MX2012003243A

MX2012003243A - Metodo para modificar el contenido de carbohidrato de una planta.

Info

Publication number: MX2012003243A
Application number: MX2012003243A
Authority: MX
Inventors: Gino Boussiengui-Boussiengui; Jens Kossman
Original assignee: Stellenbosch University South African Sugarcane Res Inst
Priority date: 2009-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2012-09-12
Also published as: EP2478102A1; GT201200076A; CO6531442A2; EP2478102B1; AU2010297007B2; EP2478102A4; CN102753688A; BR112012006074A2; US20120180161A1; WO2011033371A1; US8729338B2; ZA201201779B; AU2010297007A1; CA2774391A1; CN102753688B

Abstract

Se describe un método para modificar al menos un carbohidrato en un tejido de una planta. El método se aplica, típicamente, a una planta de caña de azúcar del género Saccharum e incluye las etapas de insertar en una célula vegetal, un casete de silenciamiento de genes que incluye ácido nucleico operativamente unido a elementos de transcripción tales como un promotor de monocotiledóneas para transcribir el ácido nucleico en una célula vegetal, en donde la transcripción del ácido nucleico disminuye la actividad de la UMP sintasa. El método incluye, además, las etapas de regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal y producir el tejido con un contenido de carbohidrato aumentado. Además, se describen los vectores usados para ello, así como una célula vegetal transformada y una planta transgénica o parte de la planta que contiene o se deriva de una célula vegetal transformada.

Description

METODO PARA MODIFICAR EL CONTENIDO DE CARBOHIDRATO DE UNA PLANTA Campo de la Invención Esta invención se refiere a un método para modificar al menos un carbohidrato en un tejido de una planta, a un vector para su uso en ello, y a una célula vegetal transformada, parte de planta o planta transgénica que contiene el vector.

Antecedentes de la Invención La sacarosa, cosechada fundamentalmente de caña de azúcar, es un alimento humano muy importante así como una materia prima importante para la producción del etanol combustible. La producción comercial de azúcar puede beneficiarse, por lo tanto, por el aumento del contenido de azúcar del cultivo o el aumento del rendimiento de la caña. Dado que el aumento del contenido de azúcar de la caña de azúcar resulta en aumentos en el rendimiento del azúcar con un aumento relativamente pequeño en los costos de producción asociados, las ganancias en el contenido de azúcar se consideran como económicamente más beneficiosas que el aumento correspondiente en el rendimiento de la caña. Esto significa que el aumento en el contenido de azúcar se ha convertido en un objetivo importante de los programas de cultivo de la caña de azúcar y la investigación transgénica usando enfoques basados en la biotecnología.

Ref . : 228836 Muchos enfoques basados en la biotecnología para aumentar el contenido de carbono o nitrógeno reducido de los cultivos se dirigen hacia el aumento de las concentraciones de los precursores directos del producto objetivo (Sonnewald y otros, 1997; Stark y otros, 1992) . Estos enfoques tienden a centrarse en el aumento de la concentración de los metabolitos relevantes, sin embargo, nunca han resultado en aumentos significativos del metabolito objetivo en un órgano de almacenamiento .

Por lo tanto, existe una necesidad de un método alternativo para modificar el contenido de carbohidrato de cultivos tales como la caña de azúcar, y de cultivos tales como la caña de azúcar con un contenido de azúcar relativamente superior.

Objeto de la Invención Es un objeto de esta invención proporcionar un método para modificar el contenido de al menos un carbohidrato de una planta.

Breve Descripción de la Invención De acuerdo con la invención, se proporciona un método para aumentar el contenido de al menos un carbohidrato en una o más células vegetales, el método incluye inhibir la actividad UMP sintasa (UMPS) en una o más células vegetales. En algunas modalidades, el método de inhibir la actividad UMPS incluirá la etapa de insertar en una o más células vegetales al menos un cásete de silenciamiento de genes. La expresión del (de los) cásete (s) de silenciamiento de genes resulta, de ese modo, en una actividad UMP sintasa disminuida y un contenido aumentado de al menos un carbohidrato (por ejemplo sacarosa) . La disminución de la actividad U PS puede ser ocasionada por diversos mecanismos (ver, por ejemplo, la discusión en la descripción detallada más abajo con respecto a los métodos para reduci la expresión UMPS) .

En algunas modalidades, uno o más casetes de silenciamiento de genes se insertarán en una población de células (por ejemplo, un callo) .

En algunas modalidades, se regenera una planta transgénica a partir de una o más células vegetales producidas como se describió anteriormente. El tejido vegetal y las partes de la planta (por ejemplo, semillas, órganos de almacenamiento, etc) pueden cosecharse de la planta.

En algunas modalidades, el tejido vegetal que tiene un contenido aumentado de al menos un carbohidrato, se produce a partir de una o más células vegetales transformadas como se describió anteriormente. Esto puede comprender, opcionalmente , regenerar una planta transgénica a partir de una o más células vegetales transformadas. El término "tejido" se usa en en la presente descripción en un sentido amplio e incluye una referencia a un agregado de células. Las células del tejido pueden ser diferenciadas o indiferenciadas . En algunas modalidades, las células pueden tener una estructura y/o función similar. En algunas modalidades, las células pueden especializarse para realizar una función particular. En una modalidad, el tejido es un callo .

En algunas modalidades, una o más células vegetales se transforman con uno o más casetes de silenciamiento de genes que incluyen ácido nucleico operativamente unido a uno o más elementos de transcripción para transcribir el ácido nucleico en donde la transcripción del ácido nucleico disminuye la actividad de la UMP sintasa.

Opcionalmente, el ácido nucleico comprende (y opcionalmente consiste en) uno o más de los siguientes: (i) la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 1), o parte de ésta (por ejemplo, al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de la secuencia) , (ii) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 1) , o a parte de ésta, (iii) la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2) , o parte de ésta, (iv) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85% 90 %, 95 ó 99% similar, a la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec . con núm. de ident . 2) , o a parte de ésta, (v) (a) (i) o (ii) como anteriormente, y (b) (iii) o (iv) como anteriormente, opcionalmente con una secuencia intrón empalmable entre (a) y (b) , y en donde la secuencia intrón empalmable es preferentemente al menos 70 ó 74 bp de longitud, preferentemente al menos 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 450 bp, o 500 bp de longitud, y con mayor preferencia al menos 74 bp de longitud.

Al menos en algunas modalidades, el ORF de UMPS se corresponde con el ORF de UMPS de la célula vegetal transformada. De este modo, por ejemplo, donde la célula vegetal es una célula vegetal de la caña de azúcar el ORF de UMPS es el ORF de la caña de azúcar y de este modo, por ejemplo, de acuerdo con (i) anteriormente, el ácido nucleico comprende la secuencia antisentido de un ORF de UMPS de la caña de azúcar, o parte de ésta.

En algunas modalidades, dos o más casetes de silenciamiento de genes pueden insertarse en una o más células vegetales, por ejemplo, un primer cásete de silenciamiento de genes con ácido nucleico de acuerdo con (i) o (ii) anteriores, y un segundo cásete de silenciamiento de genes con ácido nucleico de acuerdo con (iii) o (iv) anteriores. De este modo, se conciben modalidades en donde las moléculas sentido y antisentido se expresan a partir de casetes de silenciamiento de genes individuales o por separado. Las moléculas de este tipo pueden usarse en ARN de interferencia de doble hebra por lo cual una molécula de ARN sentido y una antisentido que es total o parcialmente complementaria a la molécula de ARN sentido de un gen UMPS se expresan en la misma célula vegetal, resultando en la inhibición de la expresión del ARNm endógeno correspondiente que codifica UMPS.

En algunas modalidades, uno o más elementos de transcripción incluyen un promotor, opcionalmente un promotor de monocotiledóneas (por ejemplo, un promotor UBI) .

En algunas modalidades, al menos un carbohidrato se selecciona del grupo que consiste de sacarosa, almidón, glucosa y fructosa. En algunas modalidades, el método resulta en un contenido aumentado de almidón y sacarosa y opcionalmente uno o más carbohidratos adicionales (por ejemplo, glucosa) .

En algunas modalidades, la planta es una planta de almacenamiento de azúcar, opcionalmente seleccionada del grupo que incluye la caña de azúcar, sorgo dulce y remolacha azucarera. En algunas modalidades la planta es del género Saccharum, opcionalmente caña de azúcar.

Las células vegetales, tejido vegetal, plantas y partes de la planta (por ejemplo, semillas, órganos de almacenamiento, caña de azúcar) obtenidos u obtenibles por el método descrito anteriormente se incluyen dentro del alcance de la invención.

De acuerdo con la invención, se proporciona, además, un vector que comprende uno o más casetes de silenciamiento de genes para disminuir la actividad UMPS en una célula vegetal. En algunas modalidades, el vector es un vector de AR i.

En algunas modalidades, el (los) cásete (s) de silenciamiento de genes incluye (n) ácido nucleico operativamente unido a uno o más elementos de transcripción para transcribir el ácido nucleico en donde la transcripción del ácido nucleico disminuye la actividad de UMPS.

Opcionalmente, el ácido nucleico comprende (y opcionalmente consiste en) uno o más de los siguientes: (i) la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 1), o parte de ésta (por ejemplo al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200 , 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de la secuencia) , (ii) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 1), o a parte de ésta, la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2), o parte de ésta, (iii) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 2), o a parte de ésta, (v) (a) (i) o (ii) como anteriormente, y (b) (iii) o (iv) como anteriormente, opcionalmente con una secuencia intrón empalmable entre (a) y (b) , y en donde la secuencia intrón empalmable es de preferencia al menos 70 ó 74 bp de longitud, de preferencia al menos 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 450 bp, o 500 bp de longitud, y con mayor preferencia al menos 74 bp de longitud.

En algunas modalidades, la planta es una planta de almacenamiento de azúcar, opcionalmente seleccionada del grupo que incluye la caña de azúcar, sorgo dulce y remolacha azucarera. En algunas modalidades la planta es del género ¦Saccarum, opcionalmente caña de azúcar.

De acuerdo con la invención, se proporciona, además, una célula vegetal transformada que incluye un vector que comprende uno o más casetes de silenciamiento de genes para disminuir la actividad UMPS en una célula vegetal.

En algunas modalidades, el vector es un vector de AR i . En algunas modalidades, el (los) cásete (s) de silenciamiento de genes incluye (n) ácido nucleico operativamente unido a uno o más elementos de transcripción para transcribir el ácido nucleico en donde la transcripción del ácido nucleico disminuye la actividad de UMPS.

Opcionalmente, el ácido nucleico comprende (y opcionalmente consiste en) uno o más de los siguientes: (i) la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . 1), o parte de ésta (por ejemplo al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de la secuencia) , (ii) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 1), o a parte de ésta, (iii) la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . 2) , o parte de ésta, (iv) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia sentido de un ORF de U PS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 2), o a parte de ésta, (v) (a) (i) o (ii) como anteriormente, y (b) (iii) o (iv) como anteriormente, opcionalmente con una secuencia intrón empalmable entre (a) y (b) , y en donde la secuencia intrón empalmable es de preferencia al menos 70 ó 74 bp de longitud, de preferencia al menos 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 450 bp, o 500 bp de longitud, y con mayor preferencia al menos 74 bp de longitud.

De acuerdo con la invención, se proporciona, además, una planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal que contiene o se deriva de una célula vegetal transformada que incluye un vector que comprende uno o más casetes de silenciamiento de genes para disminuir la actividad de UMPS en una célula vegetal.

En algunas modalidades, el vector es un vector de ARNi .

Opcionalmente, el ácido nucleico comprende (y opcionalmente consiste en) uno o más de los siguientes: (i) la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 1), o parte de ésta (por ejemplo al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200 , 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de la secuencia) , (ii) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec . con núm. de ident . 1) , o a parte de ésta, (iii) la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2) , o parte de ésta, (iv) una secuencia de nucleótidos al menos 80% , 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 2) , o a parte de ésta, (v) (a) (i) o (ii) como anteriormente, y (b) (iii) o (iv) como anteriormente, opcionalmente con una secuencia intrón empalmable entre (a) y (b) , y en donde la secuencia intrón empalmable es de preferencia al menos 70 ó 74 bp de longitud, de preferencia al menos 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 450 bp, o 500 bp de longitud, y con mayor preferencia al menos 74 bp de longitud.

En algunas modalidades, la planta es del género Saccharum, opcionalmente caña de azúcar, y la parte de la planta transgénica un callo.

El término "carbohidrato" como se usa en la presente descripción se refiere a los compuestos orgánicos que producen energía tales como almidones y azúcares.

El término "UMP sintasa" como se usa en la presente descripción se refiere a una enzima capaz de catalizar las dos últimas etapas de la biosíntesis de novo de pirimidina y que tiene actividad orotato fosforribosil transferasa y orotidilato descarboxilasa.

Breve Descripción de las Figuras Una modalidad de la invención se describirá, a modo de ejemplo solamente, con referencia a las figuras en las que: La Figura 1 es una representación esquemática del vector de expresión de la planta, pihUMPS, que contiene el fragmento de ADNc de UMPS de 801 bp en orientación sentido y antisentido y separados por un intrón de 74 bp; La Figura 2 es un gel de agarosa que muestra los productos restringidos resueltos de una digestión de pihUMPS con Kpnl y Xbal; La Figura 3 es un gel de agarosa que muestra los productos de la amplificación PCR resueltos obtenidos durante la exploración por PCR de los clones potenciales de caña de azúcar transformados con pihUMPS; Las Figuras 4A-4C son un gel de agarosa que muestra los productos de la amplificación de RT-PCR resueltos obtenidos durante el análisis RT-PCR semi-cuantitativo de la expresión de UMP sintasa endógena (UMPS) (4A) , expresión de la nucleósido difosfato fosfatasa endógena (NDPasa) (4B) , y la expresión de actina endógena (4C) en los clones transgénicos ; La Figura 5 muestra la represión de la actividad UMPS en caña de azúcar transformada con pihUMPS. Los extractos crudos de proteína desalinizada de las células en suspensión y internodales 8-10 (Entrenudo) se usaron para determinar la actividad UMPS. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, n = 3. * P <0.02; ** P <0.002; La Figura 6 muestra la regulación ascendente de la actividad de la uridina cinasa (UK por sus siglas en inglés) en la caña de azúcar transformada con pihUMPS. Los extractos crudos de proteína desalinizada de las células en suspensión y internodales 8-10 (Entrenudo) se usaron para determinar la actividad de UK. Los valores se calcularon como media + DESVEST, n = 3. * P <0.02; La Figura 7 muestra la actividad uracilo fosforribosiltransferasa (UPRTasa) en la caña de azúcar transformada con pihUMPS. Los extractos crudos de proteína desalinizada de las células en suspensión y internodales 8-10 (Entrenudo) se usaron para determinar la actividad UPRTasa. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, n = 3. * P <0.03; La Figura 8 muestra la actividad de la sacarosa sintasa (SuSy) , en la descomposición y síntesis en la caña de azúcar transformada con pihUMPS . Los extractos crudos de proteína desalinizada de las células en suspensión se usaron para determinar la actividad SPS. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, n = 3. * P <0.03; La Figura 9 muestra la actividad de la sacarosa sintasa (SuSy) , en la descomposición y síntesis en la caña de azúcar transformada con pihUMPS. Los extractos crudos de proteína desalinizada de los internodales 8-10 se usaron para determinar la actividad SPS. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, n = 3. P <0.03; La Figura 10 muestra la actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa) en la caña de azúcar transformada con pihUMPS. Los extractos crudos de proteína desalinizada de las células en suspensión y internodales 8-10 (Entrenudo) se usaron para determinar la actividad AGPasa. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, n = 3. * P=0.03; La Figura 11 muestra la actividad UDP-glucosa pirofosforilasa (UGPasa) en la caña de azúcar transformada con pihUMPS . Los extractos crudos de proteína desalinizada de las células en suspensión y internodales 8-10 (Entrenudo) se usaron para determinar la actividad UGPasa. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, n = 3. * P 0.05; La Figura 12 muestra el contenido de sacarosa en la caña de azúcar transformada con pihUMPS . Los extractos de etanol soluble de las células en suspensión y internodales 8-10 (Entrenudo) se usaron para determinar la concentración de sacarosa. Los valores se calcularon como media + DESVEST, WT, n = 5 y las líneas transgénicas de caña de azúcar, n=3. * P<0.05, * P 0.02; La Figura 13 muestra el contenido de almidón en la caña de azúcar transformada con pihUMPS. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, WT, n = 5 y las líneas transgénicas de caña de azúcar, n=3. * P <0.05, * P= 0.02; La Figura 14 muestra el contenido de glucosa en la caña de azúcar transformada con pihUMPS. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, WT, n = 5 y las líneas transgénicas de caña de azúcar, n=3. * P <0.05, * P< 0.02; La Figura 15 muestra el contenido de fructosa en la caña de azúcar transformada con pihUMPS. Los valores se calcularon como media ± DESVEST, WT, n = 5 y las líneas transgénicas de caña de azúcar, n=3. * p <0.05, * P= 0.02; Las Figuras 16A-16F muestran las correlaciones lineales de los metabolitos implicados en el metabolismo de la sacarosa y almidón en las células en suspensión. Aparte de la sacarosa, almidón y hexosas (pmol/g de FW) todos los niveles de metabolitos se dan en nmol/g de FW. Para la sacarosa, (16A) UDP-glucosa, (16B) fosfatos de hexosa, (16C) hexosas, (16D) uridinilatos totales; para el almidón, (16E) fosfatos de hexosa, y (16F) nucleótidos totales de adenina. Los datos son la media de tres cultivos en suspensión independientes por línea.

La Figura 17A-17F muestra las correlaciones lineales de metabolitos implicados en el metabolismo de la sacarosa y almidón en los internodales maduros. Aparte de la sacarosa, almidón y hexosas (pmol/g de FW) todos los niveles de metabolitos se dan en nmol/g de FW.Para la sacarosa, (17A) uridinilatos totales, (17B) fosfatos de hexosa, (17C) hexosas, (17D) UDP-glucosa; para el almidón, (17E) fosfatos de hexosa, y (17F) adenilatos totales. Los datos son el promedio de tres plantas independientes por línea.

La Figura 18A-18D muestra las correlaciones lineales de metabolitos y enzimas principales en las células en suspensión. Aparte de la sacarosa (pmol/g de FW) todos los niveles de metabolitos se dan en nmol/g de FW y todas las actividades enzimáticas se expresan en nmol . min^mg"1 de proteína (18A) sacarosa y sacarosa fosfato sintasa, (18B) uridina cinasa, (18C) sacarosa y UMP sintasa y (18D) uridinilatos totales y uridina cinasa. Los datos son la media de tres réplicas de las líneas tipo salvaje y transgénica.

La Figura 19A-19D muestra las correlaciones lineales de los metabolitos y enzimas principales en los internodales maduros. Aparte de la sacarosa (pmol/g de FW) todos los niveles de metabolitos se dan en nmol/g de FW y todas las actividades enzimáticas se expresan en nmol/min g de proteína; (19A) sacarosa y sacarosa fosfato sintasa, (19B) sacarosa y UMP sintasa, (19C) uridina cinasa, y (19D) uridinilatos totales y uridina cinasa. Los datos son la media de tres réplicas de las líneas tipo salvaje y transgénica.

La Figura 20 muestra el resultado de la búsqueda BLAST para las secuencias que producen alineamientos significativos usando la secuencia de ADN de UMPS de la caña de azúcar TC68130; La Figura 21 muestra una alineación de secuencias de pares de la secuencia de ADN de UMPS de caña de azúcar TC68130 (caña de azúcar) y secuencia de ADN de UMPS de sorgo dulce (XM_002456891.1) (sorgo dulce), y La sec . con núm de ident . 1 muestra la secuencia antisentido del ORF de UMPS, y La sec. con núm. de ident. 2 muestra la secuencia sentido de ORF de UMPS .

Descripción Detallada de la Invención La preparación de una planta transgénica incluye, por lo general, la transformación de una célula de una planta conocida como un protoplasto. Las técnicas de transformación para dicotiledóneas se conocen bien en la técnica e incluyen técnicas basadas en Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium.

Las técnicas de transformación incluyen la transformación a través del bombardeo de partículas, la absorción de protoplastos , tal como con PEG y por electroporación y microinyección. La elección del vector depende en gran medida de la selección preferida de las especies que se transforman. Una planta transgénica completa puede generarse después a partir del protoplasto transformado usando técnicas estándar.

La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica usada para la transformación de dicotiledóneas debido a su alta eficiencia de transformación y su amplia utilidad con muchas especies diferentes que incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, colza, papa, soja, alfalfa y álamo. La transformación de Agrobacterium típicamente implica la transferencia de un vector binario, que lleva el ADN exógeno, a una cepa apropiada de Agrobacterium. La cepa seleccionada depende del complemento de los genes vir portados por la cepa huésped de Agrrobacterium, ya sea en un plásmido co-residente o de forma cromosómica. La transferencia del vector binario recombinante , a Agrrojbacfcerium se lleva a cabo mediante apareamiento triparental usando E. coli transformada con el vector binario recombinante. El vector binario recombinante puede transferirse también a Agrobacterium por transformación de ADN. El tejido transformado se regenera en un medio selectivo que porta un antibiótico o marcador de resistencia a herbicidas.

La transferencia génica dirigida dentro de los protoplastos usando técnicas de PEG o electroporación y el bombardeo de partículas dentro del tejido del callo son técnicas de transformación preferidas para las monocotiledóneas . La transformación puede llevarse a cabo con un único vector o con múltiples vectores. La transformación del arroz puede llevarse a cabo también directamente por técnicas de transferencia génica dirigida utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación de células monocotiledóneas tales como Zea mays puede lograrse al poner en contacto las células monocotiledóneas con una multiplicidad de cuerpos como agujas en los cuales estas células pueden ser perforadas, causando una ruptura en la pared celular permitiendo de este modo la entrada del ADN transformante a las células.

Los métodos para la preparación de los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de nucleótidos para efectuar el silenciamiento de genes se conocen en la técnica. Por ejemplo, el ADNc que codifica el ácido nucleico se inserta en un vector de transformación de la planta en la forma de un cásete que contiene todos los elementos necesarios para la transformación de la célula vegetal y la expresión del ADNc para producir el ácido nucleico en la célula vegetal. El cásete podría, por ejemplo, contener en el marco de lectura apropiado y por lo tanto, operativamente unido, un promotor funcional en las células vegetales, una secuencia líder 5 ' no traducida, el inserto de ADN, y una región funcional 3' no traducida en las plantas para provocar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 31 de la secuencia de ARN para los requisitos de traducción.

Los promotores para la expresión de ácidos nucleicos en las células vegetales, y la secuencia de nucleótidos de éstos, pueden, por ejemplo, originarse a partir de plantas o virus ADN de plantas, y diversos promotores para este propósito se usan en la técnica. Los promotores seleccionados pueden tener actividad constitutiva tal como el promotor CaMV 35S, el promotor de actina, y el promotor de ubiquitina. Como alternativa, pueden ser inducibles y de este modo conducir la expresión del gen de resistencia a los sitios de infección por la herida o patógeno. Otros promotores útiles se expresan en tipos de células específicos (tales como células epidérmicas de la hoja, células del mesófilo, células de la corteza de la raíz) o en los tejidos u órganos específicos (por ejemplo, raíces, hojas o flores), tales como el gen trpA de maíz que se expresa preferentemente en las células de la médula y el promotor derivado del gen de maíz que codifica la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) , que dirige la expresión de una manera específica en la hoja. El promotor seleccionado puede conducir la expresión del gen bajo un promotor inducido por la luz u otro temporalmente regulado. Una alternativa adicional es que el promotor seleccionado sea químicamente regulado. El promotor puede ser también específico para la expresión del ácido nucleico en plantas monocotiledoneas o para las plantas dicotiledóneas.

Una variedad de sitios de poliadenilación y de escisión transcripcional están disponibles para usar en casetes de expresión. Estas son responsables del procesamiento correcto (formación) del extremo 3 1 del AR m. La escisión transcripcional apropiada y los sitios de poliadenilación funcional en las plantas incluyen la escisión y los sitios de poliadenilación 35S de CaMV, la escisión y los sitios poliadenilación de tml, la escisión y los sitios de poliadenilación de la nopalina sintasa, la escisión y los sitios de poliadenilación rbcS E9 del guisante. Estos se pueden usar en monocotiledoneas y dicotiledóneas.

Un número de secuencias líder no traducidas derivadas de los virus se conocen para mejorar la expresión, específ camente en las células dicotiledóneas. Las secuencias líder del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV por sus siglas en inglés, la "O-secuencia" ) , Virus del Moteado Clorótico del Maíz (MCMV por sus siglas en inglés) , y Virus del Mosaico de la Alfalfa (AMV por sus siglas en inglés) pueden usarse para mejorar la expresión.

Un cásete de expresión que comprende el ácido nucleico que contiene uno o más de los diversos elementos descritos anteriormente puede insertarse en un vector de transformación de la planta por métodos estándar de ADN recombinante . Como alternativa, algunos o todos los elementos del cásete de expresión pueden presentarse en el vector, y cualquiera de los elementos restantes se puede adicionar al vector según sea necesario. Muchos vectores de transformación están disponibles en el comercio para la transformación de la planta, y los ácidos nucleicos de esta invención se pueden usar junto con cualquiera de los vectores de ese tipo. La mayoría de los vectores incluyen uno o más genes que codifican las proteínas marcadoras de selección. El vector usado dependerá de la técnica de transformación preferida, las especies objetivo para la transformación, y el marcador de selección deseado. Para determinadas especies objetivo, pueden preferirise marcadores específicos de selección de herbicida o antibiótico, tal como el gen nptll que confiere resistencia a la kanamicina, el gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina, el gen hph que confiere resistencia al antibiótico higromicina, y el gen dhfr que confiere resistencia al metotrexato.

De acuerdo con la invención, se pueden preparar plantas transgénicas usando técnicas estándar que resultan en la regulación descendente o regulación ascendente de la expresión de un¦ gen o la eliminación completa de su expresión. De esta manera, pueden producirse células vegetales, plantas, partes de planta, etc., con actividad UMPS reducida. El cambio en la expresión puede provocarse por la introducción de secuencias que interfieren con la expresión génica. Las secuencias de este tipo se conocen en la técnica e incluyen constructos antisentido, constructos sentido, constructos ARN de silenciamiento, o moléculas de ARN de interferencia, o se puede provocar por interrupciones genómicas del gen de la sensibilidad propio a través del uso de, por ejemplo, transposones, tilling, recombinación homologa o mutaciones sin sentido. El uso de ácidos nucleicos antisentido se conoce bien en la técnica, y puede ser ARN, ADN, un APN o cualquier otra molécula adecuada. Las moléculas de ARN catalíticas o ribozimas se pueden usar para inhibir la expresión de los genes de sensibilidad. Pueden diseñarse ribozimas que pareen específicamente con el ARN objetivo y escindan el esqueleto fosfodiéster en un lugar específico, y de ese modo inactivando funcionalmente el ARN objetivo. Las secuencias de ribozima pueden usarse en combinación con los ARN antisentido. Las plantas transgénicas que incluyen uno o más genes de sensibilidad inactivados se pueden producir, además, usando el silenciamiento o interferencia por ARN (ARNi) , que puede denominarse también silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS por sus siglas en inglés) o co-supresión .

En el contexto de esta invención, "silenciamiento génico" (también llamado silenciamiento de ARN, ARNi o interferencia mediada por ARN) incluye una referencia a cualquier mecanismo a través del cual la presencia de un ARN de hebra simple o de hebra doble en una célula resulta en la inhibición de la expresión de un gen objetivo que comprende una secuencia idéntica o casi idéntica a la del ARN, e incluye, pero no se limitan a: ARN de interferencia, represión de la traducción de un ARNm objetivo transcrito a partir del gen objetivo sin alteración de la estabilidad del ARNm, y el silenciamiento transcripcional tal como por acetilación de histona y formación de heterocromatina que conduce a la inhibición de la transcripción del ARNm objetivo .

En la práctica de la invención puede usarse cualquier método para reducir la expresión de un gen UMP sintasa en una planta. El término "expresión" como se usa en la presente descripción en el contexto de un producto génico, se refiere a la biosíntesis de ese producto génico, incluyendo la transcripción y/o traducción y/o ensamblaje del producto génico. Los métodos para silenciar (es decir, reducir o eliminar) la expresión de un gen en una planta se conocen bien en la técnica, y cualquier método de este tipo puede usarse en los métodos de la presente invención. Las construcciones antisentido, total o parcialmente complementarias con al menos una parte del ARN mensajero (ARNm) para la secuencia objetivo se pueden utilizar como se mencionó anteriormente. Los nucleótidos antisentido se diseñan para unirse al ARNm correspondiente.

Las modificaciones de las secuencias para usar en las moléculas UMP de silenciamiento de genes de la invención se pueden preparar siempre que las secuencias se unan a, e interfieran con, la expresión del ARNm correspondiente. En este sentido, las secuencias que tienen al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, o una similitud superior de secuencia a la secuencia UMP objetivo se pueden usar con la invención. Las partes de las secuencias para usar en las moléculas UMP de silenciamiento de genes de la invención se pueden usar también para interrumpir la expresión del gen UMP objetivo. El uso de secuencias de al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos aproximadamente 200 nucleótidos, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 450, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 550, o mayores, pueden usarse preferentemente. La co-supresión puede usarse también para inhibir la expresión del gen UMP objetivo. En este sentido, una secuencia heteróloga UMP sintasa puede expresarse en la orientación sentido para inhibir la expresión del gen endógeno UMP sintasa.

Las secuencias similares al gen UMP descrito en la presente descripción pueden encontrarse usando diversas bases de datos conocidas en la técnica, disponibles al público tales como el GenBank (htt : //www. ncbi . nlm. nih. gov/Genbank/index .html) .

El uso de secuencias intrón empalmables para regular la expresión de genes exogenos en plantas transgénicas se conoce en la técnica. Las secuencias intrón empalmables de al menos 70 nt pueden usarse con la invención. El uso de secuencias de al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos aproximadamente 200 nucleótidos, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 450, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 550, o mayores se conocen en la técnica. Las secuencias intrón empalmables de hasta aproximadamente 0.75 kb o incluso hasta 1.1 kb de longitud se conocen en la técnica.

En una modalidad de la invención, el contenido de sacarosa, almidón y glucosa de tejido de caña de azúcar transgénica se aumenta por la regulación descendente de UMPS basada en ARNi. En resumen, un vector que contiene un cásete de silenciamiento de genes se inserta en una célula vegetal, el c sete de silenciamiento de genes incluye el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 1 y sec . con núm. de ident. 2 y una secuencia intrón empalmable de 74 bp entre ellas, el cásete de silenciamiento de genes operativamente unido a un elemento de transcripción en forma del promotor de monocotiledóneas : el promotor UBI . La transcripción del ácido nucleico en la célula vegetal disminuye la actividad de la UMP sintasa. Una planta transgénica de caña de azúcar se regenera después a partir de la célula vegetal transformada; y el tejido de caña de azúcar se produce con un contenido de carbohidrato aumentado.

EJEMPLO 1. Introducción Aunque los nucleótidos uridina se reportaron por varios grupos como cofactores importantes en el uso de azúcares para la síntesis de almidón, el trabajo reciente de Geigenberger y otros (2005) demostró que la inhibición antisentido de la vía de novo de la síntesis de pirimidina resulta en una estimulación compensatoria de las vías de salvamento que consumen menos energía. Los efectos posteriores de la inhibición de esta vía en tubérculos de papa incluyeron una mezcla elevada de nucleótidos uridina, contenidos elevados de almidón, contenidos de sacarosa disminuidos y un rendimiento mejorado de los cultivos.

La biosíntesis de novo de nucleótidos de pirimidina, también referida como la vía de orotato, se define como la formación de UMP de carbamoilfosfato (CP) , aspartato, y 5-fosforribosil-l-pirofosfato (PRPP) . La biosíntesis de nucleótidos de pirimidina consta de seis etapas enzimáticas.

La carbamoil fosfato sintasa (CPSasa) produce CP a partir de una combinación de carbonato, ATP, y un grupo amino. CP se usa no sólo en la síntesis de novo de pirimidina, sino también como un precursor para la biosíntesis de arginina. La siguiente etapa, en la que la aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza la condensación de CP con aspartato para formar carbamoilaspartato (CA) , es específica para la biosíntesis de pirimidina. La ciclización de la carbamoilaspartato para producir el anillo de pirimidina se cataliza por la enzima dihidroorotasa (DHOasa) .

Posteriormente, el dihidroorotato (DHO) se oxida por la dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) para producir orotato (OA) . El orotato se condensa con PRPP a orotidina 5-monofosfato (OMP) por orotato fosforribosiltransferasa (OPRTasa) , que se descarboxila después por orotidilato descarboxilasa (ODCasa) para formar uridina-5-monofosfato (UMP) .

Como la síntesis de novo de los nucleótidos es consumidora de energía, las células han desarrollado una estrategia para volver a usar los nucleósidos preformados y nucleobases a través de reacciones de salvamento. Los nucleósidos de uridina/citidina y timidina se salvan a sus respectivos nucleótidos por cinasas de nucleósidos específicas y el uracilo se salva directamente con PRPP dentro de UMP a través de uracilo fosforribosiltransferasa.

Las vías de salvamento pueden jugar además un papel importante en el suministro de nucleobases a las células, que son incapaces de sintetizar cantidades suficientes para sus necesidades .

En las plantas, la UMP sintasa es una proteína bifuncional que cataliza las dos últimas etapas de la biosíntesis de novo de pirimidina. Al igual que en eucariotas superiores, la UMP sintasa de planta tiene actividades orotato fosforribosiltransferasa (OPRTasa, EC 2.4.2.10) y orotidilato descarboxilasa (ODCasa, EC 4.1.1.23). Se demostró anteriormente que la inhibición de UMP sintasa por la inhibición antisentido de la vía de novo de la síntesis de pirimidina da lugar a una disminución de los contenidos de sacarosa (Geigenberger y otros, 2005) . En contraste, informamos en la presente descripción, el aumento inesperado en el contenido de azúcar de una planta como resultado de la inhibición antisentido de la vía novo de la síntesis de pirimidina. 2. Materiales y Métodos Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma- Aldrich (Sudáfrica) a menos que se indique lo contrario. Todas las enzimas de acoplamiento se obtuvieron de Roche (Sudáfrica) a menos que se indique lo contrario. 2.1 Preparación de plantas trangénicas de caña de azúcar 2.1.1 Clonación de UMPS en el vector de silenciamiento pihUMPS El vector ihpARN usado en este proyecto se basó en la tecnología de alto rendimiento de silenciamiento génico mediado por AR i . El vector pihUMPS (Figura 1) se construyó a partir de un producto de PCR de 801 bp amplificado a partir del ADNc completo de UMPS de caña de azúcar clonado en pGEM®-T Easy (Promega) . El ADNc de UMP sintasa se aisló del ARN del enrollamiento de la hoja de caña de azúcar (variedad N19) . Los cebadores específicos directo (GCAAGTTTGCTGACATTGGA) e inverso (CCACAGAAGCACTGGTGAAA) se diseñaron a partir de la secuencia de ADN de la caña de azúcar obtenida de TIGR (TC68130, www. tigr . org) usando el programa Primer3 (http : / /frodo . wi . mit . edu) . Las secuencias aisladas muestran los marcos de lectura abiertos (ORF por sus siglas en inglés) de 166 aminoácidos. Debido a la disponibilidad del sitio de multi-clonación, así como del cebador T7 y el inverso T3 ; el vector pGEMT-Easy se usó para clonar el gen aislado antes de la sub-clonación en pBlueScript® SK y pBlueScript® KS (usando los sitios PstI y Apal) modificados para contener secuencias intrones de 45 b . Las inserciones y sus segmentos intrones adyacentes a partir del pBlueScript® SK y pBlueScript® KS modificados se aislaron posteriormente (a continuación de la digestión de plásmidos con Kpnl y Xbal) . El vector de expresión pU3Z (que contiene un promotor de monocotiledóneo) se digirió igualmente con Kpnl y se desfosforiló . Usando la ligazón de dos insertos, se construyó el constructo pihUMPS, que incluía las cadenas sentido y antisentido de UMP sintasa. Los fragmentos génicos de UMPS se separaron por un intrón completamente ensamblado de 74 nucleótidos de longitud. El vector pihUMPS contuvo por tanto un fragmento UMPS con orientación antisentido y sentido a cada lado de una secuencia de intrón empalmable y operativamente unido al promotor UBI. 2.1.2 Material de la planta Las plantas de caña de azúcar (tipo transgénico y salvaje de Saccharum spp. variedad N19) se cultivaron bajo condiciones de invernadero (¾ período de 6 h de luz, ¾25 0 C) . Tres tallos maduros se cosecharon de cada línea transgénica seleccionada. Para limitar las pérdidas de metabolitos, los tejidos de las plantas (8-10 internodales mezclados) se cortaron en N2 líquido inmediatamente después de la cosecha y se molieron hasta un polvo fino en un molino analítico básico All IKA® (IKA). Todos los tejidos se almacenaron a -80 °C en tubos de 50 mi con tapa de rosca (Corning) . 2.1.3 Transformación de la planta El vector pihUMPS se usó para co-transformar los callos de caña de azúcar usando protocolos estándares. Los callos transgénicos se seleccionaron usando geneticina de acuerdo con los protocolos estándares, basados en el marcador de selección npt-11 en el constructo co-transformado, y regenerado en las plantas. Las plantas regeneradas se aclimataron y cultivaron bajo condiciones de invernadero para su análisis posterior. 2.1.4 Detección por PCR de los transformantes potenciales Para seleccionar los clones positivamente transformados, los transformantes se detectaron por medio de la amplificación por PCR para la presencia del vector pihUMPS. El ADN se extrajo de 30-50 mg de tejidos de internodales maduros (8-10) de líneas transgénicas potenciales como se describió por un método modificado de McGarvey y Kaper (1991) . 400 µ? de amortiguador de extracción (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, bromuro de cetiltrimetilamonio al 1% (CTAB) (Merck), 0.7 M de NaCl, 10 mM de EDTA, polivinilpirrolidona al 0.5%, ß-mercaptoetanol al 0.1% (BME, se adicionó justo antes del uso)) se adicionó a los tejidos y agitó durante 1 minuto. Los tubos se incubaron después durante 60 min a 60 °C. 400 µ? de cloroformo se adicionó y las muestras se agitaron y centrifugaron (13 000 rpm, 5 min) . La capa acuosa se transfirió a tubos nuevos Eppendorff que contenían 1 volumen de isopropanol al 100% frío y se incubó en hielo durante 15 min. Los ácidos nucleicos precipitados se centrifugaron (13 000 rpm, 10 min) y lavaron en EtOH al 70%, se secaron y resuspendieron en 20 µ? de amortiguador TE (10 mM de Tris-HCl, pH 7.5 , 1 mM de EDTA) que contenía 20 g/ml de RNAsaA. La reacción de PCR incluyó 25 ng de ADN molde, intrón directo (GAT CCC ACC TGC ATCGAT; 10µ?) , Nos-t (CAC AAG GGC CAA AGG ADJ C; 10 µ?) , 10 µ? de dNTPs (1 µ? cada uno), amortiguador para PCR lOx que contenía 0.37mM de MgCl2, y 0.25µ1 de la enzima Taq polimerasa (1 U) para un volumen final de 25 µ?. Los. parámetros del ciclo incluyeron la incubación de la reacción de PCR durante 3 minutos a 94 °C, seguido por un ciclo de 3-etapas de 94°C durante 30 segundos, 60 °C durante 45 segundos y 72 °C durante 2 minutos, repetidos un total de 30 veces. Se incluyó una etapa final de elongación de 5 minutos a 72 °C.

Para cada transformación, siete plantas independientes regeneradas que fueron resistentes a la geneticina se transfirieron al suelo y se aclimataron en condiciones estándares. 2.2 Caracterización de la expresión génica 2.2.1 Análisis semi-cuantitativo de la expresión génica de UMP sintasa y NDPasa endógenas usando RT-PCR Las células en suspensión (cultivo de tejido), así como tejido internodal (8-10) recogidos de plantas maduras cultivadas en el invernadero se usaron para la extracción de ARN. El ARN total se extrajo de todos los tejidos de acuerdo con un método modificado de Bugos y otros (1995) . Los tejidos se cortaron en trozos pequeños directamente dentro de N2 líquido y se molieron en un molino analítico básico All IKA®.

El polvo fino se transfirió a tubos estériles de 50 mi (Corning) en N2 líquido y se almacenó a -80 °C. Dos gramos de tejido congelado se adicionó a 10 mi de amortiguador de homogenización (0.1 M de Tris, pH 8.0, 1 m de EDTA, 0.1 M de NaCl, SDS al 1% (p/v) , BME al 0.1%) y 10 mi de fenolcloroformo (1:1) en un tubo de 50 mi y se agitó. Se adicionó acetato de sodio, pH 5.2 , a una concentración final de 0.1 M y la emulsión se incubó en hielo durante 15 minutos, seguido por la centrifugación a 4 °C (12 000 g, 15 minutos) .

La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo que contenía 3 volúmenes de EtOH al 100% y 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M, pH 5.2, se mezcló y precipitó a -20 °C durante dos horas. El ácido nucleico precipitado se centrifugó a 4 °C (12 000 g, 15 minutos) y se lavó con EtOH al 75%. Las muestras se resuspendieron en agua y se trataron con desoxirribonucleasa I (libre de RNasa, Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante seguido por la precipitación con 2.5 volúmenes de EtOH al 100%, 0.1 volúmenes de acetato de sodio.

La RT-PCR semi-cuantitativa se usó para determinar si la regulación descendente de la transcripción de la UMP sintasa resultó en la regulación ascendente de los transcritos que codifican para las enzimas de salvamento, tales como NDPasa.

Cinco µ? de ARN total obtenido de los tejidos de internodales maduros de la caña de azúcar transgénica que mostraban una actividad UMP sintasa reducida se transcribieron de manera inversa usando el Kit RevertAid™ para síntesis de la primera cadena de ADNc (Fermentas, Estados Unidos) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores usados para amplificar los transcritos de ARN de UMPS fueron: directo (GCTTGAAGCTGAAGGGTTTG) e inverso (ACACAAACGATGATGGAGCA) ; para la nucleósido difosfato fosfatasa (NDPasa) fueron: directo (AAGGCCTTGAAGCTTGTGAA) e inverso (TGCAAAGACGCGAAAGTAAA) ; y para el gen de limpieza actina fueron: directo (ACTGGGACGACATGGAGAAG) e inverso (TTCTCCACAGAGGAGCTGGT) . Cada reacción de PCR contuvo 0.5 g de ADNc como molde. La amplificación por RT-PCR del gen de limpieza -actina se llevó a cabo para normalizar la cantidad de ADNc molde.

Cinco líneas transgénicas de caña de azúcar se seleccionaron para análisis posterior basado en el nivel de actividad de la UMP sintasa y la disponibilidad de regeneración de la planta. Estas líneas transgénicas de caña de azúcar se marcaron 2.2, 3.1, 3.2, 3.3 y 4.2, y se refieren como tal a continuación. En los análisis posteriores, las líneas transgénicas de caña de azúcar se compararon con la caña de azúcar no transformada o de tipo salvaje ( T por sus siglas en inglés) . 2.3 Caracterización de la actividad enzimática 2.3.1 Determinación de proteína Las concentraciones de proteína se determinaron de acuerdo con Bradford (1976) usando una solución de ensayo de proteínas disponible en el comercio (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La albúmina bovina (Fracción V) (Roche) se usó como estándar de proteína . 2.3.2 Ensayo para la actividad de UMP sintasa (UMPS) , uridina cinasa (UK) , y uracilo fosforibotransferasa (UPRTasa) Los extractos crudos de proteína se prepararon a partir del cultivo en suspensión/callos y el tejido de maduración internodales (8-10) . El amortiguador de extracción de proteína consistió en 50 mM de HEPES-NaOH, pH 7.6, 2 mM de EDTA, glicerol al 10%, 28mM de /3-mercaptoetanol, PVPP al 2% y Completo, el cual se adicionó justo antes del uso. Los extractos se incubaron en hielo durante 10 minutos y se centrifugaron durante 15 minutos (10 000 xg, 4 °C) . Los sobrenadantes se transfirieron a columnas de giro Sephadex G-50 (Sigma-Aldrich) pre-equilibradas en amortiguador de extracción y se centrifugaron durante 2 min (10000 rpm, 4 °C) . La reacción de UMP sintasa se inició por la adición de la proteína desalinizada en el cóctel de ensayo que contenía, 50 mM de HEPES-NaOH (pH 7.6), 10 mM de MgCl2, 2 mM de MgCl2, 28µ? de -mercaptoetanol , 0.6 mM de PRPP, 45µ? de ácido orótico marcado con [2-14C] . La mezcla de reacción se incubó durante 15-25 minutos a temperatura ambiente y se detuvo con ebullición durante 2 minutos; modificada por Ashihara y otros 2000. En un TLC se cargaron dos (2) µ? y se corrieron durante 1 hora en un amortiguador de butanol : ácido acético: agua (25:24:1) .

Para la uridina cinasa (UK) , la reacción se inició mediante la adición de la proteína desalinizada en el cóctel de ensayo que contenía, 50 mM de HEPES-NaOH (pH 7.6), 10 mM de MgCl2, 2 mM de MgCl2, 28µ? de /3-mercaptoetanol , 3.75 mM de ATP, 45µ? de uridina marcada con [2-14C] . La mezcla de reacción se incubó durante 15-25 minutos a temperatura ambiente y se detuvo con ebullición durante 2 minutos; modificada por Ashihara y otros 2000. En un TLC se cargaron dos (2) µ? y se corrieron durante 1 hora en un amortiguador de butanol: ácido acético: agua (25:24:1).

Para la uracilo fosforibotransferasa (UPRTasa) , la reacción se inició mediante la adición de la proteína desalinizada en el cóctel de ensayo que contiene, 50 mM de HEPES-NaOH (pH 7.6), 10 mM de MgCl2, 2 mM de MgCl2, 28µ? de ß-mercaptoetanol, 0.6 mM de PRPP, 45µ? de uracilo marcado con [2-1 C] . La mezcla de reacción se incubó durante 15-25 minutos a temperatura ambiente y se detuvo con ebullición durante 2 minutos; modificada por Ashihara y otros 2000. En un TLC se cargaron dos (2) µ? y se corrieron durante 1 hora en un amortiguador de butanol: ácido acético: agua (25:24:1). 2.3.3 Extracción y cuantificación de sacarosa, hexosa y almidón Cincuenta miligramos (50 ± 10 mg) de tejido congelado se adicionaron a 500 µ? de etanol al 80%. Las suspensiones se incubaron a 65 °C durante la noche y centrifugaron durante 5 minutos (3500 xg, temperatura ambiente) . El sobrenadante se usó directamente para el ensayo de azúcar. Los residuos se extrajeron una vez más en etanol al 80% y los sobrenadantes se descartaron para eliminar las hexosas restantes. Las pelotillas se resuspendieron en 500µ1 de H20 MilliQ y se incubaron a 100°C durante 4 horas. Los sobrenadantes se usaron directamente para el análisis de fondo del almidón o se almacenaron a -20 °C. Las pelotillas se resuspendieron en amortiguador ???µ? (50 mM de NaCl) que contenía 10 unidades de AMG y se incubaron a 55°C durante 2 horas.

La cuantificación enzimática se realizó de acuerdo con el método de Bergmeyer y Bernt (1974) . Para el análisis de hexosa, 5 µ? de extracto se adicionaron a 45 µ? de H20 MilliQ y 200 µ? de amortiguador A (150 mM de Tris pH 8.1, 5 mM de MgCl2, 1 mM de ATP (Roche), 1 mM de NADP (Roche)) en una placa de microtitulación de 96 pocilios (Nunc) . Después de una lectura inicial a A340 , se adicionaron 0.5 U de hexocinasa/glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (HK/G6-PDH) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Una segunda lectura se tomó para calcular el contenido de glucosa libre. Se adicionaron 0.7 U de fosfoglucosa isomerasa (PGI) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Una tercera lectura se tomó para calcular el contenido de fructosa libre presente en el extracto. Para cuantificar la sacarosa presente en la muestra, 5 µ? del extracto se incubaron con 40 µ? de amortiguador B (100 mM de citrato pH 5.0, 5 mM de MgCl2) y 10 U de ß- fructosidasa (Roche) durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la adición de 200 µ? de amortiguador A y 0.5 U de HK/G6-PDH, las muestras se incubaron y se leyeron como antes. Todas las lecturas espectrofotométricas se obtuvieron usando un lector de placas PowerWaveX. 2.3.4 Ensayo para la actividad de la sacarosa fosfato sintasa (SPS, por sus siglas en inglés) La actividad de SPS se determinó en los tejidos de callo y internodales (8-10) . La actividad de SPS se ensayó de acuerdo con Baxter y otros (2003) bajo condiciones de reacción máximas (Vmáx) y limitativas (Viim) . El amortiguador de extracción de proteína consistió en 50 mM de HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 10 mM de DTT y comprimidos del cóctel de inhibidores de proteasa Completo® (Roche) que se adicionó justo antes del uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los extractos se centrifugaron durante 2 minutos (16 000 g, 4 °C) . Los sobrenadantes se transfirieron a las columnas de giro Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich) pre-equilibrada con amortiguador de extracción y centrifugada durante 2 min (2000 rpm, 4 °C) . 100 µ? de la muestra cruda de protelna se incubó durante 30 min a 35 °C con 100 µ? de amortiguador de ensayo (50 mM de HEPES-KOH, pH 7.5, 20 mM de KC1 y 4 mM de MgCl2) que contiene (a) ensayo de Vmsx; 12 mM de UDP-GIc, 10 mM de Fruc 6-P y 40 mM de Glc-6-?, o (b) ensayo de Viim; 4 mM de UDP-GIc, 2 mM de Fru-6-?, 8 mM de Glc-6-? y 5 mM de KH2P04. La reacción se calentó a 95 °C durante 5 minutos para detener la reacción y se centrifugó a 16 000 g durante 5 min. 100 µ? de sobrenadante se adicionaron a 100 µ? de 5 M de KOH y se incubaron a 95 °C durante 10 minutos para destruir los fosfatos de hexosa sin reaccionar. Después de adicionar 200 µ? del reactivo de antrona (antrona al 0.14% en 14.6 M de H2S04) a 50 µ? de muestra, se midió la absorbancia a 620 nm en un espectrofotómetro PowerWaveX . La cantidad absoluta de sacarosa se calculó a partir de una curva estándar con 0-200 nmol de sacarosa. 2.3.5 Ensayo para la sacarosa sintasa (SuSy) en la dirección de la descomposición de sacarosa Para determinar la tasa de descomposición de sacarosa en los tejidos de callos e internodos (8-10) , la actividad catalítica de SuSy se ensayó de acuerdo con Scháfer y otros (2004) . El amortiguador de extracción de la proteína consistió en 100 mM de Tris-HCl, pH 7.0 , 10 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 10 mM de DTT y comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasa Completo® (Roche) que se adicionó justo antes del uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los extractos se centrifugaron durante 2 minutos (16 000 g, 4 °C).Los sobrenadantes se transfirieron a las columnas de giro Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich) pre-equilibrada con amortiguador de extracción y centrifugada durante 2 min (2000 rpm, 4 °C) . Las muestras de proteína cruda (20 µ?) se incubaron con amortiguador de ensayo consistente de 100 mM de Tris-HCl (pH 7.0), 2 mM de MgCl2, 400 mM de sacarosa, 2 mM de NAD+, 1 mM de pirofosfato de sodio, 4 U/ml de fosfoglucomutasa (Roche) , 4 U/ml de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Roche) . Las reacciones se iniciaron mediante la adición de difosfato uridina (UDP) a 2 mM. La producción de NADH se monitoreó a 340 nm. 2.3.6 Ensayo para la sacarosa sintasa (SuSy) en la dirección de la síntesis de sacarosa Para determinar la tasa de síntesis de sacarosa en los te idos de callos y internodales (8-10) , la actividad sintética de SuSy se ensayó de acuerdo con Scháfer y otros (2004) . El amortiguador de extracción de la proteína consistió en 100 mM de Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 10 mM de DTT y comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasa Completo® (Roche) . Los extractos se centrifugaron durante 2 minutos (16 000 g, 4 °C). Los sobrenadantes se transfirieron a las columnas de giro Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich) pre-equilibrada con amortiguador de extracción y centrifugada durante 2 min (2000 rpm, 4 °C) . Las muestras de proteína cruda (20 µ?) se incubaron con amortiguador de ensayo consistente de 100 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM de MgCl2, 20 mM de UDP-glucosa, 0.2 mM de NADH, 1 mM de fosfoenolpiruvato (PEP) , y 0.45 U/ml de piruvato cinasa/lactato deshidrogenasa (PK/LDH, Roche) . Las reacciones se iniciaron mediante la adición de fructosa a 10 mM. La producción de NAD+ se monitoreó a 340 nm. 2.3.7 Ensayo para la actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa La actividad de la ADP-glucosa pirofosforilasa se ensayó de acuerdo con una modificación del método de Ou Lee y Setter (1985) . El cóctel de ensayo consistió de 50 mM de amortiguador HEPES (pH 7) que contiene 5 mM de MgCl2, 5 mM de ADP-glucosa, 2 mM de pirofosfato de sodio (PPi) , 1 mM de NADP+, 4U/ml de fosfoglucomutasa, 4U/ml de 6-fosfogluconato deshidrogenasa y 4U/ml de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. La lectura de fondo se realizó durante 5 minutos a 340 nm después de adicionar 20 µ? de extracto de proteínas en el cóctel de ensayo sin PPi, y la reacción se inició mediante la adición de PPi y se leyó durante 20 minutos a 340 nm. 2.3.8 Ensayo para la actividad de la UDP-glucosa pirofosforilasa La actividad de la UDP-glucosa pirofosforilasa se ensayó de acuerdo con una modificación del método de Ou Lee y Setter (1985) . El cóctel de ensayo consistió de 100 mM de amortiguador Tris (pH 7) que contenía 2 mM de MgCl2/ 10 mM de UDP-glucosa, 1 mM de pirofosfato de sodio (PPi) , 1 mM de NAD+, 4U/ml de fosfoglucomutasa, y 4U/ml de glucosa- 6 - fosfato deshidrogenasa . La lectura de fondo se realizó durante 5 minutos a 340 nm después de adicionar 20 µ? de extracto de proteínas en el cóctel de ensayo sin PPi, y la reacción se inició mediante la adición de PPi y leyó durante 20 minutos a 340 nm. 2.3.9 Extracción de sacarosa, hexosa y almidón y cuanti ficación enzimática Cincuenta miligramos (50 ± 10 mg) de tejido congelado se adicionaron a 500µ1 de etanol al 80%. Las suspensiones se incubaron a 65 °C durante la noche y se centrifugaron durante 5 minutos (3 500 xg, temperatura ambiente) . El sobrenadante se usó directamente para el ensayo de azúcar. Los residuos se extrajeron una vez más en etanol al 80% y los sobrenadantes se descartaron para eliminar las hexosas restantes. Las pelotillas se resuspendieron en 500µ1 de H20 MilliQ y se incubaron a 100°C durante 4 horas. Los sobrenadantes se usaron directamente para el análisis de fondo del almidón o se almacenaron a -20 °C. Las pelotillas se resuspendieron en ???µ? de amortiguador (50 mM de NaCl) conteniendo 10 unidades de AMG e incubaron a 55 °C durante 2 horas. La cuantificación enzimática se realizó de acuerdo con el método de Bergttieyer y Bernt (1974) .

Para el análisis de hexosa, 5µ1 de extracto se adicionaron a 45µ1 de H20 MilliQ y 200µ1 de amortiguador A (150 mM de Tris pH 8.1, 5 mM de MgC12, 1 mM de ATP (Roche), 1 mM de NADP (Roche)) en una placa de microtitulación de 96 pocilios (Nunc) . Después de una lectura inicial a 340 nm, se adicionaron 0.5 unidades de hexocinasa/glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (HK/G6-PDH) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Una segunda lectura se tomó para calcular el contenido de glucosa libre. Se adicionaron 0.7 unidades de fosfoglucosa isomerasa (PGI) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Una tercera lectura se tomó para calcular el contenido de fructosa libre presente en el extracto. Para cuantificar la sacarosa presente en la muestra, 5µ1 del extracto se incubaron con 40µ1 de amortiguador B (100 mM de citrato pH 5.0 , 5 mM de MgCl2) y 10 unidades de ß- fructosidasa (Roche) durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la adición de 200µ1 de amortiguador A y 0.5 unidades de HK/G6-PDH, las muestras se incubaron y se leyeron como anteriormente. Todas las lecturas espectrofotométricas se realizaron con un lector de placas PowerWaveX . 2.3.10 Determinación del fosfato de hexosa y nucleótidos Las extracciones del metabolito se realizaron de acuerdo con Stitt y otros (1989) . Un gramo de tejido previamente almacenado se adicionó a 1.5 mi de HC104 al 10% helado, se agitó e incubó a 4°C durante 20 minutos con la mezclado. El material insoluble se centrifugó durante 2 minutos (13 000 rpm, a 4°C) . Después de la eliminación del sobrenadante, el sedimento se lavó e incubó durante 15 minutos con 500µ1 de HC104 al 2%, se centrifugó durante 2 minutos (13 000 rpm, 4°C), y se mezcló con el primer sobrenadante. Las muestras se neutralizaron (pH 7.0-7.5) mediante la adición de 5M de KOH, 1 M de trietanolamina y see incubaron a 4 °C durante 15 minutos. El KC104 insoluble se centrifugó durante 2 minutos (13 000 rpm) y el sobrenadante neutralizado se filtró en un 0.25pm y usó para la cuantificación del fosfato de hexosa. El sobrenadante neutralizado filtrado se congeló rápidamente en nitrógeno liquido y se liofilizó en un Speed Vac Plus A SCllA.

Para el ensayo de fosfatos de hexosa, 20µ1 de la muestra se adicionaron a 230µ1 de amortiguador de reacción que contenía 100 mM de Tris, pH 8.0, 5 mM de MgCl2 y 0.25 mM.de NADP en una placa de 96 pocilios. El fondo se leyó a 340 nm . 0.1 unidades de G6-PDH, 0.7 unidades de PGI y 0.2 unidades de fosfoglucomutasa (PGM) en 5 mM de Tris-HCl, pH 8.0 se adicionaron secuencialmente , se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y se leyeron a 340 nm para determinar la glucosa-6-fosfato, f utosa- 6 - fosfato y glucosa-l-fosfato, respectivamente. Los nucleótidos y azúcares de nucleótidos se ensayaron a partir de las muestras liofilizadas resuspendidas usando la cromatografía líquida de alta presión. 2.3.11 Análisis estadístico de los datos La prueba t de Student se usó para detectar diferencias significativas entre las medias de los grupos. El cuadrado del coeficiente de correlación producto-momento de Pearson (coeficiente de determinación) se calculó para indicar la correlación entre las características. Para todos los análisis estadísticos se usó STATISTICA (sistema de programa para análisis de datos), versión 8. www.statsoft.com) . 2.3.10 Análisis bioinformático de UMPS de caña de azúcar La secuencia de ADN de UMPS de caña de azúcar (TC68130) se usó para llevar a cabo una búsqueda BLAST de las secuencias de ADN muy similares usando las herramientas en linea disponibles en http : //-blast . ncbi . nlm . nih . gov/Blast . cgi . Las secuencias de regiones que mostraban una alta similitud se alinearon cada una con el ADN de la UMPS de caña de azúcar usando la web estándar basada en las herramientas de alineación, tales como las ofrecidas por el Instituto Europeo de Bioinformática-EMBL y disponibles en línea en http : //www . ebi . ac . uk/Tools/emboss/align/ índex . html . 3 Resultados 3.1 Confirmación de las líneas transgénicas potenciales de caña de azúcar La identidad de pihUMPS (como se muestra en el mapa de plásmido de la Figura 1) se confirmó por digestión con enzimas de restricción usando Kpnl y Xbal y la resolución de los productos restringidos mediante electroforesis en gel de agarosa. La digestión con Kpnl produjo los fragmentos esperados de 4858 bp y 1816 bp, mientras que la digestión doble con Kpnl y Xbal produjo los fragmentos esperados de 4838 bp y 908 bp (Figura 2) .

Para seleccionar los clones positivamente transformados, los transformantes se verificaron para la presencia del vector de silenciamiento por medio del PCR (Figura 3) . El ADN de los internodales maduros (8-10) se extrajo. Para cada transformación siete (7) plantas independientes regeneradas que fueron resistentes a la geneticina se transfirieron al suelo y se aclimataron bajo condiciones estándares. Se seleccionaron cinco líneas para el análisis posterior basado en el nivel de actividad de UMPS y la disponibilidad de regeneración de la planta. 3.2 Caracterización de la expresión génica 3.2.1 Análisis semi - cuantitativo de la expresión génica de UMP sintasa (UMPS) y nucleósido difosfato fosfatasa (NDPasa) endógenas usando RT-PCR Se esperaba que los efectos posteriores del silenciamiento de UMPS incluyeran un bajo nivel de transcripción de UMPS y una regulación ascendente de la vía de salvamento en comparación con la de la línea tipo salvaje sin transformar. La RT-PCR semi-cuantitativa se usó, por lo tanto, para determinar si la regulación descendente de la transcripción de UMPS resultó en la regulación ascendente de los transcritos que codifican las enzimas de salvamento, tales como NDPasa. Se observó que la expresión de UMPS era menor en tej idos de internodales maduros de caña de azúcar transgénica que la observada en la línea tipo salvaje sin transformar (Figura 4A) , mientras que se observó que la expresión de NDPasa era mayor (Figura 4B) . La expresión del gen de limpieza a-actina fue similar en las líneas transgénicas de caña de azúcar y en la línea tipo salvaje sin transformar, confirmando que cantidades similares de ADNc molde se incluyeron en las reacciones de RT-PCR. 3.3 Caracterización de la actividad enzimática 3.3.1 Actividad enzimática de UMPS sintasa, UK, y UPRTasa Tanto las células en suspensión como el tejido internodales obtenidos a partir de las cinco líneas transgénicas de caña de azúcar demostraron una actividad de UMPS significativamente menor que las células en suspensión y tejido internodales obtenidos de la caña de azúcar de tipo salvaje (Figura 5) , lo que demuestra el éxito del enfoque basado en el ARNi de la expresión de UMPS. En contraste, se encontró que la actividad enzimática de la enzima UK de la vía de salvamento era significativamente menor en las células en suspensión y tejido internodales obtenidos a partir de las cinco líneas transgénicas de caña de azúcar que la obtenida a partir de la línea de caña de azúcar de tipo salvaje (Figura 6) , lo que demuestra una regulación ascendente de la vía de salvamento de la pirimidina. La actividad UPRTasa de las células en suspensión y el tejido internodales obtenidos a partir de las cinco líneas transgénicas de caña de azúcar fue generalmente menor que la obtenida de la caña de azúcar de tipo salvaje, con células en suspensión de líneas transgénicas de caña de azúcar 3.1, 3.2, 3.3, y 4.2 que muestran una actividad UPRTasa significativamente menor (Figura 7) . 3.3.2 Actividad enzimática de la sacarosa sintasa (SuSy) Los extractos crudos de proteínas desalinizadas de células en suspensión y internodales 8-10 obtenidos a partir de líneas celulares transgénicas se analizaron para determinar la actividad SuSy. Se observó que la actividad SuSy analizada en la dirección de la descomposición se incrementó generalmente en las células en suspensión obtenidas a partir de líneas transgénicas de caña de azúcar 3.1, 3.2, y 3.3 y disminuyó generalmente en las líneas transgénicas de caña de azúcar 2.2, y 4.2 (Figura 8). Se observó que la actividad SuSy analizada en la dirección de la síntesis se incrementó generalmente en células en suspensión obtenidas a partir de líneas transgénicas de caña de azúcar 3.1 y 3.3 y disminuyó generalmente en líneas transgénicas de caña de azúcar 2.2, 3.2, y 4.2 (Figura 8).

Sin embargo, se observó que la actividad SuSy analizada en las direcciones de descomposición y de síntesis disminuía significativamente en el tejido internodales obtenido de toda la caña de azúcar transgénica (Figura 9) .

La actividad SuSy de las células en suspensión y el tejido internodales de las líneas transgénicas de la caña de azúcar se evaluó bajo condiciones máximas (Vmáx) y limitativas ( iim) y se comparó con la de la línea de tipo salvaje sin transformar. La Vm¾x de SuSy de las células en suspensión de las líneas transgénicas de caña de azúcar 3.1 y 3.2 fue significativamente mayor que la de la línea de tipo salvaje sin transformar (Tabla 1) . Además, tanto la Vmax como la Viim de todas las líneas celulares transgénicas fueron significativamente mayor que la observada para la línea de tipo salva e sin transformar (Tabla 1) .

Tabla 1 Actividad de la sacarosa sintasa (SuSy) en las células en suspensión y internodales obtenidos a partir de líneas celulares transgénicas de caña de azúcar bajo condiciones máximas (Vmáx) y limitativas (Vlim) . La actividad se expresa en mol/min/mg de proteína de la desviación estándar de las medias, n = 3. 3.3.3 Actividad enzimática de AGPasa y UGPasa Las células en suspensión obtenidas a partir de las líneas transgénicas de caña de azúcar 2.2 y 3.1 demostraron una actividad AGPasa significativamente menor que las células en suspensión obtenidas de la caña de azúcar de tipo salvaje, mientras que el tejido internodales obtenido de líneas transgénicas de caña de azúcar 3.1, 3.2 y 4.2 demostraron una actividad AGPasa significativamente menor (Figura 10) .

Las células en suspensión obtenidas a partir de las líneas transgénicas de caña de azúcar 2.2, 3.2 y 3.3 demostraron significativamente más actividad UGPasa que las células en suspensión obtenidas de la caña de azúcar de tipo salvaje, mientras que el te ido internodales obtenido de líneas transgénicas de caña de azúcar 3.1, 3.2, 3.3, y 4.2 demostraron una actividad UGPasa significativamente menor (Figura 11) . 3.3.4 Acumulación de sacarosa, hexosa y almidón en líneas transgénicas de caña de azúcar El efecto del enfoque basado en el ARNi de la expresión de UMPS se evaluó en la acumulación de sacarosa, glucosa, fructosa y almidón en la caña de azúcar transgénica, metabolitos. Se observó que el contenido de sacarosa de todas las líneas transgénicas de caña de azúcar era significativamente mayor que el observado en la línea de tipo salvaje sin transformar tanto en las células en suspensión como el tejido internodales (Figura 12), y el contenido de almidón aumentó significativamente en las células en suspensión de todas las líneas transgénicas de caña de azúcar (Figura 13) . Se observó, además, que el contenido de almidón en el tejido internodales obtenido a partir de las líneas transgénicas de caña de azúcar 3.2 y 4.2 era significativamente mayor que en la línea de tipo salvaje sin transformar (Figura 13) .

Además, se evaluó el contenido de glucosa y fructosa de las líneas transgénicas de caña de azúcar y se observó que el contenido de glucosa era significativamente aumentado en las células en suspensión de los clones de 2.2 y 3.1, y en el tejido internodales del clon 3.2 (Figura 14). Sin embargo, se observó que el contenido de fructosa no era significativamente diferente entre las líneas transgénicas de caña de azúcar y la línea de tipo salvaje sin transformar (Figura 15) . 3.3.5 Análisis de los metabolitos usando la correlación lineal Los contenidos de sacarosa y almidón se trazaron contra a los principales metabolitos para determinar una posible relación en las células en suspensión como en los internodales. En las células en suspensión, UDP-glucosa, fosfatos de hexosa y uridinilatos totales (UDP y UDP-glucosa) se correlacionaron positivamente con el aumento del contenido de sacarosa en todas las líneas transgénicas con la correlación positiva más fuerte (R2 = 0.68) observada entre la sacarosa y el fosfato de hexosa y los uridinilatos totales (Figura 16B y 16D, respectivamente) . No se observó correlación significativa entre la sacarosa y hexosas, sin embargo, los cambios en el contenido de almidón se correlacionaron positivamente con el aumento del fosfato de hexosa y el total de nucleótidos de adenina (Figura 16E y 16F) .

En los internodales, se observó una correlación positiva significativa en todas las líneas transgénicas entre sacarosa y uridinilatos totales y fosfatos de hexosa (Figura 17A y 17B, respectivamente) . La sacarosa y la hexosa y la UDP-glucosa, así como el almidón y los fosfatos de hexosa y los adenilatos totales demostraron, por otro lado, correlaciones muy débiles en todas las plantas (Figuras 17A-17F) . 3.3.6 Análisis de metabolitos y enzimas claves usando la correlación lineal Los uridinilatos totales y la sacarosa se trazaron contra las actividades de las enzimas claves para determinar una posible relación, en las células en suspensión y en los internodales maduros. En las células en suspensión, se observó una correlación positiva significativa entre el contenido de sacarosa y las actividades de la sacarosa fosfato sintasa y de uridina cinasa (Figura 18A y 18B, respectivamente) . Sin embargo, el aumento del contenido de sacarosa se correlacionó negativamente con los cambios en la actividad de la UMP sintasa en todas las líneas transgénicas (Figura 18 C; P = 0.665).

En los internodales, se observó un patrón similar; una regulación ascendente de la actividad de la sacarosa fosfato sintasa positivamente correlacionada con los cambios en la acumulación de sacarosa, y una disminución en la actividad de la UMP sintasa negativamente correlacionada con los cambios en el contenido de sacarosa (Figura 19A y 19B, P = 0.656 y P = 0.784, respectivamente). En contraste, un aumento en la actividad de la cinasa uridina no mostró una correlación significativa con los cambios en el contenido de sacarosa; sin embargo, los cambios en la uridina cinasa se correlacionaron positivamente con un aumento en los uridinilatos totales (Figura 19C y 19D, respectivamente) . 3.3.5 Análisis bioinformático de UMPS de caña de azúcar La búsqueda BLAST de secuencias de ADN que muestran alta similitud a la secuencia de ADN de UMPS de caña de azúcar (TC68130) reveló el ADN que codifica las enzimas UMPS de otras plantas que almacenan azúcar, tal como el sorgo dulce (Figuras 16A-16F) . La secuencia de ADN del sorgo dulce (XM_002456891.1) se alineó con la de caña de azúcar y mostraron una alta similitud (85.5%) (Figuras 17A-17F) . 4. Discusión En el trabajo mostrado en este documento, se usó la tecnología del intrón-empalmado en el vector ARN horquilla para construir un vector de ARNi para la transformación de callos embrionarios de caña de azúcar. Se generaron cinco líneas transformadas con el vector ihpARN (pihUMPS) . Para evaluar el efecto de UMP sintasa reprimida, se determinaron los niveles de las actividades de las enzimas y metabolitos de las vías que circundan los principales carbohidratos, almidón y sacarosa. Los análisis de PCR y RT-PCR confirmaron la integración de la construcción en las líneas transgénicas de caña de azúcar, e indicaron que las líneas transformadas tenían disminución del nivel del transcrito de UMP sintasa, respectivamente. Los ensayos de proteínas mostraron una represión de hasta 62% de la actividad de la UMP sintasa, que se correlacionó bien con el nivel del transcrito encontrado en todas las líneas transgénicas en comparación con el control de tipo salvaje sin transformar.

Los datos demostraron que la represión de la actividad de UMP sintasa en plantas transgénicas de caña de azúcar condujeron a una regulación ascendente significativa de una de las enzimas de salvamento de la pirimidina (UK) , aumentos en sacarosa, UDP-glucosa, almidón,, y en la concentración de las mezclas fosfato de hexosa, así como SPS, la principal enzima responsable de la síntesis de sacarosa. El trabajo descrito ilustra un método para obtener un cultivo de caña de azúcar con un contenido superior de sacarosa y almidón.

Aquellos con experiencia en la materia apreciarán, sin embargo, que el método descrito en la presente invención puede exhibir otras características además de la modificación del contenido de carbohidrato de una planta; se apreciará, además, que pueden introducirse modificaciones al método sin apartarse del alcance de la invención. 5. REFERENCIAS Ashihara, H., Stasolla, C, Loukanina, N . , y Thorpe, T.A (2000) . Purine and pyrimidine metabolism in cultured white spruce (Picea glauca) cells: Metabolic fate of 14C-labeled precursors and activity of key enzymes. Physiol. Plant . 108, 25-33.

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Tabe I, Higgins TJV (1998) Engineering plant protein composition for improved nutrition. Trend in Plant Science 3, 282-286 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVI DICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para aumentar el contenido de al menos un carbohidrato en una o más células vegetales, caracterizado porque incluye inhibir la actividad UMP sintasa (UMPS) en una o más células vegetales.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la etapa de insertar en una o más células vegetales al menos un cásete de silenciamiento de genes para disminuir la actividad UMP sintasa .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno o más casetes de silenciamiento de genes se insertan en una población de células.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se regenera una planta transgénica a partir de una o más células vegetales.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además producir tejido con un contenido aumentado de al menos un carbohidrato a partir de la una o más células vegetales.

6. Un método para aumentar el contenido de al menos un carbohidrato en un tejido vegetal, caracterizado porque comprende producir una o más células vegetales de conformidad con el método de la reivindicación 1.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque se regeneran una o más plantas transgénicas a partir de la célula vegetal.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el tejido vegetal es un callo.

9. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque se inserta uno o más casetes de silenciamiento de genes en una o más células vegetales, en donde uno o más casetes incluyen ácido nucleico operativamente unido a uno o más elementos de transcripción para transcribir el ácido nucleico en una o más células vegetales, en donde la transcripción del ácido nucleico disminuye la actividad de UMP sintasa.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que incluye: (i) la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . 1), o parte de ésta (por ejemplo al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200 , 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de la secuencia) , (ü) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident . 1), o a parte de ésta, (iii) la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2), o parte de ésta, (iv) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 2) , o a parte de ésta, (v) (a) (i) o (ii) como anteriormente, y (b) (iii) o (iv) como anteriormente, opcionalmente con una secuencia intrón empalmable entre (a) y (b) , y en donde la secuencia intrón empalmable es de preferencia al menos 70 ó 74 bp de longitud, de preferencia al menos 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 450 bp, o 500 bp de longitud, y con mayor preferencia al menos 74 bp de longitud.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la UMPS corresponde al ORF de UMPS de la célula vegetal transformada.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se insertan dos o más casetes de silenciamiento de genes en una o más células vegetales.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque uno o más elementos de transcripción incluyen un promotor.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el promotor es un promotor de monocotiledóneas .

15. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque al menos un carbohidrato se selecciona del grupo que incluye sacarosa, almidón, glucosa, y fructosa.

16. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que incluye la caña de azúcar, sorgo dulce y remolacha azucarera.

17. Un vector caracterizado porque comprende uno o más casetes de silenciamiento de genes para disminuir la actividad UMPS en una célula vegetal, la disminución en la actividad UMPS resulta en un aumento del contenido de al menos un carbohidrato en la célula vegetal .

18. El vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el vector es un vector de AR i .

19. El vector de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque el uno o más casetes de silenciamiento de genes incluyen · ácido nucleico operativamente unido a uno o más elementos de transcripción para transcribir el ácido nucleico en donde la transcripción del ácido nucleico disminuye la actividad de la UMP sintasa.

20. El vector de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que incluye: (i) la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . 1), o parte de ésta (por ejemplo al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200 , 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de la secuencia) , (ii) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 1) , o a parte de ésta, (iii) la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2) , o parte de ésta, (iv) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 2) , o a parte de ésta, (v) (a) (i) o (ii) como anteriormente, y (b) (iii) o (iv) como anteriormente, opcionalmente con una secuencia intrón empalmable entre (a) y (b) , y en donde la secuencia intrón empalmable es de preferencia al menos 70 ó 74 bp de longitud, de preferencia al menos 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 450 bp, o 500 bp de longitud, y con mayor preferencia al menos 74 bp de longitud.

21. El vector de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque el uno o más elementos de transcripción incluyen un promotor.

22. El vector de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el promotor es un promotor de monocotiledóneas .

23. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, caracterizado porque al menos un carbohidrato se selecciona del grupo que incluye sacarosa, almidón, glucosa, y fructosa.

24. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que incluye la caña de azúcar, sorgo dulce y remolacha azucarera.

25. Una célula vegetal transformada, caracterizada porque incluye un vector que comprende uno o más casetes de silenciamiento de genes para disminuir la actividad de la UMPS en una célula vegetal, la disminución de la actividad UMPS resulta en un aumento del contenido de al menos un carbohidrato en la célula vegetal .

26. La célula vegetal transformada de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el vector es un vector de AR i .

27. La célula vegetal transformada de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizada porque uno o más casetes de silenciamiento de genes incluyen ácido nucleico operativamente unido a uno o más elementos de transcripción para transcribir el ácido nucleico en donde la transcripción del ácido nucleico disminuye la actividad de la UMP sintasa.

28. La célula vegetal transformada de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que incluye : (i) la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident. 1), o parte de ésta (por ejemplo al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200 , 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de la secuencia) , (ii) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 1) , o a parte de ésta, (iii) la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núra. de ident. 2), o parte de ésta, (iv) una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec . con núm. de ident. 2) , o a parte de ésta, (v) (a) (i) o (ii) como anteriormente, y (b) (iii) o (iv) como anteriormente, opcionalmente con una secuencia intrón- empalmable entre (a) y (b) , y en donde la secuencia intrón empalmable es de preferencia al menos 70 ó 74 bp de longitud, de preferencia al menos 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 450 bp, o 500 bp de longitud, y con mayor preferencia al menos 74 bp de longitud.

29. La célula vegetal transformada de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizada porque uno o más elementos de transcripción incluyen un promotor.

30. La célula vegetal transformada de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque promoter es un promotor de monocotiledóneas .

31. La célula vegetal transformada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizada porque al menos un carbohidrato se selecciona del grupo que incluye sacarosa, almidón, glucosa, y fructosa.

32. La célula vegetal transformada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que incluye la caña de azúcar, sorgo dulce y remolacha azucarera.

33. Una planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal, caracterizados porque contiene o se derivan de una célula vegetal transformada que incluye un vector que comprende uno o más casetes de silenciamiento de genes para disminuir la actividad U PS en una célula vegetal, la disminución de la actividad UMPS resulta en un aumento del contenido de al menos un carbohidrato en la célula vegetal.

34. La planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 33, caracterizados porque el vector es un vector ARNi.

35. La planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 33 o 34, caracterizados porque uno o más casetes de silenciamiento de genes incluyen ácido nucleico operativamente unido a uno o más elementos de transcripción para transcribir el ácido nucleico en donde la transcripción del ácido nucleico disminuye la actividad de la UMP sintasa.

36. La planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 35, caracterizados porque el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que incluye: (i) la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . 1), o parte de ésta (por ejemplo al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos de la secuencia) , una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia antisentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec . con núm. de ident. 1) , o a parte de ésta, la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. 2) , o parte de ésta, una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% similar, a la secuencia sentido de un ORF de UMPS (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 2) , o a parte de ésta, (a) (i) o (ii) como anteriormente, y (b) (iii) o (iv) como anteriormente, opcionalmente con una secuencia intrón empalmable entre (a) y (b) , y en donde la secuencia intrón empalmable es de preferencia al menos 70 ó 74 bp de longitud, de preferencia al menos 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 450 bp, o 500 bp de longitud, y con mayor preferencia al menos 74 bp de longitud.

La planta transgénica, parte de la planta o tejido de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizados porque el uno o más elementos de transcripción incluyen un promotor.

38. La planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 37, caracterizados porque el promotor es un promotor de monocotiledóneas .

39. La planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38, caracterizados porque al menos un carbohidrato se selecciona del grupo que incluye sacarosa, almidón, glucosa, y fructosa.

40. La planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39, caracterizados porque la planta se selecciona del grupo que incluye la caña de azúcar, sorgo dulce y remolacha azucarera .

41. La planta transgénica, parte de la planta o tejido vegetal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 40, caracterizados porque la parte de la planta transgénica es un callo.