MX2011010831A - Procedimiento para producir un maiz hibrido que tiene granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual, por medio de una herramienta genetica y un maiz hibrido de la misma. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la generación de maíz híbrido cuyos granos están diferenciados y preservados por un recubrimiento completo de sus superficies, una aislación de la totalidad del endosperma con respecto al exterior y la conservación de todas las características germinativas y de los nutrientes de los padres; y el maíz producido por el procedimiento.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UN MAÍZ HÍBRIDO QUE TIENE GRANOS CON UNA ENVOLTURA AISLADA Y UN REVESTIMIENTO PROTECTOR INDIVIDUAL, POR MEDIO DE UNA HERRAMIENTA GENÉTICA, Y UN MAÍZ HÍBRIDO DE LA MISMA CAMPO TECNICO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se refiere a la generación de maíz híbrido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Nada similar que ha sido desarrollado genéticamente y que se encuentra presente en cualquier semilla o grano de maíz híbrido comercial es conocido actualmente en el arte previo. Todos los demás logros que normalmente se llevan a cabo en semillas de maíz son químicos aplicados a través de un equipo que produce una película denominada artificialmente como recubrimiento o revestimiento.

En el documento WO/2008/070939, a nombre de Bottega, se describe la introducción de antocianinas en relación con el pericarpio del maíz híbrido. Esta antocianina es del tipo monomérico, que está formada por unidades fáciles de extraer o separar mediante agua, ácidos u otras técnicas comunes. Sin embargo, todavía existe un desafío de encontrar sustancias poliméricas que están fijadas en el tegumento del pericarpio del grano y que actúan como una envoltura protectora y que son resistentes a las condiciones ambientales en promedio rigurosas para la endosperma del grano de maíz.

Por lo tanto se ha intentado desarrollar una presión de selección rigurosa para establecer entre el germoplasma conocido cuales son los granos sanos cosechados bajo estrés hídrico altamente contrastante durante el ciclo. El término "estrés hídrico contrastante" está definido para la presente invención para denominar la combinación de sequía extrema durante el desarrollo vegetativo de la planta de maíz y de lluvia significativa con una humedad relativa alta permanente durante y después de la maduración física hasta la cosecha del grano. Este tipo de condición climática causa muchas más manchas y pudrición que cualquier condición única de sequía prolongada o por el contrario, cualquier episodio único de abundantes lluvias durante la totalidad del ciclo de la planta.

Este contraste de sequía/lluvia es un mecanismo muy agresivo para la fisiología de la planta de maíz haciéndola susceptible a enfermedades del grano y pérdida de calidad. Esta pérdida de calidad puede ser el resultado de agresiones físicas directamente en la superficie del grano por las condiciones ambientales promedio y los insectos que quiebran la resistencia del pericarpio y consecuentemente ingresan hongos, bacterias o virus completando el daño severo al germen y la endosperma. El germen contiene la planta nueva que florecerá de la semilla de maíz, y la endosperma contiene ios nutrientes para alimentar la planta inicial antes que se desarrollen las hojas y las raíces. Por lo tanto el germen y la endosperma son muy ricos en nutrientes que sirven tanto como alimento para insectos o como medios para el crecimiento de bacterias, hongos y virus cuando el pericarpio es dañado normalmente.

El estrés hídrico contrastante aparece muy raramente en las condiciones de la naturaleza normales, por lo tanto deben ser desarrolladas condiciones artificiales para sembrar los materiales para la selección en los semilleros.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente descripción es un procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual, en donde el procedimiento comprende las etapas de: (a) seleccionar un germoplasma de un linaje híbrido existente con un alto contenido de antocianinas y alta resistencia a estrés hídrico en combinación con irrigación intensa y con irrigación adicional en el momento de la madurez hasta la cosecha; (b) retrocruzar el material seleccionado con el linaje híbrido existente; el germoplasma del linaje híbrido existente que se ha utilizado como un linaje hembra y el germoplasma del material seleccionado que se ha utilizado como un linaje macho; (c) retrocruzar y seleccionar el material retrocruzado con dichas características para al menos cinco ciclos consecutivos, y conseguir un linaje que es 96.87% similar al linaje existente y (d) obtener una planta de maíz uniforme, que contiene una envoltura aislada y revestimiento protector individual para los granos, y generar un material vegetal de maíz híbrido adecuado para usos industriales y agrícolas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 muestra una sección transversal de un fruto de maíz regular (Zea mays).

La FIGURA 2 muestra una sección transversal del fruto de maíz modificado (Zea mays).

La FIGURA 3 muestra una sección transversal del pericarpio del maíz modificado.

La FIGURA 4 muestra una vista frontal de las células epidérmicas del pericarpio del maíz modificado.

La FIGURA 5 muestra los elementos componentes del mesocarpio y endocarpio del maíz modificado.

La FIGURA 6 muestra una vista frontal de la cubierta aleurónica del maíz.

La FIGURA 7 muestra una vista en sección transversal de la cubierta aleurónica del maíz.

Las FIGURAS 8 y 9 muestran una vista en sección transversal del amplificador parenquimático de la endosperma del maíz.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la realización preferida de la presente invención se provee algo que en conjunto es simple e innovador tal como colocar una envoltura aislada en cada grano individual mediante una herramienta genética. Provee la generación de maíz híbrido cuyos granos están diferenciados y preservados por un recubrimiento completo de sus superficies, aislados de la totalidad del endosperma con respecto al exterior y que conservan todas las características germinativas y de los nutrientes de los padres.

La protección está presente desde el momento en el cual la semilla es plantada en los campos de siembra para formar la semilla de maíz híbrida. Tan pronto como sea cosechada, secada, clasificada, envasada, almacenada, transportada, es distribuida a los campesinos para sembrar. También, cuando la semilla está siendo sembrada en los campos de los productores agrícolas, y también cuando el grano es cosechado, transportado y vendido. También cuando el grano es secado, almacenado y entregado a los fabricantes de forrajes para animales o de alimentos humanos. Adicionalmente, esta característica genética es transferida fácilmente hacia cualquier linaje parental para formar parte de los nuevos híbridos.

La presente descripción se refiere a la generación de maíz híbrido con la inclusión uniforme de polímeros, inmersos dentro de las células del pericarpio del grano, que lo envuelve y provee un revestimiento para su superficie total sin utilizar protectores químicos sintéticos, pero preferiblemente medios genéticos. Estos pigmentos polimerizados son estructural mente resistentes a condiciones rurales severas para el grano maduro tales como: agua, temperatura, humedad relativa, polvo (abiótico), ataque de insectos, bacterias u hongos (biótico). Es una cobertura total e individual para cada grano de maíz. Este revestimiento se encuentra desde las semillas para la siembra así como también en el grano cosechado. La presentación del grano tiene un aspecto parejo, tal como una porcelana que irradia salud y es brillante.

Las ventajas y características del maíz híbrido modificado tal como se ha descrípto en esta memoria descriptiva pueden ser aplicadas en cuatro fases básicas: (1) Transferir las características a los parientes o padres Las características de revestimiento total e individual para cada grano de maíz pueden ser transferidas desde el linaje con la película del revestimiento, como donante en cinco retro-cultivos consecutivos y dos auto-polinizaciones, a cualquier linaje femenino que se combina en el cultivo con el linaje masculino, a las semillas del maíz híbrido plantadas por los campesinos para cosechar el grano. Esto significa que cualquier semilla de maíz y, consecuentemente, el grano cosechado por el campesino, tendrá esta característica de revestimiento. (2) Aplicar en semillas plantadas por campesinos. Las semillas que tienen una característica del revestimiento, que son utilizadas para sembrar, no necesitan ser tratadas con tintura, fungicida o insecticida de suelos en virtud del revestimiento protector. Las semillas necesitan solamente insecticida sistémico cuando emergen las plantas y las hojas son atacadas por insectos. (3) Aplicar en granos de maíz cosechados en plantaciones por campesinos. El grano cosechado desde las semillas con la característica de revestimiento y plantada por los campesinos, incluirán un revestimiento idéntico a las semillas plantadas. La calidad del grano será mejorado consecuentemente.

El grano no es dañado ni presentará una calidad menor debido a condiciones externas abióticas cuando se acerca el tiempo de cosechar el grano de maíz o es cosechado. Estas condiciones pueden ser: lluvias copiosas, lluvias con intervalos de sequía, humedad relativa alta, noches de rocío abundante, días de niebla, temperaturas altas durante el día, una combinación de temperaturas elevadas durante el día y temperaturas bajas durante la noche, etc. El grano tampoco es dañado por condiciones bióticas normales cuando el grano de maíz se acerca al tiempo de cosecha o es cosechado, por los insectos ahuecadores o chupadores de fin de ciclo y las bacterias u hongos que atacan la superficie del grano.

El grano también es menos dañado por grietas y cortes de los procedimientos de cosecha mecánica, transporte y movimiento del grano a lo largo de cintas transportadoras o en elevadores. (4) Aplicar en granos almacenados. El grano es menos dañado en el momento de secado por aire y por temperatura. También el grano es menos dañado por insectos, y tampoco se produce la pérdida de ciertas vitaminas sensibles ni la decoloración debido a los períodos de almacenamiento prolongados.

También son posibles otras aplicaciones útiles, tal como que el pericarpio que contiene este revestimiento p uede ser separado cuando es extraído por los equipos industriales de procesamiento de maíz y sus sub-productos tales como harina, germen, jarabe, etc. Una vez separado, debido a la alta resistencia de este material el mismo puede ser usado en la fabricación de otros materiales tales como aglomerados, recubrimiento para pildoras, materiales con mayor resistencia que los plásticos comúnmente utilizados, papel de alta resistencia, etc.

Las características del maíz también pueden ser aplicadas con efectos nutricionales en los seres humanos como pigmentos muy estables que podrían posiblemente comportarse en forma diferente con respecto a las antocianinas en el sistema digestivo que interactúa con la absorción de los lípidos y glúcidos.

El desarrollo de los linajes fue llevado a cabo en regiones en donde no llueve durante el desarrollo de las plantas y con irrigación intensa en el punto de madurez y de la cosecha. Los linajes fueron desarrollados en Cañada Larga, Santa Cruz, Bolivia, en una región muy seca, cálida y de baja altitud donde no es posible plantar y cosechar maíz. Poco después de alcanzar la madurez fisiológica, fue llevada a cabo la irrigación con un equipo de alto suministro del tipo de cañón, los mismos que tienen una gran penetración de agua dentro de la chala de las mazorcas de maíz la que se pone en contacto con los granos e induce una lesión del pericarpio y el desarrollo de microorganismos que provocan granos pobres.

Fue realizada una selección de todo el germoplasma que presentaba antocianina en el pericarpio que se originaba desde algunos linajes segregados descriptos en WO/2008/070939, o sea: A, B, C y D. Estos fueron todos plantados bajo un alto estrés hídrico y en combinación con una irrigación intensa y con una irrigación adicional en el momento de la madurez hasta la cosecha.

Las plantas que presentaban buena salud fueron recogidas, y solamente las mazorcas de maíz que mostraron un excelente nivel de calidad, de un grado mayor a 8 de un nivel de 1 para mazorcas de maíz podridas y de 10 para choclos muy saludables.

Todas las mazorcas de maíz luego de ser clasificadas desde la más saludable hasta la menos saludable, y en este orden, fueron dejadas ordenadamente en la paja o chala del mismo maíz que había sido elegido y pasadas por un rodillo de cuchillas y mezcladas con suelo húmedo.

Esta es la mejor condición de cultivo para hongos y bacterias y actúa como el mejor inoculo. Los mismos fueron irrigados periódicamente cada 10 días para mantener la presión del inoculo en las mazorcas de maíz dejadas en el suelo.

Luego de 90 días se hizo una evaluación para ver como las mazorcas de maíz habían soportado la presión de las condiciones de humedad,, sol, sequía, contacto con la tierra y el gran inoculo de las plantas de maíz.

Nuevamente se llevó a cabo una evaluación para seleccionar la más grande de 8 y de centenas de choclos o mazorcas de maíz sólo 1 alcanzó el grado 10 totalmente saludable y 3 mazorcas de maíz lograron el grado 9.

Nuevamente el ciclo comienza y granos de grado 10 mazorca de maíz fueron plantados como machos y 3 mazorcas de maíz que tienen grado 9 como hembras para obtener una cruza mazorcas de maíz más sanas.

Al momento de cosechar, las mazorcas de maíz que fueron cosechadas con grado 0 fueron solo 13.

Todos los grados de las 13 mazorcas de maíz fueron plantados nuevamente, se auto-polinizó el 100% de las plantas F1 y nuevamente las mazorcas de maíz que fueron seleccionadas fueron aquellas que presentaban el grado 10 de salud, totalizando 27.

Todos los grados de las 27 mazorcas de maíz fueron plantados nuevamente, auto-polinizando el 80% de las plantas que tenían buenas características desde el punto de vista agronómico, y en el momento de la cosecha de las mazorcas de maíz fueron seleccionadas aquellas que presentaron el grado 10 de salud totalizando 37. Estas 37 mazorcas de maíz fueron puestas en orden de grado de salud nuevamente en el suelo húmedo y mezcladas con la paja o chala de maíz por otros 90 días al final de los cuales solo 16 mazorcas de maíz de grado 10 de salud fueron seleccionadas y con pericarpio muy suave y brilloso. De las 16 mazorcas de maíz 14 presentaron pericarpio con un intenso color rojo y dos con baja intensidad de rojo las cuales al mismo tiempo tenían una apariencia de baja calidad de grado de manera que las mismas fueron descartadas.

Estas 14 mazorcas de maíz seleccionadas formaron el germoplasma de élite para la calidad del grado por medio de un protector genético. Todas estas mazorcas de maíz, el pericarpio brillante del grado de moteado y contraste con la apariencia del pericarpio co n an tocianina monomérica, es fácilmente pintado durante el manipuleo.

El ciclo de selección anteriormente expuesto fue llevado a cabo 15 veces, en cada ciclo, disponiendo en piso húmedo o mojado, con paja o chala de maíz, 10 mazorcas de maíz con un testigo de semillas de maíz "Agricom" de la variedad AGRI-104 (MARCA REGISTRADA) un maíz sin pericarpio protector. El testigo en el momento de la evaluación tuvo siempre un grado menor de 5.

Los linajes obtenidos inmediatamente de todos los ciclos de selección que fueron de grado 10 y color rojo fueron enviados al laboratorio para determinar si los mismos actuaron como un protector.

Los resultados obtenidos confirman que ya no era la antocianina monomérica, sino más que esto, un pigmento muy estable de polifenoles con resistencia a la extracción de supercrítico C02, agua, etanol, metanol, acetona más cloroformo, metanol ácido, hexano y aún hexano más acetona (análisis No 1 ). Todos estos productos químicos fácilmente extraen las antocianinas, pero no operan para extraer los polifenoles de pericarpio protectores y altamente estables.

Teniendo los linajes con el pericarpio protector todos con calidad de grado 10 y los cuales serían la base del germoplasma, e s necesario transmitir la característica del pericarpio para los linajes que forman un híbrido en la parte de la hembra.

Este procedimiento es muy directo y tiene 5 retrocruzamientos consecutivos. Es importante utilizar la fuente de germoplasma del pericarpio protector como la hembra; y el linaje hembra (linaje corriente) el cual forma el híbrido al cual la característica protectora se desea incorporar, como el macho. La semilla resultante es utilizada nuevamente como la hembra y el linaje hembra forma el híbrido al cual la característica protectora se desea incorporar, como el macho.

De esta manera se procede hasta completar 5 retrocruzamientos o 96.87 % de similarídad con el relinaje corriente. Uno o más entrecruzamientos adicionales pueden ser requeridos para obtener más similarídad con el linaje que es deseable para la conversión.

Subsiguientemente, cuando sea necesario las plantas obtenidas deberían ser auto-polinizadas por dos ciclos sucesivos para eliminar todos los riesgos para tener el deseado linaje totalmente convertido y listo para ser utilizado como una hembra original a ser el híbrido con pericarpio protector.

ANÁLISIS 1 DEL MAÍZ El presente análisis utilizó muestras de maíz originadas de material genético desarrollado por semillas "AgricomSeeds"" cuyos granos están protegidos por una herramienta genética.

El método utilizado fue el de extraer el pericarpio a ser sometido a un procedimiento de disociación de tejido de acuerdo con la técnica de Jeffrey (Foster, 1950). Otros cortes del fruto fueron obtenidos con una afeitadora de mano, en una sección transversal y longitudinal.

En ambos casos las muestras fueron sometidas a diferentes tintas: azul de metileno (Stevens, 1916), azul de toluidina, safranina (Johansen, 1940) y azul astra más safranina. Para detectar almidón se utilizó Lugol (Johansen, 1940), y para compuestos lipidíeos Sudán III (Foster, 1949). Subsiguientemente, las muestras fueron montadas entre placas de microscopio, con una gota de agua, y observadas en un microscopio óptico y se tomó una fotografía con una cámara fotográfica.

Resultados: Un maíz normal (Zea mays L.) es un fruto cariopsis (Fig. 1) cuyo pericarpio está unido a la semilla, que carece de color y presenta abundante endosperma amiláceo, con un cotiledón en donde está insertado el eje embriónico. Como en el fruto de maíz normal, el fruto de maíz modificado presenta las mismas características estructurales, siendo la diferencia básica la presencia de pigmentos rojos (polifenoles) en las células de todo el pericarpio, siendo dicha pigmentación evidenciada en el aspecto exterior de este fruto.

El co rte en sección transversal de un fruto de maíz regular ( Zea mays) se muestra en la FIGURA 1. La estructura incluye un pericarpio (P 1), una cobertura aleurónica (AC 1), y un endosperma amilífero (AE 1 ).

El corte en sección transversal del fruto del maíz modificado (Zea mays) se muestra en la FIGURA 2. Le estructura incluye una cutícula (C 2), un pericarpio (P 2), una cubierta aleurónica (AC 2), y un endosperma de la semilla (ES 2).

En la FIGURA 3 se muestra un corte en sección transversal del pericarpio del maíz modificado. En el pericarpio es posible distinguir un epicarpio (EP 3), un mesocarpio (M 3) y un endocarpio (EDC 3). El epicarpio está formado por una cubierta de células epidérmicas y otra cobertura hipodérmica; las células de la epidermis son alargadas, rectangulares y con paredes celulares engrosadas, y con puntos conspicuos (ver la FIGURA 4). El pericarpio incluye una cutícula (C 3), una epidermis (E 3) y una hipodermis (H 3), que son el epicarpio (EP 3); luego el mesocarpio (M 3), y el endocarpio (EDC 3), que tiene células transversales (CL 3), y células axiales (AXC 3).

Tal como se ve en la FIGURA 3, además de una cutícula con una cobertura más engrosada en la cubierta exterior, debido a su estructura y naturaleza química, este provee impermeabilidad al agua, una función de protección mecánica, y resistencia a micro-organismos tales como insectos, hongos y bacterias, así como también a radiación solar y al ingreso de productos contaminantes químicos. La hipodermis está formada por una cobertura celular similar a aquella de la epidermis. A su vez, el mesocarpio ti ene aproximadamente 5 cubiertas celulares regulares, con paredes grasas y puntos conspicuos. Ver la FIGURA 4, en donde se muestra una vista frontal de las células epidérmicas del pericarpio del maíz.

En el endocarpio, a su vez, se distinguen dos grupos de células: las más exteriores dispuestas en 3 cubiertas aproximadamente, transversalmente dispuestas en relación al eje del grano, paredes celulares muy engrosadas y puntos conspicuos; y las más interiores comprenden una cobertura celular con disposición axial con respecto al eje del grano, similares a las anteriores, tal como puede verse en la FIGURA 5, en donde se muestra una vista frontal de las células epidérmicas del pericarpio del maíz modificado, en donde las paredes celulares are con puntos conspicuos. Una característica del pericarpio es que todas sus células contienen pigmentos en el protoplasma, esto es, dentro de la célula.

En la FIGURA 5 se muestran los elementos componentes del mesocarpio y endocarpio del maíz modificado. En donde (A 5) son células de mesocarpio, y (B 5) y (C 5) son células de endocarpio de semilla. Todas ellas tienen pigmento (P 5).

Una primera cubierta de células parenquimatcsas, con alto contenido aleurónico (A 6) puede verse en las FIGURAS 6 y 7.

Hay además células parenquimatosas isodiamétricas que forman la endosperma tal como puede verse en las FIGURAS 10 y 1 1.

La característica estructural que provee protección para los granos del maíz híbrido modificado descripto en la memoria descriptiva, con inclusión uniforme de polímeros inmersos dentro de las células del pericarpio del grano, es la cutícula. La cutícula encierra al grano y le brinda una total protección para su superficie sin utilizar protectors químicos sintéticos y mejor aún, utilizando herramientas genéticas. Esta estructura provee la resistencia de los granos maduros a rigurosas condiciones tales como: lluvia durante la cosecha, altas o bajas temperaturas de campo, alta humedad relativa, polvo (abiótico) ataque de insectos, bacterias u hongos (biótico). De hecho, es una cubierta total e individual para cada grano de maíz, desde la pre-cosecha, cosecha y almacenamiento. La apariencia del grano se vuelve como una porcelana muy suave con un color rojo brillante y saludable.

ANÁLISIS 2 DEL MAÍZ Análisis de fenólicos en maíz rojo - Reporte para semillas "AgricomSeeds" - por las Dras. M. Monica Giusti, Nuryati Pangestu, Departmento de Tecnología y Ciencia d elos Alimentos, The Ohio State University 1 10 Parker Food Science Building, 2015 Fyffe Rd, Columbus, OH 43017.

Resumen: Muestras de maíz pigmentadas fueron recidas de Semillas "AgricomSeeds". Las muestras fueron analizadas para determinar los datos de la composición del maíz incluyendo contenido de antocíanina, antocianinas políméricas, fenólicos totales, y proantocianidínas. Ni las antocianinas monoméricas ni las antocianinas políméricas fueron recuperadas de los granos de maíz o pericarpio de granos de maíz. Sin embargo, las muestras tuvieron altos contenidos fenólicos, con un promedio de 64.2 mg de fenólicos/100 gramos de maíz seco, medido como equivalentes de ácido gálico. Además, ensayos preliminares revelaron la presencia de pro-antocianidinas en el extracto fenólico obtenido de granos enteros y de pericarpio del grano. Además, presentaron un alto contenido de carotenoides.

Los pigmentos responsables del color del tejido epidérmico del grano fueron muy estables, resistentes al hervor, hidrólisis ácida y extracción con solventes comunes utilizados en el laboratorio. Estos no fueron antocianinas monoméricas, y se necesitó un examen adicional para determinar su identidad.

Comentario: Las muestras de maíz recibidas muestran un potencial de valor agregado debido a su alto contenido fenólico, y la presencia de pro-antocianidinas. Este nuevo cultivo de maíz no es recomendado como una fuente de colorante debido a la dificultad de extraer los pigmentos del tejido. Sin embargo, la coloración estable podría representar una gran ventaja para aplicaciones alimenticias.

Procedimiento: Las muestras de maíz pigmentadas fueron recibidas de Semillas "AgricomSeeds". Las muestras fue ron dispuestas en tres diferentes bolsas de papel y tratadas como tres replicaciones. Las muestras fueron analizadas para determinar la composición de del maíz incluyendo el contenido de antocianina, antocianinas poliméricas, fenólicos totales, y proantocianidinas. Cada muestra de maíz fue convertida en polvo utilizando un mezclador Waring. Se utilizó acetona para extracción y se particionó con parte de cloroformo para obtener antocianinas y otros fenólicos. El extracto resultante fue de color amarillo y no se encontraron antocianinas. La torta (material de la planta insoluble) fue de color amarillo y la piel en polvo permaneció coloreada (rojo púrpura). También se llevó a cabo una extracción utilizando diferentes solventes (metanol ácido (0.1 %), hexano, hexano y acetona (1 :1 ratio)). Las muestras fueron hervidas utilizando agua acidificada (0.1 %) para facilitar la extracción de pigmento, y también como un ensayo preliminar para las pro-antocianidinas. Los fenólicos totales fueron medidos en extracto de acetona por medio del método Folin-Ciocalteau para todas las muestras de maíz.

Protocolo HPLC: Las muestras de granos de maíz rojo fueron suministradas por Agricom Seeds. Las muestras fueron extraídas con acetona, y particionadas con cloroformo, seguido por semi-purificación con un cartucho C-18.

Se utilizó un Sistema de cormatografía líquida de fase inversa de alta calidad (HPLC) (Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan) consistente de un cromatógrafo líquido de prominencia LC-20AD, un detector de disposición de iodo de prominencia SPD-M20A, y un tomador automático de muestras SIL-20AC a 4 °C, solución LCMS, software Ver3.30.

Columnas y fase móvil: Se utilizó la columna de Simetría C18, de fase inversa 3.5 µ?t? (4.6x150mm, Waters Corp., Milford, MA, USA) provisto con una columna micro-guarda 4.6 x 22 mm, Simetría 2 (Waters Corp., Milford, MA, USA ). Los solventes y las muestras fueron filtradas a través de filtros de membrana de nylon de 0.45 µ??.

La separación se hizo utilizando una fase de gradiente móvil como sigue: 5% a 25% B, 0-15min; 25% B, 15-20 min; 25-5% B, 20-25min. El solvente A fue 5% (v/v) de ácido fórmico en agua y B fue 10 0% de acetonitrilo. Se utilizó un volumen de inyección de 20 µ? con un rango de flujo o caudal de 0.8 ml/min. Se recogió la información espectral en un rango de longitud de onda de 254-700 nm.

Análisis de antocianina monomérica y polimérica: El pericarpio del grano de maíz mostró un fuerte color rojo/púrpura, típico de la pigmentación de antocianina. Se empleó un protocolo anteriormente usado con otros cultivares de maíz (tal como maíz púrpura Peruano) para extraer y caracterizar antocianinas en este nuevo material de planta. Sin embargo, la extracción con los solventes típicos (acetona, metanol, agua caliente, Tabla 1) para análisis de antocianina resultaron en la no extracción de antocianinas monoméricas o color rojo. Los extractos fueron evaluados por medios Espectrofotométricos y por análisis HPLC. La FIGURA 1 muestra el cromatograma a 520nm, típico de las antocianinas, y no se detectaron picos. No hubo an tocianina mo nomérica o antocíaninas poliméricas detectadas en los extractos.

Fenólicos totales: Cada muestra de maíz fue convertida en polvo utilizando un mezclador Waring. Se utilizó acetona para la extracción y se particionó con cloroformo p ara obtener antocianinas y otros fen ólicos. Los fenólicos totales fueron medidos con extractos de acetona como equivalente de ácido Gálico (GAE) mediante el uso del método Folin-Ciocalteau para todas las muestras de maíz y un espectrofotómetro de doble haz Shímadzu. Las muestras de grano de maíz tuvieron alto contenido de fenólicos, con un promedio de 64.2 mg GAE/100 gramos de granos de maíz seco. El análisis HPLC (FIGURA 1) mostró un pico mayor que representó 62% del total de absorbencia a 280nm y 320nm, indicando la presencia de una mayoría de compuesto fenólico. La muestra de maíz es rica en fenólicos, con alrededor de 3 veces la cantidad reportada para la media total de contenido fenólico de maíz congelado y cultivado convencionalmente (24.7 mg/100 g de peso fresco).

Proantocianidinas: Un ensayo preliminar/ fue llevado a cabo para evaluar la presencia de proantocianidinas en los extractos de maíz. Las muestras fueron sometidas a un tratamiento de ácido fuerte/calor. El resultado fue la formación de un color rojo, sugiriendo la formación de antocianidinas. Por lo tanto, este ensayo preliminar sugiere la presencia de proantocianidinas en las muestras. Su identidad no ha sido determinada.

Estabilidad del Pigmento: Los granos de maíz y tejidos de pericarpio fueron sometidos a tratamientos con diferentes solventes, y la coloración en el tejido no desapareció. Además, los tejidos fueron tratados con agua caliente y agua caliente acidificada, y la coloración rojo/púrpura permaneció presente. Estos resultados indican que los pigmentos responsables por la atractiva coloración de los granos de maíz del cultivar evaluado fueron muy estables. Más estudios serían necesarios para dilucidar la identificación de los pigmentos.

Análisis Espectrofotométrico de flavonoides: Antocianinas, flavonoles y ácidos fenólicos fueron extraídos de semillas individuales con 1 % HCI en 95% de etanol. Los extractos fueron centrifugados dos veces y su absorción determinado espectrofotometricamente a 530 nm para las antocianinas, a 350 nm para los flavonoles y a 280 nm para los ácidos fenólicos. La cantidad de antocianinas fue calculada como equivalentes de cianidina 3-glucósido (con coeficiente de extinción molar (e) 26900 L nVmoh1. M. W. 484.82), contenido de flavonoles como equivalentes de quercetina 3-glucósido (e 21877 L nr1mol-1, M. W. 464.38) y la cantidad de fenólicos como equivalentes de ácido ferúlico (e 14700 L m-1mol- M. W. 194.18). Los valores medio representan siete réplicas independientes ±S.D. Los flobafenos fueron extraídos de semillas individuales con 1 volumen de HCI concentrado y 4 volúmenes de dimetilsulfóxido (DMSO) secuencialmente con vigoroso vórtice luego de cada agregado, esencialmente tal como lo describe Das et al. (28). Los extractos fueron luego centrifugados y el sobrenadante obtenido se diluyó con metanol (20% de concentración final). La concentración de Flobafenos fue expresada como valor de absorbancia a Amax (510 nm) por g. de peso seco ±S.D.

Tabla 1. Observaciones cualitativas con diferentes solventes de extracción: Solvente Color de Color de pellet Otra observación solución (torta) 70 % acetona amarillo El material de La piel en polvo /cloroformo planta insoluble permaneció con el partición fue amarillo. color (rojo púrpura).

Metanol ácido (0.1 amarillo El material de La piel en polvo %) planta insoluble permaneció con el fue amarillo. color (rojo púrpura).

Hexano amarillo El material de La piel en polvo planta insoluble permaneció con el fue amarillo. color (rojo púrpura).

Hexano y acetona amarillo El material de La piel en polvo (1 :1 ratio) planta insoluble permaneció con el fue amarillo. color (rojo púrpura).

De la FIGURA 1 . Cromatograma HPLC de granos de maíz rojo, que muestra el perfil fenólico (280nm) y la falta de antocianinas (520nm), se muestra la siguiente gráfica. 280nm Fenólico A 1000 b s o 500 G b a 40 n 520nm Antocianinas c i 20 a 10 15 Min

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual, en donde el procedimiento comprende las etapas de: (a) seleccionar un germoplasma de un linaje híbrido existente con un alto contenido de antocianinas y alta resistencia a estrés hídrico en combinación con irrigación intensa y con irrigación adicional en el momento de la madurez hasta la cosecha; (b) retrocruzar el material seleccionado con el linaje híbrido existente; el germoplasma del linaje híbrido existente que se ha utilizado como un linaje hembra y el germoplasma del material seleccionado que se ha utilizado como un linaje macho; (c) retrocruzar y seleccionar el material retrocruzado con dichas características para al menos cinco ciclos consecutivos, y conseguir un linaje que es 96.87% similar al linaje existente y (d) obtener una planta de maíz uniforme, que contiene una envoltura aislada y revestimiento protector individual para los granos, y generar un material vegetal de maíz híbrido adecuado para usos industriales y agrícolas.

2. Un procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual, en donde el procedimiento comprende las etapas de: (a) seleccionar un germoplasma de un linaje híbrido existente con un alto contenido de antocianinas (b) sembrar e I germoplasma y se leccionar el material de mazorcas obtenido de las plantas de maíz, con alta resistencia a estrés hídrico en combinación con irrigación intensa y con irrigación adicional en el momento de la madurez hasta la cosecha; (c) retrocruzar el material seleccionado con el linaje híbrido existente; el germoplasma del linaje híbrido existente que se ha utilizado como un linaje hembra y el germoplasma del material seleccionado que se ha utilizado como un linaje macho; (d) clasificar el seleccionado material de mazorca desde el más saludable hasta el menos saludable en una escala de rangos que va desde 1 para choclos pésimos y 10 para choclos muy saludables; (e) seleccionar the material de mazorca de grado mayor a 8 dentro de la escala de 1 a 10; (f) almacenar el seleccionado material de mazorca en la paja de la propia planta de maíz, siendo la paja previamente desintegrada por medio de un rodillo de cuchillas y mezclada con suelo húmedo, promoviendo la inoculación y cultivo de bacterias y hongos existentes que están presentes en la paja; (g) irrigar periódicamente el material almacenado; (h) seleccionar el material de mazorca almacenado, con alta resistencia a la humedad, sol, sequía, contacto con la tierra y gran inoculo de las plantas de maíz, dentro de la escala de 1 a 10; (i) sembrar granos de choclo de maíz de grado 10 como machos y granos de choclo de maíz de grado 9 como hembras; (j) seleccionar y cosechar el material de mazorca sembrado de grado 10, dentro de la escala de 1 a 10; (k) promover la auto-polinización del 100% de las plantas seleccionadas obtenidas F1 ; (I) seleccionar y cosechar el material de mazorca sembrado de grado 10, dentro de la escala de 1 a 10; (m) sembrar granos de choclo de maíz de grado 10 (como machos y granos de choclo de maíz de grado 9 como hembras) promover la auto-polinización del 80% de las plantas seleccionadas obtenidas de las plantas que tienen buenas características desde el punto de vista agronómico, (n) seleccionar y cosechar el material de mazorca sembrado de grado 10, dentro de la escala de 1 a 10; (o) almacenar el seleccionado material de mazorca en la paja de la propia planta de maíz, siendo la paja previamente desintegrada por medio de un rodillo de cuchillas y mezclada con suelo húmedo, promoviendo la inoculación y cultivo de bacterias y hongos existentes que están presentes en la paja; (p) irrigar periódicamente el material almacenado; (q) seleccionar el material de mazorca almacenado de grado 10 y con pericarpio muy suave y brilloso con un intenso color rojo, llevando el material el germoplasma deseado para la calidad del grado por medio de un linaje protector genético que es 96.87% similar al linaje existente, y (r) obtener una planta de maíz uniforme, que contiene una envoltura aislada y revestimiento protector individual para los granos, y generar un material vegetal de maíz híbrido adecuado para usos industriales y agrícolas.

3. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la planta de maíz obtenida en la etapa (d) es además auto-polinizada por medio de dos ciclos sucesivos para eliminar todos los riesgos de tener el deseado linaje totalmente convertido y listo para ser utilizado como una hembra original a ser el híbrido con pericarpio protector.

4. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la planta de maíz obtenida en la etapa (r) es además auto-polinizada por medio de dos ciclos sucesivos para eliminar todos los riesgos de tener el deseado linaje totalmente convertido y listo para ser utilizado como una hembra original a ser el híbrido con pericarpio protector.

5. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 2, en donde en la etapa (h) la selección del material de mazorca almacenado, con alta resistencia a la humedad, sol, sequía, contacto con la tierra y gran inoculo de las plantas de maíz, dentro de la escala de 1 a 10; es llevada a cabo luego de un periodo de noventa días.

6. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde los granos del maíz híbrido tienen las características fisiológicas y morfológicas de tener una envoltura aislada en cada grano individual que cubre enteramente las superficies del grano y aisla la totalidad del endosperma con respecto al exterior y conserva todas las características germinativas y de los nutrientes de los padres.

7. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde los granos del maíz híbrido tienen las características fisiológicas y morfológicas de tener una inclusión uniforme de polímeros, inmersos dentro de las células del pericarpio del grano, en donde el pericarpio envuelve y provee un revestimiento protector para la totalidad de la superficie del grano.

8. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la planta de maíz híbrido tiene las características fisiológicas y morfológicas de: (1) tolerancia al estrés debido a la falta de agua y resistencia a la indebida cantidad de agua, (2) resistencia a las inadecuadas temperatura y humedad relativa (3) resistencia al polvo, (5) resistencia a las enfermedades por insectos, bacterias u hongos.

9. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el pericarpio que tiene el revestimiento protector de la planta de maíz híbrido tiene las características fisiológicas y morfológicas de ser capaz de ser separado cuando es extraído por medio de los equipos industriales de procesamiento de choclo y los sub-productos y el pericarpio separado son capaces de ser utilizados en la fabricación de materiales de mayor resistencia.

10. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los granos del maíz híbrido tienen las características fisiológicas y morfológicas de tener una envoltura aislada en cada grano individual que cubre enteramente las superficies del grano y aisla la totalidad del endosperma con respecto al exterior y conserva todas las características germinativas y de los nutrientes de los padres.

11. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los granos del maíz híbrido tienen las características fisiológicas y morfológicas de tener una inclusión uniforme de polímeros, inmersos dentro de las células del pericarpio del grano, en donde el pericarpio envuelve y provee un revestimiento protector para la totalidad de la superficie del grano.

12. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la planta de maíz híbrido tiene las características fisiológicas y morfológicas de: (1) tolerancia al estrés debido a la falta de agua y resistencia a la indebida cantidad de agua, (2) resistencia a las inadecuadas temperatura y humedad relativa (3) resistencia al polvo, (5) resistencia a las enfermedades por insectos, bacterias u hongos.

13. El procedimiento para producir un maíz híbrido que presenta granos con una envoltura aislada y un revestimiento protector individual de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el pericarpio que tiene el revestimiento protector de la planta de maíz híbrido tiene las características fisiológicas y morfológicas de ser capaz de ser separado cuando es extraído por medio de los equipos industriales de procesamiento de choclo y los sub-productos y el pericarpio separado son capaces de ser utilizados en la fabricación de materiales de mayor resistencia.

14. Una semilla del maíz híbrido producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 1.

15. Una semilla del maíz híbrido producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 2.

16. Una planta de maíz híbrido, o una parte de la misma, producida mediante el cultivo de la semilla de acuerdo con la reivindicación 14.

17. Una planta de maíz híbrido, o una parte de la misma, producida mediante el cultivo de la semilla de acuerdo con la reivindicación 15.

18. Polen de la planta de maíz híbrido de acuerdo con la reivindicación 16.

19. Polen de la planta de maíz híbrido de acuerdo con la reivindicación 7.

20. Un óvulo u óvulos de la planta de maíz híbrido de acuerdo con la reivindicación 16.

21. Un óvulo u óvulos de la planta de maíz híbrido de acuerdo con la reivindicación 17.

22. Un cultivo de tejido de células regenerables producido a partir de la planta de maíz híbrido de acuerdo con la reivindicación 16.

23. Un cultivo de tejido de células regenerables producido a partir de la planta de maíz híbrido de acuerdo con la reivindicación 17.

24. Protoplastos o callos producidos a partir del cultivo de tejido de acuerdo con la reivindicación 22.

25. Protoplastos o callos producidos a partir del cultivo de tejido de acuerdo con la reivindicación 23.

26. El cultivo de tejido de acuerdo con la reivindicación 22, en donde las células regenerables del cultivo de tejido son producidas a partir de protoplastos o a partir de tejido de una parte de planta seleccionada del grupo que consiste de: embrión inmaduro, embrión, células meristemáticas, táselas inmaduras, microesporas, polen, raíz, punta de raíz, antera, seda, hoja, flor, grano, espiga, mazorca, cáscara y tallo.

27. El cultivo de tejido de acuerdo con la reivindicación 23, en donde las células regenerables del cultivo de tejido son producidas a partir de protoplastos o a partir de tejido de una parte de planta seleccionada del grupo que consiste de: embrión inmaduro, embrión, células meristemáticas, táselas inmaduras, microesporas, polen, raíz, punta de raíz, antera, seda, hoja, flor, grano, espiga, mazorca, cáscara y tallo.