MX2011005830A - Complejo proteico que favorece el crecimiento de las plantas. - Google Patents
Complejo proteico que favorece el crecimiento de las plantas.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un complejo proteico que favorece el crecimiento de las plantas. Más específicamente, la invención se refiere al uso de proteínas específicas del complejo promotor de la anafase/ciclosoma para aumentar las velocidades de crecimiento de los brotes y/o para mejorar las velocidades de la división celular.
Description
COMPLEJO PROTEICO QUE FAVORECE EL CRECIMIENTO DE LAS
PLANTAS
La presente invención se refiere a un complejo proteico que favorece el crecimiento de las plantas. Más específicamente, la invención se refiere al uso de proteínas específicas del complejo promotor de la anafase/ciclosoma para aumentar las velocidades de crecimiento de los brotes y/o para mejorar la velocidad de la división celular. La proteolisis mediada con ubiquitinación es un mecanismo primario por medio del cual se controlan los niveles de proteínas reguladoras. El proceso de ubiquitinación de un sustrato implica la actividad de una cascada de tres enzimas, la enzima que activa la ubiquitina (El), la enzima que enjuga la ubiquitina (E2) y la ubiquitina proteína ligasa (E3). La especificidad y regulación del sustrato de ubiquitinación es conferida por la ubiquitina proteína ligasa (E3), el cual se enlaza directamente a la proteína diana y es el paso que limita la velocidad en la cascada de ubiquitinación (revisado en Hershko and Ciechanover, .1998 y Peters, 2002 ) . ·
Dos multiproteínas E3 ligasas relacionadas estructuralmente , el complejo promotor de la anafase/ciclosoma APC/C y el complejo proteico Skpl/cullin/F-box (SCF) manda la progresión a través del ciclo celular eucariótico. La actividad de las ligasas SCF principalmente controla la transición de Gl/S y G2/M, 5 mientras que APC/C principalmente se necesita para la progresión mitótica y salida (Morgan, 1999). APC es una de las máquinas moleculares más complejas conocidas para catalizar las reacciones de la ubiquitinación , ya que contiene más de una docena de subunidades ( Yoon et al., l() 2003; Peters et al., ( 1996 ). Esta complejidad es inesperada porque muchas otras ubiquitina ligasa únicamente están compuestas de una o de pocas subunidades, significando que la actividad de la ubiquitina ligasa no depende inevitablemente de
15 subunidades múltiples. Por lo tanto, sigue siendo una interrogante por qué el APC está compuesto de muchos componentes proteicos y lo que son sus funciones individuales .
0 APC10 es una subunidad de APC/C que contiene un dominio Doc 1 (Destrucción de Ciclina) que también se encuentra en varias otras proteínas del sistema proteasoma- ubiquitina. Se sabe que los mutantes de APC10 en levadura evitan el enlace del sustrato con APC/CCdhl, sugiriendo 5 que esta subunidad puede tener una función en el reconocimiento del sustrato. Passmore et al. (2003) ha demostrado que APC10 contribuye al reconocimiento del sustrato APC, independientemente del coactivador e implica que APC10 actúa como una subunidad reguladora de APC potencial.
El análisis bioquímico de levadura para budín APC muestra que APC10/DOC1 aumenta la facilidad de procesamiento de la ubiquitinación del sustrato mejorando la afinidad del complejo APC-sustrato (Carrol et al., 2005). De forma importante, la interacción entre PAC y los activadores CDH1 y CDC20 no es afectado por la pérdida de la función APC10/DOC1 y CDC20 no es afectado por la perdida de la función APC10/DOC1, sugiriendo que APC10/DOC1 favorece el enlace del sustrato directamente o de acuerdo con otras subunidades del núcleo APC. (Au et al., 2002).
La identificación de la serie completa de genes que codifican las subunidades APC en Arabidopsis refuerza la evidencia de que los procesos básicos controlados por proteólisis mediada con ubiquitina en plantas es similar a otros eucariotos (Eloy et al., 2006) sin embargo, los resultados en la estructura del gen y las características únicas para desenredar la expresión de la planta APC y ella indica el prospecto de complejos flexibles que puede necesitarse particularmente para las respuestas de crecimiento necesarias para adaptarlas a las condiciones del entorno cambiante (Eloy et al., 2006).
De forma sorprendente, se encontró que las lineas, sobreexpresion de la subunidad APC10 así como las líneas con una pérdida de función de un interactivador novedoso de la subunidad APC 10 (SAMBA) mostró un crecimiento mejorado.
Un primer aspecto de la invención es el uso de APC 10, o una variante de éste, para aumentar el crecimiento de la planta y/o producción. El uso, como se indica en la presente, es el uso de la proteína y/o el uso de un ácido nucleico que codifica esta proteína, o el complemento de ésta. Se incluye, pero no se limita a DNA genómico, cDNA, mensajero RNA (que incluye las regiones 5' y 3' no trasladadas) y RNAi. Las variantes, como se utilizan en la presente, están incluidas, pero no limitadas a homólogos, ortólogos y parálogos de ID SEC No. 1 (proteína APC10) . "Homólogos" de una proteína abarca péptidos, oligopéptidos , polipéptidos , proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos en relación con la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad funcional y biológica similar a la proteina no modificada de la cual se derivan. Ortólogos y parálogos abarcan conceptos evolucionarlos utilizados para describir las relaciones ancestrales de genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral; ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de la especiación y también se derivan de un gen ancestral común. Preferiblemente, los homólogos, ortólogos o parálogos tienen una identidad de secuencia en el nivel de proteina de al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54% o 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, preferiblemente 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, más preferiblemente 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, aún más preferiblemente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, más preferiblemente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más medido en un programa BLASTp (Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005). Como un ejemplo no limitante, los ortólogos de ID SEC No 1 son Pt796785 (álamo), W00024912001 (vitis) , AC198383 (maíz) y Os05g50360 (Arroz). El aumento del crecimiento de la planta y/o producción se midió comparando la planta de prueba, que contenia un gen utilizado de acuerdo con la invención, con la planta parental, no transformada, crecida en las mismas condiciones que la planta testigo.
Preferiblemente, el aumento del crecimiento se midió como un aumento de la producción de biomasa. "Producción2 se refiere a una situación donde únicamente una parte de la planta, preferiblemente una parte económica importante de la planta, como pueden ser las hojas, raices, o semillas, es aumentada en biomasa. El término "aumento" como se utiliza en la presente significa menos de 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, preferiblemente al menos 15% o 20%, más preferiblemente 25%, 30%, 35% o 40% más producción y/o crecimiento en comparación con las plantas testigo como se define en la presente. El aumento del crecimiento de la planta, como se utiliza en la presente, preferiblemente se midió como el aumento de una o más de la biomasa de la hoja, biomasa de la raíz y biomasa de la semilla .
Otro aspecto de la invención es el uso de una proteina que interactúa con APC10, o una variante de ésta, o el uso de ácido nucleico que codifica esta proteina, o el complemento de ésta para aumentar el crecimiento de la planta. De hecho, como APC10 es una parte de un complejo proteico, su función se puede compensar por sobre o por sobre- o sub-expresión de otras proteínas en el complejo. Preferiblemente, la proteina que interactúa con APC10 se selecciona de la lista que consiste en cualquiera de uno o más de AT2G39090, AT2G20000, AT5G05560, AT3G48150, AT1G06590, AT1G78770, AT4G21530, AT2G04660, AT1G32310, AT2G42260, AT4GA19210, AT3G57860, AT3G16320, AT4G25550, AT5G13840, AT3G48750, AT3G56150 y AT2G06210, o una variante de éstos. Aún más preferiblemente, la prote na que interactúa con APC10 es SAMBA (ID SEC N° 2), o una variante de ésta. Las variantes, como se utilizan en la presente, están incluidas, pero no limitadas a homologas, ortólogas o parálogas de ID SEC N°2 (proteina SAMBA). "Homologas" de una proteina abarca péptidos, oligopéptidos , polipéptidos , proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácido en relación con la proteína no modificada en cuestión y que tiene actividad funcional y biológica similar como la proteína no modificada de la cual se derivan. Ortólogos y parálogos abarcan conceptos revolucionarios utilizados para describir las relaciones de genes ancestrales. Parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral; ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de la especiación y también son derivados de un gen ancestral común. Preferiblemente, los homólogos, ortólogos o parálogos tienen una secuencia de identidad en el nivel de proteína de al menos 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, preferiblemente 50%, 51%, 52%, 53%, 54% o 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, preferiblemente 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, más preferiblemente 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, aún más preferiblemente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, más preferiblemente 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más como se midieron en un programa BLASTp (Altschul et al., 1997 ; Altschul et al., 2005). Preferiblemente, el homólogo, ortólogo o parálogo tiene uno o más de los siguientes motives conservados K ( D/E ) EA y/o PRS(R/H/C)I, aún más preferiblemente los motivos ( R/S ) K ( D/E ) E ( M/L/V) y/o F(E/Q/D/G/A) (G/A)PRS(R/H/C) I, más preferiblemente el motivo K(D/E)EAXXXLXXXXMXXLXXXVXXLXXXXWXFXXPRSXI, donde X puede ser cualquier aminoácido. Los motives conservados se muestran en la Figure 15. Preferiblemente, el homólogo, ortólogo o parálogo es una proteina de la planta, aún más preferiblemente una proteina de la planta con el porcentaje de identidad y el motivo conservado. Preferiblemente, el homólogo, ortólogo o parálogo es un activo biológico, medido por su interacción con APC10, in vitro o in vivo. Como un ejemplo no limitado, los ortólogos de SAMBA (ID SEC Nu2) se seleccionan de la lista que consiste en ID SEC N°3 - ID SEC N°21.
En una modalidad preferida, APC10 está sobreexpresado . En otra modalidad preferida, la expresión de SAMBA se reprime o se elimina completamente. La sobreexpresión o represión se refiere a la expresión en la planta modificada, comparada con la planta parental no modificada, crecida en las mismas condiciones. Los métodos para la sobreexpresión de genes o represión de genes expresión son conocidos por las personas con experiencia en la técnica. La sobreexpresión se puede realizar, como un ejemplo no limitante, colocando la secuencia codificada del gen bajo el control de un promotor fuerte, como puede ser, pero no limitado al promotor CMV 35 S. De otro modo, la sobreexpresión se puede realizar aumentando el número de copias del gen. La represión de la expresión del gen se puede realizar, como un ejemplo no limitante, por silenciación de genes, RNA antisentido o por RNAi . El diseño de RNAi es conocido por las personas con experiencia en la técnica. Como un ejemplo no limitante, RNAi se puede diseñar con el diseñador Web micro RNA (Ossowki et al., 2005-2009). El RNAi se puede dirigir contra una parte de la región terminal 5' no traducida, contra una parte de la secuencia codificada, y/o contra la región terminal 3' de la mRNA. Algunos ejemplos no limitantes de las secuencias diana se listan en la Tabla 1.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención es el uso de RNAi contra un ácido nucleico que codifica SAMBA o una variante de ésta, como se define antes, para aumentar el crecimiento de la planta. La RNAi elegirá únicamente una parte del ácido nucleico, considerando que la secuencia Diana se puede situar en la secuencia codificadora, o en las regiones no traducidas 5 ' o 3 ' del ácido nucleico que codifica SAMBA o una variante.
La sobreexpression o represión de la expresión de un gen diana se puede obtener transfiriendo un constructo genético, propuesto para la sobreexpresion o la represión de la expresión en una planta. La transferencia de genes extraños en el genoma de una planta se llama transformación. La transformación de la especie de la planta es una técnica rutinaria totalmente conocida por las personas con experiencia en la técnica. De forma ventajosa, cualquiera de los diversos métodos de transformación se puede utilizar para introducir el gen de interés en una célula ancestro adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de los tejidos de la planta o células de la planta se pueden utilizar para la transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen, pero no están limitados a transformación mediada con agrobacterias , el uso de liposomas, electroporación , químicos que aumentan la captación de DNA libre, inyección del DNA directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyeccion.
Preferiblemente, la planta como se utiliza en esta invención se selecciona del grupo que consiste en Arabidopsis thaliana, Brassicus sp., Glycine max, Medicago truncatula, Vitis vinifera, Populus sp., Solanum sp., Beta vulgaris, Gossypium hirsutum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Triticum aestivum, Oryza sativa, Phyllostachys edulis, Miscanthus sp., Panicum virgatum, Zea mays , Saccharu officinarum, Sorghum bicolor y Ricinus communis. En una modalidad preferida, la planta es una planta de cultivo, preferiblemente una monocotiledónea o un cereal, aún más preferiblemente es un cereal seleccionado del grupo que consiste en arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo y avena.
Aún otro aspecto de la invención es una planta transgénica, que tiene una RNAi contra un ácido nucleico que codifica SAMBA (ID SEC N° 2) o una variante de ésta. Una planta transgénica como se utiliza en la presente es una planta, que contiene un constructo DNA recombinante , por medio del cual el constructo DNA recombinante se puede introducir directamente por transformación, o indirectamente por reproducción. RNAi contra un ácido nucleico contra SAMBA significa que la RNAi es capaz de regular de forma descendente la expresión del tipo nativa de SAMBA. Preferiblemente, la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste en Arabidopsis thaliana, Brassicus sp., Glycine max, Medicago truncatula, Vitis vinifera, Populus sp., Solanum sp.. Beta vulgaris, Gossypíum hirsutum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Triticum aestivum, Oryza sativa, Phyllostachys edulis, Miscanthus sp., Panicum virgatum, Zea mays, Saccharum officinaru , Sorghum bicolor y Ricinus communis . Más preferiblemente, la planta transgénica es una planta de cultivo, preferiblemente una monocotiledónea o un cereal, aún más preferiblemente es un cereal seleccionado del grupo que consiste en arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo y avena.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Expresión de APC10. Análisis O-PCR de la expresión APC10 en plántulas totales de plantas de tres semanas .
Figura 2: Análisis Fenotipico de lineas APC10 . Tipo Nativa crecido in vitro de dos semanas (panel izquierdo) y plantas APC10OE (panel derecho)
Figura 3: Análisis Cinemático del Crecimiento de Hoja del Primer Par de Hojas de Tipo Nativa (Col-O) y Plantas Sobreproduciendo APC10.
(A) Área del Borde de la Hoja.
(B) Número de célula epidérmica en el lado abaxial de la hoja.
(C) Tamaño de célula epidérmica en el lado abaxial de la hoja .
Figura 4: Medición de la Hoja de tres semanas crecida en el suelo, Columbia tipo Nativa y plantas APC10OE. A- Área de la hoja y linea de longitud de la hoja 5.3, B- Área de la hoja y linea de longitud de la hoja 2.3. El área y longitud de la hoja del tipo Nativa se indica mediante la linea amarilla.
Figura 5 : Medición de peso Fresco y Seco de plantas de tres semanas:
A- Peso Fresco de brotes en APC10OE y plantas T de 22 días .
B- Peso Seco de brotes en APC10OE y plantas WT de 22 días.
Figura 6: Distribución del nivel de Ploidia de las primeras hojas: A- 14 días y B- 18. C- las plantas tipo nativa, APC10OE5.3 y APC10OE2.3 se midieron por citometría de flujo.
5
Figura 7: Análisis Molecular de plantas Samba con un gen desactivado. A- Representación esquemática de la estructura exon (cajas) e intrones (lineas) de Samba. Los triángulos blancos indican los sitios de inserción de T-l () DNA. B-expresión de SAMBA. Análisis 0-PCR de la expresión SAMBA en las dos primeras hojas de plantas de dos semanas .
Figura 8: Análisis Fenotipico de lineas SAMBA con un gen 15 desactivado. Plantas SAMBA con un gen desactivado con crecimiento in vitro de dos semanas (panel izquierdo) y tipo nativa (panel derecho) . A- Plantas SAMBA con un gen desactivado ( SALK_018488 ) y tipo nativa. B- Plantas SAMBA con un gen desactivado de ( SALK_048833 ) y tipo nativa. 0
Figura 9: Medición de Hojas de plantas de tres semanas con crecimiento in vitro e in vivo. A- Medición de una serie de hojas de plantas desde 22 con crecimiento in vitro-Columbia (linea) y plantas con un gen desactivado 5 de SAMBA (bloques). B- Imagen representativa de la medición de A. C- Medición de serie de hojas de plantas desde 22 días con crecimiento in vivo-Columbia (línea clara) y plantas Samba con un gen desactivado (línea oscura ) .
Figura 10: Medición de peso Fresco y Seco de plantas de tres semanas. A- Peso de brote fresco de plantas de Samba y Testigo Tipo Nativa. B- Peso de brote seco de plantas de Samba y testigo tipo Nativa.
Figura 11: Medición de Hoja 1 y 2 de plantas de 12 y 15 de plantas tipo Nativa y Con un gen desactivado Samba y distribución de nivel de Ploidía de las primeras hojas de plantas tipo nativa y Con un gen desactivado Samba de 14 días. Rectángulo negro (tipo nativa) y rectángulo gris (Con un gen desactivado Samba)
(A) Área del borde de la hoja (mm2)
(B) Número de células epidérmicas en el lado abaxial de la hoja
(C) Nivel de Ploidía (%) de plantas tipo Nativa y con un gen desactivado Samba.
Figura 12: Medición de raíz de plantas de dos semanas. A-Medición de la raíz principal de plantas del tipo Nativa y Samba con un gen desactivado. B- Imagen representativa de la medición de A. C- Medición de peso Fresco de la raíz. D- Medición de peso Seco de la raíz.
Figura 13: Medición del tamaño de la semilla de plantas tipo Nativa y Samba con un gen desactivado.
Figura 14: Experimento Manitol. Plantas tipo Nativa y Samba con un gen desactivado con crecimiento en 25 mM de condición manitol y las plantas del experimento testigo crecieron sin Manitol.
Figura 15: Alineación de variantes SAMBA, que muestran los motivos conservados. Arath: Arabidopsis thahana; Brana: Brassicus napus; Glyma: Glycine max; Medtr : Medicago truncatula; Vitvi : Vitis vinifera; Poptr: Populus trémula Solly: Solanum lycopersicon; Betvu : Beta vulgaris; Avesa: Avena sativa; Horvu : Hordeum vulgare; Triae: Triticum aestivum; Orysa: Oryza sativa; Phyed : Phyllostachys edulis; Panvi : Panicum virgatum; Zeama: Zea mays; Sacof: Saccharum officinarum; Sorbi : Sorghum bicolor
EJEMPLOS
Materiales y métodos para los ejemplos
Clonación
La clonación de transgenes que codifican las fusiones de etiqueta bajo el control del promotor constitutivo del virus 35S del mosaico de tabaco de coliflor, transformación de cultivos de suspensión de células Arabidopsis, preparación de extracto de proteínas, purificación TAP , precipitación y separación de proteínas se hizo como se describe (Van Leene et al., 2007 & 2008).
La versión del genoma de Arabidopsis thaliana (www.arabidopsis.org) se investigó para homologarlo con el gen APC10 utilizando un programa BLAST . Se identificó una secuencia de 579 bp y aproximadamente 21 KDa en la base de datos TAIR. La región codificadora de APC10 (AT2G18290) se utilizó para diseñar cebadores específicos ( ttblAPClO
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggcgacagagtcatcggaat y Attb2APC10 ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatgttcttcaaacttctcctgctc ) para aislar el cDNA respectivo y se amplificó directamente por PCR de tejidos de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbra.
La reacción PCR se realizó utilizando el Equipo Pfx (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento PCR, refiriéndose a cDNA completo del gen APC10 se introdujo en pDONr 201 utilizando el sistema Gateway (Invitrogen) por sitios de recombinación attBXattP y recombinados de forma subsiguiente en el vector p 7 G2 por recombinación de los sitios attL XattR. La secuencia se confirmó por secuenciación .
La construcción APC10_pK7WG2 se utiliza para transformar ñrabidopsis thaliana por el método de inmersión floral (Clough and Bent, 1998).
Material de la planta
Las plantas con un gen desactivado SAMBA (código de semilla: SALK_048833 y SALK_018488) se obtuvieron de la colección Salk (http://signal.salk.edu/). Veinte genotipos de planta de cada línea se determinaron por PCR con cebadores específicos para el elemento de inserción T-DNA y para SAMBA ( LP_atgacgaaacaccgaaaacacand ; RP_agttttatggtcggtcacacg para salk 018488 y
LP_ccattgggatcattactgctg ; RP_aaaggaaacgtgacgattgtg para Salk 048833 y LBbl_3 attttgccgatttcggaac para el cebador limítrofe T-DNA izquierdo).
Entre 20 plantas encontramos 2 homocigotos individuales de cada linea. La presencia de la inserción de T-DNA y ausencia del gen tipo Nativa se confirmó por PCR genómica de las hojas de plantas de 15 días. Estas plantas se seleccionaron para producir más semillas y para análisis subsiguientes. O-PCR utilizando cebadores específicos (SAMBA_Fwd gctggtctagacgatttcca y SAMBA_Rev-gcttcacttcacctcctttc) para SAMBA se realizaron para confirmar la ausencia de mRNA de SAMBA. Las plantas Arabidopsis (ecotipo Col-0) se transformaron con la construcción APC10_pK7WG2 por el método de inmersión floral (10).
Las líneas transgénicas (APC10OE) se identificaron por selección en un medio de germinación de 50 mg/1 de canamicina y después se transfirieron al suelo para la producción óptima de la semilla y selección de plantas homocigotos T3. Las líneas de sobreexpresión se confirmaron por O-PCR utilizando cebadores específicos (APC10_Fwd tcatatccgccagatcaaagttt y APC10_Rev aaggttggtgcggaatagga ) para confirmar los niveles de mRNA de las plantas transgénicas.
Extracción de RNA y preparación de cDNA.
RNA total se extrajo de los materiales congelados utilizando Reactivo TRIzol ( Invitrogen ) . Para eliminar el DNA genómico residual presente en la preparación, el RNA se trató con DNAse libre de RNAse I de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences) y la purificación se realizó con el equipo RNeas y Mini de Oiagen. Después se cuantificó el total de RNA con un espectrofotómetro y se cargo en un gel agarosa para verificar su integridad. Se hizo cDNA con "Superscript III first strand synthesis system" (Invitrogen) con la solución cebadora oligo ( dT ) en 2 ug de la plantilla del RNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Proteólisis y aislamiento del péptido
Después de desteñirlos, los desbastes en gel se lavaron durante 1 hora en H20, los puentes de disulfuro de polipéptido se redujeron a 40 mm en 25 mL de DTT 6,66 mM en 50 mM de NH4HC03 y de forma secuencial los grupos tiol fueron alquilatados durante 30 min en 25 mL de IAM 55 mM en 50 mM de NHHC03. Después de lavar los desbastes en gel 3 veces con agua, las franjas completas de los geles proteicos se cortaron en rebanadas, se recolectaron en placas de microtitulación y se trataron esencialmente como se describe antes con modificaciones menores (Van Leene et al., 2007). Por fuente de placa de microtitulación, se rehidrataron partículas de gel deshidratadas en 20 pL solución amortiguadora para digestión que contiene 250 ng de tripsina (MS Gold; Promega, Madison, WI), 50 mm de NH4HC03 y 10% de CH3CN (v/v) durante 30 min a 4o C. Después de adicionar 10 pL de una solución amortiguadora que contiene 50 mm de NH4HCO3 y 10% de CH3CN (v/v), las proteínas fueron digeridas a 37° C durante 3 horas. Los péptidos resultantes se concentraron y desalaron con las puntas de la microcolumna en fase sólida (punta PerfectPureTM C18, volumen de lecho 200 nL; Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se diluyeron directamente en una placa diana MALDI (Opti-TOFTM384 ell Insert; Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando 1.2 µ?, de CH3CN al 50%: solución saturada de CF3COOH al 0.1% con -cyano-4- ácido hidroxicinámico y adicionados con 20 fmol/uL de Glul Fibrinopéptido B (Sigma Aldrich), 20 fmol/ L de des-Pro2-Bradicinina (Sigma Aldrich), y 20 fmol/yL de Fragmento de Hormona Adrenocorticotrópico 18-39 humana (Sigma Aldrich).
Adquisición de espectros de masa
Un instrumento MS en cascada con MALDI (Analizador Proteómico 4700 y 4800; Applied Biosystems) se utilizó para adquirir huellas de masa de péptidos y de forma subsiguiente los espectros de fragmentación 1 kV CID de los péptidos seleccionados. Los espectros de masa de péptidos y secuencia de péptidos se obtuvieron utilizando esencialmente los parámetros como se describe anteriormente (Van Leene et al., 2007). Cada placa con MALDI se calibró de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Todos los espectros de huella de masa de péptidos (PMF) se calibraron internamente con tres normas internas en m/z 963.516 (des-Pro2-B radicinina) , m/z 1 570.677 (Glu 1-Fibrinopeptide B) y m/z 2465,198 (Fragmento de Hormona Adrenocorticotrópico 18-39) resultando en una exactitud de masa promedio de 5 ppm ± 10 ppm para cada punto de péptido analizado en las dianas MALDI . Utilizando los espectros PMF individuales, hasta dieciséis péptidos, excediendo una relación señal a ruido 20 que pasa a través de un filtro de exclusión de masa se sometieron a análisis de fragmentación.
Identificación de homología proteica con base en MS
Los espectros PMF y los espectros de secuencia péptidos de cada muestra se procesaron utilizando la suite de software acompañante (GPS Explorer 3.6, Applied Biosystems ) con ajustes de parámetros prácticamente como se describe anteriormente (Van Leene et al., 2007). Los archivos de búsqueda de datos se generaron y sometieron a identificación de homología proteica contra el TAIR 8.0 utilizando un motor de búsqueda de base de datos local (Mascot 2.1, Matrix Science). Las identificaciones de homología proteica del límite superior (primer rango) con una marca relativa que excede 95% de probabilidad fueron retenidas. Las identificaciones positivas adicionales (segundo rango y más) fueron retenidas cuando la marca excedió el umbral de probabilidad de 98%.
Citometría de flujo
Análisis de Citometría de flujo. El tejido de las hojas se cortó con una navaja para rasurar en 200-400 x de solución amortiguadora (45 mM de MgC12, 30 mM de citrato sodio, 20 mM de ácido 3- [ -morfolino ] -propan-sulfónico , pH 7, y Tritón X-100 al 1%), se filtraron sobre una malla de 30 µp?, y se adicionó 1 \i~L de 1 pg/mL de 4 , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La distribución del contenido de DNA nuclear se analizó con un aparato citómetro de flujo Cyflow ML (Partee).
Medición de hoja y análisis de número de células
La medición de la hoja y subsiguiente análisis del número de células de plantas con un gen desactivado de Samba y tipo nativa se realizaron en la epidermis abaxial de la hoja 1 y bordes 2 cosechados en los días 12 y 15, como se describe anteriormente (De Veylder et al. 2001). Las plantas se sembraron en secciones de cuartos de cajas de Petri redondas de 12-cm llenadas con 100 mL del medio Murashige y Skoog al 0.5 (Duchefa, Haarlem, Países Bajos) y agar para cultivo tisular vegetal al 0.9%. Todas las plantas saludables se colocaron en etanol toda la noche para eliminar la clorofila, y de forma subsiguiente se aclararon y almacenaron en ácido láctico para el microscopio. Los análisis cinemáticos completos se realizaron como se describe anteriormente (De Veylder et al., 2001) en la epidermis abaxial de la hoja 1 y bordes 2 cosechadas diariamente desde el día 4 hasta el día 25 con plantas APC10OE y testigo.
Análisis fenotípico
Para la medición de biomasa, se recolectó la parte vegetal de una planta 20 días y el peso fresco se midió pesando aproximadamente 20 plantas de cada línea y para el peso seco las mismas plantas se colocaron en cajas de Petri y se permitió que se secaran durante 1 semana y se pesaron nuevamente. Para la medición del área de la hoja, las series de hojas se hicieron de plantas crecidas in vitro durante 22 días. Las hojas se disecaron a partir de las rosetas con el lado izquierdo, empezando desde dos cotiledóneos seguidos de izquierda a derecha por la la, 2a, 3a y las hojas subsiguientes.
Para el análisis de raíz, las plantas crecieron en posición vertical en placas con medio MS de agar al 1.2% durante 15 días. Después de los 15 días las placas fueron barridas y se analizaron las imágenes utilizando el programa Image J 1.37. Para la medición del peso fresco la raíz total de 25 plantas se cortó desde el brote y se pesaron de forma individual y para el peso seco las mismas plantas se colocaron en cajas de Petri y se les permitió secarse durante 1 semana y se pesaron nuevamente.
La medición del tamaño de semilla se realizó colocando las semillas en papel plástico transparente y cada línea se barrió de forma separada. Las imágenes del área total de semilla se analizaron utilizando el programa Image J 1.37.
Análisis cinemático
El análisis cinemático se realizó como se describe anteriormente (De Veylder et al., 2001) en la epidermis abaxial de la hoja 1 y bordes 2 cosechadas diariamente a partir del día 4 hasta el día 25.
Experimento con Manitol
Las plántulas de con un gen desactivado Samba y tipo nativa, ecotipo Columbia-0 (Col-0) con crecimiento in vitro en un medio Murashige y Skoog de concentración media (Murashige and Skoog, 1962), complementado con sacarosa al 1% en un régimen de 16-h al día (110 ymol m-2 s-1) y 8-h en la noche. Antes de someterlo a autoclave, se adicionaron 25 mM de manitol (Sigma) al medio de agar. Las plantas tratadas tuvieron crecimiento en placas con 25 mM de manitol, mientras que las plantas testigo tuvieron crecimiento en el mismo medio sin manitol. Las plantas crecieron durante 20 días y se tomaron y analizaron las imágenes utilizando el programa Image J 1.37.
Ejemplo 1: efecto de APClO en el crecimiento de la planta
Para evaluar la función de APClO durante el desarrollo, se generaron plantas Arabidopsis expresando niveles más altos de APClO mRNA en el control del promotor constitutivo del virus 35S del mosaico de tabaco de coliflor. Seleccionamos 11 homocigotos independientes, plantas de un solo locus en el cual se confirmó el nivel de expresión mejorada de APClO por OPCR (Figura 1). Los análisis de fenotipo comparativo entre las lineas de sobreexpresión APClO (APC10OE) y lineas testigo mostraron que las plantas con niveles más altos de APClO provocaron un aumento en la roseta y el crecimiento de la hoja durante el crecimiento (Figura 2).
Para saber cuales hojas fueron afectadas, determinamos que el área de todas las hojas de 2 líneas independientes de APC10OE y testigo tipo Nativa. En tres semanas de crecimiento en el suelo el área de todas las hojas aumentó de forma importante en las plantas transgénicas cuando se compararon con las plantas testigo del tipo Nativa (Figura 4).
Para investigar la base celular del fenotipo observado, realizamos análisis cinemáticos de las hojas en desarrollo. La Figura 3 muestra un aumento importante en el área de la hoja y el número de células en las plantas APC10OE desde el inicio del desarrollo (día 4 y día 5) cuando se comparó con las plantas tipo nativa.
La conclusión principal es que las velocidades de división de las células fueron más altas en las plantas APC10OE durante el desarrollo temprano de la hoja cuando se compararon con las testigos tipo nativa. Aunque la organización celular de la hoja y los tamaños de la hoja fueron similares a aquellos de las plantas testigos, lo números de células aumentaron de forma importante en las hojas maduras de las plantas APC10OE. Para verificar si teníamos diferencia importante en la biomasa de las plantas transgénicas comparada con la de tipo nativa se midió el tipo fresco y seco del brote en las plantas APC10OE y tipo nativa. Observamos un aumento en biomasa en las plantas transgénicas cuando se comparó con las plantas testigo tipo nativa (Figura 5A y B), el peso fresco y seco de esas plantas fue aproximadamente 15% más alto que el de las plantas tipo nativa .
Analizamos el contenido de DNA en etapas de desarrollo diferentes: proliferación (d8; dlO y dl2), expansión (dl4; dl6 y 18), y tejidos maduros (d20; d22; d24) de las células de hojas de las plantas APC10OE. Observamos una proporción más alta de células con contenido de DNA 2C y 4C y, por el contrario una proporción inferior de células con contenidos DNA 8C y 16C comparado con las plantas tipo nativa, mostrando que en las plantas APC10OE se reduce la endoreduplicación (Figura 6).
Ejemplo 2: aislamiento de TAP e identificación MS de proteínas que ínteractúan con APClO
Para identificar las contrapartes de la interacción de APClO in vivo, realizamos purificaciones de afinidad en cascada (TAP) en cultivos de suspensión de células Arabidopsis transgénicas que expresaron bajo control del promotor 35ScaMV la APClO como una proteina se fusionó en sus N-términos con la etiqueta TAP tradicional desarrollada para levadura (Rigaut et al., 1999) y con la etiqueta GS (Bürckstümmer et al., 2006). Se realizaron cuatro purificaciones TAP independientes en los cultivos con la etiqueta tradicional de acuerdo con Van Leene et al. ( 2007 ), y dos purificaciones en los cultivos con la etiqueta GS de acuerdo con Van Leene et al. (2008). Los extractos proteicos se cosecharon dos días después del sub-cultivo en el medio fresco. La afinidad de proteínas purificadas se separó en un gel NuPAGE del 4-12% y se tiñó con Coomassie Brilliant Blue. Las bandas proteicas se cortaron, digerido dentro del gel con tripsina y se sometieron a espectrometría de masa en el aparato MALDI-TOF/TOF para la identificación de proteínas. Después de sustraer las proteínas del fondo, identificadas por purificaciones de testigos (Van Leene et al., 2007 & 2008), se identificaron 18 proteínas que interactúan con APC10 (Tabla 2). Éstas se pueden dividir en dos grupos: 14 proteínas se confirmaron de forma experimental y 4 proteínas se identificaron únicamente en uno de 6 experimentos TAP y el cual puede representar interacciones ya sean débiles o transitorias.
Ejemplo 3: estimulación del crecimiento de la planta mediante con un gen desactivado de la proteina Novel APC Interactivador (SAMBA)
Entre las proteínas que interactúan, se identificó una novedosa proteina de aminoácido 100 (AT1G32310) (Tabla 2). Seleccionamos esta proteina para analizarla en más detalles, porque mostró enlace muy especifico con la subunidad APC 10. La proteina expresada es una proteina desconocida similar a la proteina desconocida de Oryza sativa (GB : AAL67597.1 ) .
Para entender mejor la función de este gen, se seleccionaron y analizaron las plantas con un gen desactivado de la colección SALK. El esquema representativo de las inserciones T-DNA en el primer exon del gene Samba se muestra en la Figura 7A. Las transcripciones SAMBA no se detectaron en las plantas mutantes de SAMBA mediante el análisis O-PCR (Figura 7B), confirmando la pérdida de la función del gen. Las plantas mutantes (lineas de homocigotos SALK) SAMBA con un gen desactivado mostraron un aumento en la roseta y en el crecimiento de la hoja cuando se compararon con las plantas testigo tipo nativa (Figura 8) similar al fenotipo de las plantas APC10OE. La medición del área total de la hoja de mutantes Samba con crecimiento in vitro también mostró un aumento importante en el área de la hoja comparada con las plantas tipo nativa (Figura 9). La medición del peso fresco y seco de los brotes (Figura 10), área de la hoja (Figure 11 ), longitud y peso de la raíz (Figura 12) y tamaño de la semilla (Figura 13) mostraron todas un aumento importante para las plantas SAMBA con un gen desactivado, probando que SAMBA es un nuevo gen que controla el crecimiento de las plantas.
El fenotipo de Samba con un gen desactivado se analizó en detalle midiendo el área total de la hoja de 22 días con crecimiento in vitro. El resultado mostró un aumento importante del área de la hoja comparado con las plantas tipo Nativa (Figura 9A) . Se hizo el mismo análisis con plantas de 22 días con crecimiento en el suelo y pudimos observar el mismo fenotipo de las plantas con crecimiento in vitro, un área de hoja aumentado de forma importante en Samba con un gen desactivado comparado con plantas tipo Nativa (Figura 9C). Para verificar si hubo una diferencia importante en biomasa de samba con un gen desactivado comparado con las plantas de tipo Nativa se midió el peso fresco y seco de la parte vegetal de unas plantas de 20 días. La medición del peso fresco (Figura 10A) y seco (Figura 10B) mostró un aumento importante en la biomasa de plantas SAMBA con un gen desactivado, corroborando con la hipótesis de un nuevo gen candidato que controla el crecimiento de las plantas.
Para investigar la base celular del fenotipo observado, medimos y analizamos el área y número de células del primer par de hojas de 12 y 15 días. Figura HA y B mostró un aumento importante del área de la hoja y número de células en Samba con un gen desactivado comparado con las plantas tipo Nativa, indicando que la división de células es más alto en las plantas Samba con un gen desactivado .
El análisis de citometria de flujo se realizó para analizar el impacto de la expresión reducida del gen Samba en el contenido DNA de la planta. Las plantas Samba con un gen desactivado mostraron niveles de aumento ligeros de contenido de 8C DNA cuando se comparó con plantas tipo nativa (Figura 11 C).
También se evaluó el impacto de Samba con un gen desactivado en la raíz y producción de semilla. La longitud de la raíz primaria se midió 15 días después de la germinación. Los datos muestran un aumento importante en la longitud de las raíces de Samba con un gen desactivado comparadas con las plantas tipo nativa (Figura 12A) . La imagen representativa de raices más largas de Samba con un gen desactivado se muestra en la Figure 12B. El peso fresco y seco (Figura 12C y D) de las raices se midió y se puedo confirmar un aumento importante de la biomasa de las raices y pudimos confirmar un aumento importante de la biomasa de la raíz en las plantas Samba con un gen desactivado.
El análisis de semillas también mostró un aumento en el tamaño de la semilla. Se midió el área total de la semilla de las plantas, tipo nativa y Samba mutante. Como podemos observar las semillas de Samba mutantes son significativamente más grandes que las plantas de tipo nativa (Figura 13).
Ejemplo 4: Efecto de la SAMBA con un gen desactivado en condiciones de stress
Las plantas de tipo Nativa y Samba con un gen desactivado con crecimiento en placas de agar complementadas con 25 mM de manitol para evaluar la capacidad de las plantas Samba mutantes crecieron bajo condiciones de stress. Como se muestra en la Figura 14, las plantas de Samba mutantes conservan su fenotipo de biomasa aumentada en condiciones de estrés.
Tabla 1. Ejemplos no limitantes de secuencias diana para
RNAi
Arabidopsis thaliana
TAAACAAAGCGTATATGACCA TCATTTTCGAGTAATAGGCTC
Hordeum vulgare
TAAGTTATGACTTATGAGCAT
TTTAGATGAATGCAACTCCAT
Oryzae sativa
TAGAATTCTACCAGGCGTCTT
TTGAGTAATCCTTACATGCGA
Brassica napus
TATAAAGTTCGTGATGGACAT
TACTAGATATCACCAAACCTA
Saccharum officinarum
TTCTACACCCTAGAAGTTCTT
TACTAGGCTTCTTACAAGCAC
Glycine max
TATCAAGCTTTAAGTGTGCTC TTAACATGACACGAACTTCGC
Vinis vinifera
TCTTGTGGAGAACTCCCCCAG
TCTTGTGGAGAACTCCAGCAG
Solanaceum lycopersicum
TATCTATACTCGTTATCGCAC
TATCTATACTCGTAATCGCTC TATCTCATATGGAATTCGCGC
Tricitum aestivum TTAACAGGTGAGTCGAATCAG TTAACAGGTGAGTCGAATCAT
Zea mays
TCAACTCTGAGAGTTTCGCAT TTACCATGACATTAACGTCGC
Tabla 2. Lista de proteínas APCIO-copurificadas identificadas por MS . La tercera columna menciona en cuantos de los seis experimentos independientes se identificó un interactivador
Mas a J
ATSH=-JS APC7 iasí-s
CDC27 ß 21 41% 123/25
APCi 6 1384 S5 651,'5S 1Ü9S6
>\T3ti>181 APC8 #777 21 A/58
?? 1?¾ß590 APG5 ß 101945 21 567.'58 '-25
?? <j23'32 2e
APCA 6 «a-330 Mi- 2?¾ 215,'Síí _2
AT2G0 66 3 13 fl¾ 77
SAfv BA 2 2S5¾ T2"21 VI4 3 6 64
»1«210 *9202 8 16% ???,'?» '2S
UVI4-l¡ke 2 I 27092 f> 2S% 72'2
AT3C 16.320 I «2032 4 8 f¡3'5>9 53<25
AT ttS9 !U ·5 * 1 3-30 3 a 17%
C S52B 1 52915 8 S~'5S 2 .??
C-DKA;1 1 M123 9 :si¾ eaísa
3
AT3G5615Ü 1 103283 0 *í> 57Í5S
1
AT2ü«i21JP 1 1212!¾£s 9 S3«5» ;M.<26
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Claims (1)
- REIVINDICACIONES El uso de APC10, o una variante de éste, y/o una proteina que interactúa con APC10 para aumentar el crecimiento y/o producción de la planta. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, por medio del cual la proteina que interactúa se selecciona del grupo consistente en AT2G39090, AT2G20000, AT5G05560, AT3G48150, AT1G06590, AT1G78770, AT4G21530, AT2G04660, AT1G32310, AT2G42260, AT4GA19210, AT3G57860, AT3G16320, AT4G25550, AT5G13840, AT3G48750, AT3G56150 y AT2G06210. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, por medio del cual la proteina que interactúa contiene SAMBA (ID SEC N° 2) o una variante de ésta. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, por medio del cual la variante contiene los motivos conservados K (D/E) EA y/o PRS(R/H/C)I. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 , por medio del cual la variante contiene los motivos conservados K ( D/E ) EAXXXLXXXXMXXLXXXVXXLXXXXWXFXXPRSXI . El uso de acuerdo con la reivindicación 1 , por medio del cual se sobreexpresa APClO o una variante de éste. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, por medio del cual se reprime la expresión de SAMBA (ID SEC N° 2 ) o variante de ésta . El uso de una RNAi contra un ácido nucleico que codifica SAMBA (ID SEC N° 2), o una variante de ésta, para aumentar el crecimiento y/o producción de la planta. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por medio del cual la planta es una planta de cultivo. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, por medio del cual el cultivo es un cereal. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, por medio del cual el cereal se selecciona del grupo consistente en arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo y avena. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, por medio del cual el aumento del crecimiento de la planta es cualquiera de uno o más de un aumento en la biomasa de la hoja, un aumento en la biomasa de la raíz y un aumento en la biomasa de la semilla. Una planta transgénica, que contiene una RNAi contra un ácido nucleico que codifica SAMBA (ID SEC ' 2) o una variante de ésta. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 13, por medio de la cual la planta transgénica es un cereal. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 14, por medio de la cual el cereal se selecciona del grupo que consiste en arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo y avena.
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