MX2012010661A - Metodo para obtener factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) humano recombinante biologicamente activo. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para obtener G-CSF humano recombinante biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión, en donde el proceso de solubilización y redoblado puede ser realizado a temperatura ambiente y el paso de purificación comprende cromatografía de fase inversa (RP), en particular RPHPLC. La preparación de G-CSF así obtenida es caracterizada por alta pureza y homogeneidad.

Description

METODO PARA OBTENER FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS (G-CSF) HUMANO RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ACTIVO Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), en particular G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) en una forma altamente activa y pura. Esto es logrado al redoblar G-CSF solubilizado contenido en cuerpos de inclusión en un sistema redox apropiado a temperaturas ambiente y usando al menos un paso de cromatografía de fase inversa (RP) en el proceso de purificación.

Antecedentes de la invención El G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos) es una citocina hematopoyética, liberada principalmente por células mononucleares y fibroblastos, que estimula la proliferación y diferenciación de células precursoras del linaje de granulocitos y la activación de neutrófilos funcionalmente maduros. Debido a dichas características, G-CSF ha llegado a ser usado en diferentes campos médicos, como por ejemplo en la reconstitución de poblaciones de células sanguíneas normales subsecuente a la quimioterapia o irradiación o para estimular la respuesta inmune a patógenos infecciosos. Así en las clínicas, G-CSF es principalmente empleado en terapia anti-tumor, en particular en el tratamiento de neutropenia como una consecuencia de quimioterapia, y es usado adicionalmente en trasplantes de médula ósea y en el tratamiento de enfermedades infecciosas. La primera preparación de G-CSF comercialmente disponible basada en G-CSF recombinante fue producida y distribuida por Amgen bajo el nombre comercial Neupogen®.

El G-CSF humano en su forma que ocurre de manera natural es una glicoproteína teniendo un peso molecular de aproximadamente 20,000 Daltones y cinco residuos de cisteína. Cuatro de estos residuos forman dos puentes de disulfuro intramoleculares, los cuales son de esencial importancia para la actividad de la proteína. Formas recombinantes de G-CSF son usados principalmente para producir farmacéuticos, los cuales pueden ser obtenidos, por ejemplo, por medio de la expresión en células de mamífero como CHO (células CHO (de ovario de hámster chino) o en células procarióticas como E. coli. Cuando las proteínas recombinantes son expresadas en procariotes, las proteínas son frecuentemente producidas dentro de la célula huésped en la forma de agregados insolubles al menos parcialmente inactivos (cuerpos refractivos, cuerpos de inclusión IB). Antes de que tales proteínas puedan ser usadas tienen que ser convertidas en su forma activa.

La formación de dichos cuerpos de inclusión conduce a la necesidad de solubilizar y renaturalizar las proteínas subsecuentes a aislamiento de los cuerpos de inclusión por medio de centrifugación a velocidad moderada con la ayuda de medios adecuados con el fin de mantener su configuración activa.

Los procesos para la renaturalización de proteínas recombinantes derivadas de cuerpos de inclusión son generalmente conocidos yd escritos, por ejemplo, en EP 0 114 506, WO 84/03711, US 4,530,787 y EP 0 241 022. Además, las técnicas generales que se refieren a solubilización y renaturalización de proteínas desnaturalizadas han sido descritas en EP 0 512097, EO 0 364926, EP 0 219 874 y WO 01/87925 y pueden ser tomadas adicionalmente a partir de literatura científica y trabajos estándares sobre química de proteínas.

EP 0 500 108 describe un método para activar G-CSF recombinante humano en una forma inactiva a partir de cuerpos de inclusión usando un sistema de lanzadera redox de glutationa reducida (GSH) y glutationa oxidada (GSSH) y análisis de cinética de reactivación para G-CSF bajo ciertas condiciones. Sin embargo, no se describe un proceso de purificación corriente abajo.

En EP 0 719 860, G-CSF conteniendo cuerpos de inclusión fueron solubilizados con N-lauroilsarcosina (sarcosilo) y subsecuentemente el redoblado fue logrado mediante oxidación con aire usando sulfato de cobre. Las desventajas de este método son las reacciones laterales, por ejemplo, formación de radicales de superóxido sobre cadenas laterales de aminoácidos. Adicionalmente, el proceso de redoblado es lento y es difícil de obtener parámetros de redoblado estandarizados. Finalmente, la remoción del desnaturalizante incluyendo un paso cromatográfico conduce a una pérdida de aproximadamente 20% de rendimiento de proteína total. El G-CSF obtenido es purificado subsecuentemente mediante cromatografía de intercambio aniónico y una cromatografía de intercambio catiónico.

EP 1 630 173 y EP 1 837 346 describe métodos para obtener G-CSF recombinante humano a partir de cuerpos de inclusión usando un sistema de lanzadera redox de glutationa reducida (GSH) y glutationa oxidada (GSSH), en donde el paso de redoblado es realizado a bajas temperaturas durante más de medio día. Por lo tanto, en una escala industrial este proceso es consumidor de energía y así de costo, debido al enfriamiento de grandes volúmenes de solución de proteína durante muchas horas. El G-CSF resultante es subsecuentemente purificado mediante cromatografía de intercambio catiónico.

En WO2007/009950, el método para purificación de G-CSF mostrado en EP 1 630 173 es especificado adicionalmente con respecto a los pasos cromatográficos en la cromatografía de intercambio catiónico y la cromatografía de interacción hidrofobica son realizados consecutivamente sin algún peso intermedio entre ellas. En particular, el procedimiento de purificación cromatográfica comprende una secuencia de dos pasos de cromatografía de intercambio catiónico conducido antes y después de la cromatografía de interacción hidrofobica, respectivamente.

Sin embargo, aunque se conocen medios y métodos para proporcionar G-CSF purificado en grado terapéutico en la técnica anterior, los procesos disponibles a la fecha para obtener G-CSF a partir de cuerpos de inclusión, en particular a una escala comercial son generalmente consumidores de tiempo, trabajo y costo. Este problema técnico es resuelto por las modalidades como es caracterizado en las reivindicaciones y descrito más adelante adicionalmente. Además, como se describe adicionalmente más adelante, estas modalidades proporcionan una separación de una isoforma de G-CSF conformacional y, por lo tanto, una preparación de G-CSF altamente homogénea.

Breve descripción de la invención La presente invención proporciona un método para recuperar y purificar factor estimulante de colonias de granulocitos (rhG-CSF) a partir de una célula recombinante productora de G-CSF. Dicho método comprende solubilizar la proteína recombinante a partir de cuerpos de inclusión , redoblar la molécula de G-CSF simplemente al diluir el solubilizado dentro de un amortiguador de redoblado a temperaturas moderadas de preferencia > 10°C y purificar el G-CSF redoblado mediante cromatografía, en donde al menos un paso de cromatografía comprendió una cromatografía de fase inversa (RP). Este método es caracterizado generalmente por (a) solubilizar el G-CSF contenido en los cuerpos de inclusión con un amortiguador de solubilización conteniendo un agente desnaturalizante y un agente reductor, (b) redoblar el G-CSF al diluir el solubilizado con un amortiguador de redoblado conteniendo glutationa reducida y oxidada a una temperatura > 1 0°C; y (c) purificar el G-CSF redoblado por al menos un paso de cromatografía, de preferencia comprendiendo cromatografía de fase inversa (RP).

En particular, en un aspecto la presente invención es basada en un proceso de redoblado en un sistema redox adecuado conducido a temperaturas por arriba de 10°C dentro de menos de la mitad del día y ventajosamente a temperatura ambiente, es decir, a 20 ± 2°C dentro de 3 a 4 horas. Además del hecho de que una renaturalización eficiente y precisa de moléculas de G-CSF puede ser lograda bajo estas condiciones, las desventajas de métodos previos descritas en la técnica anterior referidas antes pueden ser evitadas. Así, el método de la presente invención es fácil de realizar, consumiendo menos tiempo y no involucra sistemas de enfriamiento consumidores de energía.

Adicionalmente, el método de la presente invención se basa en la sorprendente observación de que durante el procedimiento para producir y recuperar G-CSF, al menos una isoforma de G-CSF es formada, lo cual se vuelve solo visible al aplicar una cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (RP-HPLC) analítica a 60°C, ver Fig. 3, que revela una hidrofobicidad ligeramente menor que la forma principal. La naturaleza estructural de esta isoforma mal doblada adicional de G-CSF fue investigada en detalle y caracterizada adicionalmente como se describe más adelante. El contenido máximo de la isoforma de G-CSF adicional en la preparación entera podría formar hasta 7% del rendimiento de proteína de G-CSF total. Análisis detallado usando espectroscopia de CD reveló que la isoforma de G-CSF difiere de la presente referencia de G-CSF en un mayor contenido de estructuras a-helicoidales (66% de la isoforma y 52% para la referencia de G-CSF). Un rasgo característico de esta isoforma adicional es su menor hidrofobicidad en comparación con un estándar de referencia de G-CSF y la fracción principal de la preparación de G-CSF de la presente invención, razón por la cual puede ser separado y así casi excluido completamente de la preparación. Como un resultado, la incorporación del paso de cromatografía de RP y en particular RP-HPLC como un paso de proceso dentro del método de la presente invención conduce a una preparación de G-CSF altamente purificada, es decir, mejorada, la cual está substancialmente libre de esta isoforma e impurezas relacionadas con producto adicionales, es decir, el contenido de isoforma de G-CSF menos hidrofobico permanece por debajo de 1% de proteína de G-CSF total. En este contexto, la cromatografía de RP va a ser distinguida de la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) que no es una modalidad preferida del método de acuerdo con la presente invención. De ahí, con respecto a la purificación de G-CSF, RP y RP-HPLC, respectivamente, se ha empleado solo hasta ahora para fines analíticos; ver, por ejemplo, WO2007/009950. Los principios de cromatografía mencionados también son distinguidos definitivamente entre expertos (ver, por ejemplo, Bioanalytik, F Lottspeich, H. Zorbas (ed.); Heidelberg, Berlín, Alemania, Spectrum Akad. Verlag 1998). Por ejemplo, aunque HIC es normalmente eluida con agua, la RP es eluida con solvente, en donde la elución es hecha con un gradiente a mayores concentraciones de solvente tal como acetonitrilo o etanol. De preferencia, los pasos cromatográficos comprenden cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de RP bajo condiciones apropiadas, precedida por una aplicación de una cromatografía de intercambio catiónico (CEX).

En este contexto, es producente asumir que en los métodos de la técnica anterior para obtener G-CSF para isoformas de cuerpos de inclusión de G-CSF son formadas también pero hasta ahora no han sido detectadas debido a que bajo las condiciones de la RP-HPLC analítica usada en la técnica anterior, las isoformas no fueron evidentes. Adicionalmente, debido a que la existencia de tales isoformas de G-CSF no era conocida, no hubo razón para buscarla .

De acuerdo con esto, el método de la presente invención , en particular el paso de cromatografía de RP preparatoria y paso de RP-HPLC, respectivamente, puede implementarse en procesos de purificación para G-CSF, especialmente G-CSF obtenida de cuerpos de inclusión después de la solubilización/renaturalización en un sistema redox adecuado, tal como aquéllos descritos en los documentos referidos antes. Más aún , en combinación con el paso de cromatografía de intercambio de cationes (CEX) precedente, estos dos pasos de cromatografía son suficientes para purificar G-CSF recombinante en un grado que es suficiente al uso del G-CSF resultante como un medicamento. Así , aunque el método de la presente invención puede ser realizado de preferencia como se señala en la Fig . 1 e ilustra en los Ejemplos, la persona experta en la técnica reconocerá que con el fin de llegar a un G-CSF con un grado terapéutico, realizar cromatografía de CEX y una RP-H PLC subsecuente es suficiente m ientras que cualquier otro paso de purificación puede ser alterado u omitido totalmente.

En resumen, se provee un método para obtener G-CSF recombinante humano biológicamente activo, puro, que puede ser conducido con un mínimo de pasos de proceso de fabricación manteniendo la complejidad técnica así como costos de energ ía a un bajo nivel, y en donde la preparación de G-CSF resultante es substancialmente similar a productos de referencia comercialmente disponibles y desprovista de isoformas adicionales de G-CSF.

La preparación de G-CSF obtenida de acuerdo con el método de la presente invención es así ventajosa en comparación con aquéllos obtenidos de acuerdo con métodos de la técnica anterior, los cuales no utilizan una cromatografía de RP-HPLC en términos de pureza, es decir, ya que son más homogéneos en sus moléculas de proteína de G-CSF. Más aún, debido a la homogeneidad de la preparación de G-CSF de la presente invención, es prudente esperar que la actividad in vivo de la preparación de G-CSF de la presente invención sea al menos similar si no es que mejorada a los productos de G-CSF recombinantes hasta ahora comercialmente disponibles. Esto también implica que las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de otra manera serán similares a las de los productos del mercado. El G-CSF obtenido de acuerdo con el método de la presente invención es así particularmente adecuado para uso en medicina humana .

Además, la preparación de G-CSF de la presente invención es particularmente adecuada para derivación adicional, debido a que el producto químicamente modificado retiene la alta pureza y homogeneidad de la preparación de G-CSF. Por lo tanto, en una modalidad adicional , el método de la presente invención comprende además modificación quím ica del G-CSF obtenido de acuerdo con dicho método, por ejemplo, al unir covalentemente un polímero soluble en agua al G-CSF, tal como polietilenglicol (PEG).

Adicionalmente, en vista de las consideraciones anteriores, la presente invención concierne a un método para la producción de una composición farmacéutica de G-CSF recombinante o un derivado del mismo y aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como amortiguadores, sales y estabilizantes, en donde dicho método comprende el método para obtener G-CSF como se describe en la presente y en particular en los Ejemplos. De preferencia , el G-CSF biológicamente activo purificado o derivado del mismo, por ejemplo, G-CSF pegilado, es formulado en ácido acético 1 0 mM a un pH de 4.0, 0.0025% de polisorbato 80 y 50 g/l de sorbitol. Las composiciones farmacéuticas así obtenidas también son sujeto de la presente invención .

Breve descripción de los dibujos Fig. 1 : Esquema de diagrama de flujo que ilustra el procedim iento de aislamiento y purificación de G-CSF de acuerdo con el método de la presente invención. Como se ilustra, en una modalidad preferida de la presente invención, el proceso de purificación y obtención de G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión comprende los pasos: (a) fermentación y recolección a. Cultivar las células recombinantes productoras de rhG-CSF, las cuales sobre-expresan rhG-CSF que se acumula en alta densidad en cuerpos de inclusión ; b. Aislamiento de cuerpos de inclusión; c. Solubilización de cuerpos de inclusión mediante el uso de un agente reductor en un amortiguador de desnaturalización seguido por filtración; d. Redoblado logrado al suministrar un amortiguador de redoblado y transferir la mezcla de solubilización hacia dicho amortiguador de redoblado en un proceso de dilución de paso simple, en donde un sistema redox basado en glutationa oxidada y reducida (GSH/GSSH) es usado en un amortiguador de hidrocloruro de arginina de álcali débil e incubar a temperaturas por arriba de 1 0°C durante al menos tres horas para g e nera r rhG-CSF so l u ble biológicamente activo en un tanque de acero inoxidable seguido por filtración; (b) purificación de rhG-CSF soluble a. Paso de ultra- y diafiltración para intercambiar el amortiguador, reduciendo la concentración del desnaturalizante y concentrando el G- CSF redoblado, de preferencia al usar un tamaño de poro de MWCO 10 kDa y seguido por filtración; b. Cromatografía de intercambio catiónico para remover especies agregadas así como proteínas huésped y DNA, intercambiar el amortiguador, y concentrar la fracción de G-CSF vía reducción de volumen; c. Un paso de microfiltración para remover impurezas insolubles; d. Un paso de purificación de RP-HPLC bajo condiciones adecuadas a temperaturas ambiente realizadas mediante por ejemplo, un Júpiter C4, con el fin de remover la isoforma de G-CSF menos hidrofóbica, la cual levíga antes de la fracción principal de G-CSF; y remover los derivados oxidados y reducidos de G-CSF . e. Un paso de ultra- y diafiltración (por ejemplo, filtración de flujo tangencial) para concentrar G-CSF purificado y ajustar G-CSF en la formulación deseada, de preferencia al usar un tamaño de poro de MWCO 5 kDA y seguido por filtración; f. almacenamiento de G-CSF purificado de preferencia a 2-8°C. Los pasos individuales de proceso y purificación son explicados adicionalmente en la descripción y ejemplos.

Fig . 2: Análisis de Western blot de rhG-CSF purificado aislado a partir de cuerpos de inclusión. Las proteínas de G-CSF purificadas fueron separadas por 4-20% de Tris-Glicina SDS-PAGE y manchadas. El Western blot se incubó con anticuerpo anti-G-CSF primario y se desarrolló usando un anticuerpo reportador secundario. Cada 0.1 µ? de proteína fue cargado por ranura. 3, 7, 9 y 1 3, campos vacíos; 2, 8 y 14, marcador de peso molecular (Magic Mark XP); 4-6, G-CSF obtenido mediante el método como se ilustra en los Ejemplos; 1 0-1 2, Neupogen® como referencia. Neupogen® y G-CSF corrido a aproximadamente 18 kDa como se muestra en los campos 4-6 comparado con los campos 10-1 2. Como resultado, G-CSF obtenido de acuerdo con el método de la presente invención carece aparentemente de bandas adicionales y es comparable con Neupogen®.

Figs. 3A-B: Análisis de RP-H PLC anal ítico de preparación de rhG-CSF antes o después del paso de purificación preparador de RP-HPLC de acuerdo con el método de la presente invención. Después de redoblado y purificación mediante cromatografía CEX, las muestras de G-CSF fueron tomadas antes (Fig. 3A) o después (Fig. 3B) del paso de purificación de cromatografía preparatoria RP-HPLC y sometidas a análisis de RP-HPLC analítica a 60°C con el fin de determinar la composición de las muestras. G-CSF * denota la isoforma menos hidrofóbica de G-CSF, mientras que G-CSF designa la fracción principal. Notar, en (Fig. 3A) con la muestra tomada antes del paso de purificación de RP-HPLC, un pico adicional antes del pico de fracción principal es visible (flecha). En (Fig. 3B) con la muestra tomada después del paso de purificación de RP-HPLC, el pico principal es visible, mientras que el segundo pico correspondiente a la isoforma de G-CSF menos hidrofóbica resaltada en (A) por una flecha está casi faltando completamente.

Descripción detallada de la invención La presente invención generalmente concierne a un método para la producción a gran escala de una preparación de G-CSF altamente purificada y homogénea con cantidades minimizadas de una isoforma menos hidrofóica de G-CSF comparada con una G-CSF de referencia. De manera más específica, la presente invención se refiere a un método para obtener G-CSF a partir de una célula recombinante productora de G-CSF, tal como E. coli comprendiendo solubilización de la proteína de G-CSF recombinante a partir de los cuerpos de inclusión, redoblado de la molécula de G-CSF al diluir el solubilizado dentro de un amortiguador de redoblado a temperaturas ambiente, de preferencia >10°C, y purificar el G-CSF redoblado mediante cromatografía, en donde al menos un paso de cromatografía comprende cromatografía de fase inversa (RP) . En otras palabras, el método de la presente invención se refiere a un método para obtener G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión comprendiendo los pasos: (a) solubilizar el G-CSF contenido en los cuerpos de inclusión con un amortiguador de solubilización conteniendo un agente desnaturalizante y un agente reductor; (b) redoblar el G-CSF al diluir el solubilizado con un amortiguador de redoblado conteniendo glutationa reducida y oxidada a una temperatura > 10°C; y (c) purificar el G-CSF redoblado por al menos un paso de cromatografía comprendiendo cromatografía de fase inversa (RP) .

De acuerdo con la presente invención, el término "G-CSF humano biológicamente activo" es entendido por denotar una preparación de G-CSF, la cual ha sido purificada mediante el método de acuerdo con la presente invención y es capaz de intensificar la diferenciación y proliferación de células progenitoras hematopoyéticas y de activar ciertas células maduras del sistema hematopoyético. Así , el G-CSF obtenido por medio del método de acuerdo con la presente invención es adecuado para tratar indicaciones donde la administración de G-CSF es ventajosa. Se entiende que el término "G-CSF humano biológicamente activo" también incluye mutantes y modificaciones de G-CSF, cuyas secuencias de aminoácidos son alteradas como es comparado con la secuencia tipo natural, pero la cual tiene actividades biológicas similares como el G-CSF tipo natural. Lo mismo aplica a conjugados de G-CSF. Normalmente, el G-CSF es G-CSF recombinante humano. De preferencia, el G-CSF a ser purificado es G-CSF de metionilo (Met) humano producido en células de E. coli.

El término "una isoforma menos hidrofóbica", como se usa en la presente, se refiere a una preparación/fracción de G-CSF la cual tiene la misma masa, punto isoeléctrico y mapeo de péptido idéntico incluyendo puentes disulfuro como se reveló por ejemplo, mediante degradación de Edman y geles de enfoque isoeléctrico (IEF) o mediante espectrometría de masa. Más aún, ni aductos de lípido ni iso-aspartato son detectables mediante espectrometría de masa. La isoforma de G-CSF menos hidrofóbica puede ser caracterizada en su diferencia en espectros de CD comparadas con la referencia de G-CSF en el rango casi UV (OD 260-320 nm) indicando un mayor contenido de estructuras a-helicoidales (66% para la isoforma y 52% para la referencia de G-CSF). Además, la diferencia en hidrofobicidad del presente G-CSF y su isoforma puede ser demostrada mediante RP-HPLC analítica a 60°C. Estas diferencias son la razón por la cual la isoforma menos hidrofóbica es eluída en una fracción más temprana comparada con la referencia de G-CSF en una cromatografía de RP-HPLC, la cual es aplicada a 60°C. Así, la isoforma de G-CSF de acuerdo con la invención puede ser definida por sus propiedades distintas de ser menos hidrofóbica y levigar en una RP-HPLC aplicada a 60°C en diferentes fracciones, en donde la isoforma de G-CSF es levigada antes del pico principal del presente G-CSF; ver Figs. 3A-B. Las técnicas para caracterizar las muestras comprendieron SDS-PAGE, IEF, UV, CD, espectroscopia de fluorescencia y NMR; ver además supra y los Ejemplos. Tomada toda junta la información, la isoforma de G-CSF menos hidrofobica es explicada mejor como una variante plegada teniendo una estructura 3D ligeramente alterada, la cual es considerada como una forma mal doblada. Su remoción debería conducir a productos de medicamento más eficientes y seguros.

Como se menciona , la preparación de G-CSF de la presente invención está substancialmente libre de la isoforma de G-CSF menos hidrofobica. El término "substancialmente libre" de una isoforma de G-CSF menos hidrofobica o "con una cantidad minimizada" de isoforma de G-CSF menos hidrofobica significa que la preparación de G-CSF de la presente invención contiene normalmente menos de 5% de la isoforma de G-CSF menos hidrofobica, de preferencia menos de 1 %, ventajosamente menos de 0.2% de las isoformas de G-CSF menos hidrofóbicas.

De acuerdo con la presente invención , el término "cuerpos de inclusión" se refiere a agregados compactos, insolubles, intracelulares, a partir de proteína expresada recombinante incorrectamente plegada o doblada parcialmente correcta, la cual puede ser aislada como una fracción particulada mediante centrifugación de Usados de células.

El término "solubilización" como se usa en la presente significa que el G-CSF, el cual forma cuerpos de inclusión se vuelve disuelto al tratar con un desnaturalizante, por ejemplo, un agente caotrópico y un agente reductor, por lo cual interacciones ínter- e intramoleculares, las cuales no están presentes en la proteína natural , se rompen , resultando por ello en una dispersión monomérica de G-CSF recombinante.

De acuerdo con la presente invención , el término "agente desnaturalizante" se refiere a un agente, el cual es capaz de desdoblar una proteína, resultando así en una reducción o pérdida de la conformación de proteína natural. Para el uso en amortiguadores de solubilización, los agentes caotrópicos adecuados o desnaturalizantes son urea, guanidina-HCL, arginina, tiocianato de sodio, de pH extremo (bases o ácidos diluidos), detergentes (por ejemplo, SDS, Sacrosyl), sales (cloruro, nitratos, tiocianatos, tricloroacetato), derivación qu ímica (sulfitolise, reacciones en las bases con Citraconanhydrid), solventes (2-amino-2-metil-1 -propanol o alcoholes, DMSO, DMS) o resinas de intercambio aniónico fuerte como por ejemplo, Q-Sepharose.

Las concentraciones apropiadas de urea son 1 -9 mol/l, de preferencia 5-9 mol/l . Las concentraciones apropiadas de guanidina-HCI son 1 -8 mol/, de preferencia 4-8 mol/l. En una modalidad preferida de acuerdo con la presente invención , el agente desnaturalizante es guanidina-HCI, de preferencia en donde la concentración de guanidina-HCI es 6.0 mol/l; ver además los Ejemplos.

Normalmente, el amortiguador de solubilización en el método de la presente invención contiene un agente reductor además del agente desnaturalizante. Los agentes reductores adecuados son glutationa reducida (GSH), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE) , cisteína, ß-mercaptoetanol. De preferencia, el agente reductor en el método de la presente invención es DTT. En una modalidad de la presente invención, la concentración del agente reductor en el amortiguador de solubilizacion es 1 a 100 mmol/l, de preferencia 1 a 10 mmol/l, y puede ajustarse de acuerdo con los Ejemplos. De acuerdo con la presente invención, un componente amortiguador adecuado del amortiguador de solubilizacion puede ser tris(hidroximetil)-aminometano o fosfato, el cual debería exhibir un valor de pH básico, con el fin de permitir la reducción de puentes disulfuro.

Con el fin de asegurar una solubilizacion eficiente y completa, una proporción apropiada de cuerpos de inclusión y amortiguador de solublización es requerida. De acuerdo con la presente Invención, 10 a 100 mi de amortiguador de solubilizacion por gramo de cuerpos de inclusión son usados, de preferencia 1 a 80 mi, muy preferiblemente 1 a 40 mi, más preferiblemente > 20 ml/g y normalmente > 30 mi por gramo de cuerpo de inclusión.

Adicionalmente, en una modalidad de la presente invención un agente quelante, por ejemplo, etilen diamino tetra acetato (EDTA) o dimetilaminoetanol (DMAE) es adicionado al amortiguador de solubilizacion y/o redoblado para formar complejos de iones de metal en solución acuosa. Una vez unido a EDTA, estos iones de metal tienden a no interferir con la acción de los detergentes o tener la capacidad para oxidar el agente reductor. Además, las proteasas dependientes de metales son inhibidas por los agentes quelantes. En una modalidad preferida de la invención, el amortiguador de solubilizacion y/o amortiguador de redoblado contiene EDTA disódico, de preferencia en una concentración entre 0.5 a 10 mM: De acuerdo con la presente invención, para asegurar una solubilización eficiente y completa, el tiempo de solublización en el método de la presente invención es 1 a 1 0, de preferencia 4 a 8, muy preferiblemente 6 ± 1 horas o 5.5 a 6.5 horas. En una modalidad preferida adicional, el proceso de solubilización es realizado a temperaturas ambiente por arriba de 10°C, de preferencia entre 1 5-30°C, muy preferiblemente a 20 ± 2°C, es decir, a la misma temperatura o similar que el proceso de redoblado; ver supra y los Ejemplos.

De acuerdo con la presente invención , el desecho de células huésped debería ser eliminado de G-CSF solubilizado para asegurar que nada de substancias distractoras interfieren con el proceso de redoblado. Por lo tanto, el solubilizado es sometido de preferencia a filtración antes de diluir con el amortiguador de redoblado. Por ejemplo, la proteína de G-CSF solubilizada es separada de desechos de células huésped , proteina desdoblada agregada, dímeros, multímeros y/o proteina desdoblada por G-CSF mediante filtración a través de un filtro de 1 .5 µ?? .

La formación de enlace disulfuro intramolecular en la proteína G-CSF es promovida mediante la adición de un amortiguador de redoblado comprendiendo un par redox. Un "par redox" se refiere a mezclas de reactivos de tiol reducidos y oxidados e incluyen por ejemplo, glutationa reducida y oxidada (GSH/GSSG), cisteína/cistina , cisteamina/cistamina, DTT/GSSG, y DTE/GSSG así como mezclas de cualquiera de los componentes de par redox mencionados; ver, por ejemplo, Clark, Cur. Op. Biotech . 1 2 (2001 ) , 202-207. En una modalidad de la presente invención, el par redox es GSH/GSSG , en donde la concentración de glutationa reducida y oxidada es 0. 1 a 20 mmol/l, de preferencia 0.5 a 10 mmol/l, muy preferiblemente 0.2 a 1 0 mmol/l cada una, ver también los Ejemplos.

El redoblado con el fin de lograr G-CSF biológicamente activo, puede ser realizado en amortiguadores a un pH neutral o básico. De preferencia, el proceso de redoblado es realizado a un valor de pH de aproximadamente 8. Los amortiguadores de redoblado pueden incluir otros aditivos para intensificar el redoblado, por ejemplo, L-arginina o hidrocloruro de arginina (0.4-1 mol/I) ; PEG; bajas concentraciones de desnaturalizantes, tales como urea ( 1 -2 mol/l) y guanidina-HCL (0.5- 1 .5 mol/I); y detergentes (por ejemplo, Chaps, SDS, CTAB, lauril maltósido, Polysrobate 80/Tween 80©, y Tritón X-1 00) . En una modalidad preferida de la presente invención, el amortiguador de redoblado contiene además arginina-HCI.

Entre las estrategias de redoblado conocidas, la dilución todavía es la metodolog ía más simple. En aplicaciones de escala industrial, la dilución es usada comúnmente para redoblar las proteínas recombinantes expresadas en cuerpos de inclusión . Normalmente, la dilución es realizada en un paso al mezclar/diluir la solución conteniendo proteína solubilizada con un diluyente conteniendo un agente solubilizante en una cantidad necesaria para alcanzar el nivel óptimo de dilución . Cuando la concentración de agente solubilizante está por debajo de un cierto nivel de umbral , la proteína comienza a regañar su conformación tridimensional biológicamente activa. Dependiendo de la proteína específica y las condiciones de doblado elegidas, el redoblado comienza dentro de milisegundos a segundos. En esta fase de explosión inicial , la proteína es altamente susceptible a agregación. Para m inimizar la agregación, la concentración de proteína tiene que ser mantenida bastante baja, de preferencia por debajo de 2 mg/ml . Después de esta fase de redoblado inicial, la proteina se forma en una estructura más compacta y finalmente, hasta una conformación de proteína natural que es menos susceptible de agregación. El redoblado completo, incluyendo la formación de enlaces disulfuro, puede lograrse para G-CSF dentro de horas. Con el fin de asegurar una renaturalización eficiente y completa, una proporción apropiada de solubilizado con amortiguador de redoblado es requerida. De acuerdo con la presente invención , el solubilizado es diluido con amortiguador de redoblado en una proporción de 1 a 1 00, de preferencia 1 a 40, muy preferiblemente 1 a 20; ver además los Ejemplos.

El término "diluir con amortiguador de redoblado" como se usa de acuerdo con el método de la presente invención en principio incluye diluir el solubilizado en una cantidad predeterminada de amortiguador de redoblado y vaciar el amortiguador de redoblado en la muestra de solubilizado. De preferencia, el solubilizado es adicionado al amortiguador de redoblado bajo agitación . En una modalidad preferida de la presente invención , el proceso de dilución dura aproximadamente una hora.

Como se menciona antes, en el método de la presente invención el proceso de redoblado en un sistema redox adecuado puede ser conducido a temperaturas ambiente, es decir usualmente por arriba de 10°C dentro de menos de la mitad del día y ventajosamente a temperatura ambiente, es decir a 20 ± 2°C dentro de 3 a 4 horas. La temperatura ambiente puede variar entre 1 0°C y 30°C y de preferencia está entre 1 5°C y 25°C, más preferiblemente entre 1 7°C y 23°C y en particular preferida entre 1 9°C y 21 °C. El tiempo para redoblado puede orientarse hacia las condiciones ¡lustradas en los Ejemplos. Así, mientras que el proceso de redoblado a aproximadamente 20 ± 2°C dura aproximadamente 3 a 4 horas ya sea el mismo marco de tiempo o una o dos horas más o menos pueden usarse dependiente de si el proceso de redoblado es realizado por debajo de 1 8°C o por arriba de 22°C. En cualquier caso, la duración del proceso de redoblado es menor que 1 2 horas.

Usando el método de la presente invención , 70% del contenido de proteína de G-CSF total a partir de cuerpos de inclusión puede ser redoblada en G-CSF biológicamente activo.

El proceso de redoblado puede ser detenido al bajar el pH del amortiguador de redoblado a un pH ácido. En una modalidad preferida de la presente invención, el ácido acético es usado para reducir el pH a 3.0 a 6.5, de preferencia 3.5 a 5.5, muy preferiblemente a 4.0.

Una vez que la proteína de G-CSF ha sido redoblada, un tensioactivo o surfactante puede ser adicionado a la muestra de proteína . En una modalidad preferida de la presente invención, un detergente no iónico, de preferencia Polysorbate 20 u 80, muy preferiblemente Polysorbate 80 (Tween 80©) es adicionado a la muestra de la proteína G-CSF redoblada en una concentración final de 0.001 a 1 %, de preferencia 0.05 a 0.1 %, muy preferiblemente a una concentración final de 0.05 a 0.06% o de 0.01 % , dependiendo del uso adicional del G-CSF.

En muchos casos, será ventajoso someter la configuración de redoblado a filtración antes de procesar adicionalmente con el fin de remover partículas de alto peso molecular, las cuales son frecuentemente agregados de proteína formados durante el doblado. En una modalidad preferida del método de la presente invención, la solución de proteína redoblada es filtrada a través de una cascada de filtro, de preferencia a través de una cascada de filtro de 1 0 y 1 .2 µ??. Siguiendo la filtración, la solución puede ser almacenada en un paso de mantenimiento, en donde las temperaturas ambiente como 22 ±2°C son preferidas; ver además Fig . 1 y Tabla 1 en el Ejemplo 6 anexado de la presente invención.

Con el fin de alcanzar una mayor concentración de producto de la preparación de G-CSF obtenida después del redoblado, la proteína de G-CSF puede ser dializada o diafiltrada para remover el par redox y/u otros componentes amortiguadores no deseados. De acuerdo con esto, un proceso de filtración es provisto en la presente para remover desecho celular, proteínas contaminantes insolubles y precipitado de ácido nucleico. Este paso proporciona un medio conveniente para remover económicamente el desecho celular, que contamina proteínas y precipitado. Al elegir un filtro o esquema de filtro, es necesario asegurar un desempeño robusto en el caso de que ocurran cambios o variaciones corriente arriba. Mantener el balance entre buen desempeño de clarificación y rendimiento de pasos requiere investigación de una gran variedad de tipos de filtro con varios medios de filtro. Los tipos de filtro adecuados pueden utilizar filtros de celulosa, fibras de celulosa regenerada , fibras de celulosa combinadas con auxiliares de filtro inorgánico (por ejemplo, tierra de diatomáceas, perlita, sílice ahumado) , fibras de celulosa combinadas con auxiliares de filtro inorgánicos y resinas orgánicas, o cualquier combinación de los mismos, y filtros poliméricos (ejemplos incluyen pero no están limitados a nylon, polipropileno, poliéter sulfona) para alcanzar remoción efectiva. En una modalidad, la filtración , por ejemplo, un paso de ultra y diafiltración es conducido usando una membrana UF de 5 - 10 kDa y aproximadamente un intercambio de amortiguador de 8 x donde el amortiguador es intercambiado por Na-acetato y un detergente no iónico, por ejemplo, Polysorbato 80 a un pH de 4.

La diafiltración es un proceso de fraccionamiento de lavar moléculas más pequeñas, dejando la molécula más grande de interés en el retenido. Es una técnica conveniente y eficiente para remover o intercambiar sales, remover detergentes, separar moléculas libres de unidas, remover materiales de bajo peso molecular, o cambiar rápidamente el ambiente de pH o iónico. El proceso normalmente emplea una membrana de microfiltración con el fin de remover un producto de interés de la pasta al tiempo que se mantiene la concentración de pasta como una constante.

Como se describe antes, el paso de purificación cromatográfica esencial en el método de la presente invención comprende cromatografía de fase inversa (RP) , en particular un paso de cromatografía l íquida de alta presión , de fase inversa (RP-H PLC) en una escala industrial . Mediante RP-HPLC anal ítica a 60°C, es posible visualizar el contaminante de isoforma de G-CSF menos hidrofóbíca en la muestra de G-CSF obtenida después del proceso de redoblado, el cual es caracterizado por el contenido a-helicoidal de 66% y el perfil de elución mostrado en las Figs. 3A-B. como se menciona en la técnica anterior, diferentes pasos de cromatografía hidrofóbica o de intercambio de iones han sido realizados para purificar G-CSF, aunque RP-HPLC como un paso de purificación a una escala industrial no ha sido previsto.

Medios y métodos para realizar cromatografía de fase inversa (RP) son bien conocidos para la persona experta en la técnica. De preferencia, el paso de cromatografía de fase inversa (RP) es cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (RP-H PLC). Normalmente, el RP-HPLC es realizado con resinas que contienen grupos metilo, butilo, fenilo, propilo y/u octilo como grupos funcionales y que emplean sistemas de fase móvil conteniendo solvente orgánico. En una modalidad preferida del método de la presente invención, la RP-HPLC es realizada con un material de cromatografía de fase inversa de C4 comercialmente disponible. Materiales de fase inversa ejemplares son: Vydac 214TPB1 01 5, C4 disponible de Grace Davison; Daisopak SP-300-1 5-C4-BIO disponible de DAISO Fine Chem . GmbH ; YMC Gel Butyl Sphárisch C4, 1 5 µ , 300A disponible de YMC Europe GmbH; Júpiter 1 5µ, C4, 300A disponible de Phenomenex.

En una modalidad particularmente preferida del método de la presente invención , se usa una resina cromatográfica Júpiter C4 en la RP-H PLC y una resina cromatográfica Source 1 5 RPC o Source 30 RPC (proveedor GE Healthcare) es usada en la cromatografía RP. Júpiter C4 consiste de partículas de gel de sílice, las superficies de las cuales portan cadenas de C4-alquilo. De acuerdo con la presente invención, una resina cromatográfica Júpiter C4 es muy preferiblemente usada; ver además los Ejemplos.

La separación de G-CSF de las impurezas proteináceas se basa en las diferencias en la fuerza de interacciones hidrofóbicas. La elución es realizada con un solvente menos polar que agua , por ejemplo, un gradiente de acetonitrilo, etanol o meta n ol e n agua , de preferen cia usando acetonitrilo en presencia de ácido trifluoroacético diluido. Por ello, la isoforma menos hidrofóbica de G-CSF puede ser separada de G-CSF al ser eluido dentro de diferentes fracciones. Usualmente, la isoforma menos hidrofóbica de la preparación de G-CSF total es eluida en una fracción más temprana que el estándar de G-CSF. El G-CSF y la isoforma de G-CSF menos hidrofóbica pueden ser eluidas con un gradiente lineal de un solvente orgánico, por ejemplo, de 0 a 90% de acetonitrilo en gua , es decir, Agua para I nyección (WFI) y conteniendo aproximadamente 0. 1 % de TFA. De preferencia, el RP-HPLC es realizado como se describe en los Ejemplos. El eluido es recolectado de preferencia en viales pre-llenados con amortiguador conteniendo Polysorbate 80; ver además supra y los Ejemplos.

Como se explicó antes y se ilustró en los Ejemplos, en el método de la presente invención el paso de cromatografía de RP es precedido normalmente mediante una cromatografía de intercambio de iones. Así, en una modalidad preferida de esta invención , G-CSF es purificada usando cromatografía de intercambio de iones simple con el fin de remover todos los contaminantes como proteínas de células huésped, en particular endotoxinas y DNA de célula huésped . En principio, la cromatografía de intercambio de iones o cromatografía de intercambio de aniones puede ser usada.

En una modalidad particularmente preferida del método de la presente invención , una cromatografía de intercambio de cationes (CEX) es realizada después del G-CSF redoblado es ultra- y diafiltrado. Como se ilustra en los Ejemplos, un paso de cromatografía de CEX con un material seleccionado (CM Sepharose® FF) está siendo realizado que permite velocidades de flujo particularmente altas y buena recuperación de producto. Debido al hecho de que es cargado positivamente en un ambiente ácido, G-CSF es un ligante fuerte y es eluido con un gradiente de cloruro de sodio lineal a un pH ácido en un pequeño volumen a una alta concentración en el amortiguador deseado. Así, de acuerdo con la presente invención , el paso de CEX es usado antes de la cromatografía de RP, en particular antes de una RP-HPLC, para intercambio de amortiguador, la concentración de G-CSF y remoción de agregados de G-CSF. Medios y métodos para realizar la cromatografía de intercambio de cationes son bien conocidos para la persona experta en la técnica ; ver además la técnica anterior declarada en la sección de antecedentes, supra o el proveedor GE Healthcare. Por ejemplo, pueden emplearse matrices convencionales comercialmente disponibles. En la presente, el G-CSF se une a la matriz de intercambio catiónico dentro de un rango de pH específico debido a su carga total positiva, mientras que la mayoría de las substancias contaminantes como ácidos nucleicos, lipopolisacáridos y proteínas que se originan a partir de células huésped así como isómeros iónicos de G-CSF y formas alteradas de G-CSF teniendo diferentes valores de pH no son capaces de unirse y aparecer en el flujo a través o de ser removidos por medio de lavado. Las matrices de intercambio de cationes adecuada incluyen , pero no están limitadas a, carboximetil (CM) celulosa , AG 50 W, Bio-Rex 709, carboximetil (CM) Sephadex, sulfopropil (SP) Sephadex, carboximetil (CM) Sepharose CL-6B, CM Sepharose H P, cerámica Hyper D-S (Biosepra) y sulfonato (S) Sepharose, SP Sepharose FF, SP Sepharose HP, SP Sepharose 1 5 XL, CM Sepharose FF, TSK gel SP 5PW, TSK gel SP-5PW-HR, Toyopearl SP-650M, Toyopearl SP-650S , Toyopearl SP-650C, Toyopearl CM-650M , Toyopearl CM-650S, etc. Matrices de sulfopropilo, en particular los productos SP Sepharose XL y SP Sepharose FF (Flujo rápido) y S-Sepharose FF, disponibles de Amersham Biosciences, Freiburg , Alemania (ahora GE Healthcare) . En una modalidad, el material de intercambio de cationes es un material de intercambio de cationes de sulfopropilo. En una modalidad preferida del método de la presente invención, la cromatografía de intercambio de iones es cromatografía de intercambio de cationes (CEX) y es realizada con CM-Sepharose FF; ver además los Ejemplos 6 y 7.

Los amortiguadores adecuados para la cromatografía de intercambio de cationes incluyen amortiguadores de maleato, malonato, citrato, lactato, ácido acético, acetato, fosfato, REPES; Bistris y Bicin. En una modalidad preferida, el ácido acético como un componente amortiguador es usado. De preferencia, la concentración del amortiguador cae entre 10 y 100 mM, de preferencia entre 20 mM y 50 mM. De acuerdo con la presente invención, un tensioactivo también es incluido en el amortiguador, de preferencia Polysorbate 20 u 80, muy preferiblemente Polysorbate 80 es usado; ver además supra. Purificar la preparación de G-CSF es conducida mediante el uso de un valor de pH del amortiguador que no es mayor que 6.0, de preferencia no mayor que 5.5. Subsecuentemente, el lavado de la columna , en donde G-CSF es unido, es usualmente realizado por cinco volúmenes de columna (CVs) de amortiguador de equilibrio, compuesto de ácido acético, Polysorbate 80 a pH 5.5.

G-CSF puede ser eluido a partir de la columna por medio de una alteración del amortiguador, en caso de la cromatografía de intercambio de cationes por medio de un aumento en el valor de pH o un aumento en la fuerza iónica. De preferencia , la elución es efectuada por medio de incrementar la fuerza iónica , de preferencia al usar un gradiente de cloruro de sodio lineal . Condiciones adecuadas para la cromatografía de intercambio de cationes puede ser tomada a partir de la literatura relevante, como por ejemplo, del manual "Ion Exchange Chromatography - Principies and Methods" (Cromatografía de intercambio de iones -Principios y métodos) por Amersham Biosciences, Freiburg , Alemania (ahora GE Healthcare) , 2002 y Ejemplo 7.

En una modalidad preferida particular del método de la presente invención, el proceso de purificación comprende: (i) un paso de ultra-/diaf iltración ; (ii) un paso de cromatografía de intercambio catiónico (CEX); (iii) un paso de microfiltración; (iv) un paso de cromatografía de fase inversa (RP) ; y (v) un paso de ultra-/diafiltración.

Esta modalidad también es mostrada en la Fig . 1 e ilustrada en los Ejemplos. En el primer paso (i) de ultra-/diafiltración, el amortiguador es Intercambiado por Na-acetato, Polysorbate 80 a un pH ácido. Finalmente, la solución es filtrada a través de una cascada de filtro 1 0 y 1 .2 µp? . Siguiendo la filtración, la solución puede ser almacenada a 22 ± 2°C (paso de mantenimiento) . Los pasos de purificación cromatográfica son diseñadas para remover componentes de cultivo celular, impurezas de células bacterianas e impurezas relacionadas con proceso y producto y para asegurar el contenido de G-CSF consistente para procesos adicionales. El enriquecimiento de G-CSF altamente purificado de acuerdo con la presente invención es realizada en los subsecuentes pasos de filtración y cromatográficos; ver también la Fig . 1 . En una modalidad adicional del método de la presente invención, la preparación de G-CSF obtenida del paso (ii) cromatografía de intercambio de cationes (CEX) es sometida a un paso de microfiltración (iii) , en donde impurezas solubles son removidas del homogeneizado celular. Con el fin de lograr una preparación de G-CSF pura sin la isoforma menos hidrofóbica, paso (iv) , la RP-HPLC es realizada adicionalmente. Subsecuentemente, el paso de ultra/diafiltración final es usado como paso de pulido final y para formular el G-CSF en su amortiguador deseado. Este acomoda para la necesidad de obtener un pequeño volumen final de la preparación, es decir, la concentración de G-CSF en el depósito de RP-H PLC tiene que ser incrementada fuertemente, y para formular el depósito de RP-HPLC en un amortiguador adecuado para estabilizar adicionalmente el G-CSF purificado.

Después de que se han conducido los diferentes pasos de purificación de acuerdo con la presente invención, la pureza de G-CSF es alta, alcanzando una pureza que excede al menos 98% o incluso 99% de la proteína total , como es determinado por RP-H PLC y electroforesis de gel SDS-PAGE , respectivamente; ver también la Fig . 2. Más aún, el contenido de d ímero/multímero de la preparación de G-CSF purificada de acuerdo con la presente invención es normalmente <2%, de preferencia 1 %, aunque la contaminación restante del DNA de célula huésped es = 100 ppm o = 200 ppm de proteína de célula huésped, respectivamente. Adicionalmente, en una modalidad preferida, la contaminación por endotoxinas es < 5 EU/mg , la biocarga total es < 1 CFU/10 mi . Más aún , el contenido final de ácido trifluoroacético restante (TFA) y acetonitrilo es= 30 ppm y < 410 ppm, respectivamente.

Debido a la alta pureza y homogeneidad de la preparación de G- CSF obtenida de acuerdo con el método de la presente invención, la preparación de G-CSF de la presente invención es particularmente adecuada para derivación adicional. Por lo tanto, en una modalidad adicional , el método de la presente invención comprende además modificación qu ímica del G-CSF obtenido de acuerdo con dicho método, por ejemplo, al unir covalentemente un pol ímero soluble en agua al G-CSF, tal como polietilenglicol (PEG) . La conjugación de polietilenglicol (PEG) a proteínas es una tecnología importante para producir moléculas con duración prolongada en el cuerpo humano. La unión de una porción de PEG de 1 0 a 30 kDa para G-CSF puede tener la capacidad para ( 1 ) prevenir la precipitación de proteína al hacer a las proteínas más solubles, y (2) bajar la velocidad de agregación en relación a G-CSF, debido al hecho de que la solubilidad de PEG-G-CSF es mediada por solvatación favorable de moléculas de agua alrededor del grupo PEG.

El término "soluble en agua" se refiere a porciones que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Pol ímeros solubles en agua ejemplares incluyen péptidos, sacáridos, poli(éteres), poli(aminas), ácidos (poli)carboxílicos y similares. El esqueleto de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli(etilenglicol) (es decir, PEG).

El término "polímero soluble en agua" unido covalentemente a G- CSF se refiere a un conjugado entre un polipéptido de G-CSF y al menos un polímero, en donde los conjugados son formados mediante un enlace covalente entre un grupo funcional del pol ímero y un grupo funcional del polipéptido. Los conjugados pueden comprender una o más porciones poliméricas. Varias porciones poliméricas adecuadas o polímeros incluyen poli(alquilenglicoles) , tal como PEG y PPG , almidones de hidroxialquilo, tal como hidroxietil almidón (HES). En una modalidad preferida, dicho pol ímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG) . Tal G-CSF pegilado incluye G-CSF monopegilado y G-CSF modificado con dos o más moléculas de PEG . En una modalidad preferida adicional , dicho polímero covalentemente unido es aproximadamente 1 0 a 30 kDa, de preferencia 20 kDa. Los métodos de modificación quím ica de G-CSF, en particular pegilación son bien conocidos para la persona experta en la técnica y son descritos en , por ejemplo, WO2008/1 24406.

La presente invención también se refiere a una preparación de G- CSF obtenida mediante el método de la presente invención como se define antes. Así, la preparación de G-CSF de la presente invención es particularmente adecuada para aplicación terapéutica. En este contexto, la presente invención también se refiere a un proceso para la fabricación de una composición farmacéutica, comprendiendo el proceso preparar y aislar G-CSF como se define antes, y proporcionar una mezcla del G-CSF así preparado y aislado con un portador farmacéuticamente aceptable.

Una modalidad preferida es un método para la producción de una composición farmacéutica de G-CSF recombinante y aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como amortiguadores, sales y estabilizantes, en donde dicho método comprende el método para obtener G-CSF de la presente invención como se describe antes. El G-CSF obtenido de acuerdo con la presente invención puede ser ya sea (i) usado directamente, o (ii) procesado adicionalmente, por ejemplo, pegilado como se define antes o ver WO2008/1 24406 y entonces almacenado en la forma de un liofilizado o en forma l íquida.

El G-CSF como un ingrediente activo de una composición farmacéutica puede ser administrado en un método típico a través de una ruta intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal , intrasternal , transdérmica, nasal , inhalante, tópica , rectal, oral , intraocular o subcutánea. El método de administración no está limitado en particular, pero una administración no oral es preferible, y la administración subcutánea o intravenosa es más preferible.

Auxiliares adecuados en las formulaciones del G-CSF expresado recombinantemente son , por ejemplo, estabilizantes como azúcar y alcoholes de azúcar, aminoácidos y tensioactivos como, por ejemplo, Polysorbate 20 / 80 así como substancias amortiguadoras adecuadas. Para modalidades adicionales de formulaciones de G-CSF de la presente invención ver, por ejemplo, WO2009/027437 y WO/2008/1 24406, cuyo contenido de descripción es incorporado en la presente por referencia . Ver también para ejemplos para formulaciones los productos comerciales Neupogen® y Granocyte en "ROTE LISTE 2004". En una modalidad preferida de acuerdo con el método de la presente invención, el G-CSF biológicamente activo purificado es formulado en 1 0 mM ácido acético a un pH de 4.0, 0.0025% Polysorbate 80 y 50 g/l Sorbitol.

La actividad del G-CSF obtenido de acuerdo con el método de la presente invención puede ser determinada por medio de un bioensayo y comparada con la actividad de un G-CSF comerciaimente disponible, estándar. Para este fin, la línea de células de ratón NFS-60, la cual es responsiva a G-CSF es cultivada en medio RPMI 1 640 (Bachern, Heidelberg, Alemania), el cual contiene 1 .5 g/l de carbonato de sodio, 4.5 g/l de glucosa, 1 0 mM de Hepes y 1 .0 mM de piruvato de sodio y complementado con 2 mM de glutam ina, 1 0% de FCS, 0.05 mM de 2- mercaptoetanol y 60 ng/ml de G-CSF. Para la prueba de actividad , las células son lavadas dos veces con medio sin G-CSF, colocado en placas de 96 cavidades a una concentración de 2 x 1 04 células por cavidad e incubadas durante tres días a 37°C y 4.5% de C02 con concentraciones variantes del G-CSF purificado y el estándar, respectivamente. Subsecuentemente, las células son manchadas con reactivo XTT y la absorción a 450 nm es medida en un lector de placa de microtítulo.

De acuerdo con la presente invención, podría mostrarse que las células tratadas con el G-CSF purificado de acuerdo con la presente invención crecen justo tan bien o mejor que aquellas células que son tratadas con el estándar. En particular, los datos muestran que el G-CSF purificado obtenido de acuerdo con el método de la presente invención es caracterizado por una actividad biológica de 80-1 25% haciendo referencia al estándar de referencia WHO en el ensayo de proliferación NFS-60.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son caracterizadas como que son estériles y libres de pirógeno. Como se usa en la presente, "composición farmacéutica" incluye formulaciones para uso humano y veterinario. Los métodos para preparar composiciones farmacéuticas de la invención están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Science, (Ciencia farmacéutica de Remington) , 17a ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa. ( 1 985) y la versión actualizada Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Remington: La ciencia y práctica de farmacia) (2000) por la University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472, la descripción completa de ambos documentos es incorporada en la presente por referencia .

Estas y otras modalidades son descritas y abarcadas por la descripción y ejemplos de la presente invención. Literatura adicional concerniente a cualquiera de los materiales, métodos, usos y compuestos a ser empleados de acuerdo con la presente invención, pueden ser recuperados de bibliotecas públicas y bases de datos, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, la base de datos pública "Medline" puede ser utilizada, la cual es organizada por el National Center for Biotechnology I nformation y/o la National Library of Medicine en los National I nstitutes of Health. Bases de datos adicionales y direcciones de la red, tales como aquéllas del European Bioinformatics Institute (EBI) , el cual es parte del European Molecular Biology Laboratory /(EMBL) son conocidas a la persona experta en la técnica y también pueden ser obtenidas usando motores de búsqueda de internet. Una revisión de información de patente en biotecnología y un reconocimiento de fuentes relevantes de información de patente útiles para búsqueda retrospectiva y para la conciencia actual está dada en Berks, TI BTECH 1 2 ( 1 994), 352-364.

La descripción anterior generalmente describe la presente invención. A menos que se declare de otra manera, un término como se usa en la presente se le da la definición como es proporcionada en el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Diccionario de Oxford de Bioqu ímica y biolog ía molecular), Oxford University Press, 1997, revisado en 200 y reimpreso en 2003, ISBN 0 19 850673 2. Varios documentos son citados a lo largo del texto de esta especificación. Los contenidos de todas las referencias citadas (incluyendo referencias de literatura, patentes emitidas, solicitudes de patente publicadas como es citado a través de esta solicitud y especificaciones, instrucciones, etc del fabricante) son incorporadas expresamente en la presente por referencia; sin embargo, no existe admisión de que cualquier documento citado sea en realidad técnica anterior en cuanto a la presente invención.

Un entendimiento más completo puede ser obtenido por referencia a los siguientes ejemplos específicos, los cuales son provistos en la presente para fines de ilustración solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención . En particular, los Ejemplos se refieren a modalidades preferidas de la presente invención .

Ejemplos A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica (por ejemplo, genética molecular, química de ácido nucleico, técnicas de hibridación, química de proteína y bioqu ím ica) . Las técnicas estándares son usadas para métodos moleculares, genéticos y bioquímicos (ver en general, Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. ( 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N .Y. y Ausubel et al. , Short Protocols in Molecular Biology (1 999) 4a ed. , John Wiley & Sons, Inc. - y la versión completa titulada Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en biología molecular, los cuales son incorporados en la presente por referencia) y métodos químicos.

Ejemplo 1: Material inicial G-CSF es expresado en 03-221 C-pHIP, un vector de expresión derivado de pBR322. La cepa huésped de E. coli BNN93 fue transformada con este plásmido para producción. BNN93 es un derivado de E. coli K12. La síntesis de G-CSF es regulada por un promotor lambda, el cual es inducido mediante un desplazamiento de temperatura desde 30°C hasta 42°C, resultando en la sobre-expresión de G-CSF insoluble primario en cuerpos de inclusión.

Ejemplo 2: Fermentación El contenido de un vial de Working Cell Bank (WCB) diluido con 1,000 mi de medio complejo sin canamicina es usado para generar el "banco de células de trabajo diluidas" para pre-fermentación. La dilución tiene lugar en una campana de flujo de aire laminar (LAF) grado A en una habitación limpia grado B. El pre-cultivo es transferido asépticamente de manera directa en el pre-fermentador de 20 I. El cultivo es iniciado a 30 ± 1°C con agitación > 200 rpm para asegurar un p0230% y pH 7.0 ± 0.2, durante 9 a 11 horas hasta que se alcanza una OD 6oo de 5 a 7.

Ejemplo 3: Expresión de G-CSF en cuerpos de inclusión La expresión de G-CSF es inducida al incrementar la temperatura a 42°C e incubación adicional durante 6.75 a 7.25 horas con agitación a = 200 rpm para asegurar un p02 = 30%. Las células bacterianas son recolectadas a temperatura ambiente por un separador de disco a 1 50 l/h, resultando en alrededor de 1 00 I de suspensión celular concentrada.

Ejemplo 4: Aislamiento de cuerpos de inclusión La suspensión celular concentrada es diluida a 200 I y homogeneizada a 500 bar (500x 105) por tres pasos subsecuentes en 20 mM Na-fosfato, pH 8.0 con 300 l/h usando un homogeneizador de alta presión. Los cuerpos de inclusión liberados son recolectados subsecuentemente mediante centrifugación de bowle tubular a 17,000 rpm con 50 l/h. Siguiendo una resuspensión en 1 8 mM Na-fosfato, 2% (w/v) Tritón X-1 00, 5 mM EDTA, pH 8.0 durante 1 0 minutos, los cuerpos de inclusión son centrifugados nuevamente a 17 , 000 rpm con 50 l/h . La pella resultante es lavada con 1 8 mM Na-fosfato pH 8.0 durante 1 0 minutos, seguido por otra centrifugación a 1 7 , 000 rpm con 50 l/h. La pella es resuspendida en Agua para inyección (WFI) y dispensada en tres alícuotas iguales. Los cuerpos de inclusión son almacenados entonces a < -1 5°C (pasos de mantenimiento) .

Ejemplo 5: Solubilización de cuerpos de inclusión y redoblado de G-CSF Después de congelar un tercio de la cantidad de cuerpo de inclusión total derivada de una fermentación de 1 ,000 litros, los cuerpos de inclusión son solubilizados mediante incubación en 25 mM Tris, 6 M GuHCI , 1 m M EDTA, pH 8.0 durante 5.5 a 6.5 horas con agitación, seguido por filtración con un filtro de 1 .5 µ?t? , por ejemplo, filtración de profundidad (filtración de clarificación). El G-CSF son redoblados entonces mediante dilución en 25 mM Tris, 0.8 arginina, 1 mM glutationa (reducida) , 1 mM glutationa (oxidad), 10 mM EDTA, pH 8.0 a 20 ± 2°C. Esto es seguido por adición de Polysorbate 80 a una concentración final de 0.01 % (w/v) y aj uste a pH 4.0 con ácido acético. Siguiendo el redoblado, un paso de ultrafiltración y un paso de diafiltración son conducidos (mWCO 10 kDa, 8.4 m2, aproximadamente 8 x intercambio de amortiguador), donde el amortiguador es intercambiado por 10 mM Na-acetato, 0.01 % (w/v) Polysorbate 80, pH 4.0. Finalmente, la solución es filtrada a través de una cascada de filtro de 1 0 y 1 .2 µ?t?. Siguiendo la filtración , la solución es almacenada a 22 ± 2°C (paso de mantenim iento) .

Ejemplo 6: Purificación de G-CSF Los pasos de purificación cromatográfica son diseñados para remover compuestos de cultivo celular, impurezas de células bacterianas, impurezas relacionadas con proceso y producto y para asegurar un contenido de G-CSF consistente para la preparación de una formulación farmacéutica o para subsecuente pegilación ; ver los siguientes Ejemplos. Un perfil del proceso de la presente invención es dado en la Fig . 1 y descrito en la Tabla 1 a continuación. Una descripción más detallada que realiza el intercambio de cationes y cromatografía de RP-HPLC es provista por el Ejemplo 7 en las Tablas 2 y 3.

Tabla 1: Composiciones amortiguadoras usadas en los pasos de proceso indicados Ejemplo 7: Cromatografía de intercambio de cationes y cromatografía líquida de alta presión de fase inversa El concentrado diafiltrado es cargado sobre una columna de intercambio catiónico (CM Sepharose® FF). Después de la carga, la columna es lavada con cinco volúmenes de columna (CVs) de amortiguador de equilibrio (20 mM ácido acético, 0.004% (p/v) Polysorbate 80, pH 5.5) y el G-CSF unido es eluido a partir de la columna CM usando un gradiente de cloruro de sodio lineal en una bolsa conteniendo 20 mM ácido acético, pH 5.5, 0.004% (p/v) Polysorbate 80 y aprox. 50-80 mg/ml sorbitol. El perfil de elución es monitoreado mediante detección UV (280 nm, 260 nm y 215 nm) y el gradiente es controlado al medir la conductividad. El G-CSF eluido es identificado de acuerdo con el perfil de conductividad y absorbancia. La concentración de la fracción depositada de G-CSF es determinada mediante absorbancia UV280 y diluida a= 1.6 mg/ml.

Tabla 2: Parámetro para realizar cromatografía de intercambio catiónico: CM Sepharose®-FF Después de la filtración con una unidad de filtro 0.45 - 0.22 µ?? , la solución es aplicada a una columna de RP-H PLC y fracciones son eluidas usando un gradiente de acetonitrilo (TFA) acidificado en agua. El perfil de elución es monitoreado por detección UV (280 nm) . El depósito de RP-HPLC es definido sobre datos de pureza de RP-H PLC analítica (a 60°C) y el depósito es ultrafiltrado y diafiltrado mediante filtración de flujo tangencial con 10 mM ácido acético, 0.0025% (p/v) Polysorbate 80, 50 mg/ml Sorbitol, pH 4.0 (MWCO 5 kDa, 4.8 m2, aproximadamente 8 x intercambio de amortiguador) .

Parámetro para realizar cromatografía de fase inversa: Júpiter Ejemplo 8: Llenado, almacenamiento o transportación El diafiltrado es diluido con el mismo amortiguador a una concentración de proteína de 1.0 ± 0.1 mg/ml, entonces es doble-filtrado (dos filtros de 0.22 µ? en una cascada) directamente en una bolsa de un solo uso (pre-filtro conectado al recipiente final en un LAF antes de la filtración, el filtro final pre-ensamblado a la bolsa de empaque primario de 50 I, esterilizado por irradiación y desconectado asépticamente por sellado después de filtración y llenado) para almacenamiento a 5 ± 3°C.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un método para obtener G-CSF humano biológicamente activo a partir de cuerpos de inclusión comprendiendo los pasos: (a) solubilizar el G-CSF contenido en los cuerpos de inclusión con un amortiguador de solubilización conteniendo un agente desnaturalizante y un agente reductor; (b) redoblar el G-CSF al diluir el solubilizado con un amortiguador de redoblado conteniendo glutationa reducida y oxidada a una temperatura Z 10°C; y (c) purificar el G-CSF redoblado mediante al menos un paso de cromatografía comprendiendo cromatografía de fase inversa (RP).

2. El método de la reivindicación 1, en donde el agente desnaturalizante es guanidina-HCI, de preferencia en donde la concentración de guanidina-HCI es 4.0 a 8.0 mol/1.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el agente reductor es DTT.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la concentración del agente reductor en el amortiguador de solubilización es 1 a 100 mmol/l, de preferencia 1 a 10 mmol/l.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde 10 a 100 mi de amortiguador de solubilización por gramo de cuerpos de inclusión son usados.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el amortiguador de solubilización y/o amortiguador de redoblado contiene además un agente quelante, de preferencia EDTA disódico.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el tiempo de solubilización es 1 a 10, de preferencia 4 a 8, muy preferiblemente es 6 ± 0.5 horas.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el amortiguador de redoblado contiene además arginina-HCI.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la concentración de glutationa reducida y oxidada es 0.2 a 10 mmol/l cada una.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el solubilizado es diluido con amortiguador de redoblado en una proporción de 1 a 20.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el redoblado es realizado a 20 ± 2°C durante al menos 3 horas.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el solubilizado es sometido a filtración antes de diluir con el amortiguador de redoblado.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el paso de cromatografía de fase inversa (RP) es cromatografía líquida de alta presión de RP (RP-HPLC).

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde se usa una resina cromatográfica Júpiter C4, Source 15 RPC o Source 30 RPC.

15. El método de la reivindicación 14, en donde una resina cromatográfica Júpiter C4 es usada en una cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (RP-HPLC).

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el paso de cromatografía RP es precedido por una cromatografía de intercambio de iones.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la cromatografía de intercambio de iones es cromatografía de intercambio de cationes (CEX).

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el paso (c) comprende: (i) un paso de ultra-/d¡afiltración; (ii) un paso de cromatografía CEX; (iii) un paso de mcirofiltración; (iv) un paso de cromatografía de RP; y (v) un paso de utlra-/diafiltración.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende además unir covalentemente un polímero soluble en agua al G-CSF.

20. El método de la reivindicación 19, en donde dicho polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG).

21. El método de la reivindicación 19 o 20, en donde el peso molecular del polímero es aproximadamente 10 a 30 kDa, de preferencia 20 kDa.

22. El uso de un paso cromatográfico de RP preparatorio como se usa en cualquiera de las reivindicaciones precedentes , para obtener G-CSF biológicamente activo.

23. Una preparación de G-CSF obtenido mediante u n método de cualquiera de las reivind icaciones 1 a 21 o el uso de la reivindicación 22.

24. Un método para la producción de una composición farmacéutica de G-CSF recombi nante y ad itivos farmacéuticamente aceptables , tales como amortig uadores, sales y estabilizantes , en donde dicho método comprende el método para obtener G-CS F de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o el uso de la reivindicación 22.

25. El método de la reivindicación 24, en donde el G-CSF biológicamente activo pu rificado es formu lado en 1 0 mM ácido acético a u n pH de 4.0, 0.0025% de Polisorbato 80 y 50 g/l de Sorbitol .

26. Una composición fa rmacéutica comprendiendo la preparación de G-CSF de la reivindicación 23 u obtenida mediante el método de la reivind icación 24 o 25.