MX2012003224A

MX2012003224A - Metodo para la produccion enzimatica de acido 3-hidroxi-s-metilbutirico a partir de acetona y acetil-coa.

Info

Publication number: MX2012003224A
Application number: MX2012003224A
Authority: MX
Inventors: Philippe Marliere
Original assignee: Philippe Marliere
Priority date: 2009-09-15
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2012-09-07
Also published as: HUE025695T2; US9017977B2; US20120220001A1; US20150240271A1; BR112012005737A8; BR112012005737A2; CN102597254B; CA2772279C; EP2478109A1; IL218245A; PH12012500510A1; DK2478109T3; KR101774064B1; RU2012114690A; AU2010297362C1; PL2478109T3; AU2010297362B2; CA2772279A1; KR20120093838A; HK1171250A1

Abstract

Se describe un método para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico (también denominado como beta-hidroxiisovalerato o HiV) a partir de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado que comprende la conversión enzimática de la acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado en ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico. La conversión hace uso de una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=O) de la acetona y el grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado. Preferiblemente, la enzima empleada en el proceso es una enzima con la actividad de una sintasa HMG CoA (EC 2.3.3.10) y/o una proteína PksG y/o una enzima con la actividad de una liasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA liasa (EC 4.1.3.4). También se describen organismos que son capaces para producir ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico a partir de acetona, un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado, el uso de las enzimas anteriormente mencionadas y organismos para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico así como el uso de acetona para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA DE ÁCIDO 3-HIDROXI- S-METILBUTÍRICO A PARTIR DE ACETONA Y ACETIL-COA La presente invención se relaciona con un método para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico (también denominado como beta-hidroxiisovalerato o HIV) a partir de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado que comprende la conversión enzimática de la acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado en ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico. La conversión hace uso de una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado. Preferiblemente, la enzima empleada en el proceso es una enzima con la actividad de una sintasa HMG CoA (EC 2.3.3.10) y/o una proteína PksG y/o una enzima con la actividad de una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como HMG CoA liasa (EC 4.1.3.4). La presente invención también se relaciona con organismos capaces de producir ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico a partir de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado y con el uso de las enzimas anteriormente mencionadas y organismos para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico. Finalmente, la presente invención se relaciona con el uso de acetona para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico.

El ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico (también denominado como beta-hidroxiisovalerato o HIV; ver Figura 1) es un metabolito del aminoácido esencial leucina y se sintetiza en el cuerpo humano. Se puede encontrar en cantidades pequeñas en toronja , alfalfa y bagre . También se sabe que puede ocurrir en algunos trastornos metabólicos de catabolismo de leucina, es decir acidemia hipovalérica. Se ha mostrado que el ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico puede tener un efecto sobre el aumento de la resistencia o peso muscular (N issen et al. , J . Appl . Physiol. 81 (1996), 2095-21 04) . Wilson et al. (Nutrition & Metabol ism 5 (2008)) propone como los mecanismos de acción los siguientes: integridad de sarcolema incrementada a través de conversión mediante HMG CoA reductasa síntesis de proteína mejorada a través de la ruta mTOR depresión de la deg radación de proteína a través de la inhibición de la ruta de ubiquitina.

Se supone que el ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico ayuda a los músculos a combatir la degradación de la proteína, ayuda en la reparación muscular y soporta la resistencia incrementada. Se ha descrito la ayuda a los pacientes con enfermedad pu lmonar obstructiva crónica en las unidades de cuidado intensivo hospitalarias, pérdida de masa muscular asociada con HIV y cáncer y víctimas de traumas con lesiones severas. Así, es de interés comercial debido a su uso como un intensificador muscular para fisicoculturismo y como un medicamento para evitar la pérdida de masa muscular. La Patente Estadounidense 7026507 describe un proceso para preparar formulaciones sólidas de 3-hidroxi -3-metilbutirato de sodio en las que, en u na primera etapa de proceso, 4,4- dimetiloxetan-2-ona se hace reaccionar con hidróxido de sodio acuoso para formar una solución de 3-hidroxi -3-metilbutirato de sodio, y luego, si es apropiado después de concentración, se aplica la solución, en una etapa de proceso adicional , para sintetizar el sílice, y en la que se seca el producto resultante, si es apropiado.

Sería deseable proporcionar un proceso para la producción de 3-hidroxi-3- metilbutirato que puede ser independ iente de las etapas de producción inorgánica y que se podría efectuar en organismos vivos siendo por lo tanto ambientalmente racional y económico. En este contexto, Lee et al . (Appl. Environ . Microbiol. 63 ( 1 997), 4191 -4195) describe un método para la producción de 3-hidrox¡-3-metilbutirato al convertir ácido 3-metilbutírico a ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico utilizando el microorganismo Galactomyces reessii. Sin em bargo, aunque este proceso permite la producción de 3-hidroxi-3-metil butirato subsiste aún una necesidad de proporcionar formas alternativas efectivas y eficientes en costos para producir 3-hidroxi-3-metilbutirato en particular mediante procesos biológicos.

La presente invención satisface esta demanda para un proceso alternativo para la producción de 3-hidroxi-3-metilbutirato y proporciona un método que se basa en recursos biológ icos y permite producir 3-hidroxi-3-metilbutirato in vitro o in vivo en un microorganismo y otras especies.

En particular, la presente invención se relaciona con un método para la producción de ácido 3-hidroxi-3-meti lbutírico (también denominado como beta-hidroxiisovalerato o H IV) a partir de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado que comprende la conversión enzimática de la acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado en ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico.

La acetona se representa por la siguiente fórmula: CH3-(C=0)-CH3. En una modalidad preferida el compuesto que proporciona un grupo acetilo activado se caracteriza por la siguiente fórmula (I): , en donde X se selecciona del grupo que consiste de S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C10H13N5O7P (coenzima A), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-0- P02H-polipéptido (proteína portadora de acilo), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH (OH)-C(CH3)2-CH2-OH (panteteína), S-CH2-CH2-NH-CO-CH3 (N-acetil-cisteamina), S-CH3 (metano tiol), S-CH2-CH(NH2)-C02H (cisterna), S-CH2-CH2-CH(NH2)-C02H (homocisteína), S-CH2-CH(NH-C5H8N03)-CO-NH-CH2-C02H (glutationa), S-CH2-CH2-SO3H (coenzima M) y OH (ácido acético).

La conversión hace uso de una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado de acuerdo con la fórmula (I). De acuerdo con este esquema de reacción el grupo oxo de la acetona reacciona como un electrófilo y el grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado de acuerdo con la fórmula ( I ) reacciona como un nucleófilo. La reacción general de la conversión de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado de acuerdo con la fórmula (I ) se muestra en la Figura 5.

La reacción puede ocurrir en una etapa, es decir 3-hidroxi -3-metilbutirato puede ser el producto directo de una reacción catalizada por la enzima descrita anteriormente. Alternativamente, la reacción puede comprender dos etapas, en particular en el caso en donde el acetil CoA se utiliza como el compuesto que proporciona un grupo acetilo activado, en el sentido de que primero un aducto de 3-hidroxi -3-metilbutirato y se produce el compuesto q ue proporciona un grupo acetilo activado, por ejemplo 3-hidroxi-3-metil butiril-CoA, que se hidroliza posteriormente, por ejemplo a 3-hidroxi-3-metilbutirato y CoA. Así, en la primera alternativa la enzima cataliza la reacción completa como se muestra en la Figura 5. En la segunda a lternativa, la enzima cataliza la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto q ue proporciona un grupo acetilo activado pero X permanece en la molécula. X luego se elimina posteriormente a partir de la molécula mediante hidrólisis.

La presente invención muestra para el primer momento que es posible producir 3-hidroxi-3-metilbutirato al hacer uso de una enzima que puede transferir un grupo acetilo activado a acetona. En la técnica anterior, se ha reportado la producción de 3-hidroxi-3-metilbutirato a partir de ácido isovalérico a través de bioconversión utilizando el hongo Galactomyces reessü . Sin embargo, considerar q ue el ácido isovalérico se obtiene a partir de leucina a través de la descarboxilación y que la leucina en sí misma se deriva en el metabol ismo de la condensación general de dos moléculas de piruvato y una molécula de acetil CoA, este proceso de producción es energéticamente desfavorable. El proceso de la presente invención evita esta desventaja.

En general, en el contexto de la presente invención se podría utilizar cualquier enzima que acepta un compuesto q ue proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente como un sustrato así como también un sustrato que contiene como un componente un grupo acetona. En una modalidad preferida, la enzima es una enzima que acepta acetil CoA como un sustrato. Ejemplos para tales enzimas son HMG CoA sintasa , H MG CoA Nasa u otra Nasa de corte de enlace C-C/condensacións. Sin embargo, como se explicará adelante, también las enzimas que se utilizan normalmente en la reacción q ue catalizan en la naturaleza un donante de acetilo diferente del acetil CoA, pueden utilizar acetil CoA o análogos del mismo, por ejemplo la proteína PksG.

En otra modalidad preferida la enzima es una enzima que acepta como un sustrato un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado de acuerdo con la fórmula (I) en el cual X es una proteína portadora de acilo, tal como la proteína acetil-S-AcpK codificada por el grupo de genes pksX para producir bacillaene en Bacillus subtilis. Un ejemplo para tal una enzima es la proteína PksG . La proteína PksG es una de las proteínaes codificadas por el grupo de genes pksX sw Bacillus subtilis. La proteína PksG es capaz de cata lizar la transferencia de un grupo carboximetilo -CH2-C02H desde el acetil-S-AcpK hasta un intermedio policétido ß-cetoéster ligado a uno de los dominios de tiolación de la proteína PskL, en una reacción que es análoga a aquella catalizada por HMG CoA sintasa. Sin embargo, se ha mostrado en el contexto de la presente invención que la proteína PksG también puede utilizar acetil CoA en lugar de la proteína acetil-S-AcpK como un donante de un grupo acetilo activado.

En una modalidad preferida el compuesto que proporciona un grupo acetilo activado es acetil CoA. La Acetil CoA (también conocida como acetil Coenzima A) en la estructura química es el tioéster entre la coenzima A (un tiol) y ácido acético.

En otra modalidad preferida el compuesto que proporciona un grupo acetilo activado tiene la fórmula (I) en la cual X es una proteína portadora de acilo, tal como la proteína acetil-S-AcpK codificada por el grupo de genes pksX para producir bacillaene en Bacillus subtilis.

Preferiblemente, la enzima empleada en el proceso es una enzima con la actividad de una sintasa HMG CoA (EC 2.3.3.10) y/o una proteína PksG y/o una enzima con la actividad de una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA liasa (EC 4.1.3.4).

En una modalidad preferida, el método de acuerdo con la presente invención comprende la conversión enzimática de la acetona y acetil CoA en 3-hidroxi-3-metilbutirato con una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono C2 del acetil CoA de acuerdo con la fórmula (I).

En una modalidad preferida, la enzima empleada en el proceso de acuerdo con la invención es una enzima que tiene actividad de una sintasa HMG CoA (EC 2.3.3.10) o una enzima que tiene actividad de una proteína PksG o una enzima que tiene actividad de una Nasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA liasa (EC 4.1 .3.4).

En particular, se ha mostrado en el contexto de la presente invención que la HMG CoA sintasa puede aceptar acetona en lugar de su sustrato normal acetoacetil-CoA permitiendo por lo tanto la conversión de acetil-CoA (o un compuesto de acuerdo con la fórmula (I)) y acetona en 3-hidroxi-3-metilbutirato.

Más aún, se ha mostrado en el contexto de la presente invención que la proteína PksG puede utilizar acetil CoA como un sustrato en lugar de la proteína Ac-S-AcpK y puede catalizar la reacción que normalmente se cataliza por la HMG CoA sintasa. Así, se contempla que también la proteína PksG, que cataliza una reacción análoga a la reacción de HMG CoA sintasa, será capaz de catalizar la conversión de acetona y un compuesto de la fórmula (I) en 3-hidroxi-3-metilbutirato. Más aún, se contempla que la liasa de corte de enlace C-C/condensacións, tales como HMG CoA liasa, puede catalizar la conversión de acetil-CoA y acetona en 3-hidroxi-3-metilbutirato-CoA que a su vez se puede hidrolizar a 3-hidroxi-3-metilbutirato y CoA.

En el contexto de la presente solicitud el término "HMG CoA sintasa" o "una proteína/enzima que tiene actividad de una sintasa HMG CoA" se refiere a cualquier enzima que se clasifica en el número EC EC 2.3.3.10 (anteriormente, la HMG-CoA sintasa se ha clasificado como EC 4.1.3.5 pero se ha tranferido a EC 2.3.3.10), en particular se refiere a cualquier enzima que es capaz de catalizar la reacción en donde la acetil-CoA se condenda con acetoacetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) (ver Figura 2) y el término también se refiere a cualquier enzima que se deriva de tal una HMG CoA sintasa y que es capaz de catalizar la conversión de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente, preferiblemente acetil CoA, en 3-hidroxi-3-metilbutirato.

Se puede medir la actividad enzimática de la condensación del acetil-CoA con acetoacetil-CoA para formar 3-hidroxi- 3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) mediante métodos bien conocidos en la técnica. Un posible y preferiblemente ensayo utilizado se describe, por ejemplo, en Clinkenbeard et al. (J. Biol. Chem. 250 (1975), 3108-3116). En este ensayo la actividad HMG-CoA sintasa se mide al monitorear la reducción en en la absorbancia a 303 nm que acompaña la desaparición dependiente de acetil-CoA de la forma enolato del acetoacetil-CoA. Preferiblemente la actividad HMG CoA sintasa se ensaya como se describe en el Ejemplo 3.

La HMG CoA sintasa es parte de la ruta de mevalonato. Se han identificado dos rutas para la síntesis de pirofosfato de isopentenilo (IPP), es decir la ruta de mevalonato y la ruta de gliceraldehído 3-fosfato-piruvato. La HMG CoA sintasa cataliza la condensación Claisen biológica de acetil-CoA con acetoacetil-CoA y es un miembro de una superfamilia de enzimas que condensan acilo que incluye beta-cetotioalasas, ácido graso sintasas (sintasa de proteína portadora de beta-cetoacilo) y policétido sintasas.

La HMG CoA sintasa se ha descrito para diversos organismos. También están disponibles las secuencias de aminoácido y ácido nucleico que codifican las HMG CoA sintasas a partir de numerosas fuentes. Generalmente, las secuencias solo comparten un bajo grado de identidad de secuencia general. Por ejemplo, las enzimas del estafilococos o estreptococos solo muestran aproximadamente 20% de identidad a aquellas de la HMG CoA sintasa humana y aviar. En alguna fuentes se reporta que las HMG CoA sintasas bacterianas y sus contrapartes animales exhiben solo aproximadamente 10% de identidad de secuencia general (Sutherlin et al., J. Bacteriol. 184 (2002), 4065-4070). Sin embargo, los residuos de aminoácido involucrados en en las reacciones de acetilación y condensación se conservan entre HMG CoA sintasas bacterianas y eucarióticas (Campobasso et al.( J. Biol. Chem. 279 (2004), 44883-44888). La estructura tridimensional de las tres enzimas HMG CoA sintasa se ha determinado y los aminoácidos cruciales para la reacción enzimática son en principio bien caracterizadas (Campobasso et al., loe. cit . ; Chun et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 17946-17953; Nagegowda et al., Biochem. J. 383 (2004), 517-527; Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582) En los eucariotes existen dos formas de la HMG CoA sintasa, es decir una forma citosólica y una mitocondrial. La forma citosólica cumple una función clave en la producción del colesterol y otros isoprenoides y la forma mitocondrial está involucrada en la producción de cuerpos de cetona.

En principio se puede utilizar cualquier enzima HMG CoA sintasa en el contexto de la presente invención, en particular de organismos procarióticos o eucarióticos.

Las HMG CoA sintasas procarióticas se describen, por ejemplo, de Staphylococcus aureus (Campobasso et al., loe. cit.; número de acceso Uniprot Q9FD87), Staphylococcus epidermidis (número de acceso Uniprot Q9FD76), Staphylococcus haemolyticus (número de acceso Uniprot Q9FD82), Enterococcus faecalis (Sutherlin et al., loe. cit.; número de acceso Uniprot Q9FD7), Enterococcus faecium (número de acceso Uniprot Q9FD66), Streptococcus pneumonía (número de acceso Uniprot Q9FD56), Streptococcus pyogenes (número de acceso Uniprot Q9FD61) y Methanobacterium thermoautotrophicum (número de acceso AE000857), Borrelia burgdorferi (Número de acceso NCBI BB0683).

Más aún, la siguiente Tabla A enumera algunas HMG CoA sintasas conocidas a partir de procariotes: Tabla A: 10 15 20 10 15 20 Q9UWU0 Sulfolobus solfataricus Las HMG CoA sintasas eucarioticas se describen, por ejemplo, de hongos, tales como Schizosaccharomyces pombe (números de acceso U32187 y P54874), Saccharomyces cerevisiae (número de acceso P54839), plantas, tales como Arabidopsis thaliana (números de acceso X83882 y P54873), Pinus sylvestris (número de acceso X96386) y animales, tales como Caenorhabditis elegans (número de acceso P54871), Mus musculus (mitocondrial; número de acceso P54869 y Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582), Rattus norvegicus (mitocondrial: número de acceso P22791 y Hegardt, Biochem. J. 338 (1999); citosólica: número de acceso P17425), 569-582), hámster Chino (Cricetulus griseus: número de acceso P13704), Sus scrofa (mitocondrial; número de acceso U90884 y Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582), Homo sapiens (mitocondrial: número de acceso P54868 y Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582; citosólica: número de acceso Q01581), Blattella germánica (forma citosólica 1; número de acceso P54961), Blattella germánica (forma citosólica 2; número de acceso P54870) y Gallus gallus (citosólica; número de acceso P23228).

Se dan ejemplos de HMG CoA sintasas a partir de diferentes organismos en la SEQ ID NO: 1 a 14. La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa citoplasmática de Caenorhabditis elegans (P54871, banco de genes F25B4.6), la SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa citoplasmática de Schizosaccharomyces pombe (levadura de fisión; P54874), la SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa citoplasmática de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero; P54839, banco de genes CAA65437.1), la SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa citoplasmática de Arabidopsis thaliana (Berro de oreja de ratón; P54873), la SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa citoplasmática de Dictyostelium discoideum (moho de limo; P54872, banco de genes L2114), la SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa citoplasmática de Blattella germánica (Cucaracha alemana; P54961, banco de genes X73679), la SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa citoplasmática de Gallus gallus (Pollo; P23228, banco de genes CHKHMGCOAS), la SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa citoplasmática de Homo sapiens (Humano; Q0158, banco de genes X66435), la SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa mitocondrial de Homo sapiens (Humano; P54868, banco de genes X83618), la SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa mitocondrial de Dictyostelium discoideum (Moho de limo; Q86HL5, banco de genes XM_638984), la SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa de Staphylococcus epidermidis (Q9FD76), la SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa de Lactobacillus fermentum (B2GBL1), la SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa de Hyperthermus butylicus (A2BMY8), la SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa de Chioroflexus aggregans (B8G795), la SEQ ID NO: 24 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa de Lactobacillus delbrueckii (Q1GAH5) y SEQ ID NO: 25 muestra la secuencia de la HMG CoA sintasa de Staphylococcus haemolyticus Q4L958 (I98>V diferencia comparada con la proteína tipo natural).

En una modalidad preferida de la presente invención la HMG CoA sintasa es una enzima que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 a 14 o una secuencia que es por lo menos n % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 14 y que tiene la actividad de una sintasa HMG CoA con n siendo un entero entre 10 y 100, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99.

Preferiblemente, el grado de identidad se determina al comparar la respectiva secuencia con la secuencia de aminoácido de una cualquiera de de las SEQ ID Nos mencionadas anteriormente. Cuando las secuencias que se comparan no tienen la misma longitud, el grado de identidad preferiblemente se refiere al porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia más corta que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia más larga o al porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia más larga que son idénticos a residuos de aminoácido en la secuencia más corta. El grado de identidad de secuencia se puede determinar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica utilizando preferiblemente algoritmos para computador adecuados tales como CLUSTAL.

Cuando se utiliza el método de análisis Clustal para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 80% idéntica a una secuencia de referencia, se pueden utilizar configuraciones predeterminadas o las configuraciones son preferiblemente como sigue: Matriz: blosum 30; Penalización de intervalo abierto: 10.0; Penalización de intervalo extendido: 0.05; Retraso divergente: 40; Distancia de separación de intervalo: 8 para comparaciones de secuencias de aminoácido. Para las comparaciones de secuencia de nucleótido, la penalización de intervalo extendido se establece preferiblemente a 5.0.

Preferiblemente, el grado de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia.

La HMG CoA sintasa empleada en el proceso de acuerdo con la invención puede ser una HMG CoA sintasa de ocurrencia natural o puede ser una HMG CoA sintasa que se deriva de una HMG CoA sintasa de ocurrencia natural, por ejemplo mediante la introducción de mutaciones u other alteraciones que, por ejemplo, alteran o mejoran la actividad enzimática, la estabilidad, etc.

El término "HMG CoA sintasa" o "una protema/enzima que tiene actividad de una HMG CoA sintasa" en el contexto de la presente solicitud también cubre enzimas que se derivan de una HMG CoA sintasa, que son capaces de producir 3-hidroxi-3-metilbutirato mediante una conversión enzimática de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente, preferiblemente acetil-CoA, pero que solo tienen una baja afinidad a acetoacetil-CoA como un sustrato o no aceptan más acetoacetil-CoA como un sustrato. Tal una modificación del sustrato preferido de una sintasa HMG CoA permite mejorar la conversión de acetona en 3-hidroxi-3-metilbutirato y reducir la producción del subproducto, por ejemplo HMG-CoA. Los métodos para modificar y/o mejorar las actividades enzimáticas deseadas de las proteínas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida a sitio y posterior selección de enzimas que tienen las propiedades deseadas o métodos de la "evolución directa".

Por ejemplo, para ingeniería genética en células procarióticas, se puede introducir una molécula de ácido nucleico que codifica el HMG CoA sintasa en plásmidos que permiten mutagénesis o modificación de secuencia mediante recombinación de secuencia de ADN. Los métodos estándar (ver Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) permiten que se realicen intercambios de base o que se agreguen secuencias naturales o sintéticas. Los fragmentos de DNA se pueden conectar entre sí al aplicar adaptadores y ligadores a los fragmentos. Más aún, se pueden utilizar medidas de ingeniería que proporcionan sitios de restricción adecuados o eliminan el DNA excedente o sitios de restricción. En aquellos casos, en los cuales las inserciones, eliminaciones o sustituciones son posibles, se puede utilizar la mutagénesis in vitro, "reparación de cebador", restricción o ligación. En general, un análisis de secuencia, análisis de restricción y otros métodos de bioquímica y biología molecular se llevan a cabo como métodos de análisis. Las variantes de HMG CoA sintasa resultantes luego se prueban para su actividad enzimática y en particular para su capacidad para preferir la acetona como un sustrato diferente de acetoacetilCoA. Un ensayo para medir la capacidad de una sintasa HMG CoA para utilizar acetona como un sustrato se describe en el Ejemplo 5. La formación de 3-hidroxi-3-metilbutirato se puede detectar mediante comparación con un compuesto estándar, por ejemplo después de separación mediante cromatografía de capa delgada, LC/MS y ensayo colorimétrico después de su derivación o mediante espectrometría de masa.

En particular, una reacción se lleva a cabo en una mezcla de reacción que contiene 40 mM Tris-HCI pH 8, 5 a 50 mM de acetil-CoA, 100 a 500 mM de acetona, 1 MgCI2 (excepto para HMG-CoA sintasa de mitocondria), 0.5 mM de DTT y una enzima que varía en el rango de 0. 2 a 8 mg/ml. Se llevan a cabo reacciones de control en la ausencia de enzima y uno de los sustratos.

El progreso de la síntesis es seguido al analizar las alícuotas tomadas después de aumentar el periodo de incubación a 30 o 37° C. Típicamente, una alícuota de 50 µ? se elimina después de 48 h de incubación, se calienta durante 1 min a 100° C para eliminar las proteínas, se centrifuga y el sobrenadante se transfiere a un frasco limpio para detección HIV mediante espectrometría de masa. Una solución de 3-hidroxi-3-metilbutirato se prepara en 40 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM de MgC2, 0.5 mM de DTT, se calienta como se describió anteriormente y se utiliza como referencia.

Las muestras se analizan sobre un espectrómetro de masa cuádruple triple PE SCIEX API 2000 en modo de ión negativo con H2O/acetonitrilo=60/40 que contiene 0.1 % de trietilamina como fase móvil, el índice de flujo es 40 pl/min. 10 µ? de cada sobrenadante se mezclan con una cantidad igual de fase móvil y se inyecta directamente en el espectómetro de masa. Se monitorea la presencia de ión [3-hidroxi-3-metilbutirato-H]". La síntesis de 3-hidroxi-3-metilbutirato también se puede llevar a cabo en la presencia de [2-14C] acetona radioetiquetada. La formación de producto se analiza después de la separación de la mezcla de reacción mediante TLC o HPLC.

En una modalidad preferida la HMG CoA sintasa empleada en la presente invención es una enzima que tiene un valor M para la acetona de 300 mM o menos, preferiblemente de 250 mM o menos aún más preferiblemente de 200 mM o menos y particularmente preferido de 150 mM o menos. Se prefiere que el valor KM se determine bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 7. En otra modalidad preferida la HMG CoA sintasa empleada en la presente invención tiene un valor k para la reacción anteriormente descrita de por lo menos 0.1 x 10"4 seg"1, preferiblemente por lo menos 0.2 x 10'4 seg'1 , aún más preferiblemente por lo menos 0.5 x 10"4 seg"1 y particularmente se prefiere por lo menos 1 x 10"4 seg"1 , por lo menos 2 x 0'4 seg"1, por lo menos 3 x 10'4 seg'1 o por lo menos 5 x 10'4 seg'1. Se prefiere que se determine el valor bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 7 Se sabe en la técnica que el His264 de HMG CoA sintasa aviar cumple una función en la interacción de la enzima con acetoacetil-CoA y que la variante Ala264 carece de interacción con el oxígeno de la unidad estructural de tioéster de acetoacetil-CoA (Misraa et al., Biochem. 35 (1996), 9610-9616). Así, con el fin de desarrollar variantes de HMG CoA sintasa que muestra una menor aceptación de acetoacetil-CoA como un sustrato pero que acepta la acetona como un sustrato, es concebible para mutar sistemáticamente en una HMG CoA sintasa el residuo de histidina que corresponde a His264 de la HMG CoA sintasa aviar descrita en Misraa et al. (loe. cit.) con el fin de reducir o desechar la aceptación de acetoacetil-CoA como sustrato.

Adicionalmente, se pueden proporcionar variantes HMG CoA sintasa que muestran un aumento de actividad. Steussy et al. (Biochemistry 45 (2006), 14407-1 414), por ejemplo, describe un mutante de la Enterococcus faecal es HMG CoA sintasa que la que Alai 10 se cambia a Gly110 y que muestra un aumento de 140 veces del índice de reacción general.

Los métodos para identificar variantes con propiedades enzimáticas mejoradas en cuanto a la producción de 3-hidroxi-3-metilbutirato también se pueden llevar a cabo en la presencia de un cofactor que permite complementacion estérica y/o electrónica en el sitio catalítico de la enzima/enzimas debido al hecho de que el sustrato de acetona es más corto que el sustrato natural acetoacetil-CoA of, HMG CoA sintasa. Un ejemplo de tal un cofactor sería la coenzima A o una molécula relacionada estrecha y estructuralmente tal como S-nitroso-CoA.

La versión modificada de la HMG CoA sintasa que acepta acetona como un sustrato pero que tiene una baja afinidad con acetoacetil-CoA como un sustrato o no acepta más acetoacetil-CoA como un sustrato se puede derivar de una HMG CoA sintasa de ocurrencia natural o de una HMG CoA sintasa ya modificada, optimizada o sintetizada sintéticamente.

Otro ejemplo de una proteína que se puede utilizar en un método de acuerdo con la invención es una proteína PksG. En el contexto de la presente solicitud el término "proteína PksG" o "una proteína/enzima que tiene actividad de una proteína PksG" se refiere a cualquier enzima que es capaz de catalizar la reacción que se cataliza naturalmente por la proteína PksG, es decir la transferencia de -CH2COO" a partir de acetil-S-AcpK (Ac-S-AcpK) a un intermedio de policétido de ß-cetotioéster ligado a uno de los dominios de tiolación de la proteina PskL Esta es una reacción que es análoga a aquella catalizada por HMG CoA sintasa con la diferencia de que el acetil-tioéster de la porción de fosfopanteteiio se adhiere a una proteína portadora en lugar de una parte de la Coenzima A. Aunque la proteína PksG en la reacción que cataliza naturalmente transfiere el grupo acetilo desde el acetil-S-AcpK a un aceptor, se ha mostrado en el contexto de la presente invención que la proteína PksG también puede efectuar la reacción que se cataliza normalmente mediante la HMG CoA sintasa, es decir la síntesis de HMG CoA partiendo de acetoacetil CoA y acetil CoA (ver Ejemplo 3 en donde se muestra en la Tabla 1 que la enzima de Mycobacterium marinum (B2HGT6) puede actuar sobre acetoacetil CoA y acetil CoA).

La actividad enzimática de la proteína PksG se puede medir mediante métodos conocidos en la técnica. Un ensayo posible utilizado preferiblemente se describe, por ejemplo, en Calderone et al. (Proc. Nati. Acad. Scí. USA 103 (2006), 8977-8982). En este ensayo acetoacetil (Acac)-S-PksL-T2 se utiliza como un sustrato modelo y se incuba junto con Ac-S-AcpK y la proteína PksG. La formación de HMG-S-PksL-T2 indica que la proteína PksG es capaz de transferir el grupo carboximetilo -CH2-C02H desde Ac-S-AcpK hasta (Acac)-S-PksL-T2. La formación de HMG-S-PksL-T2 se puede determinar ya sea mediante ionización por electrorrociado (ESI)-FT S o en una autorradiografía. En una modalidad preferida los ensayos correspondientes se llevan a cabo cpmo se describe en la página 8982 de Calderone et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103 (2006), 8977-8982).

La proteína PksG es parte de la ruta pksX en el Bacillus subtilis que codifica las enzimas responsables de la biosíntesis de bacillaene (Butcher et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 104 (2007), 1506-1509). Las proteínas codificadas son AcpK, PksC, PksL, PksF, PksG, PksH y Pksl. De acuerdo con Calderone et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103 (2006), 8977-8982) estas enzimas actúan para incorporar un acetato derivado de una ramificación de ß-metilo sobre una proteína portadora acetoacetil-S.

En una modalidad preferida de la presente invención la proteína PksG es una enzima que comprende una secuencia de aminoácido como se muestra en la SEQ ID NO: 15 o 16 o una secuencia que es por lo menos n % idéntica a la SEQ ID NO: 1 5 o 16 y que tiene la actividad de una proteína PksG con n que es un entero entre 10 y 100, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99. La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácido de la proteína PksG del Bacillus subtilis (P40830) y la SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácido de la proteina PksG de Mycobacterium marinum (B2HGT6).

En cuanto a la determinación del grado de identidad de secuencia la muestra aplica como se ha establecido anteriormente en relación con la HMG CoA sintasa.

La proteína PksG empleada en el proceso de acuerdo con la invención puede ser una proteína PksG de ocurrencia natural o puede ser una proteína PksG que se deriva de una proteína PksG de ocurrencia natural, por ejemplo mediante la introducción de mutaciones u otras alteraciones que, por ejemplo, alteran o mejoran la actividad enzimática, la estabilidad, etc.

El término "proteína PksG" o "una proteína/enzima que tiene actividad de una proteína PksG" en el contexto de la presente solicitud también cubre enzimas que se derivan de una proteína PksG, que son capaces de producir 3-hidroxi-3-metilbutirato mediante una conversión enzimática de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente, preferiblemente acetil-CoA, pero que solo tiene una baja afinidad a sus sustrato natural o no acepta más su sustrato natural. Tal una modificación del sustrato preferido de una proteína PksG permite mejorar la conversión de acetona en 3-hidroxi-3-metilbutirato y reducir la producción del subproducto no deseado. Los métodos para modificar y/o mejorar las actividades enzimáticas deseadas de proteínas son bien conocidos por el experto en la técnica y se han descrito anteriormente. Las variantes de proteína PksG resultantes luego se prueban para su actividad enzimática y en particular por su capacidad de preferir la acetona como un sustrato. Un ensayo para medir la capacidad de una proteína PksG para utilizar acetona como un sustrato es el descrito en el Ejemplo 5 para la HMG-CoA sintasa. La formación de 3-hidroxi-3-metilbutirato se puede detectar como se describió anteriormente.

Tales métodos para identificar las variantes con propiedades enzimáticas mejoradas en cuanto a la producción de 3-hidrox¡-3-metilbutirato también se pueden llevar a cabo en la presencia de un cofactor que permite para una complementación esférica y/o electrónica en el sitio catalítico de la enzima/enzimas debido al hecho de que el sustrato acetona es más corto que el sustrato natural de la proteína PksG.

La versión modificada de la proteína PksG que acepta la acetona como un sustrato pero que tiene una baja afinidad a o no acepta más su sustrato natural se puede derivar de una proteína PksG de ocurrencia natural o de una proteína PksG ya modificada, optimizada o sintetizada sintéticamente.

En el contexto de la presente invención el término "Liasa de corte de enlace C-C/condensación" o "una proteína/enzima que tiene actividad de una liasa de corte de enlace C-C/condensación" se refiere a una enzima que es capaz de dividir o formar mediante condensación un enlace C-C y que contiene un dominio de barril denominada TIM (triosa-fosfato isomerasa). Este dominio de barril TIM se encuentra en un número de enzimas que unen el piruvato y enzimas dependientes de acetil-CoA (Forouhar et al. J. Biol. Chem. 281 (2006), 7533-7545). El dominio de barril TIM tiene el linaje de clasificación 3.20.20.150 en la base de datos de clasificación de proteína CATH (www.cathdb.info/cathnode/3.20.20.150 ).

El término "Masas de corte de enlace C-C/condensación" en particular incluye enzimas que se clasifican como isopropilmalato sintasa (EC 2.3.3.13), como homocitrato sintasa (EC 2.3.3.14) o como 4-hidroxi-2-cetovalerato aldolasa (EC 4.1.3.39). La isopropilmalato sintasa cataliza la siguiente reacción: acetil-CoA + 3-metil-2-oxobutanoato + H20? (2S)-2-isopropilmalato + CoA. Ejemplos para tales enzimas son la correspondiente enzima de Brucella abortus (cepa 2308; Q2YRT1) y la correspondiente enzima de Hahella chejuensis (cepa KCTC 2396; Q2SFA7).

Un homocitrato sintasa (EC 2.3.3.14) es una enzima que cataliza la reacción química acetíl-CoA + H20 + 2-oxoglutarato ? (R)-2-hidroxibutano-1 ,2,4-tricarboxilato + CoA. La 4-hidroxi-2- cetovalerato aldolasa cataliza la reacción química 4-hidroxi-2-oxopentanoato ? acetaldehído + piruvato.

En el contexto de la presente invención el término "HMG CoA Masa" o "una proteína/enzima que tiene actividad de una HMG CoA Masa" se refiere a cualquier enzima que se clasifica en el número EC EC 4.1.3.4, en particular se refiere a cualquier enzima que es capaz de catalizar la división de HMG CoA en acetil CoA y acetoacetato (ver Figura 3) o el inverso de esta reacción, es decir la producción de HMG CoA a través de la condensación de acetil CoA y acetoacetato, y el término también se refiere a cualquier enzima que se deriva de tal una HMG CoA asa y que es capaz de catalizar la conversión de acetona y un compuesto proporcionando un grupo acetilo activado como se definió anteriormente, preferiblemente acetil CoA, en 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA. En el contexto de la presente invención el 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA producido luego se puede hidrolizar para producir 3-hidroxi-3-metilbutirato. Esto se puede alcanzar mediante medidas conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo al hacer uso de una acil-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.20) o una acil-CoA transferasa (EC 2.8.3.8).

La actividad enzimática de HMG CoA Nasa se puede medir mediante métodos bien conocidos en la técnica. Se describe un posible ensayo, por ejemplo, en Melianby et al. (Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer Ed. (1963), 454-458). En particular, la actividad de enzima se mide mediante un ensayo espectrofotométrico utilizando la reducción dependiente de NADH de acetoacetato mediante 3-hidroxibutirato deshidrogenasa.

Preferiblemente la actividad de HMG CoA Masa se ensaya como se describe en el Ejemplo 4. En tal un ensayo la mezcla de reacción (1 mi) contiene 40 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM de MgCI2, 0.5 mM de DTT, 0.4 mM de HMG-CoA, 0.2 mM de NADH, 5 unidades de 3-hidroxibutirato deshidrogenasa y se incuba durante 5 min antes de agregar 0.005 mg/ml de HMG-CoA Masa y luego el progreso de la reacción se monitorea por la reducción en la absorbancia a 340 nm.

La reacción catalizada por HMG CoA Masa se describe en algunos ejemplos para requerir la presencia de un catión divalente, tal como Mg2+ o Mn2+. Así, se prefiere que un ensayo para determinar la actividad de HMG CoA asa incluye tales cationes divalentes y que el método de acuerdo con la invención para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico, si se hace uso de HMG CoA Masa, se lleva a cabo en la presencia de tales cationes.

La HMG CoA asa es parte de la cetogénesis hepática. Esta cataliza la reacción terminal en la cetogénesis hepática que es una etapa clave de esta ruta. La reacción es también una etapa importante en el catabolismo de leucina.

Se ha descrito la HMG CoA Masa para diversos organismos. Ls secuencias de aminoácido y ácido nucleico que codifican las HMG CoA Masas están disponibles de numerosas fuentes. Generalmente, las secuencias solo comparten un grado de identidad intermedio de secuencia general. Por ejemplo, las enzimas de Bacillus subtilis o Brucella melitensis solo muestran aproximadamente 45% de identidad con aquella de la HMG CoA asa humana (Forouhar et al., J. Biol. Chem. 281 (2006), 7533-7545). Se ha determinado la estructura tridimensional de diversas enzimas HMG CoA Masa y los aminoácidos cruciales para la reacción enzimática son en principio bien caracterizadas (Forouhar et al., loe. c¡ ; Fu et al., J. Biol. Chem. 281 (2006), 7526-7532). En los eucariotes la HMG CoA Masa se localiza en la matriz mitocondrial.

En principio cualquier se puede utilizar la enzima HMG CoA Masa en el contexto de la presente invención, en particular de organismos procarióticos o eucarióticos.

Se describen las HMG CoA Masas procarióticas, por ejemplo, de Brucella abortus (números de acceso UniProt Q2YPL0 y B2S7S2), Bacillus subtilis (número de acceso UniProt 034873), Bacillus licheniformis (Fu et al., loe. cit.),, Pseudomonas syringae (números de acceso UniProt Q4ZTL2 y Q4Z W6), Pseudomonas mevalonii (número de acceso UniProt P13703), Shewanella piezotolerans (número de acceso UniProt B8CRY9), Cellvibrio japonicus (número de acceso UniProt B3PCQ7), Azotobacter vinelandii (números de acceso UniProt C1DJK8 y C1DL53), Herminiimonas arsenicoxidans (número de acceso UniProt A4G1F2) y Burkhoideria cenocepacia (número de acceso UniProt A2VUW7).

Más aún, la siguiente Tabla B enumera algunas HMG CoA liasas conocidas de procariotes: Tabla B: Se describen HMG CoA Masas eucarióticas, por ejemplo, de plantas, tales como rábano (Raphanus sativus) y Zea mays (Número de acceso B6U7B9, banco de genes ACG45252) y animales, tales como humano (Homo sapiens; número de acceso Uniprot P35914), mono cinomolgo (número de acceso UniProt Q8XZ6), orangután de Sumatra (Pongo abelii; número de acceso Uniprot Q5R9E1), rata (Rattus norvegicus; número de acceso Uniprot P97519; Fu et al., loe. cit.) . Mus musculus (número de acceso UniProt P38060), pato (Anas spec), ganado (Bos taurus; número de acceso Uniprot Q29448), cabra (Capra hircus), paloma (Columba livia), pollo (Gallus gallus; número de acceso Uniprot P35915), oveja (Ovis aries), cerdo pig (Sus scrofa), Danio rerio (Brachydanio rerio; A8WG57, banco de genes BC 154587) y de los protozoos Tetrahymena pyriformis.

Se dan ejemplos de HMG CoA liasas de diferentes organismos en la SEQ ID NOs: 17 a 23. La SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de la HMG CoA liasa de Zea mays (Número de acceso B6U7B9, banco de genes ACG45252), la SEQ ID NO: 18 muestra la secuencia de la HMG CoA liasa de Danio rerio (Brachydanio rerio; A8WG57, banco de genes BC 154587), la SEQ ID NO: 19 muestra la secuencia de la HMG CoA liasa de Bos taurus (número de acceso Uniprot Q29448) y SEQ ID NO: 20 muestra la secuencia de la HMG CoA liasa de Homo sapiens (mitocondrial , número de acceso Uniprot P35914, banco de genes HUMHYMEGLA), la SEQ ID NO: 21 muestra la secuencia de la HMG CoA liasa de Pseudomonas putida (Q88H25) , la S EQ I D NO: 22 muestra la secuencia de la HMG CoA liasa de Acinetobacter baumannii (B7H4C6) y SEQ I D NO: 23 muestra la secuencia de la HMG CoA liasa de Thermus thermophilus (Q72I H0).

En una modalidad preferida de la presente invención la HMG CoA liasa es una enzima que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 1 7 a 23 o una secuencia que es por lo menos n % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 7 a 23 y que tiene la actividad de una HMG CoA liasa con n que es un entero entre 1 0 y 1 00, preferiblemente 1 0, 1 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92 , 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99.

En cuanto a la determinación del grado de identidad de secuencia la muestra aplica como se ha establecido anteriormente en relación con HMG CoA sintasa.

La HMG CoA liasa empleada en el proceso de acuerdo con la invención puede ser una H MG CoA liasa de ocurrencia natural o puede ser una H MG CoA liasa que se deriva de una HMG CoA liasa de ocurrencia natural, por ejemplo mediante la introducción de mutaciones u otras alteraciones que, por ejemplo, alteran o mejoran la actividad enzimática, la estabilidad , etc.

El término "HMG CoA liasa" o "una proteína/enzima que tiene actividad de una HMG CoA Masa" en el contexto de la presente solicitud también cubre enzimas de se derivan de una HMG CoA Masa, que son capaces de producir 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA mediante una condensación de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente, preferiblemente acetil-CoA pero que solo tiene una baja afinidad a acetoacetato como un sustrato o no acepta más acetoacetato como un sustrato. Tal una modificación del sustrato preferido de una HMG CoA Masa permite mejorar la conversión de acetona en 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA y reducir la producción del subproducto HMG-CoA. Los métodos para modificar y/o mejorar las actividades enzimáticas deseadas de las proteínas son bien conocidos por el experto en la técnica y se han descrito anteriormente.

La capacidad de una enzima dada para catalizar la producción de 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA se puede determinar en un ensayo como se describe en el Ejemplo 6.

La versión modificada de la HMG CoA asa que acepta acetona como un sustrato pero que tiene una baja afinidad para acetoacetato como un sustrato o no acepta más acetoacetato como un sustrato que se puede derivar de una HMG CoA Masa de ocurrencia natural o de una HMG CoA asa ya modificada, optimizada y sintetizada sistémicamente.

En el proceso de acuerdo con la invención es posilble emplear solo una enzima como se definió anteriormente, por ejemplo solo una HMG CoA sintasa o solo una HMG CoA Masa o solo una proteína PksG. Sin embargo, por supuesto también es posible emplear más de una actividad, es decir diferentes enzimas, en particular cualquier combinación de una HMG CoA sintasa y una HMG CoA Masa y una proteína PksG. Por ejemplo, en el caso de un método in vitro, más de una actividad de enzima se puede agregar a la mezcla de reacción, ya sea de forma simultánea o posteriormente en cualquier orden posible. En un método in vivo que emplea organismos, en particular microorganismos, es, por ejemplo, posible utilizar un organismo, en particular microorganismo, que expresa una enzima como se definió anteriormente. Sin embargo, también es concebible utilizar un organismo/microorganismo que expresa cualquier combinación posible de las enzimas mencionadas anteriormente. Más aún, también es posible utilizar una mezcla de dos o más tipos de organismos/microorganismos con un tipo que expresa una enzima y otro que expresa otra enzima. Estos diferentes tipos luego se pueden cocultivar.

La enzima, por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o proteína PksG y/o una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA Masa, empleada en el proceso de acuerdo con la presente invención puede ser una versión natural de la proteína o una proteína sintética así como también una proteína que se ha sintetizado o producido químicamente en un sistema biológico o mediante procesos recombinante. La enzima, por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o proteína PksG y/o una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA Masa, también se puede modificar químicamente, por ejemplo con el fin de mejorar su/sus estabilidad, resistencia, por ejemplo a temperatura, para facilitar su purificación o su inmovilización sobre un soporte. La enzima/enzimas se pueden utilizar en forma aislada, forma purificada, en forma inmovilizada , como un crudo o extracto parcialmente purificado obtenido a partir de células que sintetizan la enzima/enzimas, como enzima(s) químicamente sintetizadas, como enzima(s) producidas recombinantemente, en la forma de microorganismos producidos que los producen etc.

El proceso de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo in vitro o in vivo. Una reacción in vitro se entiende que es una reacción en la que no se emplean células, es decir una reacción acelular.

Para llevar a cabo el proceso in vitro el sustrato para la reacción y la enzima/enzimas se incuban bajo condiciones (regulador, temperatura, cofactores etc. ) que permiten la enzima/enzimas para ser activas y puede ocurrir la conversión enzimática. La reacción se deja proceder durante un tiempo suficiente para producir 3-hidroxi-3-metilbutirato. La producción de 3-hidroxi-3-metilbutirato y/o 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA se puede detectar mediante comparación con compuesto estándar después de separación mediante cromatografía de capa fina, LC/MS y ensayo colorimétrico después de su derivación .

La enzima/enzimas puede estar en una forma adecuada que permite que tenga lugar la reacción enzimática . Se pueden purificar o purificar parcialmente o en la forma de extractos celulares crudos o extractos parcialmente purificados. También es posible que la enzima/enzimas se inmovilizan sobre un portador adecuado.

Debido a que el sustrato acetona es en general más corto que el sustrato natural utilizado por la enzima, por ejemplo acetoacetilo-CoA/acetoacetato utilizado por la HMG CoA sintasa y HMG CoA Masa, respectivamente, puede ser ventajoso agregar a la mezcla de reacción un cofactor que permite una complementación estérica y/o electrónica en el sitio catalítico de la enzima/enzimas. Un ejemplo de tal un cofactor, en el caso de HMG CoA sintasa, sería la coenzima A o una molécula relacionada estrecha y estructuralmente tal como S-nitroso-CoA.

Para llevar a cabo el proceso in vivo se hace uso de un organismo/microorganismo(s) adecuado que es/son capaces de proporcionar los sustratos, es decir acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente, y una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado, en una modalidad preferida dicha enzima es una HMG CoA sintasa y/o proteína PksG y/o una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA liasa.

Así, en el caso de esta modalidad el método de acuerdo con la invención se caracteriza porque la conversión de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado se realiza en la presencia de un organismo, preferiblemente un microorganismo capaz de producir acetona y que expresa una enzima que es capaz de la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado, preferiblemente que expresa una enzima con la actividad de una sintasa HMG CoA (EC 2.3.3.10) y/o que expresa una proteína PksG y/o que expresa una enzima con la actividad de una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA Masa (EC 4.1.3.4).

El término "que es capaz de producir acetona" en el contexto de la presente invención significa que el organismo/microorganismo tiene la capacidad para producir acetona dentro de la célula debido a la presencia de enzimas que proporcionan actividades enzimáticas que permiten la producción de acetona a partir de precursores metabólicos.

Se produce la acetona mediante ciertos microorganismos, tales como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa y Pseudomonas putida. La síntesis de la acetona se caracteriza mejor en Clostridium acetobutylicum. Esta empieza con una reacción (etapa de reacción 1) en las que dos moléculas de acetil-CoA se condensan en acetoacetil-CoA. Esta reacción se cataliza mediante acetil-CoA acetiltransferasa (EC 2.3.1.9). El Acetoacetil-CoA luego se convierte en acetoacetato mediante una reacción con ácido acético o ácido butírico que resulta también en la producción de acetil-CoA o butiril-CoA (etapa de reacción 2). Esta reacción se cataliza por ejemplo mediante acetoacetilCoA transferasa (EC 2.8.3.8). La acetoacetilCoA transferasa se conoce a partir de diversos organismos, por ejemplo a partir de E . coli en la que está se codificada por el gene atoAD o a partir de Clostridium acetobutylicum en la que esta se codifica por el gene ctfAB.

Sin embargo, también otras enzimas pueden catalizar esta reacción, por ejem plo 3-oxoácido CoA transferasa (EC 2.8.3.5) o succinato CoA ligasa (EC 6.2.1 .5).

Finalmente, se convierte el acetoacetato en acetona mediante una etapa de descarboxilación (etapa de reacción 3) catalizada por acetoacetato descarboxilasa (EC 4.1 . 1 .4) .

Las etapas de reacción descritas anteriormente 1 y 2 y las enzimas que las catalizan no son características para la síntesis de acetona y se pueden encontrar en diversos organismos. En contraste, al etapa de reacción 3 que se cataliza mediante acetoacetato descarboxilasa (EC 4.1 . 1 .4) solo se encuentra en aquellos organismos que son capaces de producir acetona .

En una modalidad preferida el organismo empleado en el método de acuerdo con la invención es un organismo, preferiblemente un microorganismo, que tiene naturalmente la capacidad de producir acetona. Así, preferiblemente el microorganismo pertenece al género Clostridium, Bacillus o Pseudomonas, más preferiblemente a la especie Clostridium acetobutylicum , Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum , Bacillus polymyxa o Pseudomonas putida.

En una modalidad preferida adicional , el organismo empleado en el método de acuerdo con la invención es un organismo, preferiblemente un microorganismo, que tiene naturalmente la capacidad para producir acetona y que es recombinante en el sentido que se ha modificado genéticamente, adicionalmente con el fin de expresar una enzima como se definió anteriormente. El término "recombinante" en una modalidad significa que el organismo se modifica genéticamente con el fin de contener una molécula de ácido nucleico externa que codifica una enzima como se definió anteriormente. En una modalidad preferida el organismo se ha modificado genéticamente con el fin de contener una molécula de ácido nucleico externa que codifica una enzima como se definió anteriormente, por ejemplo una HMG CoA sintasa, una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA Masa, o una proteína PksG o una secuencia de ácido nucleico externa que codifica cualquier combinación posible de tales proteínas. El término "externo" en este contexto significa que la molécula de ácido nucleico no ocurre naturalmente en dicho organismo/microorganismo. Esto significa que no ocurre en la misma estructura o en la misma estructura o en la misma ubicación en el organismo/microorganismo. En una modalidad preferida, la molécula ácido nucleico externo es una molécula recombinante que comprende un promotor y una secuencia codificante que codifica la respectiva enzima, por ejemplo una HMG CoA sintasa y/o una asa de corte de enlace C-C/condensación, tal como HMG CoA asa, y/o una proteína PksG, en la que el promotor que maneja la expresión de la secuencia codificante es heteróloga con respecto a la secuencia codificante. Heterólogo en este contexto significa que el promotor no es el promotor que maneja en forma natural la expresión de dicha secuencia codificante pero es un promotor que maneja en forma natural la expresión de una secuencia codificante diferente, es decir, se deriva de otro gene, o es un promotor sintético o un promotor quimérico. Preferiblemente, el promotor es un promotor heterólogo al organismo/microorganismo, es decir un promotor que no ocurre naturalmente en el organismo/microorganismo respectivo. Aún más preferiblemente, el promotor es un promotor inducible. Los promotores para manejar la expresión en diferentes tipos de organismos, en particular en microorganismos, son bien conocidos por el experto en la técnica.

En otra modalidad preferida la molécula de ácido nucleico es externa para el organismo/microorganismo en el que la enzima(s) codificada, por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o la división del enlace C-C codificada/condensación liasa, tal como HMG CoA Masa, y/o proteína PksG, no es/son endógena para el organismo/microorganismo, es decir no se expresan naturalmente mediante el organismo/microorganismo cuando no se modifica genéticamente. En otras palabras, la HMG CoA sintasa codificada y/o la división del enlace C-C codificada/condensación liasa, tal como H MG CoA liasa, y/o proteína PksG es/son heteróloga con respecto a el organismo/microorganismo.

El término "recombinante" en otra modalidad significa que el organismo se modifica genéticamente en la región reg uladora que controla la expresión de una enzima como se definió anteriormente que ocurre naturalmente en el organismo con el fin de llevar a un aumento en la expresión de la respectiva enzima en comparación con un organismo no modificado genéticamente correspondiente. El significado del término "expresión mayor" se describe adicionalmente adelante.

Tal una modificación de una región reguladora se puede alcanzar mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Un ejemplo es intercambiar el promotor de ocurrencia natural mediante un promotor que permite una mayor expresión o modificar el promotor de ocurrencia natural con el fin de mostrar una mayor expresión. Así, en esta modalidad el organismo contiene en la región reguladora del gene que codifica una enzima como se definió anteriormente una molécula de ácido nucleico externa que no ocurre naturalmente en el organismo y que lleva a una mayor expresión de la enzima en comparación con un organismo no modificado genéticamente correspondiente.

La molécula ácido nucleico externo puede estar presente en el organismo/microorganismo en forma extracromosómica, por ejemplo como el plásmido, o se integra de forma estable en el cromosoma. Se prefiere una integración estable.

En una modalidad preferida adicional el organismo/microorganismo se caracteriza porque la expresión/actividad de una enzima como se definió anteriormente, por ejemplo de una sintasa HMG CoA y/o una liasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como HMG CoA liasa, y/o una proteína PksG, es mayor en el organismo/microorganismo genéticamente modificado con la molécula ácido nucleico externo en comparación con el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente. Una expresión/actividad "mayor" significa que la expresión/actividad de la enzima, en particular de la HMG CoA sintasa y/o una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como HMG CoA Masa, y/o una proteína PksG, en el m icrooganismo modificado genéticamente es por lo menos 10% , preferiblemente por lo menos 20% , más preferiblemente por lo menos 30% o 50% , aún más preferiblemente por lo menos 70% o 80% y particularmente preferido por lo menos 90% o 100% mayor que en el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente. En modalidades aún más preferidas el aumento en la expresión/actividad puede ser por lo menos 1 50% , por lo menos 200% o por lo menos 500%. En modalidades particularmente preferidas la expresión es por lo menos 1 0 veces, más preferiblemente por lo menos 1 00 veces y aún más preferido por lo menos 1000 veces mayor que en el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente.

El término expresión/actividad "mayor" también cubre la situación en la que el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente no expresa una enzima correspondiente, por ejemplo una HMG CoA sintasa y/o una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA asa , y/o una proteína PksG , de tal manera que la expresión/ actividad correspondiente en el organismo/ microorganismo no modificado genéticamente es cero.

Los métodos para medir el nivel de expresión de una proteína dada en una célula son bien conocidos por el experto en la técnica. En una modalidad, la medición del nivel de expresión se hace al medir la cantidad de la proteína correspondiente. Los métodos correspondientes son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen Western Blot, ELISA etc. En otra modalidad la medición del nivel de expresión se hace al medir la cantidad del RNA correspondiente. Los métodos correspondientes son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen , por ejemplo, Northern Blot.

Los métodos para medir la actividad enzimática de las enzimas anteriormente mencionadas, en particular HMG CoA sintasa y/o una liasa de corte de enlace C-C/condensación , tal como una HMG CoA Masa, y/o una proteína PksG , respectivamente, se conocen en la técnica y ya se han descrito anteriormente.

En otra modalidad preferida, el organismo empleado en el método de acuerdo con la invención es un organismo modificado genéticamente, preferiblemente un microorganismo, derivado de un organismo/microorganismo que naturalmente no produce acetona pero que se ha modificado genéticamente con el fin de producir acetona, es decir al introducir los genes necesarios para permitir la producción de acetona en el organismo/microorganismo. En principio cualquier microorganismo se puede modificar genéticamente en esta forma. Las enzimas responsables para la síntesis de la acetona se han descrito anteriormente. Se conocen los genes que codifican las enzimas correspondientes en la técnica y se pueden utilizar para modificar genéticamente un microorganismo dado con el fin de producir acetona. Como se describió anteriormente, las etapas de reacción 1 y 2 de la síntesis de acetona ocurren en forma natural en la mayoría de los organismos. Sin embargo, la etapa de reacción 3 es característica y crucial para la síntesis de acetona. Así, en una modalidad preferida, un organismo /microorganismo modificado genéticamente derivado de un organismo/microorganismo que naturalmente no produce acetona se modifica con el fin de contener una secuencia de nucleótido que codifica una enzima que cataliza la conversión de acetoacetato en acetona mediante descarboxilación, por ejemplo un acetoacetato descarboxilasa (EC 4.1 .1 .4). Las secuencias de nucleótido de varios organismos que codifican esta enzima se conocen en la técnica , por ejemplo el gene adc de Clostridium acetobutylicum (número de acceso Uniprots P23670 y P23673), Clostridium beijerinckii (Clostridium MP; Q9RPK1 ), Clostridium pasteurianum (número de acceso Uniprot P81 336) , Bradyrhizobium sp. (cepa BTAM / ATCC BAA- 1 1 82; número de acceso Uniprot A5EBU7), Burkholderia mallei (ATCC 1 0399 A9LBS0) , Burkholderia mallei (número de acceso Uniprot A3MAE3), Burkholderia mallei FMH A5XJB2, Burkholderia cenocepacia (número de acceso Uniprot A0B471 ) , Burkholderia ambifaria (número de acceso Uniprot Q0b5P 1 ), Burkholderia phytofirmans (número de acceso Uniprot B2T31 9), Burkholderia spec. (número de acceso Uniprot Q38ZU0) , Clostridium botulinum (número de acceso Uniprot B2TLN8) , Ralstonia pickettii (número de acceso Uniprot B2UIG7), Streptomyces nogalater (número de acceso Uniprot Q9EYI7), Streptomyces avermitilis (número de acceso Uniprot Q82NF4), Legionella pneumophila (número de acceso Uniprot Q5ZXQ9), Lactobacillus salivarius (número de acceso Uniprot Q 1 WVG5), Rhodococcus spec. (número de acceso Uniprot Q0S7W4), Lactobacillus plantarum (número de acceso Uniprot Q890G0) , Rhizobium leguminosarum (número de acceso Uniprot Q 1 91 1 ) , Lactobacillus casei (número de acceso Uniprot Q03B66), Francisella tularensis (número de acceso Uniprot Q0BLC9), Saccharopolyspora erythreae (número de acceso Uniprot A4FKR9) , Korarchaeum cryptoftlum (número de acceso Uniprot B 1 L3N6), Bacillus amyloliquefaciens (número de acceso Uniprot A7Z8K8) , Cochliobolus heterostrophus (número de acceso Uniprot Q8NJQ3), Sulfolobus islandicus (número de acceso Uniprot C3ML22) y Francisella tularensis subsp. holarctica (cepa OSU 1 8).

Más preferiblemente, el organismo, preferiblemente el microorganismo, se modifica genéticamente con el fin de transportar con una molécula de ácido nucleico una enzima capaz de catalizar la etapa 2 de la reacción mencionada anteriormente de la s íntesis de acetona, es decir la conversión de acetoacetil CoA en acetoacetato.

Aún más preferiblemente, el organ ismo, preferiblemente el microorganismo, se modifica genéticamente con el fin de ser transformado con una molécula de ácido nucleico una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 1 de la síntesis de acetona, es decir la condensación de dos moléculas de acetil CoA en acetoacetatil CoA.

En una modalidad particularmente preferida el organismo/microorganismo se modifica genéticamente con el fin de ser transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 1 de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 2 de la síntesis de acetona o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 1 de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 3 de la síntesis de acetona o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 2 de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 3 de la síntesis de acetona o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 1 de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 2 de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 3 de la síntesis de acetona.

Los métodos para preparar el organismo modificado genéticamente anteriormente mencionado, preferiblemente los microorganismos, son bien conocidos en la técnica . Así, generalmente, el organismo/microorganismo se transforma con una construcción de DNA que permite la expresión de la respectiva enzima en el microorganismo. Tal construcción comprende normalmente la secuencia codificante en cuestión ligada a las secuencias reguladoras que permiten la transcripción y traducción en la célula anfitriona respectiva, por ejemplo un promotor y/ mejorador y/o terminador de transcripción y/o sitios de unión de ribosoma etc. La técnica anterior ya describe microorganismos que se han modificado genéticamente con el fin de ser capaz de producir acetona. En particular se han introducido genes de, por ejemplo, Clostridium acetobutylicum en E. coli permitiendo por lo tanto la síntesis de la acetona en E. coli, una bacterias que naturalmente no produce acetona (Bermejo et al . , Appl. Environ. Microbiol. 64 (1 998); 1 079-1085; Hanai et al. , Appl . Environ . Microbiol. 73 (2007), 7814-781 8). En particular Hanai et al . (loe. cit. ) muestra que es suficiente introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica un acetoacetato descarboxilasa (tal como aquella del Clostridium acetobutylicum) con el fin de alcanzar producción de acetona en E. coli que indica que las enzimas endógenas en E . coli que cataliza las etapas de reacción mencionadas anteriormente 1 y 2 (es decir los productos de la expresión de los genes atoB y atoAD de E. coli) son suficientes para proporcionar el sustrato para la producción de acetona.

En una modalidad particularmente preferida el organismo, preferiblemente un microorganismo, empleado en el método de acuerdo con la invención es un organismo/microorganismo recombinante derivado de un organismo/microorganismo que naturalmente no produce acetona pero que se ha modificado genéticamente, como se describió anteriormente, con el fin de producir acetona y que expresa una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C = 0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente. El término '"recombinante" en este contexto preferiblemente significa que el organismo se recombina en el sentido que ha sido además modificado genéticamente con el fin de expresar una enzima como se definió anteriormente. El término "recombinante" en una modalidad significa que el organismo se modifica genéticamente con el fin de contener una molécula de ácido nucleico externa que codifica una enzima como se definió anteriormente, por ejemplo una HMG CoA sintasa o una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA Masa, o una proteína PksG, o una molécula de ácido nucleico externa que codifica cualquier combinación posible de las enzimas definidas anteriormente.

En cuanto a la definición del término "molécula de ácido nucleico externo" lo mismo aplica a lo que ya ha se ha expuesto anteriormente.

El término "recombinante" en otra modalidad significa que el organismo se modifica genéticamente en la región reguladora que controla la expresión de una enzima como se definió anteriormente que ocurre naturalmente en el organismo con el fin de llevar a un aumento en la expresión de la respectiva enzima en comparación con un organismo no modificado genéticamente correspondiente. El significado del término "expresión mayor" se describe adicionalmente adelante.

Preferiblemente tal un organismo/microorganismo se caracteriza porque la expresión/actividad de dicha enzima , por ejemplo la H MG CoA sintasa y/o una liasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA liasa, y/o una proteína PksG , es mayor en el organismo /microorganismo recombinante en comparación con el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente. Una expresión/actividad "mayor" significa que la expresión/actividad de la enzima, por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o una liasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como HMG CoA liasa, y/o una proteína PksG, en el organismo /m icroorganismo modificado genéticamente es por lo menos 10%, preferiblemente por lo menos 20%, más preferiblemente por lo menos 30% o 50%, aún más preferiblemente por lo menos 70% o 80% y particularmente preferido por lo menos 90% o 1 00% mayor que en el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente, en modalidades aún más preferidas el aumento en la expresión/ actividad puede ser por lo menos 50%, por lo menos 200% o por lo menos 500% . En modalidades particularmente preferidas la expresión es por lo menos 10 veces, más preferiblemente por lo menos 100 veces y aún más preferido por lo menos 1 000 veces mayor que el el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente.

El término expresión/actividad "mayor" también cubre la situación en la que el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente no expresa dicha enzima, por ejemplo una H MG CoA sintasa y/o una Masa de corte de enlace C-C/condensación , tal como una HMG CoA liasa, y/o una proteína PksG, de tal manera que la expresión / actividad correspondiente en el organismo/ microorganismo no modificado genéticamente es cero. En cuanto a los métodos para medir el nivel de expresión o actividad, lo mismo aplica a lo que ya ha se ha expuesto anteriormente.

El término "organismo" como se utiliza en el contexto de la presente invención se refiere en general cualquier posible tipo de organismo, en particular organismos eucarióticos, organismos procarióticos y arqueobacterias. El término incluye animal, plantas, hongos, bacterias y arqueobacterias. El término también incluye células aisladas o agregados celulares de tales organismos, como tejido o callo.

En una modalidad preferida , el organismo es un microorganismo. El término "microorganismo" en el contexto de la presente invención se refiere a células procarióticas, en particular bacterias, así como también con hongos, tal como levaduras, y también con algas y las arqueobacterias. En una modalidad preferida, el microorganismo es una bacteria. En principio se puede utilizar cualquier bacteria. Las bacterias que se van a emplear en el proceso de acuerdo con la invención son bacterias del género Bacillus, Clostridium , Pseudomonas o Escherichia.

En una modalidad particularmente preferida la bacteria pertenece al género Escherichia y aún más preferida a la especie Escherichia coli.

En otra modalidad preferida el microorganismo es un hongo, más preferiblemente un hongo del género Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus o Trichoderma y aún más preferiblemente de la especie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger o de la especie Trichoderma reesei.

En todavía otra modalidad preferida el microorganismo es un microorganismo fotosintéticamente activo tal como bacterias que son capaz de llevar a cabo fotosíntesis o micro-algas.

En una modalidad particularmente preferida el m icroorganismo es un alga, más preferiblemente un alga que pertenece a las diatomáceas.

Si se utiliza microorganismo en el contexto del método de la presente invención, también es concebible llevar a cabo el método de acuerdo con la invención en una manera en que los dos tipos de microorganismos se emplean, es decir un tipo que produce acetona y un tipo que utiliza la acetona producida por el primer tipo de microorganismos para convertirse con la ayuda de una enzima como se definió anteriormente.

Cuando el proceso de acuerdo con la invención se lleva a cabo in vivo al utilizar microorganismos que proporcionan la actividad/actividades de enzima respectiva, los microorganismos se cultivan bajo condiciones de cultivo adecuadas que permiten la ocurrencia de las reacciones enzimáticas. Las condiciones de cultivo específicas dependen del microorganismo específico empleado pero son bien conocidos por el experto en la técnica. Las condiciones de cultivo se seleccionan generalmente en tal una forma que permiten la expresión de los genes que codifican las enzimas para las respectivas reacciones. Se conocen varios métodos por el experto en la técnica con el fin de mejorar y afinar la expresión de ciertos genes en ciertas etapas del cultivo tal como inducción de expresión de gene mediante inductores químicos o mediante un cambio de temperatura.

En otra modalidad preferida el organismo empleado en el método de acuerdo con la invención es un organismo que es capaz de fotosíntesis, tales como una planta o m icroalga . En principio se puede utilizar cualquier planta, es decir una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea. Es preferible utilizar una planta que se pueda cultivar en una escala agrícolamente significativa y que permite producir grandes cantidades de biomasa. Ejemplos son las gram íneas como Lolium, cereales como el centeno, cebada , avena, mijo, ma íz, otras plantas que almacenan almidón como la papa o plantas que almacenan azúcar como la remolacha o la caña de azúcar. También es concebible el uso de tabaco o de plantas vegetales tales como tomate, pimienta , cohombro, berenjena etc. Otra posibilidad es el uso de plantas que almacenan aceite tales como semillas de colza, olivas etc. También es concebible es el uso de árboles, en particular árboles de crecimiento rápido tales como eucalipto, álamo o árbol de caucho (Hevea brasiliensis) .

La presente invención también se relaciona con un organismo, preferiblemente un microorganismo, que se caracteriza por las siguientes características: (a) es capaz de producir acetona; y (b) expresa una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente, preferiblemente una enzima con la actividad de una sintasa HMG CoA (EC 2.3.3.1 0) y/o una enzima con la actividad de una Masa de corte de enlace C-C/condensación , tal como una H MG CoA Masa (EC 4.1 .3.4) y/o una proteína PksG.

En cuanto a la fuente, naturaleza, propiedades, secuencia etc. de la enzima, en particular la HMG CoA sintasa, la Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como H MG CoA Masa, y/o una proteína PksG expresada en el organismo de acuerdo con la invención , lo mismo aplica como se estableció anteriormente en relación con el método de acuerdo con la invención.

En una modalidad preferida, el organismo de acuerdo con la invención es un organismo, preferiblemente un microorganismo que naturalmente tiene la capacidad para producir la acetona, es decir, la característica (a) mencionada anteriormente es una característica que el organismo, preferiblemente el microorganismo, muestra en forma natural. Así, preferiblemente el organismo es un microorganismo que pertenece al género Clostridium , Bacillus o Pseudomonas, más preferiblemente a la especie Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum , Bacillus polymyxa o Pseudomonas putida .

En otra modalidad preferida, el organismo, preferiblemente el microorganismo, de acuerdo con la invención es un organismo/microorganismo modificado genéticamente derivado de un organismo/microorganismo que naturalmente no produce acetona pero que se ha modificado genéticamente con el fin de producir acetona , es decir al introducir los genes necesarios para permitir la producción de acetona en el organismo/microorganismo. En principio cualquier organismo /microorganismo se puede modificar genéticamente en esta forma. Las enzimas responsables para la síntesis de la acetona se han descrito anteriormente. Se conocen los genes que codifican las enzimas correspondientes en la técnica y se pueden utilizar para modificar genéticamente un organismo dado, preferiblemente el microorganismo con el fin de producir acetona.

En una modalidad preferida, un organismo/microorganismo modificado genéticamente derivado de un organismo/microorganismo que naturalmente no produce acetona se modifica con el fin de contener una secuencia de nucleótido que codifica una enzima que cataliza la conversión de acetoacetato en acetona mediante descarboxilación, por ejemplo un acetoacetato descarboxilasa (EC 4. 1 . 1 .4). Las secuencias de nucleótido de varios organismos que codifican esta enzima se conocen en la técnica, por ejemplo el gene adc del Clostridium acetobutylicum . Más preferiblemente, el organismo/microorganismo se modifica genéticamente con el fin de ser transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 2 de la síntesis de acetona, es decir la conversión de acetoacetil CoA en acetoacetato.

Aún más preferiblemente, el organismo/microorganismo se modifica genéticamente con el fin de ser transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa de reacción mencionada anteriormente 1 de la síntesis de acetona, es decir la condensación de dos moléculas de acetil CoA en acetoacetatil CoA.

Los métodos para preparar los org nanismos/microorganismos genéticamente modificados anteriormente mencionados bien conocidos en la técnica. Así, generalmente, el organismo/microorganismo se transforma con una construcción de DNA que permite la expresión de la respectiva enzima en el organismo/microorganismo. Tal una construcción comprende normalmente la secuencia codificante en cuestión ligada a secuencias reguladoras q ue permiten la transcripción y traducción en la célula anfitriona respectiva , por ejemplo un promotor y mejorador y/o terminador de transcripción y/o sitios de unión de ribosoma etc. La técnica anterior ya describe organismo, en particular microorganismos que se han modificado genéticamente con el fin de ser capaz de producir acetona. En particular los genes de, por ejemplo, Clostridium acetobutylicum se han introducido en E. coli permitiendo por lo tanto la síntesis de la acetona en E. coli , una bacteria que naturalmente no produce acetona (Bermejo et al. , Appl. Environ. Microbiol. 64 (1 998); 1079-1 085; Hanai et at. , Appl. Environ . Microbiol. 73 (2007), 7814-781 8). En particular Hanai et al . (loe. cit. ) muestra que es suficiente introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetoacetato descarboxilasa (tal como aquella de Clostridium acetobutylicum) con el fin de alcanzar la producción de acetona en E. coli lo que indica que las enzimas endógenas es E. coli que catalizan las etapas de reacción mencionadas anteriormente 1 y 2 (es decir los productos de la expresión de los genes de atoB y atoAD E. coli) son suficientes para proporcionar el sustrato para la producción de acetona.

En una modalidad preferida adicional el organismo, preferiblemente un microorganismo, de acuerdo con la invención se modifica genéticamente con el fin de expresar una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del com puesto que proporciona un grupo acetilo activado. En este contexto, el término "recombinante" significa en un primer aspecto que el organismo contiene una molécula de ácido nucleico externa que codifica una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado, preferiblemente una molécula de ácido nucleico externa que codifica una HMG CoA sintasa o una molécula de ácido nucleico externa que codifica una liasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA liasa, o una molécula de ácido nucleico externa que codifica una proteína PksG o una molécula de ácido nucleico externa que codifica cualquier combinación posible de las enzimas que tiene la propiedad mencionada anteriormente. El término "externo" en este contexto significa que la molécula de ácido nucleico no ocurre naturalmente en dicho organismo/microorganismo. Esto significa que no ocurre en la misma estructura o en la misma ubicación en el organismo/microorganismo. En una modalidad preferida , la molécula ácido nucleico externo es una molécula recombinante que comprende un promotor y una secuencia codificante que codifica dicha enzima, por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o una liasa de corte de enlace C-C/condensación , tal como una HMG CoA liasa, y/o una proteína PksG, en la que el promotor que maneja la expresión de la secuencia codificante es heteróioga con respecto a la secuencia codificante. Heterólogo en este contexto significa que el promotor no es el promotor que maneja en forma natural la expresión de dicha secuencia codificante pero es un promotor que maneja en forma natural la expresión de una secuencia codificante diferente, es decir, se deriva de otro gene, o es un promotor sintético o un promotor quimérico. Preferiblemente, el promotor es un promotor heterólogo con el organismo/microorganismo, es decir un promotor que no ocurre naturalmente en el organismo/microorganismo respectivo. Aún más preferiblemente, el promotor es un promotor inducible. Los promotores para manejar la expresión en diferentes tipos de organismos, en particular microorganismos, son bien conocidos por el experto en la técnica.

En otra modalidad preferida la molécula de ácido nucleico es externo al organismo/microorganismo en que las enzima(s), codificadas por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o la división del enlace C-C codificada/condensación Masa, tal como una H MG CoA Masa, y/o la proteína PksG codificada, no es/son endógena para el organismo/microorganismo, es decir no se expresan naturalmente mediante el organismo/microorganismo cuando no se modifica genéticamente. En otras palabras, la enzima(s) codificada, por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o la división del enlace C-C codificada/condensación liasa, tal como HMG CoA asa, y/o la próteína PksG codificada, es/son heterólogo con respecto al organismo/microorganismo.

El término "recombinante" en otro aspecto significa que el organismo se modifica genéticamente en la región reguladora que controla la expresión de una enzima como se definió anteriormente que ocurre naturalmente en el organismo con el fin de llevar a un aumento en la expresión de la respectiva enzima en comparación con un organismo no modificado genéticamente correspondiente. El significado del término "expresión mayor" se describe adicionalmente adelante.

En una modalidad preferida adicional el organismo/microorganismo se caracteriza porque la expresión/actividad de dicha enzima, por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o una liasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como HMG CoA liasa, y/o la proteína PksG, es mayor en el organismo/microorganismo genéticamente modificado con la molécula ácido nucleico externo en comparación con el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente. Una expresión/actividad "mayor" significa que la expresión/actividad de la enzima, por ejemplo la HMG CoA sintasa y/o una liasa de corte de enlace C-C/condensación , tal como HMG CoA liasa, y/o la proteína PksG, en el organismo /microorganismo modificado genéticamente es por lo menos 10%, preferiblemente por lo menos 20%, más preferiblemente por lo menos 30% o 50%, aún más preferiblemente por lo menos 70% o 80% y particularmente preferido por lo menos 90% o 100% mayor que en el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente. En modalidades aún más preferidas el aumento en la expresión/ actividad puede ser por lo menos 1 50% , por lo menos 200% o por lo menos 500%. En modalidades particularmente preferidas la expresión es por lo menos 1 0 veces, más preferiblemente por lo menos 1 00 veces y aún más preferido por lo menos 1 000 veces mayor que en el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente.

El término expresión/actividad "mayor" también cubre la situación en la que el organismo/microorganismo no modificado genéticamente correspondiente no expresa una enzima correspondiente, por ejemplo una HMG CoA sintasa y/o una liasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA liasa, y/o una proteína PksG, so that la expresión / actividad correspondiente en el organismo/ microorganismo no modificado genéticamente es cero.

Métodos para medir el nivel de expresión de una proteína dada en una célula son bien conocidos por el experto en la técnica. En una modalidad, la medición del nivel de expresión se hace al medir la cantidad de la proteína correspondiente. Los métodos correspondientes son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen Western Blot, ELISA etc. En otra modalidad la medición del nivel de expresión se hace al medir la cantidad del RNA correspondiente.

Los métodos correspondientes son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen , por ejemplo, Northern Blot.

Los métodos para medir la actividad enzimática de la enzima mencionada anteriormente, en particular de una sintasa HMG CoA y/o una HMG CoA liasa y/o una proteína PksG , respectivamente, se conocen en la técnica y ya se han descrito anteriormente.

El término "organismo" como se utiliza en el contexto de la presente invención se refiere en general acyalquier posible tipo de organismo, en particular organismos eucarióticos, organismos procarióticos y arqueobacterias. El término incluye animal, plantas, hongos, bacterias y arqueobacterias. El término también incluye células aisladas o agregados celulares de tales organismos, como tejidos o callo.

En una modalidad preferida , el organismo es un microorganismo. El término "microorganismo" en el contexto de la presente invención se refiere a células procarioticas, en particular bacterias, así como también a hongos, tales como levaduras, y también a algas y arqueobacterias. En una modalidad preferida, el microorganismo es una bacteria. En principio se puede utilizar cualquier bacteria . Las bacterias preferidas a ser empleadas en el proceso de acuerdo con la invención son bacterias del género Bacillus, Clostridium, Pseudomonas o Escherichia. En una modalidad particularmente preferida la bacteria pertenece al género Escherichia y aún más preferida a la especie Escherichia coli .

En todavía otra modalidad preferida el microorganismo es un microorganismo fotosintéticamente activo tales como bacterias que son capaces de llevar a cabo fotosíntesis o micro-algas.

En una modalidad particularmente preferida el microorganismo es un alga, más preferiblemente un alga del género que pertenece a las diatomáceas.

En otra modalidad preferida el organismo de acuerdo con la invención es un organismo que es capaz de fotosíntesis, tales como una planta o microalga. En principio puede ser cualquier planta posible, es decir una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea. Es preferiblemente una planta que se puede cultivar en una escala agrícolamente significativa y que perm ite producir grandes cantidades de biomasa. Ejemplos son las gram íneas como Lolium , cereales como el centeno, cebada, avena, mijo, ma íz, otras plantas que almacenan almidón como la papa o plantas que almacenan azúcar como la caña de azúcar o la remolacha. También es concebible el uso de tabaco o de plantas vegetales tales como tomate, pimienta, cohombro, berenjena etc. En otra modalidad preferida la planta es una planta que almacena aceite tales como semillas de colza, olivas etc. También es concebible es el uso de árboles, en particular árboles de crecimiento rápido tales como eucalipto, álamo o árbol de caucho (Hevea brasiliensis) .

La presente invención también se relaciona con el uso de un organismo, preferiblemente un microorganismo, que se caracteriza por las siguientes características: (a) es capaz de producir acetona; y (b) expresa una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente, preferiblemente una enzima con la actividad de una sintasa H G CoA (EC 2.3.3.1 0) y/o una enzima con la actividad de una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA Masa (EC 4.1 .3.4), y/o una proteína PksG para la producción de ácido 3-h id roxi-3-metil butírico.

Es decir, la presente invención también se relaciona con el uso de un organismo/microorganismo de acuerdo con la invención para la producción de 3-hidroxi- 3-metilácido butírico.

La presente invención también se relaciona con una composición que comprende un organismo de acuerdo con la presente invención .

Más aún, la presente invención también se relaciona con una composición que comprende (i) acetona; y (ii) un com puesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente; y (iii) una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente.

Para las modalidades preferidas de la enzima lo mismo se aplica como se ha establecido anteriormente en relación con el método y el organismo de acuerdo con la invención.

Más aún, la presente invención también se relaciona con el uso de una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente para la producción de ácido 3-hidroxi-3- metilbutírico.

Finalmente, la presente invención también se relaciona con el uso de acetona para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutír¡co, que comprende la conversión enzimática de la acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se definió anteriormente. En una modalidad preferida la conversión enzimática se alcanza mediante una enzima como se describió anteriormente en relación con el método de acuerdo con la invención, más preferiblemente con una enzima que tiene la actividad enzimática de una sintasa HMG CoA y/o con una enzima que tiene la actividad enzimática de una liasa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA liasa, y/o una proteína PksG , y más preferiblemente la conversión se alcanza mediante el uso de un organismo de acuerdo con la invención.

Figura 1 : Estructura química del ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico (también denominado como beta-hidroxiisovalerato) Figura 2: Esquema de Reacción de la reacción catalizada por HMG- CoA sintasa Figura 3: Esquema de Reacción de la reacción catalizada por HMG-CoA liasa Figura 4: Esquema de Reacción de las reacciones de la ruta pksX que incluyen la reacción catalizada por la proteína PksG Figura 5: Esquema de Reacción de la reacción de la conversión de acetona y un compuesto que contiene un grupo acetilo activado en ácido 3-hidroxi- 3- metilbutírico X representa S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-N H-CO-CH(OH)- C(CH3)2- CH2-O-PO2H-C 1 0H 13N5O7P (coenzima A) , S- CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2- 0-P02H- polipéptido (proteína portadora de acilo), S-CH2- CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-OH (panteteína), S-C H2-C H2-NH-CO-C H3 (N-acetil-cisteamina), S-CH3 (metano tiol) , S-CH2-CH(NH2)-C02H (cisteína), S- CH2-CH2-CH(NH2)-C02H (homocisteína) , S-CH2-CH(NH- C5H8N03)-CO-NH-CH2-C02H (glutationa) , S-CH2-CH2-S03H (coenzima M) y OH (ácido acético).

Figura 6: Espectro de masa de 3-hidroxi-3-metilbutirato comercialmente disponible Figura 7: Espectro de masa de formación de 3-hidroxi-3-metilbutirato a partir de acetil-CoA y acetona en la presencia de Hmg- CoA sintasa de Gallus gallus (P23228) .

Figura 8 Espectro de masa del ensayo de control sin enzima.

Figura 9 Gráfica Michaelis-Menten para la reacción con la HMG CoA sintasa de S. epidermidis descrita en el Ejemplo 7 Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención.

Ejemplo 1 Método bioinformático utilizado para crear bases de datos de HMG-CoA sintasas y HMG-CoA liasas Un panel de 1 2 HMG-CoA sintasas y 8 H MG-CoA liasas se seleccionan para crear un conjunto de proteínas no redundante con el objetivo de representar la diversidad de estas clases de enzima tal como se encuentran a través de los organismos eucarióticos. Estas proteínas se identifican al realizar múltiples búsquedas basadas en secuencia y basadas en texto en la Universal Protein Resource Datábase Uniprot (http://www. uniprot.org/) . Todas contienen características únicas tales como los dominios de proteína conservados y motivos característicos de la clase de enzima de interés. Con el fin de cubrir efectivamente la diversidad de secuencia sin tener que seleccionar un gran conjunto de proteínas, el grupo inicial de enzimas se reduce al agruparlos en grupos de secuencias con más del 85% de homolog ía y luego seleccionar una única secuencia candidata representativa de cada grupo. La identidad de secuencia de la proteína varía de 30% a 80% y de 50% a 80% entre cualquiera de dos proteínas del panel de HMG-CoA sintasas panel y el panel liasas respectivamente.

El mismo método se aplica para seleccionar las H MG-CoA sintasas y las HMG-CoA liasas a partir de organismos procarióticos. El conjunto creado contiene 50 homólogos de proteína para HMG-CoA sintasas, que incluyen proteínas PksG, y 59 homólogos de proteína para las HMG-CoA liasas.

Ejemplo 2 Clonación, expresión y purificación de una colección de HMG-CoA Liasas y HMG-CoA sintasas Clonación de gene: Las secuencias de ácido nucleico que se codifican para HMG-CoA sintasa y Masa a partir de organismos eucarioticos se optimizan para preferencia de codón de E.coli y se obtienen los genes mediante síntesis química (GeneArt).

Los genes que se codifican para las HMG-CoA sintasas y liasas a partir de organismos procarióticos se clonan a partir de DNA genómico de diferentes orígenes mediante técnicas de recombinación de rutina. Estos genes luego se insertan en una His-tag que contiene vectores pET 25b y pET 22b (Novagen), respectivamente, para organismos eucarioticos y procarióticos.

Sobreexpresión en E. coli: Los plásmidos se electroporan en bacterias E. coli BL21 (Novagen) que luego se esparcen sobre una caja Petri LB-Agar que contienen ampicilina. Los cultivos se hacen crecer a 30° C sobre medio TB, que contiene 0.5 M de sorbitol, 5 mM de betaina, 100 pg/ml de ampicilina bajo agitación moderada. Cuando el OD (600 nm) alcanza 0.8, IPTG se agrega a una concentración final de 1 mM, y la expresión se corre durante 16 horas a 20° C bajo agitación moderada. Las células bacterianas luego se cosechan mediante centrifugación a 4o C, 10.000 rpm , 20 minutos y se congelan a -80° C.

Preparación de extracto celular: Los extractos cxelulares se preparan al resuspender 1 .6 g de pella celular en 5 mi de regulados Na2HP04 50 m M , que contiene 300 mM de NaCI, 5 mM de MgCI2, 1 mM de DTT pH 8. 20 µ? de lisonasa (Novagen) luego se agrega a las preparaciones, que se incuban durante 10 mn a temperatura ambiente y 20 min en hielo. Se logra la tisis celular mediante tratamiento de sonicación triple de 5 minutos en un baño de agua ultrasónico sobre hielo y la homogenización del extracto entre cada pulso. Los extractos crudos luego se depuran mediante centrifugación a 4o C, 10.000 rpm , 20 minutos.

Purificación de proteina: Los sobrenadantes claros se cargan en una columna PROTI NO-1000 Ni-I DA (Macherey-Nagel) que permite la inmovilización específica de proteínas que llevan colas de 6-histidina . Las columnas se lavan y las enzimas se eluyen con 4 mi de amortiguador Na2HP0 50 mM, que contiene 300 mM NaCI, 5 m M MgCI2) 1 mM de DTT, 250 mM de imidazol pH 8. Las fracciones que contienen enzima luego se concentran y se desalan sobre una unidad de flitro Amicon Ultra-4 10 kDa (Millipore) y se resuspenden en 250 µ? de Tris-HCI 40 mM pH8, que contiene 0.5 mM DTT. Se determina la concentración de proteína mediante el método Bradford.

La homogeneidad de las enzimas purificadas varía de 20 % a 75 %.

Ejemplo 3 Medición de la actividad HMG-CoA sintasa utilizando sustratos naturales acetoacetil-CoA y acetil-CoA Se mide la actividad de la H MG-CoA sintasa de acuerdo con Clinkenbeard et al. (J. Biol.Chem . 250 (1 975), 3108-31 16). La mezcla de medio de ensayo estándar para las HMG-CoA sintasas que contiene 40 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM MgCI2, 1 00 µ? acetoacetil-CoA, 200 µ? acetil-CoA, 0.5mM de DTT en un volumen total de 1 mi . De HMG-CoA sintasa de mitocondrias se ensaya en la ausencia de MgCI2 para evitar la inhibición observada para esta enzima (Reed et al , J. Biol. Chem. 250 ( 1975), 31 1 7-31 23) . La reacción se inicia mediante adición de 0.02 mg/mL de enzima.

Se lleva a cabo un ensayo de control en la ausencia de enzima. Se mide la actividad de la HMG-CoA sintasa al monitorear la reducción en la absorbancia a 303 nm que acompaña la desaparición dependiente de acetil-CoA de la forma enolato del acetoacetil-CoA. Para tener en cuenta para la desaparición no específica de acetoacetil-CoA, los resultados obtenidos en ensayo de control que carecen de enzima se sustraen de los resultados obtenidos en as muestras de prueba. El coeficiente de absorción evidente para acetoacetil-CoA bajo las condiciones de ensayo es 5600 M" 1.

Tabla 1 : Actividad fisiológica de algunas HMG-CoA sintasas purificadas o enzimas homologas a las HMG CoA sintasas Ejemplo 4 Medición de la actividad HMG-CoA liasa utilizando sustrato natural HMG-CoA Se mide la actividad HMG-CoA liasa de acuerdo con Mellanby J et al. (Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer Ed. ( 1 963) , 454-458). La mezcla de reacción completa ( 1 mi) que contiene 40 m M Tris-HCI pH 8, 1 mM MgCI2, 0.5 mM de DTT, 0.4 mM de HMG-CoA, 0.2 mM de NADH, 5 unidades de 3-hidroxibutirato deshidrogenasa se incuba durante 5 min antes de agregar 0.005 mg/ml de HMG-CoA liasa y luego el progreso de la reacción se monitorea por la reducción en la absorbancia a 340 nm. Se lleva a cabo un control de ensayo en la ausencia de enzima.

Para tener en cuenta la desaparición no específica de NADH, los resultados obtenidos en un ensayo de control que carece de enzima se sustraen de los resultados obtenidos en las muestras de prueba. Las actividades especificas se calculan como ?µ???? NADH/min- mg de proteína.

Tabla 2: Actividad fisiológica de algunas HMG-CoA Masas purificadas Ejemplo 5 Producción de 3-hidroxi-3-met¡l butirato La reacción completa para la síntesis de 3-hidroxi-3-metilbutirato contiene 40 mM Tris-HCI pH 8, 5 a 50 mM de acetil-CoA, 100 a 500 mM de acetona, 1 MgCI2 (excepto para HMG-CoA sintasa de mitocondria), 0.5 mM de DTT y enzima que varia en el rango de 0.2 a 8 mg/ml. Se llevan a cabo reacciones de control en la ausencia de enzima y uno de los sustratos.

El progreso de la síntesis se sigue al analizar al ícuotas tomadas después de aumentar el periodo de incubación a 30 o 37° C. Típicamente, se elimina una al ícuota de 50 µ? después de 48 h de incubación, se calienta durante 1 min a 100° C para eliminar las proteínas, se centrifuga y el sobrenadante se transfiere a un frasco limpio para detección HV mediante espectrometría de masa. Una solución de 3-hidroxi-3-metilbutirato se prepara en 40 m M Tris- HCI H 8, 1 mM gCI2, 0.5 mM de DTT, se calienta como se describió anteriormente y se utiliza como referencia.

Las muestras se analizan sobre un espectrómetro de masa triple cuádruple PE SCI EX API 2000 en modo de ión negativo con H2O/acetonitrilo=60/40 que contiene 0.1 % de trietilamína como fase móvil, el índice de flujo es 40 µ?/mín. 10 µ? de cada sobrenadante se mezclan con una cantidad igual de fase móvil y se inyectan directamente en el espectrómetro de masa. Se monitorea la presencia de ión [3-hidroxi-3-metilbutirato-H]". Se observa un pico que corresponde a 3-hidroxi-3-metilbutirato para las siguientes enzimas enzimas: Blattella germánica (Cucaracha alemana) P54961 (SEQ I D NO: 6) Gallus gallus (Pollo) P23228 (SEQ ID NO: 7) Homo sapiens (Humano) Q01 581 (SEQ I D NO: 8) Arabidopsis thaliana P54873 (CAA58763) (SEQ I D NO: 4) Caenorhabditis elegans P54871 (SEQ I D NO: 1 ) Schizosaccharomyces pombe (Levadura de fisión) P54874 (SEQ ID NO: 2) Saccharomyces cerevisiae (Levadura de beaker) P54839 (SEQ I D NO: 3) Dictyostelium discoideum (Moho de limo) Q86H L5 (SEQ I D NO: 1 0) Leuconostoc mesenteroides Q03WZ0 (SEQ I D NO: ) Staphylococcus epidermidis Q8CN06 (SEQ I D NO: 1 1 ) Lactobacillus delbrueckii Q 1 GAH5 (SEQ ID NO: 24) Staphylococcus haemolyticus Q4L958 (I98>V diferencia comparada con la proteína tipo natural) (SEQ I D NO: 25) Las Figuras 6 a 8 muestran resultados representativos para 3-hidroxi-3-metilbutirato disponible comercialmente, para la reacción utilizando la HMG CoA sintasa a partir de Gallus gallus (P23228) y para el ensayo de control sin enzima.

Ejemplo 6 Producción de 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA utilizando Masas Se lleva a cabo la síntesis de 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA en la presencia de [2- 14C] acetona radioetiquetada. La reacción completa para la síntesis de 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA contiene 40 mM Tris-HCI pH 8, 5 a 50 mM de acetil-CoA, 1 00 a 500 mM de acetona, 1 a 1 0 mM MgCI2, 0.5 mM de DTT y enzima que varia en el rango de 0.5 a 7 mg/ml. La formación de producto se analiza después de separación de la mezcla de reacción mediante TLC o HPLC.

También se analiza 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA mediante el método TLC (Stadtman E. R. , J. Biol. Chem . 196 ( 1 952) , 535-546). Se deposita una alícuota de reacción sobre una placa de celulosa y se cromatografía en el siguiente sistema disolvente: etanol/acetato de sodio 0.1 M pH 4.5 ( 1 /1 ) . Co-A y acetil-CoA se utilizan como estándares internos. Rf reportado para 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA es 0.88.

Ejemplo 7 Parámetros cinéticos para la reacción enzimática entre acetil-CoA y acetona en el caso de H G sintasas Se miden los parámetros cinéticos utilizando una concentración variable de acetona y una concentración constante de de acetil-CoA (1 0 mM) en las siguientes condiciones: 40 mM Tris-HCI pH 8 2 mM MgCI2 0 - 1 M acetona El pH final se ajusta a 8.

Se inicia la reacción mediante la adición de 3 mg de enzima purificada a 1 mi de la mezcla de reacción. La mezcla luego se incuba sin agitación a 37° C durante 40 h.

Análisis de producción de 3-hidroxi-3-metilbutirato Se aplican las condiciones termoquim icas que conducen a la descomposición de 3-hidroxi-3-metilbutirato en isobuteno (Pressman et al. , JACS, 1 940, 2069-2080): el pH de las mezclas de reacción primero se ajusta a pH 4 utilizando HCI 6N y las muestras luego se transfieren a frascos se cromatografía de gas (I nterchim) . Los frascos se sellan y se incuban 1 10° C durante 4 horas, conduciendo asi a la descomposición de 3-hidroxi-3-metilbutirato en isobuteno.

Se prepara la curva de calibración en las mismas condiciones utilizando 3-hidroxi-3-metilbutirato comercial.

Se recolecta un mililitro del gas de la parte superior y se inyecta en un cromatografo de gas HP5890 (HP) equipado con un detector FID y una columna CP SilicioPlot (Varían) . Se utiliza el isobuteno comercial como referencia. Se calcula de la señal de isobuteno la cantidad de 3- hidroxi-3-metilbutirato presente inicialmente en la m uestra.

Los parámetros cinéticos para varias de las H MG-CoA sintasas estudiadas se presentan en la siguiente Tabla.

Para la enzima de S. epidermidis la Figura 9 muestra una gráfica de Michaelis- Menten correspondiente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico que comprende la conversión enzimática de la acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado caracterizado por la siguiente fórmula (I): , en donde X se selecciona del grupo que consiste de S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C 10H 13N5O7P (coenzima A) , S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-0-P02H- polipéptido (proteína portadora de acilo), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-OH (panteteína), S-CH2-CH2-NH-CO-CH3 (N-acetil-cisteamina), S-CH3 (metano tiol), S-CH2-CH(NH2)-C02H (cisteína), S-CH2-CH2-CH(NH2)-C02H (homocisteína), S-CH2-CH(N H-C5H8N03)-CO-NH-CH2-C02H (glutationa), S-CH2-CH2-S03H (coenzima M) y OH (ácido acético) utilizando una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado de acuerdo con la fórmula (I).

2. El método de la Reivindicación 1 en donde X es una coenzima A.

3. El método de la Reivindicación 1 en donde X es una proteína portadora de acilo.

4. El método de la Reivindicación 1 o 2, en donde dicha enzima es una enzima que tiene la actividad de una HMGCoA sintasa (EC 2.3.3.1 0) o en donde dicha enzima es una enzima que tiene la actividad de una Masa de corte de enlace C-C/condensación , tal como una HMG CoA Masa (EC 4.1 .3.4) o en donde dicha enzima es una proteína PksG.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se caracteriza porque la conversión se realiza en la presencia de un organismo capaz de producir acetona y expresar una enzima como se define en la reivindicación 1 .

6. Un organismo recombinante que se caracteriza por las siguientes características: (a) es capaz de producir acetona; y (b) expresa una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado de acuerdo con la fórmula (I).

7. El organismo de la reivindicación 6 en donde dicha enzima es una enzima que tiene la actividad enzimática de una sintasa HMG CoA (EC 2.3.3.1 0) y/o la actividad enzimática de una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como a HMG CoA, Masa (EC 4.1 .3.4) y/o una proteína PksG.

8. El organismo de la reivindicación 6 o 7 en donde el organismo es un organismo que tiene naturalmente la capacidad para producir acetona, preferiblemente un microorganismo que pertenece al género Clostridium, Bacillus o Pseudomonas, más preferiblemente a las especies Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa o Pseudomonas putida.

9. El organismo de la reivindicación 6 o 7 en donde el organismo se deriva de un organismo que naturalmente no produce acetona y se modifica genéticamente con el fin de ser capaz de producir acetona mediante la introducción de gene(s) necesarios para permitir la producción de acetona en el organismo.

10. El método de la Reivindicación 9, en donde el organismo es un organismo capaz de fotosíntesis.

11. Uso de un organismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico.

12. Una composición que comprende un organismo de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.

13. Una composición que comprende (i) acetona; y (ii) un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado caracterizado por la siguiente fórmula (I): , en donde X se selecciona del grupo que consiste de S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C 1 0H 1 3N5O7P (coenzima A), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-0-P02H-polipéptido (proteína portadora de acilo), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-OH (panteteína), S-CH2-CH2-N H-CO-CH3 (N-acetil-cisteamina), S-CH3 (metano tiol), S-CH2-CH(NH2)-C02H (cisteína), S-CH2-CH2-CH(NH2)-C02H (homocisteína) , S-CH2-CH(NH-C5H8N03)-CO-NH-CH2-C02H (glutationa) , S-CH2-CH2-S03H (coenzima M) y OH (ácido acético); y (iii) una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el átomo de carbono (C2) que corresponde al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado de acuerdo con fórmula (I).

14. Uso de una enzima como se define en la reivindicación 1 para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico.

15. Uso de la acetona para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico que comprende la conversión enzimática de la acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado caracterizado por la siguiente fórmula (I): , en donde X se selecciona del grupo que consiste de S-CH2-CH2-NH- CO-CH2-CH2-N H-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-C1 0H 1 3N5O7P (coenzima A), S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-0-P02H-polipéptido (proteína portadora de acilo) , S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-N H-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-OH (panteteína) , S-CH2-CH2-N H-CO-C H3 (N-acetil-cisteamina), S-CH3 (metano tiol), S-CH2-CH(NH2)-C02H (cisteína), S-CH2-CH2-CH(NH2)-C02H (homocisteína) , S-CH2-CH(NH-C5H8N03)-CO-NH-CH2-C02H (glutationa), S-CH2-CH2-SO3H (coenzima) y OH (ácido acético). RES U M E N Se describe un método para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico (también denominado como beta-hidroxiisovalerato o HiV) a partir de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado que comprende la conversión enzimática de la acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado en ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico. La conversión hace uso de una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir el C=0) de la acetona y el grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado. Preferiblemente, la enzima empleada en el proceso es una enzima con la actividad de una sintasa HMG CoA (EC 2.3.3.10) y/o una proteína PksG y/o una enzima con la actividad de una Masa de corte de enlace C-C/condensación, tal como una HMG CoA Masa (EC 4. 1 .3.4). También se describen organismos que son capaces para producir ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico a partir de acetona, un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado, el uso de las enzimas anteriormente mencionadas y organismos para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico así como el uso de acetona para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metil butírico.