MX2012002117A

MX2012002117A - Eficiencia mejorada para la generacion de celulas madre pluripotentes inducidas a partir de las celulas somaticas humanas.

Info

Publication number: MX2012002117A
Application number: MX2012002117A
Authority: MX
Inventors: Renne A Reijo Pera; James Byrne
Original assignee: Univ Leland Stanford Junior
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2010-08-18
Publication date: 2012-06-01
Also published as: US8883430B2; JP2013502220A; EP2467469A1; US20120220030A1; CA2771303A1; WO2011022507A1; EP2467469A4; IL218111A0

Abstract

Se proporciona una población sustancialmente pura de células somáticas humanas que tienen un potencial mejorado que llegarán a inducir las células madre pluripotentes (células ¡PS). También se proporcionan los métodos para la generación de esta población de células y los métodos para la generación de las células ¡PS a partir de esta población de células.

Description

EFICIENCIA MEJORADA PARA LA GENERACION DE CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS A PARTIR DE LAS CELULAS SOMATICAS HUMANAS Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada Conforme al 35 U.S.C. § 119 (e), esta solicitud reivindica la prioridad en la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Norteamericana Provisional Serie No. 61/276,112 presentada el 21 de agosto de 2009, cuya descripción está incorporada en la presente por referencia.

Campo de la Invención Las células somáticas humanas se seleccionan para uno o más marcadores asociados con la pluripotencia, para proporcionar una población purificada de células que tienen un potencial mejorado para llegar a ser células madre pluripotentes inducidas (iPS, por sus siglas en inglés).

Antecedentes de la Invención La generación de células madre pluripotentes que son genéticamente idénticas a un individuo proporcionan oportunidades únicas para la investigación básica y para las terapias basadas en células nuevas compatibles inmunológicamente potenciales (Byrne JA. (2008) Human Mol humano. Gen. 17:R37-41). Los métodos para reprogramar las células somáticas del primate a un estado pluripotente incluyen la transferencia nuclear de la célula somática (Stojkovic M, y colaboradores (2005) Reprod Biomed Online 11:226-231; Byrne JA, y colaboradores (2007) Nature 450:497-502), fusión de la célula somática con células madre pluripotentes (Cowan CA, y colaboradores (2005) Science 309:1369-1373) y la reprogramación directa para producir células madre pluripotentes (células iPS, por sus siglas en inglés) (Takahashi K, y colaboradores (2007) Cell 131:861-872; Park IH, y colaboradores (2008) Nature 451:141-146; Yu J, y colaboradores (2007) Science 318:1917-1920; Kim D, y colaboradores (2009) Cell Stem Cell 4:472-476; Soldner F, y colaboradores (2009) Cell. 136:964-977; Huangfu D, y colaboradores (2008) Nature Biotechnology 26:1269-1275; Li W, y colaboradores (2009) Cell Stem Cell 4:16-19). Estas metodologías, sin embargo, se caracterizan por una eficacia en la reprogramación baja y una carencia del conocimiento con respecto a los mecanismos subyacentes. Mientras que se ha demostrado previamente que más células diferenciadas demuestran una eficacia de reprogramación más baja (Gurdon JB y Byrne JA. (2003) Proc Nati Acad Sci USA 100:8048) y diferentes tipos de célula somática poseen una capacidad de reprogramación diferencial (Aoi T, y colaboradores (2008) Science 321:699-702; Aasen T, y colaboradores (2008) Nature Biotechnology 2008;26(11 ): 1276-1284) la técnica no ha identificado una subpoblación de células dentro de un tipo de célula somática que posea un potencial de reprogramación diferencial.

El aislamiento de una subpoblación o subpoblaciones de células dentro de una población de células somáticas que poseen un potencial de reprogramación diferencial proporcionaría un método para aumentar significativamente la eficacia de la reprogramación, de tal modo que mejora la viabilidad de las aplicaciones potenciales basadas en esta tecnología (Byrne JA. (2008) Human Mol. Gen. 17:R37-41). El aislamiento de tales subpoblaciones también proporcionaría una herramienta para que los estudios de investigación básica entiendan los mecanismos de reprogramación subyacente.

Breve Descripción de la Invención Se proporciona una población sustancialmente pura de células somáticas humanas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células madre pluripotentes inducidas (iPs, por sus siglas en inglés), (células iPS). También se proporcionan los métodos para enriquecer una población de células somáticas humanas que tienen un potencial mejorado para llegar a ser células madre pluripotentes inducidas (iPS, por sus siglas en inglés) (células iPS), para generar células iPS utilizando esta población de células, y para usar las células iPS generadas por este método.

En algunos aspectos de la invención, se proporciona una composición sustancialmente pura de células somáticas que tienen un potencial mejorado para llegar a ser células iPS. Las células somáticas con potencial mejorado llegan a ser expresiones de células iPS de uno o más marcadores asociados con la pluripotencia, y que tienen una eficacia creciente de reprogramación con relación a las células somáticas que no expresan el marcador de pluripotencia. En algunas modalidades de la invención, el marcador de pluripotencia es un Antígeno Embrionario Específico de Etapa 3 (SSEA3, por sus siglas en inglés). Las poblaciones de interés incluyen cultivos primarios de células somáticas, es decir células de paso temprano (pasos <10) derivados directamente de tejidos somáticos humanos. En algunas modalidades, las células somáticas son células fibroblasto primarias, que incluyen, sin limitación, fibroblastos dérmicos. En algunas modalidades, la eficacia creciente es por lo menos aproximadamente doble o más alta.

En algunos aspectos de la invención, los métodos se proporcionan para enriquecer o seleccionar la población de células somáticas humanas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células madre pluripotentes inducidas (iPS, por sus siglas en inglés), (células iPS). En estos métodos, una población de células somáticas se pone en contacto con un reactivo que reconoce específicamente un marcador asociado con la pluripotencia, y se seleccionan las células que expresan el marcador de pluripotencia. En algunas modalidades, el marcador de pluripotencia es SSEA3. En algunas modalidades, la población inicial de las células somáticas que se ha contactado es la población de fibroblastos humanos. En algunas de estas modalidades, los fibroblastos humanos son fibroblastos dérmicos. En algunas modalidades, la población inicial de células somáticas es un cultivo primario.

En algunos aspectos de la invención, los métodos se proporcionan para generar células iPS de las células somáticas. En estos métodos, una población inicial de células somáticas se pone en contacto con un reactivo que reconoce específicamente un marcador asociado con la pluripotencia, las células que expresan el marcador de pluripotencia se seleccionan, y las células seleccionadas se ponen en contacto con los factores de reprogramación. En algunas modalidades, el marcador de pluripotencia es SSEA3. En algunas modalidades, la población inicial de las células somáticas que se pone en contacto es la población de fibroblastos humanos. En algunas modalidades, los fibroblastos humanos son fibroblastos dérmicos. En algunas modalidades, la población inicial de células somáticas es un cultivo primario. En algunas modalidades, los factores de reprogramación se proporcionan como partículas virales. En algunas modalidades, ios factores de reprogramación se proporcionan como polipéptidos sin integración, de accionamiento nuclear. En algunas modalidades, los factores de reprogramación incluyen uno o más de los siguientes factores: OCT4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, y Lin28. En algunas modalidades, los factores de reprogramación comprenden OCT4, SOX2, KLF4 y cMyc. Éstos y otros objetivos, ventajas, y características de la invención llegarán a ser evidentes a los expertos en la técnica con respecto a la lectura de los detalles de los métodos y composiciones objetivos más completamente descritos más abajo.

Breve Descripción de los Dibujos La invención se entiende mejor de la siguiente descripción detallada cuando se lee en conjunto con los dibujos anexos. El archivo de la solicitud o patente contiene por lo menos un dibujo ejecutado en color. Las copias de esta solicitud de publicación de patente o patente con los dibujos de color serán proporcionadas por la Oficina a petición y pago de los honorarios necesarios. Se acentúa que, de acuerdo con la práctica común, varias características de los dibujos no son a escala. Por el contrario, las dimensiones de varias características se amplían o se reducen arbitrariamente para mayor claridad. Se incluyen en los dibujos las siguientes figuras.

Figura 1. Expresión de SSEA3 a partir de fibroblastos dérmicos humanos primarios. (A-B) Línea de fibroblasto humano adulto primario HUF1: (A) Imagen de contraste de fase, y (B) Detección inmunocitoquímica de la expresión SSEA3 (verde). Tinción de ¡nmunofluorescencia (C-D) para (C) TRA-1-60 y (D) TRA-1-81 en células HUF1. (E) Recubrimiento de la expresión SSEA3 en la imagen de contraste de fase de las células HUF1. (F) Sección confocal a través la detección primaria de SSEA3/488 que demuestra la célula fibroblasto humana primaria (HUF1) a partir de la membrana celular en adición a la detección perinuclear localizada. (G) Detección de SSEA3/488 en las células madre embríonicas humanas H9. (H) Tinción de control negativo únicamente del anticuerpo secundario 488 de las células HUF1. (C-H) Tinción de DAPI para etiquetar la célula nucleica en azul. Barras a escala que representan 100 micrones.

Figura 2. Análisis y aislamiento de FACS de fibroblastos humanos adultos primarios positivos a SSEA3. (A) análisis inmunocitoquímico para la expresión SSEA3 en ocho líneas de fibroblasto dérmico humano adulto primario adicionales. (B) Histograma de las células HUF1 analizadas por FACS después del enlace vivo del complejo del anticuerpo SSEA3/488. (C) Detección de la señal de fluorescencia de SEA3/488 en FACS clasificada en poblaciones negativas a SSEA3/488 y positivas a SSEA3 después de la adherencia durante la noche. Tinción de SEA3 en verde. Tinción de DAPI en azul. Las barras a escala representan 100 micrones.

Figura 3. Caracterización de las células madre pluripotentes inducidas derivadas HUF1 (control HiPS-1). (A) Expresión de los marcadores de pluripotencia de las células iPS (control HiPSC-1) generada después de la transducción retroviral de las células HUF1 no clasificadas. Tinción de DAPI para etiquetar la célula nucleica en azul. Barra a escala que representa 100 micrones. (B) Análisis del cariotipo SKY de la línea de control HiPS-1. (C) Análisis histológico del teratoma de la línea de control HiPS-1.

Figura 4. Morfología de las colonias y líneas después de la transducción retroviral de las células HUF1. (A) Antecedentes de colonia grande sin atributos tipo ESC. (B) Colonia iPSC tipo ESC. (C) Morfología de las líneas seleccionadas SSEA3 después de la derivación. (A-C) Barra a escala que representa 100 micrones.

Figura 5. Expresión del marcador de pluripotencia y cariotipo de las líneas HiPSC seleccionadas de SSEA3. (A) Expresión de los marcadores de pluripotencia en H9 ESCs y líneas HiPSC seleccionadas de SSEA3. Tinción de fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) en rojo oscuro/púrpura. Imágenes manchadas de DAPI se insertan en azul. Barra a escala que representa 100 micrones. (B) Cariotipo espectral (SKY, por sus siglas en inglés) de la línea iPSC seleccionada de SSEA3 (HÍPS-2C). (C) Análisis histológico del teratoma de la línea iPSC seleccionada de SSEA3 (HÍPSC-2C).

Figura 6. Análisis transcripcional de subpoblaciones fibroblasto dérmicas primarias con la expresión SSEA3 diferencial. Expresión relativa de Nanog, Sall4, hTerc y Gapdh a partir de tres subpoblaciones de las células HUF1: Células negativas SSEA3 (que representan el 10% inferior para la expresión/detección SSEA3), células intermediarias SSEA3 (que representan el 80% del intermediario de las células entre la parte superior y parte inferior, 10% para la expresión/detección) y células positivas a SSEA3 (que representan el 10% superior para la expresión/detección de SSEA3). Tres réplicas biológicas se analizaron para cada muestra. El valor relativo de la expresión del gen representa el nivel de expresión del gen para cada muestra comparada al promedio total para ese gen a través de las tres subpoblaciones.

Figura 7. Expresión de SSEA3 en biopsia de piel dérmica humana adulta. Una subpoblación de células se detectó dentro de una estructura en la dermis papilar de la piel dérmica humana adulta que demostró fluorescencia significativa después de la exposición al anticuerpo primario anti-SSEA3 de rata y al anticuerpo secundario 488 de cabra anti-rata. No se detectó ninguna fluorescencia significativa de las estructuras similares expuestas únicamente al anticuerpo secundario de cabra anti-rata (el control de isotipo). La expresión SSEA3 está en verde y DAPI en blanco. La barra a escala representa 100 micrones.

Descripción Detallada de la Invención Ante las composiciones y métodos presentes que se describen, deberá entenderse que esta invención no está limitada a las composiciones particulares y métodos descritos, ya que, por supuesto, pueden variar. Deberá también entenderse que la terminología utilizada en la presente es con el fin de describir modalidades particulares únicamente, y no se desea limitar, ya que el alcance de la presente invención será limitada únicamente a las reivindicaciones anexas.

Donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, al décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se describen específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor intermedio o indicado en ese intervalo indicado se comprende dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden independientemente incluirse o excluirse en el intervalo, y cada intervalo donde, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos más pequeños también se comprenden dentro de la invención, conforme a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Donde el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos excepto cualquiera o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según lo entendido comúnmente por un experto en la técnica al cual esta invención pertenece. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente puedan utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, algunos métodos y materiales potenciales y preferidos ahora se describen. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan en la presente por referencia para describir y mencionar los métodos y/o materiales con respecto a los cuales se citan las publicaciones. Se entiende que la presente invención reemplaza cualquier descripción de una publicación incorporada al grado de existir una contradicción.

Deberá observarse que según lo utilizado en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno", y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia "a un polipéptido de factor de reprogramación" incluye una pluralidad de tales polipéptidos, y la referencia a "las células madre pluripotentes inducidas" incluye la referencia a una o más células madre pluripotentes inducidas y equivalentes de las mismas conocidas a los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Las publicaciones discutidas en la presente se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente deberá interpretarse como una admisión que la presente invención no confiera el derecho a preceder tal publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de la publicación proporcionadas pueden ser diferentes a partir de las fechas de publicación actuales que pueden necesitar confirmarse independientemente. DEFINICIONES Se proporciona una población sustancialmente pura de células somáticas humanas que tienen un potencial mejorado para llegar a ser células madre pluripotentes inducidas (¡Ps), (iPSCs, por sus siglas en inglés). También se proporcionan métodos para enriquecer una población de células somáticas humanas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células madre pluripotentes inducidas (iPS, por sus siglas en inglés) (células iPS), y métodos para generar células iPS de esta población de células, la cuales después pueden utilizarse para el trasplante, investigación del fármaco, modelos experimentales de diferenciación e interacción celulares; para ensayos de investigación in vitro para definir factores de crecimiento y diferenciación, para caracterizar genes implicados en el desarrollo y regulación de la célula, y similares. Estas células pueden utilizarse directamente para estos propósitos, o pueden modificarse genéticamente para proporcionar capacidades alteradas. Éstos y otros objetivos, ventajas, y características de la invención llegarán a ser evidentes a los expertos en la técnica a la lectura de los detalles de los métodos y composiciones objetivos como se describe completamente más abajo.

Los términos "célula somática diferenciada" o simplemente "célula somática" comprenden cualquier célula en o de un organismo que no puede constituir todos los tipos de células en un organismo. Es decir, las células somáticas son las células que se han distinguido suficientemente de las que no generarán naturalmente células de las tres capas germinales corporales, es decir, ectodermo, mesodermo y endodermo. Por ejemplo, las células somáticas incluirían progenitores neurales y de neuronas, este último el cual puede ser capaz de constituirse naturalmente para todos o algunos tipos de célula del sistema nervioso central pero no pueden constituirse para las células de los linajes mesodermo o endodermo.

Los términos "células primarias", "líneas celulares primarias", y "cultivos primarios" se utilizan alternativamente en la presente para referirse a las células y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y se dejaron crecer in vitro por un número limitado de pasos, es decir, divisiones del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son los cultivos que pueden haber pasado 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, ó 15 veces, pero no pasaron suficientes veces a través de la etapa de crisis. Normalmente, las líneas celulares primarias de la presente invención se mantienen por menos de 10 pasos in vitro.

Por "pluripotencia" significa la capacidad de las células para diferenciar todos los tipos de células en un organismo. Por "células madre pluripotentes", esto significa que las células que pueden a) auto-renovarse y b) diferenciarse para producir todos los tipos de células en un organismo. El término "célula madre pluripotente inducida" comprende las células madre pluripotentes, que, igual que las células madre embrionarias (ES, por sus siglas en inglés), pueden cultivarse durante un largo periodo de tiempo mientras que mantienen la capacidad de diferenciarse en todos los tipos de células en un organismo, pero que, diferente de las células ES (que se derivan de la masa celular interna de los blastocitos), se derivan de las células somáticas, es decir, las células que tienen un potencial más estrecho, definido y que en ausencia de manipulación experimental no podrían originar todos los tipos de células en el organismo. Las células iPS tienen una morfología tipo hESC, que crece como colonias planas con relaciones nucleo-citoplasmáticas grandes, fronteras definidas y núcleos prominentes. En adición, las células iPS expresan uno o más marcadores esenciales pluripotenciales conocidos por un experto en la técnica, que incluyen pero no se limitan a la Fosfatasa Alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, y Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT, y zfp42. En adición, las células iPS son capaces de formar teratomas. Además, son capaces de formar o contribuir a los tejidos ectodermos, mesodermos, o endodermos en un organismo vivo.

Por "tener el potencial para llegar a ser células iPS", esto significa que las células somáticas pueden inducirse para llegar a ser, es decir, que pueden reprogramarse para llegar a ser, células iPS. En otras palabras, la célula somática puede inducirse para re-diferenciar para establecer células que tienen características morfológicas, capacidad de crecimiento y pluripotencia de células pluripotentes.

El término "eficacia de reprogramación" se utiliza para referirse a la capacidad de un cultivo celular primario para constituir colonias de la célula iPS cuando se pone en contacto con los factores de reprogramación. Por "eficacia mejorada de reprogramación", esto significa que las células demostrarán una capacidad mejorada que constituye a las células iPS cuando se ponen en contacto con los factores de reprogramación para un control.

Según lo utilizado en la presente, los "factores de reprogramación" se refieren a uno o más, es decir un coctel, de factores biológicamente activos que actúan en una célula para alterar la transcripción, de tal modo que se reprograma una célula a multipotencia o pluripotencia. Los factores de reprogramación pueden proporcionarse individualmente a las células del sujeto de la invención o como una sola composición, es decir, como una composición premezclada, de los factores de reprogramación. Los factores pueden proporcionarse en la misma relación molar o en relaciones molares diferentes. Los factores pueden proporcionarse una vez o múltiples veces en el curso del cultivo de las células del sujeto de la invención. En algunas modalidades el factor de reprogramación es un factor de transcripción, que incluye sin limitación, oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Nanog; y Lin-28.

Los términos "tratamiento", "tratando", "tratar" y similares se utilizan en la presente para referirse generalmente a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de total o parcialmente prevención de una enfermedad o síntoma del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de estabilización o curación parcial o completa para una enfermedad y/o efecto nocivo atribuible a la enfermedad. El "tratamiento" según lo utilizado en la presente cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevención de la enfermedad o síntoma a partir de que ocurre en un sujeto que puede predisponerse a la enfermedad o síntoma pero que todavía no se ha diagnosticado que lo tiene; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, causando la regresión de la enfermedad o síntoma.

Los términos "individuo", "sujeto", "anfitrión", y "paciente", se utilizan alternativamente en la presente y se refieren a cualquier sujeto mamífero para quien se desee el diagnóstico, tratamiento, o terapia, particularmente humanos.

Se proporciona una composición sustancialmente pura de las células somáticas humanas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células madre pluripotentes inducidas (iPS, por sus siglas en inglés) (iPSCs). Según lo discutido anteriormente, el término "célula somática" comprende cualquier célula en un organismo que no puede constituir todos los tipos de células en un organismo, es decir no es pluripotente. En otras palabras, las células somáticas son células que se han diferenciado suficientemente ya que no generarán naturalmente células de las tres capas germinales corporales, es decir ectodermo, mesodermo y endodermo. Los ejemplos de las células somáticas que pueden comprender la composición sustancialmente pura de la presente solicitud son ésos linajes de cresta neural (por ejemplo melanocitos) , endodérmicos (por ejemplo células pancreáticas, mesodérmicos (por ejemplo, fibroblasto), ectodérmicos (por ejemplo, queratinocitos). Las células somáticas pueden ser, por ejemplo, fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células beta pancreáticas, neuronas, oligodendrocitos, astrocitos, hepatocitos, células madre hepáticas, cardiomiocitos, células musculares esqueléticas, células musculares lisas, células hematopoyéticas, osteoclastos, osteoblastos, pericitos, células endoteliales vasculares, células de Schwann, y similares. Ellas pueden ser células que en ausencia de manipulación experimental no proliferarán, o si lo hacen, podrán únicamente ser capaces de originar más su propia clase, por ejemplo células terminalmente diferenciadas; o pueden diferenciarse al punto de que son capaces de originar células de un linaje específico, por ejemplo células madre multipotentes no pluripotentes adultas, por ejemplo células madre mesenquimales, células madre neurales, células madre cardiacas, células madre hepáticas, y similares. En algunas modalidades, las células tendrán un fenotipo reflexivo de su estado diferenciado por ejemplo, morfología de la célula, marcadores, y/o características funcionales que reflejen el estado diferenciado de las células, como es bien conocido en la técnica. Como un ejemplo no limitante, la célula somática puede ser una célula del linaje del fibroblasto. Las células en este linaje incluyen fibroblastos diferenciados, por ejemplo fibroblastos dérmicos, y menos células progenitoras distinguidas, por ejemplo células madre mesenquimales derivadas del tejido y de la circulación; células de una transición epitelial-mesenquimal, etc., como es bien conocido en la técnica. Los fibroblastos dérmicos pueden expresar el antígeno superficial del fibroblasto y/o vimentina (FSA, por sus siglas en inglés), mientras que los fibroblastos menos diferenciados pueden expresar CD34 y/o proteínas de choque térmico 47 (HSP47, por sus siglas en inglés). Además, los fibroblastos tienen una morfología "fibroblástica" general, que, en general comprende un citoplasma ramificado alrededor de un núcleo manchado elíptico, que tiene uno o dos nucléolos.

En adición para ser células somáticas, las células que tienen potencial mejorado llegan a ser células madre pluripotentes inducidas (iPs, por sus siglas en inglés), (iPScs), expresarán niveles detectables del antígeno embrionario específico de etapa 3 marcador de pluripotencia (SSEA3, por sus siglas en inglés). En otras palabras, las células somáticas son positivas para la expresión de SSEA3, es decir, ellas son células SSEA+. SSEA3, según lo descrito primero por Shevinsky LH, y colaboradores (1982) Cell 3:697-705, es un antígeno superficial de la célula del carbohidrato presente en los glicolípidos y glicopéptidos superficiales de la célula. Los anticuerpos de SSEA3 están comercialmente disponibles, por ejemplo de Millipore, catálogo número mab4303.

Será entendido por los expertos en la técnica que los niveles de expresión indicados reflejan cantidades detectables de la proteína marcadora en la superficie celular. Una célula que es negativa para la tinción (el nivel de enlace de un reactivo específico del marcador no es detectable diferente de un control equivalente al isotipo) puede incluso expresar cantidades menores del marcador. Y mientras que esto es común en la técnica referente a las células "positiva" o "negativa" para un marcador particular, los niveles de expresión actuales son un rasgo cuantitativo. El número de moléculas en la superficie celular puede variar por varios registros, incluso si se caracteriza como "positivo".

La intensidad de tinción de las células puede supervisarse por la citometría de flujo, donde los láseres detectan los niveles cuantitativos de fluorocromo (que es proporcional a la cantidad del marcador de la superficie celular enlazado por reactivos específicos, por ejemplo, anticuerpos). La citometría de flujo, o FACS, también puede utilizarse para separar las poblaciones de la célula basadas en la intensidad de unión a un reactivo específico, así como otros parámetros tales como el tamaño de célula y dispersión de luz. Aunque el nivel absoluto de tinción puede diferenciarse con un fluorocromo particular y preparación del reactivo, los datos pueden normalizarse para un control.

Para normalizar la distribución para un control, cada célula se registra como un punto de datos que tiene una intensidad de tinción particular. Estos puntos de datos pueden exhibirse de acuerdo con una escala de registro, donde la unidad de medición es la intensidad de tinción arbitraria. En un ejemplo, las células manchadas más brillantes en una muestra pueden ser tanto como 4 registros más intensos que las células sin tinción. Cuando se exhibe de este modo, está claro que las células que se ubican en el registro de intensidad de tinción más alta son brillantes, mientras que ésas en la intensidad más baja son negativas. Las células manchadas positivamente "bajas" tienen un nivel de tinción más brillante que el de un control de isotipo apareado, pero no son tan intensas como las células de tinción más brillantes normalmente encontradas en la población. Un control alternativo puede utilizar un sustrato que tiene una densidad definida del marcador en su superficie, por ejemplo un gránulo fabricado o una línea celular, que proporcionan el control positivo para la intensidad.

También se proporcionan los métodos para la separación/enriquecimiento de las células somáticas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células iPS, es decir, células somáticas SSEA3, referidas de aquí en adelante como "las células SSEA3+ del sujeto". La población de células enriquecida será una población sustancialmente pura, donde por "sustancialmente pura" significa que tiene por lo menos aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, o aproximadamente 80% de las células de la población que son del fenotipo seleccionado, más generalmente por lo menos 85% ó 90% de la población es del fenotipo seleccionado, y en ocasiones por lo menos 95% o más de la población son del fenotipo seleccionado, por ejemplo 95%, 98%, y hasta 100% de la población.

En los métodos de la invención, las células somáticas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células ¡PS, es decir células somáticas SSEA3+, se separan de una población inicial de las células somáticas ex vivo o in vitro, es decir fuera del cuerpo del individuo, y algunas veces en cultivo. Esta población inicial de células somáticas, referida de aquí en adelante como "la población inicial del sujeto" frecuentemente es una mezcla compleja o un cultivo heterogéneo de células somáticas. La población inicial del sujeto puede obtenerse a partir de cualquier especie de mamífero, por ejemplo humano, primate, equino, bovino, porcino, canino, felino, etc. La población inicial del sujeto puede incluir células frescas o congeladas, las cuales pueden ser de un recién nacido, joven o adulto, y de tejidos que incluyen piel, músculo, médula, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, bazo, hígado, páncreas, pulmón, intestino, estómago, y otros tejidos diferenciados. El tejido puede obtenerse por biopsia o aféresis de un donante vivo, u obtenido de un muerto o donador moribundo en un plazo de aproximadamente 48 horas de muerto, o tejido recientemente congelado, tejido congelado en un plazo de aproximadamente 12 horas de muerto y mantenido en aproximadamente debajo de -20°C, generalmente a aproximadamente temperatura de nitrógeno líquido (-190°C) indefinidamente. Para el aislamiento de las células del tejido, puede utilizarse una solución apropiada para la dispersión o suspensión de las células. Tal solución será generalmente una solución de sal balanceada, por ejemplo solución salina normal, PBS, solución de sal balanceada de Hank, etc., suplementada convenientemente con suero fetal de becerro u otros factores de ocurrencia naturales, en conjunto con un amortiguador aceptable a baja concentración, generalmente a partir de 5-25 mm. Los amortiguadores convenientes incluyen HEPES, amortiguadores de fosfato, amortiguadores de lactato, etc.

En algunas modalidades, las células somáticas SSEA3+, es decir las células SSEA3* del sujeto, se separan de la población inicial del sujeto de las células somáticas inmediatamente después de la dispersión o suspensión de las células. En algunas modalidades, la población inicial del sujeto se cultiva primero para formar un cultivo de células heterogéneas, por ejemplo, un cultivo primario de fibroblastos, que después se somete a las técnicas de separación que enriquecerá a las células que expresan SSEA3. En algunas modalidades, la población inicial del sujeto se congela y congelada se almacena, generalmente d aproximadamente -80°C a aproximadamente temperatura de nitrógeno líquido (-190°C), hasta un tiempo en el cual la separación de las células SSEA3+ del sujeto a partir de la población inicial del sujeto puede realizarse. En tales casos, las células se almacenan generalmente en 10% D SO, 50% de suero, 40% de medio protegido, o cierta otra solución como se utiliza comúnmente en la técnica para preservar las células a tales temperaturas, y serán descongeladas y vueltas a cultivar por los métodos conocidos comúnmente en la técnica y según lo descrito adicionalmente más abajo.

La separación de las células SSEA3* del sujeto de la población inicial del sujeto de células somáticas puede ser por cualquier técnica de separación conveniente. Por ejemplo, las células SSEA3+ del sujeto pueden separarse de la población inicial del sujeto por técnicas de separación de afinidad. Las técnicas para la separación de afinidad pueden incluir la separación magnética usando perlas magnéticas recubiertas con un reactivo de afinidad, cromatografía de afinidad, "cribado" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida, por ejemplo placa, agentes citotóxicos unidos a un reactivo de afinidad o utilizados en conjunto con un reactivo de afinidad, por ejemplo complemento y citotoxinas, u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan la separación exacta incluyen los distribuidores celulares activados por fluorescencia, que pueden tener grados de sofisticación variados, tales como canales de color múltiples, ángulo bajo y canales de detección de dispersión de luz obtusa, canales de impedancia, etc. Las células pueden seleccionarse contra las células muertas utilizando tintes asociados con las células muertas (por ejemplo yoduro de propidio). Cualquier técnica puede usarse la cual no sea excesivamente perjudicial a la viabilidad de las células SSEA3 + del sujeto.

Para separar las células SSEA3+ del sujeto por técnicas de separación de afinidad, la población inicial del sujeto de las células somáticas se pone en contacto con un reactivo de afinidad que reconoce específicamente y une selectivamente al marcador asociado con pluripotencia, es decir el marcador SSEA3. Por "unir selectivamente" significa que la molécula une preferiblemente al objetivo de interés o une con mayor afinidad al sujeto que a otras moléculas. Por ejemplo, un anticuerpo se unirá a una molécula que comprende un epítopo para el cual es específico y no a epítopos no relacionados. En algunas modalidades, el reactivo de afinidad puede ser un anticuerpo, es decir un anticuerpo que es específico para SSEA3. En algunas modalidades, el reactivo de afinidad puede ser un receptor o ligando específico para SSEA3, por ejemplo un ligando y receptor del péptido; moléculas receptoras y efectoras, un receptor de la célula T específico para SSEA3, y similares. En algunas modalidades, los reactivos de afinidad múltiples específicos para SSEA3 pueden utilizarse. Los receptores de la célula T y anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden producirse por animales transgénicos, animales inmunizados, células B animales o humanos inmortalizadas, células transfectadas con vectores del ADN que codifican al receptor de la célula T o anticuerpo, etc. Los detalles de la preparación de anticuerpos y su conveniencia para el uso como miembros de unión específicos son bien conocidos a los expertos en la técnica. De interés particular es el uso de anticuerpos como reactivos de afinidad. Convenientemente, estos anticuerpos se conjugan con una etiqueta para uso en la separación. Las etiquetas incluyen perlas magnéticas, que permiten la separación directa; biotina, la cual puede retirarse con avidina o estreptavidina enlazada a un soporte; fluorocromos, que pueden utilizarse con un distribuidor celular activado por fluorescencia; o similares, para permitir la fácil separación del tipo de célula particular. Los fluorocromos que encuentran uso incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína y rojo de Texas. Frecuentemente cada anticuerpo se etiqueta con un fluorocromo diferente, para permitir la distribución independiente para cada marcador.

La población inicial del sujeto de células somáticas se pone en contacto con los reactivos de afinidad e incubados por un periodo de tiempo suficiente para unir a los antígenos superficiales de la cela disponibles. La incubación será generalmente por lo menos de aproximadamente 5 minutos y generalmente menos de aproximadamente 60 minutos. Es deseable tener una concentración suficiente de anticuerpos en la mezcla de reacción, tales que la eficacia de la separación no se limita por la carencia del anticuerpo. La concentración apropiada se determina por la titulación, pero será normalmente una dilución del anticuerpo en el volumen de la suspensión celular que es de aproximadamente 1:50 (es decir, 1 parte de anticuerpo a 50 partes del volumen de reacción), aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:150, aproximadamente 1:200, aproximadamente 1:250, aproximadamente 1:500, aproximadamente 1:1000, aproximadamente 1:2000, o aproximadamente 1:5000. El medio en el cual se suspenden las células será cualquier medio que mantenga la viabilidad de las células. Un medio preferido es la solución salina amortiguada con fosfato de 0.1 a 0.5% BSA o suero de cabra 1-4%. Varios medios están comercialmente disponibles y pueden utilizarse de acuerdo con la naturaleza de las células, que incluyen el Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés), Solución de Sal Básica de Hank (HBSS, por sus siglas en inglés), solución amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS, por sus siglas en inglés), RPMI, medio de Iscove, PBS con 5 mm de EDTA, etc., frecuentemente complementado con suero fetal de becerro, BSA, HSA, suero de cabra etc.

Las células en la población contactada que llega a ser etiquetada por el reactivo de afinidad, es decir, las células SSEA3* del sujeto, se seleccionan por cualquier técnica de separación de afinidad conveniente, por ejemplo como se describe anteriormente o según lo conocido en la técnica. Después de la separación, las células separadas pueden recolectarse en cualquier medio apropiado que mantenga la viabilidad de las células, generalmente teniendo un amortiguador de suero en la parte inferior del tubo de recolección. Varios medios están comercialmente disponibles y pueden utilizarse de acuerdo con la naturaleza de las células, que incluyen dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, medio de Iscove, etc., frecuentemente suplementados con suero fetal de becerro.

Las composiciones altamente enriquecidas para las células somáticas SSEA3* se alcanzan de este modo. Las células somáticas SSEA3+ serán de aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% o más de la composición de celular, aproximadamente 95% o más de la composición celular enriquecida, y será preferiblemente aproximadamente de 95% o más de la composición celular enriquecida. En otras palabras, la composición será una composición sustancialmente pura de las células somáticas SSEA3*. Las células de la composición sustancialmente pura también expresarán niveles más altos del gen Nanog que las células que no expresan o niveles bajos de SSEA3 de las que fueron separadas. Adicionalmente, las células de la composición sustancialmente pura serán morfológicamente indistinguibles de las células de las cuales fueron separadas; por ejemplo, si están enriquecidas a partir de una población de fibroblasto dérmica humana, las células somáticas SSEA3+ aparecerán sustancialmente de forma morfológica iguales que o idénticas a los fibroblastos dérmicos humanos SSEA3.

Las células somáticas SSEA3 + , es decir las células SSEA3 + del sujeto, pueden utilizarse inmediatamente. Alternativamente, las células SSEA3* del sujeto pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse por largos periodos de tiempo, siendo descongeladas y capaces de ser reutilizadas. En tales casos, las células serán congeladas generalmente en 10% de DMSO, 50% de suero, 40% de medio amortiguado, o algo de otra solución como es generalmente usada en la técnica para preservar las células en tales temperaturas de congelación, y descongeladas de una forma comúnmente conocida en la técnica para descongelar las células cultivadas congeladas.

Las células SSEA3" del sujeto pueden cultivarse in vitro bajo varias condiciones del cultivo. El medio de cultivo puede ser líquido o semisólido, por ejemplo que contiene agar, metilcelulosa , etc. La población de la célula puede suspenderse convenientemente en un medio nutriente apropiado, tal como DMEM modificado por Iscove o RPMI-1640, normalmente suplementado con suero fetal de becerro (aproximadamente 5-10%), la L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, por ejemplo penicilina y estreptomicina.

El cultivo puede contener factores de crecimiento de los cuales las células son responsables. Los factores de crecimiento, según lo definido en la presente, son moléculas capaces de promover supervivencia, crecimiento y/o diferenciación de células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos en un receptor de transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen factores de polipéptidos y sin polipéptidos.

Las células SSEA3* del sujeto pueden utilizarse en una gran variedad de maneras. El medio nutriente, que es un medio condicionado, puede aislarse en varias etapas y los componentes analizados. La separación puede alcanzarse con HPLC, fase HPLC inversa, electroforesis de gel, concentración isoeléctrica, diálisis, u otras técnicas no degradantes, que permiten la separación por peso molecular, volumen molecular, carga, combinaciones de los mismos, o similares. Una o más de estas técnicas pueden combinarse para enriquecer adicionalmente a fracciones específicas. Las células de los mismos sujetos pueden analizarse, por ejemplo para la expresión de genes, por ejemplo para caracterizar mejor las células del sujeto.

Un uso preferido para las células SSEA3+ del sujeto es producir las células iPS. Para inducir a las células SSEA3+ del sujeto que llegan a ser células iPS, la población sustancialmente pura de las células SSEA3* del sujeto, es decir, la población de células que fueron seleccionadas a partir de la población inicial de las células contactando a la población inicial con un reactivo de afinidad y selección de las células que expresan SSEA3, se contactan con los Factores de Reprogramación (RFs, por sus siglas en inglés). Los factores de reprogramación, según lo utilizado en la presente, se refieren a uno o más, es decir un coctel, de los factores biológicamente activos que actúan en una célula para alterar la transcripción, de tal modo reprogramando una célula a multipotencia o pluripotencia. En algunas modalidades el factor de reprogramación es un factor de transcripción, que incluye sin limitación, Oct3/4; Sox2¡ Klf4¡ c-Myc; Nanog; y Lin- 28.

Un polipéptido oct3/4 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de Oct3/4 humano, también conocida como Homo sapiens clase POU 5 homeosecuencia 1 (POU5F1) cuya secuencia puede encontrarse en el Acceso GenBank No. NP_002692 y N M_002701. Los polipétidos Oct3/4, por ejemplo, los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en el Acceso GenBank No. NM_002701, y ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido Sox2 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de por lo menos 70% idéntico a la secuencia de aminoácido de Sox2 humano, es decir, proteína 2 Y-box de la región determinante de sexo, secuencia la cual se encontró en el Acceso GenBank Nos. NP_003097 y NM_003106. Los polipéptidos Sox2, por ejemplo los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en el Acceso GenBank No. NM_003106, y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido Klf4 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido Klf4 humano, es decir, Factor 4 tipo Kruppel, la secuencia de la cual puede encontrarse en el Acceso GenBank No. NP_004226 y NM_004235. Los polipéptidos Klf4, por ejemplo los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%), 92%, 95%, 97%, 99%, o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en el Acceso GenBank No. NM_004235, y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente invención.

El polipéptido c-Myc es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de c-Myc humano, es decir, compuesto homólogo de oncogén vírico de mielocitomatosis, cuya secuencia puede encontrarse en el Acceso GenBank Nos. NP_002458 y NM_002467. Los polipéptidos c-Myc, por ejemplo los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en el Acceso GenBank No. NM_002467, y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido Nanog es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de Nanog humano, es decir, homeosecuencia de Nanog, cuya secuencia puede encontrarse en el Acceso GenBank No. NP_079141 y N M_024865. Los polipéptidos de Nanog, por ejemplo los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, o 100% idénticos a la secuencia proporcionada en el Acceso GenBank No. NM_024865, y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente invención.

Un polipéptido Lin-28 es un polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de humano Lin-28, es decir, Lin-28 homólogo de C. elegans, la secuencia de la cual puede encontrarse en el Acceso GenBank No. NP_078950 y NM_024674. Los polipéptidos Lin-28, por ejemplo los que son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 99%, ó 100% idéntica a la secuencia proporcionada en el Acceso GenBank No. NM_024674, y los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente invención.

En algunas modalidades, los factores de reprogramación se proporcionan en la composición sustancialmente pura de las células SSEA3+ del sujeto como ácidos nucleicos que codifican a los factores de reprogramación. Muchos vectores útiles para transferir genes exógenos en las células mamíferas objetivas están disponibles. Los vectores pueden mantenerse episomáticamente, por ejemplo como plásmidos, minicirculos de ADNs, vectores derivados del virus tal como citomegalovirus, adenovirus, etc., o ellos pueden integrarse en el genoma de la célula objetivo, a través de la recombinación homóloga o integración aleatoria, por ejemplo los vectores derivados de los retrovirus tales como M LV, VIH-1, ALV, etc.

Los ácidos nucleicos que codifican los factores de reprogramación pueden proporcionarse directamente en las células del sujeto. En otras palabras, las células somáticas SSEA3+ del sujeto se ponen en contacto con los ácidos nucleicos los cuales comprenden los vectores que codifican a los factores de reprogramación de modo que los vectores son absorbidos por las células. Los métodos para contactar células con vectores de ácido nucleico, tales como electroporación, transfección del cloruro de calcio, y lipofección, son bien conocidos en la técnica.

Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican los factores de reprogramación pueden proporcionarse al sujeto vía un virus. Es decir, las células somáticas SSEA3* del sujeto se ponen en contacto con los ácidos nucleicos los cuales comprenden partículas virales que codifican a los factores de reprogramación. Los retrovirus, por ejemplo, lentivirus, son particularmente convenientes al método de la invención, ya que ellos pueden utilizarse con las células sin división transfectadas (ver, por ejemplo, Uchida y colaboradores (1998) P.N.A.S. 95(20): 11939-44). Los vectores retrovirales usados comúnmente son "defectuosos", es decir incapaces de producir proteínas virales requeridas para la infección productiva. Preferiblemente, la réplica del vector requiere crecimiento en una línea celular embalada.

Para generar ácidos nucleicos los cuales comprenden las partículas virales que codifican los factores de reprogramación, el ácido nucleico el cual comprende ácidos nucleicos retrovirales que codifican los factores de reprogramación se embala en cápsidos virales por una línea celular embalada. Diferentes líneas celulares embaladas proporcionan una proteína de envoltura diferente que se incorporará en el cápsido, esta proteína de envoltura determina la especificidad de la partícula viral para las células. Las proteínas de envoltura son por lo menos de tres tipos, ecotrópica, amfotrópica y xenotrópica. Los retrovirus embalados con la proteína de envoltura ecotrópica, por ejemplo MMLV, son capaces de infectar a la mayoría de los tipos de célula murino y de rata, y son generados usando líneas celulares de empaque ecotrópico tales como BOSC23 90:8392 (Pear y colaboradores (1993) P.N.A.S. 90:8392-8396). Los retrovirus que llevan la proteína de envoltura amfotrópica, por ejemplo 4070A (Danos y colaboradores, supra.), son capaces de infectar a la mayoría de los tipos de la célula mamífera, que incluyen humano, perro y ratón, y se generan usando líneas celulares embaladas amfotrópico tal como PA12 (1985) Miller y colaboradores, (1985) Mol. Cel. Biol. 5:431-437) (Miller y colaboradores; Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902) GRIP (Danos y colaboradores (1988) PNAS 85:6460-6464). Los retrovirus embalados con la proteína de envoltura xenotrópica, por ejemplo AKR env, son capaces de infectar la mayoría de los tipos de célula mamífera, excepto las células murino. La célula embalada apropiada puede utilizarse para asegurar que las células somáticas CD33+ del sujeto sean marcadas por las partículas virales embaladas. Los métodos para introducir el ácido nucleico los cuales comprenden los vectores retrovirales que codifican los factores de reprogramación dentro de las líneas celulares embaladas y recolección de las partículas virales que se generan por las líneas embaladas son bien conocidos en la técnica.

Los vectores usados para proporcionar los factores de reprogramación en las células del sujeto como los ácidos nucleicos, normalmente comprenderán promotores convenientes para conducir la expresión, es decir, activación transcriptiva, de los ácidos nucleicos del factor de reprogramación. Esto puede incluir promotores que actúan ubicuamente, por ejemplo, el promotor CMV-b-actinia, o los promotores inducibles, tal como promotores que son activos en poblaciones celulares particulares o que respondan a la presencia de fármacos tal como tetraciclina. Por activación transcriptiva, se desea que la transcripción será aumentada arriba de los niveles básicos en la célula marcada por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, más generalmente por lo menos aproximadamente 100 veces. Además, los vectores utilizados para proporcionar factores de reprogramación con las células del sujeto pueden incluir genes que deberán eliminarse más adelante, por ejemplo, usando un sistema de recombinasa tal como Cre/Lox, o las células que las expresan destruidas, por ejemplo, incluyendo genes que permiten toxicidad selectiva tal como herpesvirus TK, bcl-xs, etc En algunas modalidades, los factores de reprogramación se proporcionan como polipéptidos sin integración, actuación nuclear, de los factores de reprogramación, o polipéptidos del factor de reprogramación. Es decir, las células somáticas SSEA3* del sujeto se ponen en contacto con los polipéptidos que codifican los factores de reprogramación y actúan en el núcleo. Por sin integración, significa que los polipéptidos no integran en el genoma de la célula hospedadora, es decir, las células somáticas SSEA3+ del sujeto.

Normalmente, un polipéptido del factor de reprogramación comprenderá las secuencias del polipéptido del factor de reprogramación fundido en un dominio permeable del polipéptido. Un número de dominios permeables se conocen en la técnica y pueden utilizarse en polipétidos sin integración, de actuación nuclear de la presente invención, que incluye péptidos, peptidomiméticos, y portadores sin péptido. Por ejemplo, un péptido permeable puede derivarse de la tercera hélice alfa de Antennapaedia del factor de transcripción de Drosophila melanogaster, referida como penetratina. Como otro ejemplo, el péptido permeable comprende la secuencia de aminoácido de la región básica de VIH-1 tat, que puede incluir, por ejemplo, los aminoácidos 49-57 de la proteína tat que ocurren naturalmente. Otros dominios permeables incluyen los motivos de la poli-arginina, por ejemplo, la región de los aminoácidos 34-56 de la proteína rev de VIH-1, nona-arginina, octa-arginina, y similares. (Ver, por ejemplo, Futaki y colaboradores (2003) Curr Protein Pept Sci. 2003 Apr; 4(2): 87-96; y Wender y colaboradores (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 2000 Nov. 21; 97(24):13003-8; solicitudes de Patente Norteamericana publicadas 20030220334; 20030083256; 20030032593; y 20030022831, incorporadas en la presente específicamente por referencia para las enseñanzas de la translocación de los péptidos y peptoides). La secuencia de la nona-arginina (R9) es una de los más eficientes PTDs que se ha caracterizado (Wender y colaboradores 2000; Uemura y colaboradores 2002).

Las secuencias del polipéptido del factor de reprogramación también pueden fundirse opcionalmente en un dominio del polipéptido que aumenta la solubilidad del producto. Generalmente el dominio se liga a la RF a través de un sitio de división de la proteasa definida, por ejemplo una secuencia TEV, que se divide por la proteasa TEV. El ligando también puede incluir una o más secuencias flexibles, por ejemplo de 1 a 10 residuos de glicina. En algunas modalidades, la división de la proteína de fusión se realiza en un amortiguador que mantiene la solubilidad del producto, por ejemplo, en presencia de 0.5 a 2 M de urea, en presencia de los polipéptidos y/o polinucleótidos que aumentan la solubilidad de la RF, y similares. Los dominios de interés incluyen los dominios endosomolíticos, por ejemplo dominio de la influenza HA; y otros polipéptidos que ayudan en la producción, por ejemplo del dominio IF2, dominio GST, dominio GRPE, y similares.

Los polipéptidos del factor de reprogramación pueden generarse en un sistema basado en la célula usando los métodos conocidos en la técnica. Un ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el polipéptido del factor de reprogramación que se inserta en un vector reproducible por la expresión. Muchos de estos vectores están disponibles. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: un origen de réplica, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, promotor, y una secuencia de terminación de transcripción.

Los polipéptidos del factor de reprogramación pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, pero también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo un polipéptido que tiene un sitio de división específico en la terminal-N de la proteína o polipéptido maduros.

Los vectores de expresión contienen generalmente un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células huésped transformadas crecidas en un medio de cultivo selectivo.

Los vectores de expresión contendrán un promotor que se reconoce por el organismo anfitrión y está ligado operablemente a la secuencia de codificación del factor de reprogramación. Los promotores son secuencias sin traducir localizados corriente arriba (5') en el condón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 bp) que controla la transcripción y traducción de la secuencia de ácido nucleico particular a la cual se ligan operablemente. Tales promotores se ubican normalmente en dos clases, inducible y constitutivo. Los promotores inducibles son los promotores que inician los niveles crecientes de transcripción del ADN bajo su control en respuesta en un cierto cambio en condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en temperatura. Un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes potenciales es bien conocido. Una secuencia del promotor de polipéptido del factor de reprogramación nativa y muchos promotores heterologos pueden utilizarse para dirigir la expresión de un polipéptido de factor de reprogramación. Sin embargo, los promotores heterólogos son preferidos, ya que permiten generalmente la mayor transcripción y producciones más altas. La transcripción por eucariotas más altas frecuentemente se aumenta insertando una secuencia mejoradora en el vector. Los mejoradores son elementos de acción por cis del ADN, generalmente aproximadamente de 10 a 300 bp, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los mejoradores son relativamente independientes de la orientación y posición, se han encontrado 5' y 3' en la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la misma secuencia de codificación.

Los vectores de expresión utilizados en las células hospedadoras eucarióticas (levadura, hongos, insecto, planta, animal, humano, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles de 5' y, ocasionalmente de 3', las regiones sin traducir del ADNs o ADNc virales o eucarióticas. Estas regiones contienen segmentos del nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del polipéptido Wnt que codifica al ARNm. Las células que comprenden el vector de expresión crecen bajo condiciones que proporcionan la expresión del polipéptido deseado, el cual después se extrae del isato de la célula por métodos convencionales.

Alternativamente, los polipéptidos del factor de reprogramación pueden generarse en un sistema libre de células, por ejemplo por los métodos enseñados en la Solicitud Norteamericana Serie No. 61/271,000, la cual está incorporada en la presente por referencia.

Después de la purificación por métodos comúnmente conocidos en la técnica, los polipéptidos del factor de reprogramación se proporcionan a las células del sujeto por métodos estándares de transducción de la proteína. En algunos casos, el método de transducción de la proteína incluye poner en contacto con las células con una composición que contiene un agente portador y por lo menos un polipéptido del factor de reprogramación purificado. Los ejemplos de los agentes portadores convenientes y los métodos para su uso incluyen, pero no se limitan a, los reactivos comercialmente disponibles tales como Chariot™ (Active Motif, Inc., Carlsbad, California) descrito en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 6,841,535; Bioport™ (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, California), GenomeONE (Cosmo Bio Co., Ltd., Tokio, Japón), y ProteoJuice™ (Novagen, Madison, WIS.), o reactivos de transducción de la proteína de nanopárticulas según lo descrito en, por ejemplo, Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 10/138,593.

Los factores de reprogramación pueden proporcionarse a las células somáticas SSEA3+ del sujeto individualmente o como una sola composición, es decir, como una composición premezclada, de los factores de reprogramación. Los factores de reprogramación pueden agregarse a las células del sujeto simultánea o secuencialmente en diferentes horas. En algunas modalidades, un conjunto de por lo menos tres factores de reprogramación purificados se agrega, por ejemplo, un polipétido Oct3/4, polipéptido Sox2, y un polipéptido Klf4. En algunas modalidades, un conjunto de cuatro factores de reprogramación purificados se proporciona a las células por ejemplo, un polipéptido Oct3/4, polipéptido Sox2, polipéptido Klf4, y polipéptido c-Myc. En algunas modalidades, las células se incuban en presencia de un polipéptido IF purificado por aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, por ejemplo, 1 hora, 1.5 horas, 2 horas, 2.5 horas, 3 horas, 3.5 horas 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, o cualquier otro período de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas. En algunas modalidades, la transducción de la proteína de las células se repite con una frecuencia de aproximadamente diario a aproximadamente cada 4 días, por ejemplo, cada 1.5 días, cada 2 días, cada 3 días, o cualquier otra frecuencia de aproximadamente diario a aproximadamente de cada cuatro días con el mismo o polipéptidos IF diferentes. Normalmente, los factores de reprogramación se proporcionan a las células del sujeto una vez, y las células se dejan incubar con los factores de reprogramación durante 16-24 horas, después de cuyo tiempo el medio se sustituye por medios frescos y las células se cultivan adicionalmente, o los factores de reprogramación se proporcionan a las células del sujeto dos veces, con dos incubaciones de 16-24 horas con los factores de recombinación después de cada provisión, después de lo cual los medios se sustituyen con medios frescos y las células se cultivan adicionalmente.

Después de poner en contacto con las células somáticas SSEA3+ del sujeto con los factores de reprogramación, las células contactadas se cultivan para promover el crecimiento de las células iPS. Los métodos para células de cultivo promueven el crecimiento de las células ES, aislamiento de los clones de las células ES y células de cultivo de los clones de las células ES para promover el crecimiento de las células ES son bien conocidos en la técnica, cualquiera de los cuales puede utilizarse en la presente invención para crecer, aislar y recultivar las células iPS de las células somáticas SSEA3+ reprogramadas del sujeto.

Las células iPS que llegan a ser tal población a partir de la célula somática SSEA3+ del sujeto tienen una morfología tipo hESC, creciendo como colonias planas con relaciones nucleocitoplasmáticas grandes, fronteras definidas y núcleos prominentes. Además, las células iPS expresan uno o más de los marcadores de pluripotencia esencial conocidos por un experto en la técnica, incluyendo pero no limitados a la Fosfatasa Alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT, y zfp42. Además, las células iPS son capaces de formar teratomas. Además, son capaces de formar o contribuir a los tejidos ectodérmicos, mesodérmicos, o endodérmicos en un organismo vivo.

Los genes pueden introducirse en las células somáticas SSEA3+ del sujeto o las células iPS derivadas de los mismos para una variedad de propósitos, por ejemplo para sustituir los genes que tienen una mutación de función, proporcionan genes marcadores, etc. Alternativamente, se introducen los vectores que expresan el ARNm o ribozimas antisentido, de tal modo que bloquean la expresión de un gen indeseado. Otros métodos de terapia del gen son la introducción de genes de resistencia del fármaco para permitir a las células progenitoras normales tener una ventaja y someterse a la presión selectiva, por ejemplo el gen de resistencia múltiple del fármaco (MDR, por sus siglas en inglés), o genes anti-apoptosis, tales como bcl-2. Varias técnicas conocidas en la técnica pueden utilizarse para introducir a los ácidos nucleicos en las células marcadas, por ejemplo electroporación , ADN precipitado de calcio, fusión, transfección, lipofección, infección y similares, según lo discutido anteriormente. La manera particular en la cual se introduce el ADN no es crítica a la práctica de la invención.

Para probar que una de las células somáticas SSEA3* o de las células iPS derivadas de las mismas se ha modificado genéticamente, se pueden utilizar varias técnicas. El genoma de las células puede ser restringido y utilizarse con o sin amplificación. Todas pueden utilizarse, la reacción en cadena de la polimerasa; electroforesis en gel; Southern, Northern, y Western blots; secuencia; o similares. Las células pueden crecer bajo varias condiciones para asegurar que las células sean capaces de madurar a todos los linajes mieloides mientras que mantienen la capacidad de expresar el ADN introducido. Varias pruebas in vitro e in vivo pueden usarse para asegurar que la capacidad pluripotente de las células se ha mantenido.

Se observa en la presente que una de las ventajas de los métodos sometidos, es que proporcionan una población sustancialmente pura de células con una eficacia me orada de reprogramación para llegar a ser células iPS. Por "eficacia mejorada de la reprogramación" significa que las células demostrarán una capacidad mejorada para constituir a las células iPS cuando se ponen en contacto con los factores de reprogramación descomponen en factores con relación a un control. Las células y las poblaciones de la célula que demuestran una eficacia mejorada de reprogramación tienen la capacidad de constituir a las células iPS que es de aproximadamente 150% de la capacidad de las células de control o de las poblaciones de la célula de control, de aproximadamente 200%, de aproximadamente 300%, de aproximadamente 400%, de aproximadamente 600%, o de aproximadamente 800% de la capacidad de las células de control o de las poblaciones de la célula del control. Es decir las células primarias o cultivos celulares primarios producen aproximadamente 1.5 - veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 6 veces o aproximadamente ocho veces el número de colonias IPS como células primarias de control o población de células primarias de control, o más. En algunos casos, la población de células de control/células de control no expresan un marcador de pluripotencia del sujeto. En algunos casos, la población de control es una población que comprende algunas células que expresan el marcador de pluripotencia del sujeto, pero no se enriquece para esas células que expresan el marcador de pluripotencia, es decir únicamente aproximadamente 2% o menos, 5% o menos, 7% o menos, 10% o menos, algunas veces 15%, 20%, ó 30% o menos, ocasionalmente 40%, 50%, 60% ó 70% o menos de las células que expresan el marcador de pluripotencia. Normalmente, los métodos de la invención proporcionan una eficacia creciente de reprogramación que es de por lo menos aproximadamente dos veces o más arriba que la eficacia de la reprogramación de la población del control.

Las células iPS producidas por los métodos antes mencionados pueden utilizarse para reconstituir o complementar las células diferenciadas o de diferenciación en un recipiente. Las células inducidas pueden diferenciarse en tipos de célula de varios linajes. Los ejemplos de las células diferenciadas incluyen cualquier célula diferenciada de los linajes ectodérmicos (por ejemplo, neuronas y fibroblastos), mesodérmicos (por ejemplo, cardiomiocitos), o endodérmicos (por ejemplo, células pancreáticas). Las células diferenciadas pueden ser una o más: células beta pancreáticas, células madre neurales, neuronas (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas), oligodendrocitos, células progenitoras de oligodendrocitos, hepatocitos, células madre hepáticas, astrocitos, miocitos, células hematopoyéticas, o cardiomiocitos.

Las células diferenciadas derivadas de las células inducidas pueden ser células terminalmente diferenciadas, o pueden ser capaces de constituir células de un linaje específico. Por ejemplo, las células inducidas pueden diferenciarse en una variedad de tipos de célula multipotente, por ejemplo, células madre neurales, células madre cardiacas, o células madre hepáticas. Las células madre después pueden adicionalmente diferenciarse en nuevos tipos de célula, por ejemplo, las células madre neurales pueden diferenciarse en las neuronas; las células madre cardiacas pueden diferenciarse en cardiomiocitos; y las células madre hepáticas pueden diferenciarse en hepatocitos.

Existen numerosos métodos para diferenciar las células inducidas en un tipo de célula más especializada. Los métodos de diferenciación de células inducidas pueden ser similares a los utilizados para diferenciar células madre, particularmente células ES, MSCs, MAPCs, MIAMI, células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés). En algunos casos, la diferenciación ocurre ex vivo.

Cualquier método conocido para generar células madre neurales a partir de las células ES puede utilizarse para generar células madre neurales a partir de las células inducidas, Ver, por ejemplo, Reubinoff y colaboradores, (2001), Nat, Biotechnol., 19 (12): 1 134-40. Por ejemplo, las células madre neurales pueden generarse cultivando las células inducidas como agregados flotantes en presencia de noggin, u otro antagonista de la proteína morfogenética del hueso, ver por ejemplo, Itsykson y colaboradores, (2005), Mol, Cell Neurosci., 30 (1):24-36. En otro ejemplo, las células madre neurales pueden generarse cultivando las células inducidas en suspensión para formar los agregados en presencia de los factores de crecimiento, por ejemplo, FGF-2, Zhang y colaboradores, (2001), Nat. Biotech., (19): 1129-1133. En algunos casos, los agregados se cultivan en el medio sin suero que contiene FGF-2. En otro ejemplo, las células inducidas se co-cultivan con una línea celular estromal de ratón, por ejemplo, PA6 en presencia del medio libre de suero que comprende FGF-2. En incluso otro ejemplo, las células inducidas se transfieren directamente al medio libre de suero que contiene FGF-2 para inducir directamente la diferenciación.

Los troncos neurales derivados de las células inducidas pueden diferenciarse en neuronas, oligodendrocitos, o astrocitos. Frecuentemente, las condiciones usadas para generar las células madre neurales también pueden utilizarse para generar neuronas, oligodendrocitos, o astrocitos.

Las neuronas dopaminérgicas desempeñan una función fundamental en la enfermedad de Parkinson y otras enfermedades neurodegenerativas y por lo tanto son de interés particular. Para promover la diferenciación en las neuronas dopaminérgicas, las células inducidas pueden co-cultivarse con una línea celular estromal de ratón PA6 bajo condiciones libres de suero, ver, por ejemplo, Kawasaki y colaboradores, (2000) Neuron, 28(1):3140. Otros métodos también se han descrito, ver, por ejemplo, Pomp y colaboradores, (2005), Stem Cells 23(7):923-30; Patente Norteamericana No. 6,395,546, por ejemplo, Lee y colaboradores, (2000), Nature Biotechnol., 18:675-679.

Los oligodendrocitos también pueden generarse de las células inducidas. La diferenciación de las células inducidas en oligodendrocitos puede lograrse por los métodos conocidos para diferenciar a las células ES o células madre neurales en oligodendrocitos. Por ejemplo, los oligodendrocitos pueden generarse por el co-cultivo de las células inducidas o células madre neurales con células estromal, por ejemplo, Hermann y colaboradores (2004), J Cell Sci. 117(Pt 19):4411-22. En otro ejemplo, los oligodendrocitos pueden generarse cultivando las células inducidas o células madre neurales en presencia de una proteína de fusión, en donde el receptor Interleucia (IL)-6, o derivado, se liga a la citocina IL-6, o derivados del mismo. Los oligodendrocitos también pueden generarse de las células inducidas por otros métodos conocidos en la técnica, ver, por ejemplo Kang y colaboradores, (2007) Stem Cells 25, 419-424.

Los astrocitos también pueden producirse a partir de las células inducidas. Los astrocitos pueden generarse cultivando células inducidas o células madre neurales en presencia del medio neurogénico con bFGF y EGF, ver por ejemplo, Brustle y colaboradores, (1999), Science, 285:754-756.

Las células inducidas pueden diferenciarse en las células beta pancreáticas por los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, Lumelsky y colaboradores, (2001) Science, 292:1389-1394; Assady y colaboradores, (2001), Diabetes, 50:1691-1697; D'Amour y colaboradores, (2006), Nat. Biotechnol. , 24:1392-1401; D'Amour y colaboradores, (2005), Nat. Biotechnol. 23:1534-1541. El método puede comprender el cultivo de células inducidas en un medio libre de suero complementado con Activina A, seguido por el cultivo en presencia del medio libre de suero complementado con ácido todo trans-retinóico, cultivado después en presencia del medio libre de suero complementado con bFGF y niconamida, por ejemplo, Jiang y colaboradores, (2007), Cell Res., 4:333-444. En otros ejemplos, el método comprende cultivar las células inducidas en presencia del medio libre de suero, activina A, y la proteína Wnt de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 6 días, por ejemplo, de aproximadamente 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, días; después del cultivo en presencia de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 2%, por ejemplo, 0.2%, FBS y activina A de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 días, por ejemplo, de aproximadamente 1, 2, 3, ó 4 días; seguido por el cultivo en presencia de 2% de FBS, FGF-10, y KAAD-ciclopamina (ceto-N-aminoetilaminocaproilo dihidro cinamoilciclopamina) y ácido retinóico de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 días, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, ó 5 días; seguido por el cultivo con 1% de B27, inhibidor de gamma-secretasa y extendin-4 de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 días, por ejemplo, 1, 2, 3, ó 4 días; y finalmente el cultivo en presencia de 1% de B27, extendin-4, IGF-1, y HGF de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 días, por ejemplo, 1, 2, 3, ó 4 días.

Las células hepáticas o células madre hepáticas pueden diferenciarse de las células inducidas. Por ejemplo, cultivo de las células inducidas en presencia del butirato de sodio puede generar hepatocitos, ver por ejemplo, Rambhatla y colaboradores, (2003), Cell Transplant, 12:1-11. En otro ejemplo, los hepatocitos pueden producirse por cultivo de las células inducidas en un medio libre de suero en presencia de Activina A, seguido por el cultivo de las células en crecimiento de fibroblasto factor-4 y protein-2 morfogenética del hueso, por ejemplo, Cai y colaboradores, (2007), Hepatology, 45 (5): 1229-39. En una modalidad ejemplar, las células inducidas se diferencian en células hepáticas o células madre hepáticas cultivando las células inducidas en presencia de Activina A de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 días, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, de aproximadamente 4 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 6 días, y después cultivar las células inducidas en presencia del factor de crecimiento del hepatocito (HGF, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 5 días a aproximadamente 10 días, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 6, de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, de aproximadamente 9 a aproximadamente 10 días.

Las células inducidas también pueden diferenciarse en células musculares cardiacas. La inhibición de la señalización de la proteína morfogenética del hueso (BMP por sus siglas en inglés) puede resultar en la generación de células musculares cardíacas (o cardiomiocitos), ver, por ejemplo, Yuasa y colaboradores, (2005), Nat. Biotechnol., 23(5):607-11. Por lo tanto, en una modalidad ejemplar, las células inducidas se cultivan en presencia de noggin de aproximadamente dos a aproximadamente seis días, por ejemplo, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, o aproximadamente 6 días, antes de permitir la formación de un cuerpo embrioide, y cultivo del cuerpo embrioide de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 4 semanas, por ejemplo, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, o aproximadamente 4 semanas.

En otros ejemplos, los cardiomiocitos pueden generarse cultivando las células inducidas en presencia del factor inhibitorio de leucemia (LIF, por sus siglas en inglés), o sometiéndolos a otros métodos conocidos en la técnica para generar cardiomiocitos de las células ES, por ejemplo, Bader y colaboradores, (2000), Circ. Res., 86:787-794, Kehat y colaboradores, (2001), J. Clin. Invertir., el 108:407-414; Mummery y colaboradores, (2003), Circulation, 107:2733-2740.

Los ejemplos de los métodos para generar otros tipos de célula a partir de las células inducidas incluyen: (1) cultivo de células inducidas en presencia del ácido retinóico, factor inhibitorio de leucemia (LIF, por sus siglas en inglés), hormona tiroidea (T3), e insulina para generar los adipocitos, por ejemplo, Dani y colaboradores, (1997), J. Cell Sci., 110:1279-1285.; (2) cultivo de células inducidas en presencia de BMP-2 o BMP4 para generar condrocitos, por ejemplo, Kramer y colaboradores, (2000), Mech. Dev., 92:193-205; (3) cultivo de células inducidas bajo condiciones para generar el músculo liso, por ejemplo, Yamashita y colaboradores, (2000), Nature, 408:92-96; (4) cultivo de células inducidas en presencia de integrina beta-1 para generar queratinocitos, por ejemplo, Bagutti y colaboradores, (1996), Dev. Biol., 179:184-196; (5) cultivo de células inducidas en presencia de lnterleucina-3 (IL-3) y factor de estimulación de la colonia del macrófago para generar los macrófagos, por ejemplo, Lieschke y Dunn (1995), Exp. Hemat., 23:328-334; (6) cultivo de células inducidas en presencia de IL-3 y factor de célula madre para generar mastocitos, por ejemplo, Tsai y colaboradores, (2000), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97:9186-9190; (7) cultivo de células inducidas en presencia de dexametasona y capa celular estromal, factor de acero para generar melanocitos, por ejemplo, Yamane y colaboradores, (1999), Dev. Dyn., 216:450-458; (8) co-cultivo de las células inducidas con osteoblastos fetales de ratón en presencia de dexametasona, ácido retinóico, ácido ascórbico, beta-glicerofosfato para generar osteoblastos, por ejemplo, Buttery y colaboradores, (2001), Tissue Eng., 7:89-99; (9) cultivo de células inducidas en presencia de los factores osteogénicos para generar osteoblastos, por ejemplo, Sottile y colaboradores, (2003), Cloning Stem Cells, 5:149-155; (10) sobre-expresión del factor-2 de crecimiento tipo insulina en las células inducidas y cultivo de las células en presencia de sulfóxido de dimetilo para generar las células musculares esqueléticas, por ejemplo, Prelle y colaboradores, (2000), Biochem. Biophys. Res. Commun., 277:631-638; (11) sometiendo a las células inducidas a condiciones para generar glóbulos blancos; o (12) cultivo de las células inducidas en presencia de BMP4 y de uno o más: SCF, FLT3, IL-3, IL-6, y GCSF para generar células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, Chadwick y colaboradores, (2003), Blood, 102:906 - 915.

En algunos casos, las subpoblaciones de células somáticas pueden purificarse o aislarse. En algunos casos, uno o más anticuerpos monoclonales específicos en el tipo de célula deseada se incuban con la población de la célula y esas células enlazadas se aislan. En otros casos, la subpoblación de células deseadas expresa un gen reportero que está bajo el control de un promotor específico del tipo de célula.

En una modalidad específica, la proteína de fusión fosfotransferasa-EGFP de higromicina B se expresa en una manera específica del tipo de célula. El método de purificación comprende la clasificación de células para seleccionar las células fluorescentes verdes y la reiteración de la clasificación según sea necesario, para obtener una población de células enriquecidas para las células que expresan el constructo (por ejemplo, fosfotransferasa-EGFP de higromicina B) en una manera dependiente del tipo de célula. La selección de las subpoblaciones de las células deseadas también puede lograrse por la selección negativa de células de proliferación con el sistema de gen suicida de timidina cinasa/ganciclovir del virus de herpes simple (HSVtk/GCV) o por la selección positiva de las células que expresan un reportero bicistrónico, por ejemplo, Anderson y colaboradores (2007) Mol. Ther. (11 ):2027-2036.

Las células inducidas, o células diferenciadas de las células inducidas, pueden utilizarse como una terapia para tratar la enfermedad (por ejemplo, un defecto genético). La terapia puede dirigirse al tratamiento de la causa de la enfermedad; o alternativamente, la terapia puede tratar los efectos de la enfermedad o condición. Las células inducidas pueden transferirse, o acercarse, a un sitio dañado en un sujeto; o las células pueden introducirse al sujeto de una forma que permite que las células emigren, o regresen, al sitio dañado. Las células transferidas pueden sustituir ventajosamente a las células dañadas o lesionadas y permite el mejoramiento en las condiciones totales del sujeto. En ocasiones, las células transferidas pueden estimular la regeneración o reparación del tejido.

Las células transferidas pueden ser células diferenciadas de las células inducidas. Las células transferidas también pueden ser células madre multipotentes diferenciadas de las células inducidas. En algunos casos, las células transferidas pueden ser células inducidas que no se han diferenciado.

El número de administraciones de tratamiento a un sujeto puede variar. La introducción de las células inducidas y/o diferenciadas en el sujeto puede ser un evento de una vez; pero en ciertas situaciones, tal tratamiento puede producir un mejoramiento por un periodo de tiempo limitado y requerir una serie en curso de tratamientos repetidos. En otras situaciones, las administraciones múltiples de las células pueden requerirse antes de que se observe un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o condición, la etapa de la enfermedad y parámetros del sujeto individual que se trata.

Las células pueden introducirse al sujeto vía cualquiera de las siguientes rutas: parenteral, intravenoso, intra-arterial, intramuscular, subcutánea, transdérmica, intratraqueal, intraperitoneal, o en fluido espinal.

Las células inducidas pueden diferenciarse en células y después transferirse a los sujetos que sufren de una amplia gama de enfermedades o trastornos. Los sujetos que sufren de enfermedades neurológicas o trastornos podrían beneficiarse especialmente de terapias de célula madre. En algunos métodos, las células inducidas pueden diferenciarse en células madre neurales o células neurales y después trasplantadas a un sitio dañado para tratar una condición neurológica, por ejemplo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, infarto cerebral, lesión de la médula espinal, u otro trastorno del sistema nervioso central, ver, por ejemplo, Morizane y colaboradores, (2008), Cell Tissue Res., 331 (1):323-326; Coutts and Keirstead (2008), Exp. Neurol., 209(2):368-377; Goswami and Rao (2007), Drugs, 10(10):713-719.

Para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, las células inducidas pueden diferenciarse en neuronas por la acción de dopamina y después trasplantadas en el cuerpo estriado de un sujeto con la enfermedad de Parkinson. Para el tratamiento de la esclerosis múltiple, las células madre neurales pueden diferenciarse en oligodendrocitos o progenitores de oligodendrocitos, que después se transfieren a un sujeto que sufre de MS.

Para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno neurológico, un método exitoso puede introducirse en las células madre neurales al sujeto. Por ejemplo, para tratar la enfermedad de Alzheimer, el infarto cerebral o lesión espinal, las células inducidas pueden diferenciarse en las células madre neurales seguidas por el trasplante en el sitio lesionado. Las células inducidas también pueden diseñarse para responder a las señales que pueden apuntar su migración en las lesiones para la reparación del cerebro y médula espinal, por ejemplo, Chen y colaboradores, (2007), Stem Cell Rev., 3(4):280-288.

Las enfermedades de otros trastornos neurológicos también pueden tratarse por una terapia de célula madre que utilice las células diferenciadas de las células inducidas, por ejemplo, células madre multipotentes o pluripotentes inducidas. Las enfermedades cardíacas degenerativas tales como cardiomiopatía isquémica, enfermedad de conducción, y defectos congénitos podrían beneficiarse de las terapias de la célula madre, ver, por ejemplo Janssens y colaboradores, (2006), Lancet, 367:113-121.

Las células islote pancreáticas (o células primarias de los islotes de Langerhans) pueden trasplantarse en un sujeto que sufre de diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus, tipo 1), ver, por ejemplo, Burns y colaboradores, (2006) Curr. Stem Cell Res. Ther., 2:255-266. En algunas modalidades, las células beta pancreáticas derivadas de las células inducidas pueden trasplantarse en un sujeto que sufre de diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus, tipo 1).

En otros ejemplos, las células hepáticas o células madre hepáticas derivadas de las células inducidas se trasplantan en un sujeto que sufre de una enfermedad del hígado, por ejemplo, hepatitis, cirrosis, o falta de hígado.

Las células hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) derivadas de las células inducidas pueden trasplantarse en el sujeto que sufre de cáncer en la sangre, u otro trastorno de sangre o inmune. Los ejemplos de cánceres de sangre que son potencialmente tratados por las células hematopoyéticas o HSC incluyen: leucemia linfoblástica aguda, leucemia de mieloblastos aguda, leucemia mielógena crónica (CML, por sus siglas en inglés), enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, y linfoma de no Hodgkin. Frecuentemente, un sujeto que sufre de tal enfermedad debe experimentar el tratamiento por radiación y/o quimioterapéutico para matar rápidamente la división de las células sanguíneas. La introducción de HSC derivado de las células inducidas a estos sujetos puede ayudar a repoblar depósitos agotados de células.

En algunos casos, las células hematopoyéticas o HSC derivadas de las células inducidas también pueden utilizarse para luchar directamente contra el cáncer. Por ejemplo, el trasplante de HSC alogenéico ha mostrado promesas en el tratamiento del cáncer de riñon, ver, por ejemplo, Childs y colaboradores, (2000), N. Engl. J. Med, 343:750-758. En algunas modalidades, los tejidos alogéneicos, o incluso autólogos, HSC derivados de las células inducidas pueden introducirse en un sujeto para tratar el riñon u otros cánceres.

Las células hematopoyéticas o HSC derivadas de las células inducidas también pueden introducirse en un sujeto para generar o reparar las células o tejido con excepción de las células sanguíneas, por ejemplo, músculo, vasos sanguíneos, o hueso.

Tales tratamientos pueden ser útiles para varios trastornos.

En algunos casos, las células inducidas se transfieren en un animal inmunocomprometido, por ejemplo, ratón SCID, y se deja para diferenciar. Las células trasplantadas pueden formar una mezcla de tipos de células diferenciadas y células tumorales. Los tipos de células diferenciadas específicas de interés pueden seleccionarse y purificarse fuera de las células tumorales por medio de marcadores de linaje específicos, por ejemplo, por distribución celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) u otro método de distribución, por ejemplo, distribución celular activada magnética (MACS, por sus siglas en inglés). Las células diferenciadas pueden trasplantarse después en un sujeto (por ejemplo, sujeto autólogo, sujeto apareado con HLA) para tratar una enfermedad o condición. La enfermedad o condición puede ser el trastorno hematopoyético, deficiencia endocrina, trastorno neurológico degenerativo, pérdida de cabello, u otra enfermedad o condición descrita en la presente.

Las células iPS pueden administrarse en cualquier medio fisiológicamente aceptable. Pueden proporcionarse solas o con un sustrato o matriz conveniente, por ejemplo para soportar su crecimiento y/u organización en el tejido al cual están siendo trasplantados. Generalmente, por lo menos las células 1x105 serán administradas, preferiblemente 1 x 106 o más. Las células pueden introducirse por inyección, catéter, o similares. Las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse por largos periodos de tiempo, siendo capaces de usarse al descongelarse. Si son congeladas, las células serán almacenadas generalmente en un 10% DMSO, 50% de FCS, 40% de RPMI medio 1640. Una vez que están descongeladas, las células pueden expandirse por el uso de los factores de crecimiento y/o células estromales asociadas con la proliferación y diferenciación celular progenitora.

Los kits pueden proporcionarse, donde el kit comprenderá la tinción de los reactivos que son suficientes para identificar la diferenciación de las células somáticas SSEA3* del sujeto descritas en la presente. Una combinación de interés puede incluir uno o más reactivos específicos para el marcador o combinación de marcadores de la presente invención, y puede incluir adicionalmente los reactivos de tinción específicos para otras proteínas que marquen las células SSEA3 del sujeto, por ejemplo Nanog. Los reactivos de tinción son preferiblemente anticuerpos, y pueden ser perceptiblemente etiquetados. Los kits también pueden incluir tubos, amortiguadores, etc., e instrucciones para uso.

EJEMPLOS Los ejemplos siguientes se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una completa descripción y conclusión de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no se desea limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni desean representar que los experimentos más abajo son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo cantidades, temperatura, etc.) pero algunos errores y desviaciones experimentales deberán explicarse. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio del peso, la temperatura es en grados centígrados, y la presión está en o aproximadamente atmosférica.

MATERIALES Y METODOS Aislamiento de las Líneas Celulares Fibroblasto Humanas Dérmicas Adultas Primarias (HUF, por sus siglas en inglés). Nueve líneas fibroblasto humanas dérmicas adultas primarias (HUF, por sus siglas en inglés) se derivaron y utilizaron en este estudio. El género y edad de los participantes fue como sigue: HUF1 hombre 28, HUF2 hombre 62, HUF3 mujer 30, HUF4 hombre 42, HUF5 mujer 46, HUF6 mujer 60, HUF7 hombre 35, HUF8 hombre 45 y HUF9 mujer 31. La aprobación para estas derivaciones somáticas y generación iPSC posterior se obtuvo del Stanford University Institutional Review Board and the Stanford University Stem Cell Research Oversight Committee, y el consentimiento informado se obtuvo de cada participante individual. Para cada línea de derivación de HUF, el donante adulto fue consentido y una biopsia con perforación de 4 mm de la piel en el brazo interno se obtuvo en la clínica Stanford Univeristy Dermatology Clínica por un dermatólogo calificado.

Las biopsias de piel fueron lavadas en una solución salina amortiguada con fosfato Dulbecco Ca/Mg-free (PBS, Invitrogen, Carlsbad, CA) y picadas en aproximadamente 12 piezas más pequeñas antes de ser sembradas en las placas de cultivo celular de 6 pozos revestidas con gelatina (Corning Enterprises, Corning, NY) que contienen medios de fibroblasto embrionario de ratón (MEF, por sus siglas en inglés) que consisten del Medio Egale Modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) complementadas con 10% de suero vacuno fetal (FBS, Invitrogen) y 100 iu/ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), y cultivadas a 37°C en una incubadora con 5% de C02. El medio de cultivo se cambió parcialmente cada dos días hasta que se observó la adherencia de la biopsia (generalmente el día 4-6) y después se cambió completamente cada dos días. Una vez que los fibroblastos emigraron fuera (generalmente el día 10-12) los fragmentos unidos de la biopsia y las células epiteliales conectadas se retiraron manualmente y los fibroblastos se dejaron expandir hasta una confluencia de 80-90%. Este cultivo primario se paso a través de una breve exposición en 0.05% de tripsina-EDTAS (Invitrogen) y sembrado en matraces de 175 cm recubiertos con gelatina con un medio de cultivo fresco. Estas células somáticas se cultivaron hasta que alcanzaron 90% de confluencia y después se congelaron en un medio de MEF complementado con 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, http://www.sigmaaldrich.com).

Cultivo Celular. Las células HUF se propagaron en el medio de MEF que consiste de DMEM (Invitrogen) complementadas con 10% FBS (Invitrogen) y 100 lU/ml Penicilina-Estreptomicina de (Invitrogen). Cuando las células alcanzaron aproximadamente la confluencia de 80-90%, se trataron brevemente con 0.05% de tripsina-EDTA (Invitrogen) y divididos en una relación 1:3 en un nuevo plato. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (células iPS, por sus siglas en inglés) y las células madre embrionarias humanas H9 (hESC, por sus siglas en inglés) se mantuvieron en el medio hESC que consiste DMEM/F12 complementadas con 20% del Sustituto de Suero Transgénico (KSR, Invitrogen), 2 mm de L-glutamina (Invitrogen), 0.1 mm de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), 0.1 mm de ß-mercaptoetanol (Millipore, Billerica, mA, http://www.chemicon.com), 100 lU/ml de Penicilina-Estreptomicina y 10 ng/ml del factor de crecimiento fibroblasto básico humano recombinante (ß-FGF, Invitrogen). Para pasar, las colonias individuales se cortaron simultáneamente y eliminaron de la placa utilizando una punta de pipeta de cristal (mitad-bucle) estilo hockey personalizada y transferida a un disco sembrado de MEF inactivado con mitomicina C (Sigma) que contiene medios de hESC frescos. Toda la investigación en este estudio se adhirió a la Academia Nacional de guías de Ciencias.

Imagen confocal. Las imágenes confocales se recolectaron con un microscopio confocal de exploración láser Zeiss LSM510 (Cari Zeiss, Jena, Alemania) con un objetivo de Plan Apocromático Zeiss 63' (NA 1.4). Para DAPI, la excitación fue en 405 nm, y se utilizó un filtro pasa banda 420-480 nm. Para Alexa 488, la excitación fue en 488 nm, y un filtro pasa banda de 505-530 nm se utilizó. Ambos detectores de orificios de alfiler se fijaron en 1 unidad Airy. El muestreo fue en 0.095 pm/pixel, 12-bits por pixel con un tiempo de permanencia del pixel de 2.18 s.

Tinción de la célula SSEA3 y distribución de la célula FACS. Aproximadamente 10 millones de células HUF1 se tripsinizaron a través de una exposición de 5 mn en 0.05% de tripsina-EDTA (Invitrogen), expuestas a los medios de MEF para inactivar a la tripsina y después se lavaron dos veces con PBS helado + 2% de suero de la cabra (PBS-G, por sus siglas en inglés). Después de que la primera lavada, las células se pasaron a través de un filtro de 40 micrómetros para retirar los grupos celulares. Por cada lavada, las células se centrifugaron durante 5 minutos en 80 g, el sobrenadante se elimino y las células se suspendieron nuevamente en PBS-G helado. Después de las lavadas, las células se suspendieron nuevamente en un tubo Eppendorf de 1.5 mi 1 mi de PBS-G helado que contiene 1:100 del anticuerpo SSEA3 (Millipore, mab4303) e incubado durante 45 minutos en oscuridad a 4°C con la oscilación apacible. Después de la unión del anticuerpo primario, las células se lavaron tres veces con PBS-G helado y después se suspendieron nuevamente en un tubo Eppendorf de 1.5 mi en 1 mi de PBS-G helado que contiene 1:200 de cabra anti-rata IgM conjugado con Alexa 488 (Invitrogen, A21212) e incubadas durante 45 minutos en obscuridad a 4°C con oscilación apacible. Después del anticuerpo secundario que une a las células fueron lavadas tres veces con PBS-G helado y después se suspendieron nuevamente en 2 mi de PBS-G helado, pasada nuevamente a través de un filtro de 40 micrómetros y después analizadas inmediatamente y distribuidas en un distribuidor de célula FACSAria (BD Biosciences, San José, CA) con la excitación de láser azul (488 nm). Los datos se analizaron, se realizo separación de doble-exclusión y las poblaciones relevantes se distribuyeron usando el software de BD FACSDiva (BD Biosciences). Las células separadas dentro del 10% superior para la expresión SSEA3 se distribuyeron en la población de "positivo a SSEA3" y las células separadas dentro del 10% inferior para la expresión SSEA3 se distribuyeron en la población de "negativa a SSEA3". Se permitió a ambas poblaciones adherirse, proliferarse y recuperarse durante 3 días antes de la transducción retroviral. Las células usadas para el análisis de inmunofluorescencia se fijaron inmediatamente después de la adherencia durante la noche eliminando las células muertas y no viables y las células usadas para el análisis transcriptivo se cultivaron durante 6 días antes del análisis.

Producción Retroviral, Infección y Generación de iPSC. Los plásmidos siguientes se obtuvieron de Addgene: pMXs-hOCT3/4 (17217), pMXs-hSOX2 (17218), pMXs-hKLF4 (17219), pMXs-hc- MYC (17220), pUMVC (8449) y pVSV-G (8454) (Addgene Inc, Cambridge, MA, USA). Las células 293FT (Invitrogen) se mantuvieron en los medios MEF complementados con 0.5 mg/ml de geneticina (Invitrogen) y cultivadas hasta alcanzar la confluencia de 90-95% antes de la transfección. Un día antes de la transfección, los medios de cultivo libres de antibiótico frescos se agregaron a las células. Para cada matraz de 175 cm, las células de 293FT transfectadas con 10 jg 10 del ADN del plásmido que lleva el transgen (OCT4, SOX2, KLF4 o cMYC) junto con 10 [ig del plásmido de envoltura pVSV-G y 15 pg del pUMVC del plásmido embalado. La transfección se facilitó por 120 ul de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y 15 mi de opti-MEM (Invitrogen) durante 6 horas y después sustituida con 18 mi del medio fresco de MEF sin antibióticos. Después de 2 días, el sobrenadante viral se recolectó girando y pasando a través de una unidad de filtrado Millex-HV 0.45 um (Millipore). Los sobrenadantes virales se concentraron a 100x por ultracentrifugación (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA, http://www.beckman.com) en 17,000 RPM durante 2.5 horas a 20°C y después suspendidas nuevamente durante la noche a 4°C en un medio de MEF. Esta acción viral concentrada 100x se utilizó ya sea fresca o congelada en partes alícuotas a -80C.

Un día antes de la transducción, las células HUF1 se sembraron en 105 células por pozo de una placa de 6 pozos recubierta con gelatina. Al día siguiente (considerado el día 0) los sobrenadantes retrovirales se concentraron deshelados y mezclados en una relación 20x OCT4, 10x SOX2, 10x KLF4, 10x cMYC, complementadas con medios frescos de MEF hasta 2 mi de volumen (por pozo) y 8 ng/ml de polipreno y después expuestas a las células HUF1 a 37°C y 5% de CO2. Después de 24 horas (día 1) el sobrenadante viral mezclado se eliminó, las células se lavaron dos veces con PBS y después cultivadas en medio fresco de MEF. El día 2 una segunda transducción se realizó en las mismas concentraciones virales. El día 3 el sobrenadante viral mezclado se retiro nuevamente, las células se lavaron dos veces con PBS y después se cultivaron en un medio fresco de MEF. 5 días post-transducción (día 5), las células se suspendieron nuevamente con tripsina, contadas y sembradas en discos pre-recubiertos de 10 cm con los alimentadores irradiados de MEF. 105 células HUF1 transducidas se sembraron por réplica biológica. Después de la incubación durante la noche, el medio MEF se sustituyó con el medio hESC, y después de esto, el medio se cambió diario o un día y otro no, como fuera necesario. Las colonias tipo hESC comenzaron a aparecer entre colonias de reserva alrededor de la post-transducción de 14 días. Las colonias se recogieron manualmente y transferidas a 12 ó 6 placas por pozo pre-recubiertas con los alimentadores MEF el día 21. Las colonias que continuaron expandiéndose y manteniendo su morfología tipo-hESC se pasaron adicionalmente; considerando que, aquellas que no pudieron expandirse y/o diferenciarse espontáneamente se desecharon.

Tinción de Fosfatasa Alcalina e Inmunofluorescencia. La tinción de la fosfatasa alcalina se realizó durante 30 minutos a temperatura ambiente en obscuridad usando el Kit 1 del Vector del Sustrato de Fosfatasa Alcalina Roja (Vector Laboratories, Burlingame, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la inmunofluorescencia, las células se fijaron a 4% de paraformaldehído/PBS durante 20 minutos, lavadas dos veces con PBS, y bloqueadas con 4% de suero de cabra en PBS durante 30 minutos, con todos los procedimientos realizados a temperatura ambiente. Para la tinción de Nanog, antes del bloqueo, las células se permeabilizaron con 1% de Triton-X100 durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, los anticuerpos primarios se agregaron a PBS e incubaron durante la noche a 4°C con agitación apacible. Las células se lavaron al día siguiente con PBS antes de que los anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes se agregaran e incubaran durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, las células se aclararon con PBS tres veces y DAPI se utilizó para etiquetar los núcleos. Los anticuerpos primarios y sus diluciones se utilizaron como sigue: SSEA3 (1:200, IgM, Millipore, mab4303), SSEA4 (1:200, IgG, Millipore, mab4304), TRA1 -60 (1:200, IgM, Millipore, mab4360), TRA1 -81 (1:200, IgM, Millipore, mab4381), Nanog (1:100, IgG, Abcam, Cambridge, mA, USA, ab21603). Los anticuerpos secundarios usados fueron: cabra anti-rata IgM conjugada con Alexa 594 (1:500 Invitrogen, A21213), cabra anti-rata IgM conjugada con Alexa 488 (1:500, Invitrogen, A21212), cabra antiratón IgM conjugado con Alexa 488 (1:500, Invitrogen, A21042), cabra anti-ratón conjugado IgG con Alexa 488 (1:500, Invitrogen, A11001), cabra anti-conejo IgG conjugado con Alexa 594 (1:500, Invitrogen, A1 1012).

Cariotipado. El cariotipado espectral (SKY, por sus siglas in inglés) se realizó de acuerdo con un protocolo previamente publicado (Nguyen HN and Reijo Pera R. (2008) Cold Spring Harb. Protoc. 5047). Brevemente, las células se trataron con 0.03 ug/ml de la solución KARYOMAX® COLCEMID® (Invitrogen) durante la noche, después tratadas con 0.05% tripsinas (Invitrogen) durante 5 minutos a 37°C para suspender nuevamente las células. La tripsina se inactivo agregando el medio de DMEM que contiene 10% de FBS. La solución hipotónica pre-calentada que contiene cantidades iguales de 0.4% de cloruro de potasio y 0.4% de citrato de sodio se agregó lentamente a las células para mejorar el abultamiento a 37°C durante 7 minutos. La solución de Carnoy (relación 3:1 de Metanol:Ácido Acético Glacial) se utilizó para fijar las células durante 30 min. Las células después se ubicaron en un portaobjetos pre-limpia (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) y la calidad de las propagaciones de la metafase se determinaron por microscopio de fase de contraste. Después de algunos días de envejecimiento a temperatura ambiente, el portaobjetos se hibridizó con pruebas del kit de ADN SKYPAINT™ para cromosomas humanos (Applied Spectral Imaging, Vista, Ca, USA) durante 2 días en una cámara humedecida a 37°C. Las propagaciones terminadas de la metafase se visualizaron y analizaron usando el sistema de imagen espectral SkyView (Imagen Espectral Aplicada).

Diferenciación in vitro para Combatir Cardiomiocitos. Para la formación del cuerpo embrioide, las células IPS se sembraron en las placas ultrabajas de unión (Corning) que contiene DMEM + 20% de FBS. Después de 8 días de crecimiento en suspensión, los agregados de la célula se transfirieron a los platos recubiertos con gelatina que contienen el mismo medio para permitir que las células se unan. El medio se cambió cada 2-3 días por hasta 3 semanas o hasta que se observó el combate de los cardiomiocitos.

Ensayo de Teratoma. Para cada injerto, 106 de las células iPS se cosecharon manualmente, lavaron y suspendieron nuevamente en un tubo de 1.5 mi que contiene 300 ul del medio hESC y después se inyectaron manualmente de forma subcutánea en los ratones hembras SCID (Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA, USA). Cualquier tumor visible 4-8 semanas después de la trasplantación se disecó y fijó durante la noche con 4% de la solución de paraformaldehído/PBS. Los tejidos después comprendieron parafina, seccionada, manchada con hematoxilina y eosina, y examinada para la presencia de representantes del tejido de tres capas germinales.

Extracción del ARN y Análisis de PCR en Tiempo Real. El ARN total se purificó usando el mini kit de RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 500 ng de ARN se utilizaron en la transcripción inversa con Superscript III (Invitrogen) y hexámeros aleatorios. 1 .25 µ? de cADN de cada muestra se mezcló con la mezcla principal que consiste de 5 Di de la mezcla de reacción x2 de células directas (Invitrogen), 2.5 µ? de la mezcla de 0.2X PPP (48 genes, Taqman/Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA), 0.5 µ? Platinos Taq (Invitrogen) y 0.75 µ? amortiguador TE. Las reacciones fueron pre-excitadas usando un termociclador (Applied Biosystems) bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo a 95°C, 10 minutos y 14 ciclos a 95°C, 15 segundos a 60°C, 4 minutos. Después las reacciones se diluyeron con el amortiguador TE a un volumen final de 20 µ?. 2.25 µ? de los productos de pre-amplificación se utilizaron en el análisis RCR en tiempo real corriente abajo usando el sistema Biomark Fluidigm (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA, USA) de acuerdo con la recomendación de la compañía. Los valores Ct para cada muestra y gen se normalizaron con relación a GAPDH, RPLPO y CTNNB1 por qBasePlus (Biogazelle, Zulte, Bélgica). El nivel de expresión del gen para cada muestra se comparó al promedio total para ese gene, a través de las tres diferentes subpoblaciones HUF1 (negativa a SSEA3, intermedia a SSEA3 y positiva a SSEA3-) para producir un valor relativo de la expresión del gen.

Análisis Estadístico. El análisis de comparaciones de variación estadístico se realizó usando el software Statview (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) con la significación estadística fija en 0.05.

RESULTADOS Derivamos una línea de fibroblasto de una biopsia de piel de un hombre adulto sano (HUF1) (figura 1A) y se utilizo inmunohistoquímica para caracterizar la expresión de los marcadores de la superficie celular asociada comúnmente a las células madre pluripotentes (figuras 1B, C y D). Inesperadamente, observamos que, incluso antes de la reprogramación, la población celular HUF1 incluyó células que fueron heterogéneas para la expresión del antígeno embrionario específico etapa 3 (SSEA3; figura 1B). SSEA3 es un glicosfingolipido de la superficie celular considerado generalmente como un marcador embrionario/pluripotecia (Kannagi R, y colaboradores (1983) Embo J. 2:2355-2361; Enver T, y colaboradores (2005) Human Molecular Henetics 14:3129). Las imágenes de inmunofluorescencia de SSEA3 y fase de contraste subyacente revelaron que la expresión SSEA3 se detectó a través de la superficie celular completa (figura 1 E) y usando microscopía confocal observamos que la expresión SSEA3 se localizó principalmente en la membrana celular (figura 1F). Las regiones adicionales pequeñas y localizadas de la fluorescencia SSEA3 también se detectaron alrededor de la región perinuclear, reflejando posiblemente el procesamiento y embalado intracelulares de SSEA3 en los cuerpos reticulares endoplásmicos perinucleares y/o Golgi (figura 1F). Notablemente, en controles positivos, la expresión superficial celular fuerte de SSEA3 se observó en células madre embrionarias humanas H9 (hESCc, por sus siglas en ingles) (figura 1G) y no se observó ninguna expresión en los controles negativos (figura 1 H).

Examinamos después si la expresión de SSEA3 en un subconjunto de fibroblastos fue específica para HUF1 o a una observación más general. Ocho líneas de fibroblasto humanas adultas primarias adicionales se derivaron de las biopsias de la piel e ¡nmunotinción. Observamos que las ocho líneas contuvieron una subpoblación de células que fueron positivas para SSEA3 (figura 2A). El análisis del distribuidor celular activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) de las células HUF1 manchadas con el complejo del anticuerpo SSEA3/488, revelaron una subpoblación de células más grande con poco o nada de la expresión SSEA3 y una subpoblación más pequeña con la expresión SSEA3 detectable (figura 2B). Posteriormente, aislamos (a través de FACS) y cultivamos el 10% superior y 10% inferior de las células fluorescentes SSEA3/488 como nuestro positivo a SSEA3 y las poblaciones negativas respectivamente (figura 2B). El análisis de inmunofluorescencia de las dos poblaciones, después de la adherencia durante la noche para excluir el análisis de las células no viables, reveló que >97% de la población de positivo a SSEA3 expresó la fluorescencia detectable de SSEA3/488 y 0% de la población negativa a SSEA3 expresaron la fluorescencia SSEA3/488 detectable (figura 2C), demostrando que el proceso de distribución de la célula activada por fluorescencia puede purificar subpoblaciones viables de células a partir de una población somática heterogénea. Estas subpoblaciones se utilizaron después para reprogramar a las células IPS.

El trabajo de reprogramación anterior demostró que podríamos reprogramar la población entera, sin distribuir de las células somáticas HUF1 usando los vectores retroviral que expresan OCT4, SOX2, KLF4 y c YC para generar células iPS que expresan los mismos marcadores de pluripotencia que el control H9 ESCs (figura 3A). Las células reprogramadas poseyeron un cariotipo normal (figura 3B) y diferenciadas in vitro en el combate de cardiomiocitos, así como, en los representantes de las tres capas germinales in vivo (figura 3C).

Tradujimos a nuestras poblaciones positivas a SSEA3 y negativo a SSEA3 con los mismos vectores retrovirales, bajo condiciones experimentales idénticas, y sembramos las células transducidas en fibroblastos embrionarios de ratón inactivo (MEFs, por sus siglas en inglés). Después de tres semanas de cultivo bajo condiciones estándares de hESC, las placas se examinaron en un análisis doble ciego por tres biólogos hESC independientes para la formación de la colonia iPSC. Las colonias con morfología iPSC se recolectaron y expandieron. Observamos que las tres réplicas biológicas con las células negativas a SSEA3 transducidas formaron muchas colonias grandes de reserva (10-27 por réplica, figura 4A) pero ninguna de las colonias iPSC emergieron; en cambio, las tres réplicas biológicas con las células positivas a SSEA3 transducidas resultaron en la formación de colonias iPSC (4-5 por réplica, fig. 4B) pero colonias de reserva no muy grandes (0-1 por réplica, figura 1). La caracterización adicional de las líneas celulares derivadas de las colonias tipo ¡PSC reveló que poseyeron morfología tipo hESC, creciendo como colonias planas con las relaciones núcleo-citoplásmicas grandes, las fronteras definidas y nucléolos prominentes (figura 4C).

Cuando 5 líneas fueron expandidas y caracterizadas adicionalmente, toda la expresión demostrada de los marcadores esenciales de pluripotencia expresados por hESCs, que incluyeron: fosfatasa fosfatasa alcalina, Nanog, SSEA3, SSEA4, TRA160 y TRA181 (figura 5A). Las células iPS seleccionadas de SSEA3 también demostraron un cariotipo masculino normal (46, XY) (figura 5B), capacidad de diferenciar en cardiomiocitos de combate funcional, así como, representantes de las tres capas germinales in vivo (figura 5C). Mayormente importante, ya que no se observó formación o línea de derivación de la colonia iPSC de las células negativas a SSEA3 transducidas, esto sugiere que estas células posean potencial significativamente más bajo o incluso no lo poseen con respecto a la a las células de expresión SSEA3 (Tabla 1). Adicionalmente, un enriquecimiento de diez veces de los fibroblastos primarios que expresan fuertemente SSEA3 resultó en una eficacia significativamente mayor (ocho veces de aumento) de la línea de derivación de iPSC comparada con el índice de derivación del control (p<0.05, tabla 1).

Tabla 1. Derivación de células iPS humanas de los fibroblastos dérmicos primarios distribuidos de SSEA3 Examinamos después la expresión de los genes que pudieron potencialmente conferir la reprogramación mejorada a la población positiva a SSEA3, incluyendo Nanog (Silva J, y colaboradores (2006) Nature 441:997-1001), SalW (Wong CC, y colaboradores (2008) PLoS ONE 3:e1955) y hTert (Park IH, y colaboradores (2008) Nature 451:141-146) así como varios genes que mantuvieron el alojamiento de control (Gapdh, Rplpo y Ctnnbi). Además de las poblaciones de células negativas y positivas a SSEA3, que representaron el 10% superior y 10% inferior de las células de expresión SSEA3 respectivamente, también incluimos las células de expresión SSEA3, que representaron el 80% restante del total de la población de la célula HUF1. Tres réplicas biológicas para cada una de las tres subpoblaciones se analizaron. Mientras que no se observó ninguna diferencia significativa en la expresión del gen para Sall4, hTert o los genes constitutivos (figura 6 y tabla 2), el análisis reveló que la expresión de Nanog aumentó significativamente (p<0.05) de la población de la célula positiva a SSEA3 comparada al intermedio de SSEA3 o a la población de negativa a SSEA3 (figura 6 y tabla 2).

Tabla 2. Análisis transcripcional de positivo a SSEA3 v de las células HUF1 neqativas Las células se distribuyeron para SSEA3 y tres poblaciones analizaron 6 días en cultivo.

Las células fueron tripsinizadas, ARN extraído, cADN hecho, pre- excitadas y fuidigm analizado.

Etiqueta de la expresión del gen de la Cantidad Relativa Normalizada Calibrada (CNRQ, por sus siglas en inglés), obtenida a través de la normalización con CTNB1, GAPDH y RPLPO Réplicas biológicas positivas a SSEA3 (Rep) obtenidas del 10% superior de las células de expresión SSEA3 Réplicas de interm-SSEA3 (intermedio) obtenidas de la población intermedia a SSEA3.

Réplicas biológicas negativas a SSEA3 obtenidas del 10% superior de las células de expresión SSEA3 Muestra de HiPS 1 A-SSEA3 sel. representa células iPS humanas derivadas de las células HUF1 positivas a SSEA3 Muestra de control HiPS1 representa células iPS humanas derivadas de las células HUF1 no distribuidas.

DISCUSIÓN En este estudio, observamos inesperadamente que SSEA3, un marcador superficial celular normalmente asociado con las células pluripotentes, nos expresaron fuertemente en una subpoblación de células derivadas de una biopsia de fibroblasto dérmico humano primario. Las células positivas a SSEA3 aparecían indistinguibles, morfológicamente, de los fibroblastos negativos a SSEA3 (figura 2C). La expresión del antígeno SSEA3 no se considera un marcador de otras células madre multipotentes, por ejemplo células madre adultas mesenquimales o epidérmicas (Deans RJ y Moseley AB. (2000) Exp. Hematol 28:875-884; Lavker RM y Sun TT (2000) Proc. Nati. Acad Sci USA 97:13473-13475).

Varios estudios recientes han demostrado que las células iPS humanas pueden generarse sin la integración permanente de factores genéticos en la cromatina de la célula reprogramada (Kim D, y colaboradores (2009) Cell Stem Cell 4:472-476; Soldner F, y colaboradores (2009) Cell 136:964-977; Kaji K, Norrby K, Paca A, y colaboradores (2009) Nature 458:771-775; Woltjen K, y colaboradores (2009) Nature 458:766-770; Yu J, y colaboradores (2009) Science 324:797-801. Mientras que estas células iPS humanas libres de integración se consideran grandes promesas futuras para terapias basadas en las células especificas del paciente (Byrne JA. (2008) Human Mol. Gen 17:R37-41), la eficacia de reprogramación normalmente es muy baja. Los métodos para mejorar la eficacia de reprogramación aumentarán significativamente la viabilidad de este método, especialmente para los tipos de célula que son difíciles de reprogramar, tales como fibroblastos humanos adultos primarios usados en este estudio. Nuestra eficacia de la derivación de las iPSC de control usando la línea HUF1 fue muy baja, con únicamente 1 línea iPSC derivada a partir de 200,000 células. Sin embargo, en este estudio hemos demostrado que una purificación de diez veces de las células de expresión SSEA3 podría aumentar la eficacia de la reprogramación ocho veces con relación a las células sin distribución y a un grado mucho mayor con relación a las células negativas a SSEA. De hecho, además de identificar una población de la célula con eficacia de reprogramación mejorada, también identificamos una población negativa SSEA3 con ya sea una eficiencia de reprogramación significativamente reducida o sin capacidad de reprogramación. El análisis de comparación entre las poblaciones positivas a y negativas a SSEA3 puede ayudarnos a aclarar los mecanismos de reprogramación d entendimiento carente actualmente.

Nuestro análisis transcriptivo de las poblaciones negativas y positivas a SSEA3 revelaron una expresión de Nanog significativamente aumentada en la población positiva a SSEA3 (p<0.05). Como la expresión Nanog aumentó se ha demostrado que mejorar la eficiencia de reprogramación (Silva J, y colaboradores (2006) Nature 441:997-1001), esto sugiere que Nanog puede desempeñar una función en la reprogramación diferencial observada. Sin embargo, deberá observarse que el nivel de expresión de Nanog es miles de veces más arriba en hESCs y células iPS completamente reprogramadas que en las células HUF1 de expresión SSEA3, hacen que probablemente otros factores pueden también desempeñar una función en la reprogramación diferencial observada. Los estudios futuros usando la proliferación epigenética y transcripcional global deberán ayudar en la identificación adicional de diferencias entre las subpoblaciones negativa a y positiva a SSEA3, y pueden ayudar a aclarar los mecanismos de reprogramación.

CONCLUSION En conclusión, hemos descrito la identificación y aislamiento de una subpoblación de fibroblastos dérmicos humanos que expresan el marcador de puripotencia SSEA3, nosotros hemos demostrado una eficacia mejorada de la generación de células iPS a partir de estas células que expresan SSEA3 y no hemos observado ninguna generación de iPSC a partir de las de no expresión SSEA3, y hemos revelado la expresión Nanog significativamente aumentada en los fibroblastos de expresión de SSEA3, sugiriendo una posible explicación mecánica para la reprogramación diferenciada. Este estudio es el primero para identificar un marcador de pluripotencia en una población heterogénea de fibroblastos dérmicos humanos, para aislar una subpoblación de células que tienen una propensión significativamente creciente a reprogramar la pluripotencia y a identificar un mecanismo para explicar esta reprogramación diferenciada.

El precedente ilustra simplemente los principios de la invención. Será apreciado que los expertos en técnica podrán idear varios arreglos que, aunque no están descritos explícitamente o mostrados en la presente, incorporan los principios de la invención y se incluyen dentro de su alcance y espíritu. Además, todos los ejemplos y lenguaje condicional enumerados en la presente se desean principalmente para ayudar al lector en la comprensión de los principios de la invención y de los conceptos contribuidos por los inventores para fomentar la técnica, y deberán interpretarse sin limitación a tales ejemplos y condiciones específicamente numeradas. Por otra parte, todas las declaraciones en la presente que mencionan principios, aspectos, y modalidades de la invención así como ejemplos específicos de los mismos, se desean para comprender los equivalentes estructurales y funcionales de los mismos. Adicionalmente, se desea que. tales equivalentes incluyan ambos, equivalentes actuales conocidos y equivalentes desarrollados en el futuro, es decir, cualquier elemento desarrollado que realice la misma función, sin importar la estructura. El alcance de la presente invención, por lo tanto, no se desea para limitarse a las modalidades ejemplares demostradas y descritas en la presente. Más bien, el alcance y espíritu de la presente invención se comprende por las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción de células madre pluripotentes inducidas (células iPS, por sus siglas en inglés), que comprende: poner en contacto una población inicial de células somáticas con un reactivo que reconoce específicamente un marcador asociado con la pluripotencia; seleccionar las células que expresan al marcador asociado con la pluripotencia para proporcionar una población de células seleccionadas; y poner en contacto con la población de células seleccionada con un coctel de factores de reprogramación, en donde las células seleccionadas se inducen para volverse células madre pluripotentes inducidas (células IPS, por sus siglas en inglés).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la eficacia de la reprogramación en la población de la célula seleccionada es por lo menos de aproximadamente dos veces la eficacia de programación en la población inicial.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la eficacia de la reprogramación en la población de la célula seleccionada es por lo menos de aproximadamente cinco veces la eficacia de la programación en la población inicial.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el marcador asociado con la pluripotencia es SSEA3.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde las células somáticas son fibroblastos humanos.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde los fibroblastos humanos son fibroblastos dérmicos.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la población inicial es un cultivo in vitro primario.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la selección comprende el aislamiento de células por la citometría de flujo.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los factores de reprogramación se proporcionan como ácidos nucleicos los cuales comprenden partículas virales que codifican los factores de reprogramación.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, los factores de reprogramación se proporcionan como polipéptidos no integrados, actuación nuclear de los factores de reprogramación.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el coctel de los factores de reprogramación comprende los factores seleccionados del grupo que consiste de OCT4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, y Lin28.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el coctel de factores de reprogramación comprende OCT4, SOX2, KLF4 y cMYC.

13. Un método de enriquecimiento para una población de células somáticas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células madre pluripotentes (células iPS, por sus siglas en inglés), que comprende: Poner en contacto una población inicial de células somáticas con un reactivo que reconoce específicamente un marcador asociado con la pluripotencia; selección de células que expresan el marcador asociado con la pluripotencia para proporcionar una población de células somáticas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células iPS.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el marcador asociado a la pluripotencia es SSEA3.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde las células somáticas son fibroblastos humanos.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde los fibroblastos humanos son fibroblastos dérmicos.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la población inicial es un cultivo in vitro primario.

18. Una composición sustancialmente pura de las células somáticas que tienen potencial mejorado para llegar a ser células iPS preparadas por el método de acuerdo con la reivindicación 13.