MX2012007745A

MX2012007745A - Inhibidores de receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) y metodos de uso de los mismos.

Info

Publication number: MX2012007745A
Application number: MX2012007745A
Authority: MX
Inventors: Joseph Schlessinger; Yan Yang
Original assignee: Univ Yale
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2012-11-23
Also published as: AU2010343193A1; EP2519253A4; CN102724996A; JP2013515776A; IN2012DN05014A; EP2519253A2; IL220147A0; SG181495A1; CA2785723A1; WO2011090648A2; KR20120115348A; WO2011090648A3; RU2012132470A; US20130071397A1; BR112012016309A2

Abstract

La presente invención proporciona porciones que enlazan a la mayor parte del dominio tipo lg próximo a la membrana del ectodominio (D7) de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), en donde las porciones antagonizan la actividad del receptor VEGF.

Description

INHIBIDORES DE RECEPTORES DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR fVEGF) Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud se relaciona y reclama la prioridad de la Solicitud Provisional Norteamericana Serie No. 61/290,789, presentada el 29 de diciembre del 2009, cuyos contenidos totales están incorporados de manera expresa a la presente invención como referencia.

Manifestación con Respecto a la Investigación o Desarrollo Patrocinado por la Federación La presente invención se elabora con soporte Gubernamental de acuerdo con el contrato R01-AR 051448, R01-AR 051886 y P50 AR054086 otorgado por el Instituto Nacional de Salud (National Institutes of Health). El gobierno puede tener ciertos derechos en la presente invención.

Antecedentes de la Invención Los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) regulan el desarrollo y homeostasis de vasos sanguíneos y linfáticos, mediante el enlace a, y la activación de los tres miembros de la familia del receptor-VEGF (VEGFR) de las cinasas de tirosina receptora (RTK) (Olsson y asociados, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol, 7(5):359-371 (2006)). VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) y VEGFR3 (Flt4) son miembros de RTK tipo V; una familia que contiene una gran región extracelular compuesta de siete dominios tipo Ig (D1-D7), una hélice de transmembrana simple (TM) y una región citoplásmica con una actividad de cinasa de tirosina y secuencias reguladoras adicionales. El segundo y tercero dominios tipo Ig del ectodominio VEGFR, por ejemplo, D2 y D3, funcionan como sitios de enlace para los cinco miembros de la familia de citocinas VEGF (por ejemplo VEGF-A, B, C, D y factor de crecimiento de placenta (P1GF)) (Barleon y asociados, J. Biol. Chem., 272(16): 10382-10388 (1997); y Shinkai y asociados, J. Biol. Chem., 273(47) : 31283-31288 (1998)). Los factores de crecimiento son homodímeros enlazados en forma covalente. Cada protómero está compuesto de hojas-ß de cuatro hebras distribuidas en una forma anti-paralela en una estructura designada como factores de crecimiento de botón de cisteína (Weismann y asociados, Cell, 91 (5):695-704 (1997)). Otros miembros de la familia de citocinas del botón de cisteína, incluyen factor de crecimiento de nervios (NGF) y factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF). Sin embargo, los ectodominios de la familia PDGFR de RTKs (tipo-lll), están compuestos de cinco repeticiones tipo Ig de las cuales D1, D2 y D3 funcionan como la región de enlace del ligando de PDGFR y otros miembros de la familia (es decir, KIT, CSF1R y Flt3). Los experimentos estructurales y bioquímicos han mostrado que el enlace SCF a la región extracelular induce la dimerización KIT, un paso seguido por contactos homotípicos entre los dos dominios tipo Ig próximos de membrana, D4 y D5 de las moléculas KIT vecinas (Yuzawa y asociados, Cell, 130(2):323-334(2007)). Los estudios bioquímicos de mutantes KIT oncogénicos y tipo natural, han mostrado que los contactos de D4 y D5 homotípicos, desempeñan un papel importante en la colocación de las regiones citoplásmicas de los dimeros KIT a una distancia y orientación que facilita la trans-autofosforilación, la activación de cinasa y la señalización celular. Sin embargo, existe la necesidad de caracterizar de mejor manera las estructuras de los receptores VEGF. Dicha caracterización conducirá a la identificación informada de regiones que pueden ser dirigidas con fármacos, farmacéuticos u otros biológicos.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona porciones, por ejemplo, anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos, moléculas pequeñas, moléculas peptídicas, aptámeros y adnectinas que enlazan al ectodominio de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (receptores VEGF), por ejemplo, VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) y VEGFR3(Flt4). Las porciones de la presente invención pueden asegurar el ectodominio del receptor VEGF en un estado inactivo, inhibiendo de esta forma la actividad del receptor VEGF. En una modalidad de la presente invención, la porción asegura el ectodominio del receptor VEGF, a un estado monomérico. En otra modalidad de la presente invención, la porción permite que el ectodominio del receptor VEGF se dimerice, pero afecte la colocación, orientación y/o distancia entre los dominios tipo Ig de los dos monómeros (por ejemplo, los dominios D7-D7 de un receptor VEGF), inhibiendo de esta forma la actividad del receptor VEGF. En otras palabras, la porción puede permitir una dimerización inducida por ligando de los ectodominios del receptor VEGF, pero afectar la colocación de los dos ectodominios en la interfase de superficie celular, o alterar o prevenir cambios de conformación en los receptores VEGF, inhibiendo de esta forma la actividad de los receptores VEGF (por ejemplo, inhibiendo la internalización de receptor y/o inhibiendo la autofosforilación de tirosina del receptor, y/o inhibiendo la capacidad que tiene el receptor de activar una trayectoria de señalización de corriente descendente. La presente invención está basada, al menos en parte, en descifrar la estructura de cristal de parte del ectodominio del receptor VEGF2. El descifrado de esta estructura de cristal ha permitido la identificación de epítopes, por ejemplo epítopes de conformación, a los cuales se pueden dirigir partes de la presente invención.

La presente invención también está basada, al menos en parte en el descubrimiento de que, en lugar de desempeñar un papel importante en la dimerización de receptor, las interacciones D7 homotípicas entre los receptores vecinos, son requeridas para la colocación precisa de las regiones próximas de membrana de dos receptores, a una distancia y orientación que permite interacciones entre sus dominios citoplásmicos, dando como resultado la activación de cinasa de tirosina.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona una porción que enlaza al ectodominio de un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (receptor VEGF) humano, en donde la porción asegura el ectodominio del receptor VEGF en un estado inactivo, antagonizando de esta forma la actividad del receptor VEGF. En una modalidad, la porción enlaza a un dominio tipo Ig de un receptor VEGF humano. En una modalidad, el dominio tipo Ig no es responsable del enlace de un ligando al receptor VEGF. En otra modalidad, el dominio tipo Ig es responsable del enlace de un ligando al receptor VEGF. En una modalidad, la porción no bloquea la interacción entre el receptor VEGF y un ligando del receptor VEGF. En otra modalidad, la porción bloquea la interacción entre el receptor VEGF y un ligando del receptor VEGF. En una modalidad, la porción no previene la dimerización del receptor VEGF. En otra modalidad, la porción previene la dimerización del receptor VEGF.

En una modalidad, la porción previene la interacción entre una región próxima de membrana del ectodominio de cada promotor del receptor VEGF. En otra modalidad, la interacción es homotípica. Aún en otra modalidad, la interacción es heterotípica.

En una modalidad, la región próxima de membrana del ectodominio es el séptimo dominio tipo Ig (D7) de un receptor VEGF. En otra modalidad, la porción enlaza a la siguiente secuencia de consenso del dominio D7 de un receptor VEGF: L/l Xi R F X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO: 158), en donde L es Leucina, I es Isoleucina, R es Arginina, F es un aminoácido hidrofóbico, D es ácido aspártico, E es ácido glutámico, G es Glicina, y X,, X2, X3, X4 y X5 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, F es Valina; se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Glutamina, Ácido Glutámico y Ácido Aspártico; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Lisina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Ácido Glutámico, Glutamina y Valina; X se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Valina; y X5 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Glicina, Serina y Glutamina.

En otra modalidad, la porción origina que la región próxima de la membrana del ectodominio de cada promotor del receptor VEGF, sea separada en una distancia mayor aproximadamente a 16 A, 17 A, 18 A, 19 A o 20 A. En una modalidad, la porción asegura el ectodominio del receptor VEGF en un estado inactivo.

En una modalidad, el receptor VEGF es VEGFR1 (Flt1). En otra modalidad, el receptor VEGF es VEGFR2 (KDR/Flk1). En otra modalidad, el receptor VEGF es VEGFR3 (Flt4).

En otra modalidad, la porción enlaza al residuo de aminoácido Arg726 de VEGFR2. En otra modalidad, la porción enlaza a los residuos de aminoácido Asp731 de VEGFR2. En otra modalidad, la porción enlaza a los residuos de aminoácido Arg726 y Asp731 de VEGFR2. En otra modalidad, la porción enlaza a uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo de residuos de aminoácido 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731 , 732 y 733 de VEGFR2. La porción puede enlazar dentro de 1A, 2Á, 3A, 4A o 5A de cualesquiera de los residuos de aminoácido anteriores.

En una modalidad, la porción enlaza al residuo de aminoácido Arg720 de VEGFR1. En otra modalidad, la porción enlaza al residuo de aminoácido Asp725 de VEGFR1. En otra modalidad, la porción enlaza a los residuos de aminoácidos Arg720 y Asp725 de VEGFR1. En otra modalidad, la porción enlaza a uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácido 718, 719, 720, 721 , 722, 723, 724, 725, 726 y 727 de VEGFR1. La porción puede enlazar dentro de 1Á, 2Á, 3A, 4A o 5Á de cualesquiera de los residuos de aminoácido anteriores. En una modalidad, la porción enlaza al residuo de aminoácido Arg737 de VEGFR3. En otra modalidad, la porción enlaza al residuo de aminoácido Asp742 de VEGFR3. En otra modalidad, la porción enlaza a los residuos de aminoácido Arg737 y Asp742 de VEGFR3. Aún en otra modalidad, la porción enlaza a uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácido 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743 y 744 de VEGFR3. La porción puede enlazar dentro de 1Á, 2A, 3A, 4A o 5A de cualesquiera de los residuos de aminoácido anteriores.

En una modalidad, la porción enlaza a un epítope de conformación en el ectodominio del receptor VEGF. En una modalidad, el epítope de conformación está compuesto de dos o más residuos en el dominio D7 del receptor VEGF. Aún en otra modalidad, el epítope de conformación comprende, o consiste en, residuos de aminoácido Arg726 y Asp731; Arg 720 y Asp 725; o Arg737 y Asp742. En ciertas modalidades, la porción enlazará dentro de 1A, 2A, 3A, 4A o 5A de los epítopes de conformación anteriores.

En otra modalidad, la porción enlaza a un epítope contiguo del receptor VEGF. En una modalidad, el epítope contiguo está compuesto de dos o más residuos y en el dominio D7 del receptor VEGF. En otra modalidad,, el epítope contiguo es un epítope seleccionado del grupo que consiste en 672VAISSS677 de VEGFR1, 678TTLDCH A684 de VEGFR 1, 685NGVPEPQ691 de VEGFR 1, 700KIQQEPG706 de VEGFR 1, 707IILG710 de VEGFR1, 7i i p G S7i 3 de VEGFR1, 71 STLFI718 de VEGFR1, 719ERVTEEDEGV728 de VEGFR 1, 689VNVSDS694 de VEGFR3, 695LEMQCLV701 de VEGFR3, AG AH APS de VEGFR3, 7 7LLEEKSG723 de VEGFR3, 724VDLA727 de VEGFR3, 728DSN730 de VEGFR3, 731QKLSI735 de VEGFR3 y 736QRVREEDAGR745 de VEGFR3, 678TSIGES683 de VEGFR2, 684l EVSCTA690 de VEGFR2, 691 SGNPPPQ697 de VEGFR2, 706TLVEDSG712 de VEGFR2, 7i3p L K7i6 de VEGFR2, 7 7DGN719 de VEGFR2, 720RNLTI724 de VEGFR2 y 725RRVRKEDEGL734 de VEGFR2. En algunas modalidades, la porción puede enlazar dentro de 1Á, 2Á, 3Á, 4Á o 5A de cualesquiera de los epítopes anteriores.

En una modalidad, la porción bloquea una autofosforilación de tirosina inducida por ligando del receptor VEGF. En otra modalidad, la porción bloquea una internalizacion inducida por ligando del receptor VEGF.

En una modalidad, la porción que enlaza al ectodominio del receptor VEGF, es un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo. En otra modalidad, el anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico y un anticuerpo quimérico. En otra modalidad, el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, comprende una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las regiones constantes lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA y IgE. En una modalidad, la región constante de cadena pesada de anticuerpo es I g G 1. En otra modalidad, el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv de cadena simple, un SMIP, un aficuerpo, un avímero, un nanocuerpo y un anticuerpo de dominio simple. Aún en otra modalidad, el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, enlaza a un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora con una KD seleccionada del grupo que consiste en 1 x 10"7 M o menos, más preferentemente 5 x 10"8 M o menos, más preferentemente 1 x 10"8 M o menos, más preferentemente 5 x 1 O"9 M o menos.

En un aspecto, la presente invención proporciona un hibridoma que produce el anticuerpo o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza al ectodominio del receptor VEGF tal como aquí se describe.

En una modalidad, la porción que enlaza al ectodominio de un receptor VEGF, es una molécula pequeña. En otra modalidad, la molécula pequeña enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido Arg726 o Asp731 de VEGFR2. En otra modalidad, la molécula pequeña enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácidos Arg720 o Asp725 de VEGFR1. En otra modalidad, la molécula pequeña enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido Arg737 o Asp742 de VEGFR3.

En otra modalidad, la porción que enlaza al ectodominio del receptor VEGF es una molécula peptídica. En una modalidad, la molécula peptídica está diseñada con base en un dominio tipo Ig del receptor VEGF. En otra modalidad, la molécula está diseñada con base en el dominio D7 del receptor VEGF humano. En una modalidad, la molécula peptídica comprende la estructura: L/l X, R F X2 X3 X4 D/E X5 G (SEQ ID NO: 158), en donde L es Leucina, I es Isoleucina, R es Arginina, F es un aminoácido hidrofóbico, D es Ácido Aspártico, E es Ácido Glutámico, G es Glicina, y ??, X2, X3, X y 5 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, F es Valina; 1 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Glutamina, Ácido Glutámico y Ácido Aspártico; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Lisina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Ácido Glutámico, Glutamina y Valina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Valina; y X5 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Glicina, Serina y Glutamina.

En otra modalidad, la molécula peptídica comprende una estructura que es al menos el 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a los residuos de aminoácido 724-733, 678-683, 684-690, 691-697, 706-712, 713-716, 717-719, 720-724 o 725-734 de VEGFR2 humano. En otra modalidad, la molécula peptídica comprende una estructura que es al menos el 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a los residuos de aminoácido 718-727, 672-677, 678-684, 685-691, 700-706, 707-710, 711-713, 714-718 ó 719-728 de VEGFR1 humana. En otra modalidad, la molécula peptídica comprende una estructura la cual es el al menos el 80%, 85%, 90% o 95% idéntica a los residuos de aminoácido 735-744, 689-694, 695-701, 702-708, 717-723, 724-727, 728-730, 731-735 ó 736-745 de VEGFR3 humano. En otra modalidad, la molécula peptídica comprende al menos un residuo de aminoácido-D.

En una modalidad, la porción que enlaza al ectodominio del receptor VEGF es una adnectina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una porción que enlaza a un epítope de conformación en el dominio D7 del receptor VEGF humano, y antagoniza la actividad del receptor VEGF humano, en donde el epítope de conformación comprende los residuos Arg726 y Asp731 de VEGFR2; residuos Arg720 y Asp725 de VEGFR1; o residuos Arg737 y Asp742 de VEGFR3.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una porción que enlaza a los residuos de aminoácido Arg726 y Asp731 de VEGFR2; residuos de aminoácido Arg720 y Asp725 de VEGFR1; o residuos de aminoácido Arg737 y Asp742 de VEGFR3, antagonizando de esta forma la actividad de un receptor VEGF humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una porción que enlaza al ectodominio de un receptor VEGF, tal como se describe en la presente invención, y un transportador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con un receptor VEGF en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una porción de la presente invención, para tratar o prevenir de esta forma la enfermedad. En una modalidad, la enfermedad asociada con cinasa de tirosina del receptor VEGF, se selecciona del grupo que consiste en cáncer, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), ateroesclerosis, artritis reumatoide, retinopatía diabética, una enfermedad del sistema linfático y enfermedades asociadas con dolor. En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en GIST, AML, SCLC, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de seno, cáncer linfático u otros cánceres cuyo crecimiento está soportado por estroma.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar una porción que enlaza al ectodominio, es decir, un dominio tipo Ig de un receptor VEGF, en donde el método comprende: contactar un receptor VEGF con una porción candidata; contactar en forma simultánea o en secuencias el receptor VEGF con un ligando del receptor VEGF; y determinar si la porción afecta la colocación, orientación y/o distancia entre los dominios tipo Ig del receptor VEGF dimérico inducido por ligando, para identificar de esta forma una porción que enlaza al ectodominio, por ejemplo, un dominio tipo Ig, de un receptor VEGF. En una modalidad, la porción asegura el ectodominio del receptor VEGF en un estado inactivo. En otra modalidad, la porción enlaza a un séptimo dominio tipo Ig (D7) del receptor VEGF.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a un epítope de conformación en el dominio D7 de receptor VEGF humano, en donde el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, antagoniza la actividad del receptor VEGF humano, y en donde el epítope de conformación comprende los residuos Arg726 y Asp731 de VEGFR2. En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlazan a un epítope de conformación en el dominio D7 del receptor VEGF humano, en donde el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, antagoniza la actividad del receptor VEGF humano, y en donde el epítope de conformación comprende los residuos Arg720 y Asp725 de VEGFR1. En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a un epítope de conformación en el dominio D7 de un receptor VEGF humano, en donde el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, antagoniza la actividad del receptor VEGF humano, y en donde el epítope de conformación comprende los residuos Arg737 y Asp742 de VEGFR3.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a los residuos de aminoácido 724-733 de VEGFR2, para antagonizar de esta forma la actividad de VEGFR2. En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a los residuos de aminoácido 718-727 de VEGFR1, para antagonizar de esta forma la actividad de VEGFR1. En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a los residuos de aminoácido 735-744 de VEGFR3, para antagonizar de esta forma la actividad de VEGFR3.

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Arg726 y Asp731 de un VEGFR2 humano, para antagonizar de esta forma la actividad del VEGFR2 humano. En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Arg720 y Asp725 de un VEGFR1 humano, para antagonizar de esta forma la actividad de VEGFR1 humano. En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Arg737 y Asp742 de un VEGFR3 humano, para antagonizar de esta forma la actividad del VEGFR3 humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una porción que enlaza al ectodominio, es decir, un dominio tipo Ig o una región de articulación, de una cinasa de tirosina de receptor humano, en donde la porción asegura el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora en un estado inactivo, para antagonizar de esta forma la actividad de la cinasa de tirosina receptora. En una modalidad, el dominio tipo Ig puede o no ser responsable del enlace de un ligando a la cinasa tirosina receptora. En otra modalidad, la porción puede o no bloquear la interacción entre la cinasa tirosina receptora y un ligando del receptor de cinasa de tirosina receptora. En otra modalidad, la porción de la presente invención puede o no prevenir la dimerización de la cinasa de tirosina receptora. En una modalidad adicional, la porción de la presente invención puede no prevenir la dimerización de receptor inducida por ligando, pero evitará las interacciones homotípicas o heterotípicas entre las regiones próximas de membrana que son requeridas para la actividad de la cinasa de tirosina receptora.

En algunas modalidades, una porción de la presente invención previene una interacción homotípica o heterotípica entre una región próxima de membrana del ectodominio de cada promotor de la cinasa de tirosina receptora. Por ejemplo, una porción de la presente invención puede originar que el término del ectodominio (los extremos del ectodominio más cercanos a la membrana de plasma) de cada promotor de la cinasa de tirosina receptora, sean separados por una distancia mayor aproximadamente a 15Á, aproximadamente a 20Á, aproximadamente a 25A, aproximadamente a 30Á, aproximadamente a 35Á o aproximadamente 40Á.

En modalidades preferidas, la cinasa de tirosina receptora es una cinasa de tirosina receptora tipo III, por ejemplo, Kit, PDGFRa, PDGFR , CSF1 R, Fms, Flt3 o Flk2.

En otras modalidades, el dominio tipo Ig el cual es enlazado por una porción de la presente invención, es un dominio D4 de la cinasa de tirosina receptora tipo III. En una modalidad específica, la porción enlaza a la siguiente secuencia de consenso para el sitio de interacción D4: LXT RX2X3 5 6X7G en donde L es Leucina, R es Arginina, G es Glicina; y ?,, X2, X3, X4l X5, ?ß y 7 con cualquier aminoácido. En una modalidad específica, X1 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Isoleucina, Valina, Prolina, Asparagina, o Lisina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Leucina, Valina, Alanina y Metionina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Histidina, Asparagina y Arginina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Valina, Alanina, Ácido Glutámico, Prolina, y Metionina; X5 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Serina, Ácido Glutámico, Alanina, Glutamina, y Ácido Aspártico; X6 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Ácido Aspártico y Glutamina; y X7 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Serina, Alanina, Lisina, Arginina, Glutamina y Treonina.

En otra modalidad, el dominio tipo Ig que es enlazado por una porción de la presente invención, es un dominio D5 de una cinasa de tirosina receptora tipo III, por ejemplo, los residuos de aminoácido 309-413 ó 410-519 del Kit humano. En una modalidad específica, una porción de la presente invención puede enlazar a una secuencia de consenso de los aminoácidos conservados del sitio de interacción D5.

En otra modalidad, la porción de la presente invención enlaza a los mutantes del dominio D4 o D5 de la cinasa de tirosina receptora tipo III o a los mutantes del dominio D7 de la cinasa de tirosina receptora tipo V. En una modalidad específica, la porción enlaza a una mutación de punta en un dominio D5 muíante de Kit humana, en donde la mutación se selecciona del grupo que consiste en Thr417, Tyr418, Asp419, Leu421, Arg420, Tyr503 y Ala502.

En algunas modalidades, la cinasa de tirosina receptora tipo III es Kit humana, y la porción de la presente invención enlaza a uno o más residuos de aminoácido, por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, o 18 o más residuos de aminoácido, seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácido mostrados en la tabla 4 que se encuentra a continuación. Por ejemplo, las porciones de la presente invención pueden enlazar a uno o más de los siguientes residuos: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, 1371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431 o G432. En modalidades específicas, la porción de la presente invención enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido en el receptor Kit seleccionado del grupo que consiste en K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, 1371 y Y373 o al menos uno de los residuos de aminoácido en el receptor Kit se selecciona del grupo que consiste en Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390. Las porciones de la presente invención pueden enlazar a todos los residuos que forman un bolsillo o una cavidad identificado en la tabla 4 o pueden enlazar a un subconjunto de residuos que forman el bolsillo o la cavidad. Un experto en la técnica podrá apreciar que en algunas modalidades, las porciones de la presente invención pueden ser fácilmente dirigidas a los residuos que corresponden a los descritos anteriormente en las otras RTKs tipo III, por ejemplo, los residuos que forman bolsillos o cavidades similares, o los que están en la misma posición mediante alineación estructural o alineación de secuencia.

En otra modalidad, una porción de la presente invención enlaza a residuos de aminoácido 381Arg y 386Glu de Kit humana. Aún en otra modalidad, una porción de la presente invención enlaza a residuos de aminoácido 18Tyr y/o 505Asn de Kit humana.

En una modalidad adicional, la porción de la presente invención enlaza a un receptor PDGFRa o PDGFRPp. En una modalidad similar, una porción de la presente invención enlaza a los residuos de aminoácido 385Arg y/o 390Glu de PDGFRp humano, o a los residuos correspondientes en PDGFRa.

Aún en otra modalidad, una porción de la presente invención enlaza a un epítope de conformación en una RTK tipo III. En modalidades específicas, el epítope de conformación está compuesto de dos o más residuos del dominio D3, D4 o D5 o regiones de articulación de una RTK tipo III, por ejemplo, el receptor Kit humano o el receptor PDGF. En modalidades específicas adicionales, las porciones de la presente invención pueden enlazar a epítopes de conformación en el receptor Kit humano compuesto de dos o más residuos, por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, o 18 o más residuos de aminoácido, seleccionados del grupo que consiste en residuos de aminoácido descritos en la tabla 4. En una modalidad particular, una porción de la presente invención enlaza a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206. V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269. En modalidades similares, una porción de la presente invención puede enlazar a un epítope de conformación de 2 o más aminoácidos seleccionados del uno de los siguientes grupos de aminoácidos: P206, F208, V238, y S239; K127, A207, F208 y T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370, 1371 y Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340 y 1371; R224, V308, K310, G311, F340, P341 y D398; K218, A219, S220, N367, E368 y S369; K218, A220, E368 y S369; G384, T385, T411, K412, E414 y K471; Y408, F433, G470, K471 y L472; F324, V325, N326 y N410; D327, N410, T411, K412 y V497; G384, G387, V409 y K471; L382, G387, V407 y V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269; P206, F208, V238 y S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, 1371 y Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470 y K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432 y K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390; Y350, R353 y F355. Tal como se indicó anteriormente, las porciones de la presente invención pueden enlazar a todos los residuos de aminoácido que forman un bolsillo o una cavidad identificada en la tabla 4, o pueden enlazar a un subconjunto de los residuos que forman el bolsillo o la cavidad.

En una modalidad adicional, una porción de la presente invención enlaza a un epítope de conformación, en donde el epítope de conformación está compuesto de dos o más residuos de aminoácido seleccionados de los péptidos descritos en la tabla 5. En una modalidad específica, el epítope de conformación está compuesto de uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un primer péptido, y uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un segundo péptido, en donde el primero y segundo péptidos se seleccionan del grupo de péptidos descritos en la tabla 5. Por lo tanto, una porción de la presente invención puede enlazar a un epítope de conformación, en donde el primero y segundo grupos de péptido son tal como se indica a continuación: Ala219-Leu222 y Thr304-Val308; Asp309-Gly311 y Arg224-Gly226; Thr303 - Glu306 y Ala219-Leu222; Asn367-Asn370 y Ser217-Tyr221 ; Ala339-Pro343 y Asn396-Val399; Ala339-Pro343 y Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 y Val374-His378; Asp357-Glu360 y Leu377-Thr380; Met351 -Glu360 y His378-Thr389; His378-Thr389 y Val323-Asp332; Val409-I Ie415 y Ala493-Thr500; Val409-lle415 y Ala431-Thr437; Val409-lle415 y Phe469-Val473; Val409-lle415 y Val325-Asn330; Val409-lle415 y Arg381 -Gly387; Gly466-Leu472 y Gly384-Gly388; Val325-Glu329 y Tyr494-Lys499; Thr411-Ieu416 y Val497-Ala502; I Ie415-Leu421 y Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 y Lys484-Thr488; y Ala502-Ala507 y Gly445-Cys450. Las porciones de la presente invención pueden enlazar a todos los residuos de aminoácido que forman el primero y segundo grupos de péptidos anteriores, o pueden enlazar a un subconjunto de residuos que forman el primero y segundo grupos de péptido.

En otras modalidades, las porciones de la presente invención enlazan a cinasas de tirosina receptora que son miembros de la familia de receptor VEGF (cinasas de tirosina receptora tipo V), por ejemplo, VEGFR-1 (Flt1), VEGFR-2(Flk1 ) y VEGFR-3(Flt4). El dominio tipo Ig enlazado mediante las porciones de la presente invención, en algunas modalidades, puede ser el dominio D7 de un miembro de la familia de receptor VEGF. En una modalidad específica, la porción enlaza a la siguiente secuencia consenso del dominio D7 de un miembro de la familia de receptor VEGF: I X ! RVX2X3EDX4G en donde I es Isoleucina, R es Arginina, E es Ácido Glutámico, D es Ácido Aspártico, G es Glicina; y ?,, X2, X3 y X4 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, X: se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Arginina y Glutamina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Lisina; y X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Alanina (SEQ ID NO: 1).

En algunas modalidades, la porción de la presente invención es un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo. El anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, comprende una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las regiones constantes lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA y IgE. En una modalidad preferida, la región constante de cadena pesada de anticuerpo es lgG1. Además, la porción de la presente invención puede ser un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv de cadena simple, un SMIP, un aficuerpo, un avímero, un nanocuerpo, y un anticuerpo de dominio simple. En modalidades particulares, un anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, de la presente invención, enlaza a un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora con una KD de 1 x 10"7 M o menos, más preferentemente 5 x 10"8 M o menos, más preferentemente 1 x 10"8 M o menos, más preferentemente 5 x 10 M o menos.

En algunas modalidades, el anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, de la presente invención enlaza a los residuos de aminoácido 309-413 y/o 410-519 de la Kit humana, asegurando de esta forma el ectodominio de Kit humana en un estado inactivo y antagonizando la actividad de Kit humana.

En modalidades adicionales, la presente invención incluye un hibridoma que produce un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, de la presente invención.

En otra modalidad preferida, la porción de la presente invención es una molécula pequeña.

En algunas modalidades preferidas, la molécula pequeña de la presente invención enlaza a uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácido mostrados en la tabla 4. Por ejemplo, las moléculas pequeñas de la presente invención pueden enlazar a uno o más de los siguientes residuos: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, 1371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431 o G432. En una modalidad específica, la molécula pequeña de la presente invención enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido en el receptor Kit, seleccionado del grupo que consiste en K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, 1371 y Y373. En una modalidad relacionada, la molécula pequeña de la presente invención enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido en el receptor Kit, seleccionado del grupo que consiste en Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390. Un experto en la técnica apreciará, que en algunas modalidades, las moléculas pequeñas de la presente invención pueden ser dirigidas fácilmente a los residuos que corresponden a los descritos anteriormente en las RTKs tipo III, por ejemplo, los residuos que forman bolsillos o cavidades similares, o los que están en la misma posición mediante alineación estructural o alineación de secuencia.

En una modalidad adicional, la porción de la presente invención es una molécula peptídica. En algunas modalidades, la molécula peptídica está diseñada con base en un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora. En una modalidad específica, la molécula peptídica de la presente invención está diseñada con base en el dominio D4 de Kit. La molécula peptídica de la presente invención puede comprender un sitio de interacción D4 conservado, por ejemplo, la secuencia de consenso D4 descrita anteriormente (LX RX2X3X4X5X6X7G), u otras generadas alineando o comparando los dominios D4 de las cinasas de tirosina receptora tipo III. En modalidades adicionales, una molécula peptídica de la presente invención comprende una estructura que es al menos el 80% idéntica a los residuos de aminoácido 309-413 de Kit humana o una estructura que es al menos el 80% idéntica a los residuos de aminoácido 410-519 de Kit humana. Las porciones peptídicas también pueden ser diseñadas con base en el dominio D5 de Kit, y, en modalidades preferidas adicionales, puede comprender una secuencia de consenso generada alineando o comparando los dominios D5 de las cinasas de tirosina receptora tipo III. En modalidades alternativas, la molécula peptídica puede estar diseñada con base en la secuencia o secuencia de consenso de los dominios D5 mutantes.

Las porciones peptídicas de la presente invención, pueden ser péptidos que comprenden o consisten en cualesquiera de las secuencias de aminoácido aquí identificadas (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1-89, 92, 93, y 105-157).

En algunas modalidades, la molécula peptídica de la presente invención comprende al menos un residuo de aminoácido-D.

En otra modalidad preferida, la porción de la presente invención es una adnectina.

Además, en algunas modalidades, las moléculas pequeñas y moléculas peptídicas de la presente invención, enlazan a epítopes de conformación en las RTKs objetivo. En otras modalidades, las moléculas pequeñas y moléculas peptídicas de la presente invención enlazan a epítopes en las RTKs objetivo, las cuales no son epítopes de conformación.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualesquiera de las porciones de la presente invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad efectiva de una porción de la presente invención (por ejemplo, una porción que enlaza al dominio D4 o D5 de una cinasa de tirosina receptora tipo III, o un Dominio D7 de una cinasa de tirosina receptora tipo V), para tratar o prevenir de esta forma la enfermedad. En modalidades preferidas, la enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora es una enfermedad linfática o cáncer, por ejemplo, GIST, AML, SCLC, melanoma, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de seno, cáncer linfático u otros cánceres.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora en un sujeto, mediante la administración al sujeto en una cantidad efectiva de una porción que enlaza a la región de articulación D3-D4 y/o D4-D5 de una cinasa de tirosina receptora tipo III humana, para tratar o prevenir de esta forma la enfermedad. En modalidades específicas, la enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora es cáncer, por ejemplo, GIST, AML, SCLC, melanoma, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de seno, cáncer linfático u otros cánceres.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para identificar una porción que enlaza a un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora, y asegura el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora a un estado inactivo. Los métodos incluyen contactar una cinasa de tirosina receptora con una porción candidata: contactar en forma simultánea o en secuencias la cinasa de tirosina receptora con un ligando de la cinasa de tirosina receptora; y determinar si la porción afecta la colocación, orientación y/o distancia entre los dominios tipo Ig de la cinasa de tirosina receptora dimérica inducida por ligando, para identificar de esta forma una porción que enlaza a un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora y asegura el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora a un estado inactivo.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para identificar una porción que asegura el ectodominio de una cinasa de tirosina receptora tipo III a un estado inactivo. Los métodos incluyen contactar la cinasa de tirosina receptora tipo III con una porción candidata; contactar en forma simultánea o en secuencias la cinasa de tirosina receptora con un ligando de la cinasa de tirosina receptora; y determinar si la porción afecta la colocación, orientación y/o distancia entre los dominios D4-D4 o D5-D5 de la cinasa de tirosina receptora dimérica inducida por ligando, para identificar de esta forma una porción que asegura el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora tipo III a un estado inactivo.

Otras características y ventajas de la presente invención podrán ser apreciadas a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones adjuntas.

Breve Descripción de las Figuras Este archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Las copias de la presente patente o publicación de solicitud de patente con un dibujo(s) a color, serán proporcionadas por la Oficina al momento de la requisición y pago de los honorarios necesarios.

Las figuras 1A-E ilustran la estructura de cristal del ectodominio Kit. La figura 1A muestra un diagrama de cinta (izquierdo) y la representación de superficie (derecha) del monómero de ectodominio Kit. El panel derecho muestra una visión siguiendo una rotación de 90° a lo largo del eje vertical de la vista mostrada en el panel izquierdo. D1 es de color azul, D2 color verde, D3 color amarillo, D4 color naranja y D5 color rosa, los términos N y C están marcados. Los enlaces de disulfuro en D1 y D5 se muestran en bolas y varas que, con los átomos de sulfuro se vuelven color naranja. Los carbohidratos enlazados por asparagina se muestran en un modelo de vara. Figura 1B-E proporciona vistas detalladas de las interfases D1-D2 (B), D2-D3 (C), D3-D4 (D) y D4-D5 (E). El código de color es el mismo que en la figura 1A. Los aminoácidos que participan en las interacciones de dominio-dominio están marcados y los enlaces de hidrógeno son dibujados como líneas color amarillas punteadas. Los elementos de estructura secundaria están diseñados de acuerdo con la nomenclatura IgSF.

Las figuras 2A-B, ilustran la estructura de cristal del complejo 2:2 del ectodominio SCF-Kit. La figura 2A muestra un diagrama de cintas del complejo SCF-Kit 2:2. La codificación de color de D1 a D5 es la misma que en la figura 1, y SCF tiene color magenta. Los términos N y C de Kit y SCF están marcados. Los enlaces de disulfuro en D1 y D5 se muestran en bolas y varas, con los átomos de azufre convirtiéndolos en color naranja. Los carbohidratos enlazados por asparagina se representan en un modelo de vara. La flecha marca una cavidad grande en el complejo SCF-Kit 2:2. La figura 2B muestra representaciones de superficie del complejo 2:2 del ectodominio SCF-Kit. La figura muestra una vista superior (superior), vista de superficie (izquierda central), vista lateral (derecha central) y vista inferior (inferior). La codificación de color es la misma que en A. Las vistas muestran que un dímero SCF interactúa en forma simétrica con D1, D2 y D3 de dos ectodominios Kit correspondientes. Además, los ectodominios Kit forman interacciones homofílicas a través de los contactos laterales entre D4 (naranja) y entre D5 (rosa) de dos receptores vecinos.

Las figuras 3A-F ilustran el reconocimiento SCF mediante Kit. La figura 3A muestra vistas de la interfase SCF-kit. Los aminoácidos en las superficies enterradas en el ectodominio SCF y Kit, son visualizados extrayendo las dos moléculas. La figura muestra la superficie molecular de Kit D1-D2-D3 (izquierda) y SCF (derecha). Los aminoácidos ácidos se muestran en color rojo, los aminoácidos base en color azul, los aminoácidos polares en color naranja y los aminoácidos hidrofóbicos en color amarillo. Están dentro de un círculo los sitios de enlace I, II y III SCF en Kit. La figura 3B ilustra complementariedad en el potencial electrostático en la interfase de ligando-receptor. El panel derecho muestra una vista que sigue una rotación de 180° a lo largo del eje vertical de la superficie electrostática presentada en el panel izquierdo. El potencial de superficie electrostática de D1-D2-D3 superimpuesta en las superficies moleculares con una impresión de un diagrama de dibujo animado de SCF enlazado está en color verde. El panel derecho ilustra el potencial de superficie electrostática de Kit enlazada por SCF en color azul (positivo) y rojo (negativo). Kit se muestra en una forma de diagrama de cintas en color cían. Las figuras 3A-E muestran vistas de acercamiento el sitio I (C), sitio II (D) y sitio III (E) de la interfase SCF-Kit. SCF tiene color verde y Kit color cian. Los aminoácidos de interacción están marcados, los enlaces de hidrógeno se dibujan como líneas amarillas punteadas, y los elementos de estructura secundarios están marcados en las cintass y hebras.

Las figuras 4A-C ilustran cambios de conformación en SCF al momento del enlace a Kit. La figura 4F muestra que el ángulo entre los dos protomeros SCF está alterado en el enlace Kit. La vista muestra un diagrama de dibujo animado de SCF libre (verde) y SCF enlazado a Kit (magenta). La superimposición de un promotor SCF (izquierda) revela un movimiento angular de aproximadamente 5°C del segundo promotor (derecha), tal como se mide para la hélice aC. Las hélices están marcadas y mostradas como cilindros. La figura 4B ilustra el cambio en conformación en el N-término de SCF al momento del enlace Kit. El sitio III de Kit se muestra como una superficie molecular (gris), el N-término de SCF libre se muestra en color verde y el de SCF enlazado a Kit en color magenta. El enlace de disulfuro entre Cys4' y Cys89' se muestra como esferas color amarillo. Los aminoácidos clave están marcados y se muestran como un modelo de vara. La figura 4C ilustra el cambio en conformación en el lazo aC-p2 de SCF al momento del enlace al sitio I de Kit. La codificación de color es la misma que en B.

Las figuras 5A-B ilustran la reconfiguración de Kit D4 y D5 al momento del enlace SCF. La figura 5A muestra la reconfiguración de D4 y D5 en el complejo SCF-Kit La superimposición de D3 del monómero Kit con D3 de Kit enlazado a SCF (ambos en color azul) muestra que D4 de la forma enlazada (rojo) se mueve 22° en forma relativa a la posición de D4 de la forma libre (verde). La superimposición (panel derecho) de D4 de las dos formas (ambas en color azul) muestran que D5 de la forma enlazada SCF (rojo) se mueve 27° en forma relativa a las posiciones de D5 de la forma libre (verde). Los dos paneles inferiores muestran vistas de acercamiento de las regiones de articulación de las interfases D3-D4 y D4-D5 de las formas monoméricas (verde) y homodiméricas (rojas). La figura 5B muestra una representación de superficie de D4 y D5 de la Kit ocupada por SCF (panel superior), vista en la misma orientación que en la figura 2. La indicación color negro muestra la ubicación de D4 y D5 de los monómeros del ectodominio Kit puenteados mediante el enlace SCF a la región de enlace de ligando. La re-configuración de D4 y D5 conduce a un movimiento del C-término de los dos ectodominios vecinos de 75A a 15Á entre cada uno. El panel inferior muestra una vista desde la membrana celular (vista inferior) del complejo SCF-Kit. Se debe observar una rotación de 90° a lo largo del eje-x. La codificación de color de D1 y D5 es la misma que en la figura 1.

Las figuras 6A-D ilustran vistas de las interfases D4-D4 y D5-D5. La figura 6A (panel superior) muestra un mapa de densidad de electrón 2Fo-Fc delineado en un nivel 1.1 s que muestra una vista de la interfase D4-D4. Los esqueletos de los promotores Kit se representa como tubos color rosa y amarillo, respectivamente. Una vista cercana (panel inferior) de la interfase D4-D4 de los dos ectodominios vecinos. Los enlaces de hidrógeno de intercadena formados entre Arg381 y Glu386, de los D4 adyacentes están en color amarillo. Los aminoácidos claves están marcados y se muestran como un modelo de vara. Los elementos de estructura secundaria se marcan de acuerdo con la nomenclatura IgSF. La figura 6B ilustra la conservación del motivo de dimerización D4-D4 a través del miembro de las familias RTK tipo III y tipo V. Los residuos 370-398 de Kit humana (AAC50969.1) (SEQ ID NO: 94) alineados con las secuencias de ratón (AAH75716.1) (SEQ ID NO: 95), pollo (NP_989692.1 ) (SEQ ID NO: 96), xenopus laevis (AAH61947) (SEQ ID NO: 97), salamandra (AAS91161.1) (SEQ ID NO: 98) y pez cebra (homólogos tipo A (SEQ ID NO: 99) y B (SEQ ID NO: 100) (NP_571128, XP_691901). También se muestran secuencias de aminoácido de CSF1R de humano (P07333) (SEQ ID NO: 101), ratón (P09581) (SEQ ID NO: 102) y torafugu tipo A (SEQ ID NO: 103) y B (SEQ ID NO: 104) (P79750, Q8UVR8), y las secuencias de PDGFRa y PDGFRP de humano (SEQ ID NOS 105 y 107, respectivamente) (P16234, P09619) y ratón (SEQ ID NOs: 106 y 108, respectivamente) (NP_035188, P05622). Las secuencias de aminoácido de las RTKs tipo-V de VEGFR humano tipo 1 a 3 (SEQ ID NOs: 109-111, respectivamente, en orden de aparición) (séptimo dominio tipo Ig) (P17948, P35968 y P35916) también se presentan. Los elementos de estructura secundaria en Kit están marcados en la parte superior de la alineación de secuencia. Los residuos conservados de Arg381 y Lys383, Leu382 y Leu379, Glu386 y Gly388 tienen color azul, amarillo, rojo y verde, respectivamente. La figura 6C ilustra un diagrama de cintas de una interfase D5-D5. Las hebras A y G de dos promotores Kit adyacentes, participan en la formación de la interfase D5-D5. La interfase D5-D5 se mantiene mediante interacciones laterales entre Tyr418 y Asn505 de dos receptores vecinos probablemente a través de ion(s) o molécula(s) de agua. La figura 6D ilustra las superficies de potencial electrostático de D4 y D5 de Kit. Las figuras muestran una vista de la superficie de interacción D4-D4 (derecha) y una vista siguiendo 90° de rotación a lo largo del eje vertical (izquierda). La posición del parche ácido y las interfases D4-D4 están en círculos y se marca la interacción de los residuos Arg381 y Glu386.

Las figuras 7A-C ilustran mutaciones de ectodominio Kit implicadas en cáncer y otras enfermedades, y el mecanismo de Kit y otra activación RTK. La figura 7A ilustra las mutaciones responsables de la pérdida de función del rasgo moteado que se muestran en el panel izquierdo. Los diagramas de cintas de D1 (azul), D2 (verde) y D3 (amarillo) y las representaciones de superficie de SCF (gris). Los aminoácidos mutados están en color rojo. Las mutaciones de ganancia de función responsables de GIST, SLC y AML se muestran en el panel derecho. La representación de superficie D4 y D5 en la forma homodimérica están en color gris. Ala502 y Tyr503 las cuales están duplicadas en GIST, se muestran en color azul, y las eliminaciones y mutaciones de inserción en proximidad a Asp419 (AML y NCLL) se muestran en color verde. Se debe observar que las mutaciones de activación Kit, están confinadas a la interfase D5-D5. La figura 7B muestra que la activación Kit está comprometida por mutantes de punta en la interfase D4-D4. Las células HEK293 que expresan temporalmente Kit tipo natural (WT), las mutaciones de punta R381A o E386A en D4, fueron estimuladas con 10ng/ml de SCF durante seis minutos a una temperatura de 37°C tal como se indica (panel superior izquierdo). Los Usados de células no estimuladas o estimuladas con SCF fueron sometidos a inmunoprecipitación (IP) con anticuerpos anti-Kit seguido de SDS-PAGE e inmunomanchado (IB) con anticuerpos ya sea anti-Kit o anti fosfotirosina (p-Tyr). La cuantificación densitométrica de autofosforilación de tirosina de Kit de inmunomanchados anti-p-Tyr (panel superior derecho). Las células 3T3 que expresan en forma estable Kit tipo natural (WT) o el mutante R381A, fueron tratadas con diferentes concentraciones de SCF. Los lisados de células no estimuladas o estimuladas con SCF fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Kit seguido de SDS-PAGE e inmunomanchado con anticuerpos anti-Kit o anti-p-Tyr (panel inferior izquierdo). El ensayo de desplazamiento de 1251-SCF enlazado por célula utilizando células SCF.3T3 nativas que expresan WT (¦), R381A (?), R381A/E386A (?), o una cinasa negativa Kit (A), se trataron con 1251-SCF en la presencia de concentraciones en incremento de SCF nativo. El EC50 (concentración de ligando que desplaza el 50% de 125I-SCF enlazada a c-Kit) de SCF hacia Kit WT (1.1 nM), es comparable con el EC50 de SCF hacia R381A (1.0 nM), R381A/E386A (0.8 nM) o el mutante de cinasa negativa Kit (1.4 nM). La figura 7C muestra modelos para Kit y otra activación RTK operada por moléculas SCF solubles (panel izquierdo) o ancladas por membrana (panel derecho) expresadas en la superficie celular de una célula vecina. SCF que enlaza al módulo de enlace del ligando D1-D2-D3, lleva el C-término de los dos monómeros de ectodominio Kit enlazados dentro del 75A de cada uno de los otros. La flexibilidad de las articulaciones D3-D4 y D4-D5 permite las interacciones D4-D4 y D5-D5 laterales que llevan el C-término de dos ectodominios vecinos dentro de 15A de cada uno de los otros. En consecuencia, la proximidad incrementada y la concentración local de los dominios citoplásmicos Kit, conduce a autofosforilación de residuos de tirosina reguladores en el dominio de cinasa que da como resultado la activación PTK. (Se debe observar que la activación PTK no está dibujada en el modelo). El reclutamiento y activación de un complemento de moléculas de señalización celular, procederán después de la fosforilación de tirosinas clave en el dominio citoplásmico. El modelo está basado en la estructura SCF libre, Kit libre de ligando, complejo SCF-Kit y estructura Kit PTK (entradas PDB 1QZJ, 1R01 y 1T45). Las regiones cuyas estructuras no han sido determinadas, fueron modeladas utilizando una predicción de estructura secundaria (hélices verdes y lazos negros). SCF tiene color magenta, el ectodominio Kit color azul y el equipo PTK color azul claro.

La figura 8 ilustra una alineación de secuencia a base de estructura de RTKs tipo III, con base en la estructura de ectodominio Kit, y la alineación a base de estructura de los ligandos de la familia RTKs tipo III. Cada fila muestra la alineación de un dominio tipo Ig individual. Las secuencias de aminoácido fueron alineadas en forma manual con base en las características de multiplicación IgSF, tal como lo determina (Harpaz y asociados. (1994) J Mol Biol 238: 528-539) y dentro del acuerdo con la predicción de estructura secundaria de los miembros de la familia tal como lo calcula Jpred (Cuff y asociados. (1998) Bioinformatics 14: 892-893). Los aminoácidos marcados en color rojo representan los aminoácidos que determinan la multiplicación de IgSF. Las hebras ß están marcadas mediante flechas y a-hélices mediante resortes arriba de la secuencia, junto con la numeración de Kit humana y SCF humano. Los residuos del sitio de enlace de ligando que muestran capacidad de acceso del solvente reducida al momento del enlace de ligando, están marcados con asteriscos. El sitio I tiene color negro, el sitio II color rojo y el sitio III verde. Se utiliza el mismo código de color para etiquetar la interacción de los residuos de aminoácido en SCF. El lazo D4 EF que es responsable de la interacción D4-D4 está en un cuadro en color cian. Las secuencias utilizadas para la alineación son: Kit humana (AAC50969), Kit de ratón (AAH75716), CSFR1 humana (P07333), PDGFRa humana (P16234), PDGFR humana (P09619) y Flt3 humana (P36888). Para la alineación de estructura de ligando, las entradas PDB de SCF ( 1 EXZ), CSF (1HMC), Flt3L (1 ETE) fueron superimpuestas utilizando Lsqman (Kleywegt y Jones, 1995), aunque la secuencia de SCF de ratón (NP_038626) estuvo alineada a la SCF humana utilizando ClustalW. La figura describe las SEQ ID NOS 112-147, respectivamente, en orden de aparición.

La figura 9 proporciona una vista estéreo de la estructura general del complejo 2:2 SCF-Kit. El modelo de cintas del complejo 2:2 SCF-Kit se muestra en una representación estéreo. La vista y el código de color son las mismas que en la figura 2A.

Las figuras 10A-B ilustran la conservación de aminoácido en la superficie del complejo SCF-Kit. La figura 10A muestra el patrón de conservación con color codificado del complejo de estructura de cristal SCF-Kit. Se utilizaron de cían a marrón para marcar aminoácidos de variables a conservados. La figura 10B muestra una visualización de SCF y Kit, extrayendo fuera las dos moléculas de cada una de las otras. El Sitio I, Sitio II y Sitio III y la región de interacción D4-D4 (interfase D4-D4), están dentro de un círculo.

Las figuras 11A-B ilustra las densidades de electrón en la interfase SCF-Kit. La figura muestra una vista parcial del sitio-ll del complejo 2:2 SCF-Kit con un mapa de 2Fo-Fc electrón-densidad dibujado alrededor de Kit en el nivel 2 s. La cadena principal Kit se dibuja en tubos amarillos excepto para las cadenas laterales marcadas. La figura 11 B ilustra las densidad de electrón de la interfase SCF-Kit, mostrando una vista parcial de la Kit libre con un mapa experimental dibujado alrededor de Kit en el nivel 1.5 s. La orientación y código de color son las mismas que en la figura 12A.

Las figuras 12A-D ¡lustran vistas de pares superimpuestos de dominios tipo Ig de Kit libre y enlazada por SCF. Los D1, D2, D3 y D4 individuales de la Kit libre y enlazada por SCF, están superimpuestos. Se muestran estructuras de pares de los dominios tipo Ig (A) D1 y D2, (B) D2 y D3, (C) D3 y D4 y (D) D4 y D5 en donde el dominio tipo Ig superimpuesto en cada par, tiene color azul, y el segundo dominio tipo Ig (no superimpuesto) está en color verde para el ectodominio libre, y en rojo para el ectodominio enlazado SCF. Estas figuras muestran que virtualmente no tienen lugar los cambios en las estructuras de cada uno de los cinco dominios tipo Ig Kit individuales al momento del enlace SCF, y que la función D1-D2-D3 como una unidad de enlace de ligando, equilibrada, hacia el enlace SCF. En contraste, tienen lugar grandes reajustes en las interfases D3-D4 y D4-D5 en Kit enlazado por SCF.

Las figuras 13A-B ilustran el potencial de superficie electrostática de la estructura de complejo SCF-Kit. La figura 13A muestra en forma específica el complejo SCF-Kit 2:2. La figura 13B ilustra el potencial de superficie electrostático de la estructura de complejo SCF-Kit, específicamente una visualización del potencial de la superficie electrostática de Kit después de que SCF se extrajo fuera del complejo SCF-Kit 2:2. Las superficies cargadas en forma positiva y negativa tienen color azul y rojo, respectivamente. La región de enlace SCF y la interfase D4-D4 están dentro de un círculo.

La figura 14 ilustra la inhibición de la activación Kit inducida por SCF a través de anticuerpos anti Kit-D5. Las células 3T3 que expresan Kit, fueron incubadas con concentraciones en incremento de D5 anti-Kit (dirigido contra el quinto dominio tipo Ig de Kit) o como controles con el ectodominio anti-SCF (dirigido contra el ligando SCF) o ectodominio anti-Kit (dirigido contra todo el ectodominio Kit).

La figura 15 ilustra la inhibición de la activación Kit inducida con SCF utilizando D4 Kit recombinante. Las células 3T3 que expresan Kit, fueron incubadas con concentraciones en incremento de Kit-D4 recombinante durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de 10 minutos de estímulo SCF.

La figura 16A demuestra que la activación PDGFR inducida por PDGF se evita mediante mutaciones de punta en D4. Las PDGFR-/-MEFs que expresan los mutantes WT PDGFR o D4 (R385A y E390A) se dejaron sin alimentación en suero durante la noche y se estimularon con la concentración indicada de PDGF BB durante 5 minutos. Los Usados celulares fueron inmunoprecipitados con anticuerpos anti-PDGFR, seguido de SDS-PAGE es inmunomanchado con anticuerpo de anti-fosfotirosina 4G10. Las membranas fueron desprendidas, y se volvieron a manchar con anticuerpos de etiqueta anti-flag para determinar los niveles totales de PDGFR.

La figura 16B demuestra que la señalización mediante PDGFR se evita mediante mutaciones de punta en D4. PDGFR-/-MEFs que expresan mutantes WT PDGFR y D4 (R385A y E390A) de dejaron sin alimentación en suero durante la noche y se estimularon con las concentraciones indicadas de PDGF BB durante 5 minutos a una temperatura de 23°C. Se sometieron a SDS-PAGE cantidades ¡guales de lisados de célula total (TCL), y se analizaron mediante inmunomanchado con anti-fosfo-MAPK, MAPK, fosfo-Akt y Akt, respectivamente. Este experimento muestra que tanto la respuesta MAPK como la activación Akt se evitan mediante mutaciones de punta en D4.

La figura 16C demuestra que las mutaciones de punta en D4 que evitan la activación PDGFR, no interfieren con dimerización PDGFR inducida con PDGF. La expresión DGFR-/-MEFs WT o el muíante E390A, se dejaron sin alimento en suero durante la noche, seguido de incubación con la cantidad indicada de PDGF en amortiguador DMEM/50mM Hepes (pH7.4) a una temperatura de 4°C durante 90 minutos. Después de eliminar el ligando no enlazado, las células fueron incubadas con 0.5 mM de suberato de disuccinimidilo (DSS) en PBS durante 30 minutos. Los Usados de células no estimuladas o estimuladas fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-PDGFR seguido de análisis SDS-PAGE, y mediante inmunomanchado con anticuerpos anti-flag (panel izquierdo) o anticuerpos anti-pTyr (panel derecho).

La figura 17 muestra cavidades en la región de articulación D3-D4. Se dispersan diversas cavidades en la interfase D3-D4 en la estructura de monómero de ectodominio. Los aminoácidos implicados en la definición de las cavidades se resumen en la tabla 4 (más adelante). Al momento de la formación de una interacción homotípica entre dos receptores Kit, se altera la región de articulación D3-D4 dando como resultado la formación de una cavidad profunda creada por los siguientes residuos: K218, S220, Y221, L222 de D3 y F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, 1371, Y373 de D4. La figura 17 muestra un diagrama de cintas de la región de articulación D3-D4 de los monómeros no ocupados (A) y los dímeros enlazados por SCF (B), y una representación de malla del bolsillo D3-D4.

La figura 18 muestra cavidades en la región de articulación D4-D5. Se forma una pequeña cavidad mediante el lazo AB y el lazo EF de D4, y el enlazador que conecta D4-D5 y parte del lazo DE y el lazo FG del D5 del monómero Kit. Los residuos que definen las cavidades se resumen en la tabla 4 (más adelante). El tamaño y la forma de las cavidades se cambian en la estructura dimérica del ectodominio Kit. Las cavidades mayores formadas mediante el lazo EF y la hebra G de D4, el enlazador D4-D5 y la hebra B y el lazo DE de D5 se localizan debajo del lazo EF de D4¡ una región crítica para la formación de la interfase homotípica D4. Se debe observar que el lazo DE de D5 que se localiza cerca de las cavidades, puede tener mayor flexibilidad tal como se revela mediante la menor calidad de las densidades de electrón de las estructuras Kit tanto no enlazadas como ocupadas. La figura 18 muestra un diagrama de cintas de monómeros no ocupados (A) y dímeros SCF (B) y una representación de malla de una cavidad poco profunda alrededor de la región de articulación D4-D5.

La figura 19 muestra una cavidad en la región que trasmite las interacciones homotípicas D4. Se localiza una superficie cóncava formada mediante el lazo CD y el lazo EF de Kit D4 a la derecha arriba de la interfase homotípica D4. Los residuos Y350, 353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390 de D4 proporcionan un área de superficie de aproximadamente 130 A2 para la superficie cóncava en la estructura dimérica de ectodominio. La cadena lateral de Glu386 que desempeña un papel importante en la interfase homotípica D4 se proyecta hacia el centro de la superficie. Una característica de la superficie cóncava es un parche hidrofóbico pequeño rodeado por residuos cargados (Glu386 y Lys358). El tamaño y accesibilidad de la superficie se altera al momento de las interacciones D4:D4 homotípicas con cambios que tienen lugar en la conformación del lazo CD que queda doblado hacia arriba hacia la parte superior del dominio. Los residuos implicados en la formación de una superficie cóncava se resumen en la tabla 4 (más adelante). El panel A en la figura que se encuentra a continuación, muestra un diagrama de cintas del dominio D4 no ocupado de Kit (dorado) colocado sobre el Kit D ocupado por ligando (no mostrado) con diferentes conformaciones de los lazos CD y EF entre las estructuras de ectodominio ocupadas por ligando (verde) y no ocupadas (rojo). Los residuos críticos para las interacciones D4:D4 se muestran en un formato de modelo de vara. Los paneles B y C muestran diagramas de cintas de estructuras Kit no ocupada (figura 19B) y Kit ocupada por SCF (figura 19C) y una presentación de malla de una cavidad poco profunda arriba de la interfase homotípica D4.

La figura 20 muestra una superficie cóncava en las regiones D2 y D3 de enlace de ligando. Se localiza una superficie cóncava poco profunda en parte de la superficie de enlace de ligando de D2 y D3. Los residuos implicados en el bolsillo pequeño son Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 y F208 de D2 y V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269 de D3. El bolsillo es creado por un parche hidrofóbico pequeño rodeado por residuos electrof íl icos. No existe una alteración importante entre las estructuras Kit no ocupada y ocupadas por SCF, con un área de superficie enterrada general de aproximadamente 500 A2. Las figuras A y B muestran diagramas de cintas de Kit ocupado (A) y Kit enlazado por SCF (B) y una presentación de malla del bolsillo D2-D3.

La figura 21 ilustra un análisis de secuencia base de estructura y el modelado de homología de la región próxima de membrana de los receptores PDGF. La figura 21A ilustra una alineación de las secuencias de aminoácido (SEQ ID NOS 148-157, respectivamente, en orden de aparición) de D4 de PDGFRa, PDGFRp y Kit. Los aminoácidos de residuos clave del doblez IgSF y los residuos del centro del doblez-lg de D4 de la estructura Kit humana tienen color rojo y verde, correspondientemente. Los dos residuos ácidos y base claves responsables de la interacción homotípica D4, están dentro de un cuadro color azul y rojo, respectivamente. Las posiciones que corresponden a los residuos de cisteína que forman un enlace de disulfuro conservado en el dominio tipo Ig (B5 y F5), están marcados con asteriscos. Las etiquetas ß se marcan con flechas debajo de la secuencia Kit. Los elementos de estructura secundaria se marcan de acuerdo con la nomenclatura IgSF. La figura 21B ilustra un modelo de una región próxima de membrana de dominio extracelular de PDGFR. La región próxima de membrana del ectodominio PDGFF^ tiene color blanco, y se muestra en la forma de cintass con una superficie molecular transparente (D4 en color naranja, y D5 en color rosa; panel izquierdo). Una vista más cercana (panel derecho) de la interfase D4-D4 de dos moléculas PDGFRP vecinas, demuestra que la interacción entre D4 se transmite mediante residuos Arg385 y Glu390 proyectados de dos lazos EF adyacentes. Los aminoácidos clave son marcados y se muestran como un modelo de vara.

La figura 22 ilustra los resultados de experimentos que demuestran que la activación PDGFR inducida por PDGF está comprometida por mutaciones en D4. La figura 22A muestra los resultados de un experimento que demuestra que la autofosforilación de tirosina inducida por PDGF de PDGFRp se ve fuertemente comprometida en células que expresan los mutantes E390A, R385A, RE/AA y RKE/AAA de PDGFR . La figura 22B es una gráfica que muestra las curvas de desplazamiento de PDGFR3s muíante y tipo natural. Los valores IC50 fueron determinados mediante una adaptación de curva con Prism4. La figura 22C ilustra el resultado de un inmunomanchado que demuestra que las mutaciones R385A, E390A o RE/AA no influencian la actividad de cinasa de tirosina intrínseca de PDGFR.

La figura 23 ilustra los resultados de un experimento de inmunoprecipitación que demuestra que PDGFR estimulado con PDGF mutado en el dominio D4, se expresa en la superficie celular en la forma de dímeros inactivos. Los lisados celulares fueron inmunoprecipitados con anticuerpos anti-PDGFR y los inmunopelets fueron analizados mediante SDS-PAGE e inmunomanchados con anticuerpos anti-flag (panel izquierdo) y anticuerpos de antifosfotirosina (panel derecho) respectivamente.

La figura 24 ilustra los resultados de un experimento de inmunoprecipitación que demuestra que las respuestas celulares inducidas por PDG están comprometidas por mutaciones en el mutante PDGFRP D4.

La figura 25 ilustra los resultados de un experimento que demuestra que la estimulación PDGF de la formación de anillo de actina, está comprometida en MEFs que expresan mutantes PDGFR D4. Aunque aproximadamente el 83% de los MEFs que expresan WT PDGFR exhibieron una formación circular de anillo de actina, únicamente el 5% de las células mutantes PDGFR D4 mostró una formación de actina circular similar después de 2 minutos de estimulación con 50 ng/ml de PDGF. Además, la formación de anillo de actina circular temporal que se eleva en EFs que expresa PDGFR después de 2 a 5 minutos de estimulación PDGF, fue detectada débilmente en células que expresan R385A, E390A o los mutantes RE/AA PDGFR.

La figura 26 ilustra los resultados de experimentos que demuestran que la internalización PDGFR y la degradación PDGFR transmitida por ubiquitina están comprometidas por mutaciones en D4 de PDGFR. La figura 26A es una gráfica que demuestra que las cinéticas de internalización de PDGF etiquetado con 125l enlazado a MEFs que expresan WT PDGFR, es mucho más rápida que las cinéticas de internalización de PDGF etiquetadas con 125l enlazadas a las células que expresan E390A, R385A o el RE/AA PDGFR. La figura 26B muestra que la cinéticas de degradación de R385A, E390A o los mutantes RE/AA PDGFR se atenuó fuertemente; y aunque la mitad de los WT PDGFRs fueron degradados en 1.5 horas de estímulo PDGF, la vida media de los mutantes PDGFR D4 fue extendida aproximadamente de 4 a 6 horas. La figura 26C ilustra un experimento que muestra que la estimulación inducida por PDGF de la ubiquitinación de E390A PDGFR, también se redujo fuertemente en comparación con WT PDGFR bajo condiciones similares.

La figura 27 ilustra los resultados de experimentos que demuestran que la interrupción de la interfase D4 bloquea las mutaciones oncogénicas en KIT. La estimulación SCF de KIT tipo natural, conduce a un aumento de la activación KIT revelada mediante autofosforilación de tirosina mejorada de KIT. El experimento muestra además que un muíante de repetición D5 oncogénico de KIT, es constitutivamente autofosforilado por tirosina. En contraste, la repetición D5/mutante E386A bloquea la autofosforilación de tirosina constitutiva de KIT transmitida por la mutación de repetición D5 oncogénica.

La figura 28 ilustra los resultados de un experimento de inmunomanchado que demuestra que los anticuerpos dirigidos contra un péptido que corresponde al motivo de interacción homotípica de KIT-D4, reconocen el receptor KIT de longitud total.

La figura 29A ilustra una alineación de secuencia múltiple a base de estructura de una región de lazo-EF anticipada de D7 de VEGFR1 y VEGFR2 de diferentes especies. Los aminoácidos clave en la estructura Ig del grupo-I se señalan en color verde, y el par Arg/Asp conservado en el lazo EF se señala con color rojo. La figura 29B ilustra una comparación de una región de lazo EF anticipada de D4 de VEGFR y D4 de KIT, CSF1R y PDGFRs (RTK tipo-lll). Los aminoácidos clave en la estructura Ig del grupo-I se señalan en color verde, y el par Arg/Asp o Glu conservado en el lazo EF se señala en color rojo. Los aminoácidos no conservados con una carga opuesta en el lazo EF, se señalan con color azul. Los motivos de "conner"-Y conservados se marcan con *.

La figura 30 demuestra que la activación inducida por ligando de VEGFR2 está comprometida por mutaciones en la región de lazo EF de D7, pero no afectada por una mutación en la región de lazo EF de D4. La figura 30A demuestra que las células HEK293 que expresan temporalmente VEGFR2 tipo natural, los mutantes VEGFR2 R726A o E731A fueron estimulados con una cantidad indicada de VEGF durante 5 minutos a una temperatura de 37°C. Los Usados de células no estimuladas, y estimuladas con VEGF fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-VEGFR2 seguidos de inmunomanchado (IB) con anticuerpos anti-pTyr o con anticuerpos anti-VEGFR2. El Usado de célula total del mismo experimento fue analizado mediante SDS-PAGE, seguido de inmunomanchado con anticuerpos anti-fosfoMAPK (pMAPK) o anti-MAPK. La figura 30B demuestra que las células 3T3 con inanición de suero que expresan en forma estable el receptor quimérico WT VEGFR2-PDGFR o receptores quiméricos que albergan mutaciones en la región D7 (mutantes dobles R726A, D731A o R726/D731 RD/2A) fueron estimuladas con VEGF durante 5 minutos a una temperatura de 37°C. Los lisados de células no estimuladas o estimuladas con VEGF, se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra la región citoplásmica del receptor quimérico seguido de inmunomanchado ya sea con anticuerpos anti-pTyr o anti-tag (FLAG), respectivamente. La figura 30C demuestra que las células 3T3 sin alimento de suero que expresan en forma estable el receptor quimérico WT VEGFR1-PDGFR o los receptores quiméricos que albergan la mutación en la región D7 (mutaciones dobles R721A, D725A o R721D725/2A) fueron estimuladas con VEGF durante 5 minutos a una temperatura de 37°C. Los Usados de células no estimuladas o estimuladas con VEGF se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos dirigidos contra la región citoplásmica de receptor quimérico seguido de inmunomanchado ya sea con anticuerpos anti-pTyr o anti-tag (FLAG), respectivamente. La figura 30D demuestra que las células 3T3 que expresan el receptor quimérico WT VEGFR2-PDGFR o receptores quiméricos que albergan mutaciones en la región D4 (mutaciones dobles D392A o D387/R391A) fueron analizadas tal como se describe en la figura 30A.

La figura 31 ilustra la estructura del dímero D7 del ectodominio VEGFR2. La figura 31A ilustra un diagrama de cintas y una superficie molecular transparente de la estructura de homodímero D7 (vista lateral). Asp731 y Arg726 se muestran como un modelo de vara. La figura 31B ilustra una vista cercana de la ¡nterfase D7 homotípica de las dos moléculas vecinas (rosa y verde). Los puentes de sal formados mediante Asp731 y Arg726 se muestran como líneas punteadas. La figura 31C ilustra la distribución de carga del homodímero D7 (vista lateral) como un modelo potencial de superficie (panel izquierdo). Vista de la superficie D7 que transmite contactos homotípicos (panel derecho). La figura 31, ilustra un mapa de electrón 2Fo-Fc delineado en el nivel 1.1s, que muestra una vista de la ¡nterfase D7-D7. Los esqueletos de los promotores VEGFR D7 se representan como tubos rosas y amarillos, respectivamente.

La figura 32 ilustra la superposición de la estructura de D7 de VEGFR2 con la estructura de D4 del complejo KIT-SCF dimérico. La colocación de la estructura VEGFR D7 (código PDB ID: 3KVQ) y el dímero KIT en complejo con SCF (código PDB ID: 2E9W) (panel izquierdo). Una vista más cercana de las regiones D7 y D4 superimpuestas, revela una alta similitud en el ajuste de dominio y contactos homotípicos (panel derecho). VEGFR D7 se ilustra en color verde y el lazo EF está en color amarillo. D4 de KIT se ilustra en color gris y su lazo EF está en color naranja.

La figura 33 ilustra un análisis filogenético de VEGFR1 y VEGFR2. La figura 33A ilustra la ubicación del lazo EF conservado en RTKs tipo III y tipo V de diversas especies. Los dominios tipo Ig que contienen el motivo de lazo EF conservado están marcados en color azul. La figura 33B ilustra el patrón de conservación codificado por color de la región VEGFR2 D7. Las secuencias de aminoácido de VEGFR humano se utilizaron como una consulta para investigar bases de datos no redundantes (nr) para secuencias homologas, utilizando PSI-BLAST (Altschul y asociados., J. Mol. Boiol., 215(3):403-410 (1990)). La alineación de secuencia de D7 se llevó a cabo utilizando ClustalW2 {Thompson y asociados, Nucleic Acids Res., 22(22):4673-4680 (1994)), ajustada en forma manual con base en el doblez IgSF restringe 20 residuos clave. La alineación de secuencias de aminoácido fue presentada en el servidor Consurf 3.0 (Landau y asociados., Nucleic Acids Res., 33 (Web Server issue): W299-302 (2005)), para generar rangos de evolución normalizados por probabilidad máxima para cada posición. Se utilizaron colores de cían a marrón para etiquetar aminoácidos de variables a conservados. La figura 33C ilustra el árbol filogenético de VEGFR1 y VEGFR2 que se generan a través de método de unión-vecino con base en el uso de Clustal W2. Las secuencias de aminoácido utilizadas en el análisis incluyen: VEGFR2_HUMAN (gi: 11321597), VEGFR2 DOG (gi:114158632), VEGFR2_HORSE (gi : 194209154), VEGFR2 CATTLE (gi: 158508551 ), VEGFR2_RAT (gi:56269800), VEGFR2_MOUSE (gi:27777648), VEGFR2_CHICK (gi:52138639), VEGFR2 QUAI L (gi: 1718188), VEGFR2 ZEBRARISH (gi:46401444), VEGFR1_HUMAN (g¡:143811474), VEGFR1_M0USE (gi: 148673892), VE FG R 1 _RAT (gi:149034835), VEFGR1_H0RSE (gi : 149730119), VEGFR1_CHICK (g i : 82105132 ), VEG F R 1 _ZEB RAF I S H (gi:72535148), VEGFR SEAURCHIN (gi: 144226988), VER 1 _C_ELEGANS (gi:6003694), VER3_C_ELEGANS (gi:3877967), VER4_C_ELEGANS (gi : 3877968), PVR_DROSOPHILA (gi:45552252), VEGF R_SE ASQ U I RT (gi:198434052).

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona porciones, por ejemplo, anticuerpos o partes de enlace de antígenos de los mismos, moléculas pequeñas, moléculas peptídicas, aptámeros y adnectinas, que enlazan al ectodominio, por ejemplo, un dominio tipo Ig o una articulación entre los dominios tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora humana, por ejemplo, un receptor VEGF, tal como el VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDRIFIkl) y VEGFR3 (Flt4) humano. Las porciones de la presente invención pueden asegurar el ectodominio del receptor VEGF a un estado inactivo, inhibiendo de esta forma la actividad del receptor VEGF. En una modalidad de la presente invención, la porción asegura el ectodominio del receptor VEGF a un estado monomérico. En otra modalidad de la presente invención, la porción permite que el ectodominio del receptor VEGF se dimerice pero afecta la colocación, orientación y/o distancia entre los dominios tipo Ig de los dos monómeros (por ejemplo los dominios D7-D7 de un receptor VEGF), inhibiendo de esta forma la actividad del receptor VEGF. En otras palabras, la porción puede permitir una dimerización inducida por ligando de los ectodominios de receptor VEGF, pero afecta la colocación de los dos ectodominios en la interfase de superficie celular o altera o previene los cambios en conformación en los receptores VEGF, inhibiendo de esta forma la actividad de los receptores VEGF (por ejemplo, inhibiendo la internalización de receptor y/o inhibiendo la autofosforilación de tirosina del receptor y/o inhibiendo la capacidad que tiene el receptor de activar una trayectoria de señalización de corriente descendente. La presente invención está basada, al menos en parte, en descifrar las estructuras de cristal de todo el ectodominio del receptor VEGF VEGFR2. El descifrado de esta estructura de de cristal ha permitido la identificación de epítopes, por ejemplo, epítopes de conformación, a donde se pueden dirigir las porciones de la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "porción" pretende incluir cualquier porción que enlaza al ectodominio, por ejemplo, un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora, en donde la porción asegura el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora en un estado inactivo, por ejemplo, un estado monomérico, para antagonizar de esta forma la actividad de la cinasa de tirosina receptora. La porción puede ser un anticuerpo aislado o parte de enlace de antígeno del mismo; una molécula pequeña; una molécula peptídica (por ejemplo, una molécula peptídica diseñada con base en la estructura de un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora); un aptámero o una adnectina. En algunos aspectos, la porción enlaza a las regiones de articulación que conectan los dominios tipo Ig de la cinasa de tirosina receptora (por ejemplo, las regiones de articulación D3-D4 o D4-D5 de las RTKs tipo III).

En algunas modalidades, la porción enlazará a secuencias específicas del receptor VEGF humano, por ejemplo, residuos 718-727 de VEGFR1, Arg720 y Asp725 de VEGFR1, residuos 724-733 de VEGFR2, Arg726 y Asp731 de VEGFR2, residuos 735-744 de VEGFR3, o residuos Arg737 y Asp742 de VEGFR3. La porción enlazará en forma alternativa a secuencias específicas del receptor Kit humano, por ejemplo, los residuos 309-413, residuos 410-519, 381Arg y 386Glu, o 18Tyr y 505Asn de la Kit humana. Los residuos 309-413 comprenden el dominio D4 y los residuos 410-519 comprende el dominio D5 de la Kit humana, y se muestran en la presente invención como importantes para la dimerización del receptor Kit. Los residuos 381Arg y 386Glu son residuos en el dominio D4 de Kit que se muestran en la presente invención como importantes para la asociación no covalente del dominio D4, y por lo tanto, la dimerización del receptor. En forma similar, los residuos 4 8Tyr y 505Asn son residuos en el dominio D5 de Kit que se muestran en la presente invención, como importantes para dimerización del receptor. Un experto en la técnica apreciará que una porción que enlaza específicamente a los residuos antes mencionados, puede antagonizar con la actividad del receptor, por ejemplo, previniendo la dimerización de las dos moléculas Kit monoméricas o de receptor VEGF.

En modalidades adicionales, la porción enlaza a un residuo de aminoácido mutado en el receptor VEGF humano, en donde el residuo de aminoácido es al menos uno de Arg720 o Asp 725 de VEGFR1, Arg726 o Asp731 de VEGFR2, o Arg737 o Asp742 de VEGFR3. En modalidades adicionales, la porción enlaza a un residuo de aminoácido mutado en la Kit humana, en donde el residuo de aminoácido es al menos uno de 417Thr, 18Tyr, 419Asp, 421Leu, 420Arg, 503Tyr o 502Ala.

En una modalidad preferida, las porciones de la presente invención enlazan a uno o más residuos en el receptor Kit que hacen las cavidades o bolsillos pequeños descritos en la tabla 4 (más adelante). Por ejemplo, las porciones de la presente invención pueden enlazar a uno o más de los siguientes residuos en la región de articulación D3-D4 del receptor Kit: K218, S220, Y221, L222 del dominio D3 y F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, 1371, Y373 del dominio D4. Las porciones de la presente invención, también pueden enlazar a uno o más de los siguientes residuos que hacen una superficie cóncava en el dominio D4 del receptor Kit: Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390.

Aún en otra modalidad, las porciones de la presente invención enlazan a uno o más de los siguientes residuos, los cuales forman un bolsillo en la región de articulación D2-D3 del receptor Kit: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 y F208 del dominio D2 y V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269 del dominio D3.

Por lo tanto, en algunas modalidades, una porción de la presente invención puede enlazar a residuos de aminoácido contiguos o no contiguos, y funcionar como una cuña molecular que evita el movimiento requerido para colocar la región próxima de la membrana de la RTK a una distancia y orientación que permite la activación de cinasa de tirosina. Las porciones de la presente invención, también pueden actuar para prevenir las interacciones homotípicas o heterotípicas del receptor D4 o D5 o desestabiliza el sitio de interacción de ligando-receptor. En algunas modalidades preferidas, las porciones de la presente invención enlazan a uno o más de los siguientes residuos en el receptor Kit: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388.1371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431, o G432. Un experto en la técnica podrá apreciar que en algunas modalidades, las porciones de la presente invención pueden ser dirigidas fácilmente a los residuos correspondientes en otras RTKs tipo III, por ejemplo, los residuos que forman bolsillos o cavidades similares a los que están en la misma posición mediante alineación estructural o alineación de secuencia.

En una modalidad preferida, una porción de la presente invención enlaza a un epítope de conformación o un epítope discontinuo en una RTK tipo III. El epítope de conformación o discontinuo puede estar compuesto de dos o más residuos del dominio D3, D4, y/o D5 o las regiones de articulación D4-D5 o D3-D4 de una RTK tipo III, por ejemplo, el receptor Kit humano o el receptor PDGF. Por ejemplo, el epítope de conformación o discontinuo puede estar compuesto de dos o más residuos descritos en la tabla 4. En una modalidad particular, una porción de la presente invención enlaza a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206, V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268, y Y269. En modalidades similares, una porción de la presente invención puede enlazar a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados de uno de los siguientes grupos de aminoácidos:: P206, F208, V238, y S239; K127, A207, F208, y T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370.1371, y Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, y 1371; R224, V308, K310, G311, F340, P341, y D398; K218, A219, S220, N367, E368, y S369; K218, A220, E368, y S369; G384, T385, T411, K412, E414, y K471; Y408, F433, G470, K471, y L472; F324, V325, N326, y N410;D327, N410, T411, K412, y V497; G384, G387, V409, y K471; L382, G387, V407, y V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, y Y269; P206, F208, V238, y S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370.1371, y Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470, y K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432, y K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386, y T390; Y350, R353, y F355. Tal como se indicó anteriormente, las porciones de la presente invención pueden enlazar a todos de los residuos de aminoácido que forman un bolsillo o cavidad identificada en la tabla 4 o pueden enlazar a un subconjunto de residuos que forman el bolsillo o la cavidad. Quedará entendido que, en ciertas modalidades, cuando se hace referencia a una porción de la presente invención que enlaza a un epítope, por ejemplo, un epítope de conformación, la intención es que la porción enlace únicamente a los residuos específicos que elaboran el epítope (por ejemplo, el bolsillo y cavidad identificado en la tabla 4) y no a otros residuos en la secuencia de aminoácido lineal del receptor.

En una modalidad adicional, una porción de la presente invención enlaza un epítope de conformación, en donde el epítope está compuesto de dos o más residuos de aminoácido seleccionados de los péptidos descritos en la tabla 5. En una modalidad específica, el epítope de conformación está compuesto de uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un primer péptido y uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un segundo péptido, en donde el primero y segundo péptidos se seleccionan del grupo de péptidos descritos en la tabla 5. Por lo tanto, una porción de la presente invención puede enlazar un epítope de conformación, en donde el primero y segundo grupos de péptido de la tabla 5 son como se indican a continuación: Ala219-Leu222 y Thr304-Val308; Asp309-Gly311 y Arg224-Gly226; Thr303 - Glu306 y Ala219-Leu222; Asn367-Asn370 y Ser217-Tyr221 ; Ala339-Pro343 y Asn396-Val399; Ala339-Pro343 y Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 y Val374-His378; Asp357-Glu360 y Leu377-Thr380; et351-Glu360 y His378-Thr389; His378-Thr389 y Val323-Asp332; Val409-ue415 y Ala493-Thr500; Val409-lle415 y Ala431-Thr437; Val409-ile415 y Phe469-Val473; Val409-lle415 y Val325-Asn330; Val409-I Ie415 andArg381 -32Gly387; Gly466-Leu472 y Gly384-Gly388; Val325-Glu329 y Tyr494-Lys499 ; Thr411-leu416 y Val497-Ala502; I Ie415-Leu421 andAla502- Ala507; Ala502-Ala507 y Lys484-Thr488; y Ala502-Ala507 y Gly445-Cys450.

Las porciones de la presente invención, pueden enlazar a todos los residuos de aminoácido que forman el primero y segundo grupos de péptidos anteriores, pueden enlazar a un subconjunto de residuos que forman el primero y segundo grupos de péptido anteriores, pueden enlazar a un subconjunto de residuos que forman el primero y el segundo grupos de péptido. Quedará entendido que, en ciertas modalidades, cuando se hace referencia a una porción de la presente invención, que enlaza a un epítope, por ejemplo, un epítope de conformación, la intención es que la porción enlace únicamente a los residuos específicos que elaboran el epítope (por ejemplo, los péptidos específicos identificados en la tabla 5) y no a otros residuos en la secuencia de aminoácido lineal del receptor.

En otra modalidad, una porción de la presente invención, enlaza a un epítope de conformación o discontinuo compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en E33, P34, D72, E76, N77, K78, Q79, K158, D159, N250, S251, Q252, T253, K254, L255, N260, W262, H264, G265, E344, N352, R353, F355, T356, D357, Y362, S365, E366, N367, N370, y G466.

En otra modalidad, una porción de la presente invención enlaza a un epítope contiguo del receptor VEGF. En una modalidad, el epítope está contiguo está compuesto de dos o más residuos en el dominio D7 del receptor VEGF. En otra modalidad, el epítope contiguo es un epítope seleccionado del grupo que consiste en VAISSS de VEGFR 1, 678TTLDCHA684 de VEGFR 1, 685NGVPEPQ691 de VEGFR 1, 700KIQQEPG706 de VEGF R 1 , 707IILG710 de VEGFR1, 711PGS713 de VEGFR1, 71 STLFI718 de VEGFR1, 719ERVTEEDEGV728 de VEGFR1, 689VNVSDS694 de VEGFR3, 695LEMQCLV701 de VEGFR3, 702AGAHAPS708 de VEGFR3, 717LLEEKSG723 de VEGFR3, 724VDLA727 de VEGFR3, 728DSN 730 de VEGFR3, 731QKLSI735 de VEGFR3, y 736Q R VR E E D AG R745 de VEGFR3, 678TSIGES683 de VEGFR2, 68 IEVSCTA690 de VEGFR2, 691 SGN PP PQ697 de VEGFR2, 706TLVEDSG712 de VEGFR2, 713IVLK716 de VEGFR2, 7 7DGN719 de VEGFR2, 720RNLTI724 de VEGFR2 y 725RRVRKEDEGL734 de VEGFR2.

En otra modalidad, una porción de la presente invención enlaza a residuos de aminoácidos 385Arg y 390Glu de PDGFR3 humano, o los residuos correspondientes en PDGFRa. Los residuos 385Arg y 390Glu de PDGFR3 humano son análogos a los residuos 381Arg y 386Glu del receptor Kit y transmiten interacciones homotípicas D4-D4 de PDGFRp. Las porciones de la presente invención pueden ejercer su efecto inhibidor en la activación de receptor, previniendo interacciones homotípicas críticas (tal como puentes de sal formados entre 385Arg y 390 Glu de PDGFRp humano) entre las regiones próximas de membrana de las RTKs tipo III, que son esenciales para la colocación del dominio citoplásmico a una distancia y orientación esencial para la activación de cinasa de tirosina. Los experimentos aquí descritos demuestran que las interacciones homotípicas D4-D4 son indispensables para la dimerización de PDGFR y que la dimerización PDGFR3 es necesaria, pero no suficiente, para la activación de receptor. Por lo tanto, las porciones de la presente invención pueden permitir la dimerización de PDGFR3, evitando al mismo tiempo la activación. La alineación de secuencia a base de estructura ha mostrado que el tamaño del lazo EF, y los aminoácidos críticos, que comprenden interfase D4-D4 están conservados en Kit, PDGFRa, PDGFRp, y CSF1R. Por lo tanto, en algunas modalidades, las porciones de la presente invención pueden dirigirse a las regiones conservadas de los dominios D4 o D5 de las RTKs tipo III. También podrán apreciar los expertos en la técnica que una porción de la presente invención puede enlazar a los residuos de azúcar que pueden aparecer en una forma glucosilada de una RTK. Es posible además que una porción de la presente invención, enlazará a un epítope que está compuesto tanto de residuos de aminoácido como residuos de azúcar.

Los términos "cinasa de tirosina receptora" y "RTK", se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, para referirse a la familia de receptores de membrana bien conocida, que fosforila residuos de tirosina. Muchas de ellas desempeñan papeles importantes en el desarrollo o división celular. Las cinasas de tirosina receptoras poseen un dominio de enlace de ligandos extracelular, un dominio de membrana y un dominio catalítico intracelular. Los dominios extracelulares enlazan a citocinas, factores de crecimiento y otros ligandos, y generalmente están comprendidos de uno o más motivos estructurales identificables, incluyendo regiones con alto contenido de cisteína, dominios tipo fibronectina III, dominios tipo inmunoglobulina, dominios tipo EGF, dominios tipo caderina, dominios tipo Kringle, dominios tipo Factor VI IT, regiones con alto contenido de glicina, regiones con alto contenido de leucina, regiones ácidas y dominios tipo discoidina. La activación del dominio de cinasa intracelular se logra mediante enlace de ligando al dominio extracelular, el cual reduce la dimerización de los receptores. Un receptor activado de esta forma, tiene la capacidad de autofosforilar residuos de tirosina fuera del dominio catalítico, facilitando la estabilización de la conformación del receptor activo. Los residuos fosforilados también sirven como sitios de enlace para proteínas, las cuales posteriormente transducen señales dentro de la célula. Los ejemplos de RTKs incluyen, pero no se limitan a, receptor Kit (también conocido como receptor de Factor de Célula Madre o receptor SCF), receptores de factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), receptores de factor de crecimiento de hepatocito (HGF), receptor de insulina, receptor del factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1), receptor de factor de crecimiento de nervios (NGF), receptor de factor de crecimiento endoletial vascular (VEGF), receptor-a PDGF, receptor-ß PDGF, receptor CSF-1 -receptor (también conocido como un receptor M-CSF o Fms), y el receptor Flt3 (también conocido como Flk2).

En una modalidad preferida de la presente invención, la RTK es una RTK tipo III. En otra modalidad de la presente invención, la RTK es una RTK tipo V, es decir, un miembro de la familia de receptor VEGF.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "familia de cinasas de tirosina receptora tipo III" o "RTKs tipo III" pretende incluir cinasas de tirosina receptora las cuales normalmente contienen cinco dominios tipo inmunoglobulina, o dominios tipo Ig, en sus ectodominios. Los ejemplos de RTKs tipo III, incluyen pero no se limita a receptores PDGF, el receptor M-CSF, el receptor FGF, el receptor Flt3 (también conocido como Flk2) y el receptor Kit. En una modalidad preferida de la presente invención, la RTK tipo III es Kit (también conocida en la técnica como receptor SCF). Kit, igual que otras RTKs tipo III, está compuesta de un dominio de enlace de ligando extracelular glucosilado (ectodominio) que está conectado a una región citoplásmica por medio de un dominio de transmembrana simple (TM) (revisada en la Publicación de Schlessinger (2000) Cell 103: 211-225). Otra marca característica de las RTKs tipo III, por ejemplo, Kit o PDGFR, es un dominio de cinasa de tirosina de proteína citoplásmica (PTK), con una región de inserto de cinasa grande. Se sabe que existen al menos dos isoformas de división receptor Kit, haciendo uso la más corta de un sitio de división en-dentro de la estructura. Todas las isoformas de Kit, y las otras RTKs, descritas anteriormente, están comprendidas en la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente invención, un dominio tipo "Ig" de una cinasa de tirosina receptora (RTK) pretende incluir los dominios conocidos en la técnica como presentes en el ectodomino de las RTKs. En el ectodominio de la familia de las cinasas de tirosina receptora tipo III (RTKs tipo III), por ejemplo, Kit, existen cinco de dichos dominios, conocidos como D1, D2, D3, D4 y D5. Los dominios D1, D2 y D3 de las RTKs tipo III, son responsables de enlazar al ligando de la RTK (revisada en la Publicación de Ullrich y Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212). Por lo tanto, en una modalidad de la presente invención, el término "dominio tipo Ig", no pretende incluir un dominio de una RTK, que es responsable del enlace del ligando. En una modalidad preferida de la presente invención, el dominio tipo Ig es un dominio D4 y/o a D5 de una RTK tipo III. En el ectodominio de la familia receptor VEGF, existen siete dominios tipo Ig, conocidos como D1, D2, D3, D4, D5, D6 y D7. En una modalidad preferida de la presente invención, el dominio tipo Ig son un dominio tipo D7 de la familia de receptor VEGF.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "receptor del factor de crecimiento endotelial vascular", "receptor VEGF", o "familia de receptor VEGF", también conocidos como RTKs tipo V incluyen receptores RTK para el factor de crecimiento endotelial. Tal como se describió anteriormente, estas RTKs tienen 7 dominios tipo Ig en sus ectodominios. Los ejemplos de receptores de la familia VEGF son VEGFR1 (también conocido como Flt-1), VEGFR2 (también conocido como KDR o Flk-1), y VEGFR3 (también conocido como Flt-4).

El término "ectodominio" de una cinasa de tirosina receptora (RTK) es bien conocido en la técnica y se refiere a la parte extracelular de la RTK, es decir, la parte de la RTK que está fuera de la membrana en plasma.

El término "una región próxima de la membrana" del ectodominio de una cinasa de tirosina receptora, se refiere a una parte extracelular de una RTK que está en proximidad a la membrana de plasma, y la cual, preferentemente, no es responsable directamente del enlace de un ligando a la RTK. Los ejemplos de regiones próximas de membrana incluyen, pero no se limitan al dominio D4 de una cinasa de tirosina receptora tipo III, el dominio D5 de una cinasa de tirosina receptora tipo III, la región de articulación D3-D4 y una cinasa de tirosina receptora tipo III, la región de articulación D4-D5 de una cinasa de tirosina receptora tipo III, y el dominio D7 de una cinasa de tirosina receptora tipo V.

El término "interacción homotípica" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a la interacción entre las dos regiones próximas de membrana idénticas de dos receptores monoméricos.

El término "interacción heterotípica" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a la interacción entre dos diferentes regiones próximas de membrana de dos receptores monoméricos. Una interacción heterotípica puede ser el resultado de la dimerización de dos diferentes tipos de receptores monoméricos, o el resultado de la dimerización de una forma muíante y una tipo natural del mismo receptor monomérico. Por ejemplo, es sabido en la técnica que un paciente con cáncer puede llevar un alelo tipo natural, y un alelo muíante para cierto receptor.

El término "estado monomérico" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al estado de una RTK, en donde la molécula RTK está compuesta de una cadena de polipéptido simple que está asociada con un segundo polipéptido RTK del mismo tipo o un tipo diferente. La dimerización RTK conduce a la autofosforilación y activación de receptor. Por lo tanto, una RTK en un estado monomérico está en un estado inactivo. Un estado monomérico también es un estado del dominio D4, D5, o D7 de una RTK simple no está asociado con el dominio D4, D5, o D7, respectivamente, de una segunda RTK.

Tal como se utiliza en la presente invención, un "promotor" es una unidad estructural de una proteína oligomérica, tal como una RTK. Un promotor es una subunidad de proteína que puede ensamblarse en una estequiometria definida para formar un oligómero. La familia VEGFR de las cinasas de tírosina receptora son homodímeros enlazados en forma covalente, y cada promotor VEGFR está compuesta de hojas-ß de cuatro hebras distribuidas en una forma anti-paralela en un estructura designada "factores de crecimiento de botón de cisteína".

La frase "asegura el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora en un estado activo", se refiere a la capacidad que tiene una porción de la presente invención, para inhibir la actividad de la cinasa de tirosina receptora. En otras palabras, esta frase incluye la capacidad que tiene una porción de la presente invención, de cambiar el equilibrio hacia la formación de una configuración de receptor inactiva o inhibida. Por ejemplo, una porción de la presente invención puede inhibir la actividad de una cinasa de tirosina receptora en al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, .80%, 85%, 90% o 95% en comparación con la actividad del receptor en la ausencia de la porción.

El término "estado inactivo", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al estado de una RTK, en donde la molécula RTK no tiene la capacidad de activar la señalización de corriente descendente. Un estado inactivo puede ser un estado en donde el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora se deje dimerizar, pero se altere la colocación, orientación, conformación y/o distancia entre los dominios tipo Ig de los dos monómeros (por ejemplo, los dominios D4-D4 o D5-D5 de la cinasa de tirosina receptora tipo III o los dominios D7-D7 de la cinasa de tirosina receptora tipo V), de modo que se inhiba la actividad de la cinasa de tirosina receptora (por ejemplo, se inhibe la internalización de receptor y/o se inhibe la autofosforilación de tirosina del receptor, y/o se inhibe la capacidad que tiene el receptor de activar una trayectoria de señalización de corriente descendente). Un estado inactivo también incluye un estado monomérico tal como se describe anteriormente. Un estado inactivo también puede ser un estado en el cual el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora se enlaza al ligando receptor y se dimeriza, pero aún no ha pasado por el cambio de conformación que permite la activación del receptor. Los ejemplos 22 a 25, describen en forma adicional experimentos los cuales muestran que existen residuos de aminoácido conservados específicos que son cruciales para la activación de RTK (por ejemplo, transmitiendo interacciones homotípicas D4 o D5), pero que son indispensables para la dimerización del receptor. El término "estado inactivo" incluye un estado en el cual una porción de la presente invención puede reducir o inhibir la actividad de una cinasa de tirosina receptora en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 30 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% en comparación con la actividad del receptor en la ausencia de la porción. Cualesquiera de los ensayos funcionales aquí descritos, pueden utilizarse para determinar la capacidad que tiene una porción de la presente invención de inhibir la actividad de una cinasa de tirosina receptora. En algunas modalidades, una porción de la presente invención puede exhibir un efecto amplio, por ejemplo, cuando se desactiva la mayor parte o todas las RTKs objetivo. En otras modalidades, una porción de la presente invención puede exhibir un efecto más angosto, por ejemplo, cuando una porción de las RTKs objetivo se desactiva. En dichas modalidades, se asegura al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de los receptores en un estado inactivo, en comparación con los receptores en la ausencia de la porción.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "epítope de conformación" o "epítope no lineal" o "epítope discontinuo" se utilizan de manera intercambiable para referirse a un epítope el cual está compuesto de al menos dos aminoácidos, los cuales no son aminoácidos consecutivos en una cadena de epítope simple. Por ejemplo, un epítope de conformación puede estar comprendido de dos o más aminoácidos los cuales están separados por una extensión de los aminoácidos de intervención, pero los cuales están lo suficientemente cercanos para ser reconocidos por una porción de la presente invención, como un epítope simple. Como ejemplo adicional, los aminoácidos que están separados por aminoácidos de intervención en una cadena de proteína simple, o los aminoácidos que existen en cadenas de proteína separadas, pueden estar en proximidad debido a la forma de conformación de una estructura de proteína o un complejo que se volverá un epítope de conformación, el cual puede ser enlazado por una porción de la presente invención. Los epítopes de conformación y discontinuos particulares se describen en la presente invención (ver, por ejemplo, las tablas 4 y 5).

Los expertos en la técnica podrán apreciar que en general, un epítope lineal enlazado por una porción de la presente invención, puede o no depender de la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de la RTK. Por ejemplo, en algunas modalidades, una porción de la presente invención puede enlazar a un grupo de aminoácidos sin importar si están doblados en una estructura de proteína tridimensional natural. En otras modalidades, una porción de la presente invención puede o no reconocer los residuos de aminoácido individuales que hacen el epítope, y puede requerir una conformación particular (doblez, retorcimiento, volteo o flexión), con el objeto de reconocer y enlazar el epítope.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "epítope contiguo" o "epítope continuo" se utilizan de manera intercambiable para referirse a un epítope que está compuesto de al menos dos aminoácidos, los cuales son aminoácidos consecutivos en una cadena de proteína simple. Los epítopes contiguos particulares se describen en la presente invención (ver, por ejemplo, la tabla 8). En una modalidad, la porción de la presente invención se enlaza a un epítope contiguo en el receptor VEGF. En otra modalidad, el epítope contiguo está compuesto de dos o más residuos en el dominio D7 del receptor VEGF. En otra modalidad, el epítope contiguo es un epítope seleccionado del grupo que consiste en 672VAISSS677 de VEGFR 1, 678TTLDCH A684 de VEGFR 1, 685NGVPEPQ691 de VEGFR 1, 700KIQQEPG706 de VEGFR 1, 707IILG710 de VEGFR1, 7 PGS713 de VEGFR1, 7 STLFI718 de VEGFR1, 719ERVTEEDEGV728 de VEGFR1, 689VN VS DS694 de VEGFR3, 695LEMQCLV701 de VEGFR3, 702AGAH APS708 de VEGFR3, 717LLEEKSG723 de VEGFR3, 724VDLA727 de VEGFR3, 728DSN730 de VEGFR3, 731QKLSI735 de VEGFR3, y 736QRVREEDAGR745 de VEGFR3, 678TSIGES683 de VEGFR2, 684l E VSCTA690 de VEGFR2, 691SGNPPPQ697 de VEGFR2, 706TLVEDSG712 de VEGFR2, 713|V|_K716 de VEGFR2, 717DGN719 de VEGFR2, 720RNLTI724 de VEGFR2 y 725RRVRKEDEGL734 de VEGFR2.

Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "aminoácido hidrofóbico" se refiere a un aminoácido que comprende propiedades hidrofóbicas, por ejemplo, alanina, cisteína, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, arginina, treonina, valina, triptofan, tirosina, serina, prolina y otros descritos.

Varios aspectos de la presente invención se describirán con mayor detalle en las siguientes subseccciones: 1. Anticuerpos que Enlazan al Ectodominio de una Cinasa de Tirosina Receptora Humana En un aspecto de la presente invención, la porción que enlaza al ectodominio, por ejemplo, un dominio tipo Ig o una región de articulación, de una cinasa de tirosina receptora humana es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

El término "anticuerpo" tal como aquí se refiere, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de enlace de anticuerpo (por ejemplo, "parte de enlace de antígeno") o cadenas simples de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), conectadas internamente mediante enlaces de disulfuro, o una parte de enlace de antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente invención como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH^ CHj. y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente invención como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio C|_- Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones de determinación de complementariedad (CDR), interdispersas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, distribuidas del término amino al término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden transmitir el enlace de la inmunoglobulina a los tejidos huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

El término "parte de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo"), tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de enlazar específicamente a un antígeno (por ejemplo, los dominios D4 o D5 de Kit o el dominio D7 del receptor VEGF). Se ha mostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo, puede ser llevada a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud total. Los ejemplos de fragmentos de enlace que están dentro del término "parte de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (¡i) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fab', el cual es esencialmente un Fab con parte de la región de articulación (ver, la Publicación de FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3o edición. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (v) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward y asociados, (1989) Nature 3_41_: 544-546), que consiste en un dominio VH; (vii) una región de determinación de complementariedad aislada (CDR); y (viii) un nanocuerpo, una región variable de cadena pesada que contiene un dominio variable simple y dos dominios constantes.

Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden estar unidos, utilizando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que les permite ser elaborados como una cadena de proteína simple, en la cual las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); ver las Publicaciones de Bird y asociados, (1988) Science 242:423-426; y Huston y asociados, (1988) Proc. Nati. Acad. Sel USA 85:5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena simple también están proyectados para ser comprendidos dentro del término "parte de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales que son conocidas para los expertos en la técnica y los fragmentos se clasifican para utilidad en la misma forma a los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo aislado", tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que enlaza específicamente a un dominio tipo Ig de una RTK que está sustancialmente libre de anticuerpos que enlazan específicamente a antígenos además del dominio tipo Ig de una RTK). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o químicos. Sin embargo, un "anticuerpo aislado", puede incluir anticuerpos policlonales que todos enlazan específicamente, por ejemplo, a un dominio tipo Ig de una RTK.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se utilizan en la presente invención, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición molecular simple. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad de enlace simple y una afinidad para un epítope en particular.

El término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente invención, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales tanto las regiones de estructura como CDR, se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo tiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la presente invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o especifica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente invención, no pretende incluir anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias de estructura humana.

El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una especificidad de enlace simple que tienen regiones variables en donde tanto las regiones de estructura como CDR, se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprenden un transgen de cadena pesada y un transgen de cadena ligera humanos fusionados a una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo humano recombinante", tal como se utiliza en la presente invención, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tal como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosomal para los genes de. inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado del mismo (que se describe adicionalmente más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresa el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humano recombinante, de combinación, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados a través de cualquier división de las secuencias de gen de inmunoglobulina humanas a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes, tienen regiones variables en las cuales las regiones de estructura y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas modalidades, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes, son secuencias que, aunque se derivan de, y están relacionadas con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano ¡n vivo.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o I g G 1 ) que está codificada por genes de región constante de cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico de un antígeno" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención con el término "un anticuerpo que enlaza específicamente a un antígeno".

El término "derivados de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

El término "anticuerpo humanizado" pretende referirse a anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en las secuencias de estructura humanas. Se pueden realizar modificaciones adicionales de la región de estructura dentro de las secuencias de estructura humana. Los expertos en la técnica podrán apreciar que cuando se "deriva" una secuencia de una especie en particular, dicha secuencia puede ser una secuencia de proteína, tal como cuando se toman aminoácidos de región variable de un anticuerpo de múrido, o la secuencia puede ser una secuencia de ADN, tal como cuando se toman ácidos nucleicos que codifican la región variable de un ADN de múrido. Un anticuerpo humanizado también puede ser diseñado con base en las secuencias conocidas de anticuerpos humanos y no humanos (por ejemplo, múrido o ratón). Los anticuerpos designados, que incorporan potencialmente residuos tanto humanos como no humanos, pueden ser químicamente sintetizados. Las secuencias también pueden ser sintetizadas en el nivel de ADN y expresarse in vitro o ¡n vivo para generar los anticuerpos humanizados.

El término "anticuerpo quimérico" pretende referirse a anticuerpos en los cuales las secuencias de región variable se derivan de una especie, y las secuencias de región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el cual las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante se derivan de un anticuerpo humano.

El término "mimético de anticuerpo" o "mímico de anticuerpo" pretenden referirse a moléculas con la capacidad de mimetizar la capacidad que tiene un anticuerpo de enlazar a un antígeno, pero que no se limitan a estructuras de anticuerpo nativas. Los ejemplos de dichos miméticos de anticuerpo, incluyen opero no se limitan a, Adnectinas (por ejemplo, moléculas de enlace de fibronectina), Aficuerpos, DARPins, Anticalinas, Avímeros, y Versacuerpos, los cuales todos emplean estructuras de enlace las cuales, aunque mimetizan el enlace de anticuerpo tradicional, se generan de, y funcionan a través de distintos mecanismos. Las modalidades de la presente invención, ya que se dirigen a anticuerpos o partes de enlace de antígenos de los mismos, también aplican a los miméticos de anticuerpo descritos anteriormente.

Tal como se utiliza en la presente invención, un anticuerpo que "enlaza específicamente" a un dominio tipo Ig de una RTK, pretende referirse a un anticuerpo que enlaza a un dominio tipo Ig de una RTK con una KD de 1 x 1CT7 M o menos, más preferentemente 5 x 10"8 M o menos, más preferentemente 1 x 10"8 M o menos, más preferentemente 5 x 10"9 o menos.

El término "no enlaza sustancialmente" a una proteína o células, tal como se utiliza en la presente invención, significa que no enlaza a, o no enlaza con alta afinidad a la proteína o células, es decir, enlaza a la proteína o células con una KD de 1 x 10"6 M o más, más preferentemente 1x10"5 M o más, más preferentemente 1 x 10"4 M o más, más preferentemente 1 x 10"3 M o más, incluso más preferentemente 1 x 1 O"2 M o más.

El término "Kass0c" o "Ka", tal como se utiliza en la presente invención, están proyectados para referirse al rango de asociación de una interacción de un anticuerpo-antígeno particular, mientras que los términos "Kdis" o "Kd" están proyectados para referirse al rango de disociación de una interacción de un anticuerpo-antígeno particular. El término "KD", tal como se utiliza en la presente invención, pretende referirse la constante de disociación, el cual se obtiene de una proporción de Kd a Ka (por ejemplo, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores KD para anticuerpos pueden ser determinados utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es a través del uso de resonancia de plasmón de superficie, utilizando preferentemente un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "alta afinidad", cuando se refiere a un anticuerpo tipo IgG, se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10~8 M o menos, más preferentemente 10"9 M o menos e incluso más preferentemente 1010 M o menos para un dominio tipo Ig de una RTK. Sin embargo, un enlace de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, un enlace de "alta afinidad" para un isotipo IgM, se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10"7 M o menos, más preferentemente 10"7 M o menos, incluso más preferentemente 10~9 M o menos.

Anticuerpos Los anticuerpos de la presente invención enlazan específicamente a un dominio tipo Ig de una RTK, por ejemplo, un miembro de la familia de cinasas de tirosina receptora tipo III humana. En modalidades preferidas, el enlace de los anticuerpos, o partes de enlace de antígeno de los mismos, de la presente invención, a un dominio tipo Ig de un monómero RTK, asegura el ectodominio en un estado inactivo, por ejemplo, un estado monomérico, y, por lo tanto, antagoniza la capacidad que tiene RTK de dimerizar y activar una trayectoria de señalización de corriente descendente. Por ejemplo, el anticuerpo puede bloquear una autofosforilación de tirosina inducida por ligando de la internalización de cinasa de tirosina receptor y/o receptora.

Los anticuerpos de la presente invención, se seleccionan o diseñan para enlazar a dominios tipo Ig específicos de la RTK, por ejemplo, el dominio D4 o el dominio D5 de Kit humano o el dominio D7 de un receptor VEGF. En otras modalidades los anticuerpos, o partes de enlace de antígeno de los mismos, se seleccionan o diseñan para enlazar proteínas que comparten homología con un dominio de la RTK, por ejemplo, el receptor Kit o el receptor VEGF. Por ejemplo, se puede seleccionar un anticuerpo o diseñarse para enlazar un dominio el cual es al menos el 50% idéntico, al menos 60% idéntico, al menos 70% idéntico, al menos 80% idéntico, al menos 90% idéntico, o al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a un dominio, por ejemplo, el dominio D4 o D5, del receptor Kit o el dominio D7 de un receptor VEGF. Dicho anticuerpo, o partes de enlace de antígeno de los mismos, pueden tener la capacidad de enlazar dominios de proteína, posiblemente en receptores Kit, VEGF, y otras RTKs, las cuales son funcionalmente similares a los dominios D4 o D5 de Kit o los dominios D7 de un receptor VEGF.

Los anticuerpos, o partes de enlace de antígeno de los mismos, de la presente invención también pueden ser seleccionados o diseñados para enlazar un motivo o secuencia de consenso particular derivada de un dominio tipo Ig de RTK, por ejemplo, una RTK tipo III humana, que permite que los anticuerpos, o partes de enlace de antígeno de los mismos, enlacen específicamente epítopes o dominios que se comparten entre miembros de la familia de RTKs tipo III humana y entre las RTKs tipo III y otras RTKs, por ejemplo, RTKs tipo V. Dicha secuencia de consenso lineal puede encontrarse por ejemplo, utilizando un algoritmo de alineación de secuencia para alinear dominios de diversas RTKs, por ejemplo, dominios de los dominios D4 a través de los tipos RTK o a través de especies (ver la figura 6B). Un experto en la técnica puede alinear las secuencias de proteína, por ejemplo, de los dominios Kit D4 de diversas especies (por ejemplo, humano, ratón, rata) para determinar que residuos de proteína están conservados en al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 100% de las secuencias que estén siendo alineadas. Dicha secuencia de consenso puede ser utilizada posteriormente para generar anticuerpos u otras porciones que enlazan específicamente la secuencia de consenso y, por lo tanto, enlazarán a los residuos más conservados de la Kit RTK. En forma similar, también se puede alinear las secuencias de proteína del dominio D7 de las RTKs tipo V (ver figura 6) para obtener una secuencia de consenso para la cual se pueden generar las porciones de la presente invención. Un experto en la técnica deberá apreciar que la mayor parte de los residuos altamente conservados son los que han sido conservados a través de la evolución, y son probablemente los más importantes para la función de proteína. Como alternativa, si se realiza la alineación a través de diversas clases de RTKs, los anticuerpos generados hacia dichas secuencias de consenso pueden permitir que los anticuerpos enlacen a un dominio tipo Ig similar en múltiples tipos RTK.

En una modalidad específica, una porción de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos, enlazan a la siguiente secuencia de consenso para el sitio de interacción D4: LX! RX2X3X4X5X6X7G en donde L es Leucina, R es Arginina, G es Glicina; y X,, X2, X3, 4, X5- ß y 7 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, X1 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Isoleucina, Valina, Prolina, Asparagina, o Usina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Leucina, Valina, Alanina, y Metionina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Histidina, Asparagina, y Arginina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Valina, Alanina, Ácido Glutámico, Prolina, y Metionina; X5 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Serina, Ácido Glutámico, Alanina, Glutamina, y ácido Aspártico; X6 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, ácido Aspártico, y Glutamina; y X7 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Serina, Alanina, Lisina, Arginina, Glutamina, y Treonina.

En otra modalidad, una porción de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos) enlazan a la siguiente secuencia de consenso para el dominio D7 de un miembro de la familia del receptor VEGF: IX1 RVX2X3EDX4_G en donde I es Isoleucina, R es Arginina, E es Ácido Glutámico, D es Ácido Aspártico, G es Glicina; y X¾1 X2, X3 y X4 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, Xi se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Arginina, y Glutamina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Lisina; y X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Alanina (SEC ID NO: 1).

En otra modalidad, una porción de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos) enlaza a la siguiente secuencia de consenso del dominio D7 del receptor VEGF: L/l X1 R f X2 X3 X4 D/E X5 G (SEC ID NO: 158), en donde L es Leucina, I es Isoleucina, R es Arginina, f es un aminoácido hidrofóbico, D es Ácido Aspártico, E es Ácido Glutámico, G es Glicina; y X X2, X3, 4, y 5 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, f es Valina; X1 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Glutamina, Ácido Glutámico y Ácido Aspártico; X2 es selecciona del grupo que consiste en Arginina, Lisina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Ácido Glutámico, Glutamina y Valina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Valina; y X5 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Glicina, Serina y Glutamina.

Los anticuerpos de la presente invención no enlazan al sitio de enlace del ligando de la RTK, por ejemplo, el sitio de enlace SCF del receptor Kit. Por consiguiente, los anticuerpos aquí descritos no antagonizan la capacidad que tiene un receptor de enlazar a su ligando objetivo.

En algunas modalidades, el anticuerpo o partes de enlace de antígeno de los mismos enlaza a secuencias específicas del receptor Kit humano, por ejemplo, residuos 309-413, residuos 410-519, 381Arg y 386Glu, o 418Tyr y 505Asn del receptor humano Kit.

En otras modalidades, los anticuerpos, o partes de enlace de antígeno de los mismos, enlazan a motivos de proteína o secuencias de consenso que representan una estructura tridimensional en la proteína. Dichos motivos o secuencias de consenso pueden no representar una cadena contigua de aminoácidos, si no una distribución de aminoácidos no contiguos que resulta del doblez tridimensional de la RTK (es decir, un "motivo estructural" o "epítope no lineal"). Un ejemplo de dicho motivo puede ser la interfase de enlace D4-D4 o D5-D5, o de un receptor Kit o la interfase de enlace D7-D7 de un receptor VEGF. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención se enlaza, por ejemplo, a un epítope no lineal en la interfase D4-D4, D5-D5 o D7-D7, previniendo la activación de la RTK.

En una modalidad específica, un anticuerpo o partes de enlace de antígeno de los mismos de la presente invención, puede enlazar a uno o más residuos en el receptor Kit el cual elabora las cavidades o bolsillos pequeños descritos en la tabla 4 (más adelante). Por ejemplo, un anticuerpo o partes de enlace de antígeno de los mismos de la presente invención, puede enlazar a uno o más de los siguiente residuos en la región de articulación D3-D4 del receptor Kit: K218, S220, Y221, L222 del dominio D3 y F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, 1371, Y373 del dominio D4. Un anticuerpo o partes de enlace de antígeno de los mismos de la presente invención también puede enlazar a uno o más de los siguientes residuos, los cuales se elaboran en una superficie cóncava en el dominio D4 del receptor Kit: Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390. En otra modalidad, un anticuerpo o partes de enlace de antígeno de los mismos de la presente invención puede enlazar a uno o más de los siguientes residuos que forman un bolsillo en la región de articulación D2-D3 en el receptor Kit: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 y F208 del dominio D2 y V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269 del dominio D3.

Por lo tanto, en algunas modalidades, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención, puede enlazar a los residuos de aminoácido contiguos o no contiguos, y funcionar como una cuña molecular que previene el movimiento requerido para la colocación de la región próxima de membrana de la RTK a una distancia y orientación que permite la activación molar de cinasa de tirosina. Un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención, también puede actuar para evitar interacciones homotípicas de receptor D4 o D5, o desestabilizar el sitio de interacción de ligando-receptor. En algunas modalidades preferidas, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención, puede enlazar a uno o más de los siguientes residuos en el receptor Kit: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388.1371 , K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341 , S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381 , R353, T411 , K412, E414, K471 , F433, G470, L472, V497, F469, A431 , o G432.

Un experto en la técnica apreciará que, en algunas modalidades, que un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención, puede ser puede ser dirigido fácilmente a los residuos correspondientes en las otras RTKs tipo III, por ejemplo, los residuos que forman bolsillos o cavidades similares o los que están en la misma posición mediante alineación estructural o alineación de secuencia.

En una modalidad específica, un anticuerpo o partes de enlace de antígeno de los mismos de la presente invención, enlaza a un epítope de conformación o un epítope discontinuo en una RTK tipo III. El epítope de conformación o discontinuo puede estar compuesto de dos o más residuos del dominio D3, D4, o D5 o las regiones de articulación D4-D5 o D3-D4 de una RTK tipo III, por ejemplo, el receptor Kit humano o el receptor PDGF. Por ejemplo, el epítope de conformación o discontinuo puede estar compuesto de dos o más de los residuos descritos en la tabla 4 que se encuentra más adelante.

En una modalidad particular, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, de la presente invención, enlaza a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206. V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268, y Y269. En modalidades similares, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención puede enlazar a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados de los siguientes grupos de aminoácidos: P206, F208, V238, y S239; K127, A207, F208, y T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370.1371, y Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, y 1371; R224, V308, K310, G311, F340, P341, y D398; K218, A219, S220, N367, E368, y S369; K218, A220, E368, y S369; G384, T385, T411, K412, E414, y K471; Y408, F433, G470, K471, y L472; F324, V325, N326, y N410;D327, N410, T411, K412, y V497; G384, G387, V409, y K471; L382, G387, V407, y V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, y Y269; P206, F208, V238, y S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370.1371, y Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470, y K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432, y K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386, y T390; Y350, R353, y F355. Tal como se indicó anteriormente, los anticuerpos de la presente invención puede enlazar a todos los residuos de aminoácido que forman un bolsillo o cavidad identificada en la tabla 4, o pueden enlazar a un subconjunto de residuos que forman el bolsillo o la cavidad. Quedará entendido que, en ciertas modalidades, cuando se hace referencia a un anticuerpo de la presente invención que enlaza a un epítope, por ejemplo, un epítope de conformación, la intención es que el anticuerpo enlace únicamente a los residuos específicos que elaboran el epítope (por ejemplo, el bolsillo o cavidad identificados en la tabla 4) y no a residuos en la secuencia de aminoácido lineal del receptor.

En una modalidad adicional, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención, enlaza a un epítope de conformación, en donde el epítope de conformación está compuesto de dos o más residuos de aminoácido seleccionados de los péptidos descritos en la tabla 5. En una modalidad específica, el epítope de conformación está compuesto de uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un primer péptido y uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un segundo péptido, en donde el primero y segundo péptidos se seleccionan del grupo de péptidos descritos en la tabla 5. Por lo tanto, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención, enlaza un epítope de conformación, en donde el primero y segundo grupos de péptido son como se indica a continuación: Ala219-Leu222 y Thr304-Val308; Asp309-Gly311 y Arg224-Gly226; Thr303 - Glu306 y Ala219-Leu222 ; Asn367-Asn370 y Ser217-Tyr221 ; Ala339-Pro343 y Asn396-Val399; Ala339-Pro343 y Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 y Val374- His378; Asp357-Glu360 y Leu377-Thr380; Met351 -Glu360 y His378-Thr389; His378-Thr389 y Val323-Asp332; Val409-lle415 y Ala493-Thr500; Val409-lle415 y Ala431 -Thr437; Val409-Ile415 y Phe469-Val473; Val409-lle415 y Val325-Asn330; Val409-ne415 y Arg381 -Gly387; Gly466-Leu472 y Gly384-Gly388; Val325-Glu329 y Tyr494-Lys499; Thr411-leu416 y Val497-Ala502; I Ie415-Leu421 y Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 y Lys484-Thr488; y Ala502-Ala507 y Gly445-Cys450.

Los anticuerpos de la presente invención puede enlazar a todos los residuos de aminoácido que forman el primero y segundo grupos de péptido anteriores que pueden enlazar a un subconjunto de residuos que forman el primero y segundo grupos de péptido. Quedará entendido que, en ciertas modalidades, cuando se hace referencia a un anticuerpo de la presente invención que enlaza a un epítope, por ejemplo, un epítope de conformación, la intención es que el anticuerpo enlace únicamente a los residuos específicos que elaboran el epítope (por ejemplo, los péptidos específicos identificados en la tabla 5) y no otros residuos en la secuencia de aminoácido lineal del receptor.

En otra modalidad, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención, enlaza a un epítope de conformación o discontinuo compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en E33, P34, D72, E76, N77, K78, Q79, K158, D159, N250, S251, Q252, T253, K254, L255, N260, W262, H264, G265, E344, 25 N352, R353, F355, T356, D357, Y362, S365, E366, N367, N370, y G466.

En otra modalidad, un anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo de la presente invención, enlaza a residuos de aminoácido 381Arg y 390Glu de PDGFR humano, o a los residuos correspondientes PDGFRa. Los residuos 385Arg y 390Glu de PDGFR humano son análogos a los residuos 38 Arg y 386Glu del receptor Kit y transmiten interacciones homotípicas D4-D4 de PDGFR . Los anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos de la presente invención, pueden ejercer su efecto inhibidor en la activación de receptor previniendo interacciones homotípicas críticas (tal como puentes de sal formados entre 385Arg y 390Glu de PDGFR humano) entre regiones próximas de membrana de las RTKs tipo-lll que son esenciales para la colocación del dominio citoplásmico a una distancia y orientación esencial para la activación de cinasa de tirosina. Los experimentos aquí descritos demuestran que las interacciones homotípicas D4-D4 son indispensables para la dimerización PDGFR , y que la dimerización PDGFR es necesaria, pero no suficiente para la activación de receptor. Por lo tanto, los anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos de la presente invención, pueden permitir la dimerización de PDGFR , previniendo al mismo tiempo la activación. La alineación de secuencia basada en la estructura, ha mostrado que el tamaño del lazo EF, y los aminoácidos importantes que comprenden la interfase D4-D4, están conservados en Kit, PDGFRa, PDGFR3, y CSF1R. Por lo tanto en algunas modalidades, los anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos de la presente invención pueden ser dirigidos a las regiones conservadas de los dominios D4 o D5 de las RTKs tipo III.

En algunas modalidades, el anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, enlaza a secuencias específicas del receptor VEGF humano, por ejemplo, residuos 718-727 de VEGFR1, Arg720 y Asp725 de VEGFR1, residuos 724-733 de VEGFR2, Arg726 y Asp731 de VEGFR2, residuos 735-744 de VEGFR3, o residuos Arg737 andAsp742 de VEGFR3.

En otra modalidad, el anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo enlaza a un epítope contiguo del receptor VEGF. En una modalidad, el epítope contiguo está compuesto de dos o más residuos en el dominio D7 del receptor VEGF. En otra modalidad, el epítope contiguo es un epítope seleccionados del grupo que consiste en 67 VAISSS677 de VEGFR1, 678TTLDCHA684 de VEGFR1, 685NGVPEPQ691 de VEGFR1, 700KIQQEPG706 de VEGFR1, 707IILG710 de VEGFR1, 7 1PGS713 de VEGFR1, 714STLFI718 de VEGFR1, 719ERVTEEDEGV728 de VEGFR 1, 689VNVSDS694 de VEGFR3, 695LEMQCLV701 de VEGFR3, 702AGAHAPS708 de VEGFR3, 7 7LLEEKSG723 de VEGFR3, 724VDLA727 de VEGFR3, 728DSN730 de VEGFR3, 731QKLSI735 de VEGFR3, y 736QRVREEDAGR de VEGFR3, 678TSIGES BJ de VEGFR2, 68 IEVSCTA690 de VEGFR2, 691 SGN PPPQ697 de VEGFR2, 706TLVEDSG712 de VEGFR2, 713IVLK716 de VEGFR2, 717DGN719 de VEGFR2, 720RNLTI724 de VEGFR2 y 725RRVRKEDEGL734 de VEGFR2.

En modalidades adicionales, el anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, de la presente invención, se selecciona o diseña para enlazar específicamente a una RTK mutante. En modalidades preferidas, la RTK mutante es un mutante tumorigénico u oncogénico. En una modalidad específica, el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, se selecciona o diseña para enlazar a un mutante de receptor Kit oncogénico. Varios de los mutantes de receptor Kit que pueden ser dirigidos por los anticuerpos de la presente invención, son receptores Kit con mutaciones en uno o más de los siguientes aminoácidos: Thr417, Tyr418, Asp419, Leu421, Arg420, Tyr503, o Ala502. Los expertos en la técnica deberán apreciar que los métodos de la presente invención pueden ser aplicables a otras mutaciones en Kit o a mutaciones en otras RTKs. Una ventaja de dirigir una RTK mutante, es que un anticuerpo terapéutico puede enlazar únicamente a las RTKs en las células que contienen la mutación, dejando en gran medida a las células saludables o no afectarlas en lo absoluto. Por consiguiente, en casos en donde la mutación es tumorigénica, únicamente las células de tumor pueden ser dirigidas para terapia, reduciendo potencialmente los efectos secundarios y requerimientos de dosificación.

Preferentemente, el anticuerpo enlaza a un dominio tipo Ig de una RTK humana con una KD o menos de 5 x 10~8 M o menos, una KD de 1 x 10"8 M o menos, una KD de 5 x 10"9 M o menos, o una KD de 1 x 10"8 M y 1x10"10 M o menos. Los ensayos estándar para evaluar la capacidad de enlace de los anticuerpos hacia un dominio tipo Ig de una RTK, por ejemplo, un receptor Kit o a VEGF, son conocidos en la técnica, e incluyen por ejemplo, ELISAs, manchados Western y RIA. Las cinéticas de enlace (por ejemplo, afinidad de enlace) de los anticuerpos también se pueden evaluar mediante ensayos estándar conocidos en la técnica tal como mediante ELISA, análisis Scatchard y Biacore.

Anticuerpos Construidos y Modificados Las secuencias VH y/o Vu de un anticuerpo preparado de acuerdo con los métodos de la presente invención, también se pueden utilizar como material de partida para construir un anticuerpo modificado, en donde el anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de inicio. Un anticuerpo puede ser construido modificando uno o más residuos dentro de una o ambas de las regiones variables originales (por ejemplo VH y/o VL), por ejemplo dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones de estructura. Además, o en forma alternativa, un anticuerpo puede ser construido modificando residuos dentro de la región(s) constante, por ejemplo, para alterar la función(s) efectora del anticuerpo.

Un tipo de construcción de región variable que puede ser llevado a cabo, es injerto CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de los residuos de aminoácido que se localizan en las seis regiones de determinación de complementariedad de cadena pesada y ligera (CDRs). Por esta razón, las secuencias de aminoácido de las CDRs, son más diversas entre anticuerpos individuales, que las secuencias fuera de CDRs. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayor parte de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que mimetizan las propiedades de los anticuerpos específicos que ocurren naturalmente, construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo específico que ocurre naturalmente injertado en las secuencias de estructura de un diferente anticuerpo con diferentes propiedades (ver, por ejemplo, las Publicaciones de Riechmann, L. y asociados, (1998) Nature 332:323-327: Jones, P. y asociados, (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. y asociados, (1989) Proc. Nati. Acad. Ver U.S. A. 86.: 10029-10033; Patente Norteamericana No. 5,225,539 de Winter, y Patentes Norteamericanas Nos .5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y asociados).

Las secuencias de estructura para anticuerpos pueden ser obtenidas de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de gen de anticuerpo lineal germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de línea germinal para los genes de región variable de cadena pesada y ligera humanos, pueden encontrarse en la base de datos de secuencia germinal humana "VBase" (disponible en el Internet en el sitio mrc-cpe. cam.ac.uk/vbase). así como en Kabat, E. A., y asociados, (1991) Secuencias de Proteína de Interés Inmunológico, Quinta Edición, U.S. Department de Health y Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., y asociados, (1992) "El Repertorio de las Secuencias de Línea Germinal Humana revela aproximadamente Cincuenta Grupos de Segmentos VH Con Diferentes Lazos Hipervariables" J. Mol. Biol. 227:776-798: y Cox, J. P L. y asociados, (1994) "Un Directorio de los Segmentos VH de Línea Germinal Humana Revela una Fuerte Polarización en su Uso", Eur. J. Immunol. 24:827-836; cuyos contenidos están incorporados expresamente a la presente invención como referencia. Como otro ejemplo, las secuencias de ADN de línea germinal de los genes de región variable de cadena pesada y ligera humanos, pueden encontrarse en la base de datos de Genbank.

Se comparan secuencias de proteína de anticuerpo contra una base de datos de secuencia de proteína compilada, utilizando uno de los métodos de búsqueda de similitud de secuencia, llamados Gapped BLAST (Altschul y asociados, (1997) Nucleic Acids Research 2_5:3389-3402), el cual es bien conocido para los expertos en la técnica. BLAST es un algoritmo heurístico ya que es probable que una alineación estadísticamente significativa entre la secuencia de anticuerpo y la secuencia de base de datos, contenga pares de segmento de alta calificación (HSP) de palabras alineadas. Los pares de segmento cuya calificación no se puede mejorar mediante extensión o recorte, se llama hit. En síntesis, las secuencias de nucleotido de origen VBASE (vbase.mrc-coe.cam.ac. uk/vbasel/list2.php) son trasladadas y la región entre y que incluye la región de estructura de FR1 a FR3 es retenida. Las secuencias de base de datos tienen una longitud promedio de 98 residuos. Las secuencias por duplicado que son coincidencias exactas en toda la longitud de una proteína, son eliminadas. Una búsqueda BLAST para proteínas utilizando un programa blastp con default, parámetros estándar excepto el filtro de baja complejidad, el cual es desactivado, y la matriz de sustitución para BLOSUM62, filtra los cinco aciertos superiores que producen las coincidencias de secuencia. Las secuencias de nucleotido se traslada en las seis estructuras, y la estructura sin codones de detención en el segmento de correspondencia de la secuencia de base de datos, se considera el acierto potencial. Esto a su vez se confirma utilizando el programa BLAST tblastx, que traduce la secuencia de anticuerpo en las seis estructuras y compara dichas traducciones con la secuencias de nucleótido VBASE traducida dinámicamente en las seis estructuras. Se puede buscar la similitud con VBASE tal como se describe anteriormente, de otras bases de datos de secuencia de línea germinal, tal como la disponible en IMGT (http://imgt.cines.fr).

Las identidades son coincidencias de aminoácido exactas entre la secuencia de anticuerpo y la base de datos de proteína en toda la longitud de la secuencia. Los signos positivos (correspondencia de sustitución de identidades +) no son idénticos, pero las sustituciones de aminoácido son guiadas por la matriz de sustitución BLOSUM62. Si la secuencia de anticuerpo da correspondencia a dos de las secuencias de la base de datos con la misma identidad, se decidirá que el acierto con más signos positivos será el acierto de correspondencia de secuencia.

Las secuencias VH CDR1, CDR2, y CDR3 identificadas y las secuencias VK CDR1, CDR2, y CDR3, pueden ser injertadas en regiones de estructura que tienen las secuencias idénticas a las encontradas en el gen de inmunoglobulina de línea germinal del cual se deriva la secuencia de estructura, o las secuencias de CDR pueden ser injertadas en regiones de estructura que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que en ciertos casos es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de estructura, para mantener o mejorar la capacidad de enlace de antígeno del anticuerpo (ver las Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y asociados).

Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de aminoácido dentro de las regiones VH y/o V« CDR1, CDR2 y/o CDR3, para mejorar de esta manera una o más propiedades de enlace (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. La mutagénesis dirigida al sitio, o mutagénesis transmitida por PCR puede ser llevada a cabo para introducir la mutación(s), y el efecto en el enlace de anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede ser evaluada en ensayos in vitro o in vivo conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención puede ser mutado para crear una biblioteca, la cual posteriormente será clasificada para enlazar a un dominio tipo Ig de un RTK, por ejemplo, un dominio D4 o D5 de la Kit RTK humana o un dominio D7 de un receptor VEGF. Se introducen modificaciones preferentemente conservadoras (tal como se describió anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácido, aunque preferentemente son sustituciones. Además, normalmente no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR son alterados.

Otro tipo de modificación de estructura implica la mutación de uno o más residuos dentro de la región de estructura, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar los epítopes de célula T, y reducir de esta forma la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este método también es referido, como "desinmunización" y se describe con mayor detalle en la Publicación de Patente Norteamericana No. 20030153043 de Carr y asociados.

Además o en forma alternativa a las modificaciones elaboradas dentro de las regiones de estructura o CDR, los anticuerpos de la presente invención pueden ser construidos para incluir modificaciones dentro de la región Fe, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como vida media en suero, fijación de complemento, enlace de receptor Fe, y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la presente invención puede ser modificado químicamente (por ejemplo, una o más porciones químicas pueden ser adheridas al anticuerpo) o ser modificado para alterar su glucosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe con mayor detalle más adelante. La numeración de residuos en la región de Fe es la de índice de Kabat EU.

En una modalidad, la región de articulación de CH1 es modificada de modo que el número de residuos de cisteína en la región de articulación se altera, por ejemplo, se incrementa o disminuye. Este método se describe en forma adicional en la Patente Norteamericana No. 5,677,425 de Bodmer y asociados. El número de residuos de cisteína residuos en la región de articulación de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamble de las cadenas pesadas y ligeras, o incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra modalidad, la región de articulación Fe de un anticuerpo, es mutada para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácido en la región de interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento de articulación Fe, que ha dañado el enlace de la proteína A Estafilococal (SpA) relativo al enlace SpA del dominio de articulación-Fc nativo. Este método se describe con mayor detalle en la Patente Norteamericana No. 6,165,745 de Ward y asociados.

En otra modalidad, el anticuerpo es modificado para incrementar su vida media biológica. Son posibles varios métodos. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,277,375 de Ward. Como alternativa, para incrementar la vida media biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítope de enlace de receptor de rescate de dos lazos de un dominio CH2 de una región Fe de un IgG, tal como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,869,046 y 6,121,022 de Presta y asociados. Estas estrategias serán efectivas siempre que no se comprometa el enlace del anticuerpo al dominio tipo Ig de la RTK.

Aún en otras modalidades, la región es Fe alterada reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un diferente aminoácido para alterar la función(s) efectora del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 con un diferente residuo de aminoácido, de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada para un ligando efector, pero retenga la capacidad de enlace de antígeno del anticuerpo de origen. El ligando efector para el cual se altera la afinidad, puede ser por ejemplo, un receptor Feo el componente C1 del complemento. Este método se describe con detalles adicionales en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,624,821 y 5,648,260, ambas de Winter y asociados .

En otro ejemplo, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 329, 331 y 322 con un diferente residuo de aminoácido, de modo que el anticuerpo tenga enlace Clq alterado y/o una citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) reducida o eliminada. Este método se describe con mayor detalle en las Patente Norteamericana No. 6,194,551 de Idusogie y asociados.

En otro ejemplo, se alteran uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones de aminoácido 231 y 239, para alterar de esta forma la capacidad que tiene el anticuerpo de fijar el complemento. Este método se describe con mayor detalle en la Publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer y asociados.

Aún en otro ejemplo, la región Fe es modificada para incrementar la capacidad del anticuerpo para transmitir una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o incrementar la afinidad del anticuerpo para un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 25 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este método se describe en forma adicional en la Publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, los sitios de enlace en I g G 1 humano para FcyR1, FcyRIl, FCYRIII y FcRn han sido mapeados, y se han descrito las variantes con el enlace mejorado (ver la Publicación de Shields, R.L. y asociados, (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mostraron mejorar el enlace a FcyRIII. Además, se mostró que los siguientes mutantes de combinación mejoran el enlace FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

Aún en otra modalidad, el extremo C-terminal de un anticuerpo de la presente invención, es modificado por la introducción de un residuo de cisteína, tal como se describe en la Solicitud Provisional Norteamericana Serie No. 60/957,271, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Dichas modificaciones incluyen pero no se limitan a, el reemplazo de un residuo de aminoácido existente en, o cerca del C-término de una secuencia de cadena pesada de longitud total, así como la introducción de una extensión que contiene cisteína al c-término de una secuencia de cadena pesada de longitud total. En modalidades preferidas, la extensión que contiene cisteína comprende la secuencia de alanina-alanina-cisteína (de N-terminal a C-terminal).

En modalidades preferidas, la presencia de dichas modificaciones de cisteína C-terminal proporciona una ubicación para la conjugación de una molécula asociada, tal como un agente terapéutico o una molécula marcadora. En particular, la presencia de un grupo de ti o I reactivo de la modificación de cisteína C-terminal, puede ser utilizada para conjugar una molécula asociada que emplea los enlazadores de disulfuro que se describen con detalle más adelante. La conjugación del anticuerpo a una molécula asociada en esta forma, permite el control incrementado en el sitio específico de adhesión. Además, al introducir el sitio de adhesión en o cerca del C-termino, se puede optimizar la conjugación, de modo que se reduzca o elimine la interferencia con las propiedades funcionales del anticuerpo, y se permita el análisis simplificado y el control de calidad de las preparaciones del conjugado.

Aún en otra modalidad, la glucosilación de un anticuerpo es modificada. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo que carece de glucosilación). La glucosilación puede ser alterada, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidrato pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden elaborar una o más sustituciones de aminoácido que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de estructura de región variable para eliminar de esta forma la glucosilación en dicho sitio. Dicha aglucosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Dicho método se describe con mayor detalle en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,714,350 y 6,350,861 de Co y asociados. Se describen con mayor detalle métodos adicionales para alterar la glucosilación en la Patente Norteamericana No. 7,214,775 de Hanai y asociados, Patente Norteamericana No. 6,737,056 de Presta, Publicación Norteamericana No. 20070020260 de Presta, Publicación PCT No. WO/2007/084926 de Dickey y asociados, Publicación PCT No. WO/2006/089294 de Zhu y asociados, y Publicación PCT No. WO/2007/0559 6 de Ravetch / asociados, cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Además o en forma alternativa, se puede elaborar un anticuerpo que tenga un tipo de glucosilacion alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras GIcNac biseccionadas incrementadas. Dichos patrones de glucosilacion alterados han demostrado incrementar la capacidad ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidrato pueden lograrse, por ejemplo, expresando un anticuerpo con maquinaria de glucosilacion alterada. Las células con maquinaria de glucosilacion alterada han sido descritas en la técnica, y se pueden utilizar como células huésped en las cuales se expresan anticuerpos recombinantes de la presente invención, para producir de esta forma un anticuerpo con glucosilacion alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705, y s709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares FUT8"'" Ms704, Ms705, y Ms709 fueron creadas mediante la interrupción dirigida del gen FUT8 en las células CHO/DG44 utilizando dos vectores de reemplazo (ver la Publicación de Patente Norteamericana No. 20040110704 de Yamane y asociados, y la Publicación de Yamane-Ohnuki y asociados, (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como otro ejemplo, la Publicación de Patente EP 1,176,195 de Hanai y asociados, describe una línea celular con un gen FUT8 con funcionalidad interrumpida, que codifica una transferasa de fucosilo, de modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación, reduciendo o eliminando la enzima relacionada con el enlace alfa 1,6. Hanai y asociados, también describe líneas celulares que tienen una baja actividad enzimática para agregar fucosa a la N-acetilglucosamina que enlaza a la región Fe del anticuerpo, o no tiene la actividad enzimática, por ejemplo, la línea de célula de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La Publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea de célula CHO variante, células Lec13 con capacidad reducida para adherir fucosa a carbohidratos enlazados a por Asn(297), dando como resultado también la hipofoculación de anticuerpos expresados en dicha célula huésped (ver también la Publicación de Shields, R.L. y asociados, (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación PCT WO 99/54342 de Umana y asociados, describe líneas celulares construidas para expresar transferasas de glucosilo con modificación de glucoptoteína (por ejemplo, beta( ,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las línea celulares, construidas exhiban estructuras GIcNac de bisección incrementadas que dan como resultado actividad ADCC incrementados de los anticuerpos (también consultar la Publicación de Umana y asociados, (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Como alternativa, los residuos de la fucosa del anticuerpo pueden ser disociados utilizando una enzima de fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa, elimina los residuos de fucosilo de los anticuerpos (Tarentino, A.L. y asociados, (1975) Biochem. 14:5516-23).

Además, o en forma alternativa, se puede elaborar un anticuerpo que tenga un tipo de glucosilación alterado, en donde dicha alteración se relaciona con el nivel de sialiación del anticuerpo. Dichas alteraciones se describen en la Publicación PCT No. WO/2007/084926 de Dickey y asociados, y en la Publicación PCT No. WO/2007/055916 de Ravetch y asociados, ambas de las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Por ejemplo, se puede emplear una reacción enzimática con sialidasa, tal como, por ejemplo, sialidasa Arthrobacter ureafacens. Las condiciones de dicha reacción se describen de manera general en la Patente Norteamericana No. 5,831,077, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Otros ejemplos no limitantes de enzimas adecuadas son neuraminidasa y N-Glucosidasa F, tal como se describe en la Publicación de Schloemer y asociados, J. Virology, 15(4), 882-893 (1975) y en Leibiger y asociados, Biochem J., 338, 529-538 (1999), respectivamente. Los anticuerpos desialilados pueden ser purificados en forma adicional, utilizando cromatografía por afinidad. Como alternativa, se pueden emplear métodos para incrementar el nivel de sialiación, tal como el empleo de enzimas de sialiltransferasa. Las condiciones de dicha reacción se describen de manera general en la Publicación de Basset y asociados, Scandinavian Journal of Immunology, 51(3), 307-311(2000).

Otra modificación de los anticuerpos que se contempla en la presente invención, es pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado, por ejemplo, para incrementar la vida media biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o un derivado de aldehido de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG quedan adheridos a los anticuerpos de fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilaclón en una molécula PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo del análogo). Tal como se utiliza en la presente invención, el término "polietilenglicol" pretende comprender cualesquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para derivar otras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que será pegilado es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la presente invención. Ver por ejemplo la Publicación de Patente EP 0 154 316 de Nishimura y asociados, y EP 0 401 384 de Ishikawa y asociados. Por lo tanto, los métodos de pegilación aquí descritos, también aplican moléculas peptídicas de la presente invención que se describen más adelante.

Fragmentos de Anticuerpo y Miméticos de Anticuerpo La presente invención no se limita a anticuerpos tradicionales y puede practicarse a través del uso de fragmentos de anticuerpo y miméticos de anticuerpo. Tal como se describe más adelante, ahora se han desarrollado una amplia variedad de tecnologías de fragmentos de anticuerpo y miméticos de anticuerpo, y son ampliamente conocidas en la técnica. Aunque un número de estas tecnologías, tal como anticuerpos, Nanocuerpos y Unicuerpos de dominio, hacen uso de fragmentos de, u otras modificaciones a las estructuras de anticuerpo tradicionales, también existen tecnologías alternativas, tal como Adnectinas, Aficuerpos, DARPins, Anticalinas, Avímeros, y Versacuerpos que emplean estructuras de enlace, las cuales aunque mimetizan el enlace de anticuerpo tradicional, se generan de, y función a través de distintos mecanismos. Algunas de estas estructuras alternativas son revisadas en la Publicación de Giliy Damle (2006) 17: 653-658.

Los anticuerpos de dominio (dAbs) son las unidades de enlace funcional más pequeños de los anticuerpos, que corresponden a las regiones variables ya sea de cadenas pesadas (VH) o ligeras (VL) de anticuerpos humanos. Los anticuerpos de dominios tiene un peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Domantis ha desarrollado una serie de bibliotecas grandes y altamente funcionales de dAbs VH y VL completamente humanos (más que diez billones de diferentes secuencias en cada biblioteca) y utiliza estas bibliotecas para seleccionar dAbs que son específicos para objetivos terapéuticos. En contraste con muchos anticuerpos convencionales, los anticuerpos de dominio son bien expresados en sistemas de células de bacterias, levadura y mamíferos. Los detalles adicionales de los anticuerpos de dominio y métodos de producción de los mismos pueden ser obtenidos mediante referencia a las Patentes Norteamericanas Nos. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; la Serie Norteamericana No. 2004/0110941; la Solicitud de Patente Europea No. 1433846 y las Patentes Europeas 0368684 y 0616640; las Publicaciones Internacionales WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821 , WO04/003019 y WO03/002609, cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Los nanocuerpos son proteínas terapéuticas derivadas de anticuerpo que contienen las propiedades estructurales y funcionales únicas de los anticuerpos de cadena pesada que ocurren naturalmente. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un solo dominio variable (VHH) y dos dominios constantes (CH2 y CH3). De manera importante, el dominio VHH clonado y aislado es un polipéptido perfectamente estable que alberga la capacidad total de enlace de antígeno del anticuerpo de cadena pesada original. Los nanocuerpos tienen alta homología con los dominios VH de los anticuerpos humanos y pueden ser humanizados en forma adicional sin cualquier pérdida de actividad. De una manera importante, los anticuerpos tienen un bajo potencial inmunogénico, que ha sido confirmado en estudios de primate con compuestos principales de najnocuerpo. Los nanocuerpos combinan las ventajas de los anticuerpos convencionales con características importantes de fármacos de molécula pequeña. Igual que los anticuerpos convencionales, los nanocuerpos muestran alta especificidad objetivo, alta afinidad para su objetivo y baja toxicidad inherente. Sin embargo, igual que los fármacos de molécula pequeña, pueden inhibir las enzimas y realmente accesar a a hendediduras de receptor. Además, los nanocuerpos son extremadamente estables, y pueden ser administrados por medio de otros medios además de inyección (ver, por ejemplo, la Publicación de Patente WO 04/041867, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia) y son fáciles de fabricar. Otras ventajas de nanocuerpos incluyen el reconocimiento de epítopes no comunes u ocultos, como resultado de su tamaño pequeño, que enlazan en cavidades o sitios activos de los objetivos de proteína con alta afinidad y selectividad, debido a su flexibilidad de formato de fármaco, tridimensional única, diseño hecho a la medida de vida media y facilidad y rapidez de descubrimiento de fármaco.

Los anticuerpos son codificados por genes simples y son producidos en forma eficiente en casi todos los huéspedes procarióticos y eucarióticos. Por ejemplo E. coli (ver, la Publicación de Patente U.S. 6,765,087, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia), moho (por ejemplo Aspergillus o Trichoderma) y levadura (por ejemplo Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia) (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,838,254, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia). Este proceso de producción es escalable y se ha producido cantidades de nanocuerpos de múltiples cantidades. Debido a que los nanocuerpos exhiben estabilidad superior con estabilidad de los anticuerpos convencionales, pueden ser formulados como una solución de larga vida en anaquel, lista para utilizarse. El método de nanoclon (ver por ejemplo la Publicación de Patente, WO 06/079372, la cual está incorporada a la presente invención en su totalidad como referencia). Es un método del propietario para generar nanocuerpos contra un objetivo deseado, con base en la selección de alto rendimiento automatizada de células B y puede utilizarse dentro del contexto de la presente invención.

Los unicuerpos son otra tecnología de fragmento de anticuerpo, sin embargo, está basada en la eliminación de la región de articulación de los anticuerpos lgG4. La eliminación de la región de articulación da como resultado una molécula que es esencialmente la mitad del tamaño de los anticuerpos lgG4 tradicionales, y tiene una región de enlace univalente en lugar de una región de enlace bivalente de los anticuerpos lgG4. También es bien sabido que los anticuerpos lgG4 son inertes y por lo tanto no interactúan con el sistema inmune, lo cual puede ser conveniente para el tratamiento de enfermedades, en donde no se desea una respuesta inmune, y esta ventaja es pasada a los Unicuerpos. Por ejemplo, los unicuerpos pueden funcionar para inhibir o silenciar, pero no exterminar las células a las cuales se enlazan. Además, el Unicuerpo que enlaza a las células de cáncer no las estimulan a proliferar. Además, debido a que los unicuerpos tienen la aproximadamente la mitad de tamaño que los anticuerpos lgG4 tradicionales, pueden mostrar una mejor distribución en tumores sólidos más grandes con una eficacia potencialmente conveniente. Los unicuerpos son despejados del cuerpo en un rango similar al de los anticuerpos lgG4 completos, y tienen la capacidad de enlazar con una afinidad similar para sus antígenos, como, anticuerpos completos. Además, se pueden obtener detalles de Unicuerpos mediante la referencia a la Solicitud de Patente WO2007/059782 , la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Las moléculas de adnectina son proteínas de enlace construidas derivadas de uno o más dominios de la proteína de fibronectina. La fibronectina existe naturalmente en el cuerpo humano. Está presente en la matriz extracelular, como un dímero de glucoproteína insoluble, y también sirve como una proteína enlazadora. También está presente en forma soluble en el plasma de sangre como un dímero enlazado por disulfuro. La forma de plasma de la fibronectina está sintetizada mediante células del hígado (hepatocitos), y la forma ECM se hace mediante condrocitos, macrófagos, células endoteliales, fibroblastos y algunas células del epitelio (ver Ward M., y Marcey, D., callutheran.edu/Academic Proqrams/Departments/BioDev/omm/f ibro/fibro.htm). Tal como se mencionó previamente, la fibronectina puede funcionar naturalmente como una molécula de adición celular, o puede transmitir la interacción de células haciendo contacto en la matriz extracelular. Normalmente, la fibronectina se elabora de tres diferentes módulos de proteína, módulos tipo I, tipo II, y tipo III. Para una revisión de la estructura de la función de la fibronectina, ver las Publicaciones de Pankov y Yamada (2002) J Cell Sci.,115(Pt 20):3861-3, Hohenester y Engel (2002) 21:115-128, y Lucena y asociados, (2007) Invest Clin.48:249-262.

En una modalidad específica, las moléculas de adnectina se derivan del dominio de fibronectina tipo III, alterando la proteína nativa la cual está compuesta de múltiples hebras, distribuidas entre dos hojas beta. Dependiendo del tejido de origen, la fibronectina puede contener múltiples dominios tipo III que pueden ser indicados, por ejemplo, fFn3, 2Fn3, 3Fn3, etc. El dominio 10Fn3 contiene un domino de enlace de integrina y contiene además tres lazos que conectan las hebras beta. Estos lazos pueden ser considerados como correspondientes para los lazos de enlace de antígeno de la cadena pesada IgG, y pueden ser alterados a través de los métodos que se describen más adelante para enlazar específicamente a un objetivo de interés, por ejemplo, un dominio tipo Ig de una RTK, tal como el dominio D4 o D5 de Kit RTK humana, o el dominio D7 de un receptor VEGF. Preferentemente, el dominio de fibronectina tipo III útil para los propósitos de la presente invención, es una secuencia que exhibe un identidad de secuencia de al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% con la secuencia que codifica la estructura de la molécula de fibronectina tipo III que puede ser accesada a partir del Protein Data Bank (PDB, rcsb.orq/pdb/home/home.do) con el código de acceso: Ittg. Las moléculas de adnectina también puede ser derivadas de polímeros de moléculas relacionadas con 10Fn3 en lugar de con una estructura 10Fn3 monomérica simple.

Aunque el dominio 10Fn3 nativo normalmente enlaza a integrina, proteínas 10Fn3 adaptadas para convertirse en moléculas de adnectina, son alteradas para enlazar a los antígenos de interés, por ejemplo, un dominio tipo Ig de una RTK, tal como el dominio D4 o D5 de Kit humana. En una modalidad, la alteración de la molécula 10Fn3 comprende al menos una mutación para la hebra beta. En una modalidad preferida, las regiones de lazo que conectan las hebras beta de la molécula 10Fn3 son alteradas para enlazar a un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina humana, por ejemplo, un receptor VEGF o una cinasa de tirosina receptora tipo III, tal como la Kit humana.

Las alteraciones en 10Fn3 pueden realizarse a través de cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, PCR de propensión se error, ADN dirigida al sitio, arrastre de ADN u otros tipos de mutagénesis de recombinación que han sido referenciados en la presente invención. En un ejemplo, las variantes del ADN que codifican las secuencias de 0Fn3 pueden ser sintetizadas directamente in vitro, y posteriormente transcritas y traducidas in vitro o in vivo. Como alternativa, se puede aislar una secuencia 10Fn3 natural o clonarse del genoma utilizando métodos estándar, tal como se lleva a cabo por ejemplo en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 20070082365), y posteriormente mutarse utilizando métodos de mutagénesis conocidos en la técnica.

En una modalidad, una proteína objetivo, por ejemplo, un dominio tipo Ig de una RTK, tal como el dominio D4 o D5 de la Kit RTK o el dominio D7 de un receptor VEGF, puede ser inmovilizada en un soporte sólido, tal como una resina de columna, o un depósito en una placa de microtitulación . Posteriormente los objetivos se contactan con una biblioteca de proteínas de enlace potenciales. La biblioteca puede comprender clones 10Fn3 o moléculas de adnectina derivadas de 10Fn3 tipo natural, mediante mutagénesis/aleatorización de la secuencia 0Fn3 o mediante mutagénesis/aleatorización de las regiones del lazo 0Fn3 (no las hebras beta). En una modalidad preferida, la biblioteca puede ser una biblioteca de fusión de proteína ARN generada mediante las técnicas descritas en la Publicación de Szostak y asociados, la Serie Norteamericana No. 09/007,005 y 09/247,190; Szostak y asociados, WO989/31700; y Roberts & Szostak (1997) 94:12297-12302. La biblioteca también puede ser una biblioteca de proteína-ADN (por ejemplo, tal como se describe en la Publicación de Lohse, Serie Norteamericana No. 60/110,549, Serie Norteamericana No. 09/459,190, y WO 00/32823). La biblioteca de fusión posteriormente se incuba con el objetivo inmovilizado (por ejemplo, el dominio D4 o D5 de la Kit humana RTK o el dominio D7 humana de un receptor VEGF) y el soporte sólido se lava para eliminar porciones de enlace no específicas. Posteriormente los enlazadores ajustados se eluyen bajo condiciones estrictas y se utiliza PCR para ampliar la información genética, o para crear una nueva biblioteca de molécula de enlace para repetir el proceso (con o sin la mutagénesis adicional). El proceso de selección/mutagénesis puede ser repetido hasta que se obtienen enlazadores con suficiente afinidad para el objetivo. Las moléculas de adnectina para utilizarse en la presente invención pueden ser construidas utilizando tecnología de PROfusion™ empleada por Adnexus, una compañía de Briston-Myers Squibb. Se creó la tecnología PROfusion con la base en la técnica referenciadas anteriormente (por ejemplo, Roberts & Szostak (1997) 94:12297-12302). Los métodos para generar biblioteca de dominios 10Fn3 alterados, y seleccionar enlazadores adecuados que pueden ser utilizados con la presente invención se describen completamente en los siguientes documentos de Solicitud de Patente y Patente Norteamericana, y están incorporadas a la presente invención como referencia; Patentes Norteamericanas Nos. 7,115,396; 6,818,418; 6,537,749; 6,660,473; 7,195,880; 6,416,950; 6,214,553; 6623926; 6,312,927; 6,602,685; 6,518,018; 6,207,446; 6,258,558; 6,436,665; 6,281,344; 7,270,950; 6,951,725; 6,846,655; 7,078,197; 6,429,300; 7,125,669; 6,537,749; 6,660,473; y Solicitudes de Patente Norteamericana Nos. 20070082365; 20050255548; 20050038229; 20030143616; 20020182597; 20020177158; 20040086980; 20040253612; 20030022236; 20030013160; 20030027194; 20030013110; 20040259155; 20020182687; 20060270604; 20060246059; 20030100004; 20030143616; y 20020182597. La generación de diversidad de los dominios de fibronectina tipo III, tal como 10Fn3, seguido de un paso de selección puede lograrse utilizando otros métodos conocidos en la técnica tal como despliegue de fago, o despliegue ribosoma, o despliegue de superficie de levadura, por ejemplo ver las Publicaciones de Lipovsek y asociados, (2007) Journal de Molecular Biology 368: 1024-1041; Sergeeva y asociados, (2006) Adv Drug Deliv Rev. 58:1622-1654; Petty y asociados, (2007) Trends Biotechnol. 25: 7-15; Rothe y asociados, (2006) Expert Opin Biol Ther. 6:177-187; y Hoogenboom (2005) Nat Biotechnol. 23:1105-1116.

Deberá ser apreciado por un experto en la técnica que las referencias de los métodos mencionadas anteriormente pueden ser utilizadas para derivar miméticos de anticuerpo de proteínas además del dominio 10Fn3 preferido. Las moléculas adicionales que se pueden utilizar para generar miméticos de anticuerpo a través de los métodos referenciados anteriormente incluyen sin limitación módulos de fibronectina humana 1Fn3-9Fn3 y 11Fn3-17Fn3, así como los módulos Fn3 relacionados de animales no humanos y procariotos. Además, los módulos Fn3 de otras proteínas con la homología de secuencia 0Fn3 tal como tenascinas y undulinas, también puede ser utilizados. Otras proteínas de ejemplo que tienen dobleces tipo inmunoglobulina (pero con secuencias que no están relacionadas con el dominio VH) incluyen N-caderina, ICAM-2, titina, receptor GCSF, receptor de citocina, inhibidor de glucosidasa, E-caderina, y cromoproteína antibiótica. Los dominios adicionales con estructuras relacionadas pueden ser derivados de la molécula de la adhesión de membrana de mielina PO, CD8, CD4, CD2, MHC clase I, receptor de antígeno de célula-T, dominios CD1, C2 y de conjunto I de VCAM-1, doblez de inmunoglobulina de conjunto-I de la proteína C de enlace de miocina, doblez de inmunoglobulina de conjunto-I de la proteína H de enlace a miocina, doblez de inmunoglobulina de conjunto I de teloquina, teliquina, NCAM, twitquina, neuroglian, receptor de hormona de crecimiento, receptor de eritropoyetina, receptor de prolactina, receptor GC-SF, receptor interferón-gama, beta-galactosidasa/glucuronidasa, beta-glucuronidasa, y transglutaminasa. Como alternativa, cualquier otra proteína que incluye uno o más dobleces tipo inmunoglobulina puede ser utilizada para crear una porción de enlace tipo adnectina. Dichas proteínas pueden ser identificadas, por ejemplo utilizando el programa SCOP (Murzin y asociados, J. Mol. Biol. 247:536 (1995); Lo Conté y asociados, Nucleic Acids Res. 25:257 (2000).

Un aptámero es otro tipo de mimético de anticuerpo que está comprendido por la presente invención. Los aptámeros normalmente son polímeros de nucleótido pequeño que enlazan a objetivos moleculares específicos. Los aptámeros pueden ser moléculas de ácido nucleico de hebra simple o doble (ADN o ARN), aunque los aptámeros a base de ADN son los que tienen hebra doble más comúnmente. No existe una longitud definida para un ácido nucleico de aptámero; sin embargo, las moléculas de aptámero más comúnmente tienen entre 15 y 40 nucleótidos de longitud.

Los aptámeros con frecuencia forman estructuras complejas tridimensionales que determinan su afinidad para moléculas objetivo. Los aptámeros pueden ofrecer muchas ventajas con respecto a los anticuerpos simples, principalmente debido a que son construidos y amplificados casi totalmente in vitro. Además, los aptámeros con frecuencia inducen poca o ninguna respuesta inmune.

Los aptámeros pueden ser generados utilizando una variedad de técnicas, aunque fueron desarrollados originalmente utilizando selección in vitro (Ellington y Szostak. (1990) Nature. 346(6287):818-22) y el método SELEX (evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial) (Schneider y asociados, 1992. J Mol Biol. 228(3):862-9) cuyos contenidos están incorporados a la presente invención como referencia. Se han publicado otros métodos para elaborar y utilizar los aptámeros incluyendo Klussmann. Manual de aptámero: Oligonucleótidos Funcionales y sus Aplicaciones. ISBN: 978-3-527-31059-3; Ulrich y asociados, 2006. Comb Chem High Throughput Screen 9(8):619-32; Cerchia y de Franciscis. 2007. Methods Mol Biol. 361:187-200; Ireson y Kelland. 2006. Mol Cáncer Ther. 2006 5(12):2957-62; Patentes Norteamericanas Nos.: 5582981; 5840867; 5756291; 6261783; 6458559; 5792613; 6111095; y Solicitudes de Patente Norteamericana Nos.: 11/482,671; 11/102,428; 11/291,610; y 10/627,543, las cuales todas están incorporadas a la presente invención como referencia.

El método SELEX es claramente el más popular y se lleva a cabo en tres pasos fundamentales. Primero, se selecciona una biblioteca de molécula de ácido nucleico candidatas para enlazar al objetivo molecular específico. Segundo, los ácidos nucleicos con suficiente afinidad para el objetivo son separados de los no enlazadores. Tercero, los ácidos nucleicos enlazados son amplificados, se forma una segunda biblioteca y se repite el proceso. En cada repetición, se elijen aptámeros que tienen la mayor afinidad para la molécula objetivo. Los métodos SELEX se describen con mayor detalle en las siguientes publicaciones, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia: Bugaut y asociados, 2006. 4(22):4082-8; Stoltenburg y asociados, 2007 Biomol Eng. 2007 24(4):381 -403; y Gopinath. 2007. Anal Bioanal Chem. 2007. 387(1 ): 171 -82.

Un "aptamero" de la presente invención también incluye a moléculas de aptámero, elaboradas de péptidos en lugar de nucleótidos. Los aptámeros de péptido comparten muchas propiedades con los aptámeros de nucleótido (por ejemplo, un tamaño pequeño y la capacidad de enlazar a moléculas objetivo con alta afinidad) y pueden ser generados mediante métodos de selección que tienen sitios similares a los utilizados para generar aptámeros de nucleótido, por ejemplo, Baines y Colas. 2006. Drug Discov Today. 11 (7-8):334-41 ; y Bickle y asociados, 2006. Nat Protoc. 1 (3): 1066-91 , las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Las moléculas de anticuerpo representan una nueva clase de proteínas de afinidad basadas en un dominio de proteína de 58 residuos de aminoácido, derivado de uno de los dominios de enlace IgG de la proteína A estafilococal . Este dominio de manojo de tres hélices ha sido utilizado como un andamio para la construcción de bibliotecas de fagémido de combinación, de las cuales se pueden seleccionar utilizando tecnología de despliegue de fago, variantes de Aficuerpo que dirigen las moléculas deseadas (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Proteínas de Enlace seleccionadas de bibliotecas de combinación de un dominio de receptor bacteriano de a-hélice, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Ligandos específicos de Inmunoglobulina Humana A (IgA) de una construcción de combinación de proteína A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). La estructura robusta, simple de las moléculas de Aficuerpo en combinación con su bajo peso molecular (6 kDa), las hace adecuadas para una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, como reactivos de detección (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, y asociados, Construcción y caracterización de quimeras Fc-aficuerpo producidas en Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261: 199-211) y para inhibir interacciones de receptor (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibición de señal de co-estimulación CD28-CD80 a través de un ligando de Aficuerpo de enlace CD28 desarrollado mediante ingeniería de proteína de combinación, Protein Eng 2003;16:691-7). Se podrán encontrar detalles adicionales con respecto a Aficuerpos y métodos de producción de los mismos, en la Patente Norteamericana No. 5,831,012, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Las DARPins (Proteínas de Repetición de Ankirina Diseñada) son un ejemplo de una tecnología de DRP (Proteína de Repetición Designada) mimética de anticuerpo que ha sido desarrollada para explotar las capacidades de enlace de polipéptidos sin anticuerpo. Las proteínas de repetición tal como ankirina o proteínas de repetición con alto contenido de leucina son moléculas de enlace ubicuitas, que ocurren, a diferencia de los anticuerpos, en forma intra y extracelular. Sus arquitecturas modulares únicas, presentan unidades estructurales dé repetición (repeticiones), que quedan pegadas para formar dominios de repetición alargados que despliegan superficies de enlace de objetivo variable y modular. Con base en esta modularidad, se pueden generar bibliotecas de combinación de polipéptidos con especificidades de enlace altamente diversificadas. Esta estrategia incluye el diseño de consenso de repeticiones auto-compatibles que despliegan residuos de superficie variables y su ensamble aleatorio en dominios de repetición.

Las DARPins pueden ser producidas en sistemas de expresión bacteriana con rendimientos muy altos, y pertenecen a las proteínas más estables conocidas. Se han seleccionado DARPins de alta afinidad, altamente específicas para un amplio rango de proteínas objetivo, incluyendo receptores humanos, citocinas, cinasas, proteasas humanas, viruses y proteínas de membrana. Se pueden obtener DARPins que tienen afinidades en el rango de un solo dígito nanomolar a pico molar.

Las DARPins han sido utilizadas en un amplio rango de aplicaciones incluyendo ELISA, ELISA de emparedado, análisis citométrico de flujo (FACS), inmunohistoquímica (IHC), aplicaciones de chip, purificación por afinidad o manchado Western. Las DARPins también han probado ser altamente activas en el compartimiento intracelular, por ejemplo, como proteínas marcadoras intracelulares fusionadas a la proteína fluorescente verde (GFP). Las DARPins fueron utilizadas en forma adicional para inhibir la entrada viral con IC50 en el rango pM. Las DARPins no únicamente son ideales para bloquear las interacciones proteína-proteína, sino que también inhiben enzimas. Las proteasas, cinasas y transportadores han sido inhibidos en forma exitosa, con mayor frecuencia con un modo de inhibición alostérico. Los enriquecimientos muy rápidos y específicos en el tumor, y las proporciones muy favorables de tumor a sangre, hacen a las DARPins adecuadas para diagnósticos in vivo o métodos terapéuticos.

Se puede encontrar información adicional con respecto a DARPins y otras tecnologías DRP, en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2004/0132028 y en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 02/20565, ambas de las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Las anticalinas son una tecnología mimética de anticuerpo adicional, sin embargo en este caso, la especificidad de enlace se deriva de lipocalinas, una familia de proteínas de bajo peso molecular que se expresan en forma natural y abundante en tejidos y fluidos corporales humanos. Las lipocalinas han sido desarrolladas para llevar a cabo un rango de funciones in vivo, asociadas con el transporte fisiológico y almacenamiento de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Las lipocalinas tienen una estructura intrínseca robusta que comprende un barril-ß altamente conservado que soporta cuatro lazos en un término de la proteína. Estos lazos forman la entrada a un bolsillo de enlace y las diferencias de conformación en esta parte de la molécula, abarcan la variación en especificidad de enlace entre lipocalinas individuales.

Aunque la estructura general de los lazos hipervariables soportados por una estructura de hoja-ß conservada es reminiscente de inmunoglobulinas, las lipocalinas difieren considerablemente a los anticuerpos en términos de tamaño, estando compuestas de una sola cadena de péptido de 160 a 180 aminoácidos que son marginalmente más grandes que un dominio de inmunoglobulina simple.

Las lipocalinas se clonan y sus lazos se someten a ingeniería con el objeto de crear anticalinas. Se han generado bibliotecas de anticalinas estructuralmente diversas, y el despliegue de anticalina permite la selección y clasificación de la función de enlace, seguido de la expresión y producción de una proteína soluble para análisis adicional en sistemas procarióticos o eucarióticos. Los estudios han demostrado con éxito que las anticalinas que pueden ser desarrolladas que son específicas virtualmente para cualquier proteína objetivo humana, pueden ser aisladas y se pueden obtener afinidades de enlace en el rango nanomolar o uno mayor.

Las anticalinas también pueden ser formateadas como proteínas de dirección doble, llamadas duocalinas. Una duocalina enlaza a dos objetivos terapéuticos separados en una proteína monomérica producida fácilmente, utilizando procesos de fabricación estándar, reteniendo al mismo tiempo la especificidad y afinidad objetivo sin importar la orientación estructural de sus dos dominios de enlace.

La modulación de múltiples objetivos a través de una sola molécula es particularmente conveniente en enfermedades conocidas por implicar más de un factor causante simple. Además, los formatos de enlace bi o multivalentes, tal como las duocalinas, tienen potencial significativo para dirigir las moléculas de superficie celular en la enfermedad, transmitir efectos agonistas en las trayectorias de traducción de señal o inducir efectos de internalización mejorados mediante el enlace y agrupación de receptores de superficie celular. Además, la alta estabilidad intrínseca de las duocalinas, es comparable con las anticalinas monoméricas, ofreciendo una formulación flexible y un suministro potencial para las duocalinas.

Se puede encontrar información adicional con respecto a las anticalinas en la Patente Norteamericana No. 7,250,297 y Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 99/16873, ambas de las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Otra tecnología mimética de anticuerpo útil dentro del contexto de la presente invención, son los avímeros. Los avímeros son desarrollados de una gran familia de dominios de receptor extracelular humano mediante arrastre de exón ¡n vitro y despliegue de fago, generando proteínas de multidominio con propiedades de enlace y de inhibición. Los dominios de enlace independiente de ligadura múltiple, han mostrado crear avidez y dan como resultado una afinidad y especificidad mejorada en comparación con proteínas de enlace de epítope simple convencionales. Otras ventajas potenciales incluyen la producción simple y eficiente de moléculas específicas multiobjetivo en Escherichia coli, termoestabilidad mejorada y resistencia a proteasas. Los avímeros con afinidades sub-nanomolares han sido obtenidos contra una variedad de objetivos.

Se puede encontrar información adicional con respecto a los Avímeros en las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/022 384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, las cuales todas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Los versacuerpos son otra clase de tecnología mimética de anticuerpo que puede ser utilizada dentro del contexto de la presente invención. Los versacuerpos son proteínas pequeñas de 3-5 kDa con el >15% de cisteínas que forman un andamio de densidad de disulfuro de alto nivel, reemplazando el centro hidrofóbico que tienen las proteínas típicas. El reemplazo en un gran número de aminoácidos hidrofóbicos, que comprenden el centro hidrofóbico, con un pequeño número de disulfuros da como resultado una proteína que es menor, más hidrofílica (menos agregación y enlace no específico), más resistentes a proteasas y calor, y tienen una menor densidad de epítopes de célula-T, debido a que los residuos que contribuyen en su mayoría a la presentación MHC, son hidrofóbicos. Las cuatro de estas propiedades son bien conocidas por afectar la inmunogenicidad, y juntas se espera que originen una gran disminución en la inmunogenicidad.

La inspiración para los versacuerpos viene de biofarmacéuticos inyectables naturales producidos mediante sanguijuelas, serpientes, arañas, escorpiones, víboras y anémonas, que son conocidas por exhibir una inmunogenicidad inesperadamente baja. Comenzando con la familia de proteínas naturales seleccionadas, mediante diseño y mediante clasificación se minimiza el tamaño, hidrofobicidad, procesamiento de antígeno proteolítico y densidad de epítope a niveles muy por debajo del promedio de las proteínas inyectables naturales.

Debido a que la estructura de los Versacuerpos, estos miméticos de anticuerpo ofrecen un formato versátil que incluye valencia, multi-especificidad, una diversidad de mecanismos de vida media, módulos de dirección de tejido y la ausencia de la región de anticuerpo Fe. Además, los Versacuerpos son fabricados en E. coli en altos rendimientos, y debido a su hidrofilicidad y tamaño pequeño, los Versacuerpos son altamente solubles y pueden ser formulados en altas concentraciones. Los Versacuerpos son excepcionalmente estables al calor (pueden ser hervidos) y ofrecen una vida en anaquel prolongada.

Se puede encontrar información adicional con respecto a los Versacuerpos en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0191272, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Los SMIPs™ (Small Modular ImmunoPharmaceuticals-Trubion Pharmaceuticals) son construidos para mantener y optimizar el enlace de objetivo, las funciones efectoras, la vida media in vivo y los niveles de expresión. SMIPS consiste en tres distintos dominios modulares. Primero contienen un dominio de enlace que puede consistir en cualquier proteína que confiere especificidad (por ejemplo, receptores de superficie celular, anticuerpos de cadena simple, proteínas solubles, etc.). En segundo lugar, contienen un dominio de articulación que sirve como un enlazador flexible entre el dominio de enlace y el dominio efector, y también ayuda a controlar la multimerización del fármaco SMIP. Finalmente, SMIP contiene un dominio efectos que puede ser derivado de una variedad de moléculas incluyendo dominios Fe u otras proteínas especialmente diseñadas. La modularidad del diseño, que permite la construcción simple de SMIPs con una variedad de diferentes dominios de enlace, articulación y efectores, proporciona un diseño de fármaco rápido y a la medida.

Se puede encontrar más información con respecto a SMIPs, incluyendo ejemplos de como diseñarlos en la Publicación de Zhao y asociados (2007) Blood 110:2569-77 y en las siguientes Solicitudes de Patente Norteamericana Nos. 20050238646; 20050202534; 20050202028; 20050202023; 20050202012; 20050186216; 20050180970; y 20050175614.

La descripción detallada de los fragmentos de anticuerpo y tecnologías miméticas de anticuerpo proporcionadas anteriormente, no pretende ser una lista integral de todas las tecnologías que pueden ser utilizadas dentro del contexto de la presente especificación. Por ejemplo, tampoco como una limitación, se pueden utilizar dentro del contexto de la presente invención, una variedad de tecnologías adicionales que incluyen tecnologías a base de polipéptido alternativo, tal como fusiones de regiones de determinación de complementariedad tal como se describe en la Publicación de Qui y asociados, Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia, así como a tecnologías a base de ácido nucleico, tal como tecnologías de aptámero de ARN descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774, y 6,387,620, las cuales todas están incorporadas a la presente invención como referencia.

Propiedades Físicas de Anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención, los cuales se enlazan a un dominio tipo Ig de una RTK, pueden ser caracterizados en forma adicional a través de las diversas propiedades físicas. Se pueden utilizar diversos ensayos para detectar y/o diferenciar diferentes clases de anticuerpos con base en estas propiedades físicas.

En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden contener uno o más sitios de glucosilacion ya sea en la región variable de cadena ligera o de cadena pesada. La presencia de uno o más sitios de glucosilacion en la región variable, puede dar como resultado una inmunogenicidad incrementada del anticuerpo, o una alteración de pK del anticuerpo debido al enlace de antígeno alterado (Marshall y asociados (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA y Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick y asociados (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 1_2:43R-56R; Parekh y asociados (1985) Nature 316:452-7; Mimura y asociados, (2000) Mol Immunol 37. : 697-706 ) . Se sabe que la glucosilacion ocurre en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. La glucosilacion de región variable puede ser probada utilizando un ensayo Glycoblot, el cual disocia el anticuerpo para producir un Fab, y posteriormente se hacen pruebas para glucosilación utilizando un ensayo que mide la oxidación de peryodato y la formación de base Schiff. Como alternativa, se puede probar la glucosilación de región variable utilizando cromatografía de luz Dionex (Dionex-LC), que disocia sacáridos de un Fab en monosacáridos, y analiza el contenido de sacárido individual. En algunos casos, puede ser preferido tener un anticuerpo que no contiene glucosilación de región variable. Esto se puede lograr ya sea seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glucosilación en la región variable, o mutando residuos dentro del motivo de glucosilación, utilizando técnicas estándar conocidas en el arte.

Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pl), aunque generalmente los anticuerpos estarán dentro de un rango de pH de entre 6 y 9.5. El pl para un anticuerpo lgG1 normalmente está dentro de un rango de pH del 7 a 9.5, y el pl para un anticuerpo lgG4 normalmente está dentro de un rango del pH de 6 a 8. Los anticuerpos pueden tener un pl que está fuera de este rango. Aunque los efectos son generalmente desconocidos, existe especulación de que los anticuerpos con un pH fuera del rango normal pueden tener cierto desdoblamiento e inestabilidad bajo condiciones ¡n vivo. El punto isoeléctrico puede ser probado utilizando un ensayo de enfoque isoeléctrico capilar, que crea un gradiente de pH y puede utilizar enfoque láser para una precisión incrementada (Janini y asociados (2002) Electrophoresis 23.: 1605-11; Ma y asociados (2001 ) Chromatographia 5_3:S75-89; Hunt y asociados (1998) J Chromatogr A 800:355-67). En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo que contiene un valor pl que está dentro del rango normal. Esto se puede regular ya sea seleccionando anticuerpos con un pl en el rango normal, o mutando residuos de superficie cargada utilizando técnicas estándar conocidas en el arte.

Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión que es indicativa de estabilidad térmica (Knshnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Una mayor estabilidad térmica indica una mayor estabilidad de anticuerpo general in vivo. El punto de fusión de un anticuerpo puede medirse utilizando técnicas tal como calorimetría de exploración diferencial (Chen y asociados (2003) Pharm Res 20.: 1952-60; Ghirlando y asociados (1999) Immunol Lett 6_8.:47-52). T 1 indica la temperatura del desdoblamiento inicial del anticuerpo. TM2 indica la temperatura del desdoblamiento completo del anticuerpo. Generalmente, se prefiere que el TMi de un anticuerpo de la presente invención, sea mayor a 60°C, preferentemente mayor a 65°C, incluso más preferentemente mayor a 70°C. Como alternativa, la estabilidad térmica de un anticuerpo puede ser medida utilizando dicroismo circular (Murray y asociados (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

En una modalidad preferida, pueden ser convenientes, anticuerpos que no se degradan rápidamente. La fragmentación de un anticuerpo puede ser medida utilizando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS, como es bien conocido en la técnica (Alexander AJ y Hughes DE (1995) Anal Chem 67_:3626-32). En otra modalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregación mínimos. La agregación puede conducir a la activación de una respuesta inmune no deseada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas o no favorables. Generalmente los anticuerpos son aceptables con una agregación del 25% o menos, preferentemente 20% o menos, incluso más preferentemente 15% o menos, incluso más preferentemente 10% o menos e incluso más preferentemente 5% o menos. La agregación puede ser medida a través de diversas técnicas conocidas en el arte, incluyendo columna de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), y dispersión de luz para identificar monómeros, dímeros, trímeros o multímeros.

Producción de Anticuerpos Policlonales de la Presente Invención Los anticuerpos policlonales de la presente invención pueden ser producidos a través de una variedad de técnicas que son conocidas en el arte. Los anticuerpos policlonales se derivan de diferentes líneas de célula B y por lo tanto pueden reconocer epítopes múltiples en el mismo antígeno. Los anticuerpos policlonales normalmente se producen mediante inmunización de un mamífero adecuado con el antígeno de interés, por ejemplo, un dominio tipo Ig de una RTK, tal como el dominio D4 o D5 de la Kit humana, o el dominio D7 del VEGF humano. Los animales utilizados con frecuencia para la producción de anticuerpos policlonales son pollos, cabras, cerdos de guinea, hamsters, caballos, ratones, ratas, ovejas y más comúnmente, conejos. En el ejemplo 14 que se encuentra más adelante, se generaron anticuerpos policlonales anti-Kit, inmunizando conejos con el cuarto (D4) o quinto (D5) dominio tipo Ig de Kit o todo el ectodominio de Kit. Los métodos estándar para producir anticuerpos policlonales son ampliamente conocidos en la técnica, y pueden ser combinados con los métodos de la presente invención (por ejemplo, research .cm. utexas.edu/bkitto/Kittolabpage/Protocols/lmmunolo gy/PAb.html; Patentes Norteamericanas Nos. 4,719,290, 6,335,163, 5,789,208, 2,520,076, 2,543,215 y 3,597,409, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia.

Producción de Anticuerpos Monoclonales de la Presente In ención Los anticuerpos monoclonales (mAbs) de la presente invención pueden ser producidos a través de una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación de célula somática estándar de Kohier y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de célula somática, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir el anticuerpo monoclonal, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Deberá observarse que los anticuerpos (monoclonales y policlonales) o partes de enlace de antígeno de los mismos, pueden ser elevados para cualquier epítope en un dominio tipo Ig de una RTK, más preferentemente los dominios D4 o D5 de la RTK Kit humana o del dominio D7 de receptor VEGF, para las secuencias de consenso aquí descritas, o para cualesquiera epítopes de conformación, discontinuos o lineales aquí descritos.

Son útiles varios de los métodos conocidos en la técnica para seleccionar en forma específica un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza específicamente un epítope discontinuo de interés. Por ejemplo, las técnicas descritas en la Publicación Norteamericana No. 2005/0169925, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia, permiten la selección de un anticuerpo que enlaza a dos diferentes péptidos dentro de una secuencia de proteína. Dichos métodos pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención, para dirigir específicamente los epítopes de conformación y discontinuos aquí descritos. Si el epítope de conformación es una estructura secundaria de proteína, dichas estructuras con frecuencia se forman fácilmente en péptidos más pequeños (por ejemplo, <50 aminoácidos). Por lo tanto, inmunizando un animal con péptidos más pequeños, se pueden capturar algunos epítopes de conformación. Como alternativa, dos péptidos pequeños que comprenden un epítope de conformación (por ejemplo, los péptidos identificados en la tabla 5) pueden ser conectados a través de un enlazador flexible (por ejemplo, poliglicol, o un estiramiento de aminoácidos no cargados, polares). El enlazador permitirá que los péptidos exploren diversas orientaciones de interacción. La inmunización con esta construcción, seguido de una clasificación adecuada puede permitir la identificación de anticuerpos dirigidos a un epítope de conformación. En una modalidad preferida, los péptidos para los epítopes de conformación o lineales específicos pueden ser generados inmunizando un animal con un dominio particular de una RTK (por ejemplo, el dominio 4 o el dominio 5 del ectodominio Kit o D7 de un receptor VEGF) y subsecuentemente clasificar los anticuerpos que enlazan al epítope de interés. En una modalidad, se puede utilizar microscopio de crioelectrones (Jiang y asociados (2008) Nature 451, 1130-1134; Joachim (2006) Oxford University Pres, _ISBN:0195182189) para identificar epítopes enlazados por un antígeno o fragmento de enlace de antígenos de la presente invención. En otra modalidad, la RTK o un dominio de la misma pueden ser cristalizados con un anticuerpo enlazado o fragmento de enlace de antígenos del mismo, y ser analizado mediante cristalografía de rayos X para determinar los epítopes precisos que se enlazan. Además, los epítopes pueden ser mapeados reemplazando porciones de la secuencia RTK, con las secuencias correspondientes de ratón u otras especies. Los anticuerpos dirigidos a epítopes de interés, enlazarán selectivamente la región de secuencia humana, y por lo tanto, es posible mapear en secuencias los epítopes objetivo. Esta técnica de mapeo de epítope a base de quimera, ha sido utilizada con éxito para identificar epítopes en varias configuraciones (ver las Publicaciones de Henriksson y Pettersson (1997) Journal of Autoimmunity. 10(6):559-568; Netzer y asociados (1999) J Biol Chem. 1999 Apr 16;274(16): 11267-74; Hsia y asociados (1996) Mol. Microbio!. 19, 53-63, las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Se considera que los epítopes de interés en las RTKs objetivo (por ejemplo, la RTK Kit o un receptor VEGF) no están glucosilados. Sin embargo, si una RTK de interés está glucosilada, los anticuerpos o partes de antígeno de los mismos (u otras porciones de la presente invención) pueden ser elevados de modo que enlacen a los residuos de aminoácido y/o azúcar relevantes. Por ejemplo, se sabe en la técnica que la proteína Kit tiene al menos 10 sitios de glucosilacion enlazada-N potencial (Morstyn, Foote, Lieschke (2004) Factores de Crecimiento Hematopoyéticos en Oncología: Ciencia Básica y Terapéuticos Clínicos. Humana Press. ISBN: 1588293025). Se considera además que Kit puede exhibir glucosilación enlazada-O, así como adhesión a residuos de ácido siálico (Wypych J, y asociados (1995) Blood, 85(l):66-73). Por lo tanto, se contempla que los anticuerpos o partes de enlace de antígeno de los mismos (u otras porciones de la presente invención) pueden ser elevados de modo que también enlacen a residuos de azúcar que pueden ser adheridos a cualquier epítope aquí identificado. Para este propósito, un péptido antigénico de interés puede ser producido en una célula animal, de modo que sea glucosilada en forma adecuada, y el péptido antigénico glucosilado posteriormente pueda ser utilizado para inmunizar un animal. Las células y técnicas adecuadas para producir péptidos glucosilados son conocidas en la técnica y se describen con mayor detalle más adelante (ver por ejemplo, las tecnologías disponibles en la Publicación de GlycoFi, Inc., Lebanon, NH y BioWa; Princeton, NJ). La glucosilación adecuada de un péptido puede ser probada utilizando cualesquiera métodos estándar, tal como enfoque isoeléctrico (IEF), hidrólisis de ácido (para determinar la composición de monosacárido), disociación química o enzimática, y espectrometría de masa (MS) para identificar glicanos. La tecnología ofrecida por Procognia (procognia.com), que utiliza una formación a base de lectina para acelerar el análisis de glicano, también puede ser utilizada. La O-glucosilación puede ser detectada en forma específica utilizando técnicas tal como disociación alcalina reductiva o "beta eliminación", mapeo de péptido, cromatografía líquida y espectrometría de masa o cualquier combinación de estas técnicas.

El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema de múrido. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmunización y técnicas para aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidas en la técnica. También se conocen asociados de fusión (por ejemplo, células de mieloma de múrido) y procedimientos de fusión.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención, pueden ser preparados con base en la secuencias de un anticuerpo monoclonal de múrido preparada tal como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera, puede ser obtenido del hibridoma de múrido de interés y construirse para contener secuencias de inmunoglobulina de no múrido (por ejemplo, humano) utilizando técnicas de biología molecular estándar). Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de múrido pueden ser enlazadas a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,816,567 de Cabilly y asociados). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR de múrido pueden ser insertadas en una estructura humana utilizando métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,225,539 de Winter, y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y asociados). Como alternativa, se puede diseñar un anticuerpo humanizado en el nivel de ADN o proteína, proporcionando conocimiento de las secuencias humanas y no humanas. Dichos anticuerpos pueden ser sintetizados directamente en forma química, o el ADN puede ser sintetizado y expresado in vitro o in vivo para producir un anticuerpo humanizado.

En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra un dominio tipo ,lg de una RTK, por ejemplo, el dominio D4 o D5 de Kit o el dominio D7 de un receptor VEGF, se puede generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente invención como ratones HuMAb y KM mice™, respectivamente, y son referidos colectivamente en la presente invención como "ratones Ig humanos".

El HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contiene un minilugar de gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y ligera humanas no reajustadas, junto con mutaciones dirigidas que desactivan el lugar de cadena µ y ? endógena (ver la Publicación de, Lonberg, y asociados (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben expresión reducida de IgM o ? de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos pasan por una conmutación de clase y mutación somática para generar el monoclonal IgGK humano de alta afinidad (Lonberg, N. y asociados (1994), supra; revisado en la Publicación de Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 1 3:49-101 : Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 1_3: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de ratones HuMab, y las modificaciones genómicas llevadas por dichos ratones, se describe en forma adicional en las Publicaciones de Taylor, L. y asociados (1992) Nucleic Acids Research 20.:6287-6295; Chen, J. y asociados (1993) International Immunology 5_: 647-656; Tuaillon y asociados (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi y asociados (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. y asociados (1993) EMBO J. 1_2: 821-830; Tuaillon y asociados (1994) J. Immunol. 1_52.:2912-2920; Taylor, L. y asociados (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. y asociados (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, cuyos contenidos totales están incorporados específicamente en la presente invención como referencia. Ver además las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas de Lonberg y Kay; la Patente Norteamericana No. 5,545,807 de Surani y asociados; las publicaciones PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la Publicación PCT No. WO 01/14424 de Korman y asociados.

En otra modalidad, los anticuerpos humanos de la presente invención pueden elevarse utilizando un ratón que lleva secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que lleva un transgen de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Dichos ratones, referidos en la presente en la presente invención como "KM mice™", se describen con detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 de Ishida y asociados.

Aún además, los sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden utilizar para elevar los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, un sistema transgénico alternativo referido como el Xenoratón (Abgenix, Inc.) puede ser utilizado; dichos ratones se describen por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 y 6,162,963 de Kucherlapati y asociados.

Además, los sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, están disponibles en la técnica y se pueden utilizar para elevar los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, los ratones que llevan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, referidos como "ratones TC" pueden ser utilizados; dichos ratones se describen en la Publicación de Tomizuka y asociados (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, se han descrito en la técnica (Kuroiwa y asociados (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) vacas que llevan transcromosomas de cadena pesada y ligera humana y se pueden utilizar para elevar los anticuerpos de la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención también se pueden preparar utilizando métodos de despliegue de fago para clasificar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Dichos métodos de despliegue de fago para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 de Ladner y asociados; Patentes Norteamericanas Nos. 5,427,908 y 5,580,717 de Dower y asociados; Patentes Norteamericanas Nos. 5,969,108 y 6,172,197 de McCafferty y asociados; y Patentes Norteamericanas Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 de Griffiths y asociados.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención, también pueden ser preparados utilizando ratones SCID en los cuales, se han reconstituido las células inmune humanas, de modo que se pueda generar al momento de la inmunización una respuesta de anticuerpo humana. Dichos ratones se describen por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,476,996 y 5,698,767 de Wilson y asociados.

En otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención pueden ser elevados utilizando técnicas de despliegue de fago bien conocidas tal como se describe en las Publicaciones de Marks, J.D., y asociados ((1991). J. Mol. Biol. 222, 581), Nissim, A., y asociados ((1994). EMBO J. 13, 692) y en las Patente Norteamericana Nos. 6,794,132; 6562341; 6057098; 5821047; y 6512097.

En una modalidad adicional, los anticuerpos de la presente invención pueden encontrarse utilizando tecnología de despliegue de superficie de célula de levadura tal como se describe por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,423,538; 6,300,065; 6,696,251; 6,699,658.

Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos de la presente invención Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención, se pueden aislar esplenocitos y/o células de nodo linfático de ratones inmunizados, y fusionarse con una línea de célula inmortalizada adecuada, tal como una línea de célula de mieloma de ratón.

Los hibridomas resultantes pueden ser clasificados para la producción de anticuerpos específicos de antígenos. Por ejemplo, las suspensiones celulares simples de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados, pueden ser fusionadas a un sexto del número células de mieloma de ratón sin secreción P3X63-Ag8. 653 (ATCC, CRL 1580) con 50% PEG. Como alternativa, la suspensión de célula simple de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados, puede ser fusionada utilizando un método de electrofusión a base de campo eléctrico, utilizando un electroporador de fusión celular de cámara grande CytoPulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland). Las células son revestidas en aproximadamente 2 x 105 en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en un medio selectivo que contiene 20% de suero de clon fetal, 18% de un medio acondicionado "653", 5% de origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 5mM de HEPES, 0.055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente dos semanas, las células pueden ser cultivadas en un medio en el cual se reemplaza el HAT. con HT. Posteriormente los depósitos individuales pueden ser clasificados mediante ELISA para anticuerpos IgM y IgG monoclonales humanos. Una vez que ocurre el crecimiento de hibridoma extenso, se puede observar un medio normalmente después de 10 a 14 días. Los hibridomas de secreción de anticuerpo pueden ser otra vez plaqueados, clasificados nuevamente y si aún son positivos para IgG humano, los anticuerpos monoclonales pueden ser subclonados al menos dos veces mediante límite de dilución. Posteriormente los subclones totales pueden ser cultivados in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en un medio de cultivo de tejido para caracterización.

Para purificar los anticuerpos monoclonales humanos, se pueden crecer hibridomas seleccionados en frascos de giros de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes pueden ser filtrados y concentrados antes de la cromatografía por afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). El IgG puede ser revisado mediante electroforesis de gel y cromatografía líquida de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución amortiguadora puede ser intercambiada en PBS, y la concentración puede ser determinada mediante OD28o utilizando 1.43 de coeficiente de extinción. Los anticuerpos monoclonales pueden ser alicuotados y almacenados a una temperatura de -80° C.

Generación de Transfectomas que Producen Anticuerpos Monoclonales de la Presente Invención Los anticuerpos de la presente invención, también se pueden producir en un transfectoma de célula huésped (un tipo de hibridoma) utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de gen, como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, para expresar que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de los mismos, los ADNs que codifican cadenas pesadas y ligeras de longitud parcial o total, pueden ser obtenidos mediante técnicas de biología molecular estándar (por ejemplo amplificación PCR o clonación cADN utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADNs pueden ser insertados en vectores de expresión, de modo que los genes sean enlazados en forma operativa a secuencias de control de transcripción y traducción. Dentro de este contexto, el término "enlazado en forma operativa" pretende significar que el gen de anticuerpo está ligado en un vector, de modo que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector, sirvan su función proyectada para regular la transcripción y traducción de un gen de anticuerpo. La secuencia del vector de expresión y de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden ser insertados en un vector separado, o más normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión a través de métodos estándar (por ejemplo, ligadura de los sitios de restricción de complementariedad en el fragmento y vector de gen de anticuerpo, o mediante ligadura de extremo sin filo si no están presentes sitios de restricción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos se pueden utilizar para crear genes de anticuerpo de longitud total de cualquier isotipo de anticuerpo, insertándolos en vectores de expresión que ya codifican las regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado, de modo que el segmento VH sea enlazado en forma operativa al segmento(s) CH dentro del vector, y el segmento VK está enlazado en forma operativa al segmento CL dentro del vector. En forma adicional o alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpos de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo puede ser clonado en el vector, de modo que el péptido de señal sea enlazado en estructura al término amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (por ejemplo, un péptido de señal de una proteína sin inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la presente invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencias reguladoras" pretende incluir promotores, aumentadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo en la Publicación de Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Los expertos en la técnica podrán apreciar que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que será transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de célula huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tal como promotores y/o aumentadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de Simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío mayor de adenovirus (AdMLP) y polioma. Como alternativa, se pueden utilizar secuencias reguladoras no virales, tal como el promotor de ubiquitina o el promotor ß-globina. Aún además, los elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tal como el sistema promotor SR, que contiene secuencias del promotor temprano SV40 y la repetición terminal larga del virus de leucemia de célula T humana tipo 1 (Takebe, Y. y asociados (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la presente invención pueden llevar secuencias adicionales tal como secuencias que regulan la réplica del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de réplica) y genes marcadores seleccionados. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en las cuales el vector ha sido introducido (ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel y asociados). Por ejemplo, normalmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) (para utilizarse en células huésped in dhfr- con selección/amplificación de metotrexato) y el neogen (para selección G418).

Para expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el vector(s) de expresión que codifica las cadenas pesadas y ligeras se transfecta en una célula huésped mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección", están proyectadas para comprender una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación , precipitación de calcio-fosfato, transfeccion de dextrano-DEAE y similares. Aunque teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la presente invención en células huésped ya sea procarióticas o eucarióticas, la expresión de los anticuerpos en células eucarióticas, y más preferentemente células huésped de mamífero, es lo más preferido debido a que dichas células eucarióticas, y en particular las células de mamífero, es más probable que ensamble^ y secreten un anticuerpo inmunológicamente activo y doblado en forma adecuada, que las células procarióticas. La expresión procariótica de genes de anticuerpo ha sido reportada como inefectiva para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

Las células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la presente invención incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (que incluyen células dhfr-CHO, descritas en la Publicación de Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, tal como se describe en la Publicación de R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 759:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para utilizarse con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión de gen GS descrito en las Publicaciones de Patente WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican los genes de anticuerpo en las células huésped de mamífero, los anticuerpos son producidos cultivando las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped, o más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las células huésped se crecen. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína estándar.

Caracterización de Anticuerpo que Enlaza a un Dominio tipo Ig de una RTK Los anticuerpos de la presente invención pueden ser probados para enlazar el ectodominio, por ejemplo, un dominio tipo Ig de una RTK (o cualquier región elegida tal como las secuencias de consenso aquí descritas), por ejemplo, mediante ELISA estándar. En síntesis, las placas de microtitulación son recubiertas con un dominio tipo Ig purificado (o un dominio receptor preferido) en 0.25 µg /mi en PBS, y posteriormente se bloquean con albúmina de suero de bovino al 5% en PBS. Las diluciones del anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma de ratones inmunizados, por ejemplo, ratones inmunizados con el dominio D4 o D5 de Kit humana) se agregan a cada depósito y se incuban durante 1 a 2 horas a una temperatura de 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y posteriormente se incuban con un reactivo secundario (para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específ ico-Fc IgG de cabra-anti-humano) conjugado para fosfatasa alcalina durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Después del lavado, las placas son desarrolladas con substrato pNPP (1 mg/ml) y analizadas en OD de 405-650. Preferentemente, los ratones que desarrollen los tituladores más altos, serán utilizados para fusiones.

Un ensayo ELISA tal como se describe anteriormente, también puede ser utilizado para clasificar hibridomas que muestran reactividad positiva con inmunogen. Los hibridomas que enlazan con alta avidez, por ejemplo, a un dominio tipo Ig de una RTK, son subclonados y caracterizados en forma adicional. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células de origen (mediante ELISA), puede ser elegido para elaborar un 5 a 10 frascos de bancos de células almacenados a una temperatura de -140°C, y para purificación de anticuerpo.

Para purificar anticuerpos anti-RTK, se pueden crecer hibridomas seleccionados en frascos de rotación de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes pueden ser filtrados y concentrados antes de la cromatografía por afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se puede revisar el IgG eluido mediante electroforesis de gel y cromatografía líquida de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución amortiguadora puede ser intercambiada en PBS, y la concentración puede ser determinada mediante OD2eo utilizando un coeficiente de extinción 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden ser alicuotados y almacenados a una temperatura de -80°C. Para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionados se enlazan a epítopes únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado utilizando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL). Los estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales no etiquetados y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden llevarse a cabo utilizando placas ELISA recubiertas con RTK, recubiertas con un dominio tipo Ig de una RTK (por ejemplo, dominio Kit-D4, dominio Kit-D5 o un dominio D7 del receptor VEGF) tal como se describió anteriormente. El enlace de mAb biotinilado puede ser detectado con una sonda de fosfatasa alcalina de estreptavidina.

Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden llevar a cabo ELISAs de isotipo utilizando reactivo específicos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, se pueden recubrir depósitos de placas de microtitulación con 1 pg/ml de inmunoglobulina anti-humana durante la noche a una temperatura de 4°C. Después del bloqueo con 1% BSA, las placas se hacen reaccionar con 1 pg /mi o menos de anticuerpos monoclonal de prueba o controles de ¡sotipo purificados, a temperatura ambiente durante una a dos horas. Los depósitos posteriormente pueden hacerse reaccionar con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina ya sea específicas de I g G 1 humano o IgM humano. Las placas se desarrollan y analizan tal como se describió anteriormente.

Se pueden probar en forma adicional IgGs humanos anti-RTK para reactividad con un dominio tipo Ig de un RTK o una secuencia de consenso aquí presentada mediante manchado Western. En síntesis, un dominio tipo Ig de una RTK, tal como el dominio D4 o D5 de la Kit RTK o el dominio D7 de un receptor VEGF, se pueden preparar y someter a electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato dodecilo de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con 10% de suero de cabra fetal, y se sondean con los anticuerpos monoclonales que serán probados. El enlace IgG humano puede ser detectado utilizando fosfatasa alcalina IgG anti-humana y desarrollarse con tabletas de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Se puede emplear mapeo de epítope para determinar el sitio de enlace de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo de la presente invención. Están disponibles diversos método que permiten mapear en forma adicional los epítopes de conformación. Por ejemplo, los métodos descritos en la Publicación de Timmerman y asociados (Mol Divers. 2004;8(2):61-77) pueden ser utilizados. Timmerman y asociados. Tuvieron la capacidad de mapear en forma exitosa epítopes discontinuos/de conformación utilizando dos técnicas novedosas, Domain Sean y Matrix Sean. Las técnicas descritas en la Publicación de Ansong y asociados (J Thromb Haemost. 2006. 4(4):842-7) también pueden ser utilizadas. Ansong y asociados utilizó espectrometría de masa dirigida por afinidad para mapear el epítope discontinuo reconocido por el anticuerpo R8B12. Además, se pueden utilizar técnicas de generación de imagen tal como Protein Tomography para visualizar el enlace de anticuerpo o péptido a las RTKs objetivo. Se ha utilizado previamente tomografía de proteína para ganar visión dentro de las interacciones moleculares, y se utilizó para mostrar que un anticuerpo de inhibición actúa mediante el enlace del dominio III de EGFR, asegurando de esta forma EGFR en una conformación inflexible e inactiva (Lammerts y asociados. Proc Nati Acad Sci U S A. 2008.105(16):6109-14). Los métodos más tradicionales tales como mutagénesis dirigida al sitio también pueden ser aplicados para mapear epítopes discontinuos. Las regiones de aminoácido consideradas que participan en un epítope discontinuo, pueden ser mutadas en forma selectiva y ensayadas para enlazar a un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo de la presente invención. La incapacidad que tiene el anticuerpo de enlazar cuando cualquier región es mutada, puede indicar que el enlace depende de ambos segmentos de aminoácido. Tal como se observó anteriormente, algunos epítopes lineales están caracterizados por estructuras tridimensionales particulares que deben estar presentes con el objeto de enlazar una porción de la presente invención. Dichos epítopes pueden ser descubiertos ensayando el enlace del anticuerpo (u otra porción) cuando la RTK está en su estado doblado o nativo, y nuevamente cuando la RTK está desnaturalizada. Una observación de que el enlace ocurre únicamente en el estado doblado, puede indicar que el epítope es ya sea un epítope linear caracterizado por una estructura doblada particular, o un epítope discontinuo presente únicamente en la proteína doblada.

Además de los ensayos de actividad aquí descritos, se puede utilizar Tomografía de Proteína para determinar si un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo de la presente invención tiene la capacidad de enlazar y desactivar una cinasa de tirosina receptora. La visualización de la interacción de enlace puede indicar que el enlace del anticuerpo puede afectar la colocación de los dos ectodominios en la ¡nterfase de superficie celular, o alterar o prevenir los cambios en conformación en la cinasa de tirosina receptora.

II. Moléculas Pequeñas Que Enlazan a un Dominio Tipo Iq o una Región de Articulación de una Cinasa de Tirosina Receptora Humana En otro aspecto de la presente invención, la porción que enlaza al ectodominio, por ejemplo, un dominio tipo Ig o una región de articulación, de una cinasa de tirosina receptora humana es una molécula pequeña.

Las moléculas pequeñas de la presente invención están caracterizadas por características o propiedades funcionales particulares. Por ejemplo, las moléculas pequeñas enlazan a un dominio tipo Ig de una RTK, por ejemplo, El dominio D4 o D5 de Kit RTK o el dominio D7 de un receptor VEGF, o una región de articulación de RTK, por ejemplo, las regiones de articulación D3-D4 o D4-D5 de la Kit RTK. En modalidades preferidas, el enlace de los inhibidores de molécula pequeña a las regiones de articulación D3-D4 o D4-D5 evitarán el movimiento que permite que la membrana próxima a los dominios D4 y D5, esté a una distancia y orientación (posición) que permita la trans-autofosforilación y activación del dominio de cinasa de tirosina, seguido del reclutamiento y activación de las trayectorias de señalización de corriente descendente. El enlace de molécula pequeña, en algunas modalidades puede permitir que el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora dimerice, pero afecte la posición, orientación y/o distancia entre los dominios tipo Ig de los dos monómeros (por ejemplo, los dominios D4-D4 o D-D5 de la cinasa de tirosina receptora tipo III o los dominios D7-D7 de una cinasa de tirosina receptora tipo V, para inhibir de esta forma la actividad de la cinasa de tirosina receptora). En otras palabras, la porción o molécula pequeña puede permitir la dimerización inducida por ligando de los ectodominios de cinasa de tirosina receptora, pero afectar la colocación de los dos ectodominios en la interfase de la superficie celular, para inhibir de esta forma la actividad de la cinasa de tirosina receptora (por ejemplo, inhibir la internalización de receptor y/o inhibir la autof osforilación de tirosina del receptor y/o inhibir la capacidad que tiene el receptor de activar una trayectoria de señalización de corriente descendente). Los términos "compuestos de molécula pequeña", "fármacos de molécula pequeña", "moléculas pequeñas" o "inhibidores de molécula pequeña" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para referirse a los compuestos de la presente invención clasificados por un efecto en las RTKs, y su capacidad de inhibir la dimerización o activación de la RTK, por ejemplo, la Kit RTKs o un receptor VEGF. Estos compuestos pueden comprender los compuestos que se encuentran en la base de datos PubChem (pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), la Base de Datos de Red Central de Clasificación de Bibliotecas Moleculares (MLSCN), los compuestos en bases de datos relacionadas o derivados y/o análogos funcionales de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "análogo" o "análogo funcional" se refiere a un compuesto químico o inhibidor de molécula pequeña que es estructuralmente similar a un compuesto de origen, pero difiere ligeramente en la composición (por ejemplo uno o más átomos o grupos funcionales se agregan, eliminan o modifican). El análogo puede o no tener diferentes propiedades químicas o físicas al compuesto original, y puede o no tener actividad biológica y/o química mejorada. Por ejemplo, el análogo puede ser más hidrofóbico, o puede tener actividad alterada (por ejemplo, incrementada, disminuida o idéntica al compuesto de origen) en comparación con el compuesto de origen. El análogo puede ser una variante que ocurre naturalmente o que no ocurre naturalmente (por ejemplo, recombinante) del compuesto original. Otros tipos de análogos incluyen isómeros (enantiómeros, diastereómeros, y similares) y otros tipos de variantes quirálicas de un compuesto, así como isómeros estructurales. El análogo puede ser una variante ramificada o cíclica de un compuesto lineal. Por ejemplo, un compuesto lineal puede tener un análogo que está ramificado o sustituido de otra forma para impartir ciertas propiedades deseables (por ejemplo, mejorar la hidrofilicidad o biodisponibilidad).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "derivado" se refiere a una versión química o biológicamente modificada de un compuesto químico o inhibidor de molécula pequeña, que es estructuralmente similar a un compuesto de origen (real o teóricamente) se puede derivar de dicho compuesto de origen. Un "derivado" difiere de un "análogo" o "análogo funcional" en cuanto a que el compuesto de origen puede ser el material de partida para generar un "derivado", mientras que el compuesto de origen no es utilizado necesariamente como el material de partida para generar un "análogo" o "análogo funcional". Un derivado puede o no tener diferentes propiedades químicas o físicas del compuesto de origen. Por ejemplo, el derivado puede ser más hidrofílico o puede tener reactividad alterada en comparación con el compuesto de origen. La derivación (por ejemplo, modificación mediante medios químicos u otros medios) puede implicar la sustitución de una o más porciones dentro de la molécula (por ejemplo, un cambio en el grupo funcional). Por ejemplo, se puede sustituir un hidrógeno con un halógeno, tal como fluoro o cloro, o un grupo hidroxilo (--OH) puede ser remplazado con una porción de ácido carboxílico (--COOH). El término "derivado" también incluye conjugados y profármacos de un compuesto de origen (por ejemplo, derivados químicamente modificados que pueden ser convertidos al compuesto original bajo condiciones fisiológicas). Por ejemplo, el profármaco puede ser una forma inactiva de un agente activo. Bajo condiciones fisiológicas, el profármaco puede ser convertido en la forma activa del compuesto. Los profármacos pueden ser formados, por ejemplo, reemplazando uno o dos átomos de hidrógeno o átomos de nitrógeno por un grupo acilo (profármacos de acilo) o un grupo carbamato (profármacos de carbamato). Se puede encontrar información más detallada relacionada a los profármacos, por ejemplo, en las Publicaciones de Fleisher y asociados, Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115; Design of Prodrugs, H. Bundgaard (ed.), Elsevier, 1985; y H. Bundgaard, Drugs of the Future 16 (1991) 443. El término "derivado" también se utiliza para describir todos los solvatos, por ejemplo hidratos o aductos (por ejemplo aductos con alcoholes), metabolitos activos y sales del compuesto de origen. El tipo de sal que puede ser preparada depende de la naturaleza de las porciones dentro del compuesto. Por ejemplo, los grupos ácidos tales como grupos de ácido carboxilico pueden formar sales de metal álcali o sales de metal de tierra alcalina (por ejemplo sales de sodio, sales de potasio, sales de magnesio, sales de calcio, y sales con iones de amonio cuaternarios fisiológicamente tolerables y sales de adición de ácido con amonio y aminas orgánicas fisiológicamente tolerables tales como trietilamina, etanolamina, o tris-(2-hidroxietil)amina). Los grupos básicos pueden formar sales de adición de ácido, por ejemplo con ácidos inorgánicos tales como ácido hidroclórico ("HCI"), ácido sulfúrico, o ácido fosfórico, o con ácidos carboxílicos orgánicos y ácidos sulfónicos tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido metanosulfónico o ácido p-toluenosulfónico. Los compuestos que contienen en forma simultánea un grupo base y un grupo ácido, tal como un grupo carboxilo, además de los átomos de nitrógeno base, pueden presentarse como zwiteriones. Las sales pueden ser obtenidas a través de métodos acostumbrados conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo combinando un compuesto con un ácido o base orgánica o inorgánica en un solvente o diluyente o de otras sales mediante intercambio de cationes o intercambio de aniones.

Las moléculas pequeñas son conocidas por tener pesos moleculares de 1200 o menos, 1000 o menos, 900 o menos, 800 o menos, 700 o menos, 600 o menos, 500 o menos, 400 o menos, 300 o menos, 200 o menos, 100 o menos, 50 o menos, 25 o menos, o 10 o menos.

Los inhibidores de molécula pequeña de la presente invención se seleccionan o diseñan para enlazar al ectodominio, por ejemplo, un dominio tipo Ig o una región de articulación de una RTK. En algunas modalidades, los inhibidores de molécula pequeña se seleccionan o diseñan para enlazar a un dominio tipo Ig o una región de articulación de Kit humana, un receptor VEGF humano o PDGFR, por ejemplo, el dominio D4 o D5, o las regiones de articulación D3-D4 y/o D4-D5 del receptor Kit humano, para antagonizar de esta forma la capacidad que tiene el receptor de dimerizarse y volverse activo, por ejemplo, autofosforilar y activar una trayectoria de transducción de señal intracelular. En otras modalidades, los inhibidores de molécula pequeña se seleccionan para enlazar a dominios que comparten homología con un dominio del receptor Kit o receptor VEGF. Por ejemplo, una molécula pequeña de la presente invención puede dirigirse hacia un dominio el cual es al menos el 50% idéntico, al menos el 60% idéntico, al menos el 70% idéntico, al menos el 80% idéntico, al menos el 90% idéntico, o al menos el 95% o 99% idéntico a un dominio tipo Ig de una RTK, por ejemplo, el dominio D4 o D5 de Kit o el dominio D7 de un receptor VEGF; o una región de articulación de una RTK, por ejemplo, las regiones de articulación D3-D4 o D4-D5 del receptor Kit o PDGFR. Dicha molécula pequeña puede tener la capacidad de enlazar dominios de proteína, posiblemente en receptores Kit, VEGFs y otras RTKs, que son funcionalmente similares a, por ejemplo, los dominios D4, D5 o dominio D7 o las regiones de articulación D3-D4 y/o D4-D5 del receptor Kit o PDGF.

Los inhibidores de molécula pequeña de la presente invención también pueden enlazar a un motivo particular o secuencia de consenso derivada de un dominio tipo Ig o una región de articulación de una RTK, por ejemplo, un receptor VEGF humano o una RTK humana tipo III, permitiendo que los inhibidores de molécula pequeña enlacen en forma específica dominios que son compartidos entre los miembros de la familia RTK, por ejemplo, miembros de la familia de RTKs humanas tipo En una modalidad específica, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a la siguiente secuencia de consenso para el sitio de interacción D4: LXT RX2X3X4X5X6 7G, en donde L es Leucina, R es Arginina, G es Glicina; y ?-?, X2, X3, X4, X5. Xe y X7 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, X^ se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Isoleucina, Valina, Prolina, Asparagina o Lisina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Leucina, Valina, Alanina y Metionina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Histidina, Asparagina y Arginina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Valina, Alanina, Ácido Glutámico, Prolina y Metionina; X5 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Serina, Ácido Glutámico, Alanina, Glutamina y Ácido Aspártico; X6 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Ácido Aspártico y Glutamina; y X7 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Serina, Alanina, Lisina, Arginina, Glutamina y Treonina.

En otra modalidad, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a la siguiente secuencia de consenso para el dominio D7 de un miembro de la familia de receptor VEGF: IX, RVX2X3EDX4G en donde es I es Isoleucina, R es Arginina, E es Ácido Glutámico, D es Ácido Aspártico, G es Glicina; y Xi, X2, X3 y X son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, X se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Arginina y Glutamina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Lisina; y X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Alanina (SEC ID NO: 1).

En otra modalidad, una porción de la presente invención (por ejemplo, una molécula pequeña) enlaza a la siguiente de consenso para el dominio D7 de un receptor VEGF: L/l XiR DX2X3X4 D/E X5 G (SEC ID NO: 158), en donde L es Leucina, I es Isoleucina, R es Arginina, F es un aminoácido hidrofóbico, D es Ácido Aspártico, E es Ácido Glutámico, G es Glicina; y ?? , X2, X3, X4 y X5 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, F es Valina; 1 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Glutamina, Ácido Glutámico y Ácido Aspártico; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Usina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Ácido Glutámico, Glutamina y Valina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Valina; y X5 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Glicina, Serina y Glutamina.

En otras modalidades, los inhibidores de molécula pequeña enlazan secuencias de motivo o consenso de proteína que representan la estructura tridimensional de la proteína. Dichas secuencias de motivo o consenso pueden no representar una cadena contigua de aminoácidos, sino una distribución de aminoácidos no lineales que resulta del doblez tridimensional de la RTK (es decir, un motivo estructural). Un ejemplo de dicho motivo puede ser un motivo diseñado con base en las regiones de articulación D3-D4 y/o D4-D5 del receptor Kit. Dichas secuencias de motivo y consenso pueden ser diseñadas de acuerdo con los métodos descritos en la Sección I que se refiere a anticuerpos.

De manera importante, un inhibidor de molécula pequeña de la presente invención no enlaza al sitio de enlace de ligando de la RTK, por ejemplo, el sitio de enlace SCF del receptor Kit. En otras palabras, el inhibidor de molécula pequeña no enlaza a los dominios tipo Ig de una RTK responsable del enlace del ligando.

En otra modalidad, el inhibidor de molécula pequeña de la presente invención enlaza a un epítope contiguo en el receptor VEGF. En una modalidad, el epítope contiguo está compuesto de dos o más residuos en el dominio D7 del receptor VEGF. En otra modalidad, el epítope contiguo es un epítope seleccionado del grupo que consiste en 672VAISSS677 de VEGFR1, 678TTLDC H A684 de VEGFR 1, 685NGVPEPQ691 de VEGFR1, 700KIQQEPG706 de VEGFR1, 707IILG710 de VEGFR1, 711PGS713 de VEGFR1, 714STLFI718 de VEGFR1 , 719ERVTEEDEG V728 de VEGFR 1, 689VNVSDS694 de VEGFR3, 695LE QCLV701 de VEGFR3, 702AGAH APS708 de VEGFR3, 717LLEEKSG723 de VEGFR3, 7 VDLA727 de VEGFR3, 728DSN730 de VEGFR3, 73 QKLSI735 de VEGFR3 y 736QRVREEDAGR745 de VEGFR3, 678TSIGES683 de VEGFR2, 684l E VSCTA690 de VEGFR2, 691SGNPPPQ697 de VEGFR2, 706TLVEDSG712 de VEGFR2, 7 3PLK716 de VEGFR2, 717DGN719 de VEGFR2, 720RNLTI724 de VEGFR2 y 725RRVRKEDEGL734 de VEGFR2.

En modalidades adicionales, los inhibidores de molécula pequeña de la presente invención se seleccionan o diseñan para enlazar específicamente a un ectodominio mutante, por ejemplo, un dominio tipo Ig mutante o una región de articulación mutante de una RTK. En modalidades preferidas, la RTK mutante es un mutante tumorigénico u oncogénico. En una modalidad específica, el inhibidor de molécula pequeña se selecciona o diseña para enlazar a un mutante de receptor Kit oncogénico. Los mutantes de receptor Kit que pueden ser dirigidos por las moléculas pequeñas de la presente invención, son receptores Kit con mutaciones en uno o más de los siguientes aminoácidos: Thr417, Tyr418, Asp419, Leu421, Arg420, Tyr503 o Ala502. Los expertos en la técnica deberán apreciar, que los métodos de la presente invención pueden ser aplicables a otras mutaciones en Kit o a mutaciones en otras RTKs. Una ventaja de dirigir una RTK mutante, es que la molécula pequeña terapéutica puede enlazar únicamente las RTKs en las células que contienen la mutación, dejando células saludables sin ser afectadas en gran parte o totalmente. Por consiguiente, en casos en donde la mutación es tumorigénica, únicamente las células de tumor pueden ser dirigidas para terapia, reduciendo potencialmente los efectos secundarios y requerimientos de dosificación.

En algunas modalidades, la molécula pequeña enlaza a secuencias específicas del receptor Kit humano, por ejemplo, los residuos 309-413, residuos 410-519, 381Arg y 386Glu, o 18Tyr y 505Asn del receptor Kit humano. En algunas modalidades, la molécula pequeña enlaza a secuencias específicas de un receptor VEGF humano, por ejemplo, los residuos 718-727 de VEGFR1, Arg720 y Asp725 de VEGFR1, residuos 724-733 de VEGFR2, Arg726 y Asp731 de VEGFR2, residuos 735-744 de VEGFR3, o residuos Arg737 y Asp742 de VEGFR3.

En una modalidad preferida, una molécula pequeña de la presente invención puede enlazar a uno o más residuos en el receptor Kit, que elabora las cavidades o bolsillos pequeños descritos en la tabla 4 (más adelante). Por ejemplo, una molécula pequeña de la presente invención puede enlazar a uno o más de los siguientes residuos en la región de articulación D3-D4 del receptor Kit: K218, S220, Y221, L222 del dominio D3 y F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, 1371, Y373 del dominio D4. Una molécula pequeña de la presente invención también puede enlazar a uno o más de los siguientes residuos que elaboran una superficie cóncava en el dominio D4 del receptor Kit: Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390. En otra modalidad, una molécula pequeña de la presente invención puede enlazar a uno o más de los siguientes residuos, que forman un bolsillo en la región de articulación D2-D3 del receptor Kit:Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 y F208 del dominio D2 y V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269 del dominio D3.

Por lo tanto, en algunas modalidades, una molécula pequeña de la presente invención puede enlazar a residuos de aminoácido contiguos o no contiguos y funcionar como una cuña molecular que evita el movimiento requerido para la colocación de la región próxima de la membrana de la RTK a una distancia u orientación que permite la activación de cinasa de tirosina. Una molécula pequeña de la presente invención, también puede actuar para prevenir las interacciones homotípicas del receptor D4 o D5, o desestabilizar el sitio de interacción del ligando-receptor. En algunas modalidades preferidas, una molécula pequeña de la presente invención puede enlazar a uno o más de los siguientes residuos en el receptor Kit: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, 1371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431 o G432. Un experto en la técnica apreciará que, en algunas modalidades, una molécula pequeña de la presente invención puede ser dirigida fácilmente a los residuos correspondientes en otras RTKs tipo III, por ejemplo, los residuos que forman bolsillos o cavidades similares, o los que están en la misma posición mediante alineación estructural o alineación de secuencia.

En una modalidad específica, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a un epítope de conformación o un epítope discontinuo en una RTK tipo III o una RTK tipo V. El epítope de conformación o discontinuo puede estar compuesto de dos o más residuos del dominio D3, D4 o D5 o de las regiones de articulación D4-D5 o D3-D4 de una RTK tipo III, por ejemplo, el receptor Kit humano o el receptor PDGF, o dos o más residuos del dominio D7 de un receptor VEGF. Por ejemplo, el epítope de conformación o discontinuo puede estar compuesto de dos o más de los residuos descritos en la tabla que se encuentra más adelante. En una modalidad particular, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206. V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269. En modalidades similares, una molécula pequeña de la presente invención puede enlazar a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados de uno de los siguientes grupos de aminoácidos: P206, F208, V238, y S239; K127, A207, F208, y T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370, 1371 y Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, y 1371; R224, V308, K310, G311, F340, P341 , y D398; ?218, ?219, S220, ?367, ?368, y S369; K218, A220, E368, y S369; G384, T385, T411, K412, E414, y K471; Y408, F433, G470, K471, y L472; F324, V325, N326, y N410;D327, N410, T411, K412, y V497; G384, G387, V409, y K471; L382, G387, V407, y V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269; P206, F208, V238, y S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, 1371 y Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470 y K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432 y K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390; Y350, R353 y F355. Tal como se indicó anteriormente, las moléculas pequeñas de la invención pueden enlazar a todos los residuos de aminoácido que forman un bolsillo o cavidad identificada en la tabla 4, o pueden enlazar un subconjunto de los residuos que forman el bolsillo o la cavidad. Quedará entendido que, en ciertas modalidades, cuando se hace referencia a una molécula pequeña de la presente invención, el enlace a un epítope, por ejemplo, un epítope de conformación, la intención es que la molécula pequeña enlace únicamente a los residuos específicos que elaboran el epítope (por ejemplo, el bolsillo o cavidad identificada en la tabla 4) y no a otros residuos en la secuencia de aminoácido lineal del receptor.

En una modalidad adicional, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a un epítope de conformación, en donde el epítope de conformación está compuesto de dos o más residuos de aminoácido seleccionados de los péptidos descritos en la tabla 5. En una modalidad específica, el epítope de conformación está compuesto de uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un primer péptido y uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un segundo péptido, en donde el primero y segundo péptidos se seleccionan del grupo de péptidos descritos en la tabla 5. Por lo tanto, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a epítope de conformación, en donde el primero y segundo grupos de péptidos son como se indica a continuación: Ala219-Leu222 y Thr304-Val308; Asp309-Gly311 y Arg224-Gly226; Thr303-Glu306 y Ala219-Leu 222 ; Asn367-Asn370 y Ser217-Tyr221 ; Ala339-Pro343 y Asn396-Val399; Ala339-Pro343 y Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 y Val374-His378; Asp357-Glu360 y Leu377-Thr380; Met351 -Glu360 y His378-Thr389; His378-Thr389 y Val323-Asp332; Val409-lle415 y Ala493-Thr500; Val409-lle415 y Ala431 -Thr437; Val409-Ee415 y Phe469-Val473; Val409-lle415 y Val325-Asn330¡ Val409-lle415 y Arg381-Gly387; Gly466-Leu472 y Gly384-Gly388; Val325-Glu329 y Tyr494-Lys499; Thr411 -Ieu416 y Val497-Ala502; Ile415-Leu421 y Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 y Lys484-Thr488; y Ala502-Ala507 y Gly445-Cys450. Las moléculas pequeñas de la presente invención pueden enlazar a todos los residuos de aminoácido que forman el primero y segundo grupos de péptido anteriores, pueden enlazar un subconjunto de residuos que forman el primero y segundo grupos de péptido. Quedará entendido que, en ciertas modalidades, cuando se hace referencia a una molécula pequeña de la presente invención, el enlace a un epítope, por ejemplo un epítope de conformación, la intención es que la molécula pequeña enlace únicamente a los residuos específicos que elaboran el epítope (por ejemplo, los péptidos específicos identificados en la tabla 5), y no otros residuos en la secuencia de aminoácido lineal del receptor.

En otra modalidad, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a un epítope de conformación o discontinuo compuesto de dos o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en E33, P34, D72, E76, N77, K78, Q79, K158, D159, N250, S251, Q252, T253, K254, L255, N260, W262, H264, G265, E344, N352, R353, F355, T356, D357, Y362, S365, E366, N367, N370 y G466.

En otra modalidad, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a residuos de aminoácido 385Arg y 390Glu de PDGFR humano, o a los residuos correspondientes en PDGFRa. Los residuos 385Arg y 390Glu de PDGFR humano son análogos a los residuos 381Arg y 386Glu del receptor Kit, y transmiten interacciones D4-D4 homotípicas de PDGFR3. Las moléculas pequeñas de la presente invención pueden ejercer su efecto inhibidor en la activación de receptor, previniendo las interacciones homotípicas críticas (tal como puentes de sal formados entre 385Arg y 390Glu de PDGFRp humano) entre regiones próximas de membrana de las RTKs tipo III que son esenciales para colocar el dominio citoplásmico a una distancia y orientación esencial para la activación de cinasa de tirosina. Los experimentos aquí descritos demuestran que las interacciones D4-D4 homotípicas son indispensables para la dimerización PDGFR3, y que la dimerización PDGFR es necesaria pero no suficiente para la activación de receptor. Por lo tanto, las moléculas pequeñas de la presente invención pueden permitir la dimerización de PDGFR previniendo al mismo tiempo la activación. La alineación de secuencia basada en la estructura que muestra que se conservan el tamaño del lazo EF, y los aminoácidos críticos que comprenden la interfase D4-D4 en Kit, PDGFRa, PDGFR y CSF1R. Por lo tanto en algunas modalidades, las moléculas pequeñas de la presente invención pueden ser dirigidas a las regiones conservadas de los dominios D4 o D5 de las RTKs tipo III.

En modalidades preferidas, una molécula pequeña de la presente invención enlaza a un dominio tipo Ig o región de articulación de Kit (por ejemplo, las regiones de articulación D3-D4 y/o D4-D5 o el sitio de enlace de interfase D4-D5 y/o D5-D5 del receptor Kit) con alta afinidad, por ejemplo, con una afinidad de una KD de 1 X 10~7 M o menos, una KD de 5 X 10"8 o menos, una KD de 1 x 10"8 M o menos, una KD de 5 x 10"9 M o menos, o una KD entre 1 x 10"8 M y 1 x 10"10 M o menos.

Los inhibidores de molécula pequeña de la presente invención, pueden elaborarse o seleccionarse a través de diversos métodos conocidos en la técnica. Los procedimientos de clasificación pueden ser utilizados para identificar moléculas pequeñas de bibliotecas que enlazan a los dominios tipo Ig deseados o regiones de articulación de una RTK, por ejemplo, el dominio D4 o D5 de la Kit RTK humana. Un método, Chemetics® (Nuevolutions), utiliza etiquetas de ADN para cada molécula en la biblioteca, para facilitar la selección. El sistema Chemetics® permite la clasificación de millones de compuestos para el enlace objetivo. Las Patentes relacionadas con las bibliotecas de molécula pequeña y la clasificación a base de etiqueta, son las Solicitudes de Patente Norteamericana Nos. 20070026397; 20060292603; 20060269920; 20060246450; 20060234231; 20060099592; 20040049008; 20030143561 las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Otros métodos bien conocidos que pueden ser utilizados para identificar moléculas pequeñas procedentes de las bibliotecas que enlazan a los dominios tipo Ig deseados o regiones de articulación de una RTK, por ejemplo, el dominio D4 o D5 de la Kit RTK o el dominio D7 de un receptor VEFG, incluyen métodos que utilizan bibliotecas en las cuales los miembros de la biblioteca son etiquetados con una etiqueta de identificación, esto es, cada etiqueta presente en la biblioteca está asociada con una estructura de compuesto separada presente en la biblioteca, de modo que la identificación de la etiqueta, indica la estructura de la molécula etiquetada. Un método de bibliotecas etiquetadas utiliza etiquetas de oligonucleótido, tal como se describe, por ejemplo en la Publicación PCT No. WO 2005/058479 A2 (la tecnología Direct Select™) y en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,573,905; 5,708,153; 5,723,598, 6,060,596, las Solicitudes PCT publicadas WO 93/06121; WO 93/20242; WO 94/13623; WO 00/23458; WO 02/074929 y WO 02/103008, y en las Publicaciones de Brenner y Lerner (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 5381-5383 (1992); Nielsen y Janda {Methods: A Companion to Methods in Enzymology 6, 361-371 (1994); y Nielsen, Brenner y Janda (J. Am. Chem. Soc. 115, 9812-9813 (1993)), cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia. Dichas etiquetas pueden ser amplificadas, utilizando por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa, para producir muchas copias de la etiqueta e identificar la etiqueta mediante secuenciación. La secuencia de la etiqueta posteriormente identifica la estructura de la molécula de enlace, que puede ser sintetizada en forma pura y ser probada con respecto a su actividad.

La preparación y clasificación de las bibliotecas químicas de combinación es bien conocidas para los expertos en la técnica. Dichas bibliotecas químicas de combinación, que se pueden utilizar para identificar porciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a bibliotecas de péptido (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,010,175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487 493 (1991) y Houghton y asociados, Nature 354:84 88 (1991)). Otras químicas para generar bibliotecas de diversidad química son bien conocidas en la técnica y pueden ser utilizadas. Dichas químicas incluyen, pero no se limita a: peptoides (por ejemplo, Publicación PCT No. WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, Publicación PCT WO 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (por ejemplo, Publicación PCT No. WO 92/00091), benzodiazepinas (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,288,514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y asociados, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909 6913 (1993)), polipéptidos vinilogosos (Hagihara y asociados, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptidales con andamio de glucosa (Hirschmann y asociados, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217 9218 (1992)), síntesis orgánica análoga de bibliotecas de compuesto pequeño (Chen y asociados, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho y asociados, Science 261: 1303 (1993)), y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell y asociados, J. Org. Chem. 59:658 (1994)), bibliotecas de ácido nucleico (ver la Publicación de Ausubel, Berger y Russell & Sambrook, todos supra), bibliotecas de ácido nucleico de péptido (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,539,083), bibliotecas de carbohidrato (ver por ejemplo, Liang y asociados, Science, 274: 1520 1522 (1996) y la Patente Norteamericana No. 5,593,853), bibliotecas de molécula orgánica pequeña (ver, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, Enero 18, página 33 (1993); isoprenoides, Patente Norteamericana No. 5,569,588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente Norteamericana No. 5,549,974; pirrolidinas, Patente Norteamericana Nos. 5,525,735 y 5,519,134; compuestos morfolino, Patente Norteamericana No. 5,506,337; benzodiazepinas, 5,288,514, y similares). Cada una de las Publicaciones anteriores está incorporada a la presente invención como referencia. Las bases de datos públicas también están disponibles y son utilizadas comúnmente para clasificación de molécula pequeña, por ejemplo, PubChem (pubchem.ncbi.nlm.nih.gov), Zinc (Irwin y Shoichet (2005) J. Chem. Inf. Model. 45(1): 177-82) y ChemBank (Seiler y asociados (2008) Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D351-D359).

Los dispositivos para la preparación de bibliotecas de combinación están comercialmente disponibles (ver por ejemplo las Publicaciones de 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky, Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). Además, numerosas bibliotecas de combinación están por sí mismas comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, Mo., 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, Md., etc.). Además, Las metodologías de clasificación están bien definidas, y es común contratar firmas de especialistas para identificar los compuestos particulares para un objetivo de interés (por ejemplo, BioFocus DPI (biofocus.com) y Quantum Lead (q-lead.com)).

Otros métodos para seleccionar moléculas pequeñas que son bien conocidas en la técnica, y pueden aplicarse a los métodos de la presente invención, son los de Huang y Stuart L. Schreiber (1997) Proc Nati Acad Sci U S A. 94(25): 13396-13401; Hung y asociados (2005) Science 310:670-674; Zhang y asociados (2007) Proc Nati Acad Sci 104: 4606-4611; o cualesquiera de los métodos revisados en la Publicación de Gordon (2007) ACS Chem. Biol. 2:9-16, las cuales todas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia .

Además de los métodos de clasificación experimentales, las moléculas pequeñas de la presente invención pueden seleccionarse utilizando métodos de clasificación virtual. Las tecnologías de clasificación virtual anticipan que moléculas de una biblioteca enlazarán a una proteína, o un epítope específico en la misma, utilizando análisis estadístico y simulaciones de docking de proteína. Más comúnmente, los métodos de clasificación virtual comparan la estructura tridimensional de una proteína con las de moléculas pequeñas en una biblioteca. Se utilizan diferentes estrategias para modelar interacciones de proteína-molécula, aunque es común emplear algoritmos que simulan energías de enlace entre átomos, incluyendo enlaces de hidrógeno, fuerzas electrostáticas e interacciones de van-der walls. Normalmente, los métodos de clasificación virtual pueden explorar bibliotecas de más de un millón de compuestos, y regresar una lista corta de moléculas pequeñas, que es probable que sean enlazadores fuertes. Están disponibles diversas revisiones de los métodos de clasificación virtual, que detallan las técnicas que pueden ser utilizadas para identificar moléculas pequeñas de la presente invención (Engel y asociados (2008) J. Am. Chem. Soc, 130 (15), 5115-5123; Mclnnes. (2007). Curr Opin Chem Biol. Oct; 11 (5):494-502; Reddy y asociados (2007) Curr Protein Pept Sci. Aug; 8(4):329-51; Muegge y Oloff. (2006) Drug Discovery Today. 3(4): 405-411; Kitchen y asociados (2004) Nature Reviews Drug Discovery 3, 935-949). Los ejemplos adicionales de clasificación de molécula pequeña pueden encontrarse en la Publicación de Patente U.S. 2005/0124678, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

Las moléculas pequeñas de la presente invención pueden contener una de las estructuras de andamio ilustradas en la tabla que se encuentra a continuación. Las referencias mencionadas en la tabla, están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Los grupos R1t R2, R3 y R4 están limitados únicamente en cuanto a que no deben interferir con, o inhibir en forma significativa la reacción indicada, y pueden incluir hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo sustituido, arilo, a r i I o sustituido, arilalquilo, heteroarilalquilo, a r i I a I q u i I o sustituido, heteroarilalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, halógeno, alcoxi, ariloxi, amino, amino sustituido y otros conocidos en la técnica. Los sustituyentes adecuados incluyen, pero no se limitan a alquilo, alcoxi, tioalcoxi, nitro, hidroxilo, sulfhidrilo, ariloxi, aril-S-, halógeno, carboxi, amino, alquilamino, dialquilamino, arilamino, ciano, cianato, nitrilo, isocianato, tiocianato, carbamilo y carbamilo sustituido.

Tabla 6 Scaffolds Amina Aldehido / Ácido Otros Referencia I Cetona Carboxílico -4968 25 Micheli, 67:5673 -5677; Park, K.-H., y asoc. (2001) J Comb Chem 3:171- 176 Brown, III. Moléculas Peptídicas Que Enlazan A Un Dominio Tipo Ig de Una Cinasa de Tirosina Receptora Humana En otro aspecto de la presente invención, la porción que enlaza al ectodominio, por ejemplo, un dominio tipo Ig o una región de articulación, de una cinasa de tirosina receptora humana es una molécula peptídica.

Las moléculas peptídicas pueden ser diseñadas con base en un dominio tipo Ig de RTK o una secuencia de consenso derivada de dicho dominio.

En una modalidad específica, las moléculas peptídicas enlazan a la siguiente secuencia de consenso para el sitio de interacción D4: LX RX2X3X4X5X6X7G en donde L es Leucina, R es Arginina, G es Glicina; y ?,, X2, X3, X4, X5, Xs Y X7 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, X1 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Isoleucina, Valina, Prolina, Asparagina, o Usina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Leucina, Valina, Alanina, y Metionina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Histidina, Asparagina, y Arginina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Valina, Alanina, Ácido Glutámico, Prolina, y Metionina; X5 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Serina, Ácido Glutámico, Alanina, Glutamina, y ácido Aspártico; X6 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, ácido Aspártico, y Glutamina; y X7 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Serina, Alanina, Lisina, Arginina, Glutamina, y Treonina.

Por lo tanto, en una modalidad, las moléculas peptídicas de la presente invención, comprenden o consisten en una secuencia que corresponde con la secuencia de consenso antes mencionada (LX! RX2X3X4X5X6X7G) en donde L es Leucina, R es Arginina, G es Glicina; y ?1 X2, X3, X4, X5, X6 Y X7 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, X1 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Isoleucina, Valina, Prolina, Asparagina, o Lisina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Leucina, Valina, Alanina, y Metionina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Histidina, Asparagina, y Arginina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Valina, Alanina, Ácido Glutámico, Prolina, y Metionina; X5 se selecciona del grupo que consiste en Treonina, Serina, Ácido Glutámico, Alanina, Glutamina, y ácido Aspártico; X6 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, ácido Aspártico, y Glutamina; y X7 se selecciona del grupo que consiste en Glicina, Serina, Alanina, Lisina, Arginina, Glutamina, y Treonina. En otra modalidad, las moléculas peptídicas de la presente invención comprenden o consisten en una secuencia de consenso del dominio D7 de un receptor VEGF: L/l X, R f X2, X3, X4, X5, X6 y Xy (SEC ID NO: 158), en donde L es Leucina, I es Isoleucina, R es Arginina, O es un aminoácido hidrofóbico, D es Ácido Aspártico, E es Ácido Glutámico, G es Glicina; y X t X2, X3, X4 y X5 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, O es Valina; X1 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Glutamina, Ácido Glutámico y Ácido Aspártico; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Lisina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Ácido Glutámico, Glutamina y Valina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Valina; y X5 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Glicina, Serina y Glutamina.

En otra modalidad, las moléculas peptídicas enlazan a la siguiente secuencia de consenso para el dominio D7 de un miembro de la familia de receptor VEGF: IX1 RVX2X3EDX4G en donde I es Isoleucina, R es Arginina, E es Ácido Glutámico, D es Ácido Aspártico, G es Glicina; y ?,, X2, X3 y son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, X1 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Arginina, y Glutamina; X2 se selecciona' del grupo que consiste en Arginina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Lisina; y X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Alanina (SEC ID NO: 1).

Por lo tanto, en una modalidad, las porciones peptídicas de la presente invención comprenden o consisten en una secuencia que corresponde a la secuencia de consenso I X ! RVX2X3EDX4G en donde I es Isoleucina, R es Arginina, E es Ácido Glutámico, D es Ácido Aspártico, G es Glicina; y X1 t X2, X3 y X4 son cualquier aminoácido. En una modalidad específica, Xi se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Arginina, y Glutamina; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Lisina; y X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Alanina (SEC ID NO: 1).

En una modalidad, las porciones peptídicas de la presente invención pueden comprender un dominio de proteína completo, por ejemplo, un dominio D4 o D5 tal como el dominio D4 (residuos 309-413) o el dominio D5 (residuos 410-519) de una Kit humana. Como un ejemplo adicional, las porciones peptídicas de la presente invención pueden comprender un dominio D7 (o fragmento del mismo) de una RTK tipo V, tal como el dominio D7 de un VEGFR (residuos 718-727 de VEGFR1, residuos 724-733 de VEGFR2 o residuos 735-744 de VEGFR3). Dicha molécula peptídica enlaza a la RTK y actúa como un antagonista, evitando la activación de RTK (ver el Ejemplo 16 que se encuentra más adelante). En algunas modalidades, las porciones peptídicas de la presente invención pueden tener tan poco como el 50% de identidad como un dominio de una RTK, tal como RTK tipo III, por ejemplo, una porción peptídica de la presente invención, puede ser al menos el 50% idéntica, al menos el 60% idéntica, al menos el 70% idéntica, al menos el 80% idéntica, al menos el 90% idéntica, o al menos 95%, 96%, 97%, o el 98% idéntica a un dominio D4, a D5 o D7 de RTK. En una modalidad específica, la porción peptídica de la presente invención es al menos el 80% idéntica, al menos el 90% idéntica, o al menos el 95%, 96%, 97%, o el 98% idéntica a los residuos de aminoácido 309-413 de la RTK Kit humana, residuos de aminoácido 718-727 de VEGFR 1, residuos de aminoácido 724-733 de VEGFR2, o residuos de aminoácido 735-744 de VEGFR3. En una modalidad similar, la porción peptídica de la presente invención es al menos el 80% idéntica, al menos el 90% idéntica, o al menos el 95%, 96%, 97%, o el 98% idéntica a residuos de aminoácido 410-519 de RTK Kit humana, los residuos de aminoácido 718-727 de VEGFR 1 , residuos de aminoácido 724-733 de VEGFR2, o los residuos de aminoácido 735-744 de VEGFR3.

En algunas modalidades, la porción peptídica de la presente invención enlaza a o comprende secuencias específicas del receptor Kit humano, por ejemplo, residuos 309-413, residuos 410-519, 381Arg y 386Glu, o 418Tyr y 505Asn del receptor Kit humano. En otras modalidades, la porción peptídica de la presente invención enlaza a o comprende secuencias específicas del receptor VEGF, por ejemplo, residuos 718-727 de VEGFR1, Arg720 y Asp725 de VEGFR1, residuos 724-733 de VEGFR2, Arg726 y Asp731 de VEGFR2, residuos 735-744 de VEGFR3, o Arg737 y Asp742 de VEGFR3.

En una modalidad preferida, una porción peptídica de la presente invención puede enlazar a (o comprender o consistir en) uno o más residuos en el receptor Kit que elabora a las cavidades o bolsillos pequeños descritos en la tabla 4 (que se encuentra más adelante). Por ejemplo, una molécula peptídica de la presente invención puede enlazar a (o comprender o consistir en) uno o más de los siguientes residuos en la región de articulación D3-D4 del receptor Kit: K218, S220, Y221, L222 del dominio D3 y F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370.1371, Y373 del dominio D4. Una molécula peptídica de la presente invención también puede enlazar a (o comprender o consistir en) uno o más de los siguientes residuos que elaboran una superficie cóncava en el dominio D4 de receptor Kit: Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390. En otra modalidad, una molécula peptídica de la presente invención puede enlazar a (o comprender o consistir en) uno o más de los siguientes residuos que forman un bolsillo en la región de articulación D2-D3 del receptor Kit: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 y F208 del dominio D2 y V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269 del dominio D3.

Una porción peptídica de la presente invención puede enlazar a residuos de aminoácido contiguos o no contiguos, y funcionar como una cuña molecular que previene el movimiento requerido para la colocación de una región próxima de la RTK a una distancia y orientación que permite la activación de cinasa de tirosina. Una molécula peptídica de la presente invención también puede actuar para prevenir las interacciones homotípicas del receptor D4, D5 o D7 o desestabilizar el sitio de interacción del ligando-receptor. En algunas modalidades preferidas, una molécula peptídica de la presente invención puede enlazar a (o comprender o consistir en) uno o más de los siguientes residuos en el receptor Kit: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, 1371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431, o G432. Las porciones peptídicas de la presente invención puede enlazar a (o comprender o consistir en) todos los residuos de aminoácido que forman un bolsillo o cavidad identificada en la tabla 4 o que pueden enlazar a (o comprender o consistir en) un subconjunto de residuos que forman el bolsillo o la cavidad. Un experto en la técnica podrá apreciar, en algunas modalidades, que una molécula peptídica de la presente invención, puede ser fácilmente dirigida a los residuos correspondientes en otras RTKs tipo III, por ejemplo, los residuos que forman bolsillos o cavidades, o los que están en la misma posición en la alineación estructural o alineación de secuencia.

En una modalidad específica, una molécula peptídica de la presente invención enlaza a un epítope de conformación o un epítope discontinuo en una RTK tipo III o una RTK tipo V. el epítope de conformación o discontinuo puede estar compuesto de dos o más residuos del dominio D3, D4, D5 o D7 o las regiones de articulación D4-D5 o D3-D4 de una RTK tipo III, por ejemplo, el receptor Kit humano o el receptor PDGF o una RTK tipo V, por ejemplo, un receptor VEGF humano. Por ejemplo, el epítope de conformación o discontinuo puede estar compuesto de dos o más de los residuos descritos en la tabla 4 que se encuentra más adelante. En una modalidad particular, una molécula peptídica de la presente invención, enlaza a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206, V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268, y Y269. En modalidades similares, una molécula peptídica de la presente invención puede enlazar a un epítope de conformación compuesto de 2 o más aminoácidos seleccionados de los siguientes grupos de aminoácidos: P206, F208, V238, y S239; K127, A207, F208, y T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370.1371, y Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, y 1371; R224, V308, K310, G311, F340, P341, y D398; K218, A219, S220, N367, E368, y S369; K218, A220, E368, y S369; G384, T385, T411, K412, E414, y K471; Y408, F433, G470, K471, y L472; F324, V325, N326, y N410;D327, N410, T411, K412, y V497; G384, G387, V409, y K471; L382, G387, V407, y V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, y Y269; P206, F208, V238, y S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370.1371, y Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470, y K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432, y K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386, y T390; Y350, R353, y F355.

En una modalidad adicional, una molécula peptídica de la presente invención enlaza a un epítope de conformación, en donde el epítope de conformación está compuesto de dos o más residuos de aminoácido seleccionados de los péptidos descritos en la tabla 5. En una modalidad específica, el epítope de conformación está compuesto de uno o más residuos de aminoácido seleccionados de un primer péptido y uno o más aminoácidos seleccionados de un segundo péptido, en donde el primero o segundo péptidos se seleccionan del grupo de péptidos descritos en la tabla 5. Por lo tanto, una molécula peptídica de la presente invención enlaza a un epítope de conformación en donde el primero y segundo grupos de péptido son como se indica a continuación: Ala219-Leu222 y Thr304-Val308; Asp309-Gly311 y Arg224-Gly226; Thr303 -Glu306 y Ala219-Leu222; Asn367-Asn370 y Ser217-Tyr221 ; Ala339-Pro343 y Asn396-Val399; Ala339-Pro343 y Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 y Val374-His378; Asp357-Glu360 y Leu377-Thr380; Met351 -Glu360 y His378-Thr389; His378-Thr389 y Val323-Asp332; Val409-lle415 y Ala493-Thr500; Val409-lle415 y Ala431-Thr437; Val409-I Ie415 y Phe469-Val473; Val409-lle415 y Val325-Asn330; Val409-I Ie415 y Arg381 -Gly387; Gly466-Leu472 y Gly384-Gly388; Val325-Glu329 y Tyr494-Lys499; Thr411-Ieu416 y Val497-Ala502; I Ie415-Leu421 y Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 y Lys484-Thr488; y Ala502-Ala507 y Gly445-Cys450. Las porciones peptídicas de la presente invención, pueden enlazar a todos los residuos de aminoácido que forman el primero y segundo grupos de péptidos anteriores, o pueden enlazar a un subconjunto de residuos que forman el primero y segundo grupos de péptido.

En otra modalidad, una porción peptídica de la presente invención puede enlazar a (o comprender o consistir en) 2 o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en E33, P34, D72, E76, N77, K78, Q79, K158, D159, N250, S251, Q252, T253, K254, L255, N260, W262, H264, G265, E344, N352, R353, F355, T356, D357, Y362, S365, E366, N367, N370, y G466.

En otra modalidad, una porción peptídica de la presente invención enlaza a un epitope contiguo en el receptor VEGF. En una modalidad, el epitope contiguo está compuesto de dos o más residuos en el dominio D7 del receptor VEGF. En otra modalidad, el epitope contiguo es un epitope seleccionado del grupo que consiste en 672VAISSS677 de VEGFR1, 678TTLDCH A684 de VEGFR 1, 685NGVPEPQ691 de VEGFR1, 700KIQQEPG706 de VEGFR 1, 707MLG710 de VEGFR1, 7 1PGS713 de VEGFR1, 71 STLFI718 de VEGFR1, 7 9ERVTEEDEGV728 de VEGFR1, 689VNVSDS694 de VEGFR3, 695LEMQCLV701 de VEGFR3, 702AGAHAPS708 de VEGFR3, 717LLEEKSG723 de VEGFR3, 72 VDLA727 de VEGFR3, 728DSN 730 de VEGFR3, 731QKLSI735 de VEGFR3, y 736QRVREEDAGR745 de VEGFR3, 678TSIGES683 de VEGFR2, 68 l E VSCTA690 de VEGFR2, 691SGNPPPQ697 de VEGFR2, 706TLVEDSG712 de VEGFR2, 713IVLK716 de VEGFR2, 717DGN719 de VEGFR2, 720RNLTI724 de VEGFR2 y 7 5RRVRKEDEGL734 de VEGFR2.

En otra modalidad, una molécula peptídica de la presente invención enlaza a, o comprende residuos de aminoácido 385Arg y 390Glu de PDGFR humano, o los residuos correspondientes en PDGFRa. Los residuos 385Arg y 390Glu de PDGFRp humano son análogos a los residuos 381Arg y 386Glu del receptor Kit y transmiten interacciones homotípicas D4-D4 de PDGFR . Las moléculas peptídicas de la presente invención pueden ejercer su efecto inhibidor en la activación de receptor, previniendo las interacciones homotípicas críticas (tal como puentes de sal formados entre 385Arg y 390Glu de PDGFR humano) entre regiones próximas de membrana de las RTKs tipo III, que son esenciales para la colocación del dominio citoplásmico a una distancia y orientación esencial para la activación de cinasa de tirosina. Los experimentos que aquí se describen demuestran que las interacciones homotípicas D4-D4 son indispensables para la dimerización PDGFR y que la dimerización PDGFRP es necesaria, pero no suficiente para la actividad del receptor. Por lo tanto, las moléculas peptídicas de la presente invención pueden permitir la dimerización de PDGFR , previniendo al mismo tiempo la activación. La alineación de secuencia a base de estructura ha mostrado que el tamaño del lazo EF, y los aminoácidos críticos, que comprenden la interfase D4-D4, están conservados en Kit, PDGFRa, PDGFR3, y CSF1R. Por lo tanto, en algunas modalidades, las moléculas peptídicas de la presente invención pueden ser dirigidas a las regiones conservadas de los dominios D4 o D5 de las RTKs tipo III.

Las porciones peptídicas de la presente invención puede ser péptidos que comprenden o consisten en cualesquiera secuencias de aminoácido aquí identificadas (por ejemplo, SEC ID NOs: 1-89, 92, 93, y 105-157). Por ejemplo, las porciones peptídicas de la presente invención puede ser péptidos que comprenden o consisten en cualesquiera secuencias de aminoácido: EVVDKGFIN (SEC ID NO: 2), ASYL (SEC ID NO: 3), TLEVV (SEC ID NO: 4), ASYLTLEVV (SEC ID NO: 5), DKG , REG, DKG REG (SEC ID NO: 6), VVSVSKASYLL (SEC ID NO: 7), VTTTLEVVD (SEC ID NO: 8), REGEEFTVTCTI (SEC ID NO: 9), TTLE (SEC ID NO: 10), TTLEASYL (SEC ID NO: 11), KS EN ES N I R (SEC ID NO: 12), N ES N (SEC ID NO: 13), SKASY (SEC ID NO: 14), NESNSKASY (SEC ID NO: 15), AFPKP (SEC ID NO: 16), NSDV (SEC ID NO: 17), AFPKPNSDV (SEC ID NO: 18), ESNIR (SEC ID NO: 19), AFPKPESNIR (SEC ID NO: 20), DKWEDYPKSE (SEC ID NO: 21), IRYVSELHL (SEC ID NO: 22), LTRLKGTEGGT (SEC ID NO: 23), GENVDLI VEYE (SEC ID NO: 24), MNRTFTDKWE (SEC ID NO: 25), KWEDY (SEC ID NO: 26), VSELH (SEC ID NO: 27), KWEDYVSELH (SEC ID NO: 28), DKWE (SEC ID NO: 29), LHLT (SEC ID NO: 30), DKWELHLT (SEC ID NO: 31), HLTRLKGTEGGT (SEC ID NO: 32), MNRTFTDKWE (SEC ID NO: 25), HLTRLKGTEGGT (SEC ID NO: 32), MNRTFTDKWE HLTRLKGTEGGT (SEC ID NO: 33), VFVNDGENVD (SEC ID NO: 34), VNTKPEI (SEC ID NO: 35), 5 AYNDVGKT (SEC ID NO: 36), VNTKPEIAYNDVGKT (SEC ID NO: 37), AGFPEPT (SEC ID NO: 38), VNTKPEI AGFPEPT (SEC ID NO: 39), FGKLV (SEC ID NO: 40), VNTKPEI FGKLV (SEC ID NO: 41), VNDGEN (SEC ID NO: 42), VNTKPEIVNDGEN (SEC ID NO: 43), RLKGTEG (SEC ID NO: 44), VNTKPEI RLKGTEG (SEC ID NO: 45), GPPFGKL (SEC ID NO: 46), GTEGG (SEQ ID NO: 47), GPPFGKLGTEGG (SEC ID NO: 48), VNDGE (SEC ID NO: 49), YNDVGK (SEC ID NO: 50), VNDGEYNDVGK (SEC ID NO: 51), TKPEILTYDRL (SEC ID NO: 52), DRLVNGMLQC (SEC ID NO: 53), GKTSAYFN FAFK (SEC ID NO: 54), CPGTEQRCSAS (SEC ID NO: 55), CSASVLPVDVQ (SEC ID NO: 56), DSSAFKH NGT (SEC ID NO: 57), GTVECKAYND (SEC ID NO: 58), LNSSGPPFGKL (SEC ID NO: 59), FAFKGNNKEQI (SEC ID NO: 60), TKPEIL (SEC ID NO: 61), VGKTSA (SEC ID NO: 62), TKPEILVGKTSA (SEC ID NO: 63), ILTYDRL (SEC ID NO: 64), AYFNFA (SEC ID NO: 65), I LTY D RLAYF N F A (SEC ID NO: 66), KHNGT (SEC ID NO: 67), AYFNFAKHNGT (SEC ID NO: 68), GTEQRC (SEC ID NO: 69), AYFNFAGTEQRC (SEC ID NO: 70), YHRKVRPVSSHGDFNY (SEC ID NO: 71), PFVS (SEC ID NO: 72), KAFT (SEC ID NO: 73), LAFKESN I Y (SEC ID NO: 74), LLEVFEFI (SEC ID NO: 75), RVKGFPD (SEC ID NO: 76), KASNES (SEC ID NO: 77), KAES (SEC ID NO: 78), GTTKEK (SEC ID NO: 79), YFGKL (SEC ID NO: 80), FVNN (SEC ID NO: 81), DNTKV (SEC ID NO: 82), GGVK (SEC ID NO: 83), LGVV (SEC ID NO: 84), YGHRKVRPFVSSSHGDFNY (SEC ID NO: 85), PFVS (SEC ID NO: 72), KS YLF PKN ES N I Y (SEC ID NO: 86), GGGYVTFFGK (SEC ID NO: 87), DTKEAGK (SEC ID NO: 88), YFKLTRLET (SEC ID NO: 89), y YRF.

Una molécula de péptido de la presente invención puede ser modificada en forma adicional para incrementar su estabilidad, biodisponibilidad o solubilidad. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácido-L dentro de las moléculas peptídicas, pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido-D. El término "mimético" tal como aplica para las moléculas peptídicas de la presente invención, pretende incluir moléculas que mimetizan la estructura química de una estructura de péptido-D y retiene las propiedades funcionales de la estructura peptídica-D. El término "mimético" está proyectado en forma adicional para comprender un "análogo" y/o "derivado" de un péptido tal como se describe más adelante. Los métodos para diseñar análogo de péptido, derivados y miméticos son conocidos en la técnica. Por ejemplo ver la Publicación de Farmer, P.S. en Diseño de Fármaco (EJ. Ariens, ed.) Academic Press, Nueva York, 1980, vol. 10, pp. 119-143; Ball. J.B. y Alewood, P.F. (1990) J. Mol. Recognition 3:55; Morgan, B.A. y Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243; y Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10:270. Ver también la Publicación de Sawyer, T.K. (1995) "Diseño de Péptidomimetico y Métodos Químicos para Metabolismo de Péptido" en Tailor, M.D. y Amidon, G.L. (eds.) Diseño de Fármaco a Base de Péptido: Control de Transporte y Metabolismo, Capítulo 17; Smith, A.B. 3rd, y asociados, (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:11 13-11 23; Smith, A.B. 3o, y asociados, (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:9947-9962; y Hirschman, R. , y asociados. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:12550-12568.

Tal como se utiliza en la presente invención, un "derivado" de una molécula peptídica de la presente invención se refiere a una forma de la molécula peptídica en la cual uno o más grupos de reacción en la molécula han sido derivados con un grupo sustituyente. Los ejemplos de derivados de péptido incluyen péptidos en los cuales la cadena lateral de aminoácido, el esqueleto de péptido, o el término amino o carboxi ha sido derivado (por ejemplo, los compuestos peptídicos con ligaduras de amida metiladas). Tal como se utiliza en la presente invención, un "análogo" de una molécula peptídica de la presente invención para una molécula peptídica que retiene estructuras químicas de la molécula necesarias para la actividad funcional de la molécula, aún contienen ciertas estructuras químicas que difieren de la molécula. Un ejemplo de un análogo de un péptido que ocurre naturalmente es un péptido que incluye uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente. Tal como se utiliza en la presente invención, un "mimético" de una molécula peptídica de la presente invención se refiere a una molécula peptídica en la cual las estructuras químicas de la molécula necesarias para la actividad funcional de molécula han sido reemplazadas con otras estructuras químicas que mimetizan la conformación de la molécula. Los ejemplos de peptidomiméticos incluyen compuestos peptídicos en los cuales el esqueleto de péptido es sustituido con una o más moléculas de benzodiazepina (ver por ejemplo, la Publicación de James, GL. y asociados, (1993) Science 260:1937-1942).

Los análogos de moléculas peptídicas de la presente invención están proyectados para incluir moléculas en las cuales uno o más aminoácidos-L o -D de la estructura peptídica, se sustituyen con un aminoácido homólogo, de modo que las propiedades de la molécula se mantienen. Preferentemente se elaboran sustituciones de aminoácido conservadoras en uno o más residuos de aminoácido. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas similares han sido definidas en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, Usina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan), cadenas laterales ramificadas-beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina). Los ejemplos no limitantes de sustituciones homologas que pueden elaborarse en las estructuras de las moléculas peptídicas de la presente invención, incluyen la sustitución de D-fenilalanina con D-tirosina, D-piridilalanina o D-homofenilalanina, la sustitución de D-leucina con D-valina u otro aminoácido natural o no natural que tiene una cadena lateral alifática y/o la sustitución de D-valina con D-leucina u otro aminoácido natural o no natural que tiene una cadena lateral alifática.

El término mimético, y en particular, péptidomimetico, pretende incluir isosteros. El término "isostero" tal como se utiliza en la presente invención pretende incluir una estructura química que puede ser sustituida por una segunda estructura química debido a la conformación estérica de la primera estructura que se ajusta a un sitio de enlace específico para la segunda estructura. El término incluye específicamente modificaciones de esqueleto de péptido (es decir miméticos del enlace de amida) bien conocidas para los expertos en la técnica. Dichas modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno de amida, el a-carbono, carbonilo de amida, el reemplazo completo del enlace de amida, extensiones, eliminaciones y reticulaciones de esqueleto. Se conocen diversas modificaciones de esqueleto de péptido, incluyendo i|i[CH2S], ?[??2??], IJJ[CSNH2], ?[????], i [COCU2], y ?[(?) o (Z) CH = CH]. En la nomenclatura utilizada anteriormente, ? indica la ausencia de un enlace de amida. La estructura que reemplaza al grupo amida está especificada dentro de los corchetes.

Otras posibles modificaciones, incluyen una sustitución de N-alqu¡lo (o arilo) (?, [CONR]) o reticulación de esqueleto para construir lactamas y otras estructuras cíclicas. Otros derivados de los compuestos moduladores de la presente invención incluyen derivados de hidroximetilo C-terminales, derivados modificados-O (por ejemplo, éter hidroximetil bencílico C-terminal), derivados modificados en forma N-terminal, incluyendo amidas sustituidas tal como alquilamidas e hidrazidas.

Las moléculas peptídicas de la presente invención pueden ser elaboradas a través de métodos estándar conocidos en la técnica. La molécula peptídica, por ejemplo, dominio D4de la RTK Kit humana o dominio D7 de receptor VEGF humano, puede ser clonada de células humanas utilizando técnicas estándar, insertarse en un vector recombinante y expresarse en un sistema de célula in vitro (por ejemplo, mediante transfección del vector en las células de levadura). Como alternativa, las moléculas peptídicas pueden estar diseñadas y sintetizadas de novo a través de métodos de síntesis conocidos tal como Atherton y asociados, (1989) Oxford, Inglaterra: IRL Press. ISBN 0199630674; Stewart y asociados, (1984). 2° edición, Rockford: Pierce Chemical Company, 91. ISBN 0935940030; errifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154.

Las moléculas peptídicas posteriormente pueden ser probadas para actividad funcional utilizando cualesquiera de los ensayos aquí descritos, por ejemplo los descritos en la sección de Ejemplos que se encuentra a continuación.

IV. Ensayos de Clasificación para Identificar Porciones de la Presente Invención Las porciones de la presente invención pueden ser clasificadas para actividad de inhibición RTK, utilizando cualesquiera de los ensayos aquí descritos y los ensayos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ensayos que pueden determinar la internalización de receptor, autofosforilación de receptor y/o señalización de cinasa, pueden ser utilizados para identificar porciones que previenen la activación de las RTKs objetivo, por ejemplo, el receptor Kit o un receptor VEGF humano. La clasificación de nuevas porciones inhibidoras puede lograrse utilizando métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, empleando un procedimiento fosfoELISA™ (disponible en Invitrogen) para determinar el estado de fosforilación de la RTK o una molécula de corriente descendente. El estado de fosforilación de receptor, por ejemplo, el receptor Kit o un receptor VEGF, puede ser determinado utilizando equipos comercialmente disponibles tales como, por ejemplo, C-Kit [pY823] ELISA KIT, HU (BioSource™; Número de Catálogo - KHO0401); c-KIT [TOTAL] ELISA KIT, HU (BioSource™; Número de Catálogo -KHO0391). Los anticuerpos, moléculas pequeñas y otras porciones de la presente invención pueden ser clasificadas utilizando equipos para determinar su actividad de inhibición RTK. Por ejemplo, después de tratamiento con un ligandos adecuado y una porción de la presente invención, se puede llevar a cabo un fosfoELISA™ para determinar el estado de fosforilación, y por lo tanto el estado de activación de una RTK de interés. Las porciones de la presente invención pueden ser identificadas como aquellas que previenen la activación RTK. Los ejemplos 15 y 16 que se encuentran más adelante describen ensayos que implican la detección de activación RTK utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina. El ejemplo 20 que se encuentra más adelante describe un posible ensayo para detectar la activación de receptor utilizando el sistema fosfoELISA™. Los ejemplos 22-25 (incluyendo los métodos e introducción relacionados con los mismos) describen métodos adicionales utilizados en la presente invención para determinar el estado de activación de RTKs.

Ya que la activación del receptor puede conducir a endocitosis e internalización de receptor, es útil, en algunas modalidades determinar la capacidad que tiene las porciones de la presente invención de inhibir las RTKs objetivo, midiendo su capacidad para prevenir la internalización de receptor. El ejemplo 25 que se encuentra más adelante (y los métodos relacionados con los mismos) describe la medida de la internalización y degradación de los mutantes de receptor PDGF. Los ensayos de internalización de receptor son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de Fukunaga y asociados, (2006) Life Sciences. 80(1). p. 17-23; Bernhagen y asociados, (2007) Nature Medicine 13, 587 - 596; natureprotocols.com/2007/04/18/receptor internalization assay. php), cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia. Un método bien conocido para determinar la internalización de receptor, es etiquetar un ligando con una proteína fluorescente, por ejemplo, Proteína Fluorescente Verde (GFP), u otro agente de etiquetado adecuado. Al momento del enlace del ligando al receptor, se puede utilizar el microscopio de fluorescencia para visualizar la internalización de receptor. En forma similar, una porción de la presente invención puede ser etiquetada con un agente de etiquetado y se puede utilizar un microscopio de fluorescencia para visualizar la internalización del receptor. Si la porción tiene la capacidad de inhibir la actividad del receptor, se puede observar la internalización disminuida de la fluorescencia en la presencia del ligando en comparación con los controles adecuados (por ejemplo, se puede observar la fluorescencia únicamente en la periferia de la célula, en donde la porción enlaza al receptor en lugar de a los endosomas o vesículas).

Además de los antes mencionados, en la técnica se conocen otros diversos ensayos de activación, los cuales pueden ser utilizados para evaluar la función de las porciones de la presente invención. Los ensayos de activación del receptor adicional que se pueden utilizar de acuerdo con presente invención, se describen · en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,287,784; 6,025,145; 5,599,681; 5,766,863; 5,891,650; 5,914,237; 7,056,685; y muchas publicaciones científicas, que incluyen pero no se limitan a: Amir-Zaltsman y asociados, (2000) Luminescence 15(6): 377-80; Nakayama y Parandoosh (1999) Journal de Immunological Methods. 225(1-2), 27, 67-74; Pike y asociados, (1987) Methods de Enzymology 146: 353-362; Atienza y asociados, (2005) Journal de Biomolecular Screening. 11(6): 634-643; Hunteretal. (1982). Journal de Biológica! Chemistry 257(9): 4843-4848; White y Backer (1991) Methods in Enzymology 201: 65-67; Madden y asociados, (1991) Anal Biochem 199: 210-215; Cleaveland y asociados, (1990) Analytical Biochemistry 190: 249-253; Lázaro y asociados, (1991) Analytical Biochemistry 192: 257-261; Hunter y Cooper (1985) Ann Rev Biochem 54: 897-930; Ullrich y Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212; Knutson y Buck (1991) Archives de Biochemistry y Biofysics 285(2): 197-204); King y asociados, (1993) Life Sciences 53: 1465-1472; Wang. (1985) Molecular y Cellular Biology 5(12): 3640-3643; Glenney y asociados, (1988) Journal de Immunological Methods 109: 277-285; Kamps (1991) Methods in Enzymology 201: 101-110; Kozma y asociados, (1991) Methods ¡n Enzymology 201: 28-43; Holmes y asociados, (1992) Science 256: 1205-10; y Cortas y asociados, (1993) PNAS, USA 90: 1624-1628.

La activación de receptor mediante enlace de ligando inicia normalmente eventos intracelulares subsecuentes, por ejemplo, incrementa en mensajeros secundarios tales como I P3 lo cual a su vez, libera los almacenes intracelulares de los iones de calcio. Por lo tanto, la actividad de receptor puede ser determinada midiendo la cantidad de mensajeros secundarios tal como IP3, nucleótidos cíclicos, calcio intracelular, o moléculas de señalización fosforiladas tales como STAT, PI3K, Grb2, u otros posibles objetivos conocidos en la técnica. La Patente Norteamericana No. 7,056,685 describe y hace referencia a diversos métodos que pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención para detectar la actividad de receptor, y está incorporada a la presente invención como referencia.

Muchos de los ensayos descritos anteriormente, tal como ensayos de internalización o ensayos de activación de receptor pueden implicar la detección o cuantificación de RTK objetivo, utilizando ensayos de enlace inmunológico (por ejemplo, cuando se utiliza un anticuerpo radioetiquetado para detectar la cantidad de RTK en la superficie celular durante un ensayo de internalización de receptor). Los ensayos de enlace inmunológicos son ampliamente descritos en la técnica (ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; y 4,837,168). Para una revisión de los inmunoensayos generales ver la también las Publicaciones de Métodos en Biología Celular: Anticuerpos en Biología Celular, volumen 37 (Asai, ed. 1993); Inmunología Básica y Clínica (Stites & Terr, eds., 7o edición 1991).

Los inmunoensayos tal como los que pueden ser empleados en estudios de internalización de receptor, estudios de activación de receptor, o ensayos de detección de receptor, con frecuencia utilizan un agente de etiquetado para enlazar en forma específica a, y etiquetar el complejo formado mediante la detección de anticuerpo y la RTK (ver la Patente Norteamericana No. 7,056,685, la cual está incorporada a la presente invención como referencia). El agente de etiquetado por si mismo puede ser el anticuerpo utilizado para detectar el receptor (aquí el anticuerpo puede o no ser una porción de la presente invención). Como alternativa, el agente de etiquetado puede ser un tercer agente, tal como un anticuerpo secundario o terciario (por ejemplo, y un anticuerpo anti-ratón que enlaza a un anticuerpo monoclonal de ratón específico para la RTK objetivo). Otras proteínas con la capacidad de enlazar específicamente a regiones constantes de inmunoglobulina, tal como proteína A o proteína G, también pueden ser utilizadas como el agente de etiquetado en un ensayo de enlace inmunológico. Estas proteínas exhiben una fuerte reactividad no inmunogénica con regiones constantes de inmunoglobulina de una variedad de especies (ver, por ejemplo, las Publicaciones de Kronval y asociados, (1973), J. Immunol. 111:1401-1406; Akerstrom y asociados, (1985), J. Immunol. 135:2589 2542). El agente de etiquetado también puede ser modificado con un agente detectable, tal como biotina, al cual se puede enlazar específicamente otra molécula, tal como estreptavidina. Una variedad de porciones detectables son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los ensayos comúnmente utilizados incluyen ensayos no competitivos, por ejemplo, ensayos de emparedado y ensayos competitivos. Los formatos de ensayo comúnmente utilizados incluyen manchados Western (inmunomanchado), que son utilizados para detectar y cuantificar la presencia de proteína en una muestra. La etiqueta o grupo detectable particular utilizado en el ensayo, no es un aspecto importante de la presente invención, siempre que no interfiera significativamente con el enlace específico de la inmunoglobulina utilizada para detectar la RTK o una porción de la presente invención, que está diseñada para enlazar y desactivar la RTK. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Dichas etiquetas detectables han sido bien desarrolladas en el campo de los inmunoensayos y en general, se puede aplicar a la presente invención casi cualquier etiqueta útil en dichos métodos. Por lo tanto, una etiqueta es cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las etiquetas útiles de la presente invención incluyen tintas fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoreceína, rojo Texas, rodamina, y similares), radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 125l, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, y otras comúnmente utilizadas en un ELISA), y etiquetas colorimétricas tales como cuentas de oro coloidal, de vidrio o plástico con color (por ejemplo, poliestireno, polipropileno o látex).

La etiqueta puede ser acoplada directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. La etiqueta también puede ser conjugada directamente para compuestos que generan señal, por ejemplo, mediante conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como etiquetas serán principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, estearasas y glucosidasas, u oxidotasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona , y similares. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina, y 2,3-dihidroftalazinadionas, por ejemplo, luminol. Para una revisión de diversos sistemas de etiquetado o producción de señal que pueden ser utilizados consultar la Patente Norteamericana No. 4,391,904.

Los medios para detectar etiquetas son bien conocidos para un experto en la técnica. Por lo tanto, por ejemplo, cuando la etiqueta es una etiqueta radioactiva, los medios de detección incluyen un contador de centelleo o película fotográfica como una autoradiografía. Cuando la etiqueta es una etiqueta fluorescente, puede ser detectada excitando el fluorocromo con la longitud de onda de luz adecuada, y detectando la fluorescencia resultante. La fluorescencia puede ser detectada visualmente, por medio de una película fotográfica, a través del uso de detectores electrónicos tales como dispositivos acoplados por carga (CCDs) o fotomultiplicadores y similares. En forma similar, las etiquetas enzimáticas pueden ser detectadas proporcionando los substratos adecuados para la enzima, y detectando el producto de reacción resultante. Finalmente, se pueden detectar etiquetas colorimétricas simples, observando simplemente el color asociado con la etiqueta. Por lo tanto, en varios ensayos de tira reactiva, el oro conjugado con frecuencia parece rosa, aunque varias cuentas conjugadas aparecen del color de la cuenta.

En un aspecto adicional de la presente invención, las porciones de la presente invención pueden enlazar a epítopes en una RTK objetivo y aún permitir que dimerice el ectodominio de la cinasa de tirosina receptora. En esta modalidad, el enlace de la porción puede afectar, la colocación, orientación y/o distancia entre los dominios tipo Ig de dos monómeros (por ejemplo, los dominios D4-D4 o D5-D5 de una cinasa de tirosina receptora tipo III o los dominios D7-D7 dominios de una cinasa de tirosina receptora tipo V), para inhibir de esta forma la actividad de la cinasa de tirosina receptora. En otras palabras, la porción puede permitir la dimerización inducida por ligando de los ectodominios de cinasa de tirosina receptora, pero afectar la colocación de los dos ectodominios en la interfase de superficie celular, o alterar o prevenir cambios de conformación en la cinasa de tirosina receptoras, inhibiendo de esta forma la actividad cinasa de tirosina receptora (por ejemplo, inhibiendo la internalización de receptor y/o inhibiendo la autofosforilación de tirosina del receptor y/o inhibiendo la capacidad que tiene el receptor de activar una trayectoria de señalización de corriente descendente).

Por lo tanto, en algunas modalidades, es útil emplear ensayos que tengan la capacidad de identificar porciones que permiten la dimerización de receptor, haciendo además inactivo al receptor. Dichos ensayos se describen más adelante. Por ejemplo, el Ejemplo 18 describe experimentos llevados a cabo con el receptor PDGF, mediante lo cual se detecta la dimerización de receptor utilizando reticulación, y se determina la activación de receptor utilizando anticuerpos específicos de fosfortirosina. Además, el Ejemplo 23 muestra que un mutante de PDGFR tiene un daño en la autofosforilación de tirosina inducida por ligando que no es originada por una deficiencia en la dimerización de receptor inducida por ligando (ver también la sección de Métodos e Introducción de los Ejemplos 22 a 25).

El estado de conformación de la RTK también puede ser determinado mediante análisis de Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia (FRET). Se puede encontrar una revisión integral de las metodologías de fluorescencia para determinar las conformaciones e interacciones de proteína en la Publicación de Johnson (2005) Traffic. Dic 2005; 6(12): 1078-92, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. En el ensayo FRET, una RTK de interés es etiquetada con fluoróforos FRET adecuados. Después de que se etiqueta RTK, las células que expresan las RTK etiquetadas son incubadas con porciones de prueba de la presente invención y el ligando de la RTK (por ejemplo, SCF para Kit RTK). El análisis FRET permitirá la observación de cambios en conformación en la RTK asociada con el enlace de ligando, dimerización RTK y/o activación de receptor. A través de este método, un experto en la técnica puede evaluar directamente un cambio de conformación de proteína que indica la dimerización RTK sin la activación de la corriente descendente. Existe una cantidad de métodos disponibles para llevar a cabo el análisis FRET, y surge una gran parte de la variación a partir del uso de diferentes fluoróforos o diferentes técnicas para incorporar dichos fluoróforos en las proteínas de interés. Los fluoróforos FRET y los métodos de análisis con bien conocidos en la técnica, y está disponible una breve revisión de la tecnología FRET en la Publicación de Heyduk. (2002) Opinión Actual en Biotecnología. 13(4). 292-296 y las referencias ahí mencionadas. Las publicaciones que se encuentran a continuación se extienden en cuanto al método FRET y están incorporadas a la presente invención como referencia: Kajihara y asociados, (2006) Nat Methods. 3(ll):923-9; Biener-Ramanujan y asociados, (2006) Growth Horm IGF Res. 16(4):247-57; Taniguchi y asociados, (2007J Biochemistry. 46(18):5349-57; Patentes Norteamericanas Nos. 6,689,574; 5,891,646; y Publicación WIPO No. WO/2002/033 02. Los fluoróforos FRET pueden ser incorporados en cualquier dominio o región de articulación de una RTK para detectar cambios en conformación (por ejemplo, los dominios D4 o D5 de una RTK Tipo III o el dominio D7 de una RTK Tipo V), siempre que los fluoróforos no interfieran con la función de la RTK o la capacidad de las porciones de la presente invención para enlazar la RTK.

Los fluoróforos útiles para FRET con frecuencia son los mismos a los que son útiles para la Transferencia de Energía de Resonancia de Bioluminiscencia (BRET) tal como se describe más adelante. El método FRET más popular es construir residuos de cisteína reactivos en una proteína de interés. Los fluoróforos posteriormente pueden hacerse reaccionar fácilmente con los residuos de cisteína elegidos. Con frecuencia se construyen proteínas de fusión, mediante lo cual se fusiona una proteína de interés a una Proteína Fluorescente Verde (por ejemplo, la Publicación de Neininger y asociados, (2001 ) EMBO Reports. 2(8):703-708). Los métodos adicionales y fluoróforos útiles para FRET se describen en las Publicaciones de Huebsch y Mooney (2007) Biomaterials. 28(15):2424-37; Schmid y Birbach (2007) Thromb Haemost. 97(3):378-84; Jares-Erijman y Jovin (2006) Curr Opin Chem Biol. 10(5):409-16; Johansson (2006) Methods Mol Biol. 335:17-29; Wallrabe y Periasamy (2005) Curr Opin Biotechnol. 16(1):19-27; y Clegg RM (1995) Curr Opin Biotechnol. 6(1):103-10, las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia .

En otras modalidades, puede ser desconocido o difícil de determinar (dependiendo del receptor) cual es la conformación RTK que indica específicamente de dimerización sin activación. En dichos casos, un experto en la técnica puede combinar ensayos que determinan la dimerización de receptor con los que determinan la activación de receptor. Por ejemplo, se pueden utilizar estudios de reticulación tradicionales (ejemplificados por Rodríguez y asociados, (1990) Endocrinología Molecular, 4(12), 1782-1790) para detectar la dimerización RTK en combinación con cualesquiera de los ensayos de activación de receptor descritos anteriormente. También se pueden utilizar FRET y sistemas similares para medir directamente la activación o dimerización de receptor. Por ejemplo, incorporando fluoróforos FRET adecuados en el dominio citoplásmico de la RTK y en una proteína objetivo de fosforilación (por ejemplo, una molécula de señalización de corriente descendente), FRET puede tener la capacidad de determinar si las moléculas de señalización de corriente descendente están siendo reclutadas en la RTK. Por consiguiente, en una modalidad, una porción útil de la presente invención es una que permite la dimerización de receptor, tal como se mide mediante reticulación o FRET, pero que evita la activación de receptor, detectada como carencia de fluorescencia mediante análisis FRET o BRET o mediante otros ensayos de activación de receptor (por ejemplo, ensayos de autofosforilación que emplea anticuerpos anti-fosfotirosina y manchado Western). Por lo tanto, utilizando las técnicas aquí descritas, un experto en la técnica puede probar fácilmente las porciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos, o anticuerpos) para determinar si inhiben la actividad RTK y si permiten la dimerización de receptor.

En particular, se puede utilizar un análisis de Transferencia de Energía de Resonancia de Bioluminiscencia (BRET), para identificar porciones que inhiben la actividad de RTKs. La Publicación de Patente Norteamericana No. 20060199226, la Publicación WIPO No. WO/2006/094073 , y la Publicación Tan y asociados, (2007. Farmacología Molecular. 72:1440-1446), describen específicamente métodos para identificar ligandos que activan RTKs, y por lo tanto están incorporados a la presente invención como referencia. Estas técnicas han sido empleadas para determinar las interacciones de proteína in vitro y in vivo (Pfleger y asociados, (2006) Nature Pwtocols 1 337-345; Kroeger y asociados, (2001), J. Biol. Chem., 276(16): 12736-43; y Harikumar, y asociados, (2004) Mol Pharmacol 65:28-35; las cuales todas están incorporadas a la presente invención como referencia.

La BRET es útil para identificar porciones de la presente invención, de los compuestos de prueba, clasificando las porciones que previenen la activación RTK.

Tal como se describe en la Publicación de Patente Norteamericana No. 2006/0199226, la cual está incorporada a la presente invención como referencia, se pueden utilizar ensayos basados en BRET para monitorear la interacción de proteínas que tienen una molécula donadora bioluminiscente (DM) con proteínas que tienen una porción aceptora fluorescente (AM). En síntesis, las células que expresan una fusión RTK-DM convertirán la energía química en el substrato en luz. Si existe una AM (por ejemplo, una fusión de proteína de señalización-AM) en proximidad cercana con la fusión RTK-DM, entonces las células emitirán luz en cierta longitud de onda. Por ejemplo, los ensayos a base de BRET pueden ser utilizados para evaluar la interacción entre una fusión de luciferasa RTK y una fusión de proteína de señalización GFP. Esto difiere ligeramente del análisis FRET, en donde la molécula donadora puede ser excitada mediante luz de una longitud de onda específica en lugar de mediante conversión de energía química. Los ejemplos de proteínas bioluminiscentes con actividad de luciferasa que se pueden utilizar en un análisis BRET, se pueden encontrar en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,229,285, 5,219,737, 5,843,746, 5,196,524, 5,670,356. Las DMs alternativas incluyen enzimas, que pueden actuar en substratos adecuados para generar una señal luminiscente. Los ejemplos específicos de dichas enzimas son beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, beta-glucuronidasa y beta-glucosidasa. Los substratos luminiscentes sintéticos para estas enzimas son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles en compañías tales como Tropix Inc. (Bedford, Mass., USA). Las DMs también se pueden aislar o construir a partir de insectos (Patente Norteamericana No. 5,670,356).

Dependiendo del substrato, las DMs emiten luz en diferentes longitudes de onda. Los ejemplos no limitantes de substratos para DMs incluyen coelenterazina, benzotiazol, luciferina, formato de enol, terpeno y aldehido y similares. La porción DM puede ser fusionada a cualquier porción amino terminal o carboxilo de la proteína RTK. Preferentemente, la colocación del dominio BDM dentro de la fusión RTK-DM, no altera la actividad de la proteína nativa o el enlace de porciones de la presente invención. Las proteínas de fusión RTK-DM pueden ser probadas para asegurar que retengan sus propiedades bioquímicas, tal como enlace de ligando y capacidad de interactuar con moléculas de señalización de corriente descendente de la proteína nativa.

AMs en el análisis BRET puede re-emitir la energía transferida como fluorescencia. Los ejemplos de AMs incluyen Proteína Fluorescente Verde (GFP), o isoformas y derivados de las mismas tal como YFP, EGFP, EYFP y similares (R. Y. Tsien, (1998) Ann. Rev. Biochem. 63:509-544). Preferentemente, la colocación del dominio AM dentro de la fusión AM no altera la actividad de la proteína nativa. Las proteínas de la fusión de AM-segunda proteína, pueden ser probadas para asegurar que retengan las propiedades bioquímicas de la proteína nativa cognato, tal como interacción con RTKs. A manera de ejemplo, se puede utilizar una fusión amino terminal de la proteína GFP a cualquier substrato, el cual es fosforilado mediante, o se puede enlazar a la RTK objetivo.

V. Composiciones Farmacéuticas que Contienen las Porciones de la Presente Invención En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene una o una combinación de las porciones de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, o una parte(s) de enlace de antígeno de los mismos, miméticos de anticuerpo, moléculas pequeñas, o moléculas peptídicas de la presente invención), formuladas junto con un transportador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados, moléculas pequeñas, o moléculas peptídicas de la presente invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente invención, puede comprender una combinación de anticuerpos y moléculas pequeñas que enlazan a diferentes epítopes en la RTK objetivo, o que tienen actividades complementarias, por ejemplo, una molécula pequeña que enlaza a la región de articulación D3-D de una RTK tipo III junto con un anticuerpo monoclonal que enlaza al dominio D4 de la RTK tipo III.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden administrar en terapia de combinación, por ejemplo, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-RTK (o molécula peptídica o molécula pequeña) de la presente invención combinada con al menos otro agente anti-cáncer. Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden ser utilizados en terapia de combinación se describen con mayor detalle más adelante.

Tal como se utiliza en la presente invención, un "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes anti-bacterianos, y anti-fúngicos, agentes de retraso de absorción e isotónicos y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el transportador es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, por ejemplo, la porción de la presente invención, puede recubrirse en un material para proteger el compuesto contra la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la presente invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no imparte cualesquiera efectos toxicológicos indeseados (ver por ejemplo, la Publicación de Berge, S.M., y asociados, (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos tales como ácido hidroclórico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrómico, hidroyódico, fosforoso y similares, así como ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácido alcanoicos hidroxi, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos, alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición base incluyen las derivadas de metales de tierra alcalina, tal como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como ?,?'-dibenciletilenediamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la presente invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes de quelación de metal tal como ácido cítrico, ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Los ejemplos de transportadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y a través del uso de tensoactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes de humectación, agentes de emulsificación y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de organismos puede ser asegurada tanto mediante procedimientos de esterilización, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, paraben, clorobutanol, ácido sórbico de fenol, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, se puede proporcionar la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable, mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, está contemplado el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios.

Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El transportador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede ser mantenida por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento, tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersión y a través del uso de tensoactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo sales de monostearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes descritos anteriormente, según se requiera, seguido de microfiltración por esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado con vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional, de una solución filtrada estéril previamente del mismo.

La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con un material transportador para producir una forma de dosificación simple, variará dependiendo del sujeto que esté siendo tratado y el modo de administración en particular. La cantidad efectiva de ingrediente activo que puede ser combinada con un material transportador para producir una forma de dosificación simple, generalmente será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. Generalmente, del 100 por ciento, esta cantidad fluctuará de aproximadamente 0.01 por ciento hasta aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferentemente de aproximadamente 0.1 por ciento hasta aproximadamente 70 por ciento, más preferentemente de aproximadamente 1 por ciento hasta aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo simple, se pueden administrar diversas dosis divididas con el tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en una forma unitaria de dosificación para facilidad de la administración y uniformidad de la dosis. La forma unitaria de dosificación tal como aquí se utiliza, se refiere a unidades físicamente separadas adaptadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que serán tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la presente invención, están dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se quiere lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la generación de compuestos, tal como el compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para administración del anticuerpo, la molécula pequeña o molécula peptídica, los rangos de dosificación son de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más normalmente de 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal del receptor. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser 0.3 mg/kg peso corporal, 1 mg/kg peso corporal, 3 mg/kg peso corporal, 5 mg/kg peso corporal o 10 mg/kg peso corporal o dentro del rango de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ejemplo comprende administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para una porción de la presente invención incluye 1 mg/kg peso corporal o 3 mg/kg peso corporal mediante administración intravenosa, con el anticuerpo siendo proporcionado utilizando uno de los siguientes programas de dosificación: (i) cada cuatro semanas durante seis dosificaciones, posteriormente, cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg peso corporal cada tres semanas.

Como alternativa, el anticuerpo, molécula pequeña, o molécula peptídica pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, caso en el cual se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varía dependiendo de la vida media de la sustancia administrada en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja en intervalos relativamente infrecuentes durante un período de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, algunas veces se requiere una dosis relativamente alta en intervalos relativamente cortos hasta que el progreso de la enfermedad es reducido o se termina, y preferentemente hasta que el paciente muestra disminución parcial o total de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos y moléculas pequeñas en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar para obtener una cantidad de ingrediente activo que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal o amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, el rango de excreción del compuesto particularmente que esté siendo empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que esté siendo tratado y factores similares conocido en las artes médicas.

Una "dosificación terapéuticamente efectiva" de una porción anti-RTK de la presente invención, da como resultado preferentemente una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención de daño y discapacidad debido al padecimiento de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una "dosificación terapéuticamente efectiva" inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecimiento de tumor en al menos aproximadamente el 20%, más preferentemente al menos aproximadamente el 40%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 60%, y aún más preferentemente al menos aproximadamente el 80% en forma relativa a los sujetos no tratados. La capacidad que tiene el compuesto de inhibir el crecimiento de tumor puede ser evaluada en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en tumores humanos. Como alternativa, esta propiedad de una composición puede ser evaluada revisando la capacidad que tiene el compuesto de inhibir, dicha inhibición in vitro, mediante ensayos conocidos para los practicantes expertos. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño de tumor, o disminuir de otra forma los síntomas en un sujeto. Un experto en la técnica podrá tener la capacidad de determinar dichas cantidades con base en factores tales como el tamaño de un sujeto, la severidad de síntomas del sujeto y la composición o ruta de administración seleccionada en particular.

Una porción anti-RTK de la presente invención puede probarse para determinar si es efectiva para antagonizar la RTK. Un método para probar la porción anti-RTK es, confirmar que la interacción no ocurre entre la porción anti-RTK y la porción RTK. Por ejemplo, un experto en la técnica puede probar si un anticuerpo, molécula pequeña, o molécula peptídica de la presente invención enlaza al dominio D4 o D5 de la Kit RTK humana o dominio D7 de un receptor VEGF. Dichas pruebas de enlace son conocidas en la técnica y pueden incluir etiquetado (por ejemplo, radioetiquetado) de la porción anti-RTK, incubación de la porción anti-RTK con una RTK bajo condiciones en las cuales puede ocurrir el enlace, y posteriormente aislando/visualizando el complejo en un gel o colador de fósforo. En forma similar, se puede emplear la técnica ELISA para determinar el enlace.

Otro método para determinar si la porción de la presente invención es antagonista para RTK, es probar el estado de fosforilación del dominio citoplásmico de la RTK. En modalidades específicas, los antagonistas efectivos evitarán la activación y autofosforilación de RTK. La fosforilación de la RTK puede ser probada utilizando métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando anticuerpos que enlazan específicamente los residuos fosforilados de la RTK. Otros métodos para detectar eventos de fosforilación incluyen los descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 6548266; o en la Publicación Goshe y asociados, (2006) Brief Funct Genomic Proteomic. 4:363-76; de Graauw y asociados, (2006) Electroforesis. 27:2676-86; Schmidt y asociados, (2007) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 849:154-62; o mediante el uso del protocolo FlashPlates (SMP200) para el Ensayo de Fosforilación de Cinasa utilizando [gamma-33P]ATP de PerkinElmer. Un experto en la técnica podrá apreciar que estos métodos, y los demostrados en los Ejemplos, también pueden ser utilizados para determinar el estado de fosforilación de las proteínas que son fosforiladas mediante la RTK, y son transductores de señal dentro de la célula. Al detectar el estado de fosforilación de dichas proteínas, también se indicará si las RTK han sido antagonizadas efectivamente a través de las porciones de la presente invención.

Una composición de la presente invención puede ser administrada a través de una o más rutas de administración utilizando una o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Tal como lo apreciarán los expertos en la técnica, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administración preferidas para enlazar porciones de la presente invención incluyen rutas de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutáneo, espinal u otras rutas parenterales, por ejemplo mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" tal como se utiliza en la presente invención, significa modos de administración además de administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, i ntratraq ueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intrasternal y infusión.

Como alternativa, una porción de enlace anti-RTK de la presente invención, se puede administrar a través de una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos activos pueden ser preparados con transportadores que protegerán el compuesto contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulado. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tal como acetato de vinilo de etileno, polianhídridos, ácido poliglucólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la técnica. Ver por ejemplo la Publicación de Sistemas de Suministro de Fármaco de Liberación Sostenida o Controlada, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc, Nueva York, 1978.

Las composiciones terapéuticas pueden ser administradas con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la presente invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o 4,596,556. Los ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: Patente Norteamericana No. 4,487,603, la cual describe una bomba de micro infusión implantable para suministrar medicamento en un rango controlado; la Patente Norteamericana No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente Norteamericana No. 4,447,233, la cual describe una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamento en un rango de infusión preciso; la Patente Norteamericana No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable del flujo variable para el suministro continuo de fármaco; la Patente Norteamericana No. 4,439,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y la Patente Norteamericana No. 4,475,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico. Estas patentes están incorporadas a la presente invención como referencia. Muchos otros de dichos implantes, sistemas de suministro y módulos son conocidos para los expertos en la técnica.

V. Métodos para Utilizar las Porciones de la Presente Invención En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad asociada con RTK en un sujeto, en donde el método comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una porción de la presente invención, las porciones anti-RTK, por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas, o moléculas peptídicas de la presente invención, tienen numerosas utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo, que implican el diagnóstico y tratamiento de una enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora. Las porciones de enlace de la presente invención pueden ser administradas a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar una enfermedad asociada con una cinasa de tirosina receptora.

Tal como se utiliza en la presente invención una "enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora" es una enfermedad o condición que es transmitida por la actividad RTK o está asociada con una expresión o activación RTK aberrante. Los ejemplos de enfermedades asociadas con cinasa de tirosina receptora incluyen enfermedades o condiciones que están asociadas con, por ejemplo, receptores FGF, receptores HGF, receptores de insulina, receptores IGF-1, receptores NGF, receptores VEGF, receptor-a PDGF, receptor-ß PDGF, receptor CSF-1, y receptores F 113 , tal como degeneración macular relacionada con la edad (AMD), ateroesclerosis, artritis reumatoide, retinopatía diabética, o enfermedades asociadas con dolor. Los ejemplos específicos de enfermedades asociadas con cinasa de tirosina receptora incluyen pero no se limitan a, tumores estromales gastrointestinales (GIST), leucemia mielogenosa aguda (AML), cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC), cáncer de seno, cáncer de seno metastático en huesos, enfermedades linfáticas y tumores de célula gigante tenosinovial. Los ejemplos adicionales de enfermedades asociadas con cinasa de tirosina receptora incluyen cáncer de colon (por ejemplo, cáncer de intestino delgado), cáncer de pulmón, cáncer de seno, cáncer pancreático, melanoma (por ejemplo, melanoma maligno y metastático), leucemia mieloide aguda, cáncer de riñon, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, y cáncer de próstata. Los ejemplos de otros cánceres que pueden ser tratados utilizando los métodos de la presente invención incluyen cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de célula renal), glioblastoma, cáncer linfático, tumores de cerebro, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemia de célula-T de adulto (T-ALL), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitica crónica, linfomas (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma CNS primario, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplásica (ALCL), linfomas de célula T cutánea, linfomas de célula disociados pequeños nodulares, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfomas/leucemia de célula T (ATLL), cánceres de linfoma foliculares enteroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfoma de célula grande difusa o de linaje B, linfoma de célula T tipo linfodenopatía angioinmunoblástico (AILD) y linfomas a base de cavidad corporal asociada con HIV), carcinomas embrionales, carcinomas no diferenciados de la rinofaringe (por ejemplo, tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de célula B, carcinomas nasofaríngeos, cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno o cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de los tubos falopianos, carcinoma del endometrio, carcinoma de la cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de la niñez, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS), angiogénesis de tumor, tumor de eje espinal, glioma de tronco cerebral, adenoma de pituitaria, cáncer epidermoide, cáncer de célula escamosa, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo los inducidos por asbestos, por ejemplo, mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres. Los ejemplos de enfermedades linfáticas, o "enfermedades del sistema linfático", que pueden ser tratados utilizando los métodos de la presente invención incluyen afibrinogenemia, anemia, anemia aplásica, anemia hemolítica, anemia no esferocítica congénita, anemia megaloblástica, anemia, perniciosa, anemia de drepanocito, anemia renal, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, deficiencia de antitrombina III, síndrome Bernard-Soulier, trastorno de coagulación de sangre, trastornos de plaquetas de la sangre, síndrome del Nevus Azul, síndrome de Chediak-Higashi, crioglobulinemia, coagulación intravascular diseminada, eosinofilia, enfermedad de Erdheim-Chester, eritroblastosis, síndrome de evans fetal, deficiencia de factor V, deficiencia de factor VII, deficiencia de factor X, deficiencia de factor XI, deficiencia de factor XII, anemia de fanconi, hiperplasia de nodo linfático gigante, enfermedades hematológicas, hemoglobinopatías, hemoglobinuria, enfermedad paroxismal, de hemofilia a, hemofilia b, enfermedad hemorrágica de recién nacido, histiocitosis, histiocitosis, célula de langerhans, histiocitosis, célula de no Langerhans, síndrome de job, leucopenia, linfadenitis, linfangioleiomiomatosis, limfoedema, metemoglobinemia, síndromes mielodisplásicos, mielofibrosis, metaplasia mieloide, trastornos mieloproliferativos, neutropenia, paraproteinemias, deficiencia del conjunto de almacenamiento de plaquetas, policitemia vera, deficiencia de proteína c, deficiencia de proteína s, púrpura, púrpura trombocitopénica, trombocitopénica trombótica, isoinmunización-RH, sarcoidosis, sarcoidosis, esferocitosis, ruptura esplénica, talasemía, trombastenia, trombocitopenia, macroglobulinemia de Waldenstrom, o enfermedad de Von Willebrand.

Además, debido a la expresión de las RTKs tipo III o tipo V en diversas células de tumor, las porciones de enlace, composiciones y métodos de la presente invención pueden ser utilizadas para tratar a un sujeto con un trastorno tumorigénico, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de células de tumor que expresan Kit incluyendo, por ejemplo, tumores estromales gastrointestinales, enfermedad de mastocito y leucemia mielogenosa aguda. Los ejemplos de otros sujetos con trastorno tumorigénico incluyen sujetos que tienen cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de célula renal), glioblastoma, tumores de cerebro, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia de célula T en adulto (T-ALL), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma CNS primario, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplásica (ALCL), linfomas de célula T cutánea, linfomas de célula disociados pequeños nodulares, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfomas/leucemia de célula T (ATLL),, cánceres de linfoma foliculares enteroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfoma de célula grande difusa o de linaje B, linfoma de célula T tipo linfodenopatía angioinmunoblástico (AILD) y linfomas a base de cavidad corporal asociada con HIV), carcinomas embrionales, carcinomas no diferenciados de la rinofaringe (por ejemplo, tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de célula B, carcinomas nasofaríngeos, cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno o cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de los tubos falopianos, carcinoma del endometrio, carcinoma de la cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de la niñez, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS), angiogénesis de tumor, tumor de eje espinal, glioma de tronco cerebral, adenoma de pituitaria, cáncer epidermoide, cáncer de célula escamosa, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo los inducidos por asbestos, por ejemplo, mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanas. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamífero tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, cabras, caballos, pollos, anfibios y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen sujetos humanos que tienen una enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora.

Las porciones (por ejemplo, anticuerpos, partes de enlace de antígeno de los mismos, moléculas pequeñas, moléculas peptídicas, miméticos de anticuerpo, y composiciones) de la presente invención, tienen utilidad adicional en terapia y diagnóstico de una enfermedad asociada con RTK. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas biespecíficas o multiespecíficas, las moléculas pequeñas, o las moléculas peptídicas pueden ser utilizadas para provocar in vivo o in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas: inhibir el crecimiento de y/o exterminar una célula que expresa una RTK (por ejemplo, Kit, un receptor VEGF o PDGFR); transmitir la fagocitosis o ADCC de una célula que expresa una RTK (por ejemplo, Kit, un receptor VEGF o PDGFR) en la presencia de células efectoras humanas; o asegurar el ectodominio de una RTK, por ejemplo, un miembro de la familia RTKs tipo III o tipo V, a un estado inactivo y/o estado monomérico para antagonizar de esta forma la actividad del receptor.

Las rutas de administración adecuadas de las porciones anti-RTK de la presente invención in vivo e in vitro son bien conocidas en la técnica pueden ser seleccionadas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las porciones anti-RTK pueden ser administradas mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutáneo). Las dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición de la porción de enlace.

Tal como se describió previamente, las porciones anti-RTK de la presente invención, pueden ser co-administradas con uno o más de los agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico, o un agente inmunosupresor. La porción puede ser enlazada al agente o puede ser administrada separada del agente. En el último caso (administración separada), la porción de enlace puede ser administrada antes o después en forma concurrente, con el agente o puede ser co-administrada con otras terapias conocidas por ejemplo terapia anti-cáncer, por ejemplo, radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen entre otros, agentes anti-neoplásicos, tales como doxorubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina de cisplatin, carmustina, clorambucil e hidroxiurea de ciclofosfamida las cuales, por sí mismas, son únicamente efectivas en niveles que son no tóxicos o subtóxicos para el paciente. Cisplatin se administra en forma intravenosa como una dosis de 100 mg/dosis cada cuatro semanas y adriamicina se administra en forma intravenosa en una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de las porciones de enlace anti-RTK, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anti-cáncer que operan mediante diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico para las células de tumor humana. Dicha co-administración puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células de tumor que pueden hacerlas no reactivas con la porción de enlace.

Cuando se administran conjugados de molécula de asociado-porción anti-RTK de la presente invención para utilizarse en la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con proliferación celular anormal, se puede utilizar una concentración en la circulación del compuesto administrado de aproximadamente 0.001 µ? a 20 µ? o aproximadamente 0.01 µ M a 5 µ M .

Las dosis para pacientes para administración oral de los compuestos aquí descritos fluctúan normalmente de aproximadamente 1 mg/día a aproximadamente 10,000 mg/día, más normalmente de aproximadamente 10 mg/día hasta aproximadamente 1,000 mg/día, y más normalmente de aproximadamente 50 mg/día hasta aproximadamente 500 mg/día. Manifestado en términos de peso corporal del paciente, el rango de dosificaciones típicas es de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 150 mg/kg/día, más normalmente de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 15 mg/kg/día, y más normalmente de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 mg/kg/día, por ejemplo 5 mg/kg/día o 3 mg/kg/día.

En al menos algunas modalidades, las dosis de pacientes que retardan o inhiben el crecimiento de tumor pueden ser de 1 pmol/kg/día o menos. Por ejemplo, las dosis de pacientes pueden ser de 0.9, 0.6, 0.5, 0.45, 0.3, 0.2, 0.15, ó 0.1 pmol/kg/día o menos (haciendo referencia a los moles del fármaco). Preferentemente, el conjugado de fármaco-porción anti-RTK retarda el crecimiento del tumor cuando se administra en la cantidad de dosificación diaria durante un período de al menos cinco días.

En una modalidad, los conjugados de la presente invención se pueden utilizar para dirigir compuestos (por ejemplo, agentes terapéuticos, etiquetas, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) células que tienen receptores de superficie de célula RTK mediante el enlace de dichos compuestos a la porción de enlace arti-RTK. Por ejemplo, se puede conjugar una porción anti-RTK para cualquiera de los compuestos de toxina descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,281,354 y 6,548,530, la Publicación de Patente Norteamericana Nos. 20030050331, 20030064984, 20030073852 y 20040087497 o los publicados en la Publicación Internacional WO 03/022806, las cuales todas están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Por lo tanto, la presente invención también proporciona métodos para localizar células ex vivo o in vivo que expresan RTK (por ejemplo, con un etiqueta detectable, tal como un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima).

Las células efectoras específicas de objetivo, por ejemplo, células efectoras enlazada a las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, partes de enlace de antígeno de los mismos, moléculas pequeñas o moléculas peptídicas) de la presente invención, también se pueden utilizar como agentes terapéuticos. Las células efectoras para dirección, pueden ser leucoticos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células exterminadoras naturales y otras células que contienen un receptor IgG o IgA. Si se desea, las células efectoras pueden ser obtenidas del sujeto que será tratado. Las células efectoras específicas objetivo pueden ser administradas como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 108- 109 pero variará dependiendo de propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula objetivo, por ejemplo, una célula de tumor que expresa RTK y llevar a cabo la exterminación de células, por ejemplo, mediante fagocitosis. También pueden variar las rutas de administración.

La terapia con células efectoras específicas de objetivo puede ser llevada a cabo junto con otras técnicas para la eliminación de células que ya fueron dirigidas. Por ejemplo, se puede utilizar, junto con quimioterapia, una terapia anti-tumor utilizando las porciones de la presente invención y/o células efectoras que contienen estas composiciones.

La presente invención proporciona además métodos para detectar la presencia de un antígeno RTK humano en una muestra, o medir la cantidad de antígeno RTK humano (por ejemplo, un dominio tipo Ig de Kit RTK humana, receptor VEGF humano o PDGFR), en donde los métodos comprenden contactar la muestra, y una muestra de control, con la porción de enlace RTK, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano u otra porción de enlace, que enlaza específicamente a una RTK humana, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y otra -porción y una RTK humana tal como Kit o un receptor VEGF humano. Posteriormente se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra comparada con la muestra de control, indica la presencia de RTK, por ejemplo, Kit RTK humana, un receptor VEGF humano o la PDGFR RTK en la muestra.

También dentro del alcance de la presente invención se encuentran equipos que comprenden las porciones de enlace anti-RTK (por ejemplo, anticuerpos, partes de enlace de antígeno de los mismos, moléculas pequeñas o moléculas peptídicas) e instrucciones para su uso. El equipo puede contener además uno o más reactivos adicionales, tal como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico o una o más porciones anti-RTK adicionales de la presente invención (por ejemplo, una porción de enlace anti-RTK que tiene una actividad complementaria que enlaza a un epítope en el antígeno RTK, distinta a la primera porción anti-RTK). Los equipos normalmente incluyen una etiqueta que indica el uso proyectado de los contenidos del equipo. El término, etiqueta, incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o dentro del equipo, o que de otra manera lo acompaña.

La presente invención se ilustra en forma adicional a través de los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser construidos como una limitación adicional. Los contenidos de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas mencionados a lo largo de la presente solicitud, así como las figuras, están incorporados en su totalidad de manera expresa a la presente invención como referencia.

EJEMPLOS Introducción de Ejemplos 1 a 19 El factor de célula madre (SCF), es una citocina que transmite sus diversas respuestas celulares mediante el enlace a, y activación de la cinasa de tirosina receptora Kit (también conocida como receptor SCF). Kit se descubrió inicialmente como un oncogen en un retrovirus felino que capturó una forma activada y truncada del receptor de superficie (Besmer y asociados (1986) J Virol 60: 194-203.). SCF está codificado por el locus de acero de múrido (SI), en tanto que Kit está codificada por el locus de manchado blanco dominante (W) en el ratón (Copeland y asociados (1990) Cell 63: 175-183; Huang y asociados (1990) Cell 63: 225-233; Flanagan y Leder (1990) Cell 63: 185-194.; Tan y asociados (1990) Science 247: 209-212; Bernstein y asociados (1990) Ciba Found Symp 148: 158-166; discusión 166-172). SCF funciona como un homodímero no covalente y las formas tanto ancladas con membrana como solubles de SCF generadas mediante la división de ARN alternativa y mediante procesamiento proteolítico han sido descritas (revisión en la Publicación de Ashman (1999) Int J Biochem Cell Biol 31:1037-1051). Kit es un miembro de la familia tipo III de las cinasas de tirosina receptoras (RTK), que también incluyen el PDGF-receptor-a y ß, CSF-1 -receptor (también conocido como receptor M-CSF o Fms), y el receptor Flt3 (también conocido como Flk2) (revisado en las Publicaciones de Ullrich y Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212; Blume-Jensen y asociados (2001) Nature 411: 355-365). Kit está compuesta de un dominio de enlace de ligando extracelular glucosilado (ectodominio) que está conectado a una región citoplásmica por medio de un dominio de transmembrana simple (TM) (revisado en la Publicación de Schlessinger (2000) Ce 11 103: 211-225). El ectodominio de Kit y otros miembros de las RTKs tipo III, todos contienen cinco dominio tipo Ig, en los cuales el segundo y el tercer dominios distales de membrana mostraron desempeñar un papel importante en el reconocimiento de ligando (revisado en la Publicación de Ullrich y Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212). Otras RTKs cuyos dominios de enlace de ligando extracelular están compuestos exclusivamente de múltiples repeticiones tipo Ig, incluyen miembros de la familia de receptor VEGF (tipo 7 Ig), receptor CCK4 (tipo 7 Ig) y receptores FGF (tipo 3 Ig). La región citoplásmica de Kit contiene un dominio de cinasa de tirosina de proteína (PTK) con una región grande de inserto de cinasa; otra marca característica de las RTKs tipo III. El enlace de SCF a Kit conduce a la dimerización de receptor, autofosforilación intermolecular y activación PTK. Se ha propuesto que el cuarto dominio tipo Ig de Kit, sea responsable de la dimerización Kit en repuesta al enlace SCF ya sea monovalente o bivalente (Lev y asociados (1992b) J Biol Chem 267: 15970-15977; Blechman y asociados (1995) Cell 80: 103-113). Sin embargo, otros estudios han demostrado que la dimerización inducida por ligando de Kit es conducida por el enlace bivalente de SCF (Philo y asociados (1996) J Biol Chem 271: 6895-6902; Lemmon y asociados (1997) J Biol Chem 272: 6311-6317).

La caracterización de ratones mutados en el lugar SCF o Kit, ha mostrado que SCF y Kit son requeridas para el desarrollo de células hematopoyéticas, melanocitos, células germinales y células de marcapasos intestinal (revisado en la Publicación de Ashman (1999) Int J Biochem Cell Biol 31:1037-1051). En humanos, las mutaciones de pérdida de función en Kit, origina el rasgo moteado que está caracterizado por la despigmentación del pecho ventral y el abdomen, mechones de cabello color blanco, sordera y constipación (Fleischman y asociados (1991) Proc Nati Acad Sci U S A 88: 0885-10889). Una variedad de mutaciones de ganancia de función en Kit se encontraron en diferentes tipos de cánceres humanos. Se encontraron mutaciones de activación Kit en tumores gastro-intestinales-estromales (GIST), leucemia mieloide aguda (AML) y leucemia de mastocito (MCL) entre otros cánceres. Se identificaron mutaciones en el dominio tipo Ig próximo a la membrana (D5) (exón 8 y 9), en el dominio de yuxtamembrana (JM) (exón 11) y en el dominio de cinasa de tirosina (PTK) (exón 17) (ver la Publicación de Forbes y asociados (2006) COSMIC 2005. BR J. CANCER, 94: 318-22. Base de datos de mutación somática: Catálogo de Mutaciones Somáticas en Cáncer httpJ/www. sanqer.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Aunque existe buena evidencia de que las mutaciones de ganancia de función en los dominios JM y PTK conducen a la activación constitutiva de Kit, mediante la liberación de las restricciones de autoinhibición (Mol y asociados (2004) J Biol Chem. 279: 31655-31663), el mecanismo molecular que subyace a las mutaciones de ganancia de función en D5 del ectodominio aún no es compredido. Existe la necesidad de caracterizar de mejor manera las estructuras de RTKs, tal como Kit y PDGFR, así como SCF, PDGFa/ß y el complejo Kit/SCF enlazado. Dicha caracterización conducirá a la identificación informada de regiones que pueden ser dirigidas con fármacos, farmacéuticos u otros biológicos.

El Factor de Célula Madre (SCF) inicia sus múltiples respuestas celulares enlazando al ectodominio de Kit, dando como resultado la activación de cinasa de tirosina. En algunos de los ejemplos que se encuentran más adelante, se muestra la estructura de cristal de todo el ectodominio de Kit antes y después de la estimulación SCF. Las estructuras muestran que la dimerización Kit es conducida por el enlace SCF, cuyo único papel es llevar dos moléculas Kit juntas. La dimerización de receptor está seguida de cambios en conformación que permiten interacciones laterales entre dominios tipo Ig próximos a la membrana, D4 y D5 de dos moléculas Kit. Los experimentos con células cultivadas muestran que la activación Kit está comprometida por las mutaciones de punta en aminoácidos críticos para la interacción D4-D4. Además, una variedad de mutaciones oncogénicas son mapeadas para la interfase D5-D5. Ya que se conservan en otros receptores las marcas características clave de las estructuras Kit, dimerización de receptor inducida por ligando y residuos críticos en la interfase D4-D4, el mecanismo de estimulación Kit revelado en este reporte puede aplicar para otra activación de receptor. Esto indica que los fármacos o biológicos dirigidos a estas interfases, pueden ser utilizados como terapéuticos.

La aclaración de la estructura de cristal de rayos X de todo el ectodominio de Kit antes y después de la estimulación SCF aquí descrita, ha proporcionado visiones valiosas con respecto al mecanismo de dimerización y activación de Kit inducida por SCF. La estructura muestra que los primeros tres dominios tipo Ig de Kit, designados D1, D2 y D3 son responsables del enlace SCF. El papel principal del enlace SCF, es reticular dos moléculas Kit para incrementar la concentración local de Kit en la membrana celular. Esto facilita un cambio de conformación grande en las regiones próximas de la membrana de Kit, dando como resultado la interacción homotípica entre D4 o D5 de las moléculas Kit vecinas. Las interacciones laterales entre D4 de dos moléculas Kit vecinas, ocurre mediante contactos directos a través de dos pares de puentes de sal de los lazos EF y de cada promotor D4. El dominio próximo de membrana D5 proporciona interacciones indirectas adicionales entre las moléculas Kit vecinas, para estabilizar en forma adicional y colocar la parte próxima a la membrana del ectodominio, en una distancia y orientación que permite la activación de la cinasa de tirosina citoplásmica.

En diversos de los ejemplos que se encuentran más adelante, se describen las estructuras de cristal de todo el ectodominio de Kit en forma tanto monomérica como homodímericas inducidas por SCF (complejo SCF-Kit 2:2). Las listas detalladas de la forma monomérica no ocupada en una resolución de 3.0 A y la forma homodimérica inducida por SCF en una resolución 3.0 A, proporcionan nuevas visiones con respecto al mecanismo de activación de Kit y otras RTKs. Los expertos en la técnica podrán apreciar que los experimentos que se describen más adelante pueden llevarse a cabo con otras RTKs. Las secuencias RTK de ejemplo que pueden ser utilizadas a través de los métodos de la presente invención se incluyen, pero no se limitan a la secuencia de Referencia Genbank para el mARN Kit NM_000222.2 (que codifica la proteína NP_000213.1; MRGARGAWDFLCVLLLLLRVQTGSSQPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRVGDEIRL LCTDPGFVKWTFEILDETNEN QNEWITE AEATNTGKYTCTN HGLSNSIYVF VRDPA LFLVDRSLYGKEDNDTLVRCPLTDPEVTNYSLKGCQGKPLPÍ DLRFIPD P AGIMI SV RAYHRLCLHCSVDQEG SVLSE FIL VRPAF AVPVVSVS AS YLLREGEEFTVTCTI DVSSSVYSTWKRENSQT LQE YNSWHHGDFNYERQA TLTISSARVNDSGVFMCYANNTFGSANVTTTLEVVD GFINIFPMINTTVFVNDG ENVDLIVEYEAFP PEHQQWIYMNRTFTDKWEDYP SENESNIRYVSELHLTRL GTEGGTYTFLVSNSDVNAAIAFNVYVNTKPEILTYDRLVNGMLQCVAAGFPEP TIDWYFCPGTEQRCSASVLPVDVQTLNSSGPPFGKLVVQSSIDSSAFKHNGTVEC KAYNDVGKTSAYFNFAF GNN EQIHPHTLFTPLLIGFVIVAGMMCIIVMILTYK YLQKPMYEVQWKVVEEINGNNYVYIDPTQLPYDHKWEFPRNRLSFGKTLGAG AFG VVEATAYGLI SDAAMTVAVKMLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNHM NIVNLLGACTIGGPTLVITEYCCYGDLLNFLRRKRDSFICS QEDHAEAALYKNL LHS ESSCSDSTNEYMDMKPGVSYVVPTKADKRRSVRIGSYIERDVTPAIMEDD ELALDLEDLLSFSYQVA GMAFLASKNCIHRDLAARNILLTHGRITKICDFGLAR DI NDSNYVVKGNARLPVKWMAPESIFNCVYTFESDVWSYGIFLWELFSLGSSP YPGMPVDSKFY MI EGFRMLSPEHAPAEMYDIMKTCWDADPL RPTFKQIVQ LIEKQISESTNHIYSNLANCSPNRQKPVVDHSVRINSVGSTASSSQPLLVHDDV (SEC ID NO: 92)) o la secuencia de referencia Genbank de la variante 2 del mARN Kit N M_001093772.1 (que codifica la proteína NP_001087241.1 ; MRGARGAWDFLCVLLLLLRVQTGSSQPSVSPGEPSPPSIHPGKSDLIVRVGDEIRL LCTDPGFVKWTFEILDETNENKQNEWITEKAEATNTGKYTCTNKHGLSNSIYVF VRDPA LFLVDRSLYG EDNDTLVRCPLTDPEVTNYSLKGCQG PLP DLRFIPD PKAGIMIKSVKRAYHRLCLHCSVDQEGKSVLSEKFILKVRPAFKAVPVVSVSKAS YLLREGEEFTVTCTI DVSSSVYSTW RENSQTKLQEKYNSWHHGDFNYERQA TLTISSARVNDSGVFMCYANNTFGSANVTTTLEVVD GFE IFPMINTTVFVNDG ENVDLIVEYEAFP PEHQQWIYMNRTFTDKWEDYPKSENESNIRYVSELHLTRL KGTEGGTYTFLVSNSDVNAAIAFNVYVNTKPEILTYDRLVNGMLQCVAAGFPEP T1DWYFCPGTEQRCSASVLPVDVQTLNSSGPPFG LVVQSSIDSSAFKHNGTVEC KAYNDVGKTSAYFNFAFKEQIHPHTLFTPLLIGFVIVAGMMCIIVMILTYKYLQKP MYEVQWKVVEEINGNNYVYIDPTQLPYDHKWEFPRNRLSFGKTLGAGAFGKV VEATAYGLIKSDAAMTVAV MLKPSAHLTEREALMSELKVLSYLGNHMNIVNLL GACTIGGPTLVITEYCCYGDLLNFLRRKRDSFICS QEDHAEAALY NLLHSKES SCSDSTNEYMDM PGVSYVVPT ADKRRSVRIGSYIERDVTPAIMEDDELALDL EDLLSFSYQVA GMAFLAS NCIHRDLAARNILLTHGRIT ICDFGLARDI NDS NYVVKGNARLPV WMAPESIFNCVYTFESDVWSYGIFLWELFSLGSSPYPGMP VDSKFYKMI EGFRMLSPEHAPAEMYDIMKTCWDADPLKRPTFKQIVQLIEKQI SESTNHIYSNLANCSPNRQ PVVDHSVRINSVGSTASSSQPLLVHDDV SEC ID NO: 93)), en donde las proteínas están diseñadas mediante el código de aminoácidos de una letra estándar.

Ejemplo 1: Expresión, Purificación y Cristalización de SCF y Kit Todo el ectodominio de Kit compuesto de cinco dominios tipo Ig designados D1, D2, D3, D4 y D5, fue expresado en células de insecto utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Los monómeros de ectodominio Kit purificados o los homodímeros de ectodominio Kit inducidos con SCF (complejo SCF-Kit 2:2) fueron sometidos cada uno a clasificación extensa para crecimiento y optimización de cristal, seguido de la determinación de sus estructuras de cristal.

Expresión y purificación de proteína Un ectodominio Kit soluble (aminoácidos 1-519) que contienen una etiqueta de polihistidina en el C-término, fue expresado en células de insecto (Sf9) utilizando el sistema de expresión de baculovirus. El ectodominio Kit fue purificado mediante Ni-quelato, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare). Después de la desglucosilación parcial utilizando la endo-glucosidasa F 1 , el ectodominio fue purificado en forma adicional mediante cromatografía de intercambio de aniones (MonoQ, GE Healthcare). Se expresó SCF (1-141), se redobló y se purificó tal como se describió anteriormente (Langley y asociados (1994) Arch Biochem Biophys 311: 55-61; Zhang y asociados (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97: .7732-7737).

Líneas celulares v vectores de expresión Se cultivaron células HEK y NIH3T3 en un DMEM suplementado con 10% de FCS y 10% de CS, respectivamente. Antes del estímulo SCF, las células se dejaron sin alimento durante la noche en un medio libre de suero tal como se describió previamente (Kouhara y asociados (1997) Cell 30: 693-702). Se llevó a cabo la transfección con Lipofectamin (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cADN de la Kit de longitud total fue subclonado en el vector de expresión RK5 para transfección temporal y en el vector pBABE/puro para expresión estable (Kouhara y asociados (1997) Cell 30: 693-702). Se generaron anticuerpos anti-Kit inmunizando conejos con el ectodominio Kit recombinante. Se utilizaron anticuerpos anti-Kit monoclonales (Santa Cruz) para inmunomanchado. Se comparan anticuerpos de anti-fosfotirosina (anti-pTyr) en Upstate Biotechnology.

Cristalización y recolección de datos Las muestras del ectodominio Kit solo en complejo con SCF, fueron sometidas a clasificación extensa para crecimiento y optimización de cristal. Los cristales del ectodominio desglucosilado de dimensiones aproximadas de 0.12x0.1x0.05 mm, fueron obtenidos en amortiguador de fosfato con polietilenglicol (PEG) como el precipitante (0.1 M de amortiguador Na-Pi pH 6.0, 0.2 M KCI, 12% PEG 400) a una temperatura de 4o. Todos los cristales se sumergieron en una solución de depósito suplementada con 5 a 8% de glicerol durante varios segundos; se enfriaron en forma instantánea y se mantuvieron en una corriente de gas de nitrógeno en 100°K durante la recolección de datos. Los cristales pertenecieron al grupo R3 del espacio romboidal con dimensiones de célula unitarias de a = 162.4 A y c = 67.1 A en una configuración de celosía hexagonal, con una molécula por unidad asimétrica. Se prepararon derivados de platino bromo y yodo de Kit enjuagando los cristales en una solución de depósito que contiene reactivos de átomos pesados en rangos de concentración de 0.1 mM a 50 mM en 277 K durante desde algunos segundos hasta 10 días.

Los cristales del complejo SCF-Kit se crecieron con polietilenglicol (PEG) en la forma del precipitante (0.2 M de sulfato de amonio, 8 a 12% de PEG 8000, 5 a 8% de etilenglicol en un pH de 7.0-8.5) a una temperatura de 4°C y se recolectaron los datos de difracción a una resolución de 3.5 A con un detector quantum-210 CCD ADSD en la línea de rayo X25 de NSLS, Brookhaven National Laboratory. Los cristales pertenecen al grupo del espacio monoclínico C2 con dimensiones de célula unitaria de a = 269.5 A, b = 52.1 A, c = 189.8 A, p = 108.2°, los cuales estuvieron comprendidos de dos conjuntos de moléculas SCF y Kit en la unidad asimétrica. Todos los grupos de datos fueron procesados y escalados utilizando DENZO y SCALEPACK y el paquete del programa HKL2000 (Otwinowski y asociados (1997) Methods Enzymol. 276: 307-326). En la tabla 1A se resumen las estadísticas de la recolección de datos.

Ejemplo 2: Determinación de estructura Se calcularon las fases experimentales utilizando el reemplazo isomorfo múltiple con dispersión anómala (MIRAS), y mediante difracción anómala de longitud de onda múltiple (MAD) en una resolución de 3.0 A (tabla 1A). Los mapas de densidad de electrón resultantes mostraron densidad de electrón continua de estructuras de emparedado ß, y los límites de proteína-solvente claros. El modelo molecular del ectodominio Kit monomérico, fue construido en forma manual en los mapas de densidad de electrón experimentales. La estructura fue refinada a una resolución de 3.0 A utilizando el conjunto de datos nativos para un factor-R cristalográfico de 25.4% y un factor-R libre del 29.6% (tabla 1B). Se resolvió la estructura del complejo SCF-Kit 2:2 mediante reemplazo molecular utilizando la estructura de la forma monomérica descrita en este reporte, y la estructura de SCF (Zhang y asociados (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97: 7732-7737; recuperable del Banco de Datos de Proteína con el código: 1EXZ) como modelos de búsqueda. La estructura fue refinada a una resolución de 3.5 A utilizando el conjunto de datos nativos para un factor-R cristalográfico de 24.9%, y un factor-R libre de 29.5% (Tablas 1A y 1B). Se produjeron imágenes moleculares utilizando el software Pymol (pymol.sourceforqe.net) y CCP4MG (Potterton y asociados (2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2288-2294). Se han depositado las coordenadas atómicas y factores de estructura del monómero Kit y el complejo SCF-Kit en el Banco de Datos de Proteína (rcsb.org/pdb) con código de acceso 2EC8 y 2E9W, respectivamente.

Ta b l a 1 A . R e co l e cci ó n d e d ato s y e sta d í sti ca s d e fa s e Kit SCF-Kit Nativo K2Pt(N02)4 Nat2 K2Pt(N02)4 2Pt(N02)4 2Pt(N02)4 Nativo (Pico) (inflexión) (remoto) Recolección de datos Fuente rayos X NSLS X28C NSLS X6A NSLS X6A NSLS 6A NSLS 6A NSLS 6A NSLS X25 Fecha 2006-Abr-3 2006-Jun-10 2008-Jun-12 2008-Jun-11 2006-Jun-11 2006-Jun-11 1999-Jun-29 Longitud de onda (A) 1.1000 1.0716 1.6000 1.0716 1.0722 0.9600 1.2500 Grupo de espacio R3 R3 R3 R3 R3 R3 C2 Dimensiones de célula unitaria (ilegible) (A) 162.25 162.09 161.61 162.02 162.44 162.27 269.48 b (A) 162 25 162.09 161.61 162.02 162.44 162.27 52.07 c (A) 67.59 56.94 67.82 69.02 69.13 Ilegible 189.79 ß (°) 103.24 Resolución (A) 50-3.0 50-3.1 50-3.0 50-3.3 50-3.3 50-3.3 50-3.5 (3.11-3.0) (3.2-3.1 ) (3.11-3.80) (3.42-3.3) (3.42-3.3) (3.42-3.3) (3.63-3.50) No. de reflecciones totales 156126 68861 128381 76599 79043 79256 113481 No. de reflecciones únicas 13342 23535 26281 19488 18558 19473 31962 Terminación (%) 99.8 (100) 99.2(99.6) 99.5 (97.1 ) 95.4 (97.2) 95.04 (97.0) 95.8 (98.4) 96.5 (91 ) (ilegible) 117 (7.5) 113 (3.0) 21.7 (9.5) 13.0 (5.9) 11.6 (4.8) 11.2 (4.7) 19.1 (6.6) (ilegible) 7.6 (17.0) 8.6 (32.1 ) 8.5 (20.8) 11.1 (22.6) 10.7 (27.0) 11.9 (27.5) 6.1 (17.6) Estadísticas de fase MIRAS MAD Resolución (A) 50-3.0 50-3.0 50-3.0 50-3.3 50-3.3 50-3.3 No de sitios 3 6 3 3 3 (ilegible) 22.0 11.6 (Ilegible) 0.85/0.68 0.80/0.61 0.78 0.74/0.81 0.81/0.96 Energía de fase (ilegible) 0.88/1.48 1.07/0.85 1.10 1.32/1.08 0.87/0.16 l(legible) 0.50 0.48 Los valores en paréntesis indican las estadísticas de las interfases de resolución más altas, (a) Terminación = (número de reflexiones independientes)/(reflexiones teóricas totales), (c) R = (ilegible), en donde (ilegible) es la intensidad observada y (¡legible) es la intensidad promediada obtenida de múltiples observaciones de reflexiones relacionadas por simetría, (c) (ilegible) (d) (ilegible) (e) Potencia de fase: (ilegible), en donde Fph y Fp son las amplitudes de factor-estructura derivadas y nativas, Fh es la amplitud de estructura de átomo pesado, respectivamente. E es la carencia residual de error de cierre, (i) <FOM> es la figura de (ilegible) mérito promedio.

Tabla 1B. Estadísticas de refinación Resolución (A) 27.7-3.0 39.0-3.5 No. de reflexiones (trabajo/prueba) 12521/650 30351/1594 Rcris.(a)/R|jbre( ) (%) 25.4/29.5 24.9/29.5 No. de átomos Proteína 3498 9064 Aguas 0 0 Carbohidrato 70 84 Factor-B promedio (A2) 31.6 75.2 R.m.s.d. del ideal (c) Longitudes de enlace (A) 0.015 0.013 Ángulos de enlace (°) 1.8 1.9 Cualidad de trazo de Ramachandran Más favorecido (%) 74.4 73.5 Favorecido en forma adicional (%) 24.4 24.5 Permitido de manera generosa (%) 1.5 2.0 No permitido (%) 0 0 Código PDB 2EC8 2E9W (a) Rcrist = (ilegible) en donde F(ilegible) y F(ilegible) son los factores de estructura observados y calculados, respectivamente, (b) Riñese calcula del 5% de reflexiones eliminadas antes de la refinación, (c) R.m.s.d., desviación de mínimos cuadrados.

Ejemplo 3: Análisis de la Estructura del ectodominio Kit Análisis General de Estructura de Ectodominio El ectodominio Kit muestra una forma de serpentina alargada con dimensiones aproximadas de 170 x 60 x 50 A (figura 1A). Los dominios D1, D2, D3, D4 y D5 de Kit exhiben un doblez de la superfamilia de inmunpglobulina (IgSF) típica, compuesta de ocho hebras ß, designadas ABCC'DEFG, ensamblada en un emparedado ß que consiste en dos hojas ß anti-paralelas (figura 1A). D1, D2, D3 y D5 cada uno contiene un enlace de disulfuro conservado que conecta a los residuos de cisteína en B5 y F5 (quinto aminoácido de la hebra B y F, respectivamente); posiciones que puentea las dos hojas ß para formar el centro del núcleo hidrofóbico del doblez tipo Ig (Harpaz y Chothia (1994) J Mol Biol 238: 528-539). D2 y D5 contienen dos enlaces de disulfuro y D4 no contiene ningún residuo de cisteína, sin embargo, se mantiene la integridad del doblez tipo Ig de D4 incluso aunque se reemplazan los residuos de cisteína conservados en B5 y F5 a través de los residuos de valina y fenilalanina, respectivamente.

El ángulo entre D1 y D2 a lo largo del eje de los dos dominios es de 76° (figura 1A, B) semejando la orientación entre el primero y segundo dominios tipo Ig del receptor de interleucina-1 ß (Vigers y asociados (1997) Nature, 386: 190-194). En contraste, el ángulo entre D2 y D3 es de 150°, entre D3 y D4 es de 119° y entre D4 y D5 es de 162°. La orientación entre hojas ß ABED y A'GFC para los diferentes dominios tipo Ig, son de -180° para D1-D2, -180° para D2-D3, -90° para D3-D4 y -180° para D4-D5 (figura 1).

La superposición de los cinco dominios tipo Kit del ectodominio Kit con telokina (Holden y asociados (1992) J. Mol.

Biol. 227: 840-851) utilizada como un estándar para los dobleces-lg, revela una desviación de mínimos cuadrados (r.m.s.) de 1.5-2.9 A para átomos Ca. D2 es el más divergente entre los cinco dominios tipo Kit Ig (figura 8), tal como lo revelan sus valores r.m.s.d. más altos, cuando están superimpuestos con telokina. Con base en la conservación estructural de los aminoácidos clave en los dominios tipo Ig y su topología estructural secundaria (Harpaz y asociados (1994) J Mol Biol 238: 528-539; Halaby y asociados (1999) Protein Eng 12: 563-571), D1, D2, D3 y D4 pertenecen al subconjunto-l y D5 está relacionado con los subconjuntos C2 y IgCAM de IgSF. Además, entre los 20 residuos de huella estructuralmente conservados de IgSF (Harpaz y asociados (1994) J Mol Biol 238: 528-539), se conservaron 10 a 14 residuos en los cinco dominios tipo Ig de Kit (Tabla 2).

Tabla 2. 20 de los residuos de huella clave de IgSF para dominios Kit y Telokina (código PDB: 1TLK) como el conjunto-l lgSF(1) tetípico Posición D1 D2 D3 04 D5 Telokina Característica A'B1 Gly51 Asp129 Gly226 Gly326 Asn423 Gly56 Gly B1 Ile54 Thr132 Phe229 Val331 Gly424 Ala59 Alifático B3 Leu56 Valí 34 Val231 Leu333 Leu426 Phe61 Hidrofóbica grande B5 Cys58 Cys136 Cys233 Val335 Cys428 Cys63 Cys B7 Asp60 Leu 33 Ile235 Tyr337 Ala430 Val65 Neutral o hidrofóbica C2 (Phe63) Tyr1 6 Ser244 Gln346 Ile436 Val73 Hidrofóbica C4 Trp66 Leu 148 ?f246 Trp348 Trp440 Trp75 Trp CD - (Leu 56) (Leu253) Phe355 - Val82 Hidrofóbica grande D1 - (Asp159) (Gln258) (Lys358) - His87 Puente básico y de forma de sal D2 - (Leu160) (Glu257) (Trp359) - Phe88 Hidrofóbica E4 Trp82 Ile170 Leu275 Leu377 Ile478 Leu100 Hidrofóbica, casi Leu E6 Thr84 Ile172 Ile277 Leu379 Ser480 Ile102 Hidrofóbica EF2 Ala87 Valí 75 Ala280 Leu382 - Valí 05 Hidrofóbica EF6 Asn91 Tyr179 Asp284 Glu386 - Asp109 Asp F1 Gly93 Leu 182 Gly286 Gly388 Gly487 Alai 11 Gly o Ala o (Asp) F3 Tyr95 Leu 184 Phe288 Tyr390 Val489 Tyr113 Tyr F5 Cys97 Cys186 Cys290 Phe392 Cys491 Cys115 Cys G6 Ile107 Phe204 Thr303 Phe405 Phe504 Ala 128 Hidrofóbica G8 Valí 09 Leu202 Leu305 Val407 Phe506 Leu 130 Hidrofóbica G10 Valí 11 Val210 Val307 Val409 - Val 132 Hidrofóbica (1) Las posiciones de 20 de los residuos de huella clave y las características típicas de cada residuo de huella se muestran en la primera y última columna, las cuales son definidas por Harpaz y Chothia.1:994 Análisis Detallado de la Estructura de dominios tipo Kit lg Kit D1. El doblez D1 es un emparedado ß compuesto de dos hojas ß. Una hoja está formada a través de tres hebras, A, B y E, y la segunda hoja está compuesta de cinco hebras, A', G, F, C y C'(ABE/A'GFCC). La primera hebra, interrumpida por una conformación-cis en Pro41, está dividida en dos hebras más cortas de A y A', las cuales se emparejan con las hebras B y G, respectivamente. Un enlace de disulfuro que conecta Cys58 de B5 con Cys97 de F5, puentea las dos hojas ß. Una hebra C bastante larga, que ¡nteractúa con la hebra C, dirige el extremo C-terminal de la cadena de polipéptido hacia la parte superior de D1, la cual está conectada directamente a la hebra E. Sobre las bases de la nomenclatura del dominio tipo lg, D1 pertenece al subconjunto 12 de IgSF (Casasnovas y asociados (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95: 4134-4139).

Kit D2. D2 consiste en la hoja-ß pequeña formada mediante las hebras B, E y D y la segunda hoja ß compuesta de las hebras A', G, F y C (BED/A'GFC), así como de una hélice adicional en el cruce entre las hebras E y F (residuos 177-179). Aunque 11 de 20 residuos característicos del conjunto I de IgSF son identificados en D2, este dominio tipo lg difiere de un conjunto 11 estándar de IgSF en una cantidad de formas. D2 tiene un residuo de Leu en la posición C4, en tanto que otro conjunto 11 de IgSF tienen una Trp conservada. El patrón de enlaces de hidrógeno en la hebra B, es alterado debido a la formación de dos hebras ß cortas, referidas como las hebras B y B'. La hebra B' adicional está alineada con la hebra A, formando una hoja ß corta con una topología AB'. La hebra G se divide en dos hebras cortas, G (parte inferior) y G' (parte superior), debido a un inserto en los aminoácidos 197-199, que da como resultado la formación de una hoja ß con una hebra A'. La interrupción del patrón de enlace de hidrógeno originado por una "enroscadura" en la hebra G en los residuos 197-199, está compensada por los enlaces de hidrógeno entre las cadenas laterales de Ser197 y la amida de cadena principal de Cys186. En forma notable, Ser197 está conservado como un residuo Ser o Thr en Kit de diferentes especies, y otras RTKs tipo III. D2 contiene un enlace de disulfuro adicional, entre Cys151 y Cys183 que puentea el lazo CD con el extremo de la hebra F para proporcionar estabilidad adicional a la hebra C y al lazo D. El puente de disulfuro adicional puede compensar la red reducida de enlaces de hidrógeno entre las hebras C y F. Estos dos Cys están altamente conservados en Kit de pez cebra a humano.

Kit D3. D3 está compuesto de dos grupos de hojas ß (ABED/A'GFC) que pertenecen a su conjunto II de IgSF. Las dos hojas ß están puenteadas por un enlace de disulfuro entre Cys233 en la hebra B y Cys290 en la hebra F. La comparación de las estructuras de telokina (código PDB: 1TLK) y D3 muestran una calificación-Z de 10.4 y una desviación r.m.s. de 2.0 A para los 98 residuos Ca alineados de D3.

Kit D4. Aunque D4 carece de un enlace de disulfuro característico entre las cisteínas en B5 y F5, D4 mantiene una topología IgSF. Además, 13 de los 20 residuos de huella del conjunto-l IgSF están conservados en D4. La integridad estructural de D4 se conserva mediante interacciones entre residuos alifáticos (Val335) y aromáticos (Phe392) enterrados presentes B5 y F5, respectivamente, que constituyen parte del núcleo hidrofóbico del dominio. La comparación estructural utilizando DALI muestra entre los dominios tipo Kit Ig, D4 es el más similar a telokina (recuperación con el Código de Banco de Datos de Proteína: 1TLK), con una calificación-Z de 11.9 y una r.m.s.d. de 1.5 A para los 89 residuos Ca alineados. La distancia de 8.6 A entre Ca-Ca de Val335 y Phe392 está dentro del rango de distancia observado entre posiciones similares en los dominios IgSF que carecen de un enlace de disulfuro que conecta B5 y F5. Por ejemplo, el dominio M5 tipo Ig (Código de Banco de Datos de Proteína: 1TNM); también carece de un enlace de disulfuro, superimpuesto con una r.m.s.d de 2 A con D4 y tiene una distancia de 8.9 A entre las posiciones B5 y F5. D4 está compuesto de dos hojas ß que contiene cada uno cuatro hebras con el ajuste ABED/A'GFC. Thr321, el primer residuo de la hebra A', forma contactos Van der Waals con el anillo aromático del Phe405 altamente conservado. En forma notable, el lazo CD que está doblado hacia arriba hacia la parte superior del dominio, es estabilizado por tres interacciones principales. La cadena lateral de Thr354 forma enlaces de hidrógeno con una cadena lateral de Gln347 y un carbonilo de cadena principal de Trp348. Los residuos hidrofóbicos (Trp348, Tyr350, Trp359 Val377, Leu379 y Tyr390), localizados en el borde del centro hidrofóbico proporcionan un ambiente hidrofóbico para Phe355. Aunque el lazo CD no exhibe una conservación de secuencia notable, este lazo contiene ocho aminoácidos en las familias RTKs tipo III.

Kit D5. D5 pertenece a C2 y el subconjunto IgCAM de IgSF y 10 de los 20 residuos de huella están conservados en este módulo. D5 exhibe una topología ABED/CFG, un enlace de disulfuro entre Cys428 de B5 y Cys491 de F5 que puentea las dos hojas ß y un segundo enlace de disulfuro que puentea la hebra C y el lazo CD. Los dos enlaces de disulfuro están conservados en todas las RTKs Kit y tipo III. En forma notable, la mitad superior de D5, se asemeja al tercer Ig de la molécula de adhesión de célula neuronal.

Axonin-1/TAG-1 (Código de Banco de Datos de Proteína 1CS6). Se pueden identificar marcas características diversas, aunque en un menor grado en Telokina (Código de Banco de Datos de Proteína 1FHG), FGFR (Código de Banco de Datos de Proteína 1CVS) y RTK Musk (Código de Banco de Datos de Proteína 2IEP). Estos incluyen dos residuos Ala (Ala430 y Ala493), en proximidad con el enlace de disulfuro que conecta B5 con F5; la presencia de pequeñas cadenas laterales en esta región, permite un empaque cerrado en la parte superior del dominio. La segunda marca característica es un reajuste de anillo de los residuos Pro y Gly, Pro413, Gly432, Pro436 y Gly498 en las hebras A, B, C y G, respectivamente. La tercera marca característica es la presencia de un individuo Asn en F9 (Asn495) que forma enlaces de hidrógeno con cadenas principales de Val497 y Pro434 del lazo FG y BC, respectivamente. Tomadas juntas, estas tres marcas características en la parte superior de D5, dan como resultado una configuración empacada en forma justa similar a la configuración de dominios tipo Ig de las proteínas de adhesión celular.

Ejemplo 4: Interacciones de dominio tipo Ig en una forma monomérica Kit Las interacciones de ¡nter-dominio entre los dominios 5 Ig de Kit son responsables de mantener la topología general de los monómeros de ectodominio Kit (figura 1). La orientación de D1 relativa D2, es determinada por el área de superficie enterrada extensa que es originada por las numerosas interacciones entre los dos dominios tipo Ig (figura 1B). El área de superficie enterrada de 1240 A2 en la interfase D1-D2, es mucho mayor que las áreas de superficie enterradas de la mayor parte de las interfases de interdominio tipo Ig de las estructuras IgSF de dominio múltiple tipo varilla (Su y asociados (1998) Science 281: 991-995), incluyendo otras tres interfases ínter dominio tipo Ig en el ectodominio Kit que fluctúan entre 500 y 800 A2. Esta interfase está formada principalmente por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas entre las hebras A' y G, los lazos EF y CC de D1 con una región N-terminal de la hebra A, el extremo C-terminal de la hebra B, el lazo BC y DE de D2 (figura 1B). Además, muchos residuos en la interfase D1-D2, incluyendo aminoácidos de las hebras G de D1, la región enlazadora que conecta D1 y D2 y el lazo BC de D2 se conservan en Kit de diferentes especies (figura 1B).

El área de superficie enterrada de la interfase D2-D3 es de aproximadamente 780 A2. La interfase D2-D3 está compuesta de un pequeño parche hidrofóbico rodeado por dos interacciones electrostáticas. Esta interfase se forma a través de una interacción entre el lazo EF de D2 y el lazo D3 de D3 y las interacciones entre la región enlazadora D2-D3 con los lazos FG y BC de D3 (figura 1C). El área de superficie enterrada de la interfase D3-D4, es de aproximadamente 570 A2. D3 y D4 interactúan principalmente a través de las hebras A' y G de D3 con los lazos Be y E de D4 (figura 1D). La longitud de la interfase D3-D4 es de aproximadamente 20A debido al ajuste angular de D4 relativo a D3 con un ángulo de 119° a lo largo del eje largo de los dos dominios tipo Ig. La interfase D4-D5 forma un área de superficie enterrada de 760 A2, transmitida principalmente por interacciones hidrofóbicas (figura 1E). La interfase se forma mediante interacciones entre las hebras A, G y F de D4, con los lazos BC y DE de D5, así como con la región enlazadora D4-D5 (figura 1E).

Información Detallada de Dominio por Dominio con respecto a las interacciones de Inter dominio tipo Ig en monómeros Kit Interfase D1-D2. Las interacciones hidrofóbicas entre los residuos Ile47, Ile70, Leu71, Ala89, Tyr108 y Phe110 de D1 y Leu119, Pro137, Leu138, Pro141, Pro166 y la cadena lateral de Lys167 de D2, estabilizan las interacciones interdominio (figura 1B). Existen dos interacciones electrostáticas importantes en la región que rodea el parche hidrofóbico incluyendo interacciones entre Argl12 de D1 y Asp140 de D2, e interacciones entre Asp72 de D1 y Argl35 de D2 (figura 1B).

Interfase D2-D3. El parche hidrofóbico está compuesto de la parte alifática de Arg177 y las cadenas laterales de Pro206, Phe208, Val238 y Phe267. La interacción electrostática implica enlaces de hidrógeno entre las cadenas laterales de Glul28 y Asp129 de D2 con Lys209 de D3 (figura 1C). Un puente de sal entre la cadena lateral de Argl77 y la cadena lateral de Glu128, estabiliza la posición de la cadena lateral de Arg177 y la cadena lateral de Pro206 en D2 y Phe267 en D3, para crear un ambiente hidrofóbico para la parte alifática de la cadena lateral de Arg177 en D2 (figura 1C). Se transmite una segunda interacción electrostática a través de las cadenas laterales de Arg181 en D2 con la cadena lateral de Asp266 de D3.

Interfase D3-D4. Las interacciones hidrofóbicas en la interfase D3-D4 incluyen las que están entre Val308 y Leu222 de D3, y Phe312, Phe340, y Ile371 de D4. La interfase D3-D4 cubre un área enterrada más pequeña que las otras interfases de interdominio tipo Ig (figura 1D).

Interfase D4-D5. El parche hidrofóbico en las interfases D4-D5 incluye Phe324 y Tyr408 de las hebras A y G de D4 y Phe433 del lazo BC de D5, respectivamente. Además, los contactos van-der-Waals contribuyen a la estabilización de la interfase que rodea el parche hidrofóbico; Phe324, Gly384, Thr389, Tyr408, Asn410, Thr411 y Met351 de D4 que interactúan con Val497, Phe433, Gly470, Phe649 y Lys471 de D5 (figura 1E).

Ejemplo 5: Análisis de la estructura general del complejo SCF-Kit enlazado La estructura del complejo SCF-Kit muestra una estequiometría de 2:2, en donde dos conjuntos de complejos 1:1 en la unidad asimétrica están relacionados por una simetría de dos dobleces no cristalográfica (figura 2). El complejo SCF-Kit 2:2 observado en la celosía de cristal es consistente con experimentos que demuestran que la dimerización Kit es conducida por el ligando SCF dimérico (Philo y asociados (1996) J Biol Chem 271: 6895-6902; Lemmon y asociados (1997) J Biol Chem 272: 6311-6317). Los dos conjuntos de ectodominios Kit y moléculas SCF parecen una letra "A" volteada con dimensiones aproximadas de 170 x 130 x 70 A (figura 2A y figura 9).

La estructura general de SCF enlazado a Kit, es similar a las estructuras descritas previamente de SCF libre (Zhang y asociados (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97: 7732-7737; Jiang y asociados (2000) Embo J 19: 3192-3203). La estructura del complejo SCF-Kit 2:2 permite que un promotor SCF individual, enlace directamente a D1, D2 y D3 de un promotor Kit individual (figura 2B). En consecuencia, un promotor de receptor simple forma un complejo simétrico con una superficie relacionada de dos dobleces similar en un promotor SCF. La di merización de Kit también es transmitida por interacciones homotípicas entre los dos dominios tipo Ig próximos de membrana de Kit, es decir, mediante interacciones D4-D4 y D5-D5 (figura 2B). Esto da como resultado configuraciones dramáticamente alteradas de D4 y D5, relativas al resto de la molécula que lleva el C-término dentro de 15 A de cada uno de los otros en forma cercana al lugar en donde conectan con el dominio de transmembrana (figura 2B y figura 9). La estructura también está caracterizada por la existencia de una cavidad grande en el centro del complejo con dimensiones de ~ 50x50x15 A (figura 2B). La estructura de cristal demuestra que cada promotor de SCF, enlace exclusivamente a una molécula Kit simple y que la dimerización de receptor es operada por dímeros SCF que facilitan las interacciones receptor-receptor adicionales.

Ejemplo 6: Análisis de la región de enlace SCF de Kit SCF está enlazado a una superficie cóncava formada por D1, D2 y D3 en Kit en una configuración en la cual se orienta el manojo de cuatro hélices de SCF en forma perpendicular hacia el eje largo de D1, D2 y D3 y el C-término de SCF y Kit se orientan en direcciones opuestas (figura 2, 3 y figura 9). El área de superficie accesible mediante solvente enterrada en la interfase entre Kit y cada uno de los promotores SCF es de aproximadamente 2060 A2; un área de superficie enterrada que está dentro del rango de las interfases de receptor de ligando conocidas. Es posible dividir la interfase SCF-Kit en tres sitios de enlace (figura 3A, B, tabla 2 y tabla 3). El sitio I está localizado en D1, el Sitio II está localizado en D2 y la región enlazadora D2-D3 y el sitio III está localizado en D3. Las áreas de superficie enterradas de Sitio I, II y III son de aproximadamente 280, 770 y 1010 A2, respectivamente.

Sitio-I El lazo ctC-132 de SCF está alineado en forma perpendicular a la hebra C de D1 tal como se presenta en la figura 3C. Asp72, Glu73 y Thr74 de D1 y Lys99', Ser101' y Phe102' de SCF están localizadas en forma cercana en una distancia Ca de 6-8 A, lo que indica que este residuo puede participar en las interacciones entre D1 y SCF. Debido a la pobre densidad de electrón de cadena lateral del lazo aC- 2, no pueden definirse interacciones específicas.

Sitio-ll El enlace es transmitido, para la mayor parte, mediante interacciones electrostáticas complementarias de superficies cargadas en Kit (figura 3A, B, D). Se forman puentes de sal entre los aminoácidos base Arg122, Arg181, Lys203 y Arg205 de Kit con los aminoácidos, ácidos Asp54', Asp77', Asp84' y Glu88' en SCF. La conformación de Arg122 es estabilizada por un puente de sal entre Glu198 de Kit y Asp54' de SCF. La figura 3D muestra que tres de los residuos de interacción mayor Tyr125, Arg181 y Lys203 en D2 están alineados en el mismo plano y forman enlaces de hidrógeno con Asp77', Asn81', Asp84', Ser53' y Thr57' de aB y aC de SCF. Los contactos van-der-Waals entre Ser123 y Ile201 de D2 y Val50' y Thr57' de SCF, también contribuyen a la formación del complejo de ligando-receptor. Sin embargo, existen diferencias notables en los residuos del Sitio-ll en Kit y SCF de otras especies (figura 3, figura 8 y figura 10). Aunque Arg181 y Lys203 son invariantes como aminoácidos base en mamíferos, Tyr125 es sustituido por una fenilalanina en ratón y rata, lo cual es probable que dé como resultado la pérdida de un enlace de hidrógeno. Arg205 de Kit es un aminoácido altamente conservado, en tanto que Glu88' está sustituido por residuos de leucina y alanina en el ratón y rata, respectivamente. Además, Arg122 de Kit y Asp54' de SCF en humanos, son sustituidos por una leucina o valina en el ratón y rata, respectivamente. Estas sustituciones pueden abarcar la afinidad reducida de SCF de roedor hacia Kit humana (Lev y asociados (1992b) J Biol Chem 267: 15970-15977).

Sitio-lll El segmento N-terminal de SCF, interactúa con la hebra D4 de D3 (figura 3 A, E). Los enlaces de hidrógeno se forman entre la cadena lateral de Asn10' de SCF, y la amida de cadena principal y el grupo de carbonilo de Ser261, así como con la cadena lateral de Asp260 y Trp262 en D3. Además, Thr9' y Asn11' de SCF se enlazan a la cadena lateral y a la amida de cadena principal de Ser261 y His263 de Kit, respectivamente. El análisis de mutación de SCF ha mostrado que la sustitución de Asn10' con residuos de alanina o ácido glutámico, reduce la afinidad de enlace de SCF hacia Kit en aproximadamente 10 veces, y que Asn10' (o Asp en otras especies) es necesario para la actividad biológica (Hsu y asociados (1998) Biochemistry 37: 2251-2262). La comparación de la interfase de enlace de receptor en SCF de diferentes especies muestra que Asn10' (o Asp) es un residuo altamente conservado (figura 8). Son transmitidas importantes interacciones adicionales mediante Asn6' y Arg7' de SCF a través de contactos van-der-Waals con Tyr259, Thr269, Ser240, Val242, Ser241 Ser244 en D3 de Kit.

Tabla 3. Interacciones SCF-Kit e Interacción Homofílica dos promotores Kit Interacciones SCF-Kit 1 Interacciones SCF-Kit 2 Interacciones KIT D4-D4 Enlaces de hidrógeno y puentes de Enlaces de hidrógeno y puentes de Enlaces de hidrógeno y puentes de sal(1) sal (1) sal (1) Kit (rtiolA) SCF(molC) Kit (molB) SCF (moID) Kit (molA) Kit (molB) Arg122 ??1 Asp54 051 Arg122 ??1 Asp54 081 Arg381 0 Arg381 ??1 Tyr125 OH Asp84 ?d1 Tyr125 OH Asp84 ?d1 Arg381 ??1 Thr380 o 0(ilegi Arg181 ??1 Asp77 052 Arg181 ??1 Asp77 0d2 Arg381 ??2 Glu386 ble)1 0(ileg¡ Arg181 ??2 Asp81 OS1 Arg 81 ??2 Asn81 ?d1 Glu386 Arg381 ??2 blel Lys203 ?? Asp84 051 Lys203 ?? Ser53 ?? Lys203 ?? Ser53 ?? Ser240 ?? Asp85 ?d2 Ser240 ?7 Asp85 052 Ser261 O Thr9 ??1 Ser261 ? Thr9 ?? Ser261 o Asn10 ?d1 Ser261 ? Asn10 081 Trp262 Nal Asn10 0d1 contacto van der waals (2) contacto van der waals (2) contacto van der waals (2) Asp72 Phe102 Asp72 Lys99 Thr380 Thr380, Arg381 Val87, Ser53 Thr74 Lys99 Arg381 Leu382, Lys383 Tyr125 Arg161 Leu60, Val80 Tyr125 Val87, Ser53 Leu382 Arg381 Ile201 Thr57 Arg181 Leu60, Val80 Lys383 Arg381 Lys203 Thr57 Ile201 Thr57 Arg205 Glu88 Lys203 Thr57, Asp84 Ser240 Arg7 Arg205 Glu66 Trp262 Thr9, Asn10, Ser240 Arg7 Asn11 His263 Thr9, Asn11, Trp262 Thr9, Asn11 Lys78, Asn81, Asp85 Gly266 Lys78, Asn81 His263 Thr9, ASn11, Lys78 Asp Asn81 Gly265 Lys78, Asn61 Tyr269 Asn6 Tyr269 Asn6 (1) Enlace de hidrógeno y puente de sal y (2) contacto van der waals tiene el rango de distancia de 2.5-3.5 y está dentro de 4.0 A, respectivamente.

Ejemplo 7: Análisis de la estructura Kit/SCF y los Cambios Conformacionales Asociados con el Enlace.

El dominio de enlace de ligando de Kit está en equilibrio para el enlace SCF La superimposición de las estructuras de D1, D2 y D3 individuales en la forma monomérica Kit con estructuras correspondientes de la forma homodimérica inducida por SCF, revela valores r.m.s.d. de 0.5, 0.8 y 1.1 A para 82, 92 y 100 residuos Ca alineados en D1, D2 y D3, respectivamente. En forma similar, la superimposición de la estructura de toda la región D1-D2-D3 de los monómeros Kit con las estructuras correspondientes en el complejo SCF-Kit 2:2, revela r.m.s.d. de 1.1 A para los 274 residuos Ca alineados de la región D1-D2-D3. En forma remarcada, no existen cambios significativos del esqueleto en las estructuras del bolsillo de enlace SCF de Kit (figura 3 y figura 11). Sin embargo, se detectaron varios cambios estructurales menores en el enlace SCF hendidos al momento del enlace SCF. El cambio estructural se observa en la mitad superior de las hebras G, F, y C (aminoácidos 167-187 y 143-166) de D2 después de enlace SCF (figura 1A, 2A). Estas hebras están localizadas en la parte opuesta a la interfase de enlace SCF, y no están implicadas en trasmitir cualesquiera contactos directos con SCF. En general, la comparación de las estructuras de monómeros Kit con los dímeros Kit ocupados por SCF muestran que la región D1-D2-D3 de Kit puede ser vista como una unidad funcional que está equilibrada para el enlace SCF, seguido de la dimerización Kit subsecuente operada por moléculas SCF diméricas.

Cambios en conformación en moléculas SCF enlazadas a Kit Aunque la estructura general de SCF enlazada a Kit es similar a la estructura de SCF libre, existen diferencias notables en el ángulo entre los dos protómeros, en las conformaciones de los lazos de conexión y en las estructuras del N-término flexible de la molécula (figura 4). La comparación de las estructuras publicadas de los dímeros SCF (códigos de acceso 1EXZ y 1SCF en el Banco de Datos de Proteína) muestra que el ángulo entre los dos protómeros (los ángulos entre hélices aC) de homodímeros SCF libres pueden variar en 2o a 6o en las diferentes estructuras, sugiriendo que existe un cierto grado de flexibilidad en el dímero SCF. El rango de diferencias en los ángulos entre protómeros SCF enlazados por Kit a los de SCF libre, fue incrementado en 3 a 9o. La figura 4 muestra una estructura SCF enlazada por Kit en la cual el ángulo entre los promotores SCF está incrementado en 5o.

La figura 4B muestra que el N-término de SCF libre de Cys4' a Asn11', tiene una configuración de resorte aleatoria (Zhang y asociados (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97: 7732-7737). También se mostró que la eliminación de los primeros cuatro aminoácidos conduce a una reducción de aproximadamente el 25% en la afinidad de enlace de SCF para Kit, lo que sugiere que el puente de disulfuro entre Cys4' y Cys89* desempeña un papel importante para mantener la integridad funcional de SCF (Langley y asociados (1994) Arch Biochem Biophys 311: 55-61). La figura 4B también muestra que Thr9' y Asn10' de la región de N-término de SCF enlazada a Kit, pasa por un cambio en conformación en la cual sus posiciones Ca quedan desplazadas en 3 a 5 A al momento del enlace de receptor (figura 4B). El puente de disulfuro entre Cys4' en el N-término y Cys89' en la hélice aC, parece desempeñar un papel importante en la transmisión del cambio de conformación que tiene lugar en el N-término SCF. La posición de Cys24' en SCF libre no está alterada al momento de la ocupación de receptor, tal como se revela mediante la desviación de mínimos cuadrados (r.m.s.d.) de 1.2 A de las posiciones Ca. Finalmente, a?-ß32 de SCF libre está ya sea desordenado o tiene una estructura diferente a la estructura del lazo a?-ß2 en SCF enlazado a Kit. La figura 4C muestra que el lazo aC-32 de SCF pasa por un gran cambio de conformación al momento del enlace receptor; un cambio crítico para el establecimiento del Sitio-I de la interfase SCF-Kit.

Reaiuste grande en orientaciones D4 y D5 de Kit enlazado por SCF La superimposición de las estructuras de D1, D2, D3, D4 y D5 individuales de la forma monomérica Kit con dominios tipo Ig individuales correspondientes en la forma homodimérica inducida por SCF, revela cambios menores en estructura de dominios tipo Ig Kit después del enlace SCF. En contraste, la superimposición de la región D3-D4-D5 de la forma monomérica Kit con la región correspondiente en la forma homodimérica, revela un gran cambio estructural en la orientación de D4 y D5 relativa a cada una de las otras, y relativa a la región de enlace de ligando de Kit (figura 5A y figura 12). Cada uno de los dominios individuales D3, D4 y D5 del Kit monomérico, pueden estar superimpuestos con sus contrapartes en el equipo ocupado por SCF con valores r.m.s.d. de 0.9, 0.9 y 1.9 A para 98, 101 y 85 átomos Ca de D3, D4 y D5, respectivamente. Sin embargo, la superimposición de la estructura D3 de monómeros Kit con la estructura D3 en la forma homodimérica ocupada por ligando revela un movimiento dramático en la orientación de D4 y D5 en el Kit enlazado por SCF (figura 5A).

Las reorientaciones de D4 y D5 relativa a la región de enlace de ligando ocurre a través de rotación a lo largo de un eje en el enlazador que conecta D3 a D4, y una rotación a lo largo de un eje en el enlazador que conecta D4 a D5 que corre a través de las interfases D3-D4 y D4-D5 (figura 5A), respectivamente. La comparación del Kit libre y enlazado por ligando muestra que D4 del Kit ocupado por ligando gira en forma relativa a D3 en 22°, y D5 del Kit ocupado por ligando gira en forma relativa a D4 en 27° (figura 5A). Los reajustes de D4 y D5 en Kit ocupado por SCF, da como resultado interacciones receptor-receptor que son transmitidas por interacciones D4-D4 y D5-D5 de dos moléculas Kit vecinas (figura 5B). La conformación del lazo DE de D5 está alterada en el ectodominio ocupado por SCF. La reorientación de D4 y D5 conducida por la dimerización de receptor, impone en el lazo DE de D5 una nueva configuración (figura 5A).

Interacciones D4:D4 en homodímeros Kit Las interacciones homotípicas entre D4 de dos moléculas Kit vecinas son transmitidas por interfase D4-D4 en el complejo SCF-Kit 2:2. La ¡nterfase D4-D4 es transmitida por dos hojas ß formadas por las hebras ABED de D4 de cada promotor Kit para formar un ajuste casi plano en el cual Arg381 de cada promotor apunta hacia cada uno de los otros dando como resultado un área de superficie enterrada de 360 A2. La figura 6A muestra que Arg381 y Glu386 forman puentes de sal y contactos van-der-Waals a través de los ejes de dos dobleces del dímero Kit. Además, las cadenas laterales de Arg381 de cada promotor forman enlaces de hidrógeno con el carbonilo de cadena principal del residuo correspondiente de las moléculas Kit vecinas.

El análisis de secuencia a base de estructura ha mostrado que la interfase D4-D4 es conservada en la mayoría de las RTKs tipo-lll incluyendo CSF1R, PDGFRa y PDGFRp (figura 6B y figura 8). En PDGFRa, Glu386 es reemplazado por un ácido aspártico; un residuo que podría funcionar también como una parte de puente de sal. Un par de residuos base (Arg381) y ácidos y (Glu386) se conservan de manera estricta en las RTKs tipo-lll de diferentes especies. El motivo de secuencia encontrado en la interfase D4-D4 también está conservado en el 7mo dominio tipo Ig próximo a la membrana (D7) de todos los miembros de la RTK tipo-V (familia VEGFR) incluyendo VEGFR-1 (Flt 1 ), VEGFR-2 (Flk1) y VEGFR-3(Flt4). En VEGFR, los residuos base (Arg) y ácidos (Asp) se localizan en el lazo EF. Aunque el motivo de secuencia del núcleo que es responsable de la interfase D4-D4 RTK tipo-lll está localizado en el dominio tipo Ig de VEGFR diferente (por ejemplo, D7 versus D4 de tipo III) es posible que también tengan lugar interacciones receptor-receptor similares a las observadas en la interfase D4-D4 de Kit, a través de una interfase D7-D7 similar (figura 6A) en todos los miembros de la familia VEGFR de RTKs (Ruch y asociados, (2007) Nature. Struct. Mol. Biol. 14: 249-250).

Interacciones D5-D5 en homodímeros Kit La figura 2B y figura 5B, 6C, muestran que en el complejo SCF-Kit 2:2, los promotores D5 vecinos están paralelos y en proximidad cercana entre sí, así como en una orientación que probablemente será perpendicular para la membrana celular. La topología de hoja ß de D5 sigue un ajuste atípico que es diferente a la mayor parte del conjunto I IgSF en donde la hebra A está dividida en la hebra A y A. La hebra A de D5 está emparejada con la hebra B dando como resultado la topología de hoja ß de ABED/CFG. En consecuencia, las hebras A y G que se localizan en el borde de dos hojas ß (ABED/CFG) están casi paralelas a una distancia de 6.5-11.5A en Ca entre sí. Además, las hebras A y G de un promotor, se orientan hacia las hebras A y G de D5 vecino en una simetría de dos dobleces. Las cadenas laterales de Asn505 de dos promotores Kit vecinos están en aproximadamente en 4.2 A una de la otra pero con iones de agua o metal que pueden transmitir interacciones indirecta entre las dos asparaginas que no pueden ser detectadas en esta área de densidad de electrón débil. Además, las interacciones D5-D5 son transmitidas por Tyr418 de dos moléculas Kit vecinas (figura 6C). La interacción entre los grupos hidroxilo de las cadenas laterales de Tyr418 vecinas, pueden ser transmitidas por moléculas de agua. Esto también sugiere que las posiciones relativas de los dominios D5 vecinos son transmitidas por interacciones indirectas formadas por Tyr418 y Asn505 de los promotores vecinos. La hebra G de D5 está conectada a través de un enlazador corto al dominio de transmembrana de Kit.

Ejemplo 8: Mecanismo de Activación de Receptor Las estructuras de los monómeros de ectodominio Kit y los dímeros inducidos por SCF proporcionan visiones novedosas que se refieren al mecanismo de la activación inducida por ligando de Kit y otras RTKs que contienen cinco o siete dominios tipo Ig en sus dominios extracelulares. La comparación de las estructuras de D1, D2 y D3 de monómeros de ectodominio Kit a la región correspondiente de los dímeros de ectodominio inducidos por SCF, muestran muy pocas alteraciones estructurales en el bolsillo de enlace SCF y en otras partes de D1, D2 y D3 después de enlace SCF. Sobre las bases de sus distintas funciones bioquímicas, hemos dividido el ectodominio de Kit en tres diferentes unidades funcionales. La primera unidad está compuesta de los tres dominios tipo Ig distales a la membrana D1, D2, y D3. La región D1-D2-D3 actúa como módulo separado que funciona como una unidad de enlace SCF específico. La unidad de enlace SCF está conectada por una unión flexible (interfase D3-D4) a D4; una segunda unidad independiente que está conectada por una unión flexible adicional (interfase D4-D5) a D5, es definida como una tercera unidad independiente. La función de D4 y D5 es transmitida, respectivamente, interacciones laterales D4-D4 y D5-D5 que llevan juntas y estabilizan las interacciones entre la región próxima a la membrana de los dos ectodominios Kit vecinos.

De acuerdo con esta visión, la dimerización de Kit es operada por el enlace SCF bivalente cuya única función es enlazar a SCF y llevar juntas dos moléculas Kit. La dimerización Kit inducida por SCF está seguida por una gran cadena en las orientaciones D4 y D5 relativas a la posición de la unidad de enlace SCF D1-D2-D3. Los datos presentados en la presente invención demuestran que las uniones flexibles en las interfases D3-D4 y D4-D5 permiten las interacciones laterales que dan como resultado un gran cambio conformacional al momento de la dimerización de receptor. En lugar de inducir un cambio conformacional en Kit, la dimerización puede seleccionar conformaciones particulares en una transición de un monómero unido en forma flexible a un dímero rígido. Esto culmina en las formaciones de complejo entre dos D4 vecinos y dos D5 vecinos de Kit, que llevan el C-término de D5 a un punto en la membrana celular en el cual los dominios de transmembrana de las dos moléculas Kit vecina están dentro de 15 A de cada uno de los otros. De hecho, la autofosforilación de tirosina inducida por SCF de Kit (figura 7B) y la estimulación de trayectorias de señalización de corriente descendente están fuertemente comprometidas por una mutación de punta ya sea en Arg381 o Glu386 dentro de D4 de Kit. La activación de receptor PDGF y la estimulación de las trayectorias de señalización de corriente descendente también están comprometidas por mutaciones de punta similares en D4 de PDGFR. Los datos aquí presentados demuestran que las interacciones homotípicas entre las regiones próximas de membrana de Kit son transmitidas principalmente por la interfase D4-D4 en cuanto a que la interfase D5-D5 desempeña un papel secundario cooperativo facilitando el posicionamiento exacto de dos ectodominios Kit en la interfase de superficie celular.

El complejo SCF-Kit exhibe una fuerte polarización de campo electroestático con la siguiente característica: (i) una superficie general cargada en forma negativa; (ii) complementariedad entre SCF (negativo), y la unidad de enlace de ligando D1-D2-D3 (positivo); y (iii) una superficie fuertemente polarizada en forma negativa arriba y alrededor de la interfase D4-D4 (figura 6D, 3B y figura 13). Estos datos demuestran que el enlace de SCF a Kit ocurre en al menos dos pasos: Primero, la atracción electrostática entre SCF y D1-D2- D3, alineará a SCF a lo largo de la región de enlace del ligando opuesta en Kit. La atracción electrostática también puede conducir a un rango de asociación más rápido de SCF debido a un efecto de Dirección (Muellera y asociados, (2002) Biochina y Biofysica Acta. 1592: 237-250). En forma subsecuente, la formación del complejo SCF-Kit será estabilizada mediante interacciones adicionales que incluyen las transmitidas por un cambio en conformación en moléculas SCF enlazadas. La superficie electrostática fuertemente polarizada en D4, también puede desempeñar un papel importante para mantener Kit en una configuración inactiva monomérica, induciendo la repulsión entre dominios D4 de los receptores Kit vecinos (figura 6D). Las afinidades de enlace de D4 hacia D4 y D5 hacia D5 de receptores vecinos, son probablemente demasiado bajas para facilitar la dimerización del ectodominio Kit antes de que incremente la concentración de receptor local en la superficie celular, mediante la dimerización de receptor operada por SCF y mediante el efecto de dimensionalidad. Una vez que dicho valor de umbral de concentración local es alcanzado, la atracción entre el D4 vecino no superará la repulsión electrostática hasta el grado en que las dos unidades D4 vecinas tendrán la capacidad de enlazar una a la otra. En forma interesante, también se transmiten interacciones principales que mantienen la interfase D4-D4, es decir puentes de sal dobles entre Arg381 y Glu386 en la molécula Kit vecina, mediante interacciones electrostáticas.

Los ectodominios de Kit y C-cadherina (Boggon y asociados, (2002) Science 296: 1308-1313), cada uno están compuestos de cinco dominios tipo Ig tándem, y ambos exhiben una topología elongada similar; 170 A para Kit y 185 A para C-caderina. Además, la molécula de adhesión bacteriana, invasina, exhibe una arquitectura elongada remarcadamente similar y topologías interdominio tipo Ig (Hamburger y asociados, (1999) Science 286: 291-295). Los ectodominios Kit pueden haberse desarrollado de un gen ancestral común que codificó para una proteína que transmite interacciones célula-célula. Aunque las caderinas clásicas utilizan su dominio tipo Ig más distal a la membrana para el enlace homotípico que transmite las interacciones célula-célula, el ectodominio de Kit ha sido desarrollado para funcionar como un receptor de señalización celular que enlaza a las isoformas SCF solubles o ancladas por membrana para inducir la dimerización y activación de receptor (figura 7C).

Ya que las marcas características de la estructura Kit, enlace de ligando y dimerización de receptor se conservan en otros receptores, el mecanismo aquí descrito para la activación Kit, puede ser un mecanismo general para activación en muchos receptores (figura 7C). Además, la información estructural aquí descrita, puede ser aplicada para diseñar novedosas intervenciones terapéuticas para el tratamiento de cánceres y otras enfermedades transmitidas por receptores activados.

Ejemplo 9: Análisis de Mutaciones Kit en Enfermedades Humanas Una variedad de enfermedades humanas son originadas por mutaciones en el gen Kit. En humanos, las mutaciones de pérdida de función en el ectodominio de Kit originan el rasgo moteado (Fleischman y asociados, (1996) J Invest Dermatol 107: 703-706; Murakami y asociados, (2005) J Invest Dermatol. 124: 670-672). Estas mutaciones de punta de exón-2 y exón-3 en el locus Kit, dan como resultado que Cys136 sea reemplazada por un residuo de arginina y Ala178 sustituido por un residuo de treonina. Ambas mutaciones tienen lugar en D2, un componente importante del sitio de enlace SCF en Kit (figura 7A). La mutación Cys136Arg moteada originará la pérdida de un enlace de disulfuro importante que desempeña un papel importante en mantener la integridad estructural y funcional de D2 y por lo tanto su capacidad para reconocer SCF. Ala178 se localiza en el lazo EF de D2 en proximidad cercana con la interfase D2-D3 (figura 7A). La mutación Ala178Thr moteada puede interrumpir las interacciones que son esenciales para mantener la integridad de la interfase D2-D3 y las interacciones que se requieren para el enlace de D2 y/o D3 a SCF (figura 7A).

Una variedad de mutaciones de ganancia de función en el locus Kit, se encontraron en diferentes cánceres incluyendo GIST, AML y SCLC (ver la Publicación de Forbes y asociados, (2006) COSMIC 2005. BR J. CÁNCER, 94: 318-22. Base de datos de mutación somática: Catálogo de Mutaciones Somáticas en Cáncer http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Muchas mutaciones oncogénicas fueron identificadas en JM y en los dominios PTK de Kit. También se encontraron una variedad de mutaciones oncogénicas en el ectodominio Kit (figura 7A) incluyendo eliminaciones en cuadro, mutaciones de punta, duplicaciones en cuadro e inserciones que conducen en forma colectiva a la formación de formas de Kit activadas. En mutaciones de eliminación e inserción en cuadro en el exón-8 que implican ya sea una pérdida o sustitución de Asp419 fueron descritas en pacientes con AML, con duplicaciones de secuencias Ala502-Tyr503 y Ala502-Phe506 que fueron identificadas en GIST (figura 7A). Asp419 se localiza en una región que conecta la hebra A y el lazo AB de D5 y Ala502-Tyr503 se localizan en la hebra G de D5 de Kit. En forma interesante, virtualmente todas las mutaciones oncogénicas de activación que se encontraron en el ectodominio Kit, fueron mapeadas para la interfase D5-D5 (figura 7A). La mayor parte de la interpretación plausible del modo de acción de las mutaciones D5 oncogénicas, es que estas mutaciones mejoran la afinidad de enlace y las interacciones homotípicas entre los dominios D5 vecinos, incrementando los rangos en rango, o disminuyendo los rangos fuera de rango o alterando los rangos de ambos procesos en una forma que facilita las interacciones D5-D5 mejoradas.

El análisis anterior demuestra que las regiones D4 y D5 son buenos candidatos contra los cuales se dirigen terapéuticos. Los fármacos, farmacéuticos o biológicos pueden ser utilizados para enlazar Kit con el objeto de estimular la dimerización/activación Kit, o más preferentemente, prevenir la dimerización/activación.

Ejemplo 10: Expresión, purificación y desglucosilación parcial del ectodominio Kit Una construcción de ADN que codifica para los aminoácidos 1-519, de Kit humana (Lemmon y asociados, (1997) J Biol Chem 272: 6311-6317) que contiene cinco residuos de histidina adicionales en el C-término, fue ligada en pFastBacI (Invitrogen, Inc). Los baculovirus que expresan las proteínas de ectodominio Kit fueron preparadas de acuerdo con procedimientos descritos en el manual de instrucción Bac-a-Bac (Invitrogen). Se crecieron células Sf9 de insecto en 15 Litros de cultivo de un medio de insecto de Grace suplementado con 10% de suero de bovino fetal desactivado por calor con Wave Bioreactor (Wave Biotech, LLC, System 20/50) para 2-3 x 106 células/ml y se infectaron posteriormente con baculovirus recombinante que llevan los genes de ectodominio Kit. Aunque el ectodominio Kit contiene la secuencia de señal de Kit humana, la proteína fue acumulada en las células de insecto en lugar de ser secretada. Después de 72 horas, las células fueron recolectadas y lisadas en 1.4 litros de 50 mM de amortiguador de fosfato de potasio con pH 8 que contiene 200 mM de NaCI, 10% de glicerol 1% de NDP-40 y 2 mM de PMSF durante 20 minutos en hielo. Después de la centrifugación y filtración, el ectodominio de Kit fue purificado utilizando cromatografía por afinidad con cuentas Ni-NTA, seguido de filtración de gel utilizando Superdex 200. El ectodominio Kit purificado en 25 mM de amortiguador Tris, pH 8.5 que contiene 25 mM de NaCI y 1% de glicerol, fue tratado durante 12 horas a una temperatura de 4°C con endoglucosilasa recombinante F1 que se agregó a la solución Kit en una proporción final de 10:1 p/p. El ectodominio tratado con endonucleasa F1 de Kit, posteriormente fue cargado en una columna 16/10 Mono Q equilibrada previamente, y eluido con un gradiente poco profundo de amortiguador Tris de pH 8.5 que contiene 400 mM de NaCI y 1% de glicerol. Las fracciones del ectodominio Kit desglucosilados fueron reunidas y concentradas en 35 mg/ml utilizando un concentrador giratorio. La preparación del ectodominio Kit purificado, parcialmente desglucosilado fue dividida en alícuotas y congelada en forma instantánea en N2 líquido. Utilizando este método, se purificaron ~10 mg de ectodominio Kit parcialmente desglucosilado de 15 litros de células cultivadas. Se expresó SCF (1-141), se volvió a doblar y se purificó tal como se describió previamente (Zhang / asociados, (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97: 7732-7737). El ectodominio de Kit (aminoácidos 1-514) también fue expresado como una forma secretada en células de insecto Sf9 utilizando el sistema de baculovirus y purificado como se describió previamente (Lemmon y asociados, (1997) J Biol Chem 272: 6311-6317).

Ejemplo 11: Determinaciones y refinamientos de estructura Se determinaron fases experimentales utilizando una combinación de difracción anómala de longitud de onda múltiple (MAD) y reemplazo isomorfo múltiple con dispersión anómala (MIRAS) de cristales de los monómeros de ectodominio Kit. Se llevaron a cabo búsquedas y fases de átomos pesados utilizando los programas CNS (Brunger y asociados, (1998) Acta Crystallogr D Biol 30 Crystallogr 54: 905-921) y SHARP (Bricogne y asociados, (2003) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59: 2023-2030). Se detectaron un sitio mayor y dos sitios menores para el derivado de platino (K2Pt(N02)4) y un sitio mayor y cinco sitios menores para cristales enjuagados con yodo. Se calcularon las fases MAD hasta una resolución de 3.3 A para derivados de platino en tres longitudes de onda utilizando CNS. Las fases MIRAS fueron calculadas a una resolución de 3.0 A para derivados de platino y yodo utilizando CNS y SHARR. La modificación de densidad de lanzamiento del solvente dio como resultado un mapa de densidad de electrón de calidad interpretable con una densidad de electrón continua y límites de solvente-proteína muy claros. Las regiones de una pobre cantidad de densidad de electrón incluyendo, la mitad superior de las hebras F, G y C, así como el lazo CD en D2 y el lazo CD, la hebra D, lazo DE y lazo EF y la mitad inferior de la hebra F en D5, fueron confirmadas comparando mapas de densidad de electrón calculados mediante fases MIRAS y MAD. La recolección de datos y las estadísticas de fases se resumen en las tablas 1A y 1B. El modelo molecular de Kit fue construido en forma manual en los mapas de densidad de electrón experimental utilizando COOT (Emsley, y Cowtan (2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2126-2132). Para el cálculo de factor-R libre, se omitieron el 5% de los datos durante el refinamiento. Los refinamientos se llevaron a cabo utilizando CNS para una resolución de 3.0 A contra los datos nativos. En la etapa final de los refinamientos, se llevaron a cabo refinamientos de traducción/liberación/roscado (TLS) a través de Refmac5 (Murshudov y asociados, (1997) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53: 240-255) en el programa CCP4 con tres grupos TLS generados utilizando el servidor web TLSMD (Painter y asociados, (2006) J Appl Cryst 39: 109-111).

La estructura del complejo SCF-Kit fue resuelta medíante el reemplazo molecular utilizando PHASER (McCoy y asociados, (2005) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61: 458-464). Se encontró una solución de reemplazo molecular clara para D1D2D3D4 del ectodominio Kit y SCF, utilizando D1D2D3 y D4 de Kit y SCF como modelos de búsqueda contra el conjunto de datos nativos, respectivamente, utilizando PHASER. Las estructuras del complejo Kit (D1 D2D3D4)-SCF fueron sometidas a refinamiento de cuerpo rígido de 20 a 4A, dando como resultado una Rcryst de 43.8%. La reconstrucción y refinamiento de modelo se llevó a cabo utilizando CNS para un valor Rcryst y Rfree de 31.6% y 34.0%, respectivamente. La densidad de electrón continua en la región de D5 fue encontrada en el mapa 2s 2Fo-Fc y 3 s Fo-Fc. Las hebras para D5 fueron trazadas manualmente en el mapa utilizando COOT, seguido de aplicación de refinamiento después de cada paso. A través de refinamiento inicial, se impusieron en los residuos restricciones de simetría no cristalográfica (NCS). Se llevaron a cabo refinamientos adicionales para una resolución 3.5A contra datos de difracción de rayos X nativos. Después de construir casi toda la molécula de complejo SCF-Kit, se liberaron restricciones NCS dando como resultado valores reducidos de R y Rfree y una densidad de electrón mejorada. Al final de la etapa de refinamiento, se liberaron completamente las restricciones NCS. La estereoquímica de los modelos fue analizada con PROCHECK (Laskowski y asociados, (1993) J Appl Cryst 26: 283-291). En la tabla 1B se muestra un resumen de las estadísticas de refinamiento.

Ejemplo 12: Rad ioetiquetado de SCF y ensayo de desplazamiento de ligando Se etiquetó SCF humano (10 pg) con ImCi de 125l (PerkinElmer) utilizando Tubos de Yodinación lodo-Gen (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para el ensayo de enlace de desplazamiento, las células 3T3 que expresan WT Kit o mutantes Kit fueron crecidas en DMEM que contiene 10% FCS. Las células se lavaron tres veces con DMEM que contiene 10 mM HEPES PH7.4 y 0.1% BSA (DMEM-BSA), y posteriormente se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 2 ng de SCF etiquetado-l en la presencia de concentraciones en incrementado de SCF nativo. Posteriormente las células fueron lavadas tres veces con DMEM-BSA frío, se Usaron en 0.5 mi de 0.5M NaOH durante 1 hora a temperatura ambiente y se aplicaron 100 µ? del Usado celular a 10 mi de una solución de centelleo Opti-Fluor (Perkin Elmer) para medir la radioactividad asociada utilizando el Contador de Centelleo (Beckman Coulter).

Ejemplo 13: Análisis de Conservación Las secuencias de aminoácido de SCF y Kit humano se utilizaron como consultas para búsqueda en la base de datos no redundante (nr) secuencias homologas, utilizando PSI-BLAST (Altschul y asociados, (1990) J Mol Biol 215: 403-410). Se llevó a cabo la alineación de secuencia utilizando ClustalW (Higgins (1994) Methods Mol Biol 25: 307-318) en secuencias SCF o en secuencias Kit, y posteriormente, se ajustaron en forma manual con base en las restricciones de doblez, para 20 residuos clave en los dominios tipo Ig Kit. La alineación de la secuencia de aminoácido fue revelada por la estructura de cristal del complejo SCF-Kit fue presentada al servidor Consurf 3.0 (Landau y asociados, (2005) Nucleic Acids Res 33: W299-302) para generar rangos de evolución normalizados de probabilidad máxima por cada posición de la alineación, en donde los rangos bajos de divergencia corresponden a la alta conservación de secuencia. Como con la producción Consurf, las calificaciones de conservación continuas se dividen en una escala separada de 9 depósitos para visualización, de modo que el depósito 9 contiene las posiciones más conservadas (marrón) y el depósito 1 contiene las posiciones más variables (cian).

Ejemplo 14: Expresión de proteína, purificación y generación de anticuerpos El ADN que codifica para el cuarto dominio tipo Ig de Kit humana (residuos 309-413; Kit D4) fue amplificado a partir del cADN de Kit humana de longitud total utilizando una reacción PCR. Se transformó el codón BL21 (DE3) E. Coli más las células con un vector de expresión bacteriano (etiquetado con pET-NusA histidina) que dirige la síntesis de Kit D4 seguido de incubación durante la noche a una temperatura de 16°C. Se purificó la proteína de fusión Kit D4-NusA a partir de Usados BL21 utilizando una columna de afinidad de quelación de metal (Ni-NTA; QIAGEN) seguido de purificación adicional utilizando cromatografía de intercambio de aniones (Columna de fuente Q; GE Healthcare). Posteriormente se incubó Kit D4-NusA durante la noche a una temperatura de 4°C con proteasa TEV con el objeto de disociar NusA y la etiqueta de histidina de D4. Se llevó a cabo un paso adicional de purificación de Kit D4 utilizando cromatografía de filtración de gel (columna Superdex 200; GE Healthcare).

El quinto dominio tipo Ig de Kit humana (residuos 410-519; Kit D5) fue expresado en las células BL21 (DE3) de la cepa E.coli y se purificó a partir de cuerpos de inclusión bacterianos utilizando un paso de redoblez utilizando 10 mM de amortiguador Tris, pH 8.0 que contiene 6.0 M de clorhidrato de guanidina. El Kit D5 redoblado fue purificado en forma adicional utilizando cromatografía de intercambio de aniones (columna de sefarosa Q; GE Healthcare), seguido de purificación utilizando cromatografía de filtración de gel (columna Superdex 200; GE Healthcare) y a través de un paso adicional de purificación utilizando cromatografía de intercambio de aniones (columna Source Q; GE Healthcare).

Los anticuerpos policlonales de conejo contra D4, D5, aislado o contra todo ectodominio Kit (aminoácidos 1-519; Kit EC) o contra una proteína de fusión GST que contiene un fragmento de la región C-terminal de Kit humana (residuos 876-976) fueron generados utilizando técnicas bien conocidas en el arte tal como el método mencionado en el Ejemplo 1. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales contra el ectodominio Kit pueden ser generados inmunizando un conejo con un ectodominio Kit purificado y recolectando los anticuerpos producidos a través de métodos estándar. Los experimentos en los cuales el efecto de los anticuerpos en la activación Kit fueron probados, tal como el Ejemplo 15 y la figura 14, se llevaron a cabo utilizando preparaciones de anticuerpo sometidas a purificación con cromatografía por afinidad con proteína A.

Ejemplo 15: Inhibición de activación Kit inducida por SCF utilizando anticuerpos contra el dominio D5 de Kit Las células 3T3 que expresan Kit humana fueron incubadas con soluciones de amortiguación que contienen concentraciones en incremento de anticuerpos de conejo policlonal generados contra D5 recombinante aislado de Kit (figura 14). Como control, las células fueron tratadas con anticuerpos policlonales de conejo contra SCF anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra todo el ectodominio Kit que fue producido en células de insecto utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Los Usados celulares fueron sometidos en inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Kit seguido de SDS-PAGE e inmunomanchado ya sea con anticuerpos anti-Kit o anti-pTyr (figura 14).

Este experimento muestra que los anticuerpos anti-D5 bloquean la autofosforilación de tirosina inducida por SCF de Kit.

Ejemplo 16: Inhibición de activación Kit inducida SCF mediante dominio D4 Kit recombinante aislado Las células 3T3 que expresan Kit, fueron incubadas durante 10 minutos a una temperatura de 23°C con concentraciones en incremento de D4 recombinante purificado que fue expresado en E. Coli seguido de incubación SCF. Los Usados de células no estimuladas y estimuladas fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Kit seguidos de SDS-PAGE e inmunomanchado con anticuerpo ya sea anti-Kit o anti-pTyr (figura 15).

Este experimento muestra que la presencia D4 aislado interfiere con la autofosforilacion de tirosina inducida por SCF de Kit.

Ejemplo 17: Experimentos de estimulación Kit inducidos con SCF Las células 3T3 que expresan Kit humana, fueron crecidas en DMM que contiene 10% de suero de becerro. Antes de la estimulación SCF, las células se dejaron sin alimento durante la noche en un medio libre de suero tal como lo describe Yuzawa y asociados (2007) Cell, 130: 323. Las células sin alimentos se lavaron tres veces con DMEM frío que contiene 10 mM en HEPES en pH 7.4 y 0.1% de BSA, seguido de incubación con concentraciones en incremento de anticuerpos o con Kit-D4 durante 10 minutos a una temperatura de 23C° tal como se indica en la figura 14 o figura 15. Las células fueron estimuladas con 100 ng/mL de SCF durante 10 minutos a una temperatura de 23°C y se lavaron tres veces con PBS frío. Los lisados de las células no estimuladas o estimuladas con SCF, fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Kit seguido de SDS-PAGE e inmunomanchado con anticuerpos anti-Kit o anti-p-Tyr.

Ejemplo 18: Activación inducida por PDGF de receptor-PDGF P y señalización mediante PDGFR se evitan mediante mutaciones de punta en aminoácidos críticos en D4 de PDGFRp.

Se utilizaron fibroblastos embriónicos de ratón (MEFs) derivados de ratones PDGFR-/- que expresan ya sea WT PDGFRp o mutantes de punta en aminoácidos críticos en D4 (sobre las bases de la similitud de secuencia con interfase D4-D4 en la estructura de cristal de rayos X de ectodominio Kit), para demostrar que las mutaciones de R385 o E390 evitan la activación de receptor inducida por PDGF (figura 16A), o la respuesta de cinasa MAP inducida por PDGF y el estímulo Akt (figura 16B). Además, utilizando experimentos de reticulación con un agente de reticulación covalente, demostramos que una mutación de punta E390A no interfiere con la dimerización de receptor inducida con PDGF. Sin embargo, a diferencia de los dímeros enlazados en forma covalente por WT PDGFRp que existe en la superficie celular en un estado activado, los dímeros reticulados en forma covalente de los mutantes E390A son inactivos (figura 16C). Este experimento muestra que la mutación de un residuo E390 crítico en D4 evita las interacciones D4-D4 que son esenciales para la activación PDGFR. Además, la dimerización inducida por PDGF de PDGFR no se afecta por una mutación de punta en D4 que evita la activación de receptor lo que indica que D4-D4 desempeña un papel importante en transmitir la colocación de la región próxima de membrana del ectodominio, para permitir la activación del dominio de cinasa de tirosina de PDGFR.

Por lo tanto, una modalidad de la presente invención incluye porciones que enlazan a, o dirigen los residuos R385 o E390 en PDGFR. Las porciones pueden ser empleadas para desactivar el receptor conservando al mismo tiempo la dimerización de receptor. Este ejemplo también demuestra que la formación basada en la estructura de cristal de una RTK, en este caso la estructura de cristal de ectodominio Kit, pueden ser fácilmente transferida a las otras RTKs. Aquí, el conocimiento del dominio Kit D4 fue corregido identificando aminoácidos que fueron importantes para la activación del receptor PDGF. En los Ejemplos 22 a 25 se describe un conjunto de experimentos más detallados que implican PDGFR. Ejemplo 19: Análisis de Superficie Molecular de Ectodominio Kit La determinación de las estructuras de cristal de todo el ectodominio de Kit antes y después del enlace SCF aquí descrito, ha demostrado que la dimerización de receptor inducida por SCF está seguida por interacciones laterales homotípicas entre los dominios tipo Ig próximos a la membrana D4 y D5 de dos moléculas Kit vecinas. La posición de las interacciones homotípicas D4 y D5 colocan a los dominios de cinasa de tirosina citoplásmica de dos receptores vecinos a una distancia y orientación que permite la autofosforilación de tirosina y la activación de cinasa. También se demuestra en la presente invención que la mutación de un residuo de aminoácido simple crítico para las interacciones homotípicas D4 comprometió la activación Kit inducida por SCF y la activación de receptor PDGF inducida por PDGF (ver Ejemplos 22 a 25).

Los análisis estructurales aquí descritos proporcionan nuevas visiones en como diseñar porciones inhibidoras tales como anticuerpos monoclonales que enlazan a epítopes de conformación y no contiguos en regiones poco profundas de las cavidades formadas por ectodominio de RTKs (por ejemplo, regiones D3, D4, o D5) o inhibidores de molécula pequeña que enlazan a las regiones de articulación D3-D4 y D4-D5 del ectodominio de Kit y otras RTKs t i p o - 111. Cuatro regiones en ectodominio fueron dirigidas inicialmente: (A) Porciones de la presente invención pueden ser creadas de manera que enlacen a las regiones de articulación D3-D4 y funcionen como una cuña molecular que evite el movimiento requerido para colocar la región próxima a la membrana en una distancia y orientación que permite la activación de cinasa de tirosina (ver figura 17); (B) Las porciones pueden ser creadas de manera que enlacen a las regiones de articulación D4-D5 y funcionen como una cuña molecular que evite el movimiento requerido para colocar la región próxima de la membrana a una distancia y orientación que permite la activación de cinasa de tirosina (ver figura 18); (C) Las porciones pueden ser creadas de manera que enlacen a la interfase D4:D4 evitando las interacciones de receptor D4 homotípicas (ver figura 19), (D) Las porciones pueden ser creadas de manera que enlacen a una superficie cóncava en la región de articulación D2-D3 dando como resultado la desestabilización de las interacciones (ver figura 20); y (E) Las porciones pueden ser creadas de manera que enlacen a regiones de péptido que forman diversos epítopes contiguos y no contiguos en la superficie de Kit (Tabla 5).

Las superficies moleculares del ectodominio de Kit y el complejo SCF-Kit (código PDB: 2EC8 y 2E9W) fueron analizados utilizando el Atlas Computarizado de Topografía de Superficie de Proteínas (CASTp) para proporcionar información con respecto a la ubicación, y permitir el delineado y medidas de regiones de superficie cóncavas en estructuras de proteína tridimensionales (Dundas y asociados, (2006) NuclAcids Res, 34: W116-W118). Las cavidades identificadas fueron visualizadas e inspeccionadas utilizando Pymol (DeLano. 2002) DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA).

(A) Cavidades en la región de articulación D3-D4 (figura 17) Se dispersaron diversas cavidades en la interfase D3-D4 en la estructura de monómero de ectodominio. Los aminoácidos implicados en definir las cavidades que se resumen en la tabla 4. Al momento de la formación de la interacción homotípica entre dos receptores Kit, la región de articulación D3-D4 es alterada dando como resultado la formación de una cavidad poco profunda creada a través de los siguientes residuos: K218, S220, Y221, L222 de D3 y F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370.1371, Y373 de D4. La figura 17 muestra un diagrama de cinta de la región de articulación D3-D4 de monómeros no ocupados (figura 17A) y dímeros enlazados mediante SCF (figura 17B) y una representación de malla del bolsillo D3-D4.

(B) Cavidades en la región de articulación D4-D5 (figura 18) Se forman pequeñas cavidades a través del lazo AB y lazo EF de D4, y el enlazador de conexión D4-D5 y parte del lazo DE y el lazo FG de D5 en el monómero Kit. Los residuos que definen las cavidades anteriores se resumen en la tabla 4. La forma y tamaño de las cavidades son cambiadas en la estructura dimérica del ectodominio Kit. Las cavidades mayores formadas a través del lazo EF y la hebra G de D4, el enlazador D4-D5 y la hebra B y el lazo DE de D5, se localizan debajo del lazo EF de D4; una región crítica para la formación de la interfase homotípica D4. Se debe observar que el lazo DE de D5 que se localiza cerca de las cavidades, puede tener mayor flexibilidad tal como lo revela la menor calidad de densidades de electrón de estructuras Kit tanto no enlazadas como ocupadas. La figura 18 muestra un diagrama de cinta de monómeros no ocupados (figura 18A) y dímeros SCF (figura 18B), y una representación de malla de una cavidad poco profunda alrededor de la región de articulación D4-D5.

(C) Cavidad en la región que transmite interacciones homotípicas D4.

Se localiza una superficie cóncava formada a través del lazo CD y el lazo EF de Kit D4, arriba de la interfase homotípica D4. Los residuos Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 y T390 de D4 proporcionan un área de superficie de aproximadamente 130 A2 para la superficie cóncava en la estructura dimérica de ectodominio. La cadena lateral de Glu386 desempeña un papel importante en la interfase homotípica D4 que se proyecta hacia el centro de la superficie. Una característica de la superficie cóncava, es un parche hidrofóbico pequeño rodeado por residuos cargados (Glu386 y Lys358). El tamaño y accesibilidad de la superficie se altera al momento de las interacciones D4:D4 homotípicas, teniendo lugar los cambios en la conformación de lazo CD que queda doblado hacia arriba hacia la parte superior del dominio. Los residuos implicados en la formación de la superficie cóncava se resumen en la tabla 4. La figura 19A ilustra un diagrama de cinta del dominio D4 no ocupado de Kit (dorado) colocado sobre el Kit ocupado D4 por ligando (no mostrado) con diferentes conformaciones de los lazos CD y EF entre las estructuras de ectodominio ocupado por ligando (verde) y no ocupado (rojo). Los residuos críticos para interacción D4:D4 se muestran en la forma de modelo de vara. Las figuras 19B y 19C muestran un diagrama de cinta de estructuras Kit no ocupadas (figura 19B) y estructura Kit ocupadas por SCF (figura 19C) y la representación de malla de una cavidad poco profunda arriba de la interfase homotípica D4.

(D) Superficie Cóncava en las regiones D2 y D3 de enlace de ligando Se localiza una superficie cóncava poco profunda en parte de la superficie de enlace de ligando de los dominios D2 y D3. Los residuos implicados en el bolsillo pequeño son Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 y F208 de D2 y V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 y Y269 del dominio D3 de Kit. El bolsillo se crea a través de un parche hidrofóbico pequeño rodeado por residuos hidrofílicos. No existe alteración importante entre las estructuras Kit no ocupadas y ocupadas por SCF, con un área de superficie entre el área general de aproximadamente 500 A2. Las figuras 20A y 20B muestran diagramas de cinta de Kit no ocupado (A) y SCF enlazado por Kit (B) y una representación de malla del bolsillo D2-D3.

SCF-Kit complex molA.C (Continuación Tabla 4) (E) El análisis estructural de la cinasa de tirosina KIT se llevó a cabo tal como se describió anteriormente. El análisis reveló epítopes tanto continuos como discontinuos que pueden ser objetivos para las porciones de la presente invención. En la tabla 5, los epítopes 1, 4, 5, 6, 8, 12-16, 19, 22-23, y 31-39 son epítopes continuos. Estos epítopes están compuestos de aminoácidos secuenciales en la proteína KIT. Los epítopes 2, 3, 7, 9-11, 17, 18, 20, 21, 24-30, y 40-43 en la tabla 5 son epítopes de conformación discontinuos compuestos de al menos 2 péptidos de la proteína KIT que se ponen en proximidad a través del doblez de la proteína KIT.

Tabla 5 Ejemplo 20: Ensayo de Actividad RTK Las células que contienen una RTK de interés se exponen al ligando de activación del receptor y una porción de la presente invención. La RTK de interés puede ser aislada mediante métodos de biología molecular estándar (por ejemplo, purificación de anticuerpo). Después de la purificación, un anticuerpo que enlaza a la RTK (no una porción de la presente invención, si no simplemente un enlazador estructural, tal como se utiliza en purificación) se recubre previamente en una placa de microtitulación de 96 depósitos. La RTK y los estándares calibrados se agregan posteriormente para separar depósitos en donde la proteína RTK es capturada. Posteriormente se agrega un anticuerpo de detección, el cual puede ser específico de un sitio fosfo (por ejemplo, c-Kit pY823 u otro residuo de Kit que es fosforilado al momento de la activación; el sistema fosfoELISA™ utiliza anticuerpo de conejo). El complejo de anticuerpo-Kit es detectado utilizando un anticuerpo secundario (por ejemplo, Ab anti-ratón para detectar un anticuerpo primario derivado de conejo) el cual es conjugado para una etiqueta o enzima (por ejemplo, se utiliza peroxidasa de rábano en el sistema fosfoELISA™) seguido con un substrato colorimétrico. Posteriormente se agrega una solución de detención y la placa se lee (por ejemplo, utilizando una fuente de luz 450 nm y detector). Los protocolos detallados para fosfoELISATM están disponibles en Invitrogen (invitrogen.com/content. cfm?pageid = 11655; invitroqen.com/downloads/F1027 BN pEI_lSA1006.pdf: invitrogen.com/downloads/F1028 BN pELISA1006.pdf C-KIT [pY823] ELISA KIT, HU (BioSource™) Número de Catálogo -KHO0401; c-KIT [TOTAL] ELISA KIT, HU (BioSource™) Número de Catálogo - KHO0391).

Ejemplo 21: Ensayo de Internalización de Receptor Las células que expresan las RTK de interés son incubadas primero con un ligandos adecuado (por ejemplo, células que expresan Kit son incubadas con SCF), induciendo la internalización de receptor. El proceso de internalización de receptor se detiene lavando las células en PBS frío. Posteriormente se elimina el ligando enlazado en la superficie restante lavando las células en una solución que tiene una concentración de sal y/o nivel de pH suficiente para disociar el ligando. Posteriormente las células se resuspenden en el amortiguador adecuado. Las células en este punto contendrán el receptor internalizado y por lo tanto, una cantidad disminuida de receptor que permanece en la superficie celular.

Se corre otro conjunto de experimentos similares, en donde las células se exponen a un ligando adecuado y una porción de prueba de la presente invención. Si la porción de prueba evita la activación de la RTK objetivo, entonces se inhibirá la internalización de receptor. Cuando se compara con las células descritas en el experimento anterior (en donde ocurre la activación de receptor), estas células muestran internalización disminuida y una mayor cantidad de receptor en la superficie celular. También se establecen grupos de control, los cuales se tratan células únicamente con solución amortiguadora o de etanol, un vehículo común para solubilización de fármacos.

La determinación de la cantidad del receptor en la superficie celular en los experimentos anteriores, pueden lograrse incubando las células con anticuerpos de ratón específicos para el receptor, seguido de, e incubando con anticuerpos anti-ratón que son conjugados para un fluoróforo tal como Proteína Fluorescente Verde (GFP). Posteriormente se pueden utilizar técnicas de microscopio de fluorescencia para visualizar y cuantificar la cantidad de receptor en la superficie celular.

Son bien conocidas en el arte, técnicas alternativas para cuantificación o visualización de los receptores de superficie celular, e incluyen una variedad de técnicas fluorescentes y radioactivas. Por ejemplo, un método implica incubar las células con un anticuerpo antireceptor radioetiquetado. Como alternativa, el ligando natural del receptor puede ser conjugado a una molécula fluorescente o etiqueta radioactiva e incubarse con las células. Los ensayos de internalización de receptor adicionales son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Publicaciones de ejemplo: Jiménez y asociados, (1999) Biochemical Pharmacology. 57(10):1125-1131 ; 30 Bernhagen y asociados, (2007) Nature Medicine. 13(5):587-596; y Conway y asociados, (2001 ) J. Cell Physiol. 189(3):341 -55, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia.

Introducción a los Ejemplos 22 a 25 El mecanismo generalmente aceptado de la activación de cinasa de tirosina receptora (RTK), es que la dimerización del receptor inducida por ligando facilita la trans-autofosforilación de los residuos de tirosina reguladores críticos en el lazo de activación del núcleo catalítico; un paso esencial para la activación de cinasa de tirosina. Esto es seguido por autofosforilación de residuos de tirosina múltiples en el dominio citoplásmico que sirve como sitios de enlace para los dominios SH2 (homología Src 2) o PTB (enlace de fosfotirosina) de una variedad de proteínas de señalización, las cuales al momento del reclutamiento y/o fosforilación de tirosina, transmite señales a una variedad de compartimentos intracelulares en una forma regulada (Schlessinger, J. (2000) Cell 103, 211-225; Pawson, T. & Nash, P (2003) Science 300, 445-452; y Hunter, T. (2000) Cell 100, 113-127).

Aunque todas las RTKs son activadas mediante dimerización, se han desarrollado diferentes familias RTK que utilizan diferentes estrategias moleculares para la dimerización y activación de receptor inducida por ligando (Burgess, A. W., y asociados, (2003) Mol Cell 12, 541-552; Schlessinger, J., y asociados, (2000) Molecular Cell 6, 743-750). Todos los ligandos de las RTKs tipo-lll incluyendo PDGFs, SCF, CSF y Flt3L son moléculas diméricas con la capacidad de reticular su receptores cognato mediante enlace bivalentes a sitios equivalentes de dos moléculas receptoras vecinas. El promotor PDGF está compuesto de una hoja ß de cuatro hebras central con el botón de cisteína característico en un extremo de la molécula. Se ajustan dos promotores PDGF en una forma antiparalela y se enlazan uno al otro a través de dos puentes de disulfuro de intercadena (Oefner, C, y asociados, (1992) EMBO J. 11, 3921-3926). En contraste, cada uno de los promotores SCF, CSF o F It 3 L está compuesto de un doblez helicoidal corto y se conectan entre sí a través de interacciones no covalentes (Jiang, X., y asociados, (2000) Embo J 19, 3192-3203; Zhang, Z., y asociados, (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97, 7732-7737; Pandit, J., y asociados, (1992) Science 258, 1358-62; y Savvides, S. N . , y asociados, (2000) Nat Struct Mol Biol 7, 486-491). A pesar de sus diversos dobleces, los dos subtipos de factor de crecimiento enlazan a y activan sus RTKs cognato en una forma virtualmente idéntica dando como resultado la formación de los complejos de ligando/RTK 2:2 activados (Savvides, S. N., y asociados, (2000) Nat Struct Mol Biol 7, 486-491). Todas las RTKs tipo-lll están compuestas de una región de enlace extracelular que contiene cinco dominios tipo Ig tándem seguido de una hélice de transmembrana simple, y un dominio de cinasa de tirosina citoplásmico con una región de inserto de cinasa grande flanqueada por regiones reguladoras que son sometidas a autofosforilación y a fosforilación mediante la cinasas de proteína heterólogas (Hubbard, S. R. (1999) Prog Biofys Mol Biol 71, 343-358).

El mecanismo de la activación del receptor ß-PDGF (PDGFRP) fue explorado analizando las propiedades de receptores mutantes que fueron diseñados con base en la estructura de cristal de la región extracelular de la cinasa de tirosina receptora Kit relacionada. Con base en estos experimentos se demostró que la activación inducida mediante PDGF de un PDGFR mutado en Arg385 o Glu390 en D4 (el 4o dominio tipo Ig de la región extracelular) estuvo comprometida dando como resultado un daño en una variedad de respuestas celulares inducidas por PDGF. Estos experimentos también demuestra que las interacciones D4 homotípicas, transmitida normalmente por los puentes de sal entre Arg385 y Glu390, desempeñan un papel importante en la activación de PDGFRß y todas las RTKs tipo-lll. También se utilizó un agente de reticulación química para enlazar en forma covalente las células estimuladas con PDGF para demostrar que un muíante Glu390Ala de PDGFR3 pasa por una dimerización de receptor típica inducida por PDGF. Sin embargo, a diferencia de WT PDGFR que se expresa en la superficie de células estimuladas por ligando en un estado activo, los dímeros Glu390Ala inducidos por PDGF fueron inactivos. Aunque los aminoácidos conservados que son requeridos para transmitir las interacciones homotípicas D4 son cruciales para la activación PDGFR3 (e interacciones similares en las RTKs tipo-lll), estas interacciones son indispensables para la dimerización PDGFR . Además, la dimerización PDGFR es necesaria pero no suficiente para la activación de cinasa de tirosina.

En forma similar al dominio D4 de Kit, el dominio D4 de PDGFRa y PDGFR3 carece de un enlace de disulfuro característico que puentea los residuos de cisteína localizados en los B5 y F5 en los dominios tipo Ig. La alineación de secuencia de aminoácido presentada en la figura 21, muestra que 13 de los 20 residuos de huella, del doblez IgSF conjunto I, están conservados en el dominio D4 de PDGFRs. y que el número y longitud de hebras que corresponden a los residuos de huella están altamente conservados en el dominio D4 de Kit, PDGFRa, PDGFR3 y CSF1R. Esto indica que los inhibidores de la presente invención, pueden estar diseñados para inhibir una variedad de moléculas receptoras incluyendo todas las RTKs tipo III.

El dominio D4 de Kit está compuesto de dos hojas ß, que contiene cada una cuatro hebras con una distribución ABED/A'GFC y los contactos homotípicos D4 son transmitidos por el lazo de EF D4 que se proyecta desde dos moléculas Kit vecinas. La estructura Kit aquí descrita, demuestra que Arg381 y Glu386 en el lazo EF, forman puentes de sal y los contactos van-der-Waals a través de un eje de dos dobleces del dímero Kit. Además, las cadenas laterales de Arg381 de cada promotor, forman enlaces de hidrógeno con el carbonilo de cadena principal del residuo correspondiente de las moléculas Kit vecinas. La alineación de secuencia a base de estructura ha mostrado que el tamaño del lazo EF, y los aminoácidos críticos que comprenden la interfase D4-D4 y están conservados en Kit, PDGFRa, PDGFR , y CSF1R. En PDGFRa, Glu386 es reemplazado por un ácido aspártico, un residuo que también puede funcionar como un asociado del puente de sal. Además, un par de residuos base y ácidos (Glu/Asp), está estrictamente conservada en PDGFRa y PDGFR de diferentes especies que fluctúan desde Takifugu rubripes a Homo sapien (figura 21), lo que proporciona un soporte adicional para la importancia funcional de esta región. Por lo tanto, las porciones de la presente invención dirigidas a RTKs, por ejemplo RTKs tipo III, con diferentes secuencias de aminoácido o para dominios variantes de función similar a las aquí descritas, también están dentro del alcance de la presente invención.

Métodos Relacionados con los Ejemplos 22 a 25 Alineación de secuencia v modelado de homología La alineación de secuencia de aminoácido se llevó a cabo utilizando el servidor CONSEC (Berezin, C, y asociados, (2004) Bioinformatics 20, 1322-1324), así como de acuerdo con las características de doblez IgSF (Harpaz, Y. & Chothia, C. (1994) Revista de Biología Molecular 238, 528-539) y de acuerdo con los residuos del núcleo del doblez Ig de D4 de la estructura Kit humana (Yuzawa, S., y asociados, (2007) Cell 130, 323-334). Los códigos de acceso de cada secuencia son: PDGFRa humano (P16234), de ratón (P26618), de pollo (Q9PUF6), de sapo (P26619) y de pez globo (Q8AXC7); PDGFRp de humano (P09619), de perro (Q6QNF3), de ratón (P05622), de pez globo (P79749) y Kit de humana (Q96RW7). Un modelo de homología D4 de PDGFRp fue generado sobre las bases de la estructura Kit D4 (código PDB: 2E9W) utilizando el servidor WHAT IF (Rodríguez, R., y asociados, (1998) Bioinformatics 14, 523-528). Las figuras fueron generadas utilizando PyMOL (Delano, W . L . ; pymol.org) .

Reactivos y Anticuerpos Se compraron anticuerpo L-histidinol y anti-flag en Sigma. Los anticuerpos contra MAPK, fosfo-MAPK, Akt, fosfo-Akt, y fosfolipasa Cy se compraron en Cell Signaling Technology. Los anticuerpos de anti-fosfotirosina (4G10) se compraron en Upstate Technology. Los anticuerpos de antiubiquitina (P4D1) se compraron en Santa Cruze. Los anticuerpos contra PDGFR3 fueron producidos mediante inmunización de conejo con péptidos sintéticos del dominio citoplásmico de PDGFF^. El cADN PDGF BB fue obtenido en Stuart Aaronson. El PDGF BB fue comprado en Invitrogen, y producido en bacterias tal como se describió previamente (Hoppe, J., y asociados, (1990) Revista Europea de Bioquímica 187, 207-214). El radionúclido 125l se compró en Perkin Elmer. El reactivo Bolton-Hunter y los tubos de yodinación cubiertos previamente con IODO-GEN se compraron en Piece. Se compró FITC-falloidin en Invitrogen. Líneas Celulares e Infección Retroviral Los fibroblastos derivados de embriones de ratón con deficiencia tanto de PDGFRa como de PDGFR (PDGFRa/ß) fueron proporcionados por Philip Sariano y Andrius Kazlauskas. El cADN PDGFR3 fue proporcionado por Daniel DeMaio. El cADN PDGFR3 fue subclonado en un vector retroviral pLXSHD, y se agregó una etiqueta-flag al C-término del receptor. Todos los mutantes en D4 fueron generados mediante mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagen). El retrovirus que codifica WT y el mutante PDGFR , fue producido en células 293GPG (Ory, D. S., y asociados, (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. 93, 11400-11406). Después de la infección, las células fueron seleccionadas con L-histidinol, y se utilizaron los conjuntos de células seleccionadas en los experimentos.

Inmunoprecipitación e Inmunomanchado Se lisaron células no estimuladas y estimuladas con PDGF en una solución amortiguadora que contiene 50 mM de Hepes, 150 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, 1% de Tritón de X-100, 25 mM de fluoruro de sodio, 1 mM de ortovanadato, 1 mM de fluoruro de fenil-metilsulfonilo, 5 g de aprotinina y leupeptina (pH 7.5). Se inmunoprecipitaron cantidades iguales de lisados celulares con anticuerpos indicados, se resolvieron los inmunopelets mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de celulosa. Las membranas fueron inmunomanchadas con diferentes anticuerpos. Las películas fueron escaneadas utilizando un densitómetro (Amersham) y cuantif icadas con el software Imagequant (Molecular dynamics).

Ensayo de fosforilación ¡n vitro para PDGFR Las células se dejaron sin alimento de suero durante 16 horas y se solubilizaron en amortiguador de lisis que contiene 150 mM de NaCI, 50 mM de Hepes (pH 7.4), 1 mM de EDTA, 25 mM de NaF, 0.1 mM de ortovanadato de sodio, 5 pg/ml de leupeptina y aprotinina, 1 mM de PMSF y 1% de NP40. Los lisados fueron inmunoprecipitados con anticuerpos anti-PDGFR y los inmunopelets fueron incubados en un amortiguador de reacción que contiene 50 mM de Hepes (pH7.4), 1 mM de ATP y 10 mM de MgCh a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Después de la incubación, los pelets fueron analizados mediante SDS-PAGE seguido de inmunomanchado con anticuerpos de antifosfotirosina. La membrana fue desprendida y se volvió a manchar con anticuerpos de etiqueta anti-Flag para determinación del nivel total de PDGFRp.

Reticulación Química de Dímeros Receptores Las células fueron crecidas en placas de 150 mm hasta que se alcanzó el 80% de confluencia y se dejaron sin alimento de suero durante 16 horas antes de la incubación con la concentración indicada de PDGF en DMEM que contiene 50 mM de Hepes (pH 7) a una temperatura de 4°C. Después de 90 minutos, las células fueron lavadas extensamente con PBS (pH 7.4). Las placas fueron transferidas a temperatura ambiente y se agregó suberato de disuccinimidilo (DSS) hasta una concentración final de 0.5 mM. La reacción de reticulación se extinguió después de 30 minutos mediante incubación con 10 mM de amortiguador Tris durante 15 minutos, seguido de lavado extenso con PBS. Los lisados celulares en 50 mM de Hepes, 150 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, 1% de Tritón X-100, 25 mM de fluoruro de sodio, 1 mM de ortovanadato de sodio, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 5 pg/ml de aprotinina y 5 pg/ml de leupeptina (pH 7.4), fueron inmunoprecipitados con anticuerpos anti-PDGFR y resueltos mediante SDS-PAGE. La membrana de nitrocelulosa fue inmunomanchada con anticuerpos de etiqueta-flag o antifosfotirosina (4G10) para detectar el nivel de receptor y el nivel de receptor fosforilado total, respectivamente.

Reorganización Citoesauelética de Actina Inducida por PDGF Se revistieron MEFs hasta la subconf luencia sobre correderas de vidrio durante 24 horas, seguido de falta inanición de suero durante la noche. Las células fueron ya sea tratadas con 50 ng/ml de PDGF durante 2, 5, 10, o 30 minutos o se dejaron sin tratar. Las células se fijaron en 4% de paraformaldehído en PBS, y se permeabilizaron con 0.1% Tritón en PBS y se mancharon con FITC-faloidina (Sigma) en PBS que contiene 1% de BSA durante 30 minutos. Las correderas de vidrio se montaron con un medio de montaje Prolong Antifade (Invitrogen), y las imágenes se adquirieron con un microscopio de fluorescencia Nikon. Se analizaron aproximadamente 400 células en cada corredera, el porcentaje de las células que mostró una formación de anillo de actina, se calculó y se presentó en forma lineal.

Enlace PDGF y Experimentos de I nternalización Se etiquetó PDG utilizando el reactivo Bolton-H unter (Pierce) antes de yodinación utilizando tubos de Yodinación lodo-gen (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se revistieron en placas de 24 depósitos y se dejaron crecer hasta el 80% de confluencia en DMEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal. Las células se lavaron dos veces en DMEM frío que contiene 20 mM de Hepes (pH 7.4) y 0.1% de BSA. Se incubaron depósitos por triplicado con 5 ng/ml de 125I-PDGF en la presencia de cantidades en incremento de PDGF nativo. El enlace se dejo proceder a una temperatura de 25°C durante 1 hora. Posteriormente las células se lavaron en PBS frío y se solubilizaron en 0.5 M de NaOH. Se determinó el contenido radioactivo de las muestras utilizando un contador de centelleo de LS6500 (Beckman Coulter), y los datos se analizaron utilizando un software PRISM (GrafPad).

Para experimentos de internalización, las células se sembraron en placas de 24 depósitos, se dejaron crecer hasta una confluencia del 80% y se dejaron en inanición durante la noche. Las células se incubaron con 5 ng/ml de 124I-PDGF en DMEM/0.1 % BSA/50 mM de Hepes, pH 7.4 durante 90 minutos a una temperatura de 4°C. Se eliminó el ligando no enlazado lavando con PBS enfriado en hielo (pH 7.4). Se agregó a las células DMEM/0.1 % templado previamente y se incubó a una temperatura de 37°C durante el tiempo indicado. Se recolectó el ligando asociado en la superficie celular con un amortiguador ácido enfriado en hielo que contiene PBS (pH 3) y 0.1% BSA durante 10 minutos. Se recolectaron los ligandos internalizados mediante solubilización con 0.5 M de NaOH. La cantidad de 125|-PDGF degradado fue determinada mediante precipitación del medio de incubación con 10% de ácido tricloroacético (TCA), y conteo del sobrenadante para la fracción soluble TCA. Las radioactividades liberadas e internalizadas, asociadas con superficie celular fueron determinadas mediante contador de centelleo líquido. Las cantidades de PDGF enlazados en la superficie intracelulares y degradadas fueron expresadas como un porcentaje de radioactividad asociada con célula total después de una incubación de 90 minutos en hielo (t = 0 minutos). Cada punto de tiempo se llevó a cabo por triplicado, y los resultados se expresaron como promedio + SE.

Ejemplo 22: La activación de receptor PDGF inducida con PDGF está comprometida por mutaciones en el dominio D4 La alineación de secuencia de aminoácido presentada en la figura 21A, demuestra que Arg385 y Glu390 en el lazo EF de PDGFR pueden transmitir interacciones homotípicas D4 similares a los puentes de sal formados entre Arg381 y Glu386 de Kit que son responsables de transmitir interacciones homotípicas D4 entre receptores Kit vecinos. Para investigar si es empleado un mecanismo similar por PDGFRP, Arg385 y Glu390, cada uno solo (R385A, E390A) o en combinación (R385E390/AA), fueron sustituidos por residuos de alanina. También se sustituyó un residuo Lys387 conservado adicional en la región de lazo por un residuo de alanina (R385K387E390/AAA) con el objeto de revisar su papel potencial en el control de activación PDGFRP inducida por PDGF. Los PDGFRps mutantes y tipo natural fueron expresados en forma estable en fibroblastos derivados de embriones de ratón (MEFs) con deficiencia tanto de PDGFRa como PDGFRp (Soriano, P (1994) Genes Dev. 8, 1888-1896; Soriano, P (1997) Development 124, 2691-2700; y Andrews, A., y asociados, (1999) Invest. Ofthalmol. Vis. Sci. 40, 2683-2689). Los MEFs que expresan PDGFR s mutantes o tipo natural que correspondieron con el nivel de expresión, fueron utilizados en los experimentos que se describen más adelante. Los Usados celulares de células no estimuladas o estimuladas con PDGF fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-PDGFR, seguido de inmunomanchado con anticuerpos anti-fosfotirosina.

Las membranas fueron desprendidas subsecuentemente, y se volvieron a manchar con anticuerpos anti-PDGFR para cuantificación de la expresión PDGFR. El experimento presentado en la figura 22A muestra que la autofosforilación de tirosina inducida por PDGF de PDGFR3 está fuertemente comprometida en células que expresan mutantes E390A, R385A, (R385E390/AA), y (R385K387E390/AAA) de PDGFR ; tanto la magnitud como las cinéticas de autofosforilación de tirosina fueron reducidas y atenuadas, respectivamente. Estos experimentos demuestran que Arg385 y Glu390 en el lazo EF de D4, desempeñan un papel importante en la estimulación inducida por PDGF de PDGFR , lo cual demuestra que existe un par similar de puentes de sal a los identificados en la estructura en Kit en los PDGFRs activados y en otros RTKs tipo III. La interacción directa entre el dominio D4 de un receptor vecino dentro del complejo de ligando-receptor puede presentar un mecanismo común utilizado para la activación inducida por ligando de las RTKs tipo III. Se ha observado en forma consistente y reproducible que la autofosforilación de receptor inducida por PDGF está comprometida más fuertemente en células que expresan el muíante E390A, en comparación con células que expresan los mutantes R385A, (R385E390/AA) o (R385K387E390/AAA). Aunque el mecanismo preciso responsable de la diferencia entre estos mutantes aún no está claro, es posible que la carga de superficie local positiva en la inferíase D4 pueda originar una repulsión electrostática para mantener D4 de los receptores vecinos separado antes de la estimulación del ligando. Mientras que la sustitución de Arg385 por un residuo de alanina evitará la formación de un puente de sal, este cambio también puede disminuir la carga positiva neta en la interfase D4-D4 dando como resultado una inhibición más débil de la activación PDGFR.

Con el objeto de revisar la posibilidad de si la mutación en el dominio D4 de PDGFR puede haber afectado la expresión de la membrana celular y la afinidad de enlace de ligando de PDGFRps mutantes, los experimentos de enlace PDGF cuantitativo a células que expresan PDGFRps tipo natural o mutantes fueron llevados a cabo posteriormente. Se incubaron las células que expresan los mutantes R385A, E390A o (R385E390/AA) PDGFRp tipo natural con una solución amortiguadora que contiene 125I-PDGF durante 90 minutos a una temperatura de 4°C en la presencia de una concentración en incremento de PDGF nativo. Se midió la radioactividad enlazada por célula utilizando un contador de centelleo. Los valores EC50 de las curvas de desplazamiento de PDGFR s muíante y tipo natural fueron analizadas mediante ajuste de curva con Prism4 (figura 22B). Las cantidades de PDGFRps muíante y tipo naíural que se expresan en los MEFs íransfecíados, íambién fueron comparadas medianíe inmunomanchado de Usados de células total con anticuerpos contra PDGFR o anticuerpos anti-lag (figuras 22A y C). Tomados junios, estos experimentos demuestran que se expresan cantidades similares de PDGFR s mutanle o íipo naíural en la superficie celular de células íransfecladas. Además, los valores IC50 similares (concenlración PDGF que desplaza el 50% del enlace 125l-PDGF) fueron obíenidos para células que expresan los mutantes tipo natural (3.7 nM), R385A (6.0 nM), E390A (2.8 nM) o RE/AA (3.0 nM). La posibilidad de que la actividad de cinasa de tirosina intrínseca de los PDGFR s muíante fuera afectada de manera adversa comparando las actividades de cinasa de tirosina in vitro de receptores mutantes y tipo natural también fue revisada. En este experimento, se sometieron Usados celulares procedentes de células con inanición de suero a inmunoprecipiíación con anlicuerpos aníi-PDGFR y los PDGFRs inmovilizados fueron someíidos a ensayos de cinasa ¡n vitro en la presencia de 1 m ATP y 10 mM de cloruro de magnesio. Después de la incubación, las muestras fueron analizadas mediante inmunomanchado con anticuerpos anti-fosfotirosina. El experimento presentado en la figura 22C, demuestra que las mutaciones R385A, E390A o RE/AA no influencian la actividad de cinasa de tirosina intrínseca de PDGFR. Juntos, estos experimentos demuestran que las mutaciones en D4 que afectan la estimulación inducida por PDGF de PDGFR3, no alteran la expresión de PDFGRp en la superficie celular, no influencian la afinidad de enlace de ligando a PDFGR y no alteran las afinidades de cinasa de tirosina intrínsecas de PDGFR3 mutante.

Ejemplo 23: Se expresan mutantes de punta D4 de receptor PDGF en la superficie de células estimuladas con PDGF en la forma de dímeros inactivos Ya que la dimerización de receptor ha sido establecida como un mecanismo importante que subyace la actividad de cinasa de tirosina receptora, investigamos si la autofosforilación de tirosina reducida del PDGFR mutante responde al estímulo PDGF originada por la deficiencia en la dimerización de receptor. Los agentes de reticulación química han sido utilizados previamente para monitorear y seguir la dimerización inducida por ligando de diversos receptores de membrana celular, incluyendo mutantes de receptor tipo natural y una gran variedad de mutantes de receptor EGF en la superficie celular de células vivas (Cochet, C, y asociados, (1988) J Biol Chem 263, 3290-3295). En este experimento, las células que expresan PDGFR3 tipo natural o el mutante E390A, se dejaron en inanición de suero durante la noche seguido de incubación PDGF durante 90 minutos a una temperatura de 4°C. Se utilizaron varios lavados para eliminar PDGF enlazado, y las células se incubaron con 0.5 mM de suberato de disuccinimidilo (DSS) en PBS durante 30 minutos a una temperatura de 25°C. Los Usados celulares de células no estimuladas o estimuladas con PDGF, fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-PDGFR seguido de SDS-PAGE, e inmunomanchado ya sea con anticuerpos anti-flag, para monitorear el estado de dimerización PDGFR o con anticuerpos de antifosfotirosina para monitorear el estado de activación (figura 23).

El experimento ilustrado en la figura 23, demuestra que el Usado de células no estimulados, se detectó una banda que migra en un gel SDS con un peso molecular aparente de 180 kDa que corresponde a los monómeros PDGFR, en Usados de células que expresan PDGFRP ya sea tipo natural o el mutante E390A. Al momento del estímulo PDGF, se detectó una banda adicional que migra en un gel SDS con un peso molecular de 360 kDa que corresponde a dímeros PDGFR, en células que expresan tanto PDGFRß tipo natural como el mutante E3901A. Sin embargo, el inmunomanchado de muestras con anticuerpos de anti-fosfotirosina, demuestra que aunque la banda que corresponde a los dímeros de PDGFR tipo natural, es fosforilado fuertemente con tirosina, se detecta una fosforilación de tirosina muy débil de la banda que corresponde a los dímeros del mutante E390A (figura 23).

Este experimento muestra que la autofosforilación de tirosina inducida por ligando dañada del mutante E390A, no es originada por una deficiencia de dimerización de receptor inducida por ligando. Este experimento también demuestra que el PDGFR tipo natural reticulado en forma covalente, se muestra en la superficie celular de células estimuladas con PDGF en la forma de dímeros activos, en tanto que el mutante E390A se muestra en la superficie de células estimuladas con PDGF en la forma de dímeros inactivos. Los datos anteriores demuestran que las interacciones homotípicas D4 en PDGFR, son indispensables para la dimerización de receptor inducida por PDGF, es necesaria pero no suficiente para la activación de cinasa de tirosina.

Ejemplo 24: Estimulación dañada de señalización celular en células que expresan mutantes de receptor PDGF D4 El impacto de las mutaciones D4 PDGFR en la señalización celular en respuesta a estimulación PDGF fue revisado. Los Usados de células no estimuladas o estimuladas con PDGF que expresan mutantes D4 ya sea WT o PDGFR, fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos Cv anti-fosfolipasa (anti-PLCy) seguido de SDS-PAGE e ¡nmunomanchado con anticuerpos ya sea anti-PLCy o anti-pTyr. El experimento presentado en la figura 24A muestra que la fosforilación de tirosina de PLCy está severamente comprometida en las células que expresan los mutantes PDGFR R385A, E390A, RE/AA o RKE/AAA.

La estimulación dañada de respuestas celulares inducidas por PDGF adicionales, puede ser observada en células que expresan mutantes D4 PDGFR. El experimento presentado en la figura 24B, muestra que la respuesta de MAP-cinasa y la estimulación Akt, estuvieron fuertemente comprometidas en células que expresan los mutantes PDGFR R385A, E390A, R385E390/AA o R385K387E3907AAA, en comparación con respuestas similares inducidas por PDGF en MEFs que expresan PDGFRs WT. En general, se requieren concentraciones mayores a aproximadamente 10 veces de PDGF para un nivel similar de respuesta MAP y estimulación Akt en células que expresan los mutantes PDGFR E390A, R385E390/AA (por ejemplo, RE/AA) o R385K387E390/AAA (por ejemplo, RKE/AAA).

Una de las características de la estimulación PDGF de fibroblastos cultivados, es una formación típica de ondulaciones de membrana y estructuras de anillo de actina circulares en la superficie dorsal de las células estimuladas con PDGF. El experimento presentado en la figura 25 muestra que la estimulación de PDGF de la formación de anillo de actina está comprometida en mutantes D4 PDGFR que expresan MEFs. Aunque en aproximadamente el 83% de WT PDGFR que expresan MEFs se exhibió una formación de anillo de actina circular, únicamente el 5% de las células mutantes PDGFR D4 mostraron una formación de anillo circular similar después de una estimulación de 2 minutos con 50 ng/ml de PDGF. Además, la formación de anillo de actina circular temporal que se eleva en WT PDGFR que expresan MEFs después de 2 a 5 minutos de estimulación PDGF, fue detectada débilmente en células que expresan los mutantes PDGFR R385A, E390A o RE/AA.

Ejemplo 25: Internalización reducida y degradación de mutantes en receptor D4 PDGF El efecto de las mutaciones D4 en internalización PDGF, degradación PDGFR y ubiquitinación PDGFR también fue revisado. Los MEFs que expresan WT PDGFR o los mutantes PDGFR D4 se trataron con 5 ng/ml de PDGF etiquetado con 125l durante 90 minutos a una temperatura de 4°C, seguido de lavados breves con PBS (pH 7.4) para eliminar el exceso de ligando en el medio. Las células pre-etiquetadas fueron calentadas a una temperatura de 37°C para iniciar la endocitosis del complejo de ligando-receptor durante varios intervalos de tiempo de hasta 4 horas. El 125I-PDGF degradado, intracelular y enlazado en superficie celular en el medio fue recolectado, cuantificado utilizando un contador de centelleo y presentado como un porcentaje de radioactividad 125IPDGF asociada con células total después de una incubación de 90 minutos (t = 0) a una temperatura de 4°C (promedio + SD). El experimento presentado en la figura 26A muestra que las cinéticas de internalización de PDGF etiquetado con 125l enlazado a MEFs que expresan WT PDGFR, son mucho más rápidas que las cinéticas de internalización de PDGF etiquetado con 125l enlazado a células que expresan los mutantes PDGFR E390A, R385A o R385E390/AA. Después de 30 minutos, -75-80% de 125I-PDGF fue eliminado de la superficie celular y se acumuló dentro de células que expresan receptores WT comparados con menos 50% en células que expresan receptores mutantes.

La degradación de bajo peso molecular del producto de 125I-PDGF se volvió detectable después de 30 minutos. La liberación de 1 5I-PDGF degradado fue mucho menor en las células mutantes E390A que en las células WT (figura 26A). La internalización y degradación PDGF fueron reducidas y fueron reflejadas en la degradación reducida de mutantes PDGFR D4. Las células que expresan WT o los mutantes PDGFR R385A, E390A o R385E390/AA, se incubaron primero durante 30 minutos con cicloheximida, con el objeto de prevenir la biosíntesis de nuevas moléculas PDGFR durante el experimento de degradación. Los Usados de células no estimuladas o estimuladas con PDGF, fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos con anti-PDGFR seguido de SDS-PAGE de inmunomanchado con anticuerpos dirigidos contra una etiqueta adherida al C-término de mutantes D4 WT o PDGFR. El experimento presentado en la figura 26B muestra que las cinéticas de degradación de los mutantes PDGFR R385A, E390A o R385E390/AA, fue fuertemente atenuada; en tanto que la mitad de los PDGFRs WT fueron degradados a las 1.5 horas del estímulo PDGF, la vida media de los mutantes D4 PDGFR fue extendida hasta aproximadamente 4 a 6 horas. El experimento presentado en la figura 26C muestra que el estímulo inducido por PDGF de ubiquitinación de PDGFR E390A también fue fuertemente reducida en comparación con PDGFR WT bajo condiciones similares. Tomados juntos estos experimentos demuestran que la internalización PDGFR y la degradación PDGFR transmitida por ubiquitinas están comprometidas por mutaciones en D4 de PDGFR.

Discusión de los Ejemplos 22 a 25 Los dominios extracelulares de todos los miembros de las RTKs tipo-lll, incluyendo PDGFRa, PDGFR , CSF1R, Flt3 y Kit están compuestos de cinco dominios Ig de los cuales los primeros tres, funcionan como un sitio de enlace para la molécula de ligando dimérica, la cual, al momento del enlace, estimula la dimerización y activación de receptor. Ya que la arquitectura molecular, las características de enlace de ligando y el mecanismo de la dimerización de receptor de las RTKs tipo- III están altamente conservadas, el mecanismo de la activación Kit inducida con SCF revelada por las estructuras de cristal del dominio extracelular completo de Kit antes y después del estímulo SCF, representa un mecanismo de activación general de todas las RTKs t i p o - 111. Además, el análisis filogénico de RTKs que contiene dominios tipo Ig en sus dominios extracelulares, indica un origen de evolución común para la RTK tipo- 111 y tipo-IV; una familia que incluye VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR) y VEGFR3 (Flt4). Además, tanto VEGF como PDGF pertenecen a la misma familia de botón de cisteína; factores de crecimiento homodiméricos, compartiendo una topología, tamaño y estrategia de enlace de receptor similar. Las características prominentes de la activación Kit reveladas por el análisis estructural de rayos x de su dominio extracelular (descrito por primera vez en la presente invención), por consiguiente, también puede aplicar a la activación inducida por ligando de las RTKs tipo V.

El análisis estructural de Kit ha mostrado que un par de puentes de sal formados entre Glu386 y Arg381 de dos dominios D4 vecinos, son responsables de transmitir interacciones D4 homotípicas que son esenciales para la activación Kit inducida por SCF. La comparación de las secuencias de aminoácido de las RTKs t i p o - II I , demuestra que existe un motivo de secuencia idéntico en la región de lazo EF de D4 de PDGFRa, PDGFR y CSF1R (figura 21), proporcionando evidencia de que también se forma un puente de sal similar entre D4 de las RTKs t i p o - 111. De hecho, la sustitución de Arg385 o Asp390 en el dominio D4 de ??T?? por alaninas, ha comprometido la estimulación PDGF de la activación PDGFRp, que da como resultado el daño de una variedad de respuestas celulares que son estimuladas por PDGF en células que expresan WT PDGFR3. El mecanismo de activación Kit inducido por ligandos, revelado por el análisis de la estructura Kit, aplica para la activación de todas las RTKs t i p o - 111. Un motivo de secuencia idéntico al motivo de secuencia responsable para las interacciones homotípicas D4, también fue identificado en el lazo EF del 7 dominio tipo Ig próximo a la membrana (D7) de los tres miembros de la familia VEGFR (tipo-IV) de RTK. Aunque el motivo de secuencia conservado que es responsable de transmitir interacciones D4 homotípicas en Kit y otras RTK tipo-lll, está localizado en el dominio D7 de las RTKs tipo-IV, D7 de VEGFRs desempeña un papel similar a D4 en la transmisión de interacciones homotípicas entre las regiones próximas a la membrana de RTKs tipo-IV. De hecho, un análisis microscópico de electrón de la estructura del dominio extracelular de VEGFR2, ha revelado un contacto directo entre D7 en dímeros VEGFR2 enlazados por VEGF (Ruch, C, y asociados, (2007) Nat Struct Mol Biol 14, 249-250). Los contactos directos entre los dominios tipo Ig próximos a la membrana representan un mecanismo general empleado por RTKs tipo-lll y tipo-IV.

Los estudios que exploran una variedad de mutantes de receptor o que emplean anticuerpos monoclonales que enlazan específicamente a dominios tipo Ig individuales de Kit (Blechman, y asociados, (1995) Cell 80, 103-113), receptores PDGF (Miyazawa, K., y asociados, (1998) J. Biol. Chem. 273, 25495-25502) y otras RTKs tipo-lll, han propuesto que D4 desempeña un papel importante en la transmisión de dimerización de receptor, incluso cuando Kit es estimulado por ligandos SCF monovalentes (Lev, S., y asociados, (1992) J Biol Chem 267, 15970-15977). Sin embargo, los análisis cuantitativos que emplean microcalorimetría de enlace SCF y estequiometria SCF hacia el dominio extraceluíar purificado Kit compuesto ya sea de los primeros tres dominios tipo Ig (D1-D3) o los cinco dominios tipo Ig (D1-D5), han mostrado que D4 y D5 son indispensables para la estimulación SCF de la dimerización Kit. En otras palabras, estos reportes han mostrado que la dimerización Kit está operada principalmente por la naturaleza dimérica del enlace SCF a Kit (Lemmon, M. A., y asociados, (1997) J. Biol. Chem. 272, 6311-6317).

Sin embargo, el trabajo aquí presentado demuestra que, en lugar de jugar un papel importante en la dimerización de receptor, las interacciones homotípicas D4 (y también D5 homotípica) entre receptores vecinos, son requeridas para la colocación precisa de las regiones próximas a la membrana de dos receptores a una distancia y orientación que permite interacciones entre sus dominios citoplásmicos, dando como resultado la activación de cinasa de tirosina. Por consiguiente, en lugar de interferir con la dimerización de receptor, las porciones, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la presente invención ejercen su efecto inhibidor en la activación de receptor, evitando interacciones homotípicas críticas entre las regiones próximas a la membrana de la RTK tipo-lll que son esenciales para la colocación del dominio citoplásmico a una distancia y orientación esencial para la activación de cinasa de tirosina.

Los experimentos aquí presentados demuestran que la dimerización de PDGFRp, Kit y otras RTKs tipo-lll, es operada completamente por el enlace de ligando y que el único papel de enlace del ligando, es reticular dos moléculas receptoras con el objeto de incrementar su concentración local en la membrana celular. Los dos puentes de sal (con interfase de un área de superficie enterrada de 360Á2) responsable de transmitir interacciones homotípicas D4, son demasiado débiles para soportar las interacciones de receptor sin el soporte de una dimerización de receptor transmitida por ligando, la cual en el caso de que Kit sea transmitida por una variedad de interacciones fuertes con un área de superficie entre el área total de 2060 A para cada promotor SCF. La concentración aparente de un receptor en la membrana celular de una célula no estimulada que expresa 20,000 receptores por célula, ha sido estimada como de aproximadamente 1 a 3 µ? (Klein, R, y asociados, (2004) Proc Nati Acad Sci U S A 101, 929-934; Chandrasekhar, S. (1943) Reviews de Modern Physics 15, 1). Al momento del enlace de un ligando dimérico tal como SCF, se mantuvieron dos receptores ocupados juntos a una distancia de 75A. Bajo estas condiciones, la concentración de receptor aparente en la membrana celular calculada utilizando la distancia promedio para alcanzar el vecino más cercano, es incrementada por más de dos órdenes de magnitud a 4 - 6 x 10" M. Este cálculo muestra que incluso las interacciones débiles con una constante de disociación dentro del rango de 10"4- 10"5 M, tal como la transmitida por dos puentes de sal, puede transmitir la asociación y contactos directos entre regiones próximas a la membrana de dos receptores vecinos. La concentración local de alto nivel en la membrana celular junto con una flexibilidad de uniones que conectan D4 y D5 al resto de la molécula receptora, permite el movimiento y formación del D4 homotípico, así como los contactos de D5 homotípico que colocan a la región próxima a la membrana del receptor, en una orientación y distancia precisa (15 A en el caso de Kit) que permite interacciones entre los dominios citoplásmicos vecinos, la autofosforilación de tirosina y el estímulo de la actividad de cinasa de tirosina.

Finalmente, al aplicar un agente de reticulación química para reticular en forma covalente WT o receptores mutantes en células no estimuladas o estimuladas con PDGF, se ha demostrado aquí que un muíante E390A PDGFRp pasa por dimerización inducida por PDGF similar a la dimerización inducida por PDGF de receptores WT. Sin embargo, en contraste con el WT PDGFRp que se expresa en la superficie celular de células estimuladas PDGF en la forma de dímeros activados, el mutante E390A es expresado en la superficie de células estimuladas con PDGF en la forma de dímeros inactivos. Este experimento demuestra que las interacciones D4 homotípicas son indispensables para la dimerización PDGFRp, y que la dimerización PDGFRp es necesaria pero no suficiente para la activación de receptor.

Ejemplo 26: Interrupción de la interfase D4-D4 que supera la activación KIT oncogénica Se estimularon con 1, 5 ó 10 ng/ml de SCF durante 5 minutos a una temperatura de 37°C células 3T3 de múrido que expresan en forma estable KIT tipo natural (WT), un mutante KIT oncogénico en el cual se duplicaron Ala502 y Tyr503 de D5 (mutante de repetición-D5) o un mutante KIT en el cual se duplicaron Ala502 y Tyr503 de D5 (Repetición-D5), junto con una mutación de punto adicional en donde Glu386 de D4 fue sustituido por un residuo Ala (mutante de repetición-D5/E386A).

Los lisados de células no estimuladas con SCF, fueron estimuladas mediante inmunoprecipitación con anticuerpos anti- KIT seguido por SDS-PAGE e inmunomanchado con anticuerpos ya sea anti-KIT o anti-fosfotirosina (anti-pY).

El experimento presentado en la figura 27 demuestra que el estímulo SCF de KIT tipo natural, conduce al aumento de la activación KIT revelado por autofosforilación de tirosina mejorada en KIT en respuesta al estímulo SCF. El experimento también muestra que un mutante de repetición-D5 oncogénico de KIT es constitutivamente autofosforilado por tirosina (es decir, es activado en la ausencia de estímulo SCF). En contraste, el mutante de repetición-D5/E386A que lleva una mutación de punto adicional en D4 (que mostró dañar la activación SCF de KIT en un fondo de proteína de receptor normal) bloquea la autofosforilación de tirosina constitutiva de KIT transmitida por la muestra de repetición-D5 oncogénica.

Este experimento proporciona una validación genética de la importancia de las interacciones homotípicas D4-D4 en transmitir la activación KIT mediante una mutación oncogénica en D5 y presumiblemente a través de otras mutaciones oncogénicas en diferentes partes de la molécula KIT. Además, este experimento proporciona validación adicional a la noción de que la interrupción de la interfase D4-D4 mediante intervención farmacológica con una porción de la presente invención, por ejemplo un anticuerpo, o una parte de enlace de antígeno del mismo, una molécula pequeña o una molécula peptídica, bloqueará la actividad de mutaciones oncogénicas en D5, mutaciones oncogénicas en otras partes de la molécula KIT y RTKs tipo-lll y tipo-IV oncogénicas.

Ejemplo 27: Anticuerpos dirigidos contra un péptido sintético que corresponde al motivo de signatura KIT, implicados en transmitir interacciones homotípicas D4, reconocen la proteína KIT intacta En este ejemplo, se elevaron anticuerpos policlonales de conejo contra tres diferentes antígenos KIT: 1. El dominio extracelular de longitud total de KIT humana (aminoácidos 1-510). 2. El dominio 4 tipo Ig KIT (D4) compuesto de los aminoácidos 308-411 (KIT-D4) 3. Un péptido 17-mer que corresponde a los aminoácidos 375-391 incluyendo el motivo de signatura KIT D4 (SELHLTRLKGTEGGTYT) conjugado para KLH.

Los conejos fueron inmunizados en intervalos de dos semanas con cada uno de los tres antígenos, y se analizaron los sangrados de prueba. Los resultados presentados proceden de una muestra de suero que fue recolectada después de la tercera inmunización.

Los Usados de células 3T3 que expresan KIT humana tipo natural, fueron incubados con 30 µ I s de suero que contiene uno de los siguientes anticuerpos: 1. Anti-KIT, dirigido contra el dominio extracelular KIT de longitud total. 2. Anti-D4, dirigido contra KIT-D4 y 3. Anti-péptido, dirigido contra péptido que corresponde a los aminoácidos 375-391 de KIT D4. Los Usados de células 3T3 que expresan KIT tipo natural, con cada uno de los anticuerpos, fueron incubados contra la Sefarosa de proteína A durante 2 horas a una temperatura de 4°C, y posteriormente se lavaron tres veces con amortiguador de lavado que contiene 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCI, 0.1% de TritonX- 00 y 5% de glicerol. Los inmunoprecipitados fueron separados en SDS-PAGE, transferidos a nitrocelulosa e inmunomanchados con cada uno de los anticuerpos tal como se describe en la figura 28. Los datos presentados en la figura 28 muestran que cada uno de los anticuerpos, incluyendo los anticuerpos anti-péptido dirigidos contra la región de interacción homotípica de D4 que es esencial para la colocación de los dímeros KIT en su configuración activada, reconoce KIT nativa intacta en los pasos para la inmunoprecipitación e inmunomanchado del experimento.

En forma remarcada, este experimento muestra que los anticuerpos anti-péptido reconocen KIT tipo natural en forma tan eficiente como los anticuerpos dirigidos contra las regiones extracelulares intactas o las regiones D4 de KIT.

Ejemplo 28: Contactos directos entre dominios próximos a la membrana extracelulares requeridos para la activación de receptor VEGF y señalización celular Los análisis estructurales de la región extracelular de KIT en complejo con SCF, revelaron un motivo de secuencia en el lazo EF del 4 dominio tipo Ig (D4) que es responsable de formar contactos de receptor homotípicos y de la activación de KIT inducida por ligandos y la señalización celular. Se identificó un motivo idéntico en la mayor parte del 7mo dominio tipo Ig próximo a la membrana (D7) de VEGFR1, 2 y 3. Este ejemplo demuestra que la autofosforilacion de tirosina inducida por ligando y la señalización celular mediante mutaciones que albergan VEGFR1 o VEGFR2 en residuos críticos (Arg726 o Asp731) en D7, se ven fuertemente dañadas. La estructura de cristal de D7 de VEGFR2 también se describe para una resolución de 2.7 A. La estructura muestra que los contactos D7 homotípicos son transmitidos por puentes de sal y contactos van der-Waals formados entre Arg726 de un promotor y Asp731 de otro promotor. La estructura del dímero D7 es muy similar a la estructura de los dímeros D4 observados en la estructura de cristal de la región extracelular de KIT en complejo con SCF. Las posiciones del lazo EF y los puentes de sal en las dos estructura son casi idénticas, y la distancia entre los términos-C son aproximadamente 15 A en ambas estructuras. La alta similitud entre VEGFR D7 y KIT D4 tanto en estructura como en función, proporciona evidencia adicional de los orígenes ancestrales comunes de las RTKs tipo III y tipo V. También revela un mecanismo conservado para la activación RTK y un objetivo novedoso para intervención farmacológica de RTKs activadas en forma patológica.

Los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) regulan el desarrollo de vasos sanguíneos y linfáticos y la homeostasis mediante el enlace A, y activación de los tres de la miembros de la familia del receptor VEGF (VEGFR) de las cinasas de tirosina receptora (RTK) (Olsspn y asociados, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol, 7(5):359-371 (2006)). VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) y VEGFR3 (Flt4) son miembros de RTK tipo-V; una familia que contiene una gran región extracelular compuesta de siete dominios tipo Ig (D1-D7), una sola hélice de transmembrana (TM) y una región citoplásmica con una actividad de cinasa de tirosina y secuencias reguladoras adicionales. El segundo y tercero dominios tipo Ig, D2 y D3 de los ectodominios VEGFR funcionan como sitios de enlace para los cinco miembros de la familia de citocinas VEGF (por ejemplo VEGF-A, B, C, D y el factor de crecimiento de placenta (P1GF)) (Barleon y asociados, J. Biol. Chem., 272( 16): 10382- 10388 (1997); y Shinkai y asociados, J. Biol. Chem., 273(47): 31283-31288 (1998)). Estos factores de crecimiento son homodímeros enlazados en forma covalente. Cada promotor está compuesto de hojas ß de 4 hebras ajustadas en una forma antiparalela en una estructura designada como factores de crecimiento de botón de cisteína (Weismann y asociados, Cell, 91 (5):695-704 (1997)). Otros miembros de la familia de botón de cisteína de las citocinas, incluyen el factor de crecimiento en nervios (NGF) y los factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF).

Sin embargo, los ectodomi nios de la familia PDGFR de RTKs ( t i p o - 111 ) están compuestos de cinco repeticiones tipo Ig de las cuales D1, D2, y D3 funcionan como una región de enlace de ligando de PDGFR, y otros miembros de la familia (por ejemplo KIT, CSF1R, y F 113 ) . Los experimentos estructurales y bioquímicos han mostrado que el enlace SCF a la región extracelular induce la dimerización KIT, un paso seguido por contactos homotípicos entre los dos dominios tipo Ig próximos a la membrana D4 y D5 de las moléculas KIT vecinas (Yuzawa y asociados, Cell, 130(2):323-334(2007)). Los estudios bioquímicos de mutantes KIT tipo natural y ocogénicas, han mostrado que los contactos D4 y D5 homotípicos, desempeñan un papel importante en la colocación de las regiones citoplásmicas de los dímeros KIT a una distancia y orientación que facilita la trans-autofosforilación, la activación de cinasa y la señalización celular.

En este ejemplo, la evidencia estructural y bioquímica demuestra que los contactos homotípicos entre la mayor parte de los dominios tipo Ig próximos a la membrana del ectodominio (D7) de receptores VEGF, desempeña un papel importante en la activación inducida por VEGF y la señalización celular a través de receptores VEGF.

Análisis de secuencia de VEGFR2 D4 y D7 Se identificó un motivo de secuencia conservado en forma evolutiva (L/lxR xxxD/ExG) responsable de transmitir contactos homotípicos entre dominios tipo Ig, mediante una lineación de secuencia basada en estructura de D4 de KIT (Yuzawa y asociados, Cell, 130(2):323-334(2007)). Se descubrió un motivo similar en D4 de PDGFRa, PDGFR y CSF1R, así como en la mayor parte del dominio tipo Ig próximo a la membrana (D7) de VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3 (figura 29). El motivo L/lxROxxxD/ExG está localizado en la región de lazo que enlaza a las hebras ß? y $F de D7¡ una región mostrada como responsable para transmitir los puentes de sal requeridos para contactos D4 homotípicos KIT. Arg y Asp son conservados en forma evolutiva de erizo de mar a humano tanto en VEGFR1 como VEGFR2 (figura 29), lo que indica una importancia funcional de estos residuos en la actividad de VEGFR. Sin embargo, en contraste con D4 de KIT y PDGFR, D7 de VEGFR1 y VEGFR2 contienen dos residuos de cisteína conservados en las posiciones B5 y F5 que forman un enlace de disulfuro entre las hebras ß, una interacción que contribuye al núcleo hidrofóbico de dominios tipo Ig, conjunto I (Harpaz y Chothia, J. Mol. Biol., 238(4):528-539(1994)).

En forma similar a D4 de PDGFR y KIT, D4 de VEGFR2 carece de cisteínas conservadas responsables de la formación de un enlace de disulfuro entre las hebras ß entre las posiciones B5 y F5. En D4 de VEGFR2, la región que conecta ß? con ß? es más corta en comparación con otros dominios Ig de ajuste-I típicos, posiblemente debido a que esta región carece de una de las hebras ß. El análisis de secuencia de aminoácido mostró que VEGFR2 D4 es homólogo al dominio D13 de miomecina (2R15) y telokina (1TLK) con una identidad de secuencia de 30% y 33%, respectivamente. La alineación de secuencia manual reveló el 20% de identidad de secuencia entre D4 de VEGFR2 y D4 de PDGFRa. Tanto D4 de KIT y D4 de PDGFR contienen aminoácidos "D/E-x-G" conservados alrededor del "motivo de esquina-Y" en 3F que consiste en el motivo D/E-x-G/A/D-x-Y-x-C (Hemmingsen y asociados, Protein Sci, 3(11):1927-1937 (1994)) (en D4 del residuo Cys es reemplazado por aminoácidos hidrofóbicos). En D4, se forma un puente de sal entre un residuo Glu en una molécula con un residuo Arg en una posición -5 de una segunda molécula KIT (figura 29B). Se encuentra un residuo Asp en D4 de VEGFR2, pero en lugar de un Arg en la posición -5, este dominio tipo Ig contiene un par de aminoácidos con cargas opuestas en las posiciones -2 y -6 relativas al residuo Asp (figura 29B). Aunque se han observado contactos directos entre D4 en imágenes de microscopio de electrón (EM) de dímeros inducidos por VEGF-A del ectodominio de VEGFR2 (Ruch y asociados, Nat. Struct. Mol. Biol., 14(3):249-250 (2007)), aún no queda clara la función de VEGFR2 D4. Por lo tanto D7 es más similar a D4 de VEGFR2 en la región del lazo EF a las secuencias correspondientes en D4 de KIT y PDGFR.

Contactos D7 homotípicos son esenciales para activación VEGFR2 inducida por ligando Este análisis de secuencia y comparación con KIT, sugiere que los residuos R726 y D731 de VEGFR2 pueden transmitir una formación de puente de sal inter-receptor y pueden alterar la respuesta al ligando. Para investigar el desempeño de los residuos conservados en la región D7 en la activación VEGFR2 inducida por ligando y la transduccion de señal, se generaron mutantes VEGFR2 en los cuales Arg726, Asp731 o ambos aminoácidos, fueron reemplazados por los residuos Ala (R726A, D731A y RD2A). Las células HEK293 fueron transfectadas temporalmente como vectores de expresión con pCADN3 que dirigen la expresión de WT VEGFR2 o VEGFR2 que albergan mutaciones D7. Después de la incubación durante 24 horas, las células transfectadas se dejaron en inanición durante la noche antes del estímulo VEGF-A. La autofosforilación de tirosina de VEGFR2 y la respuesta MAPK de células no estimuladas o estimuladas con VEGF-A, fueron analizadas utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina (anti-pTyr) o anticuerpos anti-fosho-M APK, respectivamente. La figura 30A muestra que las mutaciones de los residuos Arg o Glu anticipadas para estar implicadas en transmitir una formación de puente de sal interreceptor, redujo en forma marcada la autofosforilación VEGFR2 inducida por VEGF-A y el estímulo MAPK.

Para superar la actividad de cinasa relativamente débil de VEGFR2, se emplea un método de receptor quimérico (Fambrough y asociados, Cell, 97(6):727-741 (1999) y Meyer y asociados, J. Biol. Chem., 281 (2):867-875 (2006)). Un receptor quimérico compuesto del ectodominio de VEGFR2 (aminoácido 1-761) conectado a la transmembrana y a la región citoplásmica de PDGFR (aminoácido 528-1106) fue preparado y utilizado para explorar en forma adicional el papel desempeñado por D7 en activación VEGFR2 inducida por VEGF-A. Los lisados de células NIH-3T3 estimuladas o no estimuladas con VEGF-A, que expresan en forma estable un VEGFR2/PDGFR quimérico o un VEGFR2/PDGFR quimérico que alberga mutaciones D7 fueron sometidas a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-PDGFR seguido de inmunoprecipitación con anticuerpos anti-pTyr. La figura 30B muestra una autofosforilación de tirosina robusta del VEGFR2/PDGFR quimérico en respuesta a estimulación VEGF-A (figura 30B, WT). En contraste, la autofosforilación de tirosina inducida por VEGF-A del receptor quimérico que alberga las mutaciones D7 (R726A, D731A, RD2A) estuvo fuertemente comprometida (figura 30B). Un receptor quimérico compuesto de la región extracelular de VEGFR1 fusionado a la región TM e intracelular de PDGFR también fue generado. Las células 3T3 que expresan en forma estable receptores quiméricos tipo natural mostraron autofosforilación en respuesta al estímulo de ligando (figura 30C, WT). En contraste, la estimulación inducida por ligando de la actividad de cinasa estuvo fuertemente comprometida en células 3T3 que expresan el receptor quimérico, albergan mutaciones en Arg720, Asp725 o tanto en aminoácidos como en R720A, D725A y RD2A, respectivamente (figura 30C). Los datos anteriores demuestran que los contactos homotípicos entre los dominios tipo Ig próximos a la membrana de las RTK tipo-lll y tipo-V, son esenciales para la activación de receptor inducido por ligando y la señalización celular.

Se utilizó un agente de reticulación covalente para explorar el efecto de las mutaciones D7 en la dimerización de receptor inducida por ligando, mediante reticulación de células estimuladas por ligando mediante análisis SDS-PAGE de Usados de células no estimuladas o estimuladas por ligando (ver, la Publicación de Cochet y asociados, J. Biol. Chem., 263(7):3290-3295 (1988)). Este experimento demostró que la dimerización inducida por VEGF-A de los receptores quiméricos no fue afectada por las mutaciones D7 (datos no mostrados). En forma similar a los reportes previos para PDGFR y KIT (Yuzawa y asociados, Cell, 130(2):323-334 (2007) y Yang y asociados, Proc. Nat'l Acad. Sel U.S. A., 105(220:7681-7686 (2008)), los contactos homotípicos transmitidos por D7 son necesarios para la activación de receptor, pero indispensables para la dimerización de receptor. Además, la dimerización de receptor inducida por ligando es necesaria pero no suficiente para la autofosforilación de tirosina y la activación de receptor. En contraste, la autofosforilación de tirosina inducida por VEGF-A de mutaciones que albergan el receptor quimérico en D4 de VEGFR2 incluyendo una mutación o mutaciones D392A en donde tanto Asp387 como Arg391 fueron sustituidos por residuos Ala (DR2A), permanecieron sin cambio (figura 30D), lo que demuestra que debe estar implicada una interfase diferente en la transmisión de interacciones D4 observadas en imágenes EM de dímeros de ectodominio VEGFR2 inducidos por VEGF-A (Ruch y asociados, Nat. Struct. Mol Biol, 14(3):249-250 (2007)).

Se utilizó centrifugación analítica para determinar la constante de disociación para la dimerización de la región D7 aislada. Los experimentos de centrifugación analítica llevados a cabo utilizando concentraciones 4 x 10"5, 8 x 10~5 y 1.6 x 10"4 M de proteína mostraron que D7 aislado permaneció monomérico en la solución en una concentración tan alta como 10"4 M, lo que indica que la constante de disociación de la dimerización D7 excede 10"4 M. Se encontró una constante de disociación de alto nivel similar para la dimerización de D4 o D5 aislado de KIT o PDGFR. Se ha mostrado previamente, que después de la dimerización inducida por SCF o PDGF, la concentración local de los dos promotores KIT o PDGFR vecinos en la membrana celular, está dentro del rango de 4 -6 x 10"4 M. Esto junto con la capacidad de dimensión reducida, permite interacciones laterales eficientes y la formación de contactos homotípicos estables entre pares de dominio tipos Ig que enlazan entre sí con baja afinidad en la membrana celular. Además, los contactos homotípicos entre el dominio tipo Ig próximo a la membrana en RTKs tipo-lll y tipo-V están soportados por interacciones laterales adicionales que tienen lugar entre las regiones TM y citoplásmicas de los receptores vecinos en una forma cooperativa.

Estructura del dominio extracelular D7 VEGFR Con el objeto de determinar las bases moleculares que subyacen el papel desempeñado por D7 en activaciones VEGFR2 inducidas por ligando la estructura de cristal de este dominio tipo Ig fue determinada. Los cristales fueron obtenidos en el grupo de espacio \2 2^2^ con una molécula D7 simple por unidad asimétrica junto con 28 moléculas de agua. La estructura D7 consiste en los aminoácidos 667 a 756 de VEGFR2 y difracciona rayos X a una resolución de 2.7 A. La estructura fue determinada por el reemplazo molecular con un modelo basado en la estructura de telokina (código PDB: 1TLK) (Holden y asociados, J. Mol. Biol, 227(3): 840-851 (1992)). Las dos copias de D7 en el complejo son muy similares entre sí con una desviación r.m.s. de 0.1 A. D7 asume un doblez IgSF típico que consiste en un emparedado-ß formado por dos hojas de cuatro hebras, una que comprende las hebras A, B, D y E, y la segunda comprende las hebras A', G, F y C. La primera mitad de la hebra A forma un enlace de hidrógeno con la hebra B y la hebra A' forma enlaces de hidrógeno con la hebra G, similar a la estructura del dominio tipo Ig Ig1 e I g 2 de la región extracelular en la cinasa de tirosina receptora MuSK (Stiegler y asociados, J. Mol. Biol, 364(3):424-433 (2006)). La conexión de cruce entre la hebra ß? y PF, incluye una vuelta helicoidal simple en los residuos 729-731. D7 despliega diversas características del doblez VEGFR2, incluyendo un enlace de disulfuro conservado entre Cys688 de ß? y Cys737 de pF, y un residuo de triptofan de signatura que se empaca contra el enlace de disulfuro para formar el núcleo hidrofóbico. La comparación estructural utilizando DALI (Holm y asociados, Curr. Protoc. Bioinformatics, Capítulo 5, Unidad 5:5 (2006)), demuestra que entre los dominios tipo Ig de VEGFR2, D7 es el más similar a telokina (código PDB: 1TLK) (Holden y asociados, J. Mol. BioL, 227(3):840-851 (1992)), con una calificación-Z de 13.4 y una r.m.s.d. de 1.5 A para los 89 residuos CP alineados. D7 contiene 16 de las 20 posiciones clave en el perfil de estructura V que define el conjunto-l (Harpaz y Chothia, J. Mol. BioL, 238(4):528-539(1994)). Se forma un enlace de disulfuro de hebra cruzada expuesto adicional, a través de un par de Cys localizados en F (Cys740) y pG (Cys745). Esta característica está altamente conservada en VEGFR2 y VEGFR3, pero no en VEGFR1.

La estructura de cristal demuestra que los contactos homotípicos de D7 son transmitidos por dos hojas formadas por las hebras ABED de D7 de cada promotor, en donde Arg726 de un promotor señala hacia Asp731 del otro, dando como resultado un área de superficie enterrada de aproximadamente 360 A. La figura 31B muestra que Arg726 y Asp731 forman puentes de sal y contactos van der Waals. La estructura del dímero D7 es muy similar a los contactos homotípicos D4 observados en la estructura de dímero extracelular KIT (código PDB: 2E9W) (Yuzawa y asociados, Cell, 130(2):323-334 (2007)). Además, D7 de VEGFR2 exhibe una fuerte polarización del campo electrostático con una superficie general cargada en forma negativa con la excepción de una tira central cargada en forma positiva recta a lo largo de la interfase D7-D7 (figura 31C). La interfase cargada fuertemente puede evitar la asociación aberrante de las molécula receptoras monoméricas antes del estímulo con ligando.

La comparación de la estructura de D4 de KIT con la estructura de D7 de VEGFR2 utilizando DALI (Holm y asociados, Curr. Protoc. Bioinformatics, Capítulo 5, Unidad 5:5 (2006)) mostró una similitud remarcada con una calificación-Z de 10.4 y una r.m.s.d. de 1.8 A para los 83 residuos Ca alineados. La posición del lazo EF en las dos estructuras es casi idéntica, y la distancia entre el C-termino es de aproximadamente 15 A para las estructuras diméricas tanto para D4 como D7 (figura 33). La alta similitud entre VEGFR D7 y KIT D4 tanto en estructura como en función, sugiere un mecanismo bien conservado para la activación RTK, y proporciona evidencia adicional para orígenes ancestrales comunes de las RTKs tipo III y tipo V. En forma interesante, los genomas de Drosofila (Cho y asociados, Cell, 108(6):865-876 (2002)), C. elegans (Plowman y asociados, Proc. Nat'l. Acad. Sel U.S. A., 96(24):13603-13610 (1999)), ascidia (Satou y asociados, Dev. Genes EvoL, 213(5-6):254-263 (2003)) y erizo de mar (Duloquin y asociados, Development, 134( 12):2293-2302 (2007)) contienen una sola familia de RTK tipo VEGFR/PDGFR que contienen siete dominios tipo Ig en su región extracelular. Los genes RTK t i p o - 1 II y tipo-V fueron segregados en forma funcional en vertebrados, pero se localizan en forma adyacente entre sí en los cromosomas (Shibuya, Biol Chem., 383( 0): 573-1579 (2002) y Grassot y asociados, Mol. Biol. Evol, 23(6): 1232-1241 (2006)). En humanos, los agentes para la RTK clase III y clase V se encontraron en tres grupos, 4q12 (KIT, PDGFRa y VEGFR2), 5q33 (FMS, PDGFR y VEGFR3) y 13q12 (FLT3 y VEGFR1). La filogenia de las RTKs clase III y clase V, sugiere que estas 8 RTKs fueron generadas por 2 vueltas de duplicación cis y 2 vueltas de duplicación trans (Grassot y asociados, Mol Biol Evol, 23(6): 1232-1241 (2006)). El motivo altamente conservado en la región de lazo EF también es identificado D7 de VER3 y VER4; dos genes de receptor tipo VEGFR/PDGFR de C. elegans. Se encontró un motivo similar en D7 del receptor tipo VEGFR/PDGFR de erizo de mar, pero no en el receptor tipo VEGFR/PDGFR de Drosofila. En forma interesante, tres de los diez dominios tipo Ig del receptor tipo VEGFR/PDGFR de ascidia, contienen motivos típicos de lazo EF. Los contactos homotípicos entre D3, D6 y D9 del receptor de ascidia tipo VEGFR/PDGFR, pueden ser requeridos para la activación inducida por ligando de una RTK que contiene 10 dominios tipo Ig en su región extracelular.

Los experimentos presentados en este ejemplo demuestran que la RTK tipo-lll y tipo-V son activadas por un mecanismo común en donde los contactos homotípicos transmitidos por los dominios tipo Ig próximos a la membrana, aseguran que las regiones TM y citoplásmicas de dos monómeros receptores, son llevadas hasta una proximidad cercana y orientación correcta, para permitir una trans-autofosforilación, activación de cinasa y señalización celular eficiente. La combinación de la dimerización inducida por ligando junto con múltiples asociaciones homotípicas de baja afinidad entre los dominios tipo Ig próximos a la membrana, proporciona un mecanismo simple pero eficiente para la señalización de transmembrana inducida por ligando. Además, la baja afinidad de enlace de los dominios tipo Ig individuales hacia cada uno de los otros, evita la activación de receptor accidental de los monómeros de receptor antes del encaje del ligando. Las regiones de contacto homotípico proporcionan objetivos ideales para la intervención farmacológica de la activación RTK patológica y la señalización celular.

Epítopes contiguos de Regiones D7 de VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3 Se llevo a cabo una alineación de secuencia a base de estructura. Esta alineación reveló epítopes contiguos potenciales en las regiones D7 VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3 que pueden ser reconocidas por las porciones de la presente invención (tabla 8). Los epítopes se localizan en la hebra B, D, E, el lazo A'B, el lazo CD, el lazo DE y el lazo EF. Estos epítopes se localizan en la interfase que transmite contactos D7 homotípicos.

Tabla 8: Epítopes contiguos en Regiones D7 VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3 Materiales y Métodos para el Ejemplo 28 1. Expresión, purificación y cristalización de proteína Se expresó D7 de VEGFR2 (aminoácidos 657-765) que contienen una etiqueta 6xHis-tag N-terminal en E. Coli utilizando vector PET28a. Se recolectaron los cuerpos de inclusión y se solubilizaron en clorhidrato de guanidina 6 (pH8.0). D7 se volvió a doblar mediante dilución en forma de gotas de la proteína en amortiguador de redoblez que contiene 10mM de Tris (pH8.0), 2mM de glutationa reducida y 0.2mM de glutationa oxidada con una concentración de proteína final en 80 a 100µg/ml. El redoblez se llevó a cabo a una temperatura de 4°C durante 48 horas con agitación. La solución de redoblez se aclaró mediante filtración utilizando una unidad de filtro de 0.45 pm y se purificó mediante columna de sefarosa FastQ, seguido de exclusión por tamaño (S200, GE Healthcare) y cromatografía de intercambio de aniones (Mono Q, GE Healthcare). Se eliminó la etiqueta 6xHis N-terminal mediante digestión de trombina. Se concentró la proteína D7 a 15 mg/ml en un amortiguador que contiene 25 mM de Tris (pH 8.0) y 200 mM NaCI; y se sometió a clasificación extensa para cristalización y optimización (investigación Hampton, clasificación de cristal). Los cristales del ectodominio D7 con dimensiones aproximadas de 300 x 75 x 20 µ? fueron crecidos en ácido succínico 0.2M y 16% de PEG3350 a una temperatura de 4°C. Todos los cristales fueron sumergidos en una solución de depósito suplementada con de 5 a 18% de glicerol durante varios segundos, enfriada en forma instantánea y se mantuvo en una corriente de gas de nitrógeno en 100K durante la recolección de datos. Los cristales pertenecieron al grupo de espacio 1212^ con dimensiones de célula unitaria de a = 39.476Á, b = 76.99lA y c=102.034 A con una molécula por unidad asimétrica. Los datos de difracción fueron recolectados en una resolución de 2.7Á con un detector ADSD quantum-210 CCD en la línea de rayo X29A de NSLS, Brookhaven National Laboratory. Todos los grupos de datos fueron procesados y escalados utilizando el paquete del programa HKL2000 (Otwinowski y Minor, Methods in Enzymology, 276 (parte A):307-326 (1997)). Las estadísticas de recolección de datos se resumen en la tabla 7. La estructura se resolvió mediante reemplazo molecular con Phaser, utilizando modelos basados en las estructuras de los dominios Ig de MUSK (2IEP) (Stiegler y asociados, J. Mol. Biol., 364(3):424-433 (2006)), telokina (ITLK) (Holden y asociados, J. Mol. Biol., 227(3):840-851 (1992)) y D4 de KIT (2E9W) (Yuzawa y asociados., Cell, 130(2):323-344 (2007)) como modelos de búsqueda. La estructura se refino en una resolución de 2.7A con un factor-R cristalográfico del 22.7% y un factor-R libre de 27.7% (tabla 7). Las coordenadas atómicas de VEGFR2 D7 fueron depositadas en el Banco de Datos de Proteína con el código de acceso XXX. Se produjeron imágenes moleculares utilizando el software Pymol y CCP4MG (Potterton y asociados., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 60 (Pt. 12 Pt. 1): 2288-2294 (2004)).

Tabla 7: Recolección de Datos y Estadísticas de Refinamiento para VEGFR-D7 a Los valores en paréntesis son estadísticas de la interfase de resolución más alta para SEB (2.8-2.7 A). b f?8mb¡nac =? /j - <l> /?/j, en donde /j es la intensidad de una reflexión individual y es la intensidad promedio de la reflexión. °fttrabajo =?NF0i - <|FCII> /? IF0I, en donde Fc es el factor de estructura calculada. d Riibre es Rtrabajo pero calculado para un 10% de la reflexión seleccionada en forma aleatoria no incluida en el refinamiento. 2. Alineación de secuencia de aminoácido Se llevó a cabo la alineación de secuencia de aminoácido de D7 utilizando ClustalW (Thompson y asociados, Nucleic Acids Res., 22(220:4673-4680 (1994)) y posteriormente se ajustó en forma manual con base en las restricciones del doblez IgSF conjunto-I para 20 residuos de aminoácido. Las secuencias de aminoácido de VEGFRs humanos se utilizaron como consulta para buscar en las bases de datos no redundantes (nr) para secuencias homologas utilizando PSI-BLAST (Altschul y asociados, J. Mol. Biol., 215(3):403-410 (1990)). La alineación de las secuencias de aminoácido así como el archivo D7 PDB, fueron presentados al servidor Consurf 3.0 (Landau y asociados, Nucleic Acids Res., 33 (Web Server Issue), W299-302 (2005)), para generar rangos de evolución normalizados de probabilidad máxima para cada posición de la alineación, en donde los bajos rangos de divergencia corresponden a una alta conservación de secuencia. Como con la salida Consurf, las 9 calificaciones de conservación continua se dividen en una escala separada de 9 depósitos para visualización, de modo que el depósito 9 contiene las posiciones más conservadas (marrón) y el depósito 1 contiene las posiciones más variables (cian). 3. Vectores de expresión VEGFR y generación de receptores quiméricos El cADN de VEGFR1 y VEGFR2 humanos, fueron proporcionados generosamente por el Dr. Masabumi Shibuya (Sawano y asociados, Blood, 97(3):785-791 (2001 )). El cADN de VEGFR2 fue subclonado en el vector de expresión pcDAN3 mediante PCR e insertado en los sitios Xhol/Xbal. Los receptores quiméricos compuestos de las regiones extracelulares ya sea de VEGFR1 o VEGFR2, fueron fusionados para la región de transmembrana y citoplásmica de PDGFR-ß. Se agregó una etiqueta-flag al C-término, y el receptor quimérico fue clonado en los sitios EcoRI/Xhol del vector de expresión retroviral pLXSHD. 4. Líneas celulares y vectores de expresión Las líneas de célula 3T3 que expresan en forma estable el receptor quimérico VEGFR1/2-PDGFR, fueron generadas mediante infección retroviral tal como se describió previamente (Yuzawa y asociados, 2007 y Cochet y asociados, 1988). Las células fueron seleccionadas con L-histidinol y los conjuntos que corresponden a un nivel de expresión similar, se utilizaron en los experimentos.

Las células HEK293 fueron transfectadas temporalmente con 1 ig de ADN y se dejaron en inanición de suero durante la noche antes de la estimulación VEGF. Las células fueron tratadas con 200ng/ml de VEGF y los Usados celulares fueron inmunoprecipitados con anticuerpos contra VEGFR1 o VEGFR2 seguido de ¡nmunomanchado con anticuerpos anti-pTyr (PY20, Santa Cruz). Los lisados de célula total fueron analizados mediante SDS-PAGE y sometidos a inmunomanchado con anticuerpos anti-MAPK y anti-MAPK (Cell Signaling) respectivamente.

VEGF se produjo en células sf9 utilizando el vector de expresión de baculovirus pFastBad tal como se describió previamente (Cohén y asociados, Growth Factors, 7(2):131-138 (1992)). Se purificó VEGF utilizando cuentas de sefarosa de heparina para el >80% de pureza mediante experimentos SDS PAGE manchados con azul Comassie. 5. Ultracentrif ugación analítica Se llevaron a cabo experimentos de velocidad de sedimentación con un Beckman Optima XL-I en el centro para Ultracentrifugación Analítica de Ensambles Macromoleculares (Department of Biochemistry, University of Texas Health Science Center, San Antonio, TX). La proteína D7 en una concentración de 4x10"5M, 8x10"5 M y 1.6x10"4 M en amortiguador que contiene 25 mM Tris, pH 8 y 100 mM NaCI, fue sometida a centrifugación en 50,000 rpm a una temperatura de 20°C. Los datos de velocidad se analizaron con un análisis de espectro bidimensional en combinación con el análisis Monte Cario.

Equivalentes Los expertos en la técnica pueden reconocer, o tener la capacidad de confirmación utilizando no más que experimentación de rutina, muchas equivalentes a las modalidades específicas de la presente invención aquí descritas. Dichos equivalentes están proyectados para estar comprendidos en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una porción que enlaza al ectodominio de un receptor de factor de crecimiento endotelial vascular humano (receptor VEGF), en donde porción antagoniza la actividad del receptor VEGF.

2. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a un dominio tipo Ig de un receptor VEGF humano.

3. La porción tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio tipo Ig no es responsable del enlace de un ligando al receptor VEGF.

4. La porción tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio tipo Ig es responsable del enlace de un ligando al receptor VEGF.

5. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción no bloquea la interacción entre el receptor VEGF y un ligando del receptor VEGF.

6. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción bloquea la interacción entre el receptor VEGF y un ligando del receptor VEGF.

7. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción no evita la dimerización del receptor VEGF.

8. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción evita la dimerización del receptor VEGF.

9. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción evita la interacción entre una región próxima a la membrana del ectodominio de cada promotor del receptor VEGF.

10. La porción tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque la interacción es homotípica.

11. La porción tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque la interacción es heterotípica.

12. La porción tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque la región próxima a la membrana del ectodominio es el séptimo dominio tipo (D7) de un receptor VEGF.

13. La porción tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizada porque la porción enlaza a la siguiente secuencia de consenso del dominio D7 de un receptor VEGF: L/l X-i R F X2 X3 X4 D/E X5 G (SEC ID NO: 158), en donde L es Leucina, I es Isoleucina, R es Arginina, F es un aminoácido hidrofóbico, D es Ácido Aspártico, E es Ácido Glutámico, G es Glicina; y ?,, X2, X3, X4 y X5 son cualquier aminoácido.

14. La porción tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizada porque F es Valina; ?? se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Glutamina, Ácido Glutámico y Ácido Aspártico; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Usina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Ácido Glutámico, Glutamina y Valina; X4 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico y Valina; y X5 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Glicina, Serina y Glutamina (SEC ID NO: 159).

15. La porción tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque la porción origina que la región próxima a la membrana del ectodominio de cada promotor de receptor VEGF, sea separada por una distancia mayor a 16 A.

16. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el receptor VEGF es VEGFR1.

17. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el receptor VEGF es VEGFR2.

18. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción receptor VEGF es VEGFR3.

19. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción asegura el ectodominio del receptor VEGF en un estado inactivo.

20. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza al residuo de aminoácido Arg726 de VEGFR2.

21. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza al residuo de aminoácido Asp731 de VEGFR2.

22. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a residuos de aminoácido Arg726 y Asp731 de VEGFR2.

23. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en residuos de aminoácido 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732 y 733 de VEGFR2.

24. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza al residuo de aminoácido Arg720 de VEGFR1.

25. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza al residuo de aminoácido Asp725 de VEGFR1.

26. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a los residuos de aminoácido Arg720 y Asp725 de VEGFR1.

27. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a uno o más residuos de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los residuos de aminoácido 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726 y 727 de VEGFR1.

28. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza al residuo de aminoácido Arg737 de VEGFR3.

29. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza al residuo de aminoácido Asp742 de VEGFR3.

30. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a los residuos de aminoácido Arg737 y Asp742 de VEGFR3.

31. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a uno o más residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácido 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743 y 744 de VEGFR3.

32. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a un epítope de conformación en el receptor VEGF.

33. La porción tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizada porque el epítope de conformación está compuesto de dos o más residuos en el dominio D7 de receptor VEGF.

34. La porción tal como se describe en la reivindicación 32, caracterizada porque el epítope de conformación comprende los residuos de aminoácido Arg726 y Asp731; Arg 720 y Asp 725; o Arg737 y Asp742.

35. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción bloquea una autofosforilación de tirosina inducida por ligando del receptor VEGF.

36. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción bloquea una internalización inducida por ligando del receptor VEGF.

37. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción enlaza a un epítope contiguo en el receptor VEGF.

38. La porción tal como se describe en la reivindicación 37, caracterizada porque el epítope contiguo está compuesto de dos o más residuos en el dominio D7 de receptor VEGF.

39. La porción tal como se describe en la reivindicación 38, caracterizada porque el epítope contiguo es un epítope seleccionado del grupo que consiste en 672VAISSS677 de VEGFR 1, 678TTLDCHA684 de VEGFR 1, 685NGVPEPQ691 de VEGFR 1 , 700KIQQEPG706 de VEGFR1, 707IILG710 de VEGFR1, 71 PGS713 de VEGFR1, 7 STLFI718 de VEGFR1, 719ERVTEEDEG V728 de VEGFR 1, 689VNVSDS694 de VEGFR3, 695LEMQCLV701 de VEGFR3, 702AGAH APS708 de VEGFR3, 717LLEEKSG723 de VEGFR3, 72 VDLA727 de VEGFR3, 728DSN730 de VEGFR3, 731QKLSI735 de VEGFR3 y 736QRVREEDAGR745 de VEGFR3, 678TSIGES683 de VEGFR2, 68 l E VSCTA690 de VEGFR2, 691SGNPPPQ697 de VEGFR2, 706TLVEDSG712 de VEGFR2, 713IVLK716 de VEGFR2, 717DGN719 de VEGFR2, 720RNLTI724 de VEGFR2 y 725RRVRKEDEGL734 de VEGFR2.

40. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción es un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo.

41. La porción tal como se describe en ia reivindicación 40, caracterizada porque el anticuerpo o parte de enlace de antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico y un anticuerpo quimérico.

42. La porción tal como se describe en la reivindicación 41, caracterizada porque el anticuerpo o parte de enlace de antígeno de mismo, comprende una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las regiones constantes lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA y IgE.

43. La porción tal como se describe en la reivindicación 42, caracterizada porque la región constante de cadena pesada del anticuerpo es lgG1.

44. La porción tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizada porque el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv de cadena simple, un SMIP, un aficuerpo, un avímero, un nanocuerpo y un anticuerpo de dominio simple.

45. La porción tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizada porque el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, enlaza a un dominio tipo Ig de una cinasa de tirosina receptora con una KD seleccionada del grupo que consiste en 1 x 10~7 M o menos, más preferentemente 5x10"8 M o menos, más preferentemente 1x10 M o menos, más preferentemente 5x10"9 M o menos.

46. Un hibridoma que produce el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 40 a 45.

47. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción es una molécula pequeña.

48. La porción tal como se describe en la reivindicación 47, caracterizada porque la porción enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en el residuo de aminoácido Arg 726 de VEGFR2, Asp731 de VEGFR2, Arg720 de VEGFR1 , Asp725 de VEGFR1 , Arg737 de VEGFR3 y Asp742 de VEGFR3.

49. La porción tal como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada porque la porción es una molécula peptídica.

50. La porción tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizada porque la molécula peptídica está diseñada con base en un dominio tipo Ig del receptor VEGF.

51. La porción tal como se describe en la reivindicación 50, caracterizada porque la molécula peptídica está diseñada con base en el dominio D7 del receptor VEGF humano.

52. La porción tal como se describe en la reivindicación 51 , caracterizada porque la molécula peptídica comprende la estructura: L/l X R F X2 X3 X4 D/E X5 G (SEC ID NO: 158), caracterizada porque L es Leucina, I es Isoleucina, R es Arginina, es un aminoácido hidrofóbico, D es Ácido Aspártico, E es Ácido Glutámico, G es Glicina; y ??, X2, X3, X4, X5 son cualquier aminoácido.

53. La porción tal como se describe en la reivindicación 52, caracterizada porque F es Valina; X se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Glutamina, Ácido Glutámico y Ácido Aspártico; X2 se selecciona del grupo que consiste en Arginina, Lisina y Treonina; X3 se selecciona del grupo que consiste en Lisina, Ácido Glutámico, Glutamina y Valina; X4 se selecciona del grupo que consiste en ácido Ácido Glutámico y Valina; y X5 se selecciona del grupo que consiste en Ácido Glutámico, Glicina, Serina y Glutamina (SEC ID NO: 159).

54. La porción tal como se describe en la reivindicación 50, caracterizada porque la molécula peptídica comprende una estructura la cual es al menos el 80% idéntica a los residuos de aminoácido 724-733 de VEGFR2 humano.

55. La porción tal como se describe en la reivindicación 50, caracterizada porque la molécula peptídica comprende una estructura que es al menos el 80% idéntica a los residuos de aminoácido 718-727 de VEGFR1 humana.

56. La porción tal como se describe en la reivindicación 50, caracterizada porque la molécula peptídica comprende una estructura la cual es al menos el 80% idéntica a los residuos de aminoácido 735-744 de VEGFR3 humano.

57. La porción tal como se describe en la reivindicación 50, caracterizada porque la molécula peptídica comprende al menos un residuo de aminoácido-D.

58. La porción tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la porción es una adnectina.

59. Una porción que enlaza a un epítope de conformación en un séptimo dominio tipo Ig de receptor VEGF humano que antagoniza la actividad del receptor VEGF humano, y en donde el epítope de conformación comprende los residuos Arg726 y Asp731 de VEGFR2; los residuos Arg720 y Asp725 de VEGFR1; o los residuos Arg737 y Asp742 de VEGFR3.

60. Una porción que enlaza a los residuos de aminoácido Arg726 y Asp731 de VEGFR2; residuos de aminoácido Arg720 y Asp725 de VEGFR1; o residuos de aminoácido Arg737 y Asp742 de VEGFR3, para antagonizar de esta forma la actividad del receptor VEGF humano.

61. Una composición farmacéutica que comprende la porción tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 60, y un transportador farmacéuticamente aceptable.

62. El uso de una cantidad efectiva de la porción tal como se describe en cualesquiera reivindicaciones de la 1 a la 60 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora VEGF en un sujeto.

63. El uso tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque la enfermedad asociada con cinasa de tirosina receptora VEGF se selecciona del grupo que consiste en cáncer, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), ateroesclerosis, artritis reumatoide, retinopatía diabética, enfermedad linfática y enfermedades asociadas con dolor.

64. El uso tal como se describe en la reivindicación 63, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste en GIST, AML, SCLC, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer linfático y cáncer de seno.

65. Un método para identificar una porción que enlaza a un dominio tipo Ig de un receptor VEGF, en donde el método comprende: contactar un receptor VEGF con una porción candidata; contactar en forma simultánea o en secuencias el receptor VEGF con un ligando para el receptor VEGF; y determinar si la porción afecta la colocación, orientación y/o distancia entre los dominios tipo Ig del receptor VEGF dimérico inducido por ligando, para identificar de esta manera una porción que enlaza a un dominio tipo Ig de un receptor VEGF.

66. El método tal como se describe en la reivindicación 65, caracterizado porque la porción asegura el ectodominio del receptor VEGF en un estado inactivo.

67. El método tal como se describe en la reivindicación 65, caracterizado porque la porción enlaza al séptimo dominio tipo Ig (D7) del receptor VEGF.

68. Un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, que enlaza a un epítope de conformación en un séptimo dominio tipo Ig de receptor VEGF humano, en donde el anticuerpo, o parte de enlace de antígeno del mismo, antagoniza la actividad del receptor VEGF humano, y en donde el epítope de conformación comprende los residuos Arg726 y Asp731 de VEGFR2; los residuos Arg720 y Asp725 de VEGFR1 ; o los residuos Arg737 y Asp742 de VEGFR3.

69. Un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque enlaza a los residuos de aminoácido 724-733 de VEGFR2, para antagonizar de esta forma la actividad de VEGFR2.

70. Un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque enlaza a los residuos de aminoácido Arg720 y Asp725 de VEGFR1, para antagonizar de esta forma la actividad de VEGFR1.

71. Un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque enlaza a los residuos de aminoácido Arg737 y Asp742 de VEGFR3, para antagonizar de esta forma la actividad de VEGFR3.

72. Un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Arg726 y Asp731 de receptor VEGF humano, para antagonizar de esta forma la actividad del receptor VEGF humano.

73. Un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Arg720 y Asp725 de receptor VEGF humano, para antagonizar de esta forma la actividad del receptor VEGF humano.

74. Un anticuerpo aislado, o una parte de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque enlaza al menos a uno de los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste en Arg737 y Asp742 de receptor VEGF humano, para antagonizar de esta forma la actividad del receptor VEGF humano.