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MX2012009321A - Metodos terapeuticos que utilizan anticuerpos anti-cd200. - Google Patents

Metodos terapeuticos que utilizan anticuerpos anti-cd200.

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MX2012009321A
MX2012009321A MX2012009321A MX2012009321A MX2012009321A MX 2012009321 A MX2012009321 A MX 2012009321A MX 2012009321 A MX2012009321 A MX 2012009321A MX 2012009321 A MX2012009321 A MX 2012009321A MX 2012009321 A MX2012009321 A MX 2012009321A
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MX
Mexico
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antibody
human
seq
amino acid
cells
Prior art date
Application number
MX2012009321A
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Inventor
Russell P Rother
Yan Yan
Original Assignee
Alexion Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD200 y al uso de los anticuerpos en métodos para tratar trastornos autoinmunes y cáncer. También se describen biomarcadores para usarse en la selección o prescripción de una modalidad de tratamiento para un paciente con un trastorno autoinmune y/o cáncer. Además, la descripción modaliza métodos de tratamiento que utilizan un anticuerpo anti-CD200 en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales tales como un agente terapéutico anti-CD200.

Description

MÉTODOS TERAPÉUTICOS QUE UTILIZAN ANTICUERPOS ANTI-CD200 Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama la prioridad y el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana Serie No 61/337,962 presentada el 11 de febrero de 2010, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.
Listado de Secuencias La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias el cual ha sido presentado mediante EFS-Web y está incorporado en su totalidad a la presente invención. La copia ASCII, creada el 9 de febrero del 2011, es nombrada ALXN1520.txt, y tiene 19,592 bytes de tamaño.
Campo de la Invención El campo de la invención es en medicina, inmunología, biología molecular y química de proteína.
Antecedentes de la Invención La proteína CD200 humana es un tipo de glucoproteína de transmembrana que normalmente se expresa en timocitos (por ejemplo, células T y células B) neuronas y células endoteliales. A través del encaje con su receptor cognato, CD200R, la proteína CD200 transduce una señal inmunoreguladora que puede suprimir las respuestas inmune transmitidas por célula T.
Los estudios en animales de eliminación CD200, así como experimentos que utilizan anticuerpos anti-CD200 antagonistas y proteínas de fusión CD200-Fc recombinantes, han demostrado que la proteína CD200 es un agente inmunosupresor en trastornos autoinmune y para trasplantes. Ver las Publicaciones de Hoek y asociados, (2000) Science 290:1768-1771 y Gorczynski y asociados, (1999) J Immunol 163:1654-1660. La interacción entre CD200 y CQ200R, da como resultado perfiles de citocina alterados y promueve una respuesta de célula T TR2 con respecto a una respuesta TH1. (Ver por ejemplo, la Publicación Kretz-Rommel (2007) J Immunol 178:5595-5605).
Breve Descripción de la Invención La presente descripción está basada, al menos en parte, en el descubrimiento por parte de los inventores, de que la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un modelo animal de una enfermedad autoinmune (enfermedad hemolítica autoinmune), da como resultado una marcada disminución en la producción por parte del animal, de autoanticuerpos asociados con la enfermedad. La administración del anticuerpo anti-CD200 también da como resultado un retraso marcado en el desarrollo de la producción de autoanticuerpos en los ratones. Debido que la producción de autoanticuerpos a través de un huésped es el origen, o está asociada con una cantidad de trastornos autoinmune (por ejemplo, miastenia grave y síndrome de Guillain-Barre) , los inventores consideran que un anticuerpo ant¡-CD200 será útil para tratar a pacientes que padecen de cualquiera de una variedad de trastornos autoinmune.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar un trastorno autoinmune en un humano. El método incluye administrar a un humano que tiene un trastorno autoinmune una cantidad de un anticuerpo anti-CD200 que es suficiente para reducir en el humano la concentración de un autoanticuerpo (o la producción o expresión de un autoanticuerpo) asociada con el trastorno autoinmune, para tratar de esta forma el trastorno autoinmune.
En algunas modalidades, la administración del anticuerpo anti-CD200 puede reducir la concentración de autoanticuerpo en la sangre del humano, en la menos 10%, 20%, 50%, 75%, o más del 75%. En algunas modalidades, la administración del anticuerpo anti-CD200 al humano, puede eliminar completamente el autoanticuerpo detectable en el humano.
La descripción también presenta métodos para prevenir un trastorno autoinmune, o retardar la generación del trastorno autoinmune, en donde el método incluye administrar a un humano que tiene un trastorno autoinmune, una cantidad de un anticuerpo ant¡-CD200 que es suficiente para: (i) prevenir la generación, producción o expresión por parte del humano de un autoanticuerpo asociado con el trastorno autoinmune o (ii) retardar la generación de, o el desarrollo de la producción o expresión por parte del humano del autoanticuerpo asociado con el trastorno autoinmune, para prevenir o retardar de esta forma la generación del trastorno autoinmune.
Aún en otro aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar un trastorno autoinmune en un humano, en donde el método incluye administrar en forma crónica a un humano que tiene un trastorno autoinmune un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para mantener en el humano una concentración reducida de un autoanticuerpo asociado con el trastorno autoinmune, para tratar de esta forma el trastorno autoinmune.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 puede ser administrado al humano en una cantidad y con una frecuencia para mantener más del 10%, 20%, 50%, 75%, o más del 75% de reducción en la concentración del anticuerpo autoinmune en comparación con la concentración del anticuerpo antes de la administración del anticuerpo anti-CD200.
Los inventores también descubrieron diversos biomarcadores que evidencian el surgimiento en un humano de un efecto inmunomodulador a través de un anticuerpo anti-CD200, administrado a animales con un trastorno autoinmune. Por ejemplo, los inventores han observado que después de la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un animal, se reduce en los animales la concentración de diversos subconjuntos de leucocito y de célula de médula ósea. Los inventores también han descubierto que la concentración, por ejemplo de linfocítos F4/80+ en bazo, se incrementan después de la administración del anticuerpo anti-CD200 al animal. Aunque la descripción no pretende limitarse a teoría o mecanismo de acción alguno en particular, los inventores consideran que el monitoreo de un paciente es tratado con un anticuerpo anti-CD200 con respecto al surgimiento de uno o más de estos biomarcadores es útil, finalmente, para determinar si el anticuerpo anti-CD200 tiene la capacidad de producir un efecto inmunomodulador en el humano al cual se administra en el anticuerpo. Además, uno o más de los biomarcadores también son útiles para identificar una dosis - una dosis de umbral - de un anticuerpo anti-CD200, tal como samalizumab (ALXN6000), que en virtud de su efecto inmunomodulador en el humano, es suficiente para lograr un efecto clínicamente significativo en la enfermedad (es decir, suficiente para tratar una enfermedad tal como cáncer o un trastorno autoinmune). Además, tal como se describe en los ejemplos de operación, un anticuerpo anti-CD200 tiene la capacidad de reducir la expresión de anticuerpos autoinmune en un modelo de ratón de enfermedad autoinmune.
Por consiguiente, la descripción también presenta un método para tratar un trastorno en un humano, en donde el método comprende administrar a un humano que necesita del mismo, un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para tratar el trastorno, manteniendo una o más de las siguientes condiciones fisiológicas en el humano: (i) una concentración disminuida (reducida) de al menos un subconjunto de leucocito CD200 + , en comparación con una concentración de control; (ii) una concentración incrementada de células F4/80 en comparación con una concentración de control; y (iii) una concentración disminuida (reducida) de al menos un subconjunto de célula madre de médula ósea, en comparación con una concentración de control. El trastorno puede ser cualquier trastorno que un practicante médico considere en forma razonable, que puede ser tratado a través de un anticuerpo anti-CD200 terapéutico. Dichas enfermedades incluyen, por ejemplo, cáncer o una enfermedad autoinmune.
En algunas modalidades, al menos un subconjunto de leucocitos CD200+ puede ser uno seleccionado del grupo que consiste en células CD3+/CD200\ células CD45R7CD200\ células CD57CD200\ células CD19+/CD200 + , células CD1387CD200\ y células CD200R7CD20CT. En algunas modalidades, el al menos un subconjunto de célula madre de médula ósea puede ser seleccionado del grupo que consiste en células de médula de ósea CD200+, células de médula de ósea lgk7CD200 + , células de médula de ósea CD138/CD200, células de médula de ósea c-kit/CD200, y células de médula de ósea c-kit+/CD200+/Lin/low. En algunas modalidades, las células F4/80+ pueden ser macrófagos F4/80 + .
En algunas modalidades, al menos un subconjunto de leucocitos CD200+ o las células F4/80+ pueden estar presentes en la sangre periférica del humano. En algunas modalidades, los leucocitos o células residen en el bazo.
En algunas modalidades, el anticuerpo puede ser administrado al humano en una cantidad y con una frecuencia para mantener al menos dos, o las tres condiciones fisiológicas en el humano.
En algunas modalidades, el trastorno autoinmune puede ser un trastorno hemolítico o una anemia hemolítica autoinmune (AIHA), tal como cualesquiera de las AIHA conocidas en las artes médicas (ver más adelante). En algunas modalidades, el trastorno autoinmune puede ser uno seleccionado del grupo que consiste en enfermedad pulmonar obstructiva crónica, diabetes melitus tipo 1, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barré, nefropatía IgA, escleroderma, síndrome de Sjógren, granulomatosis de Wegener, pénfigo vulgaris, artritis reumatoide, enfermedad de aglutinina fría, síndrome anti-fosfol ípido, anemia hemolítica autoinmune caliente, hemoglobinuria fría paroxismal, enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave, cirrosis biliar pulmonar, y síndrome de Miller Fisher.
En algunas modalidades, el trastorno autoinmune puede ser el resultado de, o puede estar asociado con, un cáncer en el humano. El cáncer puede ser un tumor líquido, tal como, pero sin limitarse a, leucemia linfocítica crónica (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica de célula B) o mieloma múltiple.
En algunas modalidades, los métodos aquí descritos pueden incluir administrar al humano al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno autoinmune o un cáncer.
Los inventores han descubierto que la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un animal, da como resultado una marcada reducción en la concentración de células CD5+ (por ejemplo, leucocitos CD5 + ) en el bazo del animal. CD5 es una glucoproteína de transmembrana 67 kDa que es expresada por células T, y un subconjunto de células B referidas como "células B1". Ver, por ejemplo, la publicación de Holodick y asociados (2009) Eur J Immunol 39(9): 2383-2394. Las células B1 están implicadas en forma integral en una defensa del huésped contra infecciones y las células B1 CD5+ expresan en forma espontánea y constitutiva ¡nmunoglobulina. Id. La expresión CD5 por parte de las células CLL también ha sido detectada. En 1992, Almasri y asociados, reportaron que las células CD5+ CLL expresan niveles menores de CD20 tal como se determina mediante citometría de flujo. Am J Hematol 40: 259, 261. Ver también la publicación de Marti y asociados (1992) "expresión CD20 y CD5 en leucemia linfocítica crónica-B" Ann N. Y. Acad Sci 651 : 480-483.
Rituximab es un anticuerpo anti-CD20 monoclonal, quimérico clínicamente aprobado para el tratamiento de, entre otras cosas, leucemia linfocítica crónica (CLL). Ver, por ejemplo, la publicación de Christian y Lin (2008) Semin Hematol 45(2): 95-103. Rituximab ha sido efectiva para tratar CLL, tanto como un agente simple, como en combinación, por ejemplo, con el régimen CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisona). Id. Sin embargo, Ennishi y asociados, reportaron una correlación entre la expresión CD5 mediante células CLL y un resultado deficiente en pacientes CLL tratados con un régimen RCHOP combinado (régimen rituximab y CHOP). (2008) Annals of Oncology 1_9: 1921, 1924 (figura 1). El reporte sugiere que existe una población de pacientes que reciben menos beneficios de terapia rituximab y pueden requerir terapias alternativas.
Aunque la presente descripción no está limitada a teoría o mecanismo de acción en particular; es probable que las células CD5+ CLL puedan ser refractarias a terapia con rituximab, al menos en parte, debido a una expresión reducida de CD20. Los inventores han mostrado que una composición terapéutica que contiene un anticuerpo anti-CD200 es útil para reducir las poblaciones de célula CD5+ en un animal, y por lo tanto consideran que la composición es particularmente útil para tratar un subconjunto de pacientes CLL que son refractarios para el tratamiento con terapia anti-CD20 (por ejemplo, resistente a rituximab).
Por consiguiente, la presente descripción también presenta un método para tratar a un humano que padece un cáncer o un trastorno autoinmune, en donde el método comprende administrar a un humano que padece de cáncer o un trastorno autoinmune, un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es suficiente para tratar el cáncer o el trastorno autoinmune, en donde el cáncer o el trastorno autoinmune es resistente, o se sospecha que es resistente, o probablemente se volverá resistente a terapia con un agente terapéutico anti-CD20.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un cáncer, en donde el método comprende administrar a un humano que padece de un cáncer, un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es suficiente para tratar el cáncer, en donde el cáncer es resistente, se sospecha que es resistente, o es probable que se vuelva resistente, a terapia con un agente terapéutico anti-CD20.
En otro aspecto, la descripción presenta otro método para tratar a un humano que padece de cáncer, en donde el método comprende: identificar a un humano como teniendo un cáncer que es resistente, o se sospecha que será resistente, al tratamiento con un agente terapéutico anti-CD20; y administrar al humano un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es efectiva para tratar el cáncer.
En algunas modalidades, el cáncer puede comprender o consistir en células de cáncer que expresan CD5.
En algunas modalidades, más de una dosis (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 o más dosis) del anticuerpo anti-CD200 se administran al humano. En algunas modalidades, se administran al humano más de 10 (por ejemplo, más de 15, 20, 25, 30, ó 35 o más) dosis del anticuerpo anti-CD200.
En algunas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. Los tumores sólidos incluyen, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer de tejido neural (por ejemplo, neuroblastoma), melanoma, cáncer de tiroides, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer vaginal, y cáncer de vejiga. En algunas modalidades, el cáncer es un tumor líquido. Los tumores líquidos incluyen, por ejemplo, leucemias (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica tal como leucemia linfocítica crónica tipo célula B o célula T) y mieloma múltiple. Los cánceres de huesos incluyen, sin limitación, osteosarcoma y osteocarcinomas.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un tumor líquido. El método incluye administrar a un humano que padece de un tumor líquido un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es suficiente para tratar el tumor líquido, en donde al menos una parte de las células de tumor líquido expresan CD5. El método puede incluir determinar si la parte de las células de tumor líquido expresan CD5.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un tumor líquido, en donde el método incluye: identificar a un humano como teniendo un tumor líquido que comprende células que expresan CD5; y administrar al humano un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es suficiente para reducir la concentración de las células de tumor líquido que expresan CD5 en el humano, para tratar de esta forma el tumor líquido.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende administrar a un humano que padece de un tumor líquido, un anticuerpo anti-CD200 y un agente terapéutico anti-CD20 para tratar de esta forma el tumor líquido, en donde al menos una parte de las células de tumor líquido expresan CD5 antes de administrar el anticuerpo y agente.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un tumor líquido, en donde el método incluye: identificar a un humano como que padece de un tumor líquido que comprende células de tumor que expresan CD5; y administrar al humano un anticuerpo anti-CD200 y un agente terapéutico anti-CD20 para tratar de esta forma el tumor líquido.
En algunas modalidades, el agente terapéutico anti-CD20 puede administrarse antes de la administración del anticuerpo anti-CD200. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 se administra antes de la administración del agente terapéutico anti-CD20. El anticuerpo anti-CD200 y el agente terapéutico anti-CD20 puede administrarse al mismo tiempo. El anticuerpo puede ser administrado utilizando la misma ruta de administración (por ejemplo, administración intravenosa) o una ruta diferente.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 y el agente terapéutico anti-CD20 se puede administrar al humano en forma concurrente como un anticuerpo biespecífico que enlaza a CD200 humano y a CD20 humano. Esto es, el agente terapéutico administrado al humano tiene tanto las propiedades del anticuerpo anti-CD200 como del agente terapéutico anti-CD20. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200/anticuerpo anti-CD20 biespecífico es un anticuerpo DVD-ig- En algunas modalidades, al menos el 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, o 60% o más de las células de tumor líquido expresan CD5.
El tumor líquido puede ser, por ejemplo, una leucemia linfocítica crónica o un mieloma múltiple. El tumor líquido puede ser, por ejemplo, una leucemia linfocítica crónica de célula B.
En algunas modalidades, el agente terapéutico anti-CD20 es un anticuerpo anti-CD20 tal como, pero sin limitarse a, rituximab, ofatumumab, TRU-015, veltuzumab, ocrelizumab, o AME-133v.
En algunas modalidades, el agente terapéutico anti-CD20 es conjugado para una toxina. Por ejemplo, en algunas modalidades, el agente terapéutico anti-CD20 es un conjugado de toxina-anticuerpo. La toxina puede ser, por ejemplo, un fármaco de molécula pequeña o un polipéptido tóxico (por ejemplo, ricina o saporina). En algunas modalidades, la toxina puede ser una toxina bacteriana, una toxina fúngica, o una toxina de planta. En algunas modalidades, la toxina puede ser un agente radioactivo tal como, pero sin limitarse a, 90Y, 186Re, 188Re, 64Cu, 67Cu, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 123l, 1 5l, 131l, 111ln, 2 1At, 32P, 177Lu, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, o 199Au. En algunas modalidades, el conjugado de toxina-anticuerpo es 90Y-ibritumomab tiuxetan o 131l-tositumomab.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 inhibe la interacción entre CD200 y CD200R.
En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el anticuerpo anti-CD200 puede contener el siguiente conjunto de CDRs emparejadas: una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende la secuencia de aminoácido: GFTFSGFAMS (SEQ ID No: 4); una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende la secuencia de aminoácido: SI SSGGTTYYLDSVKG (SEQ ID No: 5); una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende la secuencia de aminoácido: GNYYSGTSYDY (SEQ ID No: 6); una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende la secuencia de aminoácido: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID No: 7); una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende la secuencia de aminoácido: RASNLES (SEQ ID No: 8); y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende la secuencia de aminoácido: QQSNEDPRT (SEQ ID No: 9).
En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GFNI KDYYMH (SEQ ID No: 10); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: WIDPENGDTKYAPKFQG (SEQ ID No: 11); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: KNYYVSNYNFFDV (SEQ ID No: 12); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: SASSSVRYMY (SEQ ID No: 13); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: DTSKLAS (SEQ ID No: 14); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: FQGSGYPLT (SEQ ID No: 15).
En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GFNIKDYYIH (SEQ ID No: 16); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: WIDPEIGATKYVPKFQG (SEQ ID No: 17); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: LYGNYDRYYAMDY (SEQ ID No: 18); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: KASQNVRTAVA (SEQ ID No: 19); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: LASNRHT (SEQ ID No: 20); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: LQHWNYPLT (SEQ ID No: 21).
En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GYSFTDYI I L (SEQ ID No: 22); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: Hl DPYYGSSN YN LKFKG (SEQ ID No: 23); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: SKRDYFDY (SEQ ID No: 24); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: KASQDINSYLS (SEQ ID No: 25); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: RANRLVD (SEQ ID No: 26); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: LQYDEFPYT (SEQ ID No: 27).
En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GYTFTEYTMH (SEQ ID No: 28); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: GVNPNNGGALYNQKFKG (SEQ ID No: 29); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: RSNYRYDDAMDY (SEQ ID No: 30); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: KSSQSLLDIDEKTYLN (SEQ ID No: 31); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: LVSKLDS (SEQ ID No: 32); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: WQGTHFPQT (SEQ ID No: 33).
En algunas modalidades de cualesquiera de los métodos aquí descritos, el anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: AFNI KDHYMH (SEQ ID No: 34); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: WIDPESGDTEYAPKFQG (SEQ ID No: 35); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: FNGYQALDQ (SEQ ID No: 36); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: TASSSVSSSYLH (SEQ ID No: 37); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: STSNLAS (SEQ ID No: 38); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: RQYHRSPPIFT (SEQ ID No: 39).
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 y/o el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo I g G 1 , lgG2, lgG2a, lgG3, lgG4, Ig , I g A 1 , lgA2, IgA, IgD, o IgE. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 y/o el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo de múrido, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena simple, o un anticuerpo humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 o el anticuerpo anti-CD20 es un fragmento de anticuerpo de enlace de antígeno seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento scFv, un minicuerpo, un diacuerpo, o un triacuerpo.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un método para seleccionar una terapia para un paciente que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende: identificar a un paciente como teniendo un tumor líquido que comprende células de tumor que expresan CD5; y seleccionar del paciente un anticuerpo anti-CD200 para utilizarse en el tratamiento del tumor líquido.
En otro aspecto, la descripción presenta un método para prescribir una terapia para un paciente que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende: identificar a un paciente como teniendo un tumor líquido que comprende células de tumor que expresan CD5; y prescribir para el paciente un anticuerpo anti-CD200 para utilizarse para tratar el tumor líquido. El anticuerpo anti-CD200 puede ser un anticuerpo biespecífico tal como uno que comprende un primer sitio de combinación de antígeno y un segundo sitio de combinación de antígeno, en donde el primer sitio de combinación de antígeno enlaza a CD200 y el segundo sitio de combinación de antígeno enlaza a CD20.
Aún en otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de combinación de antígeno y un segundo sitio de combinación de antígeno, en donde el primer sitio de combinación de antígeno enlaza a CD200 y el segundo sitio de combinación de antígeno enlaza a CD20. El anticuerpo biespecífico puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgG 1 , lgG2, lgG2a, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgA, IgD, o IgE. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200/anti-CD20 biespecífico es un anticuerpo de múrido, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena simple, o un anticuerpo humano. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se puede utilizar en cualesquiera de los métodos aquí descritos (por ejemplo, para tratar cáncer o una enfermedad autoinmune).
Aún en otro aspecto, la descripción presenta: (i) un ácido nucleico que codifica el anticuerpo biespecífico; (ii) un vector (por ejemplo, un vector de expresión) que comprende el ácido nucleico; y (iii) una célula que comprende el vector. En otro aspecto, la descripción presenta un método para producir el anticuerpo, en donde el método comprende cultivar la célula durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la producción del anticuerpo en la célula. El método también puede incluir el paso de aislar el anticuerpo biespecífico de la célula o del medio en el cual se cultiva la célula.
En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es un diacuerpo de cadena simple, un fragmento Fv de cadena simple en tándem, un diacuerpo de cadena simple en tándem, o una proteína de fusión que comprende un diacuerpo de cadena simple y al menos una parte de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es una inmunoglobulina de dominio variable dual.
En algunas modalidades, el primer sitio de combinación de antígeno enlaza a una proteína CD200 humana, por ejemplo, una proteína CD200 humana que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 3. En algunas modalidades, el segundo sitio de combinación de antígeno enlaza a una proteína CD20 humana, por ejemplo, una proteína CD20 humana que comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 40 a 42. En algunas modalidades, el segundo sitio de combinación de antígeno enlaza a una proteína CD20 humana en un epítope que comprende al menos parte (por ejemplo, al menos 4 aminoácidos) de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 41 y al menos parte (por ejemplo, al menos 4 aminoácidos) de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 42.
En algunas modalidades, el primer sitio de combinación de antígeno se obtiene de samalizumab. En algunas modalidades, el segundo sitio de combinación de antígeno se obtiene de rituximab, ofatumumab, TRU-015, veltuzumab, ocrelizumab, o AME-133v. El anticuerpo biespecífico puede ser conjugado para, o contener, una porción heteróloga tal como una etiqueta detectable o una toxina.
Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se utilizan de manera intercambiable y significan cualquier cadena de aminoácidos enlazada por péptido, sin importar la longitud o modificación post-traducción. Las proteínas CD200 aquí descritas pueden contener o ser proteínas tipo natural, o pueden ser variantes que no tienen más de 50 (por ejemplo, no más de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, ó 50) substituciones de aminoácido conservadoras. Las substituciones conservadoras normalmente incluyen substituciones entre los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina, y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina y treonina; Usina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina.
Las proteínas CD200 y las proteínas CD20 aquí descritas también incluyen "fragmentos de péptido antigénico" de las proteínas, que son más cortas que las proteínas de longitud total, pero retinen al menos 10% (por ejemplo, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99.5%, o 100% o más) de la capacidad de la proteína de longitud total para inducir una respuesta antigénica en un mamífero (ver más adelante bajo la sección de "Métodos para Producir un Anticuerpo"). Los fragmentos de péptido antigénico de una proteína CD200 o una proteína CD20 incluyen variantes de eliminación de la proteína terminales así como internas. Las variantes de eliminación pueden carecer de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 segmentos de aminoácido (de dos o más aminoácidos) o aminoácidos simples no contiguos. Los fragmentos de péptido antigénico pueden tener al menos 6 (por ejemplo, al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ó 200 o más) residuos de aminoácido de longitud (por ejemplo, al menos 6 residuos de aminoácido contiguos en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 3). En algunas modalidades, el fragmento de péptido antigénico de una proteína CD200 humana tiene menos de 225 (por ejemplo, menos de 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 60, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, ó 7) residuos de aminoácido de longitud (por ejemplo, menos de 225 residuos de aminoácido contiguos en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 3). En algunas modalidades, un fragmento de péptido antigénico de una proteína CD200 de longitud total tiene al menos 6, pero menos de 225, residuos de aminoácido de longitud.
En algunas modalidades, la proteína CD200 humana puede tener una secuencia de aminoácido que es, o es mayor a 70 (por ejemplo, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100) % idéntica a la proteína CD200 humana que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 1 o la SEQ ID No: 2 (ver más adelante). En algunas modalidades, la proteína CD20 humana puede tener una secuencia de aminoácido que es, o es mayor a 70 (por ejemplo, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100) % idéntica a la proteína CD200 humana que tiene la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 40.
El porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácido se define como el porcentaje de aminoácidos en una secuencia candidata que es idéntica a los aminoácidos en una secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir aberturas, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia, se puede lograr en diversas formas que están dentro de las habilidades en la técnica, por ejemplo, utilizando el software de computadora públicamente disponible tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación con respecto a la longitud total de las secuencias que están siendo comparadas, pueden ser determinados a través de métodos conocidos.
Las secuencias de aminoácido para proteínas CD200 humanas y proteínas CD20 humanas de ejemplo, así como fragmentos de péptido antigénico de las mismas, son conocidas en la técnica y se establecen más adelante.
Tal como se utiliza en la presente Invención, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula de anticuerpo completa o intacta (por ejemplo, IgM, IgG (incluyendo I g G 1 , lgG2, lgG3, e lgG4), IgA, IgD, o I g E) o cualquier fragmento de enlace de antígeno del mismo. El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo desinmunizado, y un anticuerpo completamente humano. Los fragmentos de enlace de antígeno de un anticuerpo incluyen, por ejemplo, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento Fv de cadena simple (scFv), un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab', o un fragmento F(ab')2. Un fragmento scFv es una cadena de polipéptido simple que incluye tanto las regiones variables de cadena pesada como ligera del anticuerpo del cual se deriva el scFv. Además, también están incluidos ¡ntracuerpos, minicuerpos, triacuerpos, y diacuerpos (ver, por ejemplo, las publicaciones de Todorovska y asociados (2001) J Immunol Methods 248(1): 47-66; Hudson y Kortt (1999) J Immunol Methods 231 (1 ): 177-189; Poljak (1994) Structure 2(12): 1121-1123; Rondón y Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51 : 257-283, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia) en la definición del anticuerpo y son compatibles para utilizarse en los métodos aquí descritos. Los anticuerpos biespecíf icos (incluyendo anticuerpos DVD-lg; ver más adelante) también están abarcados por el término "anticuerpo". Los anticuerpos biespecíf icos son monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos diferentes antígenos.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado al comúnmente comprendido por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente descripción. En caso de conflicto, el presente documento, incluyendo las definiciones, tomaran el control. Los métodos y materiales preferidos se describen más adelante, aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos también se pueden utilizar en la práctica o pruebas de los métodos y composiciones aquí descritos. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias aquí mencionadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
Otras características y ventajas de la presente descripción, por ejemplo, métodos para tratar un cáncer resistente a rituximab (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica), podrán ser apreciadas a partir de la siguiente descripción, los ejemplos, y las reivindicaciones.
Breve Descripción de las Figuras .La figura 1 es una gráfica de líneas que ilustra el retraso en la producción del anticuerpo RBC anti-ratón, en ratones con enfermedad hemolítica autoinmune, tratados con un anticuerpo anti-CD200. El eje-Y representa la incidencia (%) de la producción de auto-anticuerpo en los ratones en cada grupo. El eje-X representa el tiempo en el cual se detectó la presencia de auto-anticuerpos en cada ratón. Los siete grupos de ratones evaluados incluyeron: ratones que fueron inmunizados con RBCs de rata, pero no tratados con un anticuerpo (No Rx); ratones que fueron inmunizados con RBCs de rata y tratados con un anticuerpo de control (Ab de Control); ratones que fueron inmunizados con RBCs de rata y tratados con un anticuerpo anti-CD200 (Anticuerpo 1); ratones que fueron inmunizados con RBCs de rata y tratados con ciclosporina (CsA); ratones que fueron inmunizados con RBCs de rata y tratados con el anticuerpo de control y ciclosporina A (Ab de Control + CsA); ratones que fueron inmunizados con RBCs de rata y tratados con anticuerpo anti-CD200 y ciclosporina A (Anticuerpo 1 + CsA); y ratones que ni fueron inmunizados con RBCs de rata ni tratados con anticuerpo o ciclosporina (No-imm No Rx).
La figura 2 es una gráfica de líneas que ilustra el efecto de un anticuerpo ant¡-CD200 en el titulador del anticuerpo anti-RBC en un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune. A los ratones C57BL/6 se les administraron 2 x 108 de RBCs de rata en forma intraperitoneal (i.p.) una vez el día 0 del estudio, y posteriormente una vez a la semana durante el resto del estudio. Posteriormente, los ratones inmunizados con RBC de rata fueron tratados con un anticuerpo anti-CD200 que poseía función efectora (Anticuerpo 1; Ab 1) en 5 mg/kg o 1 mg/kg; un anticuerpo anti-CD200 que no posee función efectora (Anticuerpo 2; Ab 2) en 5 mg/kg; o un anticuerpo de control (Control) en 5 mg/kg. El grupo de ratones también fue tratado únicamente con vehículo. Un grupo final de ratones no recibió inmunización o tratamiento de anticuerpo (NC). El eje-Y ilustra la intensidad de fluorescencia relativa reflejada como el OD405 x factor de dilución de suero, y el eje-X representa el número de días después del inicio del estudio.
La figura 3 es una gráfica de barras que ilustra la reducción en la proliferación de esplenocitos inducida por antígeno aislados de ratones tratados con un anticuerpo anti-CD200. El eje-Y representa los conteos promedio por minuto de radioactividad de 3H-timidina en ácido nucleico aislado de cada población de células. El eje-X representa ratones individuales, tres (3) ilustrados en cada grupo. Para cada ratón, las cuatro medidas son para proliferación de esplenocitos inducida mediante medio solo, glóbulos rojos de ratón (mRBC), glóbulos rojos de rata (rRBC), o albúmina de suero de bovino (BSA). Los ratones del Grupo 1 fueron tratados con un anticuerpo anti-CD200 con función efectora (Anticuerpo 1) en una dosis de 5 mg/kg. Los ratones del Grupo 2 fueron tratados con anticuerpo 1 en una dosis de 1 mg/kg. Los ratones del Grupo 3 fueron tratados con un anticuerpo de control que no enlaza a CD200 y los ratones del Grupo 4 no fueron tratados con un anticuerpo o inmunizados con glóbulos rojos de rata.
La figura 4 es una gráfica de barras que ilustra la reducción en esplenocitos CD200+ en ratones tratados con un anticuerpo anti-CD200. A los ratones C57BL/6 se les administraron 2 x 1 O8 de RBCs de rata en forma intraperitoneal (i.p ) una vez el día 0 del estudio y posteriormente una vez a la semana durante el resto del estudio. Los ratones inmunizados con RBC de rata posteriormente fueron tratados con un anticuerpo anti-CD200 que posee función efectora (Anticuerpo 1; Ab 1) en 5 mg/kg o 1 mg/kg; un anticuerpo anti-CD200 que no posee función efectora (Anticuerpo 2; Ab 2) en 5 mg/kg; o un anticuerpo de control (Control) en 5 mg/kg. Un grupo de ratones también fue tratado únicamente con vehículo. Un grupo final de ratones no recibió inmunización o tratamiento de anticuerpo (Un-imm, No-Ab). El eje-Y representa el porcentaje de células CD200+ en la población total de esplenocitos viables. El eje-X representa ratones individuales, tres (3) ilustrados en cada grupo.
Descripción Detallada de la Invención La presente descripción se refiere a anticuerpos anti-CD200 y al uso de los anticuerpos en métodos para tratar trastornos autoinmunes o cáncer. También se presentan biomarcadores para utilizarse en la selección o prescripción de una modalidad de tratamiento para un paciente con un trastorno autoinmune y/o cáncer. Además, la presente descripción presenta métodos de tratamiento utilizando un anticuerpo anti-CD200 en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales tales como un agente terapéutico anti-CD20. Aunque no se pretende la limitación en forma alguna, los anticuerpos anti-CD200 y los fragmentos de enlace CD200 de los mismos, conjugados, composiciones y formulaciones farmacéuticas, biomarcadores, y métodos de ejemplo que emplean cualesquiera de los anteriores, son elaborados más adelante y son ejemplificados en los Ejemplos de operación. Anticuerpos Anti-CD200 La descripción presenta anticuerpos que enlazan a un polipéptido CD200 humano (algunas veces los anticuerpos son referidos en la presente invención como "anticuerpos anti-CD200"). También se presentan fragmentos de enlace de antígeno (enlace CD200) de los anticuerpos. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito enlaza a un epítope en la proteína CD200 humana. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD200 puede enlazar a un epítope en la proteína CD200 humana que comprende, o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: MERLVI RMPFSHLSTYSLVWVMAAVVLCTAQVQ VVTQDEREQLYT PASLKCSLQ AQEALI VTWQKKKAVS ENMVTFSENHG VVIQPAYK DKI ITQLGLQNSTITFWNITLEDEGCYMCLFNTFG FG KISGTACLT VYVQPI VSLHYKFSEDHLNITCSATARPAPMVFWKVPRSG IE STV TLSHPNGTTSVTSI LH I KDPKQVG KEVICQVLHLGTVTDFKQTVNKG YWFSVPLLLSIVSLVILLVLISI LLYWKRHRNQDREP (SEQ ID No: 1; Acceso Genbank No. NP_005935.2) . SEQ ID No: 1 ilustra la secuencia de aminoácido de una proteína de isoforma A CD200 humana precursora, de longitud total. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito enlaza a un epítope en la proteína CD200 humana que comprende, o consiste en la siguiente secuencia de aminoácido: M E R LTLTRTI G G PLLTATLLG KTTINDYQVIRMPFSH LSTYS LVWVM AAVVLCTAQ VQ VVTQDER EQLYTPASLKCSLQNAQEALI VTWQKK KAVSPENMVTFSENHG VVIQPAYKDKI NITQLGLQNSTITFWNITLE DEGC YMCLFNTFGFG Kl SGTACLT VYVQPI VSLHYKFSEDH L ITCS ATARPAPMVFWKVPRSG I ENSTVTLSHPNGTTSVTSILHI KDPKNQ VG KE ICQVLHLGTVTDFKQTVNKG YWFSVPLLLSI VSLVI LLVLISI LLYWKRHRNQDREP (SEQ ID No: 2; Acceso Genbank No. NP_001004196.2) . La SEQ ID No: 2 ¡lustra la secuencia de aminoácido de una proteína de isoforma B CD200 de longitud total. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 enlaza a un epítope presente en una proteína CD200 humana que tiene la siguiente secuencia de aminoácido: VI RMPFSHLSTYSLVWVMAAVVLCTAQVQVVTQDEREQLYTTASLK CSLQNAQEALIVTWQKKKAVSPEN MVTFSEN HG VVIQPAYKDKI NI TQLGLQNSTITFWN ITLEDEGCYMCLFNTFGFGKISGTACLTVY Q PIVSLHYKFSEDH LN I TC S ATAR P AP VFWKV PR SG I ENSTVTLSHP NGTTSVTSI LHI KDPKNQ VGKE VI CQVLH LGTVTDFKQTVNKGYWF SVPLLLSIVSLVI LLVLI SI LLYWKRHRNQDRGELSQGVQKMT (SEQ ID No: 3; Acceso Genbank No. CAA28943.1; figura 3 de la publicación de cCaughan y asociados (1987) Immunogenetics 25: 329-335). La SEQ ID No: 3 es una secuencia de ejemplo para una proteína CD200 humana de longitud total.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito enlaza a un epítope dentro de la parte extracelular de una proteína CD200. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 puede enlazar a una proteína CD200 en un epítope dentro o que traslapa con: (i) los aminoácidos 1 a 233 de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 1; (ii) los aminoácidos 1 a 258 de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 2; o los aminoácidos 1 a 229 de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 3.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 enlaza a un epítope en la proteína CD200 humana que carece de la secuencia líder. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede enlazar a una proteína CD200 en un epítope dentro o que traslapa con los aminoácidos 31 a 233 de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 1, que corresponde a la parte extracelular de la forma madura de la isoforma A CD200 humana, menor a la secuencia líder terminal amino. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede enlazar a una proteína CD200 en un epítope dentro o que traslapa con los aminoácidos 56 a 258 de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 2, que corresponde a la parte extracelular de la forma madura de la isoforma B CD200 humana, menor a la secuencia líder terminal amino. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede enlazar a una proteína CD200 en un epítope dentro o que traslapa con los aminoácidos 27 a 229 de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 3, que corresponde a la parte extracelular de la forma madura de CD200 humana menor a la secuencia líder terminal amino.
Un "epítope" se refiere al sitio en una proteína (por ejemplo, una proteína CD200 humana) que es enlazada por un anticuerpo. Los "epítopes de traslape" incluyen al menos uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, o seis) residuo(s) de aminoácido común.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 enlaza específicamente a una proteína CD200 humana (por ejemplo, la proteína CD200 humana que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, o los dominios extracelulares de las formas maduras de las proteínas CD200). Los términos "enlace específico" o "enlace en forma específica" se refieren a dos moléculas que forman un complejo (por ejemplo, un complejo entre un anticuerpo anti-CD200 y una proteína CD200) que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. Normalmente, el enlace se considera específico cuando la constante de asociación (Ka) es mayor a 106 M"1. Por lo tanto, un anticuerpo anti-CD200 puede enlazar específicamente a una proteína CD200 con una Ka de al menos (o mayor a) 1 O6 (por ejemplo, al menos o mayor a 107, 108, 109, 1010, 1011 101z, 1013, 1014, ó 1015 o mayor) M 1. Los ejemplos de anticuerpos que enlazan específicamente a una proteína CD200 humana se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos.: 7,408,041; 7,427,665; 7,435,412; y 7,598,353, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
Las secuencias de aminoácido para diversos anticuerpos anti-CD200 de ejemplo se describen, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 7,408,041. Por ejemplo, el anticuerpo anti- CD200 puede comprender la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada y ligera de uno de los anticuerpos Fab - d1B10, d1A5, d1B5, c2aB7, c1A10, o c2aA10 - ilustrados en la figura 23 de la Patente Norteamericana No. 7,408,041, las secuencias ilustradas en la figura 23 están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito contiene un conjunto emparejado de CDRs de cadena pesada y CDRs de cadena ligera de uno de los anticuerpos Fab ilustrados en la figura 23 de la Patente Norteamericana No. 7,408,041. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito contiene el conjunto emparejado de CDRs del anticuerpo d1B10 Fab: una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende la siguiente secuencia: GFTFSGFAMS (SEQ ID No: 4); una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende la siguiente secuencia: SISSGGTTYYLDSVKG (SEQ ID No: 5); una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende la siguiente secuencia: GNYYSGTSYDY (SEQ ID No: 6); una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende la siguiente secuencia: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID No: 7); una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende la siguiente secuencia: RASNLES (SEQ ID No: 8); y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende la siguiente secuencia: QQSNEDPRT (SEQ ID No: 9).
En otro ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede contener el conjunto de CDRs emparejadas procedentes del anticuerpo d1A5 Fab: (i) una HCDR1 que comprende la siguiente secuencia: GFNIKDYYMH (SEQ ID No: 10); una HCDR2 que comprende la siguiente secuencia: WIDPENGDTKYAPKFQG (SEQ ID No: 11); una HCDR3 que comprende la siguiente secuencia: KNYYVSNYNFFDV (SEQ ID No: 12); una LCDR1 que comprende la siguiente secuencia: SASSSVRYMY (SEQ ID No: 13); una LCDR2 que comprende la siguiente secuencia: DTSKLAS (SEQ ID No: 14); y una LCDR3 que comprende la siguiente secuencia: FQGSGYPLT (SEQ ID No: 15).
En otro ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede comprender un conjunto de CDRs emparejadas procedentes del anticuerpo d1B5 Fab: una HCDR1 que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: GFNIKDYYIH (SEQ ID No: 16); una HCDR2 que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: Wl DPEI G ATKYVPKFQG (SEQ ID No: 17); una HCDR3 que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: LYGNYDRYYAMDY (SEQ ID No: 18); una LCDR1 que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: KASQ VRTAVA (SEQ ID No: 19); una LCDR2 que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: LASNRHT (SEQ ID No: 20); y una LCDR3 que comprende la siguiente secuencia de aminoácido: LQHWNYPLT (SEQ ID No: 21).
En otro ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede contener un conjunto emparejado de CDRs procedentes del anticuerpo c2aB7 Fab: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: G YSFTDYI I L (SEQ ID No: 22); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: HIDPYYGSSNYNLKFKG (SEQ ID No: 23); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: SKRDYFDY (SEQ ID No: 24); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: KASQDINSYLS (SEQ ID No: 25); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: RANRLVD (SEQ ID No: 26); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: LQYDEFPYT (SEQ ID No: 27). Samalizumab (ALXN6000) contiene el conjunto CDR emparejado antes mencionado del anticuerpo c2aB7 Fab originalmente establecido en la figura 23 de la Patente Norteamericana No. 7,408,041.
Aún en otro ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede contener un conjunto emparejado de CDRs procedente del anticuerpo c1A10 Fab: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GYTFTEYTMH (SEQ ID No: 28); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: GVNPNNGGALYNQKFKG (SEQ ID No: 29); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: RSNYRYDDAMDY (SEQ ID No: 30); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: KSSQSLLDI DEKTYLN (SEQ ID No: 31); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: LVSKLDS (SEQ ID No: 32); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: WQGTHFPQT (SEQ ID No: 33).
Y aún en otro ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede contener un conjunto emparejado de CDRs procedente del anticuerpo c2aA10 Fab: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: AFNIKDHYMH (SEQ ID No: 34); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: Wl DPESGDTEYAPKFQG (SEQ ID No: 35); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: FNGYQALDQ (SEQ ID No: 36); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: TASSSVSSSYLH (SEQ ID No: 37); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: STSNLAS (SEQ ID No: 38); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: RQYHRSPPIFT (SEQ ID No: 39).
Los conjuntos de CDRs de ejemplo adicionales de los anticuerpos anti-CD200 se describen por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 7,427,665. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 es samalizumab (ALXN6000).
Los métodos para determinar si un anticuerpo enlaza a un antígeno de proteína y/o la afinidad de un anticuerpo para un antígeno de proteína son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el enlace de un anticuerpo a un antígeno de proteína puede ser detectado y/o cuantificado utilizando una variedad de técnicas, tal como, pero sin limitarse a, manchado Western, manchado de punto, método de resonancia de plasmón de superficie (por ejemplo, sistema BIAcore; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.), o un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA). Ver, por ejemplo, la publicación de Harlow y Lañe (1988) "Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Ingeniería de Anticuerpo: Métodos y Protocolos", Humana Press (ISBN: 1588290921 ); Borrebaek (1992) "Ingeniería de Anticuerpo, Una Guía Práctica", W.H. Freeman y Co., NY; Borrebaek (1995) "Ingeniería de Anticuerpo", 2a Edición, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne y asociados (1993) J Immunol Meth 60: 191-198; Jonsson y asociados (1993) Ann Biol Clin 51_: 19-26; y Jonsson y asociados (1991) Biotechniques JM_: 620-627.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 puede bloquear en forma cruzada el enlace de otro anticuerpo que enlaza a un epítope dentro, o que traslapa con, una proteína CD200 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 puede bloquear en forma cruzada el enlace de un anticuerpo que enlaza a un epítope dentro, o que traslapa con, un fragmento de péptido de una proteína CD200 humana. El fragmento de péptido puede ser un fragmento de una proteína CD200 humana que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada, por ejemplo, en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 3. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo de bloqueo cruzado" se refiere a un anticuerpo que disminuye la cantidad de enlace del anticuerpo anti-CD200 a un epítope en una proteína CD200 relativa a la cantidad de enlace del anticuerpo anti-CD200 al epítope en la ausencia del anticuerpo. Los métodos adecuados para determinar si un primer anticuerpo bloquea en forma cruzada el enlace de un segundo anticuerpo a un epítope, son conocidos en la técnica.
También son conocidos en la técnica métodos para identificar el epítope al cual enlaza un anticuerpo particular (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200). Por ejemplo, el enlace del epítope de un anticuerpo anti-CD200 puede ser identificado midiendo el enlace del anticuerpo a diversos (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 15, 20, ó 30 o más) fragmentos de péptido de traslape de una proteína CD200 (por ejemplo, diversos fragmentos de traslape de una proteína que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada, por ejemplo, en cualesquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 3). Cada uno de los diferentes péptidos de traslape posteriormente es enlazado a una dirección única en un soporte sólido, por ejemplo, depósitos separados de una placa de ensayo de depósitos múltiples. Posteriormente, el anticuerpo anti-CD200 es interrogado contactando a cada uno de los péptidos en la placa de ensayo durante una cantidad de tiempo, y bajo condiciones que permiten que el anticuerpo enlace a su epítope. El anticuerpo anti-CD200 no enlazado es eliminado mediante el lavado de cada uno de los depósitos. Posteriormente, un anticuerpo secundario etiquetado en forma detectable que enlaza al anticuerpo anti-CD200, si está presente en un depósito de la placa, es contactado a cada uno de los depósitos, y el anticuerpo secundario no enlazado es eliminado mediante pasos de lavado. La presencia o cantidad de la señal detectable producida por el anticuerpo secundario etiquetado en forma detectable en un depósito es una indicación de que el anticuerpo anti-CD200 se enlaza al fragmento de péptido particular asociado con el depósito. Ver, por ejemplo, la publicación de Harlow y Lañe (supra), Benny K. C. Lo {supra), y la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20060153836, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Un epítope particular al cual enlaza un anticuerpo, también puede ser identificado utilizando técnicas cromatográficas BIAcore (ver, por ejemplo, la publicación de Pharmacia Bl Atechnology Handbook, "Mapeo de Epítope", Sección 6.3.2, (Mayo 1994); y Johne y asociados (1993) J Immunol Methods 160: 20191-8).
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200, o un fragmento de enlace CD200 del mismo, aquí descrito enlaza a un polipéptido CD200 humano expresado en la superficie de una célula. Los métodos para determinar si un anticuerpo enlaza a una proteína expresada en la superficie de una célula, son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las publicaciones de Petermann y asociados (2007) J Clin Invest 117(12): 3922-9; Rijkers y asociados (2008) Mol Immunol 45(4): 1126-35; y Kretz-Rommel (2007) J Immunol 178(9): 5595-605.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 o un fragmento de enlace CD200 del mismo aquí descrito, inhibe la interacción entre una proteína CD200 y el receptor CD200. Los métodos para determinar si un agente (tal como un anticuerpo) inhibe la interacción entre CD200 y CD200R son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación de Hatherly y Barclay (2004) Eur J Immunol 34(6): 1688-94.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 o fragmento de enlace CD200 del mismo inhibe la formación de osteoclastos in vitro y/o in vivo. Los métodos adecuados para determinar si un anticuerpo inhibe la formación de osteoclastos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Publicación PCT No. WO 2008/089022 y en la publicación de Cui y asociados (2007) Proc Nati Acad Sci EUA 104(36): 14436-14441. Por ejemplo, se pueden cultivar células de médula ósea de múrido en la presencia, por ejemplo, de RANKL y M-CSF en la presencia o ausencia de un anticuerpo anti-CD200. Una disminución en el porcentaje de osteoclastos formados a partir de células de médula ósea en la presencia del anticuerpo en comparación con el porcentaje de osteoclastos formados en la ausencia del anticuerpo, indica que el anticuerpo inhibe la formación de osteoclastos in vitro.
Ya que CD200 se expresa en células normales tal como células endoteliales, aunque en menores niveles que en células de cáncer, en algunas modalidades puede ser conveniente administrar un anticuerpo anti-CD200 variante (o fragmento de enlace CD200 del mismo) con una región constante modificada de modo que no transmita, o tenga capacidad disminuida de transmitir, una citotoxicidad transmitida por célula dependiente de anticuerpo (ADCC), mediante lo cual los anticuerpos enlazan a receptores Fe en células asesinas naturales (NK) o macrófagos que conducen a la muerte celular, o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), que es una muerte celular inducida por la activación de la cascada de complemento (revisada en las publicaciones de Daeron (1997) Annu Rev Immunol 1_5: 203-234; Ward y Ghetie (1995) Therapeutic Immunol 2: 77-94; y Ravetch y Kinet (1991) Annu Rev Immunol. 9: 457-492). Dicha modificación puede ser útil para limitar el daño a las células normales. La expresión CD200 también es regulada en algunas células normales activadas (por ejemplo, células T activadas), que hacen a dichas células vulnerables a exterminación a través de un anticuerpo anti-CD200 con función efectora. Puede ser conveniente utilizar un anticuerpo anti-CD200 que carece de función efectora para evitar el exterminio de estas células mediante ADCC o CDC. La función efectora del anticuerpo anti-CD200 puede ser eliminada reemplazando una región constante de inmunoglobulina que tiene función efectora (por ejemplo, el dominio constante lgG1) para una región constante que no tiene función efectora (por ejemplo, una región constante de fusión lgG2/lgG4). Ver, por ejemplo, las publicaciones de Burton y asociados (1992) Adv Immun 51_: 1-18; Canfield y asociados (1991) J Exp Med 173: 1483-1491; y Mueller y asociados (1997) Mol Immunol 34(6): 441-452). Por ejemplo, (y de acuerdo con la numeración de Kabat), las regiones constantes I gG 1 y lgG4 contienen residuos G249G25o, en tanto que la región constante lgG2 no contiene el residuo 249, pero contiene G250. En una región constante híbrida G2/G4, en donde la región 249-250 viene de la secuencia G2, la región constante puede ser modificada en forma adicional para introducir un residuo de glicina en la posición 249 para producir una fusión G2/G4 que tiene G249/G25o. Los métodos adicionales para eliminar la función efectora se describen más adelante.
Quedará entendido que cualesquiera de los anticuerpos anti-CD200 antes descritos pueden ser incorporados en los anticuerpos anti-CD200/anti-CD20 biespecíf icos aquí descritos. Agentes Terapéuticos Anti-CD20 La descripción también presenta agentes terapéuticos que dirigen en forma específica células (por ejemplo, células de cáncer) que expresan la proteína CD20 mediante enlace específico a CD20 en la superficie de las células. El terapéutico anti-CD20 puede ser, por ejemplo, un compuesto de molécula pequeña que enlaza a CD20, una proteína (por ejemplo, un ligando natural o sintético para CD20) o fragmento del mismo, un aptámero ARN, un aptámero L-ARN, o un espiegelmero.
En algunas modalidades, los agentes terapéuticos anti-CD20 son anticuerpos que enlazan a polipéptidos CD20 (algunas veces los anticuerpos son referidos en la presente invención como "anticuerpos anti-CD20"). También se presentan fragmentos de enlace de antígeno (enlace CD20) de los anticuerpos. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD20 aquí descrito enlaza a un epítope en la proteína CD20 humana. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD20 puede enlazar a un epítope en la proteína CD20 humana que comprende, o consiste en, la siguiente secuencia de aminoácido: TTPRNSVNGTFPAEPM KGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFF RESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMI PAG I YAPICVTVWYPLWGG I MYI ISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNI KISHFLK ESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSL FLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKE QTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDI El I Pl QE EE EE ETETN FPE PPQD QESSPIENDSSP (SEQ ID No: 40; Acceso Genbank No. NP 068769.2). La SEQ ID No: 40 ilustra la secuencia de aminoácido de una proteína de isoforma A CD20 humana precursora, de longitud total. La secuencia de aminoácido de un polipéptido CD20 humano de longitud total también se describe, por ejemplo, en la publicación de Tedder y asociados (1988) Proc Nati Acad Sci EUA 85(1): 208-212.
Un anticuerpo anti-CD20 aquí descrito enlaza a un epítope dentro de la porción extracelular de una proteína CD20. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD20 puede enlazar a una proteína CD20 en un epítope dentro o que traslapa con: (i) los aminoácidos 72 a 80 de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 40; o (ii) los aminoácidos 140 a 186 de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEQ ID No: 40. Ver, por ejemplo, la publicación de Teeling y asociados (2006) J Immunol 177: 362-367. Esto es, un anticuerpo anti-CD20 aquí descrito puede enlazar a un epítope de CD20 humana dentro o que traslapa con la secuencia de aminoácido IPAGIYAPI (SEQ ID No: 41) o NIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI (SEQ ID No: 42).
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD20 enlaza en forma específica a una proteína CD20 humana (por ejemplo, la proteína CD20 humana que tiene la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEQ ID No: 40 o uno o más de los lazos extracelulares de la proteína CD20 humana). Los ejemplos de anticuerpos que enlazan específicamente a una proteína CD20 humana se describen, por ejemplo, en las publicaciones de Teeling y asociados (2006) en 363, supra; Levene y asociados (2005) J R Soc Med 98.: 146-152; y en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,435,803; 5,595,721; y 7,422,739, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
Los anticuerpos anti-CD20 terapéuticos de ejemplo, que son aprobados para uso clínico o están en desarrollo clínico, que se pueden utilizar en los métodos aquí descritos incluyen, sin limitación, rituximab (Biogen Idee), 90Y-ibritumomab tiuxetan (Biogen Idee), 131 l-tositumomab (GlaxoSmithKIine), ofatumumab (Genmab), TRU-015 (Trubion), veltuzumab (IMMU-106; Immunomedics) , ocrelizumab (Roche), y AME-133v (Applied Molecular Evolution). Ver, por ejemplo, las publicaciones de Levene y asociados (2005), supra Burge y asociados (2008) Clin Ther 30(10): 1806-1816: Kausar y asociados (2009) Expert Opin Biol Ther 9(7): 889-895; Morschhauser y asociados (2009) J Clin Oncol 27(20): 3346-3353; y Milani y Castillo (2009) Curr Opin Mol Ther 11 (2): 200-207.
Los métodos para determinar si un anticuerpo enlaza a CD20 y/o la afinidad de un anticuerpo para CD20 son conocidos en la técnica. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD20 puede bloquear en forma cruzada el enlace de otro anticuerpo que enlaza a un epítope dentro, o que traslapa con, una proteína CD20 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD20 puede bloquear en forma cruzada el enlace de un anticuerpo que enlaza a un epítope dentro, o que traslapa con, un fragmento de péptido de una proteína CD20 humana. El fragmento de péptido puede ser un fragmento de una proteína CD200 humana que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada, por ejemplo, en cualesquiera de las SEQ ID No: 41 o SEQ ID No: 42.
Quedará entendido que cualesquiera de los anticuerpos anti-CD200 antes descritos puede ser incorporado en los anticuerpos anti-CD200/anti-CD20 biespecíficos aquí descritos. Composiciones y Formulaciones Farmacéuticas Las composiciones que contienen un anticuerpo anti- CD200, un agente terapéutico anti-CD20, tal como un anticuerpo anti-CD20, o ambos, se pueden formular como una composición farmacéutica, por ejemplo, para la administración a un humano para tratar cáncer o un trastorno autoinmune. Las composiciones farmacéuticas generalmente incluirán un transportador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente invención, un "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere, e incluye, cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antif úngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Las composiciones pueden incluir una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una sal de adición de ácido o una sal de adición base. Ver, por ejemplo, la publicación de Berge y asociados (1977) J Pharm Sci 66.: 1-19.
Las composiciones se pueden formular de acuerdo con métodos estándar. La formulación farmacéutica es una técnica bien establecida, y se describe en forma adicional, por ejemplo, en las publicaciones de Gennaro (2000) "Remington: Ciencia y Práctica de Farmacia" 20a Edición, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel y asociados (1999) "Formas de Dosificación Farmacéutica y Sistemas de Suministro de Fármaco" 7a Edición, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); y Kibbe (2000) "Manual de Excipientes Farmacéuticos de la Asociación Farmacéutica Americana", 3a Edición (ISBN: 091733096X). En algunas modalidades, se puede formular una composición, por ejemplo, como una solución amortiguada en una concentración adecuada y adecuada para almacenarse a una temperatura de 2-8°C. En algunas modalidades, una composición puede ser formulada para almacenamiento a una temperatura menor a 0°C (por ejemplo, -20°C o -80°C).
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en una variedad de formas. Estas formas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquida, semisólida y sólida, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende, en parte, del modo de administración y la aplicación terapéutica proyectados. Por ejemplo, las composiciones que contienen un anticuerpo anti-CD200 o un anticuerpo anti-CD20, proyectadas para suministro sistémico o local, pueden estar en la forma de soluciones inyectables o infusibles. Por consiguiente, las composiciones se pueden formular para administración a través de un modo parenteral (por ejemplo, inyección, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular). La "administración parenteral", "administrado en forma parenteral", y otras frases gramáticamente equivalentes, tal como aquí se utilizan, se refieren a modos de administración además de administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intranasal, infraocular, pulmonar, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural, intracerebral , intracraneal, intracarótida e intrasternal e infusión (ver más adelante).
Las composiciones se pueden formular en la forma de una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para almacenamiento estable a una alta concentración. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un anticuerpo aquí descrito en la cantidad requerida en un solvente adecuado, con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada.
Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando un anticuerpo anti-CD200 (y/o un agente terapéutico anti-CD20 tal como un anticuerpo anti-CD20) aquí descrito en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y. los otros ingredientes requeridos de los descritos anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del anticuerpo aquí descrito, más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada-estéril del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede proporcionar incluyendo en la composición un reactivo que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 (y/o el agente terapéutico anti-CD20 tal como un anticuerpo anti-CD20) se puede preparar con un transportador que protegerá al compuesto contra rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tal como acetato de vinilo de etileno, polianhídridos, ácido poliglucólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. En la técnica se conocen muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones. (Ver, por ejemplo, la publicación de J.R. Robinson (1978) "Sistema de Suministro de Fármaco de Liberación Sostenida y Controlada", Marcel Dekker, Inc., Nueva York).
En algunas modalidades, un anticuerpo aquí descrito se puede formular en una formulación adecuada para administración intrapulmonar (por ejemplo, para la administración mediante un nebulizador) a un mamífero tal como un humano. Los métodos para preparar dichas composiciones son bien conocidos en la técnica y s'e describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20080202513; en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,112,341 y 6,019,968; y en las Publicaciones PCT Nos. WO 00/061178 y WO 06/122257, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Las formulaciones de inhalador de polvo en seco y los sistemas adecuados para la administración de las formulaciones se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20070235029, la Publicación PCT No. WO 00/69887; y la Patente Norteamericana No. 5,997,848.
En algunas modalidades, se puede modificar un anticuerpo anti-CD200 (y/o un agente terapéutico anti-CD20 tal como un anticuerpo anti-CD20) aquí descrito, por ejemplo, con una porción que mejora su estabilización y/o retención en la circulación, por ejemplo, en la sangre, suero, u otros tejidos. La porción de estabilización puede mejorar la estabilidad, o la retención del anticuerpo en al menos 1.5 (por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, ó 50 o más) veces.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede formularse con uno o más agentes activos adicionales útiles para tratar cáncer o disminuir un síntoma del mismo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 puede formularse con un agente terapéutico anti-CD20 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 tal como cualesquiera de los anticuerpos anti-CD20 aquí descritos), un agente genotoxico o un agente quimioterapéutico, o uno o más inhibidores de cinasa. El agente genotoxico o quimioterapéutico puede ser, pero no se limita a: carboplatina, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamída, camptotecina, ifosfamida, melfalan, clorambucil, bisulfan, nitrosurea, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoposida, podof illotoxina, taxol, satraplatino, 5-fluorouracil, vincristina, vinblastina, metotrexato, ara-C, taxotere, gemcitabina, cisplatina (CDDP), adriamicina (ADR), o un análogo de cualquiera de los mencionados anteriormente. Los inhibidores de cinasa incluyen, por ejemplo, uno o más de: trastuzumab, gefitinib, erlotinib, mesilato de imatinib, o malato de sunitinib. Los agentes adicionales son conocidos en la técnica y se describen en la presente invención.
Cuando el anticuerpo anti-CD200 será utilizado en combinación con un segundo agente activo, o cuando dos o más diferentes anticuerpos anti-CD200 serán utilizados, los agentes se pueden formular por separado o juntos. Por ejemplo, la composición farmacéutica respectiva puede ser mezclada, por ejemplo, justo antes de la administración, y administrarse junta o se puede administrar por separado, por ejemplo, al mismo tiempo o en diferentes tiempos (ver más adelante).
Tal como se describió anteriormente, se puede formular una composición que incluya una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD200 o la composición se puede formular para incluir una cantidad sub-terapéutica del anticuerpo y una cantidad sub-terapéutica de uno o más agentes activos adicionales tal como los componentes que en total son terapéuticamente efectivos para tratar un cáncer o un trastorno autoinmune. En algunas modalidades, se puede formular una composición para incluir dos o más anticuerpos anti-CD200, cada uno en dosis sub-terapéuticas, de modo que los anticuerpos en combinación estén en una concentración que sea terapéuticamente efectiva para tratar un cáncer o un trastorno autoinmune en un humano. Los métodos para determinar una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD200 son conocidos en la técnica y se describen en la presente invención.
Métodos para Producir un Anticuerpo Anti-CD200 o un Anticuerpo anti-CD20 Los métodos adecuados para producir un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 o un anticuerpo anti-CD20) o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, de acuerdo con la descripción son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 7,427,665; 7,435,412; y 7,408,041, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia) y aquí se describen. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-CD200 pueden ser generados utilizando células que expresan CD200 humana, un polipéptido CD200 humano, o un fragmento antigénico de un polipéptido CD200 humano como un inmunogen, elevando de esta forma una respuesta inmune en animales de los cuales se pueden aislar las células que producen anticuerpo, y a su vez, los anticuerpos monoclonales. En forma similar, un anticuerpo anti-CD20 monoclonal se puede generar utilizando células que expresan CD20 humana, un polipéptido CD20 humano, o un fragmento antigénico del polipéptido CD20 humano como un inmunogen en un animal. La secuencia de dichos anticuerpos se puede determinar, y los anticuerpos o variantes de los mismos producirse mediante técnicas recombinantes. Las técnicas recombinantes se pueden utilizar para producir anticuerpos quiméricos, injertados-CDR, humanizados o completamente humanos basados en la secuencia de los anticuerpos monoclonales, así como los polipéptidos con la capacidad de enlazar al antígeno de interés (por ejemplo, CD200 o CD20).
Además, los anticuerpos anti-CD200 derivados de bibliotecas recombinantes ("anticuerpos de fago") pueden ser seleccionados utilizando células que expresan CD200, o polipéptidos derivados de las mismas, como carnadas para aislar los anticuerpos o polipéptidos sobre las bases de la especificidad objetivo. La producción y aislamiento de anticuerpos anti-CD200 no humanos y quiméricos está dentro de las habilidades de los expertos en la técnica. Quedará entendido que los anticuerpos anti-CD20 pueden ser seleccionados utilizando adaptaciones meramente de rutina de los métodos descritos anteriormente.
La tecnología de ADN recombinante se puede utilizar para modificar una o más características de los anticuerpos producidos en células no humanas. Por lo tanto, se pueden construir anticuerpos quiméricos con el objeto de disminuir la inmunogenicidad de los mismos en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Además, la inmunogenicidad puede minimizarse, humanizando los anticuerpos mediante injerto CDR, y opcionalmente, mediante modificación de estructura. Ver, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,225,539 y 7,393,648, cuyos contenidos están incorporados a la presente invención como referencia.
Se pueden obtener anticuerpos de suero de animal, o en el caso de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, producidos en cultivo celular. Se puede utilizar tecnología de ADN recombinante para producir los anticuerpos de acuerdo con el procedimiento establecido, incluyendo procedimientos en cultivo de células bacterianas, o preferentemente de mamíferos. El sistema de cultivo de células seleccionado, segrega preferentemente el producto de anticuerpo.
En otra modalidad, un proceso para la producción de un anticuerpo aquí descrito, incluye cultivar un huésped, por ejemplo, E. coli o una célula de mamífero, que ha sido transformada con un vector híbrido. El vector incluye uno o más cartuchos de expresión que contienen un promotor enlazado en forma operable a una primera secuencia de ADN que codifica un péptido de señal enlazado en el cuadro de lectura adecuado a una segunda secuencia de ADN que codifica la proteína de anticuerpo. La proteína de anticuerpo posteriormente se recolecta y aisla. Opcionalmente, el cartucho de expresión puede incluir un promotor enlazado en forma operable a una secuencia de ADN policistrónica (por ejemplo, bicistrónica) que codifica proteínas de anticuerpo cada una enlazada en forma operable al péptido de señal en el cuadro de lectura adecuado.
La multiplicación de células de hibridoma o células huésped de mamífero in vitro se lleva a cabo en un medio de cultivo adecuado, que incluye el medio de cultivo estándar acostumbrado (tal como, por ejemplo, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) o medio RPMI 1640), opcionalmente rellenado con un suero de mamífero (por ejemplo, suero de becerro fetal), o elementos residuales y suplementos que sustentan el crecimiento (por ejemplo, células alimentadoras tales como células de exudado peritoneal de ratón normal, células de bazo, macrófagos de médula ósea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoproteína de baja densidad, ácido oleico, o similares). La multiplicación de células huésped que son células bacterianas o células de levadura se lleva a cabo de igual manera en un medio de cultivo adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, para bacterias, el medio de cultivo adecuado incluye el medio LE, NZCYM, NZYM, NZM, Caldo Terrífico, SOB, SOC, 2 xYT, o Medio Mínimo M9. Para levadura, el medio de cultivo adecuado incluye el medio YPD, YEPD, Medio Mínimo, o Medio de Goteo Mínimo Completo.
La producción in vitro proporciona preparaciones de anticuerpo relativamente puras y permite la producción a mayor escala para proporcionar grandes cantidades de los anticuerpos deseados. Las técnicas para cultivo de célula bacteriana, levadura, planta, o de mamífero son conocidas en la técnica e incluyen un cultivo de suspensión homogénea (por ejemplo, en un reactor elevado en el aire o en un reactor de agitación continua), y un cultivo de célula inmovilizada o atrapada (por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, o microcuentas de agarosa o cartuchos de cerámica).
También se pueden obtener grandes cantidades de los anticuerpos deseados multiplicando in vivo las células de mamífero. Para este propósito, las células de hibridoma deseadas que producen los anticuerpos son inyectadas en mamíferos histocompatibles para originar el crecimiento de tumores que producen anticuerpo. Opcionalmente, los animales son imprimados con un hidrocarburo, especialmente aceites minerales tales como pristano (tetrametil-pentadecano) , antes de la inyección. Después de una a tres semanas, los anticuerpos son aislados de los fluidos corporales de dichos mamíferos. Por ejemplo, las células de hibridoma obtenidas mediante fusión de células de mieloma adecuadas con células de bazo que producen anticuerpos de ratones Balb/c, o células transí ectadas derivadas de línea de célula de hibridoma Sp2/0 que producen los anticuerpos deseados, se inyectan en forma intraperitoneal en ratones Balb/c, opcionalmente tratados previamente con pristano. Después de una a dos semanas, se toma el fluido ascítico de los animales.
Lo anterior, y otras técnicas, se describen, por ejemplo, en las publicaciones de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256: 495-497; Patente Norteamericana No. 4,376,110; Harlow y Lañe, Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, (1988) Cold Spring Harbor, cuyas descripciones están incorporadas a la presente invención como referencia. Las técnicas para la preparación de moléculas de anticuerpo recombinante se describen en las referencias anteriores, y también, por ejemplo, en: WO97/08320; Patente Norteamericana No. 5,427,908; Patente Norteamericana No. 5,508,717; Smith (1985) Science 225: 1315-1317; Parmley y Smith (1988) Gene 73_: 305-318; De La Cruz y asociados (1988) Journal of Biological Chemistry 263: 4318-4322; Patente Norteamericana No. 5,403,484; Patente Norteamericana No. 5,223,409; WO88/06630; W092/15679; Patente Norteamericana No. 5,780,279; Patente Norteamericana No. 5,571,698; Patente Norteamericana No. 6,040,136; Davis y asociados (1999) Cáncer Metástasis Rev. 18(4): 421-5; y Taylor y asociados (1992) Nucleic Acids Research 20.: 6287-6295; Tomizuka y asociados (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97(2): 722-727, cuyos contenidos están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia.
Los sobrenadantes de cultivo celular son clasificados para los anticuerpos deseados, preferentemente mediante manchado inmunofluorescente de células que expresan CD200, mediante inmunomanchado, mediante un inmunoensayo de enzimas, por ejemplo, un ensayo de emparedado o un ensayo de punto, o un radioinmunoensayo.
Para aislamiento de los anticuerpos, las inmunoglobulinas en los sobrenadantes de cultivo o en el fluido ascítico pueden ser concentradas, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio, diálisis contra material higroscópico tal como polietilénglicol, filtración a través de membranas selectivas, o similares. Si es necesario y/o deseado, los anticuerpos son purificados mediante los métodos de cromatografía acostumbrados, por ejemplo, filtración de gel, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía sobre DEAE-celulosa y/o cromatografía (immuno)-afinidad, por ejemplo, cromatografía por afinidad con uno o más polipéptidos de superficie derivados de una línea de célula que expresa CD200 o péptidos de fragmento CD200 sintéticos, o con Proteína-A o -G.
Otra modalidad proporciona un proceso para la preparación de una línea de célula bacteriana que secreta anticuerpos dirigidos contra una proteína CD200 humana o una CD20 humana (dependiendo del anticuerpo que esté siendo generado) en un mamífero adecuado. Por ejemplo, un conejo es inmunizado con muestras recolectadas de tejido o células que expresan CD200 o polipéptido CD200 o fragmentos de los mismos. Una biblioteca de despliegue de fago producida del conejo inmunizado se construye y lava con batea para los anticuerpos deseados de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (tal como, por ejemplo, los métodos descritos en las diversas referencias incorporadas en la presente invención como referencia).
También se describen células de hibridoma que segregan los anticuerpos monoclonales. Las células de hibridoma preferidas son genéticamente estables, segregan anticuerpos monoclonales aquí descritos de la especificidad deseada, y se pueden expandir de los cultivos congelados profundamente, mediante descongelación y propagación in vitro o como ascitos in vivo.
En otra modalidad, se proporciona un proceso para la preparación de una línea de célula de hibridoma que segrega anticuerpos monoclonales contra una proteína CD200 humana. En dicho proceso, un mamífero adecuado, por ejemplo, un ratón Balb/c, es inmunizado con uno o más polipéptidos o fragmentos antigénicos de CD200 o con uno o más polipéptidos o fragmentos antigénicos derivados de una célula que expresa CD200, la propia célula que expresa CD200, o un transportador antigénico que contiene un polipéptido purificado tal como aquí se describe. Las células que producen anticuerpo del mamífero inmunizado se crecen brevemente en un cultivo o se fusionan con células de una línea de célula de mieloma adecuada. Las células híbridas obtenidas en la fusión son clonadas, y los clones celulares que segregan los anticuerpos deseados son seleccionados. Por ejemplo, las células de bazo de ratones Balb/c inmunizados con un fragmento de proteína de CD200 humana, son fusionadas con células de la línea de célula de mieloma PAI o la línea de célula de mieloma Sp2/0-Ag 14. Posteriormente, las células híbridas obtenidas son clasificadas para secreción de los anticuerpos deseados y se clonan las células de hibridoma positivas.
Los métodos para preparar la línea de célula de hibridoma incluyen inmunizar ratones Balb/c, inyectando varias veces en forma subcutánea y/o intraperitoneal un fragmento de péptido de CD200 humana, por ejemplo, cuatro a seis veces, durante varios meses, por ejemplo, entre dos y cuatro meses. Las células de bazo de los ratones inmunizados se toman dos a cuatro días después de la última inyección y se fusionan con células de la línea de célula de mieloma PAI en la presencia de un promotor de fusión, preferentemente polietilénglicol. Preferentemente, las células de mieloma se fusionan con un exceso de tres a veinte veces de células de bazo de los ratones inmunizados en una solución que contiene de aproximadamente 30% hasta aproximadamente 50% de polietilénglicol de un peso molecular de alrededor de 4000. Después de la fusión, las células son expandidas en un medio de cultivo adecuado tal como se describe supra, suplementado con un medio de selección, por ejemplo, medio HAT, en intervalos regulares con el objeto de prevenir que las células de mieloma normales sobrecrezcan las células de hibridoma deseadas.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser "quiméricos". Los anticuerpos quiméricos y los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos comprenden partes de dos o más diferentes especies (por ejemplo, ratón y humano). Los anticuerpos quiméricos pueden ser producidos con regiones variables de ratón de especificidad deseada dividida en segmentos de gen de dominio constante humano (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,816,567). En esta forma, los anticuerpos no humanos pueden ser modificados para hacerlos más adecuados para aplicación clínica humana (por ejemplo, métodos para tratar o prevenir un cáncer en un sujeto humano).
Los anticuerpos monoclonales de la presente descripción incluyen formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratón). Los mAbs humanizados o injertados CDR son particularmente útiles como agentes terapéuticos para humanos, debido a que no son despejados de la circulación en forma tan rápida como los anticuerpos de ratón, y normalmente no provocan una reacción inmune adversa. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo procedentes de una fuente no humana. Estos residuos de residuos de aminoácido no humano con frecuencia son referidos como residuos de "importación", los cuales normalmente son tomados de un dominio variable de "importación". Los métodos para preparar anticuerpos humanizados generalmente son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (ver, por ejemplo, las publicaciones de Jones y asociados (1986) Nature 321 : 522-525; Riechmann y asociados (1988) Nature 332: 323-327; y Verhoeyen y asociados (1988) Science 239: 1534-1536), mediante substitución de las CDRs o secuencias CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. También ver, por ejemplo, la publicación de Staelens y asociados (2006) Mol Immunol 43: 1243-1257. En algunas modalidades, las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratón) son anticuerpos humanos (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de la región hiper-variable (CDR) del anticuerpo receptor son reemplazados por residuos de región hiper-variable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad de enlace deseada. En algunos casos, los residuos de la región de estructura de la inmunoglobulina humana también se reemplazan mediante los residuos no humanos correspondientes (llamados "retromutaciones"). Además, se pueden utilizar bibliotecas de despliegue de fago para variar los aminoácidos en posiciones elegidas dentro de la secuencia de anticuerpo. Las propiedades de un anticuerpo humanizado también son afectadas por la elección de la estructura humana. Además, los anticuerpos humanizados y quimerizados pueden ser modificados para comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante y con el objeto de proporcionar propiedades de anticuerpo mejoradas, tal como, por ejemplo, afinidad o función efectora.
También se proporcionan anticuerpos completamente humanos en la descripción. El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si están presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano" no incluye anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como ratón, han sido injertadas en las secuencias de estructura humana (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Los anticuerpos completamente humanos o humanos pueden ser derivados de ratones transgénicos que llevan genes de anticuerpo humano (que llevan los exones variables (V), de diversidad (D), de unión (J), y constantes (C)) o de células humanas. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que tienen la capacidad, al momento de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Ver, por ejemplo, las publicaciones de Jakobovits y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci EUA 90.: 2551 ; Jakobovits y asociados (1993) Nature 362: 255-258; Bruggemann y asociados (1993) Year in Immunol 7: 33; y Duchosal y asociados (1992) Nature 355: 258. Se pueden diseñar mediante ingeniería cepas de ratón transgénico para que contengan secuencias de gen de genes de inmunoglobulina humana no reajustados. Las secuencias humanas pueden codificar tanto para cadenas pesadas como ligeras de anticuerpos humanos, y pueden funcionar correctamente en los ratones, pasando por un reajuste para proporcionar un amplio repertorio de anticuerpos similar al que se encuentra en humanos. Los ratones transgénicos pueden ser inmunizados con la proteína objetivo (por ejemplo, una proteína CD200 humana, fragmentos de los mismo, o células que expresan la proteína CD200; o una proteína CD20 humana, fragmentos de los mismos, o células que expresan la proteína CD20) para crear una diversa formación de anticuerpos específicos y su ARN de codificación. Los ácidos nucleicos que codifican los componentes de cadena de anticuerpo de dichos anticuerpos posteriormente pueden ser clonados del animal en un vector de despliegue. Normalmente, se clonan poblaciones separadas de ácidos nucleicos que codifican secuencias de cadena pesada y ligera, y las poblaciones separadas posteriormente son recombinadas en inserción en el vector, de modo que cualquier copia del vector determinada, recibe una combinación aleatoria de una cadena pesada o una ligera. El vector se diseña para expresar cadenas de anticuerpo, de modo que puedan ser ensambladas y desplegadas en la superficie externa del paquete de despliegue que contiene el vector. Por ejemplo, las cadenas de anticuerpo pueden ser expresadas como proteínas de fusión con una proteína de recubrimiento de fago de la superficie externa del fago. Posteriormente, se pueden clasificar paquetes de despliegue para el despliegue de anticuerpos que enlazan a un objetivo.
Además, los anticuerpos humanos pueden ser derivados de bibliotecas de despliegue de fago (Hoogenboom y asociados ( 991) J Mol Biol 227: 381 ; Marks y asociados (1991 ) J Mol Biol 222: 581-597; y Vaughan y asociados (1996) Nature Biotech 1_4: 309 (1996)). Se pueden crear bibliotecas de fago sintéticas las cuales utilizan combinaciones aleatorizadas de regiones de anticuerpo V humano sintético. Mediante la selección del antígeno, se pueden elaborar anticuerpos completamente humanos, en donde las regiones V son por naturaleza muy similares a las humanas. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,794,132, 6,680,209, 4,634,666, y la publicación de Ostberg y asociados (1983) Hybridoma 2: 361-367, cuyos contenidos están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia.
Para la generación de anticuerpos humanos, ver también las publicaciones de Méndez y asociados (1998) Nature Genetics 1_5: 146-156, Green y Jakobovits (1998) J Exp Med 188: 483-495, cuyos contenidos están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia. Los anticuerpos humanos se describen y delinean en forma adicional en las Patentes Norteamericanas Nos.: 5,939,598; 6,673,986; 6,114,598; 6,075,181; 6,162,963; 6,150,584; 6,713,610; y 6,657,103, así como en las Publicaciones de Patente Norteamericanas Nos. 20030229905 A1, 20040010810 A1 , US 20040093622 A1 , 20060040363 A1, 20050054055 A1 , 20050076395 A1, 20050287630 A1. También ver las Publicaciones Internacionales Nos. WO 94/02602, WO 96/34096, y WO 98/24893, y la Patente Europea No. EP 0 463 151 B1. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes, y referencias antes mencionadas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
En un método alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han^utilizado un método de "minilocus". En el método de minilocus, un locus Ig exógeno es minimizado a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus Ig. Por lo tanto, se forman uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (preferentemente una región constante gamma) en una construcción para inserción en un animal. Este método se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos.: 5,545,807; 5,545,806; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; y 5,814,318; 5,591 ,669; 5,612,205; 5,721 ,367; 5,789,215; 5,643,763; 5,569,825; 5,877,397; 6,300,129; 5,874,299; 6,255,458; y 7,041 ,871, cuyas descripciones están incorporadas a la presente invención como referencia. Ver también la Patente Europea No. 0 546 073 B1, las Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Ver además las publicaciones de Taylor y asociados (1992) Nucleic Acids Res 20: 6287; Chen y asociados (1993) Int Immunol 5.: 647; Tuaillon y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci EUA 90.: 3720-4; Choi y asociados (1993) Nature Genetics 4: 117; Lonberg y asociados (1994) Nature 368: 856-859; Taylor y asociados (1994) International Immunology 6: 579-591; Tuaillon y asociados (1995) J. Immunol. 154: 6453-65; Fishwild y asociados (1996) Nature Biotechnology 14: 845; y Tuaillon y asociados (2000) Eur J Immunol 1_0: 2998-3005, cuyas descripciones están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia.
En ciertas modalidades, se proporcionan anticuerpos anti-CD200 desinmunizados o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos. Los anticuerpos desinmunizados o los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos son los modificados para hacer al anticuerpo o al fragmento de enlace de antígeno del mismo no inmunogénico, o menos inmunogénico, para una especie determinada. Se puede lograr la desinmunización modificando el anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas para los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, las Publicaciones PCT Nos. WO 04/108158 y WO 00/34317). Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo puede ser desinmunizado identificando los epítopes de célula T y/o epítopes de célula B potenciales dentro de la secuencia de aminoácido del anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, y eliminando uno o más de los epítopes de célula T y/o epítopes de célula B potenciales del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, por ejemplo, utilizando técnicas recombinantes. El anticuerpo modificado o fragmento de enlace de antígeno del mismo opcionalmente puede ser producido y probado para identificar anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos que han retenido una o más actividades biológicas deseadas, tal como, por ejemplo, afinidad de enlace, pero tienen inmunogenicidad reducida. Los métodos para identificar epítopes de célula T y/o epítopes de célula B potenciales pueden llevarse a cabo utilizando técnicas conocidas en el arte, tal como, por ejemplo, métodos de cómputo (ver por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 02/069232), técnicas in vitro o in silico, y ensayos biológicos o métodos físicos (tal como, por ejemplo, determinación del enlace de péptidos en moléculas MHC, determinación del enlace de péptido de complejos de MHC a los receptores de célula T de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, pruebas de la proteína o partes de péptido de la misma utilizando animales transgénicos con moléculas MHC de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, o pruebas con animales transgénicos reconstituidos con células de sistema inmune de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, etc.). En varias modalidades, los anticuerpos desinmunizados (por ejemplo, anticuerpos anti-CD200 desinmunizados o anticuerpos anti-CD20 desinmunizados) aquí descritos, incluyen fragmentos de enlace de antígeno desinmunizados, Fab, Fv, scFv, Fab' y F(ab')2, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de múrido, anticuerpos diseñados por ingeniería (tal como, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, de cadena simple, injertados-CDR, humanizados, completamente humanos, y anticuerpos seleccionados en forma artificial), anticuerpos sintéticos y anticuerpos semisintéticos.
En algunas modalidades, se produce un ADN recombinante que comprende un inserto que codifica para un dominio variable de cadena pesada y/o para un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-CD200 o una línea de célula que expresa la proteína CD200. El término ADN incluye codificación de ADNs de hebra simple, ADNs de hebra doble que consisten en las ADNs de codificación y en las ADNs complementarias de las mismas, o éstos propios ADNs complementarios (de hebra simple) .
Además, un ADN que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos anti-CD200, o la línea de célula que expresa CD200, se pueden sintetizar en forma enzimática o química para contener la secuencia de ADN auténtica que codifica para un dominio variable de cadena pesada y/o para el dominio variable de cadena ligera, o un mutante del mismo. Un mutante del ADN auténtico es un ADN que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos antes mencionados en los cuales se eliminan, insertan o intercambian uno o más aminoácidos con uno o más de otros aminoácidos. Preferentemente dicha modificación(s) está fuera de las CDRs del dominio variable de cadena pesada y/o del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo en aplicaciones de optimización de humanización y expresión. El término ADN mutante, también abarca mutantes silentes en donde se reemplazan uno o más nucleótidos por otros nucleótidos con nuevos codones que codifican para el mismo aminoácido(s) . El término secuencia mutante, también incluye una secuencia de degeneración. Las secuencias de degeneración son degeneradas dentro del significado del código genético, en cuanto a que se reemplaza un número ilimitado de nucleótidos por otros nucleótidos, sin dar como resultado un cambio de la secuencia de aminoácido originalmente codificada. Dichas secuencia de degeneración pueden ser útiles debido a sus diferentes sitios de restricción y/o frecuencia de codones particulares que son preferidos por el huésped específico, particularmente E. coli, para obtener una expresión óptima del dominio variable de múrido de cadena pesada y/o del dominio variable de múrido de cadena ligera.
El término muíante, está proyectado para incluir un muíante de ADN obíenido medianíe mulagénesis in vitro del ADN auténtico de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Para el ensamble de moléculas de inmunoglobulina leíramérica complela y la expresión de anticuerpos quiméricos, los insertos de ADN recombinantes que codifica para los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera se fusionan con los ADNs correspondientes que codifican para los dominios constantes de cadena pesada y ligera, posteriormente se transfieren en las células huésped adecuadas, por ejemplo, después de incorporación en vectores híbridos.
Se pueden utilizar ADNs recombinantes que incluyen un inserto que codifica para un dominio variable de múrido de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD200 o una línea de célula que expresa CD200 fusionada a un domino constante humano IgG, por ejemplo, ?1, ?2, y3 o y4, en particular modalidades ?1 o ?4. También se proporcionan ADNs recombinantes que incluyen un inserto que codifica para un dominio variable de múrido de cadena ligera de un anticuerpo fusionado a un dominio constante humano ? o ?, preferentemente ?.
Otra modalidad pertenece a ADNs recombinantes que codifican para un polipéptido recombinante, en donde el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se enlazan por medio de un grupo espaciador, que comprende opcionalmente una secuencia de señal que facilita el procesamiento del anticuerpo en la célula huésped y/o una secuencia de ADN que codifica un péptido que facilita la purificación del anticuerpo y/o un sitio de disociación y/o un espaciador de péptido y/o un agente. El ADN que codifica para un agente está proyectado para ser un ADN que codifica para el agente útil en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Por lo tanto, las moléculas agentes que son toxinas o enzimas, especialmente enzimas con la capacidad de catalizar la activación de profármacos, están particularmente indicadas. El ADN que codifica dicho agente, tiene la secuencia de una enzima que ocurre naturalmente o una toxina que codifica ADN, o mutantes de los mismos, y se pueden preparar a través de métodos conocidos en la técnica.
Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de enlace de antígeno de la descripción, pueden ser anticuerpos desprotegidos o fragmentos de enlace de antígeno que no son conjugados para otros agentes, por ejemplo, un agente terapéutico o etiqueta detectable. Como alternativa, el anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace de antígeno puede conjugarse para un agente tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, una molécula pequeña, una hormona, una enzima, un factor de crecimiento, una citocina, una ribozima, un peptidomimético, un químico, un profármaco, una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de codificación (tal como antisentido, ARNi, construcciones de dirección de gen, etc.), o una etiqueta detectable (por ejemplo, un RMN o un agente de contraste de rayos-X, una molécula fluorescente, etc.)- En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 o fragmento de enlace de antígeno (por ejemplo, Fab, Fv, scFv de cadena simple, Fab', y F(ab')2) se enlaza a una molécula que incrementa la vida media del anticuerpo o el fragmento de enlace de antígeno (ver anteriormente).
Están disponibles diversos sistemas de vector posibles para la expresión de genes de cadena pesada y de cadena ligera clonados en células de mamífero. Una clase de vectores depende de la integración de las secuencias de gen deseadas en el genoma de célula huésped. Las células que tienen un ADN integrado en forma estable pueden ser seleccionadas introduciendo en forma simultánea genes de resistencia a fármacos tales como E. coli gpt (Mulligan y Berg (1981) Proc Nati Acad Sci EUA, 7_8: 2072) o Tn5 neo (Southern y Berg (1982) Mol Appl Genet 1_: 327). El gen marcador seleccionable puede ser ya sea enlazado a secuencias de gen de ADN que serán expresadas, o introducido en la misma célula mediante co-transfección (Wigler y asociados (1979) Cell 1_6: 77). Una segunda clase de vectores utiliza elementos de ADN que confieren capacidades de réplica en forma autónoma para un plásmido extracromosomal . Estos vectores pueden ser derivados de virus animales, tal como papilomavirus de bovino (Sarver y asociados (1982) Proc Nati Acad Sci EUA, 79: 7147), virus de polioma (Deans y asociados (1984) Proc Nati Acad Sci EUA 8J_: 1292), o virus SV40 (Lusky y Botchan (1981) Nature 293: 79).
Ya que un cADN de inmunoglobulina está comprendido únicamente de secuencias que representan el mARN maduro que codifica una proteína de anticuerpo, se requieren elementos de expresión de gen adicionales que regulan la transcripción del gen y procesamiento del ARN para la síntesis del mARN de inmunoglobulina. Estos elementos pueden incluir señales de división, promotores de transcripción, incluyendo promotores inducibles, aumentadores, y señales de terminación. Los vectores de expresión de cADN que incorporan dichos elementos incluyen los descritos por Okayama y Berg (1983) Mol Cell Biol 3: 280; Cepko y asociados (1984) Cell 3_7: 1053; y Kaufman (1985) Proc Nati Acad Sci EUA 82.: 689.
Como es evidente a partir de la descripción, los anticuerpos anti-CD200 y/o anticuerpos anti-CD20 pueden ser utilizados en terapias (por ejemplo, terapias para tratar un cáncer), incluyendo terapias de combinación, así como en el monitoreo del progreso de la enfermedad.
En las modalidades terapéuticas de la presente descripción, se contemplan anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos diferentes antígenos. En este caso, una de las especificidades de enlace es para el antígeno CD200 en una célula (tal como, por ejemplo, una célula inmune), el otro es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína o receptor de superficie celular o una subunidad de receptor. En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico es uno que enlaza a CD200 humana y CD20 humana.
Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos está basada en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello (1983) Nature 305: 537-539). Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar para secuencias de domino constante de inmunoglobulina. La fusión está preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo al menos parte de las regiones de articulación, CH2, y CH3. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina, y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Para detalles adicionales de los métodos actualmente conocidos ilustrativos para generar anticuerpos biespecíf icos ver, por ejemplo, las publicaciones de Suresh y asociados (1986) Methods in Enzymology 121: 210; la Publicación PCT No. WO 96/27011; Brennan y asociados (1985) Science 229: 81; Shalaby y asociados. J Exp Med (1992) 175: 217-225; Kostelny y asociados (1992) J Immunol 148(5): 1547-1553; Hollinger y asociados (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6444-6448; Gruber y asociados (1994) J Immunol 152: 5368; y Tutt y asociados (1991) J Immunol 147: 60. Los anticuerpos biespecíf icos también incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser elaborados utilizando cualesquiera métodos de reticulación. Los agentes de reticulación adecuados son conocidos en la técnica, y se describen en la Patente Norteamericana No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación.
También se han descritos diversas técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente del cultivo de célula recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíf icos utilizando cierres de leucina. Ver, por ejemplo, la publicación de Kostelny y asociados (1992) J Immunol 148(5) : 1547-1553. Los péptidos de cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun pueden enlazarse a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión genética. Los homodímeros de anticuerpo pueden ser reducidos en una región de articulación, para formar monómeros, y posteriormente volverse a oxidar para formar los heterod ímeros de anticuerpo. Este método también puede ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger y asociados (1993) Proc Nati Acad Sci EUA 90.: 6444-6448, ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíf icos. Los fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por medio de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento, son empujados a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, para formar de esta manera dos sitios de enlace de antígeno. También ha sido reportada otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíf icos a través del uso de dímeros Fv de cadena simple (scFv). Ver, por ejemplo, la publicación de Gruber y asociados (1994) J Immunol 152: 5368. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" tal como se describe, por ejemplo, en la publicación de Zapata y asociados (1995) Protein Eng 8(10): 1057-1062. En síntesis, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1 -VH-CH1 ) que forman un par de regiones de enlace de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
La descripción también abarca formas variantes de anticuerpos biespecíficos, tal como las moléculas de inmunogiobulina de dominio variable dual tetravalente (DVD-lg) descritas en la publicación de Wu y asociados (2007) Nat Biotechnol 25(11 ): 1290-1297. Las moléculas DVD-lg están diseñadas de modo que dos diferentes dominios variables de cadena ligera (VL) de dos diferentes anticuerpos de origen, se enlacen en tándem directamente o a través de un enlazador corto mediante técnicas de ADN recombinante, seguido del dominio constante de cadena ligera. Los métodos para generar moléculas DVD-lg de dos anticuerpos de origen, se describen en forma adicional, por ejemplo, en las Publicaciones PCT Nos. WO 08/024188 y WO 07/024715, cuyas descripciones están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD200 y/o anticuerpos anti-CD20 pueden ser modificados, por ejemplo, con una porción que mejora la estabilización y/o retención de los propios anticuerpos en la circulación, por ejemplo, en sangre, suero, u otros tejidos. Por ejemplo, un anticuerpo anti- CD200 aquí descrito puede ser PEGilado tal como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de Lee y asociados (1999) Bioconjug Chem 10(6): 973-8; Kinstler y asociados (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 5_4: 477-485; y Roberts y asociados (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476. La porción de estabilización puede mejorar la estabilidad, o la retención del anticuerpo en el cuerpo de un sujeto (por ejemplo, sangre o tejido) en al menos 1.5 (por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, ó 50 o más) veces.
Modificación de los Anticuerpos o Fragmentos de Enlace de Antígeno de los Mismos Los anticuerpos anti-CD200 o anticuerpos anti-CD20, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, se pueden modificar después de su expresión y purificación. Las modificaciones pueden ser modificaciones covalentes o no covalentes. Dichas modificaciones pueden ser introducidas en los anticuerpos o fragmentos, por ejemplo, haciendo reaccionar los residuos de aminoácido dirigidos del polipéptido con un agente de derivación orgánica que tenga la capacidad de reaccionar con las cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Los sitios adecuados para modificación pueden ser elegidos utilizando cualquiera de una variedad de criterios incluyendo, por ejemplo, análisis estructural o análisis de secuencia de aminoácido de los anticuerpos o fragmentos.
En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos pueden ser conjugados para una porción heteróloga. La porción heteróloga puede ser, por ejemplo, un polipéptido heterólogo, un agente terapéutico (por ejemplo, una toxina o un fármaco), o una etiqueta detectable tal como, pero sin limitarse a, una etiqueta radioactiva, una etiqueta enzimática, una etiqueta fluorescente, o una etiqueta luminiscente. Los polipéptidos heterólogos adecuados incluyen, por ejemplo, una etiqueta antigénica (por ejemplo, FLAG, polihistidina, hemaglutinina (HA), glutationa-S-transferasa (GST), o proteína de enlace de maltosa (MBP)) para utilizarse en la purificación de los anticuerpos o fragmentos. Los polipéptidos heterólogos también incluyen polipéptidos que son útiles como marcadores de diagnóstico o detectables, por ejemplo, luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), o transferasa de acetilo de cloramfenicol (CAT). Las etiquetas radioactivas adecuadas incluyen, por ejemplo, 32P, 33P, 1 C, 125 | 131 ^ 355^ v 3 |_j Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, sin limitación, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteína fluorescente verde (GFP), DyLight 488, ficoeritrina (PE), yoduro de propidio (Pl), PerCP, PE-Alexa Fluor® 700, Cy5, aloficocianina, y Cy7. Las etiquetas luminiscentes incluyen, por ejemplo, cualquiera de una variedad de quelatos de lántanida luminiscente (por ejemplo, europio o terbio). Por ejemplo, los quelatos de europio adecuados incluyen quelato de europio de ácido penta-acético de dietiléntriamina (DTPA) o ácido tetra-azaciclododecano-1 ,4,7, 10-tetra-acético (DOTA). Las etiquetas enzimáticas incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina, CAT, luciferasa, y peroxidasa de rábano. Los polipéptidos heterólogos pueden ser incorporados en los anticuerpos anti-CD200 como proteínas de fusión. Los métodos para generar ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión de polipéptido heteróloga-anticuerpo, son conocidos en la técnica de la ingeniería de anticuerpos y se describen, por ejemplo, en la publicación de Dakappagari y asociados (2006) J Immunol 176: 426-440.
En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo es uno que es tóxico para una célula. Por ejemplo, el polipéptido tóxico puede ser seleccionado del grupo que consiste en exotoxina Pseudomonas (PE), briodina, gelonina, aspergilina, restrictocina, angiogenina, saporina, abrina, una ribonucleasa procariótica, una ribonucleasa eucariótica, ricina, proteína antiviral de hierba carmín (PAP), un polipéptido pro-apoptótico, una proteína de inhibición ribosomal, o un fragmento biológicamente activo de cualesquiera de las anteriores. Los polipéptidos pro-apoptóticos incluyen, por ejemplo, Bax, Bad, Bak, Bim, Bik, Bok, Hrk, FasL, TRAIL, y TNF-a, y fragmentos pro-apoptóticos, biológicamente activos de los mismos.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200, un anticuerpo anti-CD20, o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos se pueden conjugar a una molécula pequeña o agente radioactivo que es tóxico para una célula. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 o un anticuerpo anti-CD20 puede conjugarse para una molécula pequeña tóxica seleccionada del grupo que consiste en cisplatina, carboplatina, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, caliceamicina, camptotecina, adriamicina, ifosfamida, melfalan, clorambucil, bisulfan, nitrosurea, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, platino, plicomicina, aurostatina de monometilo, auristatina E, mitomicina, etoposida, verampil, podofilotoxina, tamoxifen, taxol, transplatino, 5-flurouracil, vincristina, vinblastina, metotrexato, o un análogo de cualesquiera de las antes mencionadas. El anticuerpo o fragmento puede ser conjugado para un agente radioactivo que es tóxico para una célula. Los agentes radioactivos incluyen, por ejemplo, 90Y, 186Re, 188Re, 64Cu, 67Cu,212Pb, 212Bi, 2 3Bi, 123l, 125l , 131l, 111ln, 211At, 32P, 177Lu, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, y 199Au.
Dos proteínas (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 o un anticuerpo anti-CD20 y una porción heteróloga) pueden ser reticulados utilizando cualquiera de un número de reticuladores químicos conocidos. Los ejemplos de dichos reticuladores son los que enlazan dos residuos de aminoácido a través de una ligadura que incluye un enlace de disulfuro "obstaculizado". En estas ligaduras, un enlace de disulfuro dentro de la unidad de reticulación está protegido (mediante grupos de obstaculización en cualquier lado del enlace de disulfuro) de la reducción mediante la acción, por ejemplo, de una glutationa reducida o la reductasa de disulfuro de enzima. Un reactivo adecuado, tolueno de 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a (2-piridilditio) (SMPT), forma dicha ligadura entre dos proteínas utilizando una Usina terminal en una de las proteínas y una cisteína terminal en la otra. También se pueden utilizar reactivos heterobifuncionales que reticulan mediante una diferente porción de acoplamiento en cada proteína. Otros reticuladores útiles incluyen, sin limitación, reactivos que enlazan dos grupos amino (por ejemplo, N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida) , dos grupos sulfihidrilo (por ejemplo, 1 ,4-bis-maleimidobutano) , un grupo amino y un grupo sulfihidrilo (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) , un grupo amino y un grupo carboxilo (por ejemplo, 4-[p-azidosalicilamido]butilamina), y un grupo amino y un grupo guanidinio que está presente en la cadena lateral de arginina (por ejemplo, monohidrato glioxal de p-azidofenilo) .
En algunas modalidades, una etiqueta radioactiva puede ser conjugada directamente al esqueleto de aminoácido del anticuerpo. Como alternativa, la etiqueta radioactiva puede incluir como parte de una molécula más grande (por ejemplo, 1 5l en meta-[ 25l]yodofenil-N-hidroxisuccinimida ([125l]mlPNHS) que enlaza a grupos amino libres para formar derivados de metal-yodofenilo (mlP) de proteínas relevantes (ver por ejemplo la Publicación de Rogers y asociados (1997) J Nucí Med 3J3: 1221-1229) o quelato (por ejemplo, para DOTA o DTPA) que a su vez enlaza al esqueleto de proteína. Los métodos para conjugar etiquetas radioactivas o moléculas/quelatos más grandes que las contienen, a los anticuerpos anti-CD200 o anticuerpos anti-CD20 aquí descritos son conocidos en la técnica. Dichos métodos implican incubar las proteínas con la etiqueta radioactiva bajo condiciones (por ejemplo, pH, concentración de sal y/o temperatura) que facilitan el enlace de la etiqueta radioactiva o quelato a la proteína (ver, por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6,001,329).
Los métodos para conjugar una etiqueta fluorescente (algunas veces referida como un "fluoroforo") a una proteína (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200, un anticuerpo anti-CD20 o fragmentos de enlace de antígeno de cualesquiera de los anteriores) son conocidos en la técnica de la química de proteínas. Por ejemplo, los fluoroforos pueden ser conjugados a grupos amino libres (por ejemplo, de lisina) o grupos sulfhidrilo (por ejemplo cisteína) de proteínas utilizando porciones de éster de succinimidilo (NHS) o de éster de tetrafluorofenilo (TFP) adheridas a los fluoroforos. En algunas modalidades, los fluoroforos pueden ser conjugados para una porción reticuladora heterobif uncional, tal como sulfo-SMCC. Los métodos de conjugación adecuados implican incubar una proteína de anticuerpo o fragmento de la misma, con el fluoroforo bajo condiciones que facilitan el enlace del fluoroforo a la proteína. Ver por ejemplo la Publicación de Welch y Redvanly (2003) "Manual de Radiofarmacéuticos: Radioquímica y Aplicaciones", John Wiley and Sons (ISBN 0471495603).
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD200 o anticuerpos anti-CD20 pueden ser modificados, por ejemplo, con una porción que mejora la estabilización y/o retención de los anticuerpos en la circulación, por ejemplo, en sangre, suero u otros tejidos. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento puede ser PEGylado tal como se describe por ejemplo en las Publicaciones de Lee y asociados (1999) Bioconjug Chem 10(6) : 973-8; Kinstler y asociados (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 5_4:477-485; y Roberts y asociados (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476. La porción de estabilización puede mejorar la estabilidad o retención del anticuerpo (o fragmento) en al menos 1.5 (por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ó 50 o más) veces.
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD200, o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, aquí descritos pueden ser glucosilados. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, puede ser sometido a tratamiento enzimático o químico o producido a partir de una célula, de modo que el anticuerpo o fragmento tenga glucosilacion reducida o no tenga glucosilacion. Los métodos para producir anticuerpos con glucosilacion reducida, son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 6,933,368; Wright y asociados (1991) EMBO J 10(101:2717-2723; y Co y asociados (1993) Mol Immunol 30: 1361.
Muestras Biológicas y Recolección de Muestras Las muestras biológicas adecuadas para utilizarse en los métodos aquí descritos incluyen cualquier fluido biológico, población de células o tejido o fracción de los mismos que incluyan uno o más glóbulos blancos y/o uno o más glóbulos rojos. Una muestra biológica puede ser por ejemplo, un espécimen obtenido de un sujeto (por ejemplo, un mamífero tal como un humano) o puede ser derivada de dicho sujeto. Por ejemplo, una muestra puede ser una sección de tejido obtenida mediante biopsia, o células que se colocan o se adaptan al cultivo de tejido. Una muestra biológica puede ser un fluido biológico tal como orina, sangre completa o una fracción de la misma (por ejemplo, plasma), saliva, semen, esputo, fluido cerebroespinal, lágrimas o moco. La muestra biológica puede ser fraccionada en forma adicional, si se desea a una fracción que contiene tipos de células particulares. Por ejemplo, una muestra de sangre completa puede ser fraccionada en suero o en fracciones que contienen tipos particulares de células de sangre tal como glóbulos rojos o glóbulos blancos (leucocitos). Si se desea, una muestra biológica puede ser una combinación de diferentes muestras biológicas de un sujeto tal como una combinación de una muestra de tejido y fluido.
Las muestras biológicas pueden ser obtenidas de un sujeto, por ejemplo, un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer (por ejemplo, un cáncer que expresa una o ambas de CD200 y CD20), por ejemplo, B-CLL. Se puede emplear cualesquiera métodos adecuados para obtener las muestras biológicas, aunque los métodos de ejemplo incluyen por ejemplo, flebotomía, raspado, por ejemplo raspado bucal), lavado, o procedimiento de biopsia de aspirado con aguja fina. Los ejemplos no limitantes de tejidos susceptibles a aspiración con aguja fina incluyen nodo linfático, pulmón, tiroides, seno e hígado. Las muestras biológicas también pueden ser obtenidas de médula ósea. Las muestras también pueden ser recolectadas, por ejemplo, mediante microdisección (por ejemplo microdisección de captura láser (LCM) o microdisección láser (LMD)), lavado de vejiga, embarrado (embarrado PAP) o lavado ductal.
Los métodos para obtener y/o almacenar muestras que conservan la actividad o integridad de las células en la muestra biológica, son bien conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser contactada en forma adicional con uno o más agentes adicionales tal como amortiguadores y/o inhibidores adecuados, incluyendo inhibidores de proteasa, los agentes que sirven para conservar o minimizar los cambios en las células (por ejemplo, cambios en osmolaridad o pH) o desnaturalizar las proteínas de superficie celular (por ejemplo, proteínas enlazadas-GPI) o porciones GPI en la superficie de las células. Dichos inhibidores incluyen, por ejemplo, queladores tales como ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA), ácido tetraacético de etilenglicol (EGTA), inhibidores de proteasa tales como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), aprotinina y leupeptina. Los amortiguadores y condiciones adecuadas para almacenar o de otra forma manipular células completas se describen por ejemplo en las Publicaciones de Pollard y Walker (1997), "Protocolos de Cultivo de Célula Básico", volumen 75 de la Publicación de Methods in molecular biology, Humana Press; Masters (2000) "Cultivo de célula animal: método práctico", volumen 232 de la Publicación de Practical approach series, Oxford University Press; y Jones (1996) "Protocolos de cultivo de célula humana", volumen 2 de la Publicación de Methods in molecular medicine, Humana Press.
Una muestra también puede ser procesada para eliminar o minimizar la presencia de sustancias de interferencia. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser fraccionada o purificada para eliminar uno o más materiales (por ejemplo, células) que no son de interés. Los métodos para fraccionar o purificar una muestra biológica incluyen, pero no se limitan a citometría de flujo, clasificación celular activada por fluorescencia y sedimentación.
Aplicaciones Las composiciones aquí descritas se pueden utilizar en una cantidad de aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, por ejemplo, los anticuerpos anti-CD200 aquí descritos se pueden utilizar en métodos para tratar o diagnosticar cáncer o enfermedades autoinmune. Por ejemplo, después de que se determina que un paciente padece de un cáncer que es resistente a tratamiento con un agente terapéutico anti-CD20 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 tal como rituximab), un practicante médico puede elegir administrar al humano el anticuerpo anti-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para tratar el cáncer del paciente. En algunas modalidades, un practicante médico puede administrar a un paciente que padece de cáncer (por ejemplo, un tumor líquido) un anticuerpo anti-CD200 y un agente terapéutico anti-CD20 para tratar el cáncer, después de que se ha determinado que el cáncer del paciente comprende células de cáncer que expresan CD5. Los métodos para administrar terapéuticamente un anticuerpo anti-CD200 a un humano son bien conocidos en la técnica, se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 7,408,041.
Métodos para tratar trastornos autoinmune La presente descripción proporciona aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico para tratar trastornos autoinmune, por ejemplo, reduciendo la concentración de autoanticuerpos asociados con enfermedad autoinmune en un sujeto que padece del trastorno. Por ejemplo, un practicante médico puede elegir administrar a un humano con un trastorno autoinmune (por ejemplo, enfermedad hemolítica autoinmune) un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para reducir la expresión (o producción) del autoanticuerpo asociado con el trastorno, o para reducir la concentración del autoanticuerpo en la sangre de paciente, para tratar de esta forma el trastorno autoinmune del paciente. Los métodos para administrar terapéuticamente un anticuerpo anti-CD200 a un humano son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 7,408,041.
Un "trastorno autoinmune", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un estado de enfermedad en el cual, a través de la acción de los glóbulos blancos (por ejemplo, células B, células T, macrófagos, monocitos o células dend ríticas) , se ha generado una respuesta inmune patológica (por ejemplo, patológica en duración y/o magnitud) en un organismo huésped contra una sustancia o tejido que normalmente está presente dentro del organismo huésped. Los tipos de enfermedades autoinmune incluyen pero no se limitan a, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, diabetes melitus tipo 1, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barré, nefropatía IgA, escleroderma, síndrome de Sjógren, granulomatosis de Wegener, pénfigo vulgaris, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave (MG), cirrosis biliar pulmonar y síndrome de Miller Fisher. Los trastornos autoinmune también pueden incluir ciertos trastornos hemolíticos autoinmune tal como síndrome de antifosfosfolípido, (APS), síndrome anti-f osfol ípido catastrófico (CAPS), síndrome urémico hemolítico típico y atípico (HUS), y anemia hemolítica autoinmune (AIHA). AIHA se refiere a una familia de enfermedades relacionadas que están caracterizadas por la producción de autoanticuerpos para los glóbulos rojos del huésped. AIHA incluye, por ejemplo, AIHA templada (WAIHA), AIHA fría (CAD), hemoglobinuria fría paroxismal (PCH), y anemias hemolíticas inducidas por fármacos (DIHA).
Un humano (en riesgo de desarrollar un trastorno autoinmune se refiere a un humano con un historial familiar de trastornos autoinmune (por ejemplo, una predisposición genética a uno o más trastornos inflamatorios) o uno expuesto a una o más condiciones que inducen autoanticuerpos/trastorno autoinmune. Por ejemplo, un humano expuesto a una toxina de shiga, está en riesgo de desarrollar HUS típica. Los humanos con ciertos cánceres (por ejemplo, tumores líquidos tal como mieloma múltiple o leucemia linfocítica crónica) pueden ser pacientes predispuestos a desarrollar ciertas enfermedades hemolíticas autoinmune. Por ejemplo, PCH puede seguir una variedad de infecciones (por ejemplo, sífilis) o neoplasmas tal como linfoma de no Hodgkin. En otro ejemplo, CAD puede estar asociada con infección de HIV, infección de Mycoplasma pneumonía , linfoma de non-Hodgkin o macroglobulinemia de Waldenstrom. Aún en otro ejemplo, la anemia hemolítica autoinmune es una complicación bien conocida de la leucemia linfocítica crónica humana, aproximadamente el 11% de los pacientes CLL con enfermedad avanzada desarrollarán AIHA. Tanto como el 30% de CLL pueden estar en riesgo de desarrollar AIHA. Ver por ejemplo, las publicaciones de Diehl y asociados (1998) Semin Oncol 25(1 ):80-97 y Gupta y asociados (2002) Leukemia 16f 10) :2092-2095. A partir de lo anterior, quedará claro que los humanos "en riesgo de desarrollar un trastorno autoinmune" no son todos los humanos dentro de una especie de interés.
Un humano del que "se sospecha tiene un trastorno autoinmune", es uno quien presenta uno o más síntomas de un trastorno autoinmune. Los síntomas de los trastornos autoinmune pueden variar en severidad y tipo con el trastorno autoinmune particular e incluyen, pero no se limitan a, enrojecimiento, hinchazón (por ejemplo, articulaciones hinchadas), articulaciones que están calientes al tacto, dolor articular, rigidez, pérdida de función de la articulación, fiebre, escalofrío, fatiga, pérdida de energía, dolor, fiebre, palidez, ictericia, erupción dérmica por urticaria, hemoglobinuria, hemoglobinemia y anemia (por ejemplo, anemia severa), dolores de cabeza, pérdida de apetito, rigidez muscular, insomnio, comezón, nariz suelta, estornudos, tos, uno o más síntomas neurológicos tales como mareo, convulsión o dolor. De los anteriores, quedará claro que no todos los humanos están en "sospecha de tener un trastorno autoinmune".
En algunas modalidades, el practicante médico puede administrar un anticuerpo anti-CD200 a un humano en una cantidad efectiva para reducir la expresión o producción de un autoanticuerpo asociado con trastorno autoinmune en el humano. Por ejemplo, PCH más comúnmente resulta de la producción, por parte de un sujeto, de un autoanticuerpo (conocido como el "Anticuerpo Donath-Landsteiner") que enlaza al antígeno P de los glóbulos rojos en temperaturas frías. Una vez que se enlaza a los glóbulos rojos, el anticuerpo facilita la hemolisis transmitida por complemento de las células en temperaturas más templadas. Tanto como el 40% de las anemias hemolíticas autoinmune en niños están asociadas con anticuerpo de Donath-Landsteiner. Ver, por ejemplo la Publicación de Sokol y asociados (1982) Acta Haematol 68(4):268-77. Por lo tanto, por ejemplo un anticuerpo anti-CD200 puede ser administrado a un paciente PCH en una cantidad suficiente para reducir la producción o expresión del anticuerpo Donath-Landsteiner en el humano para tratar de esta forma la PCH del humano.
En forma similar, CAD (o enfermedad de hemaglutinina fría o CHD/CHAD) es un trastorno autoinmune caracterizado por autoanticuerpos que enlazan al antígeno I en los glóbulos rojos en temperaturas más frías. Una vez enlazados, los anticuerpos facilitan la hemaglutinación, y la hemolisis transmitida por complemento de las células. Por lo tanto, un practicante médico puede administrar un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad suficiente para reducir la producción o expresión de los anticuerpos de antígeno anti-l en el humano, para tratar de esta forma la CAD del humano.
En otro ejemplo, un gran número de pacientes con MG expresan anticuerpos que enlazan a e inhiben la actividad del receptor de acetilcolina nicotínico (AChR). Los anticuerpos originan la pérdida de receptores de acetilcolina y la función receptora disminuida en la placa de extremo del músculo de la articulación neuromuscular madura. Algunos pacientes quienes carecen de anticuerpos anti-AChR detectables, más bien expresan auto-anticuerpos dirigidos a una cinasa de tirosina receptora específica de músculo (MuSK). Ver por ejemplo la Publicación de Hoch y asociados (2001) Nature Meó. 7(3) :365-368). Por lo tanto, un practicante médico puede administrar un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad suficiente para reducir la producción o expresión de los anticuerpos anti-AChR o anti-MuSK en el humano para tratar de esta forma la MG del humano.
Los métodos para detectar la presencia o cantidad de un autoanticuerpo asociado con trastorno autoinmune en un humano, son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Burbelo y asociados (2009) J Transí Med 7:83; Hanke y asociados (2009) Arthritis Res Ther 11(1) : R22; Hoch y asociados (2001), supra; Vernino y asociados (2008) J Neuroimmunol 197(1 ):63-69; Sokol y asociados (1982), supra; y Littleton y asociados (2009) Mol Cell Proteomics 8(7) : 1688-1696.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 se administra a un sujeto en una cantidad y con una frecuencia para mantener una concentración reducida (o una expresión o producción reducida) del autoanticuerpo asociado con trastorno autoinmune.
Los métodos para detectar la expresión o un cambio en la concentración de autoanticuerpos son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, manchado Western, ¡nmunohistoquímica y técnicas de citometría de flujo) y se describen en la presente invención. A través de un proceso interactivo, un practicante médico puede determinar la cantidad de dosis adecuada y la frecuencia de administración de cada dosis, requerida para mantener una concentración reducida de los autoanticuerpos asociados con trastorno autoinmune en el paciente. Por ejemplo, un practicante médico puede administrar a un paciente con un trastorno autoinmune, tal como AIHA, una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o 10 o más o, por ejemplo, al menos dos, al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más) veces un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que reduce (o al menos se espera que reduzca) la concentración de autoanticuerpos en el humano. Las al menos dos dosis deben estar separadas en tiempo en al menos un (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, o incluso 14) día(s). Las muestras biológicas (por ejemplo, muestras de sangre) que contienen los autoanticuerpos se obtienen de paciente en diversos momentos, por ejemplo, antes de la primera administración del anticuerpo anti-CD200, entre la primera dosis y al menos una dosis adicional, y al menos una recolección de muestras biológicas después de la segunda dosis. En algunas modalidades, las muestras biológicas pueden ser recolectadas al menos dos veces entre las dosis y/o al menos una vez después de la dosis final administrada al paciente. Los autoanticuerpos en cada muestra biológica obtenidos posteriormente son interrogados para el titulador relativo del autoanticuerpo asociado con enfermedad autoinmune, para determinar si la cantidad y/o frecuencia de administración del anticuerpo anti-CD200 son suficientes para mantener una concentración reducida del autoanticuerpo en el paciente. El practicante médico (y/o una computadora) puede determinar un programa de dosificación de anticuerpo anti-CD200 para el paciente, que sea suficiente para mantener una concentración reducida de autoanticuerpos asociados con trastorno autoinmune en el paciente durante el curso del tratamiento.
En algunas modalidades, la administración del anticuerpo anti-CD200 al humano reduce la concentración de autoanticuerpo en al menos 5 (por ejemplo, al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o 85 O más) %.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 puede ser administrado en forma crónica al humano. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "administrado en forma crónica", "tratamiento crónico", "tratamiento en forma crónica" o variaciones gramaticales similares de los mismos, se refieren a un régimen de tratamiento que es empleado para mantener una cierta concentración de umbral de un agente terapéutico en la sangre de un paciente, con el objeto de mantener un estado particular en el paciente durante un período de tiempo prolongado. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 puede ser administrado en forma crónica a un paciente con MG para mantener una concentración reducida de anticuerpos anti-AChR en la sangre del paciente durante un período de tiempo prolongado. Por consiguiente, un paciente tratado crónicamente con un anticuerpo anti-CD200 puede ser tratado durante un período de tiempo que sea mayor o igual a 2 semanas (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ó 52 semanas; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses; o 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5 ó 12 años o durante el resto de la vida del paciente).
Los inventores han identificado y proporcionado en la presente invención, diversos biomarcadores consistentes con la producción en un humano de un efecto inmunomodulador a través de un anticuerpo anti-CD200 administrado al humano. Esto es, al momento de la administración del anticuerpo a los ratones con una enfermedad autoinmune (enfermedad hemolítica autoinmune), la concentración del número de esplenocitos y subconjuntos de célula de médula ósea cambiaron en los ratones. Un "efecto inmunomodulador" y términos gramaticalmente similares, tal como se utilizan en la presente invención, se refieren a un efecto inmunológico medible en un animal (por ejemplo un humano) atribuible a la actividad biológica de un anticuerpo anti-CD200 administrado a un animal (por ejemplo, un humano). Por ejemplo, los inventores han observado que después de la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un ratón, se reduce la concentración de las siguientes poblaciones de leucocito CD200+: células CD3+/CD200 + , células CD45R7CD200 + , células CD5+/CD200 + , células CD19+/CD200+, células CD138+/CD200 + , CD45FT/CD138+/CD200+ y células CD200R+/CD200 + . En algunas modalidades, los leucocitos CD200+ se localizan en el bazo. La reducción de los subconjuntos de célula CD200+ antes mencionados puede ser observada en sangre periférica. También se observó que al momento de la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un ratón, se reduce la concentración de los siguientes subconjuntos. de médula ósea CD200+: células de médula ósea CD200 + , células de médula ósea lgk+/CD200 + , células de médula ósea CD45RVCD1387CD200*, células de médula ósea CD138+/CD200+, células de médula ósea c-kit+/CD200+ y células de médula ósea c-kit+/CD200+/Lin". Aunque no se pretende la limitación a teoría o mecanismo de acción en particular, los inventores consideran que el monitoreo de un paciente tratado con un anticuerpo anti-CD200 con respecto al surgimiento de uno o más de estos biomarcadores, es útil, finalmente, para determinar si el anticuerpo anti-CD200 tiene la capacidad de producir un efecto biológico en el humano al cual se administra el anticuerpo. Además, uno o más de los biomarcadores también son útiles para identificar una dosis-una dosis de umbral - de un anticuerpo anti-CD200, tal como samalizumab (ALXN6000), que en virtud de su efecto inmunomodulador en el humano, es suficiente para lograr un efecto clínicamente significativo en la enfermedad (es decir, suficiente para tratar una enfermedad tal como un trastorno autoinmune o un cáncer). Es importante observar, que los ratones con enfermedad hemolítica autoinmune tratados con un anticuerpo anti-CD200, exhibieron una concentración reducida del autoanticuerpo asociado con la enfermedad en los ratones.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente descripción, un practicante médico puede administrar a un humano que necesita del mismo un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para tratar el trastorno autoinmune, manteniendo una o más de las siguientes condiciones fisiológicas (efectos inmunológicos) en el humano: (i) una concentración disminuida de al menos un subconjunto de leucocito CD200+ (por ejemplo, al menos un subconjunto de esplenocitos CD200 + ); (ii) una concentración incrementada de células F4/80+ esplénicas o periféricas; y (iii) una concentración disminuida de al menos un subconjunto de célula madre de médula ósea. Los subconjuntos de leucocitos CD200 + , pueden ser por ejemplo células CD37CD200 + , células CD45R+/CD200 + , células CD57CD200\ células CD197CD200\ células CD138 + /CD200 + , CD45R7CD1387CD200+ y células CD200R7CD200 + . Los subconjuntos de célula de médula ósea CD200+ pueden ser por ejemplo, células de médula ósea CD200+, células de médula ósea lgk+/CD200 + , células de médula ósea CD45R7CD 1387CD200 + , células de médula ósea CD1387CD2007 células de médula ósea c-kit7CD200+ y células de médula ósea c-kit7CD2007Lin . Las células F4/80 + esplénicas o periféricas pueden ser macrófagos. En algunos casos, se mantienen al menos dos condiciones fisiológicas. En algunas modalidades, todas las condiciones son mantenidas en el humano a lo largo del período de tratamiento.
Los métodos para medir la concentración de células CD200+ (por ejemplo, cualesquiera de los subconjuntos de célula de médula ósea o leucocito CD200 + ) son bien conocidos en la técnica e incluyen entre otros métodos, citometría de flujo. Ver por ejemplo, la Publicación de Chen y asociados (2009) Mol Immunol 46(10): 1951-1963. Un método adecuado para detectar y/o medir la concentración de célula de médula ósea CD200 + , esplenocito, o subconjuntos de leucocito de sangre periférica también se establece en los ejemplos de operación. En algunas modalidades, un practicante puede interrogar una muestra biológica obtenida de un paciente posttratamiento (un paciente al cual se le ha administrado un anticuerpo anti-CD200) con respecto a la concentración de células de un subconjunto particular de células CD200 + . Por ejemplo, un practicante puede determinar la concentración de leucocitos CD45R+/CD200+ y/o la concentración de células de médula ósea c-kit7CD200+/Lin" presentes en una muestra biológica de un paciente post-tratamiento.
En algunas modalidades, después de la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un humano, la concentración de un leucocito CD200+ (por ejemplo, población de leucocito CD200 + en el bazo) o subconjunto de célula de médula ósea es al menos el 5% menor a la concentración del subconjunto correspondiente en el humano antes del tratamiento. En algunas modalidades, la concentración post-tratamiento del subconjunto de esplenocito CD200+ o de célula de médula ósea es al menos 10 (por ejemplo, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, O más de 80)% menor a la concentración del subconjunto correspondiente antes del tratamiento con el anticuerpo.
Un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito puede ser coadministrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles para tratar o prevenir una condición inflamatoria. El uno o más agentes incluyen, por ejemplo, un fármaco anti-inflamatorio no esteroidal (NSAID), un fármaco anti-reumático que modifica la enfermedad (D ARD), un modificador de respuesta biológica o un corticoesteroide. Los modificadores de respuesta biológica incluyen por ejemplo, un agente anti-TNF (por ejemplo, un receptor TNF soluble o un anticuerpo específico para TNF tal como adulimumab, infliximab o etanercept). En algunas modalidades, el uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden ser por ejemplo esteroides, anti-malarias, aspirina, fármacos anti-inf lamatorios no esferoidales inmunosupresores, fármacos citotóxicos, corticoesteroides (por ejemplo, prednisona, dexametasona y prednisolona) , metotrexato, metilprednisolona, inmunosupresores de macrólido (por ejemplo, sirolimus y tacrolimus), inhibidores mitóticos (por ejemplo, azatioprina, ciclofosfamida y metotrexato), metabolitos fungióos que inhiben la actividad de linfocitos T (por ejemplo, ciclosporina) , mofetil de micofenolato, acetato de glatiramer y agentes citotóxicos y que dañan el ADN (por ejemplo, clorambucilo o cualquier otro agente que daña el ADN aquí descrito o conocido en la técnica).
Métodos para tratar cánceres La presente descripción también proporciona aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico para tratar cánceres. Por ejemplo, después de que se ha determinado que un humano tiene un tumor que comprende células de tumor que expresan CD200, un practicante médico puede elegir administrar al humano el anticuerpo anti-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para tratar el cáncer del paciente. Los métodos para administrar terapéuticamente un anticuerpo anti-CD200 a un humano son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 7,408,041.
El cáncer es una clase de enfermedades o trastornos caracterizada por división no controlada de células y la capacidad que tienen éstas de dispersarse, ya sea mediante crecimiento directo en el tejido adyacente a través de invasión, o mediante implante en sitios distantes mediante metástasis (en donde las células de cáncer son transportadas a través del torrente sanguíneo o sistema linfático). El cáncer puede afectar personas de todas las edades, pero el riesgo tiende a incrementar con la edad. Los tipos de cánceres pueden incluir, por ejemplo cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de renal, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer hematológico, cáncer de tejido neural (por ejemplo, neuroblastoma) , melanoma, cáncer de tiroides, cáncer de ovario, un tumor líquido, cáncer testicular, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer vaginal, o cáncer de vejiga. Los tumores líquidos incluyen, por ejemplo, leucemias (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica tal como leucemia linfocítica crónica tipo célula B o célula T) y mieloma múltiple. Los cánceres de huesos incluyen, sin limitación, osteosarcoma y osteocarcinomas.
Tal como se utiliza en la presente invención, un humano "en riesgo de desarrollar un cáncer", es un humano que tiene una predisposición a desarrollar un cáncer, por ejemplo, una predisposición genética a desarrollar cáncer, tal como una mutación en el gen supresor de tumor (por ejemplo, mutación en BRCA1, p53, RB o APC u otros reajustes genéticos) o ha estado expuesto a condiciones que pueden dar como resultado cáncer. Por lo tanto, un humano también puede ser uno "en riesgo de desarrollar un cáncer" cuando el humano ha sido expuesto a niveles mutagénicos o carcinogénicos de ciertos compuestos (por ejemplo, compuestos carcinogénicos en humo de cigarro tal como acroleína, arsénico, benceno, benz{a}antraceno, benzo{a}pireno, polonio-210 (radon), uretano, o cloruro de vinilo). Además, el humano puede estar "en riesgo de desarrollar un cáncer" cuando el humano ha estado expuesto por ejemplo, a grandes dosis de luz ultravioleta o radiación-X, o ha sido infectado por un virus asociado/que causa tumor, tal como un papilomavirus, virus de Epstein-Barr, virus de hepatitis B, o un virus de linfoma de leucemia de célula T humana. A partir de lo anterior quedará claro que no todos los humanos están "en riesgo de desarrollar un cáncer".
Un humano del que "se sospecha tiene un cáncer" es uno que tiene uno o más síntomas de un cáncer. Los síntomas de cáncer son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen sin limitación, nodulos en seno, dolor, pérdida de peso, debilidad, fatiga excesiva, dificultad para comer, pérdida de apetito, tos crónica, empeoramiento en la capacidad respiratoria, tos con sangre, sangre en la vena, sangre en heces, náusea, vómito, metástasis en hígado, metástasis en pulmón, metástasis en huesos, saciedad abdominal, inflamación, fluido en cavidad peritoneal, sangrado vaginal, constipación, distención abdominal, perforación de colon, peritonitis aguda (infección, fiebre, dolor), dolor, sangrado en vómito, sudoración pesada, fiebre, alta presión sanguínea, anemia, diarrea, ictericia, mareos, escalofríos, espasmos musculares y dificultad para tragar. Los síntomas de cáncer primario (por ejemplo, un cáncer primario grande) pueden incluir por ejemplo, cualesquiera de las metástasis de colon, metástasis de pulmón, metástasis de vejiga, metástasis de hígado, metástasis de huesos, metástasis de riñon y metástasis de páncreas.
Los inventores han descubierto que la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un animal, dio como resultado una marcada reducción en la concentración de células CD5+ en el bazo del animal. Aunque la descripción no pretende limitarse a teoría o mecanismo de acción en particular, es probable que las células CD5+ CLL puedan ser refractarias a terapia con rituximab, al menos en parte debido a una expresión reducida por parte de las células CD20. Los inventores han mostrado que una composición terapéutica que contiene un anticuerpo anti-CD200 es útil para reducir las poblaciones de célula CD5+ en un animal, y por lo tanto consideran que la composición es particularmente útil para tratar un subconjunto de pacientes CLL que son refractarios a tratamiento con terapia anti-CD20 (por ejemplo, resistentes a rituximab).
Por consiguiente, la presente descripción presenta una variedad de métodos para tratar cánceres, particularmente para seleccionar o identificar que cánceres pueden beneficiarse más del tratamiento con un anticuerpo anti-CD200. Por ejemplo, la descripción presenta un método para tratar a un humano que padece de un cáncer que es resistente, se sospecha que será resistente o probablemente será resistente a tratamiento con un agente terapéutico anti-CD20, tal como rituximab. La "resistencia" a una terapia, "refractario" a la terapia y frases gramaticales similares, tal como se utilizan en la presente invención, se refieren a un estado clínico del paciente, en el cual existe una reducción en la efectividad de un tratamiento determinado (por ejemplo, tratamiento con un agente terapéutico anti-CD20) en tratamiento o curación de un trastorno determinado (por ejemplo, un cáncer) o una reducción en la efectividad del tratamiento para disminuir uno o más síntomas asociados con el trastorno. Por ejemplo, los beneficios terapéuticos de la terapia anti-CD20 a un paciente que padece de un tumor líquido tal como leucemia linfocítica crónica de célula B, puede disminuir con el tiempo de modo que el cáncer resurja, permanezca o progrese incluso en la presencia de la terapia. La resistencia por parte de los cánceres a los agentes terapéuticos tales como agentes terapéuticos anti-CD20, está bien documentada en la técnica de la medicina y se describe por ejemplo en las Publicaciones de Reddy y asociados (2006) J Clin Oncol 24(18S): 17509; Bello and Sotomayor (2007) Hematology 1:233; Hernandez-llizaliturri y asociados (2009) J Clin Oncol 27(15s) :8543; y Friedberg y asociados (2005) Hematology 1:329.
En algunas modalidades, un paciente puede tener un cáncer que se sospecha es resistente, o probablemente se volverá resistente a una terapia anti-CD20. Un biomarcador útil para evaluar si un cáncer probablemente será resistente a un agente terapéutico anti-CD20 tal como rituximab, es la presencia o concentración de células de CD5+ en la población. Tal como se describió anteriormente, debido a que las células CD5+ expresan niveles reducidos de CD20, las células son menos afectadas por la terapia anti-CD20, y por lo tanto pueden ser seleccionadas debido a una creciente ventaja con respecto a células de cáncer que expresan mayores niveles de CD20. Los métodos para detectar la expresión de CD5 son bien conocidos en la técnica de la biología molecular e incluyen sin limitación, manchado Western, manchado de punto y citometría de flujo, que son útiles para cuantificar la expresión de la proteína CD5, o la reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) y análisis de manchado Northern para cuantificar la expresión de mARN CD5. Ver por ejemplo, las publicaciones de Ennishi y asociados (2008), supra; Holodick y asociados (2009), supra; Garaud y asociados (2009) J Immunol 182(91:5623-5632: y McNab y asociados (2009) Ann Clin Lab Sci 39(2): 108-113. Ver de manera general la Publicación de Sambrook y asociados (1989) "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, segunda edición", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel y asociados (1992) "Protocolos Actuales en Biología Molecular", Greene Publishing Associates. Un método adecuado para detectar y/o cuantificar la expresión de CD5 por parte de las células, o para determinar los porcentajes de células que expresan CD5 en una población, es citometría de flujo y se ejemplifica en los ejemplos de operación.
En algunas modalidades, un cáncer que probablemente será resistente a un agente terapéutico anti-CD20, comprende al menos una pluralidad de una parte de (por ejemplo, dos o más; al menos 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 17%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% o 45% o más) de células de cáncer (por ejemplo, células de leucemia linfocítica crónica de célula B) que expresan CD5. En algunas modalidades, más de 45 (por ejemplo, más de 50, 55, 60, 65, 70, 75 ó 80 o más) % de las células de cáncer de paciente pueden expresar CD5. En algunas modalidades, el cáncer comprende células (por ejemplo, una pluralidad o incluso una mayoría de células) que expresan o sobreexpresan CD5 (por ejemplo, proteína CD5 y/o mARN CD5). En algunas modalidades, al menos (o más de) 10 (por ejemplo, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95) % de las células de cáncer del cáncer del humano sobreexpresan CD5. En algunas modalidades, todas las células de cáncer ensayadas sobreexpresan CD5 en forma relativa a las células normales. En algunas modalidades, una célula de cáncer (por ejemplo, una pluralidad de células de cáncer, al menos el 10% de las células de cáncer, o todas las células de cáncer ensayadas) pueden expresar la proteína CD5 en niveles de al menos aproximadamente 1.4 (por ejemplo, al menos aproximadamente 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.2., 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 ó 5 o más) -veces que los niveles de expresión encontrados en células normales del mismo tipo histológico, o mayores que la expresión promedio de células normales de uno o más pacientes que no tienen cáncer.
En algunas modalidades, los métodos aquí descritos pueden incluir determinar si el humano tiene cáncer. En algunas modalidades, los métodos aquí descritos pueden incluir el paso de determinar si una o más células de cáncer del humano, expresan CD200. En algunas modalidades, los métodos pueden incluir determinar si una o más células de cáncer del cáncer del humano sobreexpresan CD200, en forma relativa a una muestra de control. En algunas modalidades, la muestra de control se obtiene del mismo humano, y comprende células normales del mismo tipo de tejido que el cáncer del humano. Por ejemplo, un experto en la técnica puede medir el nivel de proteína CD200 presente en células de cáncer de colon de un paciente, en comparación con células de cáncer normales del paciente. En algunas modalidades, la muestra de control puede ser el nivel de expresión (o nivel de expresión promedio) de células obtenidas de uno o más humanos quienes no tienen cáncer. En algunas modalidades, el cáncer comprende células (por ejemplo, una pluralidad o incluso la mayoría de las células) que expresan o sobreexpresan CD200 (por ejemplo, proteína CD200 y/o mARN CD200). En algunas modalidades, al menos (o más de) 10 (por ejemplo, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, ó 95) % de células de cáncer del humano sobreexpresan CD200. En algunas modalidades, todas las células de cáncer ensayadas sobreexpresan CD200 en forma relativa a las células normales. En algunas modalidades, una célula de cáncer (por ejemplo, una pluralidad de células de cáncer, al menos el 10% de las células de cáncer, o todas las células de cáncer ensayadas) pueden expresar proteína CD200 en niveles de al menos aproximadamente 1.4 (por ejemplo, al menos aproximadamente 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.2., 2.5, 3.0, 3.5,4.0, 4.5, ó 5 o más) - veces más que los niveles de expresión encontrados en células normales del mismo tipo histológico o mayores a la expresión promedio de células normales de uno o más pacientes quienes no tienen cáncer.
En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti- CD200 únicamente a un humano, si el cáncer del humano comprende una pluralidad de células de cáncer que expresan o sobreexpresan CD200. Los métodos para detectar la expresión de CD200 son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, manchado Western, inmunohistoquímica, y técnicas de citometría de flujo. Los métodos adecuados para detectar la expresión de CD200 se describen con detalle, por ejemplo en las Publicaciones de Kretz-Rommel y asociados, (2007) J Immunol 178:5595-5605 y Kretz-Rommel y asociados, (2008) Jlmmunol 180:699-705.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CD200 bloquea la supresión inmune en cáncer, mediante dirección de células de cáncer que expresan CD200. La erradicación o inhibición de estas células de cáncer, puede estimular el sistema inmune y permitir la erradicación adicional de las células de cáncer.
En algunas modalidades, la combinación directa de la célula de cáncer que extermina y conduce la respuesta inmune hacia un perfil Th1, proporciona eficacia mejorada en el tratamiento de cáncer. Por lo tanto, en una modalidad, se proporciona un tratamiento de cáncer en donde un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que enlaza a CD200 y tanto a) bloquea la interacción entre CD200 y su receptor, como b) extermina directamente las células de cáncer que expresan CD200, se administra a un paciente con cáncer. El mecanismo a través del cual las células de cáncer son exterminadas puede incluir, pero no se limitan a, ADCC o CDC; fusión con una toxina; fusión con un agente radioactivo tóxico, fusión con un polipéptido tóxico tal como granzima B o perforina; fusión con un virus citotóxico (por ejemplo, reo virus citotóxico tal como Reolysin®); o fusión con una citocina tal como TNF-ct o IFN-a. En una modalidad alternativa, un tratamiento de cáncer implica administrar un anticuerpo el cual, tanto a) bloquea la interacción entre CD200 y su receptor como b) la actividad de célula T o célula NK citotóxica contra el tumor. Dicho aumento de la actividad de célula T o célula NK citotóxica, por ejemplo, puede combinarse fusionando el anticuerpo con citocinas tales como, por ejemplo, IL-2, IL-12, IL-18, IL-13, y IL-5. Además, dicho aumento puede lograrse mediante la administración de un anticuerpo anti-CD200 en combinación con inhibidores tales como análogos de IMiDs, talidomida, o talidomida.
Aún en otra modalidad, el tratamiento de cáncer implica administrar un anticuerpo el cual a) bloquea la interacción entre CD200 y su receptor y b) atrae células T hacia las células de tumor. La atracción de célula T se puede lograr fusionando el Ab con quimiocinas tales como MIG, IP-10.1-TAC, CCL21, CCL5 o LIGHT. Asimismo, el tratamiento con quimioterapéuticos puede dar como resultado la activación deseada de LIGHT. La acción combinada de bloquear la supresión inmune y exterminar directamente a través de la dirección de anticuerpo de las células de tumor, es un método único que proporciona eficacia incrementada.
La presente descripción también proporciona un método para tratar un cáncer utilizando una terapia de combinación de un anticuerpo anti-CD200 y un agente terapéutico anti-CD20. Sin pretender limitarse a teoría o mecanismo de acción en particular, los inventores consideran que la administración de un anticuerpo anti-CD200 mejorará la eficacia de un agente terapéutico anti-CD20, reduciendo la proporción de células de cáncer que probablemente serán refractarias, a saber las células de cáncer CD5 + . El agente terapéutico anti-CD20 puede ser cualesquiera de los descritos en la presente invención o conocidos en la técnica tal como por ejemplo rituximab (Biogen Idee), 90Y-ibritumomab tiuxetan (Biogen Idee), 131 l-tositumomab (Glaxo SmithKIine), ofatumumab (Genmab), TRU-015 (Trubion), veltuzumab (IMMU-106; Immunomedics), ocrelizumab (Roche) y AME-133v (Applied Molecular Evolution).
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD200 y el agente terapéutico anti-CD20 son agentes separados. Por consiguiente, el anticuerpo anti-CD200 y el agente terapéutico anti-CD20 pueden administrarse al mismo tiempo. En otras modalidades, el anticuerpo anti-CD200 se administra primero y el agente terapéutico anti-CD20 se administra en segundo lugar. En algunas modalidades, la terapia anti-CD20 se administra en primer lugar, y el anticuerpo anti-CD200 se administra en segundo lugar.
El anticuerpo anti-CD200 puede reemplazar o aumentar una terapia administrada previamente o en ese momento, tal como un agente terapéutico anti-CD20. Por ejemplo, al momento del tratamiento con un anticuerpo anti-CD200 o fragmento de enlace de antígeno del mismo, la administración del agente terapéutico anti-CD20 puede terminar o disminuirse, por ejemplo, administrarse en menores niveles. En algunas modalidades, se puede mantener la administración del agente terapéutico anti-CD20. En algunas modalidades, la administración del agente terapéutico anti-CD20 será mantenida hasta que el nivel del anticuerpo anti-CD200 alcance un nivel suficiente para proporcionar un efecto terapéutico. Las dos terapias pueden ser administradas en combinación con un solo agente, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que enlaza tanto a CD200 como CD20 (ver anteriormente).
Un anticuerpo anti-CD200 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo aquí descrito, se puede administrar a un humano con cáncer, junto con uno o más agentes anti-cáncer terapéuticos adicionales. De igual manera, se puede adminsitrar al humano que tiene cáncer un anticuerpo anti-CD200 aquí descrito, junto con un agente terapéutico anti-CD20 y uno o más agentes anti-cáncer terapéuticos adicionales. Los agentes anti-cápcer incluyen por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, radiación por ionización, agentes de inmunoterapia o agentes de hipertermoterapia. Los agentes quimioterapéuticos, incluyen pero no se limitan a aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, asparaginasa, bcg, bicalutamida, bleomicin, buserelin, busulfan, camptotecina, capecitabina, carboplatin, carmustina, clorambucil, cisplatin, cladribina, clodronato, colquicina, ciclof osfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicin, daunorubicin, dienestrol, dietilstilbestrol, docetaxel, doxorubicin, epirubicin, estradiol, estramustina, etopósida, exemestano, filgrastim, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, f luoxi mesterona, flutamida, gemcitabina, genistein, goserelin, hidroxiurea, idarubicin, ifosfamida, imatinib, interferón, irinotecan, letrozol, leucovorin, leuprolida, levamisole, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalan, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicin, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazol, octreotida, oxaliplatin, paclitaxel, pamidronato, pentostatin, plicamicin, porfimer, procarbazina, raltitrexed, rituximab, estreptozocin, suramin, tamoxifen, taxol, temozolomida, teniposida, testosterona, tioguanina, tiotepa, dicloruro de titanoceno, topotecan, trastuzumab, tretinoin, vinblastina, vincristina, vindesina, y vinorelbina. En algunas modalidades, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD200 o fragmento de enlace CD200 del mismo, se puede formular con uno o más de cualesquiera de los agentes anteriores, o cualquier otra agente anti-cancer aquí descrito.
Estos compuestos anti-tumor quimioterapéuticos se pueden categorizar en grupos por su mecanismo de acción, incluyendo, por ejemplo, los siguientes: agentes anti-metabolitos/anti-cáncer, tales como análogos de pirrimidina (5-f luorouracil , floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina) y análogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)) ; agentes antiproliferativos/antimitóticos incluyendo productos naturales tales como alcaloides vinca (vinblastina, vincristina, y vinorelbina) , interruptores de microtúbulo tales como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilones y navelbina, epidipodof illotoxinas (etopósida, teniposida), agentes que dañan el ADN (actinomicin , amsacrina, antraciclinas, bleomicin, busulfan, camptotecin, carboplatin, clorambucil, cisplatin, ciclofosfamida, citoxan, dactinomicin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, hexametilmelaminaoxaliplatin, ifosfamida, melfalan, mecloretamina, mitomicin, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicin, procarbazina, taxol, taxotere, teniposida, trietilenetiofosforamide y etopósido (VP16)); antibióticos tal como dactinomicin (actinomicin D), daunorubicin, doxorubicin (adriamicin), idarubicin, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicin (mitramicin) y mitomicin; enzimas (L-asparaginasa que metaboliza sistémicamente L-asparagina y priva a las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); agentes antiplaqueta; agentes de alquilacion antiproliferativos/antimitóticos tales como mostazas de nitrógeno (mecloretamina, ciclofosfamida y análogos, melfalan, clorambucil), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), alquilo sulfonatos-busulfan, nitrosoureas (carmustina (BCNU) y análogos, estreptozocina) , trazenos - dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tal como análogos de ácido fólico (metotrexato) ; complejos de coordinación de patino (cisplatin, carboplatin) , procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, análogos de hormona (estrógeno, tamoxifen, goserelin, bicalutamida, nilutamida) e inhibidores de aromatása (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales de heparina sintética y otros inhibidores de trombina); agentes fibrinolítico (tal como activador de plasminogen de tejido, estreptocinasa y urocinasa), aspirina, dipirridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratorios; agentes anti-secreción (breveldin); inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicin), azatioprina, mofetil de micofenolato) ; agentes inmunomoduladores (talidomida y análogos de los mismos, tales como lenalidomida (Revlimid, CC-5013) y CC-4047 (Actimid)), ciclofosfamida; compuestos anti-angiogénicos (TNP-470, genistein) e inhibidores de factor de crecimiento (inhibidores de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), inhibidores del factor de crecimiento de fibroblasto (FGF)); bloqueador de receptor de angiotensina; donadores de óxido nítrico; oligonucleótidos antisentido; anticuerpos (trastuzumab) ; inhibidores de ciclo celular e inductores de diferenciación (tretinoin); inhibidores mTOR, inhibidores de topoisomerasa (doxorubicin (adriamicin) , amsacrina, camptotecin, daunorubicin , dactinomiein , eniposida, epirubicin, etoposida, idarubicin y mitoxantrona, topotecan, irinotecan), corticoesteroides (cort'isona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona, y prednisolona); inhibidores de cinasa de transducción de señal de factor de crecimiento; inductores de disfunción mitocondrial y activadores de caspasa; e interruptores de cromatin.
En algunas modalidades, los métodos aquí descritos pueden incluir, después de administrar el anticuerpo anti-CD200, monitorear al humano con respecto a una mejoría en el trastorno y/o uno o más síntomas del mismo. El monitoreo de un humano para una mejoría en un trastorno (por ejemplo, un cáncer, una condición inflamatoria, o un trastorno asociado con pérdida ósea), tal como aquí se define, significa evaluar al sujeto con respecto a un cambio en un parámetro de la enfermedad, por ejemplo, una mejoría en uno o más síntomas de la enfermedad. En algunas modalidades, la evaluación se lleva a cabo al menos 1 hora, por ejemplo, al menos 2, 4, 6, 8, 12, 24 ó 48 horas, o al menos 1 día, 2 días, 4 días, 10 días, 13 días, 20 días o más, o al menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 10 semanas, 13 semanas, 20 semanas o más, después de la administración. El humano puede ser evaluado en uno o más de los siguientes períodos: antes de comenzar el tratamiento; durante el tratamiento, o después de que se ha administrado uno o más elementos del tratamiento. La evaluación puede incluir evaluar la necesidad de tratamiento adicional, por ejemplo evaluar si se debe alterar una dosificación, frecuencia de administración o duración del tratamiento. También puede incluir evaluar la necesidad de agregar o disminuir una modalidad terapéutica seleccionada, por ejemplo, agregar o disminuir cualesquiera de los tratamientos para un trastorno aquí descrito.
En algunas modalidades, el monitoreo del progreso y/o efectividad de un tratamiento terapéutico incluye monitorear el nivel de expresión CD200 por parte de las células de cáncer antes y después del tratamiento. En algunas modalidades, el monitoreo de progreso y/o efectividad del tratamiento terapéutico incluye monitorear el nivel de expresión CD5 por parte de las células de cáncer antes y después del tratamiento. En algunas modalidades, el monitoreo del progreso y/o efectividad de un tratamiento terapéutico incluye monitorear el nivel de expresión CD200 y CD5 por parte de las células de cáncer antes y después del tratamiento. Por ejemplo, los niveles pre-tratamiento de expresión CD200 y/o CD5 por parte de las células de cáncer, puede ser confirmado, y después de al menos una administración de la terapia, se pueden determinar nuevamente los niveles de CD200 y/o CD5. Un disminución en la expresión CD200 y/o CD5 por parte de las células de cáncer puede ser indicativa de un tratamiento efectivo (ver más adelante). La medida de los niveles de expresión CD200 y/o CD5 por parte de las células de cáncer puede ser utilizada por el practicante como una guía para incrementar la cantidad de dosificación o frecuencia de la terapia. Por supuesto deberá quedar entendido que los niveles CD200 y/o CD5 pueden ser directamente monitoreados o como alternativa, se puede monitorear cualquier marcador que se correlacione con CD200 y/o CD5.
Debido a que la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un animal reduce la concentración de células CD5+ en el animal, se considera benéfico administrar al humano un anticuerpo antí-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para sostener la concentración reducida de células CD5+ es un humano, particularmente en el caso de leucemia linfocítica crónica CD5+ por las razones descritas anteriormente. Los métodos para detectar la expresión o un cambio en expresión de CD5 por parte de las células (por ejemplo, células de cáncer tal como células CLL de célula B) son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, manchado Western blot, inmunohistoquímica y técnicas de citometría de flujo) y se describen en la presente invención. Por ejemplo, después de la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un humano, se puede determinar la concentración de células de cáncer CD5+ mediante análisis de citometría de flujo de las células de cáncer presentes en una muestra biológica obtenida de un paciente. La concentración de células de cáncer CD5 + post-tratamiento, se puede comparar con una concentración de control (por ejemplo, la concentración de células de cáncer CD5+ en el humano antes del tratamiento con el anticuerpo), en donde una reducción en la concentración de células de cáncer CD5 + , indica que el anticuerpo anti-CD200 ha sido administrado al humano en una cantidad y con una frecuencia suficiente para reducir la concentración de células CD5+ en el humano y por lo tanto es terapéuticamente efectiva.
A través de un proceso interactivo, un practicante puede determinar la cantidad de dosis adecuada, y la frecuencia de administración de cada dosis, requerida para mantener una concentración reducida de células de cáncer CD5+ en el paciente. Por ejemplo, un practicante médico puede administrar a un paciente con cáncer, una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez, o más, por ejemplo al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más) veces un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que reduce (o al menos se espera que reduzca) la concentración de células de cáncer CD5 + . Las al menos dos dosis deben ser espaciadas en tiempo en al menos un (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13 o incluso 14) día(s). Las muestras biológicas (por ejemplo, muestras de sangre) que contienen células de cáncer, se obtienen del paciente en diversos tiempos, por ejemplo, antes de la primera administración de anticuerpo anti-CD200, entre la primera dosis y al menos una dosis adicional, y al menos una recolección de muestras biológicas después de la segunda dosis. En algunas modalidades, las muestras biológicas pueden ser recolectadas al menos dos veces entre dosis y/o al menos una vez después de la dosis final administrada al paciente. Las células de cáncer en cada muestra biológica obtenida posteriormente se interrogan para el porcentaje relativo de células de cáncer CD5+, para determinar si la cantidad y/o la frecuencia de administración del anticuerpo anti-CD200 son suficientes para mantener una concentración reducida de células de cáncer CD5+. Con la información obtenida con respecto a la concentración de células de cáncer CD5+ en el paciente con el tiempo, y el efecto en la concentración de células de cáncer CD5+ con el tiempo mediante la administración del anticuerpo anti-CD200 al paciente, un practicante médico (y/o una computadora) puede determinar un programa de dosificación de anticuerpo anti-CD200 para el paciente, que sea suficiente para mantener una concentración reducida de células de cáncer CD5+ en el paciente durante el curso del tratamiento. Tal como se describió anteriormente, el tratamiento puede llevarse a cabo junto con una terapia anti-CD20, tal como rituximab.
Un anticuerpo descrito anteriormente (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 o un anticuerpo anti-CD200) puede ser administrado en una dosis fija, o en una dosis de miligramo por kilogramo (mg/kg). En algunas modalidades, la dosis también puede ser elegida para reducir o evitar la producción de anticuerpos u otras respuestas inmune huésped contra uno o más de los anticuerpos activos en la composición. Sin pretender en forma alguna limitarse, las dosificaciones de ejemplo del anticuerpo incluyen, por ejemplo, 1 a 100 g/kg, 0.5 a 50 g/kg, 0.1 a 100 pg/kg, 0.5 a 25 pg/kg, 1 a 20 pg/kg, and 1 a 10 pg/kg, 1 a 100 mg/kg, 0.5 a 50 mg/kg, 0.1 a 100 mg/kg, 0.5 a 25 mg/kg, 1 a 20 mg/kg y 1 a 10 mg/kg. Las dosis de ejemplo de un anticuerpo aquí descrito incluyen sin limitación, 0.1 pg/kg, 0.5 pg/kg, 1.0 pg/kg, 2.0 pg/kg, 4 pg/kg y 8 pg/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4 mg/kg y 8 mg/kg. Las dosis de ejemplo también incluyen, por ejemplo, más o igual a 50 mg/m2, 75 mg/m2, 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2, 450 mg/m2, 500 mg/m2, 550 mg/m2 y/o 600 mg/m2.
Una composición farmacéutica puede incluir una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo aquí descrito. Dichas cantidades efectivas pueden ser fácilmente determinadas por un experto en la técnica, con base en parte, en el efecto del anticuerpo administrado, o el efecto de combinación del anticuerpo y uno o más agentes activos adicionales, si se utiliza más de un agente. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo aquí descrito, también puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad que tiene el anticuerpo (y uno o más agentes activos adicionales) de provocar una respuesta deseada en el individuo, por ejemplo, disminuir al menos un parámetro de la condición, por ejemplo, disminuir al menos un síntoma del cáncer y/o la presencia de al menos uno de los biomarcadores de efecto inmunomodulador aquí descritos. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales de la composición, en donde pesan más los efectos terapéuticamente benéficos.
La toxicidad y eficacia terapéutica de dichas composiciones puede ser determinada mediante procedimientos farmacéuticos conocidos en cultivos celulares o animales experimentales (por ejemplo, modelos animales de cáncer o trastornos autoinmune). Estos procedimientos se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción LD50/ED5o. Se prefiere un anticuerpo anti-CD200 y/o un agente terapéutico anti-CD20 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20) que exhibe un alto índice terapéutico. Aunque las composiciones que exhiben efectos secundarios tóxicos pueden ser utilizadas, se debe tener cuidado en designar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado, y que minimice el daño potencial a células normales, y de esta forma reduzca los efectos secundarios.
Los ejemplos que se encuentran a continuación pretenden ilustrar, no limitar, la presente invención.
Ejemplos Ejemplo 1. Eficacia de un anticuerpo anti-CD200 en un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune Estudio 0 (Modelo de Prevención). Se probaron anticuerpos anti-CD200 terapéuticos con respecto a su capacidad para prevenir, retrasar o hacer lenta la severidad de, la producción de autoanticuerpos asociados con enfermedad hemolítica autoinmune, utilizando un modelo de ratón de la enfermedad. Ver, por ejemplo la Publicación de Playfair and Marshall-Clarke (1973) Nat New Biol 243:213-21 ; Naysmith y asociados (1981) Immunol Rev 55:55-87.
Para provocar en los ratones la producción de autoanticuerpos que enlazan a glóbulos rojos de ratón (RBCs), se administraron 2 x 108 RBCs de rata en forma intraperitoneal (i.p.) a ratones C57BL/6 hembra una vez el día 0 del estudio y posteriormente una vez a la semana durante el resto del estudio. La producción de los aloanticuerpos RBC anti-rata a través de los ratones inmunizados fue observada a través de la segunda semana del estudio y se observó en la semana tres la producción por parte de los ratones de los autoanticuerpos RBC anti-ratón.
Los ratones inmunizados con RBC de rata fueron divididos en seis grupos experimentales designados: Grupo 1 (6 ratones), Grupo 2 (6 ratones), Grupo 3 (8 ratones), Grupo 4 (7 ratones), Grupo 5 (9 ratones) y Grupo 6 (9 ratones). También se evaluó como un control un grupo adicional - Grupo 7 (6 ratones). Los ratones del Grupo 7 ni fueron inmunizados con RBCs de rata ni recibieron cualesquiera de los tratamientos adicionales que se describen más adelante.
Comenzando el día 0 (esto es el día de la primera administración de los RBCs de rata), los ratones de cada uno de los Grupos 2 a 6 fueron administrados con un agente terapéutico o vehículo bajo el siguiente programa: durante cada semana del estudio, se administraron cinco dosis de agente o vehículo en la forma de una dosis al día durante cinco días consecutivos. Los ratones del Grupo 1 fueron tratados únicamente con vehículo - solución salina amortiguada por fosfato (PBS). Los ratones del Grupo 2 se trataron bajo el programa de tratamiento anterior utilizando 5 mg/kg de un anticuerpo de Control que no enlaza a CD200, pero posee función efectora (lgG2a). Los ratones del Grupo 3 se trataron bajo el programa de tratamiento antes mencionado con Anticuerpo 1 - un anticuerpo anti-CD200 (lgG2a) que tiene función efectora - siendo cada dosis de 5 mg/kg. Los ratones del grupo 4 se trataron con ciclosporina en una dosis de 15 mg/kg. Los ratones del Grupo 5 se trataron con el Anticuerpo de Control en 5 mg/kg y ciclosporina en 15 mg/kg. Los ratones del Grupo 6 ratones se trataron con el Anticuerpo 1 en una dosis de 5 mg/kg y ciclosporina en una dosis de 15 mg/kg. Los tratamientos de anticuerpo fueron administrados con i.p. Se administró Ciclosporina a los ratones en forma subcutánea (s.c). El diseño del grupo y los programas de tratamiento para cada Grupo se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Diseño de Grupo y Programa de Tratamiento para Estudio 0 N se refiere al número de ratones en cada grupo.
N/A = no aplicable Sobre bases semanales, se extrajo sangre de los ratones de los grupos 1 a 7 antes, durante y después de los tratamientos anteriores para evaluar mediante citometría de flujo, si el tratamiento afectó el titulador de los autoanticuerpos RBC anti-ratón y/o los aloanticuerpos RBC anti-rata en los ratones. Para determinar la concentración relativa de los autoanticuerpos anti-ratón producidos en un sujeto ratón (por ejemplo, un ratón tratado del Grupo 3), se incubó la sangre completa obtenida del ratón con una preparación de anticuerpo anti-ratón etiquetado en forma fluorescente, para detectar de esta forma la presencia de anticuerpos RBC anti-ratón presentes en la superficie de RBC de ratón en la sangre de los animales. Las células fueron lavadas con PBS y posteriormente se sometieron a citometría de flujo para evaluar la cantidad relativa de RBCs anti-ratón de ratón enlazados a los RBCs de ratón como una función de la intensidad de fluorescencia promedio. Entre el día 13 y 17, incrementó la concentración de los autoanticuerpos RBC anti-ratón en los ratones de los Grupos 1, 2, 4, 5 y 6. En contraste, se redujo en forma marcada la concentración de los autoanticuerpos RBC anti-ratón en los ratones del Grupo 3, en comparación con la concentración del autoanticuerpo en los otros grupos. Además, la producción del autoanticuerpo por parte de los ratones en el Grupo 3, fue retrasada en forma marcada en comparación con los ratones en los otros grupos (figura 1). Por ejemplo, el 50% de los ratones en los Grupos 1, 2, 4, 5 y 6 desarrollaron autoanticuerpos entre el día 20 y 27 del estudio. En contraste, la producción de autoanticuerpo en al menos 50%> de los ratones del Grupo 3, no ocurrió hasta entre el día 27 y el día 34. Estos resultados indican que el Anticuerpo 1, un anticuerpo anti-CD200, en 5 mg/kg, tuvo la capacidad no únicamente de reducir la concentración de autoanticuerpos RBC anti-ratón en un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune, sino también tuvo la capacidad de retrasar en forma significativa la producción de los autoanticuerpos en los ratones.
Para determinar la concentración relativa de los aloanticuerpos producidos en un sujeto ratón (por ejemplo, un ratón tratado del Grupo 3), se incubó el suero obtenido del ratón con una muestra de RBCs de rata aislados durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que cualesquiera aloanticuerpos específicos de RBC de rata presentes en el suero, enlazarán a RBCs de rata. Las ratas fueron lavadas con PBS y posteriormente incubadas con un anticuerpo etiquetado en forma fluorescente que enlaza a anticuerpos de ratón. Después de un paso de lavado adicional, las células se sometieron a citometría de flujo para evaluar la cantidad relativa de RBCs anti-rata de ratón, enlazados a RBCs de rata como la intensidad de fluorescencia promedio. Los sueros obtenidos de ratones de los Grupos 1, 2, 4, 5 y 6, contenían una concentración en incremento de aloanticuerpos RBC antirata durante el curso del experimento. En contraste, los sueros obtenidos de los ratones del Grupo 3 contenían mucho menos autoanticuerpos RBC anti-rata detectables en comparación con los otros Grupos. Estos resultados indicaron además que el Anticuerpo 1, un anticuerpo anti-CD200, en 5 mg/kg tuvo la capacidad de reducir el titulador de aloanticuerpos específicos de RBC, así como autoanticuerpos anti-RBC, producidos en un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune.
Estudio 1 (Modelo de Tratamiento). Los anticuerpos anti-CD200 terapéuticos fueron probados con respecto a su capacidad para reducir la producción de autoanticuerpos asociados con enfermedad hemolítica autoinmune utilizando un modelo de ratón de la enfermedad. Para provocar en los ratones la producción de autoanticuerpos que enlazan a glóbulos rojos de ratón (RBCs), se administraron 2 x 108 RBCs de rata en forma intraperitoneal (i.p.) a ratones C57BL/6 hembra, una vez el día 0 del estudio, y posteriormente una vez a la semana durante el resto del estudio. La producción de aloanticuerpos RBC anti-rata mediante los ratones inmunizados, fue observada en la segunda semana del estudio, y se observó en la semana tres la producción por parte de los ratones de los auto-anticuerpos RBC anti-ratón.
Los ratones inmunizados con RBC de rata fueron divididos en cinco grupos designados Grupo 1 (8 ratones), Grupo 2 (8 ratones), Grupo 3 (8 ratones), Grupo 4 (7 ratones) y Grupo 5 (8 ratones). También se evaluó como un control un sexto grupo de ratones (designado Grupo 6; 6 ratones). Los ratones del Grupo 6 ni fueron inmunizados con RBCs de rata ni recibieron cualesquiera de los tratamientos adicionales que se describen más adelante.
Comenzando el día 112, los ratones de cada uno de los Grupos 1 a 5 recibieron un tratamiento adicional de 14 dosis de un agente terapéutico o control de vehículo administrado bajo el siguiente programa: (i) cinco dosis de agente o vehículo administrado como una dosis por día durante cinco días consecutivos; (¡i) una interrupción en el tratamiento de dos días; (iii) cinco dosis adicionales de agente o vehículo administrado una dosis al día durante cinco días consecutivos; otra interrupción en el tratamiento de dos días; y (iv) cuatro dosis más de agente o vehículo administrado una dosis por día durante cuatro días consecutivos. Los ratones del Grupo 1 fueron tratados únicamente con vehículo - solución salina amortiguada por fosfato (PBS). Los ratones del Grupo 2 fueron tratados bajo el programa de tratamiento antes mencionado con Anticuerpo 1 - un anticuerpo anti-CD200 (lgG2a) que tiene función efectora - cada dosis siendo de 5 mg/kg. Los ratones del Grupo 3 fueron tratados con el Anticuerpo 1 en una dosis de 1 mg/kg. Los ratones del Grupo 4 fueron tratados bajo el programa de tratamiento anterior con el Anticuerpo 2 - un anticuerpo anti-CD200 que carecía de función efectora - cada dosis en 5 mg/kg. Los ratones del Grupo 5 fueron tratados bajo el programa de tratamiento anterior, utilizando una dosis de 5 mg/kg de un anticuerpo de Control que no enlaza a CD200, pero posee función efectora (lgG2a). El diseño del Grupo y los programas de tratamiento para cada grupo se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Diseño de Grupo v Programa de Tratamiento para Estudio 1.
N se refiere al número de ratones en cada grupo.
N/A = No aplicable Sobre bases semanales, se extrajo sangre de los ratones de los Grupos 1 a 6 antes, durante y después de los tratamientos anteriores para evaluar mediante citometría de flujo, si el tratamiento afectó el titulador de los autoanticuerpos RBC anti-ratón y/o los aloanticuerpos RBC anti-rata en los ratones. Entre el día 133 y 137 del estudio, los ratones fueron sacrificados y sus bazos fueron recolectados. Para determinar la concentración relativa de aloanticuerpos producidos en un sujeto ratón (por ejemplo, un ratón tratado del Grupo 2) se contactó el suero obtenido del ratón (por ejemplo, el día 133) con una muestra de RBCs de rata aislados durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que cualesquiera aloanticuerpos específicos de RBC de rata presentes en el suero, enlazaran a RBCs de rata. Las células fueron lavadas con PBS y posteriormente incubadas con un anticuerpo etiquetado en forma fluorescente que enlaza a anticuerpos de ratón. Después de un paso de lavado adicional, las células sometidas a citometría de flujo para evaluar la cantidad relativa de RBCs anti-rata de ratón enlazada a RBCs de rata como la intensidad de fluorescencia promedio. Los inventores observaron que los sueros post-tratamiento obtenidos de los ratones de los Grupos 1, 3, 4 y 5, contenían una concentración incrementada de aloanticuerpos RBC anti-rata en comparación con el suero correspondiente obtenido de los ratones antes del tratamiento. En contraste, los sueros obtenidos de los ratones del Grupo 2 contenían post-tratamiento, menos aloanticuerpos RBC anti-rata detectables en comparación con los sueros correspondientes obtenido de los ratones antes del tratamiento. Estos resultados indican que el Anticuerpo 1, un anticuerpo anti-CD200, en 5 mg/kg, tuvo la capacidad de reducir la producción de anticuerpos específicos de RBC en un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune.
Los inventores observaron en forma subsecuente que el Anticuerpo 2 tuvo una vida media significativamente más corta en los ratones tratados en comparación con la vida media del Anticuerpo 1. Por lo tanto, los resultados observados con el Anticuerpo 2 en el Estudio 1, y otros estudios aquí descritos, pueden no reflejar completamente la eficacia real del Anticuerpo 2 en el modelo de enfermedad hemolítica auioinmune, ni el efecto inmunomodulador del anticuerpo en los animales.
Estudio 2 (Modelo de Prevención). Se probaron anticuerpos anti-CD200 terapéuticos con respecto a su capacidad para prevenir, retrasar o detener la severidad de la producción de autoanticuerpos asociados con enfermedad hemolítica autoinmune utilizando el modelo de ratón descrito anteriormente de la enfermedad.
Para provocar en los ratones la producción de autoanticuerpos que enlazan a glóbulos rojos de ratón (RBCs), se administraron RBCs de rata en forma intraperitoneal (i.p.) a ratones BALB/c hembra una vez el día 0 del estudio, y posteriormente una vez a la semana durante el resto del estudio. Tal como se describió anteriormente, la producción de los aloanticuerpos RBC anti-rata a través de los ratones inmunizados, fue observada en la segunda semana del estudio, y en la tercera semana se observó la producción por parte de los ratones de autoanticuerpos RBC anti-ratón.
Los ratones inmunizados con RBC de rata, fueron divididos en cinco grupos designados Grupo 1 (8 ratones), Grupo 2 (8 ratones), Grupo 3 (8 ratones), Grupo 4 (8 ratones) y Grupo 5 (8 ratones). También se evaluó como un control un sexto grupo de ratones (designado Grupo 6; 6 ratones). Los ratones del Grupo 6 ni fueron inmunizados con RBCs de rata, ni recibieron cualesquiera de los tratamientos adicionales que se describen más adelante.
Comenzando el día 0 (este es el día de la primera administración de las RBCs de rata), los ratones de cada uno de los Grupos 1 a 5 fueron administrados con un agente terapéutico o vehículo bajo el siguiente programa: durante cada semana del estudio, cinco dosis de agente o vehículo administrado como una dosis al día durante cinco días consecutivos. Los ratones del Grupo 1 fueron tratados únicamente con vehículo - solución salina amortiguada por fosfato (PBS). Los ratones del Grupo 2 fueron tratados bajo el programa de tratamiento antes mencionado con el Anticuerpo 1 - un anticuerpo anti-CD200 (lgG2a) que tiene función efectora -siendo cada dosis de 5 mg/kg. Los ratones del Grupo 3 fueron tratados con Anticuerpo 1 en una dosis de 1 mg/kg. Los ratones del Grupo 4 fueron tratados bajo el programa de tratamiento anterior con el Anticuerpo 2 - un anticuerpo anti-CD200 que carece de función efectora - cada dosis en 5 mg/kg. Los ratones del Grupo 5 fueron tratados bajo el programa de tratamiento anterior utilizando 5 mg/kg de un anticuerpo de Control que no enlaza a CD200, pero posee función efectora (lgG2a). El diseño del Grupo y los programas de tratamiento para cada grupo se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3. Diseño de Grupo y Programa de Tratamiento para Estudio 2.
N se refiere al número de ratones en cada grupo.
N/A = no aplicable Sobre bases semanales, se extrajo sangre de los ratones de los Grupos 1 a 6 antes, durante y después de los tratamientos anteriores para evaluar mediante citometría de flujo, si el tratamiento afectó el titulador de los autoanticuerpos RBC anti-ratón y/o aloanticuerpos RBC anti-rata en los ratones. En el día 64 ó 65 del estudio, los ratones fueron sacrificados y sus bazos fueron recolectados. (Se sacrificaron cuatro ratones en cada grupo el día 64 y otros cuatro ratones en cada grupo fueron sacrificados el día 65). Para determinar la concentración relativa de aloanticuerpos producidos en un sujeto ratón (por ejemplo, un ratón tratado del Grupo 3), se contactó el suero obtenido del ratón con una muestra de RBCs de rata aislados durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que cualesquiera aloanticuerpos específicos de RBC de rata presentes en el suero, enlazaran a RBCs de rata. Las células fueron lavadas con PBS y posteriormente incubadas con un anticuerpo etiquetado en forma fluorescente que enlaza a anticuerpos de ratón. Después de un paso de lavado adicional, las células fueron sometidas a citometría de flujo para evaluar la cantidad relativa de RBCs anti-rata de ratón enlazada a RBCs de rata como la intensidad de fluorescencia promedio. Tal como se muestra en la figura 2, los sueros obtenidos de los ratones de los Grupos 1, 3, 4 y 5 contenían una concentración en incremento de aloanticuerpos RBC anti-rata durante el curso del experimento. En contraste, los sueros obtenidos de los ratones del Grupo 2 pos-tratamiento, contenían muchos menos aloanticuerpos RBC anti-rata detectables en comparación con los otros grupos. Estos resultados indican en forma adicional que el Anticuerpo 1, un anticuerpo anti-CD200, en 5 mg/kg tuvo la capacidad de reducir el titulador de los aloanticuerpos específicos de RBC producidos en un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune.
Estudio 3 (Modelo de Tratamiento). Los anticuerpos anti-CD200 terapéuticos fueron probados con respecto a su capacidad para tratar enfermedad hemolítica autoinmune utilizando un modelo de ratón de la enfermedad. Para provocar en los ratones la producción de autoanticuerpos que enlazan a glóbulos rojos de ratón (RBCs), los RBCs de rata se administraron en forma intraperitoneal (i.p.) a ratones C57BL/6 hembra una vez el día 0 del estudio y posteriormente una vez a la semana durante el resto del estudio. Tal como se describió anteriormente, la producción de aloanticuerpos RBC anti-rata por parte de los ratones inmunizados, fue observada en la segunda semana del estudio, y en la tercera semana se observó la producción por parte de los ratones, de autoanticuerpos RBC anti-ratón. Los ratones inmunizados con RBC de rata, fueron divididos en tres grupos designados Grupo 1 (6 ratones), Grupo 2 (3 ratones) y Grupo 3 (5 ratones).
Comenzando el día 86, los ratones de cada uno de los Grupos 1 a 3, recibieron un tratamiento adicional de 10 dosis de un agente terapéutico o control de vehículo administrado bajo el siguiente programa: (i) cinco dosis de agente o vehículo administrado como una dosis al día durante cinco días consecutivos; (ii) una interrupción en el tratamiento de dos días; y (iii) cinco dosis adicionales del agente o vehículo administrado una dosis por día durante cinco días consecutivos.
Los ratones del Grupo 1 fueron tratados bajo el programa de tratamiento antes mencionado con Anticuerpo 1 - un anticuerpo anti-CD200 (lgG2a) que tiene función efectora - cada dosis siendo de 5 mg/kg. Los ratones del Grupo 2 fueron tratados con Anticuerpo 1 en una dosis de 1 mg/kg. Los ratones del Grupo 3 fueron tratados bajo el programa de tratamiento anterior con el Anticuerpo 2 - un anticuerpo anti-CD200 que carece de función efectora - cada dosis en 5 mg/kg. El diseño del Grupo y los programas de tratamiento de cada grupo se resumen en la Tabla 4.
Tabla 4. Diseño de Grupo y Programa de Tratamiento para el Estudio 3.
N se refiere al número de ratones en cada grupo.
N/A = no aplicable En la conclusión del estudio, los ratones fueron sacrificados y sus bazos fueron recolectados. Para determinar si la administración del Anticuerpo 1 a los ratones afectó la activación de esplenocitos mediante RBC, además de afectar la producción de los anticuerpos antí-RBC en los ratones, se evaluó la activación de esplenocito en la presencia de RBCs utilizando un ensayo de proliferación in vitro. En síntesis, se cultivaron esplenocitos aislados con uno de tres diferentes antígenos ¦=- RBCs de ratón, RBCs de rata o albúmina de suero de bovino (control) - o con medio solo. Después de contactar los esplenocitos con los antígenos, se agregó 3H-timidina al medio de cultivo de esplenocito durante aproximadamente 16 horas. Los medios fueron eliminados y las células fueron recolectadas. La activación relativa de los esplenocitos por parte de los antígenos, posteriormente fue medida como una función de la cantidad de 3H-timidina incorporada en el ADN de los esplenocitos.
Tal como se muestra en la figura 3, los esplenocitos de los ratones del Grupo 2 y 3 exhibieron una respuesta prolif erativa robusta después del contacto con RBCs de rata. En contraste, los esplenocitos de los ratones del Grupo 1 proliferaron ' muy poco en la presencia de RBCs de rata, lo que indica que la administración de un anticuerpo anti-CD200 en 5 mg/kg, tuvo la capacidad de inhibir la activación de esplenocitos mediante RBCs de rata en un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune.
Estudio 4 (Modelo de Tratamiento). Tal como se describió anteriormente, para provocar en los ratones la producción de autoanticuerpos que enlazan a glóbulos rojos de ratón (RBCs), se administraron RBCs de rata en forma intraperitoneal (i.p.) a ratones C57BL/6 hembra una vez el día 0 del estudio, y posteriormente una vez a la semana durante el resto del estudio.
Los ratones inmunizados con RBC de rata fueron divididos en siete (7) grupos, designados Grupo 1, Grupo 2, Grupo 3, Grupo 4, Grupo 5, Grupo 6 y Grupo 7. También se evaluó como un control un octavo grupo de ratones (designado Grupo 8). Los ratones del Grupo 8 ni fueron inmunizados con RBCs de rata, ni recibieron cualesquiera de tratamientos adicionales que se describen más adelante. Estuvieron diez ratones en cada grupo.
Comenzando el día 21, los ratones de cada uno de los Grupos 1 a 7 recibieron un tratamiento adicional de uno o más agentes terapéuticos o control de vehículo administrado bajo el siguiente programa: durante cada semana del estudio, se administraron cinco dosis de uno o más agentes o vehículo como una dosis al día durante cinco días consecutivos. Los ratones del Grupo 1 fueron tratados únicamente con vehículo -solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Los ratones del Grupo 2 fueron tratados bajo el programa de tratamiento anterior utilizando una dosis de 5 mg/kg de un anticuerpo de Control que no enlaza a CD200, pero posee función efectora (lgG2a). Los ratones del Grupo 3 fueron tratados bajo el programa de tratamiento antes mencionado con Anticuerpo 1 - un anticuerpo anti-CD200 (lgG2a) que tiene función efectora, cada una siendo de 5 mg/kg. Los ratones del Grupo 4 fueron tratados bajo el programa anterior con 15 mg/kg de ciclosporina. Los ratones del Grupo 5 fueron tratados bajo el programa de dosificación anterior tanto con el anticuerpo de Control (en 5 mg/kg) como ciclosporina (en 15 mg/kg). Los ratones del Grupo 6 fueron tratados bajo el programa de dosificación anterior tanto con Anticuerpo 1 (en 5 mg/kg) como con ciclosporina (en 15 mg/kg). Los ratones del Grupo 7 fueron tratados bajo el programa de dosificación anterior tanto con Anticuerpo 1 (en 1 mg/kg) como con ciclosporina (en 15 mg/kg). El diseño del Grupo y los programas de tratamiento de cada grupo se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5. Diseño de Grupo y Programa de Tratamiento para Estudio 4 N se refiere al número de ratones en cada grupo.
N/A = no aplicable Sobre bases semanales, se extrajo sangre de los ratones de los Grupos 1 a 8 antes, durante y después de los tratamientos anteriores, para evaluar mediante citometría de flujo, si el tratamiento afectó el titulador de los autoanticuerpos RBC anti-ratón y/o aloanticuerpos RBC anti-rata en los ratones. El día 37 del estudio, los ratones fueron sacrificados y sus bazos fueron recolectados. También se obtuvieron células de médula ósea de los dos huesos del fémur y tibia del ratón. Se sometieron las células de bazo y de médula ósea a citometría de flujo tal como se describe más adelante (Ejemplo 2).
Estuvo presente una concentración reducida de aloanticuerpos RBC anti-rata en el suero post-tratamiento obtenido de ratones de los Grupos 3 y 4, en comparación con el suero pre-tratamiento correspondiente. La reducción posttratamiento en aloanticuerpos RBC anti-rata fue incluso mayor en los ratones de los Grupos 6 y 7, lo que indica que la ciclosporina y el anticuerpo 1, tiene un efecto sinérgico en la reducción de la producción de aloanticuerpo en los ratones ciclosporina y Anticuerpo 1 tienen un efecto sinérgico en la reducción de la producción de aloanticuerpo en los ratones. Estos resultados se indicaron incluso en forma adicional, ya que un anticuerpo anti-CD200 tuvo la capacidad de reducir el titulador de los anticuerpos específ icos-RBC producidos en un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune y debido a que un anticuerpo anti-CD200 es útil para tratar la enfermedad.
Ejemplo 2. La administración de un anticuerpo anti-CD200 a ratones, afecta la concentración de las poblaciones de esplenocito y célula de médula ósea en los ratones.
Los esplenocitos obtenidos de ratones del Estudio 1, fueron evaluados para determinar el porcentaje de células que expresan CD200. Las células fueron recolectadas de los bazos de los ratones y se incubaron con una composición de anticuerpos anti-CD200 etiquetados con biotina (policlonal) durante una cantidad del tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir el enlace de los anticuerpos a CD200, si está presente en las células. La preparación de anticuerpo policlonal fue utilizado para prevenir o detener cualquier efecto de enmascaramiento debido a la presencia del anticuerpo anti-CD200 terapéutico residual (por ejemplo, Anticuerpo 1 o Anticuerpo 2) en las células. Las células se lavaron e incubaron con una proporción de estreptavidina etiquetada en forma fluorescente. Después de un paso de lavado adicional, las células se sometieron a citometría de flujo. Tal como se muestra en la figura 4, hubo una marcada reducción en la concentración de esplenocitos CD200+ en los ratones tratados con dosis de 14, 5 mg/kg del Anticuerpo 1, en comparación con la concentración de esplenocitos CD200+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, o el Anticuerpo 2.
Los esplenocitos recolectados de los bazos de los ratones del Estudio 2, también fueron sometidos a manchado y análisis de citometría de flujo tal como se describe anteriormente. Hubo una marcada reducción en la concentración de esplenocitos CD200+ en ratones tratados en forma crónica con 5 mg/kg del Anticuerpo 1, en comparación con la concentración de esplenocitos CD200+ en ratones tratados con vehículo o el anticuerpo de Control. Tampoco hubo cambio en la concentración de esplenocitos CD200+ en los ratones del Grupo 3 tratados con 1 mg/kg de Anticuerpo 1 y los ratones de Grupo 4 tratados con 5 mg/kg de Anticuerpo 2.
Los esplenocitos recolectados de los bazos de los ratones del Estudio 4, tampoco fueron sometidos a manchado y a análisis de citometría de flujo tal como se describe anteriormente. Hubo una marcada reducción en la concentración de esplenocitos CD200+ en ratones tratados con 5 mg/kg de Anticuerpo 1, con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de esplenocitos CD200+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo cambio en la concentración de esplenocitos CD200+ en los ratones del Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis de 1 mg/kg del Anticuerpo 1. También se llevó a cabo un análisis de la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) de los esplenocitos CD200+ de cada ratón (lo cual es una medida del nivel de expresión relativo de CD200 a través de cada esplenocito CD200+). El MFI de los esplenocitos CD200+ de los Grupos 4 y 7, fue marcadamente reducido en comparación con el MFI de los esplenocitos CD200+ en los Grupos restantes (salvo el Grupo 8). Esto indicó que no únicamente la administración del Anticuerpo 1 a los ratones reduce el número total de esplenocitos CD200 + , si no las células restantes que expresan CD200+ en ratones tratados con Anticuerpo 1, expresan CD200 en niveles mucho menores.
Tomados juntos, estos resultados confirman que la administración de un anticuerpo anti-CD200 a un animal reduce la concentración de esplenocitos CD200+ en el animal. Los resultados también indican que la reducción transmitida por el anticuerpo anti-CD200 en esplenocitos CD200 + , no se ve afectada en forma positiva o negativa por ciclosporina.
Los inventores también revisaron en forma adicional el efecto de los anticuerpos anti-CD200 en: (i) la concentración de los subconjuntos de linfocitos CD200+ particulares de esplenocitos de los ratones del Estudio 4 y (ii) la concentración de los subconjuntos CD200+ particulares de células derivadas de médula ósea de los ratones del Estudio 4.
Concentración de Subconjuntos de Linfocito Esplénicos en Ratones del Estudio 4 Subconjunto de linfocito CD3+/CD200+ . Se incubó una muestra de esplenocitos de cada uno de los ratones del Estudio 4, con la preparación del anticuerpo anti-CD200 policlonal y un anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a CD3 para identificar de esta forma la proporción de células CD3+/CD200+ en los bazos de ratones de los grupos 1 a 8. La población CD3 de las células incluye células T tal como células T CD4+ y CD8 + . Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo. Hubo una marcada reducción en la concentración de esplenocitos CD37CD200+ en ratones tratados en forma crónica con 5 mg/kg del Anticuerpo 1 con o sin cíclosporina, en comparación con la concentración de esplenocitos CD3+/CD200 + en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. También hubo un cambio significativo en la concentración de esplenocitos CD3+/CD200 + en los ratones del Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis de 1 mg/kg de Anticuerpo 1.
Subconjunto de Linfocito CD5+/CD200+ . Se incubó una muestra de esplenocitos de cada uno de los ratones del Estudio 4 con una preparación de anticuerpo anti-CD200 policlonal y un anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a CD5, para identificar de esta forma la proporción de células CD5+/CD200+ en los bazos de ratones de los Grupos 1 a 8. La población de células CD5 incluye células T así como a células B (la población de célula B1). Las células etiquetadas se sometieron a citometría de flujo. Hubo una marcada reducción en la concentración de esplenocitos CD5 + /CD200+ en ratones tratados en forma crónica con 5 mg/kg de Anticuerpo 1, con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de esplenocitos CD5+/CD200+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo un cambio significativo en la concentración de esplenocitos CD5+/CD200 + en los ratones de Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis 1 mg/kg del Anticuerpo 1.
Subconjunto de Linfocito CD 19+/CD200+ . Se incubó una muestra de esplenocitos de cada uno de los ratones del Estudio 4 con la preparación del anticuerpo anti-CD200 policlonal, y el anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a CD19 para identificar de esta forma la proporción de células CD19 + /CD200+ en los bazos de ratones de los Grupos 1 a 8. La población CD19+ de células incluye células B. Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo. Igual que las células CD5 + /CD200+ y las células CD3 + /CD200+, también hubo una marcada reducción en la concentración de esplenocitos CD19+/CD200+ en ratones tratados crónicamente con 5 mg/kg del Anticuerpo 1, con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de esplenocitos CD19 + /CD200+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo cambio significativo en la concentración de esplenocitos CD19+/CD200+ en los ratones del Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis 1 mg/kg de Anticuerpo 1.
Subconjunto de linfocito CD138*/CD200+ . Una muestra de esplenocitos de cada uno de los ratones del Estudio 4 fue incubada con la preparación del anticuerpo anti-CD200 policlonal y un anticuerpo etiquetado en forma detectabie que enlaza a CD138 para identificar de esta forma la proporción de células CD1387CD200+ en los bazos de ratones en los Grupos 1 a 8. La población CD138+ de células incluye células de plasma. Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo. Hubo una marcada reducción en la concentración de esplenocitos CD138+/CD200+ en ratones tratados crónicamente con 5 mg/kg de Anticuerpo 1 con o sin ciclósporina, en comparación con la concentración de esplenocitos CD138+/CD200+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclósporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclósporina. Tampoco hubo un cambio significativo en la concentración de esplenocitos CD 138+/CD200 + en los ratones del Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclósporina y una dosis de 1 mg/kg de Anticuerpo 1.
Subconjunto del Linfocito F4/80+. F4/80 es una proteína de transmembrana de 125 kDa de proteína presente en la superficie celular de los macrófagos de ratón maduro. Para determinar si la administración de un anticuerpo anti-CD200 afecta la concentración de macrófagos residentes en el bazo, se incubó una muestra de esplenocitos de cada ratón del Estudio 4 con un anticuerpo etiquetado en forma detectabie que enlaza a F4/80. Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo para identificar de esta forma la proporción de células F4/80+ en los bazos de ratones de los Grupos 1 a 8. La concentración de esplenocitos F4/80+ incrementó en ratones tratados con 5 mg/kg del Anticuerpo 1 (10 dosis) con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de esplenocitos F4/804 en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo cambio significativo en la concentración de esplenocitos F4/80+ en los ratones del Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis 1 mg/kg del Anticuerpo 1.
Tomados juntos, estos resultados indican que la administración de un anticuerpo anti-CD200 reduce una variedad de subconjuntos de esplenocito CD200 + , pero incrementa ciertos subconjuntos de macrófago, en los animales tratados.
Concentración de Subconjuntos de Médula Ósea en Ratones del Estudio 4 Subconjunto de Célula de Médula Ósea CD34+/CD200 + . Se incubó una muestra de las células de médula ósea de cada uno de los ratones con la preparación del anticuerpo anti-CD200 policlonal y un anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a CD34 para identificar de esta forma la proporción de células CD347CD200+ en la médula ósea de ratones de los Grupos 1 a 8. Las células CD34+ incluyen una población de células madre hematopoyéticas (HSCs). Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo, seleccionando también las células que tienen un bajo linaje (Lin"' ). Hubo una marcada reducción en la concentración de células de médula ósea CD347CD200+ en ratones tratados con 5 mg/kg de Anticuerpo 1 (10 dosis) con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de células de médula ósea CD347CD200+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo un cambio significativo en la concentración de células de médula ósea CD34+/CD200+ en los ratones de Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis de 1 mg/kg del Anticuerpo 1.
Subconjuntos de Célula de Médula Ósea Sca-1+/CD200* . Una muestra de células de médula ósea de cada uno de los ratones fue incubada con la preparación del anticuerpo anti-CD200 policlonal y un anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a Sca-1 para identificar de esta forma la proporción de células Sca-1 +/CD200+ en la médula ósea denratones de los Grupos 1 a 8. Las células Sca-1+ incluyen una población de HSCs y células madre mesenquimales (MSCs). Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo, seleccionando también las células que son de linaje bajo (Lin" /Low). Hubo una marcada reducción en la concentración de células de médula ósea Sca-1 +/CD200+ en ratones tratados con 5 mg/kg de Anticuerpo 1 (10 dosis) con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de células de médula ósea Sca-1 +/CD200 + en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo un cambio significativo en la concentración de células de médula ósea Sea- 17CD200 + en los ratones de Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis 1 mg/kg del Anticuerpo 1.
Subconjuntos de Célula de Médula ósea Sca-1* /CD34 + . Una muestra de células de médula ósea de cada uno de los ratones fue incubada con un primer anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a CD34, y un segundo anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a Sca-1, para identificar de esta forma la proporción de células Sca-1+/CD34 + en la médula ósea de ratones de los Grupos 1 a 8. Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo, seleccionando también las células que son de linaje bajo (Lin" Low). Las células Sca-1 +/CD34/Lin- incluyen una población de MSCs. Hubo una marcada reducción en la concentración de células de médula ósea Sca-1+/CD34+ en ratones tratados con 5 mg/kg de Anticuerpo 1 (10 dosis) con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de células de médula ósea Sca-1+/CD34+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo un cambio significativo en la concentración de células de médula ósea Sca-1+/CD34+ en los ratones de Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis 1 mg/kg del Anticuerpo 1.
Subconjuntos de Médula Ósea c-kit+/CD200+ . Una muestra de células de médula ósea de cada uno de los ratones fue incubada con la preparación del anticuerpo anti-CD200 policlonal y un anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a c-kit, para identificar de esta forma la proporción de células c-kit+/CD200+ en la médula ósea de los ratones de los Grupos 1 a 8. Las células c-kit+ incluyen una población de HSCs y MSCs. Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo, seleccionando también las células que son de bajo linaje (Lin' Low) . Hubo una marcada reducción en la concentración de células de médula ósea c-kit+/CD200+ en ratones tratados crónicamente con 5 mg/kg de Anticuerpo 1 con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de células de médula ósea c-kit+/CD200+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo un cambio significativo en la concentración de células de médula ósea c-kit+/CD200+ en los ratones del Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis 1 mg/kg de Anticuerpo 1.
Subconjunto de Célula de Médula Ósea CD200+/CD200R Una muestra de células de médula ósea de cada uno de los ratones, fue incubada con la preparación del anticuerpo anti-CD200 policlonal y el anticuerpo etiquetado en forma detectable que enlaza a CD200R para identificar de esta forma la proporción de células CD2007CD200FT en la médula ósea de ratones de los Grupos 1 a 8. Las células etiquetadas fueron sometidas a citometría de flujo. Hubo una marcada reducción en la concentración de células de médula ósea CD200+/CD200R + en ratones tratados crónicamente con 5 mg/kg del Anticuerpo 1, con o sin ciclosporina, en comparación con la concentración de células de médula ósea CD200+/CD200R+ en ratones tratados con vehículo, el anticuerpo de Control, ciclosporina sola, o una combinación del anticuerpo de Control y ciclosporina. Tampoco hubo un cambio significativo en la concentración de células de médula ósea CD2007CD200R+ en los ratones del Grupo 7 tratados con un programa de combinación de ciclosporina y una dosis de 1 mg/kg del Anticuerpo 1.
Ejemplo 3. Recuperación de célula de médula ósea y subconjuntos de esplenocito CD200* después de extracción de la terapia anti-CD200 Estudio 5 (Modelo de Tratamiento). Los anticuerpos anti- CD200 terapéuticos fueron nuevamente probados con respecto a su capacidad de modular la concentración de poblaciones del subconjunto específico de esplenocitos y células de médula ósea. Los anticuerpos fueron administrados a los ratones dentro del contexto de un modelo de ratón de enfermedad hemolítica autoinmune. Tal como se describe anteriormente, para provocar en los ratones la producción de autoanticuerpos que enlazan a glóbulos rojos de ratón (RBCs), se administraron 2 x 108 de RBCs de rata en forma intraperitoneal (i.p.) a ratones BALB/c hembra una vez el día 0 del estudio, y posteriormente una vez a la semana durante el resto del estudio. La producción de los aloanticuerpos RBC anti-rata por parte de los ratones inmunizados, fue observada en la segunda semana del estudio, y en la tercera semana se observó la producción por parte de los ratones de los anticuerpos RBC anti-ratón.
Los ratones inmunizados-RBC de rata fueron divididos en cinco grupos designados Grupo 2 (20 ratones), Grupo 3 (20 ratones), Grupo 4 (20 ratones), Grupo 5 (15 ratones), y Grupo 6 (15 ratones). También se evaluó como un control un sexto grupo de ratones (designado Grupo 1; 20 ratones). Los ratones del Grupo 1 ni fueron inmunizados con RBCs de rata, ni recibieron cualesquiera tratamientos adicionales que se describen más adelante.
Comenzando el día 21, los ratones de cada uno de los Grupos 2 a 6 recibieron un tratamiento adicional de 10 dosis del agente terapéutico o control de vehículo administrado bajo el siguiente programa: (i) cinco dosis de agente o vehículo administrado una dosis al día durante cinco días consecutivos; (ii) una interrupción en el tratamiento de dos días; y (iii) cinco dosis adicionales del agente o vehículo administrada una dosis al día durante cinco días consecutivos. Los ratones del grupo 6 fueron tratados únicamente con vehículo-solución salina amortiguada por fosfato (PBS). Los ratones del Grupo 2 fueron tratados bajo el programa de tratamiento antes mencionado con el Anticuerpo 1 - un anticuerpo anti-CD200 (lgG2a) que tiene función efectora - siendo cada dosis de 5 mg/kg. Los ratones de Grupo 3 fueron tratados bajo el programa de tratamiento anterior con el Anticuerpo 2 - un anticuerpo anti-CD200 que careció de función efectora - cada dosis en 5 mg/kg. Los ratones del Grupo 4 fueron tratados bajo el programa de tratamiento anterior utilizando una dosis de 5 mg/kg de un anticuerpo de Control, que no enlaza a CD200, pero posee función efectora (lgG2a). Los ratones del Grupo 5 fueron tratados de acuerdo con el programa de tratamiento anterior, utilizando una dosis de 5 mg/kg de un anticuerpo de Control que no enlaza a CD200 y no posee función efectora. El diseño del Grupo y los programas de tratamiento de cada grupo se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6. Diseño de Grupo y Programa de Tratamiento del Estudio 5.
N se refiere al número de ratones en cada grupo N/A no aplicable Sobre bases semanales, se extrajo sangre de los ratones de los Grupos 1 a 6, antes, durante y después de los tratamientos anteriores para evaluar mediante citometría de flujo, si el tratamiento afecto el titulador de los autoanticuerpos RBC anti-ratón y/o los aloanticuerpos RBC anti-rata en los ratones. El día 35 del estudio, se sacrificaron tres ratones de cada grupo y se recolectaron sus bazos. También se aisló la médula ósea de los femores y tibias de cada ratón. Tal como se describió anteriormente, las células fueron etiquetadas con anticuerpos etiquetados en forma detectable (por ejemplo, la preparación del anticuerpo anti-CD200 policlonal y un anticuerpo etiquetado en forma fluorescente adicional) y se sometieron a citometría de flujo. En la Tabla 7 se muestra un resumen de los resultados.
Tabla 7. Efecto de anticuerpo Anti-CD200 en Esplenocitos v Subconiuntos de Célula de Médula Ósea el Día 35 "*" indica que la reducción en la concentración de un subconjunto de célula particular en un ratón tratados con Anticuerpo 2, no es tan profunda como la reducción observada en el mismo subconjunto de células en ratones tratados con Anticuerpo 1. "**" indica que la reducción o incremento en la concentración de un subconjunto de célula particular es relativa a la concentración del subconjunto particular en ratones tratados con vehículo (Grupo 6) y el control de isotipo correspondiente. Por lo tanto, la reducción de esplenocitos CD200* observada en ratones del Grupo 2 en ratones es relativa a la concentración de esplenocitos CD200* en los ratones del Grupo 6 y en ratones del Grupo 4. "-" indica que no se observó diferencia en los niveles entre un Anticuerpo 2 y su anticuerpo de Control correspondiente.
Del día 35 al día 91, los ratones restantes de cada grupo recibieron inmunizaciones RBC adicionales pero no tratamiento con los anticuerpos, siendo el propósito determinar si las poblaciones de esplenocitos y células de médula ósea pueden recuperarse con el tiempo. Se sacrificaron tres ratones en cada Grupo el día 91 y sus bazos y médula ósea se recolectó tal como se describió anteriormente. Se llevó a cabo análisis de citometría de flujo en las células aisladas, para determinar si los subconjuntos de esplenocitos y célula de médula ósea de la población particular, que se redujeron el día 35, se recuperaron el día 91. Cada una de. las poblaciones celulares se recuperó completamente el día 91, indicando que los efectos moduladores del anticuerpo anti-CD200 en la concentración de subconjuntos de célula de médula ósea y esplenocito es reversible al momento de la extracción del anticuerpo.
Aunque la presente descripción ha sido descrita con referencia en las modalidades específicas de la misma, deberá quedar entendido para los expertos en la técnica, que se pueden realizar diversos cambios y que los equivalentes pueden ser sustituidos sin apartarse del espíritu y alcance real de la presente descripción. Además, se pueden realizar muchas modificaciones para adaptar una situación, material, composición de materia, proceso, paso o pasos de proceso particulares al objetivo, espíritu y alcance de la presente descripción. Todas de dichas modificaciones están proyectadas para estar dentro del alcance de la presente descripción.

Claims (77)

REIVINDICACIONES
1. Un método para tratar un trastorno autoinmune en un humano, en donde el método comprende administrar a un humano que tiene un trastorno autoinmune, una cantidad de un anticuerpo anti-CD200 que es suficiente para reducir en el humano la concentración de un autoanticuerpo asociado con el trastorno autoinmune, para tratar de esta forma el trastorno autoinmune.
2. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la administración del anticuerpo anti- CD200 reduce la concentración de autoanticuerpo en al menos el 10%.
3. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la administración del anticuerpo anti-CD200 reduce la concentración de autoanticuerpo en al menos el 20%.
4. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque la administración del anticuerpo anti-CD200 reduce la concentración de autoanticuerpo en al menos el 50%.
5. Un método para tratar un trastorno autoinmune en un humano, en donde el método comprende administrar crónicamente a un humano que tiene un trastorno autoinmune, un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para mantener en el humano una concentración reducida de un autoanticuerpo asociado con el trastorno autoinmune para tratar de esta forma el trastorno autoinmune.
6. El método tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 se administra al humano en una cantidad y con una frecuencia para mantener una reducción mayor al 50% en la concentración del anticuerpo autoinmune en comparación con la concentración del anticuerpo antes de la administración del anticuerpo anti-CD200.
7. Un método para tratar un trastorno autoinmune en un humano, en donde el método comprende administrar a un humano que necesita del mismo, un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad y con una frecuencia suficiente para tratar el trastorno autoinmune, manteniendo una o más de las siguientes condiciones fisiológicas en el humano: (i) una concentración disminuida de al menos un subconjunto de leucocito CD200+ en comparación con una concentración de control; (ii) una concentración incrementada de células F4/80+ en comparación con una concentración de control; y (iii) una concentración disminuida de al menos un subconjunto de célula madre de médula ósea en comparación con una concentración de control.
8. El método tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el al menos un subconjunto de leucocito CD200+, se selecciona del grupo que consiste en células CD3+/CD200 + , células CD45R+/CD200 + , células CD5+/CD200 + , células CD19+/CD200+, células CD 1387CD200 + , y células CD200R + /CD200+.
9. El método tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque al menos un subconjunto de célula madre de médula ósea se selecciona del grupo que consiste en células de médula ósea CD200+, células de médula ósea lgk/CD200 + , células de médula ósea CD138+/CD200 + , células de médula ósea c-kit+/CD200 + , y células de médula ósea c-kit+/CD200/Lin".
10. El método tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque las células F4/80+ son macrófagos F4/80 + .
11. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 10, caracterizado porque al menos un subconjunto de leucocito CD200+ o células F4/80 + están presentes en la sangre periférica del humano.
12. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo se administra al humano en una cantidad y con una frecuencia para mantener las tres condiciones fisiológicas en el humano.
13. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizado porque el trastorno autoinmune es un trastorno hemolítico.
14. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el trastorno autoinmune es una anemia hemolítica autoinmune.
15. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizado porque el trastorno autoinmune se selecciona del grupo que consiste en enfermedad pulmonar obstructiva crónica, diabetes melitus tipo 1, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barré, nefropatía IgA, escleroderma, síndrome de Sjógren, granulomatosis de Wegener, pénfigo vulgaris, artritis reumatoide, enfermedad de aglutinina fría, síndrome anti-fosfolípido, anemia hemolítica autoinmune caliente, hemoglobinuria fría paroxismal, enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave, cirrosis biliar pulmonar, y síndrome de iller Fisher.
16. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizado porque el trastorno autoinmune está asociado con un cáncer en el humano.
17. El método tal como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque el cáncer es un tumor líquido.
18. El método tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el tumor líquido es leucemia linfocítica crónica o mieloma múltiple.
19. El método tal como se describe en la reivindicación 18, caracterizado porque la leucemia linfocítica crónica es leucemia linfocítica crónica de célula B.
20. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 19, caracterizado porque comprende además administrar al humano al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno autoinmune.
21. Un método para tratar a un humano que padece de un cáncer, en donde el método comprende administrar a un humano que padece de un cáncer, un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es suficiente para tratar el cáncer, en donde el cáncer es resistente, o se sospecha que será resistente a terapia con un agente terapéutico anti-CD20.
22. Un método para tratar a un humano que padece de un cáncer, en donde el método comprende: identificar a un humano como teniendo un cáncer que es resistente, se sospecha es resistente a tratamiento con un agente terapéutico anti-CD20; y administrar al humano un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es efectiva para tratar el cáncer.
23. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque el cáncer comprende células de cáncer que expresan CD5.
24. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 21 a la 23, caracterizado porque se administra al humano más de una dosis del anticuerpo anti- CD200.
25. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 21 a la 24, caracterizado porque se administran al humano más de diez dosis del anticuerpo anti-CD200.
26. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 21 a la 25, caracterizado porque el cáncer es un tumor líquido.
27. El método tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque el tumor líquido es una leucemia linfocítica crónica o mieloma múltiple.
28. El método tal como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque la leucemia linfocítica crónica es una leucemia linfocítica crónica de célula B.
29. Un método para tratar a un humano que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende administrar a un humano que padece de un tumor líquido, un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es suficiente para tratar un tumor líquido, en donde al menos una parte de las células del tumor líquido, expresan CD5.
30. El método tal como se describe en la reivindicación 29, caracterizado porque comprende además determinar si la parte de las células de tumor líquido, expresan CD5.
31. Un método para tratar a un humano que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende: identificar a un humano como teniendo un tumor líquido que comprende células que expresan CD5; y administrar al humano un anticuerpo anti-CD200 en una cantidad que es suficiente para reducir la concentración de las células de tumor líquido que expresan CD5 en el humano, para tratar de esta forma el tumor líquido.
32. Un método para tratar a un humano que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende administrar a un humano que padece de un tumor líquido un anticuerpo anti-CD200 y un agente terapéutico anti-CD20 para tratar de esta forma el tumor líquido, en donde al menos una parte de células de tumor líquido expresan CD5 antes de la administración del anticuerpo y el agente.
33. Un método para tratar a un humano que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende: identificar a un humano como padeciendo de un tumor líquido que comprende células de tumor que expresan CD5; y administrar al humano un anticuerpo anti-CD200 y un agente terapéutico anti-CD20 para tratar de esta forma el tumor líquido.
34. El método tal como se describe en la reivindicación 32 ó 33, caracterizado porque el agente terapéutico anti-CD20 se administra antes de la administración del anticuerpo anti-CD200.
35. El método tal como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque del anticuerpo anti-CD200 se administra antes de la administración del agente terapéutico anti-CD20.
36. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 32 ó 33, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 y el agente terapéutico anti-CD20 se administran a través de la misma ruta.
37. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 32 a la 36, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 y el agente terapéutico anti-CD20 se administran en forma concurrente como un anticuerpo biespecífico que enlaza un CD200 humano y un CD20 humano.
38. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 29 a la 37, caracterizado porque al menos el 1% de las células del tumor líquido, expresan CD5.
39. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 29 a la 38, caracterizado porque al menos el 5% de las células del tumor líquido, expresan CD5.
40. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 29 a la 39, caracterizado porque al menos el 10% de tumor líquido que expresan CD5.
41. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 29 a la 40, caracterizado porque el tumor líquido es una leucemia linfocítica crónica o un mieloma múltiple.
42. El método tal como se describe en la reivindicación 41, caracterizado porque la leucemia linfocítica crónica es una leucemia linfocítica crónica de célula B.
43. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 21 a la 28 o de la 32 a la 37, caracterizado porque el agente terapéutico anti-CD20 es un anticuerpo anti-CD20.
44. El método tal como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque el anti-CD20 anticuerpo es rituximab.
45. El método tal como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 es ofatumumab, TRU-015, veltuzumab, ocrelizumab, o AME-133v.
46. El método tal como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 es un conjugado de toxina-anticuerpo.
47. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque la toxina es un fármaco de molécula pequeña o un polipéptido tóxico.
48. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque la toxina es un agente radioactivo.
49. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el agente radioactivo es 90Y, 186Re, 188Re, 64Cu, 67Cu, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 1 3l, 25l, 131l, 111ln, 211At, 32P, 77Lu, 7Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, o 99Au.
50. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 46, 48, ó 49, caracterizado porque el conjugado de toxina-anticuerpo es 90Y-ibritumomab tiuxetan o 31 l-tositumomab.
51. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 50, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 inhibe la interacción entre CD200 y CD200R.
52. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjuntos de CDRs emparejadas: una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende la secuencia de aminoácido: GFTFSGFAMS (SEC ID NO:4); una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende la secuencia de aminoácido: SISSGGTTYYLDSVKG (SEC ID NO:5); una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende la secuencia de aminoácido: GNYYSGTSYDY (SEC ID NO:6); una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende la secuencia de aminoácido: RASESVDSYGNSFMH (SEC ID NO:7); una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende la secuencia de aminoácido: RASNLES (SEC ID NO: 8); y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende la secuencia de aminoácido: QQSNEDPRT (SEC ID NO:9).
53. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 la 51, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GFNIKDYYMH (SEC ID NO: 10); una HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácido: WIDPENGDTKYAPKFQG (SEC ID NO: 11); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: KN YYVSNYNFFDV (SEC ID NO: 12); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: SASSSVRYMY (SEC ID NO: 13); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: DTSKLAS (SEC ID NO: 14); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: FQGSGYPLT (SEC ID NO: 15).
54. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GFNIKDYYIH (SEC ID NO: 16); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: Wl DPEI G ATKYVPKFQG (SEC ID NO: 17); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: LYGNYDRYYA DY (SEC ID NO: 18); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: KASQNVRTAVA (SEC ID NO: 19); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: LASNRHT (SEC ID NO:20); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: LQHWNYPLT (SEC ID NO:21).
55. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51, caracterizado porque del anticuerpo ahti-CD200 contiene el siguiente conjunto de de CDRs emparejados: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GYSFTDYI I L (SEC ID NO:22); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: HIDPYYGS SNYNLKFKG (SEC ID NO:23); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: SKRDYFDY (SEC ID NO:24); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: KASQDI NSYLS (SEC ID NO:25); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: RANRLVD (SEC ID NO:26); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: LQYDEFPYT (SEC ID NO:27).
56. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51, caracterizado porque del anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: GYTFTEYTMH (SEC ID NO:28); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: GVN P NGGALYNQKFKG (SEC ID NO:29); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: RSNYRYDDAMDY (SEC ID NO:30); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: KSSQSLLDIDEKTYLN (SEC ID NO:31); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: LVSKLDS (SEC ID NO:32); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: WQGTHFPQT (SEC ID NO:33).
57. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 51, caracterizado porque del anticuerpo anti-CD200 contiene el siguiente conjunto de de CDRs emparejadas: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: AFN I KDHYMH (SEC ID NO:34); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: WIDPESGDTEYAPKFQG (SEC ID NO:35); una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: FNGYQALDQ (SEC ID NO:36); una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácido: TASSSVSSSYLH (SEC ID NO:37); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácido: STSNLAS (SEC ID NO:38); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácido: RQYHRSPPIFT (SEC ID NO:39).
58. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 57, caracterizado porque del anticuerpo anti-CD200 es un anticuerpo I g G 1 , lgG2, lgG2a, lgG3, lgG4, IgM, lgA1 , lgA2, IgA, IgD, o IgE.
59. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 58, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 es un anticuerpo múrido, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena simple, o anticuerpo humano.
60. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 58, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD200 es un fragmento de anticuerpo de enlace CD200, seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento scFv, un minicuerpo, un diacuerpo, o un triacuerpo.
61. Un método para seleccionar una terapia para un paciente que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende: identificar a un paciente como teniendo un tumor líquido que comprende células de tumor que expresan CD5; y seleccionar para el paciente un anticuerpo anti-CD200 para utilizarse en el tratamiento de un tumor líquido.
62. Un método para prescribir una terapia para un paciente que padece de un tumor líquido, en donde el método comprende: identificar a un paciente como teniendo un tumor líquido, que comprende células de tumor que expresan CD5; y prescribir para el paciente un anticuerpo anti-CD200 para utilizarse en el tratamiento del tumor líquido.
63. El método tal como se describe en la reivindicación 61 ó 62, caracterizado porque del anticuerpo anti-CD200 es un anticuerpo biespecíf ico.
64. El método tal como se describe en la reivindicación 61 ó 62, caracterizado porque el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de combinación de antígeno y un segundo sitio de combinación de antígeno, en donde el primer sitio de combinación de antígeno enlaza a CD200 y un segundo sitio de combinación de antígeno enlaza a CD20.
65. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de combinación de antígeno que enlaza a una proteína CD200, y un segundo sitio de combinación de antígeno que enlaza a una proteína CD20.
66. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en la reivindicación 65, caracterizado porque el anticuerpo es un diacuerpo de cadena simple, un fragmento Fv de cadena simple tándem, un diacuerpo de cadena simple tándem o una proteína de fusión que comprende un diacuerpo de cadena simple y al menos una parte de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina.
67. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en la reivindicación 65, caracterizado porque el anticuerpo es una inmunoglobulina de dominio variable dual.
68. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 67, caracterizado porque el primer sitio de combinación de antígeno enlaza a una proteína CD200 humana.
69. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en la reivindicación 68, caracterizado porque la proteína CD200 humana comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEC ID NOs: 1 a 3.
70. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 69, caracterizado porque el segundo sitio de combinación de antígeno, enlaza a una proteína CD20 humana.
71. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en la reivindicación 70, caracterizado porque la proteína CD20 humana comprende la secuencia de aminoácido ilustrada en cualesquiera de las SEC ID NOs: 40 a 42.
72. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 70 ó 71, caracterizado porque el segundo sitio de combinación de antígeno, enlaza a una proteína CD20 humana en un epítope que comprende al menos parte de la secuencia de aminoácido ilustrada en la SEC ID NO: 41, y al menos parte de la secuencia de aminoácido ¡lustrada en la SEC ID NO: 42.
73. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 65 a 72, caracterizado porque el primer sitio de combinación de antígeno se obtiene de samalizumab.
74. El anticuerpo biespecífico tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 65 a la 72, caracterizado porque el segundo sitio de combinación de un antígeno se obtiene de rituximab, ofatumumab, TRU-015, veltuzumab, ocrelizumab, o AME-133v.
75. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo biespecífico tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 65 a 74.
76. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 75.
77. Una célula que comprende el vector tal como se describe en la reivindicación 76.
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