MX2012005006A - Variantes de glicosilacion de anticuerpos. - Google Patents

Abstract

Las moléculas de anticuerpo y otras que contienen Fc con variaciones de la glicosilación en la región Fc muestran una resistencia aumentada a las proteasas tales como pepsina, plasmina, tripsina, quimotripsina, una metaloproteinasa de la matriz, una serina endopeptidasa y una cisteína proteasa. Las moléculas que contienen Fc son útiles en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos.

Description

VARIANTES DE GLICOSILACIÓN DE ANTICUERPOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la evaluación de la secuencia del Fe de los anticuerpos y otras moléculas que contienen Fe y, más particularmente, a los métodos para preparar, alterar y usar preparaciones de anticuerpos y otras moléculas que contienen Fe para alterar la susceptibilidad a las proteasas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las modificaciones de aminoácidos dentro del dominio Fe pueden tener lo que se considera efectos alostéricos, es decir, que afectan la conformación del Fe desde una distancia. En particular, se ha demostrado que las sustituciones de aminoácidos en el dominio CH3 afectan la unión a los receptores Fe-gamma, los cuales se unen al anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro intercatenarios entre las cadenas pesadas (la región bisagra inferior) la cual es, además, el dominio CH2 (Shields y otros, (2001) J Biol Chem 276:6591 ; Stavenhagen y otros, (2007) Cáncer Res. 67:8882).

En el anticuerpo maduro, los dos oligosacáridos bi-antenarios complejos unidos a la Asn297 están enterrados entre los dominios CH2, y forman amplios contactos con la cadena principal del polipéptido. Se encontró que su presencia es esencial para que el anticuerpo medie las funciones efectoras, tales como ADCC (Lifely, M. R., y otros, Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., y otros, Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. y Morrison, S. L., supra). Los estudios realizados por otros y por los presentes solicitantes (patente núm. WO2007005786) han demostrado, además, que la composición de los oligosacáridos de estos glicanos adjuntos de forma natural en la región Fe altera, además, las afinidades de unión al receptor Fe y la sensibilidad a las proteasas en diversos sitios no adyacentes de la cadena polipeptídica (Raju, ST 2008 Curr Op Immunol 20:471-478; patente núm. WO2007024743).

Por lo tanto, ya que la comprensión de los diversos aspectos conformacionales de las moléculas del anticuerpo evoluciona y las técnicas de modelar y modificar las proteínas se vuelven más sofisticadas, es posible ahora seleccionar regiones dentro de los candidatos a anticuerpos terapéuticos para la modificación que coincida con el espectro deseado de interacciones in vivo para un uso o indicación particular. Tal modificación puede proporcionar anticuerpos terapéuticos mejorados que mantienen la inocuidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona las composiciones de dominios constantes de inmunoglobulinas glicosiladas, modificados, útiles en el diseño de anticuerpos o similares a anticuerpos terapéuticos, tales como aquellos que comprenden una región Fe, que tienen uno o más sitios de glicosilación ligado a Asn diseñados ("N-glicosilación").

En una modalidad de la invención, existe un sitio de N-glicosilación en la posición 359 a partir de una mutación en la posición 361 y/o un sitio de N-glicosilación en la posición 419 a partir de una mutación en la posición 421. Adicionalmente, la glicosilación del Fe nativo está presente en la Asn297 y en otra modalidad, la glicosilación del Fe nativo puede estar ausente. Las construcciones derivadas de anticuerpos son estructuras de proteínas diméricas derivadas de o que comprenden secuencias de lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humanas. En un aspecto, las construcciones contienen sustituciones de aminoácidos en las posiciones 228, 234, o 235 (numeración EL) de Kabat) en la región de bisagra.

Otro objetivo de la invención comprende compuestos basados en los dominios constantes de inmunoglobulinas glicosiladas, modificados con propiedades mejoradas en comparación con compuestos que tienen el dominio constante de inmunoglobulina análogo no modificado; las propiedades incluyen, pero sin limitarse a, sensibilidad a las proteasas, vida media en suero, y unión al receptor Fe.

Es un objetivo adicional de la invención proporcionar composiciones y métodos para aumentar la capacidad de las preparaciones de anticuerpos glicosilados para resistir el clivaje por las proteasas y por lo tanto proporcionar preparaciones de anticuerpos para tratar afecciones patológicas asociadas con la presencia de niveles elevados de proteasas, tales como el cáncer. En otra modalidad del método, la proteína que contiene Fe glicosilado es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal terapéutico. La proteasa, la actividad de clivaje a la cual se resiste, se selecciona del grupo que consiste en pepsina, plasmina, tripsina, quimotripsina, una metaloproteinasa de la matriz, una serina endopeptidasa y una cisteína proteasa que se derivan del huésped o un patógeno que puede ser un parásito, bacteria o un virus. En una modalidad específica, la proteasa es una metaloproteinasa de la matriz seleccionada del grupo que consiste en gelatinasa A (MMP2), gelatinasa B (MMP-9), metaloproteinasa de la matriz 7 (MMP-7), estromelisina (MMP-3) y elastasa del macrófago (MMP-12). Las modificaciones pueden introducirse en las secuencias de anticuerpos. Las construcciones modificadas descritas muestran mayor resistencia a las proteasas fisiológicamente relevantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de variantes de bisagra y dominios Fe basadas en la lgG4 y donde el número se basa en el número de Kabat del anticuerpo EL). La secuencia que se muestra comienza con la bisagra núcleo (residuo 227) y termina con el C-terminal del dominio Fe (residuo 447) lo que indica que la CNTO 5303 y la CNTO 7363 difieren de la CNTO 530 y la CNTO 736, respectivamente, por tener una Asn (N) en la posición 359 en lugar de una Thr, y una Thr (T) en la posición 361 en lugar de una Asn, lo que resulta en la creación del motivo de glicosilación y hace que la proteína esté glicosilada en la Asn359. Las variantes CNTO 5304 y CNTO 7364 difieren de la CNTO 5303 y la CNTO 7363 por tener la Thr en la posición 299 sustituida por Asn, y eliminar así el motivo y la glicosilación en la Asn297. La secuencia NEM 3052, al cambiar los aminoácidos en las posiciones 419 y 421 , resulta en el motivo de glicosilación y glicosilación en la posición 419. Otro sitio que se muestra para una creación de la posición de motivos de glicosilación está entre 382 y 384 que se muestra en la figura como ("variante posible"). Los puntos indican que el aminoácido es el mismo que en la secuencia silvestre.

La Figura 2 muestra la estructura de un residuo 359 del fragmento Fe, un sitio de nueva glicosilación, resaltado en ambas cadenas pesadas.

La Figura 3 muestra la CNTO 530 y sus variantes fraccionadas a través de un gel de SDS-PAGE (no reducido) La Figura 4 muestra un análisis basado en AlphaScreen de lo bien que las dos variantes de la construcción MIMETIBODY™ compiten con un mAb biotinilado por la unión al FcRn humano.

Las Figuras 5A - 5F muestran los datos obtenidos para MALDI-TOF-MS al trazar la velocidad de desaparición de las construcciones de Fe intactas tras la incubación con la MMP-3 humana o la elastasa de neutrófilos humana (NE) en el tiempo (Figuras 5A-5D), la CNTO 5303 a la CNTO 530 y comparación de la CNTO 7363 a la CNTO 736, cuando se incubaron con la MMP-3 o la NE. (Figuras 5E, 5F) todas las muestras que incluyen la CNTO 5304 y la CNTO 7364 cuando se incubaron con las dos proteasas.

La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de variantes de bisagra y dominios Fe basadas en la lgG1 como en la Figura 1.

La Figura 7 es un gráfico que representa la persistencia en suero de la CNTO530 vs. la CNTO5303 en la sangre de los ratones inyectados con ambas moléculas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Abreviaturas AA = ácido antranílico; crt .3 GT = a-1 ,3-galactosiltransferasa¡ ARD = distrés respiratorio agudo; ß1.4 GT = 3-1 ,4-galactosiltransferasa; a2.3 ST = a-2,3-sialiltransferasa; ADCC = citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo; CDC = citotoxicidad dependiente de complemento; CMP-Sia = ácido /V-acetilneuramínico citidina monofosfato; FBS = suero fetal bovino, IgG = inmunoglobulina G, MALDI-TOF-MS = espectrometría de masas mediante ionización/desorción por láser asistida por matriz y asociada a un analizador de tiempo de vuelo; NANA = ácido /V-acetilneuramínico isómero del ácido siálico; NGNA = ácido A/-glicolilneuramínico isómero del ácido siálico; OA = osteoartritis; PNGasa F = péptido /V-glicosidasa F, HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa, RA = artritis reumatoide; SA = ácido sinápico; Sia = ácido siálico; SDHB = ácido dihidroxibenzoico que contiene cloruro de sodio; UDP-Gal = uridina difosfato galactosa, UDP-GIcNAc = uridina difosfato /V-acetilglucosamina.

Definiciones v Explicación de la terminología Los términos "Fe", "proteína que contiene Fe" o "molécula que contiene Fe", como se usan en la presente descripción, se refieren a una proteína monomérica, dimérica o heterodimérica que tiene al menos un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulina. Los dominios CH2 y CH3 pueden formar al menos una parte de la región dimérica de la proteína/molécula (por ejemplo, anticuerpo).

El término "anticuerpo" pretende abarcar los anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones específicas y variantes de estas, que incluyen, sin limitarse a, miméticos del anticuerpo o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o porción de estos, que incluyen, sin limitarse a, minicuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio sencillo, minicuerpos y fragmentos de estos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión al antígeno que se unen al antígeno objetivo de interés. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a un antígeno objetivo o porciones de este, que incluyen, pero sin limitarse a, fragmentos Fab (por ejemplo, por digestión de papaína), Fab' (por ejemplo, por digestión y reducción parcial de pepsina) y F(ab')2 (por ejemplo, por digestión de pepsina), facb (por ejemplo, por digestión de plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión de pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión de pepsina, reducción parcial y reagrupación), Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular), son abarcados por el término anticuerpo (ver, por ejemplo, Colligan, Immunology, supra).

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente descripción, es una forma específica de la proteína de fusión que contiene Fe que comprende al menos un dominio de unión al ligando el cual mantiene homología sustancial con al menos uno de un dominio variable del anticuerpo de cadena ligera o pesada de al menos una especie de anticuerpo animal. Información general La presente invención se motivó por un interés en identificar un nuevo sitio de PEGilación en un dominio Fe. Como se conocen técnicas para la conjugación de restos de PEG a los glicanos de las proteínas, los cuales proporcionan un sitio específico para dirigir la modificación, se intentó el uso de los glicanos naturales en la Asn297, sin embargo, debido a la estructura terciaria y cuaternaria de la estructura dimérica del Fe, los glicanos del Fe nativo demostraron ser insuficientemente accesibles para permitir las conjugaciones de estructuras PEG grandes.

Por lo tanto, las posiciones en el dominio Fe se consideraron donde un sitio de glicosilación ligado a N alternativo o adicional pudiera introducirse por ingeniería en la secuencia motivo Asn-Xxx-Ser/Thr, conocido como un sitio de reconocimiento para las glicosiltransferasas en el retículo endoplásmico de las células eucariotas. Al hacer tales variantes de glicano para dos construcciones diferentes que comprenden Fe, la CNTO 530 (la construcción EPO MIMETIBODY™) y la CNTO 736 (la construcción GLP-1 MIMETIBODY™), se observó que las variantes de glicano no PEGilado inesperadamente mostraron una resistencia significativamente aumentada a las enzimas proteolíticas.

El cuerpo produce proteasas de manera natural para la digestión y la remodelación de las proteínas, a lo que se someten, además, las proteínas terapéuticas. En estados de enfermedad no inducida por patógenos, tales como la RA y otras enfermedades inflamatorias y cáncer, se conoce bien que un cierto espectro de enzimas proteolíticas están elevadas. Se conoce además que las proteasas humanas se asocian con las enfermedades inflamatorias, proliferativas, metastásicas e infecciosas. Las inmunoglobulinas circulantes y, específicamente, aquellos anticuerpos de la clase IgG, son proteínas séricas principales. Se aprecia que las proteasas humanas, metaloproteinasas de la matriz (MMP) y la elastasa de neutrófilos, cortan el polipéptido de cadena pesada de IgG en un residuo único para cada proteasa similar a las proteasas bacterianas, tales como la glutamil endopeptidasa (Staph. aureus) o la enzima degradante de inmunoglobulina del estreptococo (Strep. pyogenes). Los sitios de clivaje en la cadena pesada se agrupan alrededor de la región denominada dominio de bisagra, en donde se produce el enlace disulfuro entre cadenas de las dos cadenas pesadas. La región debajo de la bisagra constituye la región Fe y comprende sitios de unión responsables de las funciones efectoras de la IgG. En el caso de los microorganismos, la expresión de proteasas es una vía de virulencia complementaria por la cual los organismos pueden evitar la opsonización (Rooijakkers y otros, Microbes and Infection (Microbios e infección) 7: 476- 484, 2005), en tanto que la liberación proteolítica del dominio Fe por clivaje debajo de la bisagra neutralice efectivamente las funciones que de cualquier otra forma conducirían a la identificación y eliminación de esa célula patológica. Por lo tanto, la elaboración de proteasas específicas puede ser representativa de una gran cantidad de trastornos que incluyen cáncer, inflamación y enfermedades infecciosas. Esa degradación de IgG mejorada en medios patológicos in vivo se evidencia, adicionalmente, por la presencia de autoanticuerpos de IgG naturales que se unen al dominio bisagra cortado (Knight y otros, 1995, Nasu y otros, 1980, Persselin y Stevens, 1985, Terness, y otros 1995 J Imunol. 154:6446-6452). Así, el aumento de la resistencia a las proteasas fisiológicamente-relevantes puede resultar en una vida media in vivo prolongada para las moléculas terapéuticas que contienen Fe, particularmente en medios ricos en proteasa, que pudieran mejorar la eficacia y/o permitir dosificaciones menos frecuentes.

Una solicitud de patente de propiedad conjunta núm.

WO2009/023457 describe proteasas capaces de degradar la IgG y las cuales se asocian con enfermedades o estados patológicos, tales como cáncer, inflamación, e infección. La información se resume en la Tabla 1 (que se reproduce más abajo), en la cual las "proteinasas de coagulación" incluyen F.XIIa, FlXa, F.Xa, trombina y proteína C activada; la plasmina era plasminógeno coincubado con activadores de plasminógenos; tPA, estreptoquinasa y estafiloquinasa; los "activadores de plasminógenos solos" son sin plasminógeno; y las MMP eran las proteinasas recombinantes obtenidas como la forma activa o la proenzima; y "Nada" indica que no se detectó clivaje en 24 horas. Excepto donde se indique, todas las enzimas eran humanas. Las designaciones del residuo son por el sistema de numeración EU para la cadena pesada completa del anticuerpo lgG1 maduro.

Tabla 1 (1 ) Barrett A. J., Rawlings N. D. and Woessner J. f.(Eds.), Handbook of Proteolytic Enzymes Vol. 1 , Elsevier, Amsterdam, 2004. (2) Barrett A. J., Rawlings N. D. and Woessner J. f.(Eds.), Handbook of Proteolytic Enzymes Vol. 2, Elsevier, Amsterdam, 2004. (3) Powers, JC, "Proteolytic Enzymes and Disease Treatment" 1982. En: Feeney y Whitaker (eds). Modification of Proteins: Food, Nutritional, and Pharmacological Aspects. Advances in Chemistry Series 198. ACS, Washington, D.C. 1982 pág. 347-367. (4) Tchetverikov I., Ronday H. K., van El B., Kiers G. H., Verzijl N., TeKoppele J. ., Huizinga T.

W. J., DeGroot J. y Hannemaaijer R., 2004. MMP Profile in paired serum and synovial fluid samples of patients with rheumatoid arthritis. Ann.Rheum.Dis. 63, 881 -883. (5) Vincents B., von Pawel-Rammingen U., Bjórck L. y Abrahamson M., 2004. La caracterización enzimática de la endopeptidasa estreptocócica, IdeS, revela que es una cisteína proteasa con una especificidad estricta para el clivaje de IgG debido a la unión a un exositio. Biochemistry 43, 15540- 15549. (6) Sun H., Ringdahl U., Homeister J.W., Fay W.P., Engleberg N.C., Yang A.Y., Rozek L.S., Wang X., Sjobring U. , Ginsburg D., 2004. El plasminógeno es un factor de patogenicidad del huésped crítico para la infección estreptocócica del grupo A. Science. 305, 1283-1286.

Funciones de los oligosacáridos Los oligosacáridos específicos están presentes en las proteínas secretadas como un resultado de la glicosilación que tiene lugar en el retículo endoplásmico de las células eucariotas como el procesamiento normal de las proteínas designado por secuencias señal para la exportación desde la célula. La composición de los oligosacáridos adjuntos a la proteína se afecta por factores tales como la naturaleza de la proteína, la especie de origen de la célula, las condiciones de cultivo y el medio extracelular. La naturaleza del "glicoma" de una especie a otra o incluso de individuo a individuo se reconoce desde hace tiempo como la fuente de epítopos antigénicos, por ejemplo, los grupos sanguíneos humanos. Así, la glicosilación de proteínas de superficie representa un método para alterar el reconocimiento de las proteínas al dirigir a receptores específicos o no específicos las estructuras de glicano particulares o sacáridos terminales. Los oligosacáridos o ligandos para los receptores de mamíferos similares a las lectinas, tales como las selectinas, por ejemplo, proteínas de unión de mañosa, selectina L y selectina P.

Los glicanos normalmente adjuntos a la Asn 297 del dominio CH2 en moléculas IgG de mamíferos actúan para proporcionar la estructura terciaria del Fe, dos cadenas de polipéptidos unidos covalentemente en la región bisagra sobre el dominio CH2 y por asociación no covalente de los dos dominios CH3. La IgG aglicosilada no se une a los receptores Fe o no muestra las funciones efectoras de ADCC o CDC o no se une al complemento C1q. Estudios recientes (Kaneko, 2006 Science 313: 670-673; Shields y otros, 2002 J Biol Chem. 277:30 26733-26740) demostraron que el contenido de glicano unido a la Asn297 puede afectar además la afinidad de unión de las moléculas de IgG a los receptores Fe (gamma).

Una preparación de globlulina gamma humana, conocida como IVIG, se usó mucho tiempo como un tratamiento antiinflamatorio general. Los estudios recientes en un modelo murino de artritis inducida por el suero donde el tratamiento con altas dosis de IVIG humana suprime la artritis, demostraron que la desialilación enzimática anterior de la IVIG suprimió su beneficio terapéutico, mientras que el enriquecimiento de la fracción sialilada de IVIG mejoró su beneficio antiinflamatorio (Kaneko, 2006 Science 313: 670-673).

Se conoce desde hace mucho tiempo que la propiedad antiinflamatoria se determina por la porción Fe de la IVIG. Los trabajos posteriores demostraron que la fracción de moléculas de la IVIG principalmente responsable de suprimir la inflamación de las articulaciones en un modelo murino de artritis son aquellas con el ácido siálico de Fe en un enlace a2.6 con la galactosa a diferencia de aquellas con ácido siálico en enlace o:2, 3 (Anthony y otros, (2008) Science 320:373). La lectina de ratón SIGN-R1 expresada en la superficie de los macrófagos esplénicos es un receptor para fragmentos Fe sialilados a2.6 como es la lectina humana, la DC-SIGN expresada en las células dendríticas humanas (Anthony, y otros, Proc Nati Acad Sci Estados Unidos, 16 de diciembre de 2008, 105 (50): 19571 -8).

Así, al usar las composiciones de proteínas de la presente invención, las composiciones de proteínas que tienen estructuras, terminales, o contenido de oligosacárido específicos pueden sintetizarse a través de la manipulación de la célula huésped y la glicoingeniería, o prepararse por pre o post-procesamiento de purificación de la proteína, tal como la fracción por medio del uso de cromatografía de afinidad con lectina o tratamientos enzimáticos o combinaciones de varios métodos. Tales métodos son de conocimiento de aquellos con experiencia en la materia tal como se enseñan en la presente descripción o se desarrollan o pueden desarrollarse por medio del uso de métodos conocidos en ingeniería genética, enzimología, fraccionamiento de proteína, y similares. Estas preparaciones pueden usarse para dirigirlas a los receptores específicos cuando ellos se encuentran en los tipos de células, tejidos u órganos seleccionados.

La glicosilación o hiperglicosilación de las proteínas aumenta el volumen hidratado de una proteína y puede añadir carga negativa debido a la presencia de residuos de ácido siálico. Estas alteraciones dan proteínas menos sujetas al aclaramiento por la filtración renal. Así, adicionalmente a la unión al FcRn como un medio por el cual el fragmento Fe aumenta la vida media de la proteína en la circulación, la circunferencia aumentada de la proteína producirá un efecto añadido, siempre que la glicosilación adicional no reduzca la unión al FcRn.

Método de preparar moléculas que contienen Fe alterado Los sitios de glicosilación adicionales se seleccionaron basados en el deseo de añadir glicanos ligados a Asn sin afectar la estructura o la función del Fe. La estructura del Fe de lgG4 (1adq) (Corper y otros (1997) Nat Struct Biol. 4: 374) se analizó para identificar los sitios potenciales de modificación. Las regiones de lazo del dominio CH3 distante del sitio de unión al FcR (gamma) en la bisagra inferior y distante del sitio de unión del FcRn en la región de unión de CH2-CH3 fueron los objetivos. Los lazos 359-TKNQVS-364, 382-ESNGQP-387, y 419-EGNVFS-424 contienen residuos que parecen ser susceptibles de modificación. Dentro de estos lazos, los residuos 359, 382 y 419 se identificaron como sitios atractivos para introducir la glicosilación basado en que la superficie esté expuesta y basado en las predicciones de que una sustitución de Asn con la glicosilación resultante sería estructuralmente compatible. Después, se creó computacionalmente un número de motivos de secuencia de N-glicosilación (N X S/T) para estas posiciones y se estimó su potencial de glicosilación al presentar las secuencias al servidor NetNGIyc (www.cbs.dtu.dk/services/NetNGIyc). Los motivos con una puntuación de 0.5 o inferior se eliminaron. Los motivos elegidos para su introducción en las moléculas de prueba fueron 359NKT y 419NGT (Figura 1). El sitio 382 no se siguió porque se consideró que el nuevo glicano podía apuntar en una dirección que podía interferir con la unión al FcRn. Sin embargo, es posible que la introducción de un sitio de glicosilación en el residuo 382 hubiera producido un dominio Fe completamente funcional. Modificación enzimática de las proteínas que contienen Fe Un método para preparar una proteína que contiene Fe con estructura de glicano específica o el contenido de oligosacárido especificado es tratar la preparación de proteína que contiene Fe con una sacarasa, tal como una enzima fucosidasa o sialidasa, y de este modo eliminar los residuos específicos de azúcar, por ejemplo, ácido siálico o fucosa. La adición de sacáridos a la región Fe puede lograrse además por medio del uso de los métodos de glicosilación in vitro.

Las glicosiltransferasas funcionan de manera natural para sintetizar los oligosacáridos. Estas producen productos específicos con excelente geometría estereoquímica y regioquímica. La transferencia de los residuos glicosilo resulta en la elongación o síntesis de un oligo- o polisacárido. Se ha descrito un número de tipos de glicosiltransferasa, que incluyen sialiltransferasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, mannosiltransferasas, N-acetilgalactosaminiltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas y similares. Las glicosiltransferasas que son útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, a-sialiltransferasas, a-glucosiltransferasas, a-galactosiltransferasas, a-fucosil-transferasas, a-mannosiltransferasas, a-xilosiltransferasas, a-N-acetilhexosaminiltransferasas, ß-sialiltransferasas, ß-glucosiltransferasas, ß-galactosiltransferasas, ß-fucosiltransferasas, ß-mannosiltransferasas, ß-xilosiltransferasas, y ß-?-acetilhexosaminiltransferasas, tales como aquellas de Neisseria meningitidis, u otras fuentes bacterianas, y aquellas de rata, ratón, conejo, vaca, cerdo, humano e insecto y fuentes virales. Preferentemente, la glicosiltransferasa es una variante truncada de la enzima glicosiltransferasa en la cual se elimina el dominio de unión a la membrana. Las galactosiltransferasas ilustrativas incluyen a(1.3) galactosiltransferasa (E.C. núm. 2.4.1.151 , ver, por ejemplo, Dabkowski y otros, Transplant Proc. 25:2921 (1993) y Yamamoto y otros Nature 345:229-233 (1990)) y a(1.4) galactosiltransferasa (E.C. núm. 2.4.1.38). Pueden usarse otras glicosiltransferasas, tal como una sialiltransferasa.

Una a(2.3) sialiltransferasa, a menudo referida como la sialiltransferasa, se puede usar en la producción de sialil lactosa o estructuras de orden superior. Esta enzima transfiere ácido siálico (NeuAc) desde el CMP-ácido siálico a un residuo Gal con la formación de un enlace a entre los dos sacáridos. La unión (enlace) entre los sacáridos está entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de Gal. Una a(2.3) sialiltransferasa ilustrativa que se refiere como a (2.3) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) transfiere el ácido siálico a la Gal terminal no reductora de un disacárido o glicósido Ga^1? 3Glc. Ver, Van den Eijnden y otros, J. Biol. Chem., 256:3159 (1981), Weinstein y otros, J. Biol.

Chem., 257:13845 (1982) y Wen y otros, J. Biol. Chem., 267: 21011 (1992) Otra a-2, 3 - siallltransferasa ilustrativa (EC 2.4.99.4) transfiere el ácido siálico a la Gal terminal no reductora del disacárido o glicósido. Ver, Rearick y otros, J. Biol. Chem., 254:4444 (1979) y Gillespie y otros, J. Biol. Chem., 267: 21004 (1992). Otras enzimas ilustrativas incluyen Gal- -1.4- GIcNAc a-2.6 siallltransferasa (Ver, Kurosawa y otros. Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)).

Otras glucosiltransferasas particularmente útiles en la preparación de los oligosacáridos de la invención son las mannosiltransferasas que incluyen la a(1.2) mannosiltransferasa, a(1.3) mannosiltransferasa, ß(1.4) mannosiltransferasa, Dol-P-Man sintasa, OCh1 y Pmt1. Todavía otras glucosiltransferasas incluyen N-acetilgalactosaminiltransferasas que incluyen la a(1.3) N-acetilgalactosaminiltransferasa, ß(1.4) N-acetilgalactosaminiltransferasas (Nagata y otros J. Biol. Chem. 267:12082-12089 (1992) y Smith y otros J. Biol Chem. 269:15162 (1994)) y polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa (Homa y otros J. Biol Chem. 268:12609 (1993)). Las N-acetilglucosaminiltransferasas adecuadas incluyen GnTI (2.4.1.101, Hull y otros, BBRC 176:608 (1991)), GnTII, y GnTIII (Ihara y otros J. Biolchem. 113:692 (1993)), GnTV (Shoreiban y otros J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)).

Para aquellas modalidades en las que el método tiene que practicarse en una escala comercial, puede ser ventajoso inmovilizar la glicosil-transferasa sobre un soporte. Esta inmovilización facilita la eliminación de la enzima a partir del lote de producto y posterior reutilización de la enzima. La inmovilización de las glicosil transferasas puede lograrse, por ejemplo, al eliminar de la transferasa su dominio de unión a la membrana y fijar en su lugar un dominio de unión a la celulosa. Alguien con experiencia en la materia entenderá que otros métodos de inmovilización también podrían usarse y se describen en la bibliografía disponible. Debido a que los sustratos aceptores pueden ser esencialmente cualquier monosacárido u oligosacárido que tenga un residuo sacárido terminal para el cual la glicosil transferasa particular muestra especificidad, el sustrato puede sustituirse en la posición de su extremo no reductor. Así, el aceptor de glicósido puede ser un monosacárido, un oligosacárido, un sacárido marcado con fluorescencia, o un derivado de sacárido, tal como un antibiótico aminoglicósido, un gangliósido, o una glicoproteína que incluye anticuerpos y otras proteínas que contienen Fe. En un grupo de modalidades preferidas, el aceptor de glicósido es un oligosacárido, preferentemente, Gal3(1-3)GlcNAc, Gai (1-4)GlcNAc, Gal (1-3)GalNAc, Gaip(1-4)GalNAc, Man a(1.3)Man, Man a(1.6)Man, o GalNAcP(1-4)-manosa. En una modalidad particular preferida, el aceptor de oligosacárido está unido al dominio CH2 de una proteína que contiene Fe.

El uso del sustrato azúcar activado, es decir, el fosfato nucleósido-azúcar se puede evitar, ya sea al usar una reacción de regeneración simultáneamente con la reacción de la glicotransferasa (que se conoce además como un sistema de reciclado). Por ejemplo, como se enseña en la patente de los EE. UU. núm. 6,030,815, un sistema de reciclado CMP- ácido siálico usa CMP- ácido siálico sintetasa para reponer el CMP-ácido siálico (CMP-NeuAc) ya que éste reacciona con un aceptor sialiltransferasa en presencia de una a(2.3) sialiltransferasa para formar el sialil-sacárido. El sistema de regeneración CMP-ácido siálico útil en la invención comprende monofosfato de citidina (CMP), un trifosfato de nucleósido (por ejemplo, trifosfato de adenosina (ATP), un donador de fosfato (por ejemplo, fosfoenolpiruvato o fosfato de acetilo), una quinasa (por ejemplo, piruvato quinasa o acetato quinasa) capaz de transferir fosfato del donador de fosfato a los difosfatos de nucleósido y una monofosfato de nucleósido quinasa (por ejemplo, miocinasa) capaz de transferir el fosfato terminal de un trifosfato de nucleósido a CMP. La a(2.3) sialiltransferasa y la CMP- ácido siálico sintetasa pueden considerarse además como parte del sistema regenerador de CMP- ácido siálico ya que como elimina el ácido siálico activado sirve para mantener la velocidad de avance de la síntesis. La síntesis y el uso de compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación que usa un fagémido que comprende un gen para una enzima sintetasa de CMP- ácido siálico modificada se describen en la solicitud internacional núm. WO 92/16640, publicada el 01 de octubre de 1992.

Un método alternativo de preparación de oligosacáridos es a través del uso de una glicosiltransferasa y derivados glicosilo activados como donantes de azúcares, lo que obvia la necesidad de nucleótidos con azúcar como donantes de azúcares como enseña la patente de los EE. UU. núm. 5,952,203. Los derivados glicosilo activados actúan como alternativa a los sustratos de origen natural, los cuales son nucleótidos con azúcares caros, generalmente nucleótidos difosfo-azúcar o nucleótidos monofosfo-azúcar en el que el fosfato del nucleótido está a-enlazado a la posición 1 del azúcar.

Los derivados de glicósido activados que son útiles incluyen un grupo saliente activado, tal como, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo, éster osilato, éster mesilato, éster triflato y similares. Las modalidades preferidas de derivados de glicósido activados incluyen fluoruros de glicosilo y mesilatos de glicosilo, los fluoruros de glicosilo son particularmente preferidos. Entre los fluoruros de glicosilo, los fluoruro de a-galactosilo, fluoruro de a-mannosilo, fluoruro de a-glucosilo, fluoruro de a- fucosilo, fluoruro de a-xilosilo, fluoruro de a-sialilo, fluoruro de alfa-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de a-N-acetilgalactosaminilo, fluoruro de ß-galactosilo, fluoruro de ß-mannosilo, fluoruro de ß-glucosilo, fluoruro de ß-fucosilo, fluoruro de ß-xilosilo, fluoruro de beta-sialilo, fluoruro de ß-?-acetilglucosaminilo y fluoruro de ß-?-acetilgalactosaminilo son los más preferidos.

Los fluoruros de glicosilo pueden prepararse a partir del azúcar libre primero al someter a acetilación el azúcar y después tratarlo con HF/piridina. Los fluoruros de glicosilo acetilados pueden desprotegerse al reaccionar con la base suave (catalítica) en metanol (por ejemplo, NaOMe/MeOH). Adicionalmente, muchos fluoruros de glicosilo están disponibles comercialmente. Otros derivados de glicosilo activados pueden prepararse por medio del uso de métodos convencionales conocidos por aquellos con experiencia en la materia. Por ejemplo, los mesilatos de glicosilo pueden prepararse por tratamiento de la forma hemiacetal del azúcar completamente bencilada con cloruro de mesilo, seguido por la hidrogenación catalítica para eliminar los grupos bencilo.

Un componente adicional de la reacción es una cantidad catalítica de un fosfato nucieósido o análogo de este. Los monofosfatos de nucieósido que son adecuados para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, monofosfato de adenosina (AMP), monofosfato de citidina (CMP), monofosfato de uridina (UMP), monofosfato de guanosina (GMP), monofosfato de inosina (IMP) y monofosfato de timidina (TMP). Los trifosfatos de nucieósido adecuados para usar de acuerdo con la presente invención incluyen trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de uridina (UTP), trifosfato de guanosina (GTP), trifosfato de inosina (ITP) y trifosfato de timidina (TTP). Un trifosfato de nucieósido preferido es UTP. Preferentemente, el fosfato de nucieósido es un difosfato de nucieósido, por ejemplo, difosfato de adenosina (ADP), difosfato de citidina (CDP), difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP), difosfato de inosina (IDP) y difosfato de timidina (TDP). Un difosfato de nucieósido preferido es UDP. Como se señaló anteriormente, la presente invención puede practicarse, además, con un análogo de los fosfatos de nucieósido. Los análogos adecuados incluyen, por ejemplo, sulfatos y sulfonatos de nucieósido. Aún otros análogos incluyen fosfatos simples, por ejemplo, pirofosfato.

Un procedimiento para modificar proteínas recombinantes producidas en, por ejemplo, células murinas donde predomina la forma hidroxilada del ácido siálico (NGNA), consiste en tratar la proteína con sialidasa, para eliminar el ácido siálico de tipo NGNA, seguido por la galactosilación enzimática por medio del uso del reactivo UDP- Gal y la beta 1.4 Gal transferasa para producir glicoformas G2 altamente homogéneas. La preparación puede tratarse después, opcionalmente, con el reactivo CMP-NANA y la alfa 2-,3 sialiltransferasa para dar glicoformas G2S2 altamente homogéneas.

Para los propósitos de esta invención, sustancialmente homogéneo para una glicoforma significará aproximadamente 85 % o más de esa glicoforma y, preferentemente aproximadamente 95 % o más de esa glicoforma.

Proteasas y sensibilidad de los anticuerpos a las proteasas La pepsina se auto-activa y se activa a pH bajo, ya que es un componente normal del fluido gástrico secretado en el lumen del estómago después de comer. En el suero pueden encontrarse bajos niveles del precursor de la enzima pepsinógeno, pero, ya que la activación y la actividad son dependientes de ácido, no es fisiológicamente relevante para los anticuerpos circulantes. La pepsina diva la lgG1 humana entre la Ieucina234-Ieucina235 en la bisagra inferior. Este sitio de escisión está corriente abajo de la bisagra central (-C-P-P-C-) que contiene dos residuos de cisteína que unen las dos cadenas pesadas a través de enlaces disulfuro y se crea una molécula F(ab ')2 la cual es bivalente para la unión del antígeno.

La bisagra inferior y el comienzo de la región CH2, P-A-P-E- F/L-L-G-G-P-S-V-F (residuos 5-16 de la SEQ ID NO: 1 y 2) comprende sitios de clivaje para las metaloproteinasas de la matriz, MMP-3 y MMP-12. La pepsina y la MMP-7 clivan, además, en esta región (P-A-P-E-L*L-G).

Además, un grupo de enzimas fisiológicamente relevantes, elastasa de neutrófilos (HNE), estromelisina (MMP-3) y elastasa del macrófago (MMP-12) clivan la IgG en varias posiciones para generar los fragmentos F(ab')2, Fab y Fe ligeramente diferentes (ver Tabla 1).

Caracterización biológica de variantes de glicoformas Las proteínas que contienen Fe pueden compararse para la funcionalidad por muchos ensayos in vitro que se conocen bien. En particular, la afinidad por los miembros de la familia FcyRI, FcyRIl, y FcyRIII de los receptores Fcy es de interés. Estas mediciones pueden realizarse por medio del uso de formas solubles recombinantes de los receptores o las formas asociadas a las células de los receptores. Adicionalmente, la afinidad por FcRn, el receptor responsable de la vida media en la circulación prolongada de las IgG, puede medirse, por ejemplo, por BIAcore por medio del uso del FcRn soluble recombinante. Los ensayos funcionales basados en células, tales como los ensayos ADCC y los ensayos CDC, proporcionan una percepción de las probables consecuencias funcionales de las estructuras de la variante particular. En una modalidad, el ensayo ADCC se configura para tener células NK que sean las células efectoras primarias, y así reflejar los efectos funcionales en el receptor FcyRI NA. Los ensayos de fagocitosis pueden usarse, además, para comparar las funciones inmunoefectoras de diferentes variantes, ya que los ensayos pueden medir esas respuestas celulares, tales como la liberación del mediador inflamatorio o superóxido. Además, pueden usarse los modelos in vivo, cuando, por ejemplo, en el caso de usar variantes de anticuerpos anti-CD3 para medir la activación de la célula T en ratones, una actividad que depende de los dominios Fe se acopla a ligandos específicos tal como los receptores Fcy.

Procesos de producción de proteínas Diferentes procesos involucrados con la producción de proteínas que contienen Fe pueden impactar la estructura del oligosacárido Fe. En un caso, las células huésped que segregan la proteína que contiene Fe se cultivan en presencia de suero, por ejemplo, suero fetal bovino (FBS) que no se sometió previamente a un tratamiento con calor elevado (por ejemplo, 56 °C durante 30 minutos). Esto resulta en una proteína que contiene Fe que no contiene o contiene muy poca cantidad de ácido siálico, debido a la presencia natural en el suero de enzimas sialidasas activas que pueden eliminar el ácido siálico de las proteínas que contienen Fe secretadas por esas células. En otra modalidad, las células secretoras de la proteína que contiene Fe se cultivan en presencia de suero que se sometió a un tratamiento de calor elevado, con lo que se desactivan las enzimas sialidasas, o en ausencia de suero u otros componentes de medio que pueden contener enzimas sialidasas, de forma que la proteína que contiene Fe tiene niveles de glicosilación superiores o inferiores o variantes de glicosilación.

En otra modalidad, se establecen las condiciones usadas para purificar y para otros procesos de las proteínas que contienen Fe que favorecerán el contenido óptimo de glicanos. En una modalidad, las condiciones producen el contenido mínimo o máximo de oligosacárido o causan la transformación del polipéptido que contiene Fe expresado en una glicoforma predominante. Por ejemplo, debido a que el ácido siálico es ácido lábil, la exposición prolongada en un medio con pH bajo tal como la elución resultante de la columna cromatográfica de proteína A o los intentos de desactivación viral, puede resultar en la reducción del contenido de ácido siálico. En otra modalidad, el material glicosilado se somete a una cromatografía con un material de soporte de lectina inmovilizada que se unirá selectivamente o retrasará el paso de las proteínas que exhiben sacáridos específicos o complejos de oligosacáridos. En el caso de la variante de la columna inmovilizada, la fracción de flujo continuo no unida (T, continuo) o la fracción de columna no unida puede separarse de la fracción unida (B, unida), la última se recoge mientras pasa el amortiguador de elución a través de la columna. Es posible, además, recoger por separado una fracción débilmente unida o la fracción de la columna retrasada (R, retrasado), por ejemplo, recoger la proteína que contiene Fe eluida durante el lavado continuo de la columna con el amortiguador de muestra original. Los ejemplos de lectinas que pueden enriquecer las proteínas sialiladas o asialiladas que contienen Fe son las lectinas de Maackia amurensis (MAA), las cuales se unen específicamente a los oligosacáridos con ácido siálico terminal, y la lectina aglutinina de germen de trigo (WGA), la cual se une específicamente a los oligosacáridos con ácido siálico terminal, o con N-acetilglucosamina terminal (GIcNAc). Otro ejemplo es la lectina Ricina I (RCA), que se une a oligosacáridos con galactosa terminal. En el último ejemplo, la fracción de flujo continuo no unido puede enriquecerse para moléculas sialiladas que contienen Fe. Otras lectinas conocidas en la materia incluyen aquellas proporcionadas por Vector labs y EY labs.

Selección de la célula huésped o modificación de la célula huésped Como se describe en la presente descripción, la célula huésped escogida para la expresión del anticuerpo monoclonal o proteína que contiene Fe recombinante es un contribuyente importante para la composición final, que incluye, sin limitarse a, la variación en la composición de las porciones de oligosacárido que decoran la proteína en el dominio CH2 de la inmunoglobulina. Así, un aspecto de la invención involucra la selección de células huéspedes adecuadas para el uso y/o desarrollo de una célula de producción que expresa la proteína terapéutica deseada.

En una modalidad en la cual se disminuye el contenido de ácido siálico del anticuerpo o la fusión Fe, la célula huésped es una célula naturalmente deficiente o desprovista de sialiltransferasas. En otra modalidad, la célula huésped se modifica genéticamente para estar desprovista de sialiltransferasas. En una modalidad adicional, la célula huésped se deriva de una línea celular huésped seleccionada para expresar niveles de sialiltransferasas reducidos o indetectables. En aún otra modalidad, la célula huésped está naturalmente desprovista, o se modifica genéticamente para estar desprovista de CMP-siálico sintetasa, enzima que cataliza la formación de CMP-ácido siálico, el cual es la fuente de ácido siálico usado por la sialiltransferasa para transferir el ácido siálico al anticuerpo. En una modalidad relacionada, la célula huésped puede estar naturalmente desprovista, o se modifica genéticamente para estar desprovista de la ácido pirúvico sintetasa, enzima que forma ácido siálico de ácido pirúvico.

En una modalidad adicional, la célula huésped puede estar naturalmente desprovista, o se modifica genéticamente para estar desprovista de galactosiltransferasas, de manera que los anticuerpos expresados en dichas células carecen de galactosa. Sin galactosa, el ácido siálico no se unirá. En una modalidad distinta, la célula huésped puede sobreexpresarse naturalmente, o modificarse genéticamente para sobreexpresar una enzima sialidasa que elimina el ácido siálico de los anticuerpos durante la producción. Tal enzima sialidasa puede actuar intracelularmente sobre los anticuerpos antes de que sean secretados o se secreten en el medio de cultivo y actúa en los anticuerpos que ya han sido secretados en el medio y puede contener además una galactasa. Se han descrito métodos para seleccionar líneas celulares con las glicosilasas alteradas y que expresan glicoproteínas con la composición alterada de carbohidratos (Ripka y Stanley, 1986. Somatic Cell Mol Gen 12:51-62; patente de los EE. UU. núm. US2004/0132140). Se han enseñado métodos para modificar las células huésped para producir anticuerpos con el patrón de glicosilación alterado que resultan en CCDA aumentada, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. núm. 6,602,864, en donde las células huésped alojan un ácido nucleico que codifica al menos una glicosil transferasa que modifica la glicoproteína, específicamente la ß (1.4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII).

Otros enfoques para modificar genéticamente las propiedades de glicosilación de una célula huésped a través de la manipulación de la glicosiltransferasa de la célula huésped incluye eliminar o suprimir la actividad, específicamente de la alfa 1.6 fucosiltransferasa (producto del gen FUT8), como se enseña en la patente núm. EP1 ,176,195. Un experto en la materia conoce cómo practicar los métodos para modificar las células huésped de otra manera distinta a los ejemplos citados anteriormente. Además, la célula huésped modificada puede ser de origen mamífero o puede seleccionarse de células COS-1 , COS-7, HEK293, BHK21 , CHO, BSC-1 , Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, linfoma, levadura, insecto o planta, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de éstas.

En otra modalidad, el método de suprimir o eliminar la actividad de la enzima requerida para la unión del oligosacárido se selecciona del grupo que consiste en silenciamiento génico como, por ejemplo, el uso de ARNip, desactivación genética, o adición de un inhibidor enzimático, tal como por la coexpresión de un anticuerpo intracelular o un péptido específico para la enzima que se une y bloquea su actividad enzimática, y otras técnicas de ingeniería genética conocidas. En otra modalidad, un método que estimula la expresión o la actividad de una enzima que bloquea la unión del sacárido, o una enzima sacaridasa que elimina los azúcares que ya se han unido puede seleccionarse del grupo que consiste en: transfecciones con genes de enzimas recombinantes, transfecciones de factores de transcripción que mejoran la síntesis de la enzima ARN y modificaciones genéticas que mejoran la estabilidad de la enzima ARN; lo que conduce a una actividad mejorada de las enzimas tales como sialidasas, que resultan en niveles inferiores de ácido siálico en el producto purificado. En otra modalidad se adicionan inhibidores enzimáticos específicos al medio de cultivo celular. Alternativamente, la célula huésped puede seleccionarse de una especie u organismo incapaz de glicosilar los polipéptidos, por ejemplo, una célula u organismo procariótico, tal como y de E. coli spp, Klebsiella spp., o Pseudomonas spp. natural o modificados Anticuerpos Un anticuerpo descrito en esta solicitud puede incluir o derivarse de cualquier mamífero tal como, pero sin limitarse a, un humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate, una cabra, o cualquier combinación de estos e incluye anticuerpos aislados humanos de primate, roedor, mamífero, quimérico, humanizado y/o anticuerpos injertados-CDR, inmunoglobulinas, productos de clivaje y otras porciones especificadas y variantes de estos.

Los anticuerpos, las proteínas que comprenden Fe, o los fragmentos Fe descritos en la presente descripción pueden derivarse de muchas formas que se conocen bien en la materia. En un aspecto, los anticuerpos se obtienen convenientemente a partir de hibridomas preparados por inmunización de un ratón u otro animal con los péptidos objetivo, células o extractos de tejido. Los anticuerpos pueden obtenerse así por medio del uso de cualquiera de las técnicas del hibridoma que se conocen bien en la materia, ver, por ejemplo, Ausubel, y otros, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lañe, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, y otros, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan y otros, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), cada uno incorporado en su totalidad en la presente como referencia.

Los anticuerpos o proteínas de fusión Fe o los componentes y dominios de estos pueden obtenerse, además, a partir de la selección de genotecas de esos dominios o componentes, por ejemplo, una genoteca de fagos. Una genoteca de fagos puede crearse al insertar una genoteca de oligonucleótidos aleatorios o una genoteca de polinucleótidos que contiene secuencias de interés, tal como a partir de las células B de un animal o un humano inmunizado (Smith, G. P. 1985,. Science 228:1315-1317). Las genotecas de fago del anticuerpo contienen pares de región variable de cadena pesada (H) y ligera (L) en un fago y permiten la expresión de fragmentos Fv o fragmentos Fab de cadena sencilla (Hoogenboom, y otros 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8). La diversidad de una genoteca de fagómidos puede manipularse para aumentar y/o alterar las inmunoespecificidades de los anticuerpos monoclonales de la genoteca para producir y posteriormente identificar anticuerpos monoclonales humanos deseables adicionales. Por ejemplo, los genes que codifican la molécula de inmunoglobulina de cadena ligera (L) y pesada (H) pueden mezclarse aleatoriamente (barajado) para crear nuevos pares HL en una molécula de inmunoglobulina ensamblada. Adicionalmente, uno o los dos genes que codifican la cadena H y L pueden mutagenizarse en una región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la región variable del polipéptido de ¡nmunoglobulina, y posteriormente seleccionarse para las capacidades de afinidad y neutralización. Las genotecas de anticuerpos pueden crearse, además, sintéticamente al seleccionar una o más secuencias marco humanas e introducir colecciones de casetes de CDR derivados de repertorios de anticuerpos humanos o a través de una variación diseñada (Kretzschmar y von Ruden 2000, Current Opinión in Biotechnology, 13:598-602). Las posiciones de diversidad no se limitan a las CDR, sino que pueden incluir, además, los segmentos marco de las regiones variables o pueden incluir regiones variables distintas del anticuerpo, tales como los péptidos. Otras genotecas de componentes de unión objetivo que pudieran incluirse además de las regiones variables del anticuerpo son la exhibición de ribosoma, exhibición de levadura y exhibiciones de bacterias. La exhibición de ribosoma es un método para traducir ARNm en sus proteínas cognadas mientras mantiene la proteína unida al ARN. La secuencia codificante de ácido nucleico se recupera por RT-PCR (Mattheakis, L.C. y otros 1994. Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 91, 9022). La exhibición de levadura se basa en la construcción de proteínas de fusión del receptor de adhesión de la levadura alfa-aglutinina asociado a la membrana, agal y aga2, una parte del sistema de tipo de apareamiento (Broder, y otros 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7). La exhibición de bacterias se basa en la fusión del objetivo a las proteínas bacterianas exportadas que se asocian con la membrana celular o pared celular (Chen y Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503). En comparación a la tecnología del hibridoma, los métodos de exhibición de fago y otros anticuerpos proporcionan la oportunidad de manipular la selección contra el antígeno objetivo in vitro y sin la limitación de la posibilidad de los efectos del huésped en el antígeno o viceversa.

La invención proporciona, además, ácidos nucleicos que codifican las composiciones de la invención como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión que incluyen los vectores compatibles con la expresión, secreción y/o exhibición de fagos filamentosos, procarióticos o eucarióticos de las composiciones o los mutágenos dirigidos de estos.

Uso de las moléculas que contienen Fe Las composiciones (anticuerpo, fusiones Fe, fragmentos Fe) generadas por cualquiera de los métodos anteriormente descritos pueden usarse para diagnosticar, tratar, detectar, o modular enfermedades humanas o patologías específicas en las células, tejidos, órganos, fluido, o, generalmente, un huésped. Como se enseña en la presente invención, la modificación de glicosilación de la porción Fe de un anticuerpo, una proteína de fusión Fe, o un fragmento Fe para resistir la digestión proteolítica por las proteasas las que se conocen que están presentes en un fluido, compartimento, tejido u órgano que es el objetivo del tratamiento puede usarse para producir moléculas terapéuticas; estas moléculas conservan sus propiedades objetivo originales y son menos propensas a la degradación por estas proteasas.

La proteasa, la actividad de clivaje a la que se resistirá, se selecciona del grupo que consiste en pepsina, plasmina, tripsina, quimotripsina, una metaloproteinasa de la matriz, una serina endopeptidasa y una cisteína proteasa; que se derivan del huésped o un patógeno que puede ser un parásito, bacteria o un virus. En una modalidad específica, la proteasa es una metaloproteinasa de la matriz seleccionada del grupo que consiste de gelatinasa A (MMP2, gelatinasa B (MMP-9), metaloproteinasa de la matriz -7 (MMP-7), estromelisina (MMP-3) y una elastasa del macrófago (MMP-12). Las modificaciones (al usar la numeración EU) para alterar la glicosilación de la porción Fe de una molécula o una molécula Fe puede seleccionarse de la eliminación del sitio de glicosilación en el dominio CH2 (sustitución de Asn 297), adición de un sitio de glicosilación ligado a N en el dominio CH3 por sustitución de una Asn en 359 y Thr en 361 , adición de un sitio de glicosilación ligado a N en el dominio CH3 por sustitución de Asn en 382 y una Thr en 384, y adición de un sitio de glicosilación ligado a N en el dominio CH3 por sustitución de Asn en 419 y una Thr en 421. Se espera que la adición de sitios de glicosilación en el dominio CH3 incremente el volumen de hidratación de la molécula resultante e incremente la permanencia en el cuerpo.

Las enfermedades o patologías que pueden estar sujetas al tratamiento por medio del uso de una composición proporcionada por la invención incluyen, pero sin limitarse a: cáncer o enfermedad proliferativa, enfermedades inflamatorias o reumáticas, trastornos autoinmunes, trastornos neurológicos, fibrosis, enfermedades cardiovasculares, enfermedades dermatológicas e infecciosas, y afecciones resultantes de quemaduras o lesión.

El cáncer o trastornos proliferativos que están sujetos al tratamiento con las composiciones de la invención se seleccionan de tumores sólidos, tumores metásticos, tumores líquidos y tumores benignos tales como los linfomas, leucemia linfoblástica o mielógena (ALL, por sus siglas en inglés), célula B, célula T o FAB ALL, leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), leucemia mielocítica crónica (CML, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (MDS, por sus siglas en inglés); una enfermedad linfoproliferativa, enfermedad de Hodgkin, enfermedad de Castleman, un linfoma maligno, linfoma no- Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorectal, carcinoma pancreático, carcinoma de células renales, cáncer de mamas, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, sarcomas, melanoma maligno, particularmente melanoma metástico, y hemangioma.

Las enfermedades inflamatorias o mediadas por el sistema inmune que están sujetas al tratamiento con las composiciones de la invención se seleccionan de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil sistémica, psoriasis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica, artropatías y placa artroscópica, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, lupus eritromatoso sistémico, síndrome antifosfolipídico, uveítis, neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vascultis sistémica, granulomatosis de Wegener, sarcoidiosis, orquitis, enfermedades alérgicas y atópicas, asma y asma atópica, rinitis alérgica, eczema, dermatitis alérgica por contacto, conjuntivitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo al transplante de órgano, enfermedad del injerto contra el huésped, síndrome de respuesta inflamatoria sistémico.

Otras enfermedades o afecciones las cuales están sujetas al tratamiento con las composiciones de la invención son el pénfigo, escleroderma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, infecciones de bacterias gram negativas o gram positivas, infecciones virales tales como la influenza y el VIH; infección con parásitos tales como la malaria o leismaniasis, lepra, encefalitis, Candidiasis, amiloidiosis, enfermedad de Alz eimer, infarto del miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, derrame, derrame isquémico y hemorragia.

Como se ejemplifica específicamente en la presente descripción, adicionar un glicano ligado a N en el dominio CH3 de una región Fe (por sustitución en el residuo Asn 359 y un residuo Thr en 361 (numeración EU)) un compuesto el cual es un péptido de una proteína de fusión Fe se hace menos sensible a la metaloproteinasa de la matriz (MMP-3) y una endopeptidasa serina (NE) mientras se mantiene la afinidad de unión FcRn de la molécula y la actividad CCDA/CDC.

Aunque la invención se describió en términos generales, las modalidades de la invención se describirán adicionalmente en los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1. Construcción de variantes de glicosilación de FC La experimentación se realizó sobre la fusión AEM-1 Fe (CNTO530) descrita como una construcción EPO MIMETIBODY™ (fusión de Fe) en la patente de los EE. UU. núm. 7,393,662 (SEQ ID NO: 88) y una construcción GLP-1 MIMETIBODY™ (fusión de Fe) (CNT0736) descrita en WO/05097175. Ambas construcciones contienen una región Fe derivada de un anticuerpo lgG4 humano como se muestra en la Figura 1.

Variantes de CNTO 530 El plásmido que codifica la CNTO530, p2630 se usó como material de partida para preparar NEM2631 por medio del uso de la PCR recombinante y métodos de clonación estándar. Para introducir las sustituciones T359N/N361T en la CNTO 530 construcción EPO MIMETIBODY™, un fragmento de restricción de codificación de CH3 se aisló a partir de NEM 2631 T359N/N361T del plásmido p3051 y se clonó en el lugar del fragmento correspondiente en el plásmido p2630 que codifica la CNTO 530. El plásmido resultante p3201 codificó la proteína CNTO 530 T359N/N361T conocida en la presente invención como CNTO 5303 (ver la Figura 2 y la Tabla 1).

Para preparar una variante de la CNTO 530 con las mismas sustituciones T359N/N361T pero carentes de glicosilación del Fe nativo en la posición 297, la porción apropiada del plásmido p3201 se amplificó por PCR con los oligonucleótidos mutagénicos y se clonó para resultar en una sustitución de codón T299N (es decir, cambió de 297NST299 a 297NSN299). El plásmido resultante fue el p3576 que codifica la proteína CNTO 530 T359N/N361T/T299N, conocida en la presente invención como CNTO 5304. Variantes de CNTO 736 Para introducir las sustituciones T359N/N361T en la CNTO 736, se aisló un fragmento de restricción que codifica CH3 a partir de NEM 2631 T359N/N361T plásmido p3051 y se clonó en el lugar del fragmento correspondiente en el plásmido p2538 que codifica CNTO 736. El plásmido resultante fue el p3349 que codifica la CNTO 736 T359N/N361T, conocida en la presente invención como CNTO 7363 (Tabla 1).

Para preparar una variante de CNTO 736 con las mismas sustituciones T359N/N361T pero carentes de la glicosilación del Fe nativo en la posición 297, la porción apropiada del plásmido p3349 se amplificó por PCR y se clonó para resultar en una sustitución de codón T299N. El plásmido resultante fue el p3577 que codifica la proteína CNTO 736 T359N/N361T/T299N, conocida en la presente invención como CNTO 7364.

Tabla 1 niveles de producción observados de las células transfectadas Expresión y purificaciones. Las células CHO-K1SV (C1013A) se transfectaron establemente con el plásmido p3201 que codifica la CNTO 5303, lo que resulta en el aislamiento de la línea celular C1514A productora de CNTO 5303. Las células NS0 de ratón se transfectaron establemente con los plásmidos anteriormente descritos que codifican la CNTO 5304, CNTO 7363, y CNTO 7364, lo que resulta en el aislamiento de las líneas celulares transfectadas C1670A, C1528A y C1671A, respectivamente (Tabla 1). Las cuatro variantes de la construcción MIMETIBODY™ se purificaron a partir del sobrenadante de las células transfectadas por cromatografía estándar de la proteína A. Dado que la proteína A y el FcRn se unen en la unión CH2-CH3 del dominio Fe, la purificación exitosa por medio del uso de las columnas de proteína A sugirieron que los nuevos sitios de glicosilación no podían afectar la unión al FcRn (ver más abajo). Ejemplo 2. Caracterización de las variantes de alicosilación de FC Se realizaron una serie de pruebas analíticas, biofísicas y de bioactividad en las construcciones expresadas del Ejemplo 1.

Se realizaron análisis MALDI-TOF- S para caracterizar las estructuras de glicanos de las variantes de la construcción MIMETIBODY™ y para establecer qué proporción de las cadenas pesadas fueron glicosiladas en el nuevo sitio.

El análisis MALDI-TOF-MS de la construcción MIMETIBODY™ intacta indicó que las muestras de CNTO 5303, CNTO 5304, CNTO 7363 y CNTO 7364 estaban de 75 - 95 % ocupadas con glicanos en el nuevo sitio. El análisis de glicanos de estas muestras mostró que eran más heterogéneas que los glicanos de la construcción MIMETIBODY™ CNTO 530 y CNTO 736, donde los glicanos en la posición 359 contenían estructuras bi-, tri-y tetra-antenarias. Los glicanos de Fe nativo en la posición 297 en la CNTO 5303 y la CNTO 7363 eran de las mismas estructuras que los glicanos de Fe nativo en la CNTO 530 y la CNTO 736, respectivamente, donde la única diferencia observada fue que la galactosilación era algo mayor en la construcción MIMETIBODY™ original (por ejemplo, aproximadamente 50 % G0 para la CNTO 530 vs. aproximadamente 70 % para la CNTO 5303).

El tamaño y la movilidad se analizaron por SDS-PAGE Las CNTO 530, CNTO 5303 y CNTO 5304 purificadas se analizaron por SDS-PAGE mediante la carga de 1 9 /carril en un gel de 1.0 mm de espesor, gradiente 4-12 % BisTris en condiciones no reductoras, y se corrió el fraccionamiento en amortiguador de corrida MOPS SDS a 200V por 50 min. El gel se tiñó con Coomassie G250 (SirnplyBlue Safe Stain, Invitrogen) y las imágenes resultantes se capturaron por medio del uso de un sistema de imagen Alphalmager 2200 (Alpha Innotech) (Figura 4).

Las migraciones observadas en el gel de SDS estaban acorde con las expectativas, es decir, la CNTO 5303 con un total de 4 sitios de N-glicosilación migró más lentamente, el peso molecular aparente aumentó en 3-4 kDa que CNTO 530 y CNTO 5304 con 2 sitios de N-glicosilación. La CNTO 5304 pareció migrar más lento que la CNTO 530 a pesar de tener el mismo número de sitios de glicosilación. Esto se debe al nuevo sitio de glicosilación en CNTO 5304 que tiene, con respecto a la glicosilación nativa en la CNTO 530, un mayor nivel de galactosilación y sialilación, así como más estructuras tri-antenarias y tetra-antenarias. Los estimados de peso molecular son 57.5, 61.5 y 59.5 kDa para la CNTO 530, CNTO 5303 y CNTO 5304, respectivamente.

Bioactividad evaluada por análisis de unión al FcRn.

Debido a que un factor para seleccionar dónde introducir la nueva glicosilación era el deseo de evitar la región de unión al FcRn, la unión a FcRn por la CNTO 5303 se comparó a la CNTO 530 por medio del uso de AlphaScreen. Primero, se dializaron toda noche las dos muestras de la construcción MIMETIBODY™ a 4 °C en un amortiguador de ensayo pH 6.0 (0.05 M MES, 0.025 % BSA, 0.001 % Tween 20, pH 6.0) por medio del uso de unidades de diálisis Slide-A-Lyzer MINI (10 K MWCO; Thermo Scientific (Pierce)) según las instrucciones del paquete. Las concentraciones del anticuerpo se determinaron por DÜ28o- Los siguientes componentes se co-incubaron después en una placa de ensayo de poliestireno blanco de 96 pocilios de media área, de fondo plano, de no fijación con mezclado por 1 hora a temperatura ambiente: mAb lgG1 humano biotinilado (CNTO 6234, concentración final de 4 pg/ml), muestras de ensayo diluidas en serie, FcRn humano marcado con polihistidina (concentración final de 8 pg/ml), bolillas aceptaras de quelato de níquel AlphaScreen (concentración final de 100 g/ml) y bolillas donantes revestidas con estreptavidina AlphaScreen (dilución final de 1 :250). Todos los materiales se diluyeron con amortiguador de ensayo como se describió anteriormente. Después de la incubación, las placas se leyeron en el instrumento EnVision por medio del uso del protocolo AlphaScreen. Los resultados (Figuras 5A-5F) mostraron que la CNTO 5303 se unió al FcRn con afinidad similar (KD sólo dos veces más débil que la CNTO 530), lo que indicó que la CNTO 5303 conservó la unión al FcRn.

Evaluación de la sensibilidad a la proteasa.

Las moléculas MIMETIBODY™ purificadas se evaluaron por su sensibilidad en relación con dos proteasas humanas, la metaloproteinasa de la matriz-3 (MMP-3) recombinante y la elastasa de neutrófilos (NE). La MMP-3, que se cree que diva después de la secuencia 228SCPAP en la bisagra inferior, se preparó en Centocor por la expresión transitoria en células HEK como pro-MMP-3 marcada con polyHis, purificación por columna de afinidad de Talón y congelada en alícuotas. La NE humana, la cual normalmente diva principalmente después de la secuencia 220CDKT de la bisagra superior, pero puede clivar además en un sitio secundario en la bisagra inferior (ver más abajo), se obtuvo a partir de Athens Research and Technologies (Athens, GA). Sensibilidad a las proteasas La MMP-3. La MMP-3 congelada se descongeló y después se activó por incubación a 55 °C por 25 minutos antes de realizar las digestiones con la MMP-3. Las muestras purificadas de la construcción MIMETIBODY™ a ~ 1 mg/ml se trataron a 37 °C con la MMP3 activada (1 :50, p/p) en amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.0, que contenía cloruro de calcio 2 mM. Se retiraron alícuotas (~ 2 µ?) a intervalos de tiempo fijo (0, 0.5, 1 , 2, 4, 6, 8 y 24 horas) y se mezclaron inmediatamente con 2 µ? de solución matriz (la solución matriz se preparó al disolver 10 mg de ácido sinápico en 1.0 mi de acetonitrilo 50 % en agua que contenía 0.1 % de ácido trifluoroacético). Se cargaron dos µ? de esta solución en la placa objetivo MALDI y se dejó secar al aire antes del análisis de espectrometría de masas descrito más abajo.

Elastasa de neutrófilos. Debido a que las porciones del péptido N-terminal de las construcciones MIMETIBODY™ eran extremadamente sensibles a la digestión con NE (lo que complicó, de ese modo, las cuantificaciones de las moléculas intactas e interfirió con el enfoque sobre la resistencia de Fe en la bisagra), y debido a que se observó que existía un sitio de clivaje secundario de la NE en algún lugar en la región bisagra inferior, especialmente en las IgGs no glicosiladas, se prepararon primero fragmentos Fe generados con papaína a partir de cada muestra de la construcción MIMETIBODY™. Esos fragmentos Fe de cada construcción MIMETIBODY™, mientras estaban a una concentración de ~ 1 mg/ml, se trataron a 37 °C con la NE (1 :50, p/p) en amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.0. Se retiraron alícuotas (~ 2 µ?) a intervalos de tiempo fijo (0, 0.5, 1 , 2, 4, 6, 8 y 24 horas) y se mezclaron inmediatamente con 2 µ? de solución matriz (la solución matriz se preparó al disolver 10 mg de ácido sinápico en 1.0 mi de acetonitrilo 50 % en agua que contenía 0.1 % de ácido trifluoroacético). Se cargaron dos µ? de esta solución en la placa objetivo MALDI y se dejó secar al aire antes del análisis de espectrometría de masas.

La IgG y los fragmentos de IgG en la digestión proteolítica se analizaron por medio del uso del análisis MALDI-TOF-MS. El análisis MALDI-TOF-MS se llevó a cabo por medio del uso de una estación de trabajo Voyager DE Biospectrometry (Applied BioSystems, Foster City, CA) en modo lineal o reflectrón para iones positivos ([M + H]+) con la extracción retardada. El instrumento se calibró externamente con un kit de calibración de proteína (Sigma). Los resultados mostraron que la presencia de la glicosilación ligada a N en la Asn359 claramente confirió una mayor resistencia a MMP-3 (Figuras 5A, 5C, 5E) y a NE (Figura 5B, 5D, 5F), dos proteasas que clivan estos sustratos en la región bisagra inferior. Después de una incubación de 8 horas con la MMP-3, menos del 20 % de la CNTO 530 original permaneció intacta, mientras que más del 60 % de la CNTO 5303 permaneció intacta. Se observaron resultados similares con la CNTO 7363 y la CNTO 736. Después de una incubación de 8 horas con la NE, menos del 10 % del Fe de la CNTO 530 estaba intacto, mientras que el 50 % del Fe de la CNTO 5303 estaba intacto y se observaron otra vez resultados similares con los fragmentos Fe de la CNTO 7363 y la CNTO 736. Las variantes de la CNTO 5304 y la CNTO 7364 que tenían la nueva glicosilación en la posición 359, pero carecían de la glicosilación del Fe nativo en 297 mostraron una sensibilidad intermedia a la MMP-3 (Figura 5E), pero una sensibilidad marcadamente mayor a la NE (Figura 5F). Quedó por determinar en qué medida la sensibilidad a la NE estaba directamente influenciada por la falta de glicosilación del Fe nativo o indirectamente por el mal plegamiento resultante de la parte superior del dominio Fe en ausencia de la glicosilación nativa. Debido a que la MMP-3 y la NE clivan en la vecindad de la región de bisagra de la construcción MIMETIBODY™, el nuevo sitio de glicosilación introducido lejos de los sitios de clivaje (ver Figura 2) tuvo aparentemente efectos alostéricos en la conformación de las proteínas, como se observó con algunas sustituciones de aminoácidos. Sin embargo, no puede descartarse que las propias sustituciones T359N o N361T pudieran resultar en tal efecto alostérico.

Ejemplo 3. Comportamiento in vivo de las variantes de glicosilación de Fe En este estudio, la farmacocinética de las variantes de glicosilación de la CNTO530 se compararon en ratones. Los ratones Balb/c hembras normales sanas de 8-12 semanas de edad (aproximadamente 18-22 g) de los laboratorios Charles Rivers (Raleigh, NC) se aleatorizaron por peso y se alojaron en grupo (4 ratones/jaula) en jaulas de plástico rematadas con filtro y se proporcionó comida comercial para roedores y agua acidificada a voluntad. Los ratones (4 por artículo de prueba) se inyectaron por vía intraperitoneal con una dosis de 10 ml/kg de cualquiera de CNTO 530 o CNTO 5303 formuladas en PBS de Dulbecco a 0.1 mg/ml con el fin de lograr una dosis de 1 mg/kg.

Las muestras de sangre se recogieron en los días 2, 7, 16, 26 y 35 por desangrado retro-orbital en serie de cada ratón anestesiado con CO2 durante los primeros 26 días. Las muestras de sangre terminales se recogieron el día 35 a través de punción cardiaca de los ratones anestesiados con CO2. Todas las muestras se marcaron como del animal del cual se derivó con el propósito de que los análisis en el curso del tiempo se pudieron llevar a cabo sobre cada animal individual.

Todas las muestras de sangre se dejaron reposar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, pero no más de 1 hora, se centrifugaron a 3500 rpm por 15 minutos y el suero se separó. Las muestras de suero se almacenaron a -20 °C hasta el final del estudio, momento en el cual todas las muestras se analizaron en conjunto.

Las muestras de suero procedentes de todos los ratones se analizaron para el Fe humano por un ELISA estándar que implicaba recubrir placas de EIA de 96 pocilios con fragmento Fe policlonal de cabra anti- IgG humana, se incuba diluciones diferentes de las muestras de suero, y se detecta la IgG humana unida con policlonal de cabra anti-lgG humana conjugado con HRP seguido por la adición de los sustratos de color apropiados. Para establecer una curva estándar con el propósito de cuantificación se añadieron a los sueros normales cantidades tituladas del artículo de prueba.

Las concentraciones de Fe humano determinadas para cada muestra de suero se normalizaron a los niveles séricos del día 2 y se graficaron. Los resultados revelaron que el perfil farmacocinético de la variante de glicosilación CNTO 5303 fue esencialmente indistinguible de la CNTO 530, lo que indicó que los nuevos glicanos no tenían un efecto perjudicial sobre la vida media en ratones sanos normales (Figura 7).

Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una molécula que contiene Fe con resistencia aumentada a la proteasa; la molécula comprende un dominio Fe del anticuerpo con sitios de N-glicosilación en los extremos de las estructuras del lazo.

2. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el dominio Fe es lgG4 y los sitios de N-glicosilación están en el dominio CH3.

3. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los sitios de N-glicosilación están distales de los sitios de clivaje proteolítico.

4. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el dominio Fe es de cualquier molécula lgG1 , lgG2, lgG3, y lgG4.

5. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la molécula que contiene Fe es un anticuerpo o proteína de fusión Fe.

6. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteasa se selecciona del grupo que consiste en pepsina, plasmina, tripsina, quimotripsina, una metaloproteinasa de la matriz, una endopeptidasa serina, y una cisteína proteasa.

7. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la proteasa es una metaloproteinasa de la matriz seleccionada del grupo que consiste en gelatinasa A (MMP2), gelatinasa B (MMP-9), metaloproteinasa de la matriz-7 (MMP-7), estromelisina (MMP-3) y elastasa del macrófago (MMP-12).

8. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el dominio Fe exhibe sitios de N-glicosilación correlativos a la numeración EU en al menos uno de los residuos 359, 382, y 419.

9. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el dominio Fe exhibe sitios de N-glicosilación correlativos a la numeración EU en los residuos 359, 382, y 419 del dominio Fe.

10. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el dominio Fe exhibe sitios de N-glicosilación correlativos a la numeración EU en los residuos 359, 382, y 419 del dominio Fe, y se elimina un sitio de N-glicosilación en el residuo 297 del dominio Fe.

11. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el residuo 299 se cambia de Thr a Asn, el residuo 359 se cambia de Thr a Asn, el residuo 361 se cambia de Asn a Thr, el residuo 419 se cambia de Thr a Asn, y el residuo 421 se cambia de Asn a Thr.

12. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el dominio Fe tiene un cambio del tipo silvestre a al menos uno del residuo 359, 361 , 419, y 421.

13. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el residuo 359 se cambia de Thr a Asn y el residuo 361 se cambia de Asn a Thr, y/o el residuo 419 se cambia de Thr a Asn y el residuo 421 se cambia de Asn a Thr.

14. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el dominio Fe tiene un cambio del tipo silvestre en los residuos 359, 361 , 419, y 421.

15. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el residuo 359 se cambia de Thr a Asn, el residuo 361 se cambia de Asn a Thr, el residuo 419 se cambia de Thr a Asn y el residuo 421 se cambia de Asn a Thr.

16. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque con relación a la numeración EL), se altera al menos uno de los residuos 228, 234, y 235 en la región bisagra.

17. Una molécula que contiene Fe con resistencia aumentada a la proteasa; la molécula comprende un dominio Fe de anticuerpo con sitios de N-glicosilación correlativos a la numeración EU en los residuos 359, 382, y 419 del dominio Fe y un sitio de N-glicosilación en el residuo 297 del dominio Fe se elimina, en donde el dominio Fe tiene un cambio del tipo silvestre en los residuos 299, 359, 361 , 419, y 421.

18. La molécula que contiene Fe de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque con relación a la numeración EU, se altera al menos uno de los residuos 228, 234, y 235 en la región bisagra.

19. El uso de una preparación de proteína que contiene Fe glicosilada, en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad caracterizado por la liberación de una proteasa en un sujeto o paciente, en donde la preparación del anticuerpo tiene residuos alterados a partir del tipo silvestre, y los residuos están distantes del sitio de unión FcyR en la bisagra inferior o distantes del sitio de unión a FcRn en la región de unión CH2-CH3.

20. Un método para aumentar la resistencia de una proteína que contiene Fe del clivaje por una proteasa; el método comprende añadir sitios de N-glicosilación a la proteína que contiene Fe correlativos a la numeración EU en al menos una de la posiciones 359, 382, y 419.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque comprende añadir sitios de N-glicosilación a la proteína que contiene Fe correlativos a la numeración EU en las posiciones 359, 382, y 419.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende adicionalmente eliminar el sitio de N-glicosilación correlativo a la numeración EU en la posición 297.

23. Un método para cambiar la susceptibilidad de una proteína que contiene Fe al clivaje por una proteasa, que comprende alterar los sitios de N-glicosilación de la secuencia de la proteína que contiene Fe correlativos a la numeración EU en los residuos 359, 382, y 419.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque comprende añadir sitios de N-glicosilación a la proteína que contiene Fe correlativos a la numeración EU en las posiciones 359, 382, y 419.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque comprende adicionalmente eliminar el sitio de N-glicosilación correlativo a la numeración EU en la posición 297.

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque comprende adicionalmente alterar a partir del tipo silvestre correlativo a la numeración EU, al menos, uno de los residuos 228, 234, y 235 en la región bisagra.