MX2012000493A - Celulas derivadas de tejido cardiaco. - Google Patents

Abstract

La presente invención se dirige a métodos y composiciones para reparar el miocardio dañado con el uso de células derivadas de tejido cardíaco humano; particularmente, la presente invención proporciona métodos y composiciones para reparar el miocardio dañado con el uso de células derivadas de tejido cardíaco humano expandidas que no expresan telomerasa.

Description

CÉLULAS DERIVADAS DE TEJIDO CARDÍACO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención reivindica la prioridad de la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 61/224,446, presentada el 9 de julio de 2009.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos y composiciones para reparar el miocardio dañado con el uso de células derivadas de tejido cardiaco humano. Particularmente, la presente invención proporciona métodos y composiciones para reparar el miocardio dañado con el uso de células derivadas de tejido cardíaco humano expandidas que no expresan telomerasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El infarto miocárdico agudo (AMI) es la causa principal de muerte en los Estados Unidos. El AMI es causado por una falta repentina y sostenida de flujo sanguíneo en un área del corazón causada, generalmente, por estrechamiento de una arteria coronaria. Sin el suministro de sangre adecuado, el tejido se vuelve isquémico y produce la muerte de miocitos y estructuras vasculares. Esta área de tejido necrótico se conoce como el sitio del infarto y se convierte, eventualmente, en tejido cicatricial. El resto de los cardiomiocitos no tiene la capacidad de reconstruir el tejido necrótico y el corazón se deteriora con el tiempo. El deterioro puede ser en forma de una pérdida de la función del músculo cardíaco asociado con la remodelación del miocardio dañado.

Algunas terapias actuales para el infarto miocárdico agudo se enfocan en la trombolisis o, alternativamente, la angioplastía, para abrir el vaso obstruido y restaurar el suministro de sangre al sitio del infarto. Estos tratamientos pueden reducir eficazmente el tamaño del sitio del infarto y mejorar la función cardiaca sistólica, pero no revierten la pérdida de la función del músculo cardiaco que se asocia con la remodelación del miocardio lesionado. Otras terapias, tales como, por ejemplo, los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACEI) y los beta-bloqueadores también mejoran la función global y la supervivencia. Sin embargo, los efectos terapéuticos de estos medicamentos pueden únicamente mejorar la supervivencia en menos del 5 % de pacientes post-AMI.

El trasplante de células puede ser otra terapia posible para el infarto miocárdico agudo. Por ejemplo, Orlic y otros (Nature 410: 701 - 705 (2001)) informaron la inyección de Lin" c-kit+ de células de médula ósea en el miocardio dañado. Orlic y otros reportan: "Nuestros estudios indican que las células de médula ósea aplicadas localmente pueden generar miocardio nuevamente, lo que mejora el resultado de la enfermedad arterial coronaria." En otro ejemplo, Nygren y otros (Nature Medicine 10: 494 - 501 (2004)) reportan: "Demostramos que las células de médula ósea sin fraccionar y una población purificada de células madre y progenitoras hematopoyéticas se injertan eficientemente en el miocardio infartado. Sin embargo, el injerto fue transitorio y de naturaleza hematopoyética. Por el contrario, se observó cardiomiocitos derivados de médula ósea fuera del miocardio infartado en una baja frecuencia y se derivaron exclusivamente a través de fusión celular." Sin embargo, no está claro el mecanismo por el cual las células derivadas de médula ósea tratan el AMI. Por ejemplo, Murry y otros (Nature 428: 664 - 668 (2004)) afirman: "Usamos transgenes reporteros restringidos de cardiomiocitos y con expresión de ubiquitina para rastrear el destino de las células madre hematopoyéticas después de 145 trasplantes en corazones normales y dañados de ratones adultos. No se detectó transdiferenciación en los cardiomiocitos con el uso de estas técnicas genéticas para seguir el destino celular y los corazones injertados con células madre no mostraron ningún aumento evidente en los cardiomiocitos en comparación con los corazones con injerto simulado. Estos resultados indican que las células madre hematopoyéticas no adquieren fácilmente un fenotipo cardiaco y son una advertencia para los estudios clínicos de la reparación del infarto." En otro ejemplo, Werner y otros (Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 5: 78-79 (2008)) afirman: "Sin embargo, hay todavía muchas preguntas sin responder con relación a la subpoblación de células progenitoras, la mejor técnica para el aumento de las células progenitoras, los mecanismos subyacentes de acción y la seguridad y eficacia del método a largo plazo. Además, varios ensayos de terapia [de células de la médula ósea] en pacientes con AMI han dado resultados negativos, posiblemente, debido a la variación en el momento de la administración [de células de la médula ósea] después de un AMI, las diferencias en los métodos de preparación de las células progenitoras usadas, o ambos." En otro ejemplo, Balsam y otros (Nature 428: 668 - 673 (2004)) afirman: "Nuestros datos sugieren que aun en el microambiente del corazón lesionado, las células BM enriquecidas con c-kit, Lin" c-kit+ células BM y c-kit+ Thy1.110 Lin- Sca-1+ que reconstituyen las células madre hematopoyéticas a largo plazo adoptan únicamente destinos hematopoyéticos tradicionales." Otra fuente potencial de células son las células madre embrionarias. Por ejemplo, Gold y otros (patente núm. WO2005090558) describen métodos para generar células del linaje de cardiomiocitos de células madre embrionarias para usar en medicina regenerativa.

En otro ejemplo, Gold y Hassanipour (patente núm.

WO2007002136) describen métodos para la diferenciación de células madre pluripotentes de primates en células del linaje de cardiomiocitos.

Otra fuente potencial de células son las células progenitores cardíacas. Las células progenitores cardíacas se han identificado en el corazón humano y de ratas. Las células progenitoras cardíacas son autorrenovables y multipotenciales lo que da lugar a todos los linajes cardíacos.

Por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20040126879A1 describe el uso de células madre cardíacas que son CD31+, CD38+ y c-kit" para tratar el miocardio dañado.

En otro ejemplo, Oh y otros (PNAS 100: 12313 - 12318 (2003)) describen la existencia de células progenitoras cardíacas adultas derivadas del corazón que expresan Sca-1 , CD31 y CD38 y que carecen de la expresión de CD4, CD8, B220, Gr-1 , Mac-1 , TER119, c-kit, Flk-1 , e-cadherina, factor de von Willebrand, CD45 y CD34.

En otro ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008024111 1A1 describe un método para preparar células derivadas de tejido cardíaco de mamífero preparadas a través de las siguientes etapas: (i) tratar enzimáticamente un fragmento de tejido cardiaco de un mamífero para preparar una suspensión de células; (ii) separar un grupo de células derivadas de tejido cardíaco de la suspensión de células mediante un método de gradiente de densidad; y (iii) cultivar en suspensión el grupo obtenido de células derivadas de tejido cardíaco en un medio de cultivo que contiene un factor de crecimiento de fibroblastos y un factor de crecimiento epidérmico y, después, seleccionar y separar las células que forman una esfera flotante.

En otro ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20080213231 A1 describe un grupo de células madre pluripotentes compuesto de células madre pluripotentes derivadas de un tejido de músculo esquelético humano o de ratón. Las células madre pluripotentes son c-met-negativo, Pax-7-negativo, Myf-5-negativo, MyoD-negativo, Miogenina-negativo, M-cadherina-negativo, CD105-positivo, CD90-positivo, c-kit-negativo y CD45-negativo, las células madre pluripotentes son CD34-negativo en el caso de células madre derivadas de humanos y son CD34-positivo en el caso de células madre derivadas de ratón y el grupo de células madre pluripotentes se obtiene por la proliferación de una sola célula.

En otro ejemplo, Laugwitz y otros (Nature 433: 647 - 653 (2005) describen células progenitoras cardíacas isl1-1+ en miocardio en ratas, ratones y humanos postnatales.

En otro ejemplo, Messina y otros (Circulation Research 95: 91 1 -921 , (2004)) describen el "aislamiento de células indiferenciadas que crecen como agrupaciones autoadherentes (que hemos denominado "cardioesferas") a partir de subcultivos de especímenes de biopsia humana postnatal auricular o ventricular y de corazones de murino. Estas células son clonigénicas, expresan antigenos/marcadores de células progenitoras endoteliales y células madre y parecen tener las propiedades de las células madre cardiacas adultas". Messina y otros afirman: "Las cardioesferas humanas y de ratón de desarrollo reciente revelaron la expresión de marcadores endoteliales (KDR (humano)/flk-1 [ratón], CD-31) y de células madre (CD-34, c-kit, sca-1)".

En otro ejemplo, Smith y otros (Circulation 1 15(7): 896 - 908 (2007) afirman: "Los especímenes de biopsia endomiocárdica percutánea cultivados en cultivo primario desarrollaron agrupaciones multicelulares conocidas como cardioesferas, que se sembraron para producir células derivadas de cardioesferas (CDC)." En otro ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070020758 describe un método para el aislamiento, expansión y preservación de muestras de biopsia de tejido de células madre cardiacas humanas o animales para usar en el trasplante de células y la reparación funcional del miocardio o de otros órganos.

En otro ejemplo, Beltrami y otros (Cell 114(6): 763 - 776 (2003)) describen "la existencia de las células Lin- c-kitPOS con las propiedades de células madre cardiacas. Estas son autorrenovables, clonigénicas y multipotenciales, que dan lugar a miocitos, músculo liso y células endoteliales".

En otro ejemplo, la patente núm. WO 2008054819 describe células madre cardiovasculares positivas para marcadores isl1+/Nkx 2.5+/ flk1+ y células madre cardiovasculares que pueden diferenciarse en los linajes celulares endoteliales, cardíacos y de músculo liso.

En otro ejemplo, la patente núm. WO 2008109839A1 describe una población enriquecida de células madre que comprende un polipéptido CXCR4 y un polipéptido Flk-I, en donde las células madre tienen la capacidad de diferenciarse en células que expresan Mef2C, GATA-4, miocardina y polipéptidos Nkx2.5.

En otro ejemplo, la patente núm. WO 2008081 57 A2 describe un método para aislar células madre cardíacas; el método comprende poner en contacto un tejido que comprende células madre cardiacas con una composición que comprende dispasa II en condiciones suficientes para inducir la disociación de las células para aislar las células madre cardiacas.

En otro ejemplo, la patente núm. WO 2008058273A2 describe un método para obtener células derivadas de miocitos (MDC) similares a células madre de mamíferos de tejido auricular o ventricular; el método comprende las siguientes etapas: aislar las células de tejido cardíaco auricular o ventricular para formar una suspensión de células y cultivar las células en un medio que comprende un mitógeno para formar una composición que comprende las MDC.

En otro ejemplo, la patente núm. WO 2008054819A2 describe un método para aislar células madre cardiovasculares; el método comprende poner en contacto una población de células con agentes que reaccionan con Isletl , Nkx2.5 y flkl y separar las células reactivas positivas de las células no reactivas.

En otro ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070212423A1 describe un método para aislar una célula precursora de cardiomiocitos c-kif/c-mef de origen muscular; el método comprende separar las células de menos de 40 pm en diámetro de una suspensión de células musculares; cultivar las células en un medio de cultivo de tejido en un sustrato sólido y aislar las células en suspensión en el medio para aislar la célula precursora de cardiomiocitos c-kit c-met" de origen muscular.

En otro ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20050058633 describe una célula aislada precursora de cardiomiocitos c-kit-/c-met de origen muscular de mamífero.

En otro ejemplo, la patente núm. WO 2004019767 describe una célula madre de cardiomiocitos de mamífero que tiene c-kitneg/CD31 + /CD38+ y que expresa transcríptasa inversa de telomerasa.

En otro ejemplo, la patente núm. WO 2008083962A1 describe células progenitoras de cardiomiocitos (CMPC) que se caracterizan por un epítope Sca-1 o uno similar a Sca-1 y CD31 en su superficie celular.

En otro ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20080213230A1 describe un método de preparación de una población de células aisladas en células madre o células progenitoras; el método comprende: (a) cultivar una muestra de tejido; (b) obtener células que migran por encima de los fibroblastos adherentes durante el cultivo; (c) clonar una o más células obtenidas en (b) para producir una o más poblaciones clonigénicas; (d) identificar una o más poblaciones clonigénicas que tienen un fenotipo deseado; (e) aislar las células madre o células progenitoras de una o más poblaciones clonigénicas identificadas en la etapa (d) al clasificar las células con el uso de uno o más marcadores de superficie celular o internos de células madre o células progenitoras y (f) cultivar las células madre o células progenitorias aisladas en un medio condicionado en ausencia de células alimentadoras para obtener una población de células aisladas enriquecidas en células madre o células progenitoras. embargo, un obstáculo para el uso de células progenitoras cardíacas es la falta de un método eficiente para aislar o expander las células. Por lo tanto, persiste la necesidad de aislar y expander eficientemente células progenitoras cardíacas para poder evaluar su eficacia como una terapia para el miocardio dañado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para aislar y expander células derivadas de tejido cardíaco humano. Las células aisladas y expandidas de conformidad con los métodos de la presente invención no expresan telomerasa y son útiles para tratar o reparar miocardio dañado.

La presente invención proporciona una población purificada de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa.

La presente invención proporciona un método para producir células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa; el método comprende las siguientes etapas: a. obtener tejido cardíaco, b. disociar el tejido cardíaco, c. digerir el tejido cardíaco para liberar las células d. eliminar los cardiomiocitos de las células liberadas, y e. cultivar las células restantes.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o reparar el miocardio dañado de un paciente; el método comprende las siguientes etapas: a. obtener una población de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresen telomerasa, y b. administrar la población de células derivadas de tejido cardíaco humano al paciente en una cantidad suficiente para tratar o reparar el miocardio dañado.

En una modalidad, las células derivadas de tejido cardiaco humano usadas para tratar al paciente han sido criopreservadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 describe el procedimiento por el cual se aislan las células de la presente invención. Los detalles del proceso para obtener las poblaciones de células se describen en el Ejemplo 1.

La Figura 2 describe el aislamiento de las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. Los detalles del proceso para obtener las poblaciones iniciales de células se describen en el Ejemplo 1.

La Figura 3 describe un método alternativo para aislar las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención.

Las Figuras 4A-4D muestran la morfología de las células derivadas de tejido cardíaco humano (hCTC) de la presente invención. Todas las imágenes mostradas tienen un aumento de 100X, a menos que se indique de otra manera. Figura 4A: es una imagen que muestra una suspensión celular obtenida al presembrar las células obtenidas de la digestión inicial. La flecha negra muestra las células S no adherentes de fase brillante; Figura 4B: La flecha negra muestra una agrupación de células S de fase brillante. La flecha blanca muestra las células adherentes obtenidas a partir de la siembra inicial (la imagen se muestra a un aumento de 200X); la Figura 4C muestra las células A2 derivadas de una siembra nueva de cultivos de células S; la Figura 4D muestra células S de fase brillante sembradas nuevamente en un cultivo de las células A2.

Las Figuras 5A-5B muestran el efecto de la densidad de siembra sobre el potencial de crecimiento de hCTC. El eje x muestra los días en cultivo después de sembrar una mezcla de las células (S) hCTC (A1) y hCTC de viales congelados. El eje y muestra el total acumulado de los duplicados de la población de las células hCTC (A3).

La Figura 6 muestra el efecto de niveles de oxígeno reducidos en el potencial de crecimiento de células hCTC (A3).

La Figura 7 muestra el potencial de crecimiento de las células rCTCA2 derivadas del tejido cardíaco de ratas (rCTC (A2)). El eje x muestra los días en cultivo después de sembrar nuevamente las células (S) rCTC de los viales congelados. El eje y muestra el total acumulado de los duplicados de la población de las células rCTC (A2).

La Figura 8 muestra la recuperación y la viabilidad de las células hCTC (A3), después de la criopreservación y el suministro simulado con un dispositivo de administración potencial (que consiste en una aguja calibre 30). El número de células viables recuperadas se indica en el eje y a la izquierda. La viabilidad celular se indica en el eje y a la derecha. Los diamantes llenos representan la viabilidad celular; los cuadrados abiertos representan la recuperación celular. Los detalles se describen en el Ejemplo 6.

La Figura 9 muestra la recuperación y la viabilidad de las células rCTC (A2) después de la criopreservación y suministro simulado con un dispositivo de administración potencial (que consiste en una aguja calibre 30). El número de células viables recuperadas se indica en el eje y a la izquierda. La viabilidad celular se indica en el eje y a la derecha. Los cuadrados llenos representan la recuperación celular antes del paso de la aguja; los triángulos llenos representan la viabilidad celular antes del paso de la aguja; los cuadrados abiertos representan la viabilidad celular después del paso de la aguja; el triángulo abierto representa la recuperación celular después del paso de la aguja. Los detalles se describen en el Ejemplo 6.

La Figura 10 muestra la expresión del marcador de superficie celular hCTC (A3) según se determinó por citometría de flujo. En cada histograma, la línea punteada es el control de ¡sotipos de anticuerpos. La línea continua es la tinción del antígeno. Los antígenos se mostraron en los grupos.

El eje x es la intensidad de la ficoeritrina (PE) en escala logarítmica. El eje y es el conteo celular.

La Figura 11 muestra la comparación de la expresión del marcador de superficie celular de las células hCTC (A3) (grupos superiores) y los fibroblastos dérmicos adultos humanos— HDF (número de catálogo: CC-2511 , Lonza, grupos inferiores). En cada histograma, el eje x es la intensidad de PE en escala logarítmica. El eje y es el conteo celular. La línea punteada representa el control de ¡sotipos de anticuerpos. La línea continua es la tinción del antígeno. La población positiva se discriminó en base al 1 % de la población positiva en controles de isotipos. Los marcadores individuales se indican en cada histograma.

La Figura 12 muestra la expresión del marcador de superficie de las células rCTC (A2) según se determinó por citometría de flujo. La línea punteada representa el control de isotipos. La línea continua es la tinción del antígeno para CD31 (grupo de la izquierda) y CD90 (grupo de la derecha).

La Figura 13 muestra la expresión génica de genes cardíacos específicos en células hCTC (A3) según se determinó por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los detalles se describen en el Ejemplo 8. El eje x muestra el porcentaje de GAPDH y se divide en escalas inferiores y superiores. La escala inferior va de 0 a 0.01 % y la escala superior va de 0.05 % a 0.15 %. Los acrónimos tienen los siguientes significados: MHC significa cadena pesada de miosina; TF cardíaca significa factor de transcripción; NHDF significa fibroblastos dérmicos humanos neonatales; corazón h significa corazón humano. Los datos se expresan como Media ± D.E (n=3).

La Figura 14 muestra la expresión elevada de la cadena pesada de miosina específica del ratón (MHC) en un cocultivo de células (A2) derivadas de tejido cardíaco de ratón (mCTC (A2)) con cardiomiocitos neonatales de rata (núm. de catálogo R357-6W, Cell Application, Austin, TX). El nivel de expresión génica de MHC de ratón se presentó como el porcentaje de GAPDH de ratón en cada muestra. El eje y indica el porcentaje de GAPDH de ratón. Los acrónimos tienen los siguientes significados: mCTC significa células mCTC (A2) cultivadas en medio de diferenciación, como se describe en el Ejemplo 9; CM significa cardiomiocitos; mCTC+CM significa mCTC cocultivadas con cardiomiocitos de rata CM en medio de diferenciación. Los datos se expresan como Media ± D.E (n=3).

La Figura 15 muestra la curva de crecimiento que se observa en las células (A3) derivadas de tejido cardíaco porcino (pCTC (A3)), cultivado de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 10. El eje x muestra el tiempo en cultivo después de la siembra. El eje y muestra el total acumulado de los duplicados de la población.

La Figura 16 muestra la expresión del marcador de superficie de las células pCTC (A3), según citometría de flujo. La línea punteada representa el control de isotipos. La línea continua es la tinción del antigeno para CD90 (grupo superior izquierdo), CD105 (grupo superior derecho), marcador de células endoteliales de cerdo (grupo inferior izquierdo), CD16 (grupo inferior central), CD45 (grupo inferior derecho).

La Figura 17 muestra una ilustración de la remodelación cardíaca después de un infarto miocárdico agudo. La ilustración se reprodujo de Pfeffer M. de Atlas of heart failure (Colucci W, editor, 1999).

La Figura 18 muestra el efecto de la administración de las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención en el acortamiento fraccional (AF) en animales en donde se ha inducido infartos miocárdicos agudos, según lo determinado por ecocardiografia. El acortamiento fraccional es el cambio porcentual (AF%) entre la sístole y la diástole en cada ciclo cardíaco y refleja la función global del corazón. Los datos que se muestran son del acortamiento fraccional registrado en un animal individual en 5 (D5) o 28 días (D28) después de la inducción del AMI. Los animales se dosificaron con células rCTC (A2) o células hCTC (A3) en las dosis indicadas en el eje x.

La Figura 19 muestra el efecto de las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención en el puntaje del movimiento parietal regional (RWMS) en animales en los que se indujo infartos miocárdicos agudos, según lo determinado por ecocardiografia. Cada grupo separado por una línea continua vertical es un grupo experimental del estudio. D5 y D28 se refieren a 5 días y 28 días, respectivamente, después de la inducción del AMI. El RWMS se determinó en el D5 como valor inicial y en el D28 como seguimiento. Los animales se dosificaron con las células rCTC (A2) o hCTC (A3) a las dosis que se indican en el eje x.

La Figura 20 muestra el efecto de las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención en la dimensión del ventrículo izquierdo al final de la diástole (LVEDD) en animales en los que se indujo infartos miocárdicos agudos. La LVEDD es una medición de la dimensión de la cámara izquierda al final de la diástole. La LEVDD se determinó a los 5 días (D5) y 28 días (D28) después de la inducción del infarto miocárdico. Los datos que se muestran son el cambio relativo [(D28-D5)/D5] en animales individuales. Los animales se dosificaron con las células rCTC (A2) o hCTC (A3) a las dosis que se indican en el eje x.

La Figura 21 muestra el análisis estadístico en comparación con el cambio relativo de LVEDD en cada grupo experimental. Se aplicó una prueba F a los datos con el uso de un análisis de la varianza unidireccional (ANOVA). Grupo 1 : vehículo; Grupo 2: 1 x 106 células rCTC (A2) (dosis objetivo); Grupo 3: 1 x 104 células hCTC (A3) (dosis objetivo); Grupo 4: 1 x 105 células hCTC (A3) (dosis objetivo); Grupo 5: 1 x 106 células hCTC (A3) (dosis objetivo).

La Figura 22 muestra el efecto de la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano en la dimensión del ventrículo izquierdo al final de la sístole (LVESD). La LVESD es una medición de la dimensión de la cámara izquierda al final de la sístole en cada ciclo cardíaco. Cada grupo separado por una línea continua vertical es un grupo experimental del estudio.

La LVESD se determinó a los 5 días (D5) y 28 días (D28) después de la inducción del infarto miocárdico. Los datos que se muestran son los registros de un solo animal en cada momento específico. Los animales se dosificaron con las células rCTC (A2) o hCTC (A3) a las dosis que se indican en el eje x.

La Figura 23 muestra la función cardiaca en el día 5 y el día 28 postinfarto y de la administración de las células derivadas de tejido cardíaco humano en animales individuales en cuatro parámetros (AF, RWMS, LVESD, LVEDD) determinados por ecocardiografía. Cada punto negro representa la función cardíaca de un animal individual en el instante que se indica en el eje x. La línea negra continua muestra la tendencia del cambio del D5 al D28 en cada animal. Cada grupo representa un parámetro determinado por ecocardiografía.

La Figura 24 muestra la correlación entre el acortamiento fraccional y la dosis de células derivadas de tejido cardíaco. El eje y es el cambio absoluto en el día 28 desde el día 5 postinfarto y la administración de las células (D28-D5). El eje x es la dosis de hCTC (A3) en escala lineal. Los datos se expresan como Medía ± D E. (n=35).

La Figura 25 muestra la correlación entre el cambio de LVEDD y la dosis de tejido cardíaco humano de la presente invención. El eje y representa el cambio absoluto al día 28 desde el día 5 postínfarto y la administración de las células (D28-D5). El eje x representa la dosis de las células hCTC (A3) a escala lineal. Los datos se expresan como Media ± D.E. (n=35).

Las Figuras 26A-26C muestran la retención de las células hCTC (A3) administradas en el corazón de animales que tienen infartos miocárdicos. La retención se calculó a partir del nivel de expresión de beta-microglobulina detectado en corazones de ratas. La Figura 26A muestra la retención de las células hCTC (A3) a las 4 semanas de la administración a las dosis que se indican en el eje x. La Figura 26B muestra la evolución en el tiempo de la retención de las células hCTC (A3), en donde el eje x representa el número de días después de la administración de las células en el corazón de ratas con MI y el eje y muestra el porcentaje de la dosis objetivo. La Figura 26C muestra la retención de las células hCTC (A3) con el tiempo, con el uso de un porcentaje promedio de las células detectadas para determinar la cantidad de las células humanas detectadas inmediatamente después de la administración de las células al 100 %. El eje x representa el número de días después de la administración de las células en el corazón de ratas con MI.

La Figura 27 muestra la correlación entre la retención de hCTC (A3) y la prevención de remodelación en el corazón de ratas con MI. El grupo de la izquierda muestra el gráfico de correlación. El eje x representa el número de células en escala logarítmica; el eje y describe los cambios de la remodelación (LVEDD delta, D28-D5). El número de células de cada animal a las cuatro semanas después de la administración y la LVEDD delta correspondiente se trazaron en el gráfico. El grupo de la derecha muestra el análisis estadístico de la regresión lineal.

Las Figuras 28A-28B muestran la localización del NuMA (antigeno de matriz nuclear) humano en el miocardio de ratas tratado con las células hCTC (A3) (una dosis objetivo de 1 x 106 células). La Figura 28A muestra la tinción positiva del NuMA humano observada a la dosis objetivo de 1 x 106 tratado con hCTC en el miocardio de ratas a un aumento de 400 veces. La Figura 28B muestra la tinción en un animal vehículo de control.

Las Figuras 29A-29D muestran la localización del NuMA humano en otro animal que recibe la dosis objetivo de 1 x 106 células hCTC (A3). La Figura 29A muestra una imagen de baja potencia (aumento de 100 veces) que muestra dos agrupaciones de células NuMA positivo. La Figura 29B es una imagen de gran aumento (aumento de 400 veces) de agrupaciones de células NuMA positivo. La Figura 29C es una imagen de gran aumento de una agrupación de células NuMA positivo. La Figura 29D es una imagen de gran aumento que muestra núcleos de células NuMA positivo con morfología similar a la de miocitos.

La Figura 30 muestra la tinción de los controles de anticuerpos para NuMA que se observan en miocardio humano y de rata. Las dos primeras imágenes muestran una tinción positiva de NuMA (grupo de la izquierda) con una alta especificidad nuclear (sin tinción con control de isotipos, grupo de la derecha) en un corazón humano. Las dos imágenes inferiores muestran los controles del corazón de rata que demuestran la especificidad de los anticuerpos de NuMA a las células humanas.

La Figura 31 muestra la evaluación del puntaje de hipertrofia miocárdica en grupos hCTC tratados con (A3) o tratados con el vehículo. La dosis objetivo se indica en el eje y. Los animales que recibieron las células hCTC (A3) recibieron una dosis objetivo de cualquiera de las células 1 x 104, 1 x 105, o 1 x 106. El área de color gris claro muestra la proporción de las secciones sin hipertrofia en todo el corazón. El área de color gris oscuro muestra la proporción de las secciones hipertróficas en todo el corazón.

Las Figuras 32A-32B muestran la evaluación del tamaño del infarto. La Figura 32A muestra el tamaño relativo del infarto (porcentaje del área del infarto en el área total del ventrículo izquierdo); La Figura 32B muestra el área absoluta del infarto. Los puntos negros representan cada animal individual. El tamaño promedio del infarto del grupo se muestra como una línea continua negra.

Las Figuras 33A-33B muestran la tinción de la densidad capilar en grupos tratados con células hCTC (A3) o tratadas con el vehículo. Los animales que recibieron células hCTC (A3) recibieron una dosis objetivo de cualquiera de las células 1 x 104, 1 x 105, o 1 x 106. La Figura 33A muestra la densidad capilar en la zona límite del infarto en el miocardio, como se detectó con tinción de isolectina-B4. La Figura 33B muestra la densidad capilar en la zona límite, como se detectó por la tinción CD31.

Las Figuras 34A-34C muestran la densidad de los miocitos en el área no infartada. La Figura 34A muestra imágenes representativas de la tinción de H&E del miocardio de los animales tratados con vehículo (grupo de la izquierda) y los animales tratados con células hCTC de 1 x105 (A3) (grupo de la derecha). La Figura 34B muestra la densidad de los miocitos observada en áreas no infartadas del corazón, expresada en números de miocitos por mm2. Los datos se muestran como Media ± D E. (n=6); La Figura 34C muestra la proliferación de miocitos que se observó por la doble tinción de Ki-67 y la cadena pesada de miosina. Los datos se expresan como Media ± D.E. (n=6).

La Figura 35 muestra los genes expresados diferencialmente en el miocardio de rata en respuesta al tratamiento con células hCTC (A3) para todas las dosis objetivo.

Las Figuras 36A-36C muestran la cuantificación del efecto de la administración de las células hCTC y hMSC en el tejido cardíaco de ratas que sufren de un MI agudo. La Figura 36A muestra la relación del área del infarto en comparación con tejido sano en la pared libre del ventrículo izquierdo. La Figura 36B muestra la clasificación de la dilatación observada en el corazón de los animales en todos los grupos. La Figura 36C muestra miocardio viable.

La Figura 37 muestra el efecto de las células hCTC (A3) y la administración de células madre mesenquimales humanas (catálogo núm. PT-2501 , Lonza, Walkersville, MD) en el tejido cardíaco de ratas que sufren de un MI agudo. Se muestra dos secciones comparativas de cada ariimal: una tomada de la línea media entre los músculos papilares y el nivel auricular y una tomada del músculo papilar. Las dos columnas de la izquierda son del grupo tratado con vehículo; las dos columnas del centro fueron del grupo tratado con hMSC (dosis objetivo de 1 x 106); las dos columnas de la derecha fueron del grupo tratado con células hCTC (A3) (dosis objetivo de 1 x 105).

Las Figuras 38A-38C muestran el efecto de la administración de las células hCTC (A3) en la función cardiaca de ratas que sufren de un MI agudo, en el día 28 postinfarto y de la administración de las células. Se determinó tres parámetros (AF, LVESD, LVEDD) por ecocardiografía. Se presenta el cambio relativo a partir de los valores iniciales (día 7 postinfarto y la administración de células) en el día 28 después de la administración de células y el infarto. Se muestra tres lotes de células hCTC (A3) de diferentes donantes, fibroblastos dérmicos humanos y células pCTC (A3).

Las Figuras 39A-39C muestran el efecto de la administración de células hCTC (A3) en la función cardiaca de ratas que sufren de un MI agudo, en el día 84 postinfarto y la administración de células. Se determinó tres parámetros (AF, LVESD, LVEDD) por ecocardiografía. Se presenta el cambio relativo a partir de los valores iniciales (día 7 postinfarto y la administración de células) hasta el día 84 después de la administración de células y del infarto. Se examinó fibroblastos dérmicos humanos y tres lotes de células hCTC (A3) diferentes que se prepararon a partir de diferentes donantes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción, y no en forma limitante, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones Como se usa en la presente, el término "miocardio dañado" se refiere a las células del miocardio que se han expuesto a condiciones de isquemia. Estas condiciones de isquemia pueden ser causadas por un infarto miocárdico u otra enfermedad cardiovascular o dolencia relacionada.

"Infarto miocárdico agudo", como se usa en la presente descripción, se refiere a la condición comúnmente conocida como "ataque cardíaco", en donde al interrumpir el suministro de sangre a una parte del corazón se provoca que algunas células del corazón mueran. Esto se debe más comúnmente a la oclusión (obstrucción) de una arteria coronaria después de la ruptura de una placa aterosclerótica, que es una colección inestable de lípidos (como el colesterol) y glóbulos blancos (especialmente, macrófagos) en la pared de una arteria. La isquemia resultante (restricción del suministro de sangre) y la falta de oxígeno, si no se trata por un período suficientemente prolongado, puede causar daño y/o muerte del tejido del músculo cardíaco (miocardio).

El término "población hCTC (S)" o "hCTC (S)", como se usa en la presente descripción, se refiere a una población no adherente de células derivadas de tejido cardíaco humano que se obtiene después del cultivo inicial de células después de que el tejido cardíaco humano se ha disociado, digerido enzimáticamente y filtrado de conformidad con los métodos de la presente descripción.

El término "población hCTC (A1)" o "células hCTC (A1)", como se usa en la presente descripción, se refiere a una población adherente de células derivadas de tejido cardíaco humano que se obtiene después del cultivo inicial de células después de que el tejido cardíaco humano se ha disociado, digerido enzimáticamente y filtrado de conformidad con los métodos de la presente descripción.

El término "población hCTC (A2)" o "células hCTC (A2)", como se usa en la presente descripción, se refiere a una población de células adherentes que se derivan de cultivos in vitro de células hCTC (S).

El término "población hCTC (A3)" o "células hCTC (A3)", como se usa en la presente descripción, se refiere a una población de células adherentes que se derivan de cultivos in vitro de una mezcla de células hCTC (S) y hCTC (A1).

Métodos para derivar las células de la presente invención La presente invención proporciona un método para producir células derivadas de tejido cardiaco humano que no expresan telomerasa; el método comprende las siguientes etapas: a. obtener tejido cardíaco, b. disociar el tejido cardíaco, c. digerir el tejido cardíaco para liberar las células, d. eliminar los cardiomiocitos de las células liberadas y e. cultivar las células restantes.

El tejido cardíaco se puede disociar manualmente. Alternativamente, el tejido cardíaco se puede disociar mecánicamente.

Los cardiomiocitos se pueden eliminar de las células liberadas mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, los cardiomiocitos se pueden eliminar por filtración, centrifugación o por FACS.

En una modalidad las células liberadas a partir de la digestión del tejido cardíaco se filtran para extraer los cardiomiocitos. El propósito de la etapa de filtración es excluir las células más grandes en tamaño que las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención son de aproximadamente 5 micrones a aproximadamente 50 micrones de diámetro y se elige un filtro de un tamaño de poro de 50 micrómetros para permitir que las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pasen a través del filtro.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardiaco humano que pasan a través del filtro se cultivan in vitro. En una modalidad las células derivadas de tejido cardiaco humano que se cultivan in vitro después de la etapa de filtración son una mezcla de células no adherentes y células adherentes.

Las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se pueden adherir a cualquier sustrato sólido. En una modalidad el sustrato sólido es policarbonato. Alternativamente, el sustrato sólido puede ser poliestireno. Alternativamente, el sustrato sólido puede ser vidrio. El sustrato sólido puede estar recubierto, además, con una capa adicional que comprende una proteína de la matriz extracelular, tal como, por ejemplo, colágeno o laminina, y similares.

Las células adherentes de la presente invención que sé obtienen después de la etapa inicial de cultivo se denominan en la presente descripción población de células (A1) derivadas de tejido cardíaco humano o células hCTC (A1). Las células no adherentes de la presente invención que se obtienen después de la etapa inicial de cultivo se denominan en la presente descripción población de células (S) derivadas de tejido cardíaco humano o células hCTC (S).

En una modalidad las células hCTC (A1) se expanden en cultivo. Las células hCTC (A1) de la presente invención se pueden cultivar en cualquier medio de cultivo de tejido adecuado. Por ejemplo, en una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco se pueden cultivar en DMEM con suplemento de D-glucosa a 1 ,000 g/l, L-glutamina a 584 mg/l y piruvato sódico a 110 mg/l, así como SFB al 10 %. Los antibióticos tales como, por ejemplo, penicilina al 50 U/ml y estreptomicina al 50 pg/ml se pueden añadir al medio de cultivo. Alternativamente, los antibióticos se pueden agregar a la suspensión de células que se obtiene después de la disociación y la digestión enzimática del tejido del corazón. Las células hCTC (A1) de la presente invención se pueden sembrar a una densidad de siembra de aproximadamente 1 ,000 a aproximadamente 10,000 células viables / cm2 en sustratos de tejido de cultivo. Las células hCTC (A1) de la presente invención se pueden incubar en oxígeno atmosférico al 5-20 %v/v.

En una modalidad las células hCTC (A1) de la presente invención se cambian de cultivo una vez que las células alcanzan aproximadamente el 80 % de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A1) de la presente invención se cambian de cultivo una vez que las células alcanzan aproximadamente el 90 % de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A1) de la presente invención se cambian de cultivo cada uno a siete días.

En una modalidad las células hCTC (S) se expanden en cultivo. En una modalidad las células hCTC (S) de la presente invención se pueden cultivar en cualquier medio de cultivo de tejido adecuado. Por ejemplo, en una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco se pueden cultivar en DMEM con suplemento de D-glucosa a 1,000 g/l, L-glutamina a 584 mg/l y piruvato sódico a 110 mg/l, así como SFB al 10 %. Los antibióticos tales como, por ejemplo, penicilina al 50 U/ml y estreptomicina al 50 pg/ml se pueden agregar al medio de cultivo. Alternativamente, los antibióticos se pueden agregar a la suspensión de células que se obtiene después de la disociación y la digestión enzimática del tejido cardíaco. Las células hCTC (S) de la presente invención se pueden incubar en oxígeno atmosférico al 5-20 % v/v. En una modalidad el tejido del medio de cultivo se reemplaza cada tres días.

En una modalidad las células hCTC (S) se vuelven adherentes con el tiempo en cultivo. El tiempo en cultivo en el cual las células hCTC (S) se vuelven adherentes es de aproximadamente 1 día a aproximadamente 7 días. La población de células adherentes que resulta de las células hCTC (S) que se vuelven adherentes se refiere en la presente descripción a la población de células (A2) derivadas de tejido cardíaco humano o células hCTC (A2).

En una modalidad las células hCTC (A2) se expanden en cultivo. Las células hCTC (A2) de la presente invención se pueden cultivar en cualquier medio de cultivo de tejido adecuado. Por ejemplo, en una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco se pueden cultivar en DMEM con suplemento de D-glucosa a 1 ,000 g/l, L-glutamina a 584 mg/l y piruvato sódico a 1 10 mg/l, así como SFB al 10 %. Los antibióticos tales como, por ejemplo, penicilina al 50 U/ml y estreptomicina al 50 pg/ml se pueden añadir al medio de cultivo. Alternativamente, los antibióticos se pueden agregar a la suspensión celular que se obtiene después de la disociación y la digestión enzimática del tejido cardíaco. Las células hCTC (A2) de la presente invención se pueden sembrar a una densidad de siembra de aproximadamente 1 ,000 a aproximadamente 10,000 células viables / cm2 en sustratos de cultivo de tejido. Las células hCTC (A2) de la presente invención se pueden incubar en oxígeno atmosférico al 5-20 %v/v.

En una modalidad las células hCTC (A2) de la presente invención se cambian de cultivo una vez que las células alcanzan aproximadamente el 80 % de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A2) de la presente invención se cambian de cultivo una vez que las células alcanzan aproximadamente el 90 % de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A2) de la presente invención se cambian de cultivo cada uno a siete días.

En una modalidad una mezcla de células hCTC (A1) y células hCTC (S) se expande en cultivo. En una modalidad la mezcla de células hCTC (A1) y células hCTC (S) forman una población de células adherentes con el tiempo en cultivo. El tiempo de cultivo en el que las células hCTC (S) se vuelven adherentes es de aproximadamente 2 días a aproximadamente 14 días. En la presente descripción la población de células adherentes que resulta de la mezcla de células hCTC (A1) y células hCTC (S) que se vuelven adherentes se denomina población de células (A3) derivadas de tejido cardíaco humano o células hCTC (A3).

En una modalidad las células hCTC (A3) se expanden en cultivo. Las células hCTC (A3) de la presente invención se pueden cultivar en cualquier medio de cultivo de tejido adecuado. Por ejemplo, en una modalidad las células derivadas de tejido cardiaco se pueden cultivar en DMEM con suplemento de D-glucosa a 1 ,000 g/l, L-glutamina a 584 mg/l y piruvato sódico a 110 mg/l, así como SFB al 10 %. Los antibióticos tales como, por ejemplo, penicilina al 50 U/ml y estreptomicina al 50 pg/ml se pueden añadir al medio de cultivo. Alternativamente, los antibióticos se pueden agregar a la suspensión de células que se obtiene después de la disociación y la digestión enzimática del tejido cardíaco. Las células hCTC (A3) de la presente invención se pueden sembrar a una densidad de siembra de aproximadamente 1 ,000 a aproximadamente 10,000 células viables / cm2 en sustratos de tejido de cultivo. Las células hCTC (A3) de la presente invención se pueden incubar en oxígeno atmosférico al 5-20 %v/v.

En una modalidad las células hCTC (A3) de la presente invención se cambian de cultivo una vez que las células alcanzan aproximadamente el 80 % de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A3) de la presente invención se cambian de cultivo una vez que las células alcanzan aproximadamente el 90 % de confluencia. Alternativamente, las células hCTC(A3) de la presente invención se cambian de cultivo cada uno a siete días.

En la Figura 1 se describe un método por el cual se obtienen las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. En la Figura 2 se describe un método alterno por el cual se obtienen las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. En la Figura 3 se describe un método alterno por el cual se obtienen las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención.

Las células de la presente invención se pueden derivar al disociar todo el corazón y, posteriormente, por la digestión del tejido disociado. Alternativamente, las células de la presente invención se pueden derivar al disociar porciones del tejido cardíaco y, posteriormente, por la digestión del tejido disociado. Las porciones se pueden obtener de cualquier parte del corazón, tales como, por ejemplo, las aurículas o los ventrículos, el ápice del corazón o de cualquier lado del corazón.

El tejido cardíaco disociado se puede digerir con el uso de enzimas tales como, por ejemplo la colagenasa y la dispasa. Las enzimas se pueden usar por separado o, alternativamente, en conjunto. En una modalidad el tejido cardíaco disociado se digiere con el uso de una mezcla de colagenasa y dispasa.

La colagenasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 0.1 U/ml a aproximadamente 10 U/ml. Alternativamente, la colagenasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 0.1 U/ml a aproximadamente 5 U/ml. Alternativamente, la colagenasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 5 U/ml. Alternativamente, la colagenasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 1 U/ml.

La dispasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 0.5 U/ml a aproximadamente 50 U/ml. Alternativamente, la colagenasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 0.5 U/ml a aproximadamente 10 U/ml. Alternativamente, la colagenasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 10 U/ml. Alternativamente, la colagenasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 5 U/ml.

El tejido disociado se puede tratar con las enzimas durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 5 horas. Alternativamente, el tejido disociado se puede tratar con las enzimas durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 5 horas. Alternativamente, el tejido disociado se puede tratar con las enzimas durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 4 horas. Alternativamente, el tejido disociado se puede tratar con las enzimas durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 3 horas. Alternativamente, el tejido disociado se puede tratar con las enzimas durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 horas. Alternativamente, el tejido disociado se puede tratar con las enzimas durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora. En una modalidad el tejido disociado se trata con las enzimas durante aproximadamente 2.5 horas.

Si se desea, las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención se pueden exponer, por ejemplo, a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce, específicamente, un marcador proteico expresado por las células derivadas de tejido cardiaco para identificar y seleccionar las células derivadas de tejido cardíaco para obtener una población sustancialmente pura de células derivadas de tejido cardíaco.

Las células de la presente invención La presente invención proporciona una población de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresa telomerasa que se puede mantener y expandir en cultivo y que es útil en el tratamiento y reparación del miocardio dañado. Las propiedades de las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención se resumen en la Tabla 1.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención que no expresan telomerasa expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: CD49e, CD105, CD59, CD54, CD90, CD34 y CD117.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención que no expresan telomerasa expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: MDR, CD19, CD16, CD31 , CD45 y lsl-1.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención que no expresan telomerasa expresan los siguientes marcadores: CD49e, CD105, CD59, CD54, CD90, CD34 y CD117.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención que no expresan telomerasa no expresan los siguientes marcadores: MDR, CD19, CD16, CD31 , CD45 ni lsl-1.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se diferencian aún más en cardiomiocitos. Esta diferenciación puede ser antes de o, alternativamente, después de la administración al paciente. Diferenciación se refiere al acto de aumentar el alcance de la captación o posesión de una o más características o funciones que difieren de las de la célula original (es decir, la especialización celular). Esto se puede detectar, por ejemplo, mediante el ensayo de un cambio en el fenotipo de la célula (es decir, identificar cambios morfológicos en la célula y/o los marcadores de superficie de la célula). Se puede usar cualquier método con la capacidad de diferenciar las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención en cardiomiocitos.

Por ejemplo, las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención se pueden diferenciar, además, en cardiomiocitos de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20040126879.

En otro ejemplo, las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención se pueden diferenciar aún más en cardiomiocitos de conformidad con los métodos descritos en la patente núm. WO2004019767.

Métodos para tratar o reparar el miocardio dañado El miocardio dañado resulta de una variedad de enfermedades cardíacas tales como, por ejemplo, infarto miocárdico agudo, infarto miocárdico crónico, insuficiencia cardiaca congestiva y similares. Las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención se pueden usar como una terapia para reparar el miocardio dañado. En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención se usan como una terapia para reparar el miocardio que se daña como resultado de un infarto miocárdico agudo.

En una modalidad la presente invención proporciona un método para tratar el miocardio dañado en un paciente; el método comprende las siguientes etapas: a. obtener una población de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresen telomerasa y b. administrar la población de células derivadas de tejido cardiaco humano al paciente en una cantidad suficiente para tratar el miocardio dañado.

En una modalidad la presente invención proporciona un método para reparar el miocardio dañado en un paciente; el método comprende las siguientes etapas: a. obtener una población de células derivadas de tejido cardiaco humano que no expresen telomerasa y b. administrar la población de células derivadas de tejido cardíaco humano al paciente en una cantidad suficiente para reparar el miocardio dañado.

En una modalidad la población de células derivadas de tejido cardíaco humano se prepara y se administra al paciente sin cultivar las células. En una modalidad alterna la población de células derivadas de tejido cardíaco se preparan y se cultivan in vitro antes de administrarlas al paciente.

En el caso en donde la población de células derivadas de tejido cardíaco humano se cultivan y se expanden ¡n vitro, la población de células que se cultiva y se expande puede ser una población de células hCTC (A1 ). Alternativamente, la población de células que se cultiva y se expande puede ser una población de células hCTC (A2). Alternativamente, la población de células que se cultiva y se expande puede ser una población de células hCTC (A3).

Las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención se pueden administrar a un paciente que sufre de miocardio dañado por cualquier método adecuado en la materia. Tales métodos los selecciona fácilmente el experto en la materia.

Por ejemplo, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pueden administrarse al miocardio dañado por medio de inyección directa en el miocardio dañado. Alternativamente, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se pueden administrar en forma sistemática. En donde las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se suministran sistemáticamente, la eficiencia de suministrar las células al miocardio dañado se puede mejorar, por ejemplo, al tratar al paciente con por lo menos otro agente o mediante otro método con la capacidad de mejorar el suministro de células al miocardio dañado.

Por ejemplo, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se pueden administrar junto con otro agente seleccionado del grupo que consiste en: factor de células madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor-1 derivado de células estromales, factor de acero, factor de crecimiento endotelial vascular, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de granulocitos y macrófagos e interleucina-3.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención se administran junto con otro agente de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20020061587.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención se administran junto con otro agente de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2002162796.

Por ejemplo, el suministro de células al miocardio dañado se puede mejorar al aislar la circulación cardíaca del paciente de la circulación sistémica del paciente y bombear una solución que comprende células dentro del circuito cardiaco. Un ejemplo de este método se describe en la patente núm. WO2007067502.

En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran al paciente de conformidad con los métodos descritos por Iwasaki, Kawamoto y otros (Circulation 113: 1311-1325; 2006).

En una modalidad alterna las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran al paciente con el uso de un catéter que se puede insertar en la arteria coronaria, de conformidad con los métodos descritos por Sherman, Martens y otros (Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 3, supl 1 : S57-64; 2006).

En una modalidad alterna las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran al paciente con el uso de un catéter con la capacidad de mapear la actividad eléctrica del miocardio. En una modalidad las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención se administran al paciente con el uso de un catéter con la capacidad de mapear la actividad eléctrica del miocardio de conformidad con los métodos descritos por Perin, Dohmann y otros (Circulation 107: 2294-2302; 2003); y Perin, Silva y otros (Journal of Molecular and Cellular Cardiology 44: 486-495; 2008). En una modalidad alterna las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención se administran al paciente de conformidad con los métodos descritos por Sherman, Martens y otros (Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 3, supl 1 : S57-64; 2006).

En una modalidad alterna las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención se administran al paciente con el uso de un catéter con la capacidad de inyección intramiocárdica, de conformidad con los métodos descritos por Hashemi, Ghods y otros (European Heart Journal 29: 251-259; 2008).

Se ilustra el actual invento aún más, pero sin limitarse a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Aislamiento de células derivadas de tejido cardiaco humano Materials y métodos: preparación del cóctel de enzimas digestivas: El cóctel de enzimas digestivas que se usa en la presente invención para aislar las células derivadas de tejido cardiaco del corazón humano se preparó como soluciones base de cóctel 2X en solución salina regulada con fosfato (PBS, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA). Las concentraciones de la colagenasa son al 0.2 U/ml o 2 U/ml (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) y dispasa II al 10 U/ml (Roche Applied Science, Indianapolis, Indiana). Estas bases de cóctel de enzimas se almacenaron a -40 °C. Antes de la digestión, el cóctel de enzimas se filtró por un sistema de filtro al vacio de 0.22 pm (Corning Incorporated, Acton, MA). Para la digestión del corazón humano se usó base de colagenasa al 2 U/ml en el procedimiento digestivo. Las concentraciones finales de enzimas digestivas de colagenasa son 1 U/ml y de dispasa 5 U/ml. El proceso digestivo del corazón humano entero y el aislamiento de las células derivadas de tejido cardíaco humano (hCTC) se resumen en la Figura 1.

Material y métodos: corazón humano: Los corazones enteros para trasplante y desecho se obtuvieron de National Development and Research Institutes (NDRI, New York, NY). El tiempo de adquisición de los corazones para trasplante y desecho fue de 40-98 horas. El órgano entero se sumergió en medio de crecimiento (DMEM+suero fetal bovino al 10 %) y se almacenó a 4 °C hasta ser procesado para el aislamiento de células.

Materiales y métodos: procesamiento del tejido cardíaco humano: El tejido cardíaco entero se transfirió a una cabina de bioseguridad y se colocó en una placa cuadrada para bioensayos (Corning Inc., Acton, MA). El exceso de tejido adiposo se eliminó con el uso de escalpelos estériles (Bard Parker, Becton Dickinson, Hancock, NY). El primer corazón entero se cortó en pedazos pequeños (2-3 cm3). Después, tres cuartos de los pedazos pequeños de tejido se trituraron manualmente hasta obtener los pedazos adecuados (1 -2 mm3 de tamaño). Este procedimiento se completó en dos horas. Un cuarto de los pedazos se transfirió a la cámara homogeneizadora PRO250 (Pro Scientific, Oxford, CT). La tapa se colocó sobre la cámara y el generador PRO250 se unió con la velocidad del generador ajustada en 3. Los pedazos de tejido se homogeneizaron durante 10 segundos a temperatura ambiente sin agregar ningún amortiguador y el tejido se examinó visualmente. La homogeneización se completó cuando el tejido se trituró finamente (para producir fragmentos de menos de 1 mm3 de tamaño).

Materiales y métodos: digestión del tejido humano: Los pedazos de tejido, tanto procesados manualmente como homogeneizados, se transfirieron a tubos cónicos separados de 250 mi (Corning Inc., Corning, NY). El tejido en cada tubo se lavó 3 veces al agregar 100 mi de PBS a temperatura ambiente e invertir el tubo 5 veces. Después, el tubo se colocó verticalmente y se dejó que el tejido se asentara. El sobrenadante se aspiró con el uso de una pipeta de aspiración de 2 mi (BD Falcon, BD Biosciences, San José, CA). La base de cóctel de enzimas digestivas (2X) se agregó al tubo de 250 mi en una relación de enzima y tejido de 1 :1. La concentración final de las enzimas fue 1 U/ml de colagenasa y 5 U/ml de dispasa II. Los tubos con el tejido y las enzimas se transfirieron a un agitador orbital a 37 °C configurado para 225 rpm (Barnstead Lab, Melrose Park, IL) y se incubaron durante 2.5 horas. Después de la incubación, el tubo se transfirió de regreso a la cabina de bioseguridad. La suspensión celular se diluyó al llenar los tubos con PBS a temperatura ambiente. Para eliminar cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró por un tamiz de prueba estándar de 20.3 cm (8 pulgadas) de diámetro de 250 µ?? (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y en un vaso de precipitado de vidrio de 500 mi. Después de esta etapa, la suspensión celular en el vaso de precipitado de vidrio se filtró adicionalmente por coladores de células (BD Falcon) de 100 pm y en múltiples tubos cónicos (BD Falcon) de 50 mi. Después, la suspensión celular se lavó por centrifugación a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente con el uso de una centrifugadora Sorvall Legend T (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) para comprimir las células. El sobrenadante se aspiró y las microesferas celulares se resuspendieron en PBS y se agruparon en tubos separados de 50 mi, uno para el proceso de trituración manual y otro para el proceso de homogeneización. La suspensión celular se lavó tres veces más con 40 mi de PBS a temperatura ambiente. Después del lavado la microesfera se resuspendió en 20 mi de amortiguador de lisis ACK (Lonza, Walkersville, MD) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para lisar cualquier glóbulo rojo restante. Después de la incubación la suspensión celular se lavó dos veces más con 40 mi de PBS a temperatura ambiente. Después de la centrifugación final, la microesfera se resuspendió en 20 mi de medio de crecimiento a temperatura ambiente (DMEM, D-glucosa al 1 ,000 mg/l, L-glutamina y piruvato sódico al HO mg/l, suero fetal bovino al 10 %, penicilina al 50 U/ml, estreptomicina al 50 ug/ml) y se contó.

Materiales y métodos: conteo celular, el análisis de densidad celular viable total y de viabilidad se realizó con el uso del XR Vi-Cell™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA). El analizador de viabilidad celular Vi-Cell™ automatiza el método de exclusión del colorante azul tripán para la evaluación de viabilidad celular con el uso de tecnología de capturas en video y análisis de imágenes de hasta 100 imágenes de células en una célula del flujo. El Vi-Cell tiene una precisión de conteo de ± 6 %. Las muestras se prepararon y se analizaron según las instrucciones del fabricante (Reference Manual PN 383674 Rev.A). En resumen, un alícuota de 500 mL de la suspensión celular final obtenido después de la lisis con RBC se transfirió a un vial de muestras Vi-Cell™ de 4 mi y se analizó con un analizador de viabilidad celular XR Vi-Cell™. Se usó el perfil predeterminado de tipos celulares: Brillo celular 85 % Definición celular 100 Brillo del sitio de células viables 75 % Área del sitio de células viables 5 % Circularidad mínima 0 Grado de desagrupación Medio Diámetro mínimo 5 micrones Diámetro máximo 50 micrones Imágenes 50 Ciclos de aspirado Ciclos de mezclado de azul tripán 3 Resultados: producción celular obtenida de la digestión de un corazón entero: Del primer corazón entero, después de la digestión, con el proceso de trituración manual se produjo 43 millones de células viables después de la separación y la digestión enzimática. La viabilidad fue de 65 %. El procedimiento de homogeneización mecánica produjo 12 millones de células viables y la viabilidad fue de 63 %. Dado que al procedimiento manual se sometió 3 veces más tejido, no hubo diferencias en la producción y la viabilidad entre los 2 procedimientos. En base a los resultados, los corazones humanos siguientes se procesaron con el uso de homogeneización mecánica. Después de la digestión, la producción total fue, típicamente, 34-64 millones de células viables por corazón. La viabilidad fue de 55-81 %, tal como se muestra en la Tabla 2.

Ejemplo 2 Selección y cultivo in vitro de las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención La suspensión celular obtenida después de la disociación y digestión enzimática de un corazón humano se expandió para un análisis experimental adicional.

La siembra inicial de las células obtenidas de la disociación y digestión enzimática de un corazón humano: La suspensión celular obtenida de la disociación y digestión enzimática de un corazón humano, de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 1 , se agregó en matraces para cultivo de tejidos T225 (Corning Inc., Corning, NY). En cada matraz que contenía 50 mi de medio de crecimiento (DMEM, D-glucosa a 1 ,000 mg/l, L-glutamina a 584 mg/l y piruvato sódico a HO mg/l, suero fetal bovino al 10 %, penicilina al 50 U/ml, estreptomicina al 50 pg/ml, Invitrogen, Calsbald, CA) se agregó 10 mi de la suspensión celular. El volumen final del cultivo inicial fue de 60 mi. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera que comprende 02 al 20 % y C02 al 5 %durante 2 días. Después de este período se observó un cultivo celular heterogéneo. Se observó células no adherentes de fase brillante (en la presente descripción denominadas células hCTC (S)) y células adherentes (en la presente descripción denominadas células hCTC (A1)). Véanse las Figuras 4A-4D.

Las células hCTC (S) obtenidas después de la etapa de cultivo inicial tenían una morfología similar a las células descritas como células madre cardíacas por Anversa (Beltrami, Barlucchi y otros 2003; Cell 1 14(6): 763-76). Véase la Figura 4A. Adicionalmente, se observó agrupaciones de células similares a las descritas por Messina y otros (Messina, De Angelis y otros 2004; Circulation Research 95(9): 911-21 ) y se muestran en la Figura 4B.

Expansión de la población hCTC (S): En este estudio, las células hCTC (S) se retiraron de los matraces para cultivo después del período de cultivo inicial de 2 días. Las células hCTC (S) se transfirieron a tubos cónicos de 50 mi. Las células hCTC (S) se centrifugaron a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó y la microesfera celular se resuspendió en 20 mi de medio de crecimiento fresco. Las células hCTC (S) se contaron después de la resuspensión. La cantidad total de células hCTC (S) obtenidas de la etapa de cultivo inicial fue de aproximadamente 10-14 millones de células en total. Una fracción de las células hCTC (S) se criopreservó en un medio de preservación a 1-1.5 millones/ml y se almacenó a -140 °C. El remanente se expandió en cultivo. Las células hCTC (S) se sembraron nuevamente en matraces a una densidad de siembra de 5,000 células/cm2. Después de 2 días en cultivo, las células hCTC (S) se volvieron adherentes y se formó una población celular adherente homogénea que en la presente descripción se denomina población hCTC (A2) o células hCTC (A2). Una vez que las células hCTC (A2) de la presente invención alcanzan una confluencia del 80 % a aproximadamente 10-14 días después de la siembra de hCTC (S), las células se tripsinizaron al aspirar el medio de crecimiento, se lavaron con 60 mi de PBS a temperatura ambiente y, después, se agregó 4 mi de tripsina-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA) en cada matraz. Las células hCTC (A2) se incubaron durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente hasta separar las células. En cada matraz se agregó 6 mi de medio de crecimiento y la suspensión celular se transfirió a un tubo cónico de 50 mi (BD Falcon, BD Biosciences, San José, CA). Un alícuota de 500 pL se retiró y se transfirió a un recipiente para muestras Vi-cell para el conteo con el uso del analizador de viabilidad celular Vi-Cell™ tal como se describe en el Ejemplo 1. Estas células se sembraron nuevamente a 5,000 células/cm2 o 3,000 células/cm2.

La expansión de las células hCTC (S) se realizó, además, con el uso de células criopreservadas. Un vial congelado de células S se descongeló a 37 °C y se lavó una vez con PBS. Después, las células se contaron y se sembraron a 5,000 células/cm2 en medio de crecimiento en matraces para cultivo. Todos los días se observó la expansión y la confluencia celular.

Por observación visual, las células hCTC (S) no adherentes se redujeron significativamente después de 2 días en cultivo y la cantidad de células hCTC (S) no adherentes no incrementó en cultivo en un periodo de 10-14 días. Las células hCTC (S) en cultivo empezaron a adherirse al matraz después de 2 días en cultivo y crecieron como células adherentes. Alcanzaron una confluencia del 80 % a los 10-14 días después de la siembra de las células hCTC (S). Aunque en cultivo aún se observó algunas células hCTC (S), la cantidad de esta población no adherente no incrementó en cultivo. Esto debido, posiblemente, al cambio en la morfología de células hCTC (S) no adherentes a células hCTC (A2) adherentes en cultivo. Dado que las células hCTC (S) se unieron al matraz después de 2 días, la cantidad de células no adherentes se redujo bastante y no se determinó.

En contraste, las células hCTC (A2) adherentes que se derivaron de las células hCTC (S) mostraron cierto potencial de crecimiento, hasta 10 PDL que se muestra en la Figura 5A. El índice de crecimiento de esta población estuvo entre 1-3 PDL/cambio de cultivo hasta alcanzar una meseta a 9-10 PDL, cuando las células hCTC (A2) se sembraron ya sea a 5,000 células/cm2 o a 3,000 células/cm2. Sin embargo, el cálculo de PDL se basa en la cantidad inicial de células sembradas en el cultivo (es decir, la cantidad de células hCTC (S)), es posible que el cálculo de PDL no sea exacto.

Expansión de la población hCTC (A1): Después de retirar el medio que contenía las células hCTC (S) de los matraces que contenían las células de la siembra inicial de dos días, se agregó 60 mi de medio de crecimiento fresco a las células adherentes restantes presentes en los matraces. Las células hCTC (A1) se cultivaron hasta que alcanzaron una confluencia del 80 %. Después de este tiempo, las células se tripsinizaron al aspirar el medio de crecimiento, se lavaron con 60 mi de PBS a temperatura ambiente y se agregó 4 mi de tripsina-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se incubaron durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente hasta separar las células. En cada matraz se agregó 6 mi de medio de crecimiento y la suspensión celular se transfirió a un tubo cónico de 50 mi (BD Falcon, BD Biosciences, San José, CA). Un alícuota de 500 pL se retiró y se transfirió a un recipiente para muestras Vi-cell para el conteo con el uso de un analizador de viabilidad celular Vi-Cell™. Después, una porción de las células se resuspendió con medio de criopreservación (FBS al 90 % y DMSO aM O %) y se guardó a 1-1.5 millones de células/ml y se almacenó a -140 °C. Las células restantes se expandieron al sembrar nuevamente los viales celulares congelados a 3,000 células/cm2. El medio usado se reemplazó tres días después de volver a sembrar y las células se cambiaron de cultivo en el día 7. Estas células se cambiaron de cultivo cada 7 días con reemplazo de medio en el día 3 con el uso de tripsinización.

Expansión de la población hCTC (A3): Un vial de hCTC (A1 ) y las células hCTC (S) de un vial se lavaron y, después, se combinaron en un tubo cónico de 50 mi (BD Falcon, BD Biosciences, San José, CA). Una mezcla ya sea de 5,000 células/cm2 o de 3,000 células/cm2 de la suspensión celular combinada se agregó en matraces T225 separados. Cada matraz se llenó con medio de crecimiento fresco hasta 60 mi por matraz y las células se incubaron a 37 °C, 02 atmosférico al 20 % durante 2 días. Después de este tiempo, la mayoría de las células formaron una población celular adherente que en la presente descripción se denomina población hCTC (A3) o células hCTC (A3). Una vez que las células alcanzaron una confluencia del 80 %, las células se cambiaron de cultivo por tripsinización y se sembraron nuevamente a una densidad de siembra de 5,000 células/cm2 o de 3,000 células/cm2 para identificar la densidad de siembra adecuada y se incubaron a 37 "C, O2 atmosférico al 20 %. Las células hCTC (A3) alcanzaron, típicamente, una confluencia del 80 % en 7 días después de la siembra. Las células hCTC (S) no adherentes se observaron visualmente a diario y se redujeron significativamente después de 2 días en cultivo, de tal manera que las células hCTC (A3) se convirtieron en una población homogénea de células. En promedio tardó aproximadamente 2 días. La población hCTC (A3) tuvo la capacidad de expenderse en una proporción de 1-3 PDL por cambio de cultivo. Cuando las células hCTC (A3) se sembraron a una densidad de 5,000 células/cm2, las células hCTC (A3) tuvieron la capacidad de alcanzar 9-10 PDL antes de alcanzar el envejecimiento. En contraste, cuando las células hCTC (A3) se sembraron a una densidad de 3,000 células/cm2, las células hCTC (A3) tuvieron la capacidad de alcanzar 24 PDL antes de alcanzar el envejecimiento. Véase la Figura 5B.

Caracterización de las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención: las células hCTC (A2) y las células hCTC (A3) mostraron un índice de crecimiento similar de 1-3 PDL en cada cambio de cultivo. Ambos grupos celulares requirieron aproximadamente 7 días para que las células alcanzaran una confluencia de 80-90 % para el cambio de cultivo. Las diferencias en el PDL total entre las dos poblaciones celulares pueden ser posiblemente debido al PDL inicial no calculado en las células hCTC (A2) al derivarse de la población celular hCTC (S).

No se observó ninguna diferencia en la expresión de los marcadores de la superficie celular o genes en todas las poblaciones de células derivadas de tejido cardíaco humano aisladas por los métodos de la presente invención. Las células hCTC (A1), hCTC (S), hCTC (A2) y hCTC (A3) no expresaron telomerasa. Véase la Tabla 1 para consultar la lista de genes expresados en las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención y las células progenitoras cardíacas en la materia. Todas las poblaciones celulares aisladas de conformidad con los métodos de la presente invención mostraron una expresión genética positiva de GATA4 y Nkx2.5. No se observó ninguna expresión o cadena pesada de miosina. El marcador de células madre c-kit se detectó por expresión génica en todas las poblaciones celulares de la presente invención. Véase la Tabla 8. Por citometría de flujo, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención fueron positivas para CD105 y CD90. Las células de la presente invención no expresaron CD31 , CD45 ni CD16. Véase la Tabla 8.

No se observó ninguna diferencia significativa en las características de las poblaciones de células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. La población hCTC (A3) se seleccionó para una caracterización adicional.

Ejemplo 3 Cultivo celular in vitro de células derivadas de tejido cardíaco humano La densidad celular y la hipoxia tienen efecto en el crecimiento celular (Tavaluc R y otros Cell Cycle 6:20, 2554-2562, 15 de octubre de 2007). El contacto célula-célula puede reducir el crecimiento celular potencial y la baja densidad de siembra puede reducir la posibilidad de contacto celular y mejora el crecimiento potencial. La hipoxia o baja tensión de 02 ha demostrado reducir la inhibición de contacto del crecimiento celular (Nonomura Y. y otros The Journal of Rheumatology, 1 de abril de 2009, vol. 36 núm. 4 698-705). En la invención actual, la densidad de siembra a 3,000 células/cm2 demostró más crecimiento potencial en comparación con la densidad de siembra a 5,000 células/cm2.

Para comparar el efecto de las concentraciones de 02 en el crecimiento celular, las células hCTC (A3) se sembraron a 3,000 células/cm2 después de cada cambio de cultivo en matraces T225. Las células se incubaron en una atmósfera ya sea de 02 al 20 % o de 02 al 5 %. En el día 3, el medio usado se reemplazó con 60 mi de medio de crecimiento fresco. En el día 7, las células hCTC (A3) se recolectaron de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 2. La cinética de crecimiento se determinó al examinar el PDL total acumulativo hasta observar el envejecimiento. La duración total del experimento fue mayor que 100 días, durante los cuales las células se cambiaron de cultivo 16-17 veces. Para las células hCTC (A3) cultivadas en condiciones normales de oxígeno (02 al 20 %), la curva de crecimiento alcanzó una meseta a PDL 24. Sin embargo, cuando las células hCTC (A3) a PDL 12 se cultivaron en condiciones con poco oxígeno (02 al 5 %), la curva de crecimiento alcanzó una meseta a PDL 28, tal como se muestra en la Figura 6.

Ejemplo 4 Aislamiento de células derivadas de tejido cardiaco de ratas Una rata Sprague-Dawley de 8-12 semanas de edad se anestesió con isofluorano y se abrió la cavidad abdominal. Los intestinos se removieron y la aorta se disecó. Una aguja calibre 27 se insertó en la vena cava torácica y el corazón se bombeó con 10 mi de PBS con heparina a 5 U/ml. Después, se realizó perfusión retrógrada del corazón a través de la aorta torácica al inyectar 10 mi de PBS con heparina a 5 U/ml. Se tuvo cuidado de asegurar que el corazón siguiera latiendo a lo largo del procedimiento. Después, el corazón entero se retiró de la cavidad torácica y se colocó en amortiguador helado de Hank. Cinco corazones de rata aislados se combinaron para la disociación y la digestión enzimática.

Después, los corazones de rata aislados se lavaron 2 veces con 20 mi de PBS a temperatura ambiente y el sobrenadante se desechó. Después, los corazones se trituraron manualmente con escalpelos quirúrgicos a temperatura ambiente y el tejido picado se colocó en tres tubos de 50 mi. Después, el tejido picado se lavó 3 veces con 25 mi de PBS y el tubo se invirtió cinco veces.

Los pedazos de tejido se transfirieron a tubos cónicos separados de 50 mi (Corning Inc., Corning, NY). El tejido en cada tubo se lavó 3 veces al agregar 30 mi de PBS a temperatura ambiente e invertir el tubo 5 veces. Después, el tubo se colocó verticalmente y se dejó que el tejido se asentara. El sobrenadante se aspiró con el uso de una pipeta de aspiración de 2 mi (BD Falcon, BD Biosciences, San José, CA). La base de cóctel de enzimas digestivas (2X) se agregó al tubo de 50 mi en una relación de enzima y tejido de 1 :1. La concentración final de las enzimas mezcladas fue de 1 U/ml de colagenasa y 5 U/ml de dispasa II. Los tubos con el tejido y las enzimas se transfirieron a un agitador orbital a 37 °C configurado para 225 rpm (Barnstead Lab, Melrose Park, IL) y se incubaron durante 2.5 horas. Después de la incubación, el tubo se transfirió de regreso a la cabina de bioseguridad. La suspensión celular se diluyó al llenar los tubos con PBS a temperatura ambiente. Para eliminar cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró por un colador de células de 20.3 cm (8 pulgadas) de diámetro de 100 µ?? (BD Falcon) y, después, por un colador de células de 40 pm (BD Falcon) y en seis tubos cónicos de 50 mi (BD Falcon). El tamaño del filtro para CTC de ratas fue menor que los usados para las células humanas debido a la diferencia de tamaño de los miocitos entre ratas y humanos. Después, la suspensión celular se lavó por centrifugación a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente con el uso de una centrifugadora Sorvall Legend T (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) para comprimir las células. El sobrenadante se aspiró y las microesferas celulares se resuspendieron en medio de crecimiento y se agruparon en un tubo de 50 mi en 20 mi de medio de crecimiento y se tomó una muestra para determinar la producción celular. Las producciones típicas obtenidas fueron de 10 millones de células por corazón, con una viabilidad del 70 %.

En la preparación de células derivadas de tejido cardíaco de rata se usó bases de colagenasa a 0.1 U/ml o a 1 U/ml para digerir el tejido cardiaco. Después de la incubación de 3 horas se agregó 20 mi de medio de crecimiento en cada tubo, tal como se describe en el Ejemplo 1. Sin embargo, el tejido cardíaco de ratas digerido con colagenasa a 0.1 U/ml no produjo ninguna célula.

La suspensión celular obtenida de la disociación y digestión enzimática del tejido cardiaco se sembró en matraces para cultivo de tejidos T225 (Corning Inc., Corning, NY) al transferir 10 mi en cada matraz. En cada matraz se agregó 35 mi de medio de crecimiento (DMEM, D-glucosa a 1 ,000 mg/l, L-glutamina a 584 mg/l y piruvato sódico a 1 10 mg/l, suero fetal bovino al 10 %, penicilina a 50 U/ml, estreptomicina a 50 pg/ml, Invitrogen, Calsbald, CA) para obtener un volumen final dentro de cada matraz de 45 mi. El cultivo celular inicial estuvo durante dos días a 37 °C en una atmósfera de 02 al 20 % y C02 al 5 %. Después del cultivo inicial de dos días, las células rCTC (S) no adherentes se eliminaron y se transfirieron a tubos cónicos de 50 mi y se centrifugaron a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó y la microesfera celular se resuspendió en 20 mi de medio de crecimiento. Las células se contaron y se sembraron nuevamente en matraces T225 a una densidad de siembra de 5,000 células/cm2. Las células rCTC (S) se cultivaron en medio de crecimiento. Después de dos días más en cultivo, se observó que las células rCTC (S) se volvieron adherentes. La población celular adherente que se formó de las células rCTC (S) qué se volvieron adherentes se denominó población de células rCTC (A2) o células rCTC (A2).

Las células rCTC (A2) se recolectaron y se cambiaron de cultivo en el día 7 por tripsinización, de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 2. Las células rCTC (A2) se sembraron a una densidad de 5,000 células/cm2, en matraces T225, con 45 mi de medio de crecimiento en cada matraz. Las células se cambiaron de cultivo cuando las células alcanzaron aproximadamente 80 %. La curva de crecimiento de las células rCTC (A2) observada se muestra en la Figura 7.

Ejemplo 5 Aislamiento de células derivadas de tejido cardiaco de ratón que expresan GFP Cinco ratones F B . Cg-Tg ( ACTB- EGFP)B5Nagy/J (ratones GFP, Jackson Lab, Bar Harbor, Maine) de 8-12 semanas de edad se anestesiaron con isofluorano y se abrió la cavidad abdominal. Los intestinos se removieron y la aorta se disecó. Una aguja calibre 27 se insertó en la vena cava torácica y el corazón se bombeó con 10 mi de PBS con heparina a 5 U/ml. Después, se realizó perfusión retrógrada del corazón a través de la aorta torácica al inyectar 10 mi de PBS con heparina a 5 U/ml. Se tuvo cuidado de asegurar que el corazón siguiera latiendo a lo largo del procedimiento. Después, el corazón entero se retiró de la cavidad torácica y se colocó en amortiguador helado de Hank.

Cinco corazones de ratones GFP aislados se combinaron para la disociación y la digestión enzimática. Después, los corazones de ratones aislados se lavaron 2 veces con 20 mi de PBS a temperatura ambiente y el sobrenadante se desechó. Después, los corazones se picaron manualmente con escalpelos quirúrgicos a temperatura ambiente y el tejido picado se colocó en tres tubos de 50 mi. Después, el tejido picado se lavó 3 veces con 25 mi de PBS y el tubo se invirtió cinco veces. Los pedazos de tejido se transfirieron a tubos cónicos separados de 50 mi (Corning Inc., Corning, NY). El tejido en cada tubo se lavó 3 veces al agregar 30 mi de PBS a temperatura ambiente e invertir el tubo 5 veces. Después, el tubo se colocó verticalmente y se dejó que el tejido se asentara. El sobrenadante se aspiró con el uso de una pipeta de aspiración de 2 mi (BD Falcon, BD Biosciences, San José, CA). La base de cóctel de enzimas digestivas (2X) se agregó al tubo de 50 mi en una relación de enzima y tejido de 1 :1. La concentración final de las enzimas mezcladas fue de 1 U/ml de colagenasa y 5 U/ml de dispasa II. Los tubos con el tejido y las enzimas se transfirieron a un agitador orbital a 37 °C configurado para 225 rpm (Barnstead Lab, Melrose Park, IL) y se incubaron durante 2.5 horas. Después de la incubación el tubo se transfirió de regreso a la cabina de bioseguridad. La suspensión celular se diluyó al llenar los tubos con PBS a temperatura ambiente. Para eliminar cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró por un colador de células de 20.3 cm (8 pulgadas) de diámetro de 100 pm (BD Falcon) y, después, por un colador de células de 40 µ?t? (BD Falcon) y en 6 tubos cónicos de 50 mi (BD Falcon). El tamaño del filtro para CTC de ratas fue menor que los usados para las células humanas debido a la diferencia de tamaño de los miocitos entre ratas y humanos. Después, la suspensión celular se lavó por centrifugación a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente con el uso de una centrifugadora Sorvall Legend T (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) para comprimir las células. El sobrenadante se aspiró y las microesferas celulares se resuspendieron en medio de crecimiento y se agruparon en un tubo de 50 mi en 20 mi de medio de crecimiento y se tomó una muestra para determinar la producción celular. Las producciones típicas obtenidas fueron de 10 millones de células por corazón, con una viabilidad del 70 %.

Después de la incubación de 3 horas, se agregó 20 mi de medio de crecimiento en cada uno de los tubos, tal como se describe en el Ejemplo 4. Para eliminar cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró por un colador de células de 20.3 cm (8 pulgadas) de diámetro de 100 pm (BD Falcon) y, después, por un colador de células de 40 pm (BD Falcon) y en seis tubos cónicos de 50 mi (BD Falcon). Después, la suspensión celular se lavó por centrifugación a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente con el uso de una centrifugadora Sorvall Legend T (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) para comprimir las células. El sobrenadante se aspiró y las microesferas celulares se resuspendieron en medio de crecimiento y se agruparon en un tubo de 50 mi en 20 mi de medio de crecimiento y se tomó una muestra para determinar la producción celular. Las producciones típicas obtenidas fueron de 10 millones de células por corazón con una viabilidad del 70 %, en base a 2 aislamientos. La población mCTC (A2) se usó en estudios posteriores. Las células se expandieron durante dos cambios de cultivo antes del estudio.

Ejemplo 6 Criopreservación. viabilidad y recuperación celular Las células derivadas de tejido cardiaco humano y de ratas de la presente invención se prepararon para criopreservación. En resumen, las células ya sea de hCTC (A3) o de las poblaciones rCTC (A2) se obtuvieron al expander las células hCTC (A3) y rCTC (A2) criopreservadas en cambios tempranos de cultivo. Las células se sembraron a 3,000 células/cm2, se incubaron a 37 °C, bajo O2 atmosférico al 20 % y se cambiaron de cultivo 7 días después en cultivo con sustitución del medio en el día 3 en cultivo. Se recolectaron a 12-14 PDL.

Las células se tripsinizaron y se resuspendieron para la criopreservación en CRYOSTOR D-LITE™ (Biolife Solutions, Inc, Bothell, WA) que contiene DMSO al 2 %, se cnopreservaron en 2 mi de polipropileno Nalgene de crioviales estériles con rosca interna con tapa de rosca (Nalgne Nunc, Rochester, NY), con el uso de un congelador programable Integra 750 Plus (Planer, Middlesex, Inglaterra) con el programa DeltaT. Las células y soluciones estaban a temperatura ambiente antes de colocarlas en el congelador programable que se mantuvo a 15 °C. Una sonda de temperatura de muestra se colocó en un vial de amortiguador congelante. El siguiente programa se usó para la criopreservación: Etapa núm. Indice (°C/min) Disparador de la temp. final (°C) Activador 1 -1 -6 Muestra 2 -25 -65 Cámara 3 +10 -19 Cámara 4 +2.16 -14 Cámara 5 -1 -100 Cámara 6 -10 -140 Cámara Cuando la temperatura alcanzó -140 °C, las muestras se transfirieron a un tanque de nitrógeno liquido para almacenamiento.

Viabilidad y recuperación de las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención después de la criopreservación: después del almacenamiento durante un mes en el tanque de nitrógeno líquido (-140 °C), un vial de células hCTC (A3) en CRYOSTOR D-LITE™ a 1 millones de células/vial se descongeló a temperatura ambiente. Después, el vial se transfirió a la cabina de bioseguridad. Una muestra de 50 pL (que contiene 0.5 millones de células) se transfirió a un tubo microcentrifugador de 1.8 mi que contiene 50 pL de solución de azul tripán. Se realizó conteos duplicados de esta preparación celular al transferir 10 pL en un hemaciómetro y se contaron. Estos conteos determinaron la recuperación to antes del paso de la aguja y la viabilidad. Para determinar la viabilidad y recuperación celular después del paso de la aguja sin incubación a temperatura ambiente (t0 después del paso de la aguja), se extrajo 100 pL de suspensión celular en una jeringa de tuberculina de 1 mi (BD cat. núm. 309602) a través de una aguja calibre 30 (BD cat. núm. 305106). Después, la muestra se cambió de cultivo nuevamente a través de la aguja y hacia un tubo microcentrifugador de 1.8 mi. A este tubo se agregó 100 pL de azul tripán y se realizó conteos duplicados, tal como se describió anteriormente. Este procedimiento se realizó después de tiempos de incubación de 10 min, 20 min y 30 min a temperatura ambiente y, además, a los 30 minutos sin ningún paso a través de la aguja.

Después de un almacenamiento de un mes se determinó una viabilidad de las células hCTC (A3) del 94 % después del descongelamiento. La recuperación de células fue de 0.54 millones, similar a la cantidad de células original antes de la criopreservación, tal como se muestra en la Tabla 3 y en la Figura 8.

La viabilidad de las células derivadas de tejido cardiaco humano evaluada después de pasar a través de una aguja de administración de calibre 30 fue mayor que 90 % después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, que es el tiempo requerido para la administración celular durante el procedimiento de infarto de ratas. La recuperación fue similar a la cantidad de células antes del paso de la aguja, tal como se muestra en la Tabla 3 y la Figura 8.

Las células hCTC (A3) se expandieron hasta PDL 12 y se almacenaron para estudios in vivo posteriores. Las muestras de las células almacenadas se examinaron para detectar cualquier anomalía de cariotipo. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

Biocompatibilidad de CTC de ratas: un vial de células rCTC (A2) en CRYOSTOR D-LITE™ a 2 millones de células/vial se descongeló tal como se describió anteriormente. Después, el vial se transfirió a la cabina de bioseguridad. Una muestra de 50 pL se transfirió a un tubo microcentrifugador de 1.8 mi que contiene 50 L de solución de azul tripán. Se realizó conteos triplicados de esta preparación celular al transferir 10 L en un hemaciómetro y se contaron. Para determinar los valores iniciales para la producción y viabilidad celular después del paso de la aguja se realizó conteos de células antes del paso de la aguja y después del paso de la aguja con un tiempo de incubación de 0, 10, 20 y 30 min. En cada momento especifico se atrajo 100 µ? de suspensión celular en una jeringa de tuberculina de 1 mi (BD cat. núm. 309602) a través de una aguja calibre 30 (BD cat. núm. 305106).

Después, la muestra se cambió de cultivo nuevamente a través de la aguja y hacia un tubo microcentrifugador de 1.8 mi. A este tubo se agregó 100 ml_ de azul tripán y se realizó conteos triplicados, tal como se describió anteriormente. Este procedimiento se realizó después de los tiempos de incubación de 10 min, 20 min y 30 min a temperatura ambiente para simular el procedimiento potencial de la administración de células en el modelo de infarto miocárdico agudo de ratas.

Después de un almacenamiento de un mes en nitrógeno líquido, la viabilidad de las células rCTC (A2) después del descongelamiento fue de 94 %. La recuperación de células fue de 1.4 millones/ml, aproximadamente 70 % de la concentración celular original (2 millones/ml). La viabilidad de células rCTC (A2) después de pasar a través de la aguja de inyección fue mayor que 90 % después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, que es el tiempo requerido para la inyección durante el procedimiento de infarto de ratas. La recuperación fue similar a la cantidad antes del paso de la aguja, tal como se muestra en la Tabla 5 y la Figura 9.

Ejemplo 7 Caracterización de las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención La expresión de las proteínas de la superficie celular se determinó en poblaciones de células derivadas de tejido cardiaco y se obtuvo por los métodos de la presente invención a partir de tejido cardíaco humano y de ratas. Los marcadores de la superficie celular evaluados se muestran en la Tabla 6. Las poblaciones de fibroblastos dérmicos humanos se incluyeron como control.

Más del 90 % de la población de células hCTC (A3) expresó CD59, CD105, CD54 y CD90 (analizados por separado). Aproximadamente 30 % de la población de células hCTC (A3) expresó CD34, un marcador de células madre para las células progenitoras endoteliales. Además, aproximadamente 30 % de hCTC (A3) mostró c-Kit positivo. En contraste, menos del 5 % de la población de células hCTC (A3) expresó ya sea CD31 , CD45 o CD16. Véase las Figuras 10, 11 y la Tabla 7. Las poblaciones de células hCTC (A1), hCTC (A1) y hCTC (S) mostraron, además, expresión similar a los marcadores de la superficie celular. Véase la Tabla 8. Además, se observó resultados similares a la población de células rCTC (A3). Véase la Figura 12. CD54, la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM), se une a las integrinas en los leucocitos y regula la transmigración de leucocitos a través de la barrera vascular hacia los tejidos (Yang L y otros Blood 106 (2): 584-92, julio de 2005). Por lo tanto, la expresión de la superficie celular de esta molécula puede facilitar la traslocación de hCTC (A3) desde la vasculatura hacia el miocardio cuando se administra en la arteria coronaria.

Ejemplo 8 Análisis de la expresión génica de las células derivadas de tejido cardíaco Se recolectó muestras de ARN de las poblaciones de células derivadas de tejido cardíaco: hCTC (A1), hCTC (A2), hCTC (A3), rCTC (A2) y mCTC (A2) (se recolectó el ARN de un millón de células de cada población celular).

La expresión de un grupo de genes se determinó por medio de PCR en tiempo real en las muestras recolectadas. La reacción PCR en tiempo real se inició de conformidad con la mezcla de reacción que se define en la Tabla 9 y los iniciadores para los genes evaluados se muestran en la Tabla 10. Se examinó dos categorías de genes: genes específicos cardíacos y genes de células madre. Los genes específicos cardíacos se separaron, adicionalmente, en marcadores diferenciados, tales como cadena pesada de miosina (MyHC) y marcadores cardiacos indiferenciados, tales como GATA-4 y Nkx2.5. Los genes de células madre se categorizaron, adicionalmente, como marcador de células madre, c-kit; marcador cardíaco embrionario islet-1 y marcador de división celular, telomerasa. Un gen de mantenimiento, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), se usó como punto de referencia para normalizar los niveles de expresión en cada muestra.

Se descubrió que la expresión de los genes evaluados era similar en las poblaciones hCTC (A1), hCTC (A2) y hCTC (A3). Véase la Tabla 10. Se expresó el marcador de células madre c-kit (Ct: 27-29), mientras que la expresión de telomerasa y de islet-1 no fue detectable en las poblaciones hCTC (A1), hCTC (A2) y hCTC (A3): No se detectó ningún mensaje para los genes a un valor Ct de 40. Los marcadores cardiacos GATA 4 y Nkx2.5 se expresaron a un valor CT de 25 y 32-34, respectivamente, en las poblaciones hCTC (A1), hCTC (A2) y hCTC (A3), mientras que no se observó ninguna expresión de la cadena pesada de miosina ni de la actina cardíaca en cualquiera de las poblaciones hCTC (A1), hCTC (A2) y hCTC (A3). Véase la Tabla 10.

Estos datos sugieren que las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención son "similares a las progenitoras", particularmente, que la relación del marcador de las células progenitoras y la expresión de los marcadores celulares era mayor que 50,000 en las poblaciones hCTC (A1 ), hCTC (A2) y hCTC (A3), en comparación con los cardiomiocitos (1 %) y los fibroblastos humanos (12 %). Véase la Tabla 10, la Tabla 11 y la Figura 13.

Las células rCTC (A2) expresaron, además, genes del linaje cardíaco, tales como GATA-4 (Ct: 28) y Nkx2.5 (Ct: 27). Sin embargo, a diferencia de las células derivadas de tejido cardíaco humano, la expresión de Nkx2.5 fue a un nivel mayor en células derivadas de tejido cardíaco de ratas que la expresión observada en las células derivadas de tejido cardiaco humano. Los marcadores c-kit, lslet-1 y telomerasa se expresaron, además, en las células rCTC (A2). Véase la Tabla 12. Las células derivadas de tejido cardíaco similares obtenidas del corazón de rata, células derivadas de tejido cardíaco de ratones expresaron, además, Nkx2.5, c-kit, lslet-1 y telomerasa. Véase la Tabla 13.

Ejemplo 9 Las células derivadas de tejido cardiaco pueden diferenciarse en cardiomiocitos Las células mCTC (A2) (200K) obtenidas de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 5 se cultivaron, primero, en medio de crecimiento durante 2 días y, después, se recolectaron por tripsinización y se contaron antes de mezclarlas con cardiomiocitos de rata (1 millón, catálogo núm. R357, Cell Application, Inc. Austin TX) a una relación de 1:5. Los cardiomiocitos de rata estuvieron en cultivo durante 5 días antes de la tripsinización y se contaron, después, se mezclaron con las células mCTC (A2). La mezcla de células se sembró en una placa de 6 pocilios tratada con laminina (catálogo núm. 354595 BD Biosciences, NJ) durante 5 días. La capacidad de las células mCTC (A2) para diferenciarse se analizó al incubar la mezcla de células en medio de cultivo de tejidos que comprende DMEM-F12(1:1) +suero equino al 10 % (Sigma), de aquí en adelante denominado medio de diferenciación. Las células se incubaron en medio de diferenciación durante 5 días en una atmósfera de 02 al 20 %, a 37 °C. Después de este tiempo, se recolectaron las células y se extrajo el ARN. El ARN total a partir de los cocultivos de células mCTC (A2) y los cardiomiocitos de rata y a partir de los cultivos paralelos de células mCTC (A2) se evaluó para analizar la expresión génica de la cadena pesada de miosina de murinos. Se usó los siguientes iniciadores de la cadena pesada de miosina de murinos: Tipo Nombre Secuencia Iniciador directo MHC-ratón-F GAAACACCTGAAGAATTCTCAAGCT Iniciador inverso HC-ratón-R TTGGCATGGACAGCATCATC Sonda HC-ratón-P ACTTGAAGGACACCCAGC El cocultivo de células mCTC (A2) con cardiomiocitos de rata produjo un incremento de 9 veces en la expresión de la cadena pesada de miosina de murinos, en comparación con los cultivos paralelos de células mCTC (A2) solos. Véase la Figura 14. Estos datos sugieren que las células derivadas del tejido cardíaco de la presente invención tienen la capacidad de diferenciarse en cardiomiocitos y el cocultivo de las células de la presente invención con cardiomiocitos puede mejorar la diferenciación.

Ejemplo 10 Aislamiento, expansión y caracterización de células derivadas de tejido cardíaco porcino Se obtuvo un solo corazón de un cerdo miniatura Góttingen de 8- 12 semanas de edad en cada aislamiento de Marshall Bioresources (North Rose, NY). El corazón se bombeó para vaciar la sangre antes de la recolección y el órgano entero se sumergió en DMEM + FBS al 10 % en hielo durante el envío. El tiempo desde la adquisición hasta la digestión tisular estuvo entre 48-96 horas. Se realizó cuatro aislamientos separados de conformidad con los procedimientos descritos a continuación.

Los corazones se cortaron en pedazos pequeños (de aproximadamente 2 a 3 cm3 de tamaño). Estos pedazos de tejido se homogeneizaron por medio de homogeneización mecánica, tal como se describe en el Ejemplo 1 para producir fragmentos de tejido cardiaco de menos de 1 mm3 de tamaño y, después, se transfirieron a un tubo cónico de 250 mi (Corning Inc., Corning, NY) y se lavaron tres veces. La base de cóctel de enzimas digestivas (2X) se agregó al tubo de 250 mi en una relación de enzima y tejido de 1 :1. La concentración final de las enzimas fue 1 U/ml de colagenasa y 5 U/ml de dispasa II. Los tubos con el tejido y las enzimas se transfirieron a un agitador orbital a 37 °C configurado para 225 rpm (Barnstead Lab, Melrose Park, IL) y se incubaron durante 2.5 horas. Después de la incubación, para remover cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró a través de un tamiz de prueba estándar de 20.3 cm (8 pulgadas) de diámetro de 250 pm para eliminar el tejido conectivo y el tejido adiposo no digerido (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y, después, se filtraron, además, a través de coladores de células de 100 pm para eliminar cardiomiocitos (BD Falcon). El medio, que contiene las células que pasaron a través del filtro, se transfirió a múltiples tubos cónicos de 50 mi (BD Falcon). Después, se lavó la suspensión celular. Después del lavado, la microesfera se resuspendió en 20 mi de amortiguador de lisis ACK (Lonza, Walkersville, MD) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para lisar cualquier glóbulo rojo restante. Después de la incubación, la suspensión celular se lavó dos veces más con 40 mi de PBS a temperatura ambiente. Después de la centrifugación final, las microesferas se resuspendieron en 20 mi de medio de crecimiento a temperatura ambiente y se contaron. Después de la disociación y la digestión enzimática, la producción de células fue, típicamente, de 27 millones de células en un volumen de 20 mi. La viabilidad fue, típicamente, de 80 %.

La suspensión celular obtenida de la disociación y digestión enzimática se agregó en matraces para cultivo de tejidos T225 (Corning Inc., Corning, NY). En cada matraz que contenía 50 mi de medio de crecimiento (D EM, D-glucosa a 1 ,000 mg/l, L-glutamina a 584 mg/l y piruvato sódico a 1 10 mg/l, suero fetal bovino al 10 %, penicilina a 50 U/ml, estreptomicina a 50 pg/ml, Invitrogen, Calsbald, CA) se agregó 10 mi de la suspensión celular. El volumen final del cultivo inicial fue de 60 mi. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera que comprende 02 al 20 % y C02 al 5 % durante 2 días. Después de este período se observó un cultivo celular heterogéneo. Se observó células no adherentes que fase brillante (en la presente descripción denominadas células pCTC (S)) y células adherentes (en la presente descripción denominadas células pCTC (A1)).

La disociación y la digestión enzimática de corazón porcino de conformidad con los métodos de la presente invención y expansión posterior de las células produjeron las siguientes poblaciones celulares: células pCTC (S), pCTC (A1), pCTC (A2) y pCTC (A3). La morfología de las células derivadas de tejido cardíaco porcino de la presente invención fue similar a la de las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención. La población pCTC (A3) se seleccionó para caracterización adicional y estudios in vivo posteriores.

Las células pCTC (S) y las células pCTC (A1) se expandieron inicialmente en cultivo como una mezcla en matraces T225. Cada matraz se llenó con medio de crecimiento fresco hasta 60 mi por matraz y las células se incubaron a 37 °C, 02 al 20 % durante 2 días. Después de este tiempo, la mayoría de las células formó una población celular adherente que en la presente descripción se denomina población pCTC (A3) o células pCTC (A3). Después de 2 días en cultivo, por observación visual, la cantidad de células no adherentes se redujo, de tal manera que las células pCTC (A3) se convirtieron en una población homogénea de células. En promedio, esto tomó 2 días. Las células pCTC (A3) se cambiaron de cultivo una vez que las células alcanzaron una confluencia del 90-100 % y se sembraron nuevamente a 3000 células/cm2. La expansión de células pCTC (A3) en cultivo excedió el crecimiento de las células derivadas de tejido cardíaco humano. Las células pCTC (A3) crecieron hasta una confluencia del 90 % en 3-4 días. Véase la Figura 15 para consultar la curva de crecimiento observada para las células pCTC (A3) de la presente invención.

Las células pCTC (A3) no expresaron telomerasa ni cadena pesada de miosina, según la PCR en tiempo real. Sin embargo, las células pCTC (A3) expresaron GATA-4. La expresión de Nkx2.5 no se examinó en las células derivadas de tejido cardíaco porcino de la presente invención. Una sola tinción de los marcadores de la superficie celular demostró que más del 90 % de la población de células pCTC (A3) fue positiva para la expresión de CD105 y CD90. Menos del 5 % de las células pCTC (A3) expresó ya sea CD45, CD16 o marcador celular endotelial porcino (catálogo núm. MCA1752, Serotec). Este marcador es una molécula del complejo de histocompatibilidad clase II que se ha identificado en endotelio capilar en una amplia variedad de tejidos, mostrado por Wilson y otros (Immunology, mayo de 1996; 88(1 ):98-103). Véase la Figura 16 y la Tabla 14. Otras poblaciones celulares, tales como las células pCTC (A1) o pCTC (A2) no se examinaron.

Ejemplo 11 Tratamiento de infarto miocárdico agudo con las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención Modelo de infarto miocárdico agudo de ratas: El modelo de infarto miocárdico de ratas se ha usado éxitosamente para analizar la eficacia de agentes, tales como ACEI y beta-bloqueadores como terapias para el AMI humano. En todas las etapas del experimento, los animales se evaluaron de conformidad con los lineamientos institucionales locales.

El modelo de infarto miocárdico de ratas está bien establecido para simular la patofisiología humana después del infarto miocárdico y el deterioro adicional de la función cardiaca después del infarto (Pfeffer M. A. y otros Circ Res 1979; 44: 503-12; Litwin S. E. y otros Circulation 1994; 89: 345-54; Hodsman G. P. y otros Circulation 1988; 78: 376-81).

Se anestesió ratas hembra sin pelo (peso de 250 a 300 g; Shizuoka Agricultural Cooperation Association, Shizuoka, Japón) con ketamina y xilazina (de 60 y 10 mg/kg de IP, respectivamente) y se aplicó respiración con presión positiva a través de un tubo endotraqueal. Se abrió el tórax en el cuarto espacio intercostal izquierdo, se exteriorizó el corazón y se hizo una incisión en el pericardio. Después de eso, el corazón se sostuvo con fórceps y se hizo una sutura en bucle con prolina 6-0 por debajo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda, aproximadamente a 2 mm de su origen. Se indujo un AMI en el corazón al jalar la ligadura para obstruir la arteria permanentemente. Se comprobó visualmente la decoloración del miocardio infartado. Se inyectó una suspensión de células derivadas de tejido cardiaco o el vehículo en la zona limite del área decolorada, aproximadamente 20 minutos después de la inducción del infarto, tal como se describió anteriormente en la administración de células. Después de la inyección se cerró el tórax y las ratas se transfirieron a sus jaulas. Las ratas fueron sacrificadas por excisión del corazón bajo efectos de anestesia al cumplirse el periodo especificado para cada una antes de la cirugía.

Se descongeló en hielo las poblaciones criopreservadas de células hCTC (A3) y rCTC (A2) que estaban almacenadas a -80 °C y se determinó su viabilidad antes de administrarlas a los animales del estudio. La viabilidad celular era mayor que 95 % en todas las poblaciones celulares usadas en esta investigación.

Las células se administraron a los animales del estudio 20 minutos después de ligar la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Se inyectó poblaciones criopreservadas de células hCTC (A3) en la zona límite del área decolorada. Los animales del estudio recibieron una de las siguientes dosis objetivo en 120 µ? de Cryostor D-lite (15 animales por dosis objetivo): células 1x104 (dosis baja), células 1x105 (dosis intermedia) o células 1x106 (dosis alta). Paralelamente, se inyectó poblaciones criopreservadas de células rCTC (A2) en la zona límite del área decolorada. Los animales del estudio recibieron una de las siguientes dosis objetivo en 120 µ? de Cryostor D-lite (15 animales por dosis objetivo): células 1x106.

En todos los animales del estudio las células criopreservadas se encontraban en un volumen total de 120 µ? de medio de criopreservación. Se inyectó las células de una dosis objetivo en cinco lugares separados alrededor del área decolorada del corazón. Un grupo control que recibió una inyección de medio de criopreservación (120 µ?) se incluyó, además, en el estudio.

Se hizo una ecocardiografía transtoráxica (SONOS 5500, Philips Medical Systems) para evaluar la función del ventrículo izquierdo (LV) en el día 5 y en el día 28 después de la inducción del AMI. Las ratas fueron anestesiadas con ketamina y xilazina mientras se realizó la ecocardiografía. Se determinó las dimensiones del ventrículo izquierdo al final de la diástole y al final de la sístole (LVEDD y LVESD, respectivamente) y el acortamiento fraccional (AF) a nivel de la mitad de los músculos papilares. El AF refleja el efecto de bombeo del corazón al medir la diferencia porcentual entre el diámetro sistólico (final de la contracción) y el diámetro diastólico (final de llenado). Se evaluó el puntaje de movimiento regional de la pared (RWMS) de conformidad con los criterios publicados: Puntaje 1 : movimiento normal de la pared y engrosamiento; Puntaje 2: movimiento disminuido de la pared y engrosamiento; Puntaje 3: ausencia de movimiento de la pared y engrosamiento; Puntaje 4: movimiento hacia afuera o abombamiento. (Véase, por ejemplo, Schiller, Shah y otros (Journal of American Society of Echocardiography vol 2: 358-367; 1989)).

En resumen, se obtuvo 17 imágenes ecocardiográficas seccionales y a cada sección se le asignó un puntaje de movimiento de la pared en base a las definiciones de la Tabla 15. Se usó una suma del puntaje del total de los 17 segmentos como el indicador de la contractibilidad de la pared. El RWMS es una medida directa de la contracción. Una reducción en el RWMS indica una mejoría en la contracción y refleja una mejoría en la función del músculo cardíaco. La Tabla 15 describe los criterios de cada puntaje.

La tasa de mortalidad observada en el estudio fue de 16 %. No hubo ninguna diferencia significativa en la mortalidad entre los grupos, tal como se muestra en la Tabla 16.

Resultados La Figura 17 reproducida del Atlas of Heart Failure de Pffeffer y otros (1999) demuestra los cambios patológicos que se observan en el corazón después de un infarto. Se estableció el modelo de infarto miocárdico agudo de rata para simular AMI y falla cardiaca crónica en pacientes humanos. Después del infarto, al igual que en los humanos, el ventrículo sufre una serie de alteraciones fisiopatológicas que inicia con el reemplazo de miocardio por tejido fibrótico en el área del infarto. La contracción y la presión en el ventrículo causa la extensión del infarto, la expansión gradual de la cámara ventricular y produce, finalmente, una remodelación del ventrículo izquierdo que se demuestra por el cambio de la geometría de la cámara, de elíptica a globular, y los cambios celulares como hipertrofia de los miocitos.

Las poblaciones criopreservadas de células hCTC (A3) mejoraron la función cardíaca global y la contractilidad cardíaca, como lo determinó el acortamiento fraccional (AF) y el puntaje del movimiento regional de la pared (RWMS), respectivamente. Se observó mejorías en la función cardíaca global y en la contractilidad cardíaca con todas las dosis objetivo de células hCTC (A3). Véase las Figuras 18 y 19.

A los 5 días después de la administración, los animales que recibieron células rCTC (A2) o la dosis objetivo de células hCTC (A3) 1x 106 demostraron un AF del 3.3 % (hCTC (A3)) y del 3.8 % (rCTC (A2)) menor que el de los animales tratados con vehículo. A las 4 semanas después de la administración de células, mejoró el valor absoluto del acortamiento fraccional (calculado al sustraer el valor del AF observado en el día 5 del valor del AF observado en el día 28). Véase la Figura 18 y las Tablas 17 y 18. El valor absoluto del AF en los animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3) fue 9.687 ± 1.329 % (n= 12, P menor que 0.001). El valor absoluto del AF en los animales tratados con 1 x 105 células hCTC (A3) fue 10.9 ± 1.6 % (n=11 , P<0.001). El valor absoluto del AF en los animales tratados con 1 x 106 células hCTC (A3) fue 12.9 ± 1.8 % (n=10, P menor que 0.001). Varias razones posibles pueden explicar la ineficacia de las células rCTC del modelo experimental que se usó en la presente invención. Aunque las ratas sin pelo están inmunocomprometidas, no se eliminó completamente su rechazo de las células foráneas. En el presente estudio, las rCTC pueden ser más susceptibles que las células humanas al rechazo inmunológico de las ratas sin pelo. Su retención en el miocardio comprometido debido al rechazo inmunológico y, por lo tanto, su efecto en el miocardio puede estar afectado.

Se observó una reducción en el RWMS en animales tratados con células hCTC (A3), 4 semanas después de la administración de células. El puntaje RWMS de los animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3) fue 24.42 ± 1.4 a las 4 semanas después del infarto y de la administración de células, pero se redujo a 21.08 ± 1.7 (n= 12, P menor que 0.001) a las 4 semanas después del infarto y de la administración de las células. El puntaje RWMS de los animales tratados con 1 x 105 células hCTC (A3) fue 25.58 ± 1.4 a los 5 días después del infarto y de la administración de las células y se redujo a 21.08 ± 1.9 (n=11 , P menor que 0.001). El puntaje RWMS de los animales tratados con 1 x 106 células hCTC (A3) fue 25.91 ± 1.6 a los 5 días después del infarto y de la administración de las células y se redujo a 20 ± 1.7 (n=10, P menor que 0.001) a las 4 semanas después del infarto y de la administración de las células. Mientras que el tratamiento con rCTC (A2) no parece haber reducido el acortamiento fraccional, se observó una pequeña reducción del RWMS. El puntaje RWMS de los animales tratados con 1 x 106 células rCTC (A2) fue 25.29 ± 1.9 a los 5 días después del infarto y de la administración de las células y se redujo a 23.86 ± 2.3 (n=12, P=0.09) a las 4 semanas después de la administración de las células. Véase la Figura 19 y las Tablas 17 y 19. Los datos observados en los animales tratados con rCTC (A2) sugieren que si bien las células rCTC (A2) no mejoraron la función global, si mejoraron la contractilidad cardíaca, tal como lo muestra el RWMS.

Por otra parte, los datos observados en animales tratados con células hCTC (A3) sugieren que las células derivadas de tejido cardíaco humano mejoraron la función cardíaca global y la contractilidad cardiaca.

Se evitó, además, la remodelación cardíaca en los animales que recibieron células hCTC (A3). La remodelación cardiaca se refiere a los cambios en el tamaño, forma y función del corazón que se observan después de lesiones isquémicas tales como, por ejemplo, infarto miocárdicó. Los cambios observados incluyen la muerte de células miocárdicas y un adelgazamiento desproporcionado de la pared de la cámara en la zona de infarto. La delgada pared de la cámara es incapaz de soportar la carga de presión y de volumen del corazón. Como resultado hay una dilatación de la cámara que se origina en la región del infarto que se extiende hacia el músculo cardíaco no infartado que lo compensa. Con el tiempo, mientras el corazón sufre una dilatación continua, el ventrículo aumenta de tamaño y adquiere una forma más elíptica y menos esférica, tal como lo demuestra el aumento en las dimensiones en la ecocardiografía. El aumento de la masa y el volumen ventricular afecta negativamente la función cardíaca aún más. El volumen aumentado al final de la diástole sobrepasa, eventualmente, la capacidad del corazón de relajarse entre contracciones, lo que resulta en una mayor disminución de la función. La gravedad de la dilatación del ventrículo determina el pronóstico del paciente. La dilatación de la cámara se correlaciona con una expectativa de vida disminuida en los pacientes con falla cardíaca.

El grado de remodelación cardíaca del ventrículo izquierdo de animales después de la inducción de un infarto miocárdico agudo se determinó al medir la dimensión del ventrículo izquierdo al final de la diástole (dimensión del ventrículo izquierdo al final de la diástole, LVEDD) y de la sístole (dimensión del ventrículo izquierdo al final de la sístole, LVESD) por medio de ecocardiografía. Un aumento en la LVEDD y LVESD refleja un aumento en la severidad de la remodelación cardiaca. Por el contrario, una reducción en los valores observados de LVEDD y LVESD refleja una reversión de la remodelación cardiaca, o una mejoría de la función cardíaca.

En los animales tratados con vehículo, la LVEDD aumentó de 0.74±0.020 mm a los 5 días después de la administración de las células a 0.83±0.0 9 mm a las 4 semanas después de la administración de las células. Esto correspondió a un incremento relativo de 12 % [100 %(D28-D5)/D5] en el ventrículo izquierdo. En los animales tratados con células rCTC (A2), la LVEDD aumentó de 0.69+0.022 mm a los 5 días después de la administración de las células a 0.80±0.018 mm a las 4 semanas después de la administración de las células. En los animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3), la LVEDD aumentó de 0.70±0.012 mm a los 5 días después de la administración de las células a 0.77±0.022 mm a las 4 semanas después de la administración de las células.

En los animales tratados con 1 x 105 células hCTC (A3), la LVEDD no parece haber cambiado significativamente, en donde la LVEDD fue 0.73±0.012 mm a los 5 días después de la administración de las células y 0.74±0.023 mm a las 4 semanas después de la administración de las células, un cambio relativo de 1.4 % (p menor que 0.01 , en comparación con el grupo de vehículo). De manera similar, en los animales tratados con 1 x 106 células hCTC (A3), la LVEDD tampoco parece haber cambiado significativamente, en donde la LVEDD fue 0.76±0.011 mm a los 5 días después de la administración de las células y 0.71 ±0.028 mm a las 4 semanas después de la administración de las células, un cambio relativo de 6.6 % de reducción, en comparación con 5 días después de la administración de las células (p menor que 0.001 , en comparación con el grupo de vehículo). Estos datos sugieren que la dosis de 1 x 105 hCTC (A3) y la dosis de 1 x 106 hCTC (A3) evitaron la remodelación cardíaca. Véase la Figura 23, la Tabla 17 y la Tabla 20. El cambio relativo de la LVEDD (100 %(28D-5D)/5D) se muestra en la Tabla 21 y en las Figuras 20-21.

En los animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3) la LVEDD fue 0.71±0.045 mm en el día 5 y 0.78±0.079 mm en el día 28. En los animales tratados con 1 x 106 células rCTC (A2) la LVEDD fue 0.70±0.083 mm en el día 5 y 0.80±0.071 mm en el día 28. No hubo una diferencia significativa de la LVEDD en comparación con los animales tratados con vehículo, lo que sugiere que no hay una mejoría en la remodelación en comparación con el grupo de vehículo. Véase la Tabla 17 y la Figura 23.

Los animales tratados con células derivadas de tejido cardiaco humano mostraron, además, una reducción en la dimensión del ventrículo izquierdo al final de la sístole (LVESD). La LVESD determina el tamaño del ventrículo al final de la contracción. Este parámetro no sólo representa la remodelación, sino que también indica la contractilidad del músculo cardíaco. Una reducción en la LVESD corresponde a un aumento en la fuerza de contracción.

La LVESD aumentó del día 5 al día 28 en los animales tratados con vehículo. La LVESD se mantuvo en el mismo nivel en los animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3) (0.56±0.05 cm en el día 5 y 0.54±0.08 cm en el día 28). La LVESD se redujo en los animales tratados con 1 x 105 (0.58±0.04 cm en el día 5 y 0.51±0.08 cm en el día 28) y 1 x 106 células hCTC (A3) 0.62±0.05 cm en el día 5 y 0.48±0.09 cm en el día 28). Véase la Figura 22 y la Tabla 22. Los datos funcionales de los 4 parámetros medidos por ecocardiografía en cada animal y en diferentes momentos se muestran en la Figura 23. Los cambios en la tendencia entre el día 5 y el día 28 son consistentes dentro de cada grupo.

El análisis de la administración de la dosis objetivo de células hCTC (A3) y de la función cardíaca, como lo determinó la función global medida por medio del acortamiento fraccional (AF) demostró una correlación (p=0.001 , n=35) entre dosis celular y mejoría funcional. Véase la Figura 24.

Del mismo modo, se observó el análisis de la administración de la dosis objetivo de células hCTC (A3) y de la remodelación cardíaca, tal como lo determinó el cambio absoluto de la LVEDD del día 5 al día 28 (28D-5D) (p=0.0002, n=35). Véase la Figura 25. Se estableció una correlación y parece ser exponencial en lugar de lineal.

Ejemplo 12 Retención de células derivadas de tejido cardiaco humano en el modelo de infarto miocárdico agudo de la rata Para entender mejor los mecanismos y los beneficios biológicos de las células derivadas de tejido cardiaco humano como terapia para el miocardio dañado, se tomó muestras de tejido de los corazones de los animales tratados con células cardíacas humanas del ejemplo anterior para determinar la retención de células derivadas de tejido cardíaco humano en los animales 4 semanas después de la administración.

Los corazones extraídos de los animales tratados con células derivadas de tejido cardíaco humano del ejemplo anterior se recolectaron a las 4 semanas después de la administración de células. Se determinó la retención de células por medio de histología (n=6 por dosis de células) y PCR cuantitativa en tiempo real (n=4 por dosis de células).

Se administraron células hCTC (A3) a animales de prueba 20 minutos después de ligar la arteria coronaria descendente anterior izquierda para establecer los valores básales de retención celular. Se inyectó poblaciones criopreservadas de células hCTC (A3) en la zona limite del área decolorada en 5 sitios de inyección separados por cada animal. Los animales recibieron una dosis objetivo de 1 x 104, 1 x 105 o 1 x 106 células. Los animales se sacrificaron en los días 0, 1 , 3 y 7 días y se extrajeron los corazones para analizar la retención celular por medio de PCR cuantitativa en tiempo real (n=3 por grupo de tratamiento).

En los casos en los que se toman muestras para análisis por PCR cuantitativa en tiempo real, los tejidos cardíacos se procesaron para obtener ARN total. Se calculó la retención de células humanas en base a la cantidad de ARN humano detectado en las muestras cardíacas.

Se detectó el ARN de células derivadas de tejido cardíaco humano a las 4 semanas después de la administración de las células en los animales tratados con células hCTC (A3). La retención celular parece ser dependiente de la dosis, ya que los animales que recibieron 1 x 106 células hCTC (A3) mostraron más retención celular que los animales que recibieron 1 x 105 células hCTC (A3). Se calculó que la retención celular estuvo a nivel del valor de base en los animales que recibieron 1 x 104 células hCTC (A3), en base a la cantidad de ARN humano detectado en las muestras.

Se detectó ARN humano en los corazones de los animales sacrificados a los 0, 1 , 3 y 7 días después de la administración de células. La retención celular cayó rápidamente inmediatamente después de la administración, y cayó aún más a las 24 horas después de la administración de las células. Como lo muestran las Figuras 26B y 26C, inmediatamente después de la administración de las células, sólo se retuvo aproximadamente 8 % de la dosis objetivo, como se calculó por medio de la detección de ARN humano en las muestras de corazón. Con el momento 0 como linea de base, el nivel de retención celular cayó aún más cuando se determinó a las 24 horas después de la administración de las células en aproximadamente 10 % en el momento 0. El nivel de retención celular permaneció en el mismo nivel en el día 7 después de la administración de las células.

Se observó una correlación entre la retención de células derivadas de tejido cardíaco humano y la prevención de la remodelación cardíaca. En los animales que recibieron células derivadas de tejido cardíaco humano, el cambio en el LVEDD (D28-D5) se correlacionó con la retención de células derivadas de tejido cardíaco humano. Como se puede ver en la Figura 27, la tendencia de la correlación es significativa como un valor de p de 0.023 y un valor r2 de 41 %. En un estudio clínico farmacológico (Lilian Murray y otros in Br J Clin Pharmacol. 1998; 45(6): 559-566) de Enalapril, un medicamento prescrito de manera adecuada para la hipertensión, se observó una correlación significativa entre el enalapril y la reducción de la presión sanguínea en el estudio (p menor que 0.01 ). Sin embargo, "el poder predictivo del modelo aumentó (r2 = 23.6 %, p menor que 0.01 ) pero dejó sin respuesta la mayor parte de la variabilidad no explicada".

En los casos en los que se tomó muestras para inmunohistoquímica, los corazones se sumergieron en medio OCT y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido (n=6 por grupo). Se obtuvo secciones de la base, porción media y del ápice del corazón. Los tejidos sumergidos congelados se enviaron a QualTek Technology (Santa Barbara, CA) para una evaluación histológica ulterior. Los tejidos se descongelaron a temperatura ambiente, se volvieron a fijar en formalina, se sumergieron en parafína y se seccionaron en cortes de 5 µ?t?. Los cortes se tiñeron con un anticuerpo contra el antígeno de matriz nuclear humano (hu NuMA) para distinguir las células derivadas de tejido cardíaco humano entre el miocardio de rata.

Los resultados de la inmunohistoquímica coincidieron con los resultados de la qPCR. Se identificó una tinción positiva para el NuMA humano en el miocardio de animales que recibieron una dosis objetivo de 1 x 106 células hCTC (A3). Véase la Figura 28A y las Figuras 29A-29D. Las células NuMA positivo que se tiñen color café oscuro y que tienen características de tinción similares a las de tejidos humanos control se muestran aquí dentro de 2 círculos ovales y sin tinción preexistente. El número calculado de células fue de aproximadamente 100 células humanas/corte. A gran aumento se identificó, además, células similares a miocitos humanos como se muestra en la Figura 29D. No se observó tinción para el NuMA en los animales tratados con vehículo. Véase las Figuras 28A y 28B, las Figuras 29A-29D y la Figura 30 Ejemplo 13 Las células derivadas de tejido cardiaco humano redujeron la hipertrofia en un modelo animal de infarto miocárdico agudo Para entender mejor los mecanismos y los beneficios biológicos de las células derivadas de tejido cardiaco humano como terapia para el miocardio dañado, se obtuvo muestras de los corazones de animales tratados con células cardíacas humanas del Ejemplo 11 para determinar el efecto de la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano en el tamaño del infarto y la patología general del corazón.

Un patólogo evaluó la histopatología en QualTek (Santa Barbara, CA). El patólogo no conocía el tratamiento del estudio. Los tejidos cardíacos estaban integrados en bloques de parafina. Se obtuvo cortes a cada 5 pm a lo largo de todo el órgano y se evaluaron por medio de patología general. La evaluación de hipertrofia se llevó a cabo por medio de un sistema de puntaje. En el miocardio hipertrófico (puntaje 1), es decir, fue común encontrar células miocárdicas con un citoplasma agrandado y núcleos inusuales. De lo contrario, se asignó un puntaje de 0 al miocardio. Se hizo un conteo del número de cortes con hipertrofia y sin hipertrofia y se presentó en la Figura 31 como una proporción del total de cortes para representar la proporción de la hipertrofia en el corazón entero.

Se observó hipertrofia miocárdica en los corazones de animales tratados con vehículo, en donde aproximadamente 70 % del miocardio mostró hipertrofia (puntaje 1). Véase la Figura 31. El tratamiento con células derivadas de tejido cardiaco humano redujo significativamente la hipertrofia observada en los corazones, en comparación con los animales tratados con vehículo. En los corazones que recibieron células hCTC (A3) a dosis objetivo de 1 x 104, 1 x 105 o 1 x 106, el miocardio hipertrófico se redujo a 30 %-50 %. Véase la Figura 31.

Se tiñó cortes de músculo papilar de cada corazón con tinción tricrómica de Masson para determinar la gravedad del infarto miocárdico. El tamaño del infarto se determinó por medio de medición directa del área infartada y del área no infartada. El tamaño relativo del infarto se calculó en porcentaje [área infartada/(área infartada +área no infartada)]. Todos los estudios morfométricos se llevaron a cabo de conformidad con los métodos descritos por Iwasaki y otros en Circulation. 2006; 113:1311-1325.

Se observó una tendencia hacia la disminución del tamaño relativo del infarto en los animales que recibieron ya sea 1 x 105 (16.5±7.3 %, p=0.02) o 1 x 106 células hCTC (A3) (14.8±8.6 %, p=0.01), en comparación con el grupo con vehículo (24.1±2.9 %). Véase la Figura 32A. Del mismo modo, se observó una tendencia hacia la disminución del tamaño del infarto en el área real infartada en los animales que recibieron ya sea 1 x 105 (5571221 , p=0.09) o 1 x 106 (537±261 , p=0.08) células hCTC (A3), en comparación con el grupo tratado con vehículo (748±191). Véase la Figura 32B.

Se observó hipertrofia miocárdica en los corazones de animales tratados con vehículo, en donde aproximadamente 70 % del miocardio mostró hipertrofia (puntaje 1). Véase la Figura 31. El tratamiento con células derivadas de tejido cardiaco humano redujo significativamente la hipertrofia observada en los corazones, en comparación con los animales tratados con vehículo. En los corazones que recibieron células hCTC (A3) a dosis objetivo de 1 x 104, 1 x 105 o 1 x 106, el miocardio hipertrófico se redujo a 30 %-50 %. Véase la Figura 31. La reducción de la hipertrofia lograda por las hCTCs se puede atribuir directamente a efectos tróficos o parácrinos, es decir, a citocinas segregadas por las hCTC, como se muestra en la Tabla 24 y/o debido al efecto secundario de aumento en la generación de novo de miocitos, como se describe en el Ejemplo 14 más adelante.

Ejemplo 14 Las células derivadas de tejido cardiaco humano aumentaron la densidad capilar en un modelo animal de infarto miocárdico agudo Para entender mejor los mecanismos y los beneficios biológicos de las células derivadas de tejido cardíaco humano como terapia para el miocardio dañado, se tomó muestras de tejido de los corazones de los animales tratados con las células cardíacas humanas del Ejemplo 1 1 para determinar el efecto de la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano en la densidad capilar en la zona límite del área infartada.

Se seleccionó aleatoriamente 5 cortes de tejido del ventrículo izquierdo de cada corazón, tomados en la zona límite del área infartada y se evaluó la densidad capilar morfométricamente por medio de examen histológico, en donde los capilares se observaron con el uso de un anticuerpo contra isolectina B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) o CD31. La isolectina B4 es específica para los residuos de azúcar de la superficie de las células endoteliales y se ha demostrado que se reconoce las células endoteliales en diferentes contextos, como lo describen Vasudevan y otros en Nature Neuroscience 11 : 429-439 (2008) y Schmidt y otros en Development 134, 2913-2923 (2007). La CD31 , también denominada molécula de adhesión a células endoteliales de las plaquetas (PECAM) se ha usado extensamente para identificar células endoteliales y, por lo tanto, la vasculatura en varios tejidos que incluyen el corazón (Tabibiazar y Rockson Eur Heart J 2001 vol 22; 903-918).

La observación de capilares por medio de isolectina B4, o CD31 , demostró que la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano aumentó la densidad capilar en la zona limite del área infartada. La administración de células hCTC (A3) en todas las dosis produjo un aumento en la densidad capilar, en comparación con los grupos tratados con vehículo, 4 semanas después de la administración de las células. Véase las Figuras 33A y 33B. (p=0.0068 para la tinción de isolectina B4 y p=0.0005 para la tinción CD31).

El aumento de la densidad capilar puede deberse, en parte, a la secreción de los factores de las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. Estos efectos tróficos pueden actuar, por ejemplo, en una forma paracrina en las células cardiacas. Los factores tróficos pueden afectar ya sea directa o indirectamente la formación de vasos sanguíneos, la función de los vasos sanguíneos y la hemodinámia, la remodelación y la función del músculo cardíaco, la proliferación de miocitos (tal como la miogénesis), la hipertrofia de los miocitos, la fibrosis o aumentar la supervivencia de las células cardíacas. Los factores tróficos pueden regular también la respuesta inmunológica del receptor. Para determinar si las células derivadas de tejido cardíaco humano secretan factores tróficos, se recolectó el medio de cultivo de las poblaciones de células hCTC (A3) que se habían cultivado in vitro durante 7 días. Las muestras de los medios se almacenaron a -80 °C antes de evaluar la presencia de citocinas secretadas.

Las citocinas segregadas por las células hCTC (A3) incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y angiopoyetina 2 (ANG2). Véase la Tabla 24. Estas citocinas desempeñan una función importante en la angiogénesis. Más importante, la combinación de VEGF y ANG2 puede iniciar y aumentar el proceso de formación de nuevos capilares, tal como lo demostraron Maisonpierre y otros en Science 277:55-60 (1997) y lo revisaron Ramsauer y otros en Journal of Clinical Investigation 110: 1615-1617 (2002).

Ejemplo 15 Las células derivadas de tejido cardiaco humano aumentaron la densidad de los miocitos en el área no infartada de animales que recibieron las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención Para entender mejor los mecanismos y los beneficios biológicos de las células derivadas de tejido cardíaco humano como terapia para el miocardio dañado, se tomó muestras de los corazones de los animales tratados con las células cardíacas humanas del Ejemplo 11 para determinar el efecto de la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano en la proliferación de miocitos de ratas en la zona límite del área infartada y la densidad de los miocitos en las regiones no infartadas del corazón.

Las muestras de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina se cortaron a 4 pm. Se seleccionó una muestra de cada animal aproximadamente en el corte 17. Los cortes se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente con un anticuerpo para Ki-67 (MIB-5), se lavaron en PBS y se incubaron con un anticuerpo IgG secundario de ratón marcado por afinidad con un micropolímero. Los cortes se lavaron en PBS y se revelaron con un sustrato de Vector SG que produce un producto de reacción azul/gris marino. Los cortes que se enjuagaron en PBS se contratiñeron con el uso de DAPI (KPL Gaithersburg, Maryland). Se incluyó controles positivos y negativos en cada protocolo de tinción.

Se incubó cortes paralelos fijados en formalina como un anticuerpo para la miocina cardíaca durante 45 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS y se incubaron con un anticuerpo IgG biotinilado secundario de ratón. Después de terminar la incubación secundaria se aplicó reactivo Vectastain ABC-AP (Kit Vectastain Universal ABC-AP, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) durante 30 minutos. Las laminillas se lavaron en PBS y, después, se revelaron con el uso de Chromogen líquido rojo permanente (Dako, Carpintería, CA) que produce un producto de reacción rosa oscuro a rojo. Las laminillas lavadas en PBS se contratiñeron con el uso de DAPI (KPL Gaithersburg, Maryland). Los controles positivos y negativos se incluyeron en cada protocolo de tinción.

Se midió los miocitos en proliferación por medio de doble tinción de Ki-67 y de la cadena pesada de míosína (MHC). Se contó el total de míocítos, reconocido por medio de la tinción de MHC. El número total de miocitos por campo de alto poder fue similar en los grupos tratados con vehículo y los tratados con células en todas las dosis. La tasa de miocitos en proliferación entre la totalidad de los miocitos fue mayor en los animales que recibieron ya sea 1 x 104 (3.8±0.02 %) o 1 x 105 (3.7±0.02 %) células hCTC (A3), en comparación con los animales tratados con vehículo (2.3±0.01 %) o los animales que recibieron 1 x 106 (1.2±0.01 %) células. Véase la Tabla 25 y las Figuras 34A-34C.

Una explicación posible de la baja tasa de miocitos en proliferación entre la totalidad de los miocitos en los anímales que recibieron 1 x 106 células puede deberse a los miocitos que entraban en GO en respuesta al tratamiento con hCTC (A3). Ki-67 es un marcador de células en proliferación que está presente en todas las fases del ciclo celular. Sin embargo, cuando las células que están en el ciclo salen de la fase GO, Ki-67 ya no está presente. Véase, por ejemplo, (Thomas Scholzen 2000; Journal of Cellular Physiology; 182 (3), 311-322).

Tinción de H&E: Las laminillas se desparafinizaron con 2 cambios de xileno, a 10 minutos por laminilla, después se rehidrataron en 2 cambios de alcohol absoluto, durante 5 minutos cada una, después con alcohol al 95 % durante 2 minutos y con alcohol al 70 % durante 2 minutos. Las laminillas se lavaron rápidamente en agua destilada, después, se tiñeron en solución de hematoxilina durante 8 minutos, se lavaron en agua corriente de chorro durante 5 minutos, se diferenciaron en alcohol ácido al 1 % durante 30 segundos se lavaron con agua corriente de chorro durante un minuto, se tiñeron en agua de amonio al 0.2 % de 30 segundos a un minuto. Después, las laminillas se lavaron en agua corriente de chorro durante 5 minutos, se enjuagaron en alcohol al 95 % (10 dips), después, se contratiñeron en solución de eosina-floxina B de 30 segundos a un minuto, se deshidrataron con alcohol al 95 %, 2 cambios de alcohol absoluto, durante 5 minutos cada una, se lavaron en 2 cambios de xileno, durante 5 minutos cada una y se montaron con medio para montar a base de xileno.

Se obtuvo muestras de un nivel por cada animal de las laminillas teñidas con H&E. En cada nivel se seleccionó 5 campos a un aumento de 400X (67,500 pm2 por campo) que contenían miofibrillas cortadas transversalmente con capilares seccionados transversalmente en su mayoría en la pared ventricular izquierda, lejana al infarto. Se reportó la densidad de miocitos para cada nivel como el promedio de 5 campos y se expresó en mm2. Se calculó el promedio, la desviación estándar y el error estándar del promedio para cada grupo en tratamiento.

Generalmente, los miocitos individuales eran visibles en el tejido teñido con hematoxilina y eosina (H&E) a una magnificación de 400X. La Figura 35 muestra imágenes representativas obtenidas de las muestras de los corazones que recibieron 1 x 105 células hCTC (A3), junto con muestras obtenidas de animales tratados con vehículo. En la Tabla 26 el promedio para el grupo tratado con vehículo (1813 ± 84/mm2) fue menor que el promedio de cualquiera de los grupos en tratamiento (1 x 104 células hCTC (A3): 2210 ± 227, 1 x 105 células hCTC (A3): 2220 ± 186, 1 x 106 células hCTC (A3): 2113 ± 186). La densidad aumentada de miocitos se puede atribuir al incremento de miocitos en proliferación (miogénesis) y/o a la reducción en la hipertrofia de miocitos, tal como la descrita en el Ejemplo 13.

Ejemplo 16 El tratamiento con células derivadas de tejido cardíaco humano indujo una expresión genética diferencial en el miocardio de ratas Para entender las alteraciones moleculares inducidas por la administración de células derivadas de tejido cardiaco, se llevó a cabo un estudio de caracterización de genes para comparar los niveles de expresión genética en grupos tratados con vehículo y con células derivadas de tejido cardíaco humano. Se obtuvo los corazones de ratas de animales que recibieron 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106 células hCTC (A3) o vehículo 4 semanas después de la administración de las células, de los animales usados en el estudio descrito en el Ejemplo 11. Se recolectó el ARN total de las muestras.

Se usó el chip genético HG-U133_Plus_2 de Affymetrix para llevar a cabo el análisis de expresión génica en las muestras. Con el uso de Spotfire DecisionSite se normalizó el conjunto de datos del microarreglo en todos los chips de microarreglo por medio de la función "Normalizar por promedio". Los chips individuales se organizaron en grupos para comparación (1 X104, 1 X105 y 1 X106 hCTC (A3) de dosis objetivo y vehículo). Con el uso de Spotfire DecisionSite se establecieron los valores de p y del cambio de multiplicación entre grupos. Se eliminó los genes que no tenían una P en la columna de Llamada actual de los datos en por lo menos 3 columnas, que tenían un valor de p comparativo de grupo menor o igual que 0.05 en por lo menos 2 columnas y cualquier gen que no tuviera un cambio en su multiplicación mayor o igual que 2.0 o menor o igual que 0.5 en por lo menos 2 columnas. El grupo filtrado comprendía 45 genes de interés. Los 45 genes entraron, después, en el programa Principie Component Analysis (PCA) de Spotfire DecisionSite para mostrar visualmente la separación del grupo con el uso de un subgrupo de genes. Véase la Tabla 27, en donde los genes expresados diferencialmente se identificaron y se enlistaron.

Dentro de los genes identificados, el receptor beta del factor del transformación del crecimiento (TGFpR) se reguló a la baja en los animales que recibieron células hCTC (A3) a cualquier dosis. Véase la Figura 35. La vía del TGF R ha sido implicada con anterioridad en el aumento de la hipertrofia (véase, por ejemplo, Watkins, Jonker y otros Cardiovasc Res. 1 de febrero de 2006; 69 (2):432-9) y la remodelación después de un infarto en el miocardio (Ellmers, Scott y otros Endocrinology. 2008 Nov; 149(11):5828-34.). Se ha reportado que el bloqueo de TGFb y TGF R reduce la remodelación y la fibrosis después de la hipertrofia (véase, por ejemplo, Ellmers, Scott y otros Endocrinology. noviembre de 2008; 149(11): 5828-34). Además, se ha reportado que la activación de la vía del TGFb y TGF R después del infarto aumenta la hipertrofia ventricular y de los miocitos y la remodelación (véase, por ejemplo, Matsumoto-lda, Takimoto y otros Am J Physiol Heart Circ Physiol. febrero de 2006; 290(2). H709-15).

Otro gen que se identificó por medio de análisis de expresión genética diferencial fue el de la sintasa de óxido nítrico (NOS1). Después del infarto, la expresión de NOS1 aumenta en el corazón. Se ha reportado que la sobreexpresión de NOS1 reduce la contractilidad del miocardio (véase, por ejemplo, (Burkard, Rokita y otros Circ Res. 16 de febrero de 2007; 100(3): e32-44). En el corazón humano que falla se ha reportado que la expresión de NOS1 a nivel de ARNm y proteina aumenta significativamente, lo que indica que la NOS1 tiene una función en la patogénesis de la disfunción cardiaca (véase, por ejemplo, Damy, Ratajczak y otros Lancet. 24 de abril de 2004; 363 (9418): 1365-7). En el miocardio tratado con células hCTC (A3), a todas las dosis, la expresión de NOS1 se redujo en comparación con el miocardio tratado con vehículo más de 10 veces.

Ejemplo 17 El tratamiento con células derivadas de tejido cardiaco humano redujo el tamaño del infarto y previno la hipertrofia en un modelo de rata de infarto miocárdico agudo La eficacia de las células derivadas de tejido cardíaco humano para tratar el miocardio dañado se comparó con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea en un modelo de roedor de infarto miocárdico agudo. Para este estudio se usó 96 ratas hembra sin pelo (Charles River Laboratories) de 8-10 semanas de edad. Se realizó procedimientos quirúrgicos tal como se describe en el Ejemplo 11. 1 x 105 células hCTC (A3) (Lote 1) se administraron en un volumen de 100 µ? de CryoStor D-lite. Paralelamente, 1 x 106 células madre mesenquimales humanas (cat. núm. PT-2501 , Lonza) se administraron en un volumen de 100 mi de Cryostor D-lite. Un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1 se usó con las siguientes modificaciones en base a la preferencia del cirujano: las células se inyectaron en dos sitios con 50 pl cada uno en la zona límite de infarto, con el uso de una jeringa de insulina de 0.3 mi ajustada con una aguja calibre 29, aproximadamente 10 minutos después de ligar la LAD cuando se observó claramente la decoloración del área infartada. Se sacrificaron animales a los 28 días después de la administración de células y los corazones se removieron para análisis posterior.

Las aurículas se cortaron y los ventrículos se limpiaron con solución salina. Los corazones se sumergieron en formalina neutra al 10 % regulada (NBF) durante 24 h antes de cortarlos en cuatro rebanadas de 2 mm. Cada rebanada se proceso para examinarla microscópicamente, se incrustó en parafina, se seccionó a 5 pm y se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) y/o tricromo de Masson. Dos secciones de cada animal se muestran lado a lado: una sección se tomó de la línea media entre el músculo papilar y el nivel basal y otra sección se tomó del músculo papilar.

Las secciones de tejido de todos los grupos y momentos específicos se cegaron y se clasificaron de conformidad con la gravedad de la enfermedad (descompensación/dilatación e hipertrofia) de más grave a menos grave. A cada ordinal se le asignó un número, en donde el número más alto corresponde a la mayor gravedad de la enfermedad. Después, el ciego se detuvo y todos los valores de rango de cada grupo se recopilaron.

Todas las imágenes se recolectaron a través de la pared libre del ventrículo izquierdo que incluía el infarto. Las imágenes de poco aumento (2X) se recolectaron de 2 rebanadas de tejido teñidas con tricromo de cada animal y se analizaron para evaluar el tamaño del infarto. Se usó el programa Image-Pro Plus versión 5.1 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD) para realizar el análisis morfométrico automático del tamaño del infarto en las imágenes recolectadas. El perímetro de la pared libre del ventrículo izquierdo se trazó y se designó como el área de interés (AOI, por sus siglas en inglés). El porcentaje ocupado por la tinción azul, que representa el infarto, y el porcentaje de la tinción roja, que representa el miocardio funcional, fueron las dos mediciones obtenidas de cada imagen.

Las secciones de tejido cardíaco teñidas con H&E y/o tricromo de Masson se examinaron 28 días después del infarto. Los animales tratados con 1 x 105 células hCTC (A3), asi como los animales tratados con 1 x 106 células madre mesenquimales humanas mostraron un área infartada reducida, en comparación con los animales tratados con vehículo. Se observó, además, una reducción en la dilatación tanto en el ventrículo izquierdo como en el derecho. Véase las Figuras 36A y 36B. Adicionalmente, hubo una preservación de miocardio funcional en la pared libre del ventrículo izquierdo en animales que recibieron 1 x 105 células hCTC (A3), asi como animales tratados con 1 x 106 células madre mesenquimales humanas. Véase la Figura 36C.

De un modo interesante, las células hCTC (A3) y las células madre mesenquimales humanas demostraron efectos diferenciales en el tabique interventricular (IVS), con hMSC que muestra agrandamiento hipertrófico del IVS, mientras que no hubo ningún cambio en los animales que recibieron células hCTC (A3). Véase la Figura 37. La evidencia de los cambios hipertróficos de los cardiomiocitos estuvo presente en los tabiques de ambos grupos, pero fue más pronunciada en los animales que recibieron hMSC. Los miocitos hipertróficos y el IVS contribuyen a la remodelación eventual en el corazón; esto sugiere que las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pueden tener más efectos positivos en la función cardíaca que las células madre mesenquimales humanas.

Ejemplo 18 Eficacia de múltiples lotes y a largo plazo de las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención en un modelo animal de infarto miocárdico agudo Los múltiples lotes de células derivadas de tejido cardíaco humano se prepararon de tres donantes. La información del donante se describe en la Tabla 28. En resumen, el Lote 1 es de un órgano cardíaco de grado de trasplante; el Lote 2 es de un corazón saludable pero el donante falló en el criterio de la edad para el trasplante; el Lote 3 de un donante diagnosticado con cardiomiopatia dilatada, una condición de falla cardíaca.

Se anestesió ratas hembra sin pelo (peso de 250 a 300 g) con ketamina y xilazina (IP de 60 y 10 mg/kg, respectivamente). Se abrió el tórax en el cuarto espacio intercostal izquierdo, se exteriorizó el corazón y se hizo una incisión en el pericardio. Después, el corazón se sostuvo con fórceps y se hizo una sutura en bucle con prolina 6-0 por debajo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda, aproximadamente a 2 mm de su origen. Se indujo un AMI en el corazón al jalar la ligadura para obstruir la arteria. Se comprobó visualmente la decoloración del miocardio infartado.

Veinte minutos después de la inducción del MI, las ratas recibieron un trasplante intramiocárdico de 1x106 células hCTC (A3) ya sea del Lote 1 , 2 o 3 hCTC (A3). Paralelamente, los animales recibieron 1x106 células pCTC (A3) o células de fibroblastos dérmicos neonatales humanos (catálogo núm. CC-2509, Lonza) o vehículo. Todas las poblaciones celulares se habían criopreservado antes de la administración e inyección en el corazón en un volumen final de 120 mi en CryoStor Dlite. Las células se administraron en 2 sitios, 50 µ? de suspensión celular o CryoStor Dlite se inyectaron en cada sitio. Después de terminar la inyección, se cerró el tórax. Se incluyó 10 animales en cada grupo. La tasa de mortalidad observada en el estudio fue de 32 %. No hubo ninguna diferencia significativa en la mortalidad entre los grupos, tal como se muestra en la Tabla 29. Los valores absolutos de la función cardíaca se muestran en la Tabla 30.

Se hizo una ecocardiografia transtorácica (SONOS 5500, Philips Medical Systems) para evaluar la función del ventrículo izquierdo a las 1 , 4 y 12 semanas después de la administración de células. Se determinó los siguientes parámetros: dimensión del ventrículo izquierdo (LV) al final de la diástole (LVEDD), dimensión del ventriculo izquierdo al final de la sístole (LVESD), acortamiento fraccional (AF), puntaje del movimiento parietal regional (RWMS).

La administración de células hCTC (A3) del Lote 1 mejoró la función cardíaca en todos los parámetros analizados a los 28 días y a los 84 días después de la administración de células. Véase las Figuras 38A-38C y 39A-39C. La administración de células hCTC (A3) del Lote 2 pudo mejorar la contractilidad cardíaca y la función cardíaca global a los 84 días después del infarto, como lo determinó el puntaje del movimiento parietal regional RWMS y AF.

El AF a los 7 días después de la administración de células fue similar entre los grupos tratados con vehículo y los tratados con célula. Sin embargo, 84 días después de la administración de células, la función cardíaca determinada por el AF mejoró en 9.5 ± 6.0 % (n= 8, p<0.01), 8.9 ± 4.1 % (n=8, p<0.001) en células hCTC (A3) del Lote 2 y células hCTC (A3) del Lote 1 , respectivamente. Véase las Figuras 39A-39C y la Tabla 30. Se observó un cambio mínimo o ningún cambio en el AF en los grupos tratados con vehículo (-1.0±3.3 %), hCTC Lote 3 (-0.4±3.0 %) y grupos de fibroblastos humanos (4.H2.1 %). Véase las Figuras 39A-39C y la Tabla 30. La función global, que coincide con RWMS, se redujo, además, en anímales que recibieron ya sea hCTC (A3) del Lote 1 de 24.83±1.64 en el día 7 hasta 22.13+1.5 (N=8, p menor que 0.05) o células del Lote 2 de 25.44+1.0 a 23.1312.2 (N=8, p menor que 0.05), en comparación con los animales tratados con vehículo. Véase la Tabla 30.

En el estudio actual, las células hCTC (A3) ya sea del Lote 1 o del Lote 2 evitaron la remodelación a los 28 y 84 días después del infarto, según la LVESD. A los 28 días después de la administración de células, la LVESD se redujo en los animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 1 (-8.9 ± 4.1 %). La LVESD en animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 2 se mantuvo en la linea basal (-0.5±4.3 %). Por el contrario, en los animales tratados con vehículo, a los 28 días después de la administración de células, la LVESD incrementó por 16.4 ± 5.2 %. En los animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 3 o fibroblastos humanos, la LVESD se incrementó en 9.1 ± 2.3 % y 5.4 ± 3.6 %, respectivamente. Véase las Figuras 38A-38C y la Tabla 30.

A los 84 días después de la administración de células, en grupo de vehículo, la LVESD se incrementó en 16.3± 2.8 %. Del mismo modo, los animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 3 o los animales tratados con fibroblastos humanos mostraron, además, agrandamiento del ventrículo izquierdo a los 84 días. La LVESD se incrementó en 12.5±3.7 % y 7.6±3.7 %, respectivamente. En contraste, no hubo remodelación cardíaca en los animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 1 (-3.9 ± 5.2 %) ni en los animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 2 (-1.8±4.2 %). Véase las Figuras 39A-39C y la Tabla 30.

El incremento en la dilatación del ventrículo izquierdo, según la LVEDD, al final de la diástole se evitó en los animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 1 (7 días: 0.80±0.10 cm 84 días: 0.84+0.07 cm, 5 % de incremento) y en los animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 2 (7 días: 0.74±0.07 cm 84 días: 0.82±0.06 cm; 6.7 % de incremento). Por el contrario, la LVEDD se incrementó en los animales tratados con vehículo (7 días: 0.75±0.03 cm; 84 días: 0.86±0.06 cm; 14.6 % de incremento) y animales que recibieron fibroblastos humanos (7 días: 0.73±0.034 cm; 84 días: 0.83±0.06 cm; 13.7 % de incremento). Los animales que recibieron células hCTC (A3) del Lote 3 mostraron, además, un incremento en la LVEDD (7 días: 0.73±0.04 cm; 84 días: 0.82±0.06 cm; 12.3 % de incremento). Véase las Figuras 39A-39C y la Tabla 30.

Ejemplo 19 Tamaño de las células derivadas de tejido cardiaco Métodos y materiales: El tamaño de las células derivadas de tejido cardíaco, obtenido de corazones humanos, de ratones, de cerdos y de ratas, de conformidad con los métodos de la presente invención se analizó durante el conteo celular. El conteo total de células viables se llevó a cabo después de la digestión y antes de volver a sembrar las poblaciones celulares con el uso del XR Vi-Cell™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA). El analizador de viabilidad celular Vi-Cell™ automatiza el método de exclusión del colorante azul tripán para la evaluación de viabilidad celular con el uso de tecnología de capturas en video y análisis de imágenes de hasta 100 imágenes de células en una célula del flujo.

Las muestras se prepararon y se analizaron de conformidad con las instrucciones del fabricante (Manual de referencia PN 383674 Rev.A). En resumen, una alícuota de 500 pL de la suspensión celular final obtenida después de la lisis con RBC se transfirió a un vial de muestras Vi-Cell™ de 4 mi y se analizó con un analizador de viabilidad celular XR Vi-Cell™. El tamaño de las células se determinó por medio del diámetro del promedio de las células contadas.

El promedio del diámetro de las células hCTC (A3) fue 16.7 ±2.13 pm. El diámetro de las células rCTC (A2) fue 18.4±1.02 pm y el diámetro de las células pCTC(A3) fue 17.2±0.42 pm. En base a estos datos, el tamaño de filtro mayor o igual que 20 pm dejaría que las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención pasaran a través del filtro para recolectarlas y dejar fuera otros tipos de células.

Ejemplo 20 Criopreservación de las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención Es favorable generar un producto para administrar directamente sin procesamiento adicional en la clínica. Para generar tal producto se evaluó la criopreservación de las células derivadas de tejido cardiaco humano con el uso de una solución de criopreservación clínicamente aprobada. Adicionalmente, se analizó la toxicidad de la solución de criopreservación en miocardio.

Para la criopreservación se recolectó células hCTC (A3) de los matraces por tripsinización. Los almacenamientos de células se criopreservaron en CryoStor Dlite™ (BioLife Solutions, Inc. Bothell, WA) que contiene DMSO al 2 % v/v. CryoStor Dlite en una solución de criopreservación libre de origen animal diseñada para preparar y preservar células en ambientes de temperatura ultra baja (de -80 °C a -196 °C) de conformidad con los principios descritos en Advances in Biopreservation editado por J.G. Baust and J.M. Baust. Es posible usar, además, otras soluciones que proporcionan, por ejemplo, los electrólitos necesarios, condiciones osmóticas y amortiguadoras para almacenamiento hipotérmico.

Las suspensiones de células se criopreservaron en 2 mi de polipropileno Nalgene, crioviales estériles de rosca interna con tapa de rosca (Nalgne Nunc, Rochester, NY) con el uso de un congelador programable Integra 750 Plus (Planer, Middlesex, Inglaterra) con el programa DeltaT. Las células y soluciones estaban a temperatura ambiente antes de colocarlas en el congelador programable que se mantuvo a 15 °C. Una sonda de temperatura de muestra se colocó en un vial de amortiguador congelante. Para criopreservar las células se usó el siguiente programa: Etapa núm. Índice (°C/m¡n) Disparador de la temp. final (°C) Disparador 1 -1 -6 Muestra 2 -25 -65 Cámara 3 +10 -19 Cámara 4 +2.16 -14 Cámara 5 -1 -100 Cámara 6 -10 -140 Cámara Cuando la temperatura alcanzó -140 °C, las muestras se transfirieron a un tanque de nitrógeno liquido para almacenamiento.

Las publicaciones citadas a lo largo de este documento se incorporan en su totalidad como referencia a la presente. Aunque los diversos aspectos de la invención han sido ilustrados anteriormente como referencia a los ejemplos y modalidades preferidas, se apreciará que el alcance de la invención no se define por la descripción descrita anteriormente pero si por las cláusulas a continuación interpretadas apropiadamente bajo los principios de la ley de patentes.

Tabla 1. Comparación de células hCTC con otras células derivadas de tejido cardiaco.

Tabla 2. Producción y viabilidad de células después de la digestión del tejido * :se procesó la mitad del corazón Tabla 3. Viabilidad después de la criopreservación y paso de la aguja Tabla 4. Cariotipo de hCTC (A3) Tabla 5. Recuperación y viabilidad de CTC de ratas después de la criopreservación y paso de la aguja. * n = 3, los datos representan el promedio. Tiempo indica el tiempo de incubación a temperatura ambiente, que refleja el tiempo de preparación durante el procedimiento de inyección celular en el modelo de infarto miocárdico.

Tabla 6. Anticuerpos usados en el ensayo de citometria de flujo en placas de 96 pocilios Tabla 7. Intensidad de fluorescencia promedio (MFI) y delta MFI Tabla 8. Marcadores de la superficie celular en tres poblaciones celulares hCTC.

Tabla 9. Grupos de iniciadores usados en qPCR Tabla 10. Comparación de células distintas obtenidas del procedimiento Tabla 11. Expresión qénica en hCTC expandidas Fibroblastoo: NHDF Tabla 12. Expresión génica de rCTC orazón r: Corazón de rata Tabla 13. Expresión génica de GFP-CTC de ratones Tabla 14. Expresión génica en pCTC Tabla 5. Definición del puntaje del movimiento regional de la pared Tabla 16. Resumen de la tasa de mortalidad observada Tabla 17. Resumen de la función cardíaca Dimensión del Dimensión Puntaje del ventrículo diastólica Acortamiento movimiento izquierdo al final ventricular derecha fraccional (FS, %) regional de la Parámetro de función de la sístole (LVEDD, cm) pared (RWMS) (LVESD, cm) Media SD Media SD Media SD Media SD 7 días 22.19 3.8 0.58 0.077 0.75 0.075 24.93 2.1 Vehículo 28 días 20.82 3.1 0.65 0.063 0.83 0.072 26.14 1.4 7 días 18.99 4.2 0.56 0.081 0.70 0.083 25.29 1.9 rCTC (A2) 28 días 23.06 6.1 0.62 0.082 0.80 0.071 23.86 2.3 7 días 21.28 3.7 0.56 0.049 0.71 0.045 24.42 1.4 hCTC ÍA3) 28 días 30.51 3.7 0.54 0.085 0.78 0.079 ir 21.08 1.7 7 días 21.33 2.3 0.58 0.037 0.73 0.045 25.58 1.4 hCTC (A3) 31.88 5.0 0.51 0.080 0.74 28 días 0.082 21.08 1.9 105 hCTC (A3) 7 días 18.38 3.2 0.62 0.047 0.76 0.038 25.91 1.6 106 28 días 33.99 6.2 0.48 0.091 0.72 0.094 20 1.7 Tabla 18. Análisis estadístico del cambio absoluto del acortamiento fraccional 95 % de intervalo de Cálculo de confianza Punto Error Punto Error Día del Comparación diferencia Error (Inferior calculado estándar calculadoestándar estudio (A versus B) porcentual estándar Superior) Valor p de A de A de B de B rCPC vs 5 Vehículo -15 6 -26 -3 0.016 18.6 0.9 21.9 1.0 1 e4 versus 5 Vehículo -4 7 -17 10 0.538 21.0 1.1 21.9 1.0 1 e5 versus 5 Vehículo -3 7 -16 11 0.650 21.2 1.1 21.9 1.0 1 e6 versus 5 Vehículo -17 6 -28 -4 0.010 18.1 1.0 21.9 1.0 rCPC vs 28 Vehículo 8 7 -5 24 0.242 22.3 1.1 20.6 1.0 1 e4 versus 28 Vehículo 47 10 28 69 < 0.001 30.3 1.6 20.6 1.0 1 e5 versus 28 Vehículo 53 11 33 76 < 0.001 31.5 1.6 20.6 1.0 1 e6 versus 28 Vehículo 62 12 41 87 < 0.001 33.5 1.8 20.6 1.0 Tabla 19. Análisis estadístico del cambio absoluto del puntaje del movimiento regional de la pared 95 % de intervalo de Cálculo de confianza Punto Error Punto Error Día del Comparación diferencia Error (Inferior calculado estándar calculadoestándar estudio (A versus B) porcentual estándar Superior) Valor p de A de A de B de B rCPC vs 5 Vehículo 1 3 -4 7 0.616 25 1 25 1 1e4 versus 5 Vehículo -2 3 -8 4 0.530 24 1 25 1 1e5 versus 5 Vehículo 3 3 -3 9 0.363 26 1 25 1 1e6 versus 5 Vehículo 4 3 -2 11 0.199 26 1 25 1 rCPC vs 28 Vehículo -9 3 -14 -4 0.001 24 0 26 1 1 e4 versus 28 Vehículo -19 2 -24 -15 < 0.001 21 0 26 1 1e5 versus 28 Vehículo -20 2 -24 -15 < 0.001 21 0 26 1 1e6 versus 28 Vehículo -24 2 -28 -19 < 0.001 20 0 26 1 Tabla 20. Análisis estadístico del cambio absoluto de la LVEDD 95 % de intervalo de Cálculo de confianza Punto Error Punto Error Día del Comparación diferencia Error (Inferior Valor calculado estándar calculado estándar estudio (A versus B) porcentual estándar Superior) P de A de A de B de B rCPC vs 5 Vehículo -7 3 -14 0 0.047 0.690 0.018 0.743 0.019 1 e4 versus 5 Vehículo -5 4 -12 3 0.199 0.707 0.020 0.743 0.019 1 e5 versus 5 Vehículo -1 4 -9 6 0.716 0.733 0.020 0.743 0.019 1e6 versus 5 Vehículo 2 4 -5 10 0.565 0.760 0.022 0.743 0.019 rCPC vs 28 Vehículo -4 4 -11 3 0.294 0.796 0.021 0.828 0.021 1 e4 versus 28 Vehículo -7 4 -14 1 0.069 0.772 0.022 0.828 0.021 1e5 versus 28 Vehículo -11 3 -17 -4 0.004 0.740 0.021 0.828 0.021 1e6 versus < 28 Vehículo -14 3 -20 -7 0.001 0.712 0.021 0.828 0.021 Tabla 21. Análisis estadístico del cambio relativo de la LVEDD Intervalos de Cálculo de 95 % de confianza diferencia Error intervalo de Punto Error individuales del Comparación porcentual estándar confianza Valor p Grupo calculado estándar 95 % rCPC versus rCPC 0.1083 0.0330 0.0423 0.1743 -0.0018 0.0466 -0.0952 0.0916 0.969 Vehículo Vehículo 0.1 101 0.0330 0.0441 0.1761 1e4 versus 1e4 0.0841 0.0356 0.0128 0.1554 -0.0260 0.0485 -0.1232 0.0712 0.594 Vehículo Vehículo 0.1101 0.0330 0.0441 0.1761 1e5 versus 1e5 -0.0069 0.0356 -0.0782 0.0644 -0.1170 0.0485 -0.2142 -0.0199 0.019 Vehículo Vehículo 0.1101 0.0330 0.0441 0.1761 1 e6 versus 1e6 -0.0459 0.0372 -0.1204 0.0285 -0.1561 0.0497 -0.2556 -0.0565 0.003 Vehículo Vehículo 0.1 101 0.0330 0.0441 0.1761 Tabla 22. Análisis estadístico del cambio absoluto de la LVESD 95 % Intervalo de Cálculo de confianza Punto Error Punto Error Día del Comparación diferencia Error (Inferior calculado estándar calculado estándar estudio (A versus B) porcentual estándar Superior) Valor P de A de A de B de B rCPC versus 5 vehículo -3 5 -12 7 0.517 0.559 0.020 0.577 0.021 1e4 versus 5 vehículo -4 5 -13 7 0.483 0.556 0.021 0.577 0.021 1 e5 versus 5 vehículo 0 5 -10 11 0.982 0.576 0.022 0.577 O.021 1e6 versus 5 vehículo 7 6 -4 19 0.222 0.616 0.025 0.577 0.021 rCPC versus 28 vehículo -6 5 -15 4 0.201 0.611 0.022 0.652 0.023 1 e4 versus 28 vehículo -17 4 -26 -8 < 0.001 0.538 0.021 0.652 0.023 1e5 versus 28 vehículo -23 4 -30 -14 < 0.001 0.503 0.019 0.652 0.023 1e6 versus 28 vehículo -28 4 -35 -20 < 0.0010.468 0.019 0.652 0.023 Tabla 23. Aislamiento de CTC de ratas de distintas partes del corazón Tabla 24. Secreción de citocina de hCTC Tabla 25. Relación de miocitos que proliferan en el total de miocitos en una zona limite Grupo Ki-67/total de miocitos Desviación estándar SEM Vehículo 2.34 % 1.36 % 0.55 % hCTC 10000 3.85 % 1.79 % 0.73 % hCTC 100000 3.69 % 2.49 % 1.02 % hCTC 1000000 1.16 % 1.33 % 0.54 % Tabla 26. Densidad de los miocitos (mm2) Grupo Vehículo hCTC 10000 hCTC 100000 hCTC 1000000 Media 1813 2210 2220 2113 std 205 555 455 456 SEM 84 227 186 186 Tabla 27. Gens expresados diferencialmente en grupos de tratamiento con grupo de vehículo Tabla 28. Información del donante dehCTC Tabla 29. Mortalidad en lotes múltiples y estudio de eficacia a largo plazo Tabla 30. Función cardíaca determinada por ecocardiografia (valor absoluto)

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método para producir células derivadas de tejido cardíaco que no expresan telomerasa; el método comprende las siguientes etapas: a. disociar un tejido cardíaco, b. digerir el tejido cardíaco para liberar las células, c. eliminar los cardiomiocitos de las células liberadas, y d. cultivar las células restantes.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el tejido cardíaco se separa manualmente.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el tejido cardíaco se separa mecánicamente.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el tejido cardíaco se digiere con por lo menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en colagenasa y dispasa.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se usa un corazón entero como la fuente de tejido cardíaco.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células derivadas de tejido cardíaco que no expresan telomerasa expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: CD49e, CD105, CD59, CD81 , CD34 y CD117.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células derivadas de tejido cardíaco que no expresan telomerasa no expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: MDR, CD19, CD16, CD46, CD106 y lsl-1.

8. El uso de una población de células derivadas de tejido cardíaco que no expresan telomerasa en la preparación de un medicamento para tratar el miocardio dañado en un paciente.

9. El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección directa en el miocardio dañado.

10. El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección directa en el área del corazón que rodea directamente el miocardio dañado.

1. El uso de una población de células derivadas de tejido cardíaco que no expresan telomerasa en la preparación de un medicamento para reparar el miocardio dañado en un paciente.

12. El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección directa en el miocardio dañado.

13. El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección directa en el área del corazón que rodea directamente el miocardio dañado.

14. Una población purificada de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan teiomerasa, que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: CD49e, CD105, CD59, CD81 , CD34 y CD117.

15. Una población purificada de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan teiomerasa, que no expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: MDR, CD19, CD16, CD46, CD106 y lsl-1.