MX2011010080A - Marcadores geneticos de severidad de la esclerosis multiple. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de SNPs para predecir la susceptibilidad y/o severidad de la esclerosis múltiple en un individuo; los SNPs están localizados en los intrones de las enzimas de glicosilación MGAT5 y XYLT1, en dirección 3' de HIF1AN, dentro de los intrones de MEGF11, FGF14, PDE9A y CDH13, y dentro de regiones desérticas de 4q34 y 17p13.

Description

MARCADORES GENÉTICOS DE SEVERIDAD DE LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al uso de SNPs para identificar una asociación con la severidad de la esclerosis múltiple (MS) en un sujeto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria y desmielinizante crónica del sistema nervioso central (SNC), que frecuentemente empieza en la edad adulta temprana. La MS se considera una enfermedad compleja, puesto que probablemente se combinan múltiples factores genéticos y no genéticos para afectar el riesgo de la enfermedad. La evidencia de una función de los factores genéticos es convincente y está apoyada por estudios en gemelos, medios hermanos y adoptados. Aunque la MS usualmente empieza con un curso de recaída-remisión (RR), la mayoría de los pacientes entran después a una fase progresiva secundaria (SP), mientras que otros, frecuentemente con un inicio tardío, pueden entrar directamente a una progresión primaria (PP).

Los barridos del genoma han excluido la presencia de un locus de susceptibilidad mayor en la MS aparte de la región de HLA de clase II, y no han podido revelar más que algunos locus putativos de susceptibilidad1"3. Dentro del complejo del gen HLA se han indicado asociaciones con varios alelos de HLA-DRB14, mientras que alguna evidencia también sugiere un factor de riesgo independiente de MS en la región de HLA de clase I5'7. Muy recientemente se está acumulando evidencia que apoya la importancia del gen IL7Ra en la MS8"10. Sin embargo, es evidente que quedan por identificar otros factores de riesgo genéticos.

La susceptibilidad a la MS es inequívocamente un rasgo genético complejo. El curso clínico y el resultado de la MS difieren ampliamente y parece probable que aunque algunos genes pueden estar implicados en la inducción de la enfermedad, otros pueden tener una función en la alteración de la severidad de la enfermedad11 ,12. La severidad de la MS se evalúa como el desarrollo de discapacidad como una función de la duración de la enfermedad, pero se puede complicar por el hecho de que la tasa de progresión difiere de tiempo en tiempo y porque los pacientes también pueden mostrar periodos de mejoramiento. El método usado más ampliamente de evaluación clínica de severidad de MS se basa en la Escala Expandida del Estatus de Discapacidad (EDSS13). Tradicionalmente se ha usado ampliamente el índice de progresión (Pl= puntuación de EDSS /duración en años), pero es entorpecido por las razones arriba mencionadas. Más recientemente se propuso la Puntuación de Severidad de MS (MSSS) como un enfoque novedoso, que relaciona las puntuaciones de EDSS con la distribución de discapacidad en los pacientes con duraciones de enfermedad comparables, compensando parcialmente la debilidad del Pl14.

Se han probado varios genes candidatos para determinar una posible asociación con la severidad de MS (véase la referencia 15). La mayoría de ellos no presentan evidencia de asociación genética con el pronóstico de MS: apolipoproteína e (APOE, véase la referencia 16), ataxia espinocerebelar 2 (SCA217), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF18), receptor 4 de tipo Toll (TLR419), osteopontina20; linfocito T citotóxico asociado 4 (CD152 o CTLA4) y CD2821, y receptor 5 de quimocina CC (CCR5) y HLA-DRB1* 50122. Solo se han reportado un puñado de locus que están asociados con el resultado clínico de MS: el locus de interleucina 1 en el cromosoma 2q12-14 contiene 3 genes (1 L-1a, IL- ß y antagonista del receptor de IL-1 IL-1 RN) en los que se reportó que 6 sitios, 5 polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) y un número variable de repeticiones en tándem (VNTR), están asociados con la severidad medida por EDSS calificada en tres categorías de severidad23; en el promotor de interleucina 10 se reportaron dos marcadores de microsatélite representados diferencialmente entre las categorías de progresión de enfermedad leve (Pl<0.5) y severa (Pl>0.5)24; se encontraron dos SNPs que están asociados con categorías de MS (recaída y remisión -RR- contra progresión primaria -PP), pero no con el pronóstico medido por MSSS en el gen ADAMTS1425; y se ha mostrado que la incidencia y severidad de la enfermedad aumenta en el modelo murino MOG-EAE deficiente en CD59a26. Sin embargo, estos estudios estuvieron basados en números limitados de individuos y ninguno se duplicó. Además, todos estos estudios utilizaron enfoques categóricos para detectar la asociación con la severidad: los pacientes se clasificaron en categorías de MS leve/moderada/severa o leve/severa escogiendo umbrales de corte sobre los volúmenes de la lesión, el EDSS, el Pl o las escalas de MSSS, y las frecuencias de los alelos y genotipos se compararon entre las categorías.

En vista de la significancia de la MS, existe la necesidad de identificar marcadores, en particular marcadores genéticos, útiles en los pacientes de MS. En particular, existe la necesidad de identificar marcadores genéticos útiles para predecir la susceptibilidad y en particular la severidad de la enfermedad MS.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención está dirigida a un método para determinar el genotipo que comprende los pasos de: (a) usar un ácido nucleico aislado de una muestra de un individuo; y (b) determinar el tipo de nucleótido en el SNP rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522, rs4573623 rs333548, rs10508075, rs2839580, rs2495725, rs3814022, rs1078922, o rs4315313, en uno o los dos alelos del marcador dialélico, o en un SNP en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de estos SNPs.

En un aspecto, la invención se refiere a uno o más SNPs seleccionados del grupo que consiste en los SNPs rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522, rs4573623, rs333548, rs10508075, rs2839580, rs2495725, rs3814022, rs1078922, rs4315313, SNPs en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de estos SNPs, para usarse en la predicción de la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple en un individuo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento de la esclerosis múltiple en un individuo en necesidad del mismo, el método comprendiendo los pasos de: (a) aplicar un método como se describe arriba a una muestra de un individuo in vitro, (b) tratar á dicho individuo que se ha identificado que presenta uno o más de los marcadores arriba descritos, y se ha identificado que dicho individuo presenta un cierto grado de severidad de la enfermedad esclerosis múltiple.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En lo siguiente la invención se describirá en más detalle; los ejemplos pretenden ilustrar la invención y no se consideran limitativos del alcance de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Distribución de MSSS Histograma de la distribución de la puntuación de la severidad de MS en los 1 ,040 pacientes de MS.

Figura 2. Cálculo de la FDR (tasa de descubrimiento falso) de las asociaciones de severidad La FDR se calculó con 10,000 rondas de barajado de MSSS y se gráfico contra el número de positivos seleccionados R para R= 100 (línea gruesa). Esta curva da la proporción calculada de falsos positivos para un número dado de positivos (por ejemplo, se calcula que 90% de los 40 SNPs más probablemente asociados {R= 40) son falsos positivos), o el número de positivos para una tasa de descubrimiento falso dada (por ejemplo solamente se selecciona un SNP a 40% de umbral de FDR). Las líneas de trazos representan los límites del intervalo de confianza de 95% del cálculo).

Figuras 3.1-3.10. Ejemplos de SNPs asociados con la severidad de la enfermedad Las gráficas de dispersión de la izquierda representan las distribuciones de MSSS en toda la población (negro: (1) columna más izquierda) y para los individuos que tienen el homocigoto mayor (rojo: (2) segunda columna desde la izquierda), el heterocigoto (azul: tercera columna desde la izquierda), y el homocigoto menor (verde: columna más derecha) para el SNP considerado. Las líneas horizontales (cuadros respectivos) indican promedios de MSSS (desviaciones estándares respectivas) dentro de las categorías. Las funciones de distribución acumulativa se representan a la derecha.

Figura 3.1 : SNP 1 desierto, chr4, rs6552511 Figura 3.2: SNP 2 desierto, chr17, rs7221818 Figura 3.3: SNPs 3 y 4, XYLT1 , rs12927173 y rs2059283 Figura 3.4: SNPs 5, 7 y 1 1 , HIF1AN, rs1343522, rs4573623 y rs2495725 Figura 3.5: SNPs 6 y 12, MGAT5, rs495391 1 y rs3814022 Figura 3.6: SNP 8, MEGF1 1 , rs333548 Figura 3.7: SNP 9, FGF14, rs10508075 Figura 3.8: SNP 10, PDE9A, rs2839580 Figura 3.9: SNP 13, MTPN, rs1078922 Figura 3.10: SNP 14, CDH13, rs4315313 Figura 4. Duplicación del SNP en XYLT1 v MGAT5 Gráficas de dispersión de asociación (la misma leyenda de las figuras 3.1-3.10) de 3 SNPs sobre el conjunto de datos de duplicación dé 873 muestras independientes. Los primeros dos SNPs de arriba están localizados en el gen MGAT5 y el tercero está en el gen XYLT1.

Los SNPs y las secuencias de contexto se representan a continuación: CJI en Códigos de SNP de la IUPAC: En un aspecto, la presente invención está dirigida a un método para determinar el genotipo, que comprende los pasos de: (a) usar un ácido nucleico aislado de una muestra de un individuo; y (b) determinar el tipo de nucleótido en el SNP rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs 343522, rs4573623 rs333548, rs10508075, rs2839580, rs2495725, rs3814022, rs 078922, o rs4315313 en uno o los dos alelos del marcador dialélico, o en un SNP en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de estos SNPs.

Los SNPs de interés particular se seleccionan preferiblemente de rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522 o rs4573623.

En una modalidad, los SNPs de acuerdo con la invención útiles en los métodos y usos de la invención son también aquellos SNPs en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de los SNPs identificados, expresados por un coeficiente de correlación de LD i2 mayor de 0.8 en por lo menos una población de por lo menos 100 individuos, preferiblemente un coeficiente de correlación de LD i2 mayor de 0.95.

La "asociación" de un marcador, por ejemplo un SNP, con la severidad de la esclerosis múltiple en un paciente de acuerdo con la invención, significa la diferencia estadísticamente significativa de las frecuencias del marcador entre dos poblaciones de pacientes que tienen diferentes grados de severidad de esclerosis múltiple.

La "severidad" de la esclerosis múltiple (MS) puede ser expresada de acuerdo con la invención con cualquier medio conocido en el campo de la MS, como por ejemplo la Escala Expandida del Estatus de la Enfermedad (EDSS) o con otras técnicas o mediciones o definiciones usadas comúnmente en el campo. Se entiende que el término "actividad de enfermedad residual" usado frecuentemente en este contexto y en el campo indica un cierto grado de enfermedad MS, por ejemplo la presencia de síntomas clínicos, definidos por cualquiera de las mediciones o definiciones aplicadas usualmente en el campo de la MS. Un indicador o medición de la "actividad de enfermedad residual" puede ser la experiencia de recaídas o progresión de la enfermedad, medidas por ejemplo por medio de la Escala Expandida del Estatus de la Enfermedad (EDSS) o por Imagenología de Resonancia Magnética (MRI). Como un ejemplo del marco de tiempo es la evaluación durante dos años de tratamiento. Se aprecia que se pueden definir y usar otros marcos de tiempo, por ejemplo un año, tres años, u otros aplicados usualmente en protocolos de estudios clínicos y muy conocidos para el experto en la materia. El marco de tiempo de referencia se puede escoger a fin de permitir una medición y lectura adecuadas. Igualmente, se pueden aplicar otras mediciones aceptadas del estatus de enfermedad, como por ejemplo la Puntuación Básica de la Esclerosis Múltiple de Cambridge (CAMBS), y otras usadas por el experto en la materia. Existen varias definiciones de un ataque de MS que serán entendidas por el experto en MS, que se pueden aplicar de acuerdo con la invención. Por consiguiente, existen varias posibilidades que el experto en la materia puede aplicar cuando trabaja con la invención. Ejemplos de evaluación o diagnóstico de MS son publicados por Kurzke J.F., Neuroepidemiology, 1991 , 10: 1 - 8; Kurzke J.F., Neúrology, 1983, 33: 1444 - 1452; McDonald W.l et al., Ann. Neurol., 2001 , 50: 121 -127; Polman C.H. et al. , Ann. Neurol. 2005, 58: 840 - 846. Por consiguiente, un marcador o SNP de severidad puede representar un marcador que indica una severidad alta o baja de una enfermedad en un paciente, en comparación con la población de MS.

Un individuo tratado de acuerdo con la invención "responderá" al tratamiento. Se entiende que la "respuesta" o los "respondedores" al tratamiento con interferón en un individuo con diagnóstico de MS, o que padece MS, o un paciente de MS en el sentido de la presente invención, es la actividad de enfermedad residual de acuerdo con los criterios expuestos más abajo por tratamiento con interferón, en particular con interferón beta 1a ó 1 b, y en particular Rebif®, Avonex®, Cinnovex® Betaseron® y Extavia®, de un paciente de MS. La respuesta se puede definir o medir como un aumentó del tiempo antes de la progresión de la enfermedad, medido por ejemplo con la Escala Expandida del Estatus de Enfermedad (EDSS), o con otras técnicas o mediciones o definiciones usadas comúnmente en el campo. En particular se considera como sin progresión o sin empeoramiento de MS, o un perfil/actividad clínica estable, o como el mejoramiento de MS, por ejemplo, en signos clínicos o medido con otros medios como MRI o análisis de CSF (fluido cerebroespinal). En particular, se puede entender como recaídas, ataques o exacerbaciones menos frecuentes, o recaídas, ataques o exacerbaciones más leves.

Como se usa en la especificación y las reivindicaciones, "un/una" significa uno o más, a menos que se indique explícitamente de otra manera.

Un "alelo" es una forma particular de un gen, marcador genético u otro locus genético, que es distinguible de otras formas del gen, marcador genético u otro locus genético; por ejemplo sin limitación por su secuencia particular de nucleótidos. El término alelo también incluye, por ejemplo, sin limitación, una forma de un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Un individuo puede ser homocigótico para un cierto alelo en células díploides, es decir, el alelo en los dos cromosomas apareados es idéntico; o heterocigótico para dicho alelo, es decir, los alelos en ambos cromosomas apareados no son idénticos.

Un "marcador genético" es un locus genético poh'mórfico ¡dentificable. Un ejemplo no limitativo de un marcador genético es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Un "marcador" puede ser un marcador genético o cualquier otro marcador, por ejemplo el grado de expresión de un gen particular en nucleótidos como ARNm, útil en el contexto de la invención por ser indicativo de una respuesta al tratamiento con interferón.

Un "genotipo", como se usa aquí, se refiere a la combinación de los dos alelos de un marcador genético, por ejemplo sin limitación de un SNP, sobre un solo locus genético en cromosomas apareados (homólogos) en un individuo. El "genotipo", como se usa aquí, también se refiere a la combinación de alelos de más de un locus genético, por ejemplo sin limitación de SNPs, sobre un par o más de un par de cromosomas homólogos en un individuo.

La "determinación del genotipo" es un proceso para determinar el genotipo de un individuo.

El "locus" o "locus genético" se refiere a una localización específica sobre un cromosoma u otro material genético.

El "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico o un derivado de ácido nucleico, que incluye sin limitación un ácido nucleico cerrado (LNA), ácido péptido nucleico (PNA) o ácido nucleico de puente (BNA), que usualmente tiene una longitud de entre 5 y 100 bases contiguas, más frecuentemente entre 5-40, 5-35, 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-50, 20-40, 20-30 o 20-25 bases contiguas de longitud. La secuencia de un oligonucleótido puede ser diseñada para hibridar específicamente con cualquiera de las formas alélicas de un marcador genético; tales oligonucleótidos se denominan sondas específicas de alelo. Si el marcador genético es un SNP, el alelo complementario para ese SNP puede ocurrir en cualquier posición dentro de una sonda específica de alelo. Otros oligonucleótidos útiles en la práctica de la invención se hibridan específicamente con una región objetivo adyacente a un SNP, con su extremo 3' localizado de 1 a = aproximadamente 10 nucleótidos del locus marcador genético, preferiblemente < aproximadamente 5 nucleótidos. Dichos oligonucleótidos que se hibridan junto a un SNP son útiles en los métodos de extensión de iniciador mediados por polimerasa, y se denominan aquí "oligonucleótidos de extensión de iniciador". En una modalidad preferida, el extremo 3' de un oligonucleótido de extensión de iniciador es un desoxinucleótido complementario al nucleótido localizado inmediatamente junto a un SNP.

El "polimorfismo" se refiere a dos o más formas alternas (alelos) en una población de un locus genético, que difieren en su secuencia de nucleótidos o tienen números variables de unidades de nucleótido repetidas. El polimorfismo ocurre en regiones codificadoras (exones), regiones no codificadoras de genes o fuera de los genes. Los diferentes alelos de un polimorfismo normalmente ocurren en una población a diferentes frecuencias, y algunas veces el alelo que ocurre más frecuentemente en una población seleccionada se denomina el alelo "mayor". Los organismos diploides pueden ser homocigóticos o heterocigóticos para los diferentes alelos que existen. Un polimorfismo dialélico tiene dos alelos. En dicho método, preferiblemente la identidad de los nucleótidos de dichos marcadores dialélicos se determina en las dos copias de dichos marcadores dialélicos presentes en dicho genoma del individuo. Se puede aplicar cualquier método conocido para el experto en la materia; preferiblemente dicha determinación se hace por medio de una prueba de microsecuenciación. Además, es posible amplificar una parte de una secuencia que comprende el marcador dialélico antes de dicho paso de determinación, por ejemplo por medio de PCR. Sin embargo se puede usar cualquier método aplicable.

De acuerdo con la invención se prefiere que el método comprenda adicionalmente el paso de correlacionar el resultado de los pasos de la determinación del genotipo con la asociación de los resultados de la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple.

Ahora los inventores han encontrado en un método preferido de acuerdo con la invención que la presencia de un alelo de severidad está caracterizada en rs3814022 por G, en rs495391 1 por T, en rs2059283 por A, en rs12927173 por A, en rs2495725 por A, en rs1343522 por G, en rs4573623 por G, una T en rs333548, una G en rs10508075, una A en rs2839580, una A en rs2495725, una G en rs3814022, una G en rs1078922, o una C en rs4315313, y que es indicativa de la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple. En el SNP particular de acuerdo con la invención, la base respectiva, A, T, C, G, está presente en un alelo o preferiblemente en los dos alelos, y por consiguiente es indicativo de la severidad de MS. En particular, un SNP de la invención puede indicar que un individuo probablemente está afectado más severamente por MS, o puede representar un marcador indicativo de estar afectado menos severamente por MS en comparación con la población promedio de MS.

Así, los inventores proveen convenientemente un medio para hacer una distinción entre diferentes pacientes y diferentes grupos de pacientes de la población general de MS, y en particular los clasifican de acuerdo con la severidad de la enfermedad. De este modo se aplican los métodos y aparatos más avanzados de biología molecular, como PCR y cicladores de PCR, y los algoritmos de estadística generalmente conocidos para el experto en la materia. De esta manera, los pacientes se pueden agrupar según su severidad de MS esperada de acuerdo con la MSSS, por ejemplo, en muy severa, medio severa, no muy severa y ligeramente severa. Por lo tanto, la invención provee una herramienta que tiene implicaciones para el mejor manejo de dichos pacientes de acuerdo con su etapa y severidad de la enfermedad. En particular, ahora será posible adaptar de mejor manera los esquemas de dosis y tratamiento para cada paciente individual.

En un aspecto preferido, la invención se refiere a uno o más SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522, rs4573623, rs333548, rs10508075, rs2839580, rs2495725, rs3814022, rs1078922, rs4315313, SNPs en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de estos SNPs, para usarse en la predicción de la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple en un individuo.

En otro aspecto, la invención está dirigida a un método para predecir la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple en un individuo, que comprende: (a) usar el ácido nucleico de una muestra de dicho individuo; (b) identificar la presencia de un marcador genético útil en dicho individuo mediante los métodos conocidos; (c) basándose en los resultados del páso (b) hacer una predicción de la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple para dicho individuo.

En dicho método el marcador genético está relacionado con uno o más SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522, rs4573623, rs333548, rs10508075, rs2839580, rs2495725, rs3814022, rs1078922, rs4315313, SNPs en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de estos SNPs. Los SNPs de interés particular se seleccionan preferiblemente de rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522 o rs4573623.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento de la esclerosis múltiple en un individuo en necesidad del mismo, el método comprendiendo los pasos de: (a) aplicar un método como el que se describe arriba a una muestra de un individuo; (b) tratar a dicho individuo aplicando un interferón, en donde se ha identificado por medio de cualquiera de los métodos arriba descritos que dicho individuo presenta uno o más de los marcadores descritos y está en riesgo de tener o desarrollar una forma severa de la enfermedad esclerosis múltiple. Alternativamente, la invención se refiere al uso de un interferón para el tratamiento, o al interferón para su usó en el tratamiento, de un paciente de esclerosis múltiple, dicho paciente caracterizado porque lleva, o se ha identificado que presenta, por lo menos un alelo de severidad de un SNP de acuerdo con la invención. En una alternativa adicional, la invención se refiere a un SNP de acuerdo con la invención para usarse en el diagnóstico de la severidad de MS en un paciente y adoptar el tratamiento para dicho paciente de acuerdo con la severidad de su enfermedad.

Los SNPs de interés particular en dicho método o uso se seleccionan preferiblemente de rs3814022, rs495391 1 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522 o rs4573623.

Así, la invención se puede usar convenientemente en particular para estratificar y ajusfar la dosis del interferón o el punto de tiempo del tratamiento. Una posible medida puede ser un tratamiento de dosis alta, o un tratamiento antes de que los signos clínicos de MS sean visibles en un paciente identificado como muy severamente afectado por MS. La MRI se puede aplicar para analizar el estatus de la enfermedad de un paciente y se puede hacer una agrupación/clasificación del paciente de acuerdo con estos resultados, de la manera indicada arriba. Será particularmente conveniente para un paciente de MS identificado de acuerdo con la invención con alto riesgo de ser afectado severamente por la MS, ser tratado en un punto de tiempo temprano para manejar su enfermedad desde temprano. Así, se pueden elegir las medidas apropiadas tales como un tratamiento y dosificación adecuadas de interferón. Además, el conocimiento del paciente apoyará el cumplimiento del tratamiento. A su vez, un aumento del cumplimiento terapéutico tiene efectos positivos sobre los resultados del tratamiento y por lo tanto sobre su eficacia.

Preferiblemente, el interferón beta (IFN) es interferón beta 1 a o 1 b. Los ejemplos del interferón beta son Rebif®, Avonex®, Cinhovex®, Betaseron® o Extavia®.

La dosis administrada de IFN a un individuo en el método o uso anterior, como una sola dosis o como dosis múltiples, variará, además de los resultados del agrupamiento del paciente, dependiendo de una variedad de factores que incluyen las propiedades farmacocinéticas, la vía de administración, las condiciones del paciente y sus características (sexo, edad, peso corporal, salud, talla), la magnitud de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia de tratamiento y el efecto deseado.

Las dosis estándares de IFN-beta humano varían de 80 000 Ul/kg a 200 000 Ul/kg por día, o 6 MUI (millones de unidades internacionales) a 12 MUI por persona por día, o 22 a 44 pg (mícrogramos) por persona. De acuerdo con la presente invención, el IFN se puede administrar convenientemente a una dosis de aproximadamente 1 a 50 Mg, de preferencia de aproximadamente 10 a 30 pg, o aproximadamente de 10 a 20 pg por persona por día.

La administración de los ingredientes activos de acuerdo con la presente invención puede ser por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Una vía de administración preferida para el IFN es la vía subcutánea.

El IFN también se puede administrar diariamente o cada tercer día, o menos frecuentemente. Preferiblemente el IFN se administra una vez, dos veces o tres veces por semana.

Una vía de administración preferida es la administración subcutánea, administrada por ejemplo tres veces a la semana. Una vía de administración más preferida es la administración intramuscular, que se puede aplicar por ejemplo una vez a la semana.

Preferiblemente se administran de 22 a 44 pg o de 6 MUI a 12 MUI de IFN-beta tres veces a la semana por inyección subcutánea. El IFN-beta se puede administrar por vía subcutánea a una dosis de 25 a 30 pg u 8 MUI a 9.6 MUI cada tercer día. Además se puede administrar 30 pg o 6 MUI de IFN-beta por vía intramuscular una vez a la semana.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no se consideran limitativos de la invención. Los siguientes ejemplos representan modalidades preferidas de la invención, que servirán para ilustrar la invención.

Los ejemplos muestran, en una modalidad preferida de la invención, los resultados de un enfoque para identificar marcadores de severidad, que es: (i) de todo del genoma (es decir, libre de hipótesis), y (ii) no categórico (es decir, continuo). En primer lugar, se reclutaron tres cohortes de pacientes de MS (n= 1 ,040) de hospitales de Francia, Suecia e Italia, y se determinó el genotipo para aproximadamente 500,000 SNPs en todo el genoma con la tecnología Affymetrix Genechip® 500K. La severidad de MS se calificó continuamente con la MSSS, y la correlación con los genotipos de los polimorfismos más frecuentes (~ 105,000 SNPs) se evaluó por medio de una prueba no paramétrica entre las distribuciones de MSSS en pacientes homocigóticos para los alelos de cada marcador. El problema de pruebas múltiples fue controlado por cálculo de la tasa de descubrimiento falso (FDR). El enfoque resultó en la identificación de 14 marcadores de severidad, localizados en 8 genes diferentes y 2 regiones desérticas. En segundo lugar, se determinaron los genotipos de algunos marcadores en una cohorte de duplicación independiente de 873 pacientes de MS. Se identificaron dos genes de enzima de glicosilación, apoyando así la importancia de la regulación del glicano en la MS.

Materiales v métodos Colecciones Un número total de 1 ,040 pacientes no emparentados de Francia, Italia y Suecia se incluyeron en el conjunto de datos de "selección", y 873 pacientes no emparentados e independientes de Francia y Suecia en el conjunto de datos de "duplicación" (cuadro 1). Todos los sujetos eran caucásicos y tenían un diagnóstico de esclerosis múltiple de acuerdo con el criterio de McDonald27; los cursos de su enfermedad se clasificaron como recaída-remisión, progresión secundaria o progresión primaria28; La discapacidad se calificó usando la EDSS de Kurtzke. La edad promedio fue de 43.8 años, la puntuación promedio de EDSS fue de 3.6 y la proporción de sexo fue 2.1 mujeres/hombres. Se obtuvo el consentimiento informado para el análisis genético de todos los individuos y los comités de ética locales aprobaron el protocolo del estudio.

Las características demográficas y clínicas detalladas de los pacientes de MS se muestran en el cuadro 2 para los conjuntos de datos de selección y duplicación. La duración de la enfermedad se definió como el número de años entre el año del inicio del primer síntoma y el año del último examen con evaluación EDSS, en la mayoría de los casos a la entrada en el estudio. La edad al inicio de los síntomas fue definida como la edad al primer episodio de disfunción neurológica sugestiva de enfermedad desmielinizante.

Calificación de la discapacidad La EDSS de Kurtzke es la medida usada más ampliamente de discapacidad en los estudios de MS, pero no toma en cuenta la duración de la enfermedad, un parámetro que es crítico para describir la tasa de progresión. Por esta razón los presentes autores utilizaron la MSSS 4, que provee una medida de la severidad de la enfermedad en un paciente individual en una base transversal. Esta escala relaciona las puntuaciones de EDSS con la distribución de discapacidad en un conjunto de datos grande de pacientes con duraciones de enfermedad comparables. La MSSS se calcula usando el programa de software MSSStest v. 2.0 que se describe en la referencia 14.

Determinación del genotipo y control de calidad Las muestras de ADN del conjunto de datos de selección se estudiaron independientemente usando la tecnología de mapeo humano 500K GeneChip® de Affymetrix. Se extrajeron los genotipos de los 497,641 SNPs seleccionados por Affymetrix para cada muestra de ADN con el programa de software B-RLMM, asegurando una tasa de extracción mínima de 97%. Se conservaron para el análisis solo los SNPs de los cromosomas autosómicos. Para evitar desviaciones debidas a frecuencias de genotipo muy bajas, se filtraron los marcadores con una frecuencia baja de alelo menor (MAF < 30%) o una tasa alta de datos faltantes (proporción de ADN no tipificado >5%). Los presentes autores decidieron enfocarse en los marcadores muy frecuentes (MAF > 30%), que aseguran una frecuencia mínima de homocigoto menor de más de 9% bajo equilibrio de Hardy-Weinberg (y por lo tanto un tamaño de población de homocigoto menor de más 100 en promedio). Los genotipos de las muestras de ADN del conjunto de datos de selección se determinaron independientemente para SNPs seleccionados usando la prueba de determinación de genotipo TaqMan® de Applied BioSystems.

Barrido de la severidad Para cada SNP se hizo una prueba de suma de rangos de Wilcoxon29 en los dos conjuntos de puntuaciones de severidad de MS que corresponden a los pacientes homocigóticos, para los alelos dé cada marcador. Esta prueba no paramétrica asigna un valor de probabilidad (valor p) a cada SNP. Para el conjunto de datos de selección, la tasa de descubrimiento falso (FDR) se calcula por permutación: (i) la distribución nula se simula barajando las puntuaciones de severidad de MS, volviendo a calcular valores p de Wilcoxon, y repitiendo el proceso 10,000 veces; (¡i) la FDR se calcula de la siguiente manera para cada umbral a del valor p; FDR = min(1 , p.m I R), en donde R es el número de positivos en el nivel a (número de SNPs con un valor p menor de a), m es el número de pruebas realizadas (número de SNPs barridos), y p es la probabilidad de tener un valor p menor que a bajo la hipótesis nula, calculada por medio del paso de permutaciones previo30'31.

Análisis qenómico Los SNPs se localizaron en la secuencia del genoma humano NCBI v36. Se tomaron anotaciones de la estructura génica (exones e intrones) de la edición 43 de ENSEMBL32. Los haplotipos y las matrices de LD se calcularon usando HaploView33 usando la columna firme del método LD con un corte de extensión 0.8 D'.

Resultados Sobre los 1 ,040 pacientes, la MSSS fue en promedio 4.42 (desviación estándar 2.79) abarcando desde 0.086 hasta 9.964 (véase la distribución global en la figura 1 ). De los 497,641 SNPs, 105,035 (21 %) superan los criterios de filtración y se usan para el análisis, cubriendo 63% del genoma.

La FDR de los resultados observados se calculó con 10,000 rondas de barajado de MSSS y se gráfico en la figura 2 para los 100 valores p más pequeños. La FDR empieza alta (alrededor de 50%), se eleva rápidamente hasta una meseta de 80% y después converge lentamente hacia 1. Cuando se considera el límite inferior del intervalo de confianza de 95%, un umbral de FDR de 40% selecciona 14 SNPs (cuadro 3). Estos SNPs corresponden a los genotipos frecuentes (como se asegura por el filtro inicial de 30% de AF) y todos estuvieron bajo equilibrio de Hardy-Weinberg. La selección corresponde a un corte de valor p de la severidad de 1.4e-4. La correlación entre los genotipos y MSSS se ilustra en las figuras 3.1-3.10.

En los enfoques categóricos clásicos, la escala MSSS se separa en categorías, por ejemplo en formas leve y severa de MS, y los estudios de asociación clásicos se hacen para detectar las diferencias de genotipo entre estas dos categorías. Cuando los presentes inventores lo aplicaron a su conjunto de datos, usando por ejemplo dos grupos de 501 formas de MS leve (MSSS < 4) y 356 formas de MS severas (MSSS > 6), no pudieron detectar ningún SNP asociado significativo después de corrección de pruebas múltiples por FDR31. Por ejemplo, el SNP rs7221818 (clasificado como 2 en el presente enfoque continuo, véase el cuadro 3), fue clasificado como 67 en el enfoque categórico (valor p genotípico = 6.7e-4), y la FDR para esta selección se calculó en 80%. Solo el SNP primer clasificado rs655251 1 es recuperado por los enfoques categóricos usando varios umbrales de MSSS (datos no mostrados). Una vez que estos 14 SNPs han sido seleccionados por el enfoque de barrido continuo, sin embargo, es posible analizarlos en función de riesgos relativos categóricos clásicos y razones de probabilidades: 9 de los genotipos menores están asociados con MSSS mas altas (escala de riesgos relativos de 1.5 a 2.3), y 5 están asociados con MSSS más bajas (escala de riesgos de 0.4 a 0.8, véanse los cuadros para consultar los detalles).

Estos SNPs de acuerdo con la invención son proyectados sobre la secuencia del genoma humano y comparados con las anotaciones de gen de ENSEMBL. Los detalles de la proyección se presentan en el cuadro 4. Dos SNPs (rs6552511 y rs7221818) se localizan en regiones desérticas (el gen más cercano está localizado a más de 100 kb de distancia). Los otros 12 SNPs están dentro de 8 genes o retirados a menos de 100 kb. Algunos de estos genes (XYLT1 , HIF1 AN y MGAT5) están representados por varios SNPs que definen bloques de severidad de desequilibrio de ligamiento (LD) dentro de los genes. Los tres marcadores localizados en dirección 3' de HIF1AN en el cromosoma 10 están en un bloque LD que no contiene ninguna parte de la estructura del gen HIF1AN (el bloque está a 50 kb de distancia del codón de detención de HIF1AN) o cualquier otra región regulatoria conocida de HIF1AN. El SNP rs1078922 está localizado a 22 kb en dirección 5' del gen MTPN. Otros SNPs están en intrones de los genes asignados: el primer ihtrón de XYLT1 (2 SNPs), el segundo intrón de MGAT5 (2 SNPs), el octavo intrón de MEGF1 1 , el tercer intrón de FGF14, el séptimo intrón de PDE9A, y el segundo intrón de CDH13.

Las señales en XYLT1 y GAT5 se duplicaron porque: (i) las señales son representadas por múltiples SNPs en LD, lo que se puede considerar como una duplicación técnica per se, y (ii) estos dos genes codifican enzimas de glicosilación y son candidatos biológicamente interesantes (véase la discusión). Se escogieron tres SNPs en los dos genes: rs12927173 en XYLT1 , y rs3814022 y rs4953911 en MGAT5 (se escogió un segundo SNPs, rs2059283, en XYLT1 , pero el fabricante no pudo suministrar iniciadores). Los valores p de estos tres SNPs en el conjunto de datos de duplicación (n=873) son respectivamente 0.42, 1.31e-2 y 3.76e-3 (figura 4 y cuadro 5). La asociación con la severidad de MS se duplica entonces en este conjunto de datos independiente para SNPs de MGAT5. Los valores p generales en los dos conjuntos de datos son 2.81 e-6 y 1.54e-7 para rs3814022 y rs495391 1 , respectivamente. Para el SNP en XYLT1 (rs12927173), la asociación no se reproduce en el conjunto de datos de duplicación (p = 0.42). Sin embargo, el valor p general en los dos conjuntos de datos es todavía significativo (p = 1.88e-4).

Los presentes inventores han realizado un análisis de barrido de todo el genoma de más de 1 ,000 pacientes de MS para identificar marcadores asociados con la severidad de la enfermedad. El proceso general ha conducido a la identificación de 2 marcadores en regiones no anotadas, 3 SNPs en un bloque LD cerca del gen HIF1AN, un SNP en la región 5' de MTPN, y 8 marcadores dentro de otros 6 genes. Se seleccionaron tres marcadores en dos genes y se determinó su genotipo en una población de duplicación independiente, llevando a la confirmación de la asociación de GAT5 con la severidad de la enfermedad. Los presentes inventores exponen aquí las elecciones clínicas y metodológicas que han hecho posible estos resultados, y después se enfocan en la relevancia biológica de los genes de severidad seleccionados y duplicados.

No hay método de consenso para medir la progresión de la MS usando evaluaciones simples transversales de discapacidad. Recientemente se ha desarrollado la MSSS como un método poderoso para comparar la progresión de la enfermedad en estudios de asociación genética. Ajusta la medición ampliamente aceptada de discapacidad, la EDSS, para la duración de la enfermedad, comparando la discapacidad de un individuo con la distribución de puntuaciones en casos que tienen una duración de enfermedad equivalente. La MSSS es potencialmente superior a la EDSS no lineal para evaluaciones estadísticas, ya que combina EDSS y duración de la enfermedad en una variable que se distribuye normalmente. En las tres poblaciones estudiadas por los presentes inventores, la distribución de MSSS no es homogénea. Esto puede ser explicado por la diferente composición de las poblaciones en función del curso de la enfermedad, y también por la conocida variabilidad inter observador (puesto que las colecciones vienen de tres hospitales diferentes). Esta heterogeneidad en las evaluaciones de medición de discapacidad podría tener un impacto significativo sobre los resultados de la asociación, especialmente si se usan umbrales de corte arbitrarios de MSSS para definir las categorías.

Los estudios de severidad publicados previamente (de genes candidatos) clásicamente llevan a cabo pruebas de asociación entre subpoblaciones de MS leve y severa. En el presente caso, enfoques categóricos similares usando diferentes umbrales de MSSS no han podido detectar ningún marcador asociado significativamente. El uso de valores de corte sobre las puntuaciones de EDSS (o derivados) es probablemente demasiado arbitrario e inadecuado para definir subgrupos homogéneos de severidad, ya que la EDSS refleja solo parcialmente (y algunas veces subjetivamente) el pronóstico de la MS. Con las puntuaciones clínicas, los enfoques continuos parecen ser entonces más adecuados. Para el barrido los presentes autores han elegido desechar los heterocigotos y realizar pruebas en U de dos muestras entre pacientes de MS que son homocigóticos para cada SNP. Tiene dos ventajas teóricas sobre el enfoque clásico de regresión lineal en 3 muestras. En primer lugar, no asume que los pacientes heterocigóticos tiene una severidad de MS intermedia (entre la severidad de los dos grupos homocigóticos), que sería el caso en un modelo aditivo de riesgo de severidad. El enfoque de los presentes autores permite teóricamente la detección de modos de transmisión dominantes o recesivos para los alelos de riesgo. En segundo lugar, la prueba de suma de rangos de Wilcoxon es una prueba no paramétrica: se aplica a distribuciones de MSSS no Gaussianas. Como contraparte, probablemente este método es de poca I fuerza para marcadores raros. Entonces los presentes inventores se enfocaron en los marcadores frecuentes (MAF > 30%) para los cuales la frecuencia del genotipo menor es de más de 9% bajo el equilibrio de Hardy-Weinberg, y está bien representada en la población seleccionada de los presentes autores (n > 100). Esta filtración redujo notablemente el número de SNPs analizados (hasta 105,035), manteniendo al mismo tiempo una cobertura razonable del genoma (63%). Se requeriría un tamaño de muestra más grande para investigar marcadores menos frecuentes con este método (por ejemplo, 2,500 individuos para 20% de marcadores, 10,000 para 10% de marcadores). Se puede ver a posteriori que la distribución de MSSS en toda la población no es uniforme y que generalmente las distribuciones de MSSS por genotipos de SNP no son Gaussianas (figura 1 , y ejemplos de SNP en las figuras 3.1 -3.10). Finalmente, es importante tomar en cuenta el problema de pruebas múltiples. Con los métodos conservativos de cálculo de tasa de error por familia (como la corrección de Bonferroni), no hay SNP seleccionado, lo que significa que no se puede seleccionar un grupo de marcadores para los cuales se estima que no hay falsos positivos. Los presentes inventores han preferido utilizar el cálculo de FDR para controlar las pruebas múltiples porque es más flexible (permite una proporción dada de falsos positivos, no necesariamente 0%), y toma en cuenta la dependencia entre los marcadores31.

El enfoque de FDR controlada ha resultado en la selección de 14 marcadores. Los primeros dos SNPs clasificados presentan importantes diferencias en la frecuencia del genotipo menor entre los resultados clínicos leves (MSSS<2) y severos (MSSS>8) (los riesgos relativos son de alrededor de 2.2), y por lo tanto son marcadores de interés para la severidad de MS. Sin embargo, están localizados en una región genómica no anotada y por lo tanto es imposible hacer hipótesis sobre su impacto funcional sobre el pronóstico de la enfermedad. Otros SNPs están dentro o cerca de genes anotados. Entre ellos, el MGAT5 es de interés biológico particular. El gen de MGAT5 (conocido también como GNT-V) codifica la beta-1 ,6-/V-acetil-glucosaminiltransferasa, una enzima implicada en la síntesis de glicanos N-enlazados beta-1 ,6 GIcNAc-ramificados adheridos a la superficie celular y glicoproteínas secretadas. En los ratones, la deficiencia de MGAT5 tiene una función protectora en el crecimiento del tumor34 y está asociado con un aumento de la susceptibilidad a la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en comparación con el tipo silvestre35. La deficiencia de MGAT5 aumenta el número de receptores de células T reclutados en la superficie presentadora de antígeno, reduciendo así la necesidad del acoplamiento del co-receptor de CD28. CD28 y MGAT5 funcionan como reguladores opuestos de los umbrales de activación de células T y la susceptibilidad a la enfermedad inmune. La asociación de CD28 con la severidad de MS ha sido analizada previamente y se mostró que no era significativa21. Además, la expresión de glicanos N-enlazados beta-1 ,6 GIcNAc-ramificados inhibe selectivamente la diferenciación de células Th1 y aumenta la polarización de las células Th236. También se ha observado glicosilación deficiente en los linfomonocitos de pacientes de MS: una disminución de la actividad de GCNT1 (otra glucosaminiltransferasa) de 25-30 % se correlaciona con la ocurrencia de fases clínicas agudas de MS y la presencia de lesiones activas en recaída-remisión37. Por lo tanto, los presentes autores apoyan aquí la asociación de MGAT5 y más generalmente de los glicanos N-enlazados GIcNAc-ramificados con el pronóstico de MS. Igual que MGAT5, la XYLT1 (xilosiltransferasa I, XT-I) es una enzima implicada en la glicosilación. La XYLT1 es la enzima iniciadora de cadena implicada en la biosíntesis de proteoglicanos que contienen glicosaminoglicano (GAG). Los proteoglicanos, un grupo grande de glicoproteínas, son de dos tipos principales, sulfato de condroitina (CSPGs) y sulfato de heparina (HSPGs). La mayoría de los CSPGs son secretados de las células y participan en la formación de la matriz extracelular (ECM). Los CSPGs son el tipo más abundante de proteoglicanos expresados en el SNC de los mamíferos y actúan principalmente como moléculas de barrera que afectan el crecimiento del axón, la migración celular y la plasticidad, particularmente a través de sus cadenas GAG. Una lesión en el SNC del adulto provoca la formación de una cicatriz glial, que consiste en células gliales proliferativas y emigrantes (principalmente astrocitos reactivos, microglia y precursores de oligodendrocitos), que regulan positivamente varias moléculas de la ECM, incluso CSPGs. Los proteoglicanos de la cicatriz glial podrían tener una función protectora, pero la cicatriz glial y sus CSPGs asociados son uno de los principales impedimentos para la regeneración del axón de las neuronas dañadas del SNC38. En la MS se ha reportado la alteración de las moléculas de la ECM, y se ha mostrado la producción y depósito excesivo de constituyentes de la membrana de basamento en las lesiones activas de MS y pueden contribuir a la pérdida axonal39. Así, como XYLT1 inicia el alargamiento de la cadena GAG y la síntesis de CSPGs, dos equipos han desarrollado una enzima de ADN que hace blanco en el ARNm de esta enzima y muestra una reducción de CSPGs40,41. Además de este vínculo con MS, se ha mostrado que la XYLT1 tiene mayor actividad en el suero de pacientes con esclerosis sistémica, que se correlaciona con la clasificación clínica42. Otros genes asignados a los marcadores de severidad seleccionados son HIF1AN (inhibidor del factor 1 alfa inducible por hipoxía), MEGF1 1 (múltiples dominios de tipo EGF 11), FGF14 (factor de crecimiento de fibroblastos 14), PDE9A (fosfodiesterasa 9A), MTPN (miotrofina) y CDH13 (caderina 13). No se ha encontrado marcador significativo en las regiones asociadas con la severidad de MS reportadas previamente 23"26.

Como MGAT5 y XYLT1 son candidatos biológicamente relevantes que comparten funciones similares de glicosilación, los presentes inventores decidieron duplicar el experimento en una población independiente. Como resultado se confirmaron claramente dos SNPs en MGAT5, y un SNP en XYLT1 no se encontró asociado en el conjunto de datos de duplicación.

En conclusión, el primer barrido de todo el genoma de la severidad de MS que los presentes inventores han realizado, ha llevado a la identificación libre de hipótesis de marcadores asociados con el pronóstico de la enfermedad. La comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes del avance de la enfermedad es un punto crucial que se requiere manejar en paralelo con la búsqueda de factores de susceptibilidad. Dos de los principales genes identificados, MGAT5 y XYLT1 , están implicados en procesos de glicosilación, confirmando así la importancia de la regulación del glicano en la MS. Entre los dos, el MGAT5 fue confirmado en un conjunto de datos de duplicación independiente, mientras que la duplicación de XYLT1 lleva a resultados más conflictivos en el presente estudio. Los glicanos tienen una función primordial en la modulación de las interacciones moleculares en el contexto de múltiples sistemas fisiológicos, incluso la defensa inmune, y se ha mostrado que la glicosilación tiene una función crítica en la regulación general de la respuesta inmune43,44. La glicosilación de proteína es importante mecanísticamente en la patogénesis de enfermedades autoinmunes; varias evidencias apoyan el "modelo de Epítopes Remanentes que Generan Autoinmunidad (REGA)" en MS, artritis reumatoide (RA) y diabetes45. De acuerdo con este modelo, el proceso autoinmune implica citocinas, quimocinas y proteinasas que cortan glicoproteínas formando epítopes remanentes que son presentados a linfocitos T autorreactivos, manteniendo la reacción autoinmune. Los ejemplos de substratos que producen dichos epítopes remanentes incluyen la proteína básica mielina, aß-cristallna e interferón ß en MS, y colágeno de tipo II en RA46. El modelo de REGA ha sido probado in vivo usando un modelo de animal y podría tener implicaciones terapéuticas interesantes, puesto que la inhibición de proteinasas como la gelatinasa B para MS o RA, produce efectos benéficos47,48.

CUADROS CUADRO 1 Colecciones de esclerosis múltiple Conjunto Origen No. RR (%) SP (%) PP (%) de datos Individuos Población Rennes (Francia) 384 172 (45%) 135 (35%) 77 (20%) de selección Huddinge (Suecia) 299 194 (65%) 83 (28%) 22 (7%) San Raffaele 357 228 (64%) 94 (26%) 35 (10%) (Italia) Total 1 ,040 594 (57%) 312 (30%) 134 (13%) Población Rennes (Francia) 184 1 10 (60%) 44 (24%) 30 (16%) de duplicación Huddinge (Suecia) 689 277 (40%) 348 (51 %) 61 (9%) Total 873 387 (44%) 392 (45%) 91 (10%) Total genera 1 ,913 981 (51%) 704 (37%) 225 (12%) CUADRO 2 Características clínicas promedio y demográficas de pacientes de MS en los coniuntos de datos de selección y duplicación CUADRO 3 SNPs seleccionados a 40% de umbral de límite inferior de FDR n: número de individuos que tienen este genotipo; m y sd: promedio y desviación estándar de MSSS para estas personas. El valor p se refiere a la prueba de suma de rangos realizada en las categorías de homocigoto (los heterocigotos no se usaron, véase el texto).

CUADRO 4 Localización qenómica de los SNPs de severidad seleccionadós Id. SNP Clase Cromosoma Posición MAF Gen más cercano rs655251 1 1 4q34 182,688,603 35% (desierto) rs7221818 2 17p13 5,742,055 35% (desierto) rs12927173 3 16p13.1 17,378,835 49% XYLT1 (intrón) rs2059283 4 16p13.1 17,377,011 49% XYLT1 (intrón) rs1343522 5 10q24 102,358, 165 44% 58kb 3' de HIFIAN rs495391 1 6 2q21 134,785,280 36% MGAT5 (intrón) rs4573623 7 10q24 102,361 ,387 46% 61 kb 3' de HIFI AN rs333548 8 15q22 64,032,567 32% MEGF1 1 (intrón) rs10508075 9 13q32 101 ,237,200 46% FGF14 (intrón) rs2839580 10 21q22 43,030, 176 40% PDE9A (intrón) rs2495725 11 10q24 102,354,010 45% 54kb 3' de HIFI AN rs3814022 12 2q21 134,764,405 31 % MGAT5 (intrón) rs 1078922 13 7q33 135,334,939 42% 22kb 5' de MTPN rs4315313 14 16q23 81 ,644,234 35% CDH13 (intrón) CUADRO 5 Duplicación de los marcadores de severidad en muestras independientes Referencias 1. Dyment DA, Ebers GC, Sadovnick AD. "Genetics of múltiple sclerosis". 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Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar un genotipo que comprende los pasos de: (a) usar un ácido nucleico aislado de una muestra de un individuo; y (b) determinar el tipo de nucleótido en el SNP rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522, rs4573623, rs333548, rs10508075, rs2839580, rs2495725, rs3814022, rs1078922, y/o rs4315313, en uno o los dos alelos del marcador dialélico, y/o en un SNP en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de estos SNPs.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la identidad de los nucleotidos en dichos marcadores dialélicos es determinada para ambas copias de dichos marcadores dialélicos presentes en el genoma de dicho individuo.

3. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque dicha determinación se hace por medio de una prueba de microsecuenciación.

4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque comprende adicionalmente amplificar una porción de una secuencia que comprende el marcador dialélico antes de dicho paso de determinación.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha amplificación se hace por medio de PCR.

6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de correlacionar el resultado de los pasos de determinación del genotipo con la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple.

7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque la presencia de una G en rs3814022, una T en rs4953911 , una A en rs2059283, una A en rs12927173, una A en rs2495725, una G en rs1343522, una G en rs4573623, una T en rs333548, una G en rs10508075, una A en rs2839580, una A en rs2495725, una G en rs3814022, una G en rs1078922, y/o una C en rs4315313, indica la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple en dicho individuo.

8. - Uno o más SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs3814022, rs495391 1 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522, rs4573623, rs333548, rs10508075, rs2839580, rs2495725, rs3814022, rs1078922, rs4315313, SNPs en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de estos SNPs, para usarse en la predicción de la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple en un individuo.

9.- Un método que es indicativo de la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple en un individuo, que comprende: (a) usar el ácido nucleico de una muestra de dicho individuo; (b) identificar la presencia de un marcador genético útil en dicho individuo por medio de los métodos conocidos; (c) basándose en los resultados del paso (b), hacer una predicción de la severidad de la enfermedad esclerosis múltiple en dicho individuo.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el marcador genético es uno o más SNPs seleccionados del grupo que consiste en rs3814022, rs4953911 , rs2059283, rs12927173, rs2495725, rs1343522, rs4573623, rs333548, rs10508075, rs2839580, rs2495725, rs3814022, rs1078922, y/o rs4315313, SNPs en desequilibrio de liganiento (LD) con uno o más de estos SNPs.

1 1. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque los SNPs en desequilibrio de ligamiento (LD) con uno o más de los SNPs de acuerdo con la reivindicación 1 , se caracterizan por un coeficiente de correlación de LD i2 mayor de 0.8 por lo menos en una población de por lo menos 100 individuos, preferiblemente un coeficiente de correlación de LD i2 mayor de 0.95, o con un LD en donde el D' absoluto promedio calculado es mayor o igual que 0.95.

12. - El uso un interferón beta para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple en un individuo en donde se ha identificado que dicho individuo presenta uno o más de los marcadores a través del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y en donde se ha determinado la severidad de la esclerosis múltiple en dicho individuo a través del método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1.

13. - Interferón beta para uso en el tratamiento de un individuo al que se le ha diagnosticado o tiene esclerosis múltiple, cuando dicho individuo muestra, por lo menos en un alelo, la presencia de una G en rs3814022, una T en rs495391 1 , una A en rs2059283, una A en rs12927173, una A en rs2495725, una G en rs1343522, una G en rs4573623, una T en rs333548, una G en rs10508075, una A en rs2839580, una A en rs2495725, una G en rs3814022, una G en rs1078922, y/o una C en rs4315313.

14. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 12 o reivindicación 13, en donde el interferón beta es interferón beta 1 a o 1 b.

15. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 12 o reivindicación 13, en donde el interferón beta es Rebif®, Avonex®, Cinnovex®, Betaseron® o Extavia®.