MX2011008297A - Composicion farmaceutica para el tratamiento de efectos secundarios mediante la administracion de espiegelmeros. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de una L-ribozima que puede realizar la escisión de un LARN en el área de una secuencia blanco de L-ARN, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de reacciones fisiológicas adversas no deseadas mediante la administración de una molécula terapéutica que contiene L-ARN. Pero con la L-ribozima también en forma alternativa se puede realizar la escisión de un ARN blanco endógeno.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA PARA EL TRATAMIENTO DE EFECTOS SECUNDARIOS MEDIANTE LA ADMINISTRACIÓN DE ESPIEGELMEROS Área técnica de la invención La invención se refiere al uso de una L-ribozima para la preparación de una composición farmacéutica, una composición farmacéutica que contiene una L-ribozima de ese tipo así como un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica tal.

Antecedentes de la invención y estado de la técnica Los aptámeros por lo general son ácidos D-nucleicos de doble cadena que se unen específicamente a una molécula blanco cualquiera, de manera análoga a una reacción de anticuerpo/ antígeno (Ellington, A.D. et al., Nature 346:818-822 (1990)). Los aptámeros específicos para una molécula blanco predeterminada se aislan, por ejemplo, mediante el procedimiento SELEX a partir de bibliotecas de ácidos nucleicos (Tuerk, C. et al., Science 249:505-510 (1990)).

En el área terapéutica, una de las finalidades de los aptámeros es ligar productos metabólicos no deseados, produciendo así su inhibición. Solamente a modo de ejemplo se indican a ese fin productos génicos oncógenos. La desventaja del uso terapéutico de aptámeros es que estos presentan una farmacocinética desfavorable, es decir que son degradados con mucha rapidez, p.ej. por nucleasas endógenas. Independientemente de ello los aptámeros de todos modos son moléculas relativamente pequeñas, las que por esa razón son excretadas comparativamente con bastante rapidez por los ríñones.

Los espiegelmeros son aptámeros en el núcleo, pero se diferencian de estos en que se forman a partir de L-nucleótidos. Los espiegelmeros pueden ser de cadena simple o doble. Mediante el uso de los L-nucleótidos se impide una degradación por medio de las nucleasas endógenas y se mejora notoriamente la farmacocinética, es decir, se prolonga el tiempo de permanencia en suero. Así se describe en la referencia bibliográfica Boisgard, R. et al., Eur Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 32:470-477 (2005) que los espiegelmeros no funcionales se mantienen completamente estables desde el punto de visto metabólico, también durante un período de dos horas. En esta referencia bibliográfica se describió asimismo el uso de espiegeimeros con fines diagnósticos, donde el espiegelmero está acoplado, por ejemplo, a una sustancia reportera radioactiva.

La identificación de espiegeimeros específicos para una molécula blanco predeterminada puede efectuarse, por ejemplo, tal como se describe en la cita bibliográfica Klussmann, S. et al., Nat Biotechnol 14:1 112-1 1 15 (1996). Con respecto a los espiegeimeros y sus posibilidades de uso con fines terapéuticos también se hace referencia a la cita bibliográfica Vater, A. et al., Curr Opin Drug Discov Devel 6:253-261 (2003).

En el uso terapéutico de espiegeimeros hasta ahora se partió de la base que los espiegeimeros no son inmunógenos (Wlotzka et al., Proc Nati Acad Sci EE.UU. 99:8898-8902 (2002)). Aunque en los estudios que se mencionan en la presente descripción, se demuestra que los ácidos L-nucleicos en un organismo no necesariamente están exentos de producir efectos secundarios. Ello implica que al utilizar espiegeimeros existe un riesgo que de ninguna manera puede ser obviado, de una reacción fisiológica adversa no deseada, por ejemplo, de una reacción inmune y/o de una reacción enzimática no deseada con ARN endógeno (inclusive de un ARN regulatorio), al administrarlos a un paciente. En especial, en vista de las experiencias negativas observadas en la fase clínica 1 con el anticuerpo monoclonal TGN1412 y ante el hecho que el tiempo de permanencia de los espiegeimeros es en comparación muy elevado debido a los factores antes enunciados. Durante la administración del espiegelmero sería deseable tener a disposición un antídoto del mismo, para que al producirse una reacción fisiológica no deseada, se pueda administrar de inmediato el antídoto y así reducir en corto tiempo el nivel del espiegelmero en suero.

De otras circunstancias, a saber, la reacción estereoselectiva Diels-Alder catalizada con ribozimas, se conocen L-ribozimas, a las que se hace referencia en las citas bibliográficas Seelig, B. et al., Angew. Chem. Int., 39:4576-4579 (2000) y Seelig, B. et al., Angew. Chem. 112:4764-4768 (2000).

Dificultad técnica de la invención La invención por lo tanto se basa en la dificultad técnica de indicar un antidoto para espiegelmeros utilizados con fines terapéuticos.

Fundamentos de la invención Para solucionar este inconveniente técnico, la invención propone el uso de una L-ribozima para la preparación de una composición farmacéutica, donde la L-ribozima puede producir la escisión de L-ARN en el área de una secuencia blanco de L-ARN, y ello en especial para la preparación de una composi-ción farmacéutica para el tratamiento de reacciones fisiológicas adversas no deseadas, en especial de reacciones inmunes y/o reacciones enzimáticas no deseadas de L-ARN con ARN endógeno (inclusive un ARN regulatorio), debido a la administración de una molécula terapéutica que contiene L-ARN.

La invención en primer lugar se basa en la sorprendente revelación que los espiegelmeros al contrario de las suposiciones anteriores, no necesariamente no producen reacciones adversas, sino que además poseen la capacidad de escindir ácidos nucleicos naturales en el organismo y producir así efectos secundarios imprevistos. La invención se basa en esta revelación continuando con el concepto técnico de poner a disposición L-ribozimas, que de manera específica escinden un espiegelmero administrado, destruyendo destruyen su efectividad fisiológica, en especial en vista de reacciones adversas no deseadas. Los ejemplos de espiegelmeros son: espiegelmero, NOXC89, NOXA42, NOXA50, NOXB11 , NOXAI2, NOXE36, NOXF37 (todos de NOXXON AG), espiegelmeros de la empresa Eli Lilly & Co., NU172 de la empresa ARCA biopharma Inc., ARCHEMIX, ARCI905, ARCI779, ARCI83, ARCI84, E10030, NU172, REG2, REG1 (todos de Archemix Corp.), AS1411 , AS1405 (ambos de Antisoma Research Ltd.), DsiARN de Dicerna Pharmaceuticals Inc., aptámero de ARN BEXCORE de la empresa BexCore Inc., ELAN de la empresa Elan Corp Pie, o Macugen. Mediante la administración de una ribozima tal después de observar una reacción secundaria no deseada durante la administración de un espiegelmero, por lo tanto es posible eliminar la causa de la reacción adversa no deseada de manera rápida, efectiva y altamente selectiva, y ello con un riesgo extremadamente bajo de efectos secundarios a causa de la administración de la L-ribozima. Esto último no se debe solo a la composición de la L-ribozima a partir de L-nucleótidos, sino que además a la elevada selectividad de la L-ribozima, que está orientada hacia la secuencia blanco del espiegelmero. El resultado es que se obtiene un antídoto de alta efectividad y muy selectivo que actúa contra un espiegelmero administrado con fines terapéuticos y es posible contrarrestar de manera efectiva, rápida y sin efectos secundarios, las reacciones adversas no deseadas del espiegelmero.

En principio, contra cada molécula de ARN, ya sea que esté conformada por D- o L-nucleótidos, se puede construir una ribozima específica que corta una secuencia blanco de la molécula de ARN, produciendo así la escisión. Una propiedad esencial de una ribozima es, por lo tanto, el enlace específico según la secuencia, de la ribozima a la secuencia blanco. Pero esto también significa que para cualquier secuencia blanco se puede preparar una secuencia parcial de una ribozima al producir la hibridación de la secuencia parcial de la ribozima, que contiene el sitio de escisión, con la secuencia blanco. Por lo tanto, en el marco de la invención no es adecuado indicar estructuralmente solo determinadas secuencias parciales de ribozimas en relación con determinadas secuencias blanco. Las secuencias blanco y secuencias parciales de ribozimas referidas en los ejemplos por lo tanto sólo se indican a ese fin y el especialista podrá sin inconvenientes determinar para cada secuencia blanco predeterminada de un espiegelmero, la adecuada secuencia parcial de ribozima, es decir, la que efectúa la hibridación, y sintetizar la ribozima con los medios usuales en la técnica, sobre la base de la información respecto de las secuencias parciales de ribozima.

En principio, la molécula terapéutica puede ser un espiegelmero o el L-ARN puede presentar una unión covalente con un aptámero. Este último caso puede darse, por ejemplo, cuando se trata de un aptámero estabilizado contra nucleasas. Entonces, el beneficio terapéutico de la invención radica en que mediante el corte de L-ARN, el aptámero se torna accesible para nucleasas, por lo que finalmente también se puede eliminar en un tiempo relativamente breve del suero un aptámero que pueda producir efectos secundarios.

Pero también es posible que la L-ribozima presente una unión covalente con un aptámero o un anticuerpo. En ese caso, el aptámero o el anticuerpo se pueden haber elegido, p.ej., de modo tal que debido a las interacciones del aptámero o bien del anticuerpo con las superficies celulares, se introduzca en la célula la construcción completa que comprende la L-ribozima y el aptámero o bien los anticuerpos .

De preferencia, la L-ribozima es una ribozima cabeza de martillo. Las ribozimas cabeza de martillo presentan una región conservada que además incluye un triplete GUH (H no es guanina, de preferencia C) o un duplete UH (H como antes indicado). Respecto del primer caso se hace referencia a la figura 1. Para el nombrado último se hace referencia a la cita bibliográfica Usman, N . et al . The Journal of Clinical Investigation, 106(10): 1197-1201 (2000). Aquí, los nucleótidos N' y N son bases cualesquiera, que se seleccionan en el área de los tallos I y III de acuerdo con la secuencia blanco. Durante la construcción de una L-ribozima contra una secuencia blanco se procede de modo tal en el núcleo, que primero se presenta una secuencia blanco, por ejemplo de un espiegelmero, debiendo esta secuencia blanco incluir el triplete GUH o el duplete UH. Luego, en los dos extremos de un triplete GUH o bien del duplete UH por lo general se agregan en cada caso 4-10 o 4-11 , en especial 6-8 o 6-9 nucleótidos, cuyas secuencias se corresponden con las secuencias de la secuencia blanco. Por lo tanto se obtiene una copia de la secuencia blanco que contiene 11 a 23 nucleótidos que incluye el triplete GUH o bien el duplete UH. Entre ambos extremos de la copia luego se inserta la secuencia catalítica cabeza de martillo, tal como puede verse en la Figura 1. Un ejemplo de una secuencia catalítica cabeza de martillo por lo tanto es: 5'-CUGANGAGN'ON'NNNNNGNCGAAAC-3'o 5'-CUGANGAGN'CN'NNNNNGNCGAAAN-3' (N = bases cualesquiera, donde en la Figura 1 se forman pares de bases N y N' enfrentados que obligatoriamente son iguales o diferentes) A ello, el extremo 3' continúa con nucleótidos en la secuencia en forma complementaria con la secuencia blanco del lado 5' del triplete GUH o bien del duplete UH y en el extremo 5", los nucleótidos en la secuencia de acuerdo con la secuencia blanco del lado 3' del triplete GUH o bien del duplete UH.

En una forma de realización alternativa la secuencia catalítica cabeza de martillo es la siguiente: 5'-CUGANGAGNUCGGAAACGACGAAAC-3' o 5'-CUGANGAGN UCGGAAACGACGAAAN-3' (N = bases cualesquiera, donde en la Figura 1 se forman pares de bases N y N' enfrentados que obligatoriamente son iguales o diferentes). Además, en el extremo 5' de la secuencia catalítica cabeza de martillo puede haberse previsto la secuencia 3'- (N) 4.6 GGUAUAGAGUGCUGAAUCC-5', por lo que se obtiene una ribozima cabeza de martillo que requiere una concentración de iones g que en comparación es baja.

La composición farmacéutica contiene la L-ribozima en como mínimo la dosis que corresponde a la dosis administrada de L-ARN, de preferencia la contiene en una dosis que equivale de 2 a 10 veces a la dosis administrada de L-ARN, respecto de la cantidad de moléculas o bien de moles. Se recomienda utilizar una sobredosis en comparación con la dosis del L-ARN, a efectos de asegurar la reacción de todos los L-ARN a eliminar. Las dosis absolutas previstas según la invención se regirán estrictamente por las dosis predeterminadas de L-ARN dentro de las proporciones relativas de cantidad indicadas y por lo tanto, podrán ser determinadas y dispuestas sin dificultades por el especialista que conoce las dosis predeterminadas para el L-ARN.

En una forma de realización alternativa de la invención la composición farmacéutica contiene además un ácido nucleico, en especial un pentámero hasta 20-mero, que puede efectuar la fusión de un L-ARN de doble cadena en el área de su secuencia blanco. Aquí se trata de secuencias que realizan una hibridación con secuencias parciales que son adyacentes a la secuencia blanco. De esa manera se logra que las regiones GUC del L-ARN, las que por lo general no son accesibles por razones esféricas a causa de la estructura terciaria del L-ARN, se tornen accesibles para la L-ribozima.

Además la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene una L-ribozima para el tratamiento de reacciones fisiológicas adversas no deseadas, en especial de reacciones inmunes, debido a la administración de una molécula terapéutica que contiene el L-ARN.

Respecto de la composición farmacéutica rigen de manera análoga todas las explicaciones anteriores y siguientes.

Finalmente la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica tal, donde una secuencia se prepara y se sintetiza a partir de L-nucleótidos que tiene la capacidad de realizar la escisión de una secuencia predeterminada formada por L-ribo nucleótidos, en especial que contiene el triplete GUC con por lo demás secuencias cualesquiera agregadas del lado 5' y 3' del triplete, y donde la L-ribozima se dispone para su administración en una dosis farmacológicamente efectiva. Para ello la L-ribozima se mezcla por lo general con adyuvantes y/o sustancias portadoras galénicas.

En principio pueden mezclarse con la L-ribozima uno o varios adyuvantes y/o sustancias portadoras, donde la mezcla es apta galénicamente para la administración local o sistémica, en especial oral, parenteral, para la infusión o bien la administración por infusión en un órgano especifico, para la inyección (p. ej. por vía i.v., i.m., intracapsular o intralumbar), para aplicación en bolsas dentarias (espacio entre la raíz de la pieza dentaria y la encía) y/o para la inhalación. La elección de las sustancias adicionales y/o de los adyuvantes dependerá de la forma de presentación elegida. La preparación galénica de la composición farmacéutica según la invención puede realizarse de la manera habitual en el rubro. Como contra iones para compuestos iónicos pueden usarse, por ejemplo, Mg++, Mn**, Ca++, CaCf , Na+, K+, Li* o ciclohexilamonio, o bien CI", Br , acetato, trifluoroacetato, propionato, lactato, oxalato, malonato, maleinato, citrato, benzoato, salicilato, putrecina, cadaverina, espermidina, espermina, etc. Las formas de preparación galénicas sólidas o líquidas son, por ejemplo, granulados, polvos, grageas, comprimidos, (micro) cápsulas, supositorios, jarabes, jugos, suspensiones, emulsiones, gotas o soluciones para inyectar (i.v., i.p., i.m., s.c.) o nebulización (aerosol), formas de preparación para la inhalación de polvo seco, sistemas transdermales, así como preparados para la liberación prolongada de principios activos, en cuya preparación se utilizan los adyuvantes usuales como sustancias portadoras, sustancias explosivas, aglutinantes, de recubrimiento, de hinchamiento, sustancias deslizantes o lubricantes, saborizantes, endulzantes y disolventes. También es posible encapsular el principio activo en nano-cápsulas que de preferencia son biodegradables, por ejemplo para obtener un preparado para la inhalación. Como adyuvantes se mencionan, por ejemplo, carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manita y otros azúcares, talco, albúmina de leche, gelatina, almidón, celulosa y sus derivados, aceites de origen animal y vegetal, como aceite de hígado de bacalao, aceite de girasol, de maní o de sésamo, polietilenglicoles y agentes disolventes, como por ejemplo agua estéril y alcoholes mono- o polivalentes, por ejemplo glicerina. Una composición farmacéutica según la invención puede prepararse al mezclar al menos una combinación de sustancias utilizada conforme la invención, en una dosis definida con un vehículo de tolerancia fisiológica y adecuado desde el punto de vista farmacéutico, y en su caso con otros principios activos adecuados, así como con adyuvantes o sustancias adicionales en dosis definidas para obtener la forma de presentación deseada. Como agentes diluyentes pueden usarse poliglicoles, agua y soluciones buffer. Las sustancias buffer adecuadas son por ejemplo ?,? -dibenciletilendiamina, dietanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina, N-bencilfenetilamina, dietilamina, fosfato, bicarbonato de sodio o carbonato de sodio. Pero también se puede realizar la elaboración sin diluyentes. Las sales de tolerancia fisiológica son sales con ácidos inorgánicos u orgánicos, como por ejemplo, ácido láctico, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido cítrico, ácido p-toluensulfónico o con bases inorgánicos u orgánicas, como por ejemplo, NaOH, KOH, Mg(OH)2, dietanolamina, etilendiamina, o con aminoácidos, como arginina, lisina, ácido glutámico, etc. o con sales inorgánicas, como CaCI2, NaCI o sus iones libres, como Ca2+, Na+, CI", SO„2" o bien las correspondientes sales y iones libres del Mg++ o Mn++, o combinaciones de estos. Se preparan de acuerdo con métodos estándar. De preferencia se ajusta un valor de pH en el rango entre 5 y 9, en especial entre 6 y 8.

De significado propio es una variante de la invención que comprende el uso de una L-ribozima para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades que son concomitantes con una sobreexpresión de como mínimo un gen endógeno, donde la L-ribozima puede realizar la escisión de una secuencia blanco de un D-ARN blanco endógeno que codifica para el gen. Por lo demás, rigen de manera análoga las explicaciones antes indicadas. Al respecto es importante una variante adicional del aspecto anterior de la invención con el uso de una L-ribozima para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades, que son concomitantes con una infección de un mamífero con un microorganismo, donde la L-ribozima puede efectuar la escisión de una secuencia blanco de un D-ARN blanco que codifica para un gen del microorganismo. Los microorganismos en cuestión son entre otros, virus, bacterias y hongos. En principio, la ribozima se puede usar para la escisión de un microorganismo cualquiera con como mínimo secuencias génicas conocidas en parte, donde se eligen áreas de las secuencias génicas para la escisión, que por ejemplo atenúan o inhiben la actividad del microorganismo y/o su capacidad de replicación y/o atenúan o inhiben el enlace con las superficies celulares.

En esta variante se aprovecha que las L-ribozimas también pueden usarse para la escisión de D-ARN, en especial de ARNm o ARN regulatorio, por ejemplo, pero sin ser limitativo, siARN, microARN, shARN, ncARN, tARN, rARN, etc. De ese modo pueden inhibirse las proteínas codificadas. Esto representa una ventaja terapéutica para todas las enfermedades concomitantes con la sobreexpresión de determinados genes, en comparación con la expresión del organismo sano.

Esta variante por una parte tiene la ventaja que la escisión de la secuencia blanco se presenta con una especificidad muy alta y por lo tanto tampoco se produce otro tipo de interferencia con el sistema regulatorio. Además se evitarán de manera segura los efectos secundarios, como se producen por ejemplo al utilizar ácidos D-nucleicos inhibitorios, como los SiARN.

Breve descripción de las figuras A continuación se explicará la invención en mayor detalle mediante las figuras y los ejemplos.

Se muestra: Figura 1 : una ribozima cabeza de martillo mínima antes (a) y después del enlace a una secuencia blanco (b), Figura 2: un análisis comparativo de la dependencia de la concentración de MgCI2 de la reacción de L-blanco con D-ribozima por una parte y de D-blanco con L-ribozima por la otra, Figura 3: un análisis comparativo de la dependencia del tiempo de la reacción de L-blanco con D-ribozima por una parte y de D-blanco con L-ribozima por la otra con MgCI2 10 mM Figura 4: un análisis comparativo de la dependencia de la concentración de MgCI2 (1-25 mM) de la reacción de L-blanco con L-ribozima por una parte y de D-blanco con D-ribozima por la otra con un exceso de 10 veces de L-ribozima, Figura 5: un análisis comparativo de la dependencia de la concentración de MgCI2(0,1-1 mM) de la reacción de L-blanco con L-ribozima por una parte y de D-blanco con D-ribozima por la otra con un exceso de 10 veces de L-ribozima, Figura 6: un análisis comparativo de la dependencia del tiempo de la reacción de L-blanco con L-ribozima por una parte y de D-blanco con D-ribozima por la otra con MgCI2 10 mM y con un exceso de 10 veces de L-ribozima, Figura 7: un análisis comparativo de la dependencia del tiempo de la reacción de L-blanco con L-ribozima por una parte y de D-blanco con D-ribozima por la otra con MgCI2 0,1 mM y con un exceso de 10 veces de L-ribozima, Figura 8: un análisis comparativo de la dependencia del tiempo de la reacción de L-blanco con L-ribozima por una parte y de D-blanco con D-ribozima por la otra con MgCI2 1 mM y un exceso de L-ribozima de una vez, Figura 9: un análisis comparativo de la dependencia del tiempo de la reacción de L-blanco con L-ribozima por una parte y de D-blanco con D-ribozima por la otra con MgCI2 0,1 mM y con un déficit de 10 veces de L-ribozima, Figura 10: un análisis comparativo de la dependencia del tiempo de la reacción de L-blanco con L-ribozima por una parte y de D-blanco con D-ribozima por la otra con MgCI2 1mM y un déficit de 10 veces de L-ribozima, Figura 11 : un análisis comparativo de la dependencia del tiempo de la reacción de L-blanco con L-ribozima por una parte y de D-blanco con D-ribozima por la otra con MgCI2 5 mM y un déficit de 10 veces de L-ribozima, y Figura 12: ensayos para la escisión de L-blanco mediante L-ribozima en suero humano.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Ensayo de escisión Las actividades de las L-ribozimas y D-ribozimas se midieron en diferentes condiciones. Las condiciones de base fueron las siguientes. Se incubaron ARN blanco 0,02 µ? con 10 µ? de mezcla de reacción en presencia de 0,002 µ?, 0,02 µ? y 2 µ? de ribozima en buffer Tris HCI 50 mM, pH 7,5, a 20°C durante 2 horas (por lo tanto, relación ribozima/blanco 10: 1 , 1 :1 y 1 : 10). Antes de la reacción se desnaturalizaron el ARN blanco y la ribozima durante 2 minutos a 70°C y se enfriaron lentamente (1°C/min.) en el bloque calentador hasta llegar a 25°C. Se analizó la influencia de los iones Mg2+ en concentraciones de 0,1 a 25 mM. Los productos de escisión se separaron con electroforesis en gel de poliacrilamida al 20% en presencia de urea 8 M en buffer Tris-borato 0,09 M, pH 8,3. El análisis de la fluorescencia se realizó en el Phosphoimager Fuji Film FLA 5100. Los datos se obtuvieron con el programa de análisis 'Fuji Analysis Program'. Los diagramas se prepararon en Excel.

Ejemplo 2: Preparación de las secuencias blanco y de la ribozima Como secuencias blanco se prepararon de acuerdo con las síntesis encomendadas por la empresa ChemGenes Corporation, Wilmington, EE.UU.: Sec.-ID 1 : 5'-FAM-ACAGUCGGUCGCC-3' (ARN, tanto con D-nucleótidos, como también con Lnucleótidos) y Sec.-ID 2: 5'-FAM-ACAGTCGGTCGCC-3' (ADN, tanto con D-nucleótidos, como también con Lnucleótidos).

Los productos de síntesis presentaron una pureza mayor que 90%.

Como secuencias de ribozimas se eligieron de acuerdo con las secuencias blanco las áreas variables de una ribozima cabeza de martillo alrededor del triplete GUC y se prepararon las siguientes secuencias de ribozimas por medio de la empresa ChemGenes Corporation, Wilmington, EE.UU.: Sec.-ID 3: 5'-FAM-GGCGACCCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUGU-3' (ARN, tanto con D-nucleótidos, como también con L-nucleótidos) Los productos de síntesis presentaron una pureza mayor que 85%.

Todos los productos de síntesis estaban marcados con fluoresceína en el extremo 5'. Ejemplo 3: Interacciones de ácidos L-nucleicos con ácidos D-nucleicos En la Figura 2 se representó la dependencia de la concentración de la escisión de un D-blanco por medio de una L-ribozima así como viceversa. C es el control (L-blanco + L-ribozima), las trazas 1 a 5 son las distintas concentraciones de MgCI2 (0 - 25 mM) indicadas en el diagrama para blanco sin ribozima, las trazas 6 a 9 de 0,2 µ? blanco con 2 µ? ribozima.

Se puede observar que aunque la D-ribozima no corta al L-blanco, por el contrario tiene lugar una considerable producción. Ello significa que, por ejemplo, los espiegelmeros que se componen de L-nucleótidos, además de su efecto de aptámero específico para una determinada estructura 3-D, contrariamente a lo que se suponía hasta ahora, podrían ser realmente capaces de generar otras interacciones fisiológicas, por ejemplo, en calidad de ribozima.

De ello se deduce que los espiegelmeros presentan el riesgo de un efecto secundario no deseado al ser administrados a un organismo.

Pero también se deduce que las L-ribozimas pueden ser utilizadas para la escisión de D-ARN endógeno, con lo que luego se produce una inhibición deseada en el aspecto terapéutico del gen o bien de la proteína codificados por D-ARN, por ejemplo ARNm.

En la Figura 3 se muestra que la proporción de productos de escisión del D-blanco por medio de una L-ribozima aumenta con el tiempo y siempre es significativamente superior a la proporción de productos de escisión del L-blanco (traza C: control, como antes indicado, trazas 1 a 10, tiempos 0 a 256 min. del diagrama) Ejemplo 4: Escisión de un L-blanco mediante L-ribozimas En las representaciones de las figuras 4 a 11 puede observarse que una L-ribozima en todas las condiciones habituales corta efectivamente un L-blanco con la correspondiente secuencia blanco y ello con tasas de efectividad que corresponden como mínimo a aquellas de una D-ribozima con un D-blanco.

En la Figura 12 se prueba que la escisión de un L-blanco mediante una L-ribozima también funciona efectivamente en las condiciones del suero humano.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Uso de una L-ribozima para la preparación de una composición farmacéutica.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 , donde la L-ribozima tiene la capacidad de escindir un L-ARN en el área de una secuencia blanco de L-ARN.

3. Uso de una L-ribozima, con capacidad para escindir un L-ARN en el área de una secuencia blanco de L-ARN, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de reacciones fisiológicas adversas no deseadas, debido a la administración de una molécula terapéutica que contiene el L-ARN.

4. Uso de una L-ribozima para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades concomitantes con una sobreexpresión de como mínimo un gen endógeno, donde la L-ribozima puede realizar la escisión de una secuencia blanco de un D-ARN blanco endógeno que codifica para el gen.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde la molécula terapéutica se compone del L-ARN, en especial de un L-ARN de doble cadena, por ejemplo un espiegelmero.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde la molécula terapéutica contiene un aptámero de unión covalente con el L-ARN o anticuerpos unidos de forma covalente con este.

7. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 y 5 a 6, donde la composición farmacéutica contiene la L-ribozima en como mínimo la dosis, que equivale a la dosis administrada de de L-ARN, de preferencia la contiene en una dosis, que equivale de 2 a 100 veces, de preferencia de 2 a 20 veces la dosis administrada de L-ARN.

8. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 7, donde la L-ribozima es una ribozima cabeza de martillo.

9. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 8, donde la composición farmacéutica contiene adicionalmente un ácido nucleico en especial un pentámero hasta 20-mero que puede fusionar un D-ARN de cadena doble o L-ARN en el área de la secuencia blanco.

10. Composición farmacéutica que contiene una L-ribozima para el tratamiento de reacciones fisiológicas adversas no deseadas, debido a la administración de una molécula terapéutica que contiene L-ARN.

11. Composición farmacéutica que contiene una L-ribozima para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades concomitantes con una sobreexpresión de como mínimo un gen endógeno, donde la L-ribozima puede realizar la escisión de una secuencia blanco de un D-ARN blanco endógeno que codifica para el gen.

12. Procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 u 1 1 , donde se prepara y se sintetiza una secuencia de L-nucleótidos que puede realizar la escisión de una secuencia predeterminada de L-ribo nucleótidos o de una secuencia predeterminada de d-ribo nucleótidos, y donde la L-ribozima se prepara para su administración en dosis farmacológicamente efectivas.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, donde la L-ribozima es mezclada con adyuvantes y/o sustancias portadoras galénicas.