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MX2012009260A - Complejos que emiten alfa-particulas objetivo que comprenden radionuclido de torio e hidroxipiridinona que contiene ligando. - Google Patents

Complejos que emiten alfa-particulas objetivo que comprenden radionuclido de torio e hidroxipiridinona que contiene ligando.

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MX2012009260A
MX2012009260A MX2012009260A MX2012009260A MX2012009260A MX 2012009260 A MX2012009260 A MX 2012009260A MX 2012009260 A MX2012009260 A MX 2012009260A MX 2012009260 A MX2012009260 A MX 2012009260A MX 2012009260 A MX2012009260 A MX 2012009260A
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complex
tissue
thorium
alpha
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MX2012009260A
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Inventor
Thomas Ramdahl
Original Assignee
Algeta Asa
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Publication date
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Abstract

La presente invención proporciona un complejo dirigido a un objetivo de tejido que comprende una porción dirigida a un objetivo de tejido, o un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona, y el ión de un radionúclido alfa-emisor de tono. La invención proporciona adicionalmente métodos terapéuticos que emplean estos complejos, métodos de sub-producción y uso, y kits y composiciones farmacéuticas que comprenden estos complejos.

Description

COMPLEJOS QUE EMITEN ALFA-PARTICULAS OBJETIVO QUE COMPRENDEN RADIONUCLIDO DE TORIO E HIDROXIPIRIDINONA QUE CONTIENE LIGANDO Campo de la Invención La presente invención se refiere a complejos de isótopos de torio, y en particular, a complejos de torio-227 con ciertos ligandos octadentados . La invención también se refiere al tratamiento de enfermedades, particularmente enfermedades neoplásticas, que comprende la administración de estos complejos.
Antecedentes de la Invención La aniquilación celular específica puede ser esencial para el tratamiento exitoso de una variedad de enfermedades en sujetos mamíferos. Los ejemplos típicos de estos están en el tratamiento de enfermedades malignas tal como sarcomas y carcinomas. Sin embargo, la eliminación selectiva de ciertos tipos de células también puede jugar un papel clave en el tratamiento de otras enfermedades, especialmente enfermedades hiperplásticas y neoplásticas .
Los métodos más comunes de tratamiento selectivo actualmente son cirugía, quimioterapia e irradiación con haz externo. La terapia con radionúclidos dirigidos al objetivo, es sin embargo, un área promisoria y en desarrollo con el potencial de administrar radiación altamente citotóxica a Ref . : 234048 tipos indeseados de células. Las formas más comunes de los radiofarmacéuticos actualmente autorizados para el uso en humanos emplean radionúclidos beta-emisores y/o gamma-emisores. Sin embargo, ha habido algún interés en el uso de radionúclidos alfa-emisores en terapia debido a su potencial para aniquilación celular más específica.
El intervalo de radicación de los alfa-emisores típicos en los alrededores fisiológicos es en general menor de 100 micrómetros, el equivalente de sólo unos pocos diámetros celulares. Esto hace a estas fuentes muy adecuadas para el tratamiento de tumores, incluyendo micrometástasis , debido a que si son bien dirigidas al objetivo, entonces poca de la energía irradiada pasará más allá de las células objetivo o diana. De esta manera, puede reducirse al mínimo el daño al tejido saludable circundante (ver Feinendegen et al., Radiat Res 148 : 195-201 (1997)). En contraste, una beta-partícula tiene un intervalo de 1 mm o más en agua (ver Wilbur, Antibody Immunocon Radiopharm 4: 85-96 (1991)).
La energía de radiación de alfa-partículas es alta, en comparación con aquella transportada por las beta-partículas, rayos gamma y rayos X, típicamente que es 5-8 MeV, o 5 a 10 veces aquella de una beta-partícula y 20 o más veces la energía de un rayo gamma. De esta manera, este depósito de una gran cantidad de energía sobre una distancia muy corta da a-radiación, una excepcionalmente alta transferencia de energía lineal (LET, por sus siglas en ingle) , alta eficiencia biológica relativa (RBE, por sus siglas en inglés) y baja relación de mejora de oxígeno (OER, por sus siglas en inglés) en comparación a radiación gamma y beta (ver Hall, "Radiobiology for the radiologist" , Quinta edición, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA, EUA, 2000) . Esto explica la citotoxicidad excepcional de los radionúclidos alfa-emisores y también impone demandas severas en la selección de objetivos biológicos de estos isótopos y en el nivel de control y estudio de la distribución de los radionúclidos alfa-emisores que es necesaria a fin de evitar efectos secundarios inaceptables.
La Tabla 1 posterior muestra las propiedades de descomposición física de los alfa-emisores hasta ahora ampliamente propuestos en la literatura como que tienen posiblemente eficiencia terapéutica.
Tabla 1 * Vida media Hasta ahora, con respecto a la aplicación en radioinmnoterapia, se ha enfocado la atención principal a 211At, 213Bi y 225Ac y estos tres núclidos se han explorado en ensayos de inraunoterapia clínica.
Varios de los radionúclidos que se ha propuesto son de vida corta, es decir, tienen vidas medias de menos de 12 horas. Estas vidas medias cortas hacen difícil producir y distribuir radiofarmacéuticos en base a estos radionúclidos de una manera comercial. La administración de un núclido de vida corta también incrementa la proporción de la dosis de radiación que se emitirá en el cuerpo antes de que se alcance el sitio objetivo.
La energía de retroceso de la alfa-emisión provocará en muchos casos la liberación de núclidos hijo de la posición de descomposición del precursor. Esta energía de retroceso es suficiente para romper muchos núcleos hijo del ambiente químico que puede haber sostenido al precursor, por ejemplo, donde el precursor se volvió, complejo por un ligando tal como un agente quelante. Esto se presentará aún donde el hijo es químicamente compatible con, es decir, se volvió complejo por, el mismo ligando. Igualmente, donde el núclido hijo es un gas, particularmente un gas noble tal como radón, o es químicamente incompatible con el ligando, este efecto de liberación aún será mayor. Cuando los núclidos hijo tienen vidas medias de más de unos pocos segundos, pueden difundirse lejos al sistema sanguíneo, sin restricción por el! agente complejante que sostiene al precursor. Estos hijos radiactivos libres entonces pueden provocar toxicidad sistémica indeseada.
El uso de Torio-227 (T1/2 = 18.7 días) bajo condiciones donde se propuso el control del isótopo hijo 23Ra unos pocos años atrás (ver WO 01/60417 y WO 02/05859) . Esto fue en situaciones donde se usa un sistema portador que permite que los núclidos hijo se retengan por un ambiente cerrado. En un caso, el radionúclidos se deposita dentro de un liposoma y el tamaño sustancial de liposoma (en comparación a la distancia de retroceso) ayuda a retener a los núclidos hijo dentro del liposoma. En el segundo caso, se usan complejos del radionúclido, que buscan el hueso, que se incorporan en la matriz ósea y por lo tanto restringen la liberación de los núclidos hijo. Estos son métodos potencialmente muy ventajosos, pero la administración de liposomas no es deseable en algunas circunstancias y hay muchas enfermedades del tejido blando en las cuales no se pueden circundar los radionúclidos por una matriz mineralizadas para retener los isótopos hijo.
Más recientemente, se estableció que la toxicidad de los núcleos hijo de 223Ra liberados en la descomposición de 2 7Th se puede tolerar en el cuerpo del mamífero a un mucho mayor grado que lo que se predijo de pruebas anteriores en núcleos comparables. En la ausencia de los medios específicos para retener los hijos de radio de torio-227 analizados anteriormente, la información públicamente disponible con respecto a la toxicidad de radio, hace claro que no fue posible usar torio-227 como un agente terapéutico puesto que las dosis requeridas para lograr un efecto terapéutico de la descomposición de torio-227 darán por resultado una dosis altamente tóxica y posiblemente letal de radiación de la descomposición de los hijos de radio, es decir, no hay una ventana terapéutica.
La WO 04/091668 describe el hallazgo inesperado que existe una ventana de tratamiento terapéutico en la cual se puede administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un radionúclido de torio-227 dirigido a objetivo a un sujeto (típicamente un mamífero) sin generar una cantidad de radio-223 suficiente para provocar mielotoxicidad inaceptable. Por lo tanto, esto se puede usar para tratamiento y profilaxis de todos los tipos de enfermedades tanto en tejidos óseos como en sitios de tejido blando.
En vista de los desarrollos anteriores, ahora es posible emplear núcleos alfa-emisores de torio-227 en terapia de endoradionúclidos sin mielotoxicidad letal que resulte del 223Ra generado. Sin embargo, la ventana terapéutica permanece relativamente estrecha y en todos los casos es deseable administrar no más radioisótopo alfa-emisor a un sujeto de lo que es absolutamente necesario. El aprovechamiento útil de esta nueva ventana terapéutica por lo tanto se mejoraría en su mayor parte si los núcleos alfa-emisores de torio-227 se pueden volver complejos y se dirijan al objetivo con un alto grado de conflabilidad.
Debido a que los radionúclidos están constantemente descomponiéndose, el tiempo transcurrido en el manejo del material entre el aislamiento y la administración al sujeto es de gran importancia. También sería de considerable valor si los núcleos alfa-emisores de torio se pueda volver complejos, dirigir al objetivo y/o administrar en una forma que fuera rápida y conveniente de preparar, requiriendo de manera preferente pocos pasos, cortos períodos de incubación y/o temperaturas que no afecten de manera irreversible las propiedades de la entidad que se dirija el objetivo.
Los presentes inventores ahora han establecido inesperadamente que el uso de un ion de torio-227 4+ , vuelto complejo con un ligando octadentado tipo hidroxipiridinona (HOPO) , enlazado a una porción dirigida a objetivo, proporciona un grado notable de control con respecto al ión de torio-227. Adicionalmente, estos complejos pueden ser relativamente rápidos y/o fáciles de preparar usando los métodos descritos en la presente.
Breve Descripción de la Invención Vista desde un aspecto, la presente invención proporciona por lo tanto un complejo dirigido a un objetivo de tejido, que comprende una porción dirigida a un objetivo de tejido, un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ión de un radionúclido alfa-emisor de torio. Un aspecto particularmente preferible es este complejo dirigido a un objetivo de tejido que comprende una porción de polipéptido dirigida a objetivo de tejido, covalentemente unida a un ligando octadentado que comprende al menos una porción de 3 , 2 -hidroxipiridinona, el ligando que se vuelve complejo al ión 4+ del radionúclido alfa-emisor de torio tal como 227Th.
Vista desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un complejo dirigido a un objetivo de tejido que comprende una porción dirigida a un objetivo de tejido un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ión de un radionúclido alfa-emisor de torio (incluyendo cualquier complejo descrito en la presente) en la elaboración de un tratamiento para el tratamiento de enfermedad hiperplástica o neoplástica que incluye cualquier enfermedad descrita en la presente.
En un aspecto correspondiente, la invención proporciona un método de tratamiento de un humano o animal no humano (particularmente uno en necesidad del mismo) que comprende la administración de al menos un complejo dirigido a un objetivo de tejido que comprende una porción dirigida a un objetivo de tejido, un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ión de un radionúclido alfa-emisor de torio (incluyendo cualquier complejo descrito en la presente) . Este método es preferentemente para el tratamiento de enfermedad hiperplástica o neoplástica incluyendo cualquier enfermedad descrita en la presente.
Vista desde un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un complejo dirigido a un objetivo de tejido que comprende una porción dirigida a un objetivo de tejido, un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ión de un radionúclido alfa-emisor de torio (incluyendo cualquier complejo descrito en la presente) conjuntamente con al menos un excipiente o portador farmacéutico.
Para distinguir de los complejos de torio del isótopo de torio que se presenta de forma natural más abundante, es decir, torio-232 (vida media 1010 años y efectivamente no radioactivo) , se debe entender que los complejos de torio y las composiciones de los mismos, reivindicadas en la presente, incluyen el radioisótopo alfa-emisor de torio (es decir al menos un isótopo de torio con una vida media de menos de 103 años, por ejemplo torio-227) a mayor abundancia relativa que la natural, por ejemplo, al menos 20 % mayor. Esta necesidad no afecta la definición del método de la invención donde se requiere explícitamente una cantidad terapéuticamente efectiva de un torio radioactivo, tal como torio-227, pero preferentemente será el caso en todos los aspectos .
Vista desde un aspecto aún adicional, la invención también proporciona kit para el uso en un método de acuerdo a la invención, el kit que incluye una porción dirigida a un objetivo de tejido, conjugada o conjugable a un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona . Todas las porciones de unión y ligandos que son preferentemente aquellas descritas en la presente. Este kit incluirá de manera opcional y preferentemente un radionúclido alfa-emisor de torio, tal como 227Th.
Breve Descripción de las Figuras La invención se ilustra adicionalmente por las figuras anexas, en las cuales: La Figura 1 - muestra el cromatograma de la mezcla de reacción de 32Th4+ (HN03) y 1 mg/ml ALG-DD-NCS en DMSO (relación teórica 2:3) después de 15 minutos a temperatura ambiente. Hay cantidades significativas del complejo 232Th-ALG-DD-NCS (tR = 5.74 min,- m/z 1328.5), y ninguna traza del ligando libre ALG-DD-NCS (tR = 5.36).
La Figura 2 - muestra el espectro másico del complejo 232Th-ALG-DD-NCS (m/z 1328.3949).
La Figura 3 - muestra el cromatograma de la mezcla de reacción de Fe3+ (HN03) y 1 mg/ml ALG-DD-NCS en DMSO (relación teórica 2:3) después de 15 minutos a temperatura ambiente. Hay cantidades significativas del complejo Fe-ALG-DD-NCS (t = 5.81 min; m/z 1153.51), y ninguna traza del ligando libre ALG-DD-NCS (tR = 5.36 min).
La Figura 4 - muestra el espectro másico del complejo Fe-ALG-DD-NCS (m/z 1153.3002).
La Figura 5 - muestra el cromatograma de la mezcla de reacción de In3+ (HCl) y 1 mg/ml ALG-DD-NCS en DMSO (relación teórica 2:3) después de 15 minutos a temperatura ambiente. Hay cantidades significativas del complejo In-ALG-DD-NCS (tR = 5.95 min; m/z 1212.5), ninguna traza de ligando libre ALG-DD-NCS (tR = 5.36 min).
La Figura 6: - muestra el espectro de masa del complejo In-ALG-DD-NCS (m/z 1212.2666).
La Figura 7 - muestra el cromatograma de la mezcla de reacción de 232Th4+ (HN03) y 1 mg/ml ALG1005-38 en amortiguador de acetato, pH 5.5, después de 10 minutos a temperatura ambiente (relación teórica 1:3). Hay cantidades significativas del complejo 232Th-ALG 1005-1038 (tR = 3.56; m/z 1184.51) y residuos del ligando libre ALG1005-38 (tR = 3.20).
La Figura 8 - muestra el espectro de masa del complejo 232Th-ALG1005-38 (m/z 1184.4662).
La Figura 9 - muestra el cromatograma de la mezcla de reacción de Fe3+ (HN03) y 1 mg/ml ALG1005-38 en amortiguador de acetato, pH 5.5, después de 10 minutos a temperatura ambiente (relación teórica 1:3). Hay cantidades significativas del complejo Fe-ALG1005-38 (tR = 3.70; m/z 1009.5) y residuos de ligando libre ALG1005-38 (tR = 3.22).
La Figura 10 - muestra el espectro de masa del complejo Fe-ALG1005-38 (m/z 1009.3727).
La Figura 11 - muestra el cromatograma de la mezcla de reacción de In3+ (HCl) y ? mg/ml ALG1005-38 en amortiguador de acetato, pH 5.5, después de 10 minutos a temperatura ambiente (relación teórica 1:3) . Hay cantidades significativas del complejo In-ALG1005-38 (tR = 3.72; m/z 1068.5) y sólo trazas del ligando libre ALG1005-38 (tR = 3.21) .
La Figura 12 - muestra el espectro másico del complejo In-ALG1005-38 (m/z 1068.3485).
La Figura 13 - muestra el cromatograma de la mezcla de reacción de Ga3+ (HCl) y 1 mg/ml ALG1005-38 en amortiguador de acetato, pH 5.5, después de 10 minutos a temperatura ambiente (relación teórica 1:3). Cantidades significativas del complejo Ga-ALG1005-1038 (tR = 3.65; m/z 1022.5) y residuos del ligando libre ALG1005-38 (tR = 3.21).
La Figura 14 - muestra el espectro másico del complejo Ga-ALG1005-1038 (m/z 1022.3571).
La Figura 15 - muestra el cromatograma de la mezcla de reacción de 232t?4+ (HCl) y 1 mg/ml Bb-l-HOPO-l-DEBN (relación teórica 2:3) después de 15 minutos a temperatura ambiente. Hay cantidades significativas del complejo 232Th-Bb-1-HOPO-l-DEBN (tr = 3.52). Trazo superior: Cromatograma de Masa de m/z 1222.5. Traza inferior: UV a 330 nra.
La Figura 16 - muestra el espectro másico del complejo 232Th-Bb-l-HOPO-l-DEBN (m/z 1222.5).
La Figura 17 - muestra la cantidad calculada de 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab y 227Th libre unido a sedimentos de células SK-OV-3 en el día 0-7, mostrada como la descomposición corregidas para la actividad de 2 Th- (cpm) .
La Figura 18 - muestra los valores normalizados de luminiscencia para células SK-OV-3 tratadas con (1) medio regular (control); (2) 20 g/ml de trastuzumab; (3) 20 kBq/ml 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab (10166 Bq/pg) , y (4) 20 kBq/ml de 2 7Th libre.
La Figura 19 - muestra un ensayo clonogénico de 1000 células SK-OV-3 individuales tratadas con (1) medio regular (control) ; trastuzumab (2) , (3 ) 2 7Th libre, y (4) Th227-ALG-DD-NCS-trastuzumab (10166 Bq/pg) . (Media ± SD, n = 3) .
La Figura 20 - muestra un ensayo clonogénico de 3000 células individuales SK-OV-3 tratadas con (1) medio regular (control), (2) trastuzumab, (3) 227Th libre, y (4)-Th227~ALG-DD-NCS trastuzumab (10166 Bq/ g) . (Media ± SD, n = 3) .
La Figura 21 - muestra la distribución en órgano del Th227-ALG-DD-NCS-trastuzumab (2700 Bq/pg) en ratones desnudos Balb/c con xenoinjertos SK-OV-3, después de la biodistribución durante 24 horas y 4 días. (Media + SD, n = 5) .
Descripción Detallada de la Invención En el contexto de la presente invención, "dirigido (a) a objetivo de tejido" se usa en la presente para indicar que la sustancia en cuestión (particularmente cuando está en la forma de un conjugado a un complejo de torio) , sirve para localizar por sí misma (y en particular para localizar cualquier complejo conjugado de torio) preferencialmente en al menos un sitio de tejido en el cual es deseada su presencia (por ejemplo para administrar una descomposición radioactiva) . La porción dirigida al objetivo puede unirse, por ejemplo, a los marcadores de superficie celular (por ejemplo, receptores, proteínas de transporte, moléculas de adhesión celular, etc.) presentes en las células afectadas por la enfermedad o en células en la vecindad de células afectadas por la enfermedad. Estos marcadores de superficie celular incluyen proteínas más pesadamente expresadas en superficies de células enfermas que en superficies de células saludables o aquellas más pesadamente expresadas en superficies celulares durante períodos de crecimiento o replicación que durante las fases inactivas. Los componentes presentes en la vecindad de células o tejidos objetivo o asociados con estos también se pueden utilizar en el objetivo para terapia de acuerdo con cualquier aspecto de la invención. Por ejemplo, los componentes presentes en, o liberados en, la matriz alrededor de las células o tejidos que se seleccionan como objetivos, se pueden usar para la selección como objetivo, si la presencia, forma o concentración permite que la región se distinga de tejidos saludable. Los ejemplos de estos son antígenos de matriz tal como tenascina, que se asocia con tumores cerebrales pero se expresa en la matriz entre células. Estos antígenos de matriz se pueden dirigir al objetivo por una porción individual o compuesta dirigida a al objetivo, como se analiza en la presente .
La porción dirigida a un objetivo de tejido también puede comprender dos o más componentes que tienen colectivamente el efecto de dirigir el complejo de torio hacia los tejidos objetivos deseados. Por ejemplo, esto puede ser donde se administra un componente primero y se una a un tejido, tumor o tipo celular particular (un agente de unión a tejido) y un segundo y/o adicional componente (agente de enlace) se administra de manera simultánea, o de manera preferentemente subsiguiente, que se une in vivo al agente que se une a tejido. El agente de enlace se conjugará directamente o de forma indirecta al torio alfa-emisor vuelto complejo, y de esta manera, de forma colectiva los agentes de enlace y de unión a tejido formarán una porción dirigida a un objetivo de tejido. Los pares específicos adecuados de unión para proporcionar el agente de unión a tejido y el agente de enlace con afinidad mutua son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, biotina con avidina o estreptavidina) .
Los varios aspectos de la invención como se describe en la presente se refieren al tratamiento de enfermedades, particularmente para la selección de objetivos selectivos de tejido enfermo, así como que se relaciona a complejos, conjugados, medicamentos, formulaciones, kits, etc., útiles en estos métodos. En todos los aspectos, el tejido enfermo puede residir en un sitio único en el cuerpo (por ejemplo en el caso de un tumor sólido localizado) o puede residir en una pluralidad de sitios (por ejemplo donde se afecten varias articulaciones en artritis o en el caso de una enfermedad cancerosa distribuida o con metástasis) .
El tejido enfermo que se va a seleccionar como objetivo puede estar en un sitio de tejido blando, en un sitio de tejido calcificado o en una pluralidad de sitios que pueden estar todos en tejido blando, todos en tejido calcificado o pueden incluir al menos un sitio de tejido blando y/o al menos un sitio de tejido calcificado. En una modalidad, se selecciona como objetivo al menos un sitio de tejido blando. Los sitios de selección como objetivo y los sitios de origen de la enfermedad pueden ser los mismos, pero de manera alternativa pueden ser diferentes. Donde esté comprendido más de un sitio este puede incluir el sitio de origen o puede ser una pluralidad de sitios secundarios.
El término "tejido blando" se usa en la presente para indicar tejidos que no tienen una matriz mineralizada "dura". En particular, los tejidos blandos como se usa en la presente pueden ser cualquier tejido que no sean tejidos esqueléticos. De forma correspondiente "enfermedad de tejido blando" como se usa en la presente indica una enfermedad que se presenta en un "tejido blando" como se usa en la presente. La invención es particularmente adecuada para el tratamiento de cánceres y "enfermedad de tejido blando" abarca de esta manera carcinomas, sarcomas, mielomas, leucemias, linfornas y cánceres de tipos mezclados que se presentan en cualquier tejido "blando" (es decir, no mineralizado), así como otras enfermedades no cancerosas de este tejido. La "enfermedad de tejido blando" cancerosa incluye tumores sólidos que se presentan en tejidos blandos así como tumores metastáticos y micro-metastáticos . En realidad, la enfermedad de tejido blando puede comprender un tumor sólido primario de tejido blando y al menos un tumor metastático de tejido blando en el mismo paciente. De manera alternativa, la "enfermedad de tejido blando" puede consistir sólo de un tumor sólido o sólo de metástasis con el tumor primario que es una enfermedad esquelética .
Es un hallazgo clave reciente que ciertos isótopos alfa-radioactivos de torio (por ejemplo 227Th) se puedan administrar en una cantidad que sea tanto terapéuticamente efectiva como no genere mielotoxicidad intolerable. Como se usa en la presente, el término "no mielotóxico de forma aceptable" se usa para indicar que, de manera más importante, la cantidad de radio-223 generada por descomposición del radioisótopo de torio-227 administrado en general no es suficiente para que sea directamente letal al sujeto. Será claro a un experto en la técnica, que sin embargo, la cantidad de daño a la médula (y la probabilidad de una reacción letal) que será un efecto secundario aceptable del tratamiento, variará de forma significativa con el tipo de enfermedad que se trate, los objetivos del régimen de tratamiento, y la prognosis para el sujeto. Aunque los sujetos preferidos para la presente invención son humanos, otros mamíferos, particularmente perros, se beneficiarán del uso de la invención y el nivel de daño aceptable a médula también puede reflejar la especie del sujeto. El nivel de daño a médula aceptable en general será mayor en el tratamiento de enfermedad maligna que para enfermedad no maligna. Una medida bien conocida del nivel de mielotoxicidad es la cuenta de células de neutrofilos, y en la presente invención, una cantidad aceptablemente no mielotóxica de 223Ra será típicamente una cantidad controlada tal que la fracción de neutrofilos en su punto más bajo (nadir) es no menos de 10 % de la cuenta antes del tratamiento. De manera preferente, la cantidad aceptablemente no mielotóxica de 223Ra será una cantidad tal que la fracción de células de neutrófilos está la menos 20 % en nadir y de manera más preferente al menos 30 %. La fracción de células de neutrófilos en nadir de al menos 40 % es lo más preferido.
Además, se pueden usar compuestos que contienen torio radioactivo (por ejemplo 227Th) en regímenes de alta dosis donde la mielotoxicidad del radio generado (por ejemplo 223Ra) normalmente sería intolerable cuando se incluya soporte de células madre o un método comparable de recuperación. En estos casos, la cuenta de células de neutrófilos se puede reducir a por abajo de 10 % en nadir y excepcionalmente se reducirá a 5 %, si es necesario por abajo de 5 %, con la condición de que se tomen precauciones adecuadas y se de soporte subsiguiente de células madre. Son bien conocidas estas técnicas.
Un isótopo de torio de interés particular en la presente invención es torio-227, y torio-227 es el isótopo preferido para todas las referencias a torio en la presente donde lo permite el contexto. Torio-227 relativamente fácil de producir y se puede preparar indirectamente de 226Ra irradiado con neutrones, que contendrá los núclidos madre de 22 Th, es decir, 27Ac (Ti/2 = 22 años) . Actinio-227 puede ser bastante fácil de separar del objetivo 2 6Ra y usar como un generador para 227Th. Este proceso se puede llevar a escala industrial si es necesario, y por lo tanto se puede evitar el problema de suministro visto con la mayoría de los otros alfa-emisores considerados candidatos para radioterapia dirigida a objetivo molecular.
El torio-227 se descompone mediante radio-223. En este caso, el hijo primario tiene una vida media de 11.4 días. A partir de una fuente pura de 22Th, sólo se producen cantidades moderadas de radio durante los pocos primeros días. Sin embargo, la toxicidad potencial de 223Ra es mayor que aquella de 227Th puesto que la emisión de 2 3Ra de un alfa-partícula se sigue en el espacio de minutos por tres alfa-partículas adicionales de los hijos de vida corta (ver Tabla 2 posterior que expone la sede de descomposición para torio-227) .
Tabla 2 Parcialmente debido a que genera productos de descomposición potencialmente peligrosos, no se ha considerado ampliamente el torio-227 (Ti/2 = 18.7 días) para terapia de alfa-partículas.
Se puede administrar torio-227 en cantidades suficientes para proporcionar efectos terapéuticos deseables sin generar demasiado radio-223 para provocar supresión intolerable de médula ósea. Es deseable mantener los isótopos hijo en la región seleccionada como objetivo de modo que se puedan derivar efectos terapéuticos adicionales de su descomposición. Sin embargo, no es necesario mantener el control de los productos de descomposición de torio a fin de tener un efecto terapéutico útil sin inducir mielotoxicidad aceptable .
Asumiendo que el efecto de aniquilación de células tumorales será principalmente de torio-227 y no de sus hijos, la dosis probablemente terapéutica de este isótopo se puede establecer por comparación con otros alfa-emisores. Por ejemplo, para astatina-211, las dosis terapéuticas en animales han sido típicamente 2-10 MBq por kg. Al corregir la vida media y energía, la dosis correspondiente para torio-227 será al menos 36-200 kBq por kg de peso corporal. Esto establecería un límite inferior en la cantidad de 227Th que se puede administrar de manera útil con la esperanza de un efecto terapéutico. Este cálculo asume retención comparable de astatina y torio. Sin embargo, claramente la vida media de 18.7 días del torio probablemente dará más por resultado mayor eliminación de este isótopo antes de su descomposición. Estas dosis calculadas por lo tanto se deben considerar normalmente como que es la cantidad mínima efectiva. La dosis terapéutica expresada en términos de 227Th completamente retenido (es decir, 227Th que no se elimina del cuerpo) será típicamente al menos 18 o 25 kBq/kg, de manera preferente al menos 36 kBq/kg y de manera más preferente al menos 75 kBq/kg, por ejemplo, 100 kBq/kg o más. Se esperará que mayores cantidades de torio tengan mayor efecto terapéutico pero no se pueden administrar si aparecen efectos secundarios intolerables. Igualmente, si el torio se administra en una forma que tiene una vida media biológica corta (es decir, la vida media antes de la eliminación del cuerpo que tiene aún el torio) , entonces, se requerirán mayores cantidades del radioisótopo para un efecto terapéutico debido a que la mayoría del torio se eliminará antes de su descomposición. Sin embargo, habrá una disminución correspondiente en la cantidad de radio-223 generado. Las cantidades anteriores de torio-227 que se van a administrar cuando el isótopo se retenga completamente, se puedan relacionar fácilmente a dosis equivalentes con vidas medias biológicas más cortas. 2stos cálculos son bien conocidos en la técnica y se dan en la WO 04/091668 (por ejemplo en el texto en los Ejemplos 1 y 2) .
Si un compuesto radiomarcado libera núclidos hijo, es importante conocer el destino, si es aplicable, de cualquier núclido hijo radioactivo. Con 227Th, el producto hijo principal es 223Ra, que está bajo evaluación clínica debido a sus propiedades de búsqueda ósea. El radio-223 se depura de la sangre muy rápidamente y ya sea se concentra en el esqueleto o se excreta mediante rutas intestinales y renales (ver Larsen, J Nucí Med 43_(5, Supplement) : 160P (2002) ) . El radio-223 liberado in vivo a partir de 227Th por lo tanto no puede afectar el tejido blando saludable a un mayor grado. En el estudio de Müller in Int. J. Radiat. Biol . 20_: 233-243 (1971) con respecto a la distribución de 227Th como la sal disuelta de citrato, se encontró que el 2 3Ra generado a partir de 227Th en tejidos blandos se re-distribuyó fácilmente a hueso o se excretó. La toxicidad conocida del radio alfa-emisor, particularmente a la médula ósea, de esta manera es una cuestión con las dosis de torio.
Se estableció por primera vez en WO 04/091668 que, en realidad, se puede administrar una dosis de la menos 200 kBq/kg de 223Ra y tolerar en sujetos humanos. Estos datos se presentan en esa publicación. Por lo tanto, ahora se puede ver que, a pesar de ser inesperado, existe una ventana terapéutica en la cual se puede administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de 227Th (tal como más de 36 kBq/kg) a un sujeto mamífero sin la expectación que ese sujeto sufrirá un riesgo inaceptable de mielotoxicidad seria o aún letal. Sin embargo, es extremadamente importante que se haga el mejor uso de esta ventana terapéutica y por lo tanto es esencial que el torio radiactivo se vuelva complejo de forma rápida y eficiente, y se mantenga con muy alta afinidad de modo que se administre al sitio objetivo diana la proporción más grande posible de la dosis.
La cantidad de 223Ra generada a partir de un producto farmacéutico de 227Th dependerá de la vida media biológica del compuesto radiomarcado . La situación ideal sería usar un complejo con una rápida captación tumoral, incluyendo internalización en la célula tumoral, fuerte retención tumoral y una corta vida media biológica en tejidos normales. Sin embargo, pueden ser útiles los complejos con menos de la vida media biológica ideal en tanto que se mantenga la dosis de 23Ra dentro del intervalo tolerable. La cantidad de radio-223 generada in vivo será un factor de la cantidad de torio administrada y el tiempo de retención biológica del complejo de torio. La cantidad de radio-223 generada en cualquier caso particular se puede calcular fácilmente por un experto en la técnica. La cantidad máxima administrable de 27Th se determinará por la cantidad de rodio generada in vivo y debe ser menor que la cantidad que producirá un nivel intolerable de efectos secundarios, particularmente mielotoxicidad. Esta cantidad en general será menos de 300kBq/kg, particularmente menos de 200 kBq/kg y de manera más preferente menos de 170 kBq/kg (por ejemplo menos de 130 kBq/kg) . La dosis mínima efectiva se determinará por la citotoxicidad del torio, la susceptibilidad del tejido enfermo a la irradiación alfa generada y el grado al cual se combina de manera eficiente el torio, se mantiene y se distribuye por el complejo que selecciona el objetivo (que es la combinación del ligando y la porción que se une a objetivo, en este caso) .
En el método de la invención, el complejo de torio se administra de manera deseable a una dosis de torio-227 de 18 a 400 kBq/kg de peso corporal, de manera preferente de 36 a 200 kBq/kg, (tal como de 50 a 200 kBq/kg) de manera más preferente de 75 a 170 kBq/kg, especialmente de 100 a 130 kBq/kg. De manera correspondiente, una unidad de dosis individual puede comprender alrededor de cualquiera de estos intervalos multiplicado por un peso corporal adecuado, tal como de 30 a 150 g, de manera preferente de 40 a 100 Kg (por ejemplo un intervalo de 540 kBq a 4000 KBq por dosis, etc.) . La dosis de torio, el agente complejante y la ruta de administración serán de manera más deseable tal que la dosis de radio-223 generada in vivo es menor de 300 kBq/kg, de manera más preferente menos de 200 kBq/kg, de manera aún más preferente menos de 150 kBq/kg, especialmente menos de 100 kBq/kg. Nuevamente, esto proporcionará una exposición a 223Ra indicadas al multiplicar estos intervalos por cualquiera de los pesos corporales indicados. Los niveles de dosis anteriores son preferentemente la dosis completamente retenida de 227Th pero puede ser la dosis administrada tomando en cuenta que se puede depurar algo de 2 7Th del cuerpo antes de que se descomponga.
Donde la vida media biológica del complejo 2 7Th es corta en comparación con la vida media física (por ejemplo menos de 7 días, especialmente menos de 3 días) se pueden necesitar dosis administradas significativamente mayores para proporcionar la dosis retenida equivalente. De esta manera, por ejemplo, una dosis completamente retenida de 150 kBq/kg es equivalente a un complejo con una vida media de 5 días administrados a una dosis de 711 kBq/kg. La dosis equivalente administrada para cualquier dosis retenida apropiada se puede calcular de la velocidad de depuración biológica del complejo usando métodos bien conocidos en la técnica.
Puesto que la descomposición de un núcleo de 227Th proporciona un átomo de 223Ra, la retención y actividad terapéutica del 227Th estará directamente relacionada a la dosis de 2 3Ra soportada por el paciente. La cantidad de 223Ra generada en cualquier situación particular se puede calcular usando métodos bien conocidos.
En una modalidad preferida, la presente invención proporciona por lo tanto un método para el tratamiento de enfermedad en un sujeto mamífero (como se describe en la presente) , el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado que comprende una porción dirigida a un objetivo de tejido, un ligando octadentado (especialmente cualquiera de aquellos descritos en la presente) y un isótopo radioactivo de torio (por ejemplo, torio-227) .
Es deseable obviamente, reducir al mínimo la exposición de un sujeto al isótopo hijo de 223Ra, a menos que se empleen de forma útil las propiedades de este. En particular, la cantidad de radio-223 generada ín vivo será típicamente mayor de 40 kBq/kg, por ejemplo mayor de 60 kBq/Kg. En algunos casos, será necesario que el 223Ra generado in vivo sea más de 80 kBq/kg, por ejemplo mayor de 100 o 115 kBq/kg.
Los conjugados marcados con torio-227 en soluciones portadoras apropiadas se pueden administrar de manera intravenosa, de forma intracavitaria (por ejemplo intraperitonealmente) , de forma subcutánea, oralmente o tópicamente, como una aplicación única o en un régimen de aplicación fraccionada. De manera preferente los complejos conjugados a la porción que se selecciona el objetivo se administrarán como soluciones por una ruta parenteral (por ejemplo, transcutánea) , especialmente de forma intravenosa o por una ruta intracavitaria. De manera preferente, las composiciones de la presente invención se formularán en solución estéril para administración parenteral.
Se puede usar torio-227 en los métodos y productos de la presente invención solos o en combinación con otras modalidades de tratamiento incluyendo cirugía, terapia de radiación de haz externo, quimioterapia, otros radionúclidos , o ajuste de temperatura de tejido, etc. Esto forma una modalidad adicional preferida del método de la invención y las formulaciones/medicamentos pueden comprender de manera correspondiente al menos un agente terapéuticamente activo, adicional, tal como otro agente radioactivo o un agente quimioterapéutico .
En una modalidad particularmente preferida, el sujeto también se somete a tratamiento con células madre y/o otra terapia de soporte para reducir los efectos de la mielotoxicidad inducida por radio-223.
De acuerdo a esta invención, el 227Th se puede volver complejo al dirigir al objetivo los agentes complej antes . Típicamente, las porciones que seleccionan el objetivo tendrán un peso molecular de 100 g/mol a varios millones de g/mol (particularmente 100 g/mol a 1 millón de g/mol) , y tendrán preferentemente afinidad para un receptor relacionado a enfermedad ya sea de forma directa, y/o comprenderán un aglutinante pre-administrado adecuado (por ejemplo biotina o avidina) unido a una molécula que se ha dirigido a objetivo en la enfermedad por adelantado para administrar 227Th. Las porciones adecuadas que se dirigen a objetivo incluyen poli- y oligo-péptidos, proteínas, fragmentos de ADN y ARN, aptámeros etc., preferentemente una proteína, por ejemplo avidina, estreptavidina, un anticuerpo policlonal o monoclonal (incluyendo anticuerpos tipo IgG e IgM) , o una mezcla de proteínas o fragmentos o construcciones de proteína. Son particularmente preferidos anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo fragmentos de FAB o cualquier fragmento que comprende al menos una región de unión a antígeno) , construcciones de fragmentos (por ejemplo anticuerpos de cadena individual) o una mezcla de los mismos.
También adecuados para el uso en la presente invención son los conjugados terapéuticos de 227Th vuelto complejo con un péptido, aminoácido, hormona esteroide o no esteroide, foliato, estrógeno, testosterona, biotina, u otros compuestos de unión específica con peso molecular típicamente por abajo de 10 000 g/mol .
En general, el ligando octadentado se conjuga directamente o de forma indirecta (por ejemplo mediante una porción ligadora) a la porción que selecciona el objetivo. Las construcciones generales de este tipo; es decir de metal activo (por ejemplo terapéuticamente o diagnósticamente activo) - porción complejante - porción ligadora opcional -porción que selecciona objetivo, son bien conocidas en el campo de los radiofarmacéuticos dirigidos a objetivo y agentes de formación de imágenes dirigidos al objetivo. Sin embargo, está disponible poco o ningún trabajo que valore la adecuabilidad de varios ligandos para uso específico con iones de torio 4+. En este respecto, se puede tener referencia por ejemplo a "Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents" , Ed. Torchilin, CRC Press, 1995.
Los queladores previamente conocidos para torio incluyen los queladores de poliaminopoliácido que comprenden una estructura de poliazaalcano cíclica o ramificada con grupos ácidos (por ejemplo carboxialquilo) unidos a los nitrógenos de la estructura. Los ejemplos de estos queladores incluyen derivados de DOTA tal como de ácido p-isotiocianatobencil-1 , 4,7, 10-tetraazaciclododecan-1 , 4,7,10-tetraacético (p-SCN-Bz-DOTA) y derivados de DTPA tal como ácido p-isotiocianatobencil-dietilentriaminapentaacético (p-SCN-Bz-DTPA) , los primeros que son queladores cíclicos, los últimos queladores lineales.
Se han ejemplificado anteriormente derivados de ácido 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l , 4,7, 10-tetraacético, pero no se pueden usar fácilmente métodos normales para quelar torio con derivados de DOTA. El calentamiento del derivado de DOTA con el metal proporciona el quelado de forma efectiva, pero frecuentemente en bajos rendimientos. Hay una tendencia de que al menos un porción de ligando se desnaturalice en forma irreversible durante el procedimiento. Adicionalmente, debido a su relativamente alta susceptibilidad a desnaturalización irreversible, en general es necesario evitar la unión de la porción que selecciona objetivo hasta que se completen todos los pasos de calentamiento. Esto adiciona un paso químico adicional (con todo el trabajo y separación necesarios) que se debe llevar a cabo durante el tiempo de vida o descomposición del isótopo alfa-emisor de torio. Obviamente, se prefiere no manejar el material alfa-emisor de esta manera o generar el correspondiente desperdicio a un mayor grado que el necesario. Adicionalmente, todo el tiempo transcurrido al preparar el conjugado desperdicia una proporción del torio que se descompondrá durante este período preparatorio.
Se prefiere que los complejos de torio alfa-emisores y un ligando octadentado, en todos los aspectos de la presente invención, se formen o se puedan formar sin calentamiento por arriba de 60°C (por ejemplo sin calentar por arriba de 50°C) , de manera preferente sin calentar por arriba de 38°C y de manera más preferente sin calentar por arriba de 25°C.
Adicionalmente, se prefiere que el conjugado de la porción de selección a objetivo y el ligando octadentado se preparen antes de la adición del isótopo alfa-emisor de torio (por ejemplo ion de 227Th4+) . Los productos de la invención de esta manera se forman preferentemente o se pueden formar por formación de complejos del isótopo alfa-emisor de torio (por ejemplo ión de 22Th4+) por un conjugado de un ligando octadentado y una porción dirigida a un objetivo de tejido.
Los queladores pueden ser moléculas no de fosfonato y en una modalidad de la presente invención, el 22Th no se unirá a ningún grupo fosfonato u otro que selecciona como objetivo el hueso no administrado con estos materiales.
Los tipos de compuestos objetivo se pueden enlazar a torio (por ejemplo, torio-227) mediante un quelador octadentado (que comprende una porción de acoplamiento como se describe en la presente) . La porción objetivo se puede seleccionar de grupos conocidos objetivo, que incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales, factores de crecimiento, péptidos, hormonas, y análogos de hormonas, foliato y derivados de foliato, biotina, avidina y estreptavidina o análogos de los mismos. Otros posibles portadores pueden ser AR , ADN, o fragmentos de los mismos, oligonucleótidos , carbohidratos, lípidos o compuestos producidos al combinar estos grupos con o sin proteínas, etc.
La porción objetivo de tejido puede excluir, en una modalidad, los buscadores óseos, los liposomas y los anticuerpos conjugados a foliato o fragmentos de anticuerpo.
De manera alternativa, se pueden incluir estas porciones.
Las moléculas marcadas con torio (por ejemplo torio-227) de la invención se pueden usar para el tratamiento de enfermedades cancerosas o no cancerosas al seleccionar como objetivo receptores relacionados a la enfermedad. Típicamente, este uso médico de 227Th será por radioinmunoterapia en base al enlace de 227Th por un quelador a un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o a una construcción de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo para el tratamiento de enfermedades cancerosas o no cancerosas . El uso de 227Th en métodos y productos farmacéuticos de acuerdo a la presente invención es particularmente adecuado para el tratamiento de cualquier forma de cáncer incluyendo carcinomas, sarcomas, linfornas y leucemias, especialmente cáncer del pulmón, mama, próstata, vejiga, riñón, estómago, páncreas, esófago, cerebro, ovario, útero, cáncer oral, cáncer colorectal, melanoma, mieloma múltiple y linforna no de Hodgkin.
La cantidad de 2 3Ra liberada se puede disminuir si la molécula que tiene 227Th tiene una corta vida media de retención biológica in vivo debido a que el radionúclido se eliminará en su mayor parte antes de que una alta proporción del 22Th se ha descompuesto a 223Ra. Sin embargo, la cantidad de 227Th se necesitará incrementar a fin de permanecer terapéuticamente efectiva, de acuerdo a la presente invención. Si el agente complejante se selecciona para distribuir el 227Th en el interior de las células seleccionadas como objetivo, esto incrementará adicionalmente la citotoxicidad específica y reducirá el efecto tóxico sistémico de los hijos radioactivos debido a la retención al menos parcial de isótopo hijo al sitio tumoral . Ambas de estas características amplían la ventana terapéutica de 227Th y de esta manera forman modalidades preferidas de la invención.
En una modalidad adicional de la invención, se pueden tratar pacientes tanto con enfermedad esquelética como del tejido blando tanto por el 227Th como por el 223Ra, generados in vivo por el torio administrado. En este aspecto particularmente ventajoso, un componente terapéutico adicional al tratamiento se deriva de la cantidad aceptablemente no mielotóxica de 223Ra por la selección como objetivo de la enfermedad esquelética. En este método terapéutico, se utiliza típicamente 227Th para tratar cáncer primario y/o metastático al enlazarlo de forma adecuada al mismo y el 223Ra generado de la descomposición de 2 7Th se utiliza para tratar enfermedad esquelética relacionada en el mismo sujeto. Esta enfermedad esquelética puede ser metástasis al esqueleto que resulta de un cáncer primario de tejido blando, o puede ser enfermedad primaria donde el tratamiento de tejido blando va a contrarrestar un cáncer metastático. Ocasionalmente, las enfermedades de tejido blando y esqueléticas pueden no estar relacionadas (por ejemplo, el tratamiento adicional de una enfermedad esquelética en un paciente con una enfermedad reumatológica de tejido blando) .
Un aspecto clave de la presente invención, en todos los aspectos, es el uso de un ligando octadentado, particularmente un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona. Estos ligandos comprenderán típicamente al menos un grupo quelante de la siguiente estructura de piridina sustituida (I) : en donde Ri es un grupo N-sustituyente opcional y de esta manera puede estar ausente o se puede seleccionar de grupos hidrocarbilo, OH, O-hidrocarbilo, SH y S-hidrocarbi , donde cualquiera o cada porción hidrocarbilo se selecciona independientemente de grupos hidrocarbilos cortos tal como hidrocarbilo de 1 a 8 átomos de carbono, incluyendo grupos alquilo, alquenilo o alquinilo de 1 a 8 átomos de carbono, o puede ser un OH u O-hidrocarbilo. Ri también puede comprender una porción ligadora, como se indica más adelante y/o puede comprender una porción de acoplamiento también como se indica más adelante.
En la Fórmula I, los grupos R2 a R6 se pueden seleccionar cada uno independientemente de H, OH, =0, hidrocarbilo corto (como se describe en la presente) , una porción ligadora (como se describe en la presente) y/o una porción de acoplamiento (como se describe en la presente) . En general, al menos uno de los grupos Ri a R6 será OH. En general, al menos uno de los grupos R2 a R6 será =0. En general, al menos uno de los grupos Rx a R6 será una porción ligadora (como se describe en la presente) . De manera preferente, exactamente uno de los grupos R2 a R6 será =0. De manera preferente de forma exacta uno de los grupos Rx a R6 será OH. De manera exactamente preferente uno de los grupos Ri a R6 será una porción ligadora (como se describe en la presente) . Los grupos restantes Rx a R6 pueden ser cualquiera de estas porciones indicadas en la presente, pero son de manera preferente H. Donde una porción ligadora o cualquier ligador opcional, grupo quelante o plantilla unida a una porción ligadora no comprenda una porción de acoplamiento entonces uno de los grupos R6 es preferentemente una porción de acoplamiento (como se describe en la presente) .
En una modalidad preferida, uno de los grupos Ri a R6 será OH y uno de R2 a R6 será =0 y los grupos OH y =0 estarán en átomos vecinos del anillo. De esta manera, en una modalidad preferida, OH y =0 pueden estar en los átomos 1,2; 2,3; 3,2; 3,4; o 4,3 respectivamente (numeración desde el nitrógeno como se esperaría) . Los ligandos octadentados que tienen al menos una porción queladora donde están presentes grupos OH y =0 en las posiciones 3 y 2, respectivamente, son altamente preferidos. Los ligandos octadentados pueden tener 2, 3 o 4 de estos grupos queladores, donde es altamente preferido 2 o 4 de estos grupos .
Las porciones queladoras adecuadas se pueden formar por métodos conocidos en la técnica, que incluyen los métodos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 5,624,901 (por ejemplo, ejemplos 1 y 2) y WO2008/063721 (ambas incorporadas en la presente como referencia) .
Como se usa en la presente, el término "porción ligadora" (RL en la fórmula II) se usa para indicar una entidad química que sirve para unir al menos dos grupos queladores en los ligandos octadentados, que forman un componente clave en varios aspectos de la invención. Típicamente, cada grupo quelador (por ejemplo aquellos de la fórmula I anterior y/o fórmula II posterior) serán bidentados y de este modo cuatro grupos queladores, de los cuales al menos uno es de la fórmula I, estarán típicamente presentes en el ligando. Estos grupos queladores se unen entre sí por medio de sus porciones ligadoras . De esta manera, una porción ligadora (por ejemplo grupo RL posterior) se puede compartir entre más de un grupo quelador de la fórmula I y/o II. Las porciones ligadoras también pueden servir como el punto de unión entre el agente complejante del ligando octadentado y la porción dirigida a objetivo. En este caso, al menos una porción ligadora se unirá a una porción de acoplamiento (Rc) . Las porciones ligadoras adecuadas incluyen grupos hidrocarbilo cortos, tal como hidrocarbilo de 1 a 12 átomos de carbono, incluyendo grupo alquilo, alquenilo o alquinilo de 1 a 12 átomos de carbono, incluyendo grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y/o hexilo de todas las topologías.
Las porciones ligadoras también pueden ser o comprender cualquier otro enlace químico adecuadamente fuerte que incluyen grupos ésteres, éteres, amina y/o amida. El número total de átomos que se unen a las dos porciones queladoras (contando por la ruta más corta si existe más de una ruta) se limitarán en general, para restringir las porciones queladoras en un arreglo adecuado para formación de complejo. De esta manera, las porciones ligadoras se elegirán típicamente para proporcionar no más de 15 átomos entre las porciones ligadoras, de manera preferente, 1 a 12 átomos, y de manera más preferente 1 a 10 átomos entre las porciones ligadoras. Donde una porción ligadora se une a dos porciones queladoras directamente, el ligador será típicamente de 1 a 12 átomos de longitud, de manera preferente de 2 a 10 (tal como de etilo, propilo, n-butilo etc.) . Donde la porción ligadora se une a una plantilla central (ver más adelante) entonces cada ligador puede ser más corto con dos ligadores separados que unen las porciones queladoras. Una longitud del ligador de 1 a 8 átomos, de manera preferente de 1 a 6 átomos se puede preferir en este caso (metilo, etilo y propilo que son adecuados, como son grupos tal como aquellos que tienen un enlace éster, éter, o amida en un extremo o ambos) .
Además de la porción ligadora, que sirve principalmente para enlazar los varios grupos queladores de ligando octadentado entre sí y/o a una plantilla central, el octadentado comprende además de manera preferente una "porción de acoplamiento" (Rc) . La función de la porción de acoplamiento es enlazar el ligando octadentado a la porción dirigida a objetivo. Esto se puede lograr ya sea por unión covalente o no covalente (por ejemplo por un par específico de unión tal como biotina/avidina (estreptavidina) . De manera preferente, las porciones de acoplamiento se enlazarán covalentemente a los grupos queladores, ya sea por unión covalente directa a uno de los grupos queladores o más típicamente por unión a una porción ligadora o plantilla. Si se usan dos o más porciones de acoplamiento, cada una se puede unir a cualquiera de los sitios disponibles tal como cualquier plantilla, ligador o grupo quelador.
En una modalidad, la porción de acoplamiento puede tener la estructura: en donde R7 es una porción de formación de puente, que es un miembro seleccionado de alquilo sustituido o insustituido, heteroalquilo sustituido o insustituido, heterocicloalquilo sustituido o insustituido, arilo sustituido o insustituido y heteroarilo sustituido o insustituido; y X es una porción de selección objetivo o un grupo funcional reactivo. Las porciones preferidas de formación de puente incluyen todos aquellos grupos indicados en la presente como porciones ligadoras adecuadas. Las porciones preferidas de selección objetivo incluyen todas aquellas descritas en la presente y los grupos X reactivo preferidos incluyen cualquier grupo capaz de formar un enlace covalente una porción de selección objetivo, que incluye, por ejemplo, grupos COOH, OH, SH, NHR y COH, donde el R de NHR puede ser H o cualquiera de los grupos hidrocarbilo cortos descritos en la presente. Los grupos altamente preferidos para unión sobre la porción de selección objetivo incluyen épsilon-aminas de residuos de lisina y grupos tiol de residuos de cisteína. Los ejemplos no limitantes de grupos X reactivos adecuados, incluyen N-hidroxisuccimidilésteres , imidoésteres , acilhaluros, N-maleimidas, alfa-halo-acetilo e isotiocianatos , donde los tres últimos son adecuados para reacción con un grupo tiol.
La porción de acoplamiento se une de manera preferente, de modo que el ligando octadentado acoplado resultante será capaz de sufrir formación de complejos estables de iones metálicos. La porción de acoplamiento de esta manera se enlazará de manera preferente al ligador, plantilla, o porción queladora en un sitio que no interfiera de forma significativa con la formación de complejos. Este sitio estará preferentemente en el ligador o plantilla, de manera más preferente en una posición distante de la superficie que se une al objetivo.
Los grupos queladores preferidos incluyen aquellos de la fórmula II a continuación: En la fórmula II anterior, la porción =0 representa un grupo ceto unido a cualquier carbono del anillo de piridina, el -OH representa una porción hidroxi unida a cualquier carbono del anillo de piridina y el -RL representa una porción ligadora que se une a la porción de hidroxipiridinona a otras porciones complejantes para formar el ligando octadentado completo. Cualquier porciór ligadora descrita en la presente es adecuada como RL incluyendo grupos hidrocarbilo cortos, tal como hidrocarbilo de 1 a 8 átomos de carbono, incluyendo grupo alquilo, alquenilo o alquinilo de 1 a 8 átomos de carbono, incluyendo grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y/o hexilo de todas las topologías. RL pueden unirse al anillo de la fórmula II en cualquier átomo del anillo de piridina, tal como átomo de carbono o nitrógeno. Los grupos RL entonces pueden unirse a su vez directamente a otra porción quelante, a otro grupo ligador y/o a un átomo o grupo central, tal como un anillo u otra plantilla (como se describe en la presente) . Los ligadoras, grupos queladores y porciones de plantilla opcionales se seleccionan para formar un ligando octadentado apropiado.
En una modalidad preferida, las porciones -OH y =0 de la fórmula II residen en los átomos vecinos del anillo de piridina, tal que 1,2-; 2,3-, 3,2-; 4,3-; y 3,4-hidroxipiridinona son todos altamente adecuados .
Donde el grupo OH o la porción ligadora RL residen en el nitrógeno del anillo de piridina, en general está ausente el grupo RN. Sin embargo, donde está presente, RN puede ser cualquier porción adecuada incluyendo grupos hidrocarbilo sustituidos o insustituidos , particularmente los grupos hidrocarbilo cortos indicados en la presente.
En una modalidad preferida, al menos una porción de 3 , 2-hidroxipiridinona está presente en la estructura del ligando octadentado. Esta se puede sustituir evidentemente por cualquiera de las varias porciones sustituyentes indicadas en la presente.
Puesto que cada una de las porciones de la fórmula II tiene dos oxígenos potencialmente complej antes , una modalidad de la presente invención proporciona un ligando octadentado que comprende al menos 2, de manera preferente al menos 3 y de manera mucho más preferente 4 porciones independientemente elegidas de la fórmula I. Cada porción de fórmula II puede tener un patrón de sustitución independiente, pero en una modalidad preferida, al menos una porción es una porción de 3 , 2 -hidroxipiridinona . El ligando puede incluir 2, 3 o 4 porciones de 3 , 2 -hidroxipiridinona (sustituidas como se apropiado, como se describe en la presente) .
Cada porción de la fórmula I o II en el ligando octadentado se puede unir al resto del ligando por cualquier grupo ligador apropiado tal como se analiza en la presente y en cualquier topología apropiada. Por ejemplo, se pueden unir cuatro grupos de la fórmula I por sus grupos ligadores a una estructura para formar un ligando lineal, o se pueden poner en puente por grupos ligadores para formar un estructura tipo "oligómero" , que puede ser lineal o cíclica. De manera alternativa, las porciones de ligando de las fórmulas I y/o II se pueden unir en una topografía de "cruz" o "estrella" a un grupo o átomo central, cada uno por un ligador (por ejemplo, porción "RL" ) - Las porciones ligadoras (RL) pueden unirse únicamente a través de enlaces carbono-carbono, o puede unirse entre sí, a otros grupos queladores, a una estructura, plantilla, porción de acoplamiento u otro ligador por cualquier funcionalidad apropiadamente fuerte incluyendo un enlace de amina, amida, éster, éter, tio-éter o disulfuro.
Un arreglo "estelar" se indica en la fórmula III a continuación: En donde todos los grupos y posiciones son como se indican anteriormente y "T" es adicionalmente un átomo central o grupo plantilla, tal como por un átomo de carbono, cadena de hidrocarbi (tal como cualquiera de aquellos descritos anteriormente en la presente) , anillo alifático o aromático (incluyendo anillos heterocíclicos) o sistema de anillo fusionado. La plantilla más básica será un carbono individual, que entonces se unirá a cada de las porciones queladoras por sus grupos de enlace. Las cadenas más largas, tal como etilo o propilo son igualmente viables con dos porciones queladoras que se unen a cada extremo de . la plantilla. De forma evidente, cualquier enlace adecuadamente fuerte se puede usar al unir la plantilla y porciones ligadoras incluyendo enlaces carbono-carbono, enlaces de éster, éter, amina, amida, tio-éter o disulfuro.
En la estructura de la fórmula III, los grupos RN y RL pueden ser los mismos tal que las porciones queladoras se unan a la plantilla T a través del átomo de nitrógeno del anillo de piridina. Esto proporciona estructuras del tipo Illb a continuación: Evidentemente, en las estructuras de la fórmula II III, Illb, IV e IVb, estas posiciones de los anillos de piridina que de otro modo no están sustituidas (por ejemplo, por una porción ligadora o de acoplamiento) pueden tener sustituyentes descritos para Rx a R5 en la fórmula I, como sea apropiado. En particular, pueden estar presentes pequeños sustituyentes de alquilo, tal como grupos metilo, etilo o propilo en cualquier posición.
El ligando octadentado comprenderá de manera en general adicional al menos una porción de acoplamiento como se describe anteriormente. Esta puede ser cualquier estructura adecuada, incluyendo cualquiera de aquellas indicadas en la presente y terminará con la porción objetivo, un aglutinante específico o un grupo funcional capaz de enlazar esta porción objetivo o aglutinante específico .
La porción de acoplamiento puede unirse a cualquier punto adecuado del ligador, plantilla o porción queladora, tal como los puntos a) , b) y/o c) como se indica en la fórmula III. La unión de la porción de acoplamiento puede ser por cualquier enlace adecuadamente fuerte tal como enlaces carbono-carbono, enlaces de éster, éter, amina, amida, tio-éter o disulfuro. De manera similar, los grupos capaces de formar cualquier de estos enlaces a la porción de selección a objetivo son adecuados para el extremo funcional de la porción de acoplamiento y esa porción terminarán con estos grupos cuando se una a la porción de selección a objetivo.
Una estructura alternativa tipo "cadena principal" se indica a continuación en la Fórmula IV En donde todos los grupos y posiciones son como se indican anteriormente y "RB" es adicionalmente una porción de cadena principal, que típicamente será de estructura similar y función similar a cualquiera de las porciones ligadoras indicadas en la presente, y de esta manera, cualquier definición de una porción ligadora puede tomarse para aplicarse a la porción y cadena principal donde lo permita el contexto. Las porciones de estructura elemental adecuadas formarán un núcleo molecular en el cual se unen las porciones queladoras por medio de sus grupos ligadores.
Usualmente, tres o cuatro porciones de cadena principal.
Típicamente, esto será tres para una cadena principal lineal o cuatro si está en ciclo la cadena principal. Las porciones de cadena principal particularmente preferidas incluyen cadenas de hidrocarburos cortos (tal como aquellas descritas en la presente) que tienen opcionalmente un heteroátomo o porción funcional en uno o ambos extremos. Los grupos amina y amida son particularmente adecuados a este respecto .
La porción de acoplamiento puede unirse a cualquier punto adecuado del ligador, cadena principal o porción queladora, tal como en los puntos a), b) y/o C) como se indica en la fórmula IV. La unión de la porción de acoplamiento puede ser por cualquier enlace adecuadamente fuerte tal como enlaces carbono- carbono , enlaces de éster, éter, amina, amida, tio-éter o disulfuro. De manera similar, los grupos capaces de formar cualquier de estos enlaces a la porción objetivo son adecuados para el extremo funcional de la porción de acoplamiento y esa porción terminarán con estos grupos cuando se una a la parte de selección a objetivo.
Como con la Fórmula III, en la estructura de la fórmula IV los grupos RN y RL pueden ser los mismos tal que las porciones queladoras se unen a la cadena principal RB a través del átomo de nitrógeno del anillo de piridina. Esto proporciona estructuras del tipo IVb a continuación: Un ejemplo de un ligando octadentado tipo "cadena principal" que tiene dos porciones queladoras de 1, 2 y dos de 3,2-HOPO unidas a una cadena principal por grupos ligadores de amida será la fórmula V como sigue: Los ligandos octadentados "en plantilla" de ejemplo, cada uno que tiene cuatro porciones queladoras de 3,2-HOPO enlazadas por grupos etil-amida a etil- y propil-diamina, respectivamente, serán las fórmulas VI y VII, como sigue : VI VII Se señalará que en las fórmulas anteriores, los nitrógenos libres de las porciones de 3, 2 -HOPO se sustituyen con grupos metilo y los pequeños grupos de hidrocarbilo tal como metilo o etilo son preferibles en esta posición (Ri en la Fórmula I o RN en la fórmula II) .
Un ligando octadentado "en plantilla" de ejemplo, que tiene cuatro porciones queladoras de 3,2-HOPO enlazadas por el nitrógeno en el anillo de HOPO al amina-ciclano será de fórmula VIII como sigue: VIII Como se indica anteriormente, el ligando octadentado incluirá típicamente una porción de acoplamiento que pueden unirse al resto del ligando en cualquier punto. Un compuesto de ejemplo con una porción funcionalizada que termine en la porción de acoplamiento, de acuerdo con esta modalidad, es la estructura IX a continuación: Todos los documentos referidos en la presente se incorporan de este modo como referencia, incluyendo Gordon AEV et al, Rational design of sequestering agents for plutonium and ot er actinides. Chem. Rev. 2003, 103, 4207-4282, PCT Patent Application O 2008/063721 A2 y T.N. Lambert et al., Tetrahedron Letters 43 (2002) 7379-7383.
La invención ahora se ilustrará por los siguientes ejemplos no limitantes. Todos los compuestos ejemplificados en los ejemplos forman modalidades preferidas de la invención (incluyendo compuesto intermedios y precursores preferidos) y se pueden usar de manera individual o en cualquier combinación en cualquier aspecto donde los permita el contexto. De esta manera, por ejemplo, cada uno y todos los compuestos 2 a 4 del Ejemplo 2, compuesto 10 del ejemplo 3 y compuesto 7 del Ejemplo 4 forman modalidades preferidas de sus varios tipos.
Ejemplo 1- Aislamiento de torio-227 Puro Se aisla Torio-227 a partir de fuente de actinio-227. Se produjo actinio-227 a través de irradiación de neutrones térmicos de radio-226 seguido por la descomposición de Radio-227 (tl/2 = 42.2 m) a actinio-227. Se retuvo selectivamente el Torio-227 de una mezcla de composición de actinio-227 en solución 8 M de HN03 por cromatografía de intercambio aniónico. Se usa una columna de 2 mm de diámetro interno, 30 mm de longitud, que contiene 70 mg de resina AGMR 1-X8 (malla 200-400, forma de nitrato) . Después del actinio-227, el radio-223 e hijos se eluyeron de la columna, se extrajo el torio-227 de la columna con HC1 12 M. El producto eluido que contiene Torio-227 se evaporó a sequedad y el residuo se suspendió en HC1 0.01 M .
?? Se adicionaron 3-benciloxi-l-metil-4- (2-tioxotiazolidin-l-il) carbonil-2 (1H) -piridinona (sintetizado de acuerdo a Raymond, K. ; Xu, J. , US 5,624,901) (2.22 mmol, 0.8 g) , trietilamina (0.31 mi, 2.22 mmol) y DMAP (5 mg) a una solución de éster ter-butílico del ácido [5-amino-6- ( (2-amino-etil) - {2- [bis- (2-amino-etil) -amino] etil} -amino) -hexil] -carbámico (BocLys-H (2.2) amina) (sintetizada de acuerdo a Raymond, K. ; Corneillie, ?.?; . Xu. J. WO 2008/063721 A2) (0.204 g, 0.505 mmol) en diclore-metano (80 mL) . Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano y se cargó sobre una columna instantánea de gel de sílice y se eluyó con un gradiente de metanol al 2-8 % en diclorometano. Las fracciones apropiadas se recolectaron y evaporaron a sequedad para dar ALG-001 (1) (~0,4 g) como un aceite espeso color beige pálido.
MS (ESI, pos): m/z 1369 [M+H]+, m/z 1391 [M+Na] + Se disolvió ALG-001 (1) (280 mg, 0.205 mmol) en ácido acético glacial (20 mL) , se adicionó Pd (OH)2 al 20 % y catalizador en carbón (60 mg) , y la mezcla se hidrogenó bajo 40-45 lb/pulg2 (2.81-3.16 kg/cm2) a temperatura ambiente durante la noche. La filtración se siguió por evaporación giratoria para dar ALG-DEBN (2) (-260 mg, con trazas de ácido acético) como aceite espeso color rojo vino.
MS (ESI, pos): m/z 1007 [M+H]+, m/z 1029 [M+Na] + Se disolvió ALG-DEBN (2) (70 mg) en MeOH/diclorometano 2:1 (15 mL) a temperatura ambiente. Luego se adicionaron 0.5 g de resina Amberlyst-15 limpiada, y la mezcla se agitó suavemente durante la noche. La resina entonces se separó por filtración y se lavó con hexano (10 mL) , tetrahidrofurano (10 mL) y metanol (10 mL) , sucesivamente. Esta resina unida a amina se transfirió a solución metanólica de amoníaco 4M (20 mL) y se agitó suavemente durante 50 minutos. Se adicionó tetrahidrofurano (10 mL) , para disolver todo el producto desprotegido. La resina entonces se removió por filtración, y la solución se evaporó, produciendo ALG-DEBN-DEBOC (3) (37 mg) .
MS (ESI, pos): /z 909 [M+H]+, m/z 931 [M+Na] + Una suspensión de 40 mg de ALG-DEBN-DEBOC (3) en isopropanol-agua 6:1 (v/v, 7 mL) se hizo reaccionar con una solución de 1, 4-fenilendiisotiocianato (4.1 equiv. ) en cloroformo (2.5 mL) . Los reactivos se agitaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego se retiró una muestra para análisis por MS . Se observaron picos que corresponden a la masa esperada (1100) . Se aislaron aproximadamente 95 mg de un sólido café claro después de la remoción de los volátiles bajo vacío. El sólido café claro se suspendió en acetonitrilo, y la mezcla se calentó bajo reflujo durante 15 min. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente, seguido por aislamiento de 26 mg de ALG-DD-NCS (4) como sólido café por filtración.
Ejemplo 3 - Síntesis de Quelador que Contiene 3, 2 -HOPO Simétrico .
Se cargó hidruro de sodio (60.1 g, como dispersión al 60 % en aceite mineral, 1.5 mol, 5 eq.) en un matraz y se adicionó tetra idrofurano (1L) . Se adicionó gota a gota dimetil-malonato (172 mL, 1.5 mol, 5 eq) durante 1.5 h, la temperatura de la mezcla de reacción se mantuvo por abajo de + 10 °C. La mezcla de reacción entonces se diluyó con tetrahidrofurano (400 mL) . Se adicionó lentamente una solución de bromuro de 4 -nitrobencilo (65.0 g, 0.3 mol, 1 equiv.) en tetrahidrofurano (170 mL) durante 30 minutos a la mezcla preparada anteriormente bajo agitación vigorosa. Después de 30 minutos de agitación a 0°C, la mezcla de reacción se vertió en salmuera (solución saturada de NaCl de 1L) y se dejó agitando durante la noche a temperatura ambiente, produciendo un precipitado blanco. La mezcla entonces se diluyó éter ter-butílico de metilo, y el precipitado se filtró y disolvió en etanol caliente. La mezcla etanólica se filtró, y el filtrado se concentró a un volumen pequeño, del cual precipitaron 24.8 g (31 %) de (4-nitrobencil) propanodioato de dimetilo (1) como un sólido cristalino blanco.
Purera por LC:>90 % (254 nm) MS (APCI pos) m/z 285.1 [M+NHJ + El compuesto 1 (24.8 g, 92.7 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano (230 mL) y se adicionó el complejo de borano-sulfuro de dimetilo (28.5 mL, 301 mmoles, 3.3 eq. ) . La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 24 h, y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante la noche. Se adicionó metanol (250 mL) a 0°C, se vertió en salmuera (600 mL) y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2S04 y se concentraron in vacuo. El residuo se co-evaporó con metanol. El producto crudo se purificó por cromatografía instantánea, dando 14.5 g (74 %) de 2- (4-nitrobencil) propano-1, 3-diol (2) como un aceite amarillo.
Pureza por LC: >92 % (254 nm) El compuesto 2 (10.0 g, 47.3 mmol) se disolvió en diclorometano (100 mL) y se adicionó trietilamina (14.5 mL, 104 mmol, 2 eq. ) . La mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo y en porciones de adicionó cloruro de metanosulfonilo (8.0 mL, 104 mmol, 2 eq.). La mezcla final se dejó alcanzar a temperatura ambiente durante la noche.
Entonces se adicionaron trietilamina adicional (1.5 mL) y cloruro de metanosulfonilo (0.8 mL) , y la agitación se continuó durante 30 min. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano, y el precipitado formado se filtró completamente. El filtrado de diclorometano se lavó con solución acuosa saturada de NaHC03; HCl acuoso 0.5 M y salmuera, se secó sobre Na2S04 y se concentró in vacuo, dando 14.5 g (83 %) de 2 - (4 -nitrobencil) propano-1 , 3 -diilo dimetano-sulfonato (3) como un aceite naranja, que se uso en el siguiente paso sin purificación adicional.
Pureza por LC:>87 % (254 nm) MS (APCI pos) m/z 385.3 [M+NH4] + El compuesto 3 (14.5 g, 39.5 mmol) se disolvió en metil-etil-cetona (100 mL) , se adicionó yoduro de sodio (16.0 g, 107 mmol, 2.7 eq.), y la mezcla se calentó a 95°C durante 1 h. El precipitado blanco resultante se filtró completamente y se lavó con metil-etil-cetona, y el filtrado se concentró in vacuo. El producto crudo se trituró de éter ter-butílico de metilo y purificó por cromatografía instantánea, dando 10.6 g (63 %) de 1- [3-yodo-2- (yodometil) -propil] -4-nitrobenceno (4) como un sólido amarillo.
Pureza por LC:>90 % (254 nm) MS (APCI pos) m/z 4310.1 [M+H] + Se disolvieron dietileno- riamina (10.8 mL, 100 mmol) y trietilamina (42 mL, 300 mmol, 3 eq. ) en tetrahidrofurano (500 mL) y se enfrió en baño de hielo. Entonces se adicionó una solución de Boc-ON (49.5 g, 200 mraol, 2 eq. ) en tetrahidrofurano (190 mL) gota a gota durante 2.5 h. La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 1 hora adicional, antes de que se dejara alcanzar a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción entonces se concentró in vacuo. El residuo se disolvió en diclorometano y se lavó con NaOH acuoso 1 M. La fase orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró in vacuo. El material crudo se purificó por cromatografía instantánea, dando 20.0 g (66 ) de (iminodietano-2, 1-diilo) biscarbamato de di- ter-butilo (5) como un aceite viscoso amarillo.
MS (APCI pos) m/z 304.3 [M+H] + Se disolvió el compuesto 5 (26.0 g, 86 mmol, 4 eq.) en tolueno seco (40 mL) y se adicionó ¿V-etil-morfolina (5.4 mL, 42 mmol, 2 eq.). El compuesto 4 (9.2 g, 21 mmol) se disolvió en tolueno seco (35 mL) y se adicionó a la mezcla de reacción. La mezcla se incubó en un reactor a presión a 105°C durante 5 días. La mezcla de reacción entonces se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo y se lavó con solución acuosa saturada de NaHC03. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2S04 y se concentraron in vacuo. El producto crudo se purificó por cromatografía instantánea, dando 11.4 g (70 %) del compuesto 6 como una espuma amarilla sólida.
Pureza por LC:>96 % (210 nm) MS (APCI pos) m/z 782.8, [M+H]+; 682.7 [M+H-Boc] +; 582.6 [M+H-2Boc]+; 382.1 [M+H-4BOC] + El compuesto 6 (2.0 g, 2.6 mmol) se disolvió en dioxano (16 mL) , y se adicionó una solución 9 M de HC1 en dioxano (22 mL) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y luego se concentró a sequedad in vacuo, dando 1.9 g de la sal de HC1 del compuesto 7 como un sólido beige.
MS (APCI pos) /z 382.5 [M+H] + Se adicionó el compuesto 7 (1.9 g, 2.6 mmol) a DMPU (1, 3 -dimetil-3 , 4 , 5, 6-tetrahidro-2 (1H) -pirimidinona) (9.5 mL) y 3- (benciloxi) -l-metil-4 [ (2-tioxo-l, 3 -tiazolidin-3 -il) carbonil] piridina-2- (1H) -ona (3.7 g, 10.3 mmol, 4 eq.). Una solución de DBU (2.3 mL, 15.5 mmol, 6 eq.) en DMPU (4.7 mL) entonces se adicionó lentamente durante 40 minutos. Se continuó la agitación durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con solución acuosa saturada de NaHC03. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua y salmuera semi-saturada, luego se secaron sobre Na2S04 y concentraron in vacuo. El producto crudo se purificó por cromatografía instantánea para obtener 4.0 g del compuesto 8 como aceite amarillo que se uso en el siguiente paso sin purificación adicional.
MS (APCI pos) m/z 1347.7 [M+H] + El compuesto 8 (4.0 g, 2.6 mmol) se disolvió en ácido acético (200 mL) y se adicionó Pd(OH)2 (20 % p/p en C, 50 % humectado) (800 mg, 10 % p/p) . La mezcla de reacción se agitó en un reactor a presión Parr a 30 bar de presión de hidrógeno a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción entonces se filtró a través de una almohadilla de CelitaMR, y el filtrado se concentró in vacuo. El producto bruto se purificó por cromatografía instantánea, dando el compuesto 9 como un sólido espumoso beige .
El compuesto 9 (996 mg) se disolvió en ácido acético (5.5 mL) , seguido por la adición de HCl 6 M acuoso (2.5 mL) y Pd al 5 %/C (99 mg, 10 % p/p). La mezcla de reacción se agitó en un reactor a presión a 8 bar de presión de hidrógeno durante la noche, y luego se filtró a través de una almohadilla de CelitaMR. El precipitado se concentró in vacuo y se co-evaporó con tolueno y metanol. El residuo se disolvió en metanol y se precipitó por la adición de éter dietílico. El precipitado beige formado se filtró y secó in vacuo durante la noche, produciendo 700 mg de la sal de HCl del compuesto 10, ALG1005-38.
MS (APCI pos) m/z 956.7 [M+H] + ?? Se adicionó anhídrido de Boc (24.4 g, 119 mmol) en porciones a una solución de imidazol (8.0 g, 117 mmol) en 50 mL de diclorometano a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante una hora. La mezcla de reacción se lavó dos veces con agua 50 mL, se secó sobre Na2S04, se filtró y redujo in vacuo. El residuo se disolvió en 20 mL de tolueno y se adicionó tris (2 -aminoetil) amina (8.19 g, 56 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 60 °C y se redujo in vacuo. El residuo se disolvió en 125 mL de diclorometano y se lavó con agua (4 veces con 50 mL) , se secó sobre Na2S04/ se filtró y se redujo in vacuo. La cromatografía instantánea seca (metanol al 0-15 % en diclorometano con trietilamina al 1 %) produjo ( ( (2-aminoetil) azanediil) bis (etano-2 , 1-diilo) ) dicarbamato de di-ter-butilo (1) (13.51 g, 39.0 mmol, 70 %) como un aceite incoloro espeso.
Los datos espectroscópicos fueron de acuerdo con los datos reportados por Frullano et al. (Chem. Eur. J. 2004, 10, 5205-17) .
Se disolvieron N-Cbz-p-alanina (8.04 g, 36 mmol), 4- (dimetilamino) piridina (4.40g, 36 mmol) y EDC-HC1 (6.90g, 36 mmol) en 25mL de tetrahidrofurano y se agitaron durante 10 minutos antes de que se adicionara el Compuesto 1 (10.4 g, 30 mmol) disuelto en 75mL de tetrahidrofurano . La mezcla de reacción se agitó durante 4 horas y se redujo in vacuo. La purificación por cromatografía instantánea seca (tetrahidrofurano al 0 - 40% en diclorometano) produjo (((2- (3- (Cbz-amino) propanamido) etil) azanodiil) bis (etano-2 , 1-diil) dicarbamato di-ter-butilo (2) (15.11 g, 27.4mmol, 91%) como un aceite ligeramente amarillo muy viscoso.
RMN-Hí (300MHz, CDCl3) : 1.43 (s, 18H) , 2.42-2.56 (m, 8H) , 3.04-3.17 (m, 4H) , 3.19-3.32 (m, 2H) , 3.41-3.57 (m, 2H) , 5.08 (s, 2H), 5.22 (bs, 2H) , 5.83 (bs, 1 H) , 7.23 (bs, 1 H) , 7.26-7.43 (m, 5H) MS (ESI, pos): m/z 574.3 [M+Na] + Se disolvió ( ( (2- (3- (Cbz-amino) ropanamido) -etil) azanediil) bis (etano-2 , 1-diil) dicarbamato de di-ter-butilo (10.30 g, 18.7 mmol) en lOOmL de metanol y se adicionó gota a gota cloruro de acetilo (25mL, 0.35 mol) . La mezcla de reacción se agitó durante una hora a temperatura ambiente . La mezcla de reacción se redujo a aproximadamente 3 de volumen in vacuo antes de que se adicionaron lOOmL de éter, conduciendo a precipitación de un sólido incoloro. Los sólidos se filtraron, se lavaron con éter y se secaron in vacuo, dando tri-clorhidrato de (3- ( (2- (bis (2-aminoetil) amino) etil) amino) -3 -oxpropil) carbamato de bencilo (3) (8.70 g, 18.7 mmol, -100%) como un sólido incoloro.
RMN-1H (300MHz, MeOD) : 3.19-3.28 (m, 2H) , 3.38-3.62 (m, 14H) , 5.10 (s, 2H) , 7.26-7.39 (m, 5H) MS (ESI, pos): m/z 352.2 [M+H] + Se adicionó trietilamina (6.75mL, 48.4 mmol) a una suspensión del Compuesto 3 (10.56 g, 11.4 mmol) en 320mL de tetrahidrofurano y 320mL de N, N-dimetilformamida a temperatura ambiente. Se adicionó N-boc-2 -aminoacetaldehído (16. Og, 100.5 mmol) y triacetoxiborohidruro de sodio (32.00 g, 151 mmol) . La mezcla de reacción se agitó durante 20 horas. Se adicionaron 200mL de salmuera y 500mL de cloroformo, las fases se separaron, y la fase acuosa se extrajo con 3 x lOOmL de cloroformo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con lOOmL de salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y redujo in vacuo. La cromatografía instantánea (metano al 0 - 10% en diclorometano) produjo ( ( ( ( (2-3-Cbz-aminopropanamido) etil) -azanodiil) bis (etano-2 , 1-diil) ) bis (azanetriil) tetrakis (etano-2 , 1-diil) tetracarbamato de tetra-ter-butilo (4) (3.40 g, 3.7 mmol, 32%) como un sólido amarillo.
MS (ESI, pos): m/z 946.7 [M+Na] + El Compuesto 4 (3.40 g, 3.7 mmol) se disolvió en 60mL de metanol y se adicionó gota a gota cloruro de acetilo (12mL, 0.17 mol) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora. La mezcla se redujo a aproximadamente lOmL in vacuo y se adicionaron 50mL de acetonitrilo, conduciendo a precipitación. El sólido se filtró, se lavó con acetonitrilo y se secó in vacuo, dando hepta-clorhidrato de (3- ( (2- (bis (2-aminoetil) amino) -etil) amino) etil) amino) -3-oxopropil) carbamato de bencilo (5) (2.88 g, 3.7 mmol, -100%) como un sólido incoloro .
RM -^ (300MHz, MeOD) : 2.44-2.61 (m, 2H) , 2.68-3.00(m, 4H) , 3.08-3.40(m, 16H) , 3.44-3.52(m, 4H) , 3.54-3.77(m, 6H) , 5.12(s, 2H) , 7.30-7.47(m, 5H) MS (ESI, pos): m/z 524.5 [M+H] + Se adicionaron trietilamina (2.52mL, 18.1 mmol) y 4- (dimetilamino) iridina (12 mg, cat . ) a una suspensión del Compuesto 5 (0.81 g, 1.04 mmol) y 3- (benciloxi) -l-metil-4- (2-tioxothiazolidina-3 -carbonil) iridina-2 (1H) -ona (1.50g, 4.16 mmol) en 180mL de Diclorometano . La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se redujo in vacuo. La cromatografía instantánea (metanol al 0 - 10% en diclorometano) produjo (1-(3- (benciloxi) -l-metil-2-oxo-l, 2-dihidropiridin-4-il) -5- (2-(3- (benciloxi) -l-metil-2-oxo-l, 2-dihidropiridina-4-carboxamido) etil) -8- (2- (bis (2- (3- (benciloxi) -l-metil-2-???-1, 2-dihidropiridina-4 -carboxamido) etil) amino) etil) -1, 12-dioxo-2 , 5 , 8 , 11-tetraazatetradecan-14-il) carbamato de bencilo (6) (673 mg, 0.45 mmol, 43 %) como un sólido café claro.
RMN-H. (300MHz, CDC13) : 2.10-2.40 (m, 20H) , 3.02-3.21 (m, 10H) , 3.32-3.46 (m, 2H) , 3.50(s, 12H) , 4.99(s, 2H) , 5.25(s, 8H) , 5.95(bS, 1 H) , 6.62(d, 7.17Hz, 4H) , 7.01 (d, 7.17Hz, 4H) , 7.15-7.40(m, 25H) , 7.89(bs, 4H) RMN-13C (75MHz, CDC13): 11.48, 35.71, 37.18, 37.35, 37.50, 37.66, 46.18, 51.55, 52.15, 52.82, 53.28, 66.34, 74.64, 74.75, 77.43, 104.63, 127.90, 127.94, 128.40, 128.65, 128.75, 128.94, 130.81, 132.32, 136.27, 136.76, 146.19, 156.45, 159.51, 163.30, 171.31 MS (ESI, pos): m/z 766.9 [M+2Na] 2+ El Compuesto 6 se disolvió y se desbenciló esencialmente como se describe en el Ejemplo 2, produciendo Bb-l-HOPO-l-DEBN (7) .
Ejemplo 5.- Experimentos de quelación con ALG-DD-NCS Se preparó una solución de reacción al disolver ALG-DD-NCS sólido (4 en el Ejemplo 2) en DMSO (Biotech grado solvente 99.8%) a 1 mg/mL. Se llevaron a cabo reacciones de quelación con diferentes metales al mezclar la solución de reacción de 1 mg/mL con soluciones seleccionadas de metales, usando una relación de ligando a metal de 3:2. Los iones metálicos para prueba que vienen de lo siguiente: solución de 232Th en HN03 al 2% (Perkin Elmer Puré Plus) , solución de Fe3+ en HNO3 al 2% (Perkin Elmer Puré Plus) , y lnCl3 (polvo anhidro 99.999+ %, Aldrich) se disolvieron en HC1 0.01 M. Los reactivos se dejaron reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente, antes de inyectar 5 L de la mezcla de reacción en un LC-MS para análisis.
Los resultados mostraron que los complejos de metal-ALG-DD-NCS se formaron de manera cuantitativa para los metales 232Th4+, Fe3+ y ln3+. Los cromatogramas de LC-MS y los espectros de los complejos 232Th-ALG-DD-NCS, Fe-ALG-DD-NCS y In-ALG-DD-NCS se muestran en las Figuras 1-6.
Las condiciones de LC-MS fueron como sigue: se realizó la separación en una columna Acquity UPLC BEH C18 columna de 1.7 µt?, de 2.1 x 50 mm, a 50 °C, usando ácido fórmico al 0.05% en H20 como fase móvil A y ácido fórmico al 0.05% en acetonitrilo como fase móvil B. La composición gradiente y el flujo se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3 Se realizó el análisis espectroscópico de masa en un instrumento Xevo-ToF-1, usando un intervalo másico de adquisición de ~. 450-1950 Da, una molaridad ES+ , una capilaridad de 3.0 kV, explorando sobre 1.000 segundos con un voltaje de cono de 20 V.
Ejemplo 6 - Experimentos de quelación con ALG1005-38 Se preparó una solución concentrada al disolver ALG 1005-38 (10 en Ejemplo 3) en MeOH (grado LC-MS) a 10 mg/mL. La solución concentradas a 10 mg/mL se diluyó con MeOH y amortiguador de NaOAc 0.5 M (pH 5.5) en proporciones de 1:8:1, para obtener 1 mg/mL de solución de reacción de ALG 1005-38. Se llevaron a cabo reacciones de quelación con diferentes metales al mezclar la solución de reacción de 1 mg/mL con los metales seleccionados, como se especifica en el Ejemplo 5 y además GaCl3 (cuentas anhidras 99.99%, Aldrich) disuelto en HC1 0.01 M, dando relaciones del ligando a metal de 3:1 a 1:2. Los reactivos se dejaron reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, la mezcla de reacción se diluyeron 10 veces con ácido fórmico (0.1%) antes de inyectar 5 pL en un LC-MS para análisis. El análisis de separación por LC-MS se realizó como se describe en el Ejemplo 5, excepto que el voltaje de cono fue de 35 V.
Los resultados mostraron que los complejos metal-ALG 1005-38 se formaron en cantidades significativas para metales tal como 232Th4+, Fe3+, ln3+ y Ga3+. Los espectros y cromatogramas LC-MS de los complejos 232Th-ALG 1005-38, Fe-ALG 1005-38, in-ALG 1005-38 y Ga-ALG 1005-38 se muestran en las Figuras 7-14.
Ejemplo 7 - Experimento de quelación con Bb-l-HOPO-l-DEBN Se preparó una solución concentrada al disolver Bb-l-HOPO-l-DEBN (producido en el Ejemplo 4) en DMSO (Biotech grado solvente 99.8%) a 1 mg/mL. Se llevó a cabo un experimento de quelación al mezclar la solución a 1 mg/mL con 232Th en HCl 0.01 M (Perkin Elmer) como se específica en el Ejemplo 5. El análisis de separación por LC-MS se realizó como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados mostraron que el complejo 232Th-Bb-l-HOPO-l-DEBN esperado se formó rápidamente, Figuras 15 y 16.
Ejemplo 8.- Conjugación de ALG-DD-NCS a trastuzumab, marcación del conjugado con torio-227, y confirmación de unión retenida a objetivo Conj gación Se usó un grado farmacéutico del anticuerpo monoclonal trastuzumab (HerceptinMR, Roche) . El anticuerpo se intercambió con un amortiguador en NaCl al 0.9% a una concentración de 6.3 mg/mL. Se preparó una solución concentrada de ALG-DD-NCS en DMSO, que contiene 1 mg/mL (sin tomar en cuenta las impurezas) . La solución concentrada de DMSO se adicionó a la solución anticuerpo que corresponde a una relación molar de quelador a anticuerpo de 6.5:1, o menos. Se adicionó una solución de bórax 0.07 M a la solución de reacción para dar pH 9 después de la incubación a 37 °C durante la noche. El conjugado resultante se purificó e intercambió con amortiguador en una unidad filtros centrífuga Amicon Ultra-4 (30k MWCO) . Alícuotas de 1 mg en 100 de NaCl al 0.9% se congelaron y almacenaron a -18°C hasta el uso.
Marcación Se adicionaron 100 L de amortiguador de NaOAc 0.5 M (pH 5.5) a un frasco de 1 mg de conjugado de ALG-DD-NCS-trastuzumab para obtener un pH adecuado para la marcación. Esta solución se mezcló con 4.2-16.4 MBq 227Th en HCld 0.01 M, y el pH se verificó con papel pH. La tapa del tubo Eppendorf se enrolló en hoja de aluminio y el tubo se colocó en un termomezclador a temperatura ambiente durante 15 minutos con mezclado suave.
El tubo se incubó adicionalmente a temperatura ambiente durante 5 minutos después de adicionar 10 L de DTPA saturado en MF-H20, se propuso capturar el torio-227 libre restante. El resultado se purificó en una columna NAP-45 usando PBS para eluir el conjugado de ALG-DD-NCS-trastuzumab marcado, dejando la mayoría de radionúclidos libres (torio-227 y núclidos hijo) y quelato de DTPA-torio en la columna.
La columna y las fracciones eluidas se midieron en un detector HPGe GEM(15) para determinar los rendimientos de reacción y la actividad específica del compuesto. La fracción del producto se filtró estéril y se almacenó a 4°C durante la noche .
Antes del uso se realizó una segunda purificación en columna NAP-5 de la fracción del producto.
Determinación de la fracción inmunorreactiva Se cultivaron células SK-OV-3 (ATCC) bajo condiciones normales. Se prepararon células SK-OV-3 fijas y se examinaron por citometría de flujo antes del uso para confirmar la presencia de HER2 en la superficie (datos no mostrados). Se preparó medio regular con medio McCoy's 5A (GIBCO) adicionado con FBS al 10% (PAA) y Pen/Strep (BioChrom) . Se realizó la incubación de las células en un incubador de C02 a 37°C y C02 al 5% usando matraces celulares T25 (25 cm2) y T75 (75 cm2) .
Se realizó cada experimento en duplicado. Células SK-OV-3 fijas se suspendieron en PBS y se transfirieron a tubos Eppendorf (10 millones de células/tubo) . Se adicionó trastuzumab no conjugado (HerceptinaMR, 10 \iL de la solución concentrada) a los dos tubos de referencia, y la reacción de bloqueo se llevó a cabo a 37°C durante 30 minutos. Se adicionaron cantidades iguales de 227Th-ALG-DD-NCS- trastuzumab (ca 500 cpm) a cada tubo, seguido por incubación a 37°C durante 2.5 horas. Las muestras se diluyeron con PBS, seguido por centrifugación y transferencia de la mitad del sobrenadante a nuevos tubos Eppendorf . Todos los tubos se midieron durante 5 minutos en un contador gamma Wizard y la cantidad de torio-227 se determinó al aplicar un protocolo para 227Th.
La unión en % se calculó como: 100* [ (P+¾S) (½S) ] / [ (P+¾S) + (¾S)] , donde P y S son las actividades medidas en el sedimento celular y en el sobrenadante, respectivamente. El cálculo se realizó en las muestras no bloqueadas para obtener la unión total (%) y las muestras bloqueadas para obtener la unión no específica (%) , y se calcula el IRF como: IRF (%) = unión total (%) - unión no específica (%) .
Los datos de este control de calidad, resumidos en la Tabla 4, muestran que 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab se une a las células objetivo o diana.
Tabla 4: Resultados para control de calidad realizados en lotes A y B de Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab, subsiguientemente usados en Ejemplos 9 y 10 respectivamente i. Rendimiento (%) se calcula después de la purificación de NAP-5 de la mezcla de reacción. ii. la recuperación (%) se calcula después de una nueva purificación de NAP-5 de la fracción de producto. iii. Se calcula la actividad específica (Bq/ g) usando la cantidad de 227T (Bq) encontrada en la fracción de producto dividida por la cantidad de ALG-DD-NCS-trastuzumab ( g) usada en la mezcla de reacción. iv. IRF se estima de acuerdo a procedimientos normales .
Ejemplo 9 - Estudios de Estabilidad y eficiencia in vitro de ALG-DD-NCS-trastuzumab marcado con torio-227 Valoración de unión con el paso del tiempo Se evalúo la estabilidad de la unión a células SK-OV-3 para la construcción 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab al medir la cantidad de actividad de 227Th asociada a sedimentos de células SK-OV-3 durante 7 días. Los resultados se compararon a datos obtenidos después de la incubación con 227Th libre.
Se cultivaron células SK-OV-3 como se describe en el Ejemplo 8 y se trataron inicialmente con 700 kBq de 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab o 700 kBq de 2 7Th libre, dando por resultado respectivamente 77 kBq (11%) y 7 kBq (1%) de actividad 227Th en el sedimento celular después de 1 hora de incubación (HPGe-detector GEM(50)). La actividad de 227Th en células SK-OV-3 se midió diariamente usando el contador gamma Wizard (protocolo para 227Th) . La radioactividad medida se corrigió para descomposición. Los resultados presentados en la Figura 17 muestran que solo 20% de la actividad que permanece con el sedimento después de 1 hora se pierde durante los siguientes 7 días. En contraste, las células tratadas con 227Th libre señalado solo a una pequeña fracción de la actividad adicionada, y se perdió la mayoría de esta (aproximadamente 95%) durante las siguientes 24 horas. De esta manera, no hay unión específica de 227Th libre a células SK-OV-3, en tanto que se retuvo de manera eficiente 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab .
Valoración de citotoxicidad Se investigó el efecto en el crecimiento de células tumorales en dos ensayos complementarios . El primer experimento, se midió la actividad metabólica en células usando un reactivo luminiscente que se une a moléculas de ATP. De esta manera, una señal disminuida de luminiscencia indica pérdida de actividad metabólica. En el segundo experimento, se contó el número de colonias formadas.
Se midió la luminiscencia diariamente durante 9 días, y los resultados de la exposición a 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab se compararon a la luminiscencia de células SK-OV-3 expuestas a trastuzumab y 227Th libre, respectivamente. Se usaron como control células SK-OV-3 que crecen en medio regular.
En el día 0, se transfirieron 35 mL de 500 000 células SK-0V-3/mL en medio regular a 4 matraces celulares T75. Estos matraces celulares se usaron para preparar las siguientes soluciones de muestra: (1) Medio regular, (2) 20 g/mL de trastuzumab, (3) 20 kBq/mL de 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab (10166 Bq/pg) , (4) 20 kBq/mL de 27Th libre. Los matraces se incubaron en una incubadora de C02 durante 1 hora. Los sobrenadantes se descartaron, y las células se tripsinizaron con solución de Tripsina-EDTA al 0.25%, se lavaron con medio regular y se centrifugaron. Los sedimentos celulares se suspendieron en medio regular fresco y se midieron en un contador gamma Wizard (protocolo para 22Th) . Cada solución de incubación se distribuyó en 7 nuevos matraces celulares T25, y se incubó en una incubadora de C02.
En los días 1 y 2 se descartaron los sobrenadantes de un matraz de cada una de las cuatro soluciones de muestra. Los sedimentos celulares se prepararon como en el día 0 y se midió la radioactividad en un contador gamma Wizard (protocolo para 227Th) y un detector HPGe GEM(50). Todas las muestras se diluyeron 4 veces en medio regular, y 5 x 100 L de cada suspensión celular se transfirieron a 5 concavidades de un aplaca View 96. Se adicionaron cinco concavidades con 100 µL de medio regular (sin células) para mediciones de luminiscencia de fondo. Finalmente, se adicionaron 100 L de reactivo Cell Titer-Glo a cada concavidad, y las soluciones se mezclaron en un agitador orbital para inducir lisis. La señal de luminiscencia se dejó estabilizar a temperatura ambiente durante 10 minutos, entonces se midió la luminiscencia tres veces en un lector de placa múltiple Envision, usando el programa LU -individual .
En el día 3, se prepararon las células y se hicieron mediciones en un contador gamma Wizard y lector de placa múltiple Envision, como se describe para el día 1-2. Entonces, cada suspensión celular se diluyó debido al crecimiento celular denso; se transfirieron % de suspensión celular a un nuevo matraz de células T75, se adicionó medio regular y se incubó en una incubadora de C02 durante la noche .
En cada uno de los días 4-9 los cuatro matraces celulares T75 se tripsinizaron con solución de Tripsina-EDTA al 0.25%, se lavaron con medio regular y se centrifugaron. Los sedimentos celulares se diluyeron 4 veces en medio regular, y se tomaron porciones de 100 ]iL y se realizaron las mediciones como antes. Entonces, se diluyeron tres de las cuatro de las suspensiones celulares en medio regular, se transfirieron a nuevos matraces celulares T75 y se incubaron en una incubadora de C02 durante la noche .
La Figura 18 muestra las mediciones de luminiscencia en células SK-OV-3 tratadas con 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab (10166 Bqy^g) , trastuzumab y 227Th libre, normalizadas a valores de luminiscencia obtenidos para células SK-OV-3 que crecen en medio regular (control) . Las señales de luminiscencia para células SK-OV-3 tratadas con 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab disminuyeron gradualmente del día 1 al día 9, en tanto que los otros tratamientos mostraron señales de luminiscencia casi constante y crecimiento durante este período. La actividad metabólica de las células SK-OV-3 tratadas con 227Th-ALG-DD-NCS- trastuzumab disminuyó con el paso del tiempo, y en el día 9 casi todas las células estuvieron muertas. Este resultado indica un efecto citotóxico significativo sostenido de 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab.
Se realizó un ensayo clonogénico para evaluar el crecimiento de colonias celulares después de la exposición de células individuales a · condiciones potencialmente citotóxicas. Se incubaron células SK-OV-3 en diferentes concentraciones de 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab, trastuzumab o 2 7Th libre durante l hora, seguido por incubación durante 12 días para inducir crecimiento de la colonia.
Se realizó la preparación de células como antes, y en cada muestra se transfirieron 12000 células en 5 mL de medio regular a un matraz de T25. El efecto de 3 cantidades de cada reactivo se investigó para 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab y 7Th, 5, 10 y 20 kBq/mL, y para trastuzumab 5, 10 y 20 µg/mL, (concentraciones finales) respectivamente. Se preparó un matraz de control. Los1 10 matraces celulares T25 se incubaron en una incubadora de C02 durante 1 hora. Los sobrenadantes se descartaron, y las células se lavaron en medio regular, se tripsinizaron con solución de Tripsina-EDTA al 0.25%, se lavaron con medio regular y se centrifugaron. Los sedimentos celulares se suspendieron en medio regular, y cada una de las diez suspensiones celulares se dividió en 6 nuevos matraces celulares T25; 3 matraces celulares a 1000 células y 3 matraces celulares a 3000 células. Los 60 matraces celulares T25 resultantes se incubaron en una incubadora de C02 hasta que las colonias alcanzaron un tamaño visible (aproximadamente 50 células/colonia) . Después de la incubación durante 12 días, se removió el medio. Las células se lavaron con PBS, se fijaron con etanol, se tiñeron con Azul de Tripano al 0.25% en PBS, se lavaron con agua de grifo y finalmente se secaron a 45 °C durante la noche. Las colonias se contaron manualmente, y el número promedio de colonias en cada solución de incubación se representó gráficamente.
Los resultados mostrados en las Figuras . 19 y 20 muestran que la incubación de 1 hora con 22Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab aniquiló de forma eficiente células SK-OV-3. La incubación con 227Th libre puede tener algún efecto de aniquilación celular, no aparente en el primer ensayo de citotoxicidad donde se usó un gran número de células . La incubación con trastuzumab no tiene efecto negativo en el crecimiento celular.
Ejemplo 10 - Selección de objetivo tumoral in vivo de ALG-DD-NCS-trastuzumab marcado con torio-227 Se inyectaron 100 L (15 kBq) de 27Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab filtrado estéril (2700 Bq/ g) en la vena de cola lateral de diez ratones desnudos Balb/c que tienen xenoinjertos SdK-OV-3. Se sacrificaron cinco ratones después de 24 horas y los otros cinco después de 4 días, y se cortaron y pesaron los órganos de interés. Todas las muestras y 3 soluciones normales que contienen ID al 10%/g se midieron durante 5 minutos en un contador gamma izard (protocolo para 227Th) . Los resultados se expresaron como % de dosis inyectadas por tramo de tejido (% de ID/g) .
Los resultados mostrados en la Figura 21 soportan que 227Th-ALG-DD-NCS-trastuzumab se une específicamente al tumor. Los valores de captación fueron moderados, pero se incrementaron algo entre la captación de 24 horas y 4 días (de 8.7% de ID/g a 11.3% de ID/g), en tanto que la concentración en sangre disminuyó aproximadamente 1% de ID/g.
La captación en el cráneo y fémur también se incrementó algo entre 24 horas y 4 días, pero estos valores en general fueron bajos (2.8-3.2%, 24 h) , indicando muy poco 227Th libre que circula en el sistema, y sugiriendo de este modo un alto grado de estabilidad del complejo 7Th-ALG-DD-NCS- trastuzumab . El soporte adicional para esta conclusión se presta por la alta probabilidad que una fracción de la actividad medida en el cráneo y fémur se provoca por captación del núclido hijo 223Ra. Algo de este 23Ra se puede detectar dentro de la ventana cerrada especificada para mediciones de 227Th en un contador gamma Wizard, por lo tanto, los valores calculados de % de ID/g para cráneo y fémur pueden sobreestimados de la cantidad de 227Th-ALG-DD-NCS -trastuzumab acumulada en estos tejidos.
Ejemplo 11 - Preparación de una porción queladora Preparación de 3 -benciloxi-l-metil-4 - (2-tioxotiazolidin-1-il) carbonil-2 (IH) -piridinona (Estructura A).
Paso 1).- l-Metil-3-hidroxi-2 (IH) -piridinona: Se colocaron 3-hidroxi-2 (IH) -piridinona (34.44 g, 0.31 mol) y yodometano (75 g, 0.53 mol) en un recipiente de teflón con tapa de 80 mL, y se calentaron a 150°C durante aproximadamente 48-60 horas en una bomba Parr. La bomba enfriada se abrió y se decantó el exceso de yodometano. El aceite oscuro espeso resultante se mezcló con sulfito de sodio (64 g, 0.5 mol) y se disolvió en 300 mL de agua para formar una solución café pálido. La solución se neutralizó a pH 7-8 y se filtró para remover las impurezas insolubles. El filtrado entonces se extrajo con cloruro de metileno (4x100 mL) . Los extractos combinados entonces se secaron, se aplicaron a un tapón de gel de sílice instantáneo (6cm.x 8 cm) y se eluyeron con metanol al 4% en cloruro de metileno. El solvente se removió para dar el compuesto del título (24.3 g, 62.6%) como cristales incoloros.
Paso 2.- 4-Carboxi-l-metil-3-hidroxi-2 (IH) -piridinona Se mezcló l-metil-3 -hidroxi-2 (IH) -piridinona (1) (6.25 g, 50 mmol) con carbonato de potasio anhidro (36 g, 0.26 mol) y se secó al vacío. La mezcla entonces se calentó a 175- 185 °C durante 3 días en una bomba Parr bajo gas de dióxido de carbono seco (850 libras/pul2 (59.76 kg/cm2) ) . La bomba enfriada se abrió y el sólido amarillo pálido resultante se disolvió en agua con hielo y se acidificó con HC1 6N para producir un producto cristalino beige .
Paso 3.- 3 -Benciloxi-4 -carboxi-l-metil-2 (1H) -piridinona Se mezcla 4 -Carboxi-l-metil-3 -hidroxi-2 (1H) -piridinona (6.8 g, 0.04 mol) con cloruro de bencilo (12.1 g, 0.088 mol) y carbonato de potasio anhidro (13.8 g, 0.1 mol) en dimetil - formamida anhidra (DMF) (120 mL) . La mezcla se calienta en la oscuridad bajo nitrógeno a 75-80°C durante 16 horas. La mezcla resultante entonces se filtra y el solvente se evapora para producir un aceite oscuro. El aceite se purifica por aplicación a un tapón de gel de sílice (6 cm.x 8 cm) y elución con metanol al 4% en cloruro de metileno que da por resultado 3 -benciloxi -4 -benciloxicarbonil-l-metil-2 (1H) -piridinona como un aceite espeso amarillo pálido. Esto se toma en metanol (50 mL) y solución de NaOH 6M (10 mL) , y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, seguido por evaporación a sequedad. El residuo se disolvió en agua (100 mL) , y se acidificó con solución de HC1 6M a pH 2 para dar el compuesto del título (9.3 g 88.7%), como un producto cristalino blanco.
Paso 4. - 3-benciloxi-l-metil-4- (2-tioxotiazolidin-l-il) carbonil-2 (1 H) -piridinona A una solución de 3-benciloxi-4-carboxi-l-metil-2 (1H) -piridinona (1.05 g, 4 mmol) , 2- mercaptotiazolina (0.50 g, 4.2 mmol) y una cantidad catalíticas de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en diclorometano seco (50 mL) , se adiciona ?,?' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) (0.86 g, 4.2 mmol). Después de la agitación durante 4 horas, los sólidos de diciclohexilurea (DCU) se remueven por filtración. El filtrado amarillo entonces se evapora de forma giratoria para proporcionar un sólido amarillo. La cristalización de isopropanol-cloruro de metileno da el compuesto del título (Estructura A, 1.16 g, 80.4%) como placas cristalinas amarillas brillosas.
Estructura A Ejemplo 12.- Preparación de precursor de 3, 2 -HOPO para fórmula VIII La preparación de la sal cíclica (Estructura 5) se hace de acuerdo al siguiente esquema de reacción: La reacción de Michael asistida con fluoruro de cesio (10% en mol) de 2, 3-dihidroxipiridina (2,3-DHP) 1 con acrilato de etilo en acetonitrilo a reflujo da el éster 2 correspondiente a buenos rendimientos. La O-bencilación subsiguiente de 2 usando condiciones normales K2C03/acetonitrilo/reflujo) seguido por reducción de la porción de éster (BH3 HF, temperatura ambiente) da el alcohol 3 en 90% de rendimiento después de la cromatografía. El tratamiento del alcohol 3 con anhídrido metanosulfónico en diclorometano en la presencia de trietilamina conduce directamente a la formación de la sal cíclica deseada 5 (~ 85-90%) junto con algo del mesilato intermedio 4 (~ 10-15%) , como se determina por análisis espectral de RMN-1!.. Se puede lograr la conversión completa a la sal cíclica 5 al agitar la mezcla de producto crudo de la mesilación en cloroformo a temperatura ambiente. Después de la trituración con acetato de etilo caliente, se aisló la sal 5 como un sólido blanco pálido en 92% de rendimiento en alta pureza.
Ejemplo 13 - Preparación de compuesto de fórmula VIII Se adiciona la sal 5 (0.2 g) a 1.2 equivalentes de cicleno (1, , 7, 10-tetraazaciclododecano) en la presencia de trietilamina en acetonitrilo (3 mi) y se calentó a 60°C durante 2 días bajo nitrógeno. La reacción entonces se diluyó con diclorometano (50 mi) y se lavó con NaHC03 saturado (50 mi) . La capa acuosa se extrajo una vez más con diclorometano (25 mi) . Los extractos orgánicos combinados se secaron con sulfato de sodio, el solvente se removió in vacuo y se removió el exceso de N-metilbencilamina mediante destilación al vacío para dar VIII. Ejemplo 14.- Preparación de compuesto de fórmula IX A una solución de 3-benciloxi-l-metil-4- (2-tioxotiazolidin-l-il) carbonil-2 (IH) -piridinona en cloruro de metileno, se adicionó la correspondiente ?,?,?',?'-tetracis (2-aminoetil) etilenediamina Funcionalizada (Estructura B, Z que es un grupo protector) . Después de la agitación durante cuatro horas, la mezcla se filtró y se llevó a sequedad.
Estructura B El producto precursor protegido con bencilo apropiado se aislará de la mezcla de reacción en una columna de sílice instantánea con propanol en cloruro de metileno. El producto final con la estructura IX estará disponible después de la desprotección acida de los grupos hidroxilo.
Ejemplo 15 La estructura VIII se conjugará a una molécula dirigida a objetivo usando métodos normales a aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se preparará el éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) y se conjugará a proteínas y péptidos usando condiciones normales y la proteína conjugada resultante se aislará usando filtración en gel .
Ejemplo 16 Marcación con Torio-227 de la proteína conjugada Una solución a 10 mg/mL de la proteína conjugada (que tiene un ligando octadentado unido por medio de una porción de acoplamiento) se producirá en una solución amortiguadora adecuada, por ejemplo, amortiguador de NaOAc 0.5 M (pH 5.5), y se marca con torio-227 purificado a 25°C durante 1 hora seguido por un paso de purificación en una columna de filtración en gel.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un complejo dirigido a objetivo de tejido, caracterizado porque comprende una porción dirigida a objetivo de tejido seleccionada de anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos, construcciones de fragmentos o una mezcla de estos, péptido, aminoácido, hormona esteroidal o no esteroidal, foliato, estrógeno, testosterona, biotina, un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ión de un radionúclido alfa-emisor de torio-227.
2. El complejo de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un ligando octadentado que comprende al menos una porción queladora de la fórmula II en donde Ri es un grupo N-sustituyente opcional y de esta manera puede estar ausente o se puede seleccionar de grupos hidrocarbilo, OH, Ó-hidrocarbilo, SH y S-hidrocarbilo; comprende una porción ligadora; y/o comprende una porción de acoplamiento; los grupos R2 a R6 se seleccionan cada uno independientemente a partir de H, OH, =0, grupos hidrocarbilo cortos, porciones ligadoras y/o porciones de acoplamiento.
3. El complejo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende 4 porciones independientemente elegidas de la fórmula I como se define en la reivindicación 2.
4. El complejo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque al menos uno de los grupos Rx a R6 es OH y al menos uno de los grupos R2 a R6 es =0.
5. El complejo de conformidad con la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque a menos uno de los grupos Ri a R6 es una porción ligadora.
6. El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque comprende al menos una porción de 3 , 2 -hidroxipiridinona .
7. El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el ión de un radionúclido alfa-emisor de torio es el ión 4+ de un radionúclido alfa-emisor de torio.
8. Uso de un complejo de un complejo dirigido a objetivo de tejido que comprende una porción dirigida a objetivo de tejido seleccionada de anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos, construcciones de fragmentos o una mezcla de los mismos, un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ión de un radionúclido alfa-emisor de tori-227 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedad hiperplástica o neoplástica.
9. Uso de conformidad con la reivindicación 8 , en donde el complejo dirigido a un objetivo de tejido es un complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Uso de conformidad con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde la enfermedad es un carcinoma, sarcoma, mieloma, leucemia, linfoma o cáncer tipo mezclado.
11. Método de tratamiento del cuerpo humano o cuerpo de animal no humano (particularmente uno en necesidad del mismo) , caracterizado porque comprende la administración de al menos un complejo dirigido a objetivo de tejido que comprende una porción dirigida a objetivo de tejido seleccionada de anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos, construcciones de fragmentos o una mezcla de los mismos, péptido, aminoácido, hormona esteroidal o no esteroidal, foliato, estrógeno, testosterona, biotina, un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ión de un radionúclido alfa-emisor de torio-227.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el complejo dirigido a objetivo de tejido es un complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. El método de conformidad con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, caracterizado porque es para el tratamiento de enfermedad hiperplástica o neoplástica tal como un carcinoma, sarcoma, mieloma, leucemia, linfoma o cáncer tipo mezclado.
14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un complejo dirigido a objetivo de tejido que comprende una porción dirigida a objetivo de tejido seleccionada de anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos, construcciones de fragmentos o una mezcla de los mismos, péptido, aminoácido, hormona esteroidal o no esteroidal, foliato, estrógeno, testosterona o biotina, un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ion de un radionúclido alfa-emisor de torio-227 conjuntamente con al menos un portador o excipiente farmacéutico.
15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende el complejo dirigido a objetivo de tejido que es un complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
16. Un kit para el uso en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 , caracterizado porque comprende una porción dirigida a objetivo de tejido seleccionada de anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos, contracciones de fragmentos o una mezcla de los mismos, péptido, aminoácido, hormona esteroidal o no esteroidal, foliato, estrógeno, testosterona, biotina, conjugada o conjugable a un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona opcionalmente y de manera preferente incluye un radionúclido alfa-emisor de torio-227.
17. Un complejo dirigido a objetivo de tejido, caracterizado porque comprende una porción dirigida a un objetivo de tejido seleccionada de anticuerpos, construcciones de anticuerpo, fragmentos de anticuerpos, contracciones de fragmentos o una mezcla de los mismos, péptido, aminoácido, hormona esteroidal o no esteroidal, foliato, estrógeno, testosterona, o biotina, un ligando octadentado que contiene hidroxipiridinona y el ión de un radionúclido alfa-emisor de torio-227 para el uso en el tratamiento de enfermedad hiperplástica o neoplástica.
18. El complejo dirigido a objetivo de tejido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el complejo dirigido a objetivo de tejido es un complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
19. El complejo dirigido a un objetivo de tejido de conformidad con la reivindicación 17 o reivindicación 18, caracterizado porque la enfermedad es un carcinoma, sarcoma, mieloma, leucemia, linfoma o cáncer tipo mezclado.
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