MX2012007545A - Antigeno ndv recombinante y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

Vacunas contra el NDV que comprenden vacunas de subunidades basadas en HN del NDV. El HN NDV se puede expresar en plantas o algas, inclusive microalgas. La invención también abarca vectores recombinantes que codifican y expresan antígenos, epitopes o inmunógenos del NDV que se pueden usar para proteger animales contra el NDV. También abarca un régimen de vacunación compatible con la estrategia DIVA, incluyendo un esquema desensibilización-refuerzo usando vacunas y vacunas de subunidades inactivadas o de vectores virales.

Description

ANTÍGENO NDV RECO BINANTE Y USOS DEL MISMO REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional N° Acta: 61/290.297, presentada el 28 de diciembre, 2009.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden un antígeno del NDV, en particular composiciones farmacéuticas que comprenden el antígeno HN del NDV.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia de virus Paramyxoviridae incluye patógenos tanto humanos (virus del sarampión, de paperas, paraNDV y del sincicio respiratorio) como de animales (virus de la enfermedad de Newcastle y el virus de la peste bovina) que causan un impacto significativo sobre la salud pública así como la economía global (Lamb et al., 2007, Paramyxoviridae: The viruses and Their Replication, páginas 1449-1496). Los miembros de esta familia de virus se definen por un genoma de ARN de cadena simple, negativo, monopartito. La familia Paramyxoviridae consiste de dos subfamilias, Paramyxovirínae y Pneumovirinae. Debido a la reciente reclasificación, la subfamilia Paramyxovirínae incluye cinco géneros, es decir Morbillivirus, Henipavirus, Rubulavirus, Respirovirus y Avulavirus en tanto Pneumovirinae incluye Pneumovirus y Metapneumovirus (Mayo, 2002, Aren Virol., 147: 1655-63). Los paramyxovirus de aves (APMV) se clasifican en el género Avulavirus y comprenden nueve serotipos antigénicamente distintos que se han definido usando pruebas de inhibición de la hemaglutinación (Hl) (Alexander, 1988, Newcastle disease, p. x, 378 p). Entre los nueve serotipos, las formas aisladas que pertenecen al subtipo APMV-1 pueden causar una enfermedad devastadora en aves de corral de importancia comercial y se clasifican como virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) velogénico. Las formas más leves del NDV se denominan formas aisladas mesogénicas y lentogénicas, en donde esta última forma es mayormente asintomática en las aves de corral domésticas. El ARN genómico del NDV contiene genes que codifican seis proteínas: HN (hemaglutinina-neuraminidasa), NP (proteína de la nucleocápside), P (fosfoproteína), M (proteína de la matriz), F (proteína de fusión) y L (ARN polimerasa dependiente de ARN).

Las vacunas de vectores virales representan una de las áreas de crecimiento más rápido en el desarrollo de vacunas. Muchas de las vacunas en desarrollo clínico para las enfermedades infecciosas globales más importantes, como VIH, tuberculosis y malaria, son vectores virales. La desventaja de los vectores virales usados actualmente es la existencia de anticuerpos de origen materno o anticuerpos adquiridos debido a una infección anterior.

Recientemente, se han investigado plantas y algas como una fuente para la producción de agentes terapéuticos tales como vacunas, anticuerpos y biofármacos. Estos sistemas de expresión en plantas y algas ofrecen diversas ventajas. Por ejemplo, la derivación de vacunas de productos de expresión de plantas o algas puede eliminar el riesgo de contaminación con patógenos animales, proveer un entorno estable al calor y podría evitar los peligros relacionados con las inyecciones si se administran como un agente comestible (Thanavala et al., Expert Rev. Vaccines 2006, 5, 249-260). Además, las plantas o algas se pueden cultivar a gran escala y se pueden emplear en instalaciones de cultivo, cosecha y almacenamiento existentes. Aún más, el costo de producción y de procesamiento para derivar agentes terapéuticos de plantas es menor (Giddings et al., Nature Biotech. 2000, 18, 1151-1155) o algas. Las proteínas F y HN del NDV fueron expresadas en plantas de papa para desarrollar una vacuna comestible contra el NDV (Berinstein A., et al., 2005, Vaccine 23: 5583-6689). WO2004/098533 divulga la expresión del antígeno HN del NDV y del antígeno HA del virus de la influenza de aves en plantas de tabaco. En la publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: US2010/0189731 se divulga la expresión del antígeno HA del virus de la influenza de aves en plantas de lenteja de agua.

El desarrollo de vacunas, anticuerpos, proteínas y biofármacos a partir de plantas o algas está muy alejado de un proceso remediación, y existen numerosos obstáculos asociados comúnmente con dicha producción de vacunas. Las limitaciones de una producción exitosa de vacunas de plantas incluye el bajo rendimiento del bioproducto o antígeno expresado (Chargelegue et al., Trends in Plant Science 2001 , 6, 495-496), la inestabilidad de las proteínas, inconsistencias en la calidad del producto (Schillberg et al., Vaccine 2005, 23, 1764-1769) y una capacidad insuficiente para producir productos de tipo viral del tamaño y la inmunogenicidad esperados (Arntzen et al., Vaccine 2005, 23, 1753-1756). Con el fin de solucionar estos problemas, la optimización de codones, enfoques cuidadosos para la cosecha y purificación de productos de plantas o algas, el uso de partes de plantas tales como cloroplastos para incrementar la captación del material y un direccionamiento subcelular mejorado constituyen todas como estrategias potenciales a considerar (Koprowski, Vaccine 2005, 23, 1757-1763).

Teniendo en cuenta el potencial efecto de patógenos de animales, tal como el NDV, sobre la salud pública y la economía, se necesitan métodos para prevenir infecciones y proteger a los animales. Aún más, persiste la necesidad de una vacuna eficaz contra los patógenos y un método adecuado para elaborar la vacuna.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones que comprenden antígenos del NDV (virus de la enfermedad de Newcastle) y fragmentos y variantes de los mismos. Los antigenos del NDV y fragmentos y variantes de los mismos poseen propiedades inmunogénicas y protectoras. Preferentemente, los antígenos del NDV comprenden un antígeno HN NDV (hemaglutinina-neuraminidasa) o fragmento o variante del mismo. Los antígenos del NDV se pueden producir en plantas o algas.

Los antígenos del NDV y fragmentos y variantes de los mismos se pueden formular en vacunas y/o composiciones farmacéuticas. Dichas vacunas o composiciones se pueden usar para vacunar un animal y proveer protección contra al menos una forma del NDV.

Los métodos de la invención incluyen métodos para elaborar los antígenos del NDV y fragmentos y variantes de los mismos en plantas o algas. Los métodos también incluyen métodos de uso, incluyendo la administración a un animal de una cantidad eficaz de uno o más polipéptidos antigénicos del NDV y fragmentos y variantes de los mismos para generar una respuesta inmunogénica protectora. Después de la producción en plantas o algas, los polipéptidos antigénicos del NDV y fragmentos y variantes de los mismos, se pueden purificar parcial o sustancialmente para su uso como una vacuna o composición.

También se proveen conjuntos de elementos que comprenden al menos un polipéptido antigénico del polipéptido antigénico o un fragmento o variante del mismo, así como instrucciones para su uso.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La siguiente descripción detallada, que se ofrece a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención exclusivamente a las realizaciones especificas descritas, se comprenderá mejor con las figuras adjuntas, en donde: La Figura 1 provee una tabla que muestra las SEQ ID N° asignadas a las secuencias de polinucleótidos y proteínas.

La Figura 2 provee las secuencias de ADN y de proteínas de los genes HN del NDV y los sitios de glucosiiación.

La Figura 3 muestra el análisis HA en un formato de placas de 96 cavidades.

La Figura 4 muestra el análisis por SDS-PAGE y transferencia Western del gen HN expresado del NDV.

La Figura 5 muestra las imágenes de tinción Coomassie, tinción de ácido periódico, inmunotransferencia para el análisis de la glucosiiación y el análisis de sitios de glucosiiación.

Las Figuras 6a y 6b proveen las alineaciones de secuencias de proteínas de HN del NDV de diferentes cepas y secuencias de proteínas maduras (sin un péptido señal).

La Figura 7a provee la alineación de secuencias de ADN de diferentes cepas del NDV. La Figura 7b muestra la alineación de secuencias de ADN entre el ADN de tipo salvaje y de codones optimizados (con preferencia por microalgas) que codifica el ADN del HN del NDV y de tipo salvaje y de codones optimizados (con preferencia por lenteja de agua) que codifica el HN del NDV. La Figura 7c representa los mapas de plásmidos para la transformación de plantas de lenteja de agua.

La Figura 8 provee la alineación de secuencias de las proteínas HN del NDV para mostrar la HN región del epitope lineal.

La Figura 9 provee una tabla que muestra la ubicación y presencia de sitios de glucosiiación en el HN del NDV de diferentes cepas.

La Figura 10 provee un mapa gráfico de características de los sitios de glucosilación y la región del epitope lineal HN de la Proteína CA/02 HN NDV (SEQ ID N°:3).

La Figura 11 provee un análisis de la secuencia de péptidos del HN expresado del NDV (SEQ ID N°:3) en algas, La Figura 12 provee el resultado de la prueba de titulación Hl y el resultado de la prueba de mortalidad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Se proveen composiciones que comprenden un antígeno del NDV (virus de la enfermedad de Newcastle), y fragmentos y variantes del mismo, que generan una respuesta inmunogénica en un animal. El antígeno del NDV, o fragmentos o variantes del mismo, se puede producir en algas. El antígeno del NDV, o fragmentos o variantes del mismo, se puede formular en vacunas o composiciones farmacéuticas y usar para generar o estimular una respuesta protectora en un animal. En una forma de realización el antígeno del NDV es un polipéptido de hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del NDV o un fragmento o variante activo del mismo.

Se considera que los polipéptidos antigénicos de la invención pueden ser polipéptidos de longitud completa o fragmentos o variantes activos de los mismos. Los "fragmentos activos" o "variantes activas" indican que los fragmentos o las variantes retienen la naturaleza antigénica del polipéptido. Por consiguiente, la presente invención abarca cualquier polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno del NDV que genere una respuesta inmunogénica en un animal. El polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno del NDV puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno del NDV que tenga capacidad de generar, provocar, inducir o estimular una respuesta en un animal.

Un polipéptido antigénico de interés particular es la hemaglutinina-neuraminidasa (HN). La glicoproteína, hemaglutinina-neuraminidasa (HN) tiene la región transmembrana ubicada en la región amino-terminal lo cual la convierte en una proteína de membrana integral de tipo II que está relacionada con la unión viral a las células a través de receptores de ácido siálico. La proteína HN sobresale de la envoltura permitiendo que el virus contenga ambas actividades hemaglutinina y neuraminidasa (Yusoff K, Tan WS, 2001 , Avian Pathol 30: 439-455).

Sin embargo, hay diferentes antígenos, cualquiera de los cuales se puede usar en la práctica de la invención. Se considera además que se pueden usar los precursores de cualquiera de estos antígenos.

Los polipéptidos antigénicos de la invención pueden ofrecer protección contra el NDV. Es decir, pueden estimular una respuesta inmune en un animal. Un "antígeno" o "inmunógeno" se refiere a una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una extensión o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune luego de su presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epitope, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Como alternativa, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o una antitoxina.

Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en la presente para hacer referencia a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos y puede estar interrumpido por porciones químicas distintas de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que ha sido modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo por formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con una marca o un componente bioactivo.

El término "polipéptido inmunogénico o antigénico" según se usa en la presente, incluye polipéptidos que son ínmunológicamente activos en el sentido que una vez administrado al huésped, puede evocar una respuesta inmune del tipo humoral y/o celular dirigido contra la proteína. Preferentemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por consiguiente, un fragmento de proteína de acuerdo con la invención comprende o consiste esencialmente de o consiste de al menos un epitope o determinante antigénico. Una proteína o un polipéptido "inmunogénico", según se usa en la presente, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma o fragmentos inmunogénicos de la misma. Un "fragmento inmunogénico" significa un fragmento de una proteína que incluye uno o más epitopes y por consiguiente genera la respuesta inmunológica descrita previamente. Dichos fragmentos se pueden identificar usando cualquiera de numerosas de técnicas de mapeo de epitopes bien conocidas en el arte. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epitopes lineales se pueden determinar, por ejemplo, por síntesis concurrente de grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, donde dichos péptidos corresponden a porciones de la molécula de proteína, y reacción de los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos aún están unidos a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en el arte y se describen, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. N°: 4.708.871. De manera similar, los epitopes conformacionales se pueden identificar fácilmente por determinación de la conformación espacial de los aminoácidos tal como, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.

Según se describe en la presente, la invención abarca fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por consiguiente, el término "polipéptido inmunogénico o antigénico" contempla además supresiones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre y cuando el polipéptido funcione produciendo una respuesta inmunológica como se define en la presente. El término "variación conservadora" denota el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o el reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de modo que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. En este sentido, las sustituciones particularmente preferidas en general serán de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos en general se dividen en cuatro familias: (1 ) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina, ¡soleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. A veces los aminoácidos fenilalanina, triptofano y tirosina se clasifican como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro residuo hidrofóbico, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y semejantes; o un reemplazo conservador similar de un aminoácido por un aminoácido relacionado estructuralmente que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente la inmunogenicidad de la proteína se encuentran por ello dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos con estas modificaciones están incluidos en la presente. El término "variación conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos generados contra el polipéptido sustituido también presenten inmunoreacción con el polipéptido no sustituido.

El término "epitope" se refiere al sitio sobre un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicas. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio del determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epitope se pueden identificar en un simple inmunoensayo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno blanco.

Una "respuesta ¡nmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune mediada por células y/o anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta ¡nmunológica" incluye, pero en un sentido no limitativo, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a uno o más antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped presentará ya sea una respuesta ¡nmunológica terapéutica o protectora, de modo tal que aumentará la resistencia a una nueva infección y/o disminuirá la severidad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demuestra por una reducción o falta de los síntomas que normalmente presenta un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un menor título viral en el huésped infectado.

Un "animal" se refiere a mamíferos, aves y semejantes. Un animal o huésped según se usa en la presente incluye mamíferos y seres humanos. El animal se puede seleccionar del grupo que consiste de equinos (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felinos (por ejemplo, eones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo chitas y linces), ovinos (por ejemplo, ovejas), bovinos (por ejemplo, ganado), porcinos (por ejemplo, cerdos), aves (por ejemplo, pollos, patos, gansos, pavos, codornices, faisanes, loros, pinzones, halcones, cuervos, avestruces, emúes y casuarios), primates (por ejemplo, prosimios, tareeros, monos, gibones, simios) y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas del desarrollo, incluyendo las etapas embrionaria y fetal.

El término "plantas", según se usa en la presente, incluye tanto plantas dicotiledóneas (dicot) como plantas monocotiledóneas (monocot). Las plantas dicot incluyen, pero en un sentido no limitativo, legumbres tales como arveja, alfalfa y soja, zanahoria, apio, tomate, papa, tabaco, pimienta, colza oleaginosa, remolacha, col, coliflor, brócoli, lechuga, maní y semejantes. Las plantas monocot incluyen, pero en un sentido no limitativo, cereales tales como trigo, cebada, sorgo y mijo, cebada, triticale, maíz, arroz o avena, caña de azúcar, lenteja de agua, pastos y semejantes. El término "planta" también incluyen una plantas que no florecen incluyendo, pero en un sentido no limitativo, heléchos, cola de caballo, licopodios, musgos, hepáticas, antoceros, algas. Los términos "algas" y "alga", según se usan en la presente incluyen cualquier cepa de algas capaz de producir un polipéptido o un fragmento o una variante del mismo. Las algas pueden incluir, por ejemplo, algas rojas, marrones y verdes, gametofitos y semejantes. Las algas pueden ser microalgas. Las microalgas pueden ser Thraustochytríaceae, por ejemplo, Schizochytríum, Thraustochytrium, Labyrínthuloides y Japonochytrium.

A menos que se expliquen de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan aquí tienen el mismo significado que entiende comúnmente alguien con una experiencia normal en el arte al que pertenece la presente divulgación. Los términos en singular "un", "una", "la" y "el" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. De manera similar, se pretende que la palabra "o" incluya "y" a menos que el contexto claramente indique lo contrario.

Se debe tener en cuenta que en esta divulgación y en particular en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y semejantes pueden tener el significado que se atribuye a los mismos bajo la Ley de Patentes de los EE.UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "incluyendo" y semejantes; y que los términos tales como "que consiste esencialmente de" y "consiste esencialmente de" tienen el significado que se atribuye a los mismos bajo la Ley de Patentes de los EE.UU., por ejemplo, permiten elementos no enumerados explícitamente, pero excluyen los elementos hallados en el arte anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.

Composiciones La presente invención se relaciona con una vacuna o composición del NDV que puede comprender una cantidad eficaz de un polipéptido o antígeno recombinante del NDV y un transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario. El polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno del NDV puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno del NDV que tenga capacidad de generar, provocar, inducir o estimular una respuesta en un animal. En una forma de realización, el polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno del NDV es una hemaglutinina-neuramidasa (HN), una ARN polimerasa, una proteína de fusión (F), una proteína de la matriz, una fosfoproteína y una nucleoproteína. En otra forma de realización, el antígeno del NDV puede ser una hemaglutinina-neuramidasa (HN).

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente de los Solicitantes que un gen recombinante del HN del NDV expresado en un sistema de expresión de proteínas en plantas o algas era altamente inmunogénico y que protegía a los animales contra infecciones por cepas homologas y heterólogas del NDV.

La presente invención se relaciona con una vacuna o composición del NDV que puede comprender una cantidad eficaz de un polipéptido o antígeno recombinante del HN NDV y un transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario. En una forma de realización, el antígeno recombinante HN del NDV es expresado en algas. En aún otra forma de realización, las algas se seleccionan entre Schizochytrium. En una forma de realización, el antígeno recombinante HN del NDV se puede expresar en un sistema de expresión de proteínas de Schizochytrium, como se describe, por ejemplo, en US 7.001.772, US 2008/0022422, US 2006/0275904, US 2006/0286650.

En una forma de realización, el objeto divulgado en la presente está dirigido a una composición que comprende un polipéptido o antígeno recombinante del HN NDV producido por un sistema de expresión de lenteja de agua y material vegetal de la lenteja de agua, incluyendo el género Lemna, y un transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario. En otra forma de realización, el objeto divulgado en la presente está dirigido a una proteína opcionalmente aglicosilada producida por un sistema de expresión de lenteja de agua que comprende un polipéptido o antígeno HN NDV. El polipéptido o antígeno recombinante HN NDV se puede expresar en un sistema de expresión de proteínas de Lemna minor, tal como el sistema LEX de BiolexSM.

En una forma de realización, el transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario puede ser una emulsión de agua-en-aceite. En otra forma de realización, la emulsión de agua-en-aceite puede ser una triple emulsión de agua/aceite/agua (W/O W por sus siglas en inglés). En aún otra forma de realización, el transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario puede ser una emulsión de aceite-en-agua.

En una forma de realización, la composición o vacuna comprende un vector recombinante y un excipiente, transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario. El vector recombinante es un vector de expresión de plantas o algas que puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno NDV. En una forma de realización, el polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno del NDV puede derivar de un ave infectado con NDV o una cepa del NDV de aves.

En una forma de realización, el polipéptido o antígeno del NDV o un fragmento o variante del mismo, comprende un polipéptido HN NDV o un fragmento o variante del mismo. En un aspecto de esta forma de realización, el polipéptido HN o fragmento o variante del mismo es un polipéptido recombinante producido por un gen HN NDV. En otro aspecto de esta forma de realización, el gen HN NDV tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 22 ó 23. En otro aspecto de esta forma de realización, el polipéptido HN NDV o un fragmento o una variante del mismo tiene al menos 80% de identidad con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 10, 11 , 13, 15, 17, 19, 20, 21 ó 28. En otro aspecto de esta forma de realización, el polipéptido HN o un fragmento o una variante del mismo comprende una región del epitope lineal HN. En otro aspecto de esta forma de realización, la región del epitope tiene al menos 80% de identidad con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 10, 11 ó 28.

En una forma de realización, el antfgeno del NDV está parcialmente purificado; o, en otra forma de realización, el antígeno del NDV está sustancialmente purificado. En aún otra forma de realización, el antígeno del NDV está presente en las microalgas cosechadas como un todo. En aún otra forma de realización, el antígeno del NDV está presente en el sobrenadante de baja velocidad.

Los antígenos sintéticos también están incluidos en la definición, por ejemplo, poliepitopes, epitopes flanqueadores y otros antígenos recombinantes o derivados mediante síntesis. Véase, por ejemplo, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Los fragmentos inmunogénicos, a los efectos de la presente invención, habitualmente incluirán al menos 3 aminoácidos aproximadamente, al menos 5 aminoácidos aproximadamente, al menos 10-15 aminoácidos aproximadamente o aproximadamente 15-25 aminoácidos o más aminoácidos, de la molécula. No hay un límite superior crítico para la longitud del fragmento, que podría comprender cerca de la longitud completa de la secuencia de la proteína, o aún una proteína de fusión que comprende al menos un epitope de la proteína.

Por lo tanto, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epitope es aquella que comprende o consiste esencialmente de o consiste de nucleótidos que codifican un epitope o determinante antigénico de un polipéptido del NDV. Un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido del NDV puede comprender o consistir esencialmente de o consistir de un mínimo de 15 nucleótidos, aproximadamente 30-45 nucleótidos, aproximadamente 45-75 o al menos 57, 87 ó 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica el polipéptido. Se pueden usar los procedimientos de determinación de epitopes, tales como generación de bibliotecas de péptidos superpuestos (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; conjuntos de elementos de síntesis de péptidos Multipin.RTM. de Chiron) y algoritmos (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605) en la práctica de la invención.

La glucosilación de una proteína puede tener múltiples efectos sobre la inmunogenicidad de una proteína. En el caso del NDV, parece que la glucosilación es necesaria para un plegamiento apropiado de la proteína y la formación del epitope conformacional (McGinnes, L. W. y T. G. Morrison, 1995, Virology, 212: 398-410). De acuerdo con McGinnes, ef al., la glucosilación de la proteína HN en los sitios de glucosilación 433 y 481 (véase Figuras 8-10) es necesaria para la actividad de la unión de la proteina y la formación de epitopes conformacional. Una glucosilación apropiada de la proteina HN puede ser necesaria para la función de la proteína y la respuesta inmune del huésped a la composición de la invención.

Los epitopes conformacionales y un epitope lineal primario de la proteína HN se describen en Gotoh. BT, et al., 1988, Virology 163: 1 4-82, lorio, R. M., J. B. et al., 1986, J Gen Viro! 67: 1393-403, lorio, RM, et al. ,1989, Virus Res 13: 245-61. Parece que las variaciones en el epitope lineal podrían ser la causa de evasión de la vacuna por cepas emergentes (Cho, SH, et al., 2008, J. Clin Microbiol., 46: 1541-4). La Figura 8 provee una alineación de las proteínas HN de cuatro cepas del NDV para mostrar el nivel de variación en la región del epitope lineal.

El término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN lineal o ramificado, de cadena simple o doble, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o un fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, ácido nucleico sondas y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos conectores, tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar aún más después de la polimerización, tai como por conjugación, con un componente de marcación. Otros tipos de modificaciones incluidos en esta definición son extremos protectores, la substitución de uno o más nucleótidos naturales por un análogo e introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones de metales, componentes de marcación, otros polinucleótidos o un soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener por síntesis química o se pueden derivar de un microorganismo.

El término "gen" se usa en un sentido amplio para hacer referencia a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por consiguiente, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o simplemente las secuencias de codificación como en los ADNc y/o las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Por ejemplo, un gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

La invención comprende además una cadena complementaria de un polinucleótido que codifica un antígeno, epitope o inmunógeno NDV. La cadena complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud, y puede contener desoxirribonucleótídos, ribonucleótidos y análogos, en cualquier combinación.

Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u organela) se refiere a un componente fue separado o purificado sustancialmente de los demás componentes biológicos en la célula del organismo en el cual el componente aparece naturalmente, por ejemplo, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y organelas. Los ácidos nucleicos y las proteínas que fueron "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas que fueron purificados mediante métodos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante tecnología recombinante, así como síntesis química.

El término "purificado", según se utiliza en la presente, no requiere de una pureza absoluta; más bien es considerado como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de polipéptidos purificados parcialmente es aquella en donde está más enriquecido el polipéptido de lo que estaría dicho polipéptido en su entorno natural. Es decir, el polipéptido está separado de los componentes celulares. El término "sustancialmente purificado" significa que se eliminó al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98%, o más de los componentes celulares o materiales. Asimilo, el polipéptido puede estar parcialmente purificado. "Parcialmente purificado" significa que se eliminó menos que un 60% de los componentes celulares o material. Lo mismo se aplica a los polinucleótidos. Los polipéptidos divulgados en la presente se pueden purificar mediante cualquiera de los medios conocidos en el arte.

En un aspecto, la presente invención provee polipéptidos HN NDV. En otro aspecto, la presente invención provee un polipéptido HN NDV que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 10, 11 , 13, 15, 17, 19, 20, 21 ó 28 y una variante o fragmento de la misma.

Además, se considera que los homólogos de los polipéptidos HN NDV se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Según se utiliza en la presente, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o una función similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que cumplen las mismas funciones o funciones similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos habitualmente cumplen funciones diferentes, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los análogos, ortólogos y parálogos de un polipéptido NDV de tipo salvaje pueden diferir del de polipéptido NDV tipo salvaje por modificaciones de post-traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos o ambas. En particular, los homólogos de la invención exhibirán en general al menos 80-85%, 85-90%, 90-95% o 95%, 96%, 97%, 98% , 99% de identidad de secuencia, con todo o parte de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos NDV de tipo salvaje, y exhibirán una función similar.

En otro aspecto, la presente invención provee un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido HN NDV que tiene una secuencia indicada en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 10, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 20, 21 ó 28. En aún otro aspecto, la presente invención provee un polipéptido HN NDV que comprende un fragmento inmunogénico que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°:10, la SEQ ID N°:11 o la SEQ ID N°:28, y en donde el polipéptido tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 9, 3, 5, 7, 17, 19, 15 ó 20.

En aún otro aspecto, la presente invención provee fragmentos y variantes de los polipéptidos HN NDV identificados antes (SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 10, 11 , 13, 15, 17, 19, 20, 21 ó 28) que el especialista en el arte puede preparar fácilmente usando técnicas de biología molecular bien conocidas.

Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 10, 11 , 13, 15, 17, 19, 20, 21 ó 28.

Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Dichas variaciones alélicas naturales típicamente pueden dar como resultado un 1- 5% de varianza en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en un número de especies diferentes, que puede efectuarse fácilmente usando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en dichas especies. Se considera que cualquiera y todas dichas variaciones de ácido nucleico y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés, se encuentran dentro del alcance de la invención.

Según se utiliza en la presente, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que contiene una o más variaciones de aminoácidos conservadores u otras modificaciones menores de modo tal que (1 ) el correspondiente polipéptido tiene una función sustancialmente equivalente cuando se compara con el polipéptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido es inmunorreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que contienen modificaciones menores en las secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido NDV que pueden dar como resultado péptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparación con la contraparte del polipéptido no modificado. Dichas modificaciones pueden ser deliberadas, tal como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla además supresiones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre y cuando el polipéptido funcione produciendo una respuesta inmunológica como se define en la presente.

El término "variación conservadora" indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o el reemplazo de un nucleótído en una secuencia de ácido nucleico de modo que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. En este sentido, las sustituciones particularmente preferidas en general serán de naturaleza conservadora, como se describió antes.

Un fragmento inmunogénico de un polipéptido HN NDV incluye al menos 8, 10, 13, 14, 15 ó 20 aminoácidos consécutivos, al menos 21 aminoácidos, ai menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos o al menos 30 aminoácidos de un polipéptido HN NDV que tiene una secuencia indicada en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 10, 11 , 13, 15, 17, 19, 20, 21 ó 28, o variantes de la misma. En otra realización, un fragmento de un polipéptido HN NDV incluye un epitope antigénico específico presente sobre un polipéptido HN NDV de longitud completa. Un fragmento inmunogénico puede comprender un fragmento que contiene la región del epitope lineal del HN NDV. En una forma de realización, el fragmento inmunogénico comprende el polipéptido que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°:10, la SEQ ID N°:11 o la SEQ ID N°:28.

En otro aspecto, la presente invención provee un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV que tiene una secuencia indicada en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 10, 11 , 13, 15, 17, 19, 20, 21 ó 28. En aun otro aspecto, la presente invención provee un polinucléotido que codifica un polipéptido HN NDV que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia indicada en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 10, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 20, 21 ó 28, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos o una combinación de estos polipéptidos. En aún otro aspecto, la presente invención provee un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV que comprende un fragmento inmunogénico que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°:10, la SEQ ID N°:11 o la SEQ ID N°:28, y en donde el polipéptido tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 15, 17, 19 ó 20.

En otro aspecto, la presente invención provee un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID Ne: 1 , 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 22 ó 23, o una variante de la misma. En aún otro aspecto, la presente invención provee un polinucleótido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno de los polinucleótidos que tiene una secuencia indicada en la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 8, 22 ó 23, o una variante de la misma.

Los polinucleótidos de la divulgación incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, de utilización de codones optimizada para un huésped específico. Según se utiliza en la presente, el término "optimizado" se refiere a un polinucleótido que fue manipulado genéticamente para incrementar su expresión en una especie dada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos NDV, se puede modificar la secuencia de ADN del gen de la proteína NDV para que 1 ) comprenda los codones preferidos por los genes de gran expresión en una especie particular; 2) comprenda un contenido de A+T o G+C en la composición de las bases de nucleótidos que sea sustancialmente el que se encuentra en dichas especies; 3) forme una secuencia de inicio en dichas especies; o 4) elimine las secuencias que causan desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN, o que forme horquillas en la estructura secundaria o sitios de procesamiento de ARN. Se puede lograr una mayor expresión de proteínas NDV en dichas especies utilizando la frecuencia de distribución de utilización de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de utilización de codones preferida" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en la utilización de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Hay 20 aminoácidos naturales, y la mayoría de ellos es especificada por más de un codón. Por ello, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la divulgación siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido HN NDV codificado por la secuencia de nucleótidos permanezca funcionalmente sin cambios.

La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se puede establecer con la ayuda de blast apareado de NCBI (National Center for Biotechnology Information) y la matriz blosum62, usando los parámetros estándar (véase, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., EE.UU.)).

La "identidad" con respecto a las secuencias puede hacer referencia al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias, en donde la alineación de las dos secuencias puede determinarse de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalidad por falta de coincidencia o hueco de 4, y luego se puede efectuar convenientemente el análisis e interpretación asistidos por computadora de los datos de la secuencia, incluyendo alineación, usando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando se dice que dos secuencias de ARN son similares o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN se encuentran dentro del alcance de la invención y se pueden derivar de secuencias ADN, considerándose que la timina (T) en la secuencia de ADN es igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN.

La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

Las reacciones de hibridación se pueden llevar a cabo bajo condiciones de diferente severidad. Las condiciones que incrementan la severidad de una reacción de hibridación son bien conocidas. Véase por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989).

La invención abarca además los polinucleótidos NDV contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión y ligados operativamente a un elemento promotor.

Un "vector" se refiere a un plásmido o virus de ADN o ARN recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que será administrado a una célula blanco, ya sea ¡n vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para fines de prevención o terapia, y opcionalmente se pueden encontrar en la forma de un cásete de expresión. Según se usa en la presente, no es necesario que un vector se pueda replicar en la célula o sujeto blanco final. El término incluye vectores de clonación y vectores virales.

El término "recombinante" significa un polinucleótido de origen semisintético o sintético que no aparece en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición que no se observa en la naturaleza.

"Heterólogo" significa que deriva de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad con la cual se compara. Por ejemplo, un polinucleótido se puede ubicar mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor removido de su secuencia de codificación nativa y ligado operativamente a una secuencia de codificación distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificación adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, UTR 5', UTR 3', terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicional bajo el control del mismo promotor o de uno diferente, secuencias que permitan la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier construcción que pueda ser deseable para proveer las formas de realización de esta invención.

Los elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno NDV ventajosamente están presentes en un vector de la invención. Por lo menos, comprenden un codón de inicio (ATG), un codón de terminación y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para determinados vectores tales como plásmidos y determinados vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos de poxvirus. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de polipéptido, por ejemplo un péptido NDV, ventajosamente, en el vector, se ubica un ATG en posición 5' del marco de lectura y un codón de terminación en posición 3'. Puede haber otros elementos para controlar la expresión, tales como secuencias potenciadoras, secuencias estabilizantes, tales como intrones y secuencias señal que permitan la secreción de la proteína.

La presente invención también se relaciona con composiciones que comprenden vectores, tales como vectores de expresión. Las composiciones pueden comprender uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden y que expresan uno o más polipéptidos del NDV, antígenos, epitopes o inmunógenos. En una forma de realización, el vector comprende un polinucleótido que codifica y/o que expresa un polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno NDV, en un transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario.

De acuerdo con otra forma de realización de la invención, el vector de expresión es un vector de un plásmido, en particular un vector de expresión in vivo. En un ejemplo no limitativo, específico, se puede utilizar el plásmido pVR1020 o 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N°: 5.846.946 y 6.451.769) como vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El plásmido pVR1020 deriva del pVR1012 y contiene a la secuencia señal tPA humana. En una forma de realización la señal tPA humana comprende desde el aminoácido M(1) hasta el aminoácido S(23) de GenBank con el N° Acceso HUMTPA14. En otro ejemplo no limitativo, específico, el plásmido utilizado como vector para la inserción de un secuencia de polinucleótidos puede contener la secuencia del péptido señal de IGF1 equina entre el aminoácido M(24) y el aminoácido A(48) de GenBank N° Acceso U28070. Se puede consultar o emplear información adicional sobre plásmidos de ADN en la práctica, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU. N°: 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 y 6.221.362.

El término "plásmido" abarca cualquier unidad de transcripción de ADN que comprenda un polinucleótido de acuerdo con la invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o blanco deseado; y, en este sentido, se debe tener en cuenta que se considera que un plásmido circular, superenrollado o no superenrollado, asi como una forma lineal, se encuentra dentro del alcance de la invención.

Cada plásmido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno NDV ligado operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, resulta ventajoso emplear un promotor fuerte que sea funcional en células eucariotas. El promotor fuerte puede ser, pero en un sentido no limitativo, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o murino, o que opcionalmente tiene otro origen tal como de rata o cobayo.

En términos más generales, el promotor puede ser de origen viral, vegetal o celular. Un promotor viral fuerte distinto de CMV-IE que puede emplearse convenientemente en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que puede emplearse convenientemente en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissa M. et al. 2000) o el promotor de actina ( iyazaki J. et al.1989).

Los plásmidos pueden comprender otros elementos de control de la expresión. Resulta particularmente ventajoso incorporar una o más secuencias estabilizadoras, por ejemplo, una o más secuencias de intrones, por ejemplo, el intrón de la alcohol deshidrogenasa de maíz (intrón de ADHI de maíz), el primer intrón de hCMV-IE (WO 89/01036), el intrón II del gen de la ß-globina de conejo (van Ooyen et al., 1979). En otra forma de realización, los plásmidos pueden comprender una UTR 3'. La UTR 3' puede ser, pero en un sentido no limitativo, la UTR 3' de la nopalina sintasa (Nos) de Agrobacterium. Los plásmidos pueden comprender además el terminador OrfC (también conocido como el terminador PFA3).

Con respecto a la señal de poliadenilación (poli A) para los vectores de plásmidos y virales distintos de poxvirus, se puede emplear una señal poli(A) del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (véase, US 5.122.458) o la señal poli(A) poli(A) del gen de ß- globina de conejo o la señal poli(A) del virus SV40.

Una "célula huésped" indica una célula procariota o eucariota que ha sido genéticamente alterada, o que puede ser alterada genéticamente por administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Con referencia a células genéticamente alteradas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada como a la progenie de la misma.

En una forma de realización, el antígeno recombinante HN del NDV se expresa en una planta transgénica. En otra forma de realización, el antígeno recombinante HN del NDV se expresa en algas transgénicas. En aún otra forma de realización, las algas transgénicas son Schizochytrium. Los destalles del sistema de expresión de proteínas de algas se pueden consultar, por ejemplo, en US 7.001.772, US 2008/0022422. En las formas de realización, el polipéptido o antígeno HN NDV puede ser cualquier polipéptido divulgado en la presente, o un polipéptido codificado por cualquier polinucleótido divulgado en la presente.

Métodos para expresar los poli éptidos del NDV en microalgas o lentejas de agua En algunas formas de realización de la invención, los polipéptidos HN NDV, o fragmentos o variantes de los mismos, se expresan en microalgas o lentejas de agua. Estos métodos comprenden el uso de casetes de expresión que se introducen en algas o plantas usando cualquier método de transformación adecuado conocido en el arte. Los polinucleótidos contenidos en estos casetes de expresión se pueden modificar para una mayor expresión del polipéptido antigénico HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, en microalgas o lenteja de agua, de la siguiente manera.

Casetes para la expresión de los polipéptidos antigénicos del NDV de microalgas o lenteja de agua Las microalgas o lentejas de agua transgénicas que expresan un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, se obtienen por transformación de microalgas o lentejas de agua con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo. De esta manera, un polinucleótido que codifican el polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, se construye dentro de un cásete de expresión y se introduce en microalgas o lentejas de agua mediante cualquier método de transformación adecuado conocido en el arte.

En algunas formas de realización, las microalgas o lentejas de agua que son transformadas con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, también fueron transformadas con un cásete de expresión que provee expresión de otro polipéptido heterólogo de interés, por ejemplo, otro polipéptido del NDV, un fragmento o una variante del mismo. El cásete de expresión que provee expresión de otro polipéptido heterólogo de interés se puede proveer en el mismo polinucleótido (por ejemplo, en el mismo vector de transformación) para la introducción en microalgas o lentejas de agua, o en un polinucleótido diferente (por ejemplo, en vectores de transformación diferentes) para la introducción en las microalgas o lentejas de agua al mismo tiempo o en momentos diferentes, mediante el mismo método de introducción o uno diferente, por ejemplo, mediante métodos de transformación iguales o diferentes.

Los casetes de expresión para su uso en la transformación de microalgas o lentejas de agua comprenden elementos de control de la expresión que comprenden al menos una región de inicio de la transcripción (por ejemplo, un promotor) ligado operativamente al poiinucleótido de interés, es decir, un poiinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV, un fragmento o una variante del mismo. El término "ligado operativamente", según se usa en la presente con referencia a secuencias de nucleótidos, se refiere a múltiples secuencias de nucleótidos ubicados en una relación funcional entre sí. En general, las secuencias de ADN ligadas operativamente son contiguas y, cuando fuera necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, en marco de lectura. Dicho cásete de expresión se provee con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del poiinucleótido o de los polinucleótidos de interés (por ejemplo, un poiinucleótido de interés, dos polinucleótidos de interés, etc.) para que se encuentren bajo la regulación de transcripción del promotor y otros elementos de control de la expresión. En formas de realización particulares de la invención, el poiinucleótido que será transferido contiene dos o más casetes de expresión, cada uno de los cuales contiene al menos un poiinucleótido de interés.

Un "elemento de control de la expresión" se refiere a una región de ADN reguladora que habitualmente comprende una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II o, en algunas formas de realización, la ARN polimerasa III, para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Un elemento de control de la expresión además puede comprender otras secuencias de reconocimiento generalmente ubicadas en posición 5' con respecto a la caja TATA, que afecta (por ejemplo, aumenta) el índice de inicio de la transcripción. Aún más, un elemento de control de la expresión además puede comprender otras secuencias de reconocimiento generalmente ubicadas en posición 3' con respecto a la caja TATA, que afecta (por ejemplo, aumenta) el índice de inicio de la transcripción.

La región de inicio de la transcripción (por ejemplo, un promotor) puede ser nativa u homóloga o extraña o heteróloga para el huésped de microalga o la planta de lenteja de agua, o podría ser la secuencia natural o una secuencia sintética. El término "extraño" significa que la región de inicio de la transcripción no está presente en el huésped de microalgas o de plantas lentejas de agua de tipo salvaje en la cual se introduce dicha región de inicio de la transcripción. Un "promotor funcional" se refiere al promotor que, cuando está ligado operativamente a una secuencia que codifica un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, puede dirigir la expresión (es decir, la transcripción y traducción) del polipéptido codificado, un fragmento o una variante. Los promotores se pueden seleccionar sobre la base del resultado deseado. Por consiguiente los casetes de expresión de la invención pueden comprender promotores constitutivos, inducibles, con preferencia por tejidos u otros promotores para la expresión en microalgas o lentejas de agua.

Se puede emplear cualquier promotor adecuado conocido en el arte en los casetes de expresión de acuerdo con la presente invención, incluyendo promotores bacterianos, de levadura, fúngicos, de insecto, de mamífero, de algas y vegetales. Por ejemplo, se pueden usar promotores de plantas o algas, incluyendo promotores de microalgas. Los ejemplos de promotores incluyen, pero en un sentido no limitativo, el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor, los promotores de opina sintetasa (por ejemplo, nos, mas, oes, etc.), el promotor de ubiquitina, el promotor de actina, el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato (RubP) carboxilasa y el promotor de la alcohol deshidrogenasa. La Patente de los EE.UU. N°: 7.001.772 divulga secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos para una acetolactato sintasa, un promotor de la acetolactato sintasa y una región terminadora, un promotor de a-tubulina, un promotor de un sistema de policetida sintasa (PKS) de Thraustochytriales y un promotor de la ácido graso desaturasa, cada uno de un microorganismo de Thraustochytriales. En las publicaciones de la Solicitud de Patente de los EE.UU. N": US2006/0275904 y US2006/0286650 se divulgan las secuencias de promotores y terminadores para cada uno de actina, factor de elongación 1 alfa y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa de Schizochytrium, así como su uso en vectores que expresan genes de Schizochytrium en células huésped. El promotor de la subunidad pequeña de la RubP carboxilasa de microalgas es conocido en el arte (Silverthorne et al. (?990) Plant Mol. Biol. También son adecuados otros promotores de virus que infectan plantas o algas incluyendo, pero en un sentido no limitativo, promotores aislados del virus en mosaico de Dasheen, del virus Chlorella (por ejemplo, el promotor de la adenina metiltransferasa del virus Chlorella; Mitra et al., (1994) Plant Mol. Biol. 26:85), del virus bandeado reticular de tomate, virus del cascabel de tabaco, virus de necrosis de tabaco, virus de mancha en anillo de tabaco, virus de mancha en anillo de tomate, virus en mosaico de pepino, virus del muñón de maní, virus en mosaico de la alfalfa, badnavirus baciliforme de caña de azúcar y semejantes.

Los elementos de control de la expresión, incluyendo promotores, se pueden seleccionar para obtener el nivel de regulación deseado. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser ventajoso usar un promotor que confiera una expresión constitutiva (por ejemplo, el promotor de la manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens). Como alternativa, en otras situaciones puede ser ventajoso usar promotores que son activados como respuesta a estímulos específicas del medio ambiente (por ejemplo, promotores del gen del shock de calor, promotores de genes inducibles por sequía, promotores de genes inducibles por patógenos, promotores de genes inducibles por lesiones y promotores de genes inducibles por luz/oscuridad) o reguladores del crecimiento vegetal (por ejemplo, promotores de genes inducidos por ácido abscísico, auxinas, citoquininas y ácido giberélico). Como una alternativa adicional, se pueden seleccionar promotores que permitan una expresión específica de tejidos (por ejemplo, promotores específicos de raíces, hojas y flores).

La fuerza global de un promotor dado puede ser afectado por la combinación y organización espacial de secuencias de nucleótidos que actúan en cis, tales como secuencias activadores 5'. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos activadoras que derivan del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens pueden mejorar la transcripción con el promotor de la manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (véase la Patente de los EE.UU. N°: 5.955.646). En la presente invención, el cásete de expresión puede contener secuencias de nucleótidos activadoras insertadas 5' con respecto a la secuencia promotora para aumentar la expresión del polipéptido antigénico del NDV de interés, o un fragmento o una variante del mismo. En una forma de realización, el cásete de expresión incluye tres secuencias activadoras 5' derivadas del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens ligadas operativamente a un promotor derivado del gen de la manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (véase la Patente de los EE.UU. N°: 5.955.646).

El cásete de expresión incluye entonces en la dirección de transcripción 5 -3', un elemento de control de la expresión que comprende una región de inicio de la transcripción y de la traducción, un polinucleotido que codifican un polipéptido HN NDV (o un fragmento o una variante del mismo) y una región de terminación de la transcripción y de la traducción funcional en plantas o algas. Se puede usar cualquier secuencia de terminación adecuada conocida en el arte de acuerdo con la presente invención. La región de terminación puede ser nativa respecto de la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa respecto de la secuencia de codificación de interés o puede derivar de otra fuente. Las regiones de terminación adecuadas se pueden obtener del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintetasa y de la nopalina sintetasa. Véase también Guerineau et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141 ; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671 ; Sanfacon et al. (1991 ) Genes Dev. 5: 141 ; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261 ; Munroe er al. (1990) Gene 91 : 151 ; Bailas er al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891 ; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627. Ejemplos adicionales de secuencias de terminación comprenden la secuencia de terminación de la subunidad pequeña de la RubP carboxilasa de arveja y la secuencia de terminación 35S del virus en mosaico de la coliflor.

En general, el cásete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de las células o tejidos de microalgas transformados. Los genes de marcadores seleccionares incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas. Los genes de resistencia a herbicidas generalmente codifican una proteína blanco modificada que no es sensible al o una enzima que degrada o detoxifica al herbicida en la planta antes que pueda actuar. Véase DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513; DeBlock ef a/.(1989) Plant Physiol. 91 :691 ; Fromm et al. (1990) BloTechnology 8:833; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603. Por ejemplo, se ha obtenido resistencia a los herbicidas glifosato o sulfonilurea usando genes que codifican las enzimas blanco mutantes, 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y acetolactato sintasa (ALS). Se ha obtenido resistencia a glufosinato de amonio, boromoxinilo y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4- D) usando genes bacterianos que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, una nitrilasa o una 2,4-diclorofenoxiacetato monooxigenasa, que detoxifica los respectivos herbicidas.

A los efectos de la presente invención, los genes marcadores seleccionares incluyen, pero en un sentido no limitativo, genes que codifican neomicina fosfotransferasa II (Fraley et al., (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1 ); cianamida hidratase (Maier-Greiner ef al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4250); acetolactato sintasa (ALS, Li, eí al., (1992) Plant Physiol., 100: 662-668); aspartato quinasa; dihidrodipicolinato sintasa (Perl eí al., (1993) S/oTecnno/ogy 11 : 715); el gen bar (Toki ef al., (1992) Plant Physiol., 100:1503; Meagher et al., (1996) Crop Sci, 36: 1367); la triptofano sintetasa (Goddijn et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:907); neomicina fosfotransferasa (NEO; Southern ef al., (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1 : 327); higromicina fosfotransferasa (HPT o HYG; Shimizu et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074); dihidrofolato reductasa (DHFR; Kwok et al., (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:4552); fosfinotricina acetiltransferasa (DeBlock et al., (1987) EMBO J. 6:2513); ácido 2,2-dicloropropiónico deshalogenasa (Buchanan-Wollatron ef al., (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); acetohidroxiácido sintasa (Patente de los EE.UU. N°: 4.761.373; Haughn ef al., (1988) Mol. Gen. Genet. 221 :266); 5-enolpiruvil- shiquimato-fosfato sintasa (aroA; Comai et al., (1985) Nature 317: 741 ); haloarilnitrilasa (WO 87/04181 ); acetil-coenzima A carboxilasa (Parker et al., (1990) Plant Physiol., 92:1220); dihidropteroato sintasa (sull; Guerineau et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); y el polipéptido de 32 kDa del fotosistema II (psbA; Hirschberg ef al., (1983) Science 222: 1346 (1983).

También se incluyen genes que codifican resistencia a: gentamicina (por ejemplo, aacC1, Wohlleben ef al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217:202-208); cloranfenicol (Herrera- Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991 ) Plant Mol. Biol. 16:807-820); higromicina (Waldron ef al. (1985) Plant Mol. Biol. 5: 03-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219; Meijer ef al. (1991 ) Plant Mol. Biol. 16:807-820); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard ef al. (1996) Transgenic Res. 5:131); bleomicina (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. Í5:127); bromoxinilo (Stalquer ef al. (1988) Science 242:419); 2,4-D (Streber ef al. (1989) BioTechnology 7:811 ); fosfinotricina (DeBlock eí al. (1987) EMBO J. 6:2513); espectinomicina (Bretagne-Sagnard y Chupeau, Transgenic Research 5:131 ).

El gen bar confiere resistencia a herbicidas para los herbicidas de tipo glufosinato, tales como fosfinotricina (PPT) o bialafos y semejantes. Según se indicó previamente, se podrían usar otros marcadores seleccionables en las construcciones del vector que incluyen, pero en un sentido no limitativo, el gen pat, también para resistencia a bialafos y fosfinotricina, el gen ALS para resistencia a imidazolinona, el gen HPH o HYG para resistencia a higromicina, el gen de la EPSP sintasa para resistencia a glifosato, el gen Hm1 para resistencia a la toxina He y otros agentes selectivos usados rutinariamente y que son conocidos por un especialista en el arte. Véase Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506; Chistopherson eí al. (1992) PNAS USA 89:6314; Yao eí al. (1992) Cell 71 :63; Reznikoff (1992) Mol. Microbio!. 6:2419; Barkley er a/. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555; Brown er al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell 52:713; Deuschle et al. (1989) PNAS USA 86:5400; Fuerst er al. (1989) PNAS USA 86:2549; Deuschle er al. (1990) Science 248:480; Labow er al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti eí al. (1992) PNAS USA 89:3952; Baim eí al. (1991 ) PNAS USA 88:5072; Wyborski eí al. (1991 ) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. And Struc. Biol. 10:143; Degenkolb eí al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591 ; Kleinschnidt eí al. (1988) Biochemistry 27:1094; Gatz eí al. (1992) Plant J. 2:397; Gossen eí al. (1992) PNAS USA 89:5547; Oliva eí al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36913; Hlavka eí al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78; and Gilí eí al. (1988) Natura 334:721.

El listado anterior de genes marcadores de selección no se ofreció en un sentido limitativo. Se puede utilizar cualquier gen marcador seleccionable en la presente invención.

Modificación de secuencias de nucleótidos para una mayor expresión en un huésped de microalgas o de plantas de lenteja de agua Cuando el polipéptido HN NDV o un fragmento o una variante del mismo es expresado en microalgas o lentejas de agua, se puede modificar la secuencia de polinucleótidos expresada que codifica el polipéptido HN NDV o un fragmento o una variante del mismo para mejorar su expresión en microalgas. Una modificación tal es la síntesis del polinucleótido usando codones con preferencia por plantas o algas, en particular los codones con preferencia por microalgas. En la técnica existen métodos disponibles para sintetizar secuencias de nudeótidos con codones preferidos para plantas o algas. Véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N°: 5..380.831 y 5.436.391 ; EP 0 359 472; EP 0 385 962; WO 91/16432; Perlak er al. (1991) PNAS USA 15:3324; lannacome eí al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; y urray et al. (1989) Nucleic Acids. Res. 17:477. La síntesis se puede realizar usando cualquier método conocido por el especialista en el arte. Los codones preferidos se pueden determinar a partir de los codones de mayor frecuencia en las proteínas expresadas en microalgas. Por ejemplo, la frecuencia de utilización de codones para microalgas se muestra en la Tabla A.

Tabla A: Schizochytrium sp. ATCC_20888 [gbpln]: 3 CDS (6473 codones) campos: [triplete] [frecuencia: por mil] ([número]) uuu 12,2 (79) UCU 7,0(45) UAU 1,1(7) UGU 0,8(5) uuc 19,9(129) UCC 23,8 (154) UAC 21, 5 (139) UGC 15,3(99) UUA 0,0(0) UCA 0,5(3) UAA 0,5(3) UGA 0,0(0) UUG 0,6(4) UCG 18,8 (122) UAG 0,0(0) UGG 8,3(54) CUU 12,7 (82) CCU 11,7(76) CAU 2,3(15) CGU 7,1(46) CUC 61,2 (396) CCC 23,8 (154) CAC 12, 8 (83) CGC 42, 9(278) CUA 0,0(0) CCA 1,5(10) CAA 2,3(15) CGA 0,3(2) CUG 7,4 (48) CCG 16,2 (105) CAG 27,7(179) CGG 0,8(5) AUU 13,9(90) ACU 9,1(59) AAU 1,9(12) AGU 1,5(10) AÜC 33,5(217) ACC 29,2 (189) AAC 32, (210) AGC 15,6(101) AUA 0,0(0) ACA 1,5(10) AAA 2,2(14) AGA 0,2(1) AUG 27, 8 (180) ACG 9, 6 (62) AAG 54, 5 (353) AGG 0,0(0) GUU 8,3(54) GCU 24, (158) GAU 13,4(87) GGU 13,0(84) GÜC 53,0(343) GCC 86,0(557) GAC 45,0(291) GGC 54,5(353) GUA 0,2(1) GCA 4,0(26) GAA 7,3(47) GGA 3,9(25) GUG 14,4(93) GCG 15,9(103) GAG 62,3(403) GGG 0,5(3) A los efectos de la presente invención, los "codones con preferencia por microalgas" se refieren a codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en microalgas mayor que un 17%. El término "codones con preferencia por microalgas" según se usa en la presente se refiere a los codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en la familia Thraustochytriaceae mayor que un 17%. Los "codones con preferencia por Schizochytríum" según se usa en la presente se refiere a los codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en Schizochytríum mayor que un 17%, donde la frecuencia de utilización de codones en Schizochytríum se obtiene a partir de la base de datos de utilización de codones (GenBank Reléase 160.0, 15 de junio, 2007).

La frecuencia de utilización de codones para Lemna minor se muestra en la Tabla B, la frecuencia de utilización de codones para Schizochytríum se muestra en la Tabla C.

Tabla B. Lemna minor [gbplnj: 4 CDS (1597 codones) campos: [triplete] [frecuencia: por mil ] ([número]) UUU 17,5(28) UCU 13,8(22) UAU 8,8(14) UGU 5,0(8) UUC 36,3(58) UCC 17,5(28) ÜAC 15,7(25) UGC 14,4(23) UUA 5,6(9) OCA 14,4(23) UAA 0,0(0) UGA 1,9(3) UUG 13,8(22) UCG 13,8(22) UAG 0,6(1) UGG 16,3(26) CUU 15,7(25) CCU 11,9(19) CAU 6,9(11) CGU 4,4(7) CÜC 25,7(41) CCC 15,7(25) CAC 16,9(27) CGC 18,2(29) CUA 5,0(8) CCA 11,3(18) CAA 10,0(16) CGA 6,3(10) CUG 21,3(34) CCG 14,4(23) CAG 22,5(36) CGG 10,6(17) AUU 18,8(30) ACU 9,4(15) AAU 13,8(22) AGU 10,0(16) AUC 19,4(31) ACC 17,5(28) AAC 21,9(35) AGC 15,0(24) ADA 1,9(3) ACA 5,0 (8) AAA 15,7(25) AGA 20,7(33) AUG 20,7(33) ACG 10,0(16) AAG 35,7(57) AGG 17,5(28) GUU 15,0(24) GCU 25,0(40) GAU 20,0(32) GGU 8,1(13) GUC 25,0(40) GCC 22,5(36) GAC 26,3(42) GGC 21,9(35) GUA 6,3(10) GCA 14,4(23) GAA 26,3(42) GGA 16,9(27) GUG 30,7(49) GCG 18,2(29) GAG 40,1(64) GGG 18,2(29) Tabla C: Schizochytrium sp. ATCC_20888 [gbpln]: 3 CDS (6473 codones) campos: [triplete] [frecuencia: por mil] ([número]) uuu 12,2 (79) UCU 7,0(45) UAU 1,1(7) UGU 0,8(5) ÜUC 19,9(129) UCC 23, 8 (154) UAC 21,5(139) UGC 15,3(99) UUA 0,0(0) UCA 0,5 (3) UAA 0,5(3) UGA 0,0(0) UUG 0,6(4) UCG 18,8 (122) UAG 0,0(0) UGG 8,3(54) CUU 12,7 (82) CCU 11,7(76) CAU 2,3(15) CGU 7,1(46) CUC 61,2 (396) CCC 23,8 (154) CAC 12, 8 (83) CGC 42, 9(278) CUA 0,0(0) CCA 1,5(10) CAA 2,3(15) CGA 0,3(2) CUG 7,4(48) CCG 16,2 (105) CAG 27,7 (179) CGG 0,8(5) AUU 13,9(90) ACU 9,1(59) AAU 1,9(12) AGU 1,5(10) AUC 33,5(217) ACC 29,2 (189) AAC 32,4 (210) AGC 15,6(101) AUA 0,0(0) ACA 1,5(10) AAA 2,2 (14) AGA 0,2 (1) AUG 27,8 (180) ACG 9,6(62) AAG 54,5 (353) AGG 0,0(0) GUU 8,3(54) GCU 24,4 (158) GAU 13,4 (87) GGU 13,0(84) GUC 53,0(343) GCC 86,0(557) GAC 45,0(291) GGC 54,5(353) GUA 0,2 (1) GCA 4,0(26) GAA 7,3(47) GGA 3,9(25) GUG 14, (93) GCG 15, 9 (103) GAG 62,3(403) GGG 0,5(3) A los efectos de la presente invención, los "codones con preferencia por lentejas de agua" se refieren a codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en lenteja de agua mayor que un 17%. Los "codones con preferencia por Lemna" según se usan en la presente se refiere a codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en el género Lemna mayor que un 17%. Los "codones con preferencia por Lemna mino según se usan en la presente se refieren a codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en Lemna minor mayor que un 17%, donde la frecuencia de utilización de codones en Lemna minor se obtiene a partir de la base de datos de utilización de codones (GenBank Reléase 160.0, 15 de junio, 2007).

Se considera además que todo o cualquier parte del polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico del NDV de interés, o un fragmento o una variante del mismo, puede ser optimizado o sintético. En otras palabras, también se pueden usar secuencias completamente optimizadas o parcialmente optimizadas. Por ejemplo, un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los codones pueden ser codones con preferencia por microalgas o con preferencia por lentejas de agua. En una forma de realización, entre un 90% y 96 % de los codones son codones con preferencia por microalgas o con preferencia por lentejas de agua. En una forma de realización, el polipéptido del NDV es un polipéptido HN NDV, por ejemplo, el polipéptido HN NDV que se muestra en la SEQ ID N°: 3 ó 15, y el cásete de expresión comprende una secuencia de codificación optimizada para este polipéptido HN NDV, en donde la secuencia de codificación comprende codones con preferencia por microalgas, por ejemplo, codones con preferencia por Thraustochytriaceae o con preferencia por Schizochytrium. En una de tales formas de realización, el cásete de expresión comprende la SEQ ID N°: 1 ó 14, que contiene codones con preferencia por Schizochytrium que codifican el polipéptido HN que se muestra en la SEQ ID N°: 3 ó 15. En otra de tales formas de realización, el cásete de expresión comprende la SEQ ID N°: 22 ó 23, que contiene codones con preferencia por Schizochytrium que codifican el polipéptido HN que se muestra en la SEQ ID N°: 17 6 20.

También se pueden efectuar otras modificaciones al polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico del NDV de interés, o un fragmento o una variante del mismo, para mejorar su expresión en microalgas. Estas modificaciones incluyen, pero en un sentido no limitativo, la eliminación de las secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de separación de exones-intrones, repeticiones tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo, que puedan ser perjudiciales para la expresión genética. Cuando fuera posible, se puede modificar el polinucleótido que codifica el polipéptido heterólogo de interés para evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas.

Existen diferencias conocidas entre las secuencias de nucleótidos en el contexto de un inicio óptimo de la traducción para los codones de inicio de la traducción en animales y plantas. Una "secuencia de nucleótidos en el contexto del inicio de la traducción", según se usa en la presente, se refiere a la identidad de los tres nucleótidos directamente 5' del codón de inicio de la traducción. Un "codón de inicio de la traducción" se refiere al codón que inicia la traducción de un ARNm transcrito a partir de la secuencia de nucleótidos de interés. La composición de estas secuencias de nucleótidos en el contexto del inicio de la traducción puede afectar la eficiencia del inicio de la traducción. Véase, por ejemplo, Fields ef al. (2000) Plant Science 154:89-98; y Joshi et al. (1997); Plant Mol. Biol. 35:993-1001. En la presente invención, se puede modificar la secuencia de nucleótidos en el contexto del inicio de la traducción para el codón de inicio de la traducción del polinucleótido que codifica el polipéptido antigénico del NDV de interés, o un fragmento o una variante del mismo, para mejorar la expresión en microalgas. En una forma de realización, la secuencia de nucleótidos se modifica de manera tal que los tres nucleótidos directamente 5' con respecto al codón de inicio de la traducción son "ACC." En una segunda forma de realización, estos nucleótidos son "ACA." La expresión de un polipéptido antigénico del NDV en microalgas o lenteja de agua también se puede mejorar mediante el uso de secuencias directrices 5'. Dichas secuencias directrices pueden servir para potenciar la traducción. Las directrices de la traducción son conocidas en la técnica e incluyen, pero en un sentido no limitativo: directrices de picornavirus, por ejemplo, la directriz EMCV (región no codificante 5' de la encefalomiocarditis; Elroy-Stein et al. (1989) PNAS USA 86:6126); directrices de potivirus, por ejemplo, la directriz TEV (virus del grabado de tabaco) (Allison et al. (1986) Virology 154:9); la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP; acajak y Sarnow (1991 ) Nature 353:90); la directriz no traducida del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus en mosaico de alfalfa (ARN 4 A V; Jobling y Gehrke (1987) Nature 325:622); la directriz del virus en mosaico de tabaco (TMV; Gallie (1989) Molecular Biology of RNA, 23:56); la directriz del virus del grabado de papa (Tomashevskaya ef al. (1993) J. Gen. Virol. 74:2717-2724); la región no traducida 5' de Fed-1 (Dickey (1992) EMBO J. 1 1 :2311-2317); la región no traducida 5' de RbcS (Silverthorne et al. (1990) J. Plant. Mol. Biol. 15:49-58); y la directriz del virus moteado clorótico de maíz (MCMV; Lommel et al. (1991 ) Virology 81 :382). Véase también, Della-Cioppa eí al. (1987) Plant Physiology 84: 965. También se ha demostrado que la secuencia directriz que comprende la secuencia del intrón vegetal, incluyendo la secuencia del intrón del gen de la alcohol deshidrogenasa 1 (ADH1 ) de maíz, el gen de catalasa de ricino o el gen PAT1 de la vía del triptofano de Arabidopsis incrementa la eficacia de traducción en plantas (Callis ef al. (1987) Genes Dev. 1 :1183-1200; Mascarenhas er a/. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920).

En algunas formas de realización de la presente invención, la secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 1222-1775 del gen de la alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (ADH1 ; GenBank N° Acceso X04049) se inserta 5' con respecto al polinucleótido que codifica el polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, para mejorar la eficacia de su traducción. En otra forma de realización, el cásete de expresión contiene a la directriz del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa-bis-fosfato carboxilasa 5B de Lemna gibba (directriz RbcS; véase Buzby et al. ( 1990) Plant Cell 2:805-814).

Se considera que se puede usar cualquiera de las modificaciones de la secuencia de nucleótidos para mejorar la expresión que se describieron antes en la presente invención, incluyendo cualquier modificación individual o cualquier combinación de modificaciones posible. La frase "modificada para una mejor expresión" en microalgas o lenteja de agua, según se usa en la presente, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que contiene cualquiera entre una o cualquier combinación de estas modificaciones. Péptido señal.

El polipéptido del NDV de interés se puede expresar normalmente o ventajosamente como una proteína secretada. Las proteínas secretadas habitualmente son traducidas a partir de polipéptidos precursores que incluyen un "péptido señal" que interactúa con una proteína receptora sobre la membrana del retículo endoplasmático (ER) para dirigir la translocación de la cadena polipeptídica en crecimiento a través de la membrana y hacia el interior del retículo endoplasmático para su secreción desde la célula. Este péptido señal se puede clivar del polipéptido precursor para producir un polipéptido "maduro" sin el péptido señal. Es posible que el péptido señal no sea clivado y que todo el polipéptido, incluyendo el péptido señal, sea secretado de la célula. En una forma de realización de la presente invención, un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, se expresa en microalgas o lenteja de agua a partir de una secuencia de polinucleótidos que está ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que dirige la secreción del polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, hacia el medio de cultivo. Los péptidos señal de plantas o algas que dirigen la translocación de proteínas hacia el retículo endoplasmático (para su secreción fuera de la célula) son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N°: 6.020.169. En la presente invención, se puede usar cualquier péptido señal de plantas o algas para dirigir el polipéptido expresado hacia el ER.

En algunas formas de realización, el péptido señal es el péptido señal de la endoquitinasa básica de Arabidopsis thaliana (aminoácidos 14-34 de la proteína en NCBI, N° Acceso BAA82823), el péptido señal de la extensina (Stiefel et al. (1990) Plant Cell 2: 785-793), el péptido señal de a-amilasa de arroz (aminoácidos 1-31 de la proteína del NCBI, N° Acceso AAA33885; véase también GenBank M24286). En otra forma de realización, el péptido señal corresponde al péptido señal de una proteína secretada de microalgas.

En una forma de realización, el péptido señal de la presente invención es el péptido señal del HN NDV que se muestra en la SEQ ID N°:13 (codificado por un polinucleótido que presenta la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°:12) o en la SEQ ID N°: 21 (codificado por un polinucleótido que presenta la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 27). El péptido señal de HN NDV de origen viral mostró un resultado sorprendente en la expresión de la proteína del NDV en microalgas, donde dirigía la translocación de la cadena polipeptídica a través de la membrana y hacia el interior del retículo endoplasmático para su secreción de la célula.

Como alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero para dirigir el polipéptido antigénico del NDV producido de manera recombinante para su secreción a partir de microalgas. Se ha demostrado que las células vegetales reconocen péptidos señal de mamífero cuyo blanco es el retículo endoplasmático, y que estos péptidos señal pueden dirigir la secreción de polipéptidos no sólo a través de la membrana plasmática sino también a través de la pared celular vegetal. Véanse, las Patentes de EE.UU. N°: 5.202.422 y 5.639.947 En una forma de realización, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal es modificada para una mayor expresión en microalgas, utilizando cualquier modificación o combinación de modificaciones divulgadas antes para la secuencia de polinucleótidos de interés.

El polipéptido HN NDV secretado, o un fragmento o una variante del mismo, se puede cosechar del medio de cultivo usando cualquier medio convencional conocido en el arte, incluyendo, pero en un sentido no limitativo, cromatografía, electroforesis, diálisis, extracción en solvente-solvente y semejantes. De esta manera, se puede obtener un polipéptido antigénico del NDV parcialmente o sustancialmente purificado, o un fragmento o una variante del mismo, a partir del medio de cultivo.

Microalgas o lenteja de agua transformadas La presente invención provee microalgas o plantas de lenteja de agua transformadas que expresan un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo. El término "microalgas" se refiere a miembros de la familia Thraustochytriaceae.

Actualmente, esta familia se divide en cuatro géneros: Schizochytrium, Thraustochytrium, Labyrinthuloides y Japonochytrium. Los ejemplos de Schizochytrium incluyen, pero en un sentido no limitativo, Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp. LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR21) (ATCC 28209) y la cepa depositada de Schizochytrium limacinum IFO 32693 (Honda et Yokochi).

El término "lenteja de agua" se refiere a miembros de la familia Lemnaceae. Actualmente, esta familia se divide en cinco géneros y 38 especies de lenteja de agua como se indica a continuación: género Lemna (L aequinoctialis, L. disperma, L. ecuadoriensis, L. gibba, L japónica, L. minor, L. miniscula, L. obscura, L. perpusilla, L. teñera, L. trisulca, L turionifera, L valdiviana); género Spirodela (S. intermedia, S. polirrhiza, S. punctata); género Wolffía {Wa. angusta, Wa. arrhiza, Wa. australina, Wa. borealis, Wa. brasiliensis, Wa. columbiana, Wa. elongata, Wa. globosa, Wa. microscópica, I/Va. neglecta); género Wolfiella (Wl. caudata, Wl. denticulata, Wl. gladiata, Wl. hyalina, Wl. lingulata, Wl. repunda, Wl. rotunda y Wl. neotropica) y género Landoltia (L. punctata). Las especies de Lemna se pueden clasificar usando el esquema taxonómico descrito por Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae—A Monograph Study (Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).

Según se utiliza en la presente, el término "planta" incluye plantas completas, órganos vegetales (por ejemplo, frondas (hojas), tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales y la progenie de las mismas. Dentro del alcance de la invención, las partes de plantas transgénicas comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos tisulares de células vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas, tejidos, callos vegetales, embriones así como flores, óvulos, tallos, frutas, hojas, raíces, puntas de raíces, nodulos y semejantes, originadas en las plantas transgénicas o su progenie transformada previamente con un polinucleótido de interés, por lo que consisten al menos en parte de células transgénicas.

Las microalgas o plantas de lenteja de agua transformadas de la invención se pueden obtener por introducción de una construcción de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, en las microalgas o plantas de lenteja de agua de interés.

El término "introducir" en el contexto de un polinucleótido, por ejemplo, una construcción de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico del NDV, o un fragmento o una variante del mismo, significa presentar a las microalgas o plantas de lenteja de agua el polinucleótido de una manera tal que el polinucleótido logra acceder al interior de una célula de las microalgas o lentejas de agua. Cuando se introducirá más de un polinucleótido, estos polinucleótidos se pueden ensamblar como parte de una sola construcción de nucleótidos o como construcciones de nucleótidos separadas, y se pueden localizar sobre un mismo vector de transformación o sobre vectores de transformación diferentes. Por lo tanto, estos polinucleótidos se pueden introducir en las células huésped de interés de microalgas o lentejas de agua en un solo evento de transformación, en eventos de transformación separados o, por ejemplo, como parte de un protocolo de cría. Las composiciones y los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir uno o más polinucleótidos en microalgas, solamente que uno o más polinucleótidos pueda acceder al interior de al menos una célula de las microalgas o plantas de lenteja de agua. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas o algas son conocidos en el arte, e incluyen, pero en un sentido no limitativo, métodos de transformación transitoria, métodos de transformación estable y métodos mediados por virus.

Una "transformación transitoria" en el contexto de un polinucleótido tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, significa que un polinucleótido es introducido en las microalgas o lentejas de agua y no se integra en el genoma de las microalgas o lentejas de agua.

Los términos "introducir de manera estable" o "introducido de manera estable" en el contexto de un polinucleótido (tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo) introducido en microalgas o lentejas de agua significa que el polinucleótido introducido se ha incorporado de manera estable en el genoma de microalgas o lentejas de agua, y por consiguiente las microalgas o las plantas de lenteja de agua son transformadas de manera estable con el polinucleótido.

Un "transformación estable" o "transformada de manera estable" significa que un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, introducido en microalgas o plantas de lenteja de agua se integra en el genoma de las microalgas o plantas y que puede ser heredado por la progenie de las mismas, más particularmente, por la progenie de múltiples generaciones sucesivas. En algunas formas de realización, las generaciones sucesivas incluyen la progenie producida vegetativamente (es decir, por reproducción asexual), por ejemplo, con propagación clonal. En otras formas de realización, las generaciones sucesivas incluyen la progenie producida por reproducción sexual.

La construcción de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, se puede introducir en las microalgas o plantas de interés usando cualquier protocolo de transformación conocido por los especialistas en el arte. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en microalgas o células vegetales o nódulos incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334; electroporación, Riggs et al. (1986) PNAS USA 83:5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los EE.UU. N°: 5.563.055-y 5.981.840), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N°: 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; y 5.932.782; y Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Las células que han sido transformadas se pueden cultivar para obtener plantas o algas de acuerdo con medios convencionales.

Según se indicó previamente, las microalgas o plantas transformadas de manera estable se pueden obtener mediante cualquier método de transferencia de genes conocido en el arte, tal como uno entre los métodos de transferencia de genes divulgados en la Patente de los EE.UU. N°: 6.040.498 o en las publicaciones de Solicitudes de Patente de los EE.UU. N°: 2003/0 15640, 2003/0033630 o 2002/0088027. Las microalgas o plantas se pueden transformar eficazmente con un cásete de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico descrita en la presente mediante cualquiera de numerosos métodos incluyendo transferencia de genes mediada por Agrobacterium, bombardeo balístico o electroporación. Los Agrobacterium usados pueden ser Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Los transformantes estables de microalgas o plantas se pueden aislar por transformación de microalgas o células vegetales con la secuencia de ácido nucleico de interés y un gen que confiere resistencia a un agente de selección, seguido por cultivo de las células transformadas en un medio que contiene al agente de selección. Véanse, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N°: 6.040.498.

Las microalgas o plantas transformadas de manera estable utilizadas en estos métodos deberían mostrar una morfología normal y ser fértiles por reproducción sexual y/o poder reproducirse vegetativamente (es decir, reproducción asexual), por ejemplo, con propagación clonal. Preferentemente, las microalgas o plantas transformadas de la presente invención contienen una sola copia del ácido nucleico transferido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, y el ácido nucleico transferido no presenta un reordenamiento destacable en el mismo. Se considera que las microalgas transformadas de la invención pueden contener al ácido nucleico transferido con un bajo número de copias (es decir, no más de doce copias, no más de ocho copias, no más de cinco copias, como alternativa, no más de tres copias, como una alternativa adicional, menos que tres copias del ácido nucleico por célula transformada).

Las plantas o algas transformadas que expresan un polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para expresar el polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo. Después se puede cosechar el polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, de las microalgas, del medio de cultivo, o de las microalgas y del medio de cultivo y, cuando se deseara, se lo puede purificar usando cualquier método convencional de aislamiento y purificación conocido en el arte, incluyendo cromatografía, electroforesis, diálisis, extracción con solvente-solvente y semejantes. El polipéptido HN NDV, o un fragmento o una variante del mismo, se puede formular luego como una vacuna para aplicaciones terapéuticas, como se describe en otra parte en la presente.

Métodos para preparar un polipéptido del NDV Como se describe acabadamente en la presente, en una forma de realización, un método para producir un polipéptido recombinante HN NDV comprende: (a) cultivar microalgas o plantas de lenteja de agua en un medio de cultivo para microalgas o lentejas de agua, en donde las microalgas o plantas de lenteja de agua son transformadas de manera estable para expresar el polipéptido del NDV, y en donde el polipéptido del NDV es expresado a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de codificación para dicho polipéptido recombinante del NDV y una secuencia de codificación ligada operativamente para un péptido señal que dirige la secreción del polipéptido del NDV hacia el medio de cultivo; y (b) recolectar el polipéptido del NDV a partir de dicho medio de cultivo. El término recolectar incluye pero en un sentido no limitativo cosechar a partir del medio de cultivo o purificar.

Después de producir el polipéptido recombinante en microalgas o plantas, se puede usar cualquier método disponible en el arte para purificación de proteínas. Los distintos pasos incluyen liberar la proteína del material no proteico o algas o material vegetal, seguido por la purificación de la proteina de interés a partir de otras proteínas. La proteina recombinante puede ser una proteina secretada que fue aislada a partir del medio de cultivo después de su producción por la célula y puede comprender un péptido señal. Dicho péptido señal puede ser olivado después de la secreción, para producir un producto proteico maduro. Según el vector y sistema huésped usados para la producción, los polipéptidos recombinantes del NDV resultantes de la presente invención pueden permanecer dentro de la célula recombinante o pueden ser secretados hacia el medio de fermentación o pueden ser secretados hacia un espacio entre dos membranas celulares; o pueden ser retenidos sobre la superficie externa de una membrana celular. Los pasos iniciales en el proceso de purificación incluyen centrifugación, filtración o una combinación de las mismas. Después de la centrifugación inicial a baja velocidad, se puede usar el sobrenadante de baja velocidad para una composición farmacéutica o en la preparación de vacunas. El sobrenadante de baja velocidad puede sufrir una purificación adicional usando diversos métodos que se describen más adelante. Las proteínas secretadas hacia el espacio extracelular de los tejidos se pueden obtener usando extracción por vacío o centrifugación. Un procesamiento mínimo también podrían comprender la preparación de productos crudos. Otros métodos incluyen maceración y extracción con el fin de permitir el uso directo del extracto.

Las proteínas recombinantes producidas mediante el método de la presente invención se pueden purificar usando una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero en un sentido no limitativo, centrifugación, filtración, cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía por filtración en gel, cromatografía de fase reversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial. Los métodos para purificar la proteína de interés pueden aprovechar las diferencias en el tamaño, las propiedades fisicoquímicas y la afinidad de unión de la proteína. Dichos métodos incluyen cromatografía, incluyendo cromatografía de afinidad por procainamida, de exclusión de tamaño, líquida de alta presión, de fase reversa y de intercambio aniónico, marcas de afinidad, etc. En particular, se puede usar cromatografía de afinidad por el ion de Ni inmovilizado para purificar la proteina expresada. Véase, Favacho et al. (2006) Protein expression and purification 46:196-203. Véase también, Zhou et al. (2007) The Protein J 26:29-37; Wang er al. (2006) Vaccine 15:2176-2185; y WO/2009/076778. Se pueden usar protectores en el proceso de purificación tales como osmóticos, antioxidantes, inhibidores de oxidación fenólica, inhibidores de proteasas y semejantes.

Métodos de uso y artículo de manufactura La presente invención incluye las siguientes formas de realización de métodos. En una forma de realización, se divulga un método para vacunar un animal comprende administrar una composición que comprende uno o más polipéptidos antigénicos del NDV o un fragmento o una variante del mismo y un transportador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario a un animal. En un aspecto de esta forma de realización, el animal es un ave, un equino, un canino, un felino o un porcino.

En aún otra forma de realización, la vacuna o composición puede ser administrada a pollos de un día de vida o mayores.

En una forma de realización de la invención, se puede emplear un régimen de sensibilización-refuerzo, que comprende al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno común. Típicamente, la composición inmunológica o vacuna usada en la administración primaria es de una naturaleza diferente de las usadas como refuerzo. Sin embargo, cabe destacar que se puede usar la misma composición en la administración primaria y en la administración de refuerzo. Este protocolo de administración se denomina "sensibilización-refuerzo".

En la presente invención, se usa un vector viral recombinante para expresar una secuencia de codificación del NDV o fragmentos de la misma que codifique un polipéptido antigénico del NDV o un fragmento o una variante del mismo. Específicamente, el vector viral puede expresar una secuencia NDV, más específicamente un gen HN NDV o un fragmento del mismo que codifique un polipéptido antigénico. El vector viral contemplado en la presente incluye, pero en un sentido no limitativo, Poxvirus [por ejemplo, un virus Vaccinia o un virus Vaccinia atenuado, un virus Avipox o un virus Avipox atenuado (por ejemplo, Canarypox, Fowlpox, Dovepox, Pigeonpox, Quailpox, ALVAC, TROVAC; véase por ejemplo, US 5.505.941 , US 5.494.8070), un virus Raccoonpox, un virus Swinepox, etc.], un adenovirus (por ejemplo, un adenovirus humano, un adenovirus canino), un herpesvirus (por ejemplo un herpesvirus canino, un herpesvirus de pavo, el virus de la enfermedad de Marek, virus de laringotraquitis infecciosa, herpesvirus felino, virus de laringotraquitis (ILTV), herpesvirus bovino, herpesvirus porcino), baculovirus, retrovirus, etc. En otra forma de realización, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de Canarypox, tal como, ALVAC. En aún otra forma de realización, el vector de expresión de avipox puede ser un vector de Fowlpox, tal como TROVAC. El polipéptido, antígeno, epitope o inmunógeno del NDV puede ser un HN NDV. Por ejemplo, el vector TROVAC que comprende al HN NDV o F puede ser un vector como se describe en US 7.144.578 y en US 2008/0188640, el vector ILTV que comprende los antígenos del NDV incluyendo HN y F puede ser un vector como el que se describe en US 6.306.400 y US 6.153.199. El polipéptido o antígeno del NDV de la invención que será expresado en un vector viral se inserta bajo el control de un promotor de poxvirus específico, por ejemplo, el promotor de 7,5 kDa de Vaccinia (Cochran et al., 1985), el promotor I3L de Vaccinia (Riviere et al., 1992), el promotor HA de Vaccinia (Shida, 1986), el promotor ATI de Cowpox (Funahashi et al., 1988), el promotor H6 de Vaccinia (Tailor et al., 1988b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989), entre otros.

En otro aspecto del protocolo o régimen de sensibilización-refuerzo de la invención, se administra una composición que comprende un antígeno NDV de la invención seguido por la administración de un vector viral recombinante o un vector de plásmido que contiene y expresa un antígeno NDV y/o variantes o fragmentos del mismo in vivo. Asimismo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de un vector viral recombinante o un vector de un plásmido seguido por la administración de un antígeno NDV recombinante de la invención. Se hace notar además que ambas administraciones primaria y secundaria pueden comprender al antígeno NDV recombinante de la invención. Por consiguiente, el antígeno NDV recombinante de la invención puede administrarse en cualquier orden con un vector viral o, como alternativa, se puede usar solo como ambas composiciones primaria y secundaria.

En aún otro aspecto del protocolo de sensibilización-refuerzo de la invención, se administra una composición que comprende un antígeno NDV de la invención seguido por la administración de una composición o vacuna viral inactivada que comprende al antígeno del NDV. Asimismo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una composición o vacuna viral inactivada seguido por la administración de un antígeno NDV recombinante de la invención. Se hace notar además que ambas administraciones primaria y secundaria pueden comprender al polipéptido recombinante antigénico de la invención. Los polipéptidos antigénicos de la invención se pueden administrar en cualquier orden con una composición o vacuna viral inactivada o, como alternativa, se pueden usar solos como ambas composiciones primaria y secundaria.

Un régimen de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos de los mismos. La vacuna usada en la administración de sensibilización puede ser de una naturaleza diferente de las usadas como vacunas de refuerzo posteriores. La administración de sensibilización puede comprender una o más administraciones. De manera similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

El volumen de la dosis de las composiciones para las especies blanco que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de la dosis de composiciones para aves, basadas en vectores virales, por ejemplo, composiciones basadas en un vector viral que no es poxvirus, generalmente comprende entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2,0 mi, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1 ,0 mi, y entre aproximadamente 0,5 mi y aproximadamente 1 ,0 mi.

Las composiciones que comprenden los polipéptidos recombinantes antigénicos de la invención usadas en los protocolos de sensibilización-refuerzo están contenidas en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario.

Los protocolos de la invención protegen al animal contra el NDV y/o previenen el avance de la enfermedad en un animal infectado.

Las diversas administraciones preferentemente tienen lugar separadas por un intervalo de 1 a 6 semanas. De acuerdo con una forma de realización, también se prevé un refuerzo anual. Los animales tienen ventajosamente al menos un día de vida en el momento de la primera administración.

La encada de las vacunas puede evaluarse aproximadamente 2 a 4 semanas después de la última inmunización con pruebas en animales, tales como aves, usando una cepa virulenta de NDV. Se usan cepas homologas y heterólogas en la prueba para evaluar la eficacia de la vacuna. El animal puede recibir la dosis en aerosol, por vía intranasal, ¡ntraocular, intratraqueal y/u oral. La prueba viral puede ser aproximadamente 105"8 EID5o en un volumen que depende de la ruta de administración. Por ejemplo, si la administración es por aerosol, se aerosoliza una suspensión de virus para generar gotas de aproximadamente 1 a 100 µ?t?, si la administración es intranasal, intratraqueal u oral, el volumen del virus de prueba es de aproximadamente 0,5 mi, 1-2 mi y 5-10 mi, respectivamente. Los animales pueden ser observados diariamente por 14 días después de la prueba para verificar sus signos clínicos, por ejemplo, deshidratación y empastamiento de cloacas. Además, se pueden sacrificar los grupos de animales y luego evaluar los hallazgos patológicos de hemorragia pulmonar y pleural, traqueitis, bronquitis, bronquiolitis y bronconeumonia. Se pueden recolectar hisopados orofaríngeos de todos los animales después de la prueba para el aislamiento del virus. La presencia o ausencia de antígenos virales en tejidos respiratorios puede ser evaluada con la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRRT-PCR). Se pueden recolectar muestras de sangre antes y después de la prueba y se pueden analizar por la presencia del anticuerpo específico del NDV.

El especialista en el arte deberá comprender que la divulgación en la presente se ofrece a modo de ejemplo y la presente invención no se limita a la misma. A partir de la divulgación en la presente y el conocimiento en el arte, el especialista puede determinar la cantidad de administraciones, la ruta de administración y las dosis a usar para cada protocolo de inyecciones, sin ninguna experimentación desmedida.

La presente invención contempla al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica elaborada de acuerdo con la invención. El animal puede ser un macho, una hembra, una hembra preñada y un recién nacido. Esta administración se puede efectuar por diversas rutas incluyendo, pero en un sentido no limitativo, una inyección intramuscular (IM), ¡ntradérmica (ID) o subcutánea (SC) o una administración por vía intranasal u oral. La composición terapéutica de acuerdo con la invención también puede ser administrada con un aparato sin aguja (como, por ejemplo con un Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EE.UU.), un aparato Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE.UU.)). Otro enfoque para administrar composiciones de plásmidos comprende el uso de electroporación (véase, por ejemplo Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; Solicitud PCT N°: WO99/01158). En otra forma de realización, la composición terapéutica es administrada al animal con una pistola de genes o por bombardeo con partículas de oro.

En una forma de realización, el objeto divulgado en la presente provee un régimen de vacunación y un método de detección para diferenciar los animales infectados de los vacunados (DIVA).

Se ha propuesto una estrategia que permite "diferenciar animales infectados de animales vacunados" (DIVA), como una posible solución para una eventual erradicación del virus sin un descarte masivo de aves y el consiguiente daño económico, especialmente en los países en desarrollo (Food and Agricultura Organization of the United (FAO) (2004). FAO, O/E & WHO Technical consultation on the Control of NDV. Animal health special report). Esta estrategia ofrece los beneficios de una vacunación (menos virus en el entorno) con la capacidad para identificar grupos infectados en tanto aún permite implementar otras medidas de control, incluyendo el sacrificio inmediato de especies susceptibles [stamping ouf\. A nivel del grupo, un enfoque simple comprende monitorear regularmente aves centinela que no fueron vacunados en cada grupo vacunado, pero esto puede generar algunos problemas de manejo, en particular para identificar los centinelas en grupos grandes. Como una alternativa, se pueden conducir pruebas para verificar la exposición a campo con las aves vacunadas. Como alternativa, el empleo de vacunas que solamente contienen la subunidad HN NDV (proteína) permitiría usar ELISA clásicos basados en NP o una matriz y AGID para detectar la infección en aves vacunadas.

En la presente se divulga que el uso de la vacuna o composición de la presente invención permite la detección de una infección por NDV en un animal vacunado usando una prueba de diagnóstico disponible destinado a detectar una respuesta de anticuerpo contra proteínas del NDV distintas de HA tal como con inmunodifusión en gel de agar o ELISA basado en NP. En la presente se divulga que el uso de la vacuna o composición de la presente invención permite la detección de la infección en animales por diferenciación de los animales infectados de los vacunados (DIVA). Se divulga en la presente un método para diagnosticar la infección del NDV en un animal usando un método de detección inmunogénico basado en NP, tal como un ELISA basado en NP. En una forma de realización, el objeto divulgado en la presente está dirigido a un método para diagnosticar una infección por NDV en un animal, que comprende: a) poner un sustrato sólido que comprende una nucleoproteína (NP) en contacto con una muestra obtenida del animal; b) poner el sustrato sólido en contacto con un anticuerpo monoclonal (MAb) contra la NP; y c) detectar la unión del MAb a la muestra capturada por la NP sobre el sustrato sólido, en donde el porcentaje de inhibición de la muestra de prueba con relación al control negativo indica que el sujeto está infectado con el NDV, diagnosticando así una infección por NDV en el sujeto.

Otra forma de realización de la invención es un conjunto de elementos para un método para generar o inducir una respuesta inmunológica o protectora contra el NDV en un animal que comprende una composición o vacuna inmunológica recombinante HN NDV y también instrucciones para conducir el método para administrar una cantidad eficaz para generar una respuesta inmune en el animal.

En una forma de realización, el objeto divulgado en la presente está dirigido a un conjunto de elementos para un método para generar o inducir una respuesta inmune que puede comprender cualquiera de las composiciones o vacunas inmunológicas recombinantes NDV, o composiciones o vacunas inmunológicas inactivadas NDV, composiciones o vacunas virales recombinantes NDV y también instrucciones para el método.

Otra forma de realización de la invención es un conjunto de elementos para un método para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra el NDV en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un antígeno NDV de la invención y una composición o vacuna inmunológica viral recombinante NDV y también instrucciones para el método para administrar una cantidad eficaz para generar una respuesta inmune en el animal.

Otra forma de realización de la invención es un conjunto de elementos para un método para inducir una respuesta inmunológica o protectora contra el NDV en un animal que comprende una composición o vacuna que comprende un antígeno NDV de la invención y una composición o vacuna inmunológica viral inactivada NDV y también instrucciones para el método para administrar una cantidad eficaz para generar una respuesta inmune en el animal.

Aún otro aspecto de la presente invención se relaciona con un conjunto de elementos para la vacunación de sensibilización-refuerzo de acuerdo con la presente invención como se describió anteriormente. El conjunto de elementos puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna o composición para la vacunación de sensibilización de acuerdo con la presente invención, y un segundo vial que contiene una vacuna o composición para el refuerzo de vacunación de acuerdo con la presente invención. El conjunto de elementos puede contener ventajosamente viales adicionales del primero o segundo tipo para efectuar vacunaciones de sensibilización adicionales o refuerzos de vacunación adicionales.

En una forma de realización, la invención provee la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una vacuna o composición para la administración y expresión de un antígeno o epitope HN del NDV en una célula blanco. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es de rutina para un especialista en el arte. En una forma de realización, la vacuna o composición comprende un polipéptido, antígeno o epitope recombinante HN NDV, y un transportador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario. En otra forma de realización, el transportador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario facilita la transfección o infección y/o mejora la conservación del vector o de la proteína.

Los transportadores o vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables o aptos para uso veterinario son bien conocidos por el especialista en el arte. Por ejemplo, un transportador o vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario puede ser una solución de NaCI 0,9% (por ejemplo, salina) o una solución amortiguadora de fosfato. Otro transportador o vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinarios que se puede usar en los métodos de esta invención incluyen, pero en un sentido no limitativo, poli-{L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El transportador o vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinarios puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilite la administración del vector o de las proteínas recombinantes; ventajosamente, el transportador, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector o de la proteína. Las dosis y el volumen de las dosis se mencionan en la presente en la descripción general y también pueden ser determinados por el especialista a partir de esta divulgación tomada junto con el conocimiento del arte, sin ninguna experimentación desmedida.

Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son adecuados, pero no exclusivamente, para los plásmidos, presentan la siguiente fórmula: CH3 I + R,— O— CH2— CH— CH2— N— R2— X I I OR. CH3 en donde R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 ó 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo DMRIE. En otra forma de realización, el lípido catiónico puede estar asociado con un lípido neutro, por ejemplo DOPE.

Entre estos lípidos catiónicos, se prefiere DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N(N-dimetil-2,3- bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio; WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

Cuando se usa DOPE, la relación molar de DMRIE:DOPE ventajosamente es de aproximadamente 95: aproximadamente 5 y de aproximadamente 5: aproximadamente 95, más ventajosamente de aproximadamente 1 : aproximadamente 1 , por ejemplo, 1 :1.

En otra forma de realización, el transportador, excipiente, vehículo, o adyuvante farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario puede ser una emulsión de agua-en-aceite. Los ejemplos de emulsiones de agua-en-aceite adecuadas incluyen emulsiones para vacunas de agua-en-aceite basadas en aceite, que son estables y líquidas a 4°C, que contienen: entre 6 y 50% v/v de una fase acuosa que contiene un antígeno, preferentemente entre 12 y 25% v/v, entre 50 y 94% v/v de una fase oleosa que contiene en total o en parte un aceite no metabolizable (por ejemplo, un aceite mineral tal como aceite de parafina) y/o un aceite metabolizable (por ejemplo, un aceite vegetal o ésteres de ácidos grasos, polioles o alcoholes), entre 0,2 y 20% p/v de agentes tensioactivos, preferentemente entre 3 y 8% p/v, siendo estos últimos en total o en parte o en una mezcla ésteres de poliglicerol, donde dichos ésteres de poliglicerol preferentemente son (poli)ricinoleatos de poliglicerol o aceites de ricino polioxietilenízados o sino aceites de ricino polioxietilenízados hidrogenados. Los ejemplos de agentes tensioactivos que se pueden usar en una emulsión de agua-en-aceite incluyen ésteres de sorbitán etoxilados (por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenizado (20) (TWEEN 80®), disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ésteres de sorbitán (por ejemplo, monooleato de sorbitán (SPAN 80®), disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Además, con respecto a una emulsión de agua-en-aceite, véase también US 6.919.084. la emulsión de agua-en-aceite puede comprender 75% de fase oleosa que contiene aceite mineral y 4% de SPAN 80® y 25% de fase acuosa que contiene 0,4% de TWEEN 80®. En algunas formas de realización, la fase acuosa que contiene al antígeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes amortiguadores del pH. Un ejemplo de una solución amortiguadora adecuado es una solución amortiguadora de salina fosfato. En una forma de realización, la emulsión de agua-en-aceite puede ser una triple emulsión de agua/aceite/agua (W/O/W) (U.S. 6.358.500). La triple emulsión WOW puede comprender 60% de fase oleosa que contiene aceite mineral y 6% de SPAN 80® y 40% de fase acuosa que contiene 1 ,6% de TWEEN 80®. Los ejemplos de otras emulsiones adecuadas se describen en la Patente de los EE.UU. N°: 7.371.395.

Las composiciones y vacunas inmunológicas de acuerdo con la invención pueden comprender o consistir esencialmente de uno o más transportadores, excipientes, vehículos o adyuvantes farmacéuticamente aceptables o aptos para uso veterinario. Los transportadores o adyuvantes adecuados para su uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros de derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de nucleótidos de oligodesoxirribosa con una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al., 1996; W098/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT que se describe en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicada por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 que se describe en la página 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citoquinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponinas o (8) otros adyuvantes descritos en cualquiera de los documentos citados e incorporados en la presente solicitud a modo de referencia o (9) cualquier combinación o mezcla de los mismos.

La emulsión de aceite en agua (3) que es especialmente apropiada para los vectores virales se pueden basar en: aceite de parafina líquido liviano (tipo Farmacopea Europea), aceite isoprenoide tal como escualano, escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, por ejemplo isobuteno o deceno, esteres de ácidos o alcoholes que contienen un grupo alquilo de cadena lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol o ásteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, en especial ésteres del ácido isoesteárico.

El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsionantes pueden ser agentes tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres por un lado de sorbitán, manida (por ejemplo oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y por otro lado de los ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, donde dichos ésteres están opcionalmente etoxilados, o bloques de copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno, tal como Pluronic, por ejemplo, L121.

Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1 ), se prefieren los polímeros de ácido acrílico o metacrílico entrecruzado, en especial entrecruzado por éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el nombre de carbómero (Pharmeuropa, volumen 8, N° 2, junio de 1996). El especialista en el arte también puede consultar US 2.909.462, que provee tales polímeros acrílicos entrecruzados con un compuesto polihidroxilado que contiene al menos tres grupos hidroxilo, preferentemente no más que ocho de tales grupos, donde los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos son reemplazados por radicales alifáticos insaturados de al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen entre 2 y 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tal como metilo. Son especialmente apropiados los productos comercializados con el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.). Están entrecruzados por alilsacarosa o por alilpentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 97 P.

Con respecto a los copolímeros de derivados de alquenilo-anhídrido maleico, se prefiere EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o entrecruzados y son entrecruzados, por ejemplo, por éter de divinilo. También se puede hacer referencia a J. Fields et al., 960.

Con referencia a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA preferentemente están formados por unidades básicas de la siguiente fórmula: COOH COOH en donde: R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3 x = 0 ó 1 , preferentemente x = 1 - y = 1 ó 2, con x + y = 2 Para EMA, x = 0 e y = 2 y para los carbómeros x = y = 1.

Estos polímeros son solubles en agua o en solución salina fisiológica (NaCI 20 g/l) y se puede ajustar el pH en 7,3 a 7,4, por ejemplo, con soda cáustica (NaOH), para proveer una solución de adyuvante en la cual se podrá incorporar el o los vectores de expresión. La concentración del polímero en la composición inmunológica o de vacuna final puede variar en un rango entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1 ,5% p/v, entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 1 % p/v y entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,4% p/v.

La citoquina o citoquinas (5) se pueden encontrar en la forma de proteínas en la composición inmunológica o de vacuna o se pueden co-expresar en el huésped con el inmunógeno o los inmunógenos o uno o más epitopes de los mismos. Se prefiere la coexpresión de la citoquina o de las citoquinas, ya sea por el mismo vector que expresa el inmunógeno o los inmunógenos o uno o más epitopes de los mismos, o por un vector separado de los mismos.

La invención comprende preparar tales composiciones combinadas; por ejemplo, mezclando los componentes activos, ventajosamente juntos y con un adyuvante, transportador, citoquina, y/o diluyente.

Las citoquinas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero en un sentido no limitativo, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón a (IFNDa), interferón ß (IFNap), interferón ? (IFNDy), interleuquina-1aD(IL-1 Da), interleuquina-1 Dp (IL-1 ?ß), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina- 5 (IL-5), interleuquina-6 (lL-6), ¡nterleuquina-7 (IL-7), ¡nterleuquina-8 (IL-8), ¡nterleuquina-9 (IL-9), interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-11 (IL-11 ), interleuquina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNFa), factor de necrosis tumoral ß (TNFDP) y factor de crecimiento transformante ß (TGFap). Se comprenderá que las citoquinas se pueden co-administrar y/o administrar sucesivamente con la composición inmunológica o de vacuna de la presente invención. Así, por ejemplo, la vacuna de la presente invención también puede contener una molécula de ácido nucleico exógena que exprese in vivo una citoquina adecuada, por ejemplo, una citoquina adaptada al huésped a vacunar o en el cual se generará una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citoquina de aves para las preparaciones que serán administradas a aves).

A continuación la presente invención se describirá con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Sin una elaboración adicional, se cree que los especialistas en el arte podrán, usando las descripciones precedentes, poner en práctica a la presente invención en su mayor extensión. Los siguientes ejemplos detallados se interpretarán entonces en un sentido meramente ilustrativo, y no limitativo de la descripción precedente en modo alguno. Los especialistas en el arte podrán reconocer fácilmente las variaciones apropiadas para los procedimientos, tanto de los reactivos como de las condiciones de reacción y los procedimientos.

La construcción de insertos, de plásmidos y de vectores de ADN recombinante de microalgas o plantas se llevó a cabo usando las técnicas estándar de biología molecular que se describen en J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

Ejemplo 1 Construcción de vectores para el gel del HN del NDV y transformación Se digirió el vector pAB0018 (N° de depósito en ATCC PTA9616) con Bam \ y A/del para dar como resultado dos fragmentos de 838 bp y 9879 bp. El fragmento de mayor tamaño se fraccionó por técnicas estándar de electroforesis en un gel de ágar ágar, y se purificó usando conjuntos de elementos comerciales para la purificación de ADN. Este fragmento de 9879 bp se ligó a un gen de codones optimizados para el HN del NDV (SEQ ID N°:1 ) que también había sido digerido previamente con SamHI y Nde\. Luego, el producto de la ligación se utilizó para transformar cepas de origen comercial de células de E. coli DH5-a competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) usando los protocolos del fabricante. Dichos plásmidos luego se seleccionaron por digestiones por restricción o por PCR para confirmar que la ligación generó las estructuras del plásmido esperadas. Uno de dichos vectores plásmidos que se obtuvo como resultado de este procedimiento se verificó por secuenciación de Sanger y se denominó pCL0081. Las secuencias específicas de ácidos nucleicos de gen del HN del NDV se optimizaron para la expresión en Schizochytríum sp. Además, el vector pCL0081 contenía un cásete de marcadores seleccionables que confiere resistencia a transformantes de Schizochytríum cultivados en presencia de sulfometuron metil, un promotor del gen del factor de elongación 1 de Schizochytrium (EF1 ) para impulsar la expresión del transgen del HN, y a continuación del transgen del HN, el terminador OrfC (también conocido como el terminador PFA3).

Se usó Schizochytrium sp. (ATCC 20888) como huésped para la transformación con el vector pCL0081 usando el método de electroporación. Las células se cultivaron en medios M50-20 sobre un agitador a 200 rpm durante 48 horas a 29°C. Las células se diluyeron a 1 :100 en medios frescos y se cultivaron durante toda la noche. Las células se centrifugaron y resuspendieron en manitol 1 M, CaCI2 10mM (pH 5,5) hasta una concentración final de 2 unidades OD6oo- Se mezclaron 5 mi de células con 0,25 mg/ml de Proteasa XIV (Sigma Chemical) y se incubaron sobre un agitador durante 4 horas. Las células se lavaron dos veces con glicerol al 10% enfriado con hielo y se resuspendieron en 500 uL de glicerol frío al 10%. Se tomaron alícuotas de 90 uL en electro-cubetas preenfriadas con 0,2 cm de espacio (Biorad 165-2086). Se agregaron 10 ul de ADN (1-5 ug) a la cubeta y se mezcló suavemente y se mantuvo sobre hielo. Se realizó la electroporación de las células a 200 ohms (resistencia), 25 uF, 250V (espacio de 0,1 cm) 500V (0,2 cm de espacio). Se agregaron inmediatamente 0,5ml de medio a la cubeta. Luego se transfirieron las células a 4,5ml de medios M50-20 y se incubaron durante 2-3 horas a 100 rpm sobre un agitador. Las células se centrifugaron y resuspendieron en 0,5 mi de medios y se pusieron en placas sobre placas 2-5 M2B con una selección apropiada (de ser necesario) y se incubaron a 29°C.

Ejemplo 2: Análisis de HA de los transformantes de algas Se cultivaron soluciones madre congeladas de cepas transgénicas de Schizochytrium (transformadas con pCL0081 ) en M50-20 (descrito en US 2008/0022422) a confluencia, luego se propagaron en matraces de 50ml con deflectores para sacudir a 27°C, 200rpm durante 48 horas en un medio que contenía (por litro) 13,62g de Na2S04, 0,72g de K2S04, 0,56g de KCI, 2,27g de MgS04.7H20, 3g de (NH4)2S04, 0,19g de CaCl2.2H20, 3g de glutamato monosódico, monohidrato, 21 , 4g de MES, y 0,4g de KH2P04. El volumen se llevó a 900ml con H20 desionizada y el pH se llevó a 6 antes de calentar en autoclave durante 35min. Luego se agregaron al medio glucosa esterilizada por filtración (50g/L), vitaminas (2ml/L) y metales de trazas (2ml/L) y el volumen se llevó a un litro. La solución de vitaminas contenía 0,16g/L de vitamina B12, 9,75g/L de tiamina, 3,33g/L de pantotenato de Ca. La solución de metales de trazas (pH 2,5) contenía 1,00g/L de ácido cítrico, 5,15g/L de FeS04.7H20, 1 ,55g/L de nCI2.4H20, 1 ,55g/L de ZnS04.7H20, 0,02g/L de CoCI2.6H20, 0,02g/L de Na2Mo04.2H20, 1 ,035g/L de CuS04.5H20, 1 ,035g/L de NiS04.6H20. Todos los reactivos se obtuvieron comercialmente.

Los cultivos de Schizochytríum se transfirieron a tubos cónicos de 50ml y se centrifugaron a 3000g durante 15min. Este sobrenadante de baja velocidad se utilizó tal cual para el ensayo de actividad de hemaglutinación. Una porción del sobrenadante de baja velocidad se continuó centrifugando a 100.000g durante una hora. Los gránulos que se obtuvieron como resultado, fracción insoluble que contenían la proteína HN, se resuspendieron en solución salina amortiguadora de pH al fosfato (PBS) y se utilizaron para análisis de la secuencia de péptidos así como para el análisis de glucosilación.

La expresión de la proteína HN por Schizochytríum se evaluó primero por un ensayo de actividad. La proteína HN funcional muestra una actividad de hemaglutinación que se pudo detectar fácilmente mediante un ensayo estándar de actividad de hemaglutinación. En resumen, se prepararon 50uL de diluciones 2x de sobrenadante de baja velocidad en PBS en una placa de microtitulación de 96 cavidades. Luego se agregó a cada cavidad un volumen igual de una solución de glóbulos rojos de pavo aproximadamente al 1 % (Fitzgerald Industries, Acton, MA, EE.UU.) en PBS seguido de incubación a la temperatura ambiente durante 30min. Luego se analizó a simple vista el grado de aglutinación. La unidad de actividad de hemaglutinación (HAU) se define como la mayor dilución del sobrenadante de baja velocidad que causa una hemaglutinación visible en la cavidad. Se encontró que la actividad típica estaba en el orden las 512 HAU en las cepas transgénicas "CL0081-23" (Figura 3B). Como control negativo se utilizó PBS o la cepa de tipo salvaje de Schizochytríum sp. ATCC 20888, cultivada y preparada de la misma manera que las cepas transgénicas, y no mostró ninguna actividad de hemaglutinación. como control positivo se utilizó una proteína recombinante hemaglutinina del NDV (HA). Se asignó puntaje a los títulos de las muestras con la mayor dilución antes de observar el botón definido. La actividad de HA se detectó en el sobrenadante sin tratar (Figura 3A). La HAU en la muestra de sobrenadante concentrado fue de 3200 HAU/50ul. Se encontró que la actividad de hemaglutinación fue estable durante múltiples ciclos de congelación/descongelación.

Ejemplo 3: Análisis de la expresión de transformantes de algas La expresión de la proteína HN se verificó también por análisis de inmunotransferencia siguiendo un procedimiento estándar de inmunotransferencia. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) en un gel con 4-12% de bis-tris (Invitrogen). Luego, las proteínas se tiñeron con azul Coomassie (SimpIyBlue Safe Stain, Invitrogen) o se transfirieron sobre una membrana de fluoruro de polivinilideno y se sondearon para determinar la presencia de proteína HN con antisuero anti-NDV de pollo con una dilución 1 :1000 (Charles River laboratories, Wilmington, MA, EE.UU.) seguido de anticuerpo secundario anti-pollo acoplado a fosfatasa alcalina con una dilución 1:5000 (AP-AffiniPure Goat Anti-Chicken #103-055- 55, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, EE.UU.). Luego se trató la membrana con solución de 5-bromo-4-cloro-3- indolil-fosfato/nitroazul de tetrazolio (BCIP/NBT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (KPL, Gaithersburg, D). En la Figura 4 se presenta un ejemplo para la cepa transgénica "CL0081-23". Los geles teñidos con azul Coomassie y las correspondientes inmunotransferencias anti-NDV se presentan en los paneles B y C. La proteína recombinante HN se detectó en el sobrenadante de baja velocidad (panel B) y en la fracción insoluble (panel C). El control negativo (-Ctrl) fue la cepa de tipo salvaje de Schizochytrium sp., ATCC 20888 o la cepa transgénica "AB0018".

Ejemplo 4: Análisis de giucosilación La presencia de glucanos en la proteína HN se evaluó primero por tratamiento enzimático. La fracción insoluble de la cepa transgénica "CL0081-23" se resuspendió en PBS y se digirió con EndoH o PNGasa F de acuerdo con las instrucciones del fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.). Luego se determinó la eliminación de los glucanos en base a la variación esperada de la movilidad al separar las proteínas en SDS-PAGE al 12% teñido con azul Coomassie, ácido peryódico, o se realizó una inmunotransferencia con antisuero anti-NDV (Figura 5, panel A). El control negativo (- Ctrl) de inmunotransferencia fue la cepa transgénica "AB0018". El control negativo para el tratamiento enzimático fue la cepa transgénica "CL0081-23" que se incubó sin enzimas (NT; sin tratar). En segundo lugar, se analizó el perfil de glucosilación de la proteína HN producida en Schizochytrium por espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser asistida por matrices y Espectrometría de masas con ionización NanoSpray-Trampa de iones lineal (Complex Carbohidrate Research Center, Georgia). Se cortaron rodajas de gel teñido con azul Coomassie de la proteínas de interés en trozos más pequeños (~1 mm3) y se destiñeron alternadamente con bicarbonato de amonio 40m (AmBic) y acetonitrilo al 100% hasta aclarar el color. El gel desteñido se volvió a hinchar en DTT 10 mM en Ambic 40mM a 55°C durante 1 hora. La solución en DTT se intercambió con yodoacetamida 55mM (IAM) y se incubó en la oscuridad durante 45 min. La incubación fue seguida del lavado alternadamente con AmBic 40mM y acetonitrilo al 100% dos veces. El gel deshidratado se volvió a hinchar con solución de tripsina (tripsina en Ambic 40 mM) sobre hielo durante 45 min inicialmente, y la digestión de la proteína se llevó a cabo a 37°C durante toda la noche. El sobrenadante se transfirió a otro tubo. Los péptidos y los glucopéptidos se extrajeron del gel en series con acetonitrilo al 20% en ácido fórmico al 5%, acetonitrilo al 50% en ácido fórmico al 5% y luego acetonitrilo al 80% en ácido fórmico al 5%. Las soluciones de muestra se secaron y combinaron en un solo tubo. El producto de la digestión con tripsina que se extrajo se hizo pasar a través de un cartucho C18 sep-pak y se lavó con ácido acético al 5% para eliminar contaminantes (sales, SDS, etc.). Los péptidos y glucopéptidos se eluyeron en series con iso-propanol al 20% en ácido acético al 5%, ¡so-propanol al 40% en ácido acético al 5% e iso-propanol al 100% y se secaron en un concentrador rápido al vacío. Las muestras que se secaron se combinaron y luego se reconstituyeron con solución amortiguadora de fosfato de sodio al 50 mM (pH 7,5) y se calentaron a 100°C durante 5 min para inactivar la tripsina. El producto de la digestión con tripsina se incubó con PNGasa F a 37°C durante toda la noche para liberar los N-glucanos. Después de la digestión, la muestra se hizo pasar a través de un cartucho C 8 sep-pak y se eluyó la fracción de carbohidratos con ácido acético al 5% y se secó por liofilización. Los oligosacáridos unidos a N liberado se permetilaron en base al método de Anumula y Taylor (Anumula y Taylor, 1992) y se obtuvo su perfil por espectrometría de masas. El análisis por espectrometría de masas se llevó a cabo a continuación del método desarrollado en el Complex Carbohydrates Research Center (Aokl K, Perlman M, Lim JM, Cantu R, Wells L, Tiemeyer . J Biol Chem. 23 de marzo, 2007; 282(12): 9127-42.). El análisis de masas se determinó usando NSI-LTQ/MSn. En resumen, los glucanos permetilados se disolvieron en NaOH 1mM en metanol al 50% y se infundieron directamente en el instrumento (LTQ, Thermo Finnigan) con un caudal constante de 0,4 pL/min. El análisis por MS se llevó a cabo en la modalidad de ion positivo. Para el mapeo total de iones, se realizó un barrido de análisis automatizado por MS/MS (con una energía de colisión de 35), rango de m/z entre 500 y 2000 en sucesivas ventanas de 2,8 unidades de masa que se superponían con la ventana precedente en 2 unidades de masa. El mapeo total de iones se llevó a cabo para analizar la presencia de iones fragmentarios indicativos de glucanos. Se tomaron todos los datos de MS/MS de m/z 500 a m/z 2000 y luego los datos en bruto se analizaron manualmente. El cromatograma y la tabla de especies que se obtuvieron por NSI-mapeo total de iones se muestran en la Figura 5 (paneles B y C). Este cromatograma se procesó usando el filtro de barrido, pérdida neutra de m/z 139, que es la pérdida neutra característica de los glucanos del tipo con un alto contenido de mañosa. El mapeo total de iones reveló que esta muestra contenía una serie de glucanos del tipo con un alto contenido de mañosa con cadena de mañosa larga.

Ejemplo 5: Análisis de los péptidos del HN del NDV La fracción insoluble se separó por SDS-PAGE y se tiñó con azul Coomassie o se transfirió a PVDF y se realizó una inmunotransferencia con antisuero anti-NDV de pollo, como se describió anteriormente. La banda correspondiente a la reacción cruzada de la inmunotransferencia se separó del gel teñido con Coomassie y se sometió a un análisis de la secuencia de péptidos. El procedimiento consistió en el lavado/desteñido de las bandas de interés en etanol al 50%, ácido acético al 5%. Luego se deshidrataron los trozos de gel en acetonitrilo, se secaron en una Speed-vac, y se digirieron con tripsina agregando 5pL de tripsina 10ng/ L en bicarbonato de amonio 50mM y se incubaron durante toda la noche digiriendo a la temperatura ambiente. Los péptidos que se formaron se extrajeron de la poliacrilamida en dos alícuotas de 30pL de acetonitrilo al 50% con ácido fórmico al 5%. Dichos extractos se combinaron y evaporaron a <10µ?_ en Speed-vac y luego se resuspendieron en ácido acético al 1% hasta un volumen final de aproximadamente 30µ?_ para el análisis por LC-MS. El sistema de LC-MS era un sistema de espectrometría de masas Finnigan LTQ con trampa de iones lineal. La columna HPLC fue una columna para cromatografía capilar de fase inversa Phenomenex Júpiter C18 self-packed de 9 cm x 75pm. Luego se inyectaron volúmenes del orden de pL del extracto y los péptidos que eluyeron de la columna usando un gradiente de acetonitrilo/ácido fórmico al 0,1% con un caudal de 0,25pL/min se introdujeron en la fuente de iones del espectrómetro de masas en línea. La fuente de iones por microelectrospray se hizo operar a 2,5kV. El digerido se analizó usando experimentos de reacción selectiva (SRM) en los cuales el espectrómetro de masas fragmenta una serie de proporciones m/z durante todo el transcurso del experimento de LC. Luego se utilizó el patrón de fragmentación de los péptidos de interés para producir cromatogramas. Se determinó el área de los picos para cada péptido y se normalizó con un estándar interno. Los estándares internos que se utilizaron en este análisis fueron proteínas con una abundancia que no cambia entre las muestras que se están estudiando. La comparación final entre los dos sistemas se determina por comparación de las proporciones entre picos normalizadas para cada proteína. Luego se compararon los espectros de disociación inducida por colisiones en la base de datos ncbi. Se identificó la proteína HN para un total de 32 péptidos cubriendo un 68% de la secuencia de la proteína. En la Figura 11 se muestran los resultados de los péptidos específicos que se secuenciaron.

Ejemplo 6: Vacunación de pollos Se realizaron estudios de exposición en pollos vacunados específicos libres de patógenos (SPF) a las entre 3 y 4 semanas de edad con proteína HN del NDV expresada por Schizochytrium en un coadyuvante. Se asignaron doce pollos a cada grupo de vacuna. Se incluyó un grupo vacunado con material de Schizochytrium de tipo salvaje en el mismo coadyuvante como grupo de control negativo. Se probaron tres grupos de pollos con un esquema de una sola inyección en tres niveles de dosificación (100 HAU, 1000 HAU, y 10000 HAU). Las emulsiones agua-en-aceite del medio de cultivo de Schizochytrium se suministraron por la ruta intramuscular en la pata (0,5 mi por sitio x 2).

El día 27, se tomaron muestras de sangre para la prueba de inhibición de la hemaglutinación, y luego los pollos se expusieron intramuscularmente al virus de la enfermedad de Newcastle cepa GB Texas at 1040 EID50 por pollo (Figura 12). Los pollos se observaron diariamente para asegurarse del estado de salud de los pollos que fueron expuestos. Después de la exposición, los pollos se observaron diariamente durante catorce días parea detectar signos clínicos graves de NDV, como por ejemplo pero en un sentido no limitativo, nerviosismo extremo, angustia respiratoria, signos de índole nerviosa o muerte. Los datos de mortalidad que se muestran en la Figura 12 indican que dicha vacunación con HN del NDV derivado de plantas causa un aumento de la protección del 33% para un nivel de dosis de 100 HAU, y causa un aumento de la protección del 00% para un nivel de dosis de 1000 HAU y 9333 HAU respecto del control.

Ejemplo 7: Expresión, caracterización, inmunogenicidad y eficacia de la proteína HN del NDV producida en lenteja de agua Se utilizó el sistema de expresión de proteínas Lemna minor para expresar el polipéptido HN del NDV (SEQ ID N°:17, NDV cepa YZCQ/Liaoning/08). El gen de L. Minor optimizado para HN (SEQ ID N°:22 y 23) se clonó en un vector binario modificado de A. tumefaciens (Gasdaska, J., et al., Bioprocessing J. 3, 50-56, 2003). Se hicieron varias construcciones del vector. Las construcciones contienen Super Promotor, directriz 5' de Lemna gibba RBCS SSU1 , y el terminador Nopalina sintasa (Nos). La construcción MerH01 contenía el gen de codones optimizados para el HN del NDV con su secuencia de señal nativa (ancla de señal tal como se muestra en los mapas de plásmido). La construcción MerH02 contenía el gen de codones optimizados para el HN del NDV con su secuencia de señal nativa y secuencia de retención KDEL del ER. La construcción MerH03 contenía el gen de codones optimizados para el HN del NDV (que codifican la Proteína HN madura) reemplazando la secuencia de señal nativa HN del NDV por la secuencia de señal de alfa amilasa. La construcción MerH04 contenía el gen de codones optimizados para el HN del NDV con su secuencia de señal nativa reemplazada por la secuencia de señal de alfa amilasa, y la secuencia de retención KDEL del ER. Los mapas de plásmido de las cuatro construcciones se muestran en la Figura 7c. Las construcciones se transformaron en A. tumefaciens C58Z707 (Hepburn, A.G. et al., J. Gen. Microbiol. 131 , 2961-2969, 1985). Usando la A. tumefaciens C58Z707 transformada con construcciones del vector de transformación de vegetales, se generaron plantas transgénicas que representaban líneas clónales individuales a partir de nódulos de L Minor de crecimiento rápido como se describe en Yamamoto, Y. et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 37, 349-353 (2001 ).

Después de generar las líneas transgénicas, se las selecciona en base a la expresión de HN del NDV en los medios y el tejido. Las plantas se cultivan durante dos semanas en pequeños recipientes para investigación y los medios y tejidos que se obtienen como resultado se recolectan para su análisis. Para el análisis de tejidos, el tejido congelado se homogeneiza, se centrífuga y se elimina el sobrenadante para realizar un ensayo estándar de hemaglutinación. Las líneas más altas de la selección inicial se llevan a escala para dar aproximadamente 1 kg de biomasa para su subsiguiente caracterización, como por ejemplo para un ensayo de hemaglutinación, ensayo de inhibición de la hemaglutinación (Hl), SDS-PAGE, Transferencia Western, e inmunolocalización.

Se prepara un extracto vegetal crudo a partir de una línea transgénica de Lemna para la evaluación de la inmunogenicidad y la eficacia en pollos específicos libres de patógenos (SPF) a las 3-4 semanas de edad. Se asignan doce pollos a cada grupo de vacuna, vacunados con la composición que comprende el polipéptido recombinante HN del NDV y un coadyuvante. Se incluye como control negativo un grupo de vacunados con material de Lemna de tipo salvaje en el mismo coadyuvante. Se realizan pruebas con otros grupos de pollos, con esquemas de una sola inyección con diferentes niveles de dosificación. El día 21, se toman muestras de sangre para la prueba de inhibición de la hemaglutinación, y luego los pollos se exponen a diferentes cepas del virus de la enfermedad de Newcastle. Después de la exposición, los pollos se observan diariamente durante catorce días para detectar signos clínicos graves de NDV, como por ejemplo pero en un sentido no limitativo, nerviosismo extremo, angustia respiratoria, signos de índole nerviosa o muerte. La composición que contenía el polipéptido recombinante HN del NDV muestra una eficacia para tratar, proteger, y prevenir la infección y enfermedad por NDV.

Todos los documentos citados o a los cuales se hace referencia en la solicitud y todos los documentos citados o a los cuales se hace referencia en la presente ("documentos citados en la presente"), y todos los documentos citados o a los cuales se hace referencia en los documentos citados en la presente, junto con todas las instrucciones, descripciones, especificaciones de producto y fichas de producto del proveedor para cualquiera de los productos mencionados en la presente o en cualquier documento incorporado a modo de referencia en la presente, se incorporan en la presente a modo de referencia, y se pueden emplear en la práctica de la invención.

Habiendo así descrito con detalle las realizaciones preferidas de la presente invención, se comprenderá que la invención definida en los párrafos anteriores no se limita a los detalles particulares indicados en la descripción anterior dado que es posible efectuar muchas variaciones evidentes de las mismas sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Una composición, CARACTERIZADA PORQUE comprende un poiipéptido o antígeno HN (hemaglutinina-neuraminidasa) del NDV (virus de la enfermedad de Newcastle) y un transportador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente s aceptable o apto para uso veterinario.

2. La composición de la reivindicación 1 , CARACTERIZADA PORQUE el poiipéptido o antígeno HN NDV comprende un fragmento inmunogénico que comprende la región del epitope lineal HN NDV.

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADA PORQUE el o poiipéptido o antígeno HN NDV se expresa en microalgas o plantas.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, CARACTERIZADA PORQUE el poiipéptido o antígeno HN NDV está parcialmente purificado.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, CARACTERIZADA PORQUE el poiipéptido o antígeno HN NDV está sustancialmente purificado. 5 6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, CARACTERIZADA

PORQUE el poiipéptido o antígeno HN NDV tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 15, 17, 19 ó 20.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, CARACTERIZADA PORQUE el poiipéptido o antígeno del NDV está codificado por un polinucleótido que tiene 0 al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 22 ó 23.

8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, CARACTERIZADA PORQUE el transportador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario es una emulsión de agua-en-aceite o una emulsión de aceite-5 en-agua.

9. Un método de vacunación de un animal susceptible al NDV, CARACTERIZADO PORQUE comprende al menos una administración de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. El método de la reivindicación 9, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende un régimen de administración de sensibilización-refuerzo.

1 1. El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE el régimen s de sensibilización-refuerzo comprende la administración de sensibilización de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y una administración de refuerzo de una composición que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable o apto para uso veterinario, un vector viral recombinante que contiene un polinucleótido que expresa, in vivo, el polipéptido HN NDV, una variante o un o fragmento del mismo, para proteger al sujeto contra una infección por NDV y/o para prevenir el avance de la enfermedad en un sujeto infectado.

12. El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE el régimen de sensibilización-refuerzo comprende la administración de sensibilización de una composición que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente 5 aceptable o apto para uso veterinario, un vector viral recombinante que contiene un polinucleótido que expresa, in vivo, el polipéptido HN NDV, una variante o un fragmento del mismo, y la administración de refuerzo de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para proteger al sujeto contra una infección por el NDV y/o para prevenir el avance de la enfermedad en un sujeto infectado. 0

13. El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE el régimen de sensibilización-refuerzo comprende una administración de sensibilización de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y una administración de refuerzo de una composición o vacuna viral inactivada que comprende el antígeno del NDV. 5

14. El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE el régimen de sensibilización-refuerzo comprende una administración de sensibilización de una composición o vacuna viral inactivada que comprende el antígeno del NDV y una administración de refuerzo de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para proteger al sujeto contra el NDV y/o para prevenir el avance de la enfermedad en un sujeto infectado.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-14, CARACTERIZADO PORQUE el animal es un ave, un equino, un canino, un felino o un porcino.

16. Un polipéptido o antígeno del NDV sustancialmente purificado expresado en microalgas o plantas de lenteja de agua, CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 15, 17, 19 0 20.

17. Un cultivo de microalgas o plantas de lenteja de agua, CARACTERIZADO PORQUE fue transformado de manera estable con un gen que expresa un polipéptido HN NDV o un fragmento o una variante del mismo.

18. El cultivo de microalgas o las plantas de lenteja de agua de la reivindicación 17, CARACTERIZADO PORQUE el polipéptido HN NDV o un fragmento o una variante del mismo tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 3, 5, 7, 9, 15, 17, 19 ó 20.

19. Un método para producir un polipéptido HN NDV, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) cultivar microalgas en cultivo o plantas de lenteja de agua en un medio de cultivo para microalgas o lenteja de agua, en donde dicho cultivo de microalgas o dichas plantas de lenteja de agua fueron transformados de manera estable para expresar el polipéptido HN NDV, y en donde el polipéptido HN NDV se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de codificación para el polipéptido HN NDV y una secuencia de codificación ligada operativamente de un péptido señal que dirige la secreción del polipéptido en dicho medio de cultivo; y (b) recolectar el polipéptido HN NDV del medio de cultivo.

20. El método de la reivindicación 19, CARACTERIZADO PORQUE el péptido señal tiene una secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 13 ó 21.

21. Un plásmido, CARACTERIZADO PORQUE comprende un fragmento de ADN que codifica un péptido señal que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 13 ó 21.

22. El plásmido de la reivindicación 21 , CARACTERIZADO PORQUE el fragmento de ADN está ligado operativamente a un polinucleótido que codifican un polipéptido HN NDV.

23. El plásmido de cualquiera de las reivindicaciones 21-22, CARACTERIZADO PORQUE el plásmido es para la transformación de plantas o algas.