MX2012005740A

MX2012005740A - Metodo.

Info

Publication number: MX2012005740A
Application number: MX2012005740A
Authority: MX
Inventors: Joern Borch Soee; Niels Erik Larsen
Original assignee: Danisco
Priority date: 2009-11-17
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2012-06-13
Also published as: CN102638995A; WO2011061657A1; AU2010320548A1; DK2501242T3; AR079053A1; PL2501242T3; EP2501242A1; ZA201202707B; US20120231116A1; NZ599619A; CN107410501A; EP2501242B1; EA201290341A1; AU2010320548B2; GB0920089D0; ES2645041T3; BR112012011533A2

Abstract

Se describe un método para producir leche en polvo; el método comprende: (a) poner en contacto la leche o una fracción de esta con una enzima lípido aciltransferasa y (b) secar la leche tratada con la enzima para producir leche en polvo. Además, se describe productos de leche en polvo producidos por el método y el uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para mejorar las propiedades de rehidratación, la diferencia sensorial perceptible (olor y/o sabor) y la fluidez de la leche en polvo, y para reducir el contenido de colesterol y/o el contenido de ácidos grasos libres de la leche en polvo, y para reducir la contaminación del equipo usado en la elaboración de la leche en polvo.

Description

METODO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para la producción de leche en polvo, una leche en polvo tratada enzimáticamente y los usos de una enzima para el tratamiento de leche en polvo para proporcionar ventajas técnicas nuevas e inesperadas .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La leche en polvo (en la presente descripción también llamada 'leche seca') es un producto lácteo industrializado que se elabora al secar la leche. El objetivo principal en secar la leche es incrementar su vida en estante y evitar la necesidad de refrigeración, debido a su bajo contenido de humedad. La leche en polvo y los productos lácteos en polvo pueden comprender leche entera en polvo, leche descremada en polvo, suero de mantequilla en polvo, suero de leche en polvo y mezclas lácteas en polvo.

Típicamente, la leche en polvo se elabora mediante el secado por aspersión de leche descremada sin grasa, leche entera, suero de mantequilla o suero de leche. La leche pasteurizada se concentra primero en un evaporador hasta aproximadamente 50% de sólidos lácteos. La leche concentrada resultante se pulveriza en una cámara caliente en donde el agua se evapora casi instantáneamente y produce partículas REF: 229671 finas de sólidos lácteos en polvo. Las partículas de polvo se separan de la corriente de aire y se recuperan en el fondo del secador mientras que el aire húmedo sale del evaporador.

Alternativamente, la leche se puede secar mediante secado en tambor (también denominado secado en rodillos) . La leche se aplica como una capa fina en la superficie de un tambor calentado (típicamente, calentado por vapor) . El agua evaporada se extrae y quedan sólidos lácteos secos que forman una capa sobre el tambor que, después, se desprende. La leche en polvo que se elabora de esta manera tiende a tener un sabor a 'cocido' debido a la caramelización causada por la exposición a calor extenso.

Otro proceso que se usa para producir leche en polvo es la deshidratación por congelación, que preserva muchos nutrientes en la leche, en comparación con el secado en tambor. Sin embargo, generalmente, este método es más costoso que el secado en tambor o por aspersión.

Los productos de leche en polvo y los procesos usados para producirlos se describen en términos generales en " ilk and Dairy Products", R. Jost, publ . iley-VCH, Weinheim, 2007, que se incorpora en la presente descripción como referencia .

La patente núm. WO 2006/066590 describe un método para producir una leche en polvo con el uso de fosfolipasas , particularmente, la fosfolipasa A. Sin embargo, este documento no describe ni sugiere que la producción de leche en polvo con el uso de esta enzima podría prevenir la contaminación del equipo usado en el método.

Las lípido aciltransferasas son conocidas por ser favorables en aplicaciones alimentarias. Se ha descubierto que las lípido aciltransferasas tienen una actividad significativa de aciltransferasas en productos alimenticios. Esta actividad tiene aplicaciones beneficiosas sorprendentes en los métodos de preparación de productos alimenticios.

Por ejemplo, la patente núm. WO 2004/064537 describe un método para la producción in situ de un emulsionante mediante el uso de una lípido aciltransferasa y las ventajas asociadas con éste.

La patente núm. WO 2008/090395 enseña la expresión de lípido aciltransferasas en una célula hospedera (heteróloga) y se incorpora en la presente descripción como referencia.

La patente núm. WO 2009/024862 describe un método para la elaboración de leche UHT con el uso de una lípido aciltransferasa y leche producida por el método.

Los constituyentes principales de la leche son agua, grasa, proteínas, lactosa (azúcar de leche) y minerales (sales). La leche contiene, además, cantidades más pequeñas de otras sustancias, tales como pigmentos, enzimas, vitaminas, fosfolípidos (sustancias con propiedades similares a la grasa), esteróles y gases.

Los muchos lípidos de la leche que juntos forman la 'grasa de la leche' tienen una composición y estructura muy compleja, aún más compleja que la mayoría de otras grasas de origen natural. Típicamente, la grasa de leche consiste en triglicéridos , di- y monoglicéridos , ácidos grasos, esteróles, carotenoides y vitaminas (A, D, E y K) . Otros componentes incluyen fosfolípidos , lipoproteínas , glicéridos, cerebrósidos , proteínas, ácidos nucleicos, enzimas, metales y agua .

Los fosfolípidos son la clase más activa en superficie debido a que son anfipolares. Dado que el tamaño molecular es relativamente grande, tienden a formar bicapas laminares. Los fosfolípidos de la leche se observan, generalmente, en estrecha relación con las proteínas, especialmente cuando se ubican en la membrana o membranas de glóbulos de grasa de leche. El constituyente principal de los fosfolípidos en la leche comprende lecitinas, que son activas en la superficie a hidrofilicidad moderada. Por lo tanto, la lecitina se puede considerar un agente de suspensión y dispersante o un emulsionante para emulsiones 0/W, así como para emulsiones W/0.

Los fosfolípidos comprenden 0.8-1.0% de la grasa de la leche natural. Los tipos principales de fosfolípidos/lecitina en la leche son la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina .

Los esteróles son altamente insolubles en agua y muestran una muy poca actividad de superficie. Estos se relacionan fácilmente con los fosfolípidos . El colesterol se puede considerar un ingrediente no deseado en la leche cuando se tiene en cuenta el valor nutricional de la leche. El colesterol comprende 0.3-0.4% de la grasa de la leche natural .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones y en el siguiente comentario.

Inesperadamente se ha descubierto que la exposición de la leche o de una fracción de esta a una lípido aciltransferasa durante la producción de la leche en polvo hace que la leche en polvo tenga una fluidez y propiedades de rehidratación mejoradas y, además, hace que la leche en polvo tenga una disminución del contenido de ácidos grasos libres (en comparación con la leche en polvo que durante su elaboración se ha tratado con una fosfolipasa) y una diminución del contenido de colesterol.

De conformidad con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir leche en polvo; el método comprende: (a) poner en contacto la leche o una fracción de esta con una enzima lípido aciltransferasa ; y (b) secar la leche tratada con la enzima para producir leche en polvo.

De conformidad con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona leche en polvo obtenida u obtenible mediante el método de la invención.

De conformidad con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un producto de leche producido mediante la rehidratación de la leche en polvo de la invención .

De conformidad con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para mejorar las propiedades de rehidratación de la leche en polvo. En un aspecto, tales propiedades de rehidratación mejoradas de la leche en polvo comprenden una humectabilidad mejorada y/o un tiempo de humectación reducido.

De conformidad con un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para mejorar la diferencia sensorial perceptible de la leche en polvo. En un aspecto, el término "diferencia sensorial perceptible" incluye un olor y/o sabor mejorados, por ejemplo, un sabor y/o aroma a cocido reducidos y/o un sabor y/o aroma a rancidez reducidos.

De conformidad con un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para reducir el contenido de colesterol en la leche en polvo.

De conformidad con un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para reducir el contenido de ácidos grasos libres de la leche en polvo en comparación con la leche en polvo que durante su elaboración se ha tratado con una fosfolipasa.

Una reducción en el colesterol se puede determinar por cromatografía de capa fina (CCF) y/o cromatografía gas-líquido (CGL) .

De conformidad con un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para mejorar la fluidez de la leche en polvo.

De conformidad con un noveno aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para reducir la contaminación del equipo que se usa en la elaboración de la leche en polvo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se describirá a continuación a modo de ejemplo únicamente con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa mutante de Aeromonas salmonicida madura (GCAT) con una mutación de Asn80Asp (particularmente, el aminoácido 80 se encuentra en la secuencia natural) (sec. con núm. de dent . 16) ; la Figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 1) de una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (núm. de la ATCC 7965) la Figura 3 muestra una secuencia consenso de pfam00657 de la versión 6 de la bases de datos (sec. con núm. de ident. 2) ; la Figura 4 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 3) obtenida del organismo de Aeromonas hydrophila (P10480; GI : 121051) ; la Figura 5 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 4) obtenida del organismo de Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI:9964017); la Figura 6 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 5) obtenida del organismo de Streptomyces coelicolor A3 (2) (número de registro del GenBank. NP_631558) ; la Figura 7 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 6) obtenida del organismo de Streptomyces coelicolor A3 (2) (número de registro del GenBank: CAC42140) ; la Figura 8 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 7) obtenida del organismo de Saccharomyces cerevisiae (número de registro del GenBank P41734) ; la Figura 9 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident . 8) obtenida del organismo de Ralstonia (número de registro del GenBank: AL646052) ; la Figura 10 muestra la sec. con núm. de ident. 9. Código de registro de proteínas del NCBI Scoel CAB39707.1 Proteína hipotética conservada GI: 539178 [Streptomyces coelicolor A3 (2) ] ; la Figura 11 muestra un aminoácido que se muestra como la sec. con núm. de ident. 10. Código de registro de proteínas del NCBI Scoe2 CAC01477.1 Proteína hipotética conservada GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)]; la Figura 12 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 11) Código de registro de proteínas del NCBI Scoe3 CAB88833.1 Proteína secretada putativa GI: 7635996 [Streptomyces coelicolor A3(2)]; la Figura 13 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 12) Código de registro de proteínas del NCBI Scoe 4 CAB89450.1 Proteína secretada putativa GI: 7672261 [Streptomyces coelicolor A3(2)] ; la Figura 14 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 13) Código de registro de proteínas del NCBI Scoe5 CAB62724 Lipoproteína secretada GI: 6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)] ; la Figura 15 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 14) Código de registro de proteínas del NCBI Sriml AAK84028.1 GDSL-lipasa GI: 15082088 [Streptomyces rimosus] ; la Figura 16 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident . 15) de una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (núm. del ATCC 14174) ; la Figura 17 muestra la sec. con núm. de ident. 19. Código de registro de proteínas del NCBI Scoel CAB39707.1 Proteína hipotética conservada GI: 4539178 [Streptomyces coelicolor A3 (2) ] ; la Figura 18 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 25) del constructo de fusión que se usa para mutagénesis del gen de la lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila . Los aminoácidos subrayados son un péptido señal de xilanasa; la Figura 19 muestra una secuencia de polipéptidos de una enzima lípido aciltransferasa de Streptomyces (sec. con núm. de ident. 26) ; la Figura 20 muestra una secuencia de polipéptidos de una enzima lípido aciltransferasa de Thermobifida (sec. con núm. de ident. 27); la Figura 21 muestra una secuencia de polipéptidos de una enzima lípido aciltransferasa de Thermobifida (sec. con núm. de ident. 28) ; la Figura 22 muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de un aminoácido 300 del motivo GDSx de Corynebacterium efficiens (sec. con núm. de ident . 29); la Figura 23 muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de un aminoácido 284 del motivo GDSx de Novosphingobium aromaticivorans (sec. con núm. de ident. 30); la Figura 24 muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de un aminoácido 269 del motivo GDSx de Streptomyces coelicolor (sec. con núm. de ident. 31); la Figura 25 muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de un aminoácido 269 de Streptomyces avermitilis \ GDSx (sec. con núm. de ident. 32); la Figura 26 muestra un polipéptido de una enzima lípido aciltransferasa de Streptomyces (sec. con núm. de ident. 33); la Figura 27 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 34) obtenida del organismo de Aeromonas hydrophila (P10480; GI: 121051) (particularmente, esta es la secuencia madura) ; la Figura 28 muestra la secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 35) de una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida madura (GCAT) (particularmente, esta es la secuencia madura) ; la Figura 29 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 36) de Streptomyces ther osacchari ; la Figura 30 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 37) de Streptomyces thermosacchari; la Figura 31 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident . 38) del aminoácido 548 de Thermobifida fusca/GDSx; la Figura 32 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 39) de Thermobifida fusca; la Figura 33 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 40) de Thermobifida fusca/GDSx; la Figura 34 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 41) del aminoácido 300 de Corynejbacterium effi iens/GDSx; la Figura 35 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 42) de Corynebacterium efficiens; la Figura 36 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 43) del aminoácido 268 de S. coelicolor/ GDSx; la Figura 37 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 44) de S. coelicolor; la Figura 38 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 45) de S. avermitilis; la Figura 39 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 46) de S. avermitilis; la Figura 40 muestra una secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident. 47) de Thermobifida fusca/GDSx.; la Figura 41 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 48) de Thermobifida fusca/GDSx; la Figura 42 muestra un alineamiento de L131 y los homólogos de S. avermitilis y T. fusca e ilustra la conservación del motivo GDSx (GDSY en L131 y S. avermitilis y T. fusca) , el recuadro GA DY, que es ya sea GGNDA o GGNDL, y el bloque HPT (considerado como la histidina catalítica conservada) . Estos tres bloques conservados aparecen resaltados ; la Figura 43 muestra la sec. con núm. de ident . 17 que es la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa de Candida parapsilosis; la Figura 44 muestra la sec. con núm. de ident. 18 que es la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa de Candida parapsilosis; la Figura 45 muestra un diagrama de cintas de la estructura de cristal de 1IV .PDB que tiene glicerol en el sitio activo, la Figura se realizó con el uso del visor Deep View Swiss-PDB; la Figura 46 muestra la estructura de cristal de 1IV .PDB, una vista lateral con el uso del visor Deep View Swiss-PDB, con glicerol en el sitio activo, los residuos dentro de 10Á del glicerol del sitio activo son de color negro; la Figura 47 muestra la estructura de cristal de 1IV .PDB, una vista superior con el uso del visor Deep View Swiss-PDB, con glicerol en el sitio activo, los residuos dentro de 10Á del glicerol del sitio activo son de color negro; la Figura 48 muestra el alineamiento 1; la Figura 49 muestra el alineamiento 2 ; las Figuras 50 y 51 muestran un alineamiento de 1IV a P10480 (P10480 es la secuencia de la bases de datos para la enzima de A. hydrophila) ; este alineamiento se obtuvo de la base de datos PFAM y se usó en el proceso de construcción del modelo; y la Figura 52 muestra un alineamiento en donde P10480 es la secuencia de la base de datos para Aeromonas hydrophila . Esta secuencia se usa para la construcción del modelo y la selección del sitio (nótese que se representa la proteína completa (sec. con núm. de ident . 25); la proteína madura (equivalente a la sec. con núm. de ident. 34) empieza en el residuo 19. A. sal es Aeromonas salmonicida (sec. con núm. de ident. 4) GDSX lipasa, A. hyd es Aeromonas hydrophila (sec. con núm. de ident. 34) GDSX lipasa; la secuencia consenso contiene un * en la posición de una diferencia entre las secuencias indicadas) ; la Figura 53 muestra un constructo génico usado en el Ejemplo 1; la Figura 54 muestra un constructo génico optimizado por codones (núm. 052907) usado en el Ejemplo 1; y la Figura 55 muestra la secuencia del inserto Xhol que contiene el gen precursor LAT-KLM3', los cuadros -35 y -10 aparecen subrayados ; la Figura 56 muestra BML780 -KL 3 ' CAP50 (que comprende la sec. con núm. de ident . 16, colonia superior) y BML780 (la cepa huésped vacía, colonia inferior) después de 48 horas de crecimiento a 37°C en agar de tributirina al 1%; la Figura 57 muestra una secuencia de nucleótidos de Aeromonas salmonicida (sec. con núm. de ident. 49) que incluye la secuencia señal (preLAT, posiciones 1 a 87) ; la Figura 58 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 50) que codifica una lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención que se obtiene del organismo de Aeromonas hydrophila; la Figura 59 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 51) que codifica una lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención que se obtiene del organismo de Aeromonas salmonicida; la Figura 60 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 52) que codifica una lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención que se obtiene del organismo de Streptomyces coelicolor A3(2) (número de registro del GenBank NC_003888.1 : 8327480.8328367 ) ; la Figura 61 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 53) que codifica una lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención que se obtiene del organismo de Streptomyces coelicolor A3(2) (número de registro del GenBank AL939131.1 : 265480.266367) ; la Figura 62 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident . 54) que codifica una lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención que se obtiene del organismo de Saccharomyces cerevisiae (número de registro del GenBank Z75034) ; la Figura 63 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 55) que codifica una lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención que se obtiene del organismo de Ralstonia; la Figura 64 muestra una secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 56 que codifica el código de registro de proteínas del NCBI CAB39707.1 Proteína hipotética conservada GI: 4539178 [Streptomyces coelicolor A3 (2)] ; la Figura 65 muestra una secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 57 que codifica el código de registro de proteínas del NCBI Scoe2 CAC01477.1 Proteína hipotética conservada GI: 9716139 [Streptomyces coelicolor A3 (2) ] ; la Figura 66 muestra una secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 58 que codifica el código de registro de proteínas del NCBI Scoe3 CAB88833.1 Proteína secretada putativa GI: 7635996 [Streptomyces coelicolor A3 (2) ] ; la Figura 67 muestra una secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 59 que codifica el código de registro de proteínas del NCBI Scoe4 CAB89450.1 Proteína secretada putativa GI: 7672261 [Streptomyces coelicolor A3 (2) ] ; la Figura 68 muestra una secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 60 que codifica el código de registro de proteínas del NCBI Scoe5 CAB62724.1 Lipoproteína putativa GI: 6562793 [Streptomyces coelicolor A3 ( 2 ) ] ; la Figura 69 muestra una secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 61 que codifica el código de registro de proteínas del NCBI Sriml AAK84028.1 GDSL-lipasa GI: 15082088 [Streptomyces rimosus] ; la Figura 70 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 62) que codifica una lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila (núm. de la ATCC 7965) ; la Figura 71 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 63) que codifica una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (núm. de la ATCC 14174); la Figura 72 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 24) que codifica una enzima de Aeromonas hydrophila que incluye una péptido señal de xilanasa; la Figura 73 muestra la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa mutante de Aeromonas salmonicida madura (GCAT) con una mutación de Asn80Asp (particularmente, el aminoácido 80 es la secuencia madura) , que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident . 16 y después de experimentar una modificación postraslacional como la sec. con núm. de ident. 68, los residuos de aminoácidos 235 y 236 de la sec. con núm. de ident. 68 no están unidos covalentemente después de la modificación postraslacional. Los dos péptidos formados se mantienen unidos por uno o más puentes S-S. El aminoácido 236 en la sec. con núm. de ident. 68 corresponde con el residuo de aminoácidos número 274 en la sec. con núm. de ident. 16 que se muestra en la presente descripción; la Figura 74 muestra leche en polvo elaborada de leche entera estándar, no tratada; la Figura 75 muestra leche en polvo elaborada de leche entera estándar tratada con una solución de enzima KLM3 , (KTP08015, 1300 TIPU/g de leche, correspondiente a 12.4 mg de enzima/g de leche) ; la actividad de la enzima en unidades TIPU se determina tal como se describe a continuación; la Figura 76 ilustra el aparato que se usó para llevar a cabo la prueba de humectabilidad del Ejemplo 3; la Figura 77 muestra una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident. 120) que codifica una lípido aciltransferasa de A. salmonicida; la Figura 78 muestra la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa mutante de Aeromonas salmonicida madura (GCAT) con una mutación de Asn80Asp (particularmente, el aminoácido 80 es la secuencia madura) , que se muestra en la presente descripción como la sec . con núm. de ident. 16 y después de experimentar una modificación postraslacional como la sec. con núm. de ident. 121, los residuos de aminoácidos 235 y 236 de la sec. con núm. de ident. 121 no están unidos covalentemente después de la modificación postraslacional; los dos péptidos formados se mantienen unidos por uno o más puentes S-S; el aminoácido 236 en la sec. con núm. de ident. 121 corresponde con el residuo de aminoácidos número 275 en la sec. con núm. de ident. 16 que se muestra en la presente descripción; la Figura 79 muestra la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa mutante de Aeromonas salmonicida madura (GCAT) con una mutación de Asn80Asp (particularmente, el aminoácido 80 es la secuencia madura) , que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16 y, después de experimentar una modificación postraslacional como la sec. con núm. de ident. 122, los residuos de aminoácidos 235 y 236 de la sec. con núm. de ident. 122 no están unidos covalentemente después de la modificación postraslacional; los dos péptidos formados se mantienen unidos por uno o más puentes S-S; el aminoácido 236 en la sec. con núm. de ident . 122 corresponde con el residuo de aminoácidos número 276 en la sec. con núm. de ident. 16 que se muestra en la presente descripción; y la Figura 80 muestra la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa imitante de Aeromonas salmonicida madura (GCAT) con una mutación de Asn80Asp (particularmente, el aminoácido 80 es la secuencia madura) , que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16 y, después de experimentar una modificación postraslacional como la sec. con núm. de ident. 123, los residuos de aminoácidos 235 y 236 de la sec. con núm. de ident. 123 no están unidos covalentemente después de la modificación postraslacional ,-los dos péptidos formados se mantienen unidos por uno o más puentes S-S; el aminoácido 236 en la sec. con núm. de ident. 123 corresponde con el residuo de aminoácidos número 277 en la sec. con núm. de ident. 16 que se muestra en la presente descripción .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se describió anteriormente, en un aspecto, la presente invención comprende un método para producir leche en polvo; el método comprende: (a) poner en contacto la leche o una fracción de esta con una enzima lípido aciltransferasa; y (b) secar la leche tratada con la enzima para producir leche en polvo.

Leche El término 1 leche ' , como se usa en la presente invención, puede comprender leche ya sea de origen animal o vegetal e incluye leche entera, leche descremada y leche semidescremada .

Es posible usar leche de origen animal, tal como de búfalo, vaca (tradicional), oveja, cabra, etc., ya sea individualmente o combinada. Es posible usar, además, leches vegetales, tales como la leche de soja, ya sea sola o en combinación con leche de origen animal. Cuando se usan leches vegetales en combinación con leche animal, la combinación comprende, típicamente, un porcentaje bajo (de leche vegetal) , es decir, menor que 15% o menor que 20% o menor que 25% v/v. Preferentemente, el término leche no comprende la leche de queso ni la crema.

El término 'consiste esencialmente', como se usa en la presente invención cuando se refiere a un producto o composición, se refiere, preferentemente, a que el producto o composición puede consistir en otros productos o composiciones, pero únicamente a una concentración máxima de, preferentemente, 10%, tal como 5%, tal como 3%, tal como 2% o 1%, o 0.5% o 0.1%.

Para la modificación enzimática de la leche y/o crema, por ejemplo, se puede preferir usar una temperatura menor que aproximadamente 30 °C, por ejemplo, adecuadamente menor que 20 °C, por ejemplo, adecuadamente menor que 10°C, por ejemplo. Se puede usar temperaturas adecuadas entre 1 y 30 °C, tal como entre 3 y 20°C, por ejemplo, tal como entre 1 y 10°C.

Incubación De conformidad con la presente invención, la leche se pone en contacto con una enzima lípido aciltransferasa a modo que la enzima se incube con esta. Las enzimas lípido aciltransferasas adecuadas se describen con más detalle en la presente invención.

En consecuencia, la lípido aciltransferasa se pone en contacto con la leche y se incuba con ella a una temperatura entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 70°C. En una modalidad, la lípido aciltransferasa se pone en contacto con la leche y se incuba con ella a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C, con mayor preferencia, entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 50°C, aún con mayor preferencia, entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 45°C y, con la máxima preferencia, aproximadamente 40°C. En otra modalidad la lípido aciltransferasa se pone en contacto con la leche y se incuba con ésta a una temperatura entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 20°C, con mayor preferencia, entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 15°C y, aún con mayor preferencia, entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 10°C.

Preferentemente, la lípido aciltransferasa se pone en contacto con la leche y se incuba con ésta en una concentración de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1 mg de enzima/kg de leche, con mayor preferencia, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.05 mg de enzima/kg de leche, aún con mayor preferencia, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.2 mg de enzima/kg de leche, aún con mayor preferencia, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg de enzima/kg de leche, todavía con mayor preferencia, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.05 mg de enzima/kg de leche y, con la máxima preferencia, aproximadamente 0.05 mg de enzima/kg de leche .

Preferentemente, el tiempo de incubación es eficaz para garantizar que hay por lo menos 10% de actividad de transferasa, con mayor preferencia, por lo menos 15%, 20%, 25%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% de actividad transferasa .

La actividad transferasa se determina mediante el ensayo de transferasa que se refiere en la presente invención.

En consecuencia, el tiempo de incubación puede ser de 1 minuto hasta 36 horas, preferentemente, de 2 minutos hasta 24 horas, con mayor preferencia, de 5 minutos hasta 18 horas, aún preferentemente, de 10 minutos hasta 12 horas y, aún con mayor preferencia, de 20 minutos hasta 8 horas.

En una modalidad, el tiempo de incubación puede ser de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 2 horas, preferentemente, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora, con mayor preferencia, aproximadamente 35 minutos a aproximadamente 45 minutos.

En otra modalidad, el tiempo de incubación puede ser de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 36 horas, preferentemente, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas.

Preferentemente, la combinación de temperatura y el tiempo de incubación es eficaz para garantizar que hay por lo menos 5% de actividad transferasa, preferentemente, por lo menos 10% de actividad transferasa, preferentemente, por lo menos 15%, 20%, 25% 26%, 28%, 30%, 40% 50%, 60% o 75% de actividad transferasa.

En consecuencia, el método puede comprender, además, una etapa que consiste en eliminar la enzima y/o desnaturalizar la enzima.

En consecuencia, la enzima para usar en la presente invención puede ser una enzima inmovilizada.

La reacción se puede llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado; por lo cual los ejemplos no limitantes incluyen un reactor de flujo continuo.

Secado Después del tratamiento con una enzima aciltransferasa como se describe en la presente invención, la leche tratada se seca para producir leche en polvo.

En una modalidad la leche tratada con la enzima se seca mediante secado por aspersión para producir leche en polvo. Las condiciones adecuadas para el secado por aspersión se describieron en términos generales en "Milk and Dairy Products", R. Jost, publ . Wiley-VCH, Weinheim, 2007, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

En la presente modalidad, la leche tratada con la enzima se suministra adecuadamente en el secador por aspersión a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C, preferentemente, de aproximadamente 50°C a aproximadamente 95°C, con mayor preferencia, de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 80°C. En una modalidad alterna la leche tratada con la enzima se suministra adecuadamente en el secador por aspersión a una temperatura en el intervalo de 35°C a 45°C, preferentemente, aproximadamente 40 °C.

En la presente modalidad, la temperatura de salida de aire del secador por aspersión se encuentra adecuadamente en el intervalo de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 150°C, preferentemente, de aproximadamente 70°C a aproximadamente 130°C, con mayor preferencia, de aproximadamente 90°C a aproximadamente 110°C y, con la máxima preferencia, aproximadamente 100°C.

En la presente modalidad, la temperatura de salida de aire del secador por aspersión se encuentra adecuadamente en el intervalo de aproximadamente 20°C a aproximadamente 80°C, preferentemente, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 70 °C, con mayor preferencia, de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 45°C y, con la máxima preferencia, aproximadamente 40°C.

En otra modalidad la leche tratada con la enzima se seca mediante secado en rodillos (también denominado secado en tambor) para producir leche en polvo. Las condiciones adecuadas para el secado en rodillos se describen en términos generales en "Milk and Dairy Products", R. Jost, publ . Wiley-VCH, Weinheim, 2007, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

En la presente modalidad la temperatura del tambor se encuentra adecuadamente en el intervalo de aproximadamente 90°C a aproximadamente 150°C, con mayor preferencia, de aproximadamente 100°C a aproximadamente 130°C.

Ventajas Una ventaja inesperada que confiere la presente invención consiste en las propiedades de rehidratación altamente mejoradas de la leche en polvo. En un aspecto, tales propiedades de rehidratación mejoradas de la leche en polvo comprenden una humectabilidad mejorada y/o un tiempo de humectación reducido. La humectabilidad se puede determinar de conformidad con el método IDF 87:1979.

Una ventaja adicional que confiere la presente invención consiste en una mejoría en la diferencia sensorial perceptible de la leche en polvo. En consecuencia, la diferencia sensorial perceptible de la leche en polvo se puede determinar con el uso de la "prueba de triángulo" que se enseña en la presente invención a continuación. En un aspecto, la "diferencia sensorial perceptible" incluye un olor y/o sabor mejorados, por ejemplo, un sabor y/o aroma a cocido reducidos y/o un sabor y/o aroma a rancidez reducidos.

Una ventaja adicional de la presente invención puede ser la reducción de contaminación de la planta procesadora en polvo (por ejemplo, de la tubería de la planta y/o de las superficies de acero) cuando se usa la leche en polvo tratada de conformidad con la presente invención, en comparación con la leche en polvo que no se ha tratado enzimáticamente y/o en comparación con la leche en polvo que durante su elaboración se ha tratado con una fosfolipasa (particularmente, ya sea una enzima fosfolipasa Al clasificada como E.C. 3.1.1.32 o una enzima fosfolipasa A2 clasificada como EC.3.1.1.4) (en vez de la lípido aciltransferasa como se describe en la presente invención) .

Una ventaja adicional de la presente invención puede ser la reducción de ácidos grasos libres en la leche en polvo tratada de conformidad con la presente invención en comparación con la leche en polvo que durante su elaboración se ha tratado con una fosfolipasa (particularmente, ya sea una enzima fosfolipasa Al clasificada como E.C. 3.1.1.32 o una enzima fosfolipasa A2 clasificada como EC.3.1.1.4) (en vez de la lípido aciltransferasa como se describe en la presente invención) .

Una ventaja adicional de la presente invención es la reducción de contenido de colesterol en la leche en polvo que puede tener mayores beneficios para la salud.

Una ventaja adicional de la presente invención es la fluidez mejorada de la leche en polvo.

En consecuencia, la mejoría en las propiedades de rehidratación y/o la mejoría en la diferencia sensorial perceptible y/o la mejoría en olor y/o sabor y/o la reducción en el contenido de colesterol y/o la fluidez mejorada de la leche en polvo y/o la contaminación reducida del equipo que se usa en su elaboración equivale a una mejoría cuando la leche tratada enzimáticamente (tratada con enzimas de conformidad con la presente invención) se compara con la leche en polvo que no se ha tratado enzimáticamente y/o en comparación con la leche en polvo que se ha tratado con una fosfolipasa (particularmente, ya sea una enzima fosfolipasa Al clasificada como E.C. 3.1.1.32 o una enzima fosfolipasa A2 clasificada como EC.3.1.1.4).

En consecuencia, la mejoría en las propiedades de rehidratación y/o la mejoría en la diferencia sensorial perceptible y/o la mejoría en olor y/o sabor y/o la reducción en el contenido de colesterol y/o la fluidez mejorada de la leche en polvo y/o la contaminación reducida del equipo que se usa en su elaboración puede significar una mejoría cuando la leche tratada enzimáticamente (tratada con enzimas de conformidad con la presente invención) se compara con la leche en polvo que se ha tratado con una o más de las siguientes fosfolipasas : fosfolipasa Al de Fusarium oxysporum (Lipopan F™) y/o una fosfolipasa de Fusarium heterosporum y/o una fosfolipasa Al de Fusarium venenatum (YieldMax™) y/o una fosfolipasa de Aspergillus niger y/o una fosfolipasa A2 de Streptomyces violaceoruber y/o una fosfolipasa A2 de páncreas porcino y/o una fosfolipasa A2 de Tu¿er borchii.

Célula hospedera El organismo huésped puede ser un organismo procariota o eucariota.

En una modalidad de la presente invención, la lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención se expresa en una célula hospedera, por ejemplo, una célula bacteriana, tal como bacilo spp, por ejemplo, una célula hospedera de bacilo licheniformis.

Las células huésped alternas pueden ser, por ejemplo, hongos, levaduras o plantas.

Se ha descubierto que el uso de una célula hospedera de bacilo licheniformis produce una expresión aumentada de una lípido aciltransferasa en comparación con otros organismos, tales como bacilo subtilis .

Se ha insertado una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida en varios vectores de expresión convencionales, diseñada para ser óptima para la expresión en bacilo subtilis, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe y Aspergillus tubigensis, respectivamente. Sin embargo, solo se detectaron niveles muy bajos en Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe y Aspergillus tubigensis . Los niveles de expresión estuvieron por debajo de 1 µ9/?t?1 y no fue posible seleccionar células que produjeran suficiente proteína para iniciar una producción comercial (no se muestra los resultados) . En contraste, el Bacillus licheniformis tuvo la capacidad de producir niveles de proteína convenientes para una producción económicamente accesible.

Particularmente, se ha descubierto que la expresión en B. licheniformis es aproximadamente 100 veces mayor que la expresión en B. subtilis bajo el control del promotor aprE o es aproximadamente 100 veces mayor que la expresión en S. lividans bajo el control de un promotor A4 y fusionado a celulosa (los resultados no se muestran en la presente invención) .

La célula hospedera puede ser cualquier célula de Bacillus distinta a B. subtilis. Preferentemente, la célula hospedera de Bacillus es de una de las siguientes especies: Bacillus licheniformis; B. alkalophilus; B. amyloliquefaciens; B. circulans; B. clausii; B. coagulans; B. firmus; B. lautus; B. lentus; B. megaterium; B. pumilus o 23. stearothermophilus .

El término "célula hospedera", en relación con la presente invención, incluye cualquier célula que comprende ya sea una secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa como se define en la presente invención o un vector de expresión como se define en la presente invención y que se usa en la producción recombinante de una lípido aciltransferasa que tiene las propiedades específicas como se define en la presente invención.

En consecuencia, la célula hospedera puede ser una cepa con proteasa insuficiente o sin proteasa y/o una cepa con a-amilasa insuficiente o sin a-amilasa.

El término "heteróloga" como se usa en la presente descripción se refiere a una secuencia derivada de una especie o fuente genética separada. Una secuencia heteróloga es una secuencia no huésped, una secuencia modificada, una secuencia de una cepa de células huésped diferente o una secuencia homologa de una ubicación cromosómica diferente de la célula hospedera.

Una secuencia "homologa" es una secuencia que se encuentra en la misma especie o fuente genética, es decir, que es de origen natural en las especies relevantes de la célula hospedera.

El término "lípido aciltransferasa recombinante" , como se usa en la presente descripción, se refiere a que la lípido aciltransferasa se ha producido por medio de recombinación genética. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica la lípido aciltransferasa se ha insertado en un vector de clonación, que resulta en una célula de B. licheniformis caracterizada por la presencia de la lípido aciltransferasa heteróloga.

Secuencias reguladoras En algunas aplicaciones, una secuencia de lípido aciltransferasa para usar en los métodos y/o usos de la presente invención se puede obtener al unir operativamente una secuencia de nucleótidos que la codifica a una secuencia reguladora que tiene la capacidad de facilitar la expresión de la secuencia de nucleótidos, tal como por la célula hospedera seleccionada (tal como una célula de B. licheniformis) .

A modo de ejemplo, se puede usar un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención unido operativamente a esa secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.

El término "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición, en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma prevista. Una secuencia reguladora "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la secuencia codificante se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias control.

El término "secuencias reguladoras" incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de expresión.

El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión de la ARN-polimerasa .

La expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene las propiedades específicas, como se define en la presente invención, se puede lograr, además, por la selección de regiones reguladoras, por ejemplo, regiones promotoras, regiones líder de secreción y regiones terminadoras que no son regiones reguladoras para la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de naturaleza.

En consecuencia, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar unida operativamente a por lo menos un promotor .

En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa puede estar unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia terminadora. Los ejemplos de secuencias terminadoras adecuadas para usar en cualquiera de los vectores, células huésped, métodos y/o usos de la presente invención incluyen: una secuencia terminadora de a-amilasa (por ejemplo, CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA - sec . con núm. de ident . 64), una secuencia terminadora de proteasa alcalina (por ejemplo, CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA -sec. con núm. de ident. 65), una secuencia terminadora específica de ácido glutámico (por ejemplo, ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT - sec. con núm. de ident. 66), una secuencia terminadora de levanasa (por ejemplo, TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT - sec . con núm. de ident. 67) y una secuencia terminadora de subtilisina E (por ejemplo, GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG sec. con núm. de ident. 119) . En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa puede estar unida operativamente a un terminador de a-amilasa, tal como un terminador de a-amilasa de B. licheniformis.

Promotor La secuencia promotora para usar de conformidad con la presente invención puede ser heteróloga u homologa a la secuencia que codifica una lípido aciltransferasa .

La secuencia promotora puede ser cualquier secuencia promotora con la capacidad de dirigir la expresión de una lípido aciltransferasa en la célula hospedera de elección.

En consecuencia, la secuencia promotora puede ser homologa a una especie de Bacillus, por ejemplo, B. licheniformis . Preferentemente, la secuencia promotora es homologa a la célula hospedera de elección.

En consecuencia, la secuencia promotora puede ser homologa a la célula hospedera. "Homologa a la célula hospedera" se refiere a que se origina dentro del organismo huésped, es decir, una secuencia promotora que se encuentra de manera natural en el organismo huésped.

En consecuencia, la secuencia promotora se puede seleccionar del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica: un promotor de a-amilasa, un promotor de proteasa, un promotor de subtilisina, un promotor de proteasa específico de ácido glutámico y un promotor de levansucrosa .

En consecuencia, la secuencia promotora puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica: LAT (por ejemplo, el promotor de alfa-amilasa de B . licheniformis, también denominado AmyL) , AprL (por ejemplo, el promotor de subtilisina Carlsberg) , EndoGluC (por ejemplo, el promotor específico de ácido glutámico de B . licheniformis) , AmyQ (por ejemplo, el promotor de alfa-amilasa de B. a yloliquefaciens) y SacB (por ejemplo, el promotor de levansucrosa de B . subtilis) .

Otros ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico en los métodos de la presente invención incluyen: el promotor del gen de proteasa alcalina de Bacillus lentus (aprH) ; el promotor del gen de alfa-amilasa de Bacillus subtilis (amyE) ; el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) ; el promotor del gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) ; los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y/o el promotor del gen tenebrionis CryIIIA de Bacillus thuringiensis subs .

En una modalidad preferida, la secuencia promotora es un promotor de a-amilasa (tal como un promotor de -amilasa de Bacillus licheniformis) . Preferentemente, la secuencia promotora comprende la secuencia -35 a -10 del promotor de OÍ-amilasa de B. licheniformis, ver las Figuras 53 y 55.

La "secuencia -35 a -10" describe la posición con relación al sitio de inicio de la transcripción. Tanto "-35" como "-10" son bloques, es decir, un número de nucleótidos; cada uno comprende 6 nucleótidos y estos bloques están separados por 17 nucleótidos. Estos 17 nucleótidos se conocen, frecuentemente, como un "separador". Esto se ilustra en la Figura 55, en donde los bloques -35 y -10 aparecen subrayados. Para evitar dudas, si se usa la "secuencia -35 a -10" en la presente descripción, se refiere a una secuencia desde el comienzo del bloque -35 hasta el extremo del bloque -10, es decir, que incluye tanto el bloque -35, el separador largo de 17 nucleótidos, como el bloque -10.

Péptido señal La lípido aciltransferasa producida por una célula hospedera por expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la lípido aciltransferasa se puede secretar o puede estar contenida intracelularmente , según la secuencia y/o el vector que se use .

Se puede usar una secuencia señal para dirigir la secreción de las secuencias codificantes a través de una membrana celular particular. Las secuencias señal pueden ser naturales o extrañas para la secuencia codificante de la lípido aciltransferasa . Por ejemplo, la secuencia codificante del péptido señal se puede obtener a partir de un gen de amilasa o proteasa de una especie de Bacillus, preferentemente, de Bacillus licheniformis.

Las secuencias codificantes del péptido señal se pueden obtener a partir de uno o más de los siguientes genes: gen maltogénico de a-amilasa, gen de subtilisina, gen de beta-lactamasa, gen de proteasa neutra, gen prsA y/o gen de aciltransferasa .

Preferentemente, el péptido señal es un péptido señal de o¡-amilasa de B. licheniformis, aciltransferasa de Aeromonas (por ejemplo, mkkwfvcllglialtvqa - sec . con núm. de ident . 21) , subtilisina de B . subtilis (por ejemplo, mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa - sec. con núm. de ident. 22) o subtilisina de B. licheniformis (por ejemplo, mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa - sec. con núm. de ident . 23) . En consecuencia, el péptido señal puede ser el péptido señal de a-amilasa de B. licheniformis .

Sin embargo, se puede usar cualquier secuencia codificante de péptido señal con la capacidad de dirigir la lípido aciltransferasa expresada en la vía secretora de una célula hospedera de Bacillus (preferentemente, una célula hospedera de B. licheniformis) de elección.

En algunas modalidades de la presente invención una secuencia de nucleótidos que codifica una péptido señal puede estar unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa de elección.

La lípido aciltransferasa de elección se puede expresar en una célula hospedera tal como se define en la presente invención como una proteína de fusión.

Vector de expresión El término "vector de expresión" se refiere a un constructo con la capacidad de expresión in vivo o in vitro.

Preferentemente, el vector de expresión se incorpora en el genoma del organismo, tal como un huésped de B. licheniformis. El término "incorporado" incluye, preferentemente, la incorporación estable en el genoma.

La secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa, como se define en la presente invención, puede estar presente en un vector en el que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a secuencias reguladoras de manera que las secuencias reguladoras tienen la capacidad de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos mediante un organismo huésped adecuado (tal como B. licheniformis) , es decir, el vector es un vector de expresión .

Los vectores de la presente invención se pueden transformar en una célula hospedera adecuada, tal como se describió anteriormente, para facilitar la expresión de un polipéptido que tiene actividad de lípido aciltransferasa como se define en la presente invención.

La elección del vector, por ejemplo, plásmido, cósmido, virus o un vector del fago, inserto genómico, depende, frecuentemente, de la célula hospedera en la que se va a introducir La presente invención puede abarcar otras formas de vectores de expresión que prestan funciones equivalentes y que son, o se vuelven, conocidos en la técnica.

Una vez transformado en la célula hospedera de elección, el vector se puede replicar y funcionar independientemente del genoma de la célula hospedera o se puede integrar en el genoma en sí.

Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables , tales como un gen que confiere resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina . Alternativamente, la selección se puede lograr por cotransformación (tal como se describe en la patente núm. WO 91/17243) .

Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o se usan para transfectar o transformar una célula hospedera.

El vector puede comprender, además, una secuencia de nucleótidos que permite al vector replicarse en la célula hospedera en cuestión. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUBUO, pE194, pAMBl y pIJ702.

Lípido aciltransferasa La secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede codificar una lípido aciltransferasa natural o una lípido aciltransferasa variante .

La lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa natural o una lípido aciltransferasa variante .

Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en la presente invención puede ser una como se describe en la patente núm. WO 2004/064537, patente núm. WO 2004/064987, patente núm. WO 2005/066347, patente núm. O 2006/008508, patente núm. WO 2009/024862 o patente del PCT núm. PCT/IB2009/054535. Estos documentos se incorporan en la presente descripción como referencia .

El término "lípido aciltransferasa" , como se usa en la presente descripción, se refiere, preferentemente, a una enzima que tiene actividad aciltransferasa (generalmente, clasificada como E.C. 2.3.1.x, por ejemplo, 2.3.1.43), por lo que la enzima tiene la capacidad de transferir un grupo acilo de un lípido a uno o más sustratos aceptores, tales como uno o más de los siguientes: un esterol, un estanol, un carbohidrato, una proteína, una subunidad proteica, un alcohol de azúcar, tal como ácido ascórbico y/o glicerol, preferentemente, glicerol y/o un esterol, tal como colesterol .

Preferentemente, la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que tiene la capacidad de transferir un grupo acilo de un fosfolípido (tal como se define en la presente invención) a un alcohol de azúcar, tal como ácido ascórbico y/o glicerol y/o un esterol, preferentemente, glicerol o un esterol, con la máxima preferencia, un esterol (por ejemplo, colesterol) .

Para algunos aspectos el "aceptor acilo" de conformidad con la presente invención puede ser cualquier compuesto que comprende un grupo hidroxi (-0H), tal como, por ejemplo, alcoholes polivalentes, que incluyen glicerol; esteróles; estañóles; carbohidratos; hidroxiácidos que incluyen ácidos de frutas, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico y ácido ascórbico; proteínas o una subunidad de estas, tales como aminoácidos, hidrolisatos de proteínas y péptidos (proteína parcialmente hidrolizada) , por ejemplo; y mezclas y derivados de estos. Preferentemente, el "aceptor acilo" de conformidad con la presente invención no es agua. Preferentemente, el "aceptor acilo" de conformidad con la presente invención es un alcohol de azúcar, tal como un poliol, con la máxima preferencia, glicerol. Para el propósito de la presente invención el ácido ascórbico se considera, además, un alcohol de azúcar.

Preferentemente, el aceptor acilo no es un monoglicérido .

Preferentemente, el aceptor acilo no es un diglicérido.

En un aspecto, la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que puede, y tiene la capacidad de, transferir un grupo acilo de un lípido a glicerol, adicionalmente , tiene la capacidad de transferir el grupo acilo de un lípido a uno o más de los siguientes: un carbohidrato, una proteína, una subunidad proteica, esterol y/o un estanol, preferentemente, tiene la capacidad de transferir ambos en un alcohol de azúcar, tal como ácido ascórbico y/o glicerol, con la máxima preferencia, un esterol, tal como colesterol, y/o esteroles/estanoles vegetales .

En algunos aspectos la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que tiene la capacidad de esterificarse por lo menos aproximadamente 10%, con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% del aceptor acilo.

En aspectos preferidos la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que tiene la capacidad de esterificarse por lo menos aproximadamente 10%, con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% del colesterol presente en la leche inicial .

Preferentemente, el sustrato lipídico sobre el que actúa la lípido aciltransferasa es uno o más de los siguientes lípidos: un fosfolípido, tal como una lecitina, por ejemplo, fosfatidilcolina y/o fosfatidiletanolamina .

En la presente invención este sustrato lipídico puede denominarse "donante de acilo lipídico" . El término lecitina, como se usa en la presente descripción, abarca fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol , fosfatidilserina y fosfatidilglicerol .

Para algunos aspectos la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es, preferentemente, una lípido aciltransferasa que no tiene la capacidad, o es sustancialmente incapaz, de actuar en un triglicérido y/o un 1-monoglicérido y/o 2-monoglicérido .

Para algunos aspectos la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es, preferentemente, una lípido aciltransferasa que no muestra actividad de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3) o que no muestra actividad significativa de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3) .

La actividad de triacilglicerol lipasa en base a la tributirina se determina de conformidad con Food Chemical Codex, 4.° edición, National Academy Press, 1996, pág . 803, con las modificaciones de que la muestra se disuelve en agua desionizada y no en amortiguador de glicina y el punto fijo est . de pH es 5.5 en vez de 7. Esta referencia se incorpora en la presente descripción como referencia. 1 unidad de lipasa (LIPU) se define como la cantidad de enzima que puede liberar 1 µt??? de ácido butírico por minuto bajo estas condiciones de ensayo.

La lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa sustancialmente incapaz de actuar en un triglicérido puede tener una LIPU menor que 5/kg de leche, con mayor preferencia, una LIPU menor que 0.25/kg de leche y, con la máxima preferencia, una LIPU menor que 0.05/kg de leche.

En consecuencia, la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que puede mostrar una o más de las siguientes actividades de fosfolipasa: actividad de la fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) y/o actividad de la fosfolipasa Al (E.C. 3.1.1.32). La lípido aciltransferasa puede tener, además, actividad de la fosfolipasa B (E.C 3.1.1.5).

En consecuencia, para algunos aspectos la lípido aciltransferasa puede tener la capacidad de transferir un grupo acilo de un fosfolípido a un alcohol de azúcar, preferentemente, glicerol y/o ácido ascórbico.

En consecuencia, para algunos aspectos la lípido aciltransferasa puede tener la capacidad de transferir un grupo acilo un fosfolípido a un estanol y/o esterol, preferentemente, colesterol .

Para algunos aspectos la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención codifica, preferentemente, una lípido aciltransferasa que tiene la capacidad de transferir un grupo acilo de un fosfolípido a un esterol y/o un estanol para formar por lo menos un éster de esterol y/o un éster de estanol .

La lípido aciltransferasa puede tener la capacidad de transferir un grupo acilo de un lípido a un poliol, tal como glicerol y/o un esterol, tal como colesterol o esterol/estanoles vegetales. Por lo tanto, en una modalidad el "aceptor acilo" de conformidad con la presente invención puede ser glicerol y/o colesterol o esterol/estanoles vegetales .

En algunos aspectos la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede comprender un motivo GDSx y/o un motivo GANDY .

Preferentemente, la enzima lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que tiene actividad aciltransferasa y que comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa o lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser obtenible, preferentemente, obtenida de un organismo de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida. Preferentemente, la lípido aciltransferasa es obtenible, preferentemente, obtenida de un organismo del género Aeromonas.

En algunos aspectos de la presente invención la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención codifica una lípido aciltransferasa que comprende un residuo de ácido aspártico en una posición correspondiente a N-80 en la secuencia de aminoácidos de la lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que se muestra como la sec. con núm. de ident . 34.

En algunos aspectos de la presente invención la lípido aciltransferasa para usar cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que comprende un residuo de ácido aspártico en una posición correspondiente a N-80 en la secuencia de aminoácidos de la lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que se muestra como la sec. con núm. de ident. 34.

Adicionalmente , o alternativamente, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención codifica una lípido aciltransferasa que puede comprender la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de homología con esta. En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa codifica una lípido aciltransferasa que puede comprender la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 16.

Adicionalmente , o alternativamente, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención codifica una lípido aciltransferasa que puede comprender la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 68 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de homología con esta. En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa codifica una lípido aciltransferasa que puede comprender la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 68.

En una modalidad la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident. 16 o sec. con núm. de ident. 68 o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 75% de identidad con ésta, preferentemente, por lo menos 80%, preferentemente, por lo menos 85%, preferentemente, por lo menos 95%, preferentemente, por lo menos 98% de identidad con esta .

Preferentemente, la enzima lípido aciltransferasa se puede caracterizar con el uso del siguiente criterio: la enzima tiene actividad aciltransferasa acilo que se puede definir como la actividad de transferencia de ésteres con lo cual la parte acilo de una unión éster original de un donante de acilo lipídico se transfiere a un aceptor acilo, preferentemente, glicerol o colesterol para formar un éster nuevo; y la enzima comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

Preferentemente, X del motivo GDSX es L o Y. Con mayor preferencia, X del motivo GDSX es L. Por lo tanto, la enzima de conformidad con la presente invención comprende, preferentemente, el motivo GDSL de la secuencia de aminoácidos.

El motivo GDSX se compone de cuatro aminoácidos conservados. Preferentemente, la serina en el motivo es una serina catalítica de la enzima lípido aciltransferasa . En consecuencia, la serina del motivo GDSX puede estar en una posición correspondiente a Ser-16 en la enzima lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que se enseña en Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology, abril de 1996, vol. 178, núm. 7, págs . 2060-2064).

Para determinar si una proteína tiene el motivo GDSX de conformidad con la presente invención, la secuencia se compara, preferentemente, con los perfiles del modelo oculto de Markov (perfiles HMM, por sus siglas en inglés) de la base de datos Pfam, de conformidad con los procedimientos que se enseñan en la patente núm. WO 2004/064537 o en la patente núm. WO 2004/064987, que se incorporan en la presente descripción como referencia.

Preferentemente, la enzima lípido aciltransferasa se puede alinear con el uso de la secuencia consenso Pfam00657 (para una explicación completa, ver la patente núm. WO 2004/064537 o la patente núm. WO 2004/064987) .

Preferentemente, una coincidencia positiva con el perfil del modelo oculto de Markov (perfil HMM) de la familia del dominio pfam00657 indica la presencia del dominio GDSL o GDSX de conformidad con la presente invención.

Preferentemente, cuando se alinea con la secuencia consenso Pfam00657, la lípido aciltransferasa para usar en los métodos o usos de la presente invención puede tener por lo menos uno, preferentemente, más de uno, preferentemente, más de dos, de los siguientes: un bloque GDSx, un bloque GAMDY, un bloque HPT. En consecuencia, la lípido aciltransferasa puede tener un bloque GDSx y un bloque GANDY. Alternativamente, la enzima puede tener un bloque GDSx y un bloque HPT. Preferentemente, la enzima comprende por lo menos un bloque GDSx. Ver la patente núm. WO 2004/064537 o la patente núm. WO 2004/064987 para más detalles.

Preferentemente, los residuos del motivo GANDY se seleccionan de GANDY, GGNDA, GGNDL, con la máxima preferencia, GANDY.

Preferentemente, cuando se alinea con la secuencia consenso Pfam00657 la enzima para usar en los métodos o usos de la presente invención tiene por lo menos una, preferentemente, más de una, preferentemente, más de dos, preferentemente, más de tres, preferentemente, más de cuatro, preferentemente, más de cinco, preferentemente, más de seis, preferentemente, más de siete, preferentemente, más de ocho, preferentemente, más de nueve, preferentemente, más de diez, preferentemente, más de once, preferentemente, más de doce, preferentemente, más de trece, preferentemente, más de catorce, de los siguientes residuos de aminoácidos en comparación con la secuencia de polipéptidos hidrófilos de la referencia A., particularmente, la sec . con núm. de ident. 1: 28His, 29His, 30His, 31His, 32Gly, 33Asp, 34Ser, 35His, 130His, 131Gly, 132HÍS, 133Asn, 134Asp, 135HÍS, 309HÍS.

El dominio GDSX pfam00657 es un identificador único que distingue las proteínas que tienen este dominio de otras enzimas .

La secuencia consenso pfam00657 se presenta en la Figura 3 como la sec. con núm. de ident. 2. Esto se deriva de la identificación de la familia 00657 de pfam, versión 6 de la base de datos, que en la presente invención se puede denominar, además, pfam00657.6.

La secuencia consenso se puede actualizar mediante el uso de liberaciones adicionales de la base de datos Pfam (por ejemplo, ver la patente núm. WO 2004/064537 o la patente núm. WO 2004/064987) .

En una modalidad, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que se puede caracterizar con el uso del siguiente criterio: (i) la enzima tiene actividad aciltransferasa que puede definir como la actividad de transferencia de ésteres con lo cual la parte acilo de una unión éster original de un donante de acilo lipídico se transfiere a un aceptor acilo, preferentemente, glicerol o colesterol , para formar un éster nuevo , preferentemente, monoglicérido colesterol, respectivamente; (ii) la enzima comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M O S; (iii) la enzima comprende His-309 o comprende un residuo de histidina en una posición correspondiente a His-309 en la enzima lípido aciltransferasa de Aeromonas hydrophila que se muestra en las Figuras 2 y 4 (sec. con núm. de ident . 1 o sec. con núm. de ident . 3) .

Preferentemente, el residuo de aminoácidos del motivo GDSX es L.

En la sec. con núm. de ident. 3 o la sec. con núm. de ident. 1 los primeros 18 residuos de aminoácidos forman una secuencia señal. La His-309 de la secuencia de longitud total, que es la proteína que incluye la secuencia señal, equivale a la His-291 de la parte madura de la proteína, es decir, la secuencia sin la secuencia señal.

En una modalidad la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que comprende la siguiente triada catalítica: Ser-34, Asp-306 y His-309 o comprende un residuo de serina, un residuo de ácido aspártico y un residuo de histidina, respectivamente, en las posiciones correspondientes a Ser-34, Asp-306 y His-309 en la enzima lípido aciltransferasa que se muestra en la Figura 4 (sec. con núm. de ident . 3) o en la Figura 2 (sec. con núm. de ident. 1) . Como se indicó anteriormente, en la secuencia que se muestra en la sec. con núm. de ident. 3 o la sec. con núm. de ident. 1 los primeros 18 residuos de aminoácidos forman una secuencia señal. Ser-34, Asp-306 y His-309 de la secuencia de longitud total, que es la proteína que incluye la secuencia señal, equivale a Ser-16, Asp-288 y His-291 de la parte madura de la proteína, es decir, la secuencia sin la secuencia señal. En la secuencia consenso pfam00657, como se muestra en la Figura 3 (sec. con núm. de ident. 2), los residuos del sitio activo corresponden a Ser-7, Asp-345 y His-348.

En una modalidad la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que se puede caracterizar con el uso del siguiente criterio: la enzima tiene actividad aciltransferasa que se puede definir como la actividad de transferencia de ésteres, con lo cual la parte acilo de una unión éster original de un primer donante de acilo lipídico se transfiere a un aceptor acilo para formar un éster nuevo,- y la enzima comprende por lo menos Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 y His-309 o comprende residuos de glicina, ácido aspártico, serina, ácido aspártico e histidina en posiciones correspondientes a Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-306 y His-309, respectivamente, en la enzima lípido aciltransferasa de Aeromonas hyárophila que se muestra en la sec. con núm. de ident . 3 o la sec. con núm. de ident. 1.

En consecuencia, cualquier de las siguientes secuencias de nucleótidos puede codificar la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención: (a) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 36 (ver la Figura 29) ; (b) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 38 (ver la Figura 31) ; (c) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 39 (ver la Figura 32) ; (d) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 42 (ver la Figura 35) ; (e) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 44 (ver la Figura 37) ; (f) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 46 (ver la Figura 39) ; (g) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident . : 48 (ver la Figura 41) ; (h) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 49 (ver la Figura 57) ; (i) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 50 (ver la Figura 58) ; (j) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 51 (ver la Figura 59) ; (k) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 52 (ver la Figura 60) ; (1) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 53 (ver la Figura 61) ; (m) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 54 (ver la Figura 62) ; (n) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 55 (ver la Figura 63) ; (o) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec . con núm. de ident . : 56 (ver la Figura 64) ; (p) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 57 (ver la Figura 65) ; (q) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 58 (ver la Figura 66) ; (r) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 59 (ver la Figura 67) ; (s) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. : 60 (ver la Figura 68) ; (t) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 61 (ver la Figura 69) (u) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 62 (ver la Figura 70) ; (v) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident.: 63 (ver la Figura 71) ; (w) o una secuencia de nucleótidos que tiene 70% o más, preferentemente, 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias que se muestran como sec . con núm. de ident . : 36, sec. con núm. de ident.: 38, sec. con núm. de ident.: 39, sec. con núm. de ident.: 42, sec. con núm. de ident.: 44, sec. con núm. de ident.: 46, sec. con núm. de ident.: 48, sec. con núm. de ident.: 49, sec. con núm. de ident.: 50, sec. con núm. de ident.: 51, sec. con núm. de ident.: 52, sec. con núm. de ident.: 53, sec. con núm. de ident.: 54, sec. con núm. de ident.: 55, sec. con núm. de ident.: 56, sec. con núm. de ident.: 57, sec. con núm. de ident.: 58, sec. con núm. de ident. : 59, sec. con núm. de ident.: 60, sec. con núm. de ident.: 61, sec. con núm. de ident.: 62 o sec. con núm. de ident.: 63.

En consecuencia, la secuencia de nucleótidos puede tener 80% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más y, aún con mayor preferencia, 95% o más de identidad con cualquiera de las secuencias que se muestran como sec. con núm. de ident. 36, sec. con núm. de ident. 38, sec. con núm. de ident. 39, sec. con núm. de ident. 42, sec. con núm. de ident. 44, sec. con núm. de ident. 46, sec. con núm. de ident . 48, sec . con núm. de ident . 49, sec . con núm. de ident . 50, sec. con núm. de ¡ ident. 51, sec . con núm . de ident . 52, sec . con núm, . de ident . 53, sec . con núm . de ident . 54, sec . con núm . de ident . 55, sec . con núm . de ident . 56, sec . con núm . de ident . 57, sec . con núm . de ident . 58, sec . con núm . de ident . 59, sec . con núm . de ident . 60, sec . con núm . de ident . 61, sec . con núm . de ident . 62 o sec. con núm . de ident. 63.

En una modalidad la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima lípido aciltransferasa para usar cualquiera de los métodos y usos de la presente invención es una secuencia de nucleótidos que tiene 70% o más, preferentemente, 75% o más de identidad con cualquiera de las secuencias que se muestran como: sec. con núm. de ident. 49, sec. con núm. de ident. 50, sec. con núm. de ident. 51, sec. con núm. de ident. 62 y sec. con núm. de ident. 63. En consecuencia, la secuencia de nucleótidos puede tener 80% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más y, aún con mayor preferencia, 95% o más de identidad con cualquiera de las secuencias que se muestran como: sec. con núm. de ident. 49, sec. con núm. de ident. 50, sec. con núm. de ident. 51, sec. con núm. de ident. 62 y sec. con núm. de ident. 63.

En una modalidad la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención es una secuencia de nucleótidos que tiene 70% o más, 75% o más, 80% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más y, aún con mayor preferencia, 95% o más de identidad con la secuencia que se muestra como la sec . con núm. de ident . 49.

En consecuencia, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: (i) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 3 (ii) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident. 4 (iü) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 5 (iv) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 6 (v) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm . de ident . 7 (vi) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident. 8 (vii) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm . de ident . 9 (viii) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident , 10 (ix) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 11 (?) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident. 12 (xi) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident. 13 (xii) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 14 (xiii) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 1 (xiv) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 15 (xv) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident. 16 (xvi) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 17 (xvii) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident. 18 (xviii ) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident. 34 (xix) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm . de ident . 35 (xx) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 68 (xxi) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident . 121 (xxii) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 122 (xxiii) la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 123 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más de identidad con cualquiera de las secuencias que se muestran como sec. con núm. de ident. 1, sec. con núm. de ident. 3, sec. con núm. de ident. 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident. 10, sec. con núm. de ident. 11, sec. con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14 o sec. con núm. de ident. 15, sec. con núm. de ident. 16, sec. con núm. de ident. 17, sec. con núm. de ident. 18, sec. con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 35, sec. con núm. de ident. 68, sec. con núm. de ident. 121, sec. con núm. de ident. 122 o sec. con núm. de ident. 123.

En consecuencia, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende ya sea la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident . 3 o como sec . con núm. de ident. 4 o la sec. con núm. de ident. 1 o sec. con núm. de ident. 15 o sec. con núm. de ident. 16 o sec. con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 35, sec. con núm. de ident. 68, sec. con núm. de ident. 121, sec. con núm. de ident. 122 o sec. con núm. de ident. 123 o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más, preferentemente, 80% o más, preferentemente, 85% o más, preferentemente, 90% o más, preferentemente, 95% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 3 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 4 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 1 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 15 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 16 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 34 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 35 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 68 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de iden . 121 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 122 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 123.

En consecuencia, la enzima lípido aciltransferasa para usar cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más y, aún con mayor preferencia, 95% o más de identidad con cualquiera de las secuencias que se muestran como sec. con núm. de ident. 3, sec. con núm. de ident. 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident. 10, sec. con núm. de ident. 11, sec. con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14, sec. con núm. de ident. 1, sec. con núm. de ident. 15, sec. con núm. de ident. 16, sec. con núm. de ident. 17, sec. con núm. de ident. 18, sec. con núm. de ident. 34 o sec. con núm. de ident. 35, sec. con núm. de ident. 68, sec. con núm. de ident. 121, sec. con núm. de ident. 122 o sec. con núm. de ident. 123.

En consecuencia, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: (a) una secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos de aminoácidos 1-100 de la sec . con núm. de ident . 3 o sec. con núm. de ident . 1; (b) una secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos de aminoácidos 101-200 de la sec. con núm. de ident. 3 o sec. con núm. de ident. 1; (c) una secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos de aminoácidos 201-300 de la sec. con núm. de ident. 3 o sec. con núm. de ident. 1; o (d) una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más, aún con mayor preferencia 95% o más de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas anteriormente en (a) - (c) .

En consecuencia, la enzima lípido aciltransferasa para usar en los métodos y usos de la presente invención puede comprender una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos : (a) una secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos de aminoácidos 28-39 de la sec. con núm. de ident . 3 o sec. con núm. de ident. i; (b) una secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos de aminoácidos 77-88 de la sec. con núm. de ident. 3 o sec. con núm. de ident. 1; (c) una secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos de aminoácidos 126-136 de la sec. con núm. de ident. 3 o sec. con núm. de ident. 1; (d) una secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos de aminoácidos 163-175 de la sec. con núm. de ident. 3 o sec. con núm. de ident. 1; (e) una secuencia de aminoácidos que se muestra como residuos de aminoácidos 304-311 de la sec. con núm. de ident. 3 o sec. con núm. de ident. 1; o (f) una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más, aún con mayor preferencia, 95% o más de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos definidas anteriormente en (a) - (e) . aspecto, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que puede ser la lípido aciltransferasa de Candida parapsilosis como se enseña en la patente europea núm. EP 1 275 711. Por lo tanto, en un aspecto, la lípido aciltransferasa para usar en el método y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende una de las secuencias de aminoácidos que se enseñan en la sec . con núm. de ident . 17 o sec. con núm. de ident. 18.

Con mayor preferencia, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que puede ser una lípido aciltransferasa que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más, aún con mayor preferencia, 95% o más, aún con mayor preferencia, 98% o más o, aún con mayor preferencia, 99% o más de identidad con la sec. con núm. de ident. 16. Esta enzima se podría considerar una enzima variante.

En un aspecto, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que puede ser una lecitina : colesterol aciltransferasa (LCAT, por sus siglas en inglés) o variante de esta (por ejemplo, una variante elaborada por evolución molecular) Las LCAT adecuadas se conocen en la técnica y pueden ser obtenibles de uno o más de los siguientes organismos, por ejemplo: mamíferos, ratas, ratones, gallinas, Drosophila elanogaster, plantas, que incluyen Arabidopsis y Oryza sativa, nematodos, hongos y levadura.

En una modalidad la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que puede ser la lípido aciltransferasa obtenible, obtenida, preferentemente, de las cepas TOP 10 de E. coli que contienen pPetl2aAhydro y pPetl2aASalmo depositadas por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, Dinamarca, bajo el Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Procedure (Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes) en la National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) (Colección Nacional de Bacterias Industriales, Marinas y Alimentarias) 23 St . Machar Street, Aberdeen, Scotland, Reino Unido el 22 de diciembre de 2003 con los números de registro NCIMB 41204 y NCIMB 41205, respectivamente .

Una enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una fosfolípido glicerol aciltransferasa . Las fosfolípido glicerol aciltransferasas incluyen las aisladas de Aeromonas spp. , preferentemente, Aeromonas hydrophila o A. salmonicida, con la máxima preferencia, A. salmonicida o variantes de estas.

Con la máxima preferencia, las lipido aciltransferasas para usar en la presente invención están codificadas por las sec. con núms . de ident . 1, 3, 4, 15, 16, 34 y 35. Un experto en la técnica reconocerá que es preferible que el péptido señal de la aciltransferasa se desdoble durante la expresión de la transferasa. Los péptidos señal de las sec. con núms. de ident. 1, 3, 4 y 15 son los aminoácidos 1-18. Por lo tanto, las regiones con la máxima preferencia son los aminoácidos 19-335 para la sec. con núm. de ident. 1 y la sec. con núm. de ident. 3 {A. hydrophilia) y los aminoácidos 19-336 para la sec. con núm. de ident. 4 y la sec. con núm. de ident. 15 (A. salmonicida) . Cuando se usa para determinar la homología de identidad de las secuencias de aminoácidos, se prefiere que los alineamientos como se describen en la presente invención usen la secuencia madura.

En una modalidad la lipido aciltransferasa para usar en la presente invención comprende (o consiste en) , en consecuencia, la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident. 16 o comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad con la sec . con núm. de ident. 16.

En una modalidad la lípido aciltransferasa para usar en la presente invención está codificada, en consecuencia, por una secuencia de nucleótidos que comprende (o consiste en) una secuencia de nucleótidos que se muestra en la sec. con núm. de ident. 49 o comprende (o consiste en) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de identidad con la sec. con núm. de ident. 49.

Por lo tanto, las regiones con la máxima preferencia para determinar la homología (identidad) son los aminoácidos 19-335 para las sec. con núms . de ident. 1 y 3 (A. hydrophilia) y los aminoácidos 19-336 para las sec. con núms. de ident. 4, 15 {A. salmonicida) . Las sec. con núms. de ident. 34 y 35 son secuencias de proteínas maduras de una lípido aciltransferasa de A. hydrophilia y A. salmonicida, respectivamente, que pueden o no experimentar modificación postraslacional adicional.

Una enzima lípido aciltransferasa para usar cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que, además, puede aislarse de Ther obifida, preferentemente, T. fusca, con la máxima preferencia, aquella codificada por la sec. con núm. de ident. 28.

Las lípido aciltransferasas adecuadas para usar de conformidad con la presente invención y/o en los métodos de la presente invención pueden comprender cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos y/o estar codificadas por las siguientes secuencias de nucleótidos: a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que muestra actividad de la lípido aciltransferasa y es por lo menos 70% idéntico (preferentemente, por lo menos 80%, con mayor preferencia, por lo menos 90% idéntico) a la secuencia de polipéptidos que se muestra en la sec . con núm. de ident. 16 o al polipéptido que se muestra en la sec. con núm. de ident. 68 o a los polipéptidos que se muestran en la sec. con núm. de ident. 121 o al polipéptido que se muestra en la sec. con núm. de ident. 122 o al polipéptido que se muestra en la sec. con núm. de ident. 123; b) un polipéptido (aislado) que comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la sec. con núm. de ident. 16 o sec. con núm. de ident. 68 o una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica (preferentemente, por lo menos 80% idéntica, con mayor preferencia, por lo menos 90% idéntica) a la sec . con núm. de ident . 16, sec . con núm. de ident. 68, sec. con núm. de ident. 121, sec. con núm. de ident. 122 o sec. con núm. de ident. 123; un ácido nucleico que codifica una lípido aciltransferasa, cuyo ácido nucleico comprende (o consiste en) una secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 49 o una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 70% idéntica (preferentemente, por lo menos 80%, con mayor preferencia, por lo menos 90% idéntica) a la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 49; un ácido nucleico que se hibridiza en condiciones de media o alta rigurosidad en una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 49 y codifica para un polipéptido que muestra actividad de la lípido aciltransferasa; un ácido nucleico que es un fragmento de las secuencias de ácido nucleico especificadas en a) , c) o d) ; o un polipéptido que es un fragmento del polipéptido especificado en b) .

Una enzima lípido aciltransferasa para usar cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que, además, puede aislarse de Streptomyces, preferentemente, S. avermitis, con la máxima preferencia, aquella codificada por la sec. con núm. de ident. 32. Otras enzimas posibles para usar en la presente invención de Streptomyces incluyen aquellas codificadas por las sec. con núms . de ident. 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 31 y 33.

Una enzima para usar en la invención se puede aislar, además, de Corynebacterium, preferentemente, C. efficiens, con la máxima preferencia, aquella codificada por la sec. con núm. de ident. 29.

En consecuencia, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran como sec. con núms. de ident. 37, 38, 40, 41, 43, 45 o 47 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con esta, o puede estar codificada por cualquiera de las secuencias de nucleótidos que se muestran como sec. con núms. de ident. 36, 39, 42, 44, 46 o 48 o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con ésta.

En una modalidad la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima lípido aciltransferasa para usar cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en: a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la sec . con núm. de ident. 36; b) un ácido nucleico que se relaciona con la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident. 36 por la degeneración del código genético; y c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos que se muestra en la sec. con núm. de ident. 36.

En una modalidad la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es una lípido aciltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la sec. con núm. de ident. 37 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 60% de identidad con esta.

En una modalidad adicional, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran como sec . con núm. de ident . 37, 38, 40, 41, 43, 45 o 47 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con esta, o puede estar codificada por cualquiera de las secuencias de nucleótidos que se muestran como sec. con núm. de ident. 39, 42, 44, 46 o 48 o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con ésta.

En una modalidad adicional, la enzima lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende cualquiera de las secuencias amino que se muestran como sec. con núm. de ident. 38, 40, 41, 45 o 47 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con esta para los usos descritos en la presente descripción.

En una modalidad adicional, la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende cualquiera de las secuencias amino que se muestran como sec. con núm. de ident. 38, 40 o 47 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con esta para los usos descritos en la presente descripción.

Con mayor preferencia, en una modalidad la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec . con núm. de ident . 47 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con esta.

En otra modalidad la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 43 o 44 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con esta.

En otra modalidad la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 41 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con esta.

En una modalidad la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede estar codificada por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la sec . con núm. de ident . 36; b) un ácido nucleico que se relaciona con la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident. 36 por la degeneración del código genético; y c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos que se muestra en la sec. con núm. de ident. 36.

En una modalidad la lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa obtenible, preferentemente, obtenida de las cepas L130 o L131 de Streptomyces depositadas por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, Dinamarca, bajo el Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Procedure (Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes) en la National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) (Colección Nacional de Bacterias Industriales, Marinas y Alimentarias) 23 St . Machar Street, Aberdeen, Scotland, Reino Unido, el 23 de junio de 2004, con los números de registro NCIMB 41226 y NCIMB 41227, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos adecuadas que codifican una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención pueden codificar un polinucleótido que codifica una lípido aciltransferasa (sec. con núm. de ident . 16) o pueden codificar una secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa (sec. con núm. de ident . 16 ) .

Una lípido aciltransferasa adecuada para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una secuencia de aminoácidos que se puede identificar por alineamiento a la secuencia L131 (sec. con núm. de ident. 37) con el uso de Align X, el algoritmo de alineamiento de pares Clustal W de VectorNTI con el uso de configuraciones predeterminadas.

Un alineamiento de L131 y homólogos de S. avermitilis y G. fusca ilustra la conservación del motivo GDSx (GDSY en L131 y S. avermitilis y T. fusca) , el bloque GANDY, que es GGNDA o GGNDL, y el bloque HPT (considerado histidina catalítica conservada) . Estos tres bloques conservados se resaltan en la Figura 42.

Cuando se alinean, ya sea a la secuencia consenso Pfam00657 de pfam (como se describe en la patente núm. WO 2004/064987) y/o a la secuencia L131 descrita en la presente descripción (sec. con núm. de ident. 37) es posible identificar tres regiones conservadas, el bloque GDSx, el bloque GANDY y el bloque HTP (ver la patente núm. WO 2004/064987 para más detalles) .

Cuando se alinean, ya sea a la secuencia consenso Pfam00657 de pfam (como se describe en la patente núm. WO 2004/064987) y/o a la secuencia L131 descrita en la presente descripción (sec. con núm. de ident . 37) i) la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención pueden ser una lípido aciltransferasa que tiene un motivo GDSx, con mayor preferencia, un motivo GDSx seleccionado del motivo GDSL o GDSY. y/o ii) la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que tiene un bloque GANDY, con mayor preferencia, un bloque GANDY que comprende GGNDx amino, con mayor preferencia, GGNDA o GGNDL. y/o iü) la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que tiene, preferentemente, un bloque HTP. y, preferentemente, iv) la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que tiene, preferentemente, un motivo GDSx o GDSY, y un bloque GA DY que comprende GGNDx amino, preferentemente, GGNDA o GGNDL, y un bloque HTP (histidina conservada) .

La lípido aciltransferasa, como se usa en la presente descripción, puede mencionarse como glicerofosfolípido colesterol aciltransferasa . En otras palabras, la lípido aciltransferasa para usar en la presente invención tiene, preferentemente, la capacidad de "hidrolizar" fosfolípidos y, al mismo tiempo, esterificar colesterol con el ácido graso libre de la hidrolización, esto es efectivo en una reacción tranferasa (por ejemplo, una interesterificación y/o una reacción de transesterificación .

El grado de "hidrólisis" se puede describir como la relación de fosfatidilcolina (PC, por sus siglas en inglés) y/o fosfatidiletanolamina (PE, por sus siglas en inglés) convertida en liso-PC o liso-PE, respectivamente. Mediante la hidrolización enzimática de PC en liso-PC, se afecta la relación entre la parte hidrofílica de las moléculas de fosfolípido (grupo de cabezas polares) y la parte hidrofóbica (cadenas de ácido graso) . Al eliminar un ácido graso (ácidos grasos saturados y/o insaturados) se reduce la parte hidrofóbica, lo que hace que la molécula completa sea más hidrofílica. Además, se puede cambiar la configuración molecular estérica, lo que puede afectar las estructuras de fase (por ejemplo, micelación) formadas por las moléculas en dispersión, así como las interacciones con otras moléculas similares, por ejemplo, proteínas de la leche.

Los productos de liso-lecitina son conocidos por tener propiedades de emulsificacion mejoradas. Con un grado alto de interesterificación y/o transesterificación es posible obtener tamaños promedio menores de gotitas de aceite en una prueba de emulsificación comparativa.

Fosfatidilcolina Colesterol + lípido aciltransferasa U enzima Lisofosfatidilcolina éster de colesterol La función de la lipido aciltransferasa consiste en cambiar el colesterol y los fosfolípidos en ésteres de colesterol y liso-fosfolípidos para proporcionar dos componentes resultantes con propiedades activas en superficie en relación a las emulsiones 0/W. Por lo tanto, los productos finales no contienen colesterol o contienen una cantidad significativamente reducida y tienen una estabilidad de emulsión mejorada.

Preferentemente, la enzima de conformidad con la presente invención no es una enzima fosfolipasa, tal como una fosfolipasa Al clasificada como E.C. 3.1.1.32 o una fosfolipasa A2 clasificada como E.C. 3.1.1.4.

Variante de la lipido aciltransferasa En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica una lipido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede codificar una lipido aciltransferasa que es una variante de la lipido aciltransferasa .

Es posible usar variantes con una actividad aumentada en los fosfolípidos, tal como una actividad hidrolítica aumentada y/o una actividad transferasa aumentada, preferentemente, una actividad transferasa aumentada en fosfolípidos .

Preferentemente, la variante de la lipido aciltransferasa se prepara mediante una o más modificaciones de aminoácidos -de las lípido aciltransferasas , tal como se describió anteriormente.

En consecuencia, la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una lípido aciltransferasa que puede ser una variante de la lípido aciltransferasa, en cuyo caso, la enzima puede caracterizarse porque la enzima comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S, y en donde la variante de la enzima comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con una secuencia genitora en uno o más de los residuos de aminoácidos definidos en el grupo 2, grupo 4, grupo 6 o grupo 7 (tal como se define en la patente núm. WO 2005/066347 y a continuación) .

Por ejemplo, la variante de la lípido aciltransferasa puede caracterizarse porque la enzima comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S, y en donde la variante de la enzima comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con una secuencia genitora en cualquiera de los residuos de aminoácidos detallados en el grupo 2, grupo 4, grupo 6 o grupo 7 (tal como se define en la patente núm. WO 2005/066347 y a continuación) identificados por la secuencia genitora estructuralmente alineada con el modelo estructural de P10480 definido en la presente descripción, que se obtiene, preferentemente, por alineamiento estructural de las coordenadas de la estructura cristalina de P10480 con IIVN.PDB y/o IDEO.PDB, tal como se define en la patente núm. O 2005/066347 y a continuación.

En una modalidad adicional, una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede ser una variante de la lípido aciltransferasa que puede caracterizarse porque la enzima comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S, y en donde la variante de la enzima comprende una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con una secuencia genitora en uno o más de los residuos de aminoácidos enseñados en el grupo 2 identificados cuando la secuencia genitora se alinea a la secuencia consenso de pfam (sec. con núm. de ident . 2 -Figura 3) y se modifica de conformidad con un modelo estructural de P10480 para asegurar la mejor superposición de ajuste, tal como se define en la patente núm. WO 2005/066347 y a continuación.

En consecuencia, una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede ser una variante de la enzima lípido aciltransferasa que puede comprender una secuencia de aminoácidos cuya secuencia de aminoácidos se muestra como sec . con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 3, sec. con núm. de ident . 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident. 10, sec. con núm. de ident. 11, sec. con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14, sec. con núm. de ident. 1, sec. con núm. de ident. 15, sec. con núm. de ident. 25, sec. con núm. de ident. 26, sec. con núm. de ident. 27, sec. con núm. de ident. 28, sec. con núm. de ident. 29, sec. con núm. de ident. 30, sec. con núm. de ident. 32, sec. con núm. de ident. 33 o sec. con núm. de ident. 35, excepto por una o más modificaciones de aminoácidos en uno o más de los residuos de aminoácidos definidos en el grupo 2, grupo 4, grupo 6 o grupo 7 (tal como se define en la patente núm. WO 2005/066347 y a continuación) identificados por alineamiento de secuencias con la sec. con núm. de ident. 34.

Alternativamente, la lípido aciltransferasa puede ser una variante de la enzima lípido aciltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos, cuya secuencia de aminoácidos se muestra como sec. con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 3, sec. con núm. de ident. 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident . 10, sec . con núm. de ident . 11, sec. con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14, sec. con núm. de ident. 1, sec. con núm. de ident. 15, sec. con núm. de ident. 25, sec. con núm. de ident. 26, sec. con núm. de ident. 27, sec. con núm. de ident. 28, sec. con núm. de ident. 29, sec. con núm. de ident. 30, sec. con núm. de ident. 32, sec. con núm. de ident. 33 o sec. con núm. de ident. 35, excepto por una o más modificaciones de aminoácidos en uno o más de los residuos de aminoácidos definidos en el grupo 2, grupo 4, grupo 6 o grupo 7, tal como se define en la patente núm. WO 2005/066347 y a continuación, identificados por la secuencia genitora que se alinea estructuralmente con el modelo estructural de P10480 definido en la presente descripción, que se obtiene, preferentemente, por alineamiento estructural de las coordenadas de la estructura cristalina de P10480 con 1IVN.PDB y/o 1DEO.PDB, tal como se enseña en la patente núm. WO 2005/066347 y a continuación.

Alternati amente, la lípido aciltransferasa puede ser una variante de la enzima lípido aciltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos cuya secuencia de aminoácidos se muestra como sec. con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 3, sec. con núm. de ident. 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident . 10, sec . con núm. de ident . 11, sec . con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14, sec. con núm. de ident. 1, sec. con núm. de ident. 15, sec. con núm. de ident. 25, sec. con núm. de ident. 26, sec. con núm. de ident. 27, sec. con núm. de ident. 28, sec. con núm. de ident. 29, sec. con núm. de ident. 30, sec. con núm. de ident. 32, sec. con núm. de ident. 33 o sec. con núm. de ident. 35, excepto por una o más modificaciones de aminoácidos en uno o más de los residuos de aminoácidos que se enseñan en el grupo 2 identificados cuando la secuencia genitora se alinea a la secuencia consenso de pfam (sec. con núm. de ident. 2) y modificados de conformidad con un modelo estructural de P10480 para asegurar la mejor superposición de ajuste, tal como se enseña en la patente núm. WO 2005/066347 y a continuación.

Preferentemente, la enzima genitora es una enzima que comprende, o es homologa a, la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 34 y/o sec. con núm. de ident. 15 y/o sec. con núm. de ident. 35.

Preferentemente, la lípido aciltransferasa puede ser una variante de la enzima que comprende una secuencia de aminoácidos cuya secuencia de aminoácidos se muestra como sec. con núm. de ident. 34 o sec. con núm. de ident. 35, excepto por una o más modificaciones de aminoácidos en uno o más de los residuos de aminoácidos definidos en el grupo 2, grupo 4, grupo 6 o grupo 7, tal como se define en la patente núm. WO 2005/066347 y a continuación.

Otras variantes adecuadas de lípido aciltransferasas para usar en los métodos/usos de la presente invención son las descritas en la patente del PCT núm. PCT/IB2009/054535.

La estructura terciaria de las lípido aciltransferasas ha revelado una estructura inusual e interesante que permite que las lípido aciltransferasas se modifiquen con mayor éxito. Particularmente, la estructura terciaria de la lípido aciltransferasa ha revelado una estructura de cueva y cañón; los residuos que forman estas estructuras se definen a continuación en la presente descripción.

Las alteraciones en la región de cueva pueden (por ejemplo) alterar la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de la enzima, por ejemplo.

Se ha descubierto que las alteraciones en el cañón (particularmente, algunas modificaciones clave preferidas) son importantes para, por ejemplo, mejorar o cambiar la especificidad del sustrato de la enzima.

Particularmente, los inventores actuales han descubierto que existen varias modificaciones en el cañón que destacan mucho y producen variantes interesantes con propiedades mejoradas; estas se pueden encontrar en las posiciones 31, 27, 85, 86, 119 y 120. En algunas modalidades las posiciones 31 y/o 27 tienen mayor preferencia.

Estas variantes de la enzima lípido aciltransferasa pueden estar codificadas por una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 90% de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa genitora y comprende por lo menos una modificación (adecuadamente, por lo menos dos modificaciones) en una posición o posiciones que corresponden en la secuencia de aminoácidos codificada a un aminoácido o aminoácidos ubicados en a) la región de cañón de la enzima y/o b) el sitio de inserción 1 y/o c) el sitio de inserción 2, en donde la región de cañón, el sitio de inserción 1 y/o el sitio de inserción 2 de la enzima se definen como la región que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la región de cañón, sitio de inserción 1 o sitio de inserción 2 de la enzima que se muestra en la presente descripción como sec . con núm. de ident. 16 o sec. con núm. de ident . 68, tal como se describe en la presente descripción a continuación.

En una modalidad, preferentemente, la modificación o modificaciones en una posición ubicada en el cañón y/o sitio de inserción 1 y/o sitio de inserción 2 se combinan con por lo menos una modificación en una posición que corresponde en la secuencia de aminoácidos codificada a un aminoácido ubicado fuera de la región de cañón y/o sitio de inserción 1 y/o sitio de inserción 2.

En una modalidad, la lípido aciltransferasa comprende por lo menos una modificación (adecuadamente, por lo menos dos modificaciones) en una posición o posiciones que corresponden en la secuencia de aminoácidos codificada a un aminoácido o aminoácidos ubicados en la posición 27, 31, 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 232, 235 y/o 236 (preferentemente, en la posición 27, 31, 85, 86, 119 y/o 120, con mayor preferencia, en la posición 27 y/o 31) , en donde la numeración de la posición se define como aquella posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec . con núm. de ident . 16.

En una modalidad adicional, la variante de la lípido aciltransferasa comprende por lo menos una modificación en una posición o posiciones que corresponde en la secuencia de aminoácidos codificada a un aminoácido o aminoácidos en la posición 27 y/o 31 en combinación con por lo menos una combinación adicional, en donde la numeración de la posición se define como la posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16.

En consecuencia, la por lo menos única combinación adicional puede estar en una o más de las siguientes posiciones 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 23, 81, 82, 289, 227, 229, 233, 33, 207, 130, en donde la numeración de la posición se define como esa posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec . con núm. de ident . 16.

La secuencia de aminoácidos de la lípido aciltransferasa para usar en la presente invención puede comprender una cadena principal modificada de manera que haya por lo menos una modificación (adecuadamente, por lo menos dos modificaciones) en una posición o posiciones que corresponden en la secuencia de aminoácidos codificada a un aminoácido o aminoácidos en a) la región de cañón de la enzima y/o b) el sitio de inserción 1 y/o c) el sitio de inserción 2, en donde la región de cañón, el sitio de inserción 1 y/o el sitio de inserción 2 de la enzima se define como aquella región que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la región de cañón, el sitio de inserción 1 o el sitio de inserción 2, respectivamente, de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16 o la sec. con núm. de ident. 68.

En una modalidad la modificación o modificaciones en una posición ubicada en el cañón y/o sitio de inserción 1 y/o sitio de inserción 2 se combina, preferentemente, con por lo menos una modificación en una posición que corresponde en la secuencia de aminoácidos codificada a un aminoácido ubicado fuera de la región de cañón y/o sitio de inserción 1 y/o sitio de inserción 2.

Preferentemente, la cadena principal de la secuencia de aminoácidos de la lípido aciltransferasa se modifica de manera que haya por lo menos una modificación (adecuadamente, por lo menos dos modificaciones) en una posición o posiciones que corresponde en la secuencia de aminoácidos codificada a un aminoácido o aminoácidos ubicados en la posición 27, 31, 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, . 232, 235 y/o 236 (preferentemente, en la posición 27, 31, 85, 86 119 y/o 120, con mayor preferencia, en la posición 27 y/o 31) , en donde la numeración de la posición se define como aquella posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16.

En otras modalidades preferidas la cadena principal de la secuencia de aminoácidos de la lípido aciltransferasa comprende por lo menos una modificación (adecuadamente, por lo menos dos modificaciones) en una posición o posiciones que corresponde en la secuencia de aminoácidos codificada a un aminoácido o aminoácidos ubicados en la posición 27, 31 en combinación con por lo menos una combinación adicional, en donde la numeración de la posición se define como aquella posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec . con núm. de ident . 16.

En consecuencia, la por lo menos única combinación adicional puede estar en una o más de las siguientes posiciones 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 23, 81, 82, 289, 227, 229, 233, 33, 207, 130, en donde la numeración de la posición se define como aquella posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16.

Se proporciona, además, una lipido aciltransferasa alterada o variante para usar en la presente invención que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica a la lipido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16 o 68, en donde un segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato que se encuentra inmediatamente en posición N-terminal del residuo Asp de la triada catalítica de la lipido aciltransferasa alterada tiene una longitud alterada con relación a la lipido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16 o 68.

Preferentemente, la alteración comprende una inserción o deleción de aminoácidos en el segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato, tal como la sustitución del segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de la enzima genitora con el segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de una lípido aciltransferasa distinta para producir la lípido aciltransferasa alterada. Preferentemente, la alteración incrementa la longitud de la cadena de acilo que puede transferir la lípido aciltransferasa .

Preferentemente, la lípido aciltransferasa alterada comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident . 16 o 68.

La secuencia de nucleótidos que codifica la variante de la enzima lípido aciltransferasa antes de la modificación es una secuencia de nucleótidos que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 120, sec. con núm. de ident. 49, sec. con núm. de ident. 50, sec. con núm. de ident. 51, sec. con núm. de ident. 62, sec. con núm. de ident. 63 o sec. con núm. de ident. 24; o es una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de identidad (preferentemente, por lo menos 80%, con mayor preferencia, por lo menos 90%, aún con mayor preferencia, por lo menos 95% de identidad) con una secuencia de nucleótidos que se muestra en la presente descripción como la sec . con núm. de ident . 120, sec. con núm. de ident. 49, sec. con núm. de ident. 50, sec. con núm. de ident. 51, sec. con núm. de ident. 62, sec. con núm. de ident. 63 o sec. con núm. de ident. 24; o es una secuencia de nucleótidos que se relaciona con la sec. con núm. de ident. 120, sec. con núm. de ident. 49, sec. con núm. de ident. 50, sec. con núm. de ident. 51, sec. con núm. de ident. 62, sec. con núm. de ident. 63, sec. con núm. de ident. 24 por la degeneración del código genético; o es una secuencia de nucleótidos que se hibridiza en condiciones de rigurosidad media o alta a una secuencia de nucleótidos que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 120, sec. con núm. de ident. 49, sec. con núm. de ident. 50, sec. con núm. de ident. 51, sec. con núm. de ident. 62, sec. con núm. de ident. 63 o sec. con núm. de ident. 24.

En una modalidad preferida, la variante de la lípido aciltransferasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico (preferentemente, de ácido nucleico aislado o recombinante) que se hibridiza en condiciones de rigurosidad media o alta con prácticamente la longitud total de la sec. con núm. de ident. 49 o sec. con núm. de ident. 120 o un complemento de la sec. con núm. de ident. 49 o sec. con núm. de ident. 120, en donde el polipéptido codificado que comprende uno o más residuos de aminoácidos seleccionados de Q, H, N, T, F, Y o C en la posición 31; R, Y, S, V, I, A, T, , F, C o L en la posición 86; R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S o F en la posición 27; H, R, D, E 85; T o I en la posición 119; K o E en la posición 120; S, L, A, F, , Y, R, H, M o C en la posición 122; R en la posición 201; S como la posición 245; A o V en la posición 235; G o S en la posición 232; G o E en la posición 236, en donde las posiciones son posiciones de aminoácidos equivalentes con respecto a la sec. con núm. de ident . 16.

La variante de la lípido aciltransferasa puede comprender un propéptido o un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa y comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% (preferentemente, por lo menos 95%, con mayor preferencia, por lo menos 98%, con mayor preferencia, por lo menos 99%) idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 16 o 68 y comprende una o más modificaciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 31, 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 232, 235 y/o 236 (preferentemente, en la posición 27, 31, 85, 86, 119 y/o 120, con mayor preferencia, en la posición 27 y/o 31) .

En una modalidad la variante comprende un propéptido o un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa y comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident . 16 o 68, excepto por una o más modificaciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 31, 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 232, 235 y/o 236 (preferentemente, en la posición 27, 31, 85, 86, 119 y/o 120, con mayor preferencia, en la posición 27 y/o 31) .

En otra modalidad la lípido aciltransferasa comprende un propéptido o un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa y comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% (preferentemente, por lo menos 95%, con mayor preferencia, por lo menos 98%, con mayor preferencia, por lo menos 99%) idéntica con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 16 o 68 y comprende una o más modificaciones en las posiciones 27 y/o 31 en combinación con por lo menos una combinación adicional, en donde la numeración de la posición se define como aquella posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 6.

En consecuencia, la por lo menos única combinación adicional puede estar en una o más de las siguientes posiciones 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 23, 81, 82, 289, 227, 229, 233, 33, 207, 130, en donde la numeración de la posición se define como esa posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident . 16.

En una modalidad preferida, la lípido aciltransferasa comprende un propéptido o un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa y comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 16 o 68, excepto por una o más modificaciones en una o más de las siguientes posiciones: 27 y/o 31 en combinación con por lo menos una combinación adicional.

En consecuencia, la por lo menos única combinación adicional puede estar en una o más de las siguientes posiciones 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 23, 81, 82, 289, 227, 229, 233, 33, 207 y/o 130, en donde la numeración de la posición se define como aquella posición que cuando se alinea en base a la estructura primaria o terciaria corresponde a la misma posición de la enzima que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16.

La lípido aciltransferasa puede ser un propéptido que experimenta una modificación postraslacional adicional a un péptido maduro, por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa . En forma de ejemplo únicamente, la sec. con núm. de ident. 68 es la misma que la sec. con núm. de ident. 16, excepto que la sec. con núm. de ident. 68 ha experimentado una modificación postraslacional y/o postranscripcional para eliminar algunos aminoácidos, más específicamente, 38 aminoácidos. Por lo tanto, el polipéptido que se muestra en la presente descripción como la sec . con núm. de ident . 16 se podría considerar en algunas circunstancias (por ejemplo, en algunas células huésped) como un propéptido, que se procesa adicionalmente en un péptido maduro por modificación postraslacional y/o postranscripcional . Estas modificaciones precisas, por ejemplo, sitio o sitios de clivaje, con respecto a la modificación postraslacional y/o postranscripcional pueden variar ligeramente según las especies huésped. En algunas especies huésped puede que no haya modificación postraslacional y/o postranscripcional; por lo tanto, el propéptido sería equivalente al péptido maduro (por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa) . Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, el sitio o sitios de clivaje se pueden cambiar por algunos residuos (por ejemplo, 1, 2 o 3 residuos) en cualquier dirección en comparación con el sitio de clivaje que se muestra como referencia para la sec. con núm. de ident. 68 en comparación con la sec. con núm. de ident. 16. En otras palabras, en vez del clivaje en la posición 235-ATR hasta la posición 273 (RRSAS) , por ejemplo, el clivaje puede comenzar en el residuo 232, 233, 234, 235, 236, 237 o 238, por ejemplo. Adicional o alternativamente, el clivaje puede terminar en el residuo 270, 271, 272, 273, 274, 275 o 276, por ejemplo. Adicional o alternativamente, el clivaje puede producir la eliminación de aproximadamente 38 aminoácidos, en algunas modalidades, el clivaje puede producir la eliminación de 30 a 45 residuos, tal como 34 a 42 residuos, tal como 36 a 40 residuos, preferentemente, 38 residuos.

En algunas modalidades, para establecer la homología a la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una lípido aciltransferasa se compara directamente a la enzima lípido aciltransferasa que se muestra en la presente descripción como la secuencia primaria de la sec . con núm. de ident. 16 o 68 y, particularmente, a un grupo de residuos conocidos por ser invariables en todas o la mayoría de lípido aciltransferasas de las que se conoce las secuencias. Después de alinear los residuos conservados para permitir las inserciones y deleciones necesarias para mantener el alineamiento (por ejemplo, para evitar la eliminación de residuos conservados a través de deleción e inserción arbitrarias) , se define los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la sec. con núm. de ident. 16 o 68. En modalidades preferidas el alineamiento de los residuos conservados conserva el 100% de los residuos. Sin embargo, el alineamiento de más del 75% o tan poco como el 50% de los residuos conservados es adecuado, además, para definir los residuos equivalentes. En modalidades preferidas se mantiene la conservación de los residuos catalíticos de serina e histidina. Los residuos conservados se usan para definir los residuos de aminoácidos equivalentes correspondientes de la lípido aciltransferasa que se muestra en la sec. con núm. de ident . 16 o 68 en otras lípido aciltransferasas , tales como de otras especies de Aeromonas, así como cualquier otro organismo.

Para alinear una lípido aciltransferasa genitora con la sec. con núm. de ident. 16 o la sec. con núm. de ident. 68 (la secuencia de referencia) , se puede usar el alineamiento de secuencias, tal como el alineamiento en pares (http : //www . ebi . ac . uk/emboss/align/índex . html ) . De ese modo, es posible determinar y modificar los aminoácidos equivalentes en los polipéptidos alternos de la lípido aciltransferasa genitora que corresponden a uno o más de los aminoácidos definidos con referencia a la sec. con núm. de ident. 68 o la sec. con núm. de ident. 16. Como lo apreciará fácilmente un experto en la técnica, cuando se usa el alineamiento de pares EMBOSS, usualmente, son suficientes las configuraciones estándar. Los residuos correspondientes se pueden identificar con el uso de "aguja" para llevar a cabo un alineamiento que cubre la longitud total de ambas secuencias. Sin embargo, es posible, además, encontrar la mejor región de similitud entre dos secuencias con el uso de "agua" .

Alternativamente, particularmente, en casos en donde la lípido aciltransferasa genitora comparte una homología baja de la secuencia primaria con la sec. con núm. de ident . 16 o la sec. con núm. de ident. 68, los aminoácidos correspondientes en la lípido aciltransferasa genitora alterna que corresponden a uno o más aminoácidos definidos con referencia a la sec. con núm. de ident. 16 o la sec. con núm. de ident. 68 se pueden determinar por alineamiento estructural al modelo estructural de la sec. con núm. de ident. 68 o la sec. con núm. de ident. 16, preferentemente, de la sec. con núm. de ident. 68.

Por lo tanto, los residuos equivalentes pueden definirse al determinar la homología al nivel de estructura terciaria para una lípido aciltransferasa cuya estructura terciaria se ha determinado por cristalografía de rayos X. En este contexto, los "residuos equivalentes" se definen como aquellos para los que las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácidos principal de la lípido aciltransferasa que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16 o 68 (N en N, CA en CA, C en C y 0 en 0) se encuentran dentro de 0.13 nm y, preferentemente, de 0.1 nm después del alineamiento. El alineamiento se logra después de orientar y posicionar el mejor modelo para producir la máxima superposición de las coordenadas atómicas de átomos de proteína que no son de hidrógeno de la lípido aciltransferasa en cuestión con la lípido aciltransferasa que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident . 16 o 68. Como se sabe en la técnica, el mejor modelo es el modelo cristalográfico que proporciona el factor R más bajo para los datos de difracción experimental a la resolución más alta disponible. Los residuos equivalentes funcional y/o estructuralmente análogos a un residuo específico de la lípido aciltransferasa, como se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16 o 68, se definen como aquellos aminoácidos de la lípido aciltransferasa que adoptan, preferentemente, una conformación tal de manera que alteran, modifican o modulan la estructura proteica para efectuar cambios en la especificación del sustrato, por ejemplo, la fijación y/o catálisis del sustrato en un manera definida y atribuida a un residuo específico de la lípido aciltransferasa que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 16 o 68. Además, son aquellos residuos de la lípido aciltransferasa (en casos en los que la estructura terciaria se ha obtenido por cristalografía de rayos X) los que ocupan una posición análoga hasta el punto en que aunque los átomos de la cadena principal del residuo específico pueden no satisfacer los criterios de equivalencia basándose en ocupar una posición homologa, las coordenadas atómicas de por lo menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo se encuentran con 0.13 nm de los átomos de la cadena lateral correspondientes de la lípido aciltransferasa que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident . 16 o 68.

Las coordenadas de la estructura tridimensional de la lípido aciltransferasa que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 68 (que es una lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida que comprende una mutación de N80D) se describen en la patente del PCT núm. PCT/IB2009/054535 y son útiles para determinar los residuos equivalentes en el nivel de estructura terciaria.

Hay una gran inserción en la aciltransferasa de Aeromonas salmonicida entre la última cadena beta y el motivo ASP-X-X_HIS en comparación con la tioesterasa de E. coli estructuralmente similar. Esta inserción crea una gran cavidad (de aquí en adelante mencionada como "cueva" que une la cadena alifática del intermedio de la enzima acilo. La modulación de la secuencia y el tamaño de esta región produce una "cueva" o cavidad más pequeña o más grande para la cadena alifática del intermedio de la enzima acilo, por ejemplo, la cadena de acilo transferida por la enzima. Por lo tanto, las enzimas de esta familia se pueden modificar para transferir, preferentemente, cadenas de acilo de distintas longitudes.

En la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida hay cuatro inserciones con relación a la tioesterasa de E. coli (entrada 1IVN PDB) que unen elementos estructurales secundarios comunes en ambas estructuras.

Las coordenadas de aminoácidos de estas inserciones en la lípido aciltransferasa que en la presente descripción se muestra como sec . con núm. de ident . 68 se enumeran en la tabla 1: Tabla 1. Inserciones en lípido aciltransferasa : Tal como se describe en detalle en la patente del PCT núm. PCT/IB2009/054535 en la lípido aciltransferasa , hay una gran superficie para que el sustrato se una que se puede dividir en dos áreas separadas por Ser 16 e His 291, en donde Ser 16 e His 291 junto con Asp288 forman la triada catalítica característica. Estas dos áreas pueden caracterizarse como un canal o "cañón" profundo, de aquí en adelante mencionado como "cañón", dirigido hacia una cavidad o "cueva" que pasa a través de la molécula.

Los residuos que forman el cañón se enumeran en la tabla 2 : Tabla 2. Residuos del cañón: Los residuos que forman la cueva se enumeran en la siguiente tabla 3.

Tabla 3. Residuos de la cueva: Los segmentos 3 y 4 preceden a las inserciones 3 y 4, respectivamente, y el segmento 5 va inmediatamente después de la inserción 4. Las inserciones 4 y 5 contribuyen, además, a la cubierta que forma la cueva; por lo tanto, la cueva difiere del cañón en que las inserciones 1 y 2 forman el revestimiento del cañón, mientras que las inserciones 3 y 4 forman la estructura subyacente. Las inserciones 3 y 4 cubren la cueva .

En una modalidad la lípido aciltransferasa para usar en la presente invención se puede alterar al modificar los residuos de aminoácidos en uno o más del cañón, la cueva, la inserción 1, la inserción 2, la inserción 3 o la inserción 4.

En una modalidad la lípido aciltransferasa para usar en la presente invención se puede alterar al modificar los residuos de aminoácidos en uno o más del cañón, la inserción 1 o la inserción 2.

En una modalidad las dimensiones de la cavidad de unión de la cadena acilo de una lípido aciltransferasa se pueden alterar al realizar cambios en los residuos de aminoácidos que forman la cueva más grande. Esto se puede hacer al modular al tamaño de las regiones que unen las características comunes de la estructura secundaria tal como se mencionó anteriormente. Particularmente, el tamaño de la cueva se puede alterar al cambiar los aminoácidos en la región entre la última (quinta) cadena beta de la enzima y el motivo Asp-X-X-His que forma parte de la triada catalítica.

El segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de una lípido aciltransferasa es una región de aminoácidos contiguos que se encuentra entre la cadena beta ß5 de la enzima y el residuo Asp de la triada catalítica de esa enzima (el residuo Asp es parte del motivo Asp-Xaa-Xaa-His) .

Las estructuras terciarias de la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida y de la tioesterasa de E. coli (depositada en la base de datos Genbank del NCBI como número de registro 1IVN_A; GID : 33357066 ) cada una con una estructura distintiva de tres capas alfa/beta/alfa, en donde las láminas beta están compuestas de cinco cadenas paralelas, permiten determinar los segmentos que determinan la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de cada una de las enzimas lípido aciltransferasas .

El segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de la lípido aciltransferasa de Aeromonas salmonicida se encuentra inmediatamente N-terminal al residuo Asp de la triada catalítica de la enzima. Sin embargo, la longitud del segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato puede variar de acuerdo a la distancia entre el residuo Asp y la cadena beta ß5 de la enzima. Por ejemplo, los segmentos que determinan la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de la lípido aciltransferasa tienen aproximadamente 13 aminoácidos, 19 aminoácidos y aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, respectivamente. Como tal, de acuerdo con la lípido aciltransferasa, la longitud de un segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato puede estar en el intervalo de 10 a 70 aminoácidos, por ejemplo, en el intervalo de 10 a 30 aminoácidos, de 30 a 50 aminoácidos o de 50 a 70 aminoácidos.

La tabla 4 proporciona una secuencia ilustrativa para el segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de la enzima lípido aciltransferasa .

Tabla 4 En ciertas modalidades la secuencia de aminoácidos de un segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato puede o no ser la secuencia de aminoácidos de una enzima silvestre. En ciertas modalidades el segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato puede tener una secuencia de aminoácidos por lo menos 70%, por ejemplo, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95% idéntica al segmento que determina la especificidad de la longitud de la cadena del sustrato de una lípido aciltransferasa silvestre.

En consecuencia, la variante de la enzima se puede preparar con el uso de mutagénesis sitio dirigida.

Las modificaciones preferidas se encuentran en una o más de las siguientes posiciones L031, 1086, M027, V085, A119, Y120, W122, E201, F235, W232, A236 y/o Q245.

Particularmente, las modificaciones clave incluyen una o más de las siguientes modificaciones: L31Q, H, N, T, F, Y o C (preferentemente, L31 Q) ; M27R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S o F (preferentemente, M27V) ; V85H, R, D o E; I86R, Y, S, V, I, A, T, M, F, C o L (preferentemente, I86S o A) ; A119T o I; Y120K o E; W122S, L o A (preferentemente, W122L) ; E201R; Q245S; F235A o V; 232G o S ; y/o A236G o E.

En una modalidad cuando la por lo menos única modificación se lleva a cabo en el cañón, la modificación o modificaciones se llevan a cabo en una o más de las siguientes posiciones: 31, 27, 85, 86, 119, 120.

Particularmente, las modificaciones clave en el cañón incluyen una o más de las siguientes modificaciones: L31Q, H, N, T, F, Y o C (preferentemente, L31 Q) ; M27R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S o F (preferentemente, M27V) ; V85H, R, D o E; I86R, Y, S, V, I, A, T, M, F, C o L (preferentemente, I86S o A) ; A119T o I; Y120K o E, que pueden llevarse a cabo en combinación entre sí y/o en combinación con otra modificación .

En una modalidad, cuando la modificación se lleva a cabo en el sitio de inserción 1, las modificaciones se llevan a cabo, preferentemente, en una o más posiciones 31 y/o 27. En consecuencia, las modificaciones pueden ser L31Q, H, N, T, F, Y o C (preferentemente, L31 Q) y/o M27R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S o F (preferentemente, M27V) .

En una modalidad, cuando la modificación se lleva a cabo en el sitio de inserción 2, las modificaciones se llevan a cabo, preferentemente, en las posiciones 085, 086. En consecuencia, las modificaciones pueden ser V85H, R, D o E y/o I86R, Y, S, V, I, A, T, M, F, C o L .

En una modalidad, cuando la modificación se lleva a cabo en el sitio de inserción 4, las modificaciones se llevan a cabo, preferentemente, en la posición 245. En consecuencia, la modificación puede ser Q245S.

En una modalidad, la modificación se lleva a cabo, preferentemente, en por lo menos el sitio de inserción 1.

En otra modalidad una modificación se lleva a cabo, preferentemente, en por lo menos el sitio de inserción 1 en combinación con otra modificación en el sitio de inserción 2 y/o 4 y/o en una o más de las siguientes posiciones 119, 120, 122, 201, 77, 130, 82, 120, 207, 167, 227, 215, 230, 289.

En una modalidad adicional, una modificación se lleva a cabo, preferentemente, en por lo menos la región de cañón en combinación con otra modificación en el sitio de inserción 4 y/o en una o más de las siguientes posiciones 122, 201, 77, 130, 82, 120, 207, 167, 227, 215, 230, 289.

Se proporcionan las modificaciones preferidas para los sitios particulares: R130R, V, Q, H, A, D, L, I, K, N, C, Y, G, S, F, T o M; K82R, N, H, S, L, E, T, M o G; G121S, R, G, E, K, D, N, V, Q o A; Y74Y o W; Y83 F o P; I77T, M, H, Q, S, C, A, E , L, Y, F, R o V; A207E; Q167T, H, I, G, L o M; D227L, C, S, E, F, V, I, T, Y, P, G, R, D, H o A; N215G; Y230A, G, V, R, I, T, S, N, H, E , D, Q, K; o N289P.

En combinación con una o más modificaciones en las posiciones 31, 27, 85, 86, 119, 120, 122, 201, 245, 235, 232, y/o 236 (por ejemplo, la modificación puede ser una o más de las siguientes: L31Q, H, N, T, F, Y o C (preferentemente, L31 Q) ; M27R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S o F (preferentemente, M27V) ; V85H, R, D o E; I86R, Y, S, V, I, A, T, M, F, C o L (preferentemente, I86S o A) ; A119T o I; Y120K o E ; W122S, L o A (preferentemente, W122L) ; E201R; Q245S; F235A o V; 232G O S; y/o A236G O E) ; en consecuencia, la variante de la lípido aciltransferasa se puede modificar adicionalmente en una o más de las siguientes posiciones 130, 82, 121, 74, 83, 77, 207, 167, 227, 215, 230, 289 (por ejemplo, la modificación adicional puede ser una o más de las siguientes: R130R, V, Q, H, A, D, L, I, K, N, C, Y, G, S, F, T o M; K82R, N, H, S, L , E, T, M o G; G121S, R, G, E, K, D, N, V, Q o A; Y74Y O ; Y83 F o P ; I77T, M, H , Q, S, C, A, E, L, Y, F , R o V; A207E; Q167T, H, I, G, L o M; D227L, C, S, E, F, V, I, T, Y, P, G, R, D , H o A; N215G; Y230A, G, V, R, I, T, S, N, H, E, D, Q, K y/o N289P) , preferentemente, la variante de la lípido aciltransferasa se puede modificar adicionalmente en por lo menos una o más de las siguientes posiciones: 130, 82, 77 o 227.

Para evitar dudas, la cadena principal de la lípido aciltransferasa cuando se alinea (en base a una estructura primaria o terciaria) con la enzima lípido aciltransferasa que se muestra en la presente descripción como la sec . con núm. de ident. 16 tiene, preferentemente, D en la posición 80. Por lo tanto, hemos mostrado N80D como una modificación en varias de las combinaciones enseñadas en la presente descripción. Si N80D no se menciona como una modificación adecuada y la cadena principal genitora no comprende D en la posición 80, entonces se debe incorporar una modificación adicional de N80D en la variante de la lípido aciltransferasa para asegurar que la variante comprende D en la posición 80.

Cuando la cadena principal o lípido aciltransferasa genitora ya contiene la modificación N80D, . las otras modificaciones se pueden expresar sin mencionar la modificación N80D, por ejemplo, L31Q, N80D, W122L se podrían expresar como L31Q, W122L, por ejemplo.

Sin embargo, es importante notar que la modificación N80D es una modificación preferida y se usa, preferentemente, una enzima de la cadena principal o enzima genitora que ya tiene el aminoácido D en la posición 80. Sin embargo, si se usa una cadena principal que no contiene el aminoácido D en posición (tal como una más de las lípido aciltransferasas que se muestran como sec . con núm. de ident . 1, 3, 4, 15, 34 o 35, por ejemplo), entonces, se incluye, preferentemente, una modificación adicional de N80D.

En consecuencia, la sustitución en la posición 31 identificada por alineamiento de la secuencia genitora con la sec. con núm. de ident. 68 o sec. con núm. de ident. 16 puede ser una sustitución para un residuo de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: Q, H, Y y F, preferentemente, Q.

En consecuencia, la variante del polipéptido comprende una o más modificaciones adicionales en cualquier posición o posiciones de residuos de aminoácidos: 27, 77, 80, 82, 85, 85, 86, 121, 122, 130, 167, 207, 227, 230 y 289, cuya posición se identifica por alineamiento de la secuencia genitora con la sec. con núm. de ident. 68. En consecuencia, por lo menos una de las modificaciones adicionales puede encontrarse en la posición de residuos de aminoácidos: 86, 122 o 130, cuya posición se identifica por alineamiento de la secuencia genitora con la sec. con núm. de iden . 68.

En consecuencia, la variante de la lípido aciltransferasa comprende una o más de las siguientes sustituciones adicionales: 186 (A, C, F, L, M, S, T, V, R, I o Y) ; W122 (S, A, F, W, C, H, L, M, R o Y) ; R130 A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, Q, T, V, R, F o Y) o cualquier combinación de éstas.

La variante de la lípido aciltransferasa puede comprender una de las siguientes combinaciones de modificaciones (en donde la cadena principal genitora ya comprende el aminoácido D en la posición 80, la modificación se puede expresar sin mencionar N80D) : L31Q, N80D, I86S, W122F L31Q, N80D, W122L L31Q, N80D, I86V, W122L L31Q, N80D, 1861, W122L L31Q, N80D, I86S, R130R L31Q, N80D, K82R, I86A L31Q, N80D, I86S, W122W L31Q, N80D, I86S, W122Y M27V, L31Q, N80D L31Q, N80D, I86A, W122L L31Q, N80D, W122L L31Q, N80D, I86S, G121S L31Q, N80D, I86S L31Q, N80D, K82R, I86S L31Q, N80D, I86S, W122L, R130Y L31Q, N80D, I86S, W122L, R130V L31Q, N80D, I86S L31Q, N80D, I86T, W122L L31Q, N80D, I86S, 122L L31Q, N80D, W122L, R130Q L31Q, N80D, I86S, W122L, R130R L31Q, N80D, I86S L31Q, N80D, G121R L31Q, N80D, I86A M27C, L31Q, N80D M27Q, L31Q, N80D L31Q, N80D, G121S L31Q, N80D, I86S, 122R L31Q, N80D, R130Q L31Q, N80D, I86S, W122H L31Q, N80D, I86M, 122L 25 L31Q, N80D, I86S, W122L L31Q, N80D, K82N L31Q, N80D, I86S, W122M L31Q, N80D, W122L L31Q, N80D, K82H L31Q, N80D, R130H L31Q, N80D, R130A L31Q, N80D, G121S L31Q, N80D, I86S, W122L, L31Q, N80D, I86M L31Q, Y74Y, N80D L31Q, N80D, R130L L31Q, N80D, Y83F L31Q, N80D, K82S L31Q, I77T, N80D L31Q, N80D, I86S, W122L, L31Q, N80D, I86S, W122L L31Q, N80D, I86F, W122L M27N, L31Q, N80D L31Q, N80D, Y83P L31Q, N80D, R130K L31Q, N80D, K82R, I86S, W122L L31Q, N80D, K82L L31Q, N80D, I86S, G121G L31Q, N80D, I86A, R130Q M27H, L31Q, N80D L31Q, N80D, 122L, A207E L31Q, N80D, W122L, R130L 5 L31Q, N80D, K82E L31Q, N80D, G121E L31Q, N80D, W122L, R130R L31Q, I77M, N80D L31Q, N80D, K82T 10 L31Q, N80D, 122L L31Q, N80D, W122H L31Q, N80D, Q167T L31Q, I77H, N80D L31Q, N80D, G121K 15 L31Q, I77Q, N80D L31Q, N80D, W122L, R130N L31Q, N80D, W122L L31Q, N80D, G121D L31Q, N80D, R130T 20 L31Q, N80D, R130T L31Q, N80D, K82M L31Q, N80D, Q167H L31Q, N80D, I86T L31Q, N80D, Q167I 25 L31Q, N80D, I86C L31Q, N80D, Q167G M27L, L31Q, N80D L31Q, N80D, I86S, G121R 5 L31Q, I77S, N80D L31Q, I77C, N80D L31Q, N80D, G121N L31Q, I77A, N80D L31Q, N80D, R130M 10 L31Q, N80D, W122F M27G, L31Q, N80D L31Q, N80D, K82G L31Q, N80D, I86S, W122L, R130K L31Q, N80D, R130A 15 L31Q, N80D, 1861 L31Q, I77E, N80D L31Q, N80D, D227L L31Q, N80D, V85H, N215G L31Q, N80D, I86A, W122L, R130N 20 L31Q, I77R, N80D L31Q, N80D, I86F L31Q, N80D, I86Y, W122L M27K, L31Q, N80D L31Q, N80D, D227C 25 L31Q, N80D, R130L L31Q, N80D, I86C, 122L L31Q, N80D, Q167L L31Q, N80D, V85H L31Q, N80D, Q167M M27D, L31Q, N80D L31Q, N80D, I86L L31Q, N80D, Y230A L31Q, N80D, W122R L31Q, N80D, Y230G L31Q, N80D, D227S L31Q, N80D, W122L, A207E, N289P L31Q, N80D, W122Y L31Q, N80D, I86L, W122L L31Q, N80D, K82R, I86S, G121S, R130Q L31Q, Y74W, N80D L31Q, N80D, R130F L31Q, N80D, G121V L31Q, N80D, 122L, R130M L31Q, N80D, R130V L31Q, N80D, Y230V L31Q, N80D, N215G L31Q, N80D, I86S, W122L, R130N L31Q, N80D, Y230R M27E, L31Q, N80D L31Q, N80D, Y230I L31Q, N80D, I86S, W122L, R130S L31Q, N80D, K82R L31Q, N80D, D227E L31Q, N80D, K82R, I86A, G121S L31Q, N80D, R130G L31Q, I77V, N80D L31Q, N80D, G121G L31Q, N80D, Y230T L31Q, N80D, K82R, I86S, R130N L31Q, N80D, D227F L3 1Q, N80D, I86A, G121R L3 1Q, N80D, I86S, R130N L31Q, N80D, W122C L31Q, N80D, Y230S L31Q, N80D, R130Y L31Q, N80D, R130C L31Q, I77L, N80D A119T, N80D A199A, N80D G67A, N80D, V85H en donde las posiciones se identifican por alineamiento de la secuencia genitora con la sec . con núm. de ident . 68 o sec. con núm. de ident . 16.

En consecuencia, la variante de la lípido aciltransferasa puede ser idéntica a la lípido aciltransferasa genitora, excepto por una modificación en la posición 31 y, opcionalmente , una o más modificaciones adicionales en cualquier posición o posiciones de residuos de aminoácidos: 27, 77, 80, 82, 85, 85, 86, 121, 122, 130, 167, 207, 227, 230 y 289, cuya posición se identifica por alineamiento de la secuencia genitora con la sec. con núm. de ident. 68 o sec. con núm. de ident. 16.

En consecuencia, la variante de la lípido aciltransferasa puede ser idéntica a la lípido aciltransferasa genitora, excepto por una modificación en la posición 31 y, opcionalmente, una o más modificaciones adicionales en cualquier posición o posiciones de residuos de aminoácidos: 86, 122 o 130, cuya posición se identifica por alineamiento de la secuencia genitora con la sec. con núm. de ident. 68 o sec. con núm. de ident. 16.

En una modalidad, en donde la secuencia genitora es la sec. con núm. de ident. 16 o la sec. con núm. de ident. 68, o en donde la secuencia genitora está codificada por la sec. con núm. de ident. 49 o la sec. con núm. de ident. 120, la variante del polipéptido tiene cualquiera de las modificaciones tal como se detalló anteriormente, excepto por una modificación en la posición 80. En este sentido, la sec. con núm. de ident . 16, sec. con núm. de ident. 68 o un polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident. 49 o la sec. con núm. de ident. 120 ya tendrá ácido aspártico en la posición 80, cuando las posiciones se identifican por alineamiento de la secuencia genitora con la sec. con núm. de ident. 16.

En consecuencia, la variante de la lípido aciltransferasa o la variante de la lípido aciltransferasa obtenible por un método de conformidad con la presente invención puede tener por lo menos 75% de identidad con la lípido aciltransferasa genitora; en consecuencia, la variante de la lípido aciltransferasa puede tener por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% de identidad con la lípido aciltransferasa genitora.

La presente invención se relaciona, además, con una variante de polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa, en donde la variante comprende una modificación en por lo menos la posición 31 en comparación con una lípido aciltransferasa genitora, en donde la posición 31 se identifica por alineamiento con la sec. con núm. de ident. 68 o la sec. con núm. de ident. 16.

En una modalidad, la variante de la lípido aciltransferasa tiene, preferentemente, las siguientes modificaciones y/o las siguientes modificaciones se llevan a cabo en los métodos de la presente invención: • L31Q, N80D, 122L (que se puede expresar como L31Q, W122L, en donde la enzima de la cadena principal ya tiene D en la posición 80) ; • M27V, L31Q, N80D (que se puede expresar como N27V, L31Q, en donde la enzima de la cadena principal ya tiene D en la posición 80) ; • L31Q, N80D, K82R, I86A (que se puede expresar como L31Q, K82R, I86A, en donde la enzima de la cadena principal ya tiene D en la posición 80) y/o • L31Q, N80D, I86S, W122F (que se puede expresar como L31Q, I86S, W122F, en donde la enzima de la cadena principal ya tiene D en la posición 80) .

Propiedades mejoradas La variante de la lípido aciltransferasa para usar en la presente invención tiene por lo menos una propiedad mejorada en comparación con una lípido aciltransferasa genitora (por ejemplo, de la cadena principal) o no modificada.

El término "propiedad mejorada", como se usa en la presente descripción, puede incluir a) una especificidad del sustrato alterada de la lípido aciltransferasa, por ejemplo, y en forma de ejemplo únicamente i) una capacidad alterada de las enzimas para usar ciertos compuestos como aceptores, por ejemplo, una capacidad mejorada para usar un carbohidrato como una molécula aceptora para mejorar la capacidad de las enzimas para producir un éster de carbohidrato) o ii) una capacidad variante para usar ácidos grasos saturados o insaturados como un sustrato o iii) una especificidad alterada de manera que la variante de la lípido aciltransferasa usa, preferentemente, el ácido graso de la posición Snl o Sn2 de un sustrato lipídico o iv) una especificidad alterada de la longitud de la cadena del sustrato en la variante de la enzima; b) cinética alterada de la enzima; y/o c) capacidad reducida de la variante de la lípido aciltransferasa para llevar a cabo una reacción de hidrólisis mientras mantiene o mejora la capacidad de las enzimas para llevar a cabo una reacción aciltransferasa .

Otras propiedades mejoradas pueden estar relacionadas, por ejemplo, a mejoras y/o cambios en la estabilidad del pH y/o de la temperatura, y/o en la estabilidad del detergente y/o en la estabilidad oxidativa. De hecho, se contempla que las enzimas que tienen varios grados de estabilidad en una o más de estas características (pH, temperatura, estabilidad proteolítica, estabilidad del detergente y/o estabilidad oxidativa) se pueden preparar de conformidad con la presente invención .

La caracterización de proteínas silvestres (por ejemplo, lípido aciltransferasa genitora) y mutantes (por ejemplo, variante de la lípido aciltransferasa) se logra por medio de cualquier medio adecuado y se basa, preferentemente, en la evaluación de las propiedades de interés.

En algunas modalidades la variante de la enzima de la presente invención, en comparación con la enzima genitora, puede tener una actividad transferasa aumentada y una actividad hidrolítica igual o menor. En otras palabras, en consecuencia, la variante de la enzima puede tener una actividad transferasa mayor en relación a la actividad hidrolítica (por ejemplo, actividad transferasa: actividad hidrolítica) en comparación con la enzima genitora. En consecuencia, la variante de la enzima puede transferir, preferentemente, un grupo acilo de un lípido (que incluye fosfolípido, galactolípido o triacilglicerol) a un aceptor acilo, en vez de simplemente hidrolizar el lípido.

En consecuencia, la lípido aciltransferasa para usar en la invención puede ser una variante con una actividad enzimática mejorada en lípidos polares, preferentemente, fosfolípidos y/o glicolípidos , en comparación con la enzima genitora. Preferentemente, tales variantes tienen, además, una actividad baja o nula sobre los lisolípidos polares. La actividad mejorada sobre los lípidos polares, preferentemente, fosfolípidos y/o glicolípidos, puede ser resultado de la hidrólisis y/o actividad transferasa o una combinación de ambas. Preferentemente, la actividad mejorada en los lípidos polares es resultado de la actividad transferasa.

Las variantes de las lípido aciltransferasas para usar en la invención pueden tener una actividad reducida sobre los triglicéridos y/o monoglicéridos y/o diglicéridos en comparación con la enzima genitora.

En consecuencia, es posible que la variante de la enzima no tenga actividad sobre los triglicéridos y/o monoglicéridos y/o diglicéridos.

Definición de grupos Grupo de aminoácidos 1 : Grupo de aminoácidos 1 (note que estos son aminoácidos en 1IVN - Figura 53 y Figura 54) Gly8, Asp9, SerlO, Leull, Serl2, Tyrl5, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75, Leu76, Glnl06, Ilel07, Argl08, Leul09, ProllO, Tyrll3, Phel21, Phel39( Phel40, Metl41, Tyrl45, Metl51, Aspl54, Hisl57, Glyl55, Ilel56, Prol58 Los motivos altamente conservados, tales como GDSx y residuos catalíticos, se deseleccionaron del grupo 1 (residuos subrayados) . Para evitar dudas, el grupo 1 define los residuos de aminoácidos dentro de 10Á del átomo de carbono central de un glicerol en el sitio activo del modelo 1IVN.

Grupo de aminoácidos 2 : Grupo de aminoácidos 2 (note que la numeración de los aminoácidos se refiere a los aminoácidos en la secuencia madura P10480) Leul7, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trplll, Valll2, Alall4, Tyrll7, Leull8, Prol56, Glyl59, Glnl60, Asnl61, Prol62, Serl63, Alal64, Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68, Vall69, Vall70, Glul71, Alal72, Tyrl79, Hisl80, Asnl81, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289 y Val290.

Los residuos seleccionados en el grupo 1 en comparación con el grupo 2 se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Grupo de aminoácidos 3 : El grupo de aminoácidos 3 es idéntico al grupo 2 pero se refiere a la secuencia codificante (sec. con núm. de ident . 35) de Aeromonas salmonicida, por ejemplo, los números de residuos de aminoácidos son 18 más altos en el grupo 3 debido a que refleja la diferencia entre la numeración de aminoácidos en la proteína madura (sec. con núm. de ident. 35) en comparación con la proteína que incluye una secuencia señal (sec. con núm. de ident. 4) .

Las proteínas maduras de GDSX (sec. con núm. de ident. 35) de Aeromonas salmonicida y de GDSX (sec. con núm. de ident. 34) de Aeromonas hydrophila difieren en cinco aminoácidos. Estos son Thr3Ser( LYS182Gln, Glu309Ala, Thr310Asn y Gly318-, en donde el residuo de salmonicida se enumera como el primero y el residuo de hydrophila se enumera como el último. La proteína de hydrophila tiene únicamente 317 aminoácidos de longitud y carece de un residuo en la posición 318. El motivo GDSX de Aeromonas salmonicida tiene una actividad considerablemente alta en los lípidos polares, tales como sustratos de galactolípidos en comparación con la proteína de Aeromonas hydrophila . Se realizó escaneo del sitio en las cinco posiciones de aminoácidos.

Grupo de aminoácidos 4 : El grupo de aminoácidos 4 es S3, Q182, E309, S310 y - 318.

Grupo de aminoácidos 5 : F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157 N, Y226F, D228N Y230F.

Grupo de aminoácidos 6 : El grupo de aminoácidos 6 es Ser3 , Leul7, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88, Trplll, Valll2, Alall4, Tyrll7, Leull8, Prol56, Glyl59, Glnl60, Asnl61, Prol62, Serl63, Alal64, Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68, Vall69, Vall70, Glul71, Alal72, Tyrl79, Hisl80, Asnl81, Glnl82, et209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318.

La numeración de los aminoácidos en el grupo 6 se refiere a los residuos de aminoácidos en P10480 (sec. con núm. de ident. 3); los aminoácidos correspondientes en las cadenas principales de otras secuencias se pueden determinar por alineamiento por homología y/o alineamiento estructural con P10480 y/o 1IVN.

Grupo de aminoácidos 7 : El grupo de aminoácidos 7 es Ser3 , Leul7, Lys22, et23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88, Trplll, Valll2, Alall4, Tyrll7, Leull8 , Prol56, Glyl59, Glnl60, Asnl61 , Prol62, Serl63, Alal64, Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68, Vall69, Vall70, Glul71, Alal72, Tyrl79, Hisl80, Asnl81 , Glnl82, Met209, Leu210 , Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318, Y30X (en donde X se selecciona de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o ) , Y226X (en donde X se selecciona de A, C, D, E , G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W) , Y230X (en donde X se selecciona de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o ) , S18X (en donde X se selecciona de A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W o Y) , D157X (en donde X se selecciona de A, C, E , F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W o Y) .

La numeración de los aminoácidos en el grupo 7 se refiere a los residuos de aminoácidos en P10480 (sec. con núm. de ident. 3); los aminoácidos correspondientes en las cadenas principales de otras secuencias se pueden determinar por alineamiento por homología y) /o alineamiento estructural con P10480 y/o 1IVN.

En consecuencia, la variante de la enzima comprende una o más de las siguientes modificaciones de aminoácidos en comparación con la enzima genitora: S3E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T o G E309Q, R o A, preferentemente, Q o R -318Y, H, S o Y, preferentemente, Y.

Preferentemente, X del motivo GDSX es L. Por lo tanto, la enzima genitora comprende, preferentemente, el motivo GDSL de aminoácidos.

En consecuencia, la primera lípido aciltransferasa genitora puede comprender cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: sec . con núm. de ident . 34, sec . con núm. de ident. 3, sec. con núm. de ident. 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident. 10, sec. con núm. de ident. 11, sec. con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14, sec. con núm. de ident. 1, sec. con núm. de ident. 15, sec. con núm. de ident. 25, sec. con núm. de ident. 26, sec. con núm. de ident. 27, sec. con núm. de ident. 28, sec. con núm. de ident. 29, sec. con núm. de ident. 30, sec. con núm. de ident. 32, sec. con núm. de ident. 33 o sec. con núm. de ident . 35.

En consecuencia, la segunda lípido aciltransferasa relacionada puede comprender cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: sec. con núm. de ident. 3, sec. con núm. de ident. 34 ( sec. con núm. de ident. 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident. 10, sec. con núm. de ident. 11, sec. con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14, sec. con núm. de ident. 1, sec. con núm. de ident. 15, sec. con núm. de ident. 25, sec. con núm. de ident. 26, sec. con núm. de ident. 27, sec. con núm. de ident. 28, sec. con núm. de ident. 29, sec. con núm. de ident. 30, sec. con núm. de ident. 32, sec. con núm. de ident. 33 o sec. con núm. de ident. 35.

La variante de la enzima debe comprender por lo menos una modificación de aminoácidos en comparación con la enzima genitora. En algunas modalidades la variante de la enzima puede comprender por lo menos 2, preferentemente, por lo menos 3, preferentemente, por lo menos 4, preferentemente, por lo menos 5, preferentemente, por lo menos 6, preferentemente, por lo menos 7, preferentemente, por lo menos 8, preferentemente, por lo menos 9, preferentemente, por lo menos 10 modificaciones de aminoácidos en comparación con la enzima genitora.

Con respecto a los residuos de aminoácidos específicos, en la presente descripción la numeración es la obtenida del alineamiento de la variante de la secuencia con la secuencia de referencia que se muestra como la sec . con núm. de ident . 34 o 'la sec. con núm. de ident. 35.

En un aspecto, la variante de la enzima comprende, preferentemente, una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos : S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W o Y; y/o L17A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o S18A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W o Y; y/o K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o Y30A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o ; y/o G40A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, o Y; y/o N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o W111A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W o Y; y/o A114C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o Y117A, C, D, E , F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o ; y/o L118A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o P156A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, o Y; y/o D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o G159A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o Q160A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W o Y; y/o N161A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o P162A, C, D, E , F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, o Y y/o S163A, C, D, E , F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W o Y y/o A164C, D , E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y y/o R165A, C, D, E , F, G, H, I, K, L , M, N, P, Q, S, T, V, W o Y y/o S166A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W o Y y/o Q167A, C, D , E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S , T , V, W o Y y/o K168A, C, D, E, F, G, H , I, L , M, N, P, Q, R, S , T, V, W o Y y/o V169A, C, D, E , F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S , T , W o Y y/o V170A, C, D, E, F , G, H, I, K, L , M, N, P, Q, R, S , T , W o Y y/o E171A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S , T , V, W o Y y/o A172C, D, E , F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, Rf S , , V, W o Y y/o Y179A, C, D, E, F , G, H, I, K, L , M, N, P, Q, R, S , T , V o W y/o H180A, C, D , E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S , T , V, o Y y/o N181A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, o Y; y/o Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T( V, o Y, preferentemente, K; y/o M209A, C, D, E , F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o L210 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o R211 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; y/o N215 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W O Y; y/o Y226A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V O W; y/o Y230A, C, D, E, G, H, I, K( L, , N, P, Q, R, S, T, V o W; y/o K284A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, o Y; y/o M285A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, o Y; y/o Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W o Y; y/o V290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W o Y; y/o E309A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W O Y; y/o S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W o Y.

Adicional o alternativamente de estas sustituciones puede haber una o más extensiones C-terminal. Preferentemente, la extensión C-terminal adicional está compuesta de uno o más aminoácidos alifáticos, preferentemente, un aminoácido no polar, con mayor preferencia, de I, L, V o G. Por lo tanto, la presente invención facilita, además, una variante de enzima que comprende una o más extensiones C-terminal: 3181, 318L, 318V, 318G.

Las variantes de enzimas preferidas pueden tener una actividad hidrolítica reducida en comparación con un fosfolípido, tal como la fosfatidilcolina (PC) , pueden tener, además, una actividad transferasa aumentada de un fosfolípido .

Las variantes de enzimas pueden tener una actividad transferasa aumentada de un fosfolípido, tal como la fosfatidilcolina (PC) , pueden tener, además, una actividad hidrolítica aumentada en comparación con un fosfolípido.

La modificación de uno o más de los siguientes residuos puede resultar en una variante de enzima que tiene una actividad transferasa absoluta incrementada en comparación con un fosfolípido: S3, D157, S310, E309, Y179, N215, K22, Q289, M23, H180, M209, L210, R211, P81, V112, N80, L82, N88; N87 Las modificaciones preferidas específicas que pueden proporcionar una variante de enzima con una actividad transferasa mejorada de un fosfolípido se pueden seleccionar de una o más de las siguientes: S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, O Y; preferentemente, N, E, K, R, A, P o M, con la máxima preferencia, S3A D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, , N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, D157S, R, E, N, G, T, V, Q, K o C S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W O Y; preferentemente, S310T -318 E E309A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W o Y; preferentemente, E309 R, E, L, R'o A Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W; preferentemente, Y179 D, T, E, R, N, V, K, Q o S, con mayor preferencia, E, R, N, V, K o Q N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, N215 S, L, R o Y K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, K22 E, R, C o A Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, o Y; preferentemente, Q289 R, E, G, P o N M23A, C, D, E , F, G, H, I, K, L N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, M23 K, Q, L, G, ? o S H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W O Y; preferentemente, H180 Q, R o K M209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, M209 Q, S, R, A, N, Y, E, V o L L210A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, L210 R, A, V, S, T, I, W o M R211A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y; preferentemente, R211T P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, P81G V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W o Y; preferentemente, V112C N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, N80 R, G, N, D, P, T, E, V, A o G L82A, C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, L82N, S o E N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W O Y; preferentemente, N88C N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W o Y; preferentemente, N87M o G La modificación preferida de uno o más de los siguientes residuos produce una variante de enzima que tiene una actividad transferasa absoluta incrementada en comparación con un fosfolípido: S3 N, R, A, G M23 K, Q, L, G, T, S H180 R L82 G Y179 E, R, N, V, K o Q E309 R, S, L o A Una modificación preferida es N80D. Este es particularmente el caso cuando se usa la sec . con núm. de ident. 35 de la secuencia de referencia como la cadena principal. Por lo tanto, la secuencia de referencia puede ser la sec. con núm. de ident. 16. Esta modificación puede llevarse a cabo en combinación con una o más modificaciones adicionales. Por lo tanto, En una modalidad preferida, de la presente invención la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede codificar una lípido aciltransferasa que comprende la sec. con núm. de ident. 35 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más, aún con mayor preferencia, 95% o más, aún con mayor preferencia, 98% o más o, aún con mayor preferencia, 99% o más de identidad con la sec. con núm. de ident. 35.

Como se mencionó anteriormente con respecto a los residuos de aminoácidos específicos, en la presente descripción la numeración es la obtenida del alineamiento de la variante de la secuencia con la secuencia de referencia que se muestra como la sec. con núm. de ident . 34 o la sec . con núm. de ident. 35.

Con mayor preferencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y usos de la presente invención puede codificar un lípido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 16 o la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 68 o una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más, preferentemente, 75% o más, preferentemente, 85% o más, con mayor preferencia, 90% o más, aún con mayor preferencia, 95% o más, aún con mayor preferencia, 98% o más o, aún con mayor preferencia, 99% o más de identidad con la sec. con núm. de ident. 16 o la sec. con núm. de ident. 68. Esta enzima se puede considerar una variante de la enzima.

En una modalidad preferida, la variante de la enzima comprende una de la sec. con núm. de ident. 121, sec. con núm. de ident. 122 o sec. con núm. de ident. 123.

Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad se basa en la cantidad de elementos de las secuencias que son iguales. El grado de identidad de conformidad con la presente invención para secuencias de aminoácidos se puede determinar, adecuadamente, por medio de programas de programación conocidos en la técnica, tales como Vector NTI 10 (Invitrogen Corp.) . Para el alineamiento de pares el puntaje usado es, preferentemente, BLOSUM62 con una penalización de apertura de interrupciones de 10.0 y una penalización de extensión de interrupciones de 0.1.

En consecuencia, el grado de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos se determina sobre por lo menos 20 aminoácidos contiguos, preferentemente, sobre por lo menos 30 aminoácidos contiguos, preferentemente, sobre por lo menos 40 aminoácidos contiguos, preferentemente, sobre por lo menos 50 aminoácidos contiguos, preferentemente, sobre por lo menos 60 aminoácidos contiguos.

En consecuencia, el grado de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos se puede determinar sobre la secuencia completa.

En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa o la enzima lípido aciltransferasa para usar en la presente invención puede ser obtenible, obtenida, preferentemente, de organismos de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibríonaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobiu , Ralstonia, Xanthomonas, Candida, Thermobifida y Corynebacterium.

En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa o la enzima lípido aciltransferasa para usar en la presente invención puede ser obtenible, obtenida, preferentemente, de uno o más de los siguientes organismos: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida , Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes , Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes , Streptococcus thermophilus, Streptomyces thermosaechari , Streptomyces avermitilis Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans , Bacillus sp, Campylobacter j juni, Vibrionaceae , Xylella fastidiosa , Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis , Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis , Candida parapsilosis, Thermobifida fusca y Corynejbacter um efficiens .

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención codifica, preferentemente, una enzima lípido aciltransferasa que de conformidad con la presente invención es obtenible, obtenida o derivada, preferentemente, de una o más de Aeromonas spp . , Aeromonas hydrophila o Aeromonas salmonicida .

En un aspecto, la lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención es, preferentemente, una enzima lípido aciltransferasa obtenible, obtenida o derivada, preferentemente, de una o más de Aeromonas spp . , Aeromonas hydrophila o Aeromonas salmonicida .

Las enzimas que funcionan como lípido aciltransferasas de conformidad con la presente invención pueden identificarse rutinariamente con el uso del ensayo que se enseña en la presente descripción a continuación: Ensayo pará evaluar la actividad transferasa La actividad transferasa se determina, preferentemente, por la cantidad molar de éster de colesterol que se forma por la transferencia de acilo de fosfolípidos y/o lípidos en leche a colesterol con relación a la cantidad de colesterol disponible originalmente.

La leche se incuba con enzima o agua (como control) durante 30 minutos a 40°C. Los lípidos de la leche se aislan por extracción por solvente y los lípidos aislados se analizan por CGL .

En base al análisis por CGL se calcula la cantidad de colesterol (CHL, por sus siglas en inglés) , éster de colesterol (CHLE, por sus siglas en inglés) y ácidos grasos libres (FFA, por sus siglas en inglés) : % de transferasa = CHLE(t) - CHLE(O) x 100 CHLE (t) -CHLE ( O) +FFA (t) - FFA(O) En donde CHLE(O) = mol/1 de éster de colesterol (control) CHLE(t) = mol/1 de éster de colesterol (tratamiento enzimático) FFA(O) = mol/1 de ácidos grasos libres (cControl) FFA(t) = mol/1 de ácidos grasos libres (tratamiento eEnzyme) El análisis por CGL se puede realizar de conformidad con el Ejemplo 5 a continuación. Con el uso de este ensayo, las lípido aciltransferasas/lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención son aquellas que tienen por lo menos 5% de actividad transferasa, preferentemente, por lo menos 10% de actividad transferasa, preferentemente, por lo menos 15%, 20%, 25% 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% de actividad transferasa.

El término "transferasa" , como se usa en la presente descripción, es intercambiable con el término "lípido aciltransferasa" .

En consecuencia, la lípido aciltransferasa como se define en la presente descripción cataliza una o más de las siguientes reacciones: interesterificación, transesterificación, alcohólisis e hidrólisis.

El término "interesterificación" se refiere a la transferencia catalizada por enzimas de grupos acilo entre un lípido donante y un lípido aceptor, en donde el lípido donante no es un grupo acilo libre.

El término "transesterificación" , como se usa en la presente descripción, se refiere a la transferencia catalizada por enzimas de un grupo acilo · desde un lípido donante (que no sea un ácido graso libre) hasta un acilo aceptor (que no sea agua) .

Como se usa en la presente descripción, el término "alcohólisis" se refiere al clivaje enzimático de un enlace covalente de un ácido derivado por la reacción con un alcohol ROH de manera que uno de los productos se combine con el H del alcohol y el otro producto se combine con el grupo OR del alcohol .

Como se usa en la presente descripción, el término "alcohol" se refiere a un compuesto alquilo que contiene un grupo hidroxilo.

Como se usa en la presente descripción, el término "hidrólisis" se refiere a la transferencia catalizada por enzimas de un grupo acilo desde un lípido hasta el grupo OH de una molécula de agua.

El término "sin aumentar o sin aumentar sustancialmente los ácidos grasos libres", como se usa en la presente descripción, significa que la lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención tiene, preferentemente, 100% de actividad transferasa (por ejemplo, transfiere 100% de los grupos acilo desde un acilo donante hasta un acilo aceptor, sin actividad hidrolítica) ; sin embargo, la enzima puede transferir menos del 100% de los grupos acilo presentes en el donante de acilo lipídico hasta el acilo aceptor. En este caso, la actividad aciltransferasa representa, preferentemente, por lo menos 5%, con mayor preferencia, por lo menos 10%, con mayor preferencia, por lo menos 20%, con mayor preferencia, por lo menos 30%, con mayor preferencia, por lo menos 40%, con mayor preferencia, 50%, con mayor preferencia, por lo menos 60%, con mayor preferencia, por lo menos 70%, con mayor preferencia, por lo menos 80%, con mayor preferencia, por lo menos 90% y, con mayor preferencia, por lo menos 98% de la actividad enzimática total. El% de actividad transferasa (es decir, la actividad transferasa como un porcentaje de la actividad enzimática total) se puede determinar mediante el "ensayo para evaluar la actividad transferasa" que se presentó anteriormente.

En algunos aspectos de la presente invención, el término "sin aumentar sustancialmente los ácidos grasos libres", como se usa en la presente descripción, se refiere a que la cantidad de ácidos grasos libres en un aceite comestible tratado con una lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención es menor que la cantidad de ácidos grasos libres producidos en el aceite comestible cuando se ha usado una enzima que no sea una lípido aciltransferasa de conformidad con la presente invención, tal como, por ejemplo, en comparación con la cantidad de ácidos grasos libres producidos cuando se ha usado una enzima fosfolipasa convencional, por ejemplo, Lecitase Ultra™ (Novozymes A/S, Dinamarca) .

La enzima de conformidad con la presente invención se puede usar con otra u otras enzimas de grado alimentario adecuadas. Por lo tanto, el alcance de la presente invención incluye que además de la enzima de la invención, se agrega por lo menos una enzima adicional al producto alimenticio. Tales enzimas adicionales incluyen enzimas degradantes de almidón, tales como endo- o exoamilasas, pululanasas, enzimas desramificantes, hemicelulasas que incluyen xilanasas, celulasas, oxidorreductasas , por ejemplo, peroxidasas, fenol oxidasas, glucosa oxidasas, piranosa oxidasa, sulfhidrilo oxidasa o una carbohidrato oxidasa, tal como una que oxide la maltosa, por ejemplo, hexosa oxidasa (HOX) , lipasas, fosfolipasas , glicolipasas , galactolipasas y proteasas.

En una modalidad, la enzima puede ser Dairy HOX™, que actúa como un depurador de oxígeno para prolongar la vida en estante del queso, mientras proporciona un control de la oxidación en los hornos para pizza. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de una enzima con la capacidad de reducir la reacción de Maillard en un producto alimenticio (ver la patente núm. O 02/39828 que se incorpora en la presente descripción como referencia) , tal como un producto lácteo, por ejemplo, queso, en donde la enzima es, preferentemente, una enzima oxidante de maltosa, tal como carbohidrato oxidae, glucosa oxidasa y/o hexosa oxidasa, en el proceso o preparación de un material alimenticio y/o producto alimenticio de conformidad con la presente invención.

En una modalidad preferida, la lípido aciltransferasa se usa en combinación con una lipasa que tiene una o más de las siguientes actividades de lipasa: actividad de glicolipasa (E.C. 3.1.1.26, actividad de triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3), actividad de fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) o actividad de fosfolipasa Al (E.C. 3.1.1.32). Las enzimas lipolíticas adecuadas se conocen bien en la técnica e incluyen, en forma de ejemplo, las siguientes enzimas lipolíticas: LIPOPAN® F, LIPOPAN® XTRA y/o LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca), fosfolipasa A2 (por ejemplo, fosfolipasa A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts , LIPOMAX™ de Genencor) , LIPOLASE® (Novozymes A/S, Dinamarca) , YIELDMAX™ (Chr. Hansen, Dinamarca), PANAMORE™ (DSM) , las lipasas que se enseñan en la patente núm. WO 03/97835, patente europea núm. EP 0 977 869 o patente europea núm. EP 1 193 314. Esta combinación de una lípido aciltransferasa, como se define en la presente descripción, y una lipasa puede preferirse, particularmente, en productos de masa o productos horneados o en productos alimenticios finos, tales como pasteles y confitería .

En algunas modalidades puede ser favorable, además, combinar el uso de lípido aciltransferasa con una enzima lipolítica, tal como pasta de cuajo preparada de estómago de ternera, de cordero, de cabrito o Palatase A750L (Novo) , Palatase M200L (Novo) , Palatase M1000 (Novo) o Piccantase A (DSM) , además, Piccantase de origen animal de DSM (K, KL, L & C) o Lipomod 187, Lipomod 338 (Biocatalysts) . Estas lipasas se usan convencionalmente en la producción de queso para producir sabores de queso. Estas lipasas se pueden usar, además, para producir un producto alimenticio modificado enzimáticamente, por ejemplo un producto lácteo (por ejemplo, queso) , particularmente, en donde el producto lácteo consiste en, se produce de o comprende grasa de mantequilla. Una combinación de la lípido aciltransferasa con una o más de estas lipasas puede tener un efecto favorable en el sabor del producto lácteo (por ejemplo, queso) .

El uso de lipasas en combinación con la enzima de la invención puede ser particularmente favorable en casos en donde se desea cierta acumulación de ácidos grasos libres, por ejemplo, en el queso en donde los ácidos grasos libres pueden impartir un sabor deseable o en la preparación de alimentos finos. El experto en la técnica podrá combinar proporciones de enzimas lipolíticas, por ejemplo, LIPOPA ® F, LIPOPAN® XTRA y/o LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Dinamarca) , fosfolipasa A2 (por ejemplo, fosfolipasa A2 de LIPOMOD™ 22L de Biocatalysts, LIPOMAX™ de Genencor) , LIPOLASE® (Novozymes A/S, Dinamarca) , YIELDMAX™ (Chr. Hansen, Dinamarca) , PANAMORE™ (DS ) , las lipasas que se enseñan en la patente núm. WO 03/97835, patente europea núm. EP 0 977 869 o patente europea núm. EP 1 193 314 y la lípido aciltransferasa de la presente invención para proporcionar la relación deseada de actividad hidrolítica y actividad transferasa que produce en el producto alimenticio el efecto técnico o combinación de efectos técnicos que se desea (tales como los enumerados en la presente descripción en la sección 'Efectos técnicos').

Además, puede ser favorable combinar el uso de la lípido aciltransferasa con una fosfolipasa, tal como la fosfolipasa Al, fosfolipasa A2 , fosfolipasa B, fosfolipasa C y/o fosfolipasa D.

El uso combinado se puede llevar a cabo secuencial o simultáneamente, por ejemplo, el tratamiento con lípido aciltransferasa puede ocurrir antes de o durante el tratamiento con enzimas adicionales. Alternativamente, el tratamiento con enzimas adicionales puede ocurrir antes de o durante el tratamiento con la lípido aciltransferasa .

En el caso de los tratamientos enzimáticos secuenciales , en algunas modalidades puede ser favorable eliminar la primera enzima usada, por ejemplo, por desactivación por calor o con el uso de una enzima inmovilizada, antes del tratamiento con la segunda (y/o tercera, etc.) enzima.

Modificaciones postranscripcionales y postraslacionales En consecuencia, la lipido aciltransferasa de conformidad con la presente invención puede estar codificada por cualquiera de las secuencias de nucleótidos que se enseñan en la presente descripción.

Según la célula hospedera usada, se pueden realizar modificaciones postranscripcionales y/o postraslacionales. Se prevé que la lipido aciltransferasa para usar en los métodos y/o usos presentes abarca las lipido aciltransferasas que han experimentado una modificación postranscripcional y/o postraslacional . Únicamente a modo de ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la presente descripción como la sec . con núm. de ident . 49 (ver la Figura 57) en una célula hospedera (tal como Bacillus licheniformis, por ejemplo) produce modificaciones postranscripcionales y/o postraslacionales que llevan a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la presente descripción como la sec. con núm. de ident. 68 (ver la Figura 73) .

La sec. con núm. de ident. 68 es la misma que la sec. con núm. de ident. 16 (que se muestra en la presente descripción en la Figura 1), excepto que la sec. con núm. de ident. 68 ha experimentado una modificación postraslacional y/o postranscripcional para eliminar 38 aminoácidos.

Además, la sec. con núm. de ident. 16 se puede modificar postranscripcional y/o postraslacionalmente para eliminar 39, 40 o 41 aminos , tal como se muestra en las sec. con núms . de ident. 121, 122 y 123, respectivamente.

Aislada En un aspecto, la lípido aciltransferasa es una lípido aciltransferasa recuperada/aislada. Por lo tanto, la lípido aciltransferasa producida puede estar e una forma aislada.

En otro aspecto la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en la presente invención puede estar en una forma aislada.

El término "aislada" significa que la secuencia o proteína está por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente con el que la secuencia o proteína se asocia naturalmente de naturaleza y como se encuentra de naturaleza .

Purificada En un aspecto, la lípido aciltransferasa puede estar en una forma purificada.

En otro aspecto la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en la presente invención puede estar en una forma purificada.

El término "purificada" significa que la secuencia se encuentra en un estado relativamente puro, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 51% de pureza o por lo menos aproximadamente 75% o por lo menos aproximadamente 80% o por lo menos aproximadamente 90% de pureza o por lo menos aproximadamente 95% de pureza o por lo menos aproximadamente 98% de pureza.

Clonación de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de conformidad con la presente invención Una secuencia de nucleótidos que codifica ya sea un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se definen en la presente descripción o un polipéptido que es adecuado para la modificación se puede aislar de cualquier célula u organismo que produce el polipéptido. En la técnica se conoce varios métodos para el aislamiento de secuencias de nucleótidos.

Por ejemplo, una biblioteca de ADN genómico y/o de ADNc se puede construir con el uso de ADN cromosómico o AN mensajero del organismo que produce el polipéptido. Si se conoce la secuencia de aminoácidos del polipéptido, se puede sintetizar y usar sondas de oligonucleótidos marcadas para identificar los clones que codifican polipéptidos de la genoteca preparada del organismo. Alternativamente, se podría usar una sonda de oligonucleótidos etiquetada que contiene secuencias homologas a otro gen de polipéptido conocido para identificar los clones que codifican polipéptidos. En el último caso, se usa condiciones de hibridación y lavado de menor rigurosidad.

Alternativamente, los clones que codifican polipéptidos se podrían identificar mediante la inserción de fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, la transformación de bacterias sin enzimas con la biblioteca de ADN genómico resultante y, después, la siembra de las bacterias transformadas en agar que contiene una enzima inhibida por el polipéptido para permitir que los clones expresen el polipéptido a identificar.

En otra alternativa adicional la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido se puede preparar sintéticamente al establecer métodos estándar, por ejemplo, el método de fosforoamidita descrito por Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, págs . 1859-1869 o el método descrito por Matthes efc al., (1984) EMBO J. 3, págs. 801-805. En el método de fosforoamidita , los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, purificado, templado, ligado y clonado en vectores adecuados.

La secuencia de nucleótidos puede ser de origen mixto genómico y sintético, de origen mixto sintético y de ADNc o de origen mixto genómico y de ADNc, que se prepara al ligar fragmentos de origen sintético, genómico o ADNc (según convenga) de conformidad con técnicas estándar. Cada fragmento ligado corresponde a varias partes de la secuencia completa de nucleotidos. La secuencia de ADN se puede preparar, además, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el uso de iniciadores específicos, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. US 4,683,202 o en Saiki R K et al., (Science (1988) 239, págs . 487-491) .

Secuencias de nucleotidos La presente invención abarca, además, secuencias de nucleotidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas tal como se define en la presente descripción. El término "secuencia de nucleotidos", como se usa en la presente descripción, se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o secuencia de polinucleótidos y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de estas (tales como porciones de estas) . La secuencia de nucleotidos puede ser de origen genómico, sintético o recombinante , puede ser bicatenaria o monocatenaria ya sea que represente la cadena codificante o la cadena no codificante.

El término "secuencia de nucleotidos" en relación a la presente invención incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferentemente, se refiere a ADN, con mayor preferencia, ADNc para la secuencia codificante.

En una modalidad preferida, la secuencia de nucleotidos que codifica en sí un polipéptido que tiene las propiedades específicas como se define en la presente descripción no incluye la secuencia de nucleótidos natural en su ambiente natural cuando se une a su secuencia o secuencias naturalmente asociada(s) que se encuentra (n) , además, en su ambiente natural. Para hacer más fácil la referencia, debemos llamar a esta modalidad preferida "secuencia de nucleótidos no natural" . En este sentido, el término "secuencia de nucleótidos natural" se refiere a una secuencia total de nucleótidos en su ambiente natural y cuando se une operativamente a un promotor completo con el que se relaciona naturalmente, cuyo promotor se encuentra, además, en su ambiente natural. Por lo tanto, el polipéptido de la presente invención se puede expresar por una secuencia de nucleótidos en su organismo natural pero en donde la secuencia de nucleótidos no se encuentra bajo control del promotor con el que se relaciona naturalmente dentro de ese organismo.

Preferentemente, el polipéptido no es un polipéptido natural. En este sentido, el término "polipéptido natural" se refiere a un polipéptido completo que se encuentra en su ambiente natural y cuando ha sido expresado por su secuencia de nucleótidos natural .

Típicamente, la secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos con las propiedades específicas tal como se define en la presente descripción se prepara con el uso de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo, ADN recombinante) .

Sin embargo, en una modalidad alterna de la invención la secuencia de nucleótidos se podría sintetizar, completa o parcialmente, con el uso de métodos químicos muy conocidos en la técnica (ver Caruthers MH efc al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232) .

Evolución molecular Una vez que se ha aislado una secuencia de nucleótidos que codifica enzimas o se ha identificado una secuencia de nucleótidos putativa que codifica enzimas, se puede preferir modificar la secuencia de nucleótidos seleccionada, por ejemplo, se puede preferir mutar la secuencia para preparar una enzima de conformidad con la presente invención.

Es posible introducir mutaciones con el uso de oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados.

Un método adecuado se describe en Morinaga et al . , (Biotechnology (1984) 2, págs . 646-649). Otro método para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican enzimas se describe en Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, págs. 147-151).

En vez de mutagénesis sitio dirigida, tal como se describió anteriormente, es posible introducir mutaciones aleatoriamente, por ejemplo, con el uso de un kit comercial, tal como el kit de mutagénesis de PCR GeneMorph de Stratagene o el kit de mutagénesis aleatoria de PCR Diversify de Clontech. La patente europea núm. EP 0 583 265 se refiere a métodos para optimizar la mutagénesis a base de PCR, que se puede combinar, además, con el uso de análogos de ADN mutagénico, tales como los descritos en la patente europea núm. EP 0 866 796. Las tecnologías de PCR propensa a errores son adecuadas para la producción de variantes de lípido aciltransferasas con las características preferidas. La patente núm. WO0206457 se refiere a la evolución molecular de las lipasas.

Un tercer método para obtener secuencias nuevas consiste en fragmentar secuencias de nucleótidos no idénticas, ya sea con el uso de cualquier número de enzimas de restricción o una enzima, tal como DNasa I, y reensamblar secuencias de nucleótidos completas que codifican proteínas funcionales. Alternativamente, es posible usar una o múltiples secuencias de nucleótidos no idénticas e introducir mutaciones durante el reensamblaje de la secuencia de nucleótidos completa. El barajado de ADN y las tecnologías de barajado son adecuados para la producción de variantes de lípido aciltransferasas con las características preferidas. Los métodos adecuados para llevar a cabo el 'barajado' se pueden encontrar en las patentes europeas nums . EPO 752 008, EP1 138 763 y EP1 103 606. Además, el barajado se puede combinar con otras formas de mutagénesis de ADN, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. US 6,180,406 y en la patente núm. O 01/34835.

Por lo tanto, es posible producir numerosas mutaciones sitio dirigidas o aleatorias en una secuencia de nucleótidos, ya sea in vivo o in vitro, y evaluarlas, posteriormente, para detectar una funcionalidad mejorada del polipéptido codificado por diversos medios. Con el uso de métodos de recombinación mediados in silicio y exo (ver la patente núm. WO 00/58517, la patente de los Estados Unidos núm. US 6,344,328, la patente de los Estados Unidos núm. US 6,361,974), por ejemplo, la evolución molecular se puede llevar a cabo en donde la variante producida retiene una homología muy baja con enzimas o proteínas conocidas. Tales variantes, obtenidas de esta manera pueden tener una analogía estructural significativa con enzimas transferasa conocidas, pero tienen una homología de secuencias de aminoácidos muy baj a .

Adicionalmente , como un ejemplo no limitante, las mutaciones o variantes naturales de una secuencia de polinucleótidos se pueden recombinar con mutaciones de tipo silvestre o de otro tipo o con variantes naturales para producir variantes nuevas. Tales variantes nuevas se pueden evaluar, además, para detectar una funcionalidad mejorada del polipéptido codificado.

La aplicación de los métodos de evolución molecular mencionados anteriormente y de métodos similares permite la identificación y selección de las variantes de las enzimas de la presente invención que tienen las características preferidas sin conocimiento anterior de la estructura o función proteica, y permite la producción de mutaciones o variantes no predecibles pero beneficiosas. Hay numerosos ejemplos de la aplicación de la evolución molecular en la técnica para optimizar o alterar la actividad enzimática, tales ejemplos incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: expresión y/o actividad optimizada en una célula hospedera o in vitro, actividad enzimática incrementada, especificidad alterada del sustrato y/o producto, estabilidad enzimática o estructural incrementada o reducida, actividad/especificidad enzimática alterada en condiciones ambientales preferidas, por ejemplo, temperatura, pH, sustrato.

Como resultará evidente para un experto en la técnica, con el uso de herramientas de evolución molecular una enzima se puede alterar para mejorar la funcionalidad de la enzima.

En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa usada en la presente invención puede codificar una variante de la lípido aciltransferasa, es decir, la lípido aciltransferasa puede contener por lo menos una sustitución, deleción o adición de aminoácidos, en comparación con una enzima genitora. Las variantes de las enzimas retienen por lo menos 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de homología con la enzima genitora. Las enzimas genitores adecuadas pueden incluir cualquier enzima con actividad de esterasa o lipasa. Preferentemente, la enzima genitora se alinea con la secuencia consenso de pfam00657.

En una modalidad preferida, una variante de la enzima lípido aciltransferasa retiene o incorpora por lo menos uno o más de los residuos de aminoácidos de la secuencia consenso de pfam00657 que se encuentran en los bloques GDSx, GANDY y HPT.

Las enzimas, tales como lipasas sin o poca actividad de la lípido aciltransferasa en un ambiente acuoso se pueden mutar con el uso de las herramientas de evolución molecular para introducir o mejorar la actividad transferasa, para producir una enzima lípido aciltransferasa con una actividad transferasa significativa adecuada para usar en las composiciones y métodos de la presente invención.

En consecuencia, la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención puede codificar una lípido aciltransferasa que puede ser una variante con una actividad enzimática mejorada en lípidos polares, preferentemente, fosfolípidos y/o glicolípidos en comparación con la enzima genitora. Preferentemente, tales variantes tienen, además, una actividad baja o nula sobre los lisolípidos polares. La actividad mejorada sobre los lípidos polares, fosfolípidos y/o glicolípidos puede ser resultado de la hidrólisis y/o actividad transferasa o una combinación de ambas .

Las variantes de las lípido aciltransferasas pueden tener una actividad reducida sobre los triglicéridos y/o monoglicéridos y/o diglicéridos en comparación con la enzima genitora.

Alternativamente, la variante de la enzima puede haber incrementado la actividad sobre los triglicéridos y/o puede haber incrementado, además, la actividad en uno o más de los siguientes, lípidos polares, fosfolípidos, lecitina, fosfatidilcolina , glicolípidos, digalactosil monoglicérido, monogalactosil monoglicérido.

Las variantes de lípido aciltransferasas son conocidas y una o más de tales variantes pueden ser adecuadas para usar en los métodos y usos de conformidad con la presente invención y/o en las composiciones enzimáticas de conformidad con la presente invención. Únicamente en forma de ejemplo, las variantes de lípido aciltransferasas que se describen en las siguientes referencias pueden usarse de conformidad con la presente invención: Hilton & Buckley J. Biol . Chem. 15 de enero de 1991: 266 (2): 997-1000; Robertson et al., J. Biol. Chem. 21 de enero de 1994; 269 (3 ): 2146-50 ; Brumlik et al., J. Bacteriol. abril de 1996; 178 (7): 2060-4; Peelman et al., Protein Sci. marzo de 1998; 7(3):587-99.

Secuencias de aminoácidos La presente invención incluye, además, el uso de secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para usar en cualquiera de los métodos y/o usos de la presente invención .

Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de aminoácidos" el sinónimo del término "polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido" .

La secuencia de aminoácidos se puede preparar/aislar de una fuente adecuada o se puede elaborar sintéticamente o se puede preparar con el uso de técnicas de ADN recombinante .

En consecuencia, las secuencias de aminoácidos se pueden obtener de los polipéptidos aislados que se enseñan en la presente descripción mediante técnicas estándar.

Un método adecuado para determinar las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos aislados consiste 'en lo siguiente : El polipéptido purificado se puede liofilizar y 100 µg del material liofilizado se pueden disolver en 50 µ? de una mezcla de urea 8 M e hidrocarbonato amónico 0.4 M, pH 8.4. La proteína disuelta se puede desnaturalizar y reducir durante 15 minutos a 50°C después del recubrimiento con nitrógeno y la adición de 5 µ? de ditiotreitol 45 mM. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se puede agregar 5 µ? de yodoacetamida 100 mM para modificar los residuos de cisteína durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad en presencia de nitrógeno. 135 µ? de agua y 5 µg de endoproteinasa Lys-C en 5 µ? de agua se pueden agregar a la mezcla de reacción mencionada anteriormente y la digestión puede ocurrir a 37°C en presencia de nitrógeno durante 24 horas.

Los péptidos resultantes se pueden separar por CLAP de fase inversa en una columna VYDAC C18 (0.46x15 cm; 10 µp?; The Separation Group, California, Estados Unidos) con el uso de solvente A: TFA al 0.1% en agua y solvente B: TFA al 0.1% en acetonitrilo . Los péptidos seleccionados se pueden someter nuevamente a cromatografía en una columna Develosil C18 con el mismo sistema de solventes, antes de la secuenciación N-terminal . La secuenciación se puede llevar a cabo con el uso de un secuenciador 476A de Applied Biosystems con el uso de ciclos rápidos de pulsado de líquido de conformidad con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, California, Estados Unidos) .

Identidad de secuencias u homología de secuencias En la presente descripción, el término "homologa" se refiere a una entidad que tiene cierta homología con las secuencias de aminoácidos sujeto y las secuencias de nucleótidos sujeto. En la presente descripción, el término "homología" se puede igualar a la "identidad" .

La secuencia de aminoácidos y/o secuencia de nucleótidos homologa debe proporcionar y/o codificar un polipéptido que retiene la actividad funcional y/o mejora la actividad de la enzima .

En este contexto, se toma una secuencia homologa para incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser por lo menos 75, 85 o 90% idéntica, preferentemente, por lo menos 95 o 98% idéntica a la secuencia sujeto. Típicamente, las secuencias homologas comprenden los mismos sitios activos, etc. que la secuencia de aminoácidos sujeto. Aunque la homología se puede considerar, además, en términos de similitud (por ejemplo, residuos de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones similares) , en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencias.

En este contexto, se toma una secuencia homologa para incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser por lo menos 75, 85 o 90% idéntica, preferentemente, por lo menos 95 o 98% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención (la secuencia sujeto) . Típicamente, los homólogos comprenden las mismas secuencias que codifican para los sitios activos, etc. como la secuencia sujeto. Aunque la homología se puede considerar, además, en términos de similitud (por ejemplo, residuos de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones similares) , en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencias.

Las comparaciones de homología se pueden realizar al ojo o, más usualmente, con ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de programación disponibles comercialmente pueden calcular el% de homología entre dos o más secuencias.

El% de homología se puede calcular en secuencias contiguas, por ejemplo, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se denomina alineamiento "sin interrupciones". Típicamente, tales alineamientos sin interrupciones se realizan únicamente en un número relativamente bajo de residuos.

Aunque este método es muy simple y consistente, no toma en consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias idénticas de cualquier otra forma, una inserción o deleción causa que los siguientes residuos de aminoácidos estén fuera de alineamiento y esto produce, potencialmente, una gran reducción en el% de homología cuando se realiza un alineamiento global. Por lo tanto, la mayoría de métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos que toman en consideración las posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente el grado de homología total . Esto se logra al insertar "interrupciones" en el alineamiento de secuencias para tratar de maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de interrupciones" a cada interrupción que se produce en el alineamiento de manera que para la misma cantidad de aminoácidos idénticos un alineamiento de secuencias con la menor cantidad de interrupciones posible, lo que refleja una relación mayor entre las dos secuencias comparadas, alcanza un puntaje más alto que un alineamiento con varias interrupciones. Típicamente, se usa "costos de interrupciones afines" que cargan un costo relativamente alto por la existencia de una interrupción y una penalización menor por cada residuo posterior en la interrupción. Este es el sistema de puntajes de interrupciones usado más comúnmente. Por supuesto, las penalizaciones de interrupciones altas producen alineamientos optimizados con menos interrupciones. La mayoría de programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones de interrupciones. Sin embargo, se prefiere usar los valores predeterminados cuando se usa un programa para comparaciones de secuencias.

Por lo tanto, el cálculo del% máximo de homología requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo tomando en consideración las penalizaciones de interrupciones. Un programa informático adecuado para llevar a cabo tal alineamiento es el Vector NTI (Invitrogen Corp.) . Los ejemplos de otros programas que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (ver Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4.° ed. capítulo 18) y FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol . 403-410). Tanto BLAST como FASTA se encuentran disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (ver Ausubel et al., 1999, págs . 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa Vector NTI. Además, está disponible una herramienta nueva llamada BLAST 2 Sequences para comparar secuencias de proteína y de nucleótidos (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi . nlm . nih.gov) .

Aunque el% final de homología puede determinarse en términos de identidad, el proceso de alineamiento en sí no se basa, típicamente, en una comparación de pares de todo o nada. Más bien, se usa, generalmente, una matriz graduada de puntajes de similitud que asigna puntajes para cada comparación de pares en base a la similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz que se usa comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz predeterminada para el paquete integrado de programas BLAST. Los programas Vector NTI usan, generalmente, los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizados, si se proporciona (ver el manual del usuario para más detalles) . Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores predeterminados para el paquete Vector NTI .

Alternativamente, el porcentaje de homologías se puede calcular con el uso de la función de alineamientos múltiples en Vector NTI (Invitrogen Corp.), en base a un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244) .

Una vez que el programa ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el% de homología, preferentemente, el% de identidad de secuencias. El programa hace esto, típicamente, como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Si se usan penalizaciones de interrupciones al determinar la identidad de secuencias, entonces se usa, preferentemente, los siguientes parámetros para el alineamiento de pares: En una modalidad la identidad de secuencias para las secuencias de nucleótidos se determina, preferentemente, con el uso de CLUSTAL con la penalización de interrupción y la extensión de interrupción determinadas tal como se definió anteriormente .

En consecuencia, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se determina en por lo menos 20 nucleótidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 30 nucleótidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 40 nucleótidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 50 nucleótidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 60 nucleótidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 100 nucleótidos contiguos.

En consecuencia, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se puede determinar sobre la secuencia completa.

En una modalidad el grado de identidad de secuencias de aminoácidos de conformidad con la presente invención se puede determinar adecuadamente por medio de programas informáticos conocidos en la técnica, tales como Vector NTI 10 (Invitrogen Corp.). Para el alineamiento de pares la matriz usada es, preferentemente, BLOSUM62 con una penalización de apertura de interrupciones de 10.0 y una penalización de extensión de interrupciones de 0.1.

En consecuencia, el grado de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos se determina en por lo menos 20 aminoácidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 30 aminoácidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 40 aminoácidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 50 aminoácidos contiguos, preferentemente, en por lo menos 60 aminoácidos contiguos.

Las secuencias pueden tener, además, deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y resultan en una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones intencionales de aminoácidos se pueden realizar en base a la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos, siempre que se retenga la actividad de la unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabezas polares sin carga que tienen valores similares de hidrofilicidad incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Las sustituciones conservadoras se pueden llevar a cabo, por ejemplo, de conformidad con la Tabla 6 a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y, preferentemente, en la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir entre sí: Tabla 6 La presente invención abarca la sustitución homologa (sustitución y reemplazo se usan en la presente descripción para indicar el intercambio de un residuo de aminoácidos existente con un residuo alterno) que puede ocurrir, es decir, la sustitución de igual a igual, tal como básico por básico, acídico por acídico, polar por polar, etc. Además, puede ocurrir la sustitución no homologa, es decir, de una clase de residuo a otro o que implica, alternativamente, la inclusión de aminoácidos no naturales, tales como ornitina (de aquí en adelante mencionada como Z) , ornitina de ácido diaminobutírico (de aquí en adelante mencionado como B) , norleucina ornitina (de aquí en adelante mencionada como O) , piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina .

Además, los reemplazos se pueden hacer por aminoácidos no naturales.

Las variantes de secuencias de aminoácidos pueden incluir grupos de separadores adecuados que se pueden insertar entre cualquier par de residuos de aminoácidos de la secuencia que incluyen grupos alquilo, tales como grupos metilo, etilo o propilo además de los separadores de aminoácidos, tales como residuos de glicina o de b-alanina. Aquellos con experiencia en la técnica comprenderán bien una forma adicional de variación que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácidos en forma peptoide. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se usa para referirse a las variantes de los residuos de aminoácidos, en donde el grupo sustituyente a-carbono se encuentra en el átomo de nitrógeno del residuo en vez del -carbono. Los procesos para preparar péptidos en la forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo, Simón RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol . (1995) 13(4), 132-134.

Las secuencias de nucleótidos para usar en la presente invención o que codifican un polipéptido con las propiedades específicas definidas en la presente invención pueden incluir dentro de estas nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conoce varios tipos distintos de modificaciones a oligonucleótidos . Estos incluyen cadenas principales de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, se debe entender que las secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención se pueden modificar por cualquier método disponible en la técnica. Tales modificaciones se realizar para mejorar la actividad in vivo o la duración de las secuencias de nucleótidos.

La. presente invención abarca, además, el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias descritas en la presente invención o cualquier derivado, fragmento o derivado de estos. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de esta, entonces esa secuencia se puede usar como una sonda para identificar secuencias codificantes similares en otros organismos, etc.

Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a las secuencias de la presente invención, pero que se encuentran dentro del alcance de la presente invención, se pueden obtener de distintas maneras. Otras variantes de las secuencias descritas en la presente invención se pueden obtener, por ejemplo, por sondeo de bibliotecas de ADN que se elaboran a partir de una variedad de individuos, por ejemplo, individuos de distintas poblaciones. Adicionalmente , es posible obtener otros homólogos virales/bacterianos o celulares, particularmente, homólogos celulares que se encuentran en células de mamíferos (por ejemplo, células de rata, de ratón, células bovinas y de primates) , y tales homólogos y fragmentos de los estos tendrán la capacidad, generalmente, de hibridizarse selectivamente en las secuencias que se muestran en el listado de secuencias de la presente invención. Tales secuencias se pueden obtener por sondeo de las genotecas de ADNc elaboradas de o genotecas de ADN de otras especies animales y sondeo de tales genotecas con sondas que comprenden toda o parte de cualquiera de las secuencias en el listado de secuencias adjunto en condiciones de rigurosidad media a alta. Consideraciones similares aplican para obtener especies homologas y variantes alélicas de las secuencias de polipéptidos o de nucleótidos de la presente invención.

Además, es posible obtener variantes y cepas/especies homologas con el uso de PCR con iniciadores degenerados diseñados para dirigir las secuencias dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas se pueden predecir, por ejemplo, al alinear las secuencias de aminoácidos de múltiples variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencias se pueden realizar con el uso de programas informáticos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el programa GCG Wisconsin PileUp se usa ampliamente.

Los iniciadores degenerados usados en la PCR contienen una o más posiciones degeneradas y se usan en condiciones de rigurosidad menor en comparación con las condiciones usadas para clonar secuencias con iniciadores de secuencias individuales contra secuencias conocidas.

Alternativamente, tales polinucleótidos se pueden obtener mediante mutagénesis sitio dirigida de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se requiere cambios silenciosos de secuencias de codones para optimizar las preferencias codónicas para una célula hospedera particular en la que se expresan las secuencias de polinucleótidos. Se puede desear otros cambios de secuencia para introducir sitios de restricción de reconocimiento de polipéptidos o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos) de la presente invención se pueden usar para producir un iniciador, por ejemplo, un iniciador de PCR, un iniciador para una reacción de amplificación alterna, una sonda, por ejemplo, marcada con un marcador revelador por medios convencionales con el uso de marcadores radiactivos o no radiactivos o los polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Tales iniciadores, sondas y otros fragmentos tienen por lo menos 15, preferentemente, por lo menos 20, por ejemplo, por lo menos 25, 30 o 40 nucleótidos de longitud y están incluidos, además, en el término polinucleótidos de la presente invención, como se usa en la presente descripción.

Los polinucleótidos, tales como polinucleótidos y sondas de ADN, de conformidad con la presente invención se pueden producir recombinantemente , sintéticamente o por cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. Además, se pueden clonar mediante técnicas estándar.

Generalmente, los iniciadores se producen por medios sintéticos, que implican una elaboración gradual de la secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleótido a la vez. Las técnicas para lograr eso con el uso de técnicas automatizadas están fácilmente disponibles en la técnica.

Generalmente, los polinucleótidos más largos se producen con el uso de medios recombinantes , por ejemplo, con el uso de técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) . Esto implica elaborar un par de iniciadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una región de la secuencia de acceso de lípidos que se desea clonar, poner en contacto los iniciadores con el AR m o el ADNc obtenido de una célula animal o humana, realizar una reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones que dan lugar a la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, mediante la purificación de la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los iniciadores se pueden diseñar para contener sitios de restricción de reconocimiento de enzimas adecuados de manera que el ADN se pueda clonar en un vector de clonación adecuado.

Hibridación La presente invención abarca, además, el uso de secuencias que son complementarias a las secuencias de la presente invención o secuencias que tienen la capacidad de hibridizarse ya sea en las secuencias de la presente invención o en secuencias complementarias a estas.

El término "hibridación", como se usa en la presente descripción, incluirá "el proceso por el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria por medio de coincidencia de bases" , así como el proceso de amplificación como se lleva a cabo en las tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) .

La presente invención abarca, además, el uso de secuencias de nucleótidos que tienen la capacidad de hibridizarse en las secuencias complementarias a las secuencias sujeto descritas en la presente invención o cualquier derivado, fragmento o derivado de estos.

La presente invención abarca, además, secuencias que son complementarias a secuencias que tienen la capacidad de hibridizarse en las secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención.

Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión del nucleótido, como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol . 152, Academic Press, San Diego CA) y confieren una "rigurosidad" definida tal como se explica a continuación.

La rigurosidad máxima ocurre, típicamente, a aproximadamente una Tm-5°C (5°C por debajo de la Tm de la sonda) ; la rigurosidad alta a aproximadamente 5°C a 10°C por debajo de la Tm; la rigurosidad intermedia a aproximadamente 10°C a 20°C por debajo de la Tm y la rigurosidad baja a aproximadamente 20°C a 25°C por debajo de la Tm. Como comprenderán los expertos en la técnica, se puede usar una hibridación de rigurosidad máxima para identificar o detectar secuencias de nucleótidos idénticas, mientras que una hibridación de rigurosidad intermedia (o baja) se puede usar para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos similares o relacionadas.

Preferentemente, la presente invención abarca el uso de secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridizarse bajo condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad intermedia en secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas, tal como se define en la presente descripción.

Con mayor preferencia, la presente invención abarca el uso de secuencias que son complementarias a secuencias que tienen la capacidad de hibridizarse bajo condiciones de rigurosidad alta (por ejemplo, 65°C y 0. lxSSC {lxSSC = NaCl 0.15 M, citrato de Na 0.015 M, pH 7.0}) en secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que tienen las propiedades específicas tal como se define en la presente invención .

La presente invención se relaciona, además, con el uso de secuencias de nucleótidos que pueden hibridizarse en las secuencias de nucleótidos descritas en la presente descripción (que incluyen secuencias complementarias a las descritas en la presente descripción) .

La presente invención se relaciona, además, con el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias que pueden ibridizarse en las secuencias de nucleótidos descritas en la presente descripción (que incluyen secuencias complementarias a las descritas en la presente descripción) .

Además, el alcance de la presente invención incluye el uso de secuencias de polinucleótidos que tienen la capacidad de hibridizarse en las secuencias de nucleótidos descritas en la presente descripción en condiciones de rigurosidad intermedia a máxima.

En un aspecto, preferido la presente invención incluye el uso de secuencias de nucleótidos que pueden hibridizarse en las secuencias de nucleótidos descritas en la presente descripción o en el complemento de estas, en condiciones rigurosas (por ejemplo, 50°C y 0.2xSSC) .

En un aspecto, con mayor preferencia la presente invención incluye el uso de secuencias de nucleótidos que pueden hibridizarse en las secuencias de nucleótidos descritas en la presente descripción o en el complemento de estas, en condiciones de rigurosidad alta (por ejemplo, 65°C y 0. lxSSC) .

Expresión de polipéptidos Una secuencia de nucleótidos para usar en la presente invención o para codificar un polipéptido que tiene las propiedades específicas, tal como se define en la presente descripción, se puede incorporar en un vector reproducible recombinante . El vector se puede usar para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma de polipéptidos , en y/o a partir de una célula hospedera compatible. La expresión se puede controlar con el uso de secuencias control que incluyen promotores/potenciadores y otras señales de regulación de expresión. Se puede usar promotores procariotas y promotores funcionales en células eucariotas. Se puede usar promotores específicos de tejido o específicos de estímulos. Además, se puede usar promotores quiméricos que comprenden elementos de secuencias a partir de dos o más promotores distintos descritos anteriormente.

El polipéptido producido por una célula recombinante huésped por expresión de la secuencia de nucleótidos se puede secretar o puede estar contenido intracelularmente , según la secuencia y/o vector que se use. Las secuencias codificantes se pueden diseñar con secuencias señal que dirigen la secreción de la sustancia de las secuencias codificantes a través de una membrana celular procariota o eucariota determinada .

Constructos El término "constructo" , que es sinónimo de términos como "conjugado", "cásete" e "híbrido", incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas tal como se define en la presente descripción para usar de conformidad con la presente invención con una unión directa o indirecta con un promotor. Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo de separadores adecuados, tal como una secuencia de intrones, tal como el Shl-intrón o el intrón ADH, intermedio del promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es válido para el término "fusionada" en relación con la presente invención que incluye una unión directa o indirecta. En algunos casos, los términos no incluyen la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína asociada normalmente con el promotor del gen silvestre y cuando ambos se encuentran en su ambiente natural .

El constructo puede, además, contener o expresar un marcador que permite la selección de la construcción genética.

Para algunas aplicaciones el constructo comprende, preferentemente, por lo menos una secuencia de nucleótidos de la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene las propiedades específicas tal como se define en la presente descripción unido operativamente a un promotor.

Organismo El término "organismo", con respecto a la presente invención, incluye cualquier organismo que podría comprender una secuencia de nucleótidos de conformidad con la presente invención o una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades específicas tal como se define en la presente descripción y/o productos obtenidos de estas .

El término "organismo transgénico" , con respecto a la presente invención, incluye cualquier organismo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades específicas tal como se define en la presente descripción y/o los productos que se obtienen de esta y/o en donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades específicas tal como se define en la presente descripción dentro del organismo. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos se incorpora en el genoma del organismo.

El término "organismo transgénico" no incluye las secuencia codificantes de nucleótidos naturales en su ambiente natural cuando se encuentran bajo el control de su promotor natural que es, además, su ambiente natural.

Por lo tanto, el organismo transgénico de la presente invención incluye un organismo que comprende cualquiera de, o combinaciones de, las secuencias de nucleótidos que codifican para un polipéptido con las propiedades específicas tal como se define en la presente descripción, constructos tal como se define en la presente descripción, vectores tal como se define en la presente descripción, plásmidos tal como se define en la presente descripción, células tal como se define en la presente invención o los productos de estos. Por ejemplo, el organismo transgénico puede comprender, además, una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene las propiedades especificas tal como se define en la presente descripción bajo control de un promotor no asociado con una secuencia que codifica una lípido aciltransferasa de naturaleza.

Transformación de células/organismo huésped El organismo huésped puede ser un organismo procariota o eucariota .

Los ejemplos de huéspedes procariotas adecuados incluyen bacterias, tales como E. coli y bacilo licheniformis, preferentemente, B. licheniformis.

Las enseñanzas sobre la transformación de huéspedes procariotas están bien documentadas en la técnica, por ejemplo, ver Sambrook et al; (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Si se usa un huésped procariota, después, puede ser necesario modificar la secuencia de nucleótidos antes de la transformación, tal como mediante la eliminación de intrones.

En otra modalidad el organismo transgénico puede ser una levadura .

Es posible transformar células de hongos filamentosos con el uso de diversos métodos conocidos en la técnica, tal como un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida por la regeneración de la pared celular en una manera conocida. El uso de Aspergillus como microorganismo huésped se describe en la patente europea núm. EP 0 238 023.

Otro organismo huésped puede ser una planta. Una revisión de las técnicas generales que se usan para transformar plantas se puede encontrar en artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol

[1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food- Industry Hi-Tech marzo/abril 1994 17-27) . Además, en la patente europea núm. EP-A-0449375 se puede encontrar enseñanzas sobre la transformación vegetal.

Las enseñanzas generales sobre la transformación de hongos, levaduras y plantas se presentan en las siguientes secciones .

Hongos transformados Un organismo huésped puede ser un hongo, tal como un hongo filamentoso. Los ejemplos de huéspedes adecuados incluyen cualquier miembro que pertenece a los géneros Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma y similares.

Las enseñanzas sobre la transformación de hongos filamentosos se revisan en la patente de los Estados Unidos núm. US-A-5741665 , que afirma que las técnicas convencionales para la transformación de hongos filamentosos y el cultivo de los hongos se conocen bien en la técnica. Una revisión extensa de las técnicas como se aplican a N. crassa se encuentra, por ejemplo, en Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.

Enseñanzas adicionales sobre hongos filamentosos se encuentran en la patente de Estados Unidos núm. US-A-5674707.

En un aspecto, el organismo huésped puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.

Un Aspergillus transgénico de conformidad con la presente invención se puede preparar, además, por seguimiento, por ejemplo, de las enseñanzas de Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation . En: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editores) Aspergillus: 50 años. Progress in industrial microbiology, vol . 29. Elsevier Amsterdam 1994. págs . 641-666) .

La expresión génica en hongos filamentosos se ha revisado en Punt et al. (2002) Trends Biotechnol, mayo 2002;20 (5) :200-6, Archer ScPeberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17 (4) :273-306.

Levadura transformada En otra modalidad, el organismo transgénico puede ser una levadura .

Una revisión de los principios de la expresión génica heteróloga en la levadura se proporciona en, por ejemplo, Methods Mol Biol (1995), 49:341-54 y Curr Opin Biotechnol (1997) oct; 8(5) :554-60 En este sentido, la levadura, tal como las especies Saccharomyces cerevisi o Pichia pastoris (ver FEMS Microbiol Rev (2000, 24 (1) :45-66) , se puede usar como un vehículo para la expresión génica heteróloga.

Una revisión de los principios de la expresión génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de productos génicos la proporciona E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2.° edición, Academic Press Ltd.).

Se ha desarrollado varios protocolos de transformación para la transformación de la levadura. Por ejemplo, una Saccharomyces transgénica de conformidad con la presente invención se puede preparar al seguir las enseñanzas de Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929) ; Beggs , J D (1978, iVature, Londres, 275, 104); e Ito, H et al; (1983, J Bacteriology 153, 163-168) .

Las células de levadura transformadas se pueden seleccionar con el uso de varios marcadores selectivos, tales como marcadores auxotróficos y marcadores dominantes de resistencia a antibióticos.

Un organismo huésped de levadura adecuado se puede seleccionar de las especies de levadura biotecnológicamente relevantes, tales como, pero sin limitarse a, las especies de levadura seleccionadas de Pichia spp., Hansenula sp . , Kluyveromyces, Yarrowinia spp., Saccharomyces spp., que incluyen S. cerevisiae, o Schizosaccharomyce spp. que incluyen Schizosaccharomyce pombe.

Una cepa de las especies de levadura metilotrófica Pichia pastoris se puede usar como el organismo huésped.

En una modalidad el organismo huésped puede ser una especie Hansenula, tal como H. polymorpha (tal como se describe en la patente núm. WO 01/39544) .

Plantas/células vegetales transformadas Un organismo huésped adecuado para la presente invención puede ser una planta. Una revisión de las técnicas generales se puede encontrar en artículos de Potrykus {Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol

[1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech marzo/abril 1994 o en la patente núm. WO 01/16308. La planta transgénica puede producir niveles mejorados de ésteres de fitosterol y esteres de fitostanol, por ejemplo.

Por lo tanto, la presente invención se relaciona, además, con un método para la producción de una planta transgénica con niveles mejorados de ésteres de fitosterol y ésteres de fitostanol; el método comprende las etapas de transformar una célula vegetal con una lípido aciltransferasa tal como se define en la presente descripción (particularmente, con un vector o constructo de expresión que comprende una lípido aciltransferasa como lo define la presente invención) y cultivar una planta a partir de la célula vegetal transformada.

Secreción Frecuentemente, se prefiere que el polipéptido se secrete del huésped de expresión en el medio de cultivo desde donde la enzima se puede recuperar con más facilidad. De conformidad con la presente invención, la secuencia líder de secreción se puede seleccionar en base a un huésped de expresión deseado. Las secuencias señal híbridas se pueden usar, además, en el contexto de la presente invención.

Los ejemplos típicos de secuencias líder de secreción no relacionadas con una secuencia de nucleótidos que codifican una lípido aciltransferasa de naturaleza son aquellas que se originan a partir del gen de la amiloglucosidasa fúngica (AG) (glaA, ambas versiones de 18 y de 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus) , el gen del a-factor (por ejemplo, levaduras, Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de la a-amilasa {Bacillus) .

Detección En la técnica se conoce una gran variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , el radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) y la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) .

Aquellos con experiencia en la técnica conocen una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación y se pueden usar en varios ensayos de ácidos nucleicos y de aminoácidos .

Varias compañías, tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) , Promega (Madison, I) y US Biochemical Corp (Cleveland, OH) , suministran kits comerciales y protocolos para estos procedimientos.

Las moléculas reporteras o etiquetas adecuadas incluyen aquellos radionúclidos , enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos , así como, sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Las patentes que enseñan el uso de tales etiquetas incluyen las patentes de los Estados Unidos núms . US 3,817,837; US 3,850,752; US 3,939,350; US 3,996,345; US 4,277,437; US 4,275,149 y US 4,366,241.

Además, las inmunoglobulinas recombinantes se pueden producir tal como se muestra en la patente de los Estados Unidos núm. US-A- , 816 , 567.

Proteínas de fusión La lípido aciltransferasa para usar en la presente invención se puede producir como una proteína de fusión, por ejemplo, para ayudar en la extracción y purificación de estas. Los ejemplos de los colaboradores de las proteínas de fusión incluyen glutatión-S- transíerasa (GST) , 6xHis, GAL4 (dominios de enlace a ADN y/o dominios de activación transcripcional ) y ß -galactosidasa . Además, puede ser conveniente incluir un sitio de clivaje proteolítico entre el colaborador de las proteínas de fusión y la secuencia de interés de la proteína para permitir la eliminación de las secuencias de proteínas de fusión. Preferentemente, la proteína de fusión no impedirá la actividad de la secuencia de proteínas.

Los sistemas de expresión de fusión de genes en E. coli se han revisado en Curr. Opin. Biotechnol . (1995) 6(5) : 501-6.

La secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas, tal como se define en la presente invención, puede estar unida a una secuencia no natural para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para la evaluación de las bibliotecas de péptidos para analizar agentes capaces de afectar la actividad de la sustancia puede ser útil codificar una sustancia quimérica que expresa un epítope no natural que es reconocido por un anticuerpo disponible comercialmente .

Determinación de la actividad fosfolipasa (ensayo TIPU- K) : Sustrato : Se disolvió L-a fosfatidilcolina al 0.6% planta 95% (Avanti núm. 441601), Triton-X 100 al 0.4% (Sigma X-100) y CaCl2 5 mM en amortiguador de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) 0.05M con un pH de 7.

Procedimiento del ensayo: Se agregó 34 µ? de sustrato en una cubeta con el uso de un analizador automático KoneLab. Al tiempo T= 0 min, se agregó 4 µ? de solución enzimática. Además, se analizó un vacío con agua en lugar de la enzima. La muestra se mezcló y se incubó a 30°C durante 10 minutos.

El contenido de ácidos grasos libres de la muestra se analizó con el uso del kit NEFA C de WAKO GmbH.

La actividad enzimática TIPU con un pH de 7 se calculó como ácido graso en micromoles producido por minuto en condiciones de ensayo.

Ejemplo 1. Expresión de KLM3 ' en Bacillus licheniformis Una secuencia de nucleótidos (sec. con núm. de ident . 49) que codifica una lípido aciltransferasa (sec. con núm. de ident. 16, de aquí en adelante KLM3 ' ) se expresó en Bacillus licheniformis como una proteína de fusión con el péptido señal de -amilasa de B. licheniformis (LAT) (ver las Figuras 53 y 54) . Para la expresión óptima en Bacillus, se ordenó un constructo génico optimizado por codones (núm. 052907) en Geneart (Geneart AG, Regensburg, Alemania) .

El constructo núm. 052907 contiene un promotor LAT incompleto (solo la secuencia -10) frente al gen precursor LAT-KLM3' y la transcripción de LAT (Tlat) corriente abajo del gen precursor LAT-KLM3' (ver las Figuras 53 y 55). Para crear un fragmento Xhol que contiene el gen precursor LAT-KLM3 ' flanqueado por el promotor de LAT completo en el extremo 5' del terminador de LAT en el extremo 3' , se realizó una amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con los iniciadores Plat5XhoI_F y EBS2XhoI_RV y el constructo génico 052907 como plantilla.

Plat5XhoI_FW: ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaa aattc ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg EBS2XhoI_RV : tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc La PCR se realizó en un termociclador con ADN-polimerasa de alta fidelidad Phusion (Finnzymes OY, Espoo, Finlandia) de conformidad con las instrucciones del fabricante (temperatura de hibridación de 55°C) .

El fragmento resultante de PCR se digirió con la enzima de restricción Xhol y se ligó con ADN-ligasa T4 en Xhol digerido en pICatH de conformidad con las instrucciones del proveedor (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos) .

La mezcla de ligación se transformó en la cepa de B. subtilis SC6.1, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. US 2002-0182734 (patente núm. WO 02/14490) . La secuencia del inserto Xhol que contiene el gen precursor LAT-KLM3' se confirmó mediante secuenciación de ADN (BaseClear, Leiden, Países Bajos) y uno de los clones de plásmidos se designó pICatH-KLM3 ' (oril) (Figura 53) . plCatH-KLM3 ' (oril) se transformó en la cepa de B. licheniformis BML780 (un derivado de BRA7 y BML612, ver la patente núm. WO 2005111203) a la temperatura permisiva (37°C) .

Se seleccionó un transformante resistente a la neomicina (neoR) y resistente al cloranfenicol (CmR) y se designó BML780 (plCatH-KLM3' (oril) ) . El plásmido en BML780 (plCatH-KLM3 ' (oril)) se integró en la región catH en el genoma de B. licheniformis mediante el crecimiento de la cepa a una temperatura no permisiva (50°C) en medio con 5 mg/ml de cloranfenicol . Se seleccionó un clon resistente a CmR y se designó B L780-plCatH-KLM3 ' (oril) . BML780-plCatH- KLM3 ' (oril ) se cultivó nuevamente a temperatura permisiva por varias generaciones sin antibióticos para eliminar las secuencias de vectores y, después, se seleccionó un clon CmR sensible a la neomicina (neoS) . En este clon las secuencias de vectores de plCatH en el cromosoma se eliminan (incluso el gen resistente a la neomicina) y solo se deja el cásete catH - LATKLM3 ' . Después, el cásete catH - LATKLM3 ' en el cromosoma se amplificó mediante el crecimiento de la cepa en/sobre medios con concentraciones cada vez mayores de cloranfenicol . Después de varias rondas de amplificación, se seleccionó un clon (resistente contra 50 mg/ml de cloranfenicol) y se designó BML780-KLM3 ' CAP50. Para comprobar la expresión de KLM3 ' , se cultivó BML780-KLM3' CAP50 y BML780 (la cepa huésped vacía) durante 48 horas a 37°C en una placa de agar Heart Infusión (Bacto) con tributirina al 1%. Una zona de despeje, indicativa para la actividad de la lípido aciltransferasa, fue claramente visible alrededor de la colonia de B L780-KL 3'CAP50 pero no alrededor de la cepa huésped BML780 (ver la Figura 56) . Este resultado muestra que una cantidad sustancial de KLM3 ' se expresa en la cepa de B. licheniformis BML780-KLM3 ' CAP50 y que estas moléculas de KLM3 ' son funcionales.

Ejemplo comparativo 1 Constructo de vectores El constructo plasmídico es pCS32new N80D que es un derivado de pCCmini que porta la secuencia que codifica la forma madura de la glicerofosfolípido-colesterol aciltransferasa de Aeromonas salmonicida natural con una sustitución Asn a Asp en la posición 80 (KLM31 ) , bajo control del promotor p32 y con una secuencia señal de CGTasa.

La cepa huésped usada para la expresión se encuentra en la cepa 0S21DAprE de Bacillus subtilis.

El nivel de expresión se determina como la actividad transferasa y se expresa como el% de colesterol esterificado, que se calcula a partir de la diferencia del colesterol libre en la muestra de referencia y del colesterol libre en la muestra de la enzima en reacciones con PC (TPC) como donante y el colesterol como molécula aceptora.

Condiciones de cultivo 5 mi de caldo de cultivo LB (10 g/1 de digestión enzimática de caseína, 5 g/1 de extracto de levadura con bajo contenido en sodio; 5 g/1 de cloruro sódico, 2 g/1 de productos auxiliares tableteados inertes) suplementado con 50 mg/1 de canamicina se inocularon con una sola colonia y se incubaron a 30°C durante 6 horas a 205 rpm. 0.7 mi de este cultivo se usaron para inocular 50 mi de medio SAS (10 g/1 de K2HP04; 40 g/1 de MOPS (ácido 3 -morfolinopropanosulfónico) ; 5 g/1 de cloruro sódico; 5 gotas/1 de antiespumante (Sin 260) ; 20 g/1 de harina de soja desgrasada; 20 g/1 de Biospringer 106 (dw YE al 100%) ) suplementado con 50 mg/1 de canamicina y una solución de hidrolisatos de almidón con alto contenido de maltosa (60 g/1) . Se continuó la incubación durante 40 horas a 30°C y 180 rpm antes de separar el sobrenadante del cultivo por centrifugación a 19000 rpm durante 30 min. El sobrenadante se trasladó a un tubo limpio y se usó directamente para la medición de la actividad transferasa.

Preparación de sustratos y reacción enzimática Se pesó PC (lípidos polares Avanti núm. 441601) y colesterol (Sigma C8503) en una relación de 9:1, se disolvieron en cloroformo y se evaporaron hasta secar completamente .

El sustrato se preparó por dispersión de PC : colesterol al 3%, 9:1, en amortiguador HEPES 50 mM, pH 7.

Se trasladó 0.250 mi de la solución de sustrato en un tubo de vidrio con tapa de rosca de 3 mi . Se agregó 0.025 mi del sobrenadante del cultivo y la mezcla se incubó a 40 °C durante 2 horas. Además, se preparó una muestra de referencia con agua en lugar de enzima. El calentamiento de la mezcla de reacción en baño de agua hirviente durante 10 minutos detuvo la reacción enzimática. Se agregó 2 mi de etanol al 99% a la mezcla de reacción antes de someterla a análisis de ensayo de colesterol .

Ensayo de colesterol 100 µ? de sustrato que contiene 1.4 U/ml de colesterol oxidasa (SERVA Electrophoresis GmbH cat . núm. 17109), 0.4 mg/ml de ABTS (Sigma A-1888) , 6 U/ml de peroxidasa (Sigma 6782) en Tris-HCl 0.1 M, pH 6.6 y Tritón X-100 al 0.5% (Sigma X-100) se incubaron a 37°C durante 5 minutos antes de agregar y mezclar 5 µ? de la muestra de reacción enzimática. La mezcla de reacción se incubó durante 5 minutos adicionales y se determinó OD405. El contenido de colesterol se calculó a partir de los análisis de soluciones estándar de colesterol que contienen 0.4 mg/ml , 0.3 mg/ml, 0.20 mg/ml , 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml y 0 mg/ml de colesterol en etanol al 99%.

Resultados La Tabla 7 a continuación muestra el promedio de 8 cultivos de expresión separados: Tabla 7 a Tpc es la actividad transferasa expresada como% de colesterol esterificado, que se calcula a partir de la diferencia de colesterol libre en la muestra de referencia y el colesterol libre en la muestra de enzima en reacciones con PC como molécula donante y el colesterol como molécula aceptora . b Promedio de 8 cultivos de expresión separados Ejemplo 2. Prueba enzimática En las pruebas descritas a continuación el contenido de humedad, el tiempo de humectación y los niveles de colesterol y de éster de colesterol de la leche en polvo formada por secado por aspersión de 25 litros de leche entera estándar tratada con una enzima durante 30 minutos y 4 horas (como se describe a continuación) se compararon con la leche en polvo formada por el suministro de 25 litros de leche entera estándar directamente en la torre de secado por aspersión (de aquí en adelante, muestra control) .

Tratamiento enzimático de leche entera de ARLA Se calentó 20 litros de leche entera hasta 40°C y se agregó 76 mi de una solución de la enzima de la sec. con núm. de ident. 16 (de aquí en adelante KLM3 ' ) , (KTP08015, 1300 TIPU/g de leche, correspondientes a 12.4 mg de enzima/g de leche) .

Se continuó con el mezclado durante 38 minutos para asegurar la homogeneidad y, después, la leche tratada se dividió en 2 lotes. El lote 1 se bombeó inmediatamente hacia la torre de rociado; el lote 2 se bombeó hacia la torre de rociado 4 horas después de agregar la enzima.

Los parámetros usados para la operación del secador por aspersión de la planta piloto durante las pruebas fueron los siguientes : Muestra control (leche entera de ARLA) Torre de rociado: secador NIRO modelo P 6.3; 400 m3 ; entrada de aire a 220°C; potencia 54 k .

Temperaturas de salida: 105 / 40.5°C (aire/producto).

Temperatura de alimentación 40°C. Bomba de alimentación Rannie 17 rpm.

Presión de las boquillas de rociado 18 MPa (180 bar) (ata). Tipo de boquillas KMFP SKYM M76.

Lote tratado con enzimas 1 400 m3; entrada de aire a 195°C; potencia 48 k .

Temperaturas de salida: 100-103 / 43°C (aire/producto) .

Temperatura de alimentación 40°C. Bomba de alimentación Rannie 15 rpm.

Presión de las boquillas de rociado 16 MPa (160 bar) (ata). Tipo de boquillas KMFP SKYM M76.

Lote tratado con enzimas 2 400 m3; entrada de aire a 195°C; potencia 48 kW.

Temperaturas de salida: 100-103 / 43°C (aire/producto) .

Temperatura de alimentación 42°C. Bomba de alimentación Rannie 16 rpm.

Presión de las boquillas de rociado: 17.5 MPa (175 bar) (ata). Tipo de boquillas KMFP SKYM M76.

Ejemplo 3. Prueba de humectabilidad Se analizó la humectabilidad de las leches en polvo derivadas del Ejemplo 2 de conformidad con el método IDF 87:1979 con la debida consideración del hecho de que el método pretende analizar leches en polvo instantáneas, mientras que el polvo elaborado del secador de la planta piloto es un polvo no instantáneo y sin aglomeraciones. El aparato usado se ilustra en la Figura 76.

Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Las características de los polvos muestran que el polvo elaborado de leche tratada con enzimas fluye más libremente y una tendencia ligeramente menor a formar grumos Tabla 8 Ejemplo 4. Análisis del contenido de humedad residual en las muestras en polvo después del almacenamiento Las muestras preparadas de conformidad con el Ejemplo 2 descrito anteriormente se analizaron para evaluar el contenido de humedad residual en las muestras en polvo después del almacenamiento durante una semana a 5°C con el uso de un analizador de humedad ML-50 de A&D Company, Limited. Los análisis de humedad se realizaron después de secar a 120°C hasta obtener un peso constante y a 140°C hasta obtener un peso constante. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Ejemplo 5. Determinación de los niveles de colesterol y de áster de colesterol Las muestras de leche en polvo preparadas en el Ejemplo 2 descrito anteriormente se analizaron por CGL para determinar el contenido de colesterol y de éster de colesterol. El método usado se describe a continuación.

Se peso 100 mg de leche en polvo en un tubo de centrifugadora de 15 mi con tapa. Se agregó 5 mi de cloroformo ¡metanol 2:1 y la muestra se extrajo durante 30 minutos por rotación en un RotaMix® a 40 rpm. La muestra se centrifugó. Una alícuota pesada del solvente se trasladó a un vial Dramglass de 10 mi y el solvente se evaporó con un vapor de nitrógeno a 50°C. La muestra aislada se analizó por CGL. Cromatografía de gases: Cromatógrafo capilar de gases Perkin Elmer Autosystem 9000 equipado con una columna de silicio fundido WCOT con un grosor de película de 12.5 m x 0.25 mm ID x 0.1 µ, fenilo al 5%-metil-silicona (CP Sil 8 CB de Chrompack) .

Gas portador: helio.

Inyector. Inyección por división de PSSI frío (temp. inicial 50°C calentado hasta 385°C) , volumen 1.0 µ? .

Detector FID : 395°C Programa del horno (usado desde 30.10.2003) : 1 2 3 Temperatura del horno, °C. 90 280 350 Tiempo isotérmico, min. 1 0 10 Velocidad de la temperatura, °C/min. 15 4 Preparación de muestras de leche para análisis por CG: La fracción de lípido se disuelve nuevamente en heptano/piridina (2:1) que contiene heptadecano como estándar interno y el colesterol se determina por CG.

Después, la solución de muestra de 500 µ? se traslada a un vial con tapón engargolado, se agrega 100 µ? de MSTFA:TMCS - 99:1 (N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida) y se hace reaccionar durante 20 minutos a 60°C.

Cálculo: los factores de respuesta para el colesterol y ésteres de colesterol se determinan de material de referencia puro (al pesar para material puro 8-10 mg en 12 mi de piridina, que contiene heptadecano interno estándar, 0.5 mg/ml) .

Los resultados se muestran en la Tabla 11 a continuación.

Tabla 10 Conclusiones El tratamiento enzimático de la leche entera con la lípido aciltransferasa KLM3 tiene un fuerte impacto en la humectabilidad de la leche en polvo producida de la leche. El tratamiento enzimático tiene, además, un impacto sobre la temperatura de secado, debido que se muestra que las muestras tratadas con enzimas tienen un contenido de agua más bajo que el control .

El colesterol libre en la leche producida de leche tratada con aciltransferasa se redujo significativamente en comparación con un control sin tratamiento enzimático.

Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anteriormente se incorporan en la presente descripción como referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistema de la presente invención descritos resultarán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la presente invención. Aunque la presente invención se ha descrito en relación con modalidades preferidas específicas, debe comprenderse que la invención tal como se reivindica no debe limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la presente invención que son obvias para los expertos en bioquímica y biotecnología o campos relacionados pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para producir leche en polvo, caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto leche o una fracción de esta con una enzima lípido aciltransferasa ; y (b) secar la leche tratada con la enzima para producir leche en polvo.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la lípido aciltransferasa se selecciona de lípido aciltransferasas en la clase enzimática (E.C.) 2.3.1.x.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la lípido aciltransferasa se selecciona de lípido aciltransferasas en la clase enzimática (E.C.) 2.3.1.43.

4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque la actividad aciltransferasa representa por lo menos 10% de la actividad total de la lípido aciltransferasa .

5. Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la actividad aciltransferasa representa por lo menos 50% de la actividad total de la lípido aciltransferasa .

6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5, caracterizado porque la lípido aciltransferasa es una enzima que al evaluar con el ensayo de transferasa definido en la presente descripción tiene por lo menos 10% de actividad aciltransferasa .

7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6, caracterizado porque la lípido aciltransferasa es una lípido aciltransferasa que tiene la capacidad de esterificarse por lo menos aproximadamente 10% del colesterol presente en la leche inicial.

8. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7, caracterizado porque la lípido aciltransferasa comprende un motivo GDSx y/o un motivo GANDY.

9. Un método de con ormidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la enzima lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que tiene actividad aciltransferasa y que comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

10. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lípido aciltransferasa es obtenible, obtenida, preferentemente, de un organismo de uno o más de los siguientes géneros: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobiu , Ralstonia, Xanthomonas y Candida .

11. Un método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la lípido aciltransferasa es obtenible, obtenida, preferentemente, de un organismo del género Aeromonas .

12. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa cuyo polipéptido se obtiene por la expresión of cualquiera de las secuencias de nucleótidos que se muestran como sec. con núm. de ident . 36, sec . con núm. de ident . 38, sec . con núm . de ident . 39, sec . con núm . de ident . 42, sec . con núm . de ident . 44, sec . con núm . de ident . 46, sec . con núm . de ident . 48, sec . con núm . de ident . 49, sec . con núm . de ident . 50, sec . con núm . de ident . 51, sec . con núm . de ident . 52, sec . con núm . de ident . 53, sec . con núm . de ident . 54, sec . con núm . de ident . 55, sec . con núm . de ident . 56, sec . con núm . de ident . 57, sec . con núm . de ident . 58, sec . con núm . de ident. 59, sec. con núm. de ident . 60, sec . con núm. de ident . 61, sec. con núm. de ident. 62 o sec. con núm. de ident. 63 o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con esta.

13. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa cuyo polipéptido se obtiene por la expresión de: (i) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 49 o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con esta; (ii) un ácido nucleico que codifica el polipéptido, en donde el polipéptido es por lo menos 70% idéntico a la secuencia de polipéptidos que se muestra en la sec. con núm. de ident. 16 o a la secuencia de polipéptidos que se muestra en la sec. con núm. de ident. 68; o (iii) un ácido nucleico que se hibridiza en condiciones de rigurosidad media en una sonda nucleica que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 49.

14. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa, cuyo polipéptido comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran como sec . con núm. de ident . 1, sec. con núm. de ident . 3, sec. con núm. de ident. 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident. 10, sec. con núm. de ident. 11, sec. con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14, sec. con núm. de ident. 15, sec. con núm. de ident. 17, sec. con núm. de ident. 16, sec. con núm. de ident. 17, sec. con núm. de ident. 18, sec. con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 35, sec. con núm. de ident. 68 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con ésta.

15. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa, cuyo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 68 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con esta.

16. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lípido aciltransferasa se pone en contacto con la leche y se incuba con esta a una temperatura entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 70°C.

17. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la lípido aciltransferasa se pone en contacto con la leche y se incuba con esta a una temperatura entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C.

18. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lípido aciltransferasa se pone en contacto con la leche y se incuba con esta durante un período entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 36 horas.

19. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la lípido aciltransferasa se pone en contacto con la leche y se incuba con esta durante un período entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 12 horas.

20. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la leche tratada con la enzima se seca por secado por aspersión para producir leche en polvo.

21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la leche tratada con la enzima se coloca en el secador por aspersión a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95 °C.

22. Un método de conformidad con la reivindicación 20 o 21, caracterizado porque la temperatura del aire de salida del secador por aspersión se encuentra en el intervalo de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 150 °C.

23. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a la 22, caracterizado porque la temperatura de la salida del producto del secador por aspersión se encuentra en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 60 °C.

24. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la leche tratada con la enzima se seca por secado en tambor para producir leche en polvo.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la temperatura del tambor se encuentra en el intervalo de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 150°C.

26. Leche en polvo caracterizada porque se obtinen por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25.

27. Leche en polvo caracterizada porque se obtiene por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25.

28. Un producto de leche caracterizado porque se produce por rehidratación de la leche en polvo de conformidad con la reivindicación 26 o 27.

29. El uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para mejorar las propiedades de rehidratación de la leche en polvo.

30. El uso de conformidad con la reivindicación 29, en donde las propiedades mejoradas de rehidratación comprenden una reducción en la humectabilidad de la leche en polvo.

31. El uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para mejorar la diferencia sensorial perceptible de la leche en polvo.

32. El uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para mejorar el olor y/o sabor de la leche en polvo.

33. El uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para reducir el contenido de colesterol de la leche en polvo.

34. El uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para reducir el contenido de ácidos grasos libres de la leche en polvo en comparación con leche en polvo que durante su elaboración se ha tratado con una fosfolipasa.

35. El uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para mejorar la fluidez de la leche en polvo.

36. El uso de una lípido aciltransferasa en la elaboración de leche en polvo para reducir la contaminación del equipo usado en la elaboración de la leche en polvo.

37. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 35, en donde la lípido aciltransferasa se selecciona de lípido aciltransferasas en la clase de enzima (E.C.) 2.3.1.x.

38. El uso de conformidad con la reivindicación 37, en donde además la lípido aciltransferasa se selecciona de lípido aciltransferasas en la clase de enzima (E.C.) 2.3.1.43.

39. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 38, en donde la actividad aciltransferasa representa por lo menos 10% de la actividad total de la lípido aciltransferasa

40. El uso de conformidad con la reivindicación 39, en donde la actividad aciltransferasa representa por lo menos 50% de la actividad total de la lípido aciltransferasa .

41. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 40, en donde la lípido aciltransferasa es una enzima que al evaluar con el ensayo de transferasa definido en la presente descripción tiene por lo menos 10% de actividad aciltransferasa .

42. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 41, en donde la lípido aciltransferasa es una lípido aciltransferasa que tiene la capacidad de esterificarse por lo menos aproximadamente 10% del colesterol presente en la leche inicial

43. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 42, en donde la lípido aciltransferasa comprende un motivo GDSx y/o un motivo GA DY.

44. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 43, en donde la enzima lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que tiene actividad aciltransferasa y que comprende el motivo GDSX de la secuencia de aminoácidos, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S.

45. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 44, en donde la lípido aciltransferasa es obtenible, obtenida, preferentemente, de un organismo de uno o más de los siguientes géneros: Aero-nonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

46. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 45, en donde la lípido aciltransferasa es obtenible, obtenida, preferentemente, de un organismo del género Aeromonas.

47. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 46, en donde la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa , cuyo polipéptido se obtiene por la expresión de : cualquiera de las secuencias de nucleótidos que se muestran como sec . con núm . de ident. 36, sec . con núm. de ident . 38, sec . con núm. de ident . 39, sec . con núm . de ident . 42, sec . con núm. . de ident • 44, sec . con núm. de ident . 46, sec . con núm. , de ident . 48, sec . con núm. de ident . 49, sec . con núm. . de ident . 50, sec . con núm. de ident . 51, sec . con núm. . de ident . 52, sec . con núm. de ident . 53, sec . con núm. . de ident . 54, sec . con núm. de ident . 55, sec . con núm. . de ident . 56, sec . con núm. de ident . 57, sec . con núm. . de ident . 58, sec . con núm . de ident . 59, sec . con núm. . de ident . 60, sec . con núm . de ident . 61, sec . con núm. de ident . 62 o sec. con núm. de ident . 63 o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con esta.

48. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 47, en donde la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa, cuyo polipéptido se obtiene por la expresión de: (i) la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 49 o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con esta; (ii) un ácido nucleico que codifica el polipéptido, en donde el polipéptido es por lo menos 70% idéntico a la secuencia de polipéptidos que se muestra en la sec. con núm. de ident . 16 o a la secuencia de polipéptidos que se muestra en la sec. con núm. de ident. 68; o (iii) un ácido nucleico que se hibridiza en condiciones de rigurosidad media en una sonda nucleica que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 49.

49. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 48, en donde la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa, cuyo polipéptido comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran como sec. con núm. de ident. 1, sec. con núm. de ident. 3, sec. con núm. de ident. 4, sec. con núm. de ident. 5, sec. con núm. de ident. 6, sec. con núm. de ident. 7, sec. con núm. de ident. 8, sec. con núm. de ident. 9, sec. con núm. de ident. 10, sec. con núm. de ident. 11, sec. con núm. de ident. 12, sec. con núm. de ident. 13, sec. con núm. de ident. 14, sec. con núm. de ident . 15, sec . con núm. de ident . 17, sec. con núm. de ident. 16, sec. con núm. de ident. 17, sec. con núm. de ident. 18, sec. con núm. de ident. 34, sec. con núm. de ident. 35, sec. con núm. de ident. 68 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con esta.

50. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 49, en donde la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad de la lípido aciltransferasa , cuyo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como la sec. con núm. de ident. 68 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con esta.