MX2012005624A - Preparaciones oftalmicas basadas en el factor neurotrofico derivado del cerebro y su uso. - Google Patents
Preparaciones oftalmicas basadas en el factor neurotrofico derivado del cerebro y su uso.Info
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Abstract
La presente invención se relaciona con preparaciones oftálmicas en la forma de gotas para ojos basadas en BDNF (Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro); las preparaciones pueden ser administradas tópicamente a la superficie del ojo intacta, y son útiles en la prevención y el tratamiento de trastornos neurodegenerativos de la retina, nervio óptico, cuerpo genicular lateral y corteza visual, para evitar la reducción de la capacidad visual y restablecer la función visual normal.
Description
PREPARACIONES OFTÁLMICAS BASADAS EN EL FACTOR
NEUROTRÓFICO DERIVADO DEL CEREBRO Y SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con preparaciones oftálmicas en la forma de gotas para ojos, las cuales contienen el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y un agente de control de viscosidad, preferiblemente un galactoxiloglucano extraído de semillas de tamarindo, también conocido como TS-polisacárido o TSP.
Las preparaciones son útiles para la prevención y el tratamiento de trastornos retínales neurodegenerativos, especialmente retinitis pigmentosa, glaucoma (incluyendo glaucoma congénito, glaucoma infantil, glaucoma juvenil, glaucoma de adulto, glaucoma de ángulo-abierto primario, glaucoma de cierre-ángulo primario, glaucoma secundario, glaucoma iatrógeno y glaucoma agudo), retínopatías relacionadas con la edad tales como degeneración macular relacionada con la edad, trastornos retínales proliferativos y vasculares, desprendimiento de la retina, retinopatía de prematurídad (ROP) y retinopatía diabética, todos los trastornos los cuales conducen a ceguera.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Neurotrofinas son proteínas sintetizadas por las neuronas las cuales controlan el trofismo normal y supervivencia de varias células presentes en el sistema nervioso.
El que mejor se conoce es el factor de crecimiento nervioso (NGF), descubierto por R. Levi-Montalcini y S. Cohén a mediados del siglo 20.
Otros factores, cuya estructura de proteína presenta similitudes estructurales con esa de NGF, fueron descubiertos después; en consecuencia, ahora se considera una clase de factores NGF (neurotrofinas) a los cuales pertenecen BDNF, NT-3, NT-4/5 y NT-6 así como NGF (los primeros tres son expresados principalmente en el sistema nervioso de mamíferos, mientas que NT-6 es un nuevo miembro de neurotrofinas identificado en teleósteo de pescado y ausente en cerebro de mamífero.
Factores neurotróficos, incluyendo neurotrofinas, son liberados por neuronas las cuales los sintetizan, y se unen a receptores específicos sobre la membrana.
A pesar de sus similitudes estructurales, las varias neurotrofinas actúan a través de diferentes receptores, y consecuentemente a través de mecanismos de acción diferentes.
La unión de un factor neurotrófico a su receptor específico (TrkA para NGF; TrkB para BDNF, y parcialmente para NT-4; TrkC para NT-3) genera una cascada de eventos, los cuales inducen una respuesta específica por la neurona.
Diferentes receptores de neurotrofina son expresados en diferentes áreas y, dentro de la misma área, en diferentes células, activando trayectorias se transducción de señal intracelular específica. Por lo tanto sigue lógicamente que no todas las áreas o neuronas pueden responder a cada una de las neurotrofinas; el factor limitante es la distribución celular del receptor específico para na neurotrofina dada.
La distribución de células retínales permite sintetizar y liberar NGF, el arquetipo de las neurotrofinas, y la distribución de células retínales que expresa el receptor NGF (TrkA), parece muy limitada y está restringida en la práctica a un sub-grupo de células de ganglio y células (García et al., 2003).
EP 1 161 256 B1 describe preparaciones oftálmicas conteniendo 200 a 500 g/ml de NGF, para ser administrados a la superficie del ojo intacta para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos afectando la esclerosis, cuerpos ciliares, cristalino, retina, nervio óptico, humor vitreo y/o el coroide.
Como se reportó por Lambíase et al., estas preparaciones incrementan los niveles retínales de NGF; sin embargo, puede ser demostrado que NGF es incapaz de realizar un efecto neuroprotector en la retina.
Esto coincide con los descubrimientos reportados recientemente por Shi et al. (2007). NGF puede unirse a dos tipos de receptor en la retina, TrkA y P75, los cuales ejercen efectos opuestos sobre el trofismo y supervivencia de las neuronas. Cuando NGF exógeno alcanza la retina, ésta por lo tanto puede inducir dos efectos opuestos sobre las células retínales, los cuales tienden a cancelarse entre sí.
De otra manera, BDNF, junto con su receptor, TrkB, es expresado abundantemente en retina de mamífero. La retina consiste de numerosos tipos de células dispuestas en capas. En particular, BDNF es sintetizada por algunas células ganglionares y células amacrinas, tales como las células dopaminérgicas, presentes en la capa interna de la retina (Herzog et al., 1994; Pérez y Caminos, 1995; Hallbook et al., 1996; Herzog y von Bartheld, 1998; Karlsson y Hallbook, 1998; Bennett et al., 1999; Pollock y Frost, 2003; Seki et al., 2003; Chytrova y Johnson, 2004).
El receptor BDNF, llamado TrkB, es expresado en numerosos tipos de células retínales, incluyendo células ganglionares, células amacrina y células gliales Müler (Jelsma et al., 1993; Cellerino y Kohler, 1997, Di Polo et al., 2000).
WO 97/45135 se relaciona con composiciones farmacéuticas de BDNF en la forma de una solución acuosa o de liofilizado. En ese documento, especialmente en la sección dedicada a la técnica anterior, BDNF es mencionado como siendo útil en el tratamiento de varios trastornos, incluyendo retinitis pigmentosa. La única forma de administración mencionada expresamente es preparaciones inyectables.
JP 2003048851 se relaciona con formulaciones oftálmicas basadas en BDNF, para ser administradas en la forma de gotas sobre la conjuntiva. Las formulaciones descritas contienen varios agentes que controlan la viscosidad, descritos como siendo igualmente eficaces en llevar BDNF a la retina.
La evidencia de actividad reportada en los documentos no es convincente, debido a que el intervalo de concentración indicado para BDNF es muy amplio: 0.001-1 % en peso/volumen, correspondiendo a una concentración en el intervalo de entre 1x1 O*2 y 10 pg/µ? [reivindicación 3, ámbito de patente; de conformidad con la descripción detallada de la invención
[0006], párrafo 3, pero en el ejemplo reportado, la concentración usada es = 0.004% (% en peso/volumen), correspondiente a 4x10'2 pg/pl, es decir, mucho menor que las concentraciones eficaces capaces de incrementar los niveles retínales de BDNF y evitar las alteraciones retínales inducidas por exposición prolongada a la luz, los cuales son iguales o mayores que 5 pg/pl, en el intervalo 15-200 pg/µ?, de conformidad con la presente invención. Debería ser notado que en JP 2003048851 la aplicación fue repetida tres veces un día (10 µ?/aplicación, 0.004% en peso/volumen) durante 5 días, igual a una dosis de 1.2 pg/día y una dosis total de 6 pg. Aún si la dosis diaria y la dosis total son tomadas en cuenta, éstas son demasiado bajas para ejercer efectos neuroprotectores; de hecho, de acuerdo con la presente invención, una dosis total mínima de 150 pg tenía que ser administrada tópicamente para obtener efectos neuroprotectores en la retina sometida a daño por luz. Nuevos datos obtenidos con otro modelo experimental, a saber un ratón que desarrolla glaucoma, confirman que de las tres concentraciones de BDNF usadas (1 , 5 y 15 pg/pl), solamente la más alta (15 g/pl) es eficaz.
Además, JP 2003048851 se refiere a un efecto protector de
retina verificado por técnicas histológicas (teñido de secciones de retina con hematoxilina-eosina) diseñadas para medir el espesor retinal, pero no acompañada por una demostración de restauración de la función retinal medida por una grabación de electrorretinograma de destello, como es reportado en la presente invención. Es bien conocido que para demostrar la eficacia neuroprotectora en nivel retinal de cualquier tratamiento, resultados obtenidos con técnicas histológicas/morfológicas solamente son insuficientes; evidencia de restauración de las funciones retínales también es requerido. Por lo tanto puede ser concluido que en JP 2003048851, las composiciones oftálmicas de BDNF en las concentraciones reportadas en los ejemplos, y más generalmente en el intervalo preferido, administradas externamente, son inapropiadas para pasar desde la superficie del ojo hacia el tejido interno en cantidades suficientes para ejercer un efecto neuroprotector capaz de restablecer la función retinal.
WO 2006/046584 se relaciona con composiciones de liberación sostenida conteniendo HGF, BDNF o PEDF, impregnadas con un hidrogel de gelatina reticulada, útil para tratar los trastornos involucrando lesiones de células visuales, tales como degeneración de retinitis pigmentosa. En los ejemplos específicos, las composiciones toman la forma de microesferas conteniendo dosis de BDNF de entre 0.001-1000 pg, y pueden ser administradas mediante inyección infraocular o implante subretinal.
EP 0 958 831 describe composiciones oftálmicas conteniendo un factor neurotrófico seleccionado de un grupo de factores incluyendo BDNF.
Las composiciones pueden ser aplicadas externamente, por ejemplo en la forma de ungüentos oftálmicos o soluciones, o pueden ser formuladas como lentes de contacto.
La concentración del factor neurotrófico descrita en EP0958831 varía desde 0.0001 hasta 0.5% (peso/volumen), es decir desde 1x10"3 hasta 5 g/l. Los intervalos de concentración reportados por lo tanto son muy amplios. EP0958831 es altamente genérico, debido a que se relaciona con varios factores neurotróficos, incluyendo BDNF, lo cual podría ser igualmente eficaz en el intervalo de concentración. Es conocido que los factores neurotróficos no son igualmente eficaces en el mismo intervalo de concentración, debido a las diferentes densidades y distribución de los receptores que determinan sus efectos biológicos en las diferentes áreas del cerebro y neuronas individuales.
Además, EP 958831 es extremadamente vago y no claro acerca del intervalo de concentraciones de BDNF eficaz para uso tópico: en la p. 3 línea 44 (véase los párrafos 0022 y 0033, reivindicaciones 19 y 20) dos intervalos de concentración son proporcionados, los cuales no coinciden (intervalo A máximo, entre 0.0001 y 0.5% (PA/), igual a un intervalo de concentración de entre 10"3 y 5 pg/µ?, e intervalo B, entre 10"3 y 2x105 pg/l; los dos intervalos de concentración claramente no corresponden. De conformidad con la presente invención, sin embargo, las concentraciones eficaces de BDNF son iguales a/mayores que 15 pg/µ? (intervalo 15-200 pg/µ?, es decir, mayor que el intervalo A reportado en EP 958831 , a saber el intervalo de concentración máximo. Los ejemplos en EP 958831 se relacionan con
composiciones oftálmicas caracterizadas por una concentración de BDNF de 0.02, 0.04 y 10 pg/l, es decir, concentraciones las cuales son mucho más bajas (1x10 6 veces menores) que la concentración más baja, la cual, de conformidad con con la presente invención, ha probado ser eficaz en elevar los niveles de BDNF en la retina y evitar tanto daño por luz como daño por glaucoma, principalmente 15 [ig/[¡\.
Por lo tanto puede ser concluido que las composiciones oftálmicas de BDNF en las concentraciones reportadas en EP 958831 , administradas externamente, no pueden pasar desde la superficie del ojo hacia los tejidos internos en cantidades suficientes para incrementar los niveles retínales de BDNF, y consecuentemente para realizar un efecto terapéutico.
NT-4, la otra neurotrofina la cual se une a TrkB, es expresada a un nivel bajo en la retina, y solamente actúa sobre un subgrupo de células amacrina, es decir, aquellas las cuales sintetizan dopamina (Calamusa et al., 2007).
La ausencia de BDNF o su receptor causa alteraciones serias en la función retinal; por ejemplo, ratones que carecen del receptor TrkB (ratones caídos) son caracterizados por pérdida completa de la respuesta retinal a luz (ausencia total de onda-b en el electrorretinograma de destello; Rohrer et al., 1999).
El grupo de LaVail ha demostrado que inyecciones intraocu lares de BDNF, pero no NGF, eficazmente evitan degeneración morfológica de los foto rrecepto res inducidos mediante daño por luz.
Inyecciones intraoculares de BDNF junto con otros factores neurotróficos han reducido el daño a las células ganglionares retínales las cuales resultan de lesiones del nervio óptico, aunque aún no es claro si BDNF es capaz de realizar solo efectos neuroprotectores, es decir, independientemente de otros factores neurotróficos (Watanabe et al., 2003; Yata et al., 2007).
Otros factores neurotróficos tales como FGF2 han probado ser igualmente eficaces en prevenir alteraciones morfológicas causadas por daño de luz, pero a diferencia de BDNF, su administración tiene el efecto indeseado de activar los factores involucrados en la respuesta inflamatoria (LaVail et al., 1987).
Otro factor neurotrófico, CNTF, también evita la degeneración morfológica resultante de daño por luz (LaVail et al. 1978); desafortunadamente, experimentos recientes demuestran que el tratamiento basado basado en CNTF altera la respuesta retinal a luz, imponiendo así una serie de limitaciones en su uso terapéutico potencial (McGill et al., 2007).
Estos resultados indican que para propósitos neuroprotectores en modelos de trastorno retinal, no es suficiente evaluar los efectos morfológicos de moléculas neuroactivas; sobre todo, es esencial evaluar si esas moléculas ejercen efectos protectores sobre la función retinal, y asegurar que éstas no imparten la respuesta de las células retínales a estímulo visual. Existe actualmente una necesidad de identificar nuevas preparaciones BDNF
las cuales pueden ser administradas por técnicas no-invasivas para transportar BDNF a la retina, evitando técnicas de administración altamente invasivas tales como inyecciones retrobulbares, subretinales o intraoculares, las cuales son inapropiadas para tratamiento crónico de largo plazo debido al riesgo de causar perforación del globo ocular, infecciones o sangrado, por ejemplo.
La presente patente propone aplicaciones conjuntivales tópicas en varias formulaciones conteniendo BDNF en un intervalo de concentración de entre 15 y 200 pg/µ?, con una dosis de BDNF total de entre 50 y 4000 pg por administración, de conformidad con el tamaño del ojo a ser tratado, lo cual dependerá de las especies animales de interés, incluyendo humanos.
La formulación contendrá preferiblemente un agente de control de viscosidad. El agente de control de viscosidad es preferiblemente un galactoxiloglucano extraído de semillas de tamarindo (TS-polisacárido o TSP) teniendo un peso molecular de entre 500000 y 800000 Da y la siguiente fórmula estructural:
p-üal-(l?2)-a-Xyl-(l?6)^
a-Xyl-(l?6)-P-Glc-(l?4)- -Glc-(l?4)- -Glc-(l?4)-D-glucitol
p-Gal-(l ->2)-a-Xyl-<l?G
Se demuestra que la preparación, en las concentraciones y dosis por administración indicada, incrementa significativamente los niveles de BDNF retinal y evita i) alteraciones retínales inducidas por exposición prolongada a luz, y ii) alteraciones retínales en glaucoma.
Ha sido demostrado anteriormente (Uccello-Barretta G et al., 2008; Ghelardi E et al., 2004; Burgalassi S et al., 2000; Ghelardi E et al. 2000) que TSP es capaz de transportar moléculas farmacológicamente activas para tratamiento tópico de la superficie del ojo. Incrementando los tiempos de retención de la formulación sobre la superficie del ojo, ha sido observada absorción incrementada de las moléculas activas. Esta propiedad de TSP ha sido descrita en combinación con antibióticos (rufloxacina, gentamicina y ofioxacina), antihistaminas (ketotifeno) y antihipertensivos (timolol), todos los cuales son moléculas pequeñas.
En el caso de preparaciones farmacológicas conteniendo proteínas recombinantes, tales como BDNF, el ingrediente activo es una proteína, una molécula con peso molecular alto sometida a modificaciones post-traslacionales y adaptación de su curvatura hasta que éste alcanza la configuración tri-dimensional. La actividad biológica de las proteínas es dependiente estrechamente de su configuración tri-dimensional, debido a interacciones con los receptores específicos y enzimas que las reconocen, y consecuentemente, la capacidad para intervenir en los procesos bioquímicos de la célula diana, depende de éstos. La configuración de proteína puede ser modificada considerablemente por el ambiente en el cual una proteína recombinante está para ser encontrada. Formulaciones conteniendo proteínas recombinantes por lo tanto deben asegurar que la proteína es mantenida en solución en su configuración activa, y garantiza su estabilidad.
La presente invención demuestra que TSP garantiza la
estabilidad de BDNF en la formulación, incrementa su absorción ocular debido al tiempo de residencia prolongado de la formulación sobre la superficie y sobre todo, mantiene BDNF en su configuración biológicamente activa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Ahora se ha descubierto que formulaciones oftálmicas conteniendo BDNF en concentraciones de al menos 15 pg/µ?, evitan alteraciones retínales inducidas por exposición prolongada a luz, y aquellas asociadas con presión intraocular incrementada en un modelo de glaucoma.
La invención por lo tanto se relaciona con preparaciones oftálmicas en la forma de gotas para ojos conteniendo el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). De conformidad con un aspecto preferido del mismo, las composiciones a las cuales la invención se relaciona contienen galactoxiloglucano extraído de semillas de tamarindo, conocido como TSP.
La invención también se relaciona con el uso de BDNF para preparar un medicamento en la forma de gotas para ojos para la prevención y/o el tratamiento de trastornos neurodegenerativos de la retina, nervio óptico y cuerpo geniculado lateral.
La presente invención también se relaciona con una preparación oftálmica en la forma de gotas para ojos conteniendo BDNF para uso en la prevención y/o el tratamiento de trastornos neurodegenerativos de la retina, nervio óptico y cuerpo geniculado lateral.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1A - Determinación de niveles de BDNF en la retina, nervio óptico (figura 1 B) y humor vitreo (figura 1C) siguiendo aplicación tópica de BDNF en solución salina. Los niveles de BDNF son mostrados sobre el eje-y, fueron medidos en el otro tratado con BDNF y el ojo de control tratado con solución salina; * indica el significado de las diferencias.
Figura 2A - Determinación de los niveles de BDNF en la retina, nervio óptico (figura 2B) y humor vitreo (figura 2C) siguiendo aplicación tópica de BDNF en solución con carboximetilcelulosa sódica. Para convenciones y símbolos, véase las Figuras 1A-1C.
Figura 3A - Determinación de los niveles de BDNF en la retina, nervio óptico (figura 3B) y humor vitreo (figura 3C) siguiendo aplicación tópica de BDNF en solución con TSP. Para convenciones y símbolos, véase las Figuras 1A-1C.
Figura 4 - Eficacia comparativa de TSP, -solución salina (NaCI) y carboximetilcelulosa sódica (CMC) en portar BDNF e incrementar sus concentraciones retínales (pg/mg de proteína, véase el eje-x). Niveles retínales de BDNF después de tratamiento tópico con BDNF en TSP (*) incrementó significativamente, comparado con el nivel de BDNF después de tratamiento tópico con BDNF en solución salina y carboximetilcelulosa sódico Los datos son derivados de las Figuras 1A, 2A y 3A.
Figura 5 - Cinética de niveles de BDNF en la retina, nervio óptico y humor vitreo siguiendo aplicación tópica de BDNF en solución con TSP. Los niveles de BDNF permanecen significativamente más altos en las primeras 6 horas después de tratamiento (*).
Figura 6 - Aplicación tópica de BDNF en TSP reduce alteraciones inducidas por daño de luz de la respuesta de destello retinal (ERG destello). La amplitud (µ?*, véase eje-y) de la onda-b del electrorretinograma evocado por destellos de diferentes luminancias (cd/m2, véase eje-x) y grabado por el ojo tratado con BDNF (símbolos negro) o el ojo de control tratado únicamente con TSP (control dañado-luz, símbolos blanco) fueron medidos; * indica que las diferencias son significativas.
Figuras 7A-7C - Tratamiento tópico con BDNF en TSP incrementa el número de fotorreceptores sobreviviendo daño por luz. Los fotorreceptores son identificados con yoduro de propidio en las secciones transversales de retina. Independientemente del método usado (conteo de fila de cuerpo celular de fotorreceptor (Figura 7B) o medición del espesor de la capa nuclear externa (ONL) (Figura 7C)), los fotorreceptores presentes en la retina central y periférica son significativamente (*) mas numerosos en el ojo tratado con BDNF que el ojo tratado con el portador (control).
Figura 8 - Aplicación tópica de BDNF en solución salina (NaCI) reduce deterioro inducido por daño de luz inducido en la respuesta retinal a luz. Para una explicación de las convenciones y símbolos, véase la Fig. 6.
Figuras 9A-9C - Tratamiento tópico con BDNF en solución salina incrementa supervivencia de fotorreceptor después de daño por luz. Para
convenciones y símbolos, véase las Figuras 7A-7C.
Figura 10 - Aplicación tópica de BDNF en solución con carboximetilcelulosa sódica, y respuesta deteriorada a luz inducida por daño de luz. Para convenciones y símbolos, véase la Fig. 6.
Figuras 11A-11C - Efectos de tratamiento tópico con BDNF en solución con carboximetilcelulosa sódica sobre la supervivencia del fotorreceptor después de daño de luz hacia el ojo tratado con BDNF y el ojo tratado con el portador (control). Para convenciones y símbolos, véase las Figuras 7A-7C.
Figura 12 - Incremento en presión intraocular (IOP, mmHg) en un modelo de glaucoma de murino experimental, DBA/2J ratón v. ratón normal (C57bl/6J). El incremento en IOP en DBA/2J es significativo (*) desde la edad de 6/2 meses.
Figura 13 - La respuesta de la retina a patrones visuales (patrón ERG, P-ERG; estímulo consistiendo de una frecuencia espacial 0.2 C/grados contraste 90%) fue grabada en ratones normales (C57bl/6J, barra oscura) y ratones desarrollando-glaucoma (DBA/2J); las amplitudes de las respuestas de P-ERG (µ?, véase eje-y) fueron medidas estimulando el ojo tratado por dos semanas con diferentes concentraciones de BDNF (1 , 5 y 15 g/ l) y estimulando el ojo tratado con el portador, considerado como ojo control (CTRL); * indica el significado de las diferencias. P-ERG fue grabado a la edad de 7 meses en el ratón DBA/2J, es decir, después del incremento en presión intraocular (IOP).
Figuras 14A y 14B - Células ganglionares retínales (preparación de cantidad total) de ratón DBA/2J desarrollando glaucoma (edad de 7 meses), etiquetadas con un anticuerpo fluorescente que se une a un factor de transcripción (Brn3b). Figura 14A. La columna a mano izquierda muestra los efectos de tratamiento tópico de dos semanas con BDNF en TSP en la retina central (fila superior) y retina periférica (fila inferior). Siguiendo tratamiento con BDNF (columna a mano izquierda), las células etiquetadas fueron más numerosas que en la retina del ojo de control (CTRL), el cual fue tratado con solamente el portador (columna a mano derecha). Figura 14B. Cuantificación de efectos de tratamiento tópico con BDNF en células ganglionares (densidad medida en células/mm2, mostrado en el eje-y) etiquetadas con Bm3b en el ratón desarrollando-glaucoma (DBA/2J; ojo tratado con BDNF; ojo tratado con portador, CTRL) y en el ratón normal (C57bl/6J).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se ha encontrado sorprendentemente que administrando factor neurotrófico derivado del cerebro exógeno (BDNF), aplicado tópicamente a la superficie intacta del ojo, en particular en el saco conjuntivo, BDNF realiza un efecto neuroprotector sobre las células retínales en ambos niveles funcionales y morfológicos, permitiendo así la prevención y/o el tratamiento de trastornos retínales neurodegenerativos.
BDNF ha demostrado eficacia neuroprotectora no solamente
hacia los fotorreceptores, sino también hacia las células ganglionares, es decir las células de (i) la capa más interna de la retina, la cual envía sus fibras hacia los centros visuales, (ii) las fibras del nervio óptico; y (iii) los centros extra retínales visuales, tales como el cuerpo geniculado lateral.
La presente invención se relaciona con una preparación oftálmica conteniendo BDNF (Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro).
La preparación oftálmica contiene BDNF en una concentración la cual puede estar en el intervalo entre el límite inferior de 15 g/µ? y 200 pg/µ?, preferiblemente entre 20 y 100 pg/µ? y aún más preferiblemente entre 30 y 50 Mg/µ?. La dosis biodisponible total puede estar entre 50 y 4000 \jg por administración, de conformidad con el volumen de la formulación oftálmica administrada y las especies a las cuales pertenece el ojo tratado, incluyendo humanos.
BDNF puede ser administrado solo o combinado con otros ingredientes activos, tales como bloqueadores-ß, prostaglandinas e inhibidores de anhidrasa carbónica.
La preparación está hecha en la forma de gotas para ojos, y puede ser una solución, una suspensión, un gel o un ungüento oftalmológico con el ingrediente activo BDNF, o ingredientes activos, en un portador aceptable farmacéuticamente compatible con el ingrediente activo y tolerado por los ojos.
El portador aceptable farmacéuticamente puede ser una solución salina, conteniendo preferiblemente 0.9% de cloruro de sodio.
También se ha encontrado que los niveles de absorción de BDNF mejorado pueden ser incrementados si por lo menos un portador aceptable farmacéuticamente es usado en la preparación, preferiblemente un galactoxiloglucano extraído de las semillas de tamarindo (TSP) el cual, debido a su viscosidad permite un tiempo de residencia de BDNF mayor en la superficie del ojo que la administración en solución salina, la cual es lavada lejos de la conjuntiva más rápidamente.
La concentración de TSP puede variar preferiblemente desde 0.05 hasta 2% (peso/volumen - p/v), y aún más preferiblemente desde 0.25 hasta 0.5% (p/v).
TSP es transparente, viscoelástico y estéril, y es usado para protección corneal. TSP también forma una película de larga duración sobre la superficie del ojo, la cual lubrica y humecta la córnea y la conjuntiva.
De conformidad con un aspecto preferido adicional, la solución de viscosidad contiene ácido hialurónico, y aún más preferiblemente, ácido hialurónico combinado con TSP.
La concentración de ácido hialurónico puede variar, preferiblemente desde 0.05% hasta 0.8% (p/v), aún más preferiblemente desde 0.2 hasta 0.4% (p/v).
De conformidad con una modalidad preferida, la preparación puede incluir BDNF en la concentración de 15 pg/µ? en una solución salina conteniendo 0.9% de NaCI.
De conformidad con una modalidad preferida, la preparación
puede contener BDNF en la concentración de 15 pg/µ? en solución salina con TSP, preferiblemente una solución de 0.25%.
La preparación en gotas para ojo puede ser administrada tópicamente directamente a la superficie del ojo intacta, es decir, en una manera no-invasiva, evitando el uso de métodos invasivos tales como inyecciones infraocular, subretinal y retrobublar, En particular, la preparación puede ser administrada en el saco conjuntivo. La preparación también puede ser formulada como un parche de ojos o en lentes de contacto.
La retina es una parte parcialmente separada del sistema nervioso central; varios tipo de barrera existen, incluyendo la barrera de sangre retinal, la cual evita la difusión no específica de compuestos tales como moléculas grandes hacia la retina. La penetración infraocular de los compuestos farmacológicamente activos aplicados tópicamente es regulada por barreras ubicadas en la córnea y la conjuntiva, por absorción sistémica y por falla metabólica afectada por las enzimas presentes en esos tejidos. Una vez instalado, los compuestos farmacológicamente activos deben cruzar un sistema complejo de barreras sanguíneas, incluyendo la barrera de sangre retinal, para penetrar los tejidos subyacentes hasta la retina.
Además, la retina, a través de las células ganglionares, a partir de las cuales se originan las fibras del nervio óptico, es conectada vía el nervio óptico para centros visuales tales como la parte dorsal del cuerpo geniculado (dLGN).
Como se demuestra en la parte experimental, BDNF, cuando es
administrado tópicamente de conformidad con la invención, puede ser transportado a la retina, incluyendo un incremento en su concentración retinal a niveles los cuales realizan efectos neuroprotectores desde ambos puntos de vista funcional y morfológico.
También ha sido encontrado sorprendentemente, como es demostrado por evidencia experimental, que las células ganglionares permiten transporte anterógrado de BDNF, permitiendo BDNF para evitar y tratar no solamente la degeneración de las células ganglionares sino también de las fibras del nervio óptico, y extensión del trastorno a los centros visuales extra-retínales, tales como el cuerpo geniculado lateral.
La presente invención también se relaciona con el uso de BDNF para preparar un medicamento oftálmico en la forma de gotas para ojos para administración tópica a la superficie del ojo intacta para la prevención y/o tratamiento de trastornos neurodegenerativos de la retina, nervio óptico y cuerpo genicular lateral, en particular retinopatías degenerativas particulares (tales como retinitis pigmentosa y glaucoma), retinopatías relacionadas con la edad (tales como degeneración macular relacionada con la edad), vascular y trastornos proliferativos de la retina, desprendimiento de la retina y retinopatía del prematuro (ROP) y retinopatía diabética, lo cual conduce a ceguera. Las preparaciones de conformidad con la invención son útiles para la prevención y/o el tratamiento de trastornos neurodegenerativos de la retina, nervio óptico y cuerpo genicular lateral, especialmente, por ejemplo, retinitis pigmentosa y glaucoma (incluyendo glaucoma congénito, glaucoma infantil, glaucoma
juvenil, glaucoma del adulto, glaucoma de ángulo-abierto principal, glaucoma de cierre-ángulo principal, glaucoma agudo, glaucoma iatrógeno y glaucoma secundario).
El glaucoma es uno de una serie de trastornos progresivos afectando el ojo el cual, si no es tratado apropiadamente, conduce a ceguera debido a la pérdida de células ganglionares y atrofia progresiva de las fibras del nervio óptico.
El glaucoma está caracterizado por un incremento en la presión infraocular (IOP) lo cual puede dañar las células ganglionares y las fibras del nervio óptico ya sea directamente (mecánicamente) o indirectamente induciendo isquemia de los vasos retínales que alimentan la retina interna. En la etapa progresiva, así como la retina, el glaucoma puede afectar los centros visuales, tales como el cuerpo genicular lateral, hasta que la corteza visual es involucrada eventualmente.
También ha sido encontrado que el tratamiento con BDNF en concentraciones eficaces no solamente evita y reduce degeneración de fotorreceptor inducida por exposición prolongada a luz (daño por luz) y preserva la respuesta retinal a luz; además el uso de un modelo de glaucoma experimental demuestra que la aplicación tópica de BDNF evita la degeneración de las células ganglionares retínales lo cual resulta de una elevación en la presión infraocular (IOP) en un modelo de glaucoma animal; en ambos modelos de animal, BDNF no alteró la respuesta retinal a estímulo visual.
Los ejemplos proporcionados a continuación ilustran la invención.
EJEMPLOS EJEMPLOS DE PREPARACIONES
¦ Preparación 1 - BDNF en solución salina: 150 pg de BDNF es disuelto en 10 pl de solución salina conteniendo NaCI al 0.9%;
¦ Preparación 2 - BDNF en solución salina con carboximetilcelulosa sódica: 150 pg de BDNF es disuelto en una solución consistiendo de 5 pl de solución salina conteniendo NaCI al 0.9% y 5 pl de carboximetilcelulosa sódica al 0.4%.
¦ Preparación 3 - BDNF en solución salina con TSP: 150 pg de BDNF son disueltos en 5 µ? de solución salina conteniendo NaCI al 0.9% y 5 µ? de TSP al 0.5%.
« Preparación 4 - BDNF en solución salina con ácido hialurónico (0.2%): 150 pg de BDNF son disueltos en 5 pl de solución salina conteniendo NaCI al 0.9% y 5 pl de ácido hialurónico al 0.4%.
¦ Preparación 5 - BDNF en solución salina con ácido hialurónico (0.4%): 150 pg de BDNF son disueltos en 5 pl de solución salina conteniendo NaCI al 0.9% y 5 pl de ácido hialurónico al 0.8%.
¦ Preparación 6 - BDNF en solución salina con ácido
hialurónico y TSP (I): 150 g de BDNF son disueltos en 5 µ? de solución salina conteniendo NaCI al 0.9% y 5 µ? de ácido hialurónico al 0.4% y TSP al 0.4%.
¦ Preparación 7 - BDNF en solución salina con ácido hialurónico y TSP (II): 150 g de BDNF son disueltos en 5 µ? de solución salina conteniendo NaCI al 0.9% y 5 µ? de ácido hialurónico al 0.8% y TSP al 0.4%.
¦ Preparación 8 - BDNF en solución salina con ácido hialurónico y TSP (II): 150 g de BDNF son disueltos en 5 µ? de solución salina conteniendo NaCI al 0.9% y 5 µ? de ácido hialurónico al 0.4% y TSP al 0.6%.
BIOENSAYOS
2.1 EJEMPLO
Determinación de niveles de BDNF en humor vitreo, retina y nervio óptico después de tratamiento tópico de 6 horas del ojo con
preparaciones basadas-BDNF
¦ Se usaron las preparaciones 1 , 2 y 3 que contienen BDNF, como se describió anteriormente:
Las pruebas fueron realizadas en ratas albinas (ratas Wistar, Harían, Italia); BDNF en solución salina con carboximetilcelulosa sódica, o en solución salina con TSP, fue aplicado tópicamente, siendo instilados dentro del saco conjuntivo de un ojo, mientras el otro ojo, usado como control, fue tratado con solución ("placebo") usada para incluir y transportar BDNF.
¦ Determinación de los niveles de BDNF en la retina, humor vitreo y nervio óptico
Los animales fueron matados 6 horas después de aplicación, después de inducción de anestesia profunda con una inyección de uretano intraperitoneal (20%). El ojo entonces fue retirado, y el nivel de BDNF medido en el humor vitreo, homogenado retinal y homogenado del nervio óptico de ambos el ojo tratado con BDNF y el otro ojo tratado con la solución portador solamente (ojo de control). Las mediciones fueron realizadas por ¡nmunoensayo (ELISA, BDNF Emax sistema de inmunoensayo, Promega, Madison, Wl, EUA). La cantidad de BDNF en el nervio óptico también fue determinada, para establecer si BDNF introducido desde el exterior por aplicación tópica fue tomado y transportado por las células retínales, en particular por las células ganglionares retínales, con sus fibras, forman el nervio óptico.
Los resultados mostrados en el diagrama en las Figuras 1A-1C fueron obtenidos con una aplicación tópica de BDNF en solución salina (0.9% NaCI), y son expresados como valores de concentración de BDNF promedio en la retina (figura 1A), nervio óptico (figura 1B) y humor vitreo (figura 1C), expresado como pg/mg de proteína.
El análisis estadístico fue llevado a cabo con la prueba t de
Student comparando el ojo tratado con BDNF con el ojo de control: en todos los casos, las diferencias entre el ojo tratado y el ojo de control fueron estadísticamente significativas (*, p<0.05).
Los resultados mostrados en los diagramas en las Figuras 2A-2C se relacionan con una aplicación tópica de BDN en solución con carboximetilcelulosa sódica (0.2%), mientras que los resultados mostrados en los diagramas en las Figuras 3A-3C fueron obtenidos con una aplicación tópica de BDNF en solución con TSP (0.25%); en ambos casos, el análisis estadístico fue llevado a cabo con la prueba t de Student, comparando el ojo tratado con BDNF con el ojo de control. En todos los casos, las diferencias entre el ojo tratado y el ojo de control fueron estadísticamente significativas (*, p<0.05).
La Fig. 4 muestra los niveles comparativos de BDNF en la retina para cada tipo de solución/portador usado; este análisis hace más fácil comparar la eficacia de las diferentes soluciones/portadores en la misma concentración BDNF (10 µ? de solución conteniendo 150 pg de BDNF). Tratamiento tópico con BDNF en TSP produjo niveles retínales significativamente más altos de BDNF que las otras dos formulaciones usadas, es decir, BDNF en solución salida y BDNF en solución con carboximetilcelulosa sódica (prueba t de Student *, p<0.05). Tratamiento tópico con BDNF en solución con carboximetilcelulosa sódica probó ser al menos eficaz en incrementar el nivel de BDNF retinal.
2.2 EJEMPLO
Determinación de niveles de BDNF en la retina, humor vitreo y nervio óptico en diferentes tiempo después de tratamiento tópico del ojo con
BDNF en TSP
El alcance al cual BDNF permaneció alto en la retina, el humor vitreo y el nervio óptico después de una aplicación tópica única fue estudiado. Este estudio fue llevado a cabo con el portador conteniendo TSP, el cual probó ser el más efectivo en facilitar el paso transescleral de BDNF hacia la retina, nervio óptico y humor vitreo. La cinética de los niveles de BDNF en la retina, nervio óptico y humor vitreo después de tratamiento tópico del ojo fueron entonces estudiados, usando TSP. N=5 ojos fueron tratados en cada grupo de prueba. La concentración de BDNF en la retina, nervio óptico y humor vitreo fue medida en diferentes intervalos de tiempo después de aplicación de una solución 0.25% de TSP conteniendo BDNF (10 µ? de una solución conteniendo 150 pg de BDNF). El ojo de control fue tratado solamente con la solución portador conteniendo 0.25% TSP. Este experimento fue realizado para establecer la tendencia de tiempo de los niveles de BDNF después de una aplicación tópica única. Los diagramas muestran los valores de BDNF promedio (eje-y; pg/ml) en la retina, el nervio óptico y el humor vitreo 6, 12 y 24 horas después de la aplicación. La Fig. 5 muestra que el nivel de BDNF en la retina permanece estadísticamente alto, regresando a los niveles de línea base en 12-24 horas. El análisis estadístico fue realizado con la prueba t de Student en A *, p<0.01 comprado con el ojo de control. Los resultados de este experimento sugieren que en tratamiento de largo plazo, con BDNF, llevados en lágrimas artificiales, en particular basado en TSP, una aplicación tópica cada 12 horas es suficiente para mantener los niveles BDNF altos en la retina.
2.3 EJEMPLO
Efectos neuroprotectores de aplicación tópica de preparaciones
basadas-BDNF
Para establecer los efectos neuroprotectores de BDNF después de tratamiento por aplicación tópica en el saco conjuntivo, un modelo experimental en el cual degeneración retinal es inducida mediante daño de luz fue usado en modelos de animales; este modelo es usado ampliamente para estudiar la degeneración de los fotorreceptores retínales inducida por exposición prolongada a una fuente de luz fuerte (La Vail et al., 1987; Rex et al., 2003). Muerte del fotorreceptor ocurre por apoptosis, y es causada por absorción excesiva de fotones por la rodopsina de pigmento visual, conduciendo a alteración del ciclo de regeneración de pigmento lo cual involucra eventualmente las células de epitelio pigmentado. El modelo animal experimental probado fue la rata albina (Surace et al., 2005), en vista de la sensibilidad marcada de estos fotorreceptores a luz. El protocolo experimental usado fue modificado (Rex et al., 2003) y expandido de ese propuesto
originalmente por el grupo de LaVail (LaVail et al., 1987).
Se usaron las siguientes preparaciones basadas en BDNF:
a) BDNF en 0.25% solución TSP (10 µ? de una solución conteniendo 150 pg de BDNF).
b) BDNF en solución salina (NaCI al 0.9% - 10 µ? de una solución conteniendo 150 pg de BDNF).
c) BDNF en una solución 0.2% de carboximetilcelulosa sódica (10 µ? de una solución conteniendo 150 pg de BDNF).
Los ojos de las ratas fueron tratados con las preparaciones listadas arriba, y las ratas fueron sometidas a daño por luz. Los ojos de control fueron tratados únicamente con la solución portador. N=4 ojos fueron tratados en cada grupo de prueba. En particular, después de tratamiento de 6 horas (ojo tratado con BDNF y ojo de control tratado únicamente con solución portador), estas ratas fueron sometidas a exposición prolongada de luz durante 48 horas (modelo de daño por luz de animal, intensidad de fuente de luz 1000 lux). Esta exposición prolongada a luz induce degeneración de muchos de los fotorreceptores en la retina de ratos albinas. La neuroprotección ejercida por BDNF fue verificada por métodos morfológicos, diseñados para evaluar la supervivencia de los fotorreceptores, y métodos funcionales, grabando la respuesta retinal a luz (electrorretinograma de destello [ERG], lo cual es ampliamente usado para evaluar el estado funcional de la retina externa en pacientes sufriendo de trastornos retínales). En vista del pequeño número de conos en la rata, formando las bases de la respuesta
ERG bajo condiciones fotópicas, y la amplitud reducida del ERG en condiciones fotópicas en la rata albina, solamente ERG de destello fue grabado bajo condiciones de adaptación escotópicas, expresando la respuesta de barras de las cuales la retina de rata está compuesta principalmente. El ERG de destello (escotópico) fue grabado 7 días después del final del período de daño por luz.
- Preparación a)
La Fig. 6 muestra la amplitud de la onda-b del ERG de destello de conformidad con la luminancia bajo condiciones de adaptación escotópica. Como es mostrado claramente en el diagrama en la Fig. 6, BDNF en TSP, aplicado tópicamente, reduce significativamente los efectos de daño por luz en la respuesta retinal a destellos (ERG de destello). De hecho, las amplitudes (valores de amplitud promedio expresados en pV) del ojo tratado con BDNF son significativamente mayores que esas del ojo de control, *, p<0.05 (ANOVA de una vía).
- Preparación b)
La Fig. 8 muestra las amplitudes de la onda-b de conformidad con la luminancia bajo condiciones de adaptación escotópica. Los resultados indican que BDNF en solución salina también es capaz de reducir las alteraciones de la respuesta retinal a luz inducida por daño de luz (ERG de destello). Las amplitudes de la onda-b en los ojos dañados por luz de ratas tratadas con BDNF son mayores que aquellas grabadas para el ojo de control; las amplitudes (valores de amplitud promedio expresados en pV) del ojo tratado con BDNF en salina son significativamente mayores que esos del ojo control, *, p<0.05 (ANOVA de una vía).
- Preparación c)
La Fig. 10 muestra la amplitud de la onda-b de conformidad con luminancia bajo condiciones de adaptación a oscuridad. La figura demuestra que las amplitudes (valores de amplitud promedio expresados en pV) del ojo tratado con BDNF en solución con carboximetilcelulosa sódica son solamente significativamente mayor que esos del ojo de control, *, p<0.05 (ANOVA de una vía) en los valores de luminancia más altos. En conclusión, en términos de recuperación funcional de la respuesta retinal a luz, carboximetilcelulosa sódica probó ser menos eficaz que TSP y solución salina en evitar deterioro de la respuesta retinal a luz.
Subsecuentemente, los efectos de tratamiento tópico con las preparaciones basadas-BDNF listadas arriba en degeneración de los receptores retínales fueron evaluados en las retinas de los ojos cuyo ERG de destello fue grabado.
Los efectos de tratamiento tópico con BDNF en degeneración de fotorreceptor fueron cuantificados contando las filas de fotorreceptores que sobrevivieron el daño de luz y midiendo el espesor de la capa nuclear exterior retinal (ONL) la cual contiene los cuerpo celulares de fotorreceptor. Para realizar esas mediciones, el núcleo del fotorreceptor fue identificado con yoduro de propidio.
- Preparación a)
Los resultados obtenidos son mostrados en las Figuras 7A-7C.
La Figura 7A muestra las secciones transversales retínales del ojo tratado con BDNF (en 0.25% TSP) y el ojo de control. Para realizar esas mediciones, el núcleo del fotorreceptor fue identificado con yoduro de propidio Independientemente de método usado (conteo de filas de cuerpo celular de fotorreceptor (Figura 7B) o espesor de la capa nuclear exterior (ONL) (Figura 7C)), los fotorreceptores presentes en la retina central y periférica son significativamente (prueba t de Student *, p<0.001) más numerosos en el ojo tratado con BDNF que el ojo tratado con el portador (control).
Se demostró entonces que BDNF en TSP, cuando es aplicado tópicamente en el saco conjuntivo, protege la retina de daño por luz.
- Preparación b)
La Fig. 9A muestra las secciones transversales retínales del ojo derecho tratadas con BDNF (en solución salina, 0.9% NaCI) y el ojo izquierdo (control) tratado solamente con solución salina. Los efectos de tratamiento tópico con BDNF sobre la degeneración del fotorreceptor fueron cuantificados contando las filas de los cuerpos celulares de los fotorreceptores que sobrevivieron al daño por kiz (Fig. 9B) o midiendo el espesor de la capa nuclear externa retinal (ONL) la cual contiene los cuerpos celulares de fotorreceptor (Fig. 9C) Las diferencias entre las retinas del ojo tratado y el ojo de control (conteo de filas de fotorreceptor o espesor ONL) probaron se significativas en ambas la retina central y periférica (prueba t de Student *, p<0.001).
Tratamiento tópico con BDNF en solución salina incrementa el número de fotorreceptores que sobreviven a daño por luz en el ojo comparado con el ojo de control.
- Preparación c)
Finalmente, los efectos de tratamiento tópico con BDNF (en solución con carboximetilcelulosa sódica) sobre la degeneración del fotorreceptor fueron cuantificados midiendo las filas de los cuerpos celulares de los fotorreceptores que sobrevivieron el daño por luz (Fig. 11 B) y el espesor de la retina nuclear externa (ONL) la cual contiene los cuerpos celulares del fotorreceptor (Fig. 11C).
Considerando los resultados obtenidos, en términos de recuperación funcional y prevención de degeneración de fotorreceptor siguiendo daño por luz, puede ser concluido que el tratamiento tópico con BDNF en TSP y en solución salina ejercita efectos neuroprotectores contra daño por luz, mientras que el tratamiento con BDNF en solución con carboximetilcelulosa sódica es menos eficaz a la misma concentración de BDNF.
También se demostró que el tratamiento con BDNF no induce alteraciones funcionales en la retina, obstaculizando su respuesta a estímulo visual.
2.4 EJEMPLO
Efectos neuroprotectores inducidos por aplicación tópica repetida de
BDNF en un modelo de glaucoma experimental
El glaucoma es un trastorno degenerativo de la retina el cual tiene varias causas, y se presenta en diferentes formas (éste es clasificado con base en la edad como glaucoma congénito, glaucoma infantil, glaucoma juvenil o glaucoma de adulto; y con base en la etiopatogénesis como glaucoma primario: glaucoma primario de ángulo abierto o glaucoma primario de cierre de ángulo; y glaucoma secundario inducido por otros trastornos, incluyendo glaucoma iatrógeno). La forma más común de glaucoma, a saber glaucoma de ángulo abierto primario (POAG), es caracterizada por presión intraocular incrementada lo cual causa disyunción y subsecuente degeneración de las células ganglionares asociadas con atrofia del nervio óptico; los síntomas son pérdida gradual de la visión, culminando en ceguera. El mecanismo que causa la disfunción y la degeneración de las células ganglionares, con atrofia del nervio óptico, aún no es completamente claro, aunque la hipótesis prevaleciente es que presión intraocular incrementada (IOP) induce daño mecánico a las fibras del nervio óptico en la lámina
cribrosa. En los últimos años, el tratamiento farmacológico ha tenido como meta reducir el IOP, aunque un número considerable de pacientes son resistentes al tratamiento farmacológico actual y sufren de pérdida progresiva, irreversible de la función visual. Actualmente no existen fármacos diseñados para lograr la neuroprotección de las células ganglionares retínales y las fibras del nervio óptico para evitar reducción de la capacidad visual y restauración del alcance visual normal. En la presente patente, se propone usar los tratamientos tópicos con BDNF en el saco conjuntivo para incrementar los niveles de BDNF retinal en una manera estable para contrarrestar la disfunción progresiva de las células ganglionares, seguido por su degeneración y muerte. Este propósito está basado parcialmente en la demostración de que el receptor BDNF, llamado TrkB es expresado en las células ganglionares (Jelsma et al., 1993). Para verificar nuestra hipótesis se usa el modelo experimental más común de glaucoma espontáneo, un ratón muíante doble llamado DBA/2J (John et al., 1998; Chang et al., 1999). Le ratón DBA/2J presenta mutaciones homocigosas de dos genes separados; el primero es proteína relacionada con tirosina (Tyrpl-/-) codificando para una proteína melanosoma, y el segundo es una glícoproteína de membrana (Gpnmb-/-). Este ratón está caracterizado por un incremento progresivo en presión infraocular con pérdida progresiva de la respuesta retinal a estímulo visual estructurado, el cual depende de la retina interna/células ganglionares; en humanos y en el modelo animal, esta respuesta retinal es llamada el electrorretinograma de patrón (P-ERG; Domenici et al., 1991 ; Ventura y
Porciatti, 2006; Falsini et al., 2008) La disfunción de las células ganglionares es seguida por una degeneración de las células con atrofia progresiva de las fibras del nervio óptico (Ventura et al., 2006). Como es mostrado en la Fig. 12, en este modelo de glaucoma de murino (DBA/2J), el IOP empieza a incrementar después de 5 meses de vida postnatal: a 6½ meses el IOP en el ratón DBA/2J (N=10) ya aparece significativamente mayor (prueba t * p<0.05) que el medido en el ratón normal (C57bl/6J;N=5) y en el ratón DBA/2J a la edad de 5 meses (N=9). El diagrama en la Fig. 13 muestra las amplitudes de la respuesta de la retina interna/células ganglionares (P-ERG) a estímulo visual estructurado (los patrones visuales usados como estímulo fueron perfiles de luminancia con frecuencia espacial=0.2 C/grados y 90% de contraste), grabados con electrodos corneales conectados a un amplificador y a una computadora para análisis en línea. Como es mostrado en la Fig. 13, el P-ERG es ya alterado en el ratón DBA/2J (CTRL, N=4) a la edad de 7 meses (reducción significativa en amplitudes P-ERG; prueba t de Student, * p<0.05). Desde la edad de 6.5 meses, es decir desde el momento cuando el IOP fue incrementado establemente (Fig. 12), un tratamiento de dos semanas fue realizado involucrando aplicaciones tópicas repetidas de BDNF en TSP (un tratamiento cada 48 horas) en un ojo, y el portador en el otro (ojo de control). Fueron usadas tres concentraciones diferentes de BDNF (N=4 DBA/2J ratones por grupo): 1 , 5 y 15 pg/pl. Como es mostrado en el histograma, el tratamiento tópico con BDNF a la concentración de 15 pg/pl (150 pg en 0 µ? de solución conteniendo 0.25% TSP, preparación oftálmica a), pero no a
concentraciones de 1 y 5 pg/µ?, evitó alteraciones de P-ERG en el ratón DBA/2J (compare los datos del ojo tratado con el ojo de control; prueba t de Student, * p<0.05). Para establecer si una alteración de P-ERG corresponde a una alteración de las células ganglionares, etiquetadas con métodos inmunohistoquímicos, se usa un factor de transcripción, Brn3b, expresado en las células ganglionares; ratones mutantes (Brn3b -/-) por este factor son asociados con una alteración de las células ganglionares (Badea et al., 2009). La Figura 14A muestra ampliaciones de preparaciones retínales en las cuales las células ganglionares son etiquetadas verde con un anticuerpo fluorescente y analizadas por microscopía confocal. El número de células ganglionares etiquetadas es claramente menor en el ojo del ratón DBA 2J, tanto en la retina central como en la retina periférica. La Figura 14B muestra la cuantificación de las células etiquetadas en término de densidad (células/mm2). Tratamiento de dos semanas con BDNF en TSP a la concentración de 15 pg/µ? evitó la reducción en las células etiquetadas con Brn3b comparado con el ojo de control tratado con solamente el portador (prueba t de Student, * p<0.05).
Los datos reportados condujeron a la conclusión de que los tratamientos tópicos con BDNF evitaron alteraciones funcionales de las células ganglionares y restablecieron la capacidad visual retinal en un modelo de glaucoma experimental. La concentración eficaz mínima de BDNF capaz de ejercer efectos protectores en la función de las células ganglionares es 15 Bibliografía
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Claims (12)
1. - Una preparación oftálmica en forma de gotas para ojos que comprende un Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (BDNF) en una concentración de al menos 15 pg/pl.
2. - La preparación oftálmica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque BDNF varía desde 15 hasta 200 pg/pl.
3. - La preparación oftálmica de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque también comprende una solución salina como portador farmacéuticamente aceptable.
4. - La preparación oftálmica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la solución salina contiene 0.9% de cloruro de sodio.
5. - La preparación oftálmica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque también comprende solución viscosificada como otro portador farmacéuticamente aceptable.
6. - La preparación oftálmica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la solución viscosificada es una solución que comprende polisacárido extraído de semillas de tamarindo (TSP).
7. - La preparación oftálmica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la concentración de TSP varía desde 0.05 hasta 2% p/v.
8. - La preparación oftálmica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque comprende adicionalmente ácido hialurónico.
9. - La preparación oftálmica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la solución viscosificada comprende TSP y ácido hialurónico.
10.- Una preparación oftálmica en forma de gotas para ojos que comprende BDNF para usarse en la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina, nervio óptico y cuerpo genicular lateral.
11. - La preparación oftálmica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque es para usarse en la prevención y/o el tratamiento de retinitis pigmentosa.
12. - La preparación oftálmica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque es para usarse en la prevención y/o el tratamiento de glaucoma simple crónico.
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