfonilo, o anhídrido acético. clorhidrato de N-[2-[8- (2-clorofenil)-6- [4- (2- 17 fluoroetil ) piperazin-1- 460 (M+l) il] -2-metil-purin-9- il] etil] acetamida Ensayos funcionales in vitro de CBi y CB2 Los compuestos ejemplificados son probados en modo agonista usando un ensayo de enlace de GTP-Y-35S a base de SPA. Todos los componentes son preparados en amortiguador de ensayo elaborado de 20 mM de HEPES, 1 00 mM de NaCI , 5 mM de MgCI2, (pH 7.4 a temperatura ambiente). Se hacen diluciones de compuesto semi-log en amortiguador de ensayo que contiene BSA (0.1 25% final) . El enlace de GTP-y35-S es medido en un formato de 96 cavidades usando una técnica de captura de membrana completa para el ensayo CBi y modificaciones de una técnica de captura de anticuerpo previamente descrita (DeLapp et al. J Pharmacol Exp Ther 289:946-955, 1 999) para el ensayo del CB2. Todas las incubaciones se hacen a temperatura ambiente.

CB, : Membranas de hCBi-CHO, GDP ( 1 uM final), y saponina (1 0 ug/mL final) se agregan al amortiguador de ensayo y homogenizan. Los compuestos diluidos, GTP-?- S (500 nM final) y membranas son agregadas a la placa de ensayo e incubadas por 30 minutos. Después, se agrega 1 mg/cavidad de perlilla SPA de Aglutinina de Germen de trigo, y las placas son selladas, sometidas a vórtices e incubadas por una hora adicional. Las placas son entonces centrifugadas a 700 x g por 10 minutos y contadas por 1 minuto por cavidad usando un contador de escintilación.

CB2-Sf9: Membranas de hCB2-Sf9 y GDP ( 1 uM final) se agregan al amortiguador de ensayo y homogen izan . Los com puestos dil uidos y membranas son agregados a la placa de ensayo y pre-incubados por 1 5 minutos. Esto es seguido por adición de GTP-y-35S (500 nM final) y otra incubación de 35 minutos. Después se agregan una mezcla que contiene detergente Nonidet P40 (0.2% final), anticuerpo anti-Gi (dilución final de 1 :362), y 1 .25 mg de perlillas de ensayo de proximidad de escintilación de anticuerpo anti-conejo. Las placas son entonces selladas, sometidas a vórtices, e incubadas por unas 2 horas adicionales antes de la centrifugación y conteo como para CB^ Para analizar los datos, primero se sustrae el antecedente de todas las cavidades. Se determina el porcentaje de eficacia agonista normalizando los datos de respuesta de dosis del agonista inverso/agonista a una respuesta de agonista completo (metanandamida). Se analizan los datos usando un ajuste reducido log ístico de 4 parámetros con Actividad Base y XLFit3.

Todos los compuestos ejemplificados se probaron esencialmente como se describe anteriormente y cada uno se encontró por tener un valor EC50 relativo para CB2 de =100 nM. El Ejemplo 2 tiene un valor EC50 relativo para CB2 de 17.2 nM y para CBi de 5560 nM. El Ejemplo 16 tiene un valor EC50 relativo para CB2 de 13.5 nM y para CB^ de >100000 nM.

De este modo, los compuestos de la presente invención muestran actividad in vitro del CB2. Además, los compuestos de la presente invención muestran efectividad para CB2 sobre CBT y así proporcionan potencial limitado para efectos secundarios centralmente mediados.

Desplazamiento de 3H-CP55940 a partir de receptores CB2 humanos y de rata Los métodos de Felder et al. (Mol. Pharmaocol. 48:443-450, 1995) se utilizaron con modificaciones menores. Específicamente, homogenados de membrana de células que expresan establemente o temporalmente el receptor CB2 de rata o humano se lavaron por centrifugación y diluyeron en 50 mM de Tris HCI (pH 7.4), 5 mM de MgCI2, 2.5 mM de EDTA, y 0.1% de amortiguador BSA. El enlace específico de 3H-CP55940 se define con 1 µ? de CP55940. La capacidad de los compuestos para desplazar el enlace 3H-CP55940 específico se probó sobre un rango de concentraciones en el amortiguador Tris, MgCI2, EDTA, BSA en la presencia de 1% de dimetil sulfóxido incubando a temperatura ambiente por 90 minutos en un volumen de 300 µ?. Microplacas de 96 cavidades Unifilter pretratadas con 0.5% de polivinilpirrolidona, 0.1% de polisorbato 20 en agua se lavaron tres veces con amortiguador Tris frío. La mezcla de reacción entonces se transfirió a la placa de filtro inmediatamente antes de terminar la incubación por filtración rápida y tres lavados de 200 µ? con amortiguador Tris frío. Después que las placas de filtro se secaron, se agregó microscint 20 a cada cavidad, la placa se selló y contó para determinación de desintegraciones por minuto. Las curvas de desplazamiento fueron graficadas y los valores Ki resultantes se determinaron utilizando Graphpad Prism.

El Ejemplo 3 tiene un valor Ki del receptor humano de 27.8 nM y un valor Ki del receptor de rata de 12.6 nM. El Ejemplo 2 tiene un valor Ki del receptor humano de 28.4 nM y un valor Ki del receptor de rata de 48.7 nM.

De este modo, los compuestos de la presente invención se muestran por unirse a tanto receptores CB2 humanos y de rata in vitro.

Modelo de Monoyodoacetato (MIA) Para todos los estudios se usaron ratas Lewis macho de aproximadamente 8 semanas de edad al tiempo de la inyección de MIA para medir el dolor en el modelo MIA. Las ratas son alojadas en grupos de 2 ó 3 por jaula y mantuvieron a temperatura constante y en un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Los animales tienen libre acceso a alimento y agua todas las veces excepto durante la recolección de datos.

En el modelo MIA estándar la rodilla derecha de cada rata se inyectó con 0.3mg de MIA en 50u l de salina y la rodilla izquierda con 50 u l de salina. Se mide el dolor a tiempos variantes después de la inyección de MIA (no normalmente antes de 1 0 días posteriores a la inyección de M IA) usando pruebas de incapacitancia. Esta mide la diferencia en peso de la pata trasera que lleva entre las rodillas inyectadas con salina y MIA, y cada medición es el promedio de 3 mediciones separadas, cada medición durante 1 segundo.

Para estudios con agonistas de CB2 las ratas son aleatorizadas en grupos de dosis (n = 5 o 6) y después dosificadas con el com puesto bajo i nvestigació n . La dos ifi ca ci ón es esca lonada por 1 5 minutos para cada rata y a un tiempo predeterm inado post-dosis (usualmente 2 horas), el dolor se mide usando pruebas de incapacitancia. Los estudios son rutinariamente ejecutados con 4 grupos, vehículo (1 % de carboximetilcelulosa en agua más 0.25% de polisorbato 80) y 3 grupos de compuesto los cuales pueden ser ya sea compuestos únicos a una dosis única o el mismo compuesto a 3 dosis. Los resultados son reportados como la diferencia en peso que lleva entre las rodillas inyectadas con salina y MIA y las comparaciones estad ísticas se hacen entre los animales tratados con compuesto y tratados con veh ículo, para valorar el efecto de los compuestos en dolor de rodilla en el modelo.

El Ejemplo 1 se probó esencialmente como se describe anteriormente y se encuentra por reducir el dolor contra el vehículo a dosis de 0.3 y 1 mg/kg . El Ejemplo 1 7 se probó esencialmente como se describe anteriormente y se encontró reduce el dolor contra el vehículo a dosis de 0. 1 , 0.3 y 1 mg/kg.

De este modo, los compuestos de la presente invención se muestran por ser útiles en el tratamiento de dolor, en particular dolor articular.

Modelo Animal de Extravasación de Proteína de Plasma Dural (PPE) Ratas macho Harían Sprague-Dawley (250-350 g) se anestesiaron con pentobarbital sódico (65 mg/kg , i.p.) y colocaron en una estructura estereotáxica (David Kopf Instruments) con la barra incisiva ajustada a -2.5 mm . Después de una incisión de la línea media sagital del cuero cabelludo, se taladraron dos pares de agujeros bilaterales a través del cráneo (3.2 mm del lado posterior, 1 .8 y 3.8 mm lateralmente, todas las coordenadas referenciadas al bregma). Pares de electrodos de estimulación de acero inoxidable, aislados excepto en las puntas (Rhodes Medical Systems, Inc.) , se bajaron a través de los agujeros en ambos hemisferios a una profundidad de 9.2 mm .

La vena femoral es expuesta y una dosis del compuesto de prueba se inyecta intravenosamente (i.v. ) a un volumen dosificante de 1 mL/kg. Aproximadamente 8 minutos posteriores a la inyección i.v, una dosis de 20 mg/kg de albúmina de suero bovino-isotiocianato de fluoresceína (FITC-BSA) también se inyectó intravenosamente. El FITC-BSA funciona como un marcador para la extravasación de la proteína. Diez minutos posteriores a la inyección del compuesto de prueba, el ganglio trigeminal izquierdo es estimulado por 5 minutos a una intensidad de corriente de 1.0 mA (5 Hz, duración 5 mseg) con un Estimulador Grass Instrument Modelo S48 con unidad de aislamiento fotoeléctrica PSIU6 (Grass-Telefactor).

Alternativamente, las ratas ayunadas durante la noche son dosificadas oralmente con el compuesto de prueba vía alimentación forzada a un volumen de 2 mL/kg. Aproximadamente 50 minutos después los animales son anestesiados y colocados en la estructura estereotáxica como se describe anteriormente. 60 minutos posteriores a la dosificación p.o., los animales son dosificados con FITC-BSA (20 mg/kg, i.v.). Una hora posterior a la dosificación p.o, los animales son estimulados como se describe anteriormente.

Cinco minutos después de la estimulación, los animales son sometidos a eutanasia por exanguinación con 40 ml_ de salina. La parte superior del cráneo es removida para facilitar la recolección de las membranas durales. Las muestras de membrana son removidas de ambos hemisferios, enjuagadas con agua, y esparcidas aplanadas en laminillas de microscopio. Una vez secos, los tejidos son cubiertos con laminillas con una solución de glicerol/agua al 70%.

Un microscopio de fluorescencia (Zeiss) equipado con un monocromador de rejilla y un espectrofotómetro se usó para cuantificar la cantidad de FITC-BSA en cada muestra. Una longitud de onda de excitación de aproximadamente 490 nm se utiliza y la intensidad de emisión a 535 nm se determina. El microscopio está equipado con una etapa motorizada y también en interfaz con una computadora personal. Esto facilita el movimiento controlado por computadora de la etapa con mediciones de fluorescencia a 25 puntos (etapas de 500 mm) en cada muestra dural . La desviación estándar y media de las mediciones se determinan por la computadora.

La extravasación inducida por estimulación eléctrica del ganglio trigeminal es un efecto ipsilateral (es decir, ocurre solamente en el lado dural en el cual el ganglio trigeminal fue estimulado). Esto permite el uso de la otra (no estimulada) mitad dural como un control. Se calcula la relación de la cantidad de extravasación dural del lado estimulado, sobre la cantidad de extravasación en el lado estimulado. Los animales de control dosificados solamente con salina , proporcionan una relaci ó n de aproxi m ad a mente 2.0. Por e l co ntra ri o , u n com puesto e l cual efectivamente previene l a extravasación dural del lado estimulado podría proporcionar una relación de aproximadamente 1 .0 El Ejemplo 1 se probó esencialmente como se describe anteriormente y se encontró que tiene una relación de extravasación de 1 .12 a 1 0 mg/kg, 2 horas posterior a la dosis. El Ejemplo 7 se probó esencialmente como se describe anteriormente y se encontró que tiene una relación de extravasación de 1 .18 a 10 mg/kg, 2 horas posterior a la dosis.

De este modo, los compuestos de la presente invención se muestran por ser útiles en el tratamiento de dolor, en particular migraña.

Claims (14)

REIVI NDICACIONES

1 . Un compuesto de la fórmula: caracterizado porque: R1 es Cl o CH3; R es C=N , -CH2S02CH3, -CONHCH3, -CH2NR4R5, o -CH2C=N ; R3 es alquilo C1-C2, fluoroalquilo Ci-C2 o C(0)CH3¡ R4 es H , C(0)CH3, C02CH3 o S02CH3; y R5 es H o se combina con R4 para formar pirrolidin-2-ona; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque R1 es Cl.

3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o 2, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque R2 es -CH2S02CH3, -CH2NR R5, o -CH2C=N.

4. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque R2 es -CH2S02CH3

5. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque R3 es metilo, 2-fluoroetilo o C(0)CH3.

6. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde R3 es metilo.

7. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivi nd icaci o nes 1 -6 , o una sal del m i s m o fa rm acéutica me nte aceptable, caracterizado porque R5 es H y R4 es C(0)CH3 o C02CH3.

8. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque es 8-(2-Clorofenil)-6-(4-metilpiperazin-1 -il)-2-metil-9-(2-metilsulfoniletil)purina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

10. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque adicionalmente comprende uno o más ingredientes terapéuticos.

1 1 . Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en terapia.

1 2. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de dolor.

1 3. Un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso de conformidad con la reivindicación 1 2, en el tratamiento de dolor osteoartrítico o migraña.

14. Un método para el tratamiento de dolor, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, a un humano o animal en necesidad del mismo. 1 5. Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque es para el tratamiento de dolor osteoartrítico o migraña.