MX2012011007A - Hemoglobina fetal (hbf) y alfa 1-microglobulina (a1m) como marcadores de etapa temprana para preeclampsia. - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar o predecir el riesgo de de desarrollar preeclampsia A1Medir el nivel de A1M y uno o más de los compuestos HbA, HbF en una muestra y comparar los valores obtenidos con valores de referencia. Al usar una combinación e información que se refiere a A1M y HbF se observa predicción o diagnóstico mejorado.

Description

HEMOGLOBINA FETAL (HBF) Y ALFAl-MICRQGLOBULINA (A1M) MARCADORES DE ETAPA TEMPRANA PARA PREECLAMPSIA Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de hemoglobina fetal (HbF) y (A1M) como marcadores para preeclampsia (PE) .

Antecedentes de la Invención La preeclampsia (PE) afecta hasta el 7-15% de todos los embarazos y es un factor importante de mortalidad y morbilidad maternal. Las manifestaciones de la PE aparecen en el segundo al tercer trimestre. La PE de comienzo temprano, la forma más severa, aparece antes de las 34 semanas de gestación (GW, por sus siglas en inglés) . Los síntomas son frecuentemente vagos y diversos tal como cefalea, visión borrosa y edema. La hipertensión y la proteinuria no son las únicas características distintivas de la enfermedad, sino también están integrales a la diagnosis.

En general, se cree que la PE se desarrolla en dos etapas, donde la primera etapa se caracteriza por placentación defectuosa, que conduce a perfusión sanguínea desigual, lesiones por re-perfusión isquémica y esfuerzo oxidativo incrementado en la placenta. La segunda etapa de PE, el síndrome maternal, se caracteriza por una disfunción vascular general en base a daño endotelial severo que causa Ref.: 235848 eventualmente vasoconstricción, inflamación vascular general y disfunción de múltiples órganos .

Aunque hay parámetros clínicos usados para la diagnosis de PE, hay grandes dificultades en la diagnosis clínica principalmente debido a los síntomas vagos. Ni la cantidad de proteinuria ni el nivel de hipertensión correlacionan bien con la severidad de la PE como se examina por Schroeder B . ACOG practice bulletin on diagnosing and managing preeclampsia and eclampsia, 15 ; 66 (2) : 330-1 y Redman C & Sargent IL, Science ,-308(5728): 1592-4).

Debido al hecho que no hay biomarcadores confiables para predecir y/o diagnosticar la PE, recientemente en este campo se ha puesto un gran esfuerzo. Sin embargo, es un gran reto el hallazgo de un buen biomarcador. Muchos de los marcadores sugeridos necesitan ser combinados entre sí y/o evaluados en combinación con ultrasonido Doppler para mejorar la exactitud de diagnóstico. A la fecha, se han sugerido varios marcadores, pero ninguno se ha aceptado como que es un biomarcador útil para la predicción clínica o diagnosis de la PE. Son promisorios dos factores anti-angiogénicos , que muestran una asociación significativa con la PE: tirosina-cinasa 1 tipo fms soluble (sFIt) y endoglina soluble como se analiza y revisa en Baumann et al., Molecular aspects of medicine 2007 Apr; 28 (2) : 227-4 , Grill et al., Reprod Biol Endocrinol 2009;7:70, Levine et al,. The New England journal of medicine 2004 Feb 12 ,-350 (7) : 672-83 y en Papageorghiou et al., Current opinión in obstetrics & gynecology 2006 Dec; 18 (6) : 594-600.

Se han descrito en la técnica anterior algunos métodos de diagnosis pero ninguno de estos se ha usado aún exitosamente en el escenario clínico a una gran escala. Por ejemplo, se puede mencionar: US 5,079,171 y US 5,108,898, que describen que la PE, la hipertensión inducida por embarazo, y la eclampsia se pueden diagnosticar al identificar la presencia de un marcador de células endoteliales, de la fibronectina celular, en una muestra de sangre, plasma o suero de una mujer embarazada, por ejemplo, al usar un inmunoensayo de intercalación o de competición. La fibronectina celular se deriva de células endoteliales que se rompen o perturban durante el proceso de la enfermedad.

Varios estudios han mostrado una proporción de predicción de aproximadamente 50%, particularmente para PE de comienzo temprano, usando ultrasonido Doppler.

El marcador anti-angiogénico sFIt es un marcador potencial de PE, bien descrito, cuando se usa en el segundo y tercer trimestre. Sin embargo, en el primer trimestre, los niveles de sFIt están sin cambio en comparación a los embarazos normales, haciéndolo menos útil para predicción de la PE. El factor de crecimiento de placenta (PIGF, por sus siglas en inglés) también se ha propuesto como un marcador de PE, pero los datos disponibles muestran resultados en conflicto. La endoglina tiene una menor eficiencia de examen en embarazo temprano en comparación a los niveles predictivos obtenidos cuando se usó la combinación sFlt/PIGF.

La US 5,238,819 describe la diagnosis de PE usando un ensayo para medir un factor mitogénico en sangre. El factor mitogénico es un compuesto proteínico de aproximadamente 160 kDa y es capaz de estimular la mitosis de fibroblastos. Su presencia se detecta al detectar la captación de timidina marcada por células activadas por los sueros o plasmas de un sujeto con PE. Este marcador aparece después del daño en que ya ha ocurrido al hecho vascular maternal, por lo tanto posterior en el progreso de la enfermedad.

La WO 05/093413 (Yale University y Brigham and Women's Hospital) describe un método para diagnosticar PE severa en una mujer embarazada, que comprende medir el nivel de hemoglobina (Hb) libre en una muestra de fluidos cerebroespinal .

Actualmente, no hay curas conocidas para PE. La PE puede variar en severidad de ser moderada hasta amenazante de la vida. Una forma moderada de la PE puede permanecer moderada con descanso en cama y monitoreo frecuente. Para casos moderados a severos, es necesaria la hospitalización y se prescriben medicamentos para la presión sanguínea y medicamentos anti-convulsionantes para impedir ataques. Si la condición llega a ser amenazante de la vida para la madre o el bebe, la única cura es terminar el embarazo, dando por resultado frecuentemente un bebe parido pre-término.

Claramente, la carencia de terapia para PE, acoplada con la carencia de capacidad en edad avanzada para diagnosticarla hasta que ha progresado la enfermedad a una forma más severa, indica la necesidad de nuevos planteamientos para diagnosticar y tratar la PE, que es un problema significativo de salud pública.

Breve Descripción de la Invención La invención como se describe en la presente se basa en datos de estudios de perfil génico y de proteínas que han revelado síntesis incrementada y acumulación de hemoglobina fetal (HbF) en el lumen vascular de placenta obtenida de mujeres con PE. Adicionalmente , los inventores han encontrado que las concentraciones en suero y/o plasma maternal de HbF y el eliminador de hematina, l-microglobulina (A1M) correlacionan con la severidad de la enfermedad en embarazos de término.

Como se escribe en la presente, los inventores han encontrado sorprendentemente que la combinación de la relación HbF y niveles de A1M proporcionan una predicción precisa extraordinaria y se puede aplicar como biomarcadores para examen temprano de la PE .

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Datos demográficos de casos y controles. Datos para semana gestacional en el parto, en el momento de muestreo, peso de nacimiento, parto pre-término y paridad. Los valores mostrados son media (±2 errores estándar) o número (%) . Se usó la prueba U de Mann-Whitney excepto parae. a: p=0.0001 b: p=0.03 c: p=0.001 después de normalizar para edad gestacional . d: 27 primigrávida el medio de PE y 18 el medio de embarazos normales. e: Pre-término definido como parte antes de GW 37+0. 7 Pacientes con PE parieron antes de GW 34+0.

La Figura 2 muestra la concentración media de HbF, A1M y Hb total en los casos preeclámpticos y los controles. Se usó regresión logística binaria para determinar el significado . a: No calculado puesto que la diferencia entre los grupos no es significativa. b: relación HbF se define como concentración de HbF/concentración total de Hb °: Cálculos de relaciones en pares en base a relación HbF x 100. Esto es debido a los valores muy bajos de la fracción de HbF.

Figura 3. Valores de sensibilidad y especificidad para la relación HbF, niveles AIM y la combinación de los dos parámetros . a: Relación HbF = Concentración de HbF/concentración total de Hb b: En base a regresión logística incluyendo ambos parámetros .

Figuras 4A-4B. Gráfica de dispersión La Figura 4A: La gráfica de expresión proporciona una representación gráfica de la distribución de muestras e control PE con relación a la fracción HbF y el tiempo de muestreo .

Relación HbF = HbF/Hb total GW-muestreo: la semana de muestreo La Figura 4B: La gráfica de expresión proporciona una representación gráfica de la distribución de muestra de control y PE con relación al nivel de AIM y el tiempo de sincronización .

AIM: El valor de AIM medido en pg/ml GW-muestreo : la semana de muestreo Figura 5. Curvas de Característica de Operación de Receptor (ROC, por sus siglas en inglés) .

Las curvas de ROC proporcionan representación gráfica de la especificidad (eje X- y la Sensibilidad (eje Y) de la relación HbF, nivel de AIM y su combinación.

Figura 6. Representación gráfica de perfil de riesgo . m: valor de referencia, A1M n: valor de referencia, Relación HbF áreas con escamas gries .

I: Bajo riesgo II y IV: Riesgo elevado III: Riesgo altamente elevado.

Gradiente de color, oscuridad representa riesgo.

Descripción Detallada de la Invención Los estudios llevados a cabo por los inventores han indicado la implicación de estrés oxidativo inducido por Hb en el desarrollo de la PE. Se ha observado el favorecimiento de la expresión de los genes de HbF y la acumulación de loa proteína en la placenta de PE: la Hb libre, es decir fuera de la célula sanguínea roja, y sus metabolitos, hematina y hierro inducen estrés oxidativo por formación de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) . El estrés oxidativo puede dañar la barrera de sangre-placenta, conduciendo fuga de HbF en la circulación maternal y eventualmente provoca niveles elevados en el suero o plasma maternal. En realidad, los niveles incrementados de HbF, la Hb total y los marcadores para estrés oxidativos, así como el eliminador de hematina y la proteína endógena anti-oxidante , A1M, se encontraron que están elevados tanto en plasma como en placenta de mujeres con PE.

AIM es un eliminador endógeno importante para hemetina. Se ha mostrado que su expresión favorece la expresión en respuesta a Hb libre y ROS. AIM se sintetiza y segrega principalmente del hígado, y se distribuye rápidamente de diferentes tejidos donde se encuentra en los compartimientos extra-vasculares como complejos de alto peso molecular unidos a IgA, albúmina y protrombina. El enlace biológico y metabólico entre Hb y AIM se soporta adicionalmente por los actuales resultados, puesto que tanto HbF como AIM se elevaron en las muestras del primer trimestre. El incremento simultáneo de AIM y Hb también se ha mostrado en la PE en embarazos de término .

Como se describe en la presente, la concentración de AIM y uno o más de los marcadores HbA, HbF o la relación HbF (Hbf/Hb total) se puede usar para predecir el riesgo de desarrollar PE. Los valores predictivos obtenidos para la relación HbF y favorablemente con principalmente otros biomarcadores de PE promisorios. Adicionalmente, la relación HbF y los niveles de AIM también son útiles para la diagnosis de PE y la determinación de la severidad de PE en embarazos de término .

Un aspecto de la invención se refiere el uso del nivel de HbF y AIM en combinación para diagnosticar PE. Por lo tanto, este aspecto de la invención se refiere a un método para predecir el riesgo de desarrollar PE a medir la concentración de HbF y A1 (el nivel de HbF y A1M) en un sujeto y la relación de los niveles medidos a valores de referencia a fin de valorar el riesgo de desarrollar PE. La concentración se puede medir en muestras que incluyen orina, sangre, suero o plasma, saliva y más preferentemente en muestras de plasma humano. El nivel de HbF y A1 se puede medir por cualquier método aplicable incluyendo cromatografía, espectrometría de masa y de manera más preferente por arreglos inmunosorbentes enlazados a enzimas, es decir, ELISA para HbF y radioinmunoensayo (RIA) para A1M.

Un aspecto de la invención se refiere al uso de la relación HbF con el nivel de A1M para el diagnóstico de PE. Para corregir la contribución de HbF, derivado de células sanguíneas rojas, maternales, lisadas, se usó la relación HbF/Hb total (relación HbF) . Si bien se debe tomar cuidado en reducir AlMínimo la hemolisis técnica durante el procesamiento de la muestra, que frecuentemente ocurre. Al usar la relación HbF, se pueden evaluar la mayoría de las muestras sin riesgo de una diagnosis o predicción de positivo falso. La relación HbF se correlaciona al nivel de A1M y proporciona por lo tanto una medida más precisa, aplicable para predecir el riesgo de desarrollar PE. Por lo tanto, este aspecto de la invención se refiere a un método para predecir el riesgo de desarrollar PE AlMedir la concentración de HbA, HbF y AlM (el nivel de HbA, HbF y AlM) en un sujeto, calcular la relación HbF y correlacionar la relación HbF calculada con el nivel de AlM a un esquema o valores de referencia a fin de proporcionar una indicación del riesgo de desarrollar PE. Se puede realizar el análisis matemático por cualquier método adecuado, incluyendo análisis de regresión o análisis de regresión logística como por ejemplo análisis de regresión logística binaria. La concentración se puede medir en muestras que incluyen orina, sangre, suero, saliva y más preferentemente en plasma humano. El nivel de HbF y AlM se pueden medir por cualquier método aplicable incluyendo cromatografía, espectrometría de masa y e manera más preferente por arreglos inmunosorbentes enlazados a enzimas, es decir, ELISA para HbF y radioinmunoensayo (RIA) o ELISA para AlM.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para diagnosticar o predecir el riesgo de desarrollar PE, el método que se caracteriza por comprender los pasos: a) Medir el nivel de AlM y uno o más de los compuestos HbA, HbF en un sujeto o en una muestra aislada de un sujeto b) Comparar los niveles medidos con uno o más valores de referencia para valorar la probabilidad de desarrollar PE.

Como se menciona anteriormente, la información combinada que se refiere a los niveles de A1M y HbF da ventajas en comparación a la información relacionada a HbF solo .

Adicionalmente, se pueden incluir pasos adicionales en el método, proporcionando de este modo un método para diagnosticar o predecir el riesgo de desarrollar PE, el método que se caracteriza por comprender los pasos: a) Medir el nivel de A1M y uno o más de los compuestos HbA, HbF en un sujeto o en una muestra aislada de un sujeto, b) Calcular la relación HbF c) Comparar los niveles medidos con uno o más valores de referencia para valorar la probabilidad de desarrollar PE.

Adicionalmente, el método se puede enmendar, proporcionando este método un método para diagnosticar o predecir el riesgo de desarrollar preeclampsia, el método que se caracteriza por comprender los pasos a) Medir el nivel de A1M, HbA y HbF en un sujeto o en una muestra aislada de un sujeto, b) Calcular la relación HbF. c) Comparar la relación HbF y la concentración de A1M a valores de referencia para valorar la probabilidad de desarrollar preeclampsia.

Como un desarrollo adicional, se pueden emplear análisis y métodos matemáticos en los cuales se analizan estadísticamente los valores medidos, proporcionando de este modo un método para diagnosticar o predecir el riesgo de desarrollar PE, el método que se caracteriza por comprender los pasos: a) Medir el nivel de AIM y uno o más de los compuestos HbA, HbF en un sujeto o en una muestra aislada de un sujeto b) Calcular la relación HbF c) Correlacionar la relación HbF al nivel de AIM d) Calcular la relación como se calcula en b) , los datos de correlación como se calculan en c) o niveles medidos en a) a uno o más valores de referencia para valorar la probabilidad de desarrollar PE.

Los presentes métodos pueden incluir adicionalmente análisis estadísticos de los valores medidos como se explica en la presente. Por lo tanto, la diagnosis de, o el riesgo de desarrollar PE se puede valorar al analizar el nivel de AIM y ia relación HbF y/o los niveles de HbF, HbA o AIM como medidas separadas, usando un análisis de regresión logística binaria, opcionalmente con una prueba de relación de probabilidad (LR, por sus siglas en inglés) .

Para valorar el riesgo de desarrollar PE, los valores medidos y/o calculados se pueden interpretar y comparar a conjuntos de valores de referencia.

Al medir y analizar el nivel de HbF en un sujeto, se puede valorar el riesgo de desarrollar PE. Se considera que un sujeto tiene una probabilidad elevada de desarrollar PE y el nivel medido de HbF excede 0.45 pg/ml, tal como por ejemplo 0.75 pg/ml tal como por ejemplo 1.0 pg/ml, tal como por ejemplo 1.5 pg/ml tal como por ejemplo 2.5 pg/ml.

Al medir y analizar el nivel de A1M en un sujeto, se puede valorar el riesgo de desarrollar PE. Se considera que un sujeto tiene una probabilidad elevada de desarrollar PE y el nivel medido de A1M excede 21 pg/ml, tal como por ejemplo 23 pg/ml, tal como por ejemplo 25yg/ml, tal como por ejemplo 30 pg/ml, tal como por ejemplo 35 pg/ml, tal como por ejemplo 40 pg/ml.

Al medir y analizar el nivel de HbA y HbF en un sujeto, se puede valorar el riesgo de desarrollar PE al calcular la relación HbF. Un método de acuerdo a cualquiera de las modalidades precedentes, en donde un sujeto se » considera que tiene una probabilidad elevada de desarrollar PE, si la relación HbF excede 0.0020, tal como por ejemplo 0.0025 tal como por ejemplo 0.0060, tal como por ejemplo 0.01.

Al medir y analizar el nivel de HbF, HbA y A1M, se puede valorar el riesgo de desarrollar PE al calcular la relación HbF y al relacionar la relación HbF al nivel de A1M.

Esto se puede hacer por ejemplo por regresión logística.

Como se resume en la figura 6, la relación HbF se puede usar en combinación con el nivel de AIM para mejorar la predicción de desarrollar PE.

Al combinar los dos parámetros se mejora grandemente la precisión de la predicción. Como se resume en la figura 6, se pueden definir valores específicos de referencia del nivel de AIM (valor m, en la figura 6) así como la relación HbF (valor n, en la figura 6) , por lo cual los sujetos se consideran como que tienen riesgo elevado de desarrollar PE si se exceden los valores de referencia.

En la presente invención, el valor de referencia (m) es aproximadamente 21 pg/ml, tal como por ejemplo 23 pg/ml, tal como por ejemplo 25 g/ml, tal como por ejemplo 30 g/ml, tal como por ejemplo 35 g/ml, tal como por ejemplo 40 g/ml cuando un sujeto se considera que tiene una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia . El valor (n) de referencia es aproximadamente 0.0020, tal como por ejemplo 0.0025 tal como por ejemplo 0.0060, tal como por ejemplo 0.01. De esta manera, si uno de los valores de referencia se excede (representado como área II y IV) , se considera que un sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar PE. Si se exceden ambos valores (es decir, área III, en la figura 6) se considera que un sujeto tiene un riesgo elevadamente alto de desarrollar PE.

Se pueden medir niveles de marcadores de muestras aisladas de un sujeto, más preferentemente muestras maternales .

Las muestras pueden incluir sangre, plasma, orina, y suero. En la presente se describen resultados derivados de plasma/suero venoso maternal. Los niveles se pueden medir por ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) , radioinmunoensayo (RIA) , Western Blot, espectrofotometría, LC-MS, MALDI-TOF MS, cromatografía etc. Las muestras también pueden ser de placenta u orina.

Se pueden aislar muestras de un sujeto y analizar durante el período completo de embarazo como ejemplo durante la semana gestacional 3-42, tal como por ejemplo la semana gestacional 7-24, tal como por ejemplo la semana gestacional 10-20 tal como por ejemplo la semana gestacional 11-16.

Si es posible, se puede realizar una medición no invasiva en el sujeto durante la semana gestacional 3-42, tal como por ejemplo la semana gestacional 7-24, tal como por ejemplo la semana gestacional 10-20 tal como por ejemplo la semana gestacional 11-16.

El nivel de HbF se puede medir por cualquier método aplicable que incluye cromatografía, espectrometría de masas y de manera más preferente por arreglos inmunosorbentes enlazado a enzimas, es decir, ELISA.

El nivel de A1M se puede medir por cualquier método aplicable incluyendo cromatografía, espectrometría de masas y de manera preferente por arreglos inmunosorbentes enlazado a enzimas o radioinmunoensayo (RIA) .

El nivel total de Hb así como el de HbA se puede medir por cualquier método aplicable incluyendo cromatografía, espectrometría de masas y de manera preferente por arreglos inmunosorbentes enlazado a enzimas o radioinmunoensayo (RIA) .

En una modalidad adicional, la invención se refiere a un equipo para medir y analizar el nivel de AIM y uno o más de los compuestos HbA o HbF en un sujeto o en una muestra aislada de un sujeto. Adicionalmente a las herramientas para medir los niveles de AIM, HbA y HbF, el equipo puede comprender guía de cómo realizar el análisis estadístico de los datos medidos, algoritmos para realizar el análisis estadístico de los niveles medidos y valores de referencia por los cuales se pueden comparar los valores medidos y/o calculados a fin de valorar el riesgo de desarrollar PE. Adicionalmente, el equipo puede proporcionar un dispositivo automatizado para medición, cálculo y valoración de riesgo de PE tal como por ejemplo un dispositivo electrónico portátil o estacionario .

Definiciones En esta descripción, a menos que se especifique de otro modo, "un" o "una" significa "uno o más" .

Como se usa en la presente, PE se define de acuerdo a la International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy. La definición para PE es por lo tanto: dos lecturas de presión sanguínea mayor de 140/90 mmHg Al enos con cuatro horas de separación, y proteinuria, mayor que o igual a 300 mg en 24 horas, o dos lecturas de AlMenos 2+ en un análisis de varilla indicadora de corriente media o especímenes de orina en catetes, si no estuvo disponible colección de orina de 24 horas. De manera alternativa, se pueden aplicar otras definiciones del término "preeclampsia" como se define de acuerdo con por ejemplo los criterios establecidos por el comité en Terminology of the American College of Obstetrics and Gynecology, es decir, hipertensión mas proteinuria, edema aparente, o ambos. Por ejemplo, se puede definir la PE como presión sanguínea > 140/90 mm de Hg y proteinuria > 0.3 g/L después de 20 semanas de gestación.

Como se define en la presente, el término embarazo normal se definió como parto después de 37 G y presión sanguínea normal .

Hemoglobina A (HbA) . Existen diferentes formas de Hb. La Hb de adulto (HbA) consiste de dos cadenas polipeptídicas alfa y dos beta (Hba, Hb) , cada una que contiene un grupo de hemetina no peptídica que se une de forma reversible a una molécula individual de oxígeno. La Hb A2 , otro componente de Hb de adulto está compuesta de dos cadenas alfa y dos cadenas delta (Hba, Hb6) .

El término "Hb libre" , en esta descripción se refiere a la Hb libre en general e incluye Hb libre total, Hb A libre, Hb A2 libre, Hb F libre, cualquier subunidad de Hb libre (por ejemplo una cadena de Hba, Hbp, Hb6 o Hby) , o cualquier combinación de esto. Adicionalmente incluye estas entidades de Hb en cualquier forma polipeptídica (proteína) o nucleótida (R A) , excepto cuando se aplica como un objetivo para tratamiento.

Hemoglobina fetal (HbF) . El término "Hb fetal" se refiere a HbF libre o cualquier subunidad de HbF e incluye entidades de HbF en una forma polipeptídica (proteína) o nucleótida (ARN, por sus siglas en inglés) , excepto cuando se aplique como un objetivo para tratamiento.

En esta descripción, el término "libre" como se usa, inter alia, en las expresiones "Hb libre", "Hb fetal libre" o "subunidades de Hb libre (por ejemplo cadenas de Hba, Hb, Hb-d o Hby)" se refiere a Hb, Hb fetal o subunidades de Hb que circulan libremente en un fluido biológico, como lo opuesto a Hb celular, que se refiere a moléculas que residen dentro de células. El término "libre" en ese sentido se usa de esta manera principalmente para distinguir Hb libre de Hb, que está presente en eritrocitos intactos.

Como se usa en la presente, el término referido como relación HbF se refiere a HbF/Hb total y se calcula por consiguiente como el nivel de HbF dividido con el nivel total de Hb.

Los términos "marcador" o "biomarcador" , en esta descripción, se refiere a una biomolécula, de manera preferente, un polipéptido o proteína, que está presente de forma diferencial en una muestra tomada de una mujer que tienen PE o una mujer en riesgo creciente de desarrollar PE en comparación a una muestra comparable tomada de una mujer, referida como una mujer/sujeto "normal" que no tiene preeclampsia o no está en riesgo incrementado de desarrollar PE.

El término "muestra biológica de mamífero femenino embarazado", el término "sujeto" o equivalentes de esto se propone que denote una muestra del mamífero mismo; por consiguiente, la muestra no se obtiene por ejemplo del feto o el fluido amniótico.

Como se usa en la presente Hb fetal, abreviada HbF se refiere al tipo de Hb, que es el componente principal de Hb en el feto. La Hb fetal tiene dos cadenas polipeptídicas alfa y dos gamma (Hba, Hby) .

Como se usa en la presente al-microglobulina (AIM) , se refiere AlMiembro de la familia de lipocalina, nombrado alfa-l-microglobulina. Alfa-l-microglobulina se puede referir en la literatura como AIM, EDC1 , HCP, HI30, IATIL, ITI, ITIL, ITILC y UTI .

A todo lo largo de la descripción, cualquiera y todas las referencias se incorporan específicamente en esta solicitud de patente como referencia.

Ej emplos Ejemplo 1 Pacientes y datos demográficos Se incluyeron un total de 96 mujeres. Los pacientes con otras enfermedades tal como diabetes e hipertensión esencial se excluyeron. Se incluyeron sesenta mujeres quienes desarrollaron subsiguientemente PE (casos) y 36 con embarazo normal no complicado (controles) . Todos los controles parieron después de 37+0 GW.

Las características se muestran en la Tabla 1. De los 60 casos, 20 casos parieron antes de 37+0 semanas gestacionales (GW) , de los cual siete parieron antes de 34+0 GW. Todos los resultados de embarazo se probaron de la base de datos de distribución principal y se verificaron para cada paciente individual. Se usó la definición de The International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy definition para PE: dos lecturas de presión sanguínea mayores de 140/90 mm de Hg AlMenos con cuatro horas de separación, y proteinaurea, mayor que o igual a 300 mg en 24 horas, o dos lecturas de AlMenos 2+ en análisis de barra indicadora de corriente media o especímenes de orina e catéter, sino estuvieron disponibles colecciones de orina de 24 horas. El embarazo normal se definió como parto después de 37 GW y presión sanguínea normal. Las muestras de control se seleccionaron al azar de mujeres quienes participaron en el estudio durante el mismo período de tiempo.

Los pacientes se reclutaron con un permiso ético, como parte de un estudio prospectivo en curso de marcadores de ultrasonido y suero de primer trimestre para PE en mujeres que atienden una visita de cuidado antenatal de rutina en la unidad obstétrica del St Georges Hospital, Londres. Se calculó la edad gestacional del último período menstrual y se confirmó por la medición de corona - rabadilla - longitud por ultrasonido.

Ejemplo 2 Muestreo Se recolectó una muestra de suero venoso materno a las 11 a 16 GW para análisis de HbF, Hb total y A1M. La sangre venosa se recolectó en un tubo vacutainer de 5 mi (Beckman Dickson) sin aditivos para permitir la coagulación y se centrifugó a 2000 g a temperatura ambiente durante 10 min.

El suero se almacenó a -80°C hasta análisis adicional .

Ejemplo 3 Medición de Hb total, HbF y A 1M Se determinaron las concentraciones de HbF y A1M por un ELISA de intercalación y radioinmunoensayo (RIA) , respectivamente, como se describe anteriormente. La concentración de Hb total de suero es midió por un ELISA competitivo, usando anticuerpos contra Hb de adulto (HbA) como se describe anteriormente. La relación HbF/Hb total se calculó y se refirió como relación HbF.

Ejemplo 4 Análisis estadístico Se usó software estadístico de computadora (SPSS, por sus siglas en inglés) para analizar los datos. Se analizó la probabilidad de desarrollar PE con relación a la relación HbF y/o los niveles de HbF, HbA o A1M, usando un análisis de regresión logística binaria con una prueba de relación de probabilidad (LR) . Se calcularon relaciones impar (OR, por sus siglas en inglés) para los biomarcadores . Puesto que la relación HbF mostró bajo valores, se multiplicó por 100 antes de que se calcular a la OR se uso en todas las pruebas un nivel de significado de 0.05.

Se hicieron curvas de ROC para HbF, A1M, relación HbF y la combinación de relación HbF y A1M en base a los resultados de regresión logística. Se calculó el área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) de las curvas de ROC. El análisis de regresión logística permitió probar la sensibilidad a diferentes proporciones positivas de examen. Se evaluó el nivel óptimo de sensibilidad. Las correlaciones lineales entre los tres biomarcadores se evaluaron por análisis de correlación bivariable calculando los coeficientes de correlación de Pearson.

Ejemplo 5 Los grupos de estudio Los datos demográficos de los casos incluidos y los controles se muestran en la Figura 1 y en Ejemplo 1. Hubo una diferencia significativa esperada en la duración gestacional en el momento del parto. Hubo una diferencia significativa en el peso de nacimiento después de la correlación a la etapa gestacional (p=0.001). Las muestras sanguíneas de PE se recolectaron en promedio 8 días después de las muestras de control (p=0.018) .

Ejemplo 6 Niveles en plasma de A 1M y relación HbF Se vio una alta concentración de Hb total en todas las muestra, sugiriendo un cierto grado de hemolisis. Los altos niveles se verificaron por espectrofotometría (datos no mostrados) . Sin embargo no hubo diferencia significativa en la concentración de Hb total entre los grupos examinados, 178 g/ml en PE y 206 g/ml en los controles (p=0.232) (Figura 2). La concentración media de HbF fue 1.38 g/ml en PE y 0.45 g/ml en los controles. Puesto que la hemolisis de fondo puede contribuir a los valores de HbF, y puesto que los niveles de HbF correlacionaron significativamente a los niveles totales de Hb, se calculó la relación HbF (HbF/Hb total) . La relación media de HbF se elevó significativamente en PE en comparación a los controles (p<0.0001 X Figura 2). La relación HbF relacionada a la edad gestacional se muestra en una gráfica de dispersión (Figura 4A) . El valor medio de AIM se elevó significativamente ¦ en PE (24 g/ml) en comparación a los controles (21 pg/ml, p=0.0001 ). Los niveles de AIM se relacionan a la edad gestacional y se muestran en una gráfica de dispersión (Figura 4B) .

Ejemplo 7 Análisis de correlación Ni los niveles de HbF ni los niveles de relación HbF se correlacionaron significativamente a los niveles de AIM (p=0.17, r=0.16). Sin embargo, los niveles de HbF correlacionaron significativamente a los niveles totales de Hb (p=0.001, r=0.35), una correlación que aún fue más fuerte en los casos de PE (p=0.005, r=0.39). Los niveles de Hb total y AIM no se correlacionaron significativamente (p=0.61, r=-0.055).

Correlación de Relación HbF a edad gestacional La relación HbF y niveles de AIM se probaron para correlación a etapa gestacional en el muestre (gráficamente representado en la figura 1) . No se observó correlación a la edad gestacional entre 10-16 GW ni para relación HbF ni para AIM.

Curvas de característica de operación de receptor (ROC) y regresión logística Se usó regresión logística para calcular las relaciones impares y de significado (Figura 2) . Se trazaron curvas de ROC (Figura 5) y la sensibilidad y especificidad para la relación HbF, AIM y su combinación, se obtuvieron. Los resultados se analizaron en cuatro diferentes valores de corte como se representa en la figura 3. El área bajo la curva (AUC) fue 0.82 para la relación HbF, 0.75 para AIM y 0.89 para la combinación de la relación HbF y AIM. La combinación de los dos marcadores mostró los valores más altos de predicción, con una sensibilidad óptima de 90% a 23% de proporción positiva de examen (Figura 3) .

Ejemplo 8 Diagnosis por medición combinada de la relación HbF y el nivel de A 1M Se determinaron las concentraciones de HbF y AIM por un ELISA de intercalación y radioinmunoensayo (RIA) , respectivamente, como se describe anteriormente. La concentración total en suero de Hb se midió por un ELISA competitivo, usando anticuerpos contra Hb de adulto (HbA) como se describe anteriormente. La relación HbF/Hb total se calculó y se refirió como relación HbF.

Como se resumen en la figura 6, la relación HbF se puede usar en combinación con el nivel de AIM para mejorar la predicción de desarrollar PE.

Al combinar los dos valores, se mejoró en su mayor parte en la precisión de la predicción. Como se resumen en la figura 6, se pueden definir valores específicos de de referencia del nivel de A1M (valor m, en la figura 6) así como la relación HbF (valor n, en la figura 6) , por lo cual los sujetos se consideran como que tienen riesgo elevado de desarrollar PE si se excedieron estos valores de referencia.

En la presente invención, el valor de referencia (m) es aproximadamente 21 pg/ml, tal como por ejemplo 23 g/ml, tal como por ejemplo 25 g/ml, tal como por ejemplo 30 µg/ml, tal como por ejemplo 35 g/ml, tal como por ejemplo 40 g/ml y un sujeto se considera que tiene una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia . El valor de referencia (n) es aproximadamente 0.0020, tal como por ejemplo 0.0025 tal como por ejemplo 0.0060, tal como por ejemplo 0.01. De esta manera, si uno de los valores de referencias se excede (representado como área II y IV), se considera que un sujeto tiene un riesgo elevado de desarrollar PE. Si ambos valores se exceden (es decir, área III, en la figura 6) se considera que un sujeto tiene un riesgo altamente elevado de desarrollar PE.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para predecir el riesgo de desarrollar preeclampsia, caracterizado porgue comprende los pasos de: a) durante la semana gestacional 10-20 medir los niveles de AIM, HbA y HbF en una muestra de suero aislada de un sujeto, b) calcular la relación HbF/Hb total (relación HbF) , en donde el sujeto se considera que tiene una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si la relación HbF excede 0.0020 y el nivel medido de AIM excede 21 g/ml .

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es una muestra maternal.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porgue la muestra se aisla en un sujeto en la semana gestacional 11-16.

4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la medición se realiza durante la semana gestacional 11-16.

5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el nivel de HbF se determina por ELISA

6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el nivel de AIM se determina por radioinmunoensayo (RIA) o ELISA.

7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración total de Hb se mide por ELISA o ELISA competitivo.

8. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la probabilidad de desarrollar preeclampsia se analiza usando un análisis de regresión logística binaria con una prueba de relación de probabilidad (LR) .

9. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque un sujeto se considera que tiene una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si el valor medido de HbF excede 0.45 pg/ml, 0.75 g/ml 1.0 g/ml, 1.5 g/ml 2.5 g/ml.

10. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque un sujeto se considera que tienen una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si el nivel medido de AIM excede 23pg/ml, 25pg/ml, 30pg/ml, 35pglml, o 40pg/ml.

11. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque un sujeto se considera que tienen una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si la relación HbF excede 0.0025, 0.0060, o 0.01.

12. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque un sujeto se considera que tienen una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si la relación HbF excede 0.0020, 0.0025, 0.0060 o 0.01 y el nivel de A1M excede 21 g/ml, 23pg/ml, 25 g/ml, 30pg/ml, 35 g/ml, o 40 g/ml.

13. Uso de A1M y la relación HbF/Hb total (relación HbF) como marcadores de etapa temprana durante la semana gestacional 10-20 para predecir la probabilidad de desarrollar preeclampsia,

14. Uso de conformidad con la reivindicación 13 , en donde los niveles de A1M, HbA y HbF se miden en una muestra de suero aislada.

15. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en donde la muestra se aisla de un sujeto durante la semana gestacional 11-16.

16. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde el nivel de HbF y/o Hb se mide por ELISA.

17. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en el cual el nivel de A1M se determina por radioinmunoensayo (RIA) o ELISA.

18. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en donde el sujeto se considera que tienen una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si la relación HbF medida excede 0.0020 y el nivel medido de A1M excede 21 pg/ml.

19. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en donde un sujeto se considera que tienen una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si el nivel de A1M excede 23pg/ml, 25 g/ml, 30pg/ml, 35pg/ml, o 40 g/ml .

20. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-19, en donde un sujeto se considera que tienen una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si el nivel medido de HbF excede 0.45 µg/ml, 0.75 pg/ml, 1.0 µg/ml, 1.5 µg/mo o 2.5 ug/ml.

21. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-20, en donde un sujeto se considera que tienen una probabilidad elevada de desarrollar preeclampsia si la relación HbF excede 0.0025, 0.0060, o 0.01.

22. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-21, en donde un sujeto se considera que tienen una probabilidad altamente elevada de desarrollar preeclampsia si la relación HbF excede 0.0020, 0.0025, 0.0060, o 0.01 y el nivel de A1M excede 21 g/ml, 23pg/ml, 25 g/ml, 30 g/ml, 35 g/ml, o 40 g/ml.