MX2012005271A - Transformantes de talaromyces. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con una transformante de Talaromyces que comprende uno o más genes recombinantes, capaz de producir celulasa en ausencia de un inductor de celulasa en un medio de glucosa, que tiene una actividad de celulasa de 2 WSU/ml o más, en un sobrenadante o caldo diluido 16 veces o más.

Description

TRANSFORMANTES DE TALAROMYCES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un procedimiento para la producción de transformantes de Talaromyces, con transformantes de Talaromyces y con un procedimiento para la producción de un poüpéptido utilizando las transformantes de Talaromyces. La invención también se refiere a un procedimiento para la sacarificación de material lignocelulosico, en donde el material lignocelulosico se pone en contacto con la transformante o con una celulasa, hemicelulasa y/o pectinasa producida por la transformante, y se producen azúcares. Además, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un producto de fermentación, por ejemplo etanol, en donde aquellos azúcares se fermentan con un microorganismo para fermentación, preferiblemente levadura, para producir el producto de fermentación .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los carbohidratos constituyen los compuestos orgánicos más abundantes sobre la tierra. Sin embargo, gran parte de este carbohidrato es secuestrado en polímeros complejos como el almidón (el principio activo de almacenamiento de carbohidratos en semillas y granos) , y una colección de carbohidratos y de lignina conocidos como lignocelulosa . Los principales carbohidratos que componen la lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa y pectinas. Estos polímeros complejos a menudo se denominan colectivamente como lignocelulosa.

La bioconversión de la biomasa lignocelulósica renovable en un azúcar fermentable que posteriormente es fermentado para producir el alcohol (por ejemplo, etanol) como una alternativa a los combustibles líquidos ha atraído una gran atención por parte de los investigadores desde los años 1970, cuando estalló la crisis del petróleo a causa de la disminución de la producción de petróleo por parte de la OPEP. El etanol ha sido ampliamente utilizado como una mezcla al 10% con la gasolina en los EE.UU., o como un combustible limpio para vehículos en Brasil en las últimas dos décadas.-Más recientemente, se ha implementado el uso de E85, una mezcla de etanol al 85%, especialmente para aplicaciones de ciudad limpia. La importancia del bioetanol combustible se incrementará en forma paralela con el aumento de los precios del petróleo y el agotamiento gradual de sus fuentes. Además, los azúcares fermentables están siendo utilizados para producir plásticos, polímeros y otros productos biológicos y se espera que esta industria crezca sustancialmente aumentando así la demanda por abundantes azúcares fermentables de bajo costo que pueden ser utilizados como un material de alimentación en lugar de materias primas a base de petróleo.

El secuestro de esas grandes cantidades de carbohidratos en la biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de energía potencial en forma de azúcares, tanto de azúcares de cinco como de seis de carbonos que podrían ser utilizados para numerosos procesos industriales y agrícolas. Sin embargo, el enorme potencial energético de estos carbohidratos está actualmente subutilizado debido a que los azúcares están bloqueados en polímeros complejos, y por lo tanto no son fácilmente accesibles para la fermentación. Los métodos que generan azúcares a partir de la biomasa vegetal proporcionarían materias primas abundantes y económicamente competitivas para ser fermentadas y producir productos químicos, plásticos, como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles, incluidos etanol, metanol, butanol, combustibles sintéticos líquidos y biogás .

Independientemente del tipo de materia prima celulósica, el costo y la eficiencia hidrolítica de las enzimas son los principales factores que limitan la comercialización de los procesos de bioconversión de la biomasa. Los costos de producción de enzimas producidas por microbios están estrechamente conectados con la productividad de la cepa productora de la enzima y con el rendimiento final producto de la actividad en el caldo de fermentación.

A pesar de la continua investigación de las últimas décadas para comprender la degradación enzimática de la biomasa lignocelulósica y la producción de celulasas, continúa siendo deseable el descubrimiento o el diseño de nuevas celulasas y hemicelulasas que sean muy activas. También sería altamente deseable construir composiciones enzimáticas altamente eficientes capaces de realizar una biodegradación rápida y eficiente de materiales lignocelulósicos .

Tales composiciones enzimáticas pueden ser utilizadas para producir los azúcares para ser fermentados y producir productos químicos, plásticos, tales como, por ejemplo, ácido succínico y (bio) combustibles, incluidos etanol, metanol, butanol, combustibles sintéticos líquidos y biogás, para ensilado, y también como enzima en otro procesos industriales, por ejemplo en industrias de alimentos o de piensos, textil, de pulpa o papel o de detergentes y otras industrias .

Un género de microorganismos que se sabe que producen enzimas adecuadas para la degradación enzimática de biomasa lignocelulósica es el género Talaromyces . Talaromyces es un hongo filamentoso.

Jain, S. et al, Mol Gen Genet (1992), 234, 489 - 493 divulga un sistema de transformación para la especie del hongo Talaromyces CL240. No se divulga expresión de polipéptidos.

Murray, F. R. et al, Curr Genet (1997), 32, 367 - 375 divulga la sobreexpresión del gen para la oxidasa de la glucosa de Talaromyces flavus en Talaromyces macrosporus. Se estudió el efecto de los hongos aislados en la inhibición del crecimiento de V. dahliae.

WO200170998 divulga beta-glucanasas de Talaromyces emersonii. En la página 16, se describe que el polinucleótido de beta-glucanasa puede ser expresado en forma heteróloga en un huésped, por ejemplo, una célula de levadura.

WO200224926 divulga xilanasa de Talaromyces emersonii. En la página 24, párrafo quinto, se describe que la producción del polipéptido puede lograrse mediante la expresión recombinante de la secuencia de ADN para la xilanasa en un célula huésped homologa o heteróloga adecuada. En el párrafo 7, se dice que la célula huésped puede sobreexpresar al polipéptido, y se conocen bien técnicas para diseñar la sobreexpresión a partir de WQ99/32617. W099/32617 se refiere a la clonación de la expresión, pero no divulga la clonación en el huésped Talaromyces .

WO20Q7091231 divulga cepas de Talaromyces emersonii que son termoestables y codifican enzimas termoestables, y también divulga composiciones de enzimas producidas por las cepas de Talaromyces emersonii . No se divulga la producción recombinante de polipéptidos homólogos o heterólogos . En la tabla 1 se muestra que se añadieron fuentes inductoras de carbono en una cantidad de 0.2 - 6%. Se incluyeron flóculos de Solka y glucosa (2%) con fines comparativos. En la página 78, línea 28 se dice que "la glucosa no reprime completamente la producción de exoglucosidasa por partede las cepas de T. emersonii (tabla 31A) . La tabla 31A muestra que IMI393751 produce actividad de beta-glucosidasa de 31.90 UI con glucosa como fuente de carbono, pero ninguna otra actividad de celulasa, por ejemplo de glucanasas o xilanasas. Por falta de actividad de tales enzimas, la cepa IMI393751 no es adecuada para la producción de celulasas para la conversión de lignocelulosa en glucosa como fuente de carbono.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presencia de un inductor de celulasa, necesario hasta la fecha en los métodos de producción de celulasa de Talaromyces, tiene varias desventajas. En primer lugar, el inductor, tal como un material vegetal, puede tener una composición variable, lo cual es desventajoso para la posibilidad de controlar el proceso de producción de celulasa. En segundo lugar, se requiere energía para esterilizar el material vegetal para la inducción. En tercer lugar, el material vegetal contaminará fuertemente el equipo. En cuarto lugar, el inductor puede resultar en una mayor viscosidad del medio para la producción de la celulasa. En quinto lugar, la presencia de inductor, en particular cuando ha sido previamente tratado, puede dar como resultado la producción de inhibidores que pueden ser perjudiciales para Talaromyces. Por consiguiente, existe la necesidad de un procedimiento mejorado y de cepas mejoradas de Talaromyces para la producción de composiciones de polipéptidos adecuadas para la degradación enzimática de biomasa lignocelulósica en Talaromyces .

Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar cepas de Talaromyces adecuadas para la conversión de lignocelulosa en azúcar. Un objeto adicional es proporcionar tales cepas de Talaromyces que puedan ser producidos en medio de glucosa, sin inductores de celulasa. La invención proporciona ahora un proceso para la producción de una transformante de Talaromyces que comprende las etapas de: (a) proporcionar uno o más casetes de expresión capaces de producir uno o más polipéptidos de interés y que contienen uno o más polinucleótidos de interés que codifican para la celulasa, hemicelulasa y / o pectinasa y al menos un promotor para la expresión del polinucleótido; (b) proporcionar un marcador de selección incluido en el cásete de expresión de (a) o incluido en un polinucleótido marcador de selección dedicado; (c) transfectar un huésped de Talaromyces con uno o más de los casetes de expresión de (a) y / o el marcador de selección de (b) ; (d) seleccionar una transformante de Talaromyces que contiene uno o más polinucleótidos que codifican celulasa, hemicelulasa y / o pectinasa y (e) aislar la transformante de Talaromyces.

La invención proporciona además transformantes de Talaromyces que contienen uno o más genes recombinantes, capaces de producir celulasa en ausencia de inductor de celulasa en un medio de glucosa, que tiene una actividad de celulasa de 2 WSU/ml o más en sobrenadante o caldo diluido 16 veces o más, que pueden ser obtenidos de acuerdo con el proceso anterior. Las transformantes de Talaromyces de la invención pueden ser cultivadas en un medio que contiene una fuente de carbono adecuada, tal como azúcar, por ejemplo glucosa, sin inductor de celulasa (la glucosa no es aquí un inductor celulasa, es decir, el inductor celulasa no incluye glucosa) y producen celulasas que tienen actividad de degradación de lignocelulosa .

La invención se refiere además a un procedimiento para la producción de una composición de polipéptido de una o más celulasas, hemicelulasas y / o pectinasas que comprenden las etapas de: (a) proporcionar uno o más casetes de expresión capaces de producir uno o más polipéptidos de interés y que contienen uno o más polinucleótidos de interés que codifican para la celulasa, hemicelulasa y / o pectinasa y al menos un promotor para la expresión del polinucleótido; (b) proporcionar un marcador de selección incluido en el cásete de expresión de (a) o incluido en un polinucleótido marcador de selección dedicado; (c) transfectar un huésped de Talaromyces con uno o más de los casetes de expresión de (a) y / o el marcador de selección de (b) ; (d) opcionalmente seleccionar una transformante de Talaromyces que contiene uno o más polinucleótidos que codifican celulasa, hemicelulasa y / o pectinasa; (e) producir el polipéptido cultivando la transformante de Talaromyces en un medio de cultivo adecuado en el que un inductor celulasa está sustancialmente ausente, y (f) opcionalmente recuperar la composición de polipéptido; Más delante se describen otras realizaciones en la descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Detección de un fragmento de la PCR del gen que codifica para ß-lactamasa de pA 8-l. Gel de agarosa mostrando los 278 nucleótidos del fragmento de la PCR del gen que codifica para la ß-lactamasa en transformantes de T. emersonii. Los carriles 1 - 10 contienen fragmentos de la PCR de las reacciones PCR utilizando ADN cromosomico de 10 transformantes de T. emersonii pAN8-l como molde; el carril 11 contiene un marcador de peso molecular; el carril 12 contiene el fragmento de la PCR de una reacción PCR utilizando al plásmido pAN8-l como molde para la PCR; el carril 13 contiene una mezcla de reacción PCR utilizando el ADN cromosómico de la cepa vacía een como molde.

Figura 2. Detección de la integración de pAN8-l en el genoma de T. emersonii. Detección de la transferencia tipo Southern del ADN de pAN8-l utilizando una sonda marcada de ß-lactamasa. El carril 1 contiene un marcador de peso molecular; el carril 2 y el 3 contienen, respectivamente, 0.5 y 5 ng de ADN del plásmido pAN8-l; el carril 4 y el 5 contienen ADN cromosómico digerido con Mlul de dos diferentes transformantes de T. emersonii pAN8-l (las bandas específicas están indicadas por medio de flechas) ; el carril 6 contiene ADN cromosómico digerido con Mlul de una cepa vacía.

Figura 3. Mapa de pGBFINEBA7 para la expresión de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG. pGBFINEBA7 es un plásmido con base en pGBFIN5. Se representa la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG (EBA7 + FLAG) expresada a partir del promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger (PglaA) . Además, se describen el gen marcador de selección (amdS) , expresado a partir del promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (Pgpd) de Aspergillus nidulans y los flancos de glucoamilasa (3'glaA y 3''glaA ") del cásete de expresión. Figuras 4A-4C. Detección de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG, expresada en T. emersonii. (4A) : Detección por SDS-PAGE de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG, expresada en T. emersonii cultivada en medio 1 de Talaromyces (carriles 1 - 3) y medio 2 de Talaromyces (carriles 5 - 7) . Sobrenadantes día transformante 1#6 pGBFINEBA7 de T. emersonii (carriles 1, 5) y 1#14 (carriles 2, 6) recolectados de cultivos de 72 horas; los carriles 3 y 7 contienen sobrenadantes de un cultivo de 72 horas de una cepa vacía; el carril 4 contiene un marcador de peso molecular. (4B) : Detección de transferencias tipo Western de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG, expresada en T. emersonii cultivada en medio 1 de Talaromyces (carriles 2 - 7) y medio 2 de Talaromyces (carriles 9 - 14) , utilizando un anticuerpo específico de la etiqueta FLAG. Los carriles 1 y 8 contienen un marcador de peso molecular; los carriles 2, 3, 9 y 10 contienen sobrenadantes día transformante 1#6 de T. emersonii pGBFINEBA7 recolectado de un cultivo de 72 horas (carriles 2, 9) y de 96 horas (carriles 3, 10); los carriles 4, 5, 11 y 12 contienen sobrenadantes día transformante 1#14 de T. emersonii PGBFINEBA7 recolectado de un cultivo de 72 horas (carriles 4, 11) y de 96 horas (carriles 5, 12); los carriles 6 y 13, y 7 y 14 contienen, respectivamente, sobrenadantes de cultivos de 72 horas y de 96 horas de una cepa vacía. (4C) : Determinación del número de copias de las transformantes por medio de PCR. Gel de agarosa mostrando l s 1285 nucleótidos del fragmento de la PCR del cásete de expresión y los 373 nucleótidos del fragmento de la PCR de control / referencia genómico de actina de transformantes de T. emersonii. La intensidad de los 1285 nucleótidos del producto de la PCR del gen EBA7 es indicativa del número de copia del gen, después de normalización de la señal de la PCR de 1285 nt con la señal de referencia genómica de la actina de 373 nt . Los fragmentos de la PCR día transformante 1#6 y 1#4 pGBFINEBA7 se muestran en el carril 1 y 2, respectivamente; el carril 3 muestra un marcador de peso molecular; los fragmentos de la PCR de transformante 8#14, 8#18, y 8#32 pGBFIN-Pgpd-EBA7 se muestran en los carriles 4, 5 y 6, respectivamente.

Figura 5. Mapa de pGBFIN-Pgpd-EBA7 para la expresión de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG bajo control del promotor gpd . pGBFIN- Pgpd-EBA7 es un plásmido basado en pGBFIN38. Se representa la la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG (EBA7 + FLAG) expresada a partir del promotor de la gliceraldehido-3 -fosfato deshidrogenasa (Pgdp) de Aspergillus nidulans . Además, se describen el gen marcador de selección (amdS) , expresado a partir del promotor de la gliceraldehido-3 -fosfato deshidrogenasa (Pgdp) de Aspergillus nidulans y los flancos de glucoamilasa (3'glaA y 3 ' ' glaA) del cásete de expresión .

Figura 6. Comparación de la expresión de proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii en T. emersonii bajo el control ya sea del promotor glaA de A. niger o del promotor gdp de A. nidulans .

Transferencia tipo Western que muestra la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG, expresada en T. emersonii. Los carriles 1, 10 y 11 contienen 15 µ? (carril 1) , 15 µ? de sobrenadante diluido 10 veces (carril 10) y 5 µ? (carril 11) de sobrenadante de un cultivo de 72 horas de una cepa vacía; los carriles 3 - 5 contienen 15 µ? de sobrenadante diluido 10 veces (carril 3), 5 µ? (carril 4) y 15 µ? (carril 5) de sobrenadante día transformante 8#14 pGBFI - Pgpd-EBA7 de T. emersonii recolectado a partir de un cultivo de 72 horas; los carriles 6 - 8 contienen 15 µ? de sobrenadante diluido 10 veces (carril 6), 5 µ? (carril 7) y 15 µ? (carril 8) de sobrenadante día transíorinante 8#18 pGBFIN-Pgpd-EBA7 de T. emersonii recolectado a partir de un cultivo de 72 horas; los carriles 12 - 14 contienen 15 µ? de sobrenadante diluido 10 veces (carril 12), 5 µ? (carril 13) y 15 µ? (carril 14) de sobrenadante día transformante 8#32 pGBFIN- Pgpd-EBA7 de T. emersonii recolectado a partir de un cultivo de 72 horas; los carriles 9 y 15 contienen 15 µ? de sobrenadante diluido 100 veces día transformante 1#6 pGBFINEBA7 de T. emersonii (promotor glaA) recolectado a partir de un cultivo de 72 horas (debido a la fuerte señal, las bandas están sobreexpuestas) ; el carril 2 contiene un marcador de peso molecular.

Figura 7: Mapa de pGBTOPEBA205 para la expresión de CBHI de T. emersonii en T. emersonii. Se representan EBA2Q5 expresadas a partir del promotor de glucoamilasa (PglaA) . Además, se representa el flanco de glucoamilasa (3 'glaA) del cásete de expresión.

Figura 8: Mapa de pGBFINEBAl76 para la expresión de CBHII de T. emersonii en T. emersonii. pGBFINEBAl76 es un plásmido basado en pGBFINll. Se representa el gen EBA176 expresado a partir del promotor de glucoamilasa (PglaA) . Además, se describen el gen marcador de selección (amdS) , expresado a partir del promotor de gliceraldehído- 3 -fosfato deshidrogenasa (Pgpd) de Aspergillus nidulans y los flancos de glucoamilasa (3'glaA y 3''glaA) del cásete de expresión. Figuras 9A-9B. Detección de múltiples celulasas recombinantes de T. emersonii de T. emersonii. (9A) . La detección por SDS-PAGE de celulasas de T. emersonii expresadas en T. emersonii. T. emersonii fue transformado con una mezcla de pGBTOPEBA4 , pGBT0PEBA8 , pGBFINEBA176 y pGBTOPEBA205. Se cultivaron aproximadamente 4QQ transformantes en placas de 96 pozos y seleccionaron por la expresión de al menos una celulasa por medio de análisis en gel E-PAGE. Las transformantes interesantes fueron cultivados en matraces de agitación que contenían medio a base de glucosa y las proteínas en los sobrenadantes recolectadas a partir de cultivos de 72 horas fueron precipitadas en TCA y analizadas mediante análisis en SDS-PAGE. FBG142 es la cepa vacía. (9B) . Gráfico que muestra la actividad de WSU en transformantes. Las transformantes fueron cultivados durante 72 horas en medio a base de glucosa y se determinó la actividad de WSU en sobrenadantes diluidos 16 veces de los cultivos. FBG142 es la cepa vacía.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 expone la secuencia de ADN del iniciador 1 de PCR; La SEQ ID NO: 2 expone la secuencia de ADN del iniciador 2 de PCR; ta SEQ ID NO: 3 expone la secuencia de aminoácidos de la (proteína) CEB ß-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG; La SEQ ID NO: 4 expone la secuencia de codificación de CEB ß-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG (ADN, región de codificación) ; La SEQ ID NO: 5 expone la secuencia de ADN del iniciador 3 de PCR; La SEQ ID NO : 6 expone la secuencia de ADN del iniciador 4 de PCR; La SEQ ID NO: 7 expone la secuencia del promotor gpd y la secuencia Kozak, el promotor gpd tiene residuos: 1 - 870. los sitios de la enzima de restricción, residuos: 871 - 882 y la secuencia de Kozak: residuos : 883 - 892; La SEQ ID NO: 8 expone la secuencia de ADN del iniciador 5 de PCR; La SEQ ID NO: 9 expone la secuencia de ADN del iniciador 6 de PCR; La SEQ ID NO: 10 expone la secuencia de aminoácidos de celobiohidrolasa I de T. emersonii; La SEQ ID NO: 11 expone la secuencia de codificación de CBHI de T. emersonii (ADN, la región de codificación) La SEQ ID NO: 12 expone la secuencia de aminoácidos de (proteína) CEA ß-glucanasa de T. emersonii; La SEQ ID NO: 13 expone la secuencia de codificación de CEA ß-glucanasa de T. emersonii (ADN, la región de codificación) La SEQ ID NO: 14 expone la secuencia de aminoácidos de (proteína) ß -glucosidasa de T. emersonii.

La SEQ ID NO: 15 expone la secuencia de codificación de ß-glucosidasa de T. emersonii (ADN, la región de codificación) . La SEQ ID NO: 16 expone la secuencia de aminoácidos de (proteína) celobiohidrolasa II de T. emersonii.

La SEQ ID NO: 17 expone la secuencia de codificación de celobiohidrolasa II de T. emersonii (ADN, la región de codificación), secuencia de tipo silvestre.

La SEQ ID NO: 18 expone la secuencia de aminoácidos de una proteína desconocida con un tamaño de 209 aa de T. emersonii. La SEQ ID NO: 19 expone la secuencia de codificación de una proteína desconocida de T. emersonii que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 18.

La SEQ ID NO: 20 expone la secuencia de aminoácidos de swolenina de T. emersonii.

La SEQ ID NO: 21 se expone la secuencia de codificación de swollenina de T. emersonii.

La SEQ ID NO: 22 expone la secuencia de aminoácidos de acetil xilan esterasa de T. emersonii.

La SEQ ID NO: 23 expone la secuencia de codificación de acetil xilan esterasa de T. emersonii.

La SEQ ID NO: 24 expone la secuencia de aminoácidos de xilanasa de T. emersonii.

La SEQ ID NO: 25 expone la secuencia de codificación de xilanasa de T. emersonii.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones acompañantes, las palabras "comprende" e "incluye" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" deben interpretarse como incluyentes. Es decir, estas palabras tienen la intención de transmitir la posible inclusión de otros elementos o enteros no específicamente citados, en donde el contexto lo permita.

Los artículos "un" y "uno" se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

De acuerdo con la presente invención, ahora se ha demostrado que se pueden utilizar las técnicas anteriores de transformación para obtener un alto nivel de expresión de polipéptidos heterólogos o para mejorar la producción de polipéptidos homólogos en Talaromyces.

Como se usa aquí "transformante" significa una célula que ha sido objeto de transformación. "Transformante" y "célula recombinante" se usa aquí como sinónimos.

"Transformación" significa aquí la alteración genética de una célula por medio de tecnología recombinante. Puede resultar en la absorción, incorporación y expresión del material genético (ADN, ARN o proteína) o mutación o supresión de material genético en la célula, a través de intervención humana .

Constructo de ácido nucleico: El término "constructo de ácido nucleico" tal como se utiliza se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea monocatenaria o bicatenaria, que se aisla de un gen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ácidos nucleicos en una forma que de otro modo no existirían en la naturaleza. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación de la presente invención.

Como se usa aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que pueden ser aisladas a partir de ADN cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido, por ejemplo, celulasa, por ejemplo una celobiohidrolasa.

Un gen puede incluir secuencias de codificación, secuencias que no codifican, intrones y / o secuencias reguladoras. Además, el término "gen" puede referirse a una molécula aislada de ácido nucleico como se define aquí.

Como se utiliza aquí la expresión "polipéptidos heterólogos" significa polipéptidos que no son prodicidos por Talaromyces, mientras que "polipéptidos homólogos" significa polipéptidos producidos por el mismo Talaromyces. Sustrato (también llamado materia prima) en este documento se utiliza para referirse a una sustancia que comprende material de carbohidrato, que puede ser tratado con enzimas de acuerdo con la invención, de modo que el material de carbohidrato que contiene se modifica. Además del material de carbohidrato, el sustrato puede contener cualquier otro componente, incluyendo pero sin limitarse a material que no es de carbohidrato y almidón. Carbohidrato en este contexto incluye a todos los sacáridos, por ejemplo polisacáridos , oligosacáridos , disacáridos o monosacáridos . "Inductor de celulasa" se define aquí como un compuesto que induce la producción de celulasa en Talaromyces. Los ejemplos de inductores de celulasa son celobiosa de celulosa pura, soforosa y gentiobiosa o cualquier material lignocelulósico .

Un polipéptido de acuerdo con la invención puede modificar un material de carbohidrato por medio de modificación química o modificación física de dicho material. La modificación química del material de carbohidrato puede resultar en la degradación de dicho material, por ejemplo por hidrólisis, oxidación u otra modificación química tal como mediante la acción de una liasa. La modificación física puede o no estar acompañada por modificación química.

A continuación se describen diferentes realizaciones de la invención con más detalle.

Transformantes de Talaromyces La invención proporciona Transformantes de Talaromyces. Los Transformantes de Talaromyces se preparan por medio de transformación de un huésped Talaromyces, tal como Talaromyces emersonii con ADN introducido en forma recombinante . Como se indicó anteriormente, la invención proporciona una transformante de Talaromyces capaz de producir celulasa en ausencia de un inductor de celulasa en un medio de glucosa, que tiene una actividad de celulasa de 2 WSU / mi o más en sobrenadante o caldo diluido 16 veces o incluso sobrenadante o caldo más diluido. En una realización, la transformante de Talaromyces tiene una actividad de celulasa de 3 WSU / mi o más en sobrenadante o caldo diluido 16 veces o sobrenadante o caldo aún más diluido, en una realización adicional 5 WSU / mi o más en sobrenadante o caldo diluido 16 veces o sobrenadante o caldo aún más diluido. En otra realización la transformante de Talaromyces tiene un actividad celulasa de 2 o más WSU / mi en sobrenadante o caldo diluido 16 a 10000 veces, 3 o más WSU en sobrenadante o caldo diluido 16 a 5000 veces, 3 o más WSU / mi en sobrenadante o caldo diluido 16 a 2500 veces.

En una realización, la transformante de Talaromyces tiene una actividad de endoglucanasa de 50 WBCU / mi o más.

En una realización, la transformante de Talaromyces tiene un contenido total de celulasa como se determina por medio de APEX de 38% o más, 39% o más, 40% o más, 41% o más, 42% o más, 43% o más, 44% o más, 45% o más, 46% o más, 47% o más y / o 48% o más.

En una realización adicional, las transformantes de Talaromyces de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que albergan dos o más genes recombinantes capaces de expresar celulasa. Las transformantes de Talaromyces de acuerdo con la invención, en donde los dos o más genes capaces de expresar celulasa incluyen celobiohidrolasa, endoglucanasa y / o gen de la beta-glucosidasa.

La invención incluye también una realización de una transformante de Talaromyces en donde el gen para la celobiohidrolasa es celobiohidrolasa I y / o celobiohidrolasa II. En una realización, en la transformante de Talaromyces uno o más genes se integran en el genoma de la Talaromyces .

El transformante de Talaromyces está libre de marcador en una realización adicional.

Células huésped Las células huésped utilizadas de acuerdo con la invención son células del género Talaromyces. Preferiblemente, el huésped Talaromyces es una Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus, Talaromyces marxianus o Talaromyces flavus. En una realización, el hésoed es Talaromyces emersonii, por ejemplo, Talaromyces emersonii ATCC16479.

Transformación La transformación del huésped puede ser llevada a cabo por cualquiera de los métodos adecuados conocidos, incluidos por ejemplo los métodos de electroporación, bombardeo de partículas o bombardeo de microproyectiles , métodos de protoplastos y transformación mediada por Agrobacterium (AMT) . Preferiblemente, se utiliza el método de los protoplastos. Procedimientos para la transformación son descritos por J. R. S. Fincham, Transformación en hongos. 1989, Microbiological reviews. 53, 148 - 170.

Para obtener transformantes utilizando el método de protoplastos, se tiene que optimizar el protocolo de transformación. Para la generación de protoplastos se recoge micelio de cultivos qué se desarrollaron durante 8 hasta 72 horas, preferiblemente 14 a 24 horas. El micelio se resuspende en un amortiguador que contiene un estabilizador osmótico y una preparación de enzima lítica. Se puede seleccionar un estabilizador osmótico del grupo que incluye, pero no se limita a, sacarosa, sorbitol, manitol, KC1, NH4CI, NaCl, MgS04, y NaCl, preferiblemente sacarosa, sorbitol o KC1, en una concentración de 0.4 - 1.4 M, preferiblemente de 0.8 a 1.2, más preferiblemente de 1.0 . Las preparaciones de enzima lítica pueden ser seleccionadas del grupo que incluye, pero no se limitan a, Glucanex 200G, Novozyme 234, Caylase C3 , Zymolyase, y Driselase, preferiblemente Glucanex 200G. La digestión puede llevarse a cabo a una temperatura entre 30° C y 37° C en un agitador rotatorio durante 1 a 3 horas. Los protoplastos se puede separar del micelio utilizando un filtro de Miracloth, un filtro de vidrio sinterizado, estopilla, tamiz de 30 µp?, o un cojinete de sorbitol, centrifugación, y el micelio se deja sedimentar y se recolectan los protoplastos por decantación. Después de lavar los protoplastos en amortiguador con un estabilizador osmótico, se añaden 104 a 109 protoplastos a 0.1 - 40 µq de ADN, y, opcionalmente , un inhibidor de nucleasa tal como ácido Aurintricarboxílico, en un amortiguador que contiene un estabilizador osmótico y CaC12 10 - 50 mM, preferiblemente CaC12 50 mM. Opcionalmente, la mezcla se incuba durante 15 -30 minutos a 4 o C o a temperatura ambiente. Se añade polietilenglicol (PEG4000. PEG6000 o PEG8000. preferiblemente PEG4000) a la mezcla con una concentración final de 6 a 55%. La adición de PEG se puede realizar en etapas secuenciales en las cuales se incrementa gradualmente la concentración de PEG. Entre las adiciones de PEG se incuba la suspensión durante 5 - 30 minutos a 4o C - 37° C. Preferiblemente, se añade PEG4000 al 6% (concentración final) a la suspensión de protoplastos y ADN, se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente, y posteriormente se añade una segunda cantidad de PEG4000 hasta una concentración final del 51%, seguido por una incubación de 15 minutos a 25° C. Se añade una parte alícuota de la mezcla ya sea directamente a agar blando y se vierte sobre placas de regeneración selectiva, o se lavan protoplastos y se siembran en placa sobre placas de regeneración selectiva. El agar blando contiene medio de crecimiento con un estabilizador osmótico con o sin marcador de selección y una baja concentración de agar que permite verter el agar a 40° C - 60° C. El medio de regeneración contiene medio de crecimiento con un estabilizador osmótico, que puede ser el mismo estabilizador osmótico que se utiliza para la formación de protoplastos.

El polinucleótido puede ser ADN, ARN o proteína. En el caso de ADN, se utiliza un vector con el promotor, una región de codificación, y una secuencia de terminación, el así llamado c sete de expresión. Utilizando la secuencia de polinucleótido deseada como sonda de hibridación, se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico (es decir, genes) de acuerdo con la invención utilizando técnicas estándar de hibridación y de clonación (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J. , Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Manual. 2nd Laboratory, Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) .

Un ácido nucleico puede ser amplificado utilizando ADNc , ARNm o alternativamente, ADN genómico, como molde e iniciadores oligonucleótidos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por PCR. El ácido nucleico así amplificado puede ser clonado en un vector apropiado y caracterizado por medio de análisis de secuencia de ADN.

Además, los oligonucleótidos correspondientes a o que pueden hibridar con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención pueden ser preparados por medio de técnicas estándar de síntesis, por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado de ADN.

Dependiendo de la funcionalidad deseada, el resultado del proceso de transformación de acuerdo con la invención puede ser expresión (heteróloga) , sobreexpresión, regulación controlada y / o supresión de genes particulares. Los poli u oligonucleótidos pueden ser aquí polinucleótidos sintéticos. La introducción de genes en el huésped puede ser episomal, utilizando un plásmido con el gen de interés, o se puede integrar el gen en el genoma del huésped durante el proceso de transformación en una o más copias. Se pueden elaborar los constructos de expresión correspondientes.

En una realización de la invención, el proceso de transformación se lleva a cabo como una transformación conjunta, es decir transformación con dos o más tipos de ADN recombinante . Por ejemplo, la transformación conjunta puede ser ejecutada con a) un vector que contiene un marcador y b) un vector que contiene uno o más genes de interés.

En una realización de la invención, la transformación puede usar bibliotecas de ADN, ADN genómico, ARN, ADNc o proteínas. La transformación del huésped Talaromyces se lleva a cabo con un marcador de selección. Para la transformación estable de las células de Talaromyces, se ha encontrado que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, sólo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador de selección (por ejemplo, de resistencia a los antibióticos) se introduce generalmente en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores adecuados de selección son por ejemplo amdS, argB (ornitina carbamoiltransíerasa) , bar ( foshinotricina acetiltransferasa) , de resistencia a la carboxina, hemA (5-aminolevulinato) , hemB (porfobilinógeno sintasa) , ble (de resistencia a la fleomicina) , hygB (higroicin fosfotransferasa) , natR (de resistencia a la nourseotricina) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina- 5 '- fosfato descarboxilasa) , DHFR, sC (sulfato adeniltransferasa) , trpc (antranilato sintasa), pyroA, riboB . Apropiados para su uso en una célula de Talaromyces son el gen amdS (EP 635574 Bl, WO 97/06261), el gen ble (Mattern, I. E., Punt, P. J. , Van den Hondel, C. A. M. J. J., 1988. Un vector de transformación de Aspergillus que confiere resistencia a la fleomicina. Fungal Genet . Newsl. 35, 25), y el gen hygB (Punt P. J., Qliver R. P. , Dingemanse M. A., Pouwels P. H., Van den Hondel C. A. M. J. J. , 1987. Transformación de Aspergillus con base en el marcador de resistencia a la higromicina B de Escherichia coli. Gene. 56: 117 - 24) . En una realización, se utiliza un gen amdS, por ejemplo, un gen amdS de A. nidulans o A. niger. En una realización, el gen marcador de selección es el amdS de A. nidulans que codifica la secuencia fusionada al promotor gdpA de A. nidulans (véase el documento EP 635574 Bl) . También pueden ser utilizados los genes amdS de otros hongos filamentosos (WO 97/06261) .

Más específicamente, se ha demostrado que la selección de cepas de Talaromyces transformadas con ADN que codifica un polipéptido deseado es posible mediante el uso de los genes marcadores utilizados para la transformación de A. niger. Debido a la distancia filogenética entre este último hongo y Talaromyces no se podría haber previsto esto.

En una realización, la transformación se puede realizar más de una vez, es decir, una cepa transformada puede ser transformada nuevamente, una, dos o más veces. En una realización de la misma, el huésped para transformación en una segunda transformación es la transformante de Talaromyces aislado de una primera transformación, e igualmente una cepa anterior es el huésped Talaromyces para posterior transformación en transformaciones múltiples. En una realización de la misma se puede utilizar otro marcador en una o más etapas diferentes de transformación, por ejemplo el uso de fleomicina y de higromicina como marcadores diferentes. Las cepas resultantes de las transformaciones múltiples son aquí denominadas como transformantes múltiples. Por consiguiente, en una realización, la invención se refiere a un proceso para la producción de una transformante múltiple de Talaromyces, en donde en una primera transformación se utiliza una transformante aislado de Talaromyces como huésped Talaromyces y se transforma en una segunda transformación y en la etapa (e) de la segunda transformación se aisla una transformante múltiple de Talaromyces .

En una realización, en la primera transformación se utiliza un marcador de selección diferente que en la segunda transformación, por ejemplo el uso de fleomicina y higromicina como marcadores diferentes.

En una realización, se elimina el marcador de selección de la célula huésped transformada después de la introducción del constructo de expresión con el fin de obtener células huésped transformadas capaces de producir el polipéptido que están libres de los genes marcadores de selección, es decir libres de marcador. Este enfoque es descrito en el documento EP 0 635 574 y puede ser utilizado en la invención. En múltiples transformaciones como se describió anteriormente se puede evitar el uso de marcadores diferentes.

Vectores Los polinucleótidos de la invención pueden ser incorporados en un vector recombinante replicable, por ejemplo un vector de clonación o de expresión. El vector puede ser utilizado para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método de fabricación de polinucleótidos de la invención mediante la introducción de un polinucleótido de la invención en un vector replicable, la introducción del vector en una célula huésped compatible, y el crecimiento de la célula huésped bajo condiciones que llevan a cabo la replicación del vector. El vector puede ser recuperado de la célula huésped. Las células huésped adecuadas se describen a continuación .

Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención se refiere a vectores, incluidos vectores de clonación y de expresión, que contienen un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido o un equivalente funcional del mismo y los métodos de cultivo, transformación o transfección de tales vectores en una célula huésped adecuada, por ejemplo bajo condiciones en las que se produce la expresión de un polipéptido de la invención. Como se usa aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el cual se ha enlazado. Se pueden utilizar vectores in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o utilizarlos para transfectar o transformar una célula huésped.

El vector puede incluir además secuencias que flanquean el polinucleótido que contienen secuencias homologas a las secuencias genómicas eucariotas o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula huésped.

El sistema de vector puede ser un vector único, tal como un plásmido único, o dos o más vectores, tales como dos o más plásmidos, que juntos contienen el ADN total que es introducido en el genoma de la célula huésped.

El vector en el que se inserta el cásete de expresión o el polinucleótido de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante , y la escogencia del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que va a ser introducido.

Un vector de acuerdo con la invención puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el (los) cromosoma (s) dentro del (de los) cual (es) se ha integrado.

Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario dentro del cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral . Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro de la cual que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tiene un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes con los cuales están operativamente enlazados . Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos . Los términos "plásmido" y "vector" se pueden utilizar indistintamente en este documento ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores cósmidos virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados) y vectores de fago que sirven funciones equivalentes.

Los vectores de acuerdo con la invención puede ser utilizados in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o utilizados para transfectar o transformar una célula huésped.

El vector o el constructo de expresión se integran preferiblemente en el genoma de la célula huésped con el fin de obtener transformantes estables. En una realización adicional, el vector o el constructo de expresión son un minicromosoma, o un cromosoma artificial. Un vector de clonación mantenido en forma autónoma puede incluir la secuencia de AMA1 (véase, por ejemplo Aleksenko y Clutterbuck (1997), Fungal Genet . Biol . 21: 373 - 397). En el caso de que los constructos de expresión se integren en el genoma de las células huésped, los constructos se integran ya sea en loci aleatorios en el genoma, o en loci objetivo predeterminados utilizando recombinación homologa, en cuyo caso los loci objetivo contienen preferiblemente un gen altamente expresado.

Un vector de la invención puede contener dos o más, por ejemplo tres, cuatro o cinco, polinucleótidos de la invención, por ejemplo para sobreexpresion.

Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped que son utilizadas para la expresión, que está operativamente enlazado a la secuencia de ácido nucleico que es expresada. Dentro de un vector, tal como un vector de expresión, "operativamente enlazado" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la(s) secuencia (s) reguladora ( s ) en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción / traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped) , es decir, el término "operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia reguladora tal como un promotor, reforzador u otra señal reguladora de la expresión "operativamente enlazado" a una secuencia de codificación está posicionada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control o las secuencias están dispuestas de modo que funcionan en forma concertada para su finalidad prevista, por ejemplo la transcripción se inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido.

Un vector o constructo de expresión para una célula huésped dada puede incluir por lo tanto los siguientes elementos operativamente enlazados entre sí en un orden consecutivo desde el extremo 5' hasta el extremo 3' en relación con la cadena de codificación de la secuencia que codifica al polipéptído de la primera invención: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptído en la célula huésped dada; la secuencia de iniciación de la traducción que incluye Kozak (véase WO2006/077258 ) (2) opcionalmente , una secuencia de señal capaz de dirigir la secreción del polipéptído desde la célula huésped dada hasta un medio de cultivo; opcionalmente, una secuencia pre-pro para una secreción eficiente (3) una secuencia de ADN de la invención que codifica una forma madura y preferiblemente activa de un polipéptído que tiene actividad de celulasa; y preferiblemente también (4) una región de terminación de la transcripción (terminadora) capaz de terminar la transcripción secuencia arriba de la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptído. Véase también la señal óptima de terminación de la traducción en WO2006/07725. Esta incluye también una señal de poliadenilación para la generación de ARNm con cola poli A+ . La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia que está operativamente enlazada al terminal 3' de la secuencia de ácido nucleico y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula del hongo filamentoso como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación, que es funcional en la célula, puede ser utilizada en la presente invención. Secuencias de poliadenilación opcionales para las células de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae, glucoamilasa de A. niger, antranilato sintasa de A. nidulans, proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de A. niger. La secuencia de control también puede ser una secuencia adecuada de terminación de la transcripción, una secuencia reconocida por una célula de hongo filamentoso para terminación de la transcripción. La secuencia de terminación está operativamente enlazada al terminal 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido. Cualquier terminador, que sea funcional en la célula, puede ser utilizado en la presente invención.

Terminadores opcionales para las células de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae, glucoamilasa (glaA) de A. niger, antranilato sintetasa de A. nidulans, alfa-glucosidasa de A. niger, del gen trpC y de la proteasa tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Secuencia debajo de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención, puede haber una región no traducida 31 que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción (por ejemplo, un terminador) . El origen del terminador es menos crítico. El terminador, por ejemplo, puede ser nativo de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido. Preferiblemente se utiliza un terminador de hongo filamentoso en células huésped de hongos filamentosos. Más preferiblemente, el terminador es endógeno a la célula huésped (en la cual la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido se va a expresar) .

En la región transcrita, puede estar presente un sitio de enlazamiento del ribosoma para la traducción. La porción de codificación de las transcripciones maduras expresadas por los constructos incluirá un AUG para iniciación de la traducción al comienzo y un codón de terminación situado convenientemente en el extremo del polipéptido que va a ser traducido. Véanse también las observaciones acerca de la secuencia Kozak y la de terminación en WO2006/07725 ) .

El término "promotor" se define aquí como una secuencia de ADN que enlaza ARN polimerasa y dirige la polimerasa al sitio correcto para inicio de la transcripción secuencia abajo de una secuencia de ácido nucleico que codifica un compuesto biológico para iniciar la transcripción. La ARN polimerasa cataliza en forma efectiva el montaje de ARN mensajero complementario a la cadena apropiada de ADN de una región de codificación. El término "promotor" también se entenderá que incluye la región no codificadora 51 (entre el promotor y el inicio de la traducción) para la traducción después de la transcripción en ARNm, elementos de control de la transcripción que actúan en forma cis tales como reforzadores, y otras secuencias de nucleótidos capaces de interactuar con factores de transcripción. El promotor puede ser cualquier secuencia apropiada de promotor adecuada para una célula huésped eucariota o procariota, que muestre actividad transcripcional , incluidos promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede ser obtenido a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos (nativos) o heterólogos (foráneos) a la celda. El promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible. Ejemplos de promotores inducibles que se pueden utilizar son promotores inducibles de almidón, cobre, ácido oléico. El promotor puede ser seleccionado entre el grupo, que incluye pero no se limita a los promotores obtenidos a partir de los genes que codifican TAKA amilasa de A. oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de A. niger, alfa-amilasa estable al ácido de A. niger, glucoamilasa (glaA) de A. niger o A. awamori, lipasa de R. miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa A. oryzae, acetamidasa de A. nidulans , el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes que codifican alfa-amilasa neutra de A. niger y triosa fosfato 4 O isomerasa de A. oryzae) , los promotores obtenidos a partir de los genes que codifican cbhl, cbh2 , egl, eg2 , eg3 , eg5, eg6, xlnl, xln2 o xyll y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos. En una realización, el promotor se elige a partir del promotor de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido o un promotor heterologo escogido del grupo consistente de: promotores de glaA de A. niger, cbhl de T. emersonii, y bg de T. emersonnii, o partes funcionales de los mismos opcionalmente precedidos por secuencias de activación secuencia arriba.

En una realización adicional, los promotores para uso en células de hongos filamentosos son un promotor, o una parte funcional del mismo, de un gen de la proteasa; por ejemplo, del gen de la proteasa tipo tripsina de F. oxysporum (patente de los Estados Unidos N. 4.288.627), un gen para la proteasa alcalina de A. oryzae (alp) , un gen pacA de A. niger, un gen de proteasa alcalina de A. oryzae, un gen de la metaloproteasa neutra de A. oryzae, un gen pepA de la proteasa aspergilopepsina de A. niger, o un gen de la tripsina de F. venenatum, un gen pepB de proteasa aspártica de A. niger. Otros promotores son los promotores descritos en WO2006/092396 y WO2005/100573 , que se incorporan aquí como referencia .

El uso de múltiples promotores en una sola cepa es descrito en el documento WO 2008/098933. La enseñanza de la patente WO 2008/098933 se puede aplicar en este documento.

Se apreciará por parte de los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores, tales como los vectores de expresión de la invención pueden ser introducidos en las células huésped para producir así polipéptidos o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como los descritos aquí (por ejemplo, polipéptidos, formas mutantes de polipéptidos, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de los mismos. Por consiguiente, los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores derivados de cromosomas, de episoma y de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, virus papova, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de los elementos genéticos del plásmido y del bacteriófago, tales como cósmidos y f gémidos. De acuerdo con la invención, se utiliza un medio de cultivo como se describe aquí en los ejemplos y condiciones de cultivo como se describe en los ejemplos o el medio alternativo y las condiciones de cultivo que tienen un rendimiento similar.

Integración De acuerdo con una realización de la invención se consigue la integración. En tal realización, un vector de clonación integrador puede integrar al azar o en un locus objetivo predeterminado en el (los) cromosoma (s) de la célula huésped dentro de la cual se integra. En una realización de la invención, un vector de clonación integrador puede comprender un fragmento de ADN que es homólogo a una secuencia de ADN en un locus objetivo predeterminado en el genoma de la célula huésped para dirigir la integración del vector de clonación con este locus predeterminado. Con el fin de promover la integración objetivo, el vector de clonación puede ser preferiblemente linealizado antes de la transformación de la célula huésped. La linealización preferiblemente puede llevarse a cabo de tal manera que al menos uno, pero preferiblemente cualquiera de los dos extremos del vector de clonación está flanqueado por secuencias homologas al locus objetivo. La longitud de las secuencias homologas que flanquean el locus objetivo es preferiblemente al menos aproximadamente de 0.1 kb, tal como aproximadamente al menos 0.2 kb, más preferiblemente al menos aproximadamente 0.5 kb, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 1 kb, lo más preferible al menos aproximadamente 2 kb .

Preferiblemente, las cepas madre huésped pueden ser modificadas para mejorar la frecuencia de la integración del ADN objetivo como se describe en WO05/095624 y/o WO2007/115886.

Preferiblemente, la eficiencia de la integración objetivo en el genoma de la célula huésped, es decir, la integración en un locus objetivo predeterminado, se incrementa por las capacidades aumentadas de recombinación homologa de la célula huésped. Tal fenotipo de la célula implica preferiblemente un gen deficiente hdfA o hdfB como se describe en WO2005/095624. WO2005/095624 divulga un método para obtener una célula de hongo filamentoso que comprende una mayor eficiencia de integración objetivo.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en dirección antisentido para proporcionar la producción del ARN antisentido. Los polinucleótidos sintéticos pueden ser optimizados en el uso del codón, preferiblemente de acuerdo con los métodos descritos en WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943 , que se incorporan aquí como referencia. PCT/EP2007/055943 dirige la optimización del par de codones. La optimización del par de codones es un método en donde las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido han sido modificadas con respecto al uso del codón, en particular los pares de codones que se utilizan, para obtener una expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido y/o la producción mejorada del polipéptido codificado. Los pares de codones se definen como los conjuntos de dos tripletes posteriores (codones) en una secuencia de codificación.

Realizaciones biotecnológicas Cuando el polipéptido de acuerdo con la invención va a ser secretado desde la célula huésped dentro del medio de cultivo, se puede añadir una secuencia señal apropiada al polipéptido con el fin de dirigir el polipéptido sintetizado de nueva procedencia a la ruta de secreción de la célula huésped. La persona capacitada en el arte sabe cómo seleccionar una secuencia señal apropiada para un huésped específico. La secuencia señal puede ser nativa a la célula huésped, o puede ser foránea a la célula huésped. Como ejemplo, se puede utilizar una secuencia señal de un polipéptido nativo a la célula huésped. Preferiblemente, dicho polipéptido nativo es un polipéptido altamente secretado, es decir un polipéptido que es secretado en cantidades superiores al 10% de la cantidad total del polipéptido que es secretada.

Como una alternativa para una secuencia señal, el polipéptido de la invención puede ser fusionado a un polipéptido portador secretado, o a una parte del mismo. Tal constructo quimérico es dirigido a la ruta de secreción por medio de la secuencia señal del polipéptido portador, o a una parte del mismo. Además, el polipéptido portador proveerá un efecto estabilizante al polipéptido de acuerdo con la invención y/o puede mejorar la solubilidad. Tal polipéptido portador puede ser cualquier polipéptido. Preferiblemente, un polipéptido altamente secretado se utiliza como un polipéptido portador. El polipéptido portador puede ser nativo o foráneo al polipéptido de acuerdo con la invención. El polipéptido portador puede ser nativo o puede ser foráneo a la célula huésped. Los ejemplos de tales polipéptidos portadores son glucoamilasa, secuencia pre-pro del factor de emparejamiento alfa, dominio de enlazamiento de celulosa del polipéptido A de enlazamiento de celulosa de Clostridium cellulovorans , glutationa S-transferasa, dominio de enlazamiento de quitina de la quitinasa A de Bacillus circulans, dominio de enlazamiento de maltosa codificado por el gen malE de E. coli K12, beta-galactosidasa, y fosfatasa alcalina. Un polipéptido portador opcional para expresión de tal constructo quimérico en células de Aspergillus es glucoamilasa. El polipéptido portador y el polipéptido de acuerdo con la invención pueden contener un motivo de un aminoácido específico para facilitar el aislamiento del polipéptido; el polipéptido de acuerdo con la invención puede ser liberado por un agente de liberación especial. El agente de liberación puede ser una enzima proteolítica o un agente químico. Un ejemplo de tal motivo de aminoácidos es el sitio de escisión de la proteasa KEX, que es bien conocido por una persona capacitada en el arte.

Una secuencia señal puede ser utilizada para facilitar la secreción y aislamiento de un polipéptido o de un polipéptidp de la invención. Las secuencias señal se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos, que son generalmente escindidos del polipéptido maduro durante la secreción en uno o más eventos de escisión. Tales péptidos señalan contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia señal de los polipéptido maduros a medida que ellos pasan a través de la ruta secretora. Esta secuencia señal dirige la secreción del polipéptido, tal como desde un huésped eucariota dentro del cual se transforma el vector de expresión, y la secuencia señal es escindida posteriormente o al mismo tiempo. El polipéptido puede ser entonces purificado fácilmente del medio extracelular por medio de métodos conocidos. Alternativamente, la secuencia señal puede ser enlazada al polipéptido de interés utilizando una secuencia, que facilita la purificación, tal como con un dominio GST. De este modo, por ejemplo, se puede fusionar la secuencia que codifica al polipéptido a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta suministrada en un vector pQE (Quiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales se encuentran comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 821 - 824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina permite una purificación conveniente del polipéptido de fusión. La etiqueta HA es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado del polipéptido hamaglutinina de la influenza, que ha sido descrito por Wilson et al., Cell 37: 767 (1984), por ejemplo. Generalmente, la transformante puede ser construido por medio de la reducción o la eliminación de la expresión de ciertos genes.

La reducción o la supresión de estos genes pueden ser convenientes ya que puede incrementar el rendimiento de polipéptido deseables y puede reducir también el rompimiento de polipéptidos deseables bajo la influencia del polipéptido expresado por el gen reducido o suprimido. La reducción o la supresión pueden lograrse mediante la utilización de uno o más métodos bien conocidos en el arte, por ejemplo, inserciones, rupturas, reemplazos, o supresiones. Los métodos para la reducción o la supresión pueden ser métodos de mutagénesis aleatoria o dirigidos al sitio. La porción del gen que es modificada o inactiva puede ser, por ejemplo, la región de codificación o un elemento regulador requerido para la expresión de la región de codificación. Un ejemplo de tal secuencia reguladora o de control de un gen puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, es decir, una parte que es suficiente para afectar la expresión del gen. Otras secuencias de control para posible modificación incluyen, pero no se limitan a, una secuencia propéptido, líder, prepropéptido, Kozak, de iniciación de la transcripción, una secuencia señal, terminadora de la transcripción, activadora transcripcional , del sitio de iniciación de la traducción, y del sitio de terminación de la traducción .

En una realización, los polinucleótidos de la presente invención como se describe aquí pueden ser sobreexpresados en una cepa microbiana de la invención comparado con la cepa microbiana madre en la cual dicho que en no es sobreexpresado . La sobreexpresión de una secuencia de polinucleótidos se define aquí como la expresión de dicha secuencia del gen que resulta en una actividad de la enzima codificada por dicha secuencia en una cepa microbiana que es al menos aproximadamente 1.2 veces la actividad de la enzima en los microbios madre; al menos 1.5 veces la actividad, preferiblemente la actividad de dicha enzima es aproximadamente al menos 2 veces , aproximadamente al menos 3 veces, aproximadamente al menos 4 veces, aproximadamente al menos 5 veces, aproximadamente al menos 10 veces, aproximadamente al menos 20 veces, aproximadamente al menos 50 veces, aproximadamente al menos 100 veces, aproximadamente al menos 200 veces, aproximadamente al menos 500 veces, aproximadamente al menos 1000 veces la actividad de la enzima en los microbios madre.

En una modalidad, se puede producir un polipéptido de fusión. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptidos son ligados juntos en el marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo por medio del empleo de terminales para ligación con extremo romo o con extremo escalonado, digestión con un enzima de restricción para proporcionar terminales apropiados, el relleno de extremos cohesivos según sea conveniente, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligación enzimática. En una realización adicional, el gen de fusión puede ser sintetizado por medio de técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automatizados de ADN. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificación por PCR de fragmentos de gen utilizando iniciadores ancla, que dan origen a voladizos complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que pueden posteriormente aparearse y amplificarse nuevamente para generar una secuencia quimérica del gen (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, se encuentran comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican una unidad estructural de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico codificador puede ser clonado en dicho vector de expresión de tal manera que la unidad estructural de fusión se enlace en el marco con el polipéptido de tal manera que los polipéptido fusionados estén en el marco y la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control del (de los) mismo (s) promotor (es) y terminador. Los polipéptidos híbridos pueden incluir una combinación de secuencias de polipéptidos parciales o completas obtenidas al menos a partir de dos polipéptidos diferentes en donde uno o más pueden ser heterólogos con la célula huésped.

Expresión/producción del polipéptido De acuerdo con la invención, el polipéptido es expresado por la transformante de Talaromyces . El transformante de Talaromyces puede . por lo tanto ser utilizado en la preparación de un polipéptido de acuerdo con la invención. Tal método comprende el cultivo de una célula huésped (por ejemplo transformada como se describió anteriormente) bajo condiciones que permitan la expresión de una secuencia de codificación que codifique al polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado.

En el contexto de la presente invención, el término "recombinante" se refiere a cualquier modificación genética no exclusivamente que involucre procesos de origen natural y/o modificaciones genéticas introducidas por someter a la célula huésped a mutagénesis aleatoria sino también rupturas y/o o supresiones y/o mutagénesis específica del gen, por ejemplo. En consecuencia, combinaciones de procesos recombinantes y de origen natural y/o modificaciones genéticas inducidas por someter a la célula huésped a mutagénesis aleatoria se considera que son recombinantes.

Las células recombinantes de Talaromyces (transformantes) de acuerdo con la invención pueden ser cultivadas utilizando procedimientos conocidos en el arte. Para cada combinación de un promotor y una célula huésped, se encuentran disponibles condiciones de cultivo que conducen a la expresión de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido. Después de alcanzar la densidad deseada de células o el título del polipéptido se detiene el cultivo y se recupera el polipéptido utilizando procedimientos conocidos.

El medio de fermentación puede incluir un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono (por ejemplo, glucosa, maltosa, molasas, almidón, celulosa, xilano, pectina, hidrolizado de biomasa lignocelulósica, etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo, sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes inorgánicas de nutrientes (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente , se puede incluir un inductor (por ejemplo celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano) .

La selección del medio apropiado se puede basar en la escogencia de un huésped de expresión y/o se puede basar en los requerimientos reguladores del constructo de expresión. Tales medios son conocidos por aquellos capacitados en el arte. El medio puede contener, si se desea, componentes adicionales que favorecen a los huéspedes de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes .

La fermentación puede ser llevada a cabo durante un período de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 30 días. Puede ser un proceso por lotes, por lotes pero alimentado, o continuo, adecuado a una temperatura en el rango de, por ejemplo, aproximadamente desde 20 hasta aproximadamente 90oC, preferiblemente 20 - 55oC, más preferiblemente 40 - 50oC y/o a un pH, por ejemplo, aproximadamente desde 2 hasta aproximadamente 8, preferiblemente aproximadamente desde 3 hasta aproximadamente 5. Las condiciones apropiadas usualmente se seleccionan con base en la escogencia del huésped de expresión y del polipéptido que va a ser expresado .

Después de la fermentación, si fuera necesario, se pueden remover las células del caldo de fermentación por medio de centrifugación o de filtración. Después de que se ha detenido la fermentación o después de la remoción de las células, se puede recuperar entonces el polipéptido de la invención y, si se desea, purificarlo y aislarlo por medios convencionales .

Polipéptido / composiciones de polipéptidos La invención proporciona un polipéptido o una composición de polipéptidos que contiene una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.

En esta memoria descriptiva, una celulasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar o modificar celulosa y/o glucanos . Un polipéptido que sea capaz de degradar celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de rompimiento de la celulosa en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo en celodextrinas , o completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se la pone en contacto con la celulosa. Tal degradación típicamente tendrá lugar por medio de una reacción de hidrólisis.

En esta memoria descriptiva, una hemicelulasa es cualquier polipéptidó que sea capaz de degradar o de modificar hemicelulosa . Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar o de modificar la uno o más entre xilano, arabano, glucuronoxilano, arabinogalactano, arabinoxilano, glucomanano, galactomanano y xiloglucano. Un polipéptidó que sea capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de rompimiento de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, ya sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos , o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo monómeros del azúcar hexosa o pentosa. Una hemicelulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se la pone en contacto con la hemicelulasa. Tal degradación típicamente tendrá lugar por medio de una reacción de hidrólisis.

En esta memoria descriptiva, una pectinasa es cualquier polipéptidó que sea capaz de degradar o de modificar pectina. Un polipéptidó que sea capaz de degradar pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de rompimiento de la pectina en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos , o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se la pone en contacto con la pectina. Tal degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de hidrólisis .

Por lo tanto, una composición de la invención puede contener cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo-ß-? .4 -glucanasa , una ß-glucosidasa o una' ß- (1.3) (1.4) -glucanasa .

En esta memoria descriptiva, una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1.4 - ß-D-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas . Esta enzima puede ser denominada también como celulasa 1. - ß-celobiosidasa, 1.4-ß-celobiohidrolasa, 1.4^-D-glucano celobio-hidrolasa, avicelasa, exo-1.4^-D-glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa .

En esta memoria descriptiva, una endo- ß - 1.4 -glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1.4 - ß-D-glucosídicos en celulosa, liquenina o ß-D-glucanos de cereal. Tal polipeptido puede también ser capaz de hidrolizar enlaces 1.4 en ß-D-glucanos que contienen también enlaces 1.3. Esta enzima también puede ser denominada como celulasa, avicelasa, ß-l . -endoglucano hidrolasa, ß- 1.4 -glucanasa, carboximetil celulasa, celudextrinasa, endo-1.4- -D-glucanasa, endo-1.4-ß-D-glucanohidrolasa, endo-1.4 - -glucanasa o endoglucanasa.

En esta memoria descriptiva, una ß-glucosidasa (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos terminales, no reductores de ß-D-glucosa con la liberación de ß-D-glucosa. Tal polipéptido puede tener una gran especificidad por ß-D-glucósidos y puede hidrolizar también uno o más de los siguientes: un ß-D-galactósido, un a-L-arabinósido, un ß-D-xilósido o un ß-D-fucósido. Esta enzima también puede ser denominada como amigdalasa, ß-D-glucosido glucohidrolasa, celobiasa o gentobiasa .

En esta memoria descriptiva una ß- (1.3 ) ( 1. ) -glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1.4 - ß-D-glucosídicos en ß-D-glucanos que contienen enlaces 1.3 y 1.4. Tal polipéptido puede actuar sobre liquenina y ß-D-glucanos de cereal, pero no sobre ß-D-glucanos que contienen únicamente enlaces 1.3 ó 1.4. Esta enzima también puede ser denominada como liqueninasa, 1.3 -1. - ß-D-glucano 4-glucanohidrolasa, ß-glucanasa, endo-ß-? .3-1.4 glucanasa, liquenasa o ß-glucanasa de enlace mixto. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo- 1.3 (4 ) -beta-glucanasa . Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1.3 ó 1.4 en beta-D-glucanos cuando el residuo de glucosa cuyo un grupo reductor está involucrado en el enlace que es hidrolizado está el mismo sustituido en C-3. Los nombres alternativos incluyen endo-1.3 -beta-glucanasa, laminarinasa, 1.3- (1.3; 1.4)-beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolas ; los sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereal.

Una composición de la invención puede incluir cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una -L-arabinofuranosidasa, una 1.4-beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, una acetil-xilano esterasa, una a-D-glucuronidasa, una celobiohidrolasa, una feruloil esterasa, una coumaroil esterasa, una -galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidasa .

En esta memoria descriptiva, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1.4 - ß -D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima también puede ser denominada como endo-1.4 -ß-xilanasa o 1.4 - ß-D-xilano xilanohidrolasa . Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa , una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1.4 xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos .

En esta memoria descriptiva, una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de 1.4 -ß-D-xilanos , para remover sucesivos residuos de D-xilosa de los terminales no reductores. Tales enzimas pueden hidrolizar también xilobiosa. Esta enzima puede ser denominada también como xilano 1. - ß -xilosidasa, 1.4 - ß-D-xilano xilohidrolasa, exo-1.4 - ß-xilosidasa o xilobiasa .

En esta memoria descriptiva, una -L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos , a-L-arabinanos que contienen enlaces (1.2) y/o (1.3) y/o (1.5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede ser denominada como -N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidas .

En esta memoria descriptiva, una a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido + H(2)0 = un alcohol + D-glucuronato . Esta enzima también puede ser denominada como alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa . Éstas enzimas también pueden hidrolizar al ácido glucurónico 4-0-metilado, que también puede estar presente como un sustituyen que en xilanos. Una alternativa es EC 3.2.1.131: xilan alfa-1.2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1.2- (4-0-metil) glucuronosilo .

En esta memoria descriptiva, una celobiohidrolasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos . Tal polipéptido puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, alfa-naftil acetato o p-nitrofenil acetato pero, típicamente, no de triacetilglicerol . Tal polipéptido típicamente no actúa sobre mañano acetilado o pectina.

En esta memoria descriptiva, una acetil-xilano esterasa (EC 3.1.1.6) es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar específicamente los enlaces éster de los grupos acetilo en las posiciones 2 y/o 3 de las unidades estructurales de xilosa del xilano natural.

En esta memoria descriptiva, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido + H(2)0 = ferulato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido . Puede catalizar típicamente la hidrólisis del grupo 4 -hidroxi-3 -metoxicinamoilo (feruloilo) de un azúcar escarificado, que es usualmente arabinosa en sustratos 'naturales'. Acetato de p-nitrofenol y metil ferulato son típicamente sustratos más pobres. Esta enzima puede ser denominada también como cinamoil éster hidrolasa, estearasa de ácido ferúlico o hidroxicinamoil esterasa. También puede ser denominada como una enzima secundaria de la hemicelulasa, ya que puede ayudar a las xilanasas y a las pectinasas a romper la hemicelulosa y la pectina de la pared celular vegetal .

En esta memoria descriptiva, una coumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: cumaroil-sacárido + H(2)0 cumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido . Esta enzima también puede ser denominada como trans-4 -cumaroil esterasa, trans-p-cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o ácido p-cumárico esterasa. Esta enzima también cae dentro de EC 3.1.1.73 de modo que también puede ser denominada como una feruloil esterasa .

En esta memoria descriptiva, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis del terminal, sin reducir los residuos de a-D-galactosa en a-D-galactósidos , incluidos los oligosacáridos de galactosa, galactomananos , galactanos y arabinogalactaños . Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-D-fucósidos. Esta enzima también puede ser denominada como melibiasa .

En esta memoria descriptiva, una ß -galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis del terminal sin reducir los residuos de ß-D-galactose en ß-D-galactósidos . Tal polipéptido puede ser capaz también de hidrolizar a-L-arabinósidos . Esta enzima también puede ser denominada como exo- ( 1- >4 ) - ß-D-galactanasa o lactasa.

En esta memoria descriptiva, una ß-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1.4 - ß-D-manósidicos en mananos, galactomananos y glucomananos . Esta enzima también puede ser denominada como mañano endo-1.4^-manosidasa o endo-1.4 -mananasa .

En esta memoria descriptiva, una ß-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos terminales no reductores de ß-D-manosa en ß -D-manósidos . Esta enzima también puede ser denominada como mananasa o manasa.

Una composición de la invención puede incluir cualquier pectinasa, por ejemplo una endo poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exo-galac uronasa, una exo-poligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa .

En esta memoria descriptiva, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1.4-a-D-galactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos . Esta enzima también puede ser denominada como poligalacturonasa pectina despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a- 1.4 -galacturónido glicanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli ( 1.4 -a-D-galacturónido) glicanohidrolasa .

En esta memoria descriptiva, una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que es capaz de catalizar la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato. La enzima puede ser conocida también como pectinaesterasa, pectina desmetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa .

En esta memoria descriptiva, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endo idrólisis de enlaces 1.4 - ß-D-galactosídicos en arabinogalactanos . La enzima puede ser conocida también como arabinogalactano endo-1.4- -galactosidasa, endo-l-4-ß-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4 - ß-D-galactanohidrolasa .

En esta memoria descriptiva, una pectina acetil esterasa se define aquí como cualquier enzima que tiene una actividad de acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de residuos GalUA de pectina .

En esta memoria descriptiva, una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión para eliminación del (1 4 ) -a-D-galacturonano metil éster para producir oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-0-metil-a-D-galacto-4 -enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima puede ser conocida también como pectina liase, pectina trans-eliminasa; endo-pectina liasa, polimetilgalacturónica transeliminasa, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1 4) - 6 -0-metil-a-D-galacturonano liasa.

En esta memoria descriptiva, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión para eliminación del (1 4 ) -a-D-galacturonano para producir oligosacáridos con grupos 4 -desoxi-a-D-galacto-4 -enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima puede ser conocida también como poligalacturónica transeliminasa, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péctico liasa, liasa péctica, ácido OÍ-1.4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-a- 1.4 -poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa o (1 4 ) -a-D-galacturonano liasa.

En esta memoria descriptiva, una alfa ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis del terminal no reductor de los residuos de -L-ramnosa en a-L-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano . Esta enzima puede ser conocida también como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnosida ramnohidrolasa .

En esta memoria descriptiva, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de hidrolizar al ácido péctico del extremo no reductor, liberando digalacturonato . La enzima puede ser conocida también como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa .

En esta memoria descriptiva, exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1.4-a-D-galacturónido) n + H20 = (1.4-a-D-galacturónido) n-1 + D-galacturonato . La enzima puede ser conocida también como galacturano 1.4 -a-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli (galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli (1.4-a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa .

En esta memoria descriptiva, exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión para eliminación del 4- (4 -desoxi-a-D-galacto-4 -enuronosil) -D-galacturonato del extremo reductor del pectato, es decir pectina desesterificada . Esta enzima puede ser conocida como pectato disacárido-liasa, pectato exo-liasa, ácido exopéctico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturonico-trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o disacárido liasa del extremo reductor de (1 4)-a-D-galacturonano .

En esta memoria descriptiva, ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar el enlace entre el ácido galactosilurónico y el ramnopiranosilo en un extremo en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes, que consisten del disacárido [ácido (1.2-alfa-L-ramnoil- (1.4) -alfa-galactosilurónico] .

En esta memoria descriptiva, ramnogalacturonano liasa es cualquier polipéptido que es capaz de escindir enlaces a-L-Rhap- (1 4)- -D-GalpA en un extremo en el ramnogalacturonano por medio de eliminación en beta.

En esta memoria descriptiva, ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipéptido que cataliza la desacetilación de la columna vertebral de residuos de ácido galacturónico y ramnosa que se alternan en el ramnogalacturonano.

En esta memoria descriptiva, ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano que se alternan en forma estricta en una forma exo.

En esta memoria descriptiva, xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúa sobre xilogalacturonano por medio de la escisión de la columna vertebral del ácido galacturónico sustituido en la xilosa ß en una forma endo. Esta enzima puede ser conocida también como xilogalacturonano hidrolasa. En esta memoria descriptiva, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos , a-L-arabinanos que contienen enlaces (1.2) y/o (1.3) y/o (1.5, arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima puede ser denominada también como oí-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

En esta memoria descriptiva, endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1.5-a-arabinofuranosídicos en 1.5-arabinanos . La enzima puede ser conocida también como endo-arabinasa, arabinano endo-1.5-a-L-arabinosidasa, endo-1.5-a-L-arabinanasa, endo-a- 1.5 -arabanasa ; endo-arabanasa o 1.5-a-L-arabinano 1.5 -a-L-arabinanohidrolasa .

Una composición de la invención contendrá típicamente al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido de acuerdo con la invención) . Una composición de la invención puede contener una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una ß-glucosidasa. Tal composición puede contener también una o más hemicelulasas y/o una o más pectinasas.

Una o más (por ejemplo dos, tres, cuatro o todas) entre una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa o una glucuronidasa pueden estar presentes en una composición de la invención.

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (peptidasas) , así como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y/o otras unidades estructurales, tales como azúcares (glicopeptidasas) . Muchas proteasas están caracterizadas bajo EC 3.4, y son adecuadas para uso en la invención incorporada aquí como referencia. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteina proteasas que incluyen pepsina, papaina y serina proteasas que incluyen quimotripsinas , carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas .

"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos, y acilglicéridos , incluyendo fosfoglicéridos , lipopolipéptidos, diacilgliceroles , y similares. En las plantas, los lípidos se utilizan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o romper la estructura de los polímeros de lignina. Las enzimas que pueden romper la lignina incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en el arte que se sabe que despolimerizan o bien rompen polímeros de lignina. También incluyen enzimas capaces de hidrolizar enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (particularmente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen pero no se limitan al siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.1), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que son capaces de transferir grupos glicosilo, más específicamente grupos hexosilo. Además de la transferencia de un grupo glicosilo de un donante que contiene glicosilo a otro compuesto que contiene glicosilo, el aceptor, las enzimas pueden transferir también al grupo glicosilo al agua como aceptor. Esta reacción es también conocida como una reacción de hidrólisis, en vez de una reacción de transferencia. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que puede ser utilizada en la invención es una ß-glucanosiltransferasa . Tal enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1.3) (1.4)glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de la celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronósido, por ejemplo ß-glucuronósido para producir un alcohol. Se han caracterizado muchas glucuronidasas y pueden ser adecuadas para ser usadas en la invención, por ejemplo ß-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirrizinato de ß-glucuronidasa (3.2.1.128) o -D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) .

Una composición de la invención puede incluir una expansina o un polipéptido tipo expansina, tal como una swollenina (véase Saloheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202 - 4211, 2002) o un polipéptido tipo swollenina. 7 O Las expansinas están involucradas en la pérdida de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de la célula vegetal. Se ha propuesto que las expansinas rompen el enlace de hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolítica. De este modo, se cree que permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y el agrandamiento de la pared celular. Swollenina, un polipéptido tipo expansina contiene un dominio de la Familia 1 del Módulo de Enlazamiento del Carbohidrato del terminal N (CBD) y un dominio como el de la expansina del terminal C. Para los propósitos de esta invención, un polipéptido como la expansina o un polipéptido como la swollenina pueden contener uno o ambos de tales dominios y/o pueden romper la estructura de las paredes celulares (tal como el rompimiento de la estructura de la celulosa) , opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores .

Otros polipéptido los que pueden estar presentes son por ejemplo escogidos de entre el grupo de catalasa, lacasa, fenoloxidasa, oxidasa, oxidorreductasas , celulasa, xilanasa, peroxidasa, lipasa, hidrolasa, esterasa, cutinasa, proteasa y otros polipéptidos proteolíticos , aminopeptidasa, carboxipeptidasa, fitasa, liasa, pectinasa y otras enzimas pectinolíticas , amilasa, glucoamilasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, manosidasa, isomerasa, invertasa, transferasa, ribonucleasa, quitinasa, mutanasa y desoxirribonucleasa .

La invención se relaciona además con composiciones que contienen uno o más de los polipéptidos de acuerdo con la invención.

En una modalidad, el polipéptido de la invención es una hemicelulasa, y la composición de la inversión incluirá típicamente una celulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.

En una modalidad adicional, el polipéptido de la invención es una pectinasa, y la composición de la invención incluirá típicamente una celulasa y/o una hemicelulasa además del polipéptido de la invención.

En una modalidad adicional, el polipéptido de la invención es una celulasa, y la composición de la invención incluirá típicamente una hemicelulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.

En una modalidad, la celulasa es una o más entre CBH I, CBH II, EG o BG. El polipéptido puede ser una sola celulasa y/o una hemicelulasa o una pectinasa o una mezcla de celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa y/o otros polipéptidos. En una modalidad, el polipéptido es una celulasa que es una mezcla de dos polipéptidos seleccionados entre CBH I, CBH II, EG o BG.

Preferiblemente la celulasa es una mezcla que contiene CBH I, CBH II, EG y BG. Una composición de la invención puede incluir uno, dos o tres clases de celulasa, por ejemplo una, dos o todas entre endo-1.?-ß-glucanasa (EG) , una exo-celobiohidrolasa (CBH) y una ß- glucosidasa (BG) .

Una composición de la invención puede incluir un polipéptido que tenga la misma actividad enzimática, por ejemplo el mismo tipo de actividad de la celulasa, hemicelulasa y/o pectinasa que aquella proporcionada por un polipéptido de la invención.

Una composición de la invención , puede incluir un polipéptido que tenga un tipo diferente de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa que aquella proporcionada por un polipéptido de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede incluir un tipo de actividad de celulasa y/o de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa suministrada por un polipéptido de la invención y un segundo tipo de actividad de celulasa y/o de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionada por una hemicelulasa/pectinasa adicional .

Una composición de la invención puede contener al producto polipeptídico de un polipéptido que incorpora celulosa, escafoldina o un polipéptido como la escafoldina, por ejemplo CipA o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum, respectivamente. Los polipéptido que incorporan escafoldinas y celulosa son subunidades incorporadoras multifuncionales , que pueden organizar subunidades celulósicas en un complejo multienzimático . Esto se logra por medio de la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir un dominio de cohesión sobre escafoldina y un dominio de doquerina sobre cada unidad enzimática. La subunidad de escafoldina también contiene un módulo de enlazamiento de celulosa (CBM) que media la unión del celulosoma con su sustrato. Un polipéptido que incorpora escafoldina o celulosa para los propósitos de esta invención puede contener uno o ambos de tales dominios .

En una modalidad la composición del polipéptido que se origina a partir de otros microorganismos diferentes a Talaromyces, por ejemplo CBHI de Trichoderma, CBHII de Trichoderma, BG de Trichoderma y/o EG de Trichoderma, beta-D-glucósido glucohidrolasa, endo-galactanasa, Swollenina, Cipl, Cip2, Xilanasa III, beta-xilosidasa XylA, acetilxilano esterasa, quitinasa, beta-manasa.

Una composición de la invención puede incluir un polipéptido inducido por celulosa o un polipéptido modulador, por ejemplo como el codificado por el gen cipl o cip2 o por genes similares de Trichoderma reesei / Hypocrea jacorina (véase Foreman et al., J. Biol . Chem. 278(34), 31988 - 31997, 2003). El producto polipeptídico de estos genes son polipéptidos bimodulares, que contienen un módulo de enlazamiento de celulosa y un dominio cuya función o actividad no pueden ser relacionadas con familias conocidas de glicosil hidrolasa. Sin embargo, la presencia de un módulo de enlazamiento de celulosa y la regulación conjunta de la expresión de estos genes con componentes de celulasas indican actividades previamente no reconocidas con un papel potencial en la declaración de la biomasa.

Una composición de la invención puede estar compuesta por un miembro de cada una de las clases de polipéptidos mencionados anteriormente, diferentes miembros de una clase de polipéptido, o cualquier combinación de estas clases de polipéptidos.

Una composición de la invención puede estar compuesta por polipéptidos, por ejemplo enzimas, de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan polipéptidos, por ejemplo enzimas; (3) un caldo complejo (tal como aquel resultante del crecimiento de una cepa microbiana en un medio, en donde las cepas secretan polipéptidos y enzimas dentro del medio; (4) Usados celulares de cepas cultivadas como en (3) ; y/o (5) material vegetal que expresa polipéptidos, por ejemplo enzimas. Diferentes polipéptidos, por e emplo enzimas en una composición de la invención pueden ser obtenidos a partir de fuentes diferentes.

Uso de los polipéptidos Los polipéptidos y las composiciones de polipéptidos de acuerdo con la invención pueden ser utilizados en muchas aplicaciones diferentes.

Por ejemplo pueden ser utilizados para producir azúcares ferméntales. En una realización pueden ser utilizados en un proceso para sacarificación de material lignocelulósico, en donde el material lignocelulósico que ha sido opcionalmente pretratado, es puesto en contacto con una transformante de Talaromyces de acuerdo con la invención o una celulasa, hemicelulasa o pectinasa de acuerdo con la invención, en donde se producen uno o más azúcares . Los azúcares fermentables pueden, como parte de un proceso de biocombustibles , ser luego convertidos en biogas o etanol, butanol, isobutanol, 2-butanol u otras sustancias adecuadas. La invención se relaciona por lo tanto con un proceso para la preparación de un producto de fermentación, por ejemplo etanol, en donde los azúcares se fermentan con un microorganismo para fermentación, preferiblemente levadura, para producir el producto de fermentación.

Alternativamente, los polipéptidos y sus composiciones pueden ser utilizados como enzimas, por ejemplo en la producción de productos alimenticios, en composiciones detergentes, en la industria de la pulpa y el papel y en formulaciones antibacterianas, en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, pastas dentríficas, y enjuague bucal. Algunos de estos usos serán ilustrados en forma más detallada más adelante.

En los usos y métodos descritos más adelante, los componentes de las composiciones descritas anteriormente pueden ser suministradas al mismo tiempo (es decir como una composición única) o en forma separada o secuencial.

La invención también se relaciona con el uso del polipéptido de acuerdo con la invención y con composiciones que contienen a tal enzima en procesos industriales.

A pesar de la experiencia obtenida a largo plazo con estos procesos, el polipéptido de acuerdo con la invención puede ofrecer una cantidad de ventajas significativas sobre las enzimas actualmente utilizadas. Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden incluir aspectos tales como menores costos de producción, mayor especificidad con relación al sustrato, una antigenicidad reducida, más pocas actividades secundarias indeseables, mayores rendimientos producidos en un microorganismo adecuado, más rangos de pH y de temperatura adecuados, la no inhibición por parte de productos hidrófobos derivados de lignina o menos inhibición del producto o, en el caso de la industria de alimentos un mejor sabor o textura del producto final así como aspectos del grado alimenticio y kosher.

En principio, un polipéptido o una composición de la invención pueden ser utilizados en cualquier proceso, que requiera del tratamiento de un material que contenga polisacáridos . De este modo, se puede utilizar un polipéptido o una composición de la invención en el tratamiento de material polisacárido. En esta memoria descriptiva, material polisacárido es un material que contiene o que consiste esencialmente de uno o, más típicamente, de más de un polisacárido .

Típicamente, las plantas y el material derivado de las mismas contienen cantidades significativas de material polisacárido diferente al almidón. Por lo tanto, un polipéptido de la invención puede ser utilizado en el tratamiento de una planta o de material fúngico o de un material derivado del mismo. Lignocelulosa Los polipéptidos pueden ser utilizados convenientemente para degradar material lignocelulósico . Los principales polisacáridos son celulosa (glucanos) , hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos ) . Además, alguna hemicelulosa puede estar presente como glucomananos , por ejemplo en materias primas derivadas de la madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos hasta azúcares solubles, por ejemplo glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, ácido D-galacturónico y otras hexosas y pentosas se presenta bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en forma concertada.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de paredes celulares típicas de tejidos no leñosos de la planta (aproximadamente entre un cuarto y la mitad de la masa seca puede estar constituida por pectinas) . La celulosa es un polisacárido y lineal compuesto de residuos de glucosa unidos por medio de enlaces ß-1.4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, así como la estequiometría de la glucosa ' enlazada en ß (con relación a a) genera estructuras más propensas a enlaces de hidrógeno entre las cadenas que las estructuras altamente ramificadas enlazadas en a del almidón. De este modo, los polímeros de celulosa son generalmente menos solubles, y forman fibras más estrechamente unidas que las fibras encontradas en el almidón.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición varía a menudo ampliamente de un organismo a otro, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es la xilosa con enlaces ß-1.4, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa está a menudo ramificada en 0-3 y/o en 0-2 y puede ser sustituida con enlaces con arabinosa, galactosa, mañosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o por esterificación con ácido acético (y esterificación delácido ferúlico con arabinosa) . La hemicelulosa también puede contener glucano, que es en términos generales para azúcares de seis carbonos enlazados en ß (tal como los glucanos ß-(1.3) (1.4) y heteroglucanos mencionados anteriormente) y adicionalmente glucomananos (en los cuales están presentes tanto glucosa como mañosa en la columna vertebral lineal, enlazados entre sí por medio de enlaces tipo ß ) .

Las sustancias pécticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos . Las pectinas son los polisacáridos más complejos en las paredes celulares de la planta. Se construyen alrededor de una cadena central de unidades de ácido D-galacturónico enlazado en forma a(1.4) intercaladas en alguna medida con L-ramnosa. En cualquier pared celular existen una cantidad de unidades estructurales que encajan con esta descripción y generalmente se ha considerado que en una molécula péctica individual, las cadenas centrales de diferentes unidades estructurales son continuas entre sí.

Los tipos principales de unidades estructurales son: 8 O galacturonano (homogalacturonano) , que puede estar sustituido con metanol sobre el grupo carboxilo y acetato sobre 0-2 y 0-3; ramnogalacturonano I (RGI) , en el cual las unidades de ácido galacturónico se alternan con unidades de ramnosa que portan cadenas laterales de galactano enlazadas en forma (1.4) y de arabinano enlazadas en forma (1.5). Las cadenas laterales de arabinano pueden estar unidas directamente a la ramnosa o indirectamente a través de las cadenas de galactano; xilogalacturonano, con unidades individuales de xilosilo sobre 0-3 del ácido galacturónico (estrechamente asociado con RGI) ; y ramnogalacturonano II (RGII) , una unidad menor particularmente compleja que contiene azúcares inusuales, por ejemplo apiosa. Una unidad RGII puede contener dos residuos de apiosilo que, bajo condiciones iónicas adecuadas, pueden formar ásteres en forma reversible con borato .

La composición, la naturaleza de la sustitución, y el grado de ramificación de la hemicelulosa es muy diferente en plantas dicotiledóneas (dicots, es decir, plantas cuyas semillas tienen dos cotiledones o dicotiledóneas tales como habas, maní, almendras, guisantes, judías) comparado con plantas monocotiledóneas (monocots; es decir, plantas que tienen un solo cotiledón o cotiledóneas tales como maíz, trigo, arroz, pastos, cebada). En las dicotiledóneas, la hemicelulosa está compuesta principalmente de xiloglucanos que son cadenas de glucosa enlazadas en forma 1.4-ß con cadenas laterales de xilosilo enlazadas en forma 1.6-ß. En las monocotiedóneas , incluidos la mayoría de los cultivos de grano, los componentes principales de la hemicelulosa son los heteroxilanos . Éstos están constituidos principalmente de polímeros con una columna vertebral de xilosa enlazada en forma 1.4-ß con enlaces 1.3-a con arabinosa, galactosa, mañosa y ácido glucurónico o ácido 4 -O-metil-glucurónico así como xilosa modificada por ácidos acéticos enlazados por éster. También están presentes ß glucanos compuestos por cadenas glucosilo enlazadas en forma 1.3 y 1.4-ß. En monocotiledóneas , la celulosa, los heteroxilanos y los ß-glucanos pueden estar presentes en cantidades aproximadamente iguales, conteniendo cada una aproximadamente 15 - 25% de la materia seca de las paredes de la célula. También, diferentes plantas pueden contener diferentes cantidades de, y diferentes composiciones de, sustancias pécticas . Por ejemplo, la remolacha azucarera contiene aproximadamente 19% de pectina y aproximadamente 21% de arabinano con base en el peso seco.

Por lo tanto, una composición de la invención puede ser elaborada con base en la materia prima particular (también llamada sustrato) que va a ser utilizada. Es decir, el espectro de actividades en una composición de la invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.

Se pueden administrar combinaciones de enzimas o tratamientos físicos en forma concomitante o secuencial. Las enzimas pueden ser producidas ya sea en forma exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego aisladas y añadidas a la materia prima lignocelulósic . Alternativamente, se producen las enzimas, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de la masa cruda de células, o el material vegetal (tal como el rastrojo de maíz), y similares se añaden a la materia prima. Alternativamente, la masa cruda de células o el medio para producción de la enzima o el material vegetal pueden ser tratados para prevenir el crecimiento adicional de microbios (por ejemplo, por medio de calentamiento o de la adición de agentes antimicrobianos) , se añaden luego a la materia prima. Estas mezclas crudas de enzima pueden incluir al organismo productor de la enzima. Alternativamente, la enzima puede ser producida en una fermentación que utiliza materia prima (tal como rastrojo de maíz) para proporcionar la nutrición a un organismo que produce una(s) enzima(s). De este modo, las plantas que producen las enzimas pueden servir como la materia prima lignocelulósica y ser añadidas dentro de la materia prima lignocelulósica. Los polímeros de carbohidrato (celulosa y hemicelulosas ) están estrechamente enlazadas a la lignina por medio de enlaces covalentes y de hidrógeno. Por lo tanto, un polipéptido de la invención puede ser utilizado en el tratamiento de material lignocelulósico . En esta memoria descriptiva, material lignocelulósico es un material que contiene o que consiste esencialmente de lignocelulos . De este modo, en un método de la invención para el tratamiento de un polisacárido diferente al almidón, del polisacárido diferente al almidón puede ser un material lignocelulósico/biomasa .

Por lo tanto, la invención proporciona un método para tratar un sustrato que contiene un polisacárido diferente al almidón en el cual el tratamiento comprende la degradación y/o la hidrólisis y/o la modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.

Las endo- 1.4 - ß-glucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble hasta celooligosacáridos (celobiosa como producto principal) , mientras que las ß- glucosidasas (BG) convierten los oligosacáridos , principalmente celobiosa y celotriosa en glucosa .

Las xilanasas junto con otras enzimas accesorias, por ejemplo OÍ-L- arabinofuranosidasas , feruloilo y acetilxilano esterasas, glucuronidasas , y ß- xilosidasas, catalizan la hidrólisis de hemicelulosas .

Las pectinasas, por ejemplo una endo poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, una pectato liasa, una alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exopoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa , una -arabinofuranosidasa .

Degradación en este contexto significa que el tratamiento trae como resultado la generación de productos de hidrólisis de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica, es decir que están presentes sacáridos de menor longitud como resultado del tratamiento de los que están presentes en un polisacárido similar no tratado diferente al almidón. De este modo, la degradación en este contexto puede dar como resultado la liberación de oligosacáridos y/o monómeros de azúcar.

Todas las plantas contienen polisacáridos diferentes almidón al igual que virtualmente todos los materiales polisacáridos derivados de la planta. Por lo tanto, en un método de la invención para el tratamiento de un sustrato que contiene un polisacárido diferente al almidón, dicho sustrato puede ser suministrado en la forma de material vegetal o de un material derivado de la planta o de un material que contiene material vegetal o un material derivado de la planta, por ejemplo una pulpa vegetal, un extracto vegetal, un producto alimenticio o un ingrediente del mismo, un tejido, un textil o una prenda de vestir.

La biomasa lignocelulósica adecuada para ser utilizada en la invención incluye biomasa y puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, compuestos orgánicos comerciales, desechos de construcción y de demolición, residuos sólidos municipales, residuos de papel y desechos de jardín. Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y pastos, trigo, paja del trigo, bagazo de la caña de azúcar, maíz, cascarilla de maíz, mazorca de maíz, granos de maíz incluida la fibra de los granos, productos y subproductos de la molienda de granos tales como maíz, trigo y cebada (incluida la molienda húmeda y la molienda seca) a menudo llamados "salvado o fibra" así como residuos sólidos municipales, residuos de papel y desechos de jardín. La biomasa también puede ser, pero no se limita a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, residuos de papel, y en residuos de la molienda de pulpa y de papel. La "biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, maíz y cascarilla de maíz, cultivos energéticos, bosques, frutos, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, cortaza de árbol, acículas, troncos, raíces raíces, árboles jóvenes, cultivos leñosos de corta rotación, arbustos, switch grasses, árboles, verduras, cáscaras de fruta, vides, pulpa de remolacha azucarera, afrecho de trigo, cascarilla de avena, y maderas blandas y duras (no se incluyen maderas con materiales perjudiciales) . Además, la biomasa agrícola incluye materiales orgánicos de desecho generados a partir de los procesos agrícolas, incluidas las actividades agrícolas y forestales, especialmente incluidos los desechos forestales de la madera. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de lo anteriormente establecido en forma particular o en cualquier combinación o mezcla de los mismos. Otros ejemplos de biomasa adecuada son preparaciones de huerto, chaparral, residuos de molienda, residuos de madera de ciudad, residuos municipales, residuos de explotación forestal, aclaramientos forestales, cultivos leñosos de corta rotación, residuos industriales, paja del trigo, paja de avena, paja de arroz, paja y cebada, paja de centeno, paja de lino, cascarilla de soja, cascarilla de arroz, paja de arroz, harina de gluten de maíz, cascarilla de avena, caña de azúcar, rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorca de maíz, cascarilla de maíz, praderas de pasto, maicillo, carricera,- pulpa de remolacha azucarera, pulpa de frutos cítricos, cascaras de semilla, residuos celulósicos de origen animal, recortes de césped, algodón, algas, árboles, arbustos, pastos, trigo, paja del trigo, bagazo de la caña de azúcar, maíz, cascarilla de maíz, mazorca de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y subproductos de la molienda húmeda o seca de los granos, residuos sólidos municipales, papel residual, desechos de jardín, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, desechos sólidos municipales, papel residual, pulpa, residuos de la molienda del papel, ramas, arbustos, cañas, maíz, cascarilla de maíz, un cultivo energético, bosque, un fruto, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza de árbol, una acícula, un tronco, una raíz, un árbol joven, un arbusto, switch grass, un árbol, una hortaliza, cáscaras de fruta, un vid, pulpa de remolacha azucarera, afrechos de trigo, cascarilla de avena, madera blanda o dura, material orgánico residual generado a partir de un proceso agrícola, residuos forestales de madera, o una combinación de dos cualquiera o más de los mismos .

Aparte de la biomasa virgen o de material prima ya procesada en alimentos y en piensos o papel e industrias de fabricación de pasta, la biomasa/materia prima puede ser pretratada adicionalmente con calor, modificaciones mecánicas y/o químicas o cualquier combinación de tales métodos con el fin dé mejorar la degradación enzimática.

Pretratamien o Antes del tratamiento enzimático, el material lignocelulósico puede ser pretratado. El pretratamiento pueden incluir la exposición del material lignocelulósico a un ácido, una base, un liquido iónico, un solvente, calor, un peróxido, ozono, trituración mecánica, molienda, pulverizado o despresurización rápida, o una combinación de dos o más de los mismos . Este pretratamiento químico a menudo se combinan con un pretratamiento térmico, por ejemplo entre 150 - 220° C durante 1 a 30 minutos.

Después de la etapa del pretratamiento, se puede utilizar una etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación que implica incubación con una enzima o mezcla de enzimas. La etapa de pretratamiento puede ser llevada a cabo a temperaturas muy diferentes. En una realización, se efectúa el pretratamiento a la temperatura más adecuada para la mezcla de enzimas que está siendo analizada, o para la enzima óptima predicha de las enzimas que son analizadas. La temperatura del pretratamiento puede estar en el rango aproximadamente de lOoC hasta aproximadamente 95oC, aproximadamente de 20oC hasta aproximadamente 85oC, aproximadamente de 30oC hasta aproximadamente 70oC, aproximadamente de 40oC hasta aproximadamente 60oC, aproximadamente de 37oC hasta aproximadamente 50oC, preferiblemente aproximadamente de 37oC hasta aproximadamente 8O0C, más preferiblemente aproximadamente de 60 - 70oC incluso más preferiblemente alrededor de 65o C. El pH de la mezcla del pretratamiento puede estar en el rango desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 10.0. pero es preferiblemente aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 7.0. más preferiblemente aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 6.0. incluso más preferiblemente aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 5.0. Nuevamente, se pueden ajustar el pH para maximizar la actividad de la enzima y se puede apostar con la adición de la enzima. La comparación de los resultados del ensayo resultantes de este análisis permitirá modificar el método que mejor se adapte a las enzimas que están siendo analizadas.

La etapa de licuefacción/hidrólisis o la redacción de presacarificación pueden ocurrir durante varios minutos hasta varias horas, tal como desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 120 horas, preferiblemente desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 48 horas, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 24 horas, lo más preferible desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 horas . El tratamiento con celulasa puede ocurrir desde varios minutos hasta varias horas, tal como desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 120 horas, preferiblemente aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 72 horas, más preferiblemente aproximadamente 24 hasta 48 horas.

Sacarificación La invención proporciona un método para producir un azúcar a partir de un material lignocelulósico el cual comprende poner en contacto un polipéptido de la invención con una composición de la invención con el material lignocelulósico. Tal método permite que los azúcares libres (monómeros) y/o oligosacáridos se generen a partir de biomasa lignocelulósica . Estos métodos involucran la conversión de la biomasa lignocelulósica en azúcares libres y en oligosacáridos pequeños con un polipéptido o composición de la invención.

El proceso de convertir un carbohidrato complejo tal como lignocelulosa en azúcares permite preferiblemente la conversión en azúcares fermentables . Tal proceso puede ser denominado como "sacarificación." Por lo tanto, un método de la invención puede dar como resultado la liberación de uno o más azúcares de hexosa y/o pentosa, tal como uno o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, mañosa, ramnosa, ribosa y fructosa.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención incluye métodos que utilizan al polipéptido de la composición de la invención descrita anteriormente junto con otras enzimas o tratamientos físicos tales como temperatura y pH para convertir la biomasa vegetal lignocelulósica en azúcares y oligosacáridos .

Aunque la composición ha sido discutida como una sola mezcla se reconoce que se pueden añadir secuencialmente las enzimas donde la temperatura, el pH, y otras condiciones pueden ser alteradas para incrementar la actividad de cada enzima individual. Alternativamente, se pueden determinar un pH y una temperatura óptimos para la mezcla de enzimas.

Las enzimas reaccionan con el sustrato bajo cualquier condición que sea apropiada. Por ejemplo, se pueden incubar las enzimas aproximadamente a 25oC, aproximadamente a 30oC, aproximadamente a 35oC, aproximadamente a 37oC, aproximadamente a 40oC, aproximadamente a 45oC, aproximadamente a 50OC, aproximadamente a 55oC, aproximadamente a 60oC, aproximadamente a 65oC, aproximadamente a 70OC, aproximadamente a 75oC, aproximadamente a 80oC, aproximadamente a 85oC, aproximadamente a 90oC o a temperaturas más altas . Es decir, pueden ser incubadas a una temperatura aproximadamente desde 20oC hasta aproximadamente 95 oC, por ejemplo en amortiguadores con una fuerza irónica entre baja y media y/o desde un pH bajo hasta neutro. Por "fuerza iónica media" se entiende que el amortiguador tiene una concentración iónica aproximadamente de 200 milimoles (mM) o menos para cualquier componente iónico individual. El pH puede estar en el rango desde aproximadamente pH 2.5, aproximadamente pH 3.0, aproximadamente pH 3.5, aproximadamente pH 4.0, aproximadamente pH 4.5, aproximadamente pH 5 , aproximadamente pH 5.5, aproximadamente pH 6 , aproximadamente pH 6.5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7.5, aproximadamente pH 8.0 , hasta aproximadamente pH 8.5. Generalmente, el rango de pH será aproximadamente de pH 3.0 hasta aproximadamente pH 7. Para producción de etanol se puede utilizar un medio ácido, por ejemplo pH = 4 , mientras que para la producción de biogas se puede utilizar un pH neutro, por ejemplo pH = 7. La incubación de combinaciones de enzimas bajo estas condiciones da como resultado la liberación de cantidades sustanciales del azúcar a partir de la lignocelulosa . Por cantidad sustancial se entiende al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más del azúcar disponible.

Los polipéptidos , tales como enzimas, pueden ser producidos ya sea en forma exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego aislados y añadidos, por ejemplo, materia prima lignocelulósica . Alternativamente, se producen las enzimas, pero no se aislan, y se puede añadir el caldo de fermentación crudo de la masa de células, o el material vegetal (tal como rastrojo de maíz) , y similares, por ejemplo, a la materia prima. Alternativamente, la masa cruda de células o el medio de producción de la enzima o el material vegetal pueden ser tratados para evitar el crecimiento de otros microbios (por ejemplo, por medio de calentamiento o de la adición de agentes antimicrobianos) , luego se añaden, por ejemplo, a la materia prima. Estas mezclas crudas de enzima pueden incluir al organismo productor de la enzima. Alternativamente, la enzima puede ser producida en una fermentación que utiliza una materia prima (tal como rastrojo de maíz) para proporcionar la nutrición a un organismo que produce una(s) enzima (s) . De este modo, las plantas que producen las enzimas pueden servir por sí mismas como materia prima lignocelulósica y ser añadidas dentro de la materia prima lignocelulósica.

Fermentación de azúcares Los azúcares fermentables pueden ser convertidos en productos de fermentación útiles de valor añadido, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen aminoácidos, vitaminas, compuestos farmacéuticos, suplementos para la alimentación animal, productos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, incluido el etanol combustible. En particular, se pueden utilizar los azúcares como materias primas para ser fermentados y convertidos en compuestos químicos, plásticos, tales como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles, incluidos combustibles líquidos sintéticos de etanol, metanol, butanol y biogas .

Por ejemplo, en el método de la invención, una enzima o una combinación de enzimas actúa sobre un sustrato lignocelulósico o biomasa vegetal, que sirve como la materia prima, para convertir este sustrato complejo en azúcares simples y oligosacáridos para producción de etanol u otros productos de fermentación útiles.

Los azúcares liberados a partir de la biomasa pueden ser convertidos en productos de fermentación útiles tal como aquellos que incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas, compuestos farmacéuticos, suplementos para alimentación animal, compuestos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, y etanol, incluido el etanol combustible.

Por lo tanto, la invención proporciona un método para la preparación de un producto de fermentación, el cual comprende : a. degradar lignocelulosa utilizando un método como el descrito aquí; y b. fermentación del material resultante, para, preparar así un producto de fermentación.

La fermentación puede ser llevada a cabo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas . Preferiblemente, el proceso se realiza bajo condiciones microaerofílicas o limitadas en oxígeno .

Un proceso de fermentación anaeróbico se define aquí como un proceso de fermentación que se lleva a cabo en ausencia de oxígeno o en el cual sustancialmente no se consume oxígeno, preferiblemente aproximadamente 5 o menos, aproximadamente 2.5 o menos o aproximadamente 1 mmol/L/h o menos, y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptoras de electrones.

Un proceso de fermentación limitado en oxígeno es un proceso en el cual el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno desde el gas hasta el líquido. El grado de limitación de oxígeno está determinado por la cantidad y la composición del flujo de gas entrante así como por las propiedades reales de transferencia de la mezcla/masa del equipo de fermentación utilizado. Preferiblemente, en un proceso bajo condiciones limitadas de oxígeno, la tasa de consumo de oxígeno es al menos aproximadamente de 5.5, más preferiblemente al menos aproximadamente de 6 e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente de 7 mmol/L/h.

Un método para la preparación de un producto de fermentación puede opcionalmente incluir la recuperación del producto de fermentación.

SSF La Fermentación y la Sacarificación pueden también ser realizados en forma de una Sacarificación y Fermentación (SSF) Simultáneos. Una de las ventajas de esta técnica es la reducción de la inhibición del azúcar sobre la hidrólisis enzimática (la inhibición del azúcar sobre las celulasas es descrita por Caminal B&B, Vol XXVII, páginas 1282 - 1290) . Productos de fermentación Los productos de fermentación que pueden ser producidos de acuerdo con la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, compuestos farmacéuticos, suplementos para alimentación animal, compuestos químicos especiales, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos/ ácido láctico, y etanol, incluido el etanol combustible (el término "etanol" debe entenderse que incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua) . Los productos específicos de valor agregado que pueden ser producidos por medio de los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, biocombustibles (incluidos etanol y butanol y un biogas) ; ácido láctico; un plástico; un compuesto químico especial; un ácido orgánico, incluidos ácido cítrico, ácido succínico, ácido fuitiárico, ácido itacónico y ácido maleico; ácido 3-hidoxi-propiónico, ácido acrílico; ácido acético; 1.3 -propano-diol ; etileno, glicerol; un disolvente; un suplemento para alimentación animal; un compuesto farmacéutico, tal como un antibiótico de ß-lactama o una cefalosporina; vitaminas; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina, y ácido aspártico; una enzima industrial, tal CQmo una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; y una materia prima química.

Biogas La invención también prevé que el uso de un polipéptido o una composición como se describe aquí en un método para la preparación de biogas. Biogas típicamente se refiere a un gas producido por la descomposición biológica de materia orgánica, por ejemplo material que contiene carbohidratos diferentes al almidón, en ausencia de oxígeno. El biogás que se origina a partir de material biogénico es un tipo de biocombustible . Un tipo de biogas es producido por medio de digestión anaeróbica o fermentación de materiales biodegradables tales como biomasa, estiércol, ensilaje o aguas residuales, residuos municipales, y cultivos energéticos. Éste tipo de biogas está compuesto principalmente de metano y dióxido de carbono. El gas metano, puede ser quemado u oxidado con oxígeno. El aire contiene un 21% de oxígeno. Esta liberación de energía permite que el biogas sea utilizado como combustible. El biogas puede ser utilizado como un combustible de bajo costo en cualquier país para cualquier propósito que requiera de calentamiento, tal como cocinar. También puede ser utilizado en instalaciones modernas para la gestión de residuos donde puede ser utilizado para operar cualquier tipo de motor térmico, para generar ya sea energía eléctrica o mecánica.

La primera etapa en la producción de biog s a partir de microorganismos consiste en la degradación enzimática de polímeros y sustratos complejos (por ejemplo carbohidratos diferentes al almidón) . Por lo tanto, la invención proporciona un método para la preparación de un biogas en el cual un sustrato que contienen un carbohidrato diferente almidón es puesto en contacto con un polipéptido o una composición de la invención, para producir así un material fermentable que puede ser convertido en un biogas por medio de un organismo tal como un microorganismo. En tal método, se puede proveer un polipéptido de la invención por medio de un organismo, por ejemplo un microorganismo que expresa tal polipéptido .

Uso de enzimas y de productos alimenticios Los polipéptidos y las composiciones de la invención pueden ser utilizados en un método para el procesamiento de material vegetal para degradar o modificar la celulosa o hemicelulosa o sustancia péctica que constituyen las paredes celulares de la planta o del material fúngico. Tales métodos pueden ser útiles en la preparación de productos alimenticios. Por lo tanto, la invención proporciona un método para la preparación de un producto alimenticio el cual comprende la incorporación de un polipéptido o de una composición de la invención durante la preparación del producto alimenticio.

La invención también provee un método para el procesamiento de material vegetal del cual comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido o una composición de la invención para degradar o modificar la celulosa en el material (planta) . Preferiblemente el material vegetal es una pulpa vegeta.1 o un extracto de una planta, tal como jugos. La presente invención también provee un método para reducir la viscosidad, aclarar y/o facilitar la filtración de un extracto vegetal el cual comprende poner en contacto el extracto vegetal con un polipéptido o una composición de la invención en una cantidad efectiva para degradar celulosa o hemicelulosa o sustancias pécticas contenidas en el extracto vegetal .

La planta y los materiales que contienen celulosa/hemicelulosa/sustancia péctica incluyen pulpa vegetal, partes de plantas y extractos de plantas. En el contexto de esta invención un extracto de un material vegetal es cualquier sustancia que puede derivarse del material vegetal por medio de extracción (mecánica y/o química) , procesamiento o por medio de cualquier otra técnica de separación. El extracto pueden ser jugo, néctar, base, o concentrados elaborados a partir de los mismos . El material vegetal puede contener o derivarse de vegetales, por ejemplo, zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soja, frijol, guisantes) o frutos, por ejemplo, fruta de pepitas o fruta de semilla (manzanas, peras, membrillo etc.), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina) , melones, ciruelas pasas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas, frambuesas, fresas, arándanos, piña y otras frutas tropicales, árboles y partes de los mismos (por ejemplo polen, de los pinos), o cereal (avena, cebada, trigo, maíz, arroz) . El material (que va a ser hidrolizado) puede ser también residuos agrícolas, tal como pulpa de remolacha azucarera, mazorcas de maíz, paja del trigo, cáscaras de nuez (molidas) , o materiales reciclables, por ejemplo papel (desechado) .

Los polipéptidos de la invención pueden ser utilizados también para tratar material vegetal incluida pulpa vegetal y extractos de plantas. También pueden ser utilizados para tratar productos alimenticios líquidos o sólidos o ingredientes alimenticios comestibles, o ser utilizados en la extracción de café, aceites vegetales, almidón o como estresantes en alimentos.

Típicamente, los polipéptidos de la invención se utilizan como una composición/preparación enzimática como se describió anteriormente. Generalmente se añadirá la composición a la pulpa vegetal que pueden ser obtenida, por ejemplo, por medio de procesamiento mecánico tal como aplastamiento o molienda del material vegetal. La incubación de la composición con la planta se llevará a cabo típicamente durante un tiempo de 10 minutos hasta 5 horas, tal como 30 minutos hasta 2 horas, preferiblemente aproximadamente durante 1 hora. La temperatura de procesamiento es preferiblemente aproximadamente de lOoC hasta aproximadamente 55oC, por ejemplo aproximadamente de 150C hasta aproximadamente 25oG, en forma óptima aproximadamente 20oC y se pueden utilizar aproximadamente desde 10 g hasta aproximadamente 300 g, preferiblemente aproximadamente desde 30 g hasta aproximadamente 70 g, en forma óptima aproximadamente 50 g de enzima por tonelada del material que va a ser tratado.

Toda(s) la(s) enzima (s) o sus composiciones utilizadas pueden ser añadidas en forma secuencial o al mismo tiempo a la pulpa vegetal. Dependiendo de la composición de la preparación de la enzima el material vegetal puede ser primero macerado (por ejemplo hasta un puré) o licuado. Utilizando los polipéptidos de la invención se pueden mejorar los parámetros de procesamiento tales como el rendimiento de la extracción, la viscosidad del extracto y/o la calidad del extracto.

Alternativamente, o además de lo anterior, se puede añadir un polipéptido de la invención al jugo crudo obtenido después del procesamiento o licuefacción de la pulpa vegetal. El tratamiento del jugo crudo se llevará a cabo en una forma similar a la de la pulpa vegetal con respecto a la dosis, la temperatura y el tiempo de permanencia. Nuevamente, se pueden incluir otras enzimas tal como aquellas discutidas previamente. Típicamente, las condiciones de incubación son como las descritas en el párrafo anterior.

Una vez se ha incubado el jugo crudo con los polipéptidos de la invención, se centrifuga luego el jugo o se lo filtra (o somete a ultrafiltración) para producir el producto final. Después del tratamiento con el polipéptido de la invención del producto (final) puede ser tratado con calor, por ejemplo aproximadamente a lOOoC durante un período de tiempo de aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 1 hora, bajo unas condiciones para inactivar parcial o completamente el (los) polipéptido (s) de la invención.

Una composición que contiene un polipéptido de la invención puede ser utilizada también durante la preparación de purés de fruta o de vegetales .

El polipéptido de la invención puede ser utilizado también en elaboración de cervezas, elaboración de vino, destilación o cocción. Puede por lo tanto ser utilizado en la preparación de bebidas alcohólicas tales como vino y cerveza. Por ejemplo puede mejorar el proceso de filtración o de clarificación, por ejemplo de cervezas, mosto (por ejemplo que contiene se basa y/o malta de sorgo) o vino.

Además, se puede utilizar un polipéptido o una composición de la invención para el tratamiento del orujo, es decir de los residuos de la producción de mosto de cerveza que contienen cebada p cebada malteada u otros cereales, para mejorar la utilización de los residuos, por ejemplo, para alimentación animal .

El polipéptido puede ayudar a la remoción de sustancias orgánicas disueltas del caldo o medio de cultivo, por ejemplo donde el residuo de la destilación de origen orgánico és bioconvertido en biomasa microbiana. El polipéptido de la invención puede mejorar el proceso de filtración y/o reducir la viscosidad en jarabes de glucosa, tal como los de cereales producidos por licuefacción (por ejemplo con -amilasa) .

En la cocción el polipéptido puede mejorar la estructura de la masa, modificar su pegajosidad o flexibilidad, mejorar el volumen del pan y/o la estructura de la miga o impartir mejores características de textura tales como calidad del rompimiento, trituración o de la miga.

La presente invención se relaciona en consecuencia con métodos para preparar una masa o un producto alimenticio a base de cereales que comprende la incorporación dentro de la masa de un polipéptido o una composición de la presente invención. Esto puede mejorar una o más de las propiedades de la masa o del producto alimenticio a base de cereales obtenido a partir de la masa con respecto a una masa o a un producto alimenticio a base de cereales en los cuales no se incorpora el polipéptido.

La preparación del producto alimenticio a base de cereales de acuerdo con la invención puede incluir además etapas conocidas en el arte tales como someter a hervido, secado, fritura, cocción al vapor o cocimiento a la masa obtenida. Los productos que se elaboran a partir de una masa que se hierve son por ejemplo fideos hervidos, bolas de masa hervidas, productos que se elaboran a partir de masa frita son por ejemplo rosquillas, buñuelos, fideos fritos, productos que se elaboran para masa hervida son por ejemplo bollos al vapor y fideos conocido al vapor, ejemplos de productos elaborados a partir de masa seca son pasta y fideos secos y ejemplos de productos elaborados a partir de masa horneada son pan, galletas, tarta.

El término "propiedad mejorada" se define aquí como cualquier propiedad de una masa y/o de un producto obtenido a partir de la masa, particularmente un producto alimenticio a base de cereales, que se mejora por medio de la acción del polipéptido de acuerdo con la invención con relación a una masa o producto o en el cual el polipéptido de acuerdo con la invención no está incorporado. La propiedad mejorada puede incluir, pero no se limita a, mayor resistencia de la masa, mayor elasticidad de la masa, mayor estabilidad de la masa, mejor procesamiento de la masa a través de una máquina, mejor prueba de resistencia la masa, menor pegajosidad de la masa, mejor posibilidad de extender la masa, mayor volumen del producto alimenticio a base de cereales, menor formación de burbujas del producto alimenticio a base de cereales, mejor estructura de la miga del producto horneado, un producto alimenticio a base de cereales más blando, mejor sabor del producto alimenticio a base de cereales, mejor antiendurecimiento del producto alimenticio a base de cereales. Mejores propiedades relacionadas con el tipo de pasta y de fideos son por ejemplo mayor firmeza, pegajosidad reducida, mejor cohesión y menor pérdida de cocción.

La propiedad mejorada puede ser determinada por medio de la comparación de una masa y/o un producto alimenticio a base de cereales preparados con y sin la adición de un polipéptido de la presente invención. Las . cualidades organolépticas pueden ser evaluadas utilizando procedimientos bien establecidos en la industria de la panificación, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un panel de degustadores de sabor entrenados .

El término "masa" se define aquí como una mezcla de harina de cereal y otros ingredientes lo suficientemente firmes para ser amasados o enrrollados. Ejemplos de cereales son trigo, centeno, maíz, cebada, arroz, sémolas, trigo sarraceno y avena . Por trigo se pretende abarcar aquí y en adelante todas las especies conocidas del género Triticum, por ejemplo aestivum, durum y/o spelta. Los ejemplos de otros ingredientes adecuados son: el polipéptido de acuerdo con la invención, enzimas adicionales, aditivos químicos y/o auxiliar de procesamiento. La masa puede ser fresca, congelada, preparada, o previamente horneada. La preparación de una masa a partir de los ingredientes descritos anteriormente es bien conocida en el arte y comprende la mezcla de dichos ingredientes y auxiliares de procesamiento y una o más etapas de amoldamiento y opcionalmente de fermentación. La preparación de la masa congelada es descrita por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters .

El término "producto alimenticio a base de cereales" se define aquí como cualquier producto preparado a partir de una masa, ya sea de carácter blando o crujiente. Los ejemplos de productos alimenticios a base de cereales, ya sea de tipo white, ligero u oscuro, que pueden ser convenientemente producidos por medio de la presente invención son pan (en particular blanco, integral o pan de centeno) , típicamente en la forma de hogazas o rollos, pan francés tipo baguette, pasta, fideos, rosquillas, panecillos, pasteles, pan de pita, tortillas, tacos, tortas, panqueques, bizcochos, galletass, pasta de tartas, pan al vapor, y pan crujiente, y similares.

El término "producto horneado" se define aquí como cualquier producto alimenticio a base de cereales preparado horneando la masa.

Los polisacáridos diferentes al almidón (NSP) pueden incrementar la viscosidad del contenido que está siendo digerido lo que puede, a su vez, disminuir la disponibilidad de los nutrientes y el rendimiento de los animales. El uso del polipéptido de la presente invención puede mejorar la utilización del fósforo así como de minerales catiónicos y del polipéptido durante la digestión del animal.

La adición de nutrientes específicos al pienso mejora la digestión animal y por lo tanto reduce los costos de alimentación. Una cantidad de aditivos para el pienso están siendo actualmente utilizados y se están desarrollando continuamente nuevos conceptos. El uso de enzimas específicas tal como las enzimas que degradan los carbohidratos diferentes al almidón podrían romper la fibra liberando energía así como incrementar la digestibilidad del polipéptido debido a una mejor accesibilidad del polipéptido cuando se rompe la fibra. De este modo podrían reducirse los costos del alimento así como también podrían reducirse los niveles de polipéptido en el pienso.

Los polisacáridos diferentes almidón (los NSP) están también presentes virtualmente en todos los ingredientes alimenticios de origen vegetal. Los NSP son escasamente utilizados y pueden, cuando se solubilizan, ejercer efectos adversos sobre la digestión. Las enzimas exógenas pueden contribuir a una mejor utilización de estos NSP y en consecuencia reducir cualquiera de los efectos antinutricionales . Las enzimas que degradan los carbohidratos diferentes al almidón de la presente invención pueden ser utilizadas para este propósito en las dietas a base de cereales para aves de corral y, en menor medida, para cerdos y otras especies.

Una enzima/polipéptido que degrada carbohidratos diferentes al almidón de la invención (de una composición que contiene al polipéptido/enzima de la invención) puede ser utilizado en la industria de los detergentes, por ejemplo para la remoción de la ropa de manchas con base en carbohidratos. Una composición detergente puede contener un polipéptido/enzima de la invención y, además, una o más entre una celulasa, una hemicelulasa, una pectinasa, una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa o una carbohidrasa .

Uso de enzimas en composiciones detergentes Una composición detergente que contiene un polipéptido o una composición de la invención pueden estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo una pasta, un gel, un polvo o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo típicamente aproximadamente hasta 70% de agua y aproximadamente desde 0 hasta aproximadamente 30% de disolvente orgánico o material no acuoso.

Tal composición detergente puede, por ejemplo, ser formulada como una composición detergente para lavado manual o en lavadora incluyendo una composición adictiva para lavado adecuada para pretratamiento de tej idos manchados y una composición suavizante para los tejidos que se añade en el enjuague, o ser formulada como una composición detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras en general en el hogar, o ser formuladas para operaciones de lavado manual o automatizado de vajillas.

En general, las propiedades de la enzima deben ser compatibles con el detergente seleccionado (por ejemplo, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y/o no enzimáticos, etc.) y la(s) enzima (s) debe(n) estar presente (s) en una cantidad efectiva.

Una composición detergente puede incluir un surfactante, por ejemplo un surfactante aniónico o no iónico, un mej orador el detergente o una gente complejante, uno o más polímeros, un sistema blanqueador (por ejemplo una fuente de H202) o un estabilizador de la enzima. Una composición detergente puede contener también cualquier otro ingrediente detergente convencional tal como, por ejemplo, un acondicionador incluida una arcilla, un reforzador de espuma, un supresor de espuma, un agente contra la corrosión, un agente para suspensión de la sociedad, un agente que evita que se deposite la sociedad, un colorante, un bactericida, un abrillantador óptico, a hidrótropos, un inhibidor de manchas o un perfume .

Uso de enzimas en el procesamiento de pulpa y de papel Un polipéptido o una composición de la presente invención pueden ser utilizados en la industria de la pulpa y del papel, entre otros en el proceso de blanqueamiento para mejorar el brillo de las pulpas blanqueadas con lo cual se puede reducir la cantidad de cloro utilizada en las etapas de blanqueo, y para incrementar la liberación de las pulpas en el proceso de reciclado del papel (Eriksson, K. E. L. , Wood Science and Technology 24 (1990): 79 - 101; Paice, et al., Biotechnol . y Bioeng. 32 (1988): 235 - 239 y Pottimier et al., Tappi Journal (1989) : 187 - 191) . Además, se pueden utilizar un polipéptido o una composición de la invención para el tratamiento de pulpa lignocelulósica para mejorar la capacidad de blanqueo de la misma. De este modo se puede reducir la cantidad de cloro necesaria para obtener un blanqueo satisfactorio de la pulpa.

Se pueden utilizar un polipéptido o una composición de la invención en un método para reducir la velocidad a la cual los textiles que contienen celulosa se tornan ásperos o para reducir la aspereza de los textiles que contienen celulosa, comprendiendo el método tratar los textiles que contienen celulosa con un polipéptido o una composición como se describió anteriormente. La presente invención se relaciona además con un método que permita la aclaración del color de los textiles coloreados que contienen celulosa, comprendiendo el método el tratamiento de los textiles coloreados que contienen celulosa con un polipéptido o una composición como se describió anteriormente, y un método para proporcionar una variación localizada en el color de los textiles coloreados que contienen celulosa, comprendiendo el método el tratamiento de los textiles coloreados que contienen celulosa con un polipéptido o una composición como se describió anteriormente. Los métodos de la invención pueden ser llevados a cabo por medio del tratamiento de los textiles que contienen celulosa durante el lavado. Sin embargo, si se desea, se puede realizar también el tratamiento de los textiles durante el remojo o el enjuague o simplemente por medio de la adición del polipéptido o de una composición como se describió anteriormente al agua en la cual están o se sumergirán los textiles.

Otros usos de la enzima Además, se pueden utilizar también un polipéptido o una composición de la presente invención en una formulación antibacteriana así como en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, cremas dentales, y enjuague bucal .

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención: EJEMPLOS Materiales y Métodos en General Cepas Las cepas de Talaromyces emersonii de la presente invención se derivan de ATCC16479, que eran anteriormente Penicillium geosmithia emersonii. Otras denominaciones de T. emersonii ATCC16479 son CBS393.64, IFQ31232 y IMI116815.

Procedimientos de ADN Se llevaron a cabo procedimientos estándar de ADN como se describe en otra parte (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) a menos que se especifique otra cosa. Se amplificó el ADN utilizando la enzima de corrección de pruebas Phusion polymerase (Finnzymes) . Las enzimas de restricción eran de Invitrogen o de New England Biolabs .

Medios y soluciones: Agar de dextrosa de papa, PDA, (Fluka, Cat . No. 70139) Extracto de papa 4 g/1 Dextrosa 20 g/1 Bacto Agar 15 g/1 pH 5.4 Agua Completar hasta un litro Esterilizar 20 min a 120°C Medio de agar para Talaromyces Fracción salina no.3 15 g Celulosa (3%) 30 g Peptona Bacto 7.5 g Harina de granos 15 g KH2P04 5 g CaC12.2H20 1 g Bacto Agar 20 g PH 6.0 Agua Completar hasta un litro Esterilización min at 120°C Composición de la fracción salina La fracción salina se hizo de acuerdo a lo divulgado en W098/37179, Tabla 1. Las desviaciones de la composoción de esta tabla fueron 1.0 g/1 de CaC12.2H20, 1.8 g/L KCl, 0.45 g/L de ácido cítrico con 1 agua de hidratación (agente de quelación) .

Medios para el matraz de agitación Medio 1 para Talaromyces Glucosa 20 g/L Extracto de lavadura (Difco) 20 g/L Clerol FBA3107 (AF) 4 gotas/L pH 6.0 Esterilización 20 min a 120°C Medio 2 para Talaromyces Fracción salina 15 g Celulosa 30 g Peptona Bacto 7.5 g Harina de granos 15 g KH2P04 10 g CaC12.2H20 0.5 g Clerol FBA3107 (AF) 0.4 mi pH 5 Agua Completar hasta un Esterilización 20 min a 120°C Medio 3 para Talaromyc Fracción salina 15 Glucosa 50 Peptona Bacto g KH2P04 10 CaC12.2H20 0.5 Clerol FBA3107 (AF) PH Agua Completar hasta un litro Esterilización min a 120°C Preparación del lote de esporas Se cultivaron las cepas a partir de existencias sobre medio agar para Talaromyces en cajas de Petri de 10 cm de diámetro durante 5 - 7 días a 40C3C. Se almacenaron las existencias de la cepa a -80DC en glicerol al 10%.

Protocolo de cultivo en matraces de agitación Se inocularon directamente las esporas en matraces de agitación de 500 mi que contenían 100 mi ya sea del medio 1 o del medio 2 para Talaromyces y se incubó a 45°C a 250 rpm en una agitador incubadora durante 3 - 4 días .

Preparación de la muestra Para los cultivos en matraz de agitación, se transfirieron 3 mi de caldo de cultivo a un tubo desechable de 12 mi y se centrifugó durante 10 min a 5.200 g. Se recolectó al menos 1 mi de sobrenadante .

Análisis de proteína Las muestras de proteína fueron separadas bajo condiciones reductoras sobre gel Bis-Tris al 4 - 12% de NuPAGE (Invitrogen, Breda, Los Países Bajos) y coloreadas como se indicó. Los geles fueron coloreados ya sea con InstantBlue (Expedeon, Cambridge, Reino Unido) , SafeStain SimplyBlue (Invitrogen, Breda, Los Países Bajos) o Sypro Ruby (Invitrogen, Breda, Los Países Bajos)) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para las transferencias tipo Western, se transfirieron las proteínas a un filtro de nitrocelulosa . Se bloqueó el filtro de nitrocelulosa con TBST (solución salina amortiguada con Tris que contenían 0.1% de Tween 40) que contenían 3% de leche desnatar y se incubó durante 16 horas con anticuerpo anti-FLAG M2 (Sigma, Zwijndrecht, Los Países Bajos) . Se lavaron dos veces las transferencias con TBST durante 10 minutos y se las coloreó con anticuerpo antirratón de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (DAKO, Glostrup, Dinamarca) durante 1 hora. Después de lavar las transferencias cinco veces con TBST durante 10 minutos, se visualizaron las proteínas utilizando SuperSignal (Pierce, Rockford, E.U.A) .

Ensayos de Celulasa 1. Ensayo con paja de trigo (ensayo WSU) .

Preparación del sustrato de paja de trigo lavado y pretratado Se homogenizó el sustrato de paja del trigo lavado utilizando un ultra- turrax, se lo lavó, liofilizó y molió antes del análisis.

Medición de la actividad de la celulasa en WSU/ml La actividad de la celulasa fue medida aquí en términos de "Unidades de Paja de Trigo" (WSU) por mililitro en un ensayo con Paja de Trigo (ensayo WSU) . El sustrato lavado de paja de trigo fue sometido a homogenización en un ultra- turrax, se lo lavó, liofilizó y molió antes del análisis. 400 µ? de los sobrenadantes recolectados de los experimentos en el matraz de agitación fueron diluidos 16 veces. Se transfirieron muestras por duplicado de 200 µ? a dos viales adecuados: un vial contenía 700 \i de materia seca al 3% (p/p) del sustrato de paja del trigo lavado y pretratado, y 100 µ? de amortiguador de citrato 250 mM, amortiguado a pH 4.5. El otro vial consistía de un blanco, en donde los 700 µ? del sustrato de paja del trigo lavado y pretratado de materia seca al 3% (p/p) fueron reemplazados por 700 µ? de agua, con 100 µ? de amortiguador de citrato 250 mM, amortiguado a pH 4.5. Se incubaron las muestras del ensayo durante 20 y/o 60 horas a 65 °C. Después de la incubación de las muestras del ensayo, se añadió un volumen fijo de D20 que contenían un estándar interno de ácido maleico. La cantidad de azúcar liberada, se basa en la señal entre 5.25 - 5.20 ppm, con relación al pimetil-sila-pentano-sulfonato determinado por medio de RMN 1H ID operando con una frecuencia de protón de 500 Hz, utilizando un programa de pulsos con supresión de agua, a una temperatura de 27oC. La solución de la enzima celulasa puede contener azúcares residuales. Por lo tanto, los resultados del ensayo se corrigen para el contenido de azúcar de la solución de la enzima. 2. Actividad de las endoglucanasas (WBCU) La endoglucanasa cataliza la hidrólisis de la carboximetil celulosa. La cantidad de azúcares reductores formados durante la redacción de la enzima se determinó con el reactivo ácido dinitrosalisílico . Las muestras fueron incubadas en presencia de 18 g/L de solución de carboximetil celulosa (Novacel, ref . 394) en amortiguador de acetato pH 4.60 a 37°C. Se detuvo la incubación después de 60 minutos por medio de la acción de una solución de hidróxido de sodio. Se sometieron a ebullición las muestras durante 5 minutos en presencia del reactivo ácido dinitrosalisílico (Acros 15644500) . Después de diluir con agua, se midió la intensidad del color a 540 nm. La metodología fue utilizada como un método relativo. Los resultados fueron relacionados con una composición de celulasa con una actividad oficialmente asignada. La actividad fue expresada en unidades WBCU. Una unidad WBCU se define como la cantidad de celulasa te hidroliza en una hora un número de enlaces glicosídicos equivalente a la producción de 0.5 mg de glucosa bajo las condiciones del ensayo. La actividad fue calculada utilizando protocolos estándar de cálculo conocidos en el arte, graficando una OD540 delta versus la actividad de las muestras con actividad conocida, seguido por el cálculo de la actividad de las muestras desconocidas utilizando la ecuación generada a partir de la línea de calibración.

EJEMPLO 1 TRANSFORMACIÓN DE TALAROMYCES EMERSONII CON PLÁSMIDOS QUE CONTIENEN MARCADORES DE RESISTENCIA A LA FLEOMICINA Este ejemplo describe un método para transformar T. emersonii con el plásmido pAN8-l que transporta un marcador de resistencia a la fleomicina (Mattern, I. E., Punt, P. J. , Van den Hondel, C. A. M. J. J., 1988. A vector of Aspergillus transíormation conferring phleomycin resistance. Fungal Genet . Newsl . 35, 25) .

Transformación de T. emersonii con pA 8-l Las esporas fueron cultivadas durante 16 horas a 45 °C en un agitador rotatorio a 250 rpm en medio YGG (por litro: 8 g de KC1, 16 g de glucosa. H20, 20 mi de extracto de levadura al 10%, 10 mi de Pen-Strep lOOx, 6.66 g de aminoácidos + YNB, 1.5 g de ácido cítrico, y 6 g de K2HP04) . Se recolectó el micelio utilizando un filtro Miracloth (Calbiochem, Nottingham, Reino Unido) . Para la formación del protoplasto, por 2 g de micelio se añadieron 10 mi de amortiguador STC (por litro: 218 g de Sorbitol (1.2 M) , 7.35 g de CaC12.2H20, Tris/HCl 10 mM pH 7.5) y 1 mi de solución de glucanex (250 mg/ml de Glucanex 200G (Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) en H20) . Se incubó la mezcla en un agitador rotatorio a 100 rpm a 34 °C durante 90 - 150 minutos. Se separaron los protoplastos del micelio utilizando un filtro Miracloth y se añadió STC hasta un volumen final de 45 mi. La suspensión de protoplasto fue centrifugada durante 5 minutos a 1560 g a 4°C y resuspendida en amortiguador STC a una concentración de 108 protoplastos/ml . Para la transformación, se añadieron 200 DI de suspensión de protoplasto a 10 Dg de ADN pAN8-l en amortiguador TE (Tris-HCI 10 mM pH 7.5, EDTA 0.1 mM) y 18 DI de ácido Aurintricarboxílico 0.4 M. Posteriormente, se añadieron 100 DI de una solución PEG (PEG 4000 al 20% (Merck, Nottingham, Reino Unido) en STC) , y después de la incubación de la suspensión de ADN - protoplasto durante 10 minutos a temperatura ambiente, se añadieron lentamente 1.5 mi de solución PEG (PEG 4000 al 60% (Merck) en STC) , mezclando repetidamente los tubos. Después de incubación durante 15 minutos a 25°C, se diluyeron las suspensiones con 2 mi de STC y se mezcló por medio de inversión de los tubos. Se añadieron aproximadamente 200 a 600 ül de suspensión de protoplasto a 5 mi de agar blando (medio de regeneración que contenía 6 g/L de agar, sin selección) y se sembraron directamente en placa sobre cajas de Petri de 10 cm con 20 mi de medio de regeneración que contenía 10 Dg/ml de fleomicina. El medio de regeneración contiene por litro: 6 g de NaN03 , 0.52 g de KCI, 1.52 g de KH2P04, 1.12 mi de KOH 4 M, 0.52 g de MgS04.7H20, 22 mg de ZnS04.7H20, 11 mg de H3BQ3, 5 mg de FeS04.7H20, 1.7 mg de CoCI2.6H20, 1.6 mg de CuSO4.5H20. 5 mg de MnC12.4H20, 1.5 mg de Na2Mo04.2H20, 50 mg de EDTA, 10 mi de Pen-Strep lOOx (Gibco) , 2.5 g de glucosa, 2.5 g de extracto de levadura, 341 g de sacarosa, y 20 g de agar (en 6 g/L de capas superpuestas) .

Después de incubación durante 4 - 6 días a 40°C, se transfirieron conidiosporas de transformantes a placas que consistían de PDA suplementado con 10 Dg/ml de fleomicina y se incubó durante 2 días a 40°C.

Análisis por PCR de transformantes sobre micelio de hongos Se incubaron las transformantes sobre placas que contenían Agar de Dextrosa de Papa durante dos días a 40 °C. Se incubó aproximadamente un tercio de una colonia durante 1 hora a 37°C en 25 DI de amortiguador KC (60 g/1 de KCI, 2 g/1 de ácido cítrico, pH 6.2), suplementado con 5 mg/ml de Glucanex 200G (Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca) . Posteriormente, se añadieron 75 DI de amortiguador de dilución del ADN (Tris-HCl 10 m , EDTA 1 m , NaCl 10 mM, pH 7.5). Se incubaron las muestras durante 5 minutos a 98 °C y, posteriormente, se diluyeron por medio de la adición de 100 DI de H20. Se utilizó una alícuota de 5 DI .de la mezcla como molde para la PCR.

Los iniciadores fueron sintetizados por Invitrogen (Breda, Los Países Bajos) . Se utilizaron los siguientes iniciadores PCR para amplificar un fragmento de 278 nucleótidos del gen para la ß-lactamasa de pAN8-l: Amp hacia adelante (SEQ ID NO : 1) : TATGCAGTGCTGCCATAACCAT; y Amp inverso (SEQ ID NO: 2) : GCAGAAGTGGTCCTGCAACTTT Condiciones de la PCR para las reacciones: 50 µ? de mezcla de reacción con 5 DI de ADN molde, 20 pmol de cada iniciador, 0.2 mM de los dNTP, amortiguador Phusion HF lx y 1 U de Phusion ADN-Polimerasa, de acuerdo con el Manual de la ADN Polimerasa de Phusion High-Fidelity (Finnzymes, Espoo, Finlandia) , desnaturalización durante 30 s a 98 °C, amplificación en 30 ciclos (10 s a 98°C, 10 s a 60°C, 15 s a 72 °C) , y una incubación final de 10 min a 72 °C.

Los resultados de gel de agarosa gel se presentan en la Figura 1. Se observó una banda de PCR específica de 278 nucleótidos en los transformantes, pero no en la cepa vacía, indicando que las transformantes contenían al gen de la ampicilina del vector pAN8-l. Por lo tanto, T. emersonii es transformado exitosamente con el vector pAN8-l.

Con el propósito de determinar si pA 8-l se integra dentro del genoma se realizó una transferencia tipo Southern. Se aisló ADN cromosómico de transformantes utilizando el kit para bacterias y levadura Puregene (Gentra Systems Inc., Minneapolis, EUA) . Se cultivaron las transformantes durante 16 horas en 10 mi de medio YGG a 45°C y se utilizó el micelio para aislar ADN cromosómico. Se llevó a cabo el lisado del micelio (-50 mg de peso fresco) por medio de la adición de 250 DI de Amortiguador para Suspensión de Células (Puregene kit, Gentra Systems, Minneapolis, EUA) y 50 µ? de Glucanex 200G (Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca, 100 mg/ml en amortiguador de citrato - KC1 pH 6.2). Se incubó el micelio resuspendido a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, se llevó a cabo una etapa de centrifugación (1 minuto a 15.700 g) y se resuspendió el precipitado formado en 600 µ? de Solución de Lisado Celular y se añadieron 3 µ? de solución de Proteinasa K (20 mg/ml, Invitrogen, Breda, Los Países Bajos) seguido por una incubación a 55 °C durante 1 hora. Las etapas posteriores que incluyan Tratamiento con ARNasa, Precipitación de la Proteína, Precipitación del ADN e Hidratación del ADN fueron llevadas a cabo de acuerdo con el protocolo del proveedor para bacterias Gram positivas.

Se digirió el ADN cromosómico con MluI y se lo sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0.7% (p/v) . Se transfirió el ADN a Hybond N+ (GE Healthcare, Eindhoven, Los Países Bajos) por medio de transferencias al vacío. Las transferencias fueron posteriormente previamente hibridadas aproximadamente durante 1 hora a 42 °C en amortiguador de hibridación ECL Gold (GE Healthcare, Eindhoven, Los Países Bajos) y se híbrido durante la noche a 42°C con una sonda marcada que representa al gen de resistencia a la ampicilina presente sobre pAN8-l. La sonda fue obtenida por medio de PCR utilizando el iniciador Amplificador hacia adelante (SEQ ID NO: 1) y Amplificador inverso (SEQ ID NO: 2) y pAN8-l como molde. Condiciones para la redacción PCR: 30 s de desnaturalización a 98°C, amplificación en 30 ciclos (10 s a 98°C, 10 s a 60°C, 20 s a 72°C) , y una incubación final de 5 min a 72 °C. La sonda fue marcada de acuerdo con el método ECL (GE Healthcare, Eindhoven, Los Países Bajos) . Después de la hibridación, se lavaron las transferencias y trataron con reactivo de detección de acuerdo con el método ECL (GE Healthcare, Eindhoven, Los Países Bajos) . Se detectó la señal utilizando el aparato ChemiDoc XRS de Biorad de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

El resultado de la transferencia tipo Southern se presenta en la Figura 2. En los carriles 2 y 3, se cargaron dos concentraciones del plásmido pAN8-l sobre el gel, que fueron detectadas como bandas de 6.1 kbp sobre la transferencia tipo Southern. La banda de 6.1 kbp no fue observada en pAN8-l de las transformantes de T. emersonii (carriles 4 y 5) , pero, en vez de eso, la sonda ß-lactamasa híbrido con fragmentos de ADN cromosómico de diferentes longitudes, indicando que el plásmido se integró dentro del genoma.

La estabilidad del fenotipo transformado fue comprobada por medio de la purificación de las transformantes de pAN8-l sobre placas que contenían Agar de Dextrosa de Papa sin selección de fleomicina. Se purificaron posteriormente las colonias individuales sobre placas que contenían Agar de Dextrosa de Papa con selección de fleomicina. Fue la de los 20 transformantes analizados, todos parecieron ser resistentes a la fleomicina. De este modo, el vector pA 8-l se integra en forma estable dentro del genoma de T. emersonii .

Este experimento demostró claramente que T. emersonii puede ser transformado con un plásmido, que se integra en forma estable dentro del genoma de T. emersonii.

EJEMPLO 2 TRANSFORMACIÓN DE TALAROMYCES EMERSONII CON PLÁSMIDOS QUE CODIFICAN CELULASAS DE TALAROMYCES EMERSONII Este ejemplo describe la clonación y la expresión de proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG en T. emersonii .

Clonación del plásmido pGBFlNEBA7 de expresión de T emersonii que codifica la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG El gen que codifica la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii y una etiqueta FLAG del terminal C fue sintetizado por medio de DNA2.0 (Menlo Park, EUA) y clonado como un fragmento Pacl/Asql dentro de pGBFIN-5, cuyo plásmido está descrito en O 9932617. El vector de expresión pGBFINS contiene al promotor de la glucoamilasa, al sitio de clonación, la región terminadora, un marcador amdS operativamente enlazado con el promotor gpd, y los flancos 3' y 3'' de glaA. Las secuencias del nucleótido y del aminoácido de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii etiquetada con FLAG están representadas por la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. La Figura 3 representa un mapa de pGBFINEBA7 que contiene la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii bajo el control del promotor de glucoamilasa dentro del vector pGBFIN-5.

Transformación de T. emersonii con pGBFINEBA7 La transformación de T. emersonii se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 1, con la excepción de que T. emersonii fue co- transformado con 2 Dg de pAN8-l y 10 ?g del ADN de pGBFINEBA7. Se identificaron los co-transformantes por medio de un análisis de PCR. Se determinó la presencia del plásmido pA 8-l por medio del uso del iniciador Amp hacia adelante (SEQ ID NO: 1) y Amp inverso (SEQ ID NO: 2) . Los siguientes iniciadores fueron utilizados para aplicar la secuencia que codifica la CEB ß-glucanasa de T. emersonii: EBA7 hacia adelante (SEQ ID NO: 5) : CAGCTTAATTAACACCGTCAAAATGGACCGTATAC ; y EBA7 inverso (SEQ ID NO: 6) : GGCGCGCCTTTACTTGTCATCATCATCCTTGTAGTCTGACTGGAAGGTGCTGCCAATG. Se utilizaron condiciones PCR como se describe en el Ejemplo 1.

Fermentaciones en matraces de agitación de T. emersonii Las transformantes fueron cultivados en matraces de agitación utilizando medio 1 para Talaromyces y medio 2 para Talaromyces, y se tomaron muestras después de 72 horas. Se precipitaron las proteínas en 65 DI de sobrenadante por medio de la adición de 228 DI de TCA-acetona (1.2 g de ácido triclórico, 9 mi de acetona, 1 mi de H20. Después de precipitar durante 3 horas a -20°C, se centrifugaron las muestras a 14.000 rpm a 4°C durante 10 min en una centrífuga eppendorf y se lavaron los precipitados con acetona. Se disolvieron los precipitados secos en amortiguador para la muestra 1 x (25 DI de amortiguador para la muestra LDS (Invitrogen, Breda, Los Países Bajos) , 10 DI de agente reductor (Invitrogen, Breda, Los Países Bajos) , 65 DI de H20) .

Análisis de la proteína Se separaron las muestras de proteína bajo condiciones reductoras sobre gel Bis-Tris al 4 - 12% NuPAGE (Invitrogen, Breda, Los Países Bajos) . Se incubaron los geles con InstantBlue (Expedeon, Cambridge, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o se los utilizó para transferencias tipo Western utilizando un anticuerpo específico para FLAG.

Los resultados de la tinción del gel de proteína con InstantBlue y las transferencias tipo Western se presentan en las Figuras 4A y 4B, respectivamente. El gel teñido con InstantBlue mostró una banda específica de EBA7-FLAG de aproximadamente 58 kDa en sobrenadantes de las transformantes pGBFINEBA7 cultivados en medio 1 para Talaromyces (carriles 1 y 2) . La banda de EBA7-FLAG no podía ser observada en los sobrenadantes de las transformantes cultivados en medio 2 para Talaromyces debido al alto contenido de proteína de las proteínas que son inducidas sobre celulosa (carriles 5 y 6) . Sin embargo, sobre la transferencia tipo Western pudimos observar una banda específica de proteína de EBA7-FLAG en sobrenadantes de las transformantes pGBFINEBA7 cultivados en cada uno de los medios, indicando que la proteína de EBA7-FLAG se produce en un medio a base de glucosa y de celulosa. Ya que no pudimos detectar ninguna señal de FLAG sobre la transferencia tipo Western en sobrenadantes de la cepa vacía (carriles 6 y 7, 13 y 14 en la Fig. 4B) , la proteína expresada es una proteína recombinante.

Determinación del número de copias de pGBFINEBA7 en transformantes de T. emersonii Se analizaron dos transformantes para la expresión de EBA7-FLAG, la transformante 1#6 y el 1#14, y se observó más producto en la transformante 1#6 (comparar el carril 1 y el carril 2 en la Fig. 4A; comparar los carriles 2+3 y los carriles 4+5 en la Fig. 4B) . Con el fin de analizar si la diferencia en el nivel de expresión es debida a diferencias en el número de copias, se aisló ADN cromosómico y utilizó para una reacción PCR. Se aisló ADN cromosómico del micelio cultivado durante 24 horas a 45 °C en un agitador rotatorio a 250 rpm en medio YGG utilizando el kit FastDNA Spin (MP Biomedicals, Solón - EUA) de acuerdo con el manual del proveedor. Se utilizaron aproximadamente 100 ng de ADN como molde para la PCR. Se amplificó parte del cásete de expresión utilizando el iniciador EBA7 hacia adelante (SEQ ID NO: 5) y el iniciador EBA7 inverso (SEQ ID NO: 6) . Se utilizaron iniciadores de actina como control para la cantidad de ADN que fue utilizada para las reacciones PCR. Se utilizaron los siguientes iniciadores para amplificar parte del gen de actina de T. emersonii: Actina hacia adelante (SEQ ID NO: 8) : CCACCTTCAACTCCATCATGAAG; y actina inverso (SEQ ID NO: 9) : TTAGAAGCACTTGCGGTGGA.

La mezcla de la PCR fue la misma descrita en el EJEMPLO 1 y se utilizaron las siguientes condiciones para la PCR: 30 s de desnaturalización a 98°C, amplificación en 20 ciclos (10 s a 98°C, 15 s a 60°C, 30 s a 72°C) , y una incubación final de 5 min a 72°C.

Como se muestra en la Figura 4C, la transformante 1#6 (carril 1) mostró una señal PCR del cásete de expresión más fuerte comparado con la transformante 1#14 (carril 2) , lo que está de acuerdo con la diferencia en el nivel de expresión. El resultado indica que la transformante 1#6 contiene múltiples copias de pGBFINEBA7.

De este modo, se expresó exitosamente una proteína recombinante en T. emersonii. Además, es posible generar transformantes con múltiples copias del gen de interés.

EJEMPLO 3 MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CELULASA DE LOS SOBRENADANTE ES AISLADOS DE TALAROMYCES EMERSONII TRANSFORMADOS CON pGBFINEBA7 Este ejemplo describe la medición de la actividad de la endoglucanasa en sobrenadantes de T. emersonii transformados con pGBFINEBA7 (véase el EJEMPLO 2 para la descripción día transformante) . Se midió la actividad por medio del uso de carboximetil celulosa como sustrato y se detectaron los azúcares reductores por medio del uso del reactivo ácido dinitrosalisílico .

Las transformantes de T. emersonii que contenían pGBFINEBA7 (véase el EJEMPLO 2) fueron utilizados para inocular 100 mi del medio 1 para Talaromyces y se incubó a 45°C a 250 rpm en un agitador incubadora durante 3 días . Se recogieron los sobrenadantes y utilizaron para medir la actividad de la endoglucanasa. Los resultados de los análisis en el ensayo de actividad de la endoglucanasa se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados de la medición de la actividad de la endoglucansa en sobrenadantes de una cepa vacía y una transformante de T. emersonii Las transformantes de T. emersonii que expresan endoglucanasa recombinante de T. emersonii mostraron al menos 32 veces más actividad de endoglucanasa comparado con la cepa de tipo silvestre.

En este experimento demuestra claramente que la endoglucanasa recombinante de T. emersonii expresada en T. emersonii es activa. Por lo tanto, las enzimas pueden ser expresadas en T. emersonii .

EJEMPLO 4 COMPARACIÓN ENTRE LA EXPRESIÓN DIRIGIDA POR EL PROMOTOR DE GLUCOAMILASA Y EL PROMOTOR DE GLICERALDEHIDO-3 -FOSFATO DESHIDROGENASA EN TALAROMYCES EMERSONII Este ejemplo describe la clonación y expresión de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii marcada con FLAG en T. emersonii bajo el control del promotor de gliceraldehido-3 -fosfato deshidrogenasa (gpd) . Se compara la extensión con la expresión de pGBFINEBA7.

Clonación del plásmido de expresión pGBFIN-Pgpd-EBA7 de T. emersonii que codifica la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii marcada con FLAG dirigida por el promotor de gpd El gen que consiste del promotor de gpd y la región de codificación de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii y una etiqueta FLAG en el terminal C FUE sintetizado por medio de DNA2.0 (Menlo Park, EUA) y clonado a través de una ligadura de 3 puntos como fragmentos Xhol/HindIII , HindIIl/AscI dentro de pGBFIN38,. cuyo plásmido se describe en WO2008053018. El vector de expresión pGBFIN38 incluye al promotor de gpd, un sitio de clonación, una región de terminación, un marcador amdS operativamente enlazado con el promotor de gpd, y flancos 3' y 3'' de glaA. Las secuencias de nucleótidos del promotor de gpd y la secuencia Kozak están representadas por la SEQ ID NO: 7. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii están representadas por la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. La Figura 5 representas un mapa de pGBFIN-Pgpd-EBA7 que contiene la proteína CEB beta-glucanasa de T. emersonii bajo el control del promotor de gpd dentro del vector pGBFIN-38.

Transformación de T. emersonii con pGBFIN-Pgpd-EBA7 La transformación de T. emersonii con pGBFIN-Pgpd-EBA7 se realizó como se describe en el EJEMPLO 2.

Fermentaciones en matraces de agitación de T. emersonii Se utilizaron transformantes de T. emersonii que contienen ya sea pGBFINEBA7 (transformante 1#6, véase el EJEMPLO 2) o pGBFIN-Pgpd-EBA7 para fermentaciones en matraces de agitación. Las fermentaciones en matraces de agitación y el análisis de la expresión de la proteína por medio del análisis de transferencias tipo Western utilizando un anticuerpo específico para FLAG fueron realizadas como se describe en el EJEMPLO 2.

Los resultados de la transferencia tipo Western se presentan en la Figura 6. Se separaron varias diluciones de sobrenadantes sobre gel para poder comparar la expresión entre los transformantes. Los sobrenadantes (dilución 1:100) de cultivos de 3 días día transformante 1#6 en los cuales EBA7 es dirigido por el promotor de glaA mostraron una banda EBA7-FLAG fuerte ( sobreexpuesta) (carriles 9 y 15) . El sobrenadante no diluido de 3 días de tres transformantes en el cual EBA7 es dirigido por el promotor de gpd (carriles 5, 8 y 14) mostró una banda sobre la transferencia tipo Western, pero la banda fue de menos intensidad comparada con el sobrenadante diluido 100 veces día transformante 1#6. No se observó expresión de EBA7-FLAG en los sobrenadantes de una cepa vacía (carriles 1, 10 y 11) . Las estimaciones del número de copias por PCR revelaron que la transformante 8#18 contiene la menor cantidad de copias, mientras que las transformantes 8#32 contienen la mayor cantidad de copias (Fig. 4C, carriles 4 - 6), lo cual se correlaciona con la expresión de EBA7-FLAG observada sobre la transferencia tipo Western (Fig. 6, comparar los carriles 4, 7 y 13) . Ya que el número de copias día transformante 1#6 de pGBFINEBA7 es comparable con la transformante 8#14 de pGBFlN-Pgpd-EBA7 (comparar el carril 1 con el carril 4 en la Fig. 4C) , mientras que la expresión de EBA7-FLAG en los sobrenadantes día transformante 1#6 es mucho mayor comparada con la expresión en la transformante 8#14, el promotor de glaA es más fuerte que el promotor de gpd.

Ensayo de actividad de la endoglucanasa (WBCU) Se analizaron también las muestras del experimento en los matraces de agitación por la actividad de la endoglucanasa. Se llevó a cabo el mismo método descrito en el EJEMPLO 3. Los resultados de los análisis en el ensayo de actividad de la endoglucanasa se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados de la medición de la actividad de la endoglucansa en sobrenadantes de una cepa vacía y transformantes de T. emersonii.

La actividad de la endoglucanasa en los sobrenadantes de las transformantes de pGBFIN- Pgpd-EBA7 no se incrementó por encima del fondo del ensayo (<10 WBCU/ml) , mientras que la actividad de la endoglucanasa en los sobrenadantes de las transformantes 1#6 de pGBFINEBA7 era al menos 32 veces superior comparada con la cepa de tipo silvestre (321 WBCU/ml) .

EJEMPLO 5 SOBREEXPRESIÓN DE MÚLTIPLES CELULASAS DE TALAROMYCES EMERSONII EN TALAROMYCES EMERSONII Este ejemplo describe la clonación y expresión de la celobiohidrolasa- I (CBHI) de T. emersonii, la celobiohidrolasa- II (CBHII) de T. emersonii, la beta-glucanasa CEA (EG) de T. emersonii, y la ß-glucosidasa (BG) de T. emersonii en T. emersonii. Además, la actividad de la celulasa de las transformantes se compara con la actividad de la celulasa de una cepa vacía después del cultivo de las cepas sobre glucosa.

Clonación de genes de T. emersonii en vectores de expresión Los genes que codifican la celobiohidrolasa- I (CBHI) de T. emersonii, la beta-glucanasa CEA (EG-) de T. emersonii, y la ß-glucosidasa de (BG) de T. emersonii fueron sintetizados por medio de DNA2.0 (Menlo Park, EUA) y clonados como un fragmento de EcoRI/SnaBI dentro del vector pGBT0P12, que contienen el promotor de glucoamilasa y a la secuencia terminadora, lo que resulta en el vector pGBTQPEBA205 , pGBTOPEBA8 y pGBTOPEBA4 , respectivamente. Para propósitos de clonación, se sintetizaron también 198 nucleótidos de la parte 3' del promotor de glucoamilasa con los genes. Las secuencias de aminoácidos de la celobiohidrolasa- I (CBHI) de T. emersonii, de la beta-glucanasa CEA (EG) de T. emersonii, y de la ß-glucosidasa (BG) de T. emersonii están representadas por las SEQ ID NOs : 10. 12, y 14, respectivamente. Las secuencias de ADN de los genes están representadas por las SEQ ID NOs : 11, 13 y 15, respectivamente. La Figura 7 representa un mapa de un pGBTOPEBA205 que contiene la proteína CBHI de T. emersonii bajo el control del promotor de glaA dentro del vector pGBTOP12. pGBT0PEBA205 es representativo para pGBTOPEBA8 , el cuale incluye EG de T. emersonii, y pGBTOPEBA4 , que incluye BG de T. emersonii.

El gen que codifica la celobiohidrolasa-II (CBHII) de T. emersonii, se obtuvo a partir de una biblioteca de ADNc de T. emersonii descrita en la patente WO/2001/070998. La Figura 8 representa un mapa de pGBFINEBA176. que contiene la proteína CBHI de T. emersonii bajo el control del promotor de glaA dentro del vector pGBFINll. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos están representadas por medio de las SEQ ID NOs : 16 y 17, respectivamente.

Transformación de T. emersonii con constructos que codifican celulasas La transformación de T. emersonii con constructos que codifican celulasas se realizó como se describe en el EJEMPLO 1. En total, 10 Dg de ADN fueron utilizados para co-transformar T. emersonii: 1 Dg de pAN8-l y 2 Dg de cada uno de los vectors pGBT0PEBA4 , pGBTOPEBA8 , pGBTOPEBA205 y pGBFINEBAl76.

Selección de transformantes que expresan las 4 celulasas Se recolectaron las transformantes de las placas y se los cultivó nuevamente en placas de microtitulación de 96 pozos (MTP) que contenían medio agar para Talaromyces durante 5 días a 40°C. Se obtuvo una réplica de las placas de cultivo utilizando un replicador de 96 puntas en las MTP que contenían medio PDA. Las placas MTP fueron incubadas durante 3 días a 40°C y utilizadas para recolectar esporas para análisis en matraces de agitación. Para hacer esto, se añadieron 100 DI del medio 1 para Talaromyces a cada pozo y después de resuspender la mezcla, se utilizaron 30 DI de suspensión de esporas para inocular 170 DI del medio 1 para Talaromyces en placas MTP. Se incubaron las placas de 96 pozos en agitadores de humedad (Infors) para 44 °C y 550 rpm, y humedad del 80% durante 96 horas. Se utilizaron placas tipo émbolo para empujar hacia abajo el micelio y, posteriormente, se recolectaron aproximadamente 100 DI de sobrenadante por pozo.

Se analizaron aproximadamente 10 DI de sobrenadante para la expresión de la proteína utilizando el sistema de electrólisis de Proteína E-PAGE 96 (Invitrogen, Breda, Los Países Bajos) . Se tiñeron los geles con colorante para proteína SimplyBlue y se seleccionaron las transformantes que expresan múltiples celulasas . Se recolectaron las esporas de transformantes interesantes de placas maestras MTP y se las utilizó para preparaciones de lotes de esporas.

Fermentaciones en matraces de agitación para T. emersonii y análisis de las muestras Se utilizaron las transformantes de T. emersonii que expresan una o más celulasas para las fermentaciones en matraces de agitación en medio 2 para Talaromyces que contenía 5% de glucose . Los análisis de expresión de la proteína por medio de SDS-PAGE fueron realizados como se describe en el EJEMPLO 2. Las proteínas fueron visualizadas utilizando colorante para proteínas SYPRO Ruby.

Los resultados del gel para SDS-PAGE teñido con SYPRO Ruby se presentan en la Figura 9A. Los diferentes transformantes expresaron diferentes combinaciones y niveles de expresión de celulasas. El sobrenadante día transformante 20 (cepa 20), contenía las 4 celulasas, mientras que, por el contrario, no se observaron proteínas celulasas en la cepa vacía (FBG142) . Por lo tanto, múltiples celulasas pueden ser simultáneamente sobreexpresadas en T. emersonii en presencia de glucosa.

Con el fin de analizar la actividad de la celulasa en transformantes de T. emersonii que expresan una o más celulasas, se midió la actividad en WSU en sobrenadantes de una cepa vacía y los transformantes. Los resultados del ensayo en WSU se muestran en la Figura 9B . A los sobrenadantes recolectados después de 72 horas de cultivos de la cepa vacía sembrada en medio que contenía glucosa no se les pudo medir actividad en WSU. Por el contrario, en transformantes se pudo observar un rango de actividades.

El Transformante 20 que expresa las 4 celulasas mostró la actividad más alta: casi 6 WSU/ml, o 5 WSU/ml o más. Los Transformantes 20 y 28 tuvieron una actividad de 4 WSU/ml o más. Los Transformantes 20. 28, 6, 64, 33, 11 y 48 tuvieron una actividad de 3 WSU/ml o más. Los Transformantes 20. 28, 6, 64, 33, 11, 48, 36, 35 y 1 tuvieron una actividad de 2.5 WSU/ml o más, y los Transformantes 20. 28, 6, 64, 33, 11, 48, 36, 35, 1, 43, 53 y 7 tuvieron una actividad de 2 WSU/ml o más. Todos los otros transformantes tuvieron una actividad muy por debajo de 1.5 WSU/ml.

Para analizar si la transformante 20 también produjo actividad de celulasa en ausencia de un inductor, se llevó a cabo una fermentación en un matraz de agitación utilizando medio 3 para Talaromyces . Se recolectaron los sobrenadantes los días 3, 4 y 5 y se analizó su actividad en WSU. Los resultados del ensayo de WSU se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Resultados de la medición de la actividad en WSU en sobrenadantes de una cepa vacía y día transformante 20 de T. emersonii en medio 3 para Talaromyces.

No se observó actividad de celulasa en sobrenadantes el día 3 de una cepa vacía, mientras que si se observó alguna actividad en períodos de tiempo posteriores. Por el contrario, la transformante que sobreexpresa múltiples celulasas bajo el control del promotor de glaA mostró actividad en WSU el día 3 (6.1 WSU/ml) , y se incrementó la actividad adicionalmente con el paso del tiempo.

Este experimento indica fuertemente que las transformantes de T. emersonii que contienen múltiples celulasas (por ejemplo 4 en este ejemplo) bajo el control del promotor de glaA son capaces de producir actividad de celulasa en medio que contiene glucosa con y sin celulosa. El transformante puede ser obtenido por selección en un fondo común de transformantes que han sido transformados con 4 constructos de celulasa.

EJEMPLO 6 SEGUNDA TRANSFORMACIÓN DE TRANSFORMANTES DE TALAROMYCES EMERSONII. SOBREEXPRESIÓN DE MÚLTIPLES CELULASAS DE TALAROMYCES EMERSONII Este ejemplo describe la segunda transformación día transformante EBAT147-1 con (hemi) celulasas y al segundo marcador de selección de higromicina B. Se describe la clonación de proteína desconocida de T. emersonii, de swollenina de T. emersonii, de acetil xilan esterasa de T. emersonii y de xilanasa de T. emersonii, y la transformación día transformante EBAT147-1 de T. emersonii con celobiohidrolasa-ll (CBHII) de T. emersonii, beta-glucanasa CEA (EG) de T. emersonii, ß-glucosidasa (BG) de T. emersonii, proteína desconocida de T. emersonii, swollenina de T. emersonii, acetil xilan esterasa de T. emersonii y xilanasa de T. emersonii.

Clonación de (hemi) celulasas de T. emersonii en vectores de expresión Los genes que codifican proteína desconocida de T. emersonii y swollenina de T. emersonii, fueron sintetizados por medio de DNA2.0 (Menlo Park, EUA) y clonados como un fragmento de EcoRl/SnaBI dentro del vector pGBTOP12, que contiene al promotor de la glucoamilasa y la secuencia terminadora, lo que resulta en él vector pGBTOPEBA224 , y pGBTOPEBA225 , respectivamente. Para propósitos de clonación, se sintetizaron también 198 nucleótidos de la la parte 3' del promotor de la glucoamilasa con los genes. Las secuencias de aminoácidos de la proteína desconocida de T. emersonii y la swollenina de T. emersonii están representadas por las SEQ ID NOs : 18 y 20. respectivamente. Las secuencias de ADN de los genes están representadas por las SEQ ID NOs : 19 y 21, respectivamente. pGBTOPEBA205 (Fig. 7) está representado por pGBTOPEBA224 , que incluye proteína desconocida de T. emersonii, y pGBTOPEBA225 , que incluye swollenina de T. emersonii .

Los genes que codifican acetil xilan esterasa (ACE) de T. emersonii y xilanasa de T. emersonii fueron obtenidos de una biblioteca de ADNc de T. emersonii descrita en la patente WO/2001/070998. pGBFINEBAl76 (FIGURA 8) es representativa para pGBFINEBA193 , que incluyen ACE de T. emersonii y pGBFINEBAl79 que incluye xilanasa de T. emersonii. Las secuencias de aminoácidos de ACE de T. emersonii y xilanasa de T. emersonii están representadas por las SEQ ID NOs: 22 y 24, respectivamente. Las secuencias de ADN de los genes están representadas por las SEQ ID NOs: 23 y 25, respectivamente. Transformación de T. emersonii con constructos que codifican (hemi) celulasas La transformación de T. emersonii con constructos que codifican celulasas se realizó como se describe en el EJEMPLO 5, con la excepción de que en vez de pAN8-l, para transportar al marcador de selección de fleomicina, se utilizó pAN7 para transportar al marcador de selección de higromicina B (Punt P. J. , Oliver R. P., Dingemanse M. A., Pouwels P. H., van den Hondel C. A. 1987. Transíormation de Aspergillus based on the hygromycin B resistance marker from Escherichia coli. Gene. 1987; 56(1): 117 - 24. En total, se utilizaron 19 Dg de ADN para co- transformar T. emersonii: 1 Dg de pAN7-l, 1 Dg de cada uno de los vectores pGBT0PEBA4 , pGBT0PEBA8 , y pGBFINEBA176 , y 2.5 Dg de cada uno de los vectores pGBTOPEBA205 , pGBTOPEBA224 , pGBTOPEBA225 , pGBFINEBA179 y pGBFINEBA193.

Selección para transformantes con actividad mejorada de celulasa Se recogieron las transformantes de las placas y se los analizó adicionalmente como se describe en el EJEMPLO 5. Con base en los resultados de SDS-PAGE y WSU, la transformante más interesante, EBAT147-2, fue seleccionado para la preparación de un lote de esporas y analizado en un lote de fermentación de 10 litros (véase el EJEMPLO 7) .

Métodos de los ejemplos 7 y 8 Ensayos de medición de proteína 1. Proteína total El método era una combinación de precipitación de proteína utilizando ácido tricloro acético (TCA) para remover las sustancias que estorban y permitir la determinación de la concentración de proteína con la reacción colorimétrica de Biuret. En la redacción de Biuret, se reduce un ión cobre (II) a cobre (I) , que forma un complejo con los nitrógenos y carbonos de los enlaces peptídicos en una solución alcalina. Un color violeta indica la presencia de proteínas. La intensidad del color, y por lo tanto la absorción a 546 nm, es directamente proporcional a la concentración de la proteína, de acuerdo con la ley de Beer-Lambert . Se llevó a cabo la estandarización utilizando BSA (Albúmina de Suero Bovino) y se expresó el contenido de proteína en g de proteína como equivalentes/L de BSA o mg de proteína como equivalentes/ml de BSA. Se calculó el contenido de proteína utilizando protocolos estándar de cálculo conocidos en el arte, graficando la OD546 versus la concentración de las muestras con concentración conocida, seguido por el cálculo de la concentración de las muestras desconocidas utilizando la ecuación generada a partir de la línea de calibración. 2. Proteínas individuales utilizando análisis proteómico APEX Materiales El sistema LC-MS/MS consistía de un Accela y de un LTQ-Velos de Thermo Fisher (San José, CA, EUA) . Las columnas fueron adquiridas a Agilent: Columna C18 Zorbax de 2.1 mm x 5 mm, tamaño de partícula 1.8 \xm. Se utilizó una centrífuga A Biofuse fresco de Heraeus para centrifugación de tubos eppendorf . Se utilizó una Allegra X-15R de Beckman Coulter para centrifugación de tubos Greiner. Se utilizó un termomezclador comfort de Eppendorf (Hamburg, Alemania) para incubaciones y se utilizaron tubos Lo-bind de Eppendorf para todos los experimentos. Se realizaron búsquedas en bases de datos, utilizando el motor de búsqueda Sorcerer 2 (SageN, San Diego, CA, EUA) que opera la Trans-Proteomics Pipeline (TPP) . Los resultados de la identificación fueron procesados utilizando el software gratuito A solute Protein Expression software (APEX) http://pfgrc.jcvi.org/index.php/ bioinformatics/apex.html, para obtener cantidades de proteínas .

Los amortiguadores A y B grado LC-MS de Ácido Fórmico (FA) al 0.1% en agua y FA al 0.1% en acetonitrilo respectivamente fueron adquiridos a Biosolve (Valkenswaard, Los Países Bajos) . La Albúmina de Suero Bovino (BSA) , Urea, Iodo Acetamida (IAA) y Ácido Tricloroacético (TCA) , solución 6.1 N, fueron adquiridos a Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA) . La solución de TCA fue diluida 4.5 veces para obtener una solución de TCA al 20%. Se adquirió el Ditiotreitol (DTT) a Roche Applied Science (Indianapolis IN, EUA) . El Ácido Fórmico (FA) fue adquirido a JT Baker (Phillipsburg, NJ, EUA) . La tripsina adecuada para secuenciación fue adquirida a Roche Applied Science (Penzberg, Alemania) .

Precipitación y digestión con TCA Se descongelaron cuidadosamente las muestras y se almacenaron sobre hielo la mayor cantidad de tiempo posible durante la preparación de la muestra. Se diluyeron las muestras con una concentración de proteína de 5 mg/ml .

Se diluyeron 100 DI de la muestra y 50 DI de BSA con una concentración de 0.1 mg/ml en proporción 1:1 con TCA al 20%. Se incubaron las muestras a 4 °C durante 30 minutos y se precipitaron las proteínas por medio de centrifugación durante 10 minutos a 13000 rpm y a 4 °C. Se removió el sobrenadante y se lavó el precipitado con 200 DI de acetona a -20 °C. Nuevamente se precipitaron las proteínas por medio de centrifugación durante 10 minutos a 13000 rpm y a 4 °C y se removió el sobrenadante.

Se disolvió el precipitado lavado en 75 DI de urea 8 M. Esta solución fue diluida con 392.5 DI de NH4HC03 100 mM. Se añadieron 5 DI de DDT 500 mM y se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación máxima en un Thermomixer. Se alquilaron las cisteínas por medio de la adición de 13.5 DI de IAA 550 mM y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación máxima en un Thermomixer en la oscuridad. Se realizó la digestión por medio de la adición de 20 DI de tripsina con una concentración de 250 Dg/ml pH 3 y se incubó a 37 °C durante la noche con agitación máxima en el Thermomixer. Se añadieron otros 5 Gl de tripsina con una concentración de 250 Dg/ml pH 3 y se continuó la digestión durante 3 horas a 37 °C para garantizar que fuera completa.

Se analizaron las muestras sobre el sistema Accela LTQ-Velos (Thermo Electron) .

Columna: coluna C18 de Agilent de 2.1 mm x 5 mm, tamaño de partícula 1.8 Dm Gradiente: 80 minutos de AcN al 5 - 40%, Ácido Fórmico al 0.1% - 2 minutos de can al 40 - 60%, Ácido Fórmico al 0.1% Flujo 400 DL/min Volumen de inyección: 20 DI Tiempo de ejecución total incluida la inyección, lavado de columna y re-equilibración: 85 minutos - Método MS : MS potenciado de doble recorrido de orden 10° m/z 300 - 2000 y MS/MS de los 10 picos superiores Rechazo del estado de la carga permitiendo únicamente iones 2+ y 3+ Exclusión dinámica: repetición 1, duración de la exclusión 10 segundos Análisis de datos utilizando Sorcerer y Spotfire Los datos fueron buscados contra la base de datos de Talaromyces emersonii (TEMER) , que fue editada manualmente para contener las secuencias del estándar interno de BSA. La búsqueda en la base de datos se realizó en el Sorcerer 2, utilizando el TPP. El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando herramientas estadísticas estándar.

Ensayo en Papel Filtro (ensayo al 2% de FPU) La actividad de la celulasa se midió en términos de "unidades de papel filtro" (FPU) por mililitro en un ensayo de Unidad de Papel Filtro (ensayo FPU) de solución original de la enzima (no diluida) . El método fue modificado a partir del procedimiento analítico de Adney y Baker (1996, MoA Laboratory Analytical Procedures-006 titulado: Measurement of cellulase activities by Adney y Baker (1996) www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html) para ser más sensible que el método estándar que se fundamenta en las directrices de la International Union of Puré and Applied Chemistry (IUPAC) . Para obtener resultados cuantitativos, se compararon las composiciones de enzima sobre la base de conversiones iguales y significativas. El valor de 1.0 mg de azúcar reductor como glucosa a partir de 50 mg de papel filtro (2% de conversión en vez del estándar internacional de 4%) en 60 minutos se denominó como el intercepto para calcular las unidades de papel filtro (FPU) por IUCA. En este procedimiento, el azúcar reductor producido no es una función lineal de la cantidad de enzima en la mezcla del ensayo; no se espera que el doble de la cantidad de enzima produzca dos veces la cantidad de azúcar reductor en el mismo tiempo. El procedimiento del ensayo involucró por lo tanto el hallazgo de una dilución del valor original de la enzima de tal manera que una alícuota de 0.5 mi de la dilución catalizará una conversión del 2% en 60 minutos, y luego se calcula la actividad (en 2% de FPU/ral) del valor original de la dilución requerida .

FPU fue calculada utilizando la siguiente fórmula: Actividad de papel filtro = 0.37/ ( [Enzima] que libera 1.0 mg de glucosa) [Unidades/ml] [Enzima] representa la proporción de la solución original de la enzima presente en la dilución de la enzima directamente analizada .

Fermentación por lotes Procedimiento de inoculación: Se añadió el contenido de un vial a un medio de cultivo previo: matraz de agitación encamisado de 2 L [20 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de glucosa, pH 6.8 (con KOH) , 300 mL de medio, esterilizado al vapor durante 20 min a 121°C] . El cultivo previo se desarrolló durante 24 - 48 h a 48°C y 200 rpm. El ritmo de la agitación se puede adaptar a la configuración del matraz de agitación y la viabilidad ' del vial .

Procedimiento de fermentación principal: El medio se componía de una mezcla de harina de granos (3%) , celulosa (6%), una fuente de nitrógeno (2.5%; los ejemplos de fuentes de nitrógeno conocidas en el arte incluyen harina de soja, extracto de levadura, licor de maceración de maíz, amoníaco, sales de amonio, sales de nitrato) , así como una fracción de sal. La extracción de sal estaba de acuerdo con W098/37179, Tabla 1, p. 12. Las desviaciones de esta tabla fueron: 1.0 g/L de CaC12.2H20, 1.8 g/L de KC1, 0.45 g/L de ácido cítrico con un agua de hidratación (agente de quelación) . El medio fue esterilizado al vapor en una fracción. Se inocularon los biorreactores con una relación de inoculo -10% y el volumen de trabajo fue de 10 L. Se controló el pH del proceso entre 5.0 - 3.0 (utilizando ácido fosfórico y amoníaco) , y la temperatura 42 - 52 °C.

Se mantuvo el flujo de aire entre 0.5 y 1.5 vvm (volumen de aire por volumen de caldo por minuto) y el DOT por encima del 30% de la saturación de oxígeno antes de la inoculación con el propósito de agitar. Se utilizó Clerol como antiespumante , en forma periódica: 2 segundos cada 30 minutos durante las primeras 24 horas, luego 2 segundos cada hora posteriormente. Al final de la fase de cultivo previo se tomaron muestras para comprobar la contaminación, la determinación de la glucosa y la medición del pH. Durante la fermentación principal, se tomaron muestras cada 24 h y se llevaron a cabo los siguientes análisis: control de contaminación, medición del pH, geles para SDS-PAGE, determinación de la concentración total de proteína (método de Biuret con TCA) , y actividad de la Unidad de Papel Filtro (2% de FPU/ml) , como se describió anteriormente.

EJEMPLO 7 FERMENTACIÓN DE UN TRANSFORMNTE DE TALAROMYCES EMERSONII QUE SOBREEXPRESA MÚLTIPLES CELULASAS Este ejemplo describe la fermentación de transformantes de T. emersonii.

Dos transformantes primarios descritos en el EJEMPLO 5, la transformante 20 (EBAT142-1) y la transformante 64 (EBAT147-1), y una transformante secundario del EJEMPLO 6, EBAT147-2, fueron analizados en un termentador para producción de 10 litros como una fermentación por lotes bajo condiciones que inducen celulasa. Como controles, se analizaron las cepas vacías FBG-142 y FBG-147.

Al final de la fermentación, se determinaron el Biuret con TCA y la actividad de la celulasa (FPU) (Tabla 4) .

Tabla 4. Resultados del Biuret con TCA y medición de la actividad de FPU de sobrenadantes de transformantes de T. emersonii y cepas huésped vacías cultivadas en un fermentado para producción de 10 litros.

Los resultados muestran claramente que las transformantes de T. emersonii mostraron una actividad mejorada de celulasa comparado con las cepas huésped vacías. El transformante EBAT142-1, que expresa las cuatro celulasas (cepa 20 en la Fig. 9), mostró una mejoría de 1.32 veces en la actividad de la celulasa comparado con el huésped vacío FBG-142. El transformante EBAT147-1, que expresa tres celulasas (cepa 64 en la Fig. 9) , mostró una mejoría de 1.25 veces en la actividad de la celulasa comparado con el huésped vacío FBG- 147. El transformante secundario, EBAT147-2, en el cual se incrementaron adicionalmente los niveles de CBHI y BG comparado con la cepa huésped EBAT147-1 y en la cual se sobreexpresó acetil xilan esterasa (véase el EJEMPLO 8), mostró una mejora adicional en la actividad de la celulasa: EBAT147-2 produjo 1.16 veces más actividad de la celulasa comparado con la cepa madre EBAT147-1 y una mejora de 1.44 veces comparado con la cepa huésped vacia FBG-147.

Además, la actividad de la celulasa por mg de proteína se incrementó en las transformantes comparada con la cepa huésped vacía. En la cepa huésped vacía se observó <1 FPU/mg de proteína, mientras que todos las transformantes primarios mostraron >1.1 FPU/mg de proteína. El transformante secundario EBAT147-2 también mostró una mejoría adicional de 1.11 veces en la actividad de la celulasa por mg de proteína comparada con la transformante primario EBAT147-1. Todos juntos, los resultados sugieren que la fracción de celulasas en el sobrenadante de las transformantes se incrementó.

El experimento indica fuertemente que es posible mejorar la actividad de la celulasa por encima de la producción de la celulasa endógena por parte de T. emersonii por sobreexpresion de las celulasas de T. emersonii. Además, una segunda transformación de una transformante mejorado mostró un incremento adicional en la actividad de la celulasa.

EJEMPLO 8 ANÁLISIS DE LOS TRANSFORMANTES DE TALAROMYCES EMERSONII QUE SOBREEXPRESAN MÚLTIPLES CELLULASAS POR PROTEÓMICA Este ejemplo describe la caracterización día transformante primario EBAT147-1 y día transformante secundario EBAT147-2 por los mayores niveles de celulasas sobreexpresadas como se determinó por medio de proteómica.

Los subrenadantes de fermentaciones por lotes de 10 litros de FBG-147 y día transformante EBAT147-1 y EBAT147-2 (véase el EJEMPLO 7) fueron analizados utilizando análisis proteómico APEX. La cantidad relativa de celulasas, hemicelulasas y de proteínas accesorias se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Comparación de los niveles relativos de celulasa (APEX) de la cepa FBG-147 de T. emersonii y día transformante primario EBAT147-1 y día transformante secundario EBAT147-2. Expresada en % de proteína total como se determinó por medio de APEX.

Tabla 5 (continuación) a. Los sobrenadantes de fermentaciones por lotes de Eschweilera de 10 litros aproximadamente durante 95 horas fueron sometidos a análisis APEX. Todos los valores se expresan en los porcentajes de las proteínas detectadas. Los valores con un asterisco indican los niveles que cambia estadísticamente en forma significativa entre FBG-147 y las cepas de los descendientes (valor p = 0.05 en la varianza desigual en los dos lados de la prueba t de Student) . Los valores resaltados con un * indicant niveles que cambian estadísticamente significativamente entre EBAT147-1 y la cepa de los descendientes (valor p = 0.05 en la varianza desigual en los dos lados de la prueba t de Student) . Los niveles de TEC como FPU2%/ml de las fermentaciones por lotes se muestra en la parte de abajo. b. Contenido total de celulasa (como se determina por APEX, expresado como % de proteína detectado por medio de análisis proteómico APEX) : la suma de CBH I, CBH II, EG, EG/CEA, EG/CEB, BG, EG/familia 61 (como se describe en la Solicitud de Patente Europea EP10167771.4 ) , proteína tipo swollenina (como se' describe en la Solicitud de Patente Europea EP10167764.9) y proteína desconocida (como se describe en la Solicitud de Patente Europea EP1016776 .2 ) , enlistadas en la Tabla 5. c. Celulasas totales y contenido de xilanasas (como se determina por APEX, expresado como % de proteína detectado por medio de análisis proteómico APEX) : Celulasa total (¾ de proteína detectado por medio de análisis proteómico APEX) como se definió anteriormente en b + xilanasa + acetil xilan esterasa, enlistadas en la Tabla 5.

Los resultados claramente muestran que 3 celulasas fueron significativamente sobreexpresadas en la transformante EBAT147-1 comparado con FBG-147: CBHI expresada a partir del plásmido pGBTOPEBA2Q5, EG/CEA expresada a partir del plásmido pGBT0PEBA8 , y BG expresada a partir del plásmido pGBTOPEBA4. Los niveles de proteínas endógenas no fueron significativamente diferentes entre EBAT147-1 y FBG-147.

En la transformante secundario EBAT147-2, CBHI expresada a partir del plásmido pGBTOPEBA205 y BG expresada a partir del plásmido pGBTOPEBA4 fueron mejoradas adicionalmente comparado con la transformante primario EBAT147-1, y, además, la acetil xilan esterasa expresada a partir del plásmido pGBFINEBA193 fue sobreexpresada .

El contenido de celulasa total enlistado en la Tabla 5 mostró que la fracción de celulasas en la cantidad total de proteína detectada se incrementa en los transformantes.

El experimento indica fuertemente que las celulasas de T.emersonii pueden ser sobreexpresadas por transformación de T.emersonii con múltiples casetes de expresión que codifican celulasas y se pueden mejorar adicionalmente los niveles de celulasas por medio de una segunda transformación de una transformante primario^ Los resultados explican la mejora en la actividad de la celulasa de las transformantes descrita en el EJEMPLO 6. Además, la fracción de celulasas en la cantidad de proteína total secretada producida por T.emersonii puede ser mejorada por sobreexpresión de celulasas, que está de acuerdo con la actividad mejorada de la celulasa por mg de proteína observada en las transformantes (EJEMPLO 6) .

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES

1. Proceso para la producción de una transformante de Talaromyces que comprende las etapas de: (a) proporcionar uno o más casetes de expresión capaces de producir uno o más polipéptidos de interés y que comprenden uno o más polinucleótidos de interés que codifican para celulasa, hemicelulasa y / o pectinasa y al menos un promotor para expresión del polinucleótido; (b) proporcionar un marcador de selección incluido en el cásete de expresión de (a) o incluido en un polinucleótido marcador de selección dedicado; (c) transfectar un huésped Talaromyces con uno o más casetes de expresión de (a) y / o el marcador de selección de (b) ; (d) seleccionar una transformante de Talaromyces que contiene uno o más polinucleótidos que codifican celulasa, hemicelulasa y / o pectinasa y (e) aislar la transformante de Talaromyces.

2. Transformante de Talaromyces que comprende uno o más genes recombinantes , capaces de producir celulasa en ausencia de inductor de celulasa en un medio de glucosa, que tiene una actividad de celulasa de 2 WSU / mi o más en 16 veces o más de sobrenadante o caldo diluido, que puede ser obtenida de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Transformante de Talaromyces de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene una actividad de celulasa de 3 WSU / mi o más, o 5 WSU / mi o más, en 16 veces o más de sobrenadante o caldo diluido.

4. Transformante de Talaromyces de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, que tiene una actividad de endoglucanasa de 50 WBCU / mi o más.

5. Transformantes de Talaromyces de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que albergan dos o más genes capaces de expresar celulasa.

6. Transformantes de Talaromyces de acuerdo con la reivindicación 5, en donde los dos o más genes capaces de expresar celulasa incluyen al gen para la celobiohidrolasa, la endoglucanasa y / o la beta-glucosidasa.

7. Transformante de Talaromyces de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el gen para celobiohidrolasa es celobiohidrolasa I y/o celobiohidrolasa II.

8. Transformante de Talaromyces de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde uno o más genes se integran en el genoma día transformante de Talaromyces.

9. Transformante de Talaromyces de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde la transformante de Talaromyces está libre de marcador.

10. Proceso para la producción de una composición de polipéptido que comprende una o más celulasas, emicelulasas y / o pectinasas que comprende las etapas de: (a) proporcionar uno o más casetes de expresión capaces de producir uno o más polipéptidos de interés y que comprenden uno o más polinucleótidos de interés que codifican para celulasa, hemicelulasa y / o pectinasa y al menos un promotor para expresión del polinucleótido; (b) proporcionar un marcador de selección incluido en el cásete de expresión de (a) o incluido en un polinucleótido marcador de selección dedicado; (c) transfectar un huésped Talaromyces con uno o más casetes de expresión de (a) y / o el marcador de selección de (b) ; (d) seleccionar una transformante de Talaromyces que contiene uno o más polinucleótidos que codifican celulasa, hemicelulasa y / o pectinasa; (e) producir la composición de polipéptido mediante el cultivo día transformante de Talaromyces en un medio de cultivo adecuado en el que un inductor celulasa está sustancialmente ausente, y (f) opcionalmente recuperar la composición de polipéptido.

11. Proceso de acuerdo con la reivindicación 10. en donde en la etapa (a) se proporcionan dos o más casetes de expresión, tres o más cassetes de expresión, o cuatro o más casetes de expresión .

12. Proceso de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11, en donde el promotor se escoge de entre el grupo consistente de: promotores de glaA de A. niger, y promotores de gpd de A. nidulans gpd o partes funcionales de los mismos opcionalmente precedidos por secuencias activadoras secuencia arriba.

13. Proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el promotor es el promotor de glaA de A. niger o partes funcionales del mismo, opcionalmente precedido por secuencias activadoras secuencia arriba.

14. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el gen marcador de selección se escoge de entre el grupo que consistente de: amdS (acetamidasa) , hygB (higromicina- fosfotransferasa) , y ble (resistencia a la fleomicina) , preferiblemente ble.

15. Composición de polipéptido producida por la transformante de Talaromyces de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 y / o por medio del proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 1 .

16. Composición de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende CBH I, II CBH, EG y / o BG.

17. Composición de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende CBH I, II CBH, EG y BG.

18. Composición de polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, que comprende un polipéptido escogido del grupo que incluye: catalasa, lacasa, fenoloxidasa, oxidasa, oxidorreductasas, xilanasa, peroxidasa, lipasa, hidrolasa, esterasa, cutinasa, proteasa y otros polipéptidos proteolíticos , aminopeptidasa, carboxipeptidasa, fitasa, liasa, y otras enzimas pectinolíticas , amilasa, glucoamilasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, manosidasa, isomerasa, invertasa, transferasa, ribonucleasa, quitinasa, mutanasa y desoxirribonucleas .

19. Proceso para la sacarificación de material lignocelulósico, en donde el material lignocelulósico que ha sido opcionalmente pretratado, se pone en contacto con una transformante de Talaromyces de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9; una composición de polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, y en donde se producen uno o más azúcares .

20. Proceso para la preparación de un producto de fermentación, que incluye aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para alimento de animales, productos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, etanol, etanol combustible o productos químicos, plásticos, tales como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles, que incluye etanol, metanol, butanol , combustibles sintéticos líquidos y biogás, en donde uno o más azúcares producidos de acuerdo con el proceso de la reivindicación 19, se fermenta con un microorganismo para fermentación, preferiblemente levadura, para producir el producto de fermentación.

21. Proceso para la producción de una transformante múltiple de Talaromyces, en donde en una primera transformación de acuerdo con la reivindicación 1, la transformante aislado de Talaromyces aislado en la etapa (e) de una primera transformación se utiliza como huésped Talaromyces y se transforma en una segunda transformación de¦ acuerdo con la reivindicación 1 y en la etapa (e) de la segunda transformación, se aisla una transformante múltiple de Talaromyces .

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en donde en la primera transformación se utiliza un marcador de selección diferente que en la segunda transformación.

23. Transformante de Talaromyces que tiene un contenido total de celulasa como se determina por APEX de 38% o más, 40% o más, y / o 45% o más.