MX2012000667A

MX2012000667A - Composiciones de proteina f de virus sincitial respiratorio (rsv) y metodos para producir las mismas.

Info

Publication number: MX2012000667A
Application number: MX2012000667A
Authority: MX
Inventors: Kurt Swanson; Philip R Dormitzer
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-06-01
Also published as: JP2015145422A; CN105214080A; AR077757A1; US20220340645A1; US20230357370A1; US20240034773A1; CA2768186A1; HRP20220756T1; EP3988115A2; EP4183412A1; CN102639147B; WO2011008974A3; US20220213177A1; CN102639147A; PL3178490T3; US11655284B2; SI3178490T1; ES2991844T3; ES2563730T3; US20230303669A1

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden proteína F de RSV, a métodos para preparar composiciones que contienen polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, y a ciertas proteínas F de RSV, manejadas, y ácidos nucleicos que codifican para las proteínas F de RSV, manejadas. Las composiciones preparadas usando los métodos pueden contener polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV en una forma y conformación deseada, individual o predominante. La invención también se refiere a métodos para inducir una respuesta inmunitaria a F de RSV.

Description

COMPOSICIONES DE PROTEINA F DE VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO (RSV) Y METODOS PARA PRODUCIR LAS MISMAS Antecedentes de la Invención El virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) es un virus de ARN, de hebra negativa, no segmentado, envuelto, en la familia Paramyxoviridae, género Pneumovirus . Es la causa más común de bronquitis y neumonía entre niños en su primer año de vida. El RSV también provoca infecciones repetitivas que incluyen enfermedad severa del tracto respiratorio inferior, que se presenta en cualquier edad, especialmente entre las personas de edad avanzada o aquellos con sistemas cardiacos, pulmonares o inmunitarios comprometidos .

Para infectar una célula hospedadora, los paramixovirus tal como RSV, como otros virus envueltos tal como virus de influenza y VIH, requieren la fusión de la membrana viral con la membrana de una célula hospedadora. Para el RSV, la proteína de fusión conservada (RSV-F) se fusiona a las membranas viral y celular por acoplamiento del repliegue proteico irreversible con yuxtaposición de las membranas. En los modelos actuales basados en estudios de paramixovirus, la proteína F de RSV se pliega inicialmente en una conformación de "pre- fusión" metaestable. Durante la entrada celular, la conformación de pre-fusión sufre REF . : 226931 replegado y cambios conformacionales a su conformación de "post- fusión" estable.

La proteína F de RSV se traduce de ARNm en una proteína de aproximadamente 574 aminoácidos designada F0. El procesamiento post-traduccional de F0 incluye la remoción de un péptido de señal N-terminal por una peptidasa de señal en el retículo endoplásmico . También, F0 se escinde en dos sitios (aproximadamente 109/110 y aproximadamente 136/137) por proteasas celulares (en particular furina) en el transGolgi . Esta escisión da por resultado la remoción de una secuencia de intervención corta y genera dos subunidades designadas Fx (~50 kDa; C-terminal; aproximadamente los residuos 137-574) y F2 (-20 kDa; N-terminal; aproximadamente los residuos 1-109) que permanecen asociadas entre sí. Fi contiene un péptido de fusión, hidrófobo en su N-términal y también dos regiones de repetición heptad antipáticas (HRA y HRB) . La HRA está cerca del péptido de fusión y la HRB está cerca del dominio transmembrana. Se montan tres heterodímeros Fi-F2 como heterotrlmeros de Fx-F2 en el virión.

Actualmente no está disponible, pero se desea una vacuna contra infección de RSV. Un planteamiento potencial para producir una vacuna es una vacuna de subunidades basada en proteína F de RSV, purificada. Sin embargo, para este planteamiento es deseable que la proteína F de RSV, purificada, esté en una forma individual y una conformación que sea estable con el paso del tiempo, consistente entre lotes de vacuna, y convenientemente purificada.

La proteína F de RSV se puede truncar, por ejemplo, por supresión del dominio transmembrana y la extremidad citoplásmica, para permitir su expresión como un ectodominio, que puede ser soluble. Además, aunque la proteína F de RSV se traduce inicialmente como un monómero, los monómeros se escinden y montan en trímeros. Cuando la proteína F de RSV está en la forma de trímeros escindidos, se expone el péptido de fusión, hidrófobo. Los péptidos de fusión, hidrófobos, expuestos en diferentes trímeros, por ejemplo, trímeros de ecto-dominio solubles, pueden asociarse entre sí, dando por resultado la formación de rosetones. Los péptidos de fusión hidrófobos también pueden asociarse con lípidos y lipoproteínas , por ejemplo de células que se usan para expresar la proteína F de RSV, soluble, recombinante . Debido a la complejidad del procesamiento, estructura y replegado de la proteína F de RSV, son difíciles de obtener preparaciones inmunogénicas, homogéneas, purificadas.

De esta manera, existe la necesidad de composiciones mejoradas de proteína F de RSV y de métodos para producir composiciones de proteína F de RSV.

Breve Descripción de la Invención La invención se refiere a composiciones inmunogénicas que contienen uno o más polipéptidos F de RSV, y a ciertas proteínas F de RSV, manejas, y ácidos nucleicos que codifican para las proteínas F de RSV, manejadas.

En un aspecto, la proteína F de RSV es soluble. Por ejemplo, la proteína F de RSV puede tener la región transmembrana y las extremidad citoplásmica, suprimidas. En algunos aspectos, la F de RSV soluble contiene una o más de 1) una o más mutaciones en uno o ambos sitios de escisión de furina, 2) una o más mutaciones al péptido de fusión, 3) una o más mutaciones al ligador p27, 4) contiene una secuencia de oligomerización adicionada, y 5) contiene una secuencia de aminoácidos adicionada que proporciona un sitio de escisión de proteasa. En aspectos adicionales o alternativos, la proteína F de RSV es un monómero, un trímero, o una combinación de monómeros y trímeros. El trímero se puede monodispersar o estar en la forma de un rosetón. En aspectos adicionales o alternativos adicionales, la proteína F de RSV puede estar en una conformación de prefusión, una conformación intermedia o una conformación de post-fusión.

En un aspecto, la composición inmunogénica contiene uno o más polipéptidos F de virus sincitial respiratorio (F de RSV) en los cuales se reemplazan los aminoácidos 100-150 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 92. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En otro aspecto, la composición inmunogénica contiene un polipéptido F de RSV en el cual se reemplazan los aminoácidos 100-150 del F de RSV con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En aún otro aspecto, la composición inmunogénica contiene un polipéptido F de RSV en el cual se reemplazan los aminoácidos 100-150 del F de RSV con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, o SEQ ID NO: 92. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En otro aspecto, la composición inmunogénica contiene un polipéptido F de RSV en el cual se reemplazan los aminoácidos 100-150 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En otro aspecto, la composición inmunogénica contiene un polipéptido F de RSV en el cual F de RSV contiene los aminoácidos 23-99 y 151-524 de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En un aspecto, la composición inmunogénica contiene un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: :63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: :67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: : 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: :89, y SEQ ID NO : 93 . En algunas modalidades, se omite el péptido de señal y/o la marca HIS. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En un aspecto, la composición inmunogénica contiene SEQ ID NO: 68, o de manera alternativa, SEQ ID NO: 68 en el cual se omite el péptido de señal, y opcionalmente la marca HIS .

En otro aspecto, la composición inmunogénica contiene un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 71, y cualquiera de las secuencias anteriores en las cuales se omite el péptido de señal, y opcionalmente la marca HIS. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En modalidades preferidas, la composición inmunogénica incluirá un adyuvante. El adyuvante es preferentemente una sal de aluminio, una emulsión de escualeno en agua (tal como MF59) , un compuesto de benzonaftiridina, un compuesto de fosfolípido (tal como E6020) , un inmunopotenciador de molécula pequeña o una combinación de cualquiera de dos o más de cualquiera de lo anterior .

Aún otro aspecto de la invención incluye polipéptidos F de RSV, recombinantes . El F de RSV puede estar en la forma de un monómero, trímero, rosetón de trímeros, o combinación de monómeros y trímeros . El polipéptido recombinante puede incluir un dominio heterólogo de oligomerización, un epítopo o un péptido de señal. El dominio heterólogo de oligomerización es preferentemente un dominio de trimerización de hemaglutinina de influenza, de espiga de SARS, o de HIV gp41, NadA, GCN4 modificado, o ATCasa.

En un aspecto, el polipéptido F de RSV, recombinante tiene los aminoácidos 100-150 reemplazados con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 92. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En otro aspecto, el polipéptido F de RSV, recombinante tiene los aminoácidos 100-150 del F de RSV reemplazados con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En otro aspecto, el polipéptido F de RSV recombinante tiene los aminoácidos 100-150 del F de RSV remplazados con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, o SEQ ID NO: 92. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En aún otro aspecto, el polipéptido F de RSV recombinante tiene los aminoácidos 100-150 del F de RSV reemplazados con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

En un aspecto, el polipéptido recombinante se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: :52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: :57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: :59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: :61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: :63, SEQ ID NO: :64, SEQ ID NO: :65, SEQ ID NO: :66, SEQ ID NO: :67, SEQ ID NO: :69, SEQ ID NO: :70, SEQ ID NO: :85, SEQ ID NO: : 86, SEQ ID NO: :87, SEQ ID NO: : 88, SEQ ID NO: 89, y SEQ : ID NO: 93, y cualquiera de las combinaciones de estas. Opcionalmente, se omite el péptido de señal y/o la marca HIS . En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es soluble (por ejemplo, un ectodominio) .

Aún otro aspecto incluye ácidos nucleicos que codifican para cualquiera de los polipéptidos anteriores. El ácido nucleico puede ser una molécula de ARN auto-replicante.

Otro aspecto de la invención es una composición inmunogénica que comprende ARN auto-replicante que codifica para un polipéptido F de RSV. La composición inmunogénica puede incluir un sistema de distribución.

Otro aspecto de la invención incluye métodos para inducir una respuesta inmunitaria a F de RSV al administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas .

La invención se refiere a métodos para preparar composiciones y a composiciones que contienen la proteína F de RSV, tal como polipéptidos de ecto-dominio F de RSV, v solubles, incluyendo composiciones inmunogénicas . Los polipéptidos de ectodominio F de RSV pueden estar en una forma individual, tal como monómeros no escindidos, trímeros no escindidos, trímeros escindidos o rosetones de trímeros escindidos. Los polipéptidos de ectodominio F de RSV también pueden estar en dos o más formas, por ejemplo dos o más formas que existen en equilibrio, tal como el equilibrio entre monómeros no escindidos y trímeros no escindidos. La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, la presencia de una forma deseada individual de F de RSV en una composición inmunogénica proporciona una respuesta inmunitaria más predecible cuando la composición se administra a un sujeto, y estabilidad más consistente y otras características físicas y químicas cuando se formula en una vacuna.

En un aspecto, la invención es un método para producir una composición que comprende polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. El método incluye a) proporcionar polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen uno o más sitios de escisión de proteasa que, cuando se escinden, producen fragmentos Fi y F2, y b) escindir los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV con una proteasa o proteasas que reconocen el sitio o sitios de escisión de proteasa. En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV contienen sitios alterados de escisión de furina, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de RSV se segregan de una célula hospedadora que los produce no escindidos en una posición del aminoácidos ,101 al aminoácidos 161, (por ejemplo, no escindido en los sitios de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 131-136) . En algunas modalidades, los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV proporcionados en a) se purifican.

Los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína de F de RSV proporcionados en a) pueden comprender un péptido de fusión intacto o un péptido de fusión alterado (por ejemplo, un péptido de fusión suprimido o un péptido de fusión mutado) . Cuando los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV proporcionados en a) contienen un péptido de fusión intacto, la escisión en el paso b) da por resultado la formación de rosetones de trímeros . Cuando los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV proporcionados en a) comprenden un péptido de fusión alterado, la escisión en el paso b) da por resultado la formación de trímeros.

El método puede comprender además el paso opcional de purificar los rosetones o trímeros producidos al escindir los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV. En modalidades preferidas, los polipéptidos escindidos de ectodominio de proteína F de RSV producidos de acuerdo al método están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas .

En otro aspecto, la invención es un método para producir una composición que comprende monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV. El método incluye a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV; y b) purificar del material biológico los monómeros o trímeros de polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV. En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV contienen sitios de escisión de furina, alterados, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de RSV se segregan de una célula hospedadora que los produce no escindidos en una posición del aminoácido 101 al aminoácidos 161, (por ejemplo, no escindido en los sitios de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 131-136) . En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV contienen adicionalmente sitio alterados de escisión de tripsina, y los polipéptidos de ectodominio de proteína F de RSV no escindidos por tripsina en un sitio entre el aminoácido 101 y el aminoácido 161. En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV contienen además un péptido de fusión, alterado .

En algunas modalidades, los trímeros de polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV se purifican. En otras modalidades, se purifican los monómeros de polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV. En aún otras modalidades, se purifica una mezcla de monómeros y trímeros no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV, que puede estar en un equilibrio dinámico. En modalidades preferidas, los polipéptidos no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV producidos de acuerdo al método están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas .

En otro aspecto, la invención es un método para producir una composición que comprende monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos escindidos de ectodominio de proteína F de RSV. El método incluya a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos escindidos de ectodominio de proteína F de RSV que contienen un péptido alterado de fusión; y b) purificar polipéptidos escindidos de ectodominio de proteína F de RSV del material biológico.

En algunas modalidades, se purifican trímeros de polipéptidos escindidos de ectodominio de proteína F de RSV.

En otras modalidades, se purifican monómeros de polipéptidos escindidos de ectodominio de proteína F de RSV. En aún otras modalidades, se purifica una mezcla de monómeros y trímeros de escindidos de ectodominio de proteína F de RSV, que pueden estar en un equilibrio dinámico. En modalidades preferidas, los polipéptidos escindidos de ectodominio de proteína F de RSV producidos de acuerdo al método están de manera sustancialmente preferente libres de lípidos de lipoproteínas . En aún otra modalidad, se purifica un trímero escindido de ectodominio de proteína F de RSV que contiene un péptido alterado de fusión.

En otros aspectos, la invención proporciona composiciones, incluyendo composiciones inmunogénicas , producidas usando los métodos de la invención.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1C muestran la vista esquemática del F de RSV tipo silvestre (Figura 1A) y de una construcción de ectodominio en la cual se han removido el dominio transmembrana y la extremidad citoplásmica y se ha adicionado una marca HIS6 opcional a C-términal (Figura IB) . Por claridad, se altera la numeración de los residuos al F de RSV cepa A2 tipo silvestre que empieza en el péptido de señal N-terminal y no se altera en construcciones que contienen supresiones de aminoácidos. Marcada en la vista esquemática está la secuencia de señal o péptido de señal (sp, por sus siglas en inglés) . La Figura 1A es una vista esquemática de la proteína F de RSV que muestra la secuencia de señal o el péptido de señal (SP) , región ligadora p27, péptido de fusión (FP, por sus siglas en inglés) , dominio HRA (HRA) , dominio HRB (HRB) , región transmembrana (TM) y extremidad citoplásmica (CT) . Pueden variar las uniones C-terminales del ectodominio. La Figura IB es una vista esquemática general de la construcción de ectodominio F de RSV que representa las características compartidas con la vista esquemática en la Figura 1A y que incluye una marca HISe opcional (marca HIS) . Los sitios de escisión de furina están presentes en las posiciones 109/110 y 136/137 de aminoácidos. La Figura 1C también muestra la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 100-150 de F de RSV (tipo silvestre) (SEQ ID NO: 108) y varias proteínas (Furmt-SEQ ID NO:3; Furdel-SEQ ID N0:4; Furx-SEQ ID NO : 6 ; Furx R113Q, K123N, K124N-SEQ ID NO : 5 ; Furx R113Q, K123Q, K124Q-SEQ ID NO: 92; Delp21 furx-SEQ ID NO: 7; Delp23 furx- SEQ ID NO: 8; Delp23 furdel-SEQ ID NO: 9; N-términal Furin-SEQ ID NO: 10; C-términal Furin-SEQ ID NO: 11; Supresión 1 de Péptido de Fusión- SEQ ID NO: 12; y Factor Xa-SEQ ID NO: 13) en las cuales se mutaron o suprimieron uno o ambos sitios de escisión de furina y/o región de péptido de fusión. En la Figura 1C, el símbolo "-" indica que se suprimió el aminoácido en esa posición.

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos del carboxi-término de la posición 488 de aminoácido al inicio de la región TM de F de RSV (tipo silvestre) (SEQ ID NO: 94) y varias proteínas (SEQ ID NOS: 95-100) que contiene sitios adicionados de escisión de proteasa. En la Figura 2, el símbolo "-" indica que no hay aminoácido en esa posición.

La Figura 3 es un cromatograma e imagen de un gel de electroforesis que muestra la purificación de monómeros F de RSV (3) usando cromatografía de exclusión de tamaño.

Las Figuras 4A-4F muestran la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 101) del plásmido que codifica para la molécula de ARN auto-replicante de pT7-TC83R-FL . RSVF (A317) que codifica para la glicoproteína F de virus sincitial respiratorio (RSV-F) . La secuencia de nucleótidos que codifica para RSV-F está subrayada.

La Figura 5 es una alineación de las secuencias de aminoácidos de proteínas F de varias cepas de RSV. La alineación se preparó usando el algoritmo descrito por Corpet, Nucleic Acids Research, 1998, 16 (22) : 10881-10890, usando parámetros por omisión (tabla de comparación de símbolo Blossum 62, penalidad de abertura de separación: 12, penalidad de extensión de separación: A2 , proteína F de la cepa A2 (número de acceso AF035006) (SEQ ID NO:102); proteína CP52 de de la cepa CP52 (número de acceso AF013255) (SEQ ID NO:103); proteína B, F de la cepa B (número de acceso AF013254) (SEQ ID NO: 104); proteína F, larga de la cepa larga (número de acceso AY911262) cepa (SEQ ID NO:105), y cepa 18537, proteína F de la cepa 18537 (número de acceso Swiss Prot P13843) (SEQ ID NO:106). También se muestra un consenso de secuencias de proteína F (SEQ ID NO: 107).

Las Figuras 6A-6D muestra regiones pertinentes de cromatogramas de exclusión de tamaño (SEC) de purificaciones de antígenos F de RSV seleccionados. El pico principal que contiene el antígeno indicado se indica por un asterisco con el tiempo de retención de la columna Superdex P200 16/60 (GE Healthcare) se indica en mililitros. En una columna calibrada, los tiempos de retención aproximados de 47 mis, 65 mis y 77 mis corresponden al volumen hueco de columna, el tiempo del trímero de F de RSV y la retención del monómero F de RSV, respectivamente. En la Figura 6A, la construcción Delp23 Furdel (??23 Furdel) no escindida se purifica del pico de monómero en aproximadamente 77 mis. Cuando el antígeno Delp23 Furdel RSV-F no escindido se trata con tripsina, la proteína puede formar rosetones, que ahora migran en SEC en el volumen hueco a aproximadamente 47 mis (Figura 6B) . La especie de trímero escindida de la supresión de péptido de fusión F de RSV se purifica del pico de trímero en aproximadamente 65 mis de tiempo de retención (Figura 6C) en tanto que la construcción Delp21 Furx no escindida (??21 Furx) se purifica el pico de monómero a aproximadamente 77 mis (Figura 6D) .

Las Figuras 7A-7D muestra imágenes EM representativas de antígenos F de RSV seleccionados. La Figura 7A muestra una imagen EM de RSV-F ??23 (Delp23) antes del tratamiento con tripsina. Las formas tipo muleta en la Figura 7A, consistentes con una conformación de trímero postfusión, no siempre se observan en la construcción ??23 (Delp23) Furdel no escindida. Cuando la construcción ??23 (Delp23) Furdel se trata con tripsina y se purifica del volumen hueco de una columna SEC y se observa por EM, se encuentra que las proteínas tienen conformaciones adoptadas de rosetones (Figura 7B) . Cuando la construcción de supresión de péptido de fusión F de RSV se purifica del pico de trímero en una columna SEC se observa una forma de muleta monodispersada, consistente con el trímero de post-fusión (Figura 7C) . En la Figura 7D se muestran tres preparaciones de ya sea ??21 (Delp21) furx RSV-F (Monómero marcado) , F de RSV con supresión de péptido de fusión (Sendas, Trímero Marcado) y rosetones de F de RSV purificado (Rosetones Marcados) . El gel contiene varias sendas de norma GE Full Range Standard (norma de pesos moleculares se marcan a la izquierda del gel) en tanto que a la derecha del gel se indican los tiempos de retención aproximados de los fragmentos de F de RSV.

Las Figuras 8A-8C son gráficas que muestran que los monóraeros (??21 (Delp21) no escindidos) , los rosetones de trímeros (??23 (Delp23) Furdel escindido) , y trímeros (supresión de péptido de fusión) de polipéptidos de ectodominio F de RSV son inmunogénicos en ratas de algodón. Se midieron los títulos en suero de IgG anti-RSV y anticuerpos neutralizantes anti-RSV 2 semanas después de la lera vacunación (2wpl) , 3 semanas después de la lera vacunación (3wpl) , y/o 2 semanas después de la 2da vacunación (2 p2) .

Descripción Detallada de la Invención La invención se refiere a polipéptidos y/o proteínas F de virus sincitial respiratorio (F de RSV) , composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos y/o proteínas F de RSV, métodos para producir polipéptidos y/o proteínas F de RSV y composiciones que comprenden polipéptidos y/o proteínas F de RSV, y ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos y/o proteínas F de RSV.

En general, las composiciones inmunogénicas comprenden polipéptidos y/o proteínas F de RSV que contienen mutaciones (por ejemplo, reemplazos, supresiones o adiciones de aminoácidos) que proporcionan características benéficas, tal como uno o más de 1) conformación de pre-fusión o intermedia (sin post-fusión) estabilizada, 2) exposición reducida o eliminada del polipéptidos de fusión, 3) estabilidad mejorada (por ejemplo, agregación y/o degradación reducida, y 4) proteína viral F1/F2 activa más cercanamente semejante. Estas características proporcionan ventajas para las composiciones inmunogénicas y para la elaboración de las composiciones inmunogénicas. Por ejemplo, como se describe en la presente, las conformaciones no de post-fusión de la proteína F de RSV (es decir, conformación de pre- fusión, conformaciones intermedias) pueden ser mejores inmunógenos y producir una mejor respuesta de anticuerpos neutralizantes. La reducción o eliminación de la exposición del polipéptido de fusión, por ejemplo, al introducir mutaciones o supresiones en los sitios de escisión de furina, reducirá la hidrofobicidad del polipéptido y facilitará las purificaciones, y también reducirá o eliminará la proteína F de RSV de asociarse con membranas celulares en un sujeto a quien se administra la proteína. La estabilidad mejorada de la proteína facilita la producción de composiciones inmunogénicas en las cuales la proteína tiene una tendencia disminuida a agregarse o degradarse, lo que proporciona una respuesta inmunitaria más predecible cuando la composición se administra a un sujeto. Finalmente, los polipéptidos o proteínas F mutantes de RSV que se asemejan a la proteína viral F1/F2, por ejemplo por supresión de toda o parte de la región ligadora p27, pueden producir una mejor respuesta de anticuerpos neutralizantes. Otras ventajas de la invención se describen en la presente.

La invención también se refiere a métodos para preparar composiciones que contienen proteína F de RSV, en particular polipéptidos de ectodominio F de RSV, y a composiciones que incluyen composiciones inmunogénicas que comprenden proteína F de RSV. De manera preferente, los polipéptidos de ectodominio F de RSV están en una forma individual o en un equilibrio dinámico entre formas conocidas .

Definiciones Como se usa en la presente, "población" se refiere a más de un polipéptido o proteína F de RSV que está presente en una composición. La población puede ser sustancialmente homogénea, en la cual sustancialmente todos los polipéptidos o proteínas F de RSV son sustancialmente los mismos (por ejemplo, misma secuencia de aminoácidos, misma conformación) , heterogénea, o tener un grado deseado de homogenicidad (por ejemplo, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 99 % de los polipéptidos o proteínas F de RSV son de conformación de pre-fusión, son de conformación de post- fusión, son monómeros, son trímeros) .

La "conformación de post- fusión" de la proteína F de RSV es un trímero caracterizado por la presencia de un fajo de seis hélices que comprende 3 regiones HRB y 3 regiones HRA.

La "conformación de pre- fusión" de la proteína F de RSV es una conformación caracterizada por un trímero que contiene una triple hélice que comprende tres regiones HRB.

Como se usa en la presente, "polipéptido de ectodominio F de RSV" se refiere a un polipéptido de proteína F de RSV que contiene sustancialmente la porción extracelular de proteína F de RSV, madura, con o sin el péptido de señal (por ejemplo, aproximadamente aminoácidos 1 a aproximadamente aminoácido 524, o aproximadamente aminoácido 22 a aproximadamente aminoácido 524) , pero que carece del dominio transmembrana y la extremidad citoplásmica de la proteína F de RSV que se presenta de forma natural .

Como se usa en la presente, "polipéptido escindido de ectodominio F de RSV" se refiere a un polipéptido de ectodominio F de RSV que se ha escindido en una o más posiciones de aproximadamente 101/102 a aproximadamente 160/161 para producir dos subunidades, en el cual una de las subunidades comprende Fi y la otra subunidad comprende F2.

Como se usa en la presente, "polipéptido no escindido C-terminal de ectodominio F de RSV" se refiere a un polipéptido de ectodominio F de RSV que se escinde en una o más posiciones de aproximadamente 101/102 a aproximadamente 131/132, y no se escinde en una o más posiciones de aproximadamente 132/133 a aproximadamente 160/161, para producir dos subunidades, en el cual, una de las subunidades comprende Fx y la otra subunidad comprende F2.

Como se usa en la presente, "polipéptido no escindido de ectodominio F de RSV" se refiere a un polipéptido de ectodominio F de RSV que no se escinde en una o más posiciones de aproximadamente 101/102 a aproximadamente 160/161. Un polipéptido no escindido de ectodominio F de RSV puede ser, por ejemplo, un monómero o un trímero.

Como se usa en la presente, "péptido de fusión" se refiere a los aminoácidos 137-154 de la proteína F de RSV.

Como se usa en la presente, "péptido alterado de fusión" se refiere a un péptido de fusión en el cual uno o más aminoácidos se reemplazan o suprimen independientemente, incluyendo reemplazo o supresión de todos los aminoácidos de las posiciones 137-154. De manera preferente, los polipéptidos escindidos de ectodominio F de RSV que contienen un "péptido alterado de fusión" no forman rosetones.

Como se usa en la presente, una proteína o polipéptido "purificado" es una proteína o polipéptido que se produce de forma recombinante o de manera sintética, o se produce por su hospedador natural, y se ha aislado de otros componentes del sistema de producción recombinante o sintético u hospedador natural tal que la cantidad de la proteína con relación a otros componentes macromolares presentes en una composición sea sustancialmente mayor que aquella presente en una preparación cruda. En general, una proteína purificada será al menos aproximadamente 50 % homogénea y de manera más preferente al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95, o sustancialmente homogénea.

Como se usa en la presente, "sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas" se refiere a composiciones, proteínas y polipéptidos que están al menos aproximadamente 95 % libres de lípidos y lipoproteínas en una base en masa cuando la pureza de la proteína y/o polipéptido (por ejemplo, polipéptido F de RSV) se observa en un gel de SDS-PAGE y el contenido total de proteína se mide usando ya sea absorción UV280 o análisis BCA, y el contenido de lípido y lipoproteína se determina usando el ensayo de Fosfolipasa C (Wako, código no. 433-36201) .

Como se usa en la presente, "sitio alterado de escisión de furina" se refiere a la secuencia de aminoácidos en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136 en la proteína F de RSV que se presenta de forma natural que se reconocen y escinden por furina o proteasas tipo furina, pero en un polipéptido no escindido de ectodorainio de proteína F de RSV contiene uno o más reemplazos de aminoácido, una o más supresiones de aminoácido, o una combinación de uno o más reemplazos de aminoácido y una o más supresiones de aminoácido, de modo que se segregue un polipéptido de ectodominio F de RSV que contiene un sitio alterado de escisión de furina de una célula que lo produce no escindido en el sitio alterado de escisión de furina.

Las características de los ectodominios de proteína F de RSV adecuados para el uso en esta invención se describen en la presente con referencia a aminoácidos particulares que se identifican por la posición del aminoácido en la secuencia de la proteína F de RSV de la cepa A2 (SEQ ID N0:1) . Los ectodominios de proteína F de RSV pueden tener la secuencia de aminoácidos de la proteína F de la cepa A2 o cualquier otra cepa deseada. Cuando se usa el ectodominio de proteína F de una cepa diferente de la cepa A2 , los aminoácidos de la proteína F se van numerar con referencia a la numeración de la proteína F de la cepa A2, con la inserción de separación es como se necesite. Esto se puede lograr al alinear la secuencia de cualquier proteína F de RSV deseada con la proteína F de la cepa A2, como se muestra en la presente para las proteínas F de la cepa A2, cepa CP52, cepa B, cepa larga, y la cepa 18537. Ver, Figura 5. De manera preferente se producen alineaciones de secuencia usando el algoritmo descrito por Corpet, Nucleic Acids Research, 1998, 16 (22) : 10881-10890, usando parámetros por defecto (tabla de comparación de símbolos Blossum 62, penalidad de abertura de separación: 12, penalidad de extensión de separación: 2.

La invención proporciona polipéptidos y proteínas F de RSV, solubles y composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos y proteína F de RSV, solubles, así como composiciones que comprenden ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de AR auto-replicantes) que codifican para los polipéptidos y proteínas F de RSV, solubles.

Los polipéptidos F de RSV (por ejemplo, polipéptidos de ectodominio) pueden estar en cualquier forma deseada, tal como en una forma individual, tal como monómeros no escindidos, trímeros no escindidos, trímeros escindidos, o rosetones de trímeros escindidos. Los polipéptidos de ectodominio F de RSV también pueden estar en dos o más formas, por ejemplo dos o más formas que existan en equilibrio, tal como equilibrio entre monómeros no escindidos y trímeros no escindidos. La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, la presencia de una forma deseada individual de RSV, o un equilibrio dinámico entre dos formas, en una composición inmunogénica, proporciona una formulación más predecible, solubilidad y estabilidad predecibles, y una respuesta inmunitaria más predecible cuando la composición se administra a un sujeto.

De manera preferente, los polipéptidos de ectodominio F de RSV están en una forma individual, tal como monómeros no escindidos, trímeros no escindidos, trímeros escindidos, rosetones de trímeros escindidos, o en un equilibrio dinámico entre un subconjunto de estas formas (por ejemplo, equilibrio entre monómeros no escindidos y trímeros no escindidos) .

En un aspecto de la invención, los polipéptidos y proteínas F de RSV están en una conformación de pre-fusión. Los epítopos de la conformación de pre-fusión pueden ser más capaces de producir anticuerpos que puedan reconocer y neutralizar viriones naturales.

En una modalidad de la invención, una composición inmunogénica comprende una población de glicoproteínas F de virus sincitial respiratorio en conformación de pre-fusión. En otro aspecto de la invención, una composición inmunogénica comprende una población de glicoproteínas F de virus sincitial respiratorio que desfavorecen la conformación de post- fusión en comparación a una población de glicoproteínas F de RSV, aisladas.

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que exhibe un epítopo presente en una pre-fusión o en una conformación de fusión intermedia de glicoproteína F de virus sincitial respiratorio pero ausente la conformación de post-fusión de la glicoproteína .

La Glicoproteína F La glicoproteína F de RSV dirige la penetración viral por fusión entre la envoltura de virión y la membrana plasmática de la célula ospedadora. Es una proteína de membrana integral de una pasada tipo I que tiene cuatro dominios generales: secuencia de señal (SS) de translocación de ER N-terminal ectodominio (ED) dominio transmembrana (TM) , y una extremidad citoplasmática (CT) . La CT consiste de un residuo de cisteína, palmitoilado, individual. La secuencia de la proteína F está altamente conservada entre los aislados de RSV, pero está en evolución constante (7) . Diferente de la mayoría de los paramixovirus, la proteína F en RSV puede mediar la entrada y formación de sincitio independiente de las otras proteínas virales (HN es usualmente necesario además de F en otros paramixovirus) .

El AR m de F de hRSV se traduce en una proteína precursora de 574 aminoácidos designada F0, que contiene una secuencia de péptido de señal en el N-terminal que se remueve por una peptidasa de señal en el retículo endoplásmico . F0 se escinde en dos sitios (a. a. 109/110 y 136/137) por proteasas celulares (en particular furina) en el trans-Golgi, removiendo una secuencia de intervención, glicosilada, corta y generando dos subunidades designadas Fl (-50 kDa, C-términal, residuos 137-574) y F2 (-20 kDa; N-términal, residuos 1-109) (Ver, por ejemplo, Figura. 1) . Fl contiene un péptido de fusión hidrófobo en su N-términal y también dos regiones de repetición heptad hidrófobas (HRA y HRB) . HRA está cerca del péptido de fusión y HRB está cerca al dominio transmembrana (Ver, por ejemplo, Figura 1) . Los heterodímeros F1-F2 se montan como homotrímeros en el virión.

El RSV existe como un serotipo individual, pero tiene dos subgrupos antigénicos : A y B. Las glicoproteínas F de dos grupos son aproximadamente 90 % idénticas. El subgrupo A, el subgrupo B o una combinación o híbrido de ambos se pueden usar en la invención. Una secuencia de ejemplo para el subgrupo A es SEQ ID NO : 1 (cepa A2 ; GenBank GI : 138251; Suiza Prot P03420) y para el subgrupo B es SEQ ID NO: 2 (cepa 18537; GI : 138250, Swiss-Prot P13843). SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 son ambas secuencias de 574 aminoácidos. El péptido de señal en la cepa A2 es a. a. 1-21, pero en la cepa 18537 es 1-22. En ambas secuencias, el dominio TM es de aproximadamente a. a. 530-550, pero se ha reportado alternativamente como 525-548.

SEQ ID NO: 1 1 ELLIL ANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTG YTSVITIE 60 61 LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFM YTLN 120 121 NAKKTNVTLS KR RRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWS 180 181 LSNGVSVLTS VLDLKJTYIDKQLLPIVN QSCSISNIETVIEFQQ NRLLEITREFSV 240 241 AGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS IWQIWQQSYSIMSIIKEEVLAYV 300 301 VQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKV 360 361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEI LCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT 420 421 KCTASNKNRGII TFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEG SLYVKGEPIINFYDP 480 481 LVFPSDEFDASISQVNE INQSLAFIRKSDELLHNWAGKSTTNI ITTITIVIIVILLS 540 541 LIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NIAFSN 574 SEQ ID NO: 2 1 MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIE 60 61 LSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTIN 120 121 TTK LNVSIS KRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEWKIKNALLSTNKAWS 180 181 LSNGVSVLTSKVLDL NYINNRLLPIV QQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVN 240 241 AGWTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL SSNVQIVRQQSYSI SIIKEEVLAYV 300 301 VQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKV 360 361 QSNRVFCDTM SLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKT 420 421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDP 480 481 LVFPSDEFDASISQV EKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNI ITTIIIVIIWLLS 540 541 LIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGI NIAFSK 574 La invención puede usar cualquier secuencia deseada de aminoácidos de F de RSV, tal como la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2, o una secuencia que tiene identidad SEC ID NO: 1 o 2. Típicamente, tendrá al menos 75 % de identidad a SEC ID NO: 1 o 2, por ejemplo, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, de identidad a SEC ID NO: 1 o 2. La secuencia se puede encontrar de forma natural en RSV.

Donde la invención usa un ectodominio de proteína F, en totalidad o en parte, puede comprender: (i) un polipéptido que comprende aproximadamente los aminoácidos 22-525 de SEQ ID NO: 1. (ii) un polipéptido que comprende aproximadamente los aminoácidos 23-525 de SEQ ID NO: 2. (iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75 % de identidad (por ejemplo, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad) a (i) o (ii) . (iv) un polipéptido que comprende un fragmento de (i), (ii) o (iii) en donde el fragmento comprende al menos un epítopo de proteína F. El fragmento será usualmente de al menos aproximadamente 100 aminoácidos de largo, por ejemplo, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 350, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 450 aminoácidos de largo.

El ectodominio puede ser una forma F0 con o sin el péptido de señal, o puede comprender dos cadenas separadas de péptidos (por ejemplo, una subunidad Fx y una subunidad F2) que están asociadas entre sí, por ejemplo, las subunidades se pueden enlazar por un puente disulfuro. Por consiguiente, todo o una porción de aproximadamente el aminoácido 101 a aproximadamente 161, tal como los aminoácidos 110-136, pueden estar ausentes del ectodominio. De esta manera, el ectodominio, en totalidad o en parte, puede comprender: (v) una primera cadena peptídica y una segundo cadena peptídica que está asociada con la primera cadena de polipéptido, donde la primera cadena peptídica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75 % de identidad (por ejemplo, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o aún 100 % de identidad) a aproximadamente el aminoácido 22 a aproximadamente el aminoácido 101 de SEQ ID NO: 1 o aproximadamente el aminoácido 23 a aproximadamente el aminoácido 101 de SEQ ID NO: 2 , y la segunda cadena peptídica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad (por ejemplo, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos .97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o aún 100 % de identidad) a aproximadamente el aminoácido 162 a aproximadamente el 525 de SEQ ID NO: l o aproximadamente los aminoácidos 162 a 525 de SEQ ID NO: 2. (vi) una primera cadena peptídica y una segundo cadena peptídica que está asociada con la primera cadena de polipéptido, donde la primera cadena peptídica comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de aproximadamente el aminoácido 22 a aproximadamente el aminoácido 101 de SEQ ID NO: 1 o de aproximadamente el aminoácido 23 a aproximadamente el aminoácido 109 de SEQ ID NO: 2, y la segunda cadena peptídica comprende un fragmento de aproximadamente el aminoácido 162 a aproximadamente el aminoácido 525 de SEQ ID NO: 1 o de aproximadamente el aminoácido 161 a aproximadamente el aminoácido 525 de SEQ ID NO: 2. Uno o ambos de los fragmentos comprenderán al menos un epítopo de proteína F. El fragmento en primera cadena peptídica usualmente será de al menos 20 aminoácidos de largo, por ejemplo, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80 aminoácidos de largo. El fragmento en la segunda cadena peptídica usualmente será de al menos 100 aminoácidos de largo, por ejemplo, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450 aminoácidos de largo. (vii) una molécula obtenible por digestión de furina de (i) , (ii) , (iii) o (iv) .

De esta manera, una secuencia de aminoácidos usada con la invención se puede encontrar de forma natural dentro de la proteína F de RSV (por ejemplo, una proteína F soluble de RSV que carece de TM y CT, aproximadamente los aminoácidos 522-574 de SEQ ID NO: 1 o 2) , y/o puede tener una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) mutaciones (inserciones, supresiones o sustituciones) individuales de aminoácido con relación a una secuencia natural de RSV. Por ejemplo, se conoce mutar proteínas F para eliminar sus secuencias de escisión de furina, impidiendo de este modo el procesamiento intracelular . En ciertas modalidades, la proteína F de RSV carece de TM y CT (aproximadamente los aminoácidos 522-574 de SEQ ID NO: 1 o 2) y contiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) mutaciones (inserciones, supresiones o sustituciones) individuales de aminoácido con relación a una secuencia natural de RSV.

Mutaciones de Escisión con Furina, Escisión con Tripsina y de Péptido de Fusión Los polipéptidos o proteínas F de RSV pueden contener una o más mutaciones que impiden la escisión en uno o ambos de los sitios de escisión de furina (es decir, aminoácidos 109 y 136 de SEQ ID NOS: 1 y 2) . Estas mutaciones pueden impedir la agregación de los polipéptidos o proteínas solubles y facilitar de este modo las purificaciones, para impedir la fusión célula-célula si la proteína F de RSV se expresa en la superficie de una célula, tal como, por expresión de un replicón viral (por ejemplo, partículas de replicón de alfavirus) , o si la proteína F de RSV es un componentes de una partícula tipo virus. Estas mutaciones, solas o en combinación con otras mutaciones descritas en la presente, también puede estabilizar la proteína en la conformación de pre-fusión.

Los ejemplos de mutaciones adecuadas de escisión con furina incluyen el reemplazo de los residuos de aminoácido 106-109 de SEQ ID NO: 1 o 2 con RARK (SEQ ID NO: 77), RARK (SEQ ID NO: 78), QAQN (SEQ ID NO: 79) O IEGR (SEQ ID NO: 80) . De manera alternativa, o adicionalmente , se pueden reemplazar los residuos 133-136 de SEQ ID NO : 1 o 2 con RKKK (SEQ ID NO: 81) , AAAR, QNQN (SEQ ID NO: 82) , QQQR (SEQ ID NO: 83) o IEGR (SEQ ID NO: 80) . (? indica que el residuo de aminoácidos se ha suprimido) . Estas mutaciones se pueden combinar, si se desea, con otras mutaciones descritas en la presente, tal como mutaciones en la región p27 (aminoácidos 110-136 de SEQ ID NO: 1 o 2) , incluyendo supresión de la región de p27 en totalidad o en parte.

Estas mutaciones de escisión de furina se pueden combinar, si se desea, con otras mutaciones descritas en la presente, tal como mutaciones de escisión con tripsina y mutaciones de péptido de fusión. Los ejemplos de mutaciones adecuadas de escisión con tripsina incluyen supresión de cualquier residuo de lisina o arginina entre aproximadamente la posición 101 y la posición 161 de SEQ ID NO: 1 o 2, o el reemplazo de cualquier residuo de lisina o arginina con un aminoácido diferente de lisina o arginina. Por ejemplo, los residuos lisina y/o arginina en la región p27 (aproximadamente los aminoácidos 110-136 de SEQ ID NOS: 1 o 2) se puede sustituir o suprimir, incluyendo la supresión de la región de p27 en totalidad o en parte.

De manera alternativa o adicionalmente a las mutaciones de escisión con furina, los polipéptidos o proteínas F de RSV pueden contener una o más mutaciones en la región de péptido de fusión (aminoácidos 137 y 153 de SEQ ID NO: 1 o 2) . Por ejemplo, esta región se puede suprimir en totalidad o en parte.

En modalidades particulares, la secuencia del residuo de aminoácidos 100-150 del polipéptido o proteína F de RSV, tal como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, o los ecto-dominios solubles de esto, es (Furmt) TPAT NRARKELPRFMOTTL NAKKTNVTLSKKRKKKFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO : 3 ) (Furdel) TPATN RARQELPRFMNYTLNNAKKTNVTLS K RFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 4) (Furx) TPATNNQAQNELPRFMNYTLNNAK TNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO : 6 ) (Furx R113Q, K123N, K124N) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 5) (Furx R113Q, K123Q, 124Q) ) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 92) (Delp21F rx) TPATNNQAQN QNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 7) (Delp23Furx) TPATNNQAQN QNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 8) (Delp21 furdel) TPATNNRARQ QNQQQRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO:109) (Delp23 furdel) TPATNNRARQ QQQRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 9) (Furina N-términal) TPATNNRARRELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 10) ( Furina C- términal ) PATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLS KRKRRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO: 11) (Supresión 1 de péptido de fusión) TPATN RARRELPRFMNYTLNNAKKTNV LSKKRKRR- - SAIAS (SEQ ID NO: 12) , (Supresión 2 de péptido de fusión) TPATNNRARRELPRF NYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR- - GVGSAIAS (SEQ ID N0:91), O (Factor Xa) TPATNNIEGRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKIEGRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID N0:i3); en donde el símbolo "-" indica que se suprime el aminoácido en esa posición.

Además de las mutaciones por escisión de furina y de péptido de fusión, o, de manera alternativa, los polipéptidos o proteínas F solubles de RSV, tal como aquellas que carecen de la región transmembrana y de la extremidad citoplásmica, pueden contener una o más secuencias de oligomerización. Cuando está presente una s.ecuencia de oligomerización, es de manera preferente una secuencia de trimerización . Las secuencias adecuadas de oligomerización son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la extremidad en espiral de la proteínas de cremallera de leucina GCN4 de levadura, la secuencia de trimerización de fibritina T4 de bacteriófago ("foldón"), y el dominio de trímero de influenza HA. Estas y otras secuencias adecuadas de oligomerización se describen en mayor detalle en la presente .

En modalidades particulares, la secuencia del término carboxi del polipéptido o proteína F de RSV, iniciando de la posición 480, es (GCN) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNDKIEEILSKIYHIENEIARI KLIGE (SEQ ID NO: 14) (HA) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEK (SEQ ID NO: 15) (Hélice Idealizada) PLVFPSDEFDASISQINEKINQILAFIRKIDELLHNIN (SEQ ID NO: 16) (foldon corto) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR SDELLHNVNGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 17) ; O (foldon largo) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR SDELLHNVNNKNDDKGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS TFL (SEQ ID NO: 18) Además de cualquier combinación de mutaciones de escisión con furina, mutaciones de péptido de fusión y secuencias de oligomerización adicionadas o, de manera alternativa, los polipéptidos o proteínas F de RSV que contienen una región transmembrana puede contener una secuencia de aminoácidos adicionada que proporciona un sitio de escisión de proteasa. Este tipo de polipéptido o proteína F de RSV se puede producir por la expresión en la superficie de una célula, y recuperar en forma soluble después de la escisión de la superficie celular usando una proteasa apropiada. En general, la secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de escisión de proteasa estará localizada dentro de aproximadamente 60 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos, o sustancialmente adyacente al término amino del dominio transmembrana (aminoácido 525 de SEQ ID NO: 1 o 2) . Muchas secuencias adecuadas de aminoácidos que se escinden por proteasas comercialmente disponibles son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la trombina escinde la secuencia LVPR (SEQ ID NO: 75) , el factor Xa escinde la secuencia IEGR y la enterocinasa escinde la secuencia DDDDK (SEQ ID NO: 76). Estas secuencias de aminoácidos se pueden introducir en un polipéptido F de RSV. En modalidades particulares, la secuencia de polipéptido o proteína F de RSV, iniciando de la posición 488 a la región TM es una secuencia mostrada en la Figura 2.

Usualmente se aislarán o se purificarán los polipéptidos inmunogénicos usados de acuerdo a la invención. De esta manera, no se asociarán con moléculas con las cuales se encuentran normalmente, si es aplicable, en la naturaleza. Por ejemplo, una protelna F usada con la invención no estará en la forma de un virión de RSV (aunque puede estar en forma de un virión artificial, tal como una virosoma o VLP) .

Usualmente se preparan polipéptidos por la expresión en un sistema hospedador recombinante . En general, ellos (por ejemplo, ecto-dominios de RSV) se producen por la expresión de construcciones recombinantes que codifican para los ecto-dominios en células hospedadoras , recombinantes, adecuadas, aunque se puede usar cualquiera de los métodos adecuados. Las células hospedadoras, recombinantes, adecuadas incluyen, por ejemplo, células insectiles (por ejemplo, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni), células mamíferas (por ejemplo, células de humano, primate no humano, caballo, vaca, oveja, perro, gato, y roedor (por ejemplo, hámster), aviares (por ejemplo, pollo, pato y ganso), bacterias (por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus sp . ) , células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenual polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guilleri ondii , Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica) , células de Tetrahymena (por ejemplo, Tetrahymena thermophila) o combinaciones de esto. Muchas células insectiles adecuadas y células mamíferas son bien conocidas en la técnica. Las células insectiles adecuadas incluyen, por ejemplo, células Sf9, células Sf21, células Tn5 , células Schneider S2 y células High Five (un aislado clonal derivado de las líneas de células Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 parental (Invitrogen) ) . Las células mamíferas adecuadas incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , células de riñon embriónico humano (células HEK293, típicamente transformadas por ADN de adenovirus tipo 5 sisallado), células NIH-3T3, células 293-T, células Vero, células HeLa, células PERC.6 (número de depósito ECACC 96022940), células Hep G2 , MRC-5 (ATCC CCL-171) , I-38 (ATCC CCL-75) , células de pulmón de mono rhesus fetal (ATCC CL-160) , células de riñon bovino de Madin-Darby ( "MDBK" , por sus siglas en inglés), células de riñon canino de Madin-Darby ("MDCK", por sus siglas en inglés) (por ejemplo, MDCK (NBL2) , ATCC CCL34 , o MDCK 33016, DSM ACC 2219) , células de riñon de hámster neonato (BHK, por sus siglas en inglés) , tal como células BHK21-F, HKCC, y similares. Las células aviares adecuadas incluyen, por ejemplo, células madre embriónicas de pollo (por ejemplo, células EBxMR) , fibroblastos embriónicos de pollo, células germinales embriónicas de pollo, células de pato (por ejemplo, línea de células AGEl.CR y AGEl.CR.pIX (ProBioGen) , que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y WO2005/042728) , células EB66, y similares.

Los sistemas adecuados de expresión de células insectiles, tal como sistemas de baculovirus, se conocen por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) . Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/células insectiles están comercialmente disponibles en forma de equipo de, ínter alia, Invitrogen, San Diego CA. Los sistemas de expresión de células aviares también se conocen por aquellos expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de los estados unidos Nos. 5,340,740, 5,656,479, 5,830,510, 6,114,168, y 6,500,668, patente europea No. EP 0787180B; solicitud de patente europea No. EP03291813.8 ; O03/043415 y O03/076601. De manera similar, los sistemas de expresión de células bacterianas y mamíferas también se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds . , 1989) Butterworths, Londres .

Las construcciones recombinantes que codifican para ecto-dominios de proteínas de F de RSV se pueden preparar en vectores adecuados usando métodos convencionales. Son bien conocidos y convencionales en la técnica varios vectores adecuados para la expresión de proteínas recombinantes en células insectiles o mamíferas. Los vectores adecuados puede contener varios componentes que incluyen, pero no se limitan a uno o más de lo siguiente: un origen de replicación, un gen marcador seleccionable , uno o más elementos de control de expresión, tal como un elemento de control transcripcional (por ejemplo, un promotor, un intensificador, un terminador) , y/o una o más señales de traducción; y una secuencia de señal o secuencia guia para dirección al objetivo a la ruta secretoria en una célula hospedadora seleccionada (por ejemplo, de origen mamífero o de una especie mamífera o no mamífera heteróloga) . Por ejemplo, para expresión en células insectiles, se usa un vector adecuado de expresión de baculovirus, tal como pFastBac (Invitrogen) , para producir partículas recombinantes de baculovirus. Las partículas de baculovirus se amplifican y se usan para infectar células insectiles para expresar proteína recombinante . Para expresión en células mamíferas, se usa un vector que activará la expresión de la construcción en la célula hospedadora, mamífera, deseada (por ejemplo, células de ovario de hámster chino) .

Los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden purificar usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, en la técnica se conocen métodos para purificar polipéptidos de ecto-dominio F de RSV por cromatografía de inmunoafinidad. Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Virol . , 85:3677-3687 (2004). Los métodos adecuados para purificar proteínas deseadas que incluyen precipitación y varios tipos de cromatografía, tal como interacción hidrófoba, intercambio iónico, afinidad, quelante y exclusión de tamaños son bien conocidos en la técnica. Los esquemas adecuados de purificación se pueden crear usando dos o más de estos u otros métodos adecuados. Si se desea, los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV pueden incluir una "marca" que facilita la purificación, tal como una marca de epítopo o una marca HIS . Estos polipéptidos marcados se pueden purificar de manera conveniente, por ejemplo, de medios acondicionados, por cromatografía de quelación o cromatografía de afinidad.

Los polipéptidos F de RSV también . se pueden producir in situ por la expresión de ácidos nucleicos que los codifican en las células de un sujeto. Por ejemplo, por la expresión de un ARN auto-replicante descrito en la presente.

Los polipéptidos pueden incluir secuencias adicionales, además de la secuencias de RSV. Por ejemplo, un polipéptido puede incluir una secuencia para facilitar la purificación (por ejemplo, una secuencia de poly-His) . De manera similar, para propósitos de expresión, la secuencia guía natural de la proteína F se puede sustituir por una diferente. Por ejemplo, la referencia 6 usó un péptido guía de melitina de abeja mielera en lugar de la natural.

Forma y Conformación de Polipéptidos La invención incluye composiciones inmunogénicas que incluyen cualquiera de las formas y conformaciones de polipéptidos y proteínas F de RSV descritos en la presente, incluyendo cualquier combinación deseada de las formas y conformaciones de polipéptidos y proteínas F de RSV descritos en la presente. El polipéptido F de RSV puede ser un monómero, o la proteína F de RSV puede ser un trímero que comprende tres polipéptidos monoméricos. Los trímeros pueden estar monodispersados o puede estar en la forma de un rosetón, por ejemplo, debido a las interacciones entre los péptidos de fusión de trímeros individuales. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender polipéptidos que son monómeros, trímeros, una combinación de monómeros y trímeros (por ejemplo, en equilibrio dinámico) , rosetones de trímeros, y cualquier combinación de lo anterior. Además, como se describe adicionalmente en la presente, la proteína F de RSV puede estar en una conformación de post- fusión, una conformación de pre-fusión, o una conformación intermedia.

La proteína F de RSV puede estar en una conformación de post-fusión, o una conformación intermedia. La "conformación de post-fusión" de la proteína F de RSV se cree que es la conformación de baja energía de F de RSV nativa y es un trímero caracterizado por la presencia de un fajo de seis hélice que comprende 3 regiones HRB y 3 regiones HRA. La conformación de post-fusión tiene una forma de "muleta" o "palo de golf" característica por microscopía electrónica. La "conformación de pre-fusión" de la proteína F de RSV es una conformación caracterizada por un trímero que contiene una espiral enrollada que comprende 3 regiones HRB. El péptido de fusión no está expuesto en la conformación de pre-fusión y, por lo tanto, las conformaciones de pre-fusión en general no forman rosetones, y tienen una forma de "pirulí" o "bola y tallo" por microscopía electrónica.

En algunos aspectos, la proteína F de RSV está en la conformación de post-fusión. Por ejemplo, la proteína F de RSV puede estar en la forma de un trímero monodisperso en la conformación de post- fusión, o en la forma de un rosetón comprendido de trímeros de post- fusión.

En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es un monómero. En algunas modalidades, el polipéptido F de RSV es un trímero.

En otros aspectos, la proteína F de RSV está en la conformación de pre- fusión. Sin que se desee que se una por alguna teoría particular, se cree que la conformación de pre-fusión o formas intermedias de la proteína F de RSV puede contener epítopos que son los mismos como aquellos en la proteína F de RSV expresada en viriones naturales de RSV, y por lo tanto proporcionan ventajas para producir anticuerpos neutralizantes .

Algunos aspectos de la invención usan un polipéptido que desfavorece la conformación de post-fusión de la proteína F. De manera preferente, los polipéptidos (en totalidad o en parte) exhibirán un epítopo de la proteína F de pre-fusión o un epítopo de una conformación intermedia en la conversión de la conformación de pre-fusión a la conformación de post-fusión. Estos polipéptidos pueden tener proteínas F nativas o mutadas en un estado de pre-fusión, puede ser proteínas F nativas o mutadas en una conformación intermedia, o pueden ser una población de proteínas nativas o mutadas, donde la conformación de post-fusión se ha desfavorecido o se estudie de manera preferencial . En ciertos casos, la proteína nativa o mutada se puede combinar con una o más moléculas adicionales que ayudan a mantener los polipéptidos en uno de los estados anteriores, tal como un anticuerpo monoclonal que se une de manera preferente a la conformación de pre-fusión o una conformación intermedia. Además, los polipéptidos pueden ser derivados de proteínas F nativas. Estos derivados incluyen polipéptidos que comprenden uno o más fragmentos de una proteína F nativa, polipéptidos de fusión que comprenden una proteína F nativa (o fragmento de la misma) y una secuencia heteróloga, y polipéptidos que comprenden una secuencia de proteína F nativa que tiene una o más mutaciones. Estas (u otras) modificaciones pueden desfavorecer la conformación de post-fusión. Los planteamientos de ejemplo para desfavorecer la conformación de post-fusión incluyen estabilizar la conformación de pre-fusión, estabilizar una conformación intermedia, desestabilizar la conformación de post-fusión o incrementar la barrera de activación de uno o más pasos que conducen a la conformación de post-fusión.

En otra modalidad, la invención es un polipéptido que exhibe al menos un epítopo que se especificó a la proteína F de conformación de pre-fusión o una proteína F de conformación intermedia. Un epítopo que se específica a la proteína F de conformación de pre-fusión o una proteína F de conformación intermedia es un epítopo que no está presente en la conformación de post-fusión. Se prefiere que al menos un epítopo se presente de forma estable, por ejemplo, el epítopo se presente de forma estable en solución durante al menos doce horas, al menos un día, al menos dos días, al menos cuatro días, al menos seis días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos cuatro semanas, o al menos seis semanas .

Estos polipéptidos pueden ser proteínas F nativas o mutadas en el estado de pre-fusión, un estado intermedio o de una población de estados donde el estado de post-fusión está subrepresentado o en un porcentaje menor que para las proteínas F nativas, aisladas, o puede ser un derivado de una proteína F nativa. Estos derivados incluyen polipéptidos que comprenden uno o más fragmentos de una proteína F nativa, polipéptidos de fusión que comprenden una proteína F nativa (o fragmento de la misma) y una secuencia heteróloga, y polipéptidos que comprenden una secuencia de proteína F nativa que tiene una o más mutaciones. Estas (u otras) modificaciones pueden estabilizar una secuencia de aminoácidos de proteína F en su conformación de pre-fusión, estabilizar una secuencia de aminoácidos de proteína F en una conformación intermedia, desestabilizar la conformación de post-fusión de una secuencia de aminoácidos de proteína F, incrementar la barrera de energía en una transición que conduce a la conformación de post-fusión de una secuencia de aminoácidos de proteína F, o una combinación de dos o más de anterior .

Los dominios T y/o CT de proteínas F son importantes para la estabilidad de la conformación de pre-fusión (8) . De esta manera, estos dominios se pueden retener de forma útil en los inmunogenos de la invención. Puesto que puede ser deseable no incluir dominios transmembrana en inmunogenos solubles, aunque, el efecto funcional de TM se puede lograr por otros medios. Por ejemplo, el comportamiento de pre- y post-fusión de la proteína F del virus 5 de parainfluenza se ha estudiado en algún detalle (6) , y los autores establecieron la estructura de pre-fusión de ED al fusionar un dominio heterólogo de trimerización al C-términal del ED.

Dominio de Oligomerización En otra modalidad de la invención, la composición puede comprender un polipéptido (por ejemplo, polipéptido recombinante) que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde (i) el primer dominio comprende la proteína F de RSV (por ejemplo, ectodominio de RSV, en totalidad o en parte) , y (ii) el segundo dominio comprende un dominio heterólogo de oligomerización. El segundo dominio permite la oligomerización del polipéptido, facilitando de este modo que el primer dominio adopte un estado de pre-fusión o un estado intermedio. El polipéptido estará de manera preferente como un oligómero, y en particular como un trímero.

Para la persona experta en la técnica están disponibles varios dominios de oligomerización. Estas son secuencias de aminoácidos que pueden formar una estructura que puede interactuar con dominios de oligomerización (ya sea los mismos o diferentes) en otros polipéptidos (ya sea los mismos o diferentes) tal que los múltiples polipéptidos pueden asociarse (usualmente de forma no covalente) para formar oligómeros, por ejemplo, trímeros. Por ejemplo, se ha logrado la trimerización de la proteína F de VIH (es decir, gpl60) al fusionarla a la subunidad catalítica de aspartato de transcarbamilasa de E. coli (ATCasa) , que es de forma natural un trímero estable (9) . De esta manera, esta subunidad de ATCasa se puede usar con la presente invención. De manera similar, la trimerización de las proteínas F de VIH (10) y PIV5 (6) se ha logrado al fusionar sus ectodominios a GCNt . De esta manera, el dominio de oligomerización usado con la presente invención puede comprender la espiral enrollada de la proteína de cremallera de leucina GCN4 de levadura (11) . Se ha logrado la trimerización del ectodominio de la proteína HA del virus de influenza al usar una secuencia trimerizante ( foldon') de la fibritina T4 de bacteriófago (GSGYIPEAPRDGQ AYVRKDGE VLLSTFL - SEQ ID NO: 19) (12) . De esta manera, el dominio de oligomerización usado con la presente invención puede comprender este foldon.

Los oligómeros de proteína que se presentan de forma natural (tanto hetero-oligómeros como homo-oligómeros) se asocian en una variedad de maneras diferentes, por ejemplo, por asociación de (ß-hojas en diferentes monómeros, por asociación de a-hélices en diferentes monómeros, por asociación de parches superficiales hidrófobos, etcétera. Un motivo estructural común comprendido en la oligomerización de proteínas es el dominio de espiral enrollada. El motivo estructural de a-hélice enrollada puede formar por sí mismo espirales y dos, tres, cuatro o cinco a-hélices, pueden enrollarse entre sí para formar una súper-hélice izquierda conocida como la "espiral enrollada" , aunque la súper-hélices derechas artificiales se han designado (13-19) . La simplicidad del dominio de espiral enrollada ha hecho una elección popular para diseñar proteínas quiméricas con estados definidos de oligomerización (16) .

En una estructura espiral enrollada las a-hélices interactúan a través de residuos hidrófobos que forman una raya apolar a lo largo de un lado de cada hélice, y también puede haber interacciones electrostáticas estabilizadoras entre las cadenas laterales en cualquier lado de esta raya. Dentro de la repetición heptad abcdefg de una a-hélice, la raya apolar se define por las cadenas laterales hidrófobas en los residuos a y d, con cualquier de las interacciones electrostáticas que están principalmente en los residuos e y g. La posición a es más frecuentemente Leu, lie o Ala y la posición d es usualmente Leu o Ala. Los residuos e y g son frecuentemente Glu o Gln, con Arg y Lys también prominentes en la posición g. Los residuos cargados son comunes en las posiciones b, c y f puesto que estos residuos están en contacto con solvente. Hay excepciones a este patrón heptad general, sin embargo, y algunas veces se encuentran residuos Pro dentro del heptad. Estas excepciones usualmente tienen significado funcional, que incluye, a manera de ejemplo, desestabilización del dominio de oligomerización para permitir replegado y rearreglo, tal como se presenta en la proteína F.

Cientos de secuencias de dominio de espiral enrollada se conocen en la técnica, y se puede usar cualquier secuencia adecuada como un dominio de oligomerización con la invención, con la condición de que retenga la capacidad de oligomerizarse con otros dominios de espiral enrollada y que no destruya la función de los otros dominios dentro del polipéptido. Se prefiere usar una espiral enrollada que se encuentra de forma extracelular (20) y que actúa de manera natural como un dominio de oligomerización. Como una alternativa usar un dominio natural de espiral enrollada, se pueden usar dominios artificiales de espiral enrollada (21, 22) . Debido a la estructura altamente repetitiva de un dominio de espiral enrollada, el dominio es particularmente tratable para modelado en computadora, puesto que las porciones de estructura de cada residuo de aminoácidos se pueden puede parameterizar en lugar de tratar cada porción de estructura de un residuo como una unidad única con sus propias variables. El dominio (b) puede incluir una secuencia de cremallera de leucina o una secuencia de cremallera alanina ( 23 ) .

El dominio de espiral enrollada usado en el polipéptido de la invención es preferentemente uno que forma un trímero, tal que el polipéptido de la invención también se pueda montar en un trímero. Los dominios de espiral-enrollada, preferidos son aquellos tomados de proteínas transmembrana bacterianas. Un subconjunto preferido de proteínas transmembrana es las adhesinas (es decir, proteínas de superficie celular que median la adhesión a otras células o a superficies) , y de manera particular a adhesinas no fimbriales (por ejemplo, en las adesinas de espiral enrolladas de oligomerización, o familia "Oca"). Las secuencias específicas para el uso con la invención incluyen aquellas descritas en la referencia 24 de adhesina YadA de Yersinia enterocolitica, adhesina NadA de Neisseria meningitidis , proteína superficial UspA2 de Moraxella catarrhalis, y otras adhesinas, tal como la adhesina HadA de Haemophilus influenzae biogrupo aegyptius etcétera (SEQ ID NOs 28-31 y 42-58 de referencia 24) . Además, el factor de transcripción de choque térmico eucariótico tiene un dominio de trimerización de espiral enrollada que se puede expresar de forma separada y por lo tanto usar con la invención.

Dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene una región de espiral enrollada, la naturaleza de repetición heptad de las a-hélices significa que el límite del dominio de espiral enrollada se puede determinar con alguna precisión, pero el residuo preciso donde se dice que termina un arreglo de espiral enrollada no se puede conocer con exactitud absoluta. Esta carencia de precisión absoluta no es un problema para practicar de la invención, sin embargo, como prueba de rutina se puede revelar si la espiral enrollada requiere algún residuo de aminoácido particular para el cual se pueda tener duda. Aún así, la invención no requiere que se conozcan los límites con precisión absoluta, puesto que el único requisito básico para la invención es que el dominio de espiral enrollada deba funcionar de una manera que permita que el polipéptido oligomérise con otros dominios de espiral enrollada sin destruir la función de los otros dominios dentro del polipéptido .

Otra clase de dominio de oligomerización que se puede usar con la invención se encuentra en la triple hélice izquierda conocida como la hélice de colágeno (25) . Estas secuencias formadoras de triple hélice comprenden una secuencia de repetición tripeptídica básica de 1Gly-2Xaa-3Xaa, donde 2Xaa es frecuentemente Pro, y 3Xaa es frecuentemente 4-hidroxiprolina. Aunque este motivo se conoce como la "hélice de colágeno" se encuentra en muchas proteínas más allá de sólo colágeno. El dominio de oligomerización de esta manera puede ser una secuencia que comprende múltiples repeticiones del motivo de secuencia 1Gly-2Xaa-3Xaa, o motivo se pliega para formar una estructura helicoidal que puede oligomerizarse con las estructuras helicoidales correspondiente en otras cadenas de polipéptido.

El colágeno también proporciona otra clase de dominio de oligomerización. La referencia 26 describe un motivo encontrado en el dominio 1 no de colágeno (NC1) de colágeno tipo X, y este motivo se puede usar para la formación de trímeros y multímeros de mayor orden sin un triple hélice. Esta asociación trimérica es altamente termoestable, sin enlaces de disulfuro intermoleculares. El dominio de oligomerización de esta manera puede comprender una secuencia de NC1.

Se pueden derivar otros dominios de oligomerización de los dominios transmembrana de proteínas TM oligoméricas . Puesto que estas son usualmente lipofilas, los residuos hidrófobos colocados en el exterior de sus regiones TM se pueden sustituir con residuos cargados, para proporcionar un dominio soluble. Estos métodos para solubilizar dominios transmembrana por manejo de proteínas se conocen en la técnica, por ejemplo, de la referencia 27. Este método también se ha usado para GCN4 , donde las posiciones de repetición heptad "a" y "d" se reemplazaron con isoleucina (11) : KQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 20) . Las secuencias adecuadas de espiral enrollada para el uso dentro del dominio de oligomerización usualmente serán de entre 20 y 35 aminoácidos de largo, por ejemplo, 23 a 30 residuos de aminoácidos de largo.

Los dominios de oligomerización usados con la invención pueden mantener en general una estructura oligomérica sin la necesidad de la formación de puentes de disulfuro inter-monómero, pero no se excluyen de la invención los oligómeros que contienen monómeros enlazados con disulfuro .

Como una alternativa, o adicionalmente , a usar un dominio de oligomerización para estabilizar una proteína F en su conformación de pre-fusión, se puede usar mutación. Por ejemplo, la referencia 28 reporta que la mutación en una región conservada de la subunidad F2 de las proteínas F en virus simiesco 5 o virus de hendra tiene influencia en la estabilidad de la conformación de pre-fusión.

En algunas casos, también se puede usar pH bajo para favorecer la conformación de pre-fusión.

Estabilización del Trímero Dominio de HRB En otro aspecto preferido de la presente invención, la conformación de post- fusión de la proteína F se puede desfavorecer por la estabilización del trímero de dominio HRB. El dominio de HRB forma una espiral enrollada de triple hebra en la pre-fusión y probablemente las formas intermedias. Como se analiza en la sección precedente, debido a su simplicidad, se han estudiado extensivamente las espirales enrolladas como sistemas modelo para interacciones intermoleculares entre proteínas y como sistemas modelo para interacciones intra-moleculares de intervalo grande (es decir, interacciones de plegado terciario) . Estos estudios son útiles al enseñar métodos que se pueden usar para estabilizar el dominio de HRB en la forma de espiral enrollada trimérica. A manera de ejemplo, se pueden reemplazar uno o más residuos en las posiciones a y/o d de la repetición heptad con residuos que favorecen la formación de espirales enrolladas, trimérica estables, tal como residuos lie. Además, aunque menos preferido, las interacciones 'iónicas desfavorables en las posiciones e y g se pueden suprimir o se pueden adicionar interacciones iónicas favorables en las posiciones e y g.

La región preferida del dominio de HRB para manipulación es la repetición heptad entre P484-N517. Los ejemplos preferidos de residuos a y d de objetivo para mutaciones son F488, 1492, V495, 1499, S502, 1506, S509, L512 y V516. Los residuos de serina son especialmente preferidos como reemplazo de los residuos hidrófilos con residuos hidrófobos que estabilizarán el núcleo hidrófobo de la espiral enrollada. Otro objetivo preferido será la fenilalanina con un residuo hidrófobo más pequeño que empacará mejor en el núcleo tal como una isoleucina.

Desestabilización del Trímero de Dominio de HRA En otro aspecto preferido de la presente invención, la conformación de post-fusión de la proteína F se puede desfavorecer por desestabilización del trímero de dominio HRA. El dominio de HRA forma una espiral enrollada de triple hebra en la post-fusión y posiblemente una o más formas intermedias. A manera de ejemplo, se pueden reemplazar uno o más residuos en las posiciones a y/o d de la repetición heptad con residuos que desfavorecen la formación de espirales enrolladas, triméricas, estables. Además, aunque menos favorable, se pueden suprimir interacciones iónicas favorables en las posiciones e y g o se pueden adicionar interacciones iónicas desfavorables en las posiciones e y g. De manera preferente estas mutaciones se seleccionarán para que tengan impacto mínimo en la estabilidad del dominio de HRA en la conformación de pre-fusión como se puede modelar en base a estructuras cristalinas disponibles de la proteína F de PIV5 en las formas de pre- fusión y post- fusión.

Otras Modificaciones Además de las modificaciones anteriores, se pueden diseñar adicionalmente modificaciones en base al modelado molecular de las proteínas F de VSRH en base a las estructuras cristalinas disponibles de la proteína F de PIV5 en las formas de pre-fusión post-fusión. Se pueden hacer mutaciones que desestabilizan la conformación de post-fusión, tal como el plegado 6HB de los dominios HRA y HRB o que estabilizan la conformación de pre-fusión, tal como el plegado HRA en la conformación de pre-fusión. Además, la barrera de energía de las transiciones que conduce a la conformación de post-fusión se puede incrementar. En tanto que experto en la técnica apreciará que la estabilización de la conformación de inicio o la desestabilización de la conformación final puede tener el efecto de incrementar la barrera de energía, se pueden introducir otras modificaciones que afectan el estado mismo de transición.

Como un ejemplo adicional, los aminoácidos N-términal al dominio HRB (aproximadamente 449-482, de manera preferente V459-F483) actúan como una "correa", que permite que el dominio HRB se cambie de un lado del trímero de proteína F al otro lado de modo que el dominio HRB puede participar en el 6HB de la conformación de post-fusión. La supresión de uno o más de estos aminoácidos deteriorarán o impedirá categóricamente que el dominio HRB participe en el plegado 6HB de la conformación de post- fusión de la proteína F (ver Figura 3) . Además, la interacción entre la correa y la proteína F en la conformación de pre- fusión se puede estabilizar para impedir que la correa jale para permitir que el dominio HRB participe en el plegado 6HB. Los ejemplos de mutaciones estabilizadoras que se pueden hacer son puentes de cisteína entre la correa y la porción de la proteína F con la que se pone en contacto la correa en la conformación de pre-fusión.

Aún otro ejemplo es la estabilización de la HRA en la conformación de pre-fusión (residuos T50-Y306) . Nuevamente, en base a las estructuras cristalinas de proteínas F homologas, el núcleo hidrófobo se puede estabilizar al reemplazar residuos hidrófilos o iónicos enterrados con residuos hidrófobos de tamaño similar. También, se pueden introducir puentes de cisteína en la superficie o dentro del núcleo. Además, como se demostró con el análisis extenso de estructuras cristalinas de mutantes de lisozima, los núcleos o proteínas hidrófobas son relativamente rígidas y por lo tanto, la introducción de agujeros desestabilizó de forma predictiva los mutantes de lisozima. De manera similar, el reemplazo del núcleo de la proteína F en la conformación de pre-fusión para eliminar cualquier agujero natural puede estabilizar la proteína F en la forma de pre- fusión o intermedia, desfavoreciendo de este modo la conformación de post-fusión.

Métodos para Preparar Composiciones La invención se refiere a métodos para preparar composiciones y a composiciones que contienen proteína F de RSV, en particular, polipéptidos de ecto-dominio F de RSV solubles, incluyendo composiciones inmunogénicas . De manera preferente, los polipéptidos de ecto-dominio de F de RSV están en una forma individual, tal como monómeros no escindidos, trímeros no escindidos, trímeros escindidos, rosetones de trímeros escindidos, o en un equilibrio dinámico entre un subconjunto de estas formas (por ejemplo, equilibrio entre monómeros no escindidos y trímeros no escindidos) . La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, como se describe en la presente, la invención proporciona métodos para producir composiciones que contienen una forma deseada predominante de proteínas F de RSV, o una forma deseada individual de proteína F de RSV, tal como monómeros no escindidos, trímeros no escindidos, trímeros escindidos, rosetones de trímeros escindidos, un equilibrio dinámico entre un subconjunto de estas formas (por ejemplo, equilibrio entre monómeros no escindidos y trímeros no escindidos) , o una mezcla de forma deseada de proteína F de RSV. Estos tipos de composiciones se pueden usar para una variedad de propósitos, tal como, en la producción de composiciones inmunogénicas que se pueden usar para producir vacunas. La presencia de una forma deseada individual de F de RSV, o un equilibrio dinámico entre formas conocidas, en una composición inmunogénica, proporciona una formulación más predecible, una solubilidad y una estabilidad más predecibles, y una respuesta inmunitaria más predecible cuando la composición se administra a un sujeto.

Cuando los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se producen por expresión recombinante convencional en células hospedadora, los polipéptidos se escinden en los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 109/110 y en aproximadamente la posición 136/137 durante la producción en la célula hospedadora antes de que se segreguen én el medio de cultivo. La escisión de los polipéptidos por las células hospedadoras es permisible para el replegado de polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV, que da por resultado la exposición del péptido de fusión hidrófobo. Por consiguiente, los polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de VSR, debido a la presencia de un péptido de fusión expuesto, forman rosetones y se asocian con lípidos y proteínas que se derivan de las células hospedadoras y medio de cultivo. En realidad, la microscopía electrónica del ecto-dominio escindido F de RSV que se producen en células insectiles y se purifican en virtud de una marca HIS6 mostró que los polipéptidos tienen una forma de muleta consistente con una forma de post- fusión y estuvieron unidos a lo que pareció ser desechos celulares residuales. Por consiguiente, no se pueden obtener fácilmente preparaciones de alta pureza de rosetones y otras formas y confirmaciones de polipéptidos de ecto-dominio proteína F de RSV por expresión recombinante convencional en células hospedadoras .

Métodos para Producir Polipéptidos Escindidos de Ecto-Dominio de Proteína F de RSV En un aspecto, la invención es un método para preparar una composición que contiene polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. En general, el método comprende proporcionar polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV y luego escindirlos para producir una subunidad Fi y una subunidad F2. Como se describe en la presente, los polipéptidos no escindidos de ecto-¦ dominio de proteína F de RSV se pueden purificar y separar fácilmente de lípidos y lipoproteínas contaminantes usando métodos adecuados, tal como cromatografía de exclusión de tamaño. Sin que se desee que se una a alguna teoría particular, se cree que el péptido de fusión hidrófobo no está expuesto en los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV y, por tanto, los polipéptidos no escindidos no se asocian con los contaminantes de lípidos y lipoproteínas. Como se describe adicionalmente en la presente, los ecto-dominios no escindidos de proteína F de RSV se pueden escindir para producir las subunidades F1 y F2, que se pueden purificar como trímeros, rosetones de trímeros, o una mezcla de trímeros y rosetones de trímeros.

Los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden producir usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, por producción recombinante en células hospedadoras que no contienen furina activa o proteasas tipo furina en el momento en que se están produciendo los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. Se pueden usar una variedad de métodos para lograr este método de producción, tal como, producción en células hospedadoras recombinantes que se mutan para impedir la expresión de furina o proteasa tipo furina ("supresión" condicional o completas) , y varios métodos que reducen o impiden la expresión de furina o proteasas tipo furina en las células hospedadoras, por ejemplo, usando interferencia de ARN u otros métodos similares, o inhibiendo la actividad de furina o proteasas tipo furina en células hospedadoras usando inhibidores de las proteasas.

Los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se producen de manera preferente por expresión recombinante de construcciones que codifican para un ecto-dominio de proteína F de RSV en el cual se altera la secuencia de aminoácidos en los sitios escisión de o con furina, de modo que los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan por una célula hospedadora que produce los polipéptidos no escindidos. Los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden producir usando cualquier célula hospedadora adecuada, tal como células insectiles (por ejemplo, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx morí, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni) , células mamíferas (por ejemplo, células de humano, primate no humano, caballo, vaca, oveja, perro, gato y roedor (por ejemplo, hámster) , células aviares (por ejemplo, pollo, pato y ganso, bacterias (por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp.), células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenual polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guilleri ondii , Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica) , células de Tetrahymena (por ejemplo, Tetrahymena thermophila) o combinaciones de estas. Muchas células insectiles adecuadas y células mamíferas adecuadas son bien conocidas en la técnica. Las células insectiles adecuadas, incluyen, por ejemplo, células Sf9, células Sf21, células Tn5, células Schneider S2 y células High Five (un aislado clonal derivado de la línea de células BTI-TN-5B1-4 de Trichoplusia ni parenteral (Invitrogen) ) . Las células mamíferas adecuadas incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) , células de riñon embriónico humano (células HEK293, típicamente transformadas por ADN cizallado de adenovirus tipo 5), células NIH-3T3, células 293-T, células Vero, células HeLa, células PERC.6 (depósito ECACC número 96022940), células Hep G2 , MRC-5 (ATCC CCL-171) , I-38 (ATCC CCL-75), células de pulmón de mono rhesus fetal (ATCC CL-160) , células de riñon bovino de Madin Darby ( " DBK" ) , células de riñon canino de Madin-Darby ("MDCK"), (por ejemplo, MDCK (NBL2) , ATCC CCL34, o MDCK 33016, DSM ACC 2219) , células riñon de hámster neonato (BHK) , tal como células BHK21-F, HKCC, y similares. Las células aviares adecuadas incluyen, por ejemplo, células madre embriónicas de pollo (por ejemplo, células EBxMR) , fibroblastos embriónicos de pollo, células germinales embriónicas de pollo, células de pato (por ejemplo, línea de células AGE1. CR y AGEl.CR.pIX (ProBioGen) , que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y WO2005/042728 ) , células EB66, y similares .

Los sistemas adecuados de expresión de células insectiles, tal como sistemas de baculovirus, se conocen por aquellos expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) . Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/células insectiles están comercialmente disponibles en forma de equipo de, ínter alia, Invitrogen, San Diego CA. Los sistemas de expresión de células aviares también se conocen por aquellos expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de los estados unidos Nos. 5,340,740, 5,656,479, 5,830,510, 6,114,168, y 6,500,668, Patente Europea No. EP 0787180B; Solicitud de Patente Europea No. EP03291813.8 ; WO03/043415 y WO03/076601 WO . De manera similar, también en la técnica se conocen sistemas de expresión de células bacterianas y mamíferas y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds . , 1989) Butterworths , Londres.

En general, la secuencia de aminoácidos de un ecto-dominio no escindido de proteína F de RSV se altera para impedir la escisión en los sitios de escisión con furina en aproximadamente la posición 109/110 y aproximadamente la posición 136/137, pero contiene un sitio de escisión de proteasa, que se presenta de forma natural o que se introduce, que cuando se escinde produce una subunidad Fi y una subunidad F2. Por ejemplo, el polipéptido no escindido de ecto-dominio proteína F de RSV puede tener una secuencia de aminoácidos que se altera para impedir la escisión en los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 109/110 y aproximadamente la posición 136/137, pero contienen una o más sitios de escisión de proteasa que se presenta de forma natural o que se introducen de aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161.

Una variedad de secuencias particulares de aminoácidos que permitirá que se produzcan y expresen por células hospedadoras los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, incluyendo secuencias de aminoácidos que no se escinden en los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 109/110 y en aproximadamente la posición 136/137 se pueden diseñar y contemplar fácilmente por un experto en la técnica. En general, se reemplazan o suprimen independientemente uno o más aminoácidos que son parte de, o que están localizados cerca de, los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 109/110 y aproximadamente la posición 136/137. Algunas sustituciones y supresiones de aminoácido que son adecuadas para impedir la escisión de los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se conocen. Por ejemplo, las sustituciones R108N, R109N, R108N/R109N, que inhibe la escisión en 109/110, y la sustitución K131Q o la supresión de los aminoácidos en las posiciones 131-134, que inhiben la escisión en 136/137, se han descrito en González-Reyes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A, 98:9859-9864 (2001). Un polipéptido no escindido de ecto-dominio F de RSV que contiene las sustituciones de aminoácidos R108N/R109N/K131Q/R133Q/R135Q/R136Q se ha descrito. Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Virol . 85:3677687 (2004). Como se describe en detalle en la presente, las secuencias adicionales de aminoácidos de proteína F de RSV que dan por resultados que el polipéptido de ecto-dominio F de RSV se segregue de una célula hospedadora no escindida contienen sitios alterados de escisión con furina, por ejemplo, alteran secuencias de aminoácidos en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136. Los sitios alterados de escisión con furina contienen al menos una sustitución o supresión de aminoácido en aproximadamente las posiciones 106-109, y al menos una sustitución o supresión de aminoácido en aproximadamente las posiciones 133-136.

De manera similar, una variedad de secuencias particulares de aminoácidos de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, que se presenta de forma natural o se introduce) que cuando se escinden producen una primera subunidad que comprende una Fj. y una segunda subunidad que comprende F2 , son posibles y se pueden diseñan y contemplar fácilmente. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína F de RSV de aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161 contiene sitios de escisión de tripsina, y se pueden escindir uno o más de los sitios de escisión de tripsina por tripsina para generar las subunidades F1 y F2. Si se desea, se pueden introducir uno o más sitios adecuados de reconocimiento de proteasa en el polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV, por ejemplo, entre aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161. Los sitios introducidos de reconocimiento de proteasa se pueden escindir usando la proteasa apropiada para generar subunidades Fi y F2. Cuando se introduce un sitio de reconocimiento de proteasa en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV, se prefiere que el sitio se reconozca por una proteasa que no escinde el ecto-dominio de la proteína F de RSV que se presenta de forma natural.

El método de este aspecto de la invención incluye: a) proporciona polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen un sitio de escisión de proteasa que, cuando se escinde, produce subunidades Fi y F2, y b) escindir los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV con una proteasa que conoce el sitio de escisión de proteasa. En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV con tienen sitios alterados de escisión de furina, y los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan de una célula hospedadora que los produce no escindidos en los sitios de escisión de furina en aproximadamente las aproximadamente 106-109 y aproximadamente las posiciones 131-136.

Los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, se pueden purificar al grado deseado. Por ejemplo, los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, se pueden proporcionar como un lisado celular, homogenado celular o medio acondicionado de cultivo celular que está sustancialmente sin procesar (por ejemplo, no procesado, o sólo clarificado) , o en forma parcial o sustancialmente purificada. En ejemplos particulares, los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, se proporcionan en medio acondicionado de cultivo celular seleccionado del grupo que consiste de medio acondicionado de células insectiles, medio acondicionado s de células mamíferas, medio acondicionado de células aviares, medio acondicionado de células de levadura, medio acondicionado de células de Tetrahymena, y combinaciones de esto .

Se prefiere en general que los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, se purifiquen, por ejemplo, se purifiquen para que sean al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o sustancialmente homogéneos. Como se escribe en la presente, los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden purificar fácilmente de lípidos y lipoproteínas, en tanto que las formas escindidas convencionalmente producidas de proteína F de RSV se co-purifican con contaminantes de lípidos y lipoproteínas . Por consiguiente, cuando se proporcionan polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, purificados, el método se puede usar para producir fácilmente una composición que contiene ecto-dominios escindidos de proteína F de RSV que están sustancialmente libres de lípidos o lipoproteínas.

En la técnica son bien conocidos y convencionales los métodos adecuados para escindir polipéptidos usando una proteasa. En general, los polipéptidos que se van a escindir se combinan con una cantidad suficiente de proteasa bajo condiciones (por ejemplo, pH, concentración de polipéptido de proteasa, temperatura) adecuadas . para la escisión de polipéptido. Muchas proteasas adecuadas están comercialmente disponibles, y las condiciones adecuadas para realizar la escisión de polipéptidos son bien conocidas para muchas proteasas. Si se desea, los polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden purificar después de la escisión con proteasa. En un ejemplo del método, los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se proporcionan que contienen un péptido intacto de fusión, tal como un polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV en el cual no se sustituye ni suprimen ninguno de los aminoácidos de las posiciones 137-154. En algunas modalidades, se purifican los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados. Los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, que contienen un péptido intacto de fusión, se escinden, y la escisión da por resultado la formación de rosetones de trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. Si se desea, los rosetones se pueden purificar adicionalmente usando cualquiera de los métodos adecuados, tal como cromatografía de exclusión de tamaño.

En otro ejemplo del método, los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se proporcionan que contienen un péptido alterado de fusión, tal como un polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV en el cual se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-152, aproximadamente los aminoácidos 137-153, aproximadamente los aminoácidos 137-145 o aproximadamente los aminoácidos 137-142. También se han descrito otras supresiones adecuadas del péptido de fusión, tal como la supresión de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Virol . , 85:3677-3687 (2004).

En algunas modalidades, se purifican los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados. Se escinden los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, y la escisión da por resultado la formación de trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. Si se desea, los trímeros se pueden purificar usando adicionalmente cualquiera de los métodos adecuados, tal como cromatografía de exclusión de tamaño.

En ejemplos particulares del método, los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados contienen al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de furdel y delp23 furdel (por ejemplo, furdel escindible con tripsina, homogénea, delp23 furdel escindible con tripsina, homogéneo, o una mezcla de furdel escindible con tripsina y delp23 furdel escindible con tripsina) . Los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, se escinden, por ejemplo con tripsina, y la escisión da por resultado la formación de trímeros escindidos, rosetones de trímeros escindidos, o una combinación de trímeros escindidos y rosetones de trímeros escindidos de polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. Si se desea, los trímeros escindidos y/o rosetones de trímeros escindidos se pueden purificar adicionalmente usando cualquiera de los métodos adecuados, tal como cromatografía de exclusión de tamaño.

Métodos para Producir Polipéptidos no Escindidos de Ecto-Dominio de Proteína F de RSV En otro aspecto, la invención es un método para preparar una composición que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. En general, el método comprende proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, tal como un lisado celular, homogenado celular o medio acondicionado de cultivo celular, y luego se purifican los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. Como se describe en el presente, se ha descubierto que los monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, purificados, pueden auto-asociarse para formar trímeros no escindidos, y que hay una mezcla de monómeros no escindidos y trímeros no escindidos o un equilibrio entre los monómeros no escindidos y trímeros no escindidos. Sin desear que se una alguna teoría particular, se cree que el equilibrio favorece el monómero, pero que el equilibrio cambiará hacia el trímero en soluciones concentradas.

El método de este aspecto de la invención incluye: a) proporcionar material biológicos que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, tal como un lisado celular, homogenado celular o medio acondicionado de cultivo celular; y b) purificar monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológicos. En algunas modalidades, se purifican monómeros no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, o se purifican trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, o se purifican monómeros y trímeros .

En general, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV contiene sitios alterados de escisión de o con furina, y los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan de una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161 (incluyendo en los sitios de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 131-136) . En ejemplos más particulares, el material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV; incluye al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de furmt, furdel, delp21 furx, delp23 furx, delp21 furdel, delp23 furdel, y la construcción de factor Xa, que se puede escindir usando el factor Xa.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV contiene sitios alterados de escisión de furina, y otros sitios de escisión de proteasa, (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se alteran o suprimen para impedir la escisión con proteasa (por ejemplo, con tripsina) .

Por ejemplo, es bien conocido que tripsina escinde. después de los residuos de lisia y arginina. En ciertas modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos del polipéptido no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV contiene sitios alterados de escisión de furina, se suprimen o reemplazan uno o más residuos de lisina y/o arginina (por ejemplo, todos los residuos de lisina y arginina) presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 con un aminoácido que no es lisina y arginina, los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan en una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV no se escinden por tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161. De manera preferente, los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV no se escinden por tripsina cuando una solución de 1 mg/ml de polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV (diluido en Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 300 mM) se trata con un volumen uno-uno mil de solución de tripsina (tripsina de plasma bovino diluida a una concentración de 1 mg/ml en Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM; relación de masa final en reacción de digestión es 0.001:1 tripsina: ecto-dominio F de RSV; tripsina usada a 10-15 unidades BAEE por mg de proteínas) durante 1 hora a 37 °C.

Si se desea, los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV (por ejemplo, los polipéptidos que contienen sitios alterados de escisión de furina, y el polipéptido que contiene sitios alterados de escisión de furina y sitios alterados de escisión de tripsina) puede contener adicionalmente un péptido de fusión alterado, tal como un polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV en el cual, por ejemplo, se reemplazan aproximadamente los aminoácidos 137-152, se reemplazan aproximadamente los aminoácidos 137-154, se reemplazan aproximadamente los aminoácidos 137-145 o se reemplazan aproximadamente los aminoácidos 137-142. También se han descrito otras supresiones adecuadas de péptido de fusión, tal como la supresión de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Virol . , 85:3677-3687 (2004) .

En modalidades particulares, el método incluye: a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, tal como un lisado celular, homogenado celular o medio acondicionado de cultivo celular, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV contiene sitios alterados de escisión con o de furina, los residuos de lisina y arginina presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se suprimen o reemplazan con un aminoácido que no es lisina ni arginina, los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan de una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV no se escinden por tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161; y b) purificar monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico .

En ejemplos más particulares, el material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, incluye al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de Furx, Furx R113Q K123N K124N, delp21 furx y delp23 furx.

En otras modalidades particulares, el método incluye: a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV en los cuales se muta el péptido de fusión (por ejemplo, al menos una porción del polipéptido de fusión se suprime) , tal como un lisado celular, homogenado celular o medio acondicionado de cultivo celular; y b) purificar polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico. El polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV puede contener sitios alterados de escisión de furina, y los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan en una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161 (que incluye en los sitios de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 131-136) . Si se desea, el polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV con sitios alterados de escisión de furina contiene además sitios alterados o suprimidos para otra proteasa (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 para impedir la escisión con o de proteasa (por ejemplo, con o de tripsina) . Por ejemplo, se suprimen o reemplazan uno o más residuos de lisina y/o arginina, (por ejemplo, todos los residuos de lisina y arginina) presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 con un aminoácido que no es lisina ni ariginina, y los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV no se escinden por tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161.

Los monómeros, trímeros y combinaciones de monómeros y trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden purificar al grado seseado. En general se prefiere que los monómeros o trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se purifiquen, por ejemplo, para que sean al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o sustancialmente homólogos. Como se describe en la presente, los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden purificar fácilmente de lípidos y lipoproteínas , por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño. Por consiguiente, el método se puede usar para producir fácilmente una composición que contiene monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas.

En un ejemplo, el método incluye proporcionar medio acondicionado de cultivo de células insectiles, medio acondicionado de cultivo de células mamíferas, medio acondicionado de células aviares, medio acondicionado de células de células de levadura, medio acondicionado de células de Tetrahymena, o una combinación de esto. En algunas modalidades, se purifican los trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. En otras modalidades, se purifican monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. En otras modalidades, se purifican monómeros y trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

Métodos para Producir Polipéptidos Escindidos de Ecto-Dominio de Proteína F de RSV con Péptidos de Fusión, Alterados En un aspecto, la invención es un método para preparar una composición que contiene polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen un péptido de fusión, alterado. Cuando los polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV que no contienen sitios alterados de escisión con o de furina, se expresan en células hospedadoras, las células hospedadoras procesan los polipéptidos, en parte al escindir el polipéptido en los sitios de furina en aproximadamente las posiciones 109/110 y aproximadamente las posiciones 136/137 para producir subunidades y F2. Los polipéptidos procesados se segregan en el cultivo y se pueden recuperar como subunidades Fi-F2 asociadas (por ejemplo, disulfuro que une la subunidad Fi y F2) , que pueden formar rosetones de trímeros a través de agregación de péptidos de fusión, expuestos. Los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen péptidos de fusión alterados se pueden producir en y segregar de células hospedadoras como subunidades Fi-F2 asociadas, y de manera preferente no se agregan en rosetones o con lípidos o contaminantes de lipoproteína. Sin que se desee que se una por alguna teoría particular, se cree que los polipéptidos no forman rosetones ni se asocian con contaminantes de lípidos y lipoproteínas debido a que el péptido de fusión alterado no media la agregación.

El método de este aspecto de la invención incluye: a) proporcionar un material biológicos que contiene polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contiene un péptido de fusión alterado (por ejemplo, al menos una porción del péptido de fusión se suprime) , tal como un lisado celular, homogenado celular o medio acondicionado de cultivo celular; y b) purificar polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico. Los polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, purificados, se pueden purificar como trímeros escindidos, rosetones de trímeros escindidos, una mezcla de trímeros escindidos y rosetones de trímeros escindidos. Los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, adecuados, que contienen péptidos de fusión alterados contienen sitios de escisión de furina, escindibles en aproximadamente 109/110 y aproximadamente 136/137 y contienen adicionalmente un péptido de fusión alterado como se describe en la presente. Por ejemplo, un polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV en el cual se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-152, se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-153, se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-145, se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-146 o se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-142 se pueden usar en el método. En ejemplos particulares, el material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV; incluyen al menos la supresión 1 de péptido de fusión.

Los polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV (por ejemplo, trímeros escindidos o una mezcla de trímeros escindidos y rosetones de trímeros escindidos), se pueden purificar al grado deseado. En general se prefiere que los polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se purifiquen, por ejemplo, que sean al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o sustancialmente homogéneos. Como se describe en la presente, los polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen un polipéptido de fusión alterado se pueden purificar fácilmente de lípidos y lipoproteínas , por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño. Por consiguiente, el método se puede usar para producir fácilmente una composición que contiene trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, rosetones de trímeros escindidos, una combinación de trímeros escindidos y rosetones de trímeros escindidos que están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas.

Métodos para Producir Polipéptidos de Ecto-Dominio de Proteína F de RSV con Mutaciones de Furina C-terminal En otro aspecto, la invención es un método para preparar una composición que contiene polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de RSV el método para preparar polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. Sin que se desee que se una a alguna teoría particular, se cree que los polipéptidos no escindidos, C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se escinden por células que producen las proteínas den el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 109/110, pero no en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, y se segregan en el medio como una subunidad Fi que está asociada con una subunidad F2. Además se cree que el péptido de fusión hidrófobo no está expuesto en los polipéptidos no escindidos, C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV y, por lo tanto, los polipéptidos no escindidos C-terminales no se asocian con contaminantes de lípidos y lipoproteínas . Como se describe adicionalmente en la presente, los ecto-dominios no escindidos C-terminales de proteína F de RCV se pueden escindir adicionalmente para producir una subunidad Fl7 en la cual el término amino es de la posición 110 a aproximadamente la posición 161, que está asociado con una subunidad F2. Estas subunidades Fi y F2, que se pueden purificar como trímeros, rosetones de trímeros, una mezcla de trímeros y rosetones de trímeros .

En general, la secuencia de aminoácidos de un ecto-dominio no escindido C-termina de proteína F de RSV se altera para impedir la escisión en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, pero contiene un sitio de escisión de proteasa que se presenta de forma natural o se introduce, que cuando se escinde produce una subunidad Fi, en la cual el término amino es de la posición 110 a aproximadamente la posición 161, y una subunidad F2. Por ejemplo, el polipéptido no escindido, C-terminal de ecto-dominio de proteína F de RSV puede tener una secuencia de aminoácidos que se altera para impedir la escisión en los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, pero contiene uno o más sitios de escisión de proteasa que se presentan de forma natural o se introducen de aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161. En un ejemplo particular, la secuencia de aminoácidos de un ecto-dominio no escindido C-terminal de proteína F de RSV se altera para impedir la escisión en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, pero contiene un sitio de escisión de furina que se presenta de forma natural en aproximadamente la posición 109/110.

Una variedad de secuencias de aminoácidos particulares que permitirán que los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se produzcan y expresen por células hospedadoras , incluyendo secuencias de aminoácidos que no se escinden en los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137, se pueden diseñar y contemplar fácilmente por una persona experta en la técnica. En general, uno o más aminoácidos que son parte de, o que están localizados cerca de, los sitios de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137 se reemplazan o suprimen de forma independiente . Las sustituciones o supresiones adecuadas de aminoácido que impiden la escisión en aproximadamente la posición 136/137 se describen en la presente. Por ejemplo, la sustitución K131Q, la supresión de los aminoácidos en las posiciones 131-134, o las sustituciones K131Q/R133Q/ R135Q/R136Q, cada una de las cuales inhibe la escisión en 136/137, se pueden usar. En ciertas modalidades, los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV comprende al menos una sustitución o supresión de aminoácidos en aproximadamente las posiciones 133-136.

De manera similar, son posibles una variedad de secuencias de aminoácidos particulares de polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV que contiene un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, que se presentan de forma natural o se introduce) que cuando se escinden producen una primera subunidad que comprende una Fj y una segunda subunidad que comprende F2, y se pueden diseñan y contemplar fácilmente. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína F de RSV de aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161 contiene sitios de escisión de tripsina, y uno o más de los sitios de escisión de tripsina se pueden escindir por tripsina para generar las subunidades Fi y F2. Si se desea, se pueden introducir uno o más sitios adecuados de reconocimiento de proteasa en el polipéptido no escindido C- terminal de ecto-dominio de proteína F de RSV, por ejemplo, entre aproximadamente las posición 101 a aproximadamente la posición 161. Los sitios de reconocimiento de proteasa, introducidos, se pueden escindir usando la proteasa apropiada para generar subunidades Fi y F2. Cuando se introduce un sitio de reconocimiento de proteasa en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido no escindido C-terminal de ecto-dominio de proteína F de RSV, se prefiere que el sitio se reconozca por una proteasa que no escinde el ecto-dominio de proteína F de RSV que se presenta de forma natural.

Los polipép idos no escindidos C- terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden producir usando cualquier método adecuado. Un método preferido es por expresión recombinante de construcciones que codifican para un ecto-dominio de proteína F de RSV en el cual se altera esa secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de furina en aproximadamente las posiciones 136/137, de modo que los polipéptidos no escindidos, C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se segreguen por una célula hospedadora que produce los polipéptidos no escindidos en el sitio de escisión de furina en aproximadamente la posición 136/137. De manera preferente, el polipéptido no escindido C-terminal de ecto-dominio de proteína F de RSV se segrega por una célula hospedadora que lo produce como una subunidad Fi que está asociada con una subunidad F2, en donde el término amino de la subunidad Fx es de la posición 132 a aproximadamente la posición 161, pero no en la posición 137. Los polipéptidos no escindidos, C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden producir usando cualquier célula hospedadora adecuada, como se describe en la presente.

Un método de este aspecto de la invención incluye: a) proporcionar polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV que comprenden un sitio alterado de escisión de furina en la posición 136/137, y los polipéptidos no escindidos, C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan de una célula que los produce en la forma de un fragmento F2 que está asociado con una subunidad que comprende Fi pero no está escindido en la posición 136/137, y b) escindir los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, con una proteasa que escinde el ecto-dominio de proteína F de RSV en un sitio entre las posiciones 101 y 161, produciendo de este modo la composición. En modalidades particulares, el paso b) comprende escindir los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteina F de RSV, proporcionados, con una proteasa que escinde el ecto-dominio de proteína F de RSV en un sitio entre aproximadamente las posiciones 101 y 132, o aproximadamente las posiciones 132 y 161, o aproximadamente las posiciones 110 y 132. De manera alternativa o adicionalmente, en algunas modalidades, los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV pueden comprender un sitio alterado de escisión de furina en la posición 136/137, con la condición que el sitio alterado de escisión de furina no sea la supresión de los aminoácidos 131-134. En ejemplos particulares, el material biológico que contiene polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV; incluye al menos el polipéptido de furina N-terminal.

Los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, se pueden purificar al grado deseado. Por ejemplo, los polipéptidos no escindidos, C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados se pueden proporcionar en un lisado celular, homogenado celular, o medio acondicionado de cultivo celular que está sustancialmente sin procesar (por ejemplo, no procesado o sólo clarificado) , o en una forma parcial o sustancialmente purificada. En ejemplos particulares, los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteina F de RSV proporcionados se proporcionan en medio acondicionado de cultivo celular seleccionado del grupo que consiste de medio acondicionado de células insectiles, medio acondicionado de células mamíferas, medio acondicionado de células aviares, medio acondicionado de células de levadura, medio acondicionado de células de Tetrahymena y combinaciones de esto.

En general se prefiere que los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados se purifique, por ejemplo, se purifiquen para que sean al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o sustancialmente homogéneos. Como se describe en la presente, los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden purificar fácilmente de lípidos y lipoproteínas, en tanto que las formas escindidas convencionalmente producidas de proteína F de RSV se co-purifican con contaminantes de lípidos y lipoproteínas. Por consiguiente, cuando se proporcionan polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, purificados, el método se puede usar para producir fácilmente una composición que contiene ecto-dominios escindidos de proteína F de RSV que están sustancialmente libres de lípidos o fosfolípidos .

Los métodos adecuados para escindir polipéptidos usando una proteasa son bien conocidos y convencionales en la técnica. En general, los polipéptidos que se van a escindir se combinan con una cantidad suficiente de proteasa bajo condiciones (por ejemplo, pH, concentración de polipéptido de proteasa, temperatura) adecuadas para la escisión del polipéptido. Están comercialmente disponibles muchas proteasas adecuadas y las condiciones adecuadas para realizar la escisión de polipéptido son bien conocidas para muchas proteasa. Si se desea, los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden purificar después de la escisión con proteasa.

En un ejemplo del método, se proporcionan polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen un péptido intacto de fusión, tal como un polipéptido no escindido C-terminal de ecto-dominio de proteína F de RSV en el cual se no sustituyen ni suprimen ninguno de los aminoácidos de las posiciones 137-154. En otro ejemplo del método, se proporcionan polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen un péptido alterado de fusión, tal como un polipéptido no escindido C-terminal de ecto-dominio de proteína F de RSV en el cual se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-152, aproximadamente los aminoácidos 137-153, aproximadamente los aminoácidos 137-145 o aproximadamente los aminoácidos 137-142. También se han descrito otras supresiones adecuadas de péptido de fusión, tal como la supresión de los aminoácidos en las posiciones 137-146. Ruiz-Arguello et al., J. Gen. Virol. , 85:3677-3687 (2004).

En algunas modalidades, se purifican los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados. Se escinden los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados, y la escisión da por resultado la formación de trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. Si se desea, los trímeros se pueden purificar adicionalmente usando cualquier método adecuado, tal como cromatografía de exclusión de tamaño.

En ejemplos particulares del método, los polipéptidos no escindidos, C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados contienen al menos el polipéptido de furina en N-terminal (Figura 1) . Se escinden los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, por ejemplo con tripsina, y la escisión da por resultado la formación de trímeros escindidos, rosetones de trímeros escindidos, o una combinación de trímeros escindidos y rosetones de trímeros escindidos de polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV. Si se desea, los trímeros escindidos y rosetones de trímeros escindidos se pueden purificar adicionalmente usando cualquier método adecuado, tal como cromatografía de exclusión de tamaño.

Otro método de este aspecto de la invención incluye a) proporcionar un material biológico, tal como un lisado celular, homogenado celular o medio acondicionado de cultivo celular, que contiene polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV que comprenden un sitio alterado de escisión de furina en la posición 136/137, y los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV solubles se segregan en una célula que los produce en la forma de un fragmento F2 que está asociado con una subunidad que comprende Fi pero no está escindido en la posición 136/137, con la condición que el sitio de escisión de furina alterado no esa la supresión de los aminoácidos 131-134; y b) purificar los polipéptidos no escindidos, C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico, produciendo de este modo la composición. De manera preferente, el término amino de la subunidad Fi es de aproximadamente la posición 110 a aproximadamente la posición 132. De manera más preferente, el término amino de la subunidad F es aproximadamente la posición 110. Es particularmente preferido que el término amino de la subunidad Fi no sea la posición 137. En ejemplos particulares, el material biológico que contiene polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, incluye al menos el polipéptido de furina N-terminal.

Si se desea, el polipéptido no escindido, C-terminal de ecto-dominio de proteína F de RSV contiene además sitios alterados o suprimidos para otras proteasas (por ejemplo, sitios de escisión de tripsina) entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 para impedir la escisión de o con proteasa (por ejemplo, de o con tripsina) . Por ejemplo, se suprimen o reemplazan uno o más residuos de lisina y/o arginina (por ejemplo, todos los residuos de lisina y arginina, presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 con un aminoácidos que no es ni lisina ni arginina, y los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV no se escinden por tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161. Los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV pueden contener un péptido de fusión intacto o un péptido de fusión alterado, como se describe en la presente.

Los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, por ejemplo, monómeros, trímeros y combinaciones de monómeros y trímeros se pueden purificar al grado deseado. En general, se prefiere que los monómeros o trímeros de polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se purifiquen, por ejemplo, para que sean al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o sustancialmente homogéneos. Como se describe en la presente, los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden purificar fácilmente de lípidos y lipoproteínas , por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño. Por consiguiente, el método se puede usar para producir fácilmente una composición que contiene polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, por ejemplo, monómeros, trímeros, una combinación de monómeros y trímeros, que están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas. En ejemplos particulares del método, los polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV contiene al menos el polipéptido de furina C-terminal (Figura l) .

En un ejemplo, el método incluye proporcionar medio acondicionado de cultivo de células insectiles, medio acondicionado de cultivo de células mamíferas, medio acondicionado de células aviares, medio acondicionado de células de levadura, medio acondicionado de células de Tetrahymena, o una combinación de estos. En algunas modalidades, se purifican los trímeros de polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV.

En otras modalidades, se purifican monómeros de polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV. En otras modalidades, se purifican monómeros y trímeros de polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV.

ARN Auto-Replicante Los polipéptidos RSV-F descritos en la presente se pueden producir por expresión de ácidos nucleicos recombinantes que codifican para los polipéptidos en las células de un sujeto. Los ácidos nucleicos preferidos que se pueden administrar a un sujeto para provocar la producción de polipéptidos RSV-F son moléculas de ARN auto-replicantes. Las moléculas de ARN auto-replicantes de la invención se basan en el ARN genómico de virus de ARN, pero carecen de los genes que codifican para una o más proteínas estructurales. Las moléculas de ARN auto-replicantes son capaces de ser traducidas para producir proteínas no estructurales del virus de ARN y proteínas heterólogas codificadas por el ARN auto-replicante .

El ARN auto-replicante contiene en general al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de replicasa viral, proteasas virales, elicasas virales y otras proteínas virales no estructurales, y también comprende secuencias de replicación cis-activas de 5 ' -3 ' -extremo, y si se desea, secuencias heterólogas que codifican para secuencias de aminoácidos deseadas (por ejemplo, una proteína como un antígeno) . Un promotor subgenómico que dirige la expresión de la secuencia heteróloga se puede incluir en el ARN auto-replicante. Si se desea, la secuencia heteróloga se puede fusionar en cuadro a otras regiones codificadoras en el ARN auto-replicante y/o puede estar bajo el control de un sitio de entrada a ribosoma internos (IRES, por sus siglas en inglés) .

Las moléculas de ARN auto-replicantes de la invención se pueden diseñar de modo que la molécula de ARN auto-replicante no pueda inducir producción de partículas virales infecciosas. Esto se puede lograr, por ejemplo, al omitir uno o más genes virales que codifican para proteínas estructurales que son necesarias para la producción de partículas virales en el ARN auto-replicante. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN auto-replicante se basa en un alfa-virus, tal como virus de Sinebis (SIN), virus forestal Semliki y virus de encefalitis equina venezolana virus (VEE) , se pueden omitir uno o más genes que codifican para proteínas estructurales virales, tal como capsida y/o glicoproteínas de envoltura, si se desea, las moléculas de ARN auto-replicante de la invención se pueden diseñar para inducir producción de partículas virales infecciosas que están atenuadas o son virulentas, o para producir partículas virales que son capaces de una ronda individual de infección subsiguiente.

Una molécula de ARN auto-replicante puede, cuando se distribuye una célula vertebrada aún sin ninguna proteína, conducir a la producción de múltiples ARN hijos por transcripción de sí mismas (o de una copia antisentido de la misma) . El ARN auto-replicante se puede traducir directamente después de la distribución o administración a una célula, y esta traducción proporciona ARN-polimerasa dependiente de ARN que entonces produce transcriptos del ARN administrado. De esta manera, el ARN administrado o distribuido conduce a la producción de múltiples ARN hijos. Estos transcriptos son antisentido con relación al ARN distribuido y se pueden traducir por sí mismos para proporcionar expresión in situ de un producto génico, o se pueden transcribir para proporcionar transcriptos adicionales con el mismo sentido con el ARN distribuido que se traducen para proporcionar expresión in situ del polipéptido RSV-F codificado.

Un sistema adecuado para lograr la auto-replicación es usar un replicón de ARN basado en alfavirus. Estos replicones de hebra positiva se traducen después de la distribución a una célula para dar una replicasa (o replicasa-transcriptasa) . La replicasa se traduce como una poliproteína que se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias genómicas de hebra - del ARN distribuido de hebra +. Estos transcriptos de hebra - se pueden transcribir por sí mismos para da copias adicionales del ARN progenitor de hebra + y también para dar un transcripto subgenómico que codifica para el polipéptido RSV-F. La traducción del transcripto subgenómico conduce de esta manera a la expresión in situ del polipéptido RSV-F por la célula infectada. Los replicones adecuados de alfa-virus pueden usar una replicasa de un virus de sindbis, un virus forestal de semliki, un virus de encefalitis equina oriental, un virus de encefalitis equina venezolana, etc.

Una molécula de ARN auto-replicante preferida codifica de esta manera para (i) una ARN-polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN auto-replicante y (ii) un polipéptido RSV-F. La polimerasa puede ser una replicasa de alfa-virus, por ejemplo que comprende proteína nsP4 de alfa-virus.

En tanto que los genomas naturales de alfa-virus codifican para proteínas de viriones estructurales además de la poliproteína de replicasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN auto-replicante basada en alfa-virus, de la invención, no codifique para proteínas estructurales de alfa-virus. De esta manera, el ARN auto-replicante puede conducir a la producción de copias de ARN genómico de sí mismo en una célula, pero no la producción de viriones de alfa-virus que contienen ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, diferentes de un alfa-virus tipo silvestre, la molécula de ARN auto-replicante no puede perpetuarse por sí misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfa-virus que son necesarias para la perpetuidad en virus tipos silvestres están ausentes de los ARN auto-replicante de la invención y su lugar se toma por genes que codifican para el producto génico deseado, tal que el transcripto subgenómico codifica para el producto génico deseado en lugar de las proteínas de viriones de alfa-virus estructurales .

De esta manera, una molécula de ARN auto-replicante útil con la invención puede tener dos cuadros de lectura abiertos. El primer cuadro de lectura abierto (5') codifica para una replicada; el segundo cuadro de lectura abierto (3') codifica para un polipéptido RSV-F. En algunas modalidades el ARN puede tener cuadros de lectura abiertos adicionales (etapa posterior) por ejemplo que codifican para productos génicos adicionales, deseados. Una molécula de ARN auto-replicante puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.

En un aspecto, la molécula de ARN auto-replicante se deriva de o se basa de un alfa-virus. En otros aspectos, la molécula de ARN auto-replicante se deriva de o se basa en un virus diferente de un alfa-virus, de manera preferente, un virus de ARN de hebra positiva, y de manera más preferente un picornavirus, flavivirus, rubivirus, pestivirus, hepacivirus, calicivirus, o coronavirus. Las secuencias adecuadas de alfa-virus tipo silvestre son bien conocidas y están disponibles de depositarios de secuencia, tal como la American Type Culture Collection, Rockville, Md. Los ejemplos representativos de alfa-virus adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368) , virus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240) , Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241) , Virus de encefalitis de equina oriental (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924) , virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR- 1243) , Kyzylagach (ATCC VR-927) , Mayaro (ATCC VR-66) , virus Mayaro (ATCC VR-1277) , Middleburg (ATCC VR-370) , virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371) , virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245) , virus Ross River (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), Semliki Forest (ATCC VR-67, ATCC VR-1247) , virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925) , Triniti (ATCC VR-469) , encefalitis equina venezolana (ATCC VR-374) , (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532) , encefalitis equina oriental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR- 9 6 ) , y Y-62-33 (ATCC VR-375) .

El ARN auto-replicante se puede asociar con un sistema de distribución o administración. El ARN auto-replicante se puede administrar con o sin un adyuvante.

Sistema de Distribución de ARN El ARN auto-replicante de la invención es adecuado para la distribución en una variedad de modalidades, tal como distribución de ARN desnudo o en combinación con llpidos, polímeros u otros compuestos que facilitan la entrada en las células. Las moléculas de ARN auto-replicante de la presente invención se pueden introducir en células objetivo o sujetos usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, por inyección directa, microinyección electroporación, lipofección, biolística, y similares. La molécula de ARN auto-replicante también se puede introducir en células por medio de endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 6,090,619; Wu y u, J. Biol . Chem. , 263:14621 (1988); y Curiel et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA, 88:8850 (1991). Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6,083,741 describe la introducción de un ácido nucleico exógeno en células mamíferas al asociar el ácido nucleico a una porción de policatión (por ejemplo, poli-L-lisina que tiene 3-100 residuos de lisina) , que por sí misma se acopla a una porción que se une a receptor de integrina (por ejemplo, un péptido cíclico que tiene la secuencia Arg-Gly-Asp) .

La molécula de ARN auto- replicante de la presente invención se puede distribuir en células mediante amfilos. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 6,071,890. Típicamente, una molécula de ácido nucleico puede forrar un complejo con el amfifilo catiónico. Las células mamíferas puestas en contacto con el complejo pueden tomarlo fácilmente.

El ANR auto-replicante se puede distribuir como ANR desnudo (por ejemplo sólo como una solución acuosa de ARN) pero, para mejorar la entrada en células y también efectos intercelulares subsiguiente, el ARN auto-replicante se administra de manera preferente en combinación con un sistema de distribución, tal como un sistema de distribución en partículas o de emulsión. Los expertos en la técnica conocen un gran número de sistemas de distribución. Los sistemas de distribución incluyen, por ejemplo, distribución basada en liposomas (Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose patente de los Estados Unidos No. 5,279,833; Brigham (1991) WO 91/06309; y Felgner et al. (1987) Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 84: 7413-7414) , así como el uso de vectores virales (por ejemplo, adenoviral (Por ejemplo, Berns et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: 95-104; Ali et al. (1994) Gene Ther. 1: 367-384; y Haddada et al. (1995) Curr. Top. Microbiol . Immunol . 199 (Pt 3): 297-306 para revisión), papilomaviral , retroviral (ver, por ejemplo, Buchscher et al. (1992) J. Virol . 66(5) 2731-2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66 (5) : 1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59; ilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); Wong-Staal et al., PCT/US94 /05700 , y Rosenburg y Fauci (1993) in Fundamental Immunology, Third Edition Paul (ed) Raven Press, Ltd., Nueva York y referencias en el mismo y Yu et al., Gene Therapy (1994) supra.), y vectores virales adeno-asociados (ver, West et al. (1987) Virology 160:38-47; Cárter et al. (1989) Patente de los Estados Unidos No. 4,797,368; Cárter et al. WO 93/24641 (1993) ; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94:1351 y Samulski (supra) para una revisión de vectores AAV; ver también, Lebkowski, patente de los Estados Unidos No. 5,173,414; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol . 5 (11) : 3251-3260 ; Tratschin, et al. (1984) Mol. Cell. Biol., 4:2072-2081; Hermonat y Muzyczka (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81:6466-6470; McLaughlin et al. (1988) y Samulski et al. (1989) J. Virol . , 63:03822-3828), y similares .

Tres sistemas de distribución particularmente útiles son (i) liposomas (ii) micropartículas de polímero no tóxicas y biodegradables (iii) emulsiones de aceite en agua submicrónicas , catiónicas.

Liposomas Varios lípidos amififílieos pueden formar bicapas en un ambiente acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo cabezal aniónico, catiónico o z iteriónico hidrófilo. La formación de liposomas de fosfolípidos aniónicos data de 1960, y se han estudiado lípidos formadores de liposomas catiónicos desde 1990. Estos fosfolípidos son aniónicos en tanto que otros son zwiteriónicos . Las clases adecuadas de fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidil etanolaminas, fosfatidilcolinas , fosfatidilserinas y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolípidos útiles se listan en la Tabla 20. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a, dioleoil-trimetilamonio-propano (DOTAP) , 1 , 2-disteariloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA) , 1,2-dioleiloxi-N, dimetil-3 -aminopropano (DODMA) , 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA) , 1,2-dilinoleniloxi-N, N-dimetil-3 -aminopropano (DLenDMA) . Los lípidos zwiteriónicos incluyen, pero no se limitan a, lípidos zwiteriónicos de acilo y lípidos zwiteriónicos de éter, los ejemplos de lípidos zwiteriónicos útiles son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden estar saturados o insaturados .

Los liposomas se pueden formar de un lípido individual o de una mezcla de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos aniónicos (ii) una mezcla de lípidos catiónicos (iii) una mezcla de lípidos zwiteriónicos, (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos, (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwiteriónicos (vi) una mezcla de lípidos zwiteriónicos y lípidos catiónicos (vii) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwiteriónicos. De manera similar, una mezcla puede comprender lípidos tanto saturados como insaturados . Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (zwiteriónico, saturado) , DlinDMA (catiónico, insaturado) , y/o DMPG (aniónico, saturado) . Donde se usa una mezcla de lípidos, no todos los lípidos componentes en la mezcla necesitan se amfifílicos, por ejemplo, se pueden mezclar con colesterol uno o más lípidos amfifílicos.

La porción hidrófila de un lípido puede estar PEGilada (es decir, modificada por unión covalente de un polietilen-glicol) . Esta modificación puede incrementar la estabilidad e impedir la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, se pueden conjugar lípidos a PEG usando técnicas tal como aquellas descritas en Heyes et al. (2005) J" Controlled Reléase 107:276-287.

Una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMPG y colesterol se usa en los ejemplos. Un aspecto separado de la invención es un liposoma que comprende DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol. Este liposoma encapsula preferentemente ARN, tal como un ARN auto-replicante, por ejemplo que codifica para un inmunógeno .

Los liposomas se dividen usualmente en tres grupos: vesículas multilamelares (MLV) ; vesículas pequeñas unilamelares (SUV) ; y vesículas unilamelares grandes (LUV) . Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimientos acuosos separados. Las SUV y LUV tienen una bicapa individual que encapsula un núcleo acuoso; típicamente las SUV tienen un diámetro <50nm, las LUV tienen un diámetro >50nm. Los liposomas útiles con la invención son de forma ideal LUV con un diámetro en el intervalo de 50-220nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) al menos 80% en número debe tener diámetros en el intervalo de 20-220nm, (ii) el diámetro promedio (Zav, por intensidad) de la población idealmente está en el intervalo de 40-200nm, y/o (iii) los diámetros deben tener un índice de polidispersidad <0.2.

En la técnica son bien conocidas las técnicas para preparar liposomas adecuados, ver, por ejemplo, Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers : Methods and Protocols. (ed. Weissig) . Humana Press, 2009. ISBN 160327359X; Liposome Technology, volumes I, II & III. (ed. Gregoriadis) . Informa Healthcare, 2006; and Functional Polimer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres , 25 microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot) . Citus Books, 2002. Un método útil comprende (i) una solución etanólica de lípidos (ii) una solución acuosa del ácido nucleico y (iii) , amortiguador, seguido por mezclado, equilibrio, dilución y purificación (Heyes et al. (2005) J Controlled Reléase 107:276-87.).

De manera preferente el ARN se encapsula dentro de los liposomas, y de este modo el liposoma forma una capa exterior alrededor de un núcleo acuoso que contiene ARN. Se ha encontrado que esta encapsulación protege el ARN de la digestión con RNasa. Los liposomas pueden incluir algún ARN externo (por ejemplo en la superficie de los liposomas) , pero al menos la mitad del ARN (y de manera ideal todo) está encapsulado .

Micropartículas Poliméricas Varios polímeros pueden formar micropartículas para encapsular o adsorbe el ARN. El uso de un polímero sustancialmente no tóxico significa que un receptor pueda recibir de forma segura las partículas, y el uso de un polímero biodegradable significa que las partículas se pueden metabolizar después de la distribución para evitar persistencia de larga duración. Los polímeros útiles también se pueden esterilizar, para ayudar a preparar formulaciones de grado farmacéutico.

Los polímeros no tóxicos biodegradables adecuados incluyen, pero no se limitan a, poli ( -hidroxi-ácidos) , ácidos polihidroxi-butíricos , polilactonas (incluyendo policaprolactonas) , polidioxanonas , polivalerolactona, poliortoésteres , polianhídridos , policianoacrilatos , policarbonatos derivados de tirosina, polivinilpirrolidinonas o poliéster-amidas, y combinaciones de estos.

En algunas modalidades, las partículas se forman a partir de poli (a-hidroxi-ácidos) , tal como poli (láctidos) ( "PLA" ) , copolímeros de láctido y glicólido tal como poli (D, L-láctido-co-glicólido) ("PLG") , y copolímeros de D,L-lactido y caprolactona . Los polímeros útiles de PLG incluyen aquellos que tienen una relación molar de láctido/glicólido que varía, por ejemplo, de 20:80 a 80:20 por ejemplo 25:75, 40:60, 45:55, 55:45, 60:40, 75:25. Los polímeros Útiles de PLG incluyen aquellos que tienen un peso molecular entre, por ejemplo, 5,000-200,000 Da por ejemplo entre 10,000-100,000, 20,000-70,000, 40,000-50,000 Da.

Las micropartículas tienen de forma ideal un diámetro en el intervalo de 0.02 µp? a 8\i . Para una composición que comprende una población de micropartículas con diferentes diámetros al menos 80% en número debe tener diámetros en el intervalo de 0.03-7µ?t?.

En la técnica son bien conocidas las técnicas para preparar micropartículas adecuadas, por ejemplo Functional Polimer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres , microcapsules & liposomes) . (eds. Arshady & Guyot) . Citus Books, 2002; Polimers in Drug Delivery. (eds. Uchegbu & Schatzlein) . CRC Press, 2006. (en particular capítulo 7) y Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines. (eds. Cohén & Bernstein) . CRC Press, 1996. Para facilitar la adsorción de AR , una micropartícula puede incluir un agente tensioactivo catiónico y/o lípido, por ejemplo como se describe en 0 'Hagan et al. (2001) J Virology75 : 9037-9043 ; y Singh et al. (2003) Pharmaceutical Research 20: 247-251. Una manera alternativa para producir micropartículas poliméricas es por moldeo y curación, por ejemplo como se describe en WO2009/132206.

Las micropartículas de la invención pueden tener un potencial zeta de entre 40-100 mV.

El ARN se puede adsorber a las micropartículas, y la adsorción se facilita al incluir materiales catiónicos (por ejemplo lípidos catiónicos) en la micropartícula .

Emulsiones Catiónicas de Aceite en Agua Se conocen emulsiones de aceite en agua para servir, adyuvante en vacunas de influenza, por ejemplo, el adyuvante MF59MR en el producto FLUADMR, y el adyuvante AS03 en el producto PREPANDRIX1^ . La distribución de ARN de acuerdo a la presente invención puede utilizar una emulsión de aceite en agua, con la condición que la emulsión incluya una o más moléculas catiónicas. Por ejemplo, se puede incluir un lípido catiónico en la emulsión para proporcionar una superficie positiva de gota a la cual puede unirse el ARN negativamente cargado.

La emulsión comprende uno o más aceites. Los aceites adecuados incluyen aquellos de, por ejemplo, una fuente animal (tal como pescado) o una fuente vegetal. El aceite es idealmente biodegradable (metabolizable) y biocompatible . Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite de coco y aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nuez. Se puede usar aceite de jojoba obtenido por ejemplo de semilla de jojoba. Los aceites de semilla incluyen aceite de cártamo, aceite de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de ajonjolí y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros granos cereales tal como trigo, centeno, arroz, teff, triticale similares también se puede usar. Se pueden preparar ásteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, en tanto que no se presenten de forma natural en los aceites de semilla, mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de nuez y semilla. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y de este modo se pueden usar. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica.

La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón, y aceite de ballena tal como esperma ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden usar en la presente. Varios aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y se refieren en general como terpenoides . También se puede usara ecualano, el análogo saturado de escualeno. Los aceites de pescado, incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica.

Otros aceites útiles son los tocoferóles, particularmente en combinación con escualeno. Donde la fase de aceite de una emulsión incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de los a, ß, ?, d, e o ?-tocoferoles, pero se prefieren a-tocoferóles . Se pueden usar tanto D-a-tocoferol como DL-a-tocoferol.. Un a-tocoferol preferido es de DL-a-tocoferol . Se puede usar una combinación de aceite que comprende escualeno y un tocoferol (por ejemplo DL-a-tocoferol) .

Las emulsiones preferidas comprenden escualeno, aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide insaturado, ramificado (C3oH5o; [ (CH3) 2C [=CHCH2CH2C (CH3) ] 2=CHCH2-] 2 ; 2, 6, 10, 15, 19, 23-hexametil-2 , 6 , 10, 14 , 18 , 22-tetracosahexaeno; CAS R 7683-64-9) .

El aceite en la emulsión puede comprender una combinación de aceites, por ejemplo, escualeno y al menos un aceite adicional.

El componente acuoso de la emulsión puede ser agua simple (por ejemplo w.f.i.) o puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un amortiguador por ejemplo sales de citrato o fosfato, tal como sales de sodio. Los amortiguadores típicos incluyen: un amortiguador de fosfato; un amortiguador de Tris; un amortiguador de borato; un amortiguador de succinato; un amortiguador de histidina; o un amortiguador de citrato. Se prefiere una fase acuosa amortiguada, y los amortiguadores se incluirán típicamente en el intervalo de 5-20mM.

La emulsión también puede incluir un lípido catiónico. De manera preferente, este lípido es un agente tensioactivo de modo que puede facilitar la formación y estabilización de la emulsión. Los lípidos catiónicos útiles contienen en general un átomo de nitrógeno que está cargado positivamente bajo condiciones fisiológicas, por ejemplo, como una amina terciaria o cuaternaria. Este nitrógeno puede, estar en el grupo cabezal hidrófilo de un agente tensioactivo anfifílico. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a: 1 , 2-dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) ropano (DOTAP) , 3' - [N- (?' ,?' -Dimetilaminoetano) -carbamoil] Colesterol (DC Colesterol) , dimetildioctadecilamonio (DDA por ejemplo el bromuro), 1, 2-Dimiristoil-3-Trimetil-AmonioPropano (DMTAP) , dipalmitoil (C16 : 0) trimetil-amonio-propano (DPTAP) , distearoiltrimetilamonio-propano (DSTAP) . Otros lípidos ¦ catiónicos útiles son: cloruro de benzalconio (BAK) , cloruro de bencetonio, cetraraida (que contiene bromuro de tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dedeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetil-amonio) , cloruro de cetilpiridinio (CPC) , cloruro de cetil-trimetilamonio (CTAC) , ?,?',?'-polioxietileno (10) -N-tallow-1, 3-diaminopropano, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetil-amonio, bromuro de alquil-trimetil-amonio mezclado, cloruro de bencildimetildodecilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecil-amonio, metóxido de benciltrimetilamonio, bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de dimetildioctadecil-amonio (DDAB) , cloruro de metilbenzetonio, cloruro de decametonio, cloruro de trimetilamonio mezclado con metilo, cloruro de metil-trioctilamonio) , cloruro de N, N-dimetil-N- [2 (2-metil-4- (1,1,3, 3tetrametilbutil) -fenoxi] -etoxi) etil] -benzenemeta-naminio (DEBDA) , sales de dialquildimetilamonio, cloruro de [1- (2, 3-dioleiloxi) -propil] -?,?,?, trimetilamonio, 1, 2-diacil-3- (trimetilamonio) -propano (grupo acilo =Dimiristoil , dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo) , 1, 2-diacil-3-(dimetilamonio) propano (grupo acilo=dimiristoil, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), 1, 2-dioleoil-3- (4 ' -trimetil-amonio) butanoil-sn-glicerol, éster de 1 , 2-dioleoil-3-succinil-sn-glicerol-colina, colesteril- (4 ' -trimetilamonio) butanoato) , sales de N-alquil-piridinio (por ejemplo bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio) , sales de N-alquilpiperidinio, electrolitos de bolaform dicatiónicos (C12Me6; C12BU6) , dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-o¡ dioleoilfosfatidiletanolamina, éster de colina de hemisuccinato de colesterol, lipopoliaminas, incluyendo pero no limitado a dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS) , dipalmitoil-fosfatidiletanolamidoespermina (DPPES) , lipopoli-L (o D) -lisina (LPLL, LPDL) , poli (L (o D) -lisina conjugada N-glutarilfosfatidiletanolamina, éster didodecil-glutamato con grupo amino colgante (CAGluPhCnN) , éster de ditetradecil-glutamato con grupo amino colgante (Cl4GIuCnN+) , derivados catiónicos de colesterol, incluyendo, pero no limitado a sal de colesteril-3-ß-oxisuccinamidoetilentrimetilamonio, colesteril-3-ß-oxisuccinamidoetilen-dimetilamina, sal de colesteril-3-ß-carboxiamidoetilentrimetilamonio, y colesteril-3-ß-carboxiamidoetilendimetilamina . Otros lípidos catiónicos útiles se describen en US 2008/0085870 y US 2008/0057080, que se incorporan en la presente como referencia.

El lxpido catiónico es preferentemente biodegradable (metabolizable) y biocompatible .

Además del aceite y lípido catiónico, una emulsión puede incluir un agente tensioactivo no iónico y/o un agente tensioactivo zwiteriónico . Estos agentes tensioactivos incluyen, pero no se limitan a: los agentes tensioactivos de ásteres de polioxietileno-sorbitan (referidos comúnmente como los Tweens) , especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO) , óxido de propileno (PO) , y/u óxido de butileno (BO) , vendidos bajo en nombre comercial D0WFAXMR, tal como copolímeros de bloque de EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1, 2-etanediilo) repetitivos, con octoxinol-9 (Tritón X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol) que son de interés particular; (octilfenoxi) olietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; fosfolípidos tal como fosfatidilcolina (lecitina) ; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocido como agentes tensioactivos Brij ) , tal como éter monolaurílico de trietileneglicol (Brij 30) ; polioxietilen-9-lauriléter; y ésteres de sorbitan (conocidos comúnmente como los Spans) , tal como trioleato de sorbitan (Span 85) y monolaurato de sorbitan. Los agentes tensioactivos preferidos para la inclusión en la emulsión son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietilen-sorbitan) , Span 85 (trioleato de sorbitan), lecitina y Tritón X-100.

Se pueden incluir mezclas de estos agentes tensioactivos en la emulsión, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85, o mezclas de Tween 80/Triton-X100. Una combinación de un éster de polioxietilen-sorbitan tal como monooleato de polioxietilen-sorbitan (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxi-polietoxietanol (Tritón X-100) también es adecuada. Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilen-sorbitan y/o un octoxinol . Las mezclas útiles pueden comprender un agente tensioactivo con un valor HLB en el intervalo de 10-20 (por ejemplo polisorbato 80, con un HLB de 15.0) y un agente tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 1-10 (por ejemplo trioleato de sorbitan, con un HLB de 1.8) .

Las cantidades preferidas de aceite (% en volumen) en la emulsión final están entre 2-20%, por ejemplo 5-15%, 6-14%, 7-13%, 8-12%. Es particularmente útil un contenido de escualeno de aproximadamente 4-6% o aproximadamente 9-11%.

Las cantidades preferidas de agentes tensioactivos (% en peso) en la emulsión final están entre 0.001% y 8%. Por ejemplo: ásteres de polioxietileno-sorbitan (tal como polisorbato 80) de 0.2 a 4%, en particular entre 0.4-0.6%, entre 0.45-0.55%, aproximadamente 0.5% o entre 1.5-2%, entre 1.8-2.2%, entre 1.9-2.1%, aproximadamente 2%, o 0.85-0.95%, o aproximadamente 1%; ásteres de sorbitan (tal como trioleato de sorbitan) 0.02 a 2%, en particular aproximadamente 0.5% o aproximadamente 1%; octil- o nonilfenoxi-polioxietanoles (tal como Tritón X-100) 0.001 a 0.1%, en particular 0.005 a 0.02%; polioxietilen-éteres (tal como laureth 9) de 0.1 a 8%, de manera preferente de 0.1 a 10% y en particular 0.1 a 1% o aproximadamente 0.5%.

Las cantidades absolutas de aceite y agente tensioactivo, y su relación, se puede variar dentro de límites amplios en tanto que aún formen una emulsión. Una persona experta puede variar fácilmente las proporciones relativas de los componentes para obtener una emulsión deseada, pero es típica una relación en peso de entre 4:1 y 5:1 para aceite y agente tensioactivo (aceite den exceso) .

Un parámetro importante para asegurar la actividad inmunoestimuladora de una emulsión, en particular en animales grandes, es el tamaño de gota de aceite (diámetro) . Las emulsiones más efectivas tienen un tamaño de gota en el intervalo de submicrones. De manera adecuada, los tamaños de gota estarán en el intervalo de 50-750 nm. De manera más útil, el tamaño promedio de gota es menos de 250nm por ejemplo menos de 200nm, menos de 150nm. El tamaño promedio de gota está de forma útil en el intervalo de 80-180nm. Idealmente, al menos 80% (en número) de las gotas de aceite de la emulsión son de menos de 250 nm de diámetro, y de manera preferente al menos 90%. Los aparatos para determinar el tamaño promedio de gota en una emulsión, y la distribución de tamaños, están comercialmente disponibles. Estos usan típicamente las técnicas de dispersión dinámica de luz y/o percepción óptica de partículas individuales, por ejemplo, la serie de instrumentos AccusizerMR y NicompMR disponibles de Particle Sizing Systems (Santa Barbara, EUA) , o los instrumentos Zetasizer de Malvern Instruments (RU) , o instrumentos Partióle Size Distribution Analyzer de Horiba (Kyoto, Japón) .

De manera ideal, la distribución de los tamaños de gota (por número) tiene solo un máximo, es decir hay una población individual de gotas distribuidas alrededor de un promedio (modo), en lugar de tener dos máximos. Las emulsiones preferidas tienen una polidispersidad de <0.4 por ejemplo 0.3, 0.2, o menos.

Las emulsiones adecuadas con gotas de submicrones y una distribución estrecha de tamaños se pueden obtener por el uso de microfluidisación. Esta técnica reduce el tamaño promedio de gota de aceite al propulsar corrientes de componentes de entrada a través de canales geométricamente fijados a alta presión y alta velocidad. Estas corrientes se ponen en contacto con las paredes de los canales, las paredes de las cámaras y entre si. Las fuerzas de corte, de impacto y de cavitación resultantes provocan una reducción en el tamaño de gota. Los pasos repetitivos de la microfluidización se pueden realizar hasta que se logre una emulsión con un promedio deseado de tamaño de gota y una distribución deseada de tamaño de gota.

Como una alternativa a la microfluidización, se pueden usar métodos térmicos para provocar inversión de fase. Estos métodos también pueden proporcionar una emulsión de submicrones con una distribución estrecha de tamaño de partículas .

Las emulsiones preferidas se pueden esterilizar por filtro, es decir, sus gotas pueden pasar a través de un filtro de 220nm. Así como se proporciona una esterilización, este procedimiento también remueve cualquier gota grande en la emulsión.

En ciertas modalidades, el lípido catiónico en la emulsión es DOTAP. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml de DOTAP. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DOTAP de aproximadamente 0. .5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 0. , 6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 0. .7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 0. , 8 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 0. , 9 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 1. .0 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1. .1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 1. .2 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1. .3 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 1. .4 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 1. .5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 1. .6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 1. .7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml , de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 24 mg/ml, de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 22 mg/ml, de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de - aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 18 mg/ml, de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0. ,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 1 .9 mg/ml , de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 1 .8 mg/ml , de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 1 .7 mg/ml , de aproximadamente 0. 5 mg/ml a aproximadamente 1 .6 mg/ml , de aproximadamente 0. 6 mg/ml a aproximadamente 1 .6 mg/ml, de aproximadamente 0. 7 mg/ml a aproximadamente 1 .6 mg/ml , de aproximadamente 0 .8 mg/ml ;a aproximadamente 1 .6 mg/ml, aproximadamente 0 .5 mg/ml, a aproximadamente 0 .6 mg/ml, aproximadamente 0 .7 mg/ml , a aproximadamente 0.8 mg/ml, aproximadamente 0.9 mg/ml , aproximadamente 1 .0 mg/ml, aproximadamente 1 ..1 mg/ml , aproximadamente 1 .2 mg/ml, aproximadamente 1 ..3 mg/ml, aproximadamente 1 .4 mg/ml, aproximadamente 1 ..5 mg/ml , aproximadamente 1 .6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml , aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml , aproximadamente 21 .8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc . En una modalidad de ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0.8 mg/ml a aproximadamente 1.6 mg/ml de DOTAP, tal como 0.8 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.4 mg/ml o 1.6 mg/ml .

En ciertas modalidades, el lípido catiónico es Colesterol de DC. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender Colesterol DC de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de Colesterol DC. Por ejemplo, la emulsión . de aceite en agua catiónica puede comprender Colesterol DC de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0.2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0.3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 0.4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0.62 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2.46 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 3.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 4.92 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 4.5 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 3.5 mg/ml , de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 2.46 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml , de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 1.5 mg/ml , de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml , de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 0.62 mg/ml, aproximadamente 0.15 mg/ml, aproximadamente 0.3 mg/ml, aproximadamente 0.6 mg/ml, aproximadamente 0.62 mg/ml, aproximadamente 0.9 mg/ml, aproximadamente 1.2 mg/ml, aproximadamente 2.46 mg/ml, aproximadamente 4.92 mg/ml, etc. En una modalidad de ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0.62 mg/ml a aproximadamente 4.92 mg/ml de Colesterol DC, tal como 2.46 mg/ml .

En ciertas modalidades, el lípido catiónico es DDA. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de DDA. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DDA de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 4.5 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 3.5 mg/ml , de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 2.5 mg/ml , de aproximadamente 0 .1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml , de aproximadamente 0. 1 mg/ml a aproximadamente 1 .5 mg/ml , de aproximadamente 0.1 L mg/ml a aproximadamente 1. 45 mg/ml , de aproximadamente 0 .2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 0 .3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 0 .4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 0 .5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 0 .6 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 0. 73 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 0 .8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 0 .9 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 1 .0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1 .2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1. 45 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 1.2 mg/ml, aproximadamente 1.45 mg/ml, etc. De manera alternativa, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprende de DDA a aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 21.5 mg/ml, aproximadamente 21.6 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml. En una modalidad de ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0.73 5 mg/ml a aproximadamente 1.45 mg/ml de DDA, tal como 1.45 mg/ml.

Se pueden usar catéteres o dispositivos similares para distribuir las moléculas de ARN auto-replicantes de la invención, como ARN desnudo o en combinación con un sistema de distribución, a un órgano o tejido objetivo o diana. Los catéteres adecuados se describen por ejemplo en la patente de los Estados Unidos Nos. 4,186,745; 5,397,307; 5,547,472; 5,674,192; y 6,129,705, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia.

La presente invención incluye el uso de sistemas de distribución adecuados, tal como liposomas, micropartículas de polímero o micropartículas de emulsión de submicrones con ARN auto-replicante encapsulado o adsorbido, para distribuir una molécula de ARN auto-replicante que codifica para un polipéptido RSV-F, por ejemplo, para producir una respuesta inmunitaria sola, o en combinación con otra macromolécula . La invención incluye liposomas, micropartículas y emulsiones de submicrones con moléculas de ARN auto-replicante adsorbidas y/o encapsuladas y combinaciones de esto.

Como se demuestra adicionalmente en los ejemplos, las moléculas de ARN auto-replicantes asociadas con liposomas y micropartículas de emulsión de submicrones se pueden administrar de manera efectiva a la célula hospedadora, y pueden inducir una respuesta inmunitaria a la proteína codificada por el ARN auto-replicante.

La composición inmunogénica La invención proporciona composiciones inmunogénicas . Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un agente inmunogénico activo individual, o varios agentes inmunogénicos . Por ejemplo, la composición inmunogénica puede comprender polipéptidos F de RSV que están en una forma individual (por ejemplo, monómero, trímero, o rosetones) o en dos o más formas (por ejemplo, una mezcla de monómero y trímero o un equilibrio dinámico entre monómero y trímero) . La composición inmunogénica puede comprender un ARN auto-replicante que codifica para un polipéptido RSV-F, y de manera preferente también comprende un sistema de distribución adecuado, tal como liposomas, micropartículas poliméricas, una emulsión de aceite en agua y combinaciones de esto.

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunoreguladores . De manera preferente, uno o más de los agentes inmunoreguladores incluyen uno más adyuvantes, por ejemplo dos, tres, cuatro o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, analizado adicionalmente más adelante.

En otra modalidad, una composición inmunogénica de la invención comprende un polipéptido que exhibe un epítopo presente en una conformación de pre- fusión o intermedia de la glicoproteína RSV-F, pero no exhibe la conformación de pos-fusión de la glicoproteína.

En otra modalidad, una composición inmunogénica de la invención comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido comprende una proteína F de RSV, en totalidad o en parte, y el segundo polipéptido comprende un dominio heterólogo de oligomerización . El primer polipéptido puede comprender un ectodominio de proteína F de RSV. El segundo polipéptido puede ser un dominio de trimerización de hemaglutinina de influenza, un dominio de trimerización de espiga de SARS, un dominio de trimerización de gp41 de VIH, NadA, GCN4 modificado, o ATCasa.

En un aspecto, la invención es una composición que comprende polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos al proporcionar polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, o polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, y escindirlos para producir subunidades Fx y F2, como se describe en la presente.

En otro aspecto, la invención es una composición que comprende trímeros y/o monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos al proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV y purificar monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, trímeros no escindidos, o una combinación de monómeros no escindidos y trímeros no escindidos (por ejemplo, un mezcla o un equilibrio dinámico) del material biológico, como se describe en la presente. En algunas modalidades, el polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV contiene sitios alterados de escisión de furina en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136, y si se desea puede contener además un polipéptido de fusión, alterado. En otras modalidades, el ecto-dominio de proteína F de RSV contiene sitios alterados de escisión de furina en aproximadamente las posiciones 106-109 y en aproximadamente las posiciones 133-136, y sitios alterados de escisión de tripsina entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y si se desea puede contener además un péptido de fusión, alterado.

En otro aspecto, la invención es una composición que comprende trímeros y/o monómeros de polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, producidos al proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos C-terminales de ecto-dominio de proteína F de RSV, y purificar monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, trímeros no escindidos, una combinación de monómeros no escindidos y trímeros no escindidos (por ejemplo, una mezcla o un equilibrio dinámico) del material biológico, como se describe en la presente.

En otro aspecto, la invención es una composición que comprende polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos al proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contiene un péptido de fusión alterado (por ejemplo, al menos una porción del polipéptido de fusión se suprime) y purificar trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico, como se describe en la presente.

En otro aspecto, la invención es una composición que comprende polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos al proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen un péptido de fusión alterado (por ejemplo, al menos una porción del péptido de fusión se suprima) y purificar monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico, como se describe en la presente.

Las composiciones de la invención son preferentemente adecuadas para la administración a un sujeto mamífero, tal como un humano, e incluyen uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo adyuvantes. Un análisis completo de los componentes está disponible en la preferencia 29. Las composiciones en general estarán en una forma acuosa. Cuando la composición es una composición inmunogénica, producirá una respuesta inmunitaria cuando se administre a un mamífero, tal como un humano. La composición inmunogénica se puede usar para preparar una formulación de vacuna para inmunizar un mamífero.

Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un agente inmunogénicos , activo, individual o varios agentes inmunogénicos . Por ejemplo, el polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV puede estar en una forma individual (por ejemplo, un monómero no escindido, monómero escindido, trímero no escindido, trímero escindido, o rosetones de trímeros escindidos) o en dos o más formas (por ejemplo, una mezcla de monómero no escindido y trímero no escindido o un equilibrio dinámico entre monómero no escindido y trímero no escindido) . Además, las composiciones pueden contener un polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV y una o más proteínas RSV diferentes (por ejemplo, una proteína G y/o una proteína M) y/o se pueden combinar con inmunógenos de otro patógenos .

La composición puede incluir conservadores tal como tiomersal o 2-fenoxietanol . Sin embargo se prefiere que la vacuna deba estar sustancialmente libre de (es decir, menos de 5yg/ml) material mercurial, por ejemplo, libre de tiomersal. Las composiciones inmunogénicas que no contienen mercurio son más preferidas. Son particularmente preferidas las composiciones inmunogénicas libres de conservador.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal sódica. Se prefiere cloruro de sodio (NaCl) , que puede estar presente de entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, fosfato diácido de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, y similares.

Las composiciones tendrán en general una osmolaridad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, de manera preferente entre 240-360 mOsm/kg, y caerán de manera preferente dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más amortiguadores. Los amortiguadores típicos incluyen: un amortiguador de fosfato, un amortiguador de Tris; un amortiguador de borato; o un amortiguador de succinato; un amortiguador de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un amortiguador de citrato. Los amortiguadores se incluirán típicamente en el intervalo de 5-20mM. El pH de una composición estará en general entre 5.0 y 8.1, y más típicamente entre 6.0 y 8.0, por ejemplo, entre 6.5 y 7.5, o entré 7.0 y 7.8. Un proceso de la invención puede incluir por lo tanto un paso para justar el pH de la vacuna volumétrica antes del envasado.

La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirogénica, por ejemplo, que contiene <l EU (unidad de endotoxina, una medida normal) por dosis, y de manera preferente <0.1 por EU por dosis. La composición está preferentemente libre de gluten. Las vacunas humanas se administran típicamente en un volumen de dosis de aproximadamente 0.5ml, aunque a niños se puede administrar una media dosis (es decir, aproximadamente 0.25ml).

Adyuvan es Las composiciones de la invención, que contienen polipéptidos RSV-F, o ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos RSV-F, también pueden contener uno o más adyuvantes, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más adyuvantes, que pueden funcionar para mejorar las respuestas inmunitarias (humoral y/o celular) producidas en un paciente que recibe la composición. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2. Los adyuvantes que se pueden usar en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a: Composiciones que contienen minerales. Las composiciones que contienen minerales adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tal como sales de calcio y sales de aluminio (o mezclas de estas) . La invención incluye sales minerales tal como hidróxido (por ejemplo oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo hidroxifosfatos, ortofosfatos) , sulfatos, etc., o mezclas de diferentes compuestos minerales, con el compuesto que toma cualquier forma adecuada (por ejemplo gel, cristalina, amorfa, etc.), y con adsorción que se prefiere. Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas "CAP" descritas en la referencia 38) . Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, y similares. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal metálica (39) . Se describen en más detalle más adelante adyuvantes de sales de aluminio.

- Composiciones de emulsión de aceite (ver en más detalles más adelante) . Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para el uso como adyuvantes de la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tal como MF59 (5% de Escualeno, 0.5% de Tween 80 y 0.5% de Span, formulados en partículas de submicrones usando un microfluidizador) .

- Agentes que inducen citocinas (ver en más detalle más adelante) . Los agentes que inducen citocina adecuados para el uso en la invención incluyen agonistas del receptor 7 tipo Toll (TLR7) (por ejemplo compuestos de benzonaftiridina descritos en WO 2009/111337.

- Saponinas (capítulo 22 de referencia 74) , que son un grupo heterólogo de esterol-glicósidos y glicósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces y aún flores de una amplia variedad de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol de molina Quillaia saponaria se ha estudiado ampliamente como adyuvante . La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata ( sarsaprilla) , Gypsophilla paniculata (velo de novia) , y Saponaria officianalis (raíz de jabón) . Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como QS21, así como formulaciones de lípidos, tal como ISCOMs. QS21 se comercializa como STIMULONMR. Se ha purificado composiciones de saponina usando HPLC y RP-HPLC. Las fracciones purificadas específicas usando estas técnicas se han identificado, que incluyen QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. De manera preferente, la saponina es QS21. Un método para la producción de QS21 se describe en la referencia 40. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol (41) . Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM) (capítulo 23 de referencia. 74) . Los SCOM incluyen también típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede usar cualquier saponina conocida en los ISCOM. De manera preferente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las referencias 41-43. Opcionalmente , los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional (44) . Una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina se puede encontrar en las referencias 45 y46.

Adyuvantes grasos (ver en más detalle más adelante) , que incluyen emulsiones de aceite en agua, lípido natural modificado como se deriva de lipopolisacáridos enterobacterianos , compuestos de fosfolípido (tal como el dímero de fosfolípido sintético, E6020) y similares.

Toxinas ADP-ribosilantes bacterianas (por ejemplo, la enterotoxina térmicamente lábil "LT" de E. coli, la toxina de cólera "CT" , o toxina de pertussis «PT") y derivados destoxificados de las mismas, tal como las toxinas mutantes conocidas como LT-K63 y LT-R72 (47) . El uso de toxinas ADP-ribosilantes destoxificadas adyuvantes mucosos se describe en la referencia 48 y como adyuvantes parenterales en la referencia 49.

Bioadhesivos y mucoadhesivos , tal como microesferas (50) de ácido hialurónico esterificado o quitosan y sus derivados (51) .

- Micropartículas (es decir, una partícula de -100 nm a ~150 pm de diámetro, de manera más preferente de -200 nm a -30 µ?? de diámetro, o -500 nm a ~10 \im de diámetro) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, a poli (OÍ-hidroxi-ácido) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, y similares), con poli (láctido-co-glicólido) que es el preferido, opcionalmente tratado para obtener una superficie negativamente cargada (por ejemplo, con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB) .

- Liposomas (Capítulos 13 y 14 de referencia 74) .

Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuados para el uso como adyuvantes se describen en la referencia 52-54. -Éteres de polioxietileno y esteres de polioxietileno (55) . Estas formulaciones incluyen además agentes tensioactivos de éster de polioxietilen-sorbitan en combinación con octoxinol (56) así como agentes tensioactivos de éteres o esteres de polioxietilen-alquilo en combinación con al menos un agente tensioactivo no iónico adicional tal como octoxinol (57) . Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen- 9- lauril-éter (laureth 9) , polioxietilen-9-esteoril-éter, polioxiteilen-8 -esteoril-éter , polioxietilen- 4 -lauril- éter , polioxietilen-35-lauril-éter , y polioxietilen-23-lauril-éter .

- Péptidos de muramilo, tal como N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP") , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no-MDP) , N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi-propilamida ("DTP-DPP", o "TheramideMR") , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' -2 ' dipalmitoil-sn-glicero-3 -hidroxifosforiloxi) -etilamina ("MTP-PE").

Una preparación de proteosoma de proteína membrana exterior preparada de una primera bacteria Gram-negativa en combinación con una preparación de liposacáridos derivada de una segunda bacteria Gram-negativa, en donde las preparaciones de liposacárido y proteosoma de proteína de membrana exterior forman un complejo adyuvante, no complejo estable. Estos complejos incluyen "IVX-908" , un complejo comprendido de membrana exterior de Neisseria meningitidis y lipopolisacáridos .

- Un polímero de polioxidonio (58, 59) u otro derivado de polietileno-piperazina N-oxidado.

- Metil-inosina-5 ' -monofosfato ("MIMP") (60).

Un compuesto dé pirrolizidina polihidroxilado (61) , tal como uno que tiene la formula: donde R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, grupos acilo, alquilo (por ejemplo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo y arilo rectos o ramificados, insustituidos o sustituidos, saturados o insaturados, o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado' del mismo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: casuarina, casuarina-6-oí-D-glucopiranosa, 3 -epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3 , 7-diepi-casuarina, y similares.

- Un ligando CDld, tal como una or-glicosilceramida (62-69) (por ejemplo, a-galactosilceramida) , a-glicosilceramidas que contiene fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [ (2S, 3S, 4R) -1-0- (oí-D-galactopiranosil) -2- (N-hexacosanoilamino) -1,3,4 -octadecanetriol] , CRONY-101, 3''-0-sulfo-galactosilceramida, etc.

- Una gamma-inulina (70) o derivado de la misma, tal como algamulina.

- Virosomas y partículas tipo virus (VLP) . Estas estructuras contienen en general una o más proteínas de un virus, opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. En general no son patógenas, no replicantes y en general no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales se pueden producir de forma recombinante o aislar de virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para el uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas de virus de influenza (tal como HA o NA) , virus de Hepatitis B (tal como proteínas de núcleo o capsida) , virus de Hepatitis E, virus de sarampión, virus de Sindbis, Rotavirus, virus de enfermedad de pies y boca, Retrovirus, virus de Norwalk, virus de papiloma humano, VIH, ARN-fagos, QS-fago (tal como proteínas de revestimiento) , GA-fago, fr-fago, AP205-fago, y Ty (tal como proteína 1 de Ty de retrotransposon) .

Estas y otras sustancias activas de adyuvante se analizan en más detalle en las referencias 74 y 75.

Las composiciones pueden incluir dos, tres, cuatro o más adyuvantes. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden incluir de manera ventajosa tanto una emulsión de aceite en agua como un agente inductor de citocinas o tanto una composición que contiene minerales y un agente inductor de citocinas, o dos adyuvantes de emulsión de aceite en agua, o dos compuestos de benzonaftiridina, etc.

Los antígenos y adyuvantes en una composición estarán típicamente en mezcla.

Adyuvantes de emulsión de aceite Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para el uso como adyuvante en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tal como MF59 (5% de escualeno, 0.5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85, formulados en partículas de submicrones usando un microfluidizador) . También se puede usar el adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) .

Se conocen varias emulsiones de aceite en agua, e incluyen típicamente al menos un aceite y al menos un agente tensioactivo, con los aceites y agentes tensioactivos que son biodegradables (metabolizables) y biocompatibles . Las gotas de aceite en la emulsión son en general de menos de 5 µ?? de diámetro, y pueden tener aun un diámetro de sub-micrones , con estos pequeños tamaños que se logran con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotas con un tamaño menor de 200 nm puesto que se pueden someter a esterilización por filtro.

La invención se puede usar con aceites tal como aquellos de una fuente animal (tal como pescado) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite de coco, y aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nuez. Se puede usar aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semilla incluyen aceite de cártamo, aceite de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de ajonjolí y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede usar el aceite de otros granos seriales tal como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Se pueden preparar ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1 , 2-propanodiol , en tanto que no se presenten de forma natural en los aceites de semilla, mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de nuez y semilla. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y por lo tanto se pueden usar en la práctica de esta invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón, y aceite de ballena tal como esperma ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden usar en la presente. Varios aceites de cadena ramificada se sintetizan de forma bioquímica en unidades de isopreno de 5-carbonos y se refieren en general como terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene, un terpenoide insaturado, ramificado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19, 23-hexametil-2 , 6 , 10 , 14 , 18 , 22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferido en la presente. También es un aceite preferido el escualano, el análogo saturado de escualeno. Los aceites de pescado, incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica. Otros aceites preferidos son los tocoferóles (ver más adelante) . Se pueden usar mezclas de aceites.

Los agentes tensioactivos se pueden clasificar por su "HLB" (equilibrio hidrófilo/lipófilo) . Los agentes tensioactivos preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, de manera preferente al menos 15, y de manera más preferente al menos 16. La invención se puede usar con agentes tensioactivos que incluyen, pero no se limitan a: los agentes tensioactivos de ásteres de polioxietileno-sorbitan (comúnmente referidos como los Tweens) , especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO) , óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO) , vendidos bajo el nombre comercial DOWFAXMR, tal como copolímeros de bloque de EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) repetitivos, con octoxinol-9 (Tritón X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol) que es de interés particular; ; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; fosfolípidos tal como fosfatidilcolina (lecitina) ; etoxilatos de nonilfenol, tal como la serie TERGIT0LR NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurilico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como agentes tensioactivos Brij ) , tal como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30) ; y ásteres de sorbitan (comúnmente conocidos como Span) , tal como trioleato de sorbitan (Span 85) y monolaurato de sorbitan. Se prefieren agentes tensioactivos no iónicos. Los agentes tensioactivos preferidos para incluir en la emulsión son TWEEN 80 (monooleato de polioxietilen-sorbitan) , Span 85 (trioleato de sorbitan), lecitina y Tritón X-100.

Se pueden usar mezclas de agentes tensioactivos, por ejemplo, mezclas de TWEEN 80MR/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilen-sorbitan tal como monooleato de polioxietilen-sorbitan (TWEEN 80MR) y un octoxinol \tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X-100) . Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilen-sorbitan y/o un octoxinol.

Las cantidades preferidas de agentes tensioactivos ( % en peso) son: esteres de polioxietilen-sorbitan (tal como (TWEEN 80R) ) de 0.01 a 1 %, en particular aproximadamente 0.1 %; octil-o nonilfenoxi-polioxietanoles (tal como Tritón X-100, u otros detergentes en la serie Tritón) de 0.001 a 0.1 %, en particular 0.005 a 0.02 %; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) de 0.1 a 20 %, de manera preferente de 0.1 a 10 % y en particular de 0.1 a 1 % o aproximadamente 0.5 %.

Los adyuvantes específicos de emulsión de aceite en agua útiles con la invención incluyen, pero no se limitan a: - Una emulsión de submicrones de escualeno, TWEEN 80MR, y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0.5 % de polisorbato 80, y aproximadamente 0.5 % de Span 85. En términos de peso, estas relaciones llegan a ser 4.3 % de escualeno, 0.5 % de polisorbato 80 y 0.48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como "MF59" (71-73) , como se describe en más detalle en el capítulo 10 de la referencia 74 y capítulo 12 de la referencia 75. La emulsión MF59 incluye de manera ventajosa iones de citrato, por ejemplo, amortiguador de citrato lOmM.

- Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y TWEEN 80MR. La emulsión puede incluir solución salina amortiguada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo al 1 %) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10 % de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol y de 0.3 a 3 % de TWEEN 80MR, y la relación en peso de escualeno: tocoferol es de manera preferente <1 puesto que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y TWEEN 80MR pueden presentar una relación en volumen de aproximadamente 5:2. Esta emulsión se puede hacer al disolver TWEEN 80MR en PBS para dar una solución al 2 %, luego mezclar 90 mi de esta solución con una mezcla de (5g de DL-a-tocoferol y 5ml de escualeno) , luego microfluidizar la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotas de aceite de submicrones, por ejemplo, con un diámetro promedio de entre 100 y 250nm, de manera preferente de aproximadamente 180nm.

- Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y un detergente Tritón (por ejemplo Tritón X-100) . La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (ver más adelante) . La emulsión puede contener un amortiguador de fosfato.

- Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80) , un detergente Tritón (por ejemplo, Tritón X-100) y un tocoferol (un succinato de cc-tocoferol) . La emulsión puede incluir estos tres componentes a una relación en masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo 750 µg/ml de polisorbato 80, 110 µg/ml de Tritón X-100 y 100 µg/ml de succinato de a-tocoferol) , y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (ver más adelante) . La fase acuosa puede contener un amortiguador de fosfato.

Una emulsión de escualeno, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("PLURONICMR L121") . La emulsión se puede formular en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4. Esta emulsión es un vehículo de distribución útil para dipéptidos de muramilo, y se ha usado como treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" (76) (0.05-1 % de Thr-MDP, 5 % escualano, 2.5 % de Pluronic L121 y 0.2 % de polisorbato 80) . También se puede usgar sin el Thr-MDP, como el adyuvante "AF" (77) (5 % de escualano, 1.25 % de Pluronic L121 y 0.2 % de polisorbato 80) . Se prefiere la microfluidización.

- Una emulsión que comprende escualeno, un solvente acuoso, un agente tensioactivo no iónico hidrófilo de éter alquílico de polioxietileno (por ejemplo éter cetoestearílico de polioxietileno (12)) y un agente tensioactivo no iónico hidrófobo (por ejemplo un éster de sorbitan o éster de manida, tal como monooleato de sorbitan o "Span 80"). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos 90 % de las gotas de aceite (en volumen) con un tamaño menor de 200 nm. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltósido y/o sacarosa) ; y/o un alquilpoliglicósido . Estas emulsiones se pueden liofilizar.

- Una emulsión que tiene de 0.5-50 % de un aceite, 0.1-10 % de un fosfolípido, y 0.05-5 % de un agente tensioactivo no iónico. Como se describe en la referencia 78, los componentes de fosfolípido preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol , fosfatidilglicerol , ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina . Los tamaños de gota de submicrones son ventajosos.

- Una emulsión de aceite en agua de submicrones de un aceite no metabolizable (tal como aceite mineral ligero) y al menos un agente tensioactivo (tal como lecitina, TWEEN 80MR o Span 80) . Se pueden incluir aditivos, tal como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina- lipófilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 79, producido por adición de amina alifática a desacilsaponina mediante el grupo carboxilo de ácido glucurónico) , bromuro de dimetiidioctadecilamonio y/o N, -dioctadecil-N, N-bis (2-hidroxietil) propanodiamina .

- Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipófilo no iónico, y un agente tensioactivo hidrófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno) .

- Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrófilo no iónico, y un agente tensioactivo lipófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno) .

Una emulsión en la cual una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) se asocian como micelas helicoidales (80) .

Las emulsiones se pueden mezclar con antígeno de forma extemporánea, en el momento de la distribución. De esta manera, el adyuvante y el antígeno se pueden mantener de forma separada en una vacuna envasada o distribuida, lista para formulación final en el momento del uso. El antígeno estará en general en una forma acuosa, tal que la vacuna se prepare finalmente al mezclar dos líquidos. La relación en volumen de los dos líquidos para mezclado puede variar (por ejemplo entre 5:1 y 1:5) pero en general es de aproximadamente 1:1.

Agentes Inductores de Citocina Los agentes inductores de citocinas para la inclusión de las composiciones de la invención son capaces, cuando se administran a un paciente, de hacer que el sistema inmunitario libere citocinas, incluyendo interferones e interleucinas . Los agentes preferidos pueden producir la liberación de uno o más de: ínterferón-?; interleucina-1 ; interleucina-2 ; interleucina-12 ; TNF-oc; TNF-ß; y GM-CSF. Los agentes preferidos producen la liberación de citocinas asociadas con respuesta inmunitaria tipo Thl, por ejemplo, interferón-?, TNF- , interleucina-2. Se prefiere la estimulación tanto de interferón-? e interleucina-2.

Como resultado de recibir una composición de la invención, por lo tanto, un paciente tendrá células t que, cuando se estimulan con una proteína F de RSV, liberarán las citocinas deseadas de una manera específica del antígeno. Por ejemplo, las células T purificadas de su sangre liberaran ?- interferón cuando se exponen in vi tro a proteína F. Los métodos para medir estas respuestas en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se conocen en la técnica, e incluyen ELISA, ELISPOT, citometría de flujo y PCR de tiempo real. Por ejemplo, la referencia 81 reporta un estudio en el cual se monitorizaron respuestas inmunitarias mediadas por células T específicas del antígeno contra toxoide de tétanos, específicamente respuestas a ?- interferón, y se encontró que ELISPOT fue el método más sensible para discriminar respuestas inducidas por TT específicas de antígeno de respuestas espontáneas, pero que la detección de citocinas intracitoplásmicas por citometría de flujo fue el método más eficiente para detectar efectos re-estimuladores.

Los agentes adecuados inductores de citocinas incluye, pero no se limitan a: - Un oligonucleótido inmunoestimulador , tal como uno que contiene un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citocina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina) , o un ARN de doble hebra, o un oligonucleótido que contiene una secuencia palindrómica, o un oligonucleótido que contiene una secuencia de poli(dG) . - monofosforil- lípido A 3 -O-desacilado ("3dMPL", también conocido como "MPLMR" ) (82-85).

Un compuesto de imidazoquinolina tal como IMIQUIMODMR ("R-837") (86, 87), RESIQUIMODMR ("R-848") (88), y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato) . Los detalles adicionales a cerca de las imidazoquinolinas inmunoestimuladoras se pueden encontrar en las referencias 89 a 93.

Un compuesto de benzonaftiridina , tal como: (a) un compuesto que tiene la fórmula: en donde : R4 se selecciona de H, halógeno, -C(0)OR7, -C(0)R7, -C(0)N(RuR12), -N(R"R12), -N(R9)2, -NHN(R9)2, -SR7, -(CH2)nOR7, -(CH2)nR7, -LR8, -LR10, -OLR8, -OLR10, Ci-C6alquÍlo, Ci-C6heteroalquilo, Ci-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C3alquino, Ci-C6alcoxi, Ci-C6haloalcoxi , arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo, en donde los grupos Cx-Cgalquilo, Ci-C6heteroalquilo, Cx-Cghaloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-C6alcoxi , Cx-Cghaloalcoxi, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo de R4 están cada uno opcionalmente sustituidos con l a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -CN, -N02, -R7, -0R8, -C(0)R8, -OC(0)R8, -C(0)OR8, -N(R9)2, -P(0)(OR8)2, -0P(0) (OR8)2, -P(0) (OR10)2, -0P (O) (OR10) 2 , C(0)N(R9)2í -S(0)2R8, -S(0)R8, -S (0) 2N (R9) 2 , y -NR9S(0)2R8; cada L se selecciona independientemente de un enlace, - (O (CH2) ra) t- Ci-Cgalquilo, C2-C6alquenileno y C2-C6alquinileno, en donde los Ci-Cealquilo, C2-C6alquenileno y C2-C6alquinileno de L están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 4 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -R8, -0R8, -N(R9)2, -P(0) (OR8)2, -0P (0) (OR8) 2, -P(O) (OR10)2, y -OP(O) (OR10)2; R7 se selecciona de H, Ci-C6alquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, Cx-Cgheteroalquilo, Ci-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-Cgalcoxi, Ci-Cghaloalcoxi , y C3-C8heterocicloalquilo, en donde los grupos Ci-C6alquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, Ci-C6heteroalquilo, Ci-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-C6alcoxi, Ci-C6haloalcoxi, y C3-C8heterocicloalquilo de R7 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 grupos R13; cada R8 se selecciona independientemente de H, -CH(R10)2, Ci-C8alquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-C6haloalquilo, Ci-C6alcoxi, Ci-Cgheteroalquilo, C3 -C8cicloalquilo, C2- C8heterocicloalquilo, C!-C6hidroxialquilo y Ci-C6haloalcoxi , en donde los grupos Ci-C8alquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-C6heteroalquilo, Cx-Cshaloalquilo, Ci-C6alcoxi, C3- C8cicloalquilo, C2-C8heterocicloalquilo, Ci-C6hidroxialquilo y Ci-C6haloalcoxi de R8 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de -CN, R11, -OR11, -SR11, -CfOjR11, -OC(0)R11, -C(0)N(R9)2, C(0)0R , -NR^tOR11, -NR9R10, -NR^R12, -N(R9)2, -OR9 , -OR10, -C(0)NR11R12, -C(0)NR11OH, -S(0)2R11, -SCOR11, -S (O) z R^R12 , R^SCO R11, -P(O) (OR11)2, Y -OP(O) (OR11),; cada R9 se selecciona independientemente de H, C(0)R8, -C(0)OR8, -C(0)R10, -C(O)OR10( -S(0)2R10, -C -C6 alquilo, d-C6heteroalquilo y C3-Cecicloalquilo, o cada R9 es independientemente un Ci-C6alquilo que conjuntamente con N se unen para formar un C3-C8heterocicloalquilo, en donde el anillo de C3-C8heterocicloalquilo contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de N, 0 y S, y en donde los grupos Ci-C3alquilo, Ci-C6heteroalquilo, C3-C6cicloalquilo, o C3-C8heterocicloalquilo de R9 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de -CN, R11, -0R11, -SR11, -CÍC^R11, -OCÍOJR11, -C(0)0R11, -NR11R12 , -CÍOJNR^R12, -C(0)NR11OH, -S(0)2R11, -SÍOjR11, -S(0)2NR11R12, - RllS(0)2R11, -P(O) (OR1:L)2, y -OP(O) (OR11)2; cada R10 se selecciona independientemente de arilo, C3-C8cicloalquilo, C3-C8heterocicloalquilo y heteroarilo, en donde los grupos arilo, C3-C8cicloalquilo, C3-C8heterocicloalquilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de halógeno, -R8, -OR8, -LR9 , -LOR9 , -N(R9)2, -NR9C(0)R8, -NR9C02R8, -C02R8, -C(0)R8 y -C(0)N(R9)2; R11 y R12 se. seleccionan independientemente de H, Cx-C6alquilo, Cx-Csheteroalquilo, Ci-C6haloalquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo, en donde los grupos Ci-C6alquilo, Ci-C6heteroalquilo, Ci-C6haloalquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo de R11 y R12 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -CN, R , -OR8, -C(0)R8, ~OC(0)R8, -C(0)OR8, -N(R9)2, -NR8C(0)R8, -NR8C(0)OR8, -C(0)N(R9)2, C3-C8heterocicloalquilo, -S(0)2R8, -S (0) 2N (R9) 2, -NR9S(0)2R8, CX-C6haloalquilo y C!-C6haloalcoxi ; o R11 y R12 son cada uno independientemente Ci- Cealquilo y tomados conjuntamente con el átomo de N al cual se unen forman un anillo de C3-C8heterocicloalquilo opcionalmente sustituido que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S; cada R13 se selecciona independientemente de halógeno, -CN, -LR9, -LOR9, -OLR9, -LR10, -LOR10, -OLR10, -LR8, -LOR8, -OLR8, -LSR8, -LSR10 , -LC(0)R8, -0LC(0)R8, -LC(0)0R8, -LC(0)R10, -L0C(O)OR8, -LC (0) NRV1 , -LC(0)NR9R8, -LN(R9)2Í -LNR9R8, -LNR9R10, -LC(0)N(R9)2, -LS(0)2R8, -LS(0)R8, -LC(0)NR80H, -LNR9C(0)R8, -LNR9C(0)OR8, -LS (O) 2N (R9) 2 , -OLS (0) 2N (R9) 2 , LNR9S(0)2R8, -LC (0)NR9LN(R9) 2, -LP (0) (OR8 ) 2 , -LOP (O) (OR8) 2 , LP(0) (OR10)2 y -OLP(O) (OR10)2; cada RA se selecciona independientemente de -R8, -R7, -OR7, -OR8, -R10, -OR10, -SR8, -N02, -CN, -N(R9)2, -NR9C(0)R8, -NR9C(S)R8, -NR9C(0)N(R9) 2, -NR9C (S) N (R9) 2 , -NR9C02R8, NR9NR9C (O) R8, -NR9NR9C(0)N(R9)2, -NR9NR9C02R8 , -C(0)C(0)R8, C(0)CH2C(0)R8, -C02R8, - (CH2)nC02R8, -C(0)R8, -C(S)R8, C(0)N(R9)2, -C(S)N(R9)2, -0C(0)N(R9)2, -OC(0)R8, -C (O) N (OR8) R8 , -C(NOR8)R8, -S(0)2R8, -S(0)3R8, -S02N(R9)2, -S(0)R8, NR9S02N(R9)2, -NR9S02R8, -P(0) (0R8)2, -0P (0) (0R8 ) 2 , -P (0) (OR10) 2 , -0P(0) (OR10)2, -N(OR8)R8, -CH=CHC02R8, -C (=NH) -N (R9) 2 , y -(CH2) nNHC (0) R8 ; o dos sustituyentes RA adyacentes en el Anillo A forman un anillo de 5-6 miembros que contiene hasta dos heteroátomos como miembros de anillo; n es, independientemente en cada ocurrencia, 0, l, 2, 3, 4 , 5, 6, 7 o 8 ; cada m se selecciona independientemente de 1 , 2, 3, 4, 5 y 6, y t es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; (b) un compuesto que tiene la fórmula: en donde: R4 se selecciona de H, halógeno, -C(0)0R7, -C(0)R7, -C(0)N(R11R12) , -N (R11R12) , -N(R9)2, -NHN(R9)2í -SR7, -(CH2)nOR7, -(CH2)nR7, -LR8, -LR10, -OLR8, -OLR10, Ci-C6alquilo, Ci-C6heteroalquilo, Cx-Cghaloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-C6alcoxi, Ci-Cghaloalcoxi, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo, en donde los grupos Ci-C6alquilo, Ci-Ceheteroalquilo, Ci-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-C6alcoxi, Ci-C6haloalcoxi, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo de R4 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -CN, -N02, -R7, -0R8, -C(0)R8, -OC(0)R8, -C(0)OR8, -N(R9)2, -P(0) (OR8)2, -0P(0) (OR8)2/ -P(0.) (OR10)2, -0P (0) (OR10) 2 , C(0)N(R9)2, -S(0)2R8, -S(0)R8, -S (O) 2N (R9) 2 , y -NR9S (0) 2R8 ; cada L se selecciona independientemente de un enlace, - (0 (CH2) m) t- / Ci-Cgalquilo, C2-Cealquenileno y C2-Cealquinileno, en donde los Ci-C6alquilo, C2-C6alquenileno y C2-C6alquinileno de L están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 4 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -R8, -0RB, -N(R9)2, -P(0)(OR8)2, -0P (0) (OR8) 2 , -P(O) (OR10)2, y -0P(0) (OR10)2; R7 se selecciona de H, Ci-C6alquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, Ci-C6heteroalquilo , Ci-Cshaloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, d-C6alcoxi, Ci-C6haloalcoxi , y C3-C8heterocicloalquilo; en donde los grupos Ci-C6alquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, Cj.-C6heteroalquilo, Ci-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-C6alcoxi, C!-C6haloalcoxi, y C3 -C8heterocicloalquilo de R7 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 grupos R13; cada R8 se selecciona independientemente de H, CH(R10)2, Ci-C8alquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-C6haloalquilo, Ci-C6alcoxi, Ci-C6heteroalquilo, C3- C8cicloalquilo, C2-C8heterocicloalquilo, Ci-C6hidroxialquilo y Ci-C6haloalcoxi , en donde los grupos Ci-C8alquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, Ci-Ceheteroalquilo, d-C6haloalquilo, Ci-C3alcoxi, C3-C8cicloalquilo, C2-C8heterocicloalquilo, Ci-C6hidroxialquilo y Ci-C6haloalcoxi de R8 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de -CN, R11, -0R11, -SR11, -CÍOJR11, -OCÍOJR11, -C(0)N(R9)2 -CÍOJOR11, -NR9C(0)R11, -NR9R10, -NRX1R12, -N(R9)2, -0R9, -OR10, -C (0) NR1XR12 , -C(0)NR1:LOH, -SfOaR11, -S(0)RX1, -S (0) z R^ 12, -NR^S (0) 2RX1, -P (0) (OR11) 2 , y -0P(0) (OR11)2; cada R9 se selecciona independientemente de H, C(0)R8, -C(0)OR8, -C(0)R10, -C(0)OR10, -S(0)2R10, -Ci-C3 alquilo, Ci-C3heteroalquilo y C3-C6cicloalquilo, o cada R9 es independientemente un Ci-C6alquilo que conjuntamente con N se unen para formar un C3-C8heterocicloalquilo, en donde el anillo de C3-C8heterocicloalquilo contienen opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S, y en donde los grupos Cx-Cgalq ilo, Ci-C6heteroalquilo , C3-C6cicloalquilo, o C3-C8heterocicloalquilo de R9 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de -CN, R11, -OR11, -SR11, -CÍOJR11, -OC(0)Rn, - C(O)OR11, -NR1:LR12, -C(O)NRI:LR12, -C(O)NRI:LOH, -S(O)2RI:L, -S(0)RU, -SÍOJz R^R1 , -NR^SÍO R11, -P (0) (OR11) 2, y -0P (0) (OR11) 2 ; cada R10 se selecciona independientemente de arilo, C3-C8cicloalquilo, C3-C8heterocicloalquilo y heteroarilo, en donde los grupos arilo, C3-C8cicloalquilo, C3- C8heterocicloalquilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de halógeno, -R8, -0R8, -LR9, -LOR9 , -N(R9)2, -NR9C(0)R8, -NR9C02R8, -C02R8, -C(0)R8 y -C(0)N(R9)2; R11 y R12 se seleccionan independientemente de H, C - C6alquilo, Ci-C6heteroalquilo, Ci-C6haloalquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo, en donde los grupos Cx-Cgalquilo, Ci-C6heteroalquilo, Ci-Cshaloalquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo de R11 y R12 están cada uno opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -CN, R8, -OR8, -C(0)R8, "OC(0)R8, -C(0)OR8, -N(R9)2, -NR8C(0)R8, -NR8C(0)OR8, -C(0)N(R9)2/ C3-C8heterocicloalquilo, -S(0)2R8, -S (O) 2N (R9) 2 , -NR9S(0)2R8, d-C6haloalquilo y Ci-C6haloalcoxi; o R11 y R12 son cada uno independientemente Ci-C6alquilo y tomados con untamente con el átomo de N al cual se unen forman un anillo de C3-C8heterocicloalquilo opcionalmente sustituido que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S; cada R13 se selecciona independientemente de halógeno, -CN, -LR9, -LOR9, -OLR9 , -LR10, -LOR10, -OLR10 , -LR8, -LOR8, -OLR8, -LSR8, -LSR10, -LC(0)R8, -0LC(0)R8, -LC(0)OR8, -LC(0)R10, -LOC(0)OR8, -LC (O) NR9R1X , -LC(0)NR9R8, -LN(R9)2, LNR9R8, -LNR9R10, -LC (O) N (R9) 2 , -LS(0)2R8, -LS(0)R8, -LC(0)NR8OH, -LNR9C(0)R8, -LNR9C(0)OR8, -LS (0) 2N (R9) 2 , -0LS (0) 2N (R9) 2 , - LNR9S(0)2R8, -LC(0)NR9LN(R9)2, -LP(O) (OR8)2, -LOP(O) (OR8)2, -LP(O) (OR10)2 y -OLP(O) (OR10)2; cada RA se selecciona independientemente de -R8, -R7, -OR7, -OR8, -R10 , -OR10, -SR8( -N02, -CN, -N(R9)2/ -NR9C(0)R8, -NR9C(S)R8, -NR9C(0)N(R9)2, -NR9C (S) N (R9) 2, -NR9C02R8, NR9NR9C(0)R8, -NR9NR9C(0)N(R9)2i -NR9NR9C02R8 , -C(0)C(0)R8, C(0)CH2C(0)R8, -C02R8, - (CH2)nC02R8, -C(0)R8, -C(S)R8, C(0)N(R9)2, -C(S)N(R9)2, -OC(0)N(R9)2, -OC(0)R8, -C (O) N (OR8) R8 , -C(NOR8)R8, -S(0)2R8, -S(0)3R8, -S02N(R9)2, -S(0)R8, NR9S02N(R9)2, -NR9S02R8, -P(0)(OR8)2, -0P (O) (OR8) 2 , -P (0) (OR10) 2 , -OP(0) (OR10)2, -N(OR8)R8, -CH=CHC02R8, -C (=NH) -N (R9) 2 , y - (CH2)nNHC(0)R8; n es, independientemente en cada ocurrencia, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; cada m se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y t es l, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; o (c) una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de (a) o (b) . Otros compuestos de benzonaf tiridinas , y métodos para producir compuestos de benzonaftiridina , se describen en W0 2009/111337. Un compuesto de benzonaftiridina , o una sal del mismo, se puede usar como está, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, se puede usar un compuesto de benzonaftiridina en combinación con una emulsión de aceite en agua o una composición que contiene minerales. En una modalidad particular, se usa un compuesto de benzonaf t iridina en combinación con una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de escualeno-agua, tal como MF59) o una composición que contiene minerales (por ejemplo, una sal mineral tal como sal de aluminio o una sal de calcio) .

- Un compuesto de tiosemicarbazona , tal como aquellos descritos en la referencia 94. En la referencia 94 también se describen métodos para formular, producir y examinar compuestos activos. Las t iosemicarbazonas son particularmente efectivas en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tal como TNF-a.

Un compuesto de triptant ina , tal como aquellos descritos en la referencia 95. En la referencia 95 también se describen métodos para formular, producir y examinar compuestos activos. Las t iosemicarbazonas son particularmente efectivas en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tal como TNF-a.

- Un análogo de nucleósido, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245 ; 7 - tia- 8 -oxoguanos ina) : y profármacos del mismo; (b) A A975; (c) A A-025-1; (d) A A380; (e) los compuestos descritos en las referencias 96 a 98; (f) un compuesto que tiene la fórmula: en donde : Ri y R2 son cada uno independientemente H, halo, - Ra bí -OH, Ci-6alcoxi, sustituido Ci-6alcoxi, heterociclilo, heterociclilo sustituido, C6-ioarilo, C6-ioarilo sustituido, Ci-6alquilo, o Cx-6 alquilo sustituido; R3 está ausente, H, Ci-ealquilo, C1-6alquilo, sustituido C6-ioarilo, C6-ioarilo sustituido, heterociclilo, o heterociclilo sustituido; R4 y Rs son cada uno independientemente H, halo, heterociclilo, heterociclilo sustituido, -C(0)-Rd, Ci-6alquilo, CVgalquilo sustituido, o unidos conjuntamente para formar un anillo de 5 miembros como en R4-5: la unión que se logra en las uniones indicadas por un ^ Xi y X2 son cada uno independientemente N, C, O, o S; R8 es H, halo, -OH, Ci-6 alquilo, C2.6alquenilo, C2-6alquinilo, -OH, -NRaRb, - (CH2)n-0-Rc, -O- (C1-6 alquilo), -S(0)pRe, o -C(O)-Rd; R9 es H, C1-6alquilo, Ci-6alquilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido o R9a, en donde R9a la unión que se logra en la unión indicada por un R10 y R11 son cada uno independientemente H, halo, Ci-6alcoxi, Ci-salcoxi sustituido, -NRaRb/ o -OH; cada Ra y Rb es independientemente H, Ci-6alquilo, Ci-6alquilo sustituido, -C(0)Rd, C6-ioa3rilo; cada Rc es independientemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, Ci-6alquilo, o Ci-6alquilo sustituido; cada R¿ es independientemente H, halo, Ci.6alquilo, sustituido Ci-6alquilo, Ci_6alcoxi, Ci-6alcoxi sustituido, -NH2, - H (Ci-galquilo) , -NH (Ci_6alquilo sustituido), -N (Ci-6alquil) 2 , - (Ci-6alquilo sustituido) 2 , C6-ioarilo, o heterociclilo; cada Re es independientemente H, Ci-6alquilo, Ci-6alquilo sustituido, C6-io arilo, C6-io arilo sustituido, heterociclilo, o heterociclilo sustituido; cada Rf es independientemente H, Ci-6alquilo, Ci-6alquilo sustituido, -C(0)Rd, fosfato, difosfato, o trifosfato; cada n es independientemente 0, 1, 2, o 3 ; cada p es independientemente 0, 1, o 2 ; o (g) una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de (a) a (f ) , un tautomero de cualquiera de (a) a (f) , o una sal farmacéuticamente aceptable del tautomero.

- Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (99) . Compuestos descritos en la referencia 100, que incluyen: compuestos de Acilpiperazina, compuestos de Indoldiona, compuestos de Tetrahidraisoquinolina (THIQ) , compuestos de Benzociclodiona, compuestos de Aminoazavinilo, compuestos de Aminobencimidazol-quinolinona (ABIQ) (101, 102), compuestos de Hidraftalamida, compuestos de Benzofenona, compuestos de Isoxazol, compuestos de Esterol, compuestos de Quinazilinona, compuestos de Pirrol (103) , compuestos de Antraquinona, compuestos de Quinoxalina, compuestos de Triazina, compuestos de Pirazalopirimidina, y compuestos de Benzazol (104) .

- Compuestos descritos en la referencia 105.

- Derivado de fosfato de aminoalquil-glucosaminida tal como RC-529 (106, 107).

Un fosfaceno, tal como poli [di (carboxilatofenoxi) fosfaceno] ("PCPP") como se describe, por ejemplo, en la referencia 108 y 109. innumopotenciadores de molécula pequeña (SMIP, por sus siglas en inglés) tal como: N2-metil-l- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2 , 4-diamina N2,N2-dimetil-l- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2, 4-diamina N2-etil-N2-metil-l- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2, 4-diamina N2-metil-l- (2-metilpropil) -N2-propil-lH-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2 , 4-diamina 1- (2-metilpropil) -N2-propil-lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2, 4-diamina N2-butil-l- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2, 4-diamina N2-butil-N2-metil-l- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2, 4-diamina N2-metil-l- (2-metilpropil) -N2-pentil-lH-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2 , 4-diamina N2-metil-l- (2-metilpropil) -N2-prop-2-enil-lH- imidazo [4 , 5-c] quinolin-2 , 4-diamina l- (2-metilpropil) -2- [ (fenilmetil) tio] -1H-imidazo [4 , 5-c] quinolin-4 -amina 1- (2-metilpropil) -2- (propiltio) -1H- imidazo [4,5-c] quinolin-4 -amina 2- [ [4-amino-l- (2-metilpropil) -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-2-il] (metil) amino] etanol Acetato de 2- [ [4-amino-l- (2-metilpropil) -1H-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2-il] (metil) amino] etilo 4-amino-l- (2-metilpropil) -1, 3 -dihidro-2H-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2-ona N2-butil-l- (2-metilpropil) -N4 ,N4-bis (fenilmetil) -lH-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2 , 4-diamina N2-butil-N2-metil-l- (2-metilpropil) -N4 ,N4-bis (fenilmetil) -lH-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2 , 4-diamina N2-metil-l- (2-metilpropil) -N4 ,N4-bis (fenilmetil) -lH-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2 , 4 -diamina N2,N2-dimetil-l- (2-metilpropil) -N4,N4-bis (fenilmetil) -lH-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2 , 4-diamina 1- [4-amino-2- [metil (propil) amino] -lH-imidazo [4,5-c] quinolin-l-il] -2-metilpropan-2-ol 1- [4 -amino-2- (propilamino) -1H-imidazo [4,5-c] quinolin-l-il] -2-metilpropan-2-ol N4 , 4 -dibenzil-1- (2-metoxi-2-metilpropil) -N2-propil-lH-imidazo [4 , 5-c] quinolin-2 , 4-diamina .

Los agentes inductores de citocinas para uso en la presente invención pueden ser moduladores y/o agonistas de los Receptores Tipo Toll (TLR) . Por ejemplo, pueden ser agonistas de uno o más de las proteínas humanas TLR1 , TLR2 , TLR3 , TLR4 , TLR7 , TLR8 , y/o TLR9. Los agentes preferidos son agonistas de TLR4 (por ejemplo, lípido natural modificado como se deriva de lipopolisacáridos enterobacterianos, compuestos de fosfolípido, tal como el dímero de fosfolípido sintético, E6020) , TLR7 (por ejemplo, benzonaftiridinas, imidazoquinolinas) y/o TLR9 (por ejemplo, oligonucleótidos de CpG) . Estos agentes son útiles para activar rutas inmunitarias innatas .

El agente inductor de citocina se puede adicionar a la composición en varias etapas durante su producción. Por ejemplo, puede estar dentro de una composición de antígeno, y esta mezcla entonces se puede adicionar a una emulsión de aceite en agua. Como una alternativa, puede estar dentro de una emulsión de aceite en agua, caso en el cual el agente ya sea se puede adicionar a los componentes de la emulsión antes del emulsionamiento, o se puede adicionar a la emulsión después del emulsionamiento. De manera similar, el agente se puede coacervar dentro de las gotas de emulsión. La ubicación y distribución del agente inductor de citocinas dentro de la composición final dependerá de sus propiedades hidrófilas/lipófilas , por ejemplo, el agente puede estar localizado en la fase acuosa, en la fase de aceite y/o en la entrecara de aceite-agua.

El agente inductor de citocinas se puede conjugar a un agente separado, tal como un antígeno (por ejemplo, CRM197) . En la referencia 110 se proporciona una revisión general de las técnicas de conjugación para moléculas pequeñas. Como una alternativa, los adyuvantes se pueden asociar de forma no covalente con agentes adicionales, tal como por medio de interacciones hidrófobas o iónicas .

Los agentes inductores de citocinas, preferidos son: (a) compuestos de benzonaftridina, (b) oligonucleótidos inmunoestimuladores y (c) 3dMPL.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tal como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra o de hebra individual (excepto para AR ) . Las referencias 111, 112, y 113 describen posibles sustituciones análogas, por ejemplo, reemplazo de guanosina con 2'-desoxi-7-desazaguanosina . El efecto adyuvante de oligonucleótidos de CpG se analiza adicionalmente en las referencias 114 a 119. Una secuencia de CpG se puede dirigir a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT (120) . La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una inmuno-respuesta Thl, tal como un CpG-A ODN (oligodesoxinucleótido) , o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como un CpG-B ODN. Los CpG-A y CpG-B ODN se analizan en las referencias 121-123. De manera preferente, el CPG es un CpG-A ODN. De manera preferente, el oligonucleótido de CpG se construye de modo que extremo 5' es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente , se pueden unir dos secuencias de oligonucleótido de CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros" . Ver, por ejemplo, referencias 120 y 124-126. Un adyuvante de CpG útil es CpG7909, también conocido como PROMUNEMR (Coley Pharmaceutical Group, Inc.).

Como una alternativa, o adicionalmente, al usar secuencias de CpG, se pueden usar secuencias de TpG (127) . Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados .

El oligonucleótido inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido consecutivo de timidina (por ejemplo, TTTT, como se describe en la referencia 127) , y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25% timidina (por ejemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etcétera) . Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citocina consecutivo (por ejemplo, CCCC, como se describe en la referencia 127) , y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25% de citocina (por ejemplo, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, etcétera) . Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados.

Los oligonucleótidos inmunoestirauladores comprenderán típicamente al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos. 3dMPL (también conocido como monofosforil-lípido A des-O-acilado o 3 -0-desacil-4 ' -monofosforil-lípido A) es un adyuvante en el cual se ha des-acilado la posición 3 de la glucosamina terminal reductora en el monofosforil-lípido A. Se ha preparado 3dMPL de un mutante heptosa de Salmonella minnesota, y es químicamente similar al lípido A, pero carece de un grupo fosforilo lábil a ácido y un grupo acilo lábil a base. Activa células de linaje de monocitos/macrófagos y estimula la liberación de varias citocinas, incluyendo IL-1, IL-12, TNF-a y GM-CSF (ver también referencia 128). La preparación de 3dMPL se describió originalmente en la referencia 129. 3dMPL puede tomar la forma de una mezcla de moléculas relacionadas, variando su acilación (por ejemplo, que tiene 3, 4, 5 o 6 cadenas de acilo, que pueden ser de longitudes diferentes) . Los dos monosacáridos de glucosamina (también conocidos como 2-desoxi-2-amino-glucosa) están N-acilados en sus carbonos de la posición 2 (es decir, en las posiciones 2 y 2'), y también hay O-acilación en la posición 3'. El grupo unido al carbono 2 tiene la' fórmula -NH-C0-CH2-CR^-R1. El grupo unido al carbono 2' tiene la fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2. El grupo unido al carbono 3' tiene la fórmula -O-CO-CH2-CR3R3. Una estructura representativa es Los grupos R1, R2 y R3 son cada uno independientemente -(CH2)n-CH3. El valor de n está de manera preferente entre 8 y 16, de manera más preferente entre 9 y 12, y de manera más preferente es 10.

Los grupos R1' , R2' y R3' pueden ser cada uno independientemente: (a) -H, (b) -OH, o (c)-O-CO-R4, donde R4 es ya sea -H o - (CH2)m-CH3, en donde el valor de m está de de manera preferente entre 8 y 16, y es de manera más preferente 10, 12 o 14. En la posición 2, m es preferentemente 14. En la posición 2', m es de manera preferente 10. En la posición 3', m es preferente 12. Los grupos R1' , R2' y R3' de esta manera son de manera preferente grupos -O-acilo de ácido dodecanoico, ácido tetradecanoico o ácido hexadecanoico .

Cuando todos de R1' , R2' y R3' son -H entonces el 3dMPL tiene solo 3 cadenas de acilo (una en cada una de las posiciones 2, 2' y 3'). Cuando solo dos de R1' , R2' y R3' son -H entonces el 3dMPL puede tener 4 cadenas de acilo. Cuando solo uno de R1' , R2' y R3' es -H entonces el 3dMPL puede tener 5 cadenas de acilo. Cuando ninguno de R1', R2 ' y R3' es -H entonces el 3dMPL puede tener 6 cadenas de acilo. El adyuvante 3 dMPL usado de acuerdo a la invención puede ser una mezcla de estas formas, con de 3 a 6 cadenas de acilo, pero se prefiere incluir 3dMPL con 6 cadenas de acilo en la mezcla, y en particular para asegurarse que la forma de cadena de hexaacilo constituya hasta 10% en peso del 3dMPL total, por ejemplo, >20%, >30%, >40%, >50% o más. 3dMPL con 6 cadenas de acilo se ha encontrado que es la forma más activa de adyuvante.

De esta manera, la forma más preferida de 3 dMPL para inclusión en las composiciones de la invención tiene la fórmula (IV) , mostrada más adelante.

Donde se usa 3dMPL en la forma de una mezcla entonces las referencias a cantidades o concentraciones de 3dMPL en las composiciones de la invención se refieren a la especie de 3 dMPL combinada en la mezcla.

En condiciones acuosas, 3dMPL puede formar agregados micelares o partículas con diferentes tamaños, por ejemplo con un diámetro de <150nm o >500 nm . Cualquiera o ambos de estos se pueden usar con la invención, y se pueden seleccionar las mejores partículas por ensayo de rutina. Se prefieren partículas más pequeñas (por ejemplo, suficientemente pequeñas para dar una suspensión acuosa clara de 3dMPL) para el uso de acuerdo a la invención debido a su actividad superior (130) . Las partículas preferidas tienen un diámetro medio menor de 220 nm, de manera más preferente menor de 200 nm o menos de 150nm o menos de 120 nm, y pueden tener un diámetro medio menor de 100 nm . En la mayoría de los casos, sin embargo, el diámetro medio no será menor de 50 nm. Estas partículas son suficientemente pequeñas para ser adecuadas para la filtración por filtro. El diámetro de partículas se puede valorar por técnica de rutina de dispersión de luz dinámica, que revela un diámetro medio de partícula. Donde se dice que una partícula tiene un diámetro de x nm, en general habrá una distribución de partículas alrededor de esta media, pero al menos 50% en número (por ejemplo, >60%, >70%, >80%, >90%, o más) de las partículas tendrá un diámetro dentro del intervalo x+25%.

Se puede usar de manera ventajosa 3dMPL en combinación con una emulsión de aceite en agua. Sus tancialmente todo 3 dMPL puede estar localizado en la fase acuosa de la emulsión.

El 3dMPL se puede usar en sí mismo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, se conoce usar 3dMPL en combinación con la saponina QS21 (131) (que incluye en una emulsión de aceite en agua (132)), con un oligonucleótido inmunoes t imulador , tanto con QS21 como con un oligonucleótido inmunoestimulador , con fosfato de aluminio (133), con hidróxido de aluminio (134), o con tanto fosfato de aluminio como con hidróxido de aluminio .

Adyuvantes grasos Los adyuvantes grasos que se pueden usar con la invención incluyen las emulsiones de aceite en agua descritas anteriormente, y también incluyen, por ej emplo : - Un compuesto de fosfolípido de la fórmula I, II o III, o una sal del mismo: II III como se define en la referencia 135, tal como 4ER 803058', 'ER 803732', ? ER 804053', ? ER 804058', 'ER 804059', ? ER '804442', ' ER 804680', ? ER 804764', x ER 803022' o ' ER 804057', por ejemplo: ER804057 también se llama E6020. Un compuesto de fosfolípido de la fórmula I, II o III, o una sal del mismo, se puede usar en sí mismo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, se puede usar compuesto de fórmula I, II o III, en combinación con una emulsión de aceite en agua o una composición que contiene minerales. En una modalidad particular, se usa E6020 en combinación con una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de escualeno-agua, tal como MF59) o una composición que contiene minerales (por ejemplo, una sal mineral tal como una sal de aluminio o una sal de calcio) .

- Derivados de lípido A de Escherichia coli tal como OM-174 (descrito en las referencias 136 y 137) .

- Una formulación de un lípido catiónico y un co-lípido (usualmente neutral) , tal como bromuro de aminopropil-dimetil-miristoleiloxi-propanaminio-difitanoil- fosfatidil-etanolamina ( "VAXFECTIN (MR)") o bromuro de aminopropil-dimetil-bis-dodeciloxi-propanaminio-dioleoil-fosfatidil-etanolamina ( "GAP-DLRIE : DOPE" ) . Se prefieren (138) formulaciones que contienen sales de (+) -N- (3-aminopropil) -N,N-dimetil-2 , 3-bis (syn-9-tetradeceneiloxi) -1-propanaminio .

Monofosforil-lípido A 3 -O-desacilado . (ver anteriormente) - Compuestos que contienen lípidos enlazados a una estructura cíclica que contiene fosfato, tal como el antagonista de TLR4 E5564 (139, 140) : - Lipopéptidos (es decir, compuestos que comprenden uno o más residuos de ácido graso y dos o más residuos de aminoácido) , tal como lipopéptidos basados en glicerilcisteína . Los ejemplos específicos de estos péptidos incluyen compuestos de la siguiente fórmula * m en la cual cada uno de R1 y R2 representa un radical de hidrocarburo alifático-cicloalifático, saturado o insaturado, alifático o mezclado que tiene de 8 a 30, de manera preferente de 11 a 21 átomos de carbono que también está opcionalmente sustituido por funciones de oxígeno, R3 representa hidrógeno o el radical R!-CO-0-CH2- en el cual R1 tiene el mismo significado como antes, y X representa un aminoácido unido por un enlace peptídico y que tiene un grupo carboxi libre, esterificado o amidado, o una secuencia de aminoácidos de 2 a 10 aminoácidos de la cual el grupo carboxi terminal está en una forma libre, esterificada o amidada. En ciertas modalidades, la secuencia de aminoácidos comprende un D-aminoácido, por ejemplo, ácido D-glutámico (D-Glu) o ácido D-gamma-carboxi-glutámico (D-Gla) .

Los lipopéptidos bacterianos reconocen en general TLR2 , sin que se requiera y que participe TLR6. (TLR opera cooperativamente para proporcionar reconocimiento específico de varios activadores, y TLR2 y TLR6 reconocen juntamente peptidoglicanos , en tanto que TLR2 reconoce lipopéptidos sin TLR6) . Estos algunas veces se clasifican como lipopéptidos naturales y lipopéptidos sintéticos. Los lipopéptidos sintéticos tienden a comportarse de forma similar, y se reconocen principalmente por TLR2.

Los lipopéptidos adecuados para el uso como adyuvantes incluyen compuestos que tienen la fórmula en donde el centro quiral marcado * y el marcado *** están ambos en la configuración R; el centro quiral marcado ** está ya sea en la configuración R o S; cada uno Rla y Rlb es independientemente un grupo de hidrocarburo alifático o cicloalif tico-alif tico que tiene 7-21 átomos de carbono, opcionalmente sustituido por funciones de oxígeno, o uno de Rla y Rlb, pero no ambos, es H; R2 es un grupo de hidrocarburo alifático o cicloalifático que tiene 1-21 átomos de carbono y opcionalmente está sustituido por funciones de oxígeno; n es 0 o 1; As representa ya sea -O-Kw-CO- o -NH-Kw-CO-, donde Kw es un grupo de hidrocarburo alifático que tiene 1-12 átomos de carbono; As1 es un D- o L-alfa-aminoácido; Z1 y Z2 representan cada uno independientemente -OH o el radical N-terminal de un ácido D- o L-alfa aminoácido de un ácido amino (alcano inferior) -sulfónico o de un péptido que tiene hasta 6 aminoácidos seleccionado de los ácidos D- y L-alfa aminocarboxílicos y ácidos amino-alquilo inferior-sulfónicos, y Z3 es H o -CO-Z4, cuando Z4 es -OH o el radical N-terminal de un D- o L-alfa aminoácido de un ácido amino-(alcano inferior) -sulfónico o de un péptido que tiene hasta 6 aminoácidos seleccionado de los ácidos D- y L-alfa aminocarboxílicos, y ácidos amino-alquilo inferior- sulfónicos, o un éster o amida formada del ácido carboxílico de estos compuestos. Las amidas adecuadas incluyen -NH2 y NH (alquilo inferior) , y los ésteres adecuados incluyen ásteres de Ci-C4alquilo . (Alquilo inferior o alcano inferior, como se usa en la presente, se refiere a alquilos de cadena recta o ramificada de Ci-C6) .

Estos compuestos se describen en más detalle en U.S 4,666,886. En una modalidad particular, el lipopéptido tiene la fórmula: Otro ejemplo de una especie de lipopéptido se llama LP40, y es un agonista de TLR2. Akdis, et al., Bur. J. Immunology, 33: 2717-26 (2003) .

Estos están relacionadas a una clase conocida de lipopéptidos de E. coli, referidos como lipoproteínas de mureína. Ciertos productos de degradación parcial de estas proteínas llamados lipopéptidos de mureína se describen en Hantke, et al. Eur. J. Biochem, 34:284-296 (1973). Estos comprenden un péptido enlazado a ácido N-acetil-murámico y de esta manera se relacionan a péptidos de muramilo, que se describen en Baschang, et al, Tetrahedron, 45 (20) : 6331-6360 (1989) .

Adyuvantes de sales de aluminio Se usar los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" y "fosfato de aluminio" . Estos nombres son convencionales, pero se usan por conveniencia únicamente, puesto que no es una descripción precisa del compuesto químico real que se presenta (por ejemplo, ver capítulo 9 de la referencia 74). La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes de "hidróxido" o de "fosfato" que son de uso general como coadyuvantes .

Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que usualmente son al menos parcialmente cristalinos . El oxihidróxido de aluminio, que se puede representar por la fórmula Alo (OH) , se puede distinguir de otros compuestos de aluminio, tal como hidróxido de aluminio Al (OH) 3 , por espectroscopia infrarroja (IR) , en particular por la presencia de una banda de absorción con 1070cm"1 y un resalto fuerte en 3090-3100cm"1 (capítulo 9 de referencia 74) . El grado de cristalinidad de un adyuvante de hidróxido de aluminio se refleja por el ancho de la banda de difracción a media altura (WHH) , con partículas pobremente cristalinas que muestran mayor ensanchamiento de línea debido a menores tamaños de cristalitos. El área superficial se incrementa con el incremento de WHH, y se ha visto que los adyuvantes con mayores valores de WHH tienen mayor capacidad para adsorción de antígeno. Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se ve en las micrografías electrónicas de transmisión) es típica para adyuvantes de hidróxido de aluminio . El pl de los adyuvantes de hidróxido de aluminio típicamente cerca de 11, es decir, el adyuvante mismo tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Las capacidades adsorbentes de entre 1.8-2.6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7.4 se han reportado para los adyuvantes de hidróxido de aluminio .

Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que también contienen f ecuentemente una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio) . Se pueden obtener por precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación tienen influencia en el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal. Los hidroxifosfatos tienen en general una relación molar de P04/A1 entre 0.3 y 1.2. Se pueden distinguir hidroxifosfatos de A1P04 estricto por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda de espectro de IR en 3164cm"1 (por ejemplo, cuando se calienta a 200eC) indica la presencia de hidroxilos estructurales (capítulo 9 de referencia 74) .

La relación molar P04/A13+ de un adyuvante de fosfato de aluminio estará en general entre 0.3 y 1.2, de manera preferente entre 0.8 y 1.2, y manera más preferente 0.95+0.1. El fosfato de aluminio en general, será amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato . Un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de P04/Al entre 0.84 y 0.92, incluida a 0.6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio en general estará en partículas (por ejemplo, morfología tipo placa como se ve en micrografías electrónicas de transmisión) . Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0.5-20µ?? (por ejemplo, aproximadamente 5-10 m) después de cualquier adsorción de antígeno. Las capacidades adsorbentes de entre 0.7-1.5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7.4 se han reportado para adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC, por sus siglas en inglés) de fosfato de aluminio se relaciona inversamente al grado de sustitución de fosfato por hidroxilo, y éste grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y la concentración de los reactivos usados para preparar la sal por precipitación. También se altera el PZC al cambiar la concentración de iones fosfatos libres en solución (más fosfato = más PZC ácido) o al adicionar un amortiguador tal como un amortiguador de histidina (más PZC más básico) . Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo a la invención tendrán en general un PZC de entre 4.0 y 7.0, más de manera más preferente entre 5.0 y 6.5, por ejemplo, aproximadamente 5.7.

Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar composiciones de la invención puede contener una amortiguador (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un amortiguador Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y están libres de pirógenos. Una suspensión puede incluir grupos fosfato, acuosos, libres, por ejemplo, presentes a una concentración de entre 1.0 y 20 mm, de manera preferente entre 5 y 15 mM, y de manera más preferente aproximadamente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio.

La invención puede usar una mezcla tanto de un hidróxido de aluminio como de un fosfato de aluminio. En este caso puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, una relación en peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etcétera.

La concentración de Al+++ en una composición para la administración a un paciente es de manera preferente menos de 10 mg/ml por ejemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/m, etcétera. Un intervalo preferido está entre 0.3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0.85 mg/dosis.

Así como incluir uno o más adyuvantes de sal de aluminio, el componente de adyuvante puede incluir uno o más agentes adyuvantes o inmunoestimuladores adicionales. Estos componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a: un compuesto de benzonaftiridina, un adyuvante de monofosforil-lípido a 3-0-desacetilado ( "3d-MPL" ) , y/o una emulsión de aceite en agua. También se ha referido 3d- PL como monofosforil-lípido A 3 -des-O-acilado o como un 3-0-desacil-4 ' -monofosforil lípido A. El nombre indica que la posición 3 de glucosamina terminal reductora en el monofosforil- lípido A está des-acilada. Se ha preparado de un mutante sin heptosa de S.minnesota, y es químicamente similar a lípido A, pero carece de un grupo fosforilo lábil a ácido y un grupo acilo lábil a base. Activa células de linaje de monocitos/macrófagos y estimula la liberación de varias citocinas, incluyendo IL-1, IL-12, TNF-a y GM-CSF. La preparación de 3d-MPL se describió originalmente en la referencia 129, y el producto se ha producido y vendido por Corixa Corporation bajo el nombre MPL (MR) . Se pueden encontrar detalles adicionales en las referencias 82 a 85.

El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio es útil, en particular en niños, y los antígenos se adsorben en general a estas sales . También se prefieren emulsiones de escualeno en agua particularmente en las personas de edad avanzada. Las combinaciones útiles de adyuvante incluyen combinaciones de adyuvantes Thl y Th2, tal como CpG y alumbre, o resiquimod y alumbre. Se puede usar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL. Otras combinaciones que se pueden usar incluyen: alumbre y un compuesto de benzonaftridina o un SMIP, una emulsión de escualeno en agua (tal como MF5 ) y un compuesto de benzonaftridina o un SMIP y E6020 y una emulsión de escualeno en agua, tal como MF59) o alumbre.

Las composiciones de la invención pueden producir tanto una respuesta inmunitaria mediada por células, así como una respuesta inmunitaria humoral.

En general se piensa que son necesarios dos tipos de células T, células CD4 y CD8 , para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humor l. Las células T CD8 puede expresar un co-receptor de CD8 y se refieren comúnmente como linfocitos T citotóxicos (CTL) . Las células T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados en moléculas de MHC Clase I.

Las células T CD4 pueden expresar un co-receptor de CD4 y se refieren comúnmente como células auxiliares T. Las células T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas de MHC clase II. En la interacción con una molécula de MHC clase II, células CD4 pueden segregar factores tal como citocina. Estas citocinas segregada pueden activar células B, células T citotóxicas, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmunitaria . Las células T auxiliares o células CD4+ se pueden dividir adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: fenotipo THl y fenotipo TH2 que difieren en su función efectora y citocinas.

Las células THl activadas mejoran la inmunidad celular (incluyendo un incremento en la producción de CTL específica de antígeno) y por lo tanto son de valor particular al responder a infecciones intracelulares . Las células THl activadas pueden segregar uno o más de IL-2, IFN-? y TNF-ß. Una respuesta inmunitaria de THl puede dar por resultado reacciones inflamatorias locales al activar macrófagos, células NK (aniquiladoras naturales) y células T citotóxicas CD8 (CTL) . Una respuesta inmunitaria de THl también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria al estimular el crecimiento de células B y T con IL-12. Las células B estimuladas con THl pueden segregar IgG2a.

Las células TH2 activadas mejoran la producción de anticuerpos y por lo tanto son valor en la respuesta a infecciones extracelulares . Las células TH2 activadas pueden segregar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Una respuesta inmunitaria de TH2 puede dar por resultado la producción de IgGl, IgE, IgA y células B de memoria para protección futura.

Una respuesta inmunitaria mejorada puede incluir una o más de una respuesta inmunitaria de THl mejorada y una respuesta inmunitaria de TH2.

Una respuesta inmunitaria de THl puede incluir uno o más de un incremento en CTL, un incremento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de THl (tal como IL-2, IFN-? y TNF-ß) , un incremento en macrófagos activados, un incremento en la actividad de N , o un incremento en la producción de IgG2a. De manera preferente, la respuesta inmunitaria mejorada de THl incluirá un incremento en la producción de IgG2a.

Una respuesta inmunitaria de THl se puede producir usando adyuvante THl. Un adyuvante THl producirá en general niveles incrementados de producción de IgG2a con relación a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes THl adecuados para el uso en la invención pueden incluir, por ejemplo formulaciones de saponina, virosomas y partículas tipo virus, derivados no tóxicos de lipopoli-sacárido enterobacteriano (LPS) , oligonucleótidos inmunoestimuladores . Los oligonucleótidos inmunoestimula-dores , tal como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes THl preferidos para el uso en la invención.

Una respuesta inmunitaria de TH2 puede incluir uno o más de un incremento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH2 (tal como, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) , o un incremento en la producción de IgGl, IgE, IgA y células B de memoria. De manera preferente, la respuesta inmunitaria mejorada de TH2 incluirá un incremento en la producción de IgGl.

Una respuesta inmunitaria de TH2 se puede producir usando un adyuvante de TH2. Un adyuvante de TH2 producirá en general niveles incrementados de producción de IgGl con relación a inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para el uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite y toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de los mismos. Las composiciones que contienen minerales, tal como sales de aluminio son adyuvantes TH2 preferidos para el uso en la invención.

Una composición puede incluir una combinación de un adyuvante THl y un adyuvante TH2. De manera preferente, esta composición produce una respuesta mejorada de THl y una respuesta mejorada de TH2, es decir, un incremento en la producción de IgGl e IgG2a con relación a la inmunización sin un adyuvante. De manera aun más preferente, la composición que comprende una combinación de adyuvante THl y TH2 produce una respuesta inmunitaria incrementada de THl y/o incrementada de TH2 con relación a la inmunización con un adyuvante individual (es decir, con relación a la inmunización con un adyuvante THl solo o inmunización con un adyuvante TH2 solo) .

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria de TH1 y una respuesta de TH2. De manera preferente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta mejorada de TH1 y una respuesta mej orada de TH2.

La respuesta inmunitaria mejorada por una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica o mucosa. De manera preferente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de respuesta inmunitaria sistémica mejorada y mucosa mejorada. De manera preferente, la respuesta inmunitaria mucosa es una respuesta inmunitaria de TH2. De manera preferente, la respuesta inmunitaria mucosa incluye un incremento en la producción de IgA.

Métodos de tratamiento y administración Las composiciones de la invención son adecuadas para la administración a mamíferos, y la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende el paso de administración una composición (por ejemplo, una composición inmunogénica) de la invención al mamífero. Las composiciones (por ejemplo, una composición inmunogénica) se pueden usar para producir una formulación de vacuna para inmunizar un mamífero. Los mamíferos son típicamente un humano, y el ecto-dominio de proteína F de RSV es típicamente un ecto-dominio de proteína F de VRS de humano. Sin embargo, el mamífero puede ser cualquier otro mamífero que sea susceptible a infección con RSV, tal como una vaca que se puede infectar con RSV bovino. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria se puede formular después de la administración de una proteína F de RSV, purificada, una partícula alfavirus o ARN auto-replicante .

La invención también proporciona una composición de la invención para el uso como un medicamento, por ejemplo, para el uso al inmunizar un paciente contra infección de RSV.

La invención también proporciona el uso de un polipéptido como se describe anteriormente en la elaboración de un medicamento para formular una respuesta inmunitaria en un paciente .

La respuesta inmunitaria formulada por estos métodos y usos incluirá en general una respuesta de anticuerpo, de manera preferente una respuesta de anticuerpo protectora. Los métodos para valorar la respuesta de anticuerpo después de la vacunación de RSV son bien conocidos en la técnica.

Las composiciones de la invención se pueden administrar de varias maneras adecuadas, tal como inyección intramuscular (por ejemplo, en el brazo o pierna) , inyección subcutánea, administración intranasal, administración oral, administración intradérmica, administración transcutánea, administración transdérmica, y similares. La ruta apropiada de administración dependerá de, la edad, salud y otras características del mamífero. Un facultativo será capaz de determinar una ruta apropiada de administración en base a estos y otros factores.

Las composiciones inmunogénicas, y formulaciones de vacuna, se pueden usar para tratar tanto niños como adultos, incluyendo mujeres embarazadas. De esta manera, un sujeto puede ser de menos de un 1 año, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, o al menos 55 años de edad. Los sujetos preferidos para recibir las vacunas son los de edad avanzada (por ejemplo, >50 años de edad, >60 años de edad y de manera preferente >65 años de edad) , los jóvenes (por ejemplo, <6 años de edad, tal como 4 a 6 años de edad, <5 años de edad) y mujeres embarazadas. Las vacunas no son adecuadas solo para estos grupos, sin embargo, y se pueden usar más generalmente en una población.

El tratamiento puede ser por un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis. Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis, las varias dosis se pueden dar por la misma o diferente ruta, por ejemplo, una cebadura parenteral y refuerzo mucoso, una cebadura mucosa y refuerzo parenteral, etcétera. La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis) es particularmente útil en pacientes inmunológicamente sin tratamiento previo. Las múltiples dosis se administrarán típicamente con al menos 1 semana de separación (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, y similares) .

Las formulaciones de vacuna producidas usando una composición de la invención se pueden administrar a pacientes sustancialmente al mismo tiempo, como (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita médica a un profesional de cuidado de la salud o centro de vacunación) otras vacunas. Aspectos adicionales de la invención La invención también proporciona un polipéptido (por ejemplo, polipéptido recombinante) que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde (i) el primer dominio comprende un ectodominio de glicoproteína F de RSV, en totalidad o en parte, y (ii) el segundo dominio comprende un dominio heterólogo de oligomerización. Los detalles adicionales se proporcionan anteriormente. Si el dominio de oligomerización comprende una .secuencia heptad (por ejemplo, la secuencia de GCN descrita anteriormente) , entonces es preferentemente una fase de repetición heptad con la secuencia de HR2 (si está presente) del ectodominio.

La invención también proporciona ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica para este polipéptido. También proporciona vectores que incluyan estos ácidos nucleicos, y células hospedadoras que incluyen estos vectores. Los vectores se pueden usar para, por ejemplo, propósitos de expresión recombinante, inmunización con ácidos nucleicos, etcétera.

La invención también proporciona una composición que comprende moléculas que comprenden ectodominios de glicoproteína F de RSV, en donde los ectodominios de al 50% (por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%) de las moléculas están presentes en una conformación de pre-fusión.

Otros virus Así como se usan con RSV de humano, la invención se puede usar con otros miembros de Pneumoviridae y Paramyxoviridae, incluyendo, pero no limitado a, virus sincitial respiratorio bovino, virus 1 de parainfluenza, virus 2 de parainfluenza, virus 3 de parainfluenza y virus 5 de parainfluenza .

De esta manera, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una glicoprotexna F de un Pneumoviridae o Paramyxoviridae, en donde la glicoproteína F está en la conformación de pre-fusión.

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido que presenta un epítopo presente en una conformación de pre-fusión de la glicoproteína F de un Pneumoviridae o Paramyxoviridae, pero está ausente la conformación de post- fusión de la glicoproteína .

La invención también proporciona un polipéptido que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde (i) el primer dominio comprende un ectodominio de la glicoproteína F de un Pneumoviridae o Paramyxoviridae, en totalidad o en parte, y (ii) el segundo dominio comprende un dominio heterólogo de oligomerización.

La invención también proporciona estos polipéptidos y composiciones para el uso en la inmunización, etcétera.

La invención también proporciona una composición que comprende moléculas que comprenden ectodominios de glicoproteína F de RSV, en donde los ectodominios de al menos 50% (por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%) de las moléculas están presentes en una conformación de pre-fusion o una conformación intermedia.

Polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV Los polipéptidos particulares de ecto-dominio de proteína F de RSV se usan o incluyen en algunas modalidades de la invención. Algunos de los polipéptidos particulares de ecto-dominio de proteína F de RSV contienen secuencias alteradas de aminoácidos de aproximadamente la posición 100 a aproximadamente la posición 161. Las secuencias de aminoácidos de la posición 100 a la posición 150 para varios polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV particulares se muestra en la Figura 1C. Las secuencias de aminoácidos de varios polipéptidos particulares de ecto-dominio de proteína F de RSV se presentan en la presente, por ejemplo, en el ejemplo 1.

Aspectos generales El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consistente" y "que consiste esencialmente de" , por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo, X+Y.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde es necesario, se puede omitir la palabra "sustancialmente" de la definición de la invención.

El término "aproximadamente" con relación a un valor x numérico significa, por ejemplo, ?±10%.

A menos que se señale específicamente, un proceso que comprende un paso de mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezclado. De esta manera, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Donde haya tres componentes entonces se pueden combinar dos componentes entre sí, y luego la combinación se puede combinar con el tercer componente, etcétera.

Donde se usen materiales de animales (y en particular de bovino) , en el cultivo de células, se deben obtener de fuentes que estén libres de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSR) , y en particular libres de encefalopatía espongiforme bovina (BSE) . En general, se prefiere cultivar células en la ausencia total de materiales derivados de animales .

Donde ser administra un compuesto al cuerpo como parte de una composición entonces ese compuesto se puede reemplazar de manera alternativa por un profármaco adecuado .

Donde se usa un sustrato celular para reclasificación o procedimientos de genética invertida, se prefiere que sea uno que sea aprobado para el uso en producción de vacunas humanas, por ejemplo en el capítulo 5.2.3., general de Ph Eur .

La identidad entre secuencias de polipéptidos se determina de preferentemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , usando una búsqueda de separación afín con parámetros, penalidad de abertura de separación = 12 y penalidad de extensión de separación = 1.

Tabla 1. Fosfolípidos DDPC 1, 2-Didecanoil-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina DEPA 1, 2-Dierucoil-sn-glicero-3-fosfato DEPC 1, 2-Erucoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DEPE 1, 2-Dierucoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DEPG 1 , 2-Dierucoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1- glicerol ... ) DLOPC 1 , 2-Linoleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DLPA 1 , 2 -dilauroilo-sn-glicero-3- fosfato DLPC 1 , 2 -dilauroilo-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina DLPE 1 , 2 -dilauroilo-sn-glicero-3 -fosfatidiletanolamina DLPG 1, 2-dilauroilo-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1- glicerol ... ) DLPS 1 , 2-dilauroilo-sn-glicero-3-fosfatidilserina DMG 1 , 2 -dimiristoil-sn-glicero-3 -fosfoetanolamina DMPA 1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato DMPC 1 , 2 -dimiristoil-sn-glicero-3 - fosfatidilcolina DMPE 1 , 2 -dimiristoil-sn-glicero-3 -fosfatidiletanolamina DMPG 1, 2-miristoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1- glicerol ... ) DMPS 1 , 2 -dimiristoil-sn-glicero-3 - fosfatidilserina DOPA 1 , 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfato DOPC 1 , 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DOPE 1 , 2-dioleoil-sn-glicero-3 - fosf tidiletanolamina DOPG 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1- glicerol ... ) DOPS 1 , 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DPPA 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato DPPC 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DPPE 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanol- amina DPPG 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1- glicerol ... ) DPPS 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DPyPE 1 , 2-difitanoil-sn-glicero-3- osfoetanolaraina DSPA 1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfato DSPC 1 , 2-distearoil-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina DSPE 1, 2-Diostearpil-sn-glicero-3-fosfatidiletanol- amina DSPG 1 , 2-distearoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1- glicerol ... ) DSPS 1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina EPC PC de huevo HEPC PC de huevo hidrogenado HSPC PC de soya hidrogenado de alta pureza HSPC PC soya hidrogenada LYSOPC MYRISTIC l-Miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina LYSOPC PALMITIC 1-Palmitoil-sn-Glicero-3 - fosfatidilcolina LYSOPC ESTEARIC l-Estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina Milk Sphingomyelin MPPC 1-miristoil, 2-palmitoil-sn-glicero 3-fosfatidilcolina MSPC 1-miristoil, 2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidil- colina PMPC 1-palmitoil, 2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidil- colina POPC 1-palmitoil, 2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidil- colina POPE l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidil- etanolamina POPG 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac- (1- glicerol) ... ] PSPC 1-palmitoil , 2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina SMPC 1-estearoil, 2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidil- colina SOPC 1-estearoil, 2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidil- colina SPPC 1-estearoil, 2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil- colina Ejemplificación Ejemplo 1-polipéptidos F de RSV Este ejemplo proporciona secuencias de varios ejemplos de polipéptidos (por ejemplo, que contienen secuencias de señal) y secuencias de ácido nucleico que se pueden usar para expresar polipéptidos F de RSV de la presente invención. Las secuencias de aminoácidos presentadas incluyen el péptido de señal y contienen un ligador C-terminal opcional y marca His (GGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 90) ) . Cuando estos polipéptidos se producen en células hospedadoras , el polipéptido usualmente se procesará por la célula para remover el péptido de señal y, como se describe en la presente, se escindirán algunos de los polipéptidos, por ejemplo, en sitios no modificados de escisión con furina. La invención incluye composiciones que contienen, todas las formas de los polipéptidos particulares de ecto-dominio de proteína F de RSV descritos en la presente, incluyendo formas maduras, que carecen del péptido de señal, formas que se pueden escindir en subunidades que comprenden Fx y F2, y formas que carecen de la marca His C-terminal opcional. Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos del alcance de la presente invención y por lo tanto no se proponen para limitar de ningún modo el alcance.

Un ejemplo de la escisión de furina tipo silvestre es His truncado tipo silvestre de F de RSV (SEQ ID NO: 84) .

Los ejemplos de polipéptidos que se pueden producir como monómeros incluyen: RSV F Furx (SEQ ID NO: 45) ; HIS truncado RSV F oíd furx (SEQ ID NO : 88) ; HIS truncado RSV F Furx R113Q 123N K124N (SEQ ID NO: 89), HIS truncado RSV F delp21 furx (SEQ ID NO: 47) y HIS truncado RSV F delP23 furx (SEQ ID NO: 48) .

Los ejemplos de polipéptidos que se pueden producir como trímeros incluyen: HIS truncado de furina N-términal de F de RSV (SEQ ID NO : 85) ; HIS truncado de supresión de fusión de F de RSV (SEQ ID NO: 67) , y HIS truncado de supresión 2 de fusión de F de RSV (HIS SEQ ID NO: 68) .

Los ejemplos de polipéptidos que se pueden producer como monómeros o rosetones de trímeros incluyen: HIS Truncado de RSV-F furmt (SEQ ID NO:50); HIS Truncado de RSV-F furdel (SEQ ID NO: 51); HIS Truncado de RSV-F delP21 furdel (SEQ ID NO: 86); y HIS Truncado de RSV-F delP23 furdel (SEQ ID NO: 49) , y HIS Truncado de Factor Xa de RSV-F (SEQ ID NO: 52) .

Un ejemplo de una escisión tipo Silvestre que produce probablemente un formación de roseta es HIS Truncado de Furina de RSV-F C-términal (SEQ ID NO: 87) .

Completo El siguiente polipéptido es un polipéptido F de RSV de longitud completa. 1 MELLIL ANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNIKENKCN GTDA VKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAT NRARRE LPRFMNYTLN 121 NAKKTNVTLS RKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV lEFQQKNNRL LEITREFSVN 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS 541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSN (SEQ ID NO: 21) La siguiente secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificadora optimizada para la secuencia de polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 5 1 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG 1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT 1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC 1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACTGAAG (SEQ ID NO : 22) HIS completo El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de RSV de longitud completa seguido por la marca de hexa-histidina . 1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PAT NRARRE LPRFMNYTLN 121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEV KIKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQ NNRL LEITREFSV 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS 541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNSGGSAG SGHHHHHH (SEQ ID NO: 23) La siguiente secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificadora optimizada para la secuencia de polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG 1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT 1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC 1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACAGCGGCGG CAGCGCCGGC 1741 TCTGGCCACC ACCACCATCA CCACTGAAG (SEQ ID NO: 24) HIS pre completo El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de RSV de longitud completa con el dominio de trimerización de GCN4 (subrayado) unido en el C-términal del polipéptido F de RSV seguido por la marca de hexa-histidina. 1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN 121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV lEFQQKNNRL LEITREFSVN 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS 541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNGSSGRM KQIEDKIEEI LSKIYHIENE 601 IARIKKLIGE SGGSAGSGHH HHHH (SEQ ID NO: 25) La siguiente secuencia de ácido nucleico es secuencia codificadora optimizada para la secuencia polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 2 1 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG 1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT 1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC 1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACGGCAGCAG CGGCCGGATG 1741 AAGCAGATCG AGGACAAGAT CGAGGAAATC CTGAGCAAGA TCTACCACAT CGAGAACGAG 1801 ATCGCCCGGA TCAAGAAGCT GATCGGCGAA AGCGGCGGCT CTGCCGGAAG CGGCCACCAC 1861 CACCATCACC ACTGAAG (SEQ ID NO: 26) HIS 2 pre completo El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de RSV de longitud completa con el dominio de trimerización de GCN4 (subrayado) unido al C-términal del polipéptido F de RSV seguido por la marca de hexa-histidina . 1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN 121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV lEFQQKNNRL LEITREFSVN 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS 541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNGSSGSG RMKQIEDKIE EILSKIYHIE 601 NEIARIKKLI GESGGSAGSG HHHHHH (SEQ ID NO: 27) La siguiente secuencia de ácido nucleico es secuencia codificadora optimizada para la secuencia polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG 1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT 1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC 1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACGGCAGCAG CGGCAGCGGC 1741 CGGATGAAGC AGATCGAGGA CAAGATCGAG GAAATCCTGA GCAAGATCTA CCACATCGAG 1801 AACGAGATCG CCCGGATCAA GAAGCTGATC GGCGAAAGCG GCGGCTCTGC CGGAAGCGGC 1861 CACCACCACC ATCACCACTG AAG (SEQ ID NO: 28) HIS ecto El siguiente polipéptido incluye el ecto-dominio del polipéptido F de RSV seguido por la marca de hexa-histidina . 1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN 121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNSGG SAGSGHHHHH H (SEQ ID NO: 29) La siguiente secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificadora optimizada para la secuencia de polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 18.1 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 5 1 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 951 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 11 1 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TAGCGGCGGC 1561 AGCGCCGGCT CTGGCCACCA CCACCATCAC CACTGAAG (SEO. ID NO: 30) HIS pre ecto El siguiente polipéptido incluye el ecto-dominio del polipéptido F de RSV con el dominio de trimerización de GCN4 (subrayado) insertado en el polipéptido F de RSV en la dirección 5 ' donde el dominio TM la proteína de REV se ha seguido (empezando en a. a. 517) por una marca de hexa- histidina . 1 MELLIL A A ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNIKENKCN GTDA VKLI QELDKY NAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN 121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLK YID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSV 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNDKI EEILSKIYHI ENEIARIKKL 541 IGESGGSAGS GHHHHHH (SEQ ID NO: 31) La siguiente secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificadora optimizada para la secuencia de polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGACAAGATC 1561 GAGGAAATCC TGAGCAAGAT CTACCACATC GAGAACGAGA TCGCCCGGAT CAAGAAGCTG 1621 ATCGGCGAAA GCGGCGGCTC TGCCGGAAGC GGCCACCACC ACCATCACCA CTGAAG (SEQ ID NO: 32) HA HIS pre completo El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de RSV de longitud completa con el dominio de trimerización de post- fusión del polipéptido de hemaglutinina de influenza (subrayado) unido en el C-terminal del polipéptido F de RSV seguido por la marca de hexa-histidina . 1 MELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN 121 NAK TNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEV KIKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV lEFQQKNNRL LEITREFSVN 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS 541 LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGIN I AFSNGSSGNE KFHQIEKEFS EVEGRIQDLE 601 KSGGSAGSGH HHHHH (SEQ ID NO: 33) La siguiente secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificadora optimizada para la secuencia de polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG 1561 AGCACCACCA ATATCATGAT CACCACAATC ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT 1621 CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC 1681 AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC GCCTTCTCCA ACGGCAGCAG CGGCAATGAG 1741 AAGTTCCACC AGATCGAGAA AGAATTCAGC GAGGTGGAGG GCCGGATCCA GGACCTGGAA 1801 AAGAGCGGCG GCTCTGCCGG AAGCGGCCAC CACCACCATC ACCACTGAAG (SEQ ID NO: 34) HA HIS pre ecto El siguiente polipéptido incluye el ecto-dominio del polipéptido F de RSV con el dominio de trimerización de post- fusión del polipéptido de hemaglitinina de influenza (subrayado) insertado en el polipéptido F de RSV en la dirección 5' de donde el dominio TM de la proteína de RSV se habría seguido (empezando en a. a. 517) por la marca de hexa-histidina . 1 ELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNIKENKCN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN 121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV lEFQQKNNRL LEITREFSVN 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS I KEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNEKF HQIEKEFSEV EGRIQDLEKS 541 GGSAGSGHHH HHH (SEQ ID NO: 35) La siguiente secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificadora optimizada para la secuencia polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGAGAAGTTC 1561 CACCAGATCG AGAAAGAATT CAGCGAGGTG GAGGGCCGGA TCCAGGACCT GGAAAAGAGC 1621 GGCGGCTCTG CCGGAAGCGG CCACCACCAC CATCACCACT GAAG (SEQ ID NO : 36) completoAHRB HIS El siguiente polipéptido incluye el polipéptido F de RSV de longitud completa con el dominio HRB suprimido seguido por la marca de hexa-histidina . 1 MELLILKA A ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNI EN CN GTDAKVKLIK QELDKYKNAV TELQLL QST PATNNRARRE LPRFMNYTLN 121 NAKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVNKI SA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS KVLDLKNYID QLLPIVN Q SCSISNIETV IEFQQKNNRL LEITREFSVN 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG YCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPNIMITTI 481 IIVIIVILLS LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSNMGGSHH HHHH (SEQ ID NO: 37) La siguiente secuencia de ácido nucleico es la secuencia codificadora optimizada para la secuencia de polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG CAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 5 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 11 1 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 0 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA ATATCATGAT CACCACAATC 1441 ATCATCGTGA TCATTGTGAT CCTGCTGTCT CTGATTGCCG TGGGCCTGCT GCTGTACTGC 1501 AAGGCCCGCA GCACCCCTGT GACCCTGTCC AAGGACCAGC TGTCCGGCAT CAACAATATC 1561 GCCTTCTCCA ACATGGGGGG TTCTCATCAT CATCATCATC ATTGAAG (SEQ ID NO : 38) 5 ecto El siguiente polipéptido incluye el ecto-dominio del polipéptido F de RSV. 1 ELLILKANA ITTILTAVTF CFASGQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE 61 LSNI ENKCN GTDAKVKLIK QELD YKNAV TELQLLMQST PATNNRARRE LPRFMNYTLN Q 121 NAKKTNVTLS K RKRRFLGF LLGVGSAIAS GVAVSKVLHL EGEVN IKSA LLSTNKAWS 181 LSNGVSVLTS VLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCSISNIETV lEFQQKNNRL LEITREFSVN 241 AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV 301 VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG WYCDNAGSVS FFPQAETCKV 361 QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT 421 KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP c. 481 LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHNVNAGK STTN (SEQ ID NO: 39) La siguiente secuencia de ácido nucleico es secuencia codificadora optimizada para la secuencia polipéptido extraña. 1 ATGGAACTGC TGATCCTGAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGACCGC CGTGACCTTC 61 TGCTTCGCCA GCGGCCAGAA CATCACCGAG GAATTCTACC AGAGCACCTG GAGCGCCGTG 121 AGCAAGGGCT ACCTGAGCGC CCTGCGGACC GGCTGGTACA CCAGCGTGAT CACCATCGAG 181 CTGTCCAACA TCAAAGAAAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CCAAGGTGAA ACTGATCAAG 241 CAGGAACTGG ACAAGTACAA GAACGCCGTG ACCGAGCTGC AGCTGCTGAT GCAGAGCACC 301 CCCGCCACCA ACAACCGGGC CAGAAGAGAG CTGCCCCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC 361 AACGCCAAGA AAACCAACGT GACCCTGAGC AAGAAGCGGA AGCGGCGGTT CCTGGGCTTC 421 CTGCTGGGCG TGGGCAGCGC CATCGCCAGC GGGGTGGCCG TGTCCAAGGT GCTGCACCTG 481 GAAGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTGCTGTCCA CCAACAAGGC CGTGGTGTCC 541 CTGAGCAACG GCGTGAGCGT GCTGACCAGC AAGGTGCTGG ATCTGAAGAA CTACATCGAC 601 AAGCAGCTGC TGCCCATCGT GAACAAGCAG AGCTGCAGCA TCAGCAACAT CGAGACCGTG 661 ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGGCTG CTGGAAATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC 721 GCCGGCGTGA CCACCCCCGT GAGCACCTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTGTCCCTG 781 ATCAATGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAAAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC 841 GTGCGGCAGC AGAGCTACTC CATCATGAGC ATCATCAAAG AAGAGGTGCT GGCCTACGTG 901 GTGCAGCTGC CCCTGTACGG CGTGATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTGCA CACCAGCCCC 961 CTGTGCACCA CCAACACCAA AGAGGGCAGC AACATCTGCC TGACCCGGAC CGACCGGGGC 1021 TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGAGC TTCTTCCCCC AAGCCGAGAC CTGCAAGGTG 1081 CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACAGCCTGA CCCTGCCCTC CGAGGTGAAC 1141 CTGTGCAACG TGGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC 1201 GACGTGAGCA GCTCCGTGAT CACCTCCCTG GGCGCCATCG TGAGCTGCTA CGGCAAGACC 1261 AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGGGGC ATCATCAAGA CCTTCAGCAA CGGCTGCGAC 1321 TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTG AGCGTGGGCA ACACACTGTA CTACGTGAAT 1381 AAGCAGGAAG GCAAGAGCCT GTACGTGAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC 1441 CTGGTGTTCC CCAGCGACGA GTTCGACGCC AGCATCAGCC AGGTCAACGA GAAGATCAAC 1501 CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGAGCGAC GAGCTGCTGC ACAATGTGAA TGCCGGCAAG 1561 AGCACCACCA ATTGAAG (SEQ ID NO: 40) RSV F Longitud completa MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATN RARRELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLK YIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSV AGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEV LCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLY CKARSTPVTLSKDQLSGI NIAFSN (SEQ ID NO:41) Enterocinasa de escisión de RSV-F idealizada MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPAT NRARRELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEV KIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLK YIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQ NRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSN VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEV LCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYG TKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQINEKINQILAFIRKIDELLHNINAGKSTTNGSGSGDDDDDKGSGSGIMITTIIIV IIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO:42) Trombina de escisión de RSV-F idealizada MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATN RARRELPRFMNYTL NA KKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEV KIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLK YIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQK NRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNT EGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVWKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQINEKINQILAFIRKIDELLHNINAGKSTTNGSGSGLVPRGSGSGIMITTIIIVII VILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGIN IAFSN (SEQ ID NO:43) Factor Xa de escisión de RSV-F idealizado MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLN A KKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLK YIDKQLLPIWKQSCSISNIETVIEFQQK RLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS NVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEV LC VDIFNPKYDCKI TSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQINEKINQILAFIRKIDELLHNINAGKSTTNGSGSGIEGRGSGSGIMITTIIIVII VILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGIN IAFSN (SEQ ID NO: 44) HIS Truncado de RSV F furx MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLIND PITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV EKINQSLAFIRKSDELLHNV AGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:45) HIS Truncado de RSV F furx R113Q, K123N, K124N MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPATN QAQNELPQFM YTL NA NNT VTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEV KIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLK YIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQK RLLEITREFSV AGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS NVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEV LC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN QEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV E INQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:46) HIS Truncado de RSV F furx R113Q, K123Q, K124Q MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTG YTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQF YTLNNA QQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLK YIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQK RLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYY KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV EKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 93) HIS Truncado de RSV F delP21 furx MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKV LIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPATNNQAQN QNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSK VLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPIT DQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPC WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLT LPSEVNLC VDIFNP YDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTF SNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQV EKINQSLAFIRKSDELLH VNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:47) (El símbolo "-" indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) HIS Truncado de RSV F delP23 furx MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTG YTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPATN QAQN QNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEV KI SALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVL DLKNYIDKQLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSV AGVTTPVSTYMLTN SELLSLINDMPITNDQ LMS NVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLP SEV LCNVDIFNPKYDC IMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSN GCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEK INQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 48) (El símbolo "-" indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) HIS TRUNCADO HIS Truncado de RSV F delP23 furdel MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLL QSTPATN RARQ QQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVL DLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTN SELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDT NSLTLP SEVNLCNVDIFNPKYDC IMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSN GCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQV EK INQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 49) (El símbolo "-" indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) HIS Truncado de RSV F furmt MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTG YTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARKELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSKKRKKKFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYG TKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:50) HIS Truncado de RSV F furdel MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPATNNRARQELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSKK RFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEV KIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLK NYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQK NRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSEL LSLINDMPITNDQKKLMS NVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHT SPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCD YVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEG SLYV GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQ SLAFIRKSDELLHNV AGKS TNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 51) (El símbolo "-" indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) HIS Truncado de Factor Xa de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAT NIEGRELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSKKIEGRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIR SDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 52) HIS de Foldon de ligador corto de RSV-F MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKEN'KCNGTDAKVKLIKQELDKY NAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTL NA KKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYID QLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEV LC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV EKINQSLAFIRKSDELLH VNAGKSTTNGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLL STFLGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 53) HIS de Foldon de ligador Largo de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTG YTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNNKNDDKGSGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 54) RSV F ecto pre his MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLK YIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQ NNRLLEITREFSV AGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEGKSLYV GEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH V DKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAG SGHHHHHH (SEQ ID NO:55) ECTO PRE HA HIS MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNA KKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIWKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSN VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVN QEG SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV EKINQSLAFIRKSDELLHNV EKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKSGGSAGSGHH HHHH (SEQ ID NO:56) RSV F ECTO Furx GCN HIS MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKEN CNGTDAKVKLIKQELDKY NAVTELQLLMQSTPAT NQAQNELPQFMNYTL A NTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDL NYIDKQLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPIT DQKKLMS NVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPC KLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV EKINQSLAFIRKSDELLH V DKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:57) RSV F ECTO delp21 GCN HIS MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTG YTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATN QAQN QNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSK VLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSV AGVTTPVSTY L TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPC WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTM SLT LPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK RGIIKTF SNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQV EKINQSLAFIRKSDELLH V DKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:58) (El símbolo "-" indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) RSV F ECTO delp23 Furx GCN HIS MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTG YTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPAT NQAQN QNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVL DLKNYIDKQLLPI KQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTN SELLSLINDMPITNDQKKLMSN1 QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLP SEVNLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK RGIIKTFSN GCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQV EK INQSLAFIRKSDELLH VN DKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:59) (El símbolo indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) RSV F ECTO delp23 Furdel GCN HIS MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAT RARQ QQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVN IKSALLSTN AWSLSNGVSVLTSKVL DLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSV AGVTTPVSTYMLTN SELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLP SEV LCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSN GCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV QEGKSLYV GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEK INQSLAFIRKSDELLHNVN DKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGESGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 60) (El símbolo indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) Furx de Longitud Completa de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNA NNTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGE KIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTY LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPC KLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF-DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV AGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NIAFSN (SEQ ID NO: 61) delp21 de Longitud Completa de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQN QNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSK VLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSV AGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMS NVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPC W LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLT LPSEV LCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTF SNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVN EKINQSLAFIRKSDELLH V AGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NIAFSN (SEQ ID NO:62) (El símbolo "-" indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) p23 Furx GCN HIS de Longitud completa de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATN QAQN QNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEV KIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVL DLK YIDKQLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSV AGVTTPVSTYMLTN SELLSLINDMPITNDQKKLMSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTM SLTLP SEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK RGIIKTFSN GCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEK INQSLAFIRKSDELLHNVN AGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO:63) (El símbolo indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) p23 Furdel GCN HIS de Longitud Completa de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPATNNRARQ QQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVL DLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQK NRLLEITREFSV AGVTTPVSTYMLTN SELLSLINDMPITNDQKKLMS NVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLP SEVNLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSN GCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEK INQSLAFIRKSDELLHNVN AGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO: 64) (El símbolo indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) HIS Truncado de Furx de Furina N-terminal de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNA QQTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV EKINQSLAFIRKSDELLH VNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 65) HIS Truncado de Furx de Furina N-terminal de RSV-F ELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVS GYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLI QELDKYK AVTELQLLMQSTPATNNRARRELPQFMNYTLN A QQT VTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYID QLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSV AGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH VNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:66) HIS Truncado de Supresión 1 de Fusión de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKY NAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFM YTLNNA KKTNVTLSKKRKRRSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQK NRLLEITREFS AGVTTPVSTYMLT NSELLSLINDMPITNDQKKLMS VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPC KLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTL PSE LCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASN RGIIKTFS NGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQV E KINQSLAFIRKSDELLH VNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 67) HIS Truncado de Supresión 2 de Fusión de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKY NAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNA K T VTLSKKRKRRGVGSAIASGVAVS VLHLEGEV KIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIWKQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSV AGVTTPVSTY MLTNSELLSLI DMPITNDQKKLMS VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDT PCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNS LTLPSEVNLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK RGIIK TFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQ VNEKINQSLAFIRKSDELLH V AGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 68) HIS Truncado de Furx de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNA QQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 69) Furx Truncado de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNA QQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQK RLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL SNWQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYV KQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH VNAGKSTTN (SEQ ID NO:70) No HIS Truncado de delP23 furdel de RSV-F (para células CHO) MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL S IKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPAT NRARQ QQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEWKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVL DLKNYIDKQLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTN SELLSLINDMPITNDQKKLMSNIVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLP SEVNLC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSN GCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEK INQSLAFIRKSDELLH VNAGKSTTN (SEQ ID NO:71) (El símbolo "-" indica que el aminoácido en esta posición está suprimido) HIS Truncado de RSV F (Wt) MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATN RARRELPRFMNYTLNNA KKT VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVS VLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSN VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 84) HIS Truncado de RSV F old furx MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATN QAQNELQRFMNYTL A N TNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEV KIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLK YIDKQLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQKN RLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEV LCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV AGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO : 88 ) HIS Truncado de Furx R113Q K123N K124N de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPATN QAQNELPQFMNYTL NA QQT VTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIV KQSCSISNIETVIEFQQK NRLLEITREFSVNAGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTM SLTLPSEV LCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV EKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO:89) HIS Truncado de Furina N-terminal de RSV-F MELLILKA AITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTG YTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK AVTELQLLMQSTPAT NRARRELPQFMNYTL NA QQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEV KI SALLSTNKAWSLSN GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSV AGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMS VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEV LC VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQV EKINQSLAFIRKSDELLH VNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 85) HIS Truncado de delP21 furdel de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARQ QNQQQRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSK VLDLK YIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPC WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLT LPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYG TKCTASNKNRGIIKTF SNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVN EKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 86) HIS Truncado de Furina C- terminal de RSV-F MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIEL SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQAQNELPQFMNYTLNNA QQTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSN GVSVLTS VLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSV AGVT TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSN VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPL YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG YCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVF CDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNK NRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEF DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHHH (SEQ ID NO: 87) Ejemplo 2.- Expresión y Purificación de Construcciones de F de RSV Las contracciones truncadas y de ectodominio de F de RSV, que carecen del dominio transmembrana y la región de extremo citoplásmico con ya sea sitios de escisión de furina tipo silvestre o que tienen mutaciones de supresión a los sitios de escisión de furina y con o sin mutaciones de estabilización de pre-fusión, se clonaron en un vector de expresión de baculovirus pFastBac (Invitrogen) . Varias de estas construcciones contienen un ligador flexible C-terminal seguido por una secuencia de marca His usada para purificación por quelación. La producción de soluciones concentradas de baculovirus de alto título se pasaron en células insectiles Sf9. Las proteínas se expresaron al infectar ya sea células insectiles Sf9, Tn5 o High Five con el baculovirus requerido y recolectando el sobrenadante del medio dos o tres días después de la infección, monitorizado por transferencia western usando anticuerpo anti-RSV-F o anti-6HIS.

El medio de expresión a grande escala se concentró/purificó por una de dos estrategias generales para eliminar el efecto perjudicial de la ferritina presente en medio de células insectiles de la corrupción de resina quelante. El primer planteamiento fue concentrar los aproximadamente 10-20 litros de medio de expresión insectil a aproximadamente 300 mi usando una columna de concentración de fibra GE Healthcare Hollotube. Se adicionó sulfato de cobre a esta mezcla concentrada a una concentración final de 500 µ? y la solución resultante se cargó en columnas quelantes HiTrap de 5 mi. La proteína marcada con HIS unida, entonces se eluyó de la columna con Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM y un gradiente de imidazol .

En la segunda estrategia de purificación, se adicionó CuCl2 al sobrenadante del medio una concentración final de 500 µ?. A cada litro de medio, se adicionaron cuatro mililitros de resina de quelación (Chelating Resin, BioRad) y la suspensión espesa se meció durante al menos treinta minutos a 4 grados centígrados y la resina y el medio se separaron por una columna de gravedad. La resina se lavó con diez veces el volumen de la columna de amortiguador de equilibrio (Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM) y la proteína F se eluyó con diez veces el volumen de la columna de amortiguador de elución (amortiguador de equilibrio con imidazol 250 mM) . La elución se analizó contra amortiguador Tris 25 mM, pH 7.5, y la solución resultante se cargó en una columna de quelación Hitrap de 5 mi con NiS04 y se eluyó con Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM y un gradiente de imidazol.

Se evaluaron las eluciones del gradiente de imidación en cualquier caso usando geles de coomassie y western anti-6HIS. Se recolectaron las fracciones que contienen construcciones pura, se dializaron contra diferentes soluciones de amortiguador/soluciones salinas y se concentraron para análisis subsiguiente usando concentradores Millipore Centriprep y/o unidades de concentración Vivaspin. También se desarrolló un protocolo de purificación por exclusión de tamaño capaz de purificar adicionalmente trímeros monodispersados de RSV de los rosetones (ver más adelante) .

Análisis por SEC de Proteínas F de RSV: Una característica documentada de otras proteínas de fusión de paramixovirus estabilizadas en su conformación de pre-fusión es que, aún cuando se escinden de modo que se expone el péptido de fusión, no forman rosetones como se observa para la conformación de post-fusión. Un análisis simple por cromatografía de inclusión de tamaño permite la identificación de una proteína en la determinación de sí una proteína está formando rosetones. Se desarrollaron dos métodos, HPLC-SEC y FPLC-SEC, que también sirve como un paso eficiente de purificación.

Se realizó HPLC-SEC usando una columna Biorad SEC (18 mm) con Tris 25 mM, pH 7.5, fase móvil de NaCl 300 mM. Usando normas Biorad HPLC-SEC para calibrar el sistema, se encontró que los rosetones de RSV (que representan las conformaciones de post-fusión, escindidas) se eluyen en el volumen hueco de la columna del análisis, en tanto que los trímeros monodisperdados de RSV (trímeros presumidos de análisis de EM subsiguiente) eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 100 kDa.

Se realizó FPLC-SEC en una FPLC GE Healtcare usando una columna 16/60 Superdex 200 con Tris 25 mM, pH 7.5, fase móvil de NaCl 300 mM. Usando normas de peso molecular alto GE Healthcare para calibrar el sistema, se encontró que los rosetones de RSV eluyen en el volumen hueco de la columna del análisis, en tanto que los trímeros monodispersados de RSV con un peso molecular aparente de aproximadamente 100 kDa. Microscopía Electrónica (EM) de Proteínas F de RSV.

Soluciones de proteína de aproximadamente 50 microgramos por mi de construcciones de F de RSV se absorbieron en rejillas revestidas con carbono descargadas de brillo y se tiñeron negativamente con fosfotungstato de sodio al 2 % (pH 7.0) o Urynal-formiato al 0.75 % (pH bajo no cuantificado) . Las rejillas se observaron en un microscopio electrónico de transmisión Technai Spirit o JOEL 1230 que opera entre 80-120 kV con un aumento entre 20,000 a 150,000 dependiendo de la resolución requerida.

Tabla 2 Ejemplo 3.- Detección de RSV-F de Pre-Fusión y Post-Fusión Están disponibles varios métodos para determinar la conformación de la proteína F de RSV para valorar si una modificación al polipéptido F de RSV o molécula adicionada desfavorece la conformación de post-fusión. Los ejemplos incluyen asociación de liposoma, anticuerpos monoclonales específicos de la conformación (incluyendo como se usa en FACS, ELISA, etc.), microscopía electrónica, sensibilidad de proteasa diferencial entre las conformaciones, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración analítica, dispersión de luz dinámica, experimentos de RMN de intercambio de deuterio, espectroscopia de masa, espectroscopia de dicroismo circular, calorimetría de titulación isotérmica, espectroscopia con triptófano y cristalografía de rayos X. Asociación de Liposoma Se puede usar asociación de liposoma para valorar la conformación de la proteína F de RSV. Las formas solubles de la proteína F de RSV en la conformación de pre-fusión no se asociarán con liposomas en tanto que la conformación de post- fusión se asociará con liposomas.

Se pueden preparar liposomas como sigue: se mezclan l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, y colesterol en cloroformo (disponibles de Avanti Polar Lipids) a una relación molar de 8:2:5. El cloroformo se evapora bajo argón. Una película de lípido se formará que se seca bajo vacío durante la noche y se re-suspende en PBS a lípidos totales de 40 mM . Después de cinco ciclos de congelación-descongelación, los lípidos se someten a vórtice y se extruyen 21 veces a través de dos filtros de 100-µt? al usar un miniestrusor (disponible de Avanti Polar Lipids) .

Una vez que se han preparado los liposomas, el ensayo de asociación de liposoma se puede realizar. Para cada muestra que se va a probar, se escinden 2 pg del polipéptido F de RSV a probar con 25 miliunidades de tripsina (disponible de Worthington Biochemical) en amortiguador de fosfato 100 mM (pH 7.1) durante 30 minutos a 25°C. Después de la escisión, se adicionan 40 pg de inhibidor de tripsina de soya (disponible de Worthington Biochemical) a cada muestra para terminar la reacción. Las muestras se pre-tratan a 60 °C durante 30 minutos con lo que se inducirá un cambio conformacional de las formas de pre-fusión a la de postfusión en la proteína F de RSV, aislada, nativa. Se adicionan liposomas (40 µ? por muestra) y PBS (80 µ? de volumen final) , y las muestras se incuban a 60°C durante 30 minutos. Se adiciona sacarosa a una concentración final de 50 % (volumen final de 500 µ?) . Las muestras se revisten con 500 µ? de cada uno de sacarosa al 40 %, sacarosa al 25 %, y PBS y se centrifugan en un rotor TLS55 a 49,000 rpm durante 3 horas a 25°C. Se recolectan fracciones (500 µ?) de la parte superior de los gradientes. Las proteínas se solubilizan en Tritón X-100 al 0.5 % y se precipitan al usar ácido tricloroacético al 12.5 % vol/vol. Los polipéptidos se separan por SDS/PAGE y se transfieren a membranas de PVDF. Las transferencias se sondean con anticuerpos monoclonales anti-RSV-F.

Microscopía Electrónica Se usó microscopía electrónica para valorar la distribución conformacional de polipéptidos F de RSV. Los polipéptidos F de RSV en la forma de pre-fusión tienen una forma de "bola y tallo" con una longitud de ~12nm. En contraste, los polipéptidos F de RSV en la forma de postfusión tienen una forma de "palo de golf" con una longitud de -16 nm. Además, los polipéptidos de fusión en el extremo estrecho del "palo de golf" se agregan para formar estructuras de rosetones. De esta manera, se puede usar microscopía electrónica para valorar la distribución de las conformaciones en una muestra de polipéptidos F de RSV debido a las formas fácilmente distinguibles.

Ejemplo 4.- Trímeros y Rosetones de Ectodominio F de RSV Las construcciones de ecto-dominio de proteína F de RSV, que codifican para polipéptidos que carecen del domino transmembrana y la región de extremidad citoplásmica con ya sea sitios de escisión de furina tipo silvestre o que tienen mutaciones de supresión a los sitios de escisión de furina y/o mutaciones de péptido de fusión, se clonaron en un vector de expresión de baculovirus pFastBac (Invitrogen) . Varias de estas construcciones contienen un ligador flexible C-terminal seguido por una secuencia de marca HIS6 usada para purificación por quelación. La producción de soluciones concentradas de baculovirus de alto título se obtuvo por el paso en células insectiles Sf9. Se expresaron proteínas al infectar ya sea células insectiles Sf9, Tn5 o High Five con el baculovirus requerido y recolectando el sobrenadante de medio acondicionado dos o tres días después de la infección.

Se monitorizó la producción de proteína por transferencia western usando un anticuerpo anti-RSV-F o anti-HIS6.

El medio de expresión a gran escala se concentró/purificó usando una de dos estrategias generales para eliminar el efecto perjudicial de la ferritina presente en medio de células insectiles, que puede corromper la resina quelante . El primer planteamiento fue concentrar los aproximadamente 10-20 litros de medio de expresión de insecto hasta aproximadamente 300 mi usando una columna de concentración de fibra GE Healthcare Hollotube. Se adicionó sulfato de cobre a esta mezcla concentrada a una concentración final de 500 µ?, y la solución resultante se cargó en columnas quelantes HiTrap de 5 mi. La proteína marcada con HIS, unida, entonces se eluyó de la columna con Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM y un gradiente de imidazol .

En la segunda estrategia de purificación, se adicionó CuCl2 al sobrenadante de medio a una concentración final de 500 µ?. A cada litro de medio, se adicionaron aproximadamente cuatro a diez mililitros de resina quelante (Chelating Resin, BioRad) , y la suspensión espesa se meció durante al menos treinta minutos a 4 grados centígrados, y la resina y el medio se separaron usando una columna de gravedad. La resina se lavó con aproximadamente diez veces el volumen de columna de amortiguador de equilibrio (Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM) , y el ecto-dominio de proteína F se eluyó con aproximadamente diez veces el volumen de columna de amortiguador de elución (amortiguador de equilibrio con imidazol 250 mM) . La elución se dializó contra amortiguador Tris 25 mM, pH 7.5, y la solución resultante se cargó en una columna de quelación Hitrap de 5 mi cargada con NiS0 . La proteína unida se eluyó con Tris 25 m, pH 7.5, NaCl 300 mM y un gradiente de imidazol .

Las eluciones del gradiente de imidazol en cualquier caso se eluyeron usando transferencias western anti-HIS6 y/o geles SDS-PAGE teñidos con coomassie. Se recolectaron las fracciones que contienen construcciones puras, se dializaron contra diferentes soluciones amortiguadoras/salinas y se concentraron para análisis subsiguiente usando concentradores Millipore Centriprep y/o unidades de concentración Vivaspin. En algunos casos, los monómeros, trímeros o rosetones se purificaron adicionalmente usando cromatografía de exclusión de tamaño. Análisis por SEC y Purificación de Ecto-dominios F de R5V Se usó cromatografía de exclusión de tamaño para purificar y analizar monómeros, trímeros y rosetones de ecto-dominio de proteína F de RSV. Este método también permitió que los ecto-dominio no escindidos de proteína F de RSV se purificaran de la célula hospedadora o de los contaminantes de lípido y lipoproteína derivados del medio. Se desarrollaron dos métodos, HPLC-SEC y FPLC-SEC, que también pueden servir como un paso eficiente de purificación.

Se realizó HPLC-SEC usando una columna Biorad SEC (18 mm) con Tris 25 mM, pH 7.5, fase móvil de NaCl 300 mM. Usando normas Biorad HPLC-SEC para calibrar el sistema, se encontró que los rosetones de RSV (que representan conformaciones de post- fusión, escindida) eluyen en el volumen hueco de la columna del análisis, en tanto que los monómeros de RSV-F eluyen con un peso molecular aparten de aproximadamente 75-85 kDa.

Se realizó FPLC-SEC en FPLC GE Healthcare usando una columna 16/60 Superdex 200 con Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM, como una fase móvil. Usando normas de alto peso molecular de GE Healthcare para calibrar el sistema, se encontró que los rosetones de RSV el eluyen en el volumen hueco de la columna del análisis, en tanto que los trímeros monodispersados de RSV eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 140-160 kDa y los monómeros de F de RSV eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 75-85 kDa.

Para la purificación se uso el método de FPLC-SEC y se recolectaron fracciones de de 1 mi.

Escisión con Tripsina de Construcciones Furdel o Delp23 Furdel Para Formar Rosetones de Post-Fusión En general, la digestión con tripsina de monómeros de Delp23 Furdel se hizo con tripsina: RDV-F 1:1000 en peso, o 10-15 unidades BAEE de tripsina por 1 mg de antígeno de RSV-F. En una reacción típica, se diluyo tripsina de plasma bovino (Sigma Aldrich, T8802: 10,000-15,000 unidades BAEE/mg de tripsina) a una concentración de 1 mg/ml en Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM. Una solución de 1 mg/ml de polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV (diluido en Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM) se trató con un microlitro de solución de tripsina (relación final en masa tripsina: RSV-F 0.001:1 o aproximadamente 10-15 unidades BAEE de tripsina a cada miligramo de RSV-F) durante 1 hora a 37°C. Típicamente, el progreso de la reacción de escisión se monitorizó por gel de SDS-PAGE. La reacción de escisión se detuvo usando un inhibidor de tripsina. La proteína F escindida de RSV se purificó adicionalmente por cromatografía de exclusión de tamaño.

En la ocasión, se adicionó un volumen 1:100 de inhibidor inmovilizado de tripsina (Sigma) o 1 microlitro de inhibidor de tripsina de soya 1 mM a la solución de escisión y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 15-30 minutos con balanceo suave para detener la reacción de tripsina. La resina de inhibidor se separó de la solución de proteína usando columna semi-centrífuga . La solución resultante se purificó por purificación de SEC.

Microscopía Electrónica (EM, por sus siglas en inglés) de Proteínas F de RSV.

Los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV (aproximadamente 50 microgramos por mi) , se absorbieron en rejillas revestidas con carbón descargadas de brillo y se tiñeron negativamente con fosfotungstato de sodio al 2 % (pH 7.0) o uranil-formiato al 0.75 % (pH bajo no cuantificado) . Las rejillas se observaron en un microscopio electrónico de transmisión Technai Spirit or JOEL 1230 que opera entre 80-120 kV con un aumento entre 20,000 a 150,000 dependiendo de la resolución requerida.

Ensayo de Fosfolipido Este ensayo se basa en el método de ensayo de fosfolípidos C-colina-oxidasa-DAOS de Wako Puré Chemical Industries, Ltd. (Cat. No 433-36201). El protocolo de ensayo se modifica sólo para reducir la cantidad de material usado en el ensayo, y para disminuir la dilución de muestra en la reacción con relación al protocolo general del vendedor. Para determinar el contenido de lxpido de la muestra de RSV-F, para generar el reactivo de color al disolver una botella de reactivo de color con una botella de amortiguador (reactivo de color es estable durante 1 semana a 4°C) . Se diluyen 300 mg/dL (3 mg/ml) de norma de fosfolipido a 1.5, 1.0, 0.75, 0.5 y 0.25 mg/ml con agua destilada. Para cada norma, una muestra en blanco de agua y la reacción de muestra, adicionar a un tubo de microcentrífuga 10 µ? de reactivo de color y 2 µ? de ya sea norma, agua destilada (0 mg/ml de norma) o muestra. Centrifugar las reacciones brevemente para asegurar el mezclado apropiado e incubar los tubos durante 15 minutos a 37°C. Registrar la absorbancia a 595 nm para cada punto de norma y generar una curva de norma. Registrar la absorbancia a 595 nm para cada muestra y calcular la concentración de fosfolípidos a partir de la curva de calibración preparada. Inmunogenicidad en Ratas de Algodón La inmunogenicidad de los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV en las formas de monómeros (no escindido delp21 furx) , rosetones de trímeros (escindido delp23 furdel) , y trímeros (supresión de péptido de fusión) se determinaron en ratas de algodón (Sigmodon hispidus) en dos estudios. En el estudio 1 (Figuras 8A y 8B) , se vacunaron 10 ratas de algodón por grupo de forma intramuscular con 10 g de monómeros o rosetones (cada uno adsorbido a hidróxido de aluminio) en los días 0 y 21. Se midieron los títulos en suero de anticuerpo neutralizantes de RSV e IgG anti-proteína F de RSV-F 2 semanas después de la primera vacunación (2wpl) y 2 semanas después de la segunda vacunación (2wp2) , o 3 semanas después de la primera vacunación (3 pl) y 2 semanas después de la segunda vacunación (2wp2) . Se determinó la IgG anti-proteína F de RSV (Figura 8A) por ELISA usando placas revestidas con proteína F de RSV y anticuerpo de detección de anti-IgG de rata de algodón, de pollo, conjugado con peroxidasa de rábano. Los datos se presentan como títulos medios geométricos logi0 (GMT, por sus siglas en inglés) + desviaciones estándar de ratas de algodón individuales . Se midieron títulos de neutralización de RSV (Figura 8B) por prueba de neutralización de reducción de placa (PRNT, por sus siglas en inglés) . En resumen, las diluciones de suero inactivado térmicamente se pre- incubaron con Long de RSV, y luego se inocularon en células HEp-2 en placas con 12 concavidades. Después de una infección de 2 horas, se removió el inoculo y las células se revistieron con agarosa. Las placas se enumeraron 5 días después por tinción de rojo neutral. El título de neutralización se define como lo recíproco de la dilución en suero que produce al menos una reducción de 60 % en el número de placas por concavidad, con relación a controles (sin suero) . Los datos se presentan como logio GMT + error estándar de 2 mezclas de 5 ratas de algodón por grupo.

En el estudio 2 (Figura 8C) , se inmunizaron 9 ratas de algodón por grupo intramuscularmente con las dosis indicadas de monómeros, trímeros o rosetones, (cada uno adsorbido a hidróxido de aluminio) . Se midieron los títulos en suero de IgG anti-proteína F de RSV 2wpl como antes.

Resultados El ecto-dominio F de RSV soluble (con sitios de escisión de furina no mutados) , se expresó, pero no se puede purificar de impurezas de lípidos y lipoproteínas derivadas de las células hospedadoras o medio de cultivo usando cromatografía de exclusión de tamaño. Estos polipéptidos de ecto-dominio F de RSV eluyen en el volumen hueco de la columna de SEC junto con los contaminantes de lípidos y lipoproteínas .

Se prepararon varias construcciones para producir polipéptidos de ecto-dominió F de RSV que contienen mutaciones a los sitios de escisión de furina, incluyendo las construcciones Furdel. Ver, Figura 1. Los polipéptidos producidos por la expresión de las construcciones Furdel se segregaron de las células como una especie no escindida de -65 kDa. La mutación Furdel también impide la exposición del péptido de fusión, que a su vez impide la formación de rosetones. Como resultado, Furdel de F de RSV soluble migró en el volumen incluido de una columna preparatoria Superdex 200, dando por resultado la separación de ambos desechos de lípidos,- que eluyó en el volumen hueco, e impureza de proteína insectil. Estos resultados muestran que los polipéptidos de ecto-dominio F de RSV en los cuales se han mutado los sitios de escisión de furina se producen como polipéptido no escindido que se puede purificar por SEC. Además, el análisis del tiempo de retención de RSV-F no escindido fue consistente con los polipéptidos que son monómeros en lugar de trímeros .

Si los polipéptidos de Furdel F de RSV fueron monómeros, trímeros o una mezcla de monómeros y trímeros se valoró usando adicionalmente ultracentrifugación analítica. Se realizaron estudios de ultracentrifugación analítica usando por rutina purificada del pico de monómero de la purificación por SEC. Los datos de velocidad de sedimentación de la RSV-F no escindida mostraron un patrón de pasos que sugieren dos especies en solución. El análisis del experimento de velocidad de sedimentación mostró que el ecto-dominio de RSV-F no escindido que tienen una alta población de monómero y una menor población de trímero aparente en la solución. Se recolectaron los datos de corrida de equilibrio y se realizaron intentos para ajustar los datos a ya sea un modelo ideal de monómero o un modelo de equilibrio de monómero- trímero . Sin embargo, son pobres los residuales de los ajustes, particularmente hacia el fondo de la celda donde es mayor la concentración de proteína. Estas observaciones sugirieron que los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio F de RSV son predominantemente un monómero con una población más pequeña que se auto-asocia (potencialmente como trímeros) o se agrega a mayores concentraciones.

Se llevó a cabo el análisis adicional de polipéptidos seleccionados de ecto-dominio de proteína F de RSV usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . Figuras 6A-6D. Los picos principales que contienen monómeros, trímeros, o rosetones de trímeros se indican por un asterisco en las Figuras 6A-6D, con el tiempo de retención de la columna Superdex P200 16/60 (GE Healthcare) se indica en mililitros. En una columna calibrada, los tiempos de retención aproximados de 47 mis, 65 mis y 77 mis corresponden al volumen hueco de columna, la retención de trímeros F y la retención de los monómeros, respectivamente. En la Figura 6A, la construcción Delp23 Furdel (Ap23 Furdel) no escindida se purificó del pico de monómero . Cuando el antígeno F de RSV, Delp23 Furdel no escindido se trató con tripsina, la proteína formó rosetones que migraron en SEC en el volumen hueco (Figura 6B) . Las especies de trímeros escindidos de la supresión de péptido de fusión de F de RSV se purificaron del pico de trímero en aproximadamente el tiempo de retención de 65 mis (Figura 6C) en tanto que la construcción Delp21 Furx no escindida (??21 Furx) se purificó del pico de monómero en aproximadamente 77 mis (Figura 6D) .

Varios polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV en la forma no escindida o después de la escisión con tripsina se valoraron por EM . Las construcciones Furdel y delp23 de RSV-F tienen residuos de arginina que permanecen en el sitio de escisión de furina . Estas argininas son susceptibles a escisión con tripsina. En la escisión, las especies F0 no escindidas se convirtieron a las especies Fi/F2, en las cuales se expone el péptido de fusión. El análisis por EM confirmó que después de la escisión con tripsina, los ecto - dominios no escindidos de RSV formaron rosetones de trímeros en virtud de sus péptidos de fusión, como se ha observado para proteínas de fusión relacionadas . Los resultados se presentan en la Tabla 3, y muestran que los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se pueden escindir para formar rosetones de trímeros. La construcción suprimida de péptido de fusión, que se escinde por furina, formó trímeros monodispersados . Ver también Figuras 7A-7D. De manera ventajosa, la producción de rosetones de trímeros de esta manera da por resultado rosetones de trímeros que están sustancialmente libres de desechos de lípidos y 1 ipoproteínas .

Los resultados de los estudios de inmunogenicidad mostraron que los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV en la forma de monómeros (delp21 furx no escindidos) , rosetones de trímeros (delp23 furdel escindido) , y trímeros (supresión de péptido de fusión) fueron inmunogénicos en ratas de algodón (Sigmodon hispidus) , e indujeron anticuerpos neutralizantes. Figuras 8A-8C.

Tabla 3 Construcción Conformación por E Ecto-dominio tipo silvestre de Rosetones de trímeros asociados con RSV-F (escindido en célula desechos de lípidos hospedadora durante expresión) Furdel escindible con tripsina Variable. Algunas preparaciones (pico de monómero purificado no muestran trímeros monodispersados; escindido) otras muestran poco material visible por EM de material negativamente teñido Furdel escindible con tripsina Rosetones de trímeros (pico de monómero purificado, escindible con tripsina después de purificación) delp23 furdel escindible con Variable. Algunas preparaciones tripsina (pico de monómero muestran trímeros monodispersados; purificado - no escindido) otras muestran poco material visible por EM de material negativamente teñido delp23 Furdel escindible con Rosetones de trímeros tripsina (pico de monómero purificado, escindible con tripsina después de purificación) Supresión de péptido de fusión Trímeros monodispersados escindida (pico de monómero purificado) Ejemplo 5 - Métodos para producir Antigenos de Sub-Unidad de RSV-F en Células Insectiles o . CHO Purificación de Antígeno de RSV-F de Células Insectiles: Las subunidades de ectodominio de RSV-F, que incluye las construcciones Delp21 Furx, Delp23 Furdel y de supresión de péptido de fusión, se expresaron en células insectiles HiFive (Invitrogen) usando el sistema de baculovirus pFAST Bac . La subunidad de RSV-F se purificó de expresiones a gran escala, 10-25 litros, mediante un método de quelación de dos pasos que redujo el efecto perjudicial del contaminante de ferritina presente en el medio de células insectiles, que puede corromper la resina quelante. Ase adicionó CuS04 al sobrenadante del medio a una concentración final de 500 µ?. Se adicionaron aproximadamente de diez a veinte mililitros de resina quelante (Chelating Resin, BioRad) a cada litro de medio, la suspensión espesa se meció durante al menos treinta minutos a 4°C, y la resina y el medio se separaron usando una columna de gravedad. Las resina se lavó con aproximadamente dos veces el volumen de resina de amortiguador de equilibrio (Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM) , y el ecto-dominio de proteína F se eluyó con aproximadamente dos veces el volumen de columna de amortiguador de elución (amortiguador de elución con imidazol 250 mM) . La elución se dializó con amortiguador Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM y la solución resultante se cargó en una columna de quelación Hitrap de 5 mi cargada con NiS04 (GE Healthcare) . Se eluyó la proteína unida con Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM y un gradiente de imidazol .

Las eluciones del gradiente de imidazol en ambos casos se eluyeron usando transferencias western anti-HIS6 y/o geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie. Las fracciones que contienen construcciones puras se recolectaron y concentraron a aproximadamente 1 mg/ml usando concentradores Millipore Centriprep y/o unidades de concentración Vivaspin para análisis/purificación subsiguiente por cromatografía en exclusión de tamaño.

Análisis por SEC y Purificación de Ectodominios de RSV-F Se usó cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) para purificar y analizar trímeros escindidos y monómeros no escindidos de ectodominio de proteína F de RSV. Este método también permitió que los ectodominios no escindidos de proteína F de RSV se purificaran de la célula hospedadora o de los contaminantes de lípidos y poliproteínas derivados del medio. En el caso en la generación de rosetones limpios, la construcción Delp23 Furdel no escindida se purificó inicialmente como un monómero y subsiguientemente en la proteasa se trató y re-purificó usando SEC para purificar los rosetones homogéneos (ver posteriormente) . Se desarrollaron dos métodos para el análisis de la oligomerización de RSV-F, HPLC-SEC y FPLC-SEC, que también puede servir como un paso eficiente de purificación.

Se realizó HPLC-SEC usando una columna Biorad SEC (18 mm) con fase móvil de Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM. Usando normas Biorad HPLC-SEC para calibrar el sistema, se encontró que los rosetones de RSV (que representan conformaciones de post- fusión, escindidas) eluyen en el volumen huevo de columna del análisis en tanto que los monómeros de RSV-F eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 75-85 kDa.

Se realizó FPLC-SEC en una FPLC GE Healthcare usando una columna 16/60 Superdex 200 con Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 300 mM como una fase móvil. Usando normas de alto peso molecular de GE Healthcare para calibrar el sistema, se encontró que los rosetones de RSV eluyen en el volumen hueco de la columna de análisis, en tanto que los trímeros monodispersados de RSV se eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 140-160 kDa y los monómeros de RSV F eluyen con un peso molecular aparente de aproximadamente 75-85 kDa. Para la purificación Delp21 Furx o Delp23 Furdel (monómeros) no escindidos de RSV o supresión de péptido de fusión (trímero), se cargó 0.5-2 mis de aproximadamente 1 mg/ml de material purificado por quelación sobre una columna Superdex P200 16/60 equilibrada con una velocidad de flujo entre 0.5-2 mls/min y se recolectaron las fracciones pertinentes.

Escisión con Tripsina de Construcciones Delp23 Furdel para Formar Rosetones de Post-Fusión La tripsina de plasma bovino (Sigma Aldrich, T8802: 10,000-15,000 unidades BAEE/mg de tripsina mg) se diluyó a una concentración 1 mg/ml en Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM. Una solución de 1 mg/ml polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV (diluido en Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 300 mM) se trató con un microlitro de solución de tripsina (relación de masa final tripsina: RSV-F 0.001:1 o aproximadamente 10-15 unidades BAEE de tripsina a cada miligramo de RSV-F) durante 1 hora a 37 °C. El progreso de la reacción de escisión se monitoreó por gel SDS-PAGE. La reacción de escisión se detuvo usando inhibidor de tripsina (Inhibidor de Tripsina de Soya Gibco usando una masa igual de inhibidor a tripsina) . Se encontró que se requiere un período de incubación entre el paso de escisión y la purificación subsiguiente de rosetones para permitir una mayor eficiencia de conversión de monómero a rosetón. Se dio un período de incubación de unas 6 horas a 37 °C para proporcionar mayor eficiencia de formación de rosetones. La proteína F de RSV escindida se purificó adicionalmente de especies monoméricas no convertidas, usando cromatografía de exclusión de tamaño (como se describe anteriormente) donde se puede recolectar rosetones homogéneos en las fracciones del volumen hueco de columna.

Purificación de Antígeno de RSV-F de Células CHO: Construcciones de supresión de péptido de fusión de RSV-F, que no contienen una marca HIS, se purificaron por purificación catiónica. El material de CHO que contiene antígeno de trímero de RSV-F expresado se concentró a aproximadamente un décimo del volumen original en un sistema de centrifugación de cartucho de fibra hueca de GE Healthcare (MWCO 10,000 kDa) . La solución concentrada entonces se intercambio con amortiguador cuatro veces con un volumen equivalente de acetato de sodio 25 mM, pH 6.0, NaCl 25 mM. La solución resultante, que contiene trímero de RSV-F concentrado en el amortiguador de acetato/solución salina, se cargó en una columna de GE Healthcare HiTrap CM pre-cargada que se ha puesto en equilibrio con amortiguador de acetato/solución salina. La proteína se eluyó de la columna usando un gradiente gradual de amortiguador de acetato 25 mM que contienen ya sea NaCl 25, 150, 250, 500 o 1000 mM (las fracciones de NaCl de 250 mM y 500 mM que contienen el volumen del material eluido) . Este material se puede purificar adicionalmente usando purificación por SEC similar al protocolo anterior.

Ejemplo 6 - Inmunogenicidad de Subunidades de RSV-F en Ratas de Algodón La inmunogenicidad y capacidad protectoras de las subunidades de trímero (RSV-F-fusión-péptido-supresión-trunc) y rosetón (RSV-F-delp23-furdel-trunc, escindido de RSV-F) , cada una formulada con alumbre o MF59, se evaluó en el modelo de rata de algodón. El antígeno usado para ELISA fue RSV-F-fusión-péptido-supresión-trunc (Tabla 4) . La neutralización fue contra RSV infeccioso, Cepa Long (Tabla 5) . Todas las combinaciones fueron inmunogénicas , produciendo respuesta de anticuerpos neutralizantes RSV-F e IgG específica de RSV-F de alto título que se reforzaron por una segunda vacunación, y dio protección de estimulo nasal con RSV.

Métodos Vacunación y Estímulo de Ratas de Algodón Se obtuvieron ratas de algodón hembras (Sigmodon hispidis) de Harían Laboratories . Los grupos de animales se inmunizaron de manera intramuscular (i.m. 100 µ?) con las vacunas indicadas en los días 0 y 21. Las muestras de suero se recolectaron 3 semanas después de la primera inmunización (3wpl) y 2 semanas después de la segunda inmunización (2wp2) . Los animales de control inmunizados o no vacunados se estimularon intranasalmente (i.n.) con lxlO5 ufp RSV Long 4 semanas después de la inmunización final. Se realizó la recolección de sangre y la estimulación con RSV bajo anestesia con isoflurano al 3 % usando un vaporizador de precisión .

ELISA Específico de RSV-F Se valoraron muestras individuales de suero para la presencia de IgG específicas de RSV-F por ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) . Las placas de ELISA (MaxiSorp de 96 concavidades, Nunc) , se revistieron durante la noche a 4°C con 1 µg/ml de RSV-F purificada (fusión-péptido-supresión-trunc) en PBS. Después del lavado (PBS con Tween-20 al 0.1 %) , las placas se bloquearon con amortiguador de bloqueo Superblock en PBS (Thermo Scientific) durante al menos 1.5 horas a 37 °C. Las placas entonces se lavaron, las diluciones en serie del suero en diluyente de ensayo (PBS con 0.1 % de Tween-20 y 5 % de suero de cabra) de ratas de algodón experimentales o de control se adicionaron, y las placas se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Después del lavado, las placas se incubaron con IgG anti-rata de algodón, de pollo, conjugada con peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) (Immunology Consultants Laboratory, Inc, diluida 1:5000 en diluyente de ensayo) durante 1 hora a 37 °C. Finalmente, las placas se lavaron y se adicionó a cada concavidad 100 µ? de solución de sustrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc) . Las reacciones se detuvieron por la adición de 100 µ? de H3PO4 1M, y se leyó la absorbancia a 450 nm usando un lector de placa. Para cada muestra de suero, se generó una gráfica de densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) versus logaritmo de la dilución en suero reciproca por regresión no lineal (GraphPad Prism) . Los títulos se definieron como la dilución en suero recíproca a un OD de aproximadamente 0.5 (normalizado a una norma, sueros mezclados de ratas algodón infectadas con RSV con un título definido de 1:2500, que se incluyó en cada placa) .

Ensayo de Microneutralización Se probaron muestras de suero para la presencia de anticuerpos neutralizantes por ensayo de microneutralización. Se adicionaron diluciones en serie de dos veces de suero inactivado térmicamente (HI, por sus siglas en inglés), (en PBS con suero bovino fetal -HI al 5 % (FBS, por sus siglas en inglés) ) a un volumen igual de RSV, cepa Long previamente titulado para dar aproximadamente 115 PFU/25 µ? . Se incubaron mezclas de suero/virus durante 2 horas a 37 °C y C02 al 5 %, para permitir que se presente la neutralización del virus, y luego se inocularon 25 µ? de esta mezcla (que contiene aproximadamente 115 PFU) en concavidades duplicadas de células HEp-2 en placas de 96 concavidades. Después de 2 horas a 37° y C02 al 5 %, las células se revistieron con 0.75 % de metil-celulosa/EMEM 5 % HI-FBS y se incubaron durante 42 horas. El número de partículas infecciosas de virus se determinó por detección de la formación de sincitios por inmunotinción seguido por conteo automatizado. El título de neutralización se define como lo recíproco de la dilución de suero que produce al menos una reducción de 60 % en el número sincitios por concavidad, con relación a controles (sin suero) .

Carga Viral La carga viral en el pulmón se determinó por ensayo de placa. Específicamente, se recolectaron los pulmones cinco días después de la infección con VRS y se colocó un lóbulo derecho en medio Eagle modificado de Dulbecco 2.5 mi (DMEM, Invitrogen) con sacarosa al 25 % y se interrumpió con un homogeneizador de tejido. Los sobrenadantes libres de células de estas muestras se almacenaron a -80°C. Para valorar las infecciones de virus, las diluciones de homogenado pulmonar clarificado (en PBS con 5 % de HI-FBS) se inocularon en monocapas confluentes de células HEp-2 en un volumen de 200 µ?/concavidad de una placa de 12 concavidades . Después de 2 horas con balance suave periódico (37 °C, C02 al 5 %) , se removió el inoculo y las células se revistieron con 1.5 mi de agarosa SeaPlaque al 1.25 % (Lonza) en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, Lonza) complementado con 5 % HI-FBS, glutamina y antibióticos. Después de 3-4 días de incubación, nuevamente las células se revistieron con 1 mi de agarosa al 1.25 % en EMEM (Sigma) que contiene 0.1 % de rojo neutral (Sigma) . Las placas se contaron un día después con la ayuda de una caja de luz.

Un método alternativo para determinar la carga viral es PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) . La carga viral se puede determinar por qRT-PCR usando cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen de RSV-F como se describe (I. Borg et al, Eur Respir J 2003; 21:944-51) con algunas modificaciones. Brevemente, se aisla el ARN de 140 µ? de homogenado pulmonar clarificado, o de un número conocido de unidades formadoras de placa (PFU, por sus siglas en inglés) de RSV (determinado por ensayo de placa, y diluido en homogenado pulmonar de animales no infectados) , usando el equipo RNeasy (Qiagen) con un volumen final de elución de 100 µ? de H20. La síntesis de ADNc y la PCR se realizan en un tubo individual usando el equipo de RT-PCR cuantitativa de un paso SuperScript III Platinum (Invitrogen) con 5 L de ARN eluido, 10 µ? de cada cebador, y 50 µ? de la sonda (cebadores y sondas de Integrated DNA Technologies) . Cebador directo: TTGGATCTGCAATCGCCA (SEQ ID NO: 72). Cebador inverso: CTTTTGATCTTGTTCACTTCTCCTTCT (SEQ ID NO: 73). Sonda: 5'-carboxifluoresceína (FAM) -TGGCACTGCTGTATCTAAGGTCCTGCACT-tetrametilcarboxirodamina (TAMRA) -3' (SEQ ID NO: 74) . Se realiza la amplificación y detección con ABI Prism 7900HT o 7500 (Applied Biosystems) . Un valor de ciclo de umbral (Ct) se define para cada muestra como el número de ciclo en el cual la señal de fluorescencia llega a ser primero detectable por arriba de un umbral establecido. Entonces se determinan los equivalentes de PFU para cada muestra en base a una curva normal de Ct versus el logaritmo el número de copias definido de ARN viral.

Resultados La rata de algodón como un modelo se ha usado extensivamente en el estudio de inmunidad y patogénesis de RSV debido a mucha similitudes entre la enfermedad inducida por RSV por ratas de algodón y humanos. Dos paralelos importantes son la eficiencia de los anticuerpos neutralizantes, y la histopatología pulmonar mejorada asociada con vacunación de RSV inactivado con formalina. Las ratas de algodón también son más susceptibles a infección de RSV que otros animales pequeños tal como ratones .

Para evaluar la inmunogenicidad de presentes vacunas de subunidades de RSV-F, se vacunaron grupos de ratas de algodón hembras intramuscularmente con varias dosis de trímeros (RSV-F-fusión-péptido-supresión-trunc) o rosetones (VSR-F-delp23-furdel-trunc, escindido) , cada uno formulado con ya sea alumbre o MF59. En todos los casos, una inmunización individual fue suficiente para inducir anticuerpos neutralizantes como específicos de F en el suero cuando se midió tres semanas después de la primera vacunación (3wpl) . A todas las ratas de algodón se les da una inmunización de refuerzo homologa tres semanas después de la primera, y esto dio por resultado un incremento significativo en el anticuerpo neutralizante IgG específica de F cuando se miden dos semanas después (2wp2) . En general, la inmunogenicidad de los rosetones fue igual a o mayor que aquella de los trímeros, la formulación de MF59 mejoró los títulos más que la formulación de alumbre, y las mayores dosis de proteína produjeron mayores títulos, aunque hubo algunas excepciones.

Para determinar la capacidad protectora de las vacunas de subunidades, todas las ratas de algodón se infectaron cuatro semanas después de la segunda vacunación con RSV por ruta nasal y la carga viral en el pulmón se midió cinco días después por ensayo de placa. En todos los casos, la vacunación de subunidades confirió protección de la estimulación, puesto que las cargas virales pulmonares en las ratas de algodón vacunadas fueron mayores que tres órdenes de magnitud menor que los animales no inmunizados, pero estimulados de control.

Tabla 4: Títulos en suero de IgG específicas de F Título en suero de IgG específico de F alumbre MF59 Suero Dosis de trímero rosetón trímero rosetón recolectado proteína (pg> 3wpl 10 20276 36841 10251 22415 1 18341 20802 3712 28610 0.1 2698 6896 1065 8293 2wp2 10 103670 97174 130016 156144 1 142331 102405 177441 299501 0.1 11581 34354 50238 111099 atítulo medio geométrico para ratas de algodón individuales (7-8 por grupo) inmunógeno de trímero fue RSV-F-fusión-péptido-supresión-trunc inmunógeno de rosetón fue RSV-F-delp23-furdel-trun, escindido. Tabla 4A: Título viral pulmonar 5 días después de estimulación con RSV vacunación Dosis de proteína título" ( g) viral Ninguno - 822760 trímero/alumbre 10 546 1 636 0.1 903 rosetón/alumbre 10 305 1 341 0.1 548 trímero/MF59 10 360 1 301 0.1 456 rosetón/ F59 10 244 1 257 0.1 716 Estimulación intranasal con 1x10s unidades formadoras de placas (pfu) de RSV Long bpfu/gramo de pulmón 5 días después de estimulación Títulos medios geométricos de 7-8 ratas de algodón individuales/grupo .

Si un animal individual tiene un título de <203 (límite de detección) se asignó un título de 100 Tabla 5: Título en suero de neutralización de RSV Título1a en suero de neutralización de RSV alumbre MF59 Suero Dosis de trímero rosetón trímero rosetón recolectado proteína ( g) 3wpl 10 628 1050 578 229 1 208 633 165 205 0.1 57 200 .51 65 2wp2 10 3669 4015 3983 3436 1 3369 2844 5728 3940 0.1 744 1902 2414 2093 atítulos de neutralización de reducción de sincitios de 60 % título media geométrica para dos mezclas de 3-4 de ratas de algodón por grupo Ejemplo 7 - Vacuna de ARN de RSV Síntesis de AR El ADN de plásmido que codifica para replicón de alfavirus (Figura 4, SEQ ID NO: 77) sirvió como una platilla para la síntesis de ARN in vitro. Para estos experimentos la glicoproteína de fusión de superficie de longitud completa de RSV (RSV-F) se usó (Figura 4) . En la distribución de los replicones a células eucarióticas , el ARN de hebra positiva se tradujo para producir cuatro proteínas no estructurales, que conjuntamente replicaron el ARN genómico y transcribieron abundantes ARNm subgenómico's que codifican para el producto génico heterólogo. Debido a la carencia de expresión de las proteínas estructurales de alfavirus, los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor de bacteriófago (T7 o SP6) en la dirección 5' del ADNc del alfavirus facilita la síntesis del ARN de replicón in v tro y la ribozima de virus delta de hepatitis (HDV) inmediatamente la dirección 3' de la poli (A) -extremidad genera el 3' -extremo correcto a través de su actividad de auto-escisión .

Después de la linealización del ADN de plásmido en la dirección 3' de la ribozima de HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, se sintetizaron transcriptos de corrida in vitro usando ARN-polimerasa dependiente de ADN derivado de bacteriófago T7 o SP6. Se realizaron transcripciones durante 2 horas a 37°C en presencia de 7.5 mM (T7 ARN-polimerasa) o 5 mM (SP6 RNA-polimerasa) de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion, Austin, TX) . Después de la transcripción, el ADN de plantilla se digirió con TURBO DNasa (Ambion, Austin, TX) . El ARN de replicón se precipitó con LiCl y reconstituyó en agua libre de nucleasa. El ARN sin rematar se remató de forma post-trascripcional la Enzima de Remate de Vaccinia (VCE) , usando el Sistema de Remate ScriptCap M7G (Epicentre Biotechnologies , Madison, I) como se resume en el manual de usuario. El ARN remotado de forma post-transcripcional A se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. La concentración de las muestras de ARN se determinó al medir la densidad óptica a 260 nra. La integridad de los transcritos in vi tro se confirmó por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante .

Formulación de RV01(01) de nanoparticulas de lípidos (Liposomas ) Se sintetizó 1, 2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-amino (DlinDMA) usando un procedimiento previamente publicado [Hayes, J. , Palmer, L., Bremner, K. , MacLachlan, I. Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids. Journal of Controlled Reléase, 107: 276-287 (2005)]. 1 , 2 -Diastearoyl-sn-glicero-3 -fosfocolina (DSPC) se compró de · Genzyme . Se obtuvo colesterol de Sigma-Aldrich (St. Lois, MO) . Se obtuvo 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (poli-etilenglicol) -2000] (sal de amonio) (PEG DMG 2000), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi (poli-etilenglicol) -2000] (sal de amonio) de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) .

Soluciones concentradas frescas de lípidos en etanol se prepararon. Se pesaron 37 mg de DlinD A, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG DMG 2000 y se disolvieron en 7.55 mi de etanol. La solución concentrada de lípidos recién preparada se meció suavemente a 37 °C durante 15 minutos para formar una mezcla homogénea. Entonces, se adicionaron 755 µ? de la solución concentráda a 1.245 mi de etanol para producir una solución concentrada de llpidos de trabajo de 2 mi. Esta cantidad de lípido se uso para formar LNP con 250 mg de ARN a una relación N:P 8:1 (nitrógeno a fosfato) . El nitrógeno protonatable en DlinDMA (el lípido catiónico) y fosfatos en el ARN se usan para este cálculo. Cada g de molécula de ARN auto-replicante se asumió que contiene 3 nmoles de fosfato aniónico, cada g de DlinDMA se asumió que contiene 1.6 nmoles de nitrógeno catiónico. También se preparó una solución de trabajo de 2 mL de ARN a partir de una solución de concentrada de -?µ?/µ?, en amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) (Teknova, Hollister, CA) ) . Tres frascos de vidrio de 20 mi (con barras de agitación) se enjuagaron con solución RNasa (Molecular BioProducts, San Diego, CA) y se lavaron con agua abundante MilliQ antes del uso para descontaminar los frascos de los ARNsas . Uno de los frascos se usó para la solución de trabajo de ARN y los otros para recolectar la mezcla de lípidos y ARN (como se describe más adelante) . Las soluciones de ARN y de lípido de trabajo se calentaron a 37° C durante 10 minutos antes de que se cargaran en jeringas luer-lok de 3 ce (BD Medical, Franklin Lakes, NJ) . Se cargaron 2 mi de amortiguador de citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 ce. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador T (unión PEEKMR 500 m ID, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) , usando tubería FEP ( [etileno-propileno fluorado] 2 mm ID x 3 mm OD, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) . La salida del mezclador en T también fue tubería FEP (2 mm ID x 3 mm) . La tercera jeringa que contiene el amortiguador de citrato se conectó a una pieza separada de tubería (2 mm ID x 3 mm OD) . Todas las jeringas entonces se accionaron a una velocidad de flujo de 7 ml/min usando una bomba de jeringa (kdScientific, modelo no. KDS-220, Holliston, MA) . Las salidas de la tubería se colocaron para recolectar las mezclas en un frasco de vidrio de 20 mi (en tanto que se agita) . La barra de agitación se extrajo y se dejo que la solución de etanol/solución acuosa llegue el equilibrio temperatura a ambiente durante 1 hora. Se cargaron 4 mi de la mezcla a una jeringa de 5 ce (BD Medical) , que se conectó a una pieza de tubería FEP (2 mm ID x 3 mm OD, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) y en otra jeringa de 5 ce conectada a una longitud igual de tubería FEP, se cargó una cantidad igual de amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) . Las dos jeringas se activaron a 7 mL/min de velocidad de flujo usando la bomba de jeringa y la mezcla final se recolectó en un frasco de vidrio de 20 mi (en tanto que se agita) . Entones, la mezcla de recolectada del segundo paso mezclado (liposomas) se hizo pasar a través de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio aniónico que une y remueve moléculas aniónicas, obtenido de Pall Corporation, AnnArbor, MI, EUA) . Antes de pasar los liposomas, se hicieron pasar sucesivamente 4 mi de NaOH 1M, 4 mi de NaCl 1M y 10 mi de amortiguador de citrato 100 mM (pH 6) , a través de la membrana Mustang. Los liposomas se calentaron durante 10 minutos a 37 °C antes de que se hicieran pasar a través del filtro mustang. Entonces, los liposomas se concentraron a 2 mi y se dializaron contra 10-15 volúmenes de IX PBS (de Teknova) , usando el sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibras huecas se compraron de Spectrum Labs (Rancho Domínguez, CA) y se usaron de acuerdo a las guías del fabricante. Se usaron membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona (número de parte P/N:X1AB-100-20P) , con un corte de tamaño de poro de 100 kDa y un área superficial de 8 cm2. Para experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentración requerida de AN con PBS IX (de Teknova) .

Método preparar emulsión catiónica 17 (CNE17) Se obtuvieron escualeno, trioleato de sorbitán (Span 85) , y monooleato de polioxi-etilen sorbitán (Tween 80) de Sigma (St. Louis, MO, EUA) . Se compró 1,2-dioleoil -3 - trimetilamonio-propano (DOTAP) de Lipoid (Ludwigshafen Alemania) . Se prepararon nanoemulsiones catiónicas (CNE) de forma similar a MF59 cargada como se describe anteriormente, con modificaciones pequeñas Ott, et al. Journal of Controlled Reléase, 79(1-3) :l-5 (2002)) . De forma breve, se combinaron componentes solubles en aceite (es decir, escualeno, span 85, lípidos catiónicos, agentes tensioactivos de lípidos) en un vaso de laboratorio, los componentes de lípidos se disolvieron en cloroformo (CHC13) o de diclorometano (DCM) . La solución de lípidos resultante se adicionó directamente al aceite más span 85. El solvente se dejó evaporar a temperatura ambiente durante 2 horas en una campana de humos antes de combinar la fase acuosa y de homogeneizar la muestra usando un homogenizador IKA T25 a 24K RPM a fin de proporcionar una alimentación homogénea. Las emulsiones primarias se hicieron pasar de tres a cinco veces a través de un homogeneizador Microfluidezer M110S o MllOPS con una espiral de enfriamiento de baño de hielo a una presión de homogeneización de aproximadamente 15k -20k PSI (Microfluidics , Newton, MA) . Las muestras de lote de 20 mi se removieron de la unidad y se almacenaron a 4°C. La tabla posterior, describe la composición de CNE17.

Tabla 6: Composición de CNE17 El número de nitrógeno en solución se calculó de la concentración de lípido catiónico, por ejemplo DOTAP, tiene un nitrógeno que se puede protonar por molécula. La concentración de ARN se usó para calcular la cantidad de fosfato en solución usando un estimado de 3 nmoles de fosfato por microgramo de ARN. Al variar la cantidad de ARN: lípidos se puede modificar la relación N/P. Se formó en complejo ARN a CNE17 a una relación de nitrógeno/fosfato (N/P, por sus siglas en inglés) de 10:1. Usando estos valores, el ARN se diluyó a la concentración apropiada en agua libre de RNasa y se adicionó directamente en un volumen igual de emulsión, en tanto que se somete a vórtice de forma ligera. La solución se dejó asentar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. Una vez que volvió complejo, la solución resultante se diluyó a la concentración requerida antes de la administración.

Electroporación La electroporación fue un método muy efectivo para la distribución de vacunas de ANDp y esta técnica se usó para distribuir ARN auto-replicante. Se anestesiaron ratones bajo isofluorano, ambas patas traseras se rasuraron cercanamente para exponer el área en la extremidad que se va a tratar. Se inyectó una dosis de 30 ul de vacuna al músculo de la pantorrilla de la extremidad trasera usando una jeringa de insulina l/2cc. El músculo se sometió a electroforesis usando el Sistema de Distribución de ADN ElgenR (Inovio, San Diego) . Los parámetros del instrumento son como sigue: 60 V, 2 pulsos cada 60ms. Se distribuyó de forma similar otra dosis a la segunda extremidad, seguido por electroporación.

Partículas de replicón virales (VRP, por sus siglas en inglés) Para comparar las vacunas de ARN a los planteamientos tradicionales con vectores de ARN para lograr la expresión in vivo de genes indicadores o antígenos, se utilizaron partículas de replicón virales (VRP, por sus siglas en inglés) producidas en células BHK por los métodos descritos por Perri et al. En este sistema, los replicones de antígeno (o gen indicador) consistieron de replicones quiméricos de alfavirus (VCR, por sus siglas en inglés) derivados del genoma de virus de encefalitis equina venezolana (VEEV, por sus siglas en inglés) manejado para contener las secuencias 3 ' -terminales (3' UTR) de virus de Sindbis y una señal de envasado de virus Sindbis (PS) (ver figura 2 de Perri et al) . Estos replicones se envasaron en VRP al someterlas a electroporación de células de riñon de hámster neonato (BH ) , junto con AR auxiliares defectuosos que codifica para la cápsida del virus Sindbis y genes de glicoproteína (ver figura 2 de Perri et al) . Las VRP entonces se recolectaron y se titularon por métodos normales y se inocularon en animales en fluido de cultivo u otros amortiguadores isotónicos. Perri S, Greer CE, Thudium K, Doe B, Legg H, Liu H, Romero RE, Tang Z, Bin Q, Dubensky TW, Jr. et al (2003) An alphavirus replicón particle chimera derived from venezuelan equine encephalitis and sindbis viruses is a potent gene-based vaccine delivery vector. J Virol 77: 10394-10403.

Vacuna de subunidad de trímero F de RSV El trímero F de RSV es una proteína recombinante que comprende el ectodominio de RSV-F con una supresión de la región de péptido de fusión que impide la asociación con otros trímeros. La construcción resultante forma un trímero homogéneo, como se observa por cromatografía de exclusión de tamaño, y tiene un fenotipo esperado consistente con una conformación de post-fusión de F como se observa por microscopía electrónica. La proteína se expresó en células insectiles y se purificó en virtud de una marca HIS en fusión con el C-términal de la construcción seguido por cromatografía de exclusión de tamaño usando técnicas convencionales. La muestra de proteína resultante exhibe más de 95% de pureza. Para la evaluación in vivo de las vacunas de subunidad F, se adsorbieron con 100 g/ml de proteína de trímero en 2 mg/ml de alumbre usando amortiguador de histidina 10 mM, pH 6.3 y la isotonicidad se ajustó con cloruro de sodio a 150 mM. La proteína de subunidad F se adsorbió en alumbre durante noche con agitación suave a 2-8°C. El pH y la osmolaridad de la vacuna final se puso como objetivo 6.5-7.5 y 240-360 mOsm/kg. La vacuna se caracterizó por adsorción de proteína por SDS-PAGE (Invitrogen Corporation, EUA) y para contenido de endotoxinas por ensayo LAL (Charles River Laboratories, EUA) . La vacuna se mezcló por inversión suave antes de la inmunización.

Estudios de inmunogenicidad murina Grupos de 10 ratones BALB/c hembras de 8-10 semanas de edad que pesan aproximadamente 20 gramos se inmunizaron en el día 0 y el día 21 con sangrados tomados en los días 14, 35 y 49. Todos los animales se inyectaron en los cuadríceps en las dos patas traseras cada una que obtiene un volumen equivalente (50 µ? por sitio) para un total de 100 µ? de vacuna para distribuir una dosis de antígeno de 10 g. Cuando se requirió medición de las respuestas de células T, los bazos se recolectaron en el día 35 o 49.

Vacunación y estimulación de ratas de algodón Se obtuvieron ratas de algodón hembras (Sigmodon hispidis) de Harían Laboratories . Todos los experimentos se aprobaron y se realizaron de acuerdo al Comité de Cuidado y Uso Animal de Novartis. Los grupos de animales se inmunizaron de manera intramuscular (i.m., 100 µ?) con las vacunas indicadas en los días 0 y 21. Las muestras de suero se recolectaron 2 semanas después de cada inmunización. Los animales de control no vacunados o inmunizados se estimularon intranasalmente (i.n.), con 1x10s UFP RSV 4 semanas después de la inmunización final. La recolección de sangre y la estimulación con RSV se realizó bajo anestesia con isoflurano al 3% usando un vaporizador de precisión.

Ensayos de función de células Tde ratón Ensayo de inmunofluorescencia de citocinas intracelulares Se mezclaron de dos a cinco bazos de ratones BALB/c idénticamente vacunados y para cultivo se prepararon suspensiones celulares individuales. Se establecieron dos cultivos estimulados con antígeno y dos cultivos no estimulados para cada mezcla de esplenocitos . Los cultivos estimulados con antígeno contuvieron lxlO"6 esplenocitos, péptido 85-93 de RSV-F (lxlO"6 M) , péptido 249-258 de RSV-F (lxlO"6 M) , péptido 51-66 de de RSV-F (lxl0"6M) , mAb anti-CD28 (l mcg/mL) , y Brefeldina A (1:1000). Los cultivos no estimulados no contienen péptidos de RSV-F, y de otro modo fueron idénticos a los cultivos estimulados . Después del cultivo durante 6 horas a 37°C, los cultivos se procesaron para inmunofluorescencia . Las células se lavaron y luego se tiñeron con anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD4 y anti-CD8 fluorescentemente marcados. Las células se lavaron nuevamente y luego se fijaron con Cytofix/cytoperm durante 20 minutos. Las células fijadas entonces se lavaron con amortiguador Perm-wash y luego se tiñeron con mAb fluorescentemente marcados específicos para IFN-g, TNF-a, IL-2, y IL-5. Las células teñidas se lavaron y luego se analizaron en el citómetro de flujo LSR II. Se usó el software FlowJo para analizar los datos adquiridos. Los subconjuntos de células T CD4+8- y CD8+4- se analizaron de forma separadas. Para cada subconjunto en una muestra dada, se determinó el % de células positivas a citocina. Se calculó el % de células T específicas de antígeno de RSV-F como la diferencia entre el % de células positivas a citocina en los cultivos estimulados con antígeno y el % de células positivas a citocina en los cultivos no estimulados. Los límites de confianza de 95% para el % de células específicas de antígeno se determinaron usando métodos normales (Statistical Methods, 7th Edition, G. . Snedecor y W.G. Cochran) .

Ensayo de citocinas segregadas Los cultivos para el ensayo de citocinas segregadas fueron similares a aquellos para el ensayo de inmunofluorescencia de citocinas intracelulares excepto que se omitió Brefeldina A. Se recolectaron sobrenadantes de cultivo después del cultivo durante la noche a 37°C, y se analizaron para múltiples citocinas usado equipos de citocinas Thl/Th2 de ratón de Meso Scale Discovery. La cantidad de cada citocina por cultivo se determinó de curvas normales producidas usando citocinas recombinantes , purificadas suministradas por el fabricante.

ELISA específico de RSV-F Se valoraron muestras de suero individuales para la presencia de IgG específica de RSV por ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA) . Se revistieron placas de ELISA (MaxiSorp 96 concavidades, Nunc) durante a 4°C con 1 pg/ml de RSV-F purificado (delp23-furdel-trunc-no escindido) en PBS . Después del lavado (PBS con Tween-20 al 0.1%), las placas se bloquearon con Amortiguador de Bloqueo Superblock en PBS (Thermo Scientific) durante al menos 1.5 horas a 37°C. Las placas entonces se lavaron, las diluciones en serie de suero en diluyente de ensayo (PBS con Tween-20 al 0.1% y suero de cabra al 5%) de ratas de algodón experimentales o de control se adicionaron, y las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C. Después del lavado, las placas se incubaron con IgG anti-rata de algodón, de pollo, conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) (Immunology Consultants Laboratory, Inc, diluida 1:5,000 en diluyente de ensayo) durante 1 hora a 37°C. Finalmente, las placas se lavaron y a cada concavidad se adicionaron 100 µ? de solución de substrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc) . Las reacciones se detuvieron por la adición de 100 µ? de H3P04 1M, y se leyó la absorbancia 450 nm usando un lector de placa. Para muestra de suero, se generó una gráfica de densidad óptica (OD) .i versus logaritmo de la dilución en suero recíproca por regresión no lineal (GraphPad Prism) . Los títulos se definieron como la dilución en suero recíproca a una OD de aproximadamente 0.5 (normalizado a sueros mezclados normales de ratas' de algodón infectas con RSV con un título definido de 1:2500, que se incluyó en cada placa) .

Ensayo de micro-neutralización Se probaron muestras de suero para la presencia de anticuerpos neutralizantes por una prueba de neutralización de reducción en placa (PRNT) . Se adicionaron diluciones en serie de dos veces de suero HI (en PBS con 5% de HI-FBS) a un volumen igual de RSV Long previamente titulado para dar aproximadamente 115 PFU/25 µ?. Se incubaron mezclas de suero/virus durante 2 horas a 37°C y 5% de C02, para permitir que se presente la neutralización del virus, y luego se inocularon 25 µ? de esta mezcla (que contiene aproximadamente 115 PFU) en concavidades duplicadas de células HEp-2 en placas de 96 concavidades. Después de 2 horas a 37°C y 5% de C02, las células se revistieron con 0.75% de Metil-Celulosa/EMEM 5% HI-FBS y se incubaron durante 42 horas. El número de partículas de virus infecciosas se determinó por la detección de formación de sincitios por inmunotinción seguido por conteo automatizado el título de neutralización se define como lo recíproco de la dilución de suero que produce al menos una reducción de 60% en el numero de sincitios por concavidad, con relación a los controles (sin suero) .

Carga viral La carga viral en el pulmón se determinó por ensayo de placa. Específicamente, se recolectaron pulmones y 5 días después de la infección con RSV y se colocó un lóbulo derecho en Medio Eagle Modificado de Dulbecco 2.5 mL (DMEM, Invitrogen) con 25% de sacarosa y se interrumpió con un homogeneizador de tejido. Los sobrenadantes libres de célula de estas muestras se almacenaron a -80 °C. Para valorar el virus infeccioso, se inocularon diluciones de homogenado pulmonar clarificado (en PBS con suero bovino fetal inactivado con calor al 5%, HI-FBS) en monocapas de células HEp-2 confluentes en un volumen de 200 µ?/concavidad de una placa de 12 concavidades . Después de 2 horas con balanceo suave periódico (37°C, 5% C02) , se removió el inoculo, y las células se revistieron con 1.5 mi de agarosa SeaPlaque al 1.25% (Lonza) en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM, Lonza) complementado con 5% HI-FBS, glutamina, y antibióticos.

Después de 3-4 días de incubación las células se revistieron nuevamente con 1 mi de agarosa al 1.25% en EMEM (Sigma) que contiene o-l por ciento de rojo neutral (Sigma) . Las placas se contaron un día después con la ayuda de una caja de luz. Patología de pulmón de rata de algodón Cinco días después de la estimulación con RSV se recolectaron pulmones y 4 lóbulos de cada animal se recolectaron y fijaron con formalina amortiguada neutral al 10% ( BF) por instilación intra traqueal suave, seguido por fijación de inmersión. Los tejidos se procesaron rutinariamente para preparar secciones teñidas con eosina y hematoxilina para examen microscópico. Se evaluaron los hallazgos usando una modificación de laos criterios previamente publicados [Prince GA, et al., 2001] para los siguientes parámetros: peribronquiolitis, alveolitis, bronquitis, infiltrados celulares perivasculares, y pneumonitis intersticial . Las lesiones se graduaron en una escala semicuantitativa de 4 puntos. El cambo mínimo (+) , contuvo uno o pocos focos pequeños; el cambio leve (++) se compuso de focos de tamaño o medio a pequeños el cambio moderado (+) contuvo focos de tamaño frecuente y/o moderado,- y cambio marcado (+++) mostró focos extensivos a confluentes que afectan la mayoría/todo el tejido. Ejemplo 7 A.- Estudio de estímulo con RSVde ratas de algodón (CRIS14) El replicón A317, que expresa la glicoproteína de fusión de superficie de RSV (RSV-F) se usó para este experimento. Ratas de algodón {Sigmodon hispidus) , 8 animales por grupo, se les dio vacunaciones intramusculares bilaterales (50 L por pata) en los días 0 y 21 con ARN-auto-replicante desnudo (A317, 1 o 10 µ?) , ARN auto-replicante formulado en LNP [RV01(01), A317, 0.1 g o 1 ]ig) , VRP (5xl06 IU) ] que expresa RSV-F, subunidad de F-trímero/alumbre (10 g) , o vacuna de RSV inactivada con formalina (5200 FI-pfu) . Se recolectó suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2wpl) y 35 (2wp2) . Todos los animales se estimularon con lxlO5 pfu RSV intranasalmente en el día 49 y se recolectaron pulmones en el día 54 (5dpc) para la determinación de carga viral y patología de pulmón.

Resultados Tabla 7: Títulos en suero de IgG específica de F en el día 14 y 3+5 Tabla 7. Títulos en suero de IgG específica de F de ratas de algodón ( Sigmodon hispidlas) , 8 ratas por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recolectó suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2wpl) 35 (2wp2) , todos los animales se estimularon con lxlO5 pfu RSV intranasalmente en el día 49. Los pulmones se recolectaron en el día 54 (5dpc) para determinación de carga viral y patología de laboratorio. Los datos se representan como títulos medios geométricos de 8 ratas de algodón individuales por grupo. Si un animal individual tienen un título de <25 (límite de detección) se asignó un título de 5.

Tabla 8: Títulos en suero de neutralización de RSV en los días 14 y 35 Tabla 8. Títulos en suero de neutralización de RSV de ratas de algodón (Sigmodon hispidus) , 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en día 0 y 21. Se recolectó suero para análisis en los días 14 (2wpl) y 35 (2wp2) . Los datos se presentan como títulos de neutralización de reducción de placa de 60 %. Título medio geométrico de 2 mezclas de ' 4 ratas de algodón por grupo. Si un animal individual tiene un título de <25 (límite de detección) se asignó un título de 5.

Tabla 9 : Título virales pulmonares 5 días después de estimulación con RSV Tabla 9 : Títulos virales pulmonares 5 días después de estimulación con RSV de ratas de algodón {Sigmodon hispidus) , 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Todos los animales se estimularon con lxlO5 pfu de RSV intranasalmente en el día 49. Los pulmones se recolectaron en el día 54 (5dpc) para determinación de carga viral y patología pulmonar. Los datos se presentan como unidades formadoras de placa por gramo de pulmón como se determina por ensayo de placa. Títulos medios geométricos de 8 ratas de algodón individuales por grupo. Si un animal individual tiene un título de <200 (límite de detección) se asignó un título de 100.

Tabla 10: Puntuaciones de alveolitis de pulmón 5 días después de estimulación con RSV Tabla 10. Alveolitis de pulmón 5 días después de estimulación con RSV de ratas de algodón {Sigmodon hispidus) , 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Todos los animales se estimularon con 1x10s pfu de RSV intranasalraente en el día 49. Los pulmones se recolectaron en el día 54 (5dpc) para la determinación de carga viral y patología pulmonar. Las lesiones se graduaron en una escala semicuantitativa de 4 puntos. El cambio mínimo (1) contuvo uno o menos puntos pequeños; el cambio moderado (2) se compuso de puntos de tamaño pequeño a medio; el cambio moderado (3) contuvo puntos de tamaño frecuente y/o moderado; el cambio marcado (4) mostró puntos extensivos a confluentes que afectan la mayoría/todo el tejido.

Conclusiones Un objetivo de este estudio fue determinar la inmunogenicidad y' capacidad protectora de ARN de replicón en el modelo de RSV en rata de algodón. Otro objetivo fue evaluar el efecto de liposomas y formulaciones de CNE17 en la inmunogenicidad y eficiencia de vacunas. El ARN de replicón no formulado indujo anticuerpos neutralizantes de RSV e IgG específica de F en suero después de una vacunación, y esta respuesta se reforzó por una segunda vacunación. Los liposomas y formulaciones de CNE17 fueron similarmente efectivos en este modelo, reforzando los títulos de IgG específica de F a 1 µg de ARN de replicón aproximadamente 8 veces y títulos de neutralización por 4-10 veces (CNE17 y Liposomas, respectivamente) después de la segunda vacunación. Todas las vacunas de ARN de replicón proporcionaron protección de un estímulo nasal de RSV, reduciendo la carga viral pulmonar mayor de tres órdenes de magnitud cuando se mide 5 días después. La magnitud y capacidad protectora de la respuesta inmunitaria generada por 1 pg de ARN de replicón formulado con liposomas estuvo dentro de dos veces la respuesta producida por 5xl06 VRP . La subunidad de trímero con adyuvante de alumbre produjo los títulos totales más altos de ELISA de IgG anti-F, produjo los títulos más altos de neutralización, y produjo el grado más grande de protección de títulos de RSV en el pulmón en la estimulación de cualquiera de las preparaciones de vacuna probadas en este estudio.

Ejemplo 7B.- Estudio de Inmunogenicidad de RSV-F (10-1001) El replicón A317 que expresa la glicoproteína de fusión superficial de RSV (RSV-F) se usó para este experimento. Ratones BALB/c, 10 animales por grupo, se les dio vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pL por pata) en los días 0 y 21 con RSV-F que expresa VRP (lxlO6 IU) , ARN auto-replicante desnudo (A317, 1 pg) , ARN auto- replicante distribuido usando electroporación (A317, 10 pg) , ARN auto-replicante formulado en liposomas (RVOl(Ol), A317, 0.1 pg o 1 pg) y ARN auto-replicante formulado con CNE17 (A317, 0.1 g o 1 pg) . Se recolectó suero para análisis de anticuerpo en los días 14 (2wpl), 35 (2wp2) y 49 (4wp2) . Se recolectaron los bazos de 5 ratones por grupo en el día 49 (4wp2) para análisis de células T.

Resultados Tabla 11: Títulos en suero de IgG específica de F en el día 14 Tabla 11. (10-1001) Títulos en suero de IgG específica de F de ratones, 10 animales por grupo, 14 días después de vacunación intramuscular. Los datos se representan como títulos para ratones individuales y los títulos medios geométricos de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tiene un título detección) se asignó un título de 5.

Tabla 12: Título en suero de IgG especifica de F en el día 35 Tabla 12. (10-1001) Títulos en suero de IgG específica de F de ratones, 10 animales por grupo, días después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recolectó suero para análisis de anticuerpo en el día 35 (2wp2) . Los datos se representan como títulos para ratones individuales y los títulos medios geométricos de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tiene un título de <25 (límite de detección) se asignó un título de 5.

Tabla 13 : Títulos en suero de IgG específica de F en el día 49 Tabla 13. (10-1001). Títulos en suero de IgG específica de F de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recolectó suero para análisis de anticuerpo en el día 49 (4wp2) . Los datos se representan como títulos para ratones individuales y los títulos medios geométricos de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tiene un título de <25 (límite de detección) se asignó un título de 5.

Tabla 14: Títulos de neutralización en suero de RSV en el día 35 Tabla 14. (10-1001) Títulos en suero de neutralización se RSV de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recolectó suero para análisis en el día 35 (2wp2) . Los datos se representan como títulos de neutralización de reducción de placa de 60 % de ratones individuales y el título medio geométrico de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tiene un título de <40 (límite de detección) se asignó un título de 20.

NA= no valorado Tabla 15: Títulos en suero de neutralización de RSV en el día 49 Tabla 15. (10-1001) Títulos de neutralización en suero de RSV de ratones, 10 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en los días 0 y 21. Se recolectó suero para análisis en el día 49 (4wp2) . Los datos se representan como títulos de neutralización de reducción de placa de 60 % de ratones individuales y el título media geométrica de 10 ratones individuales por grupo. Si un animal individual tiene un título de <40 (límite de detección) se asignó un título de 20.

NA= no valorado Tabla 16: Respuesta de células T en el día 49 Tabla 16. (10-1001) Frecuencias de células T esplénicas CD4+ específicas de F de RSV en el día 49 (4wp2) . Se muestran frecuencia positiva a citocinas neta (específica de antígeno) (%) ± 95 % medio intervalo de confianza. Las frecuencias netas mostradas en negritas indican respuestas estimuladas que fueron estadísticamente significativas >0.

Tabla 17: Respuesta de células T en día 49 Tabla 17. (10-1001) Frecuencias de células T esplénicas CD8+ específicas de RSV-F en el día 49 (4wp2) . Se muestran frecuencia positiva a citocinas neta (específica de antígeno) (%) ± 95 % medio intervalo de confianza. Las frecuencias netas mostradas en negritas indican respuestas estimuladas que fueron estadísticamente significativas >0.

Conclusiones La formulación de liposoma mejoró significativamente la inmunogenicidad, como se determina por títulos incrementados de IgG específica de F (incremento de 8-30 veces) , títulos de neutralización, y respuestas de células T CD4 y CD8, con relación al control de AR desnudo.

En forma sorprendente, los títulos de IgG específica de F y los títulos de neutralización para RV01(01) tanto a la dosis de 0.1 como de 1.0 g fueron equivalentes a la VRP (lxlO6 IU) . La respuesta de células T para la formulación de LNP fueron equivalentes a la mayor dosis al VRP (lxlO6 IU) . La formulación del ARN auto-replicante con CNE17 mejoró significativamente la inmunogenicidad, como se determina por títulos incrementados de IgG específica de F (incremento de 2-5 veces) , títulos de neutralización, y respuestas de células T CD4 y CD8, con relación al control de ARN desnudo. La electroporación de ARN mejoró la inmunogenicidad con relación al control de ARN desnudo, pero fue significativamente menor que la distribución de liposoma.

Ejemplo 7C- Estudio de inmunogenicidad de RSV-F (10-1018) El replicón A317 que expresa la glicoproteína de fusión superficial de RSV (RSV-F) se usó para este experimento. Ratones BALB/c, 8 animales por grupo, se les dio vacunaciones intramusculares bilaterales (50 L por pata) en los días 0 y 21 con RSV-F que expresa VRP (lxlO6 IU) , ARN auto-replicante desnudo (A306, 1, 0.1, 0.01 g) , y ARN auto-replicante formulado en liposomas (RVOl(Ol), usando el método 1 (A317, 10.0, 1.0, 0.1, 0.01 µg) . Se recolectó suero para análisis de anticuerpo en los días 14 (2 pl) , y (2wp2) . Se recolectaron los bazos de 5 ratones por grupo en el día 49 (4wp2) para análisis de células T.

Resultados La formulación de liposoma de RV01(01) tiene un diámetro promedio de partícula Z de 158 nm con un índice de polidispersidad de 0.14, la eficiencia de encapsulación fue 96 %. Los títulos en suero de IgG específica de F en los días 14 y 35 se muestran en las tablas 18 y 19 y las respuestas de células T en el día 49 se muestran en las tablas 20 y 21.

Tabla 18: Títulos en suero de IgG específica de F en el día 14 y 35 Tabla 18: (10-1018) Títulos en suero de IgG específica de F en ratones, 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en día 0 y 21. Se recolectó suero para análisis de anticuerpos en los días 14 (2wpl) y 35 (2wp2) . Los datos se presentan como ratones individuales y los títulos medios geométricos de 8 ratas de algodón individuales por grupo. Si un animal individual tiene un título de <25 (límite de detección) se asignó un título de 5.

Tabla 19: Títulos en suero de IgG específica de F en el día 14 V 35 Tabla 19: Continúa de 23A. (10-1018) Títulos en suero de IgG específica de F en ratones, 8 animales por grupo, después de vacunaciones intramusculares en día 0 y 21. Se recolectó suero para análisis de anticuerpo en los días 14 (2wpl) y 35 (2wp2) . Los datos se presentan como animales individuales y los títulos medios geométricos (GMT) de 8 ratas de algodón individuales por grupo. Si un animal individual tiene un título de <25 (límite de detección) se asignó un título de 5.

Tabla 20: Respuestas de células T en día 49 Tabla 20. Frecuencias de células T esplénicas CD4+ específicas de RSV-F en día 49 (Expt. 10-1018, 4wp2) . Se muestran la frecuencia positiva a citocinas neta (específica de antígeno) (%)±95 % medio intervalo de confianza. Las frecuencias netas mostradas en negritas indican respuestas estimuladas que fueron estadísticamente significativas >0.

Tabla 21: Respuesta de células T en día 49 Tabla 21. Frecuencias de células T CD8+ escplénicas específicas de F en día 49 (Expt. 10-1018, 4wp2) . Se muestran la frecuencia positiva a citocinas neta (específica de antígeno) (%)±95 % medio intervalo de confianza. Las frecuencias netas mostradas en negritas indican respuestas estimuladas que fueron estadísticamente significativas >0. Conclusiones La formulación de liposoma mejoró significativamente la inmunogenicidad, como se determina por títulos incrementados de IgG específica de F y frecuencias de células T, con relación a los controles de ARN desnudo. Los títulos de IgG específica de F y las frecuencias de células T CD8 para RV01(01) al a dosis de 10 µg de ARN se mejoró con relación al grupo de VRP (lxlO6 IU) .

Referencia adicionales Las siguientes referencias se incorpora de este modo como referencia para todos los propósitos. 1. Fields Virology. 4th edition, 2001. 2. Snell et al. (1997) Virus Genes 14:63-72. 3. Bembridge et al. (1999) J Virol 73: 10086- 1009 . 4. Li et al. (1998) J Exp Med 188:681-688 5. Patente de los Estados Unidos No. 6,060,308. 6. Yin et al. (2006) Nature 439:38-45. 7. Kim et al. (2007) J Med Virol 79: 820-828. 8. Yin et al. (2005) Proc Nati Acad Sci USA. 102 (26) : 9288-93. 9. Chen et al. (2004) J" Virol 78:4508-16. 10. Yang et at . (2002) J Virol 76:4634-42. 11. Harbury et al. (1993) Science 262:1401-1407. 12. Stevens et al. (2004) Science 303:1866-70. 13. Burkhard et al. (2001) Trends Cell Biol 11:82- 88. 14. Section 5.5.2 of Proteins by Creighton (ISBN 0-7167-2317-4) . 15. Yu (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:1113-1129. 16. uller et al. (2000) Methods Enzymol 328:261- 282. 17. Beck & Brodsky (1998) J Struct Biol 122:17-29. 18. 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Las enseñanzas completas de todos los documentos citados en la presente se incorporan de este modo en la presente como referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende uno o más polipéptidos F de virus sincitial respiratorio (F de RSV) en los cuales se reemplazan los aminoácidos 100-150 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 92.

2. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se reemplazan los aminoácidos 100-150 del F de RSV con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

3. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se reemplazan los aminoácidos 100-150 del F de RSV con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, O SEQ ID NO: 92.

. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se reemplazan los aminoácidos 100-150 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 9.

5. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el F de RSV está en la forma de un monómero, trímero, o combinación de monómeros y trímeros .

6. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 3 o 4, caracterizada porque F de RSV está en la forma de un monómero, trímero, rosetón o cualquier combinación de estos .

7. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el polipéptido F de RSV es un polipéptido soluble que comprende el ecto-dominio F de RSV.

8. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque F de RSV comprende los aminoácidos 23-99 y 151-524 de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2.

9. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: :49, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO :71, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO :43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO :52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO : 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO :64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: :67, SEQ ID NO :69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: :86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, y SEQ ID NO: 93; cualquiera de las secuencias anteriores en las cuales se omita el péptido de señal y/o marca HIS, y combinaciones de estas.

10. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el polipéptido es SEQ ID NO: 68 o SEQ ID NO: 68 en el cual se omite el péptido de señal, y opcionalmente la marca HIS.

11. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 71, y cualquiera de las secuencia anteriores en la cual se omite el péptido de señal, y opcionalmente la marca HIS.

12. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque además comprende un adyuvante.

13. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de: una sal de aluminio, una emulsión de escualeno en agua, un compuesto de benzonaftiridina, un compuesto de fosfolípido, un inmunopotenciador de molécula pequeña y combinaciones de cualesquiera de lo anterior.

14. Un polipéptido F recombinante de virus sincitial respiratorio (F de RSV) , caracterizado porque se reemplazan los aminoácidos 100-150 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 91 O SEQ ID NO: 92.

15. El F recombinante dé RSV de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque se reemplazan los aminoácidos 100-150 del F de RSV con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

16. El F recombinante de RSV de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque se reemplazan los aminoácidos 100-150 del F de RSV con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, O SEQ ID NO: 92.

17. El F recombinante de RSV de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque se reemplazan los aminoácidos 100-150 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

18. El F recombinante de RSV de conformidad con la reivindicación 14 o 15, caracterizado porque el F de RSV está en la forma de un monómero, trímero, o una combinación de monómeros y trímeros.

19. El F recombinante de RSV de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque F de RSV está en la forma de un monómero, trímero, rosetón de trímeros o cualquier combinación de estos.

20. Un polipéptido recombinante, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 49, SEC ! ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: :45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: ;50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: :54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: :59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: :63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: :67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: : 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO :89, y SEQ ID NO: 93 ; cualquiera de las secuencias anteriores en las cuales se omita el péptido de señal y/o marca HIS, y combinaciones de estas.

21. El polipéptido recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-20, caracterizado porque además comprende un dominio heterólogo de oligomerización, un epítopo, o un péptido de señal.

22. El polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el dominio heterólogo de oligomerización se selecciona del grupo que comprende un dominio de trimerización de hemaglutinina de influenza, de espiga de SARS, o de HIV gp41, NadA, GCN4 modificado, o ATCasa.

23. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica para el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 14-21.

24. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es una molécula de ARN auto-replicante.

25. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende la molécula de ARN auto-replicante de conformidad con la reivindicación 24.

26. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque además comprende un sistema de distribución.

27. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto a F de RSV, caracterizado porque comprende administrar una composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 al suj eto .

28. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto a F de RSV, caracterizado porque comprende administrar una composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 25 al sujeto.

29. Un método para producir una composición que comprende polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína a F de SV, caracterizado porque comprende: a) proporcionar polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteina F de RSV que contienen un sitio de escisión de proteasa que cuando se escinden produce subunidades Fi y F2, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que comprende sitios alterados de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 133-136, y los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se obtienen de una célula que los produce no escindidos; y b) escindir los polipéptidos solubles proporcionados de ecto-dominio de proteína F de RSV con una proteasa que escinde el sitio de escisión de proteasa, produciendo de este modo una composición que comprende polipéptidos escindidos, solubles de ecto-dominio de proteína F de RSV.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque en el paso b) los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, se escinden en una o más posiciones de aproximadamente la posición 101 a aproximadamente la posición 161.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, se escinden en unas o más de las posiciones de aproximadamente la posición 106 a aproximadamente la posición 142.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-31, caracterizado porque se purifican los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados en a) .

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-32, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados en a) comprenden un péptido intacto de fusión.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la escisión en el paso b) da por resultado la formación de rosetones de trímeros .

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque además comprende c) purificar los rosetones de trímeros .

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la purificación de los rosetones de trímeros comprende cromatografía de exclusión de tamaño.

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-32, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados en a) comprenden un péptido alterado de fusión .

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque al menos una porción del péptido de fusión se suprime en los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque los aminoácidos 137-153, aminoácidos 137-146, aminoácidos 137-145, o aminoácidos 137-142 se suprimen del péptido de fusión.

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-39, caracterizado porque la escisión en el paso b) da por resultado la formación de trímeros .

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque además comprende c) purificar los trímeros .

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la purificación de los trímeros comprende cromatografía de exclusión de tamaño.

43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-42, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados en a) se expresan en células de insecto, células mamíferas, células aviares, células de levadura, células de Tetrahymena o combinaciones de estas.

44. El método de conformidad con las reivindicaciones 29-43, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados en a) se proporcionan en medios acondicionados de cultivo celular.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque los medios acondicionados de cultivo celular se seleccionan del grupo que consiste de medio acondicionado de cultivo de células insectiles, medio acondicionado de cultivo de células mamíferas y combinaciones de estos .

46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-36 y 41, caracterizado porque los rosetones de trímeros comprenden fragmentos F± y F2 de al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de Furdel y Delp23 furdel.

47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-46, caracterizado porque los polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV están sustancialmente libres de lípidos y lipoproteínas .

48. Una composición, caracterizada porque comprende polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-47.

49. La composición de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque es una composición inmunogénica .

50. Un método para producir una composición que comprende monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos no escindidos, solubles de ecto-dominio de proteína F de RSV que comprenden sitios alterados de escisión de furina en las posiciones 106-109 y 133-136, y estos polipéptidos no escindidos, solubles de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan de una célula que los produce no escindidos, y b) purificar monómeros o trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico, produciendo de este modo la composición.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el material biológico se selecciona del grupo que consiste de medio acondicionado de cultivo de células insectiles o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células mamíferas o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células aviares o lisado celular, medio acondicionado de células de levadura o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células Tetrahymena o lisado celular, y combinaciones de estos.

52. El método de conformidad con la reivindicación 50 o 51, caracterizado porque en b) se purifican los trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

53. El método de conformidad con la reivindicación 50 o 51, caracterizado porque en b) se purifican los monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

54. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la purificación en b) comprende cromatografía de exclusión de tamaño.

55. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50-54, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV comprenden además un péptido alterado de fusión.

56. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos, solubles, de ecto-dominio de proteína F de RSV comprende al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de furmt, furdel, Delp21 furx, Delp23 furx, Delp21 furdel, Delp23 furdel, y la construcción del factor Xa.

57. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50-56, caracterizado porque la composición que comprende polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV está sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas .

58. Una composición, caracterizada porque comprende monómeros o trímeros de polipéptidos no escindidos, solubles de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 50-57.

59. La composición de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque la composición es una composición inmunogénica .

60. Un método para producir una composición que comprende monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un material biológico que contiene polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido no escindido de ecto-dominio de proteína F de RSV contiene sitios alterados de escisión de furina, los residuos de lisina y arginina presentes entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161 se suprimen o reemplazan con un aminoácido que no es lisina ni arginina, los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se obtienen de una célula hospedadora que los produce no escindidos entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161, y los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV no se escinden entre aproximadamente la posición 101 y aproximadamente la posición 161; y b) purificar monómeros o trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico.

61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el material biológico se selecciona del grupo que consiste de medio acondicionado de cultivo de células insectiles o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células mamíferas o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células aviares o lisado celular, medio acondicionado de células de levadura o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células Tetrahymena o lisado celular, y combinaciones de estos.

62. El método de conformidad con la reivindicación 60 o 61, caracterizado porque en b) se purifican los trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

63. El método de conformidad con la reivindicación 60 o 61, caracterizado porque en b) se purifican los monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

64. El método de conformidad con la reivindicación 60 o 61, caracterizado porque en b) se purifican monómeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV y trímeros de polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

65. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 o 64, caracterizado porque la purificación en b) comprende cromatografía de exclusión de tamaño .

66. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 o 64, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV comprenden además un péptido alterado de fusión.

67. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV comprenden al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de Furx, Furx, R113Q K123N K124N, Delp21 furx y Delp23 furx.

68. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-67, caracterizado porque la composición que comprende polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV está sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas .

69. Una composición, caracterizada porque comprende polipéptidos no escindidos, solubles de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60-68.

70. La composición de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque la composición es una composición inmunogénica .

71. Un método para producir una composición que comprende monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, caracterizado porque comprende: a) proporcionar material biológico que contiene polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que contienen un péptido alterado de fusión; y b) purificar polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico.

72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV comprende una secuencia de aminoácidos en la cual se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-152, se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-153, se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-145, se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-146 o se suprimen aproximadamente los aminoácidos 137-142.

73. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, caracterizado porque el material biológico se selecciona del grupo que consiste de medio acondicionado de cultivo de células insectiles o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células mamíferas o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células aviares o lisado celular, medio acondicionado de células de levadura o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células Tetrahymena o lisado celular, y combinaciones de estos.

74. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-73, caracterizado porque en b) se purifican los trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

75. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-73, caracterizado porque en b) se purifican los monómeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

76. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-73, caracterizado porque en b) se purifican monómeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV y trímeros de polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

77. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-73, caracterizado porque la purificación en b) comprende cromatografía de exclusión de tamaño.

78. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque los polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV comprende al menos el polipéptido de supresión de Péptido de Fusión.

79. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-78, caracterizado porque la composición que comprende polipéptidos no escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV está sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas .

80. Una composición, caracterizada porque comprende polipéptidos no escindidos, solubles de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 71-79.

81. La composición de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la composición es una composición inmunogénica.

82. Un método para producir una composición que comprende polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, caracterizado porque comprende: a) proporcionar polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que comprenden un sitio alterado de escisión de furina en las posiciones 133-136, y los polipéptidos solubles de ecto-dominio de proteína F de RSV se seleccionan de una célula que los produce en la forma de un fragmento F2 que está asociado con una subunidad que comprende Fi pero se escinde en la posición 136/137; y b) escindir los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, proporcionados, con una proteasa que escinde el ecto-dominio de proteína F de RSV en un sitio entre las posiciones 101 y 161, produciendo de este modo la composición .

83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque se purifican los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados en a) .

84. El método de conformidad con la reivindicación 82 u 83, caracterizado porque los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados en a) se expresan en células insectiles, células mamíferas, células aviares, células de levadura, células de Tetrahymena o combinaciones de estas.

85. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-84, caracterizado porque los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV proporcionados en a) se proporcionan en medio acondicionado de cultivo celular, extracto celular o una combinación de esto.

86. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV se proporcionan en medio acondicionado de cultivo celular que se selecciona del grupo que consiste de medio acondicionado de cultivo de células insectiles, medio acondicionado de cultivo de células mamíferas, medio acondicionado de cultivo de células aviares, medio acondicionado de células de levadura, medio acondicionado de cultivo de células Tetrahymena, y combinaciones de esto.

87. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-86, caracterizado porque los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV incluyen al menos el polipéptido de furina de C-términal.

88. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-87, caracterizado porque los polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos en b) están sustancialmente libres de lípidos .y lipoproteínas .

89. Una composición, caracterizada porque comprende polipéptidos escindidos de ecto-dominio de proteína F de RSV producidos usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-88.

90. La composición de conformidad con la reivindicación 89, caracterizada porque la composición es una composición inmunogénica .

91. Un método para producir una composición que comprende polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV, caracterizado porque comprende: a) proporcionar material biológico que contiene polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV que comprenden un sitio alterado de escisión de furina en las posiciones 133-136, y los polipéptidos solubles de ecto-dominio de proteína F de RSV se segregan de una célula que los produce en la forma de un fragmento F2 que está asociado con una subunidad que comprende Fi pero no se escinde en la posición 136/137 con la condición que el sitio alterado de escisión de furina no se suprima de los aminoácidos 131-134; y b) purificar los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV del material biológico, produciendo de este modo la composición.

92. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque el material biológico se selecciona del grupo que consiste de medio acondicionado de cultivo de células insectiles o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células mamíferas o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células aviares o lisado celular, medio acondicionado de células de levadura o lisado celular, medio acondicionado de cultivo de células de Tetrahymena o lisado celular, y combinaciones de esto.

93. El método de conformidad con la reivindicación 91 o 92, caracterizado porque en b) se purifican monómeros, trímeros o una combinación de monómeros y trímeros de polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV.

9 . El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la purificación en b) comprende cromatografía de exclusión de tamaño.

95. El método de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 91 o 94, caracterizado porque los polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV incluyen al menos el polipéptido de furina de C-términal.

96. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 91-95, caracterizado porque la composición que comprende polipéptidos de ecto-dominio de proteína F de RSV está sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas .

97. Una composición, caracterizada porque comprende polipéptido de ecto-dominio de proteína F de RSV producido usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 92-96.

98. La composición de conformidad con la reivindicación 97, caracterizada porque la composición es una composición inmunogénica.