MX2011004945A - Anticuerpos completamente humanos contra n-cadherina. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud proporciona anticuerpos completamente humanos contra N-cadherina para métodos terapéuticos y diagnósticos en cáncer.

Description

ANTICUERPOS COMPLETAMENTE HUMANOS CONTRA N-CADHERINA REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° EE.UU. 61/113.042, presentada el 10 de noviembre de 2008, que se incorpora en la presente a título de referencia .

DECLARACIÓN EN CUANTO A LOS DERECHOS A LAS INVENCIONES HECHAS BAJO INVESTIGACIONES O DESARROLLOS PATROCINADOS FEDERALMENTE .

[0002] NIH/NCI SOMI Training Grant, R25 CA 098010, M. Phelps/A. Wu, Directores NIH/NCI UCLA Prostate SPORE, P50 CA 092131, R. Reiter/A. Wu. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

REFERENCIA A "LISTADO DE SECUENCIAS", UNA TABLA, O UN APÉNDICE CON UN LISTADO DE PROGRAMA DE COMPUTADORA PRESENTADOS EN UN DISCO COMPACTO

[0003] NO CORRESPONDE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] El cáncer de próstata es la condición maligna más común y la segunda causa de muertes relacionadas con el cáncer en los hombres en los EE.UU. El cáncer de próstata es una enfermedad biológicamente y clínicamente heterogénea. Una mayoría de hombres con esta condición maligna muestra cánceres de crecimiento lento que tal vez no incidan sobre la expectativa de vida de un individuo, mientras que otros son afectados de tumores metastásicos rápidamente progresivos. La detección selectiva por PSA tiene un valor limitado por su falta de carácter específico y su incapacidad de predecir cuáles pacientes corren el peligro de desarrollar una enfermedad metastásica refractaria de las hormonas. Los estudios recientes que preconizan reducir el umbral de PSA para el diagnóstico pueden incrementar la cantidad de diagnósticos de cáncer de próstata y complicar más aún la identificación de pacientes con cánceres indolentes vs . cánceres agresivos (Punglia et al., N Engl J Med, 349: 335-342 (2003)). Se necesitan urgentemente nuevos marcadores de sueros y tej idos que se correlacionan con pronósticos clínicos o que permitan identificar pacientes con una enfermedad potencialmente agresiva (Welsh et al., Proc Nati Acad Sci U S A, 100: 3410-3415 (2003)).

[0005] Los estudios de perfilado recientes sugieren que las signaturas de expresión para tumores metastásicos vs . no metastásicos puede residir en el tumor primario (Ramaswamy et al., Nat Genet, 33: 49-54 (2003); Sotiriou et al., Proc Nati Acad Sci U S A, 100: 10393-10398 (2003)). Con alguna frecuencia, en el tumor primario puede haber presentes rasgos adicionales que predisponen a los tumores a formar metástasis en órganos específicos (Kang et al., Cáncer Cell, 3: 537-549 (2003)). Estas observaciones recientes sugieren que es posible identificar en la etapa temprana de la enfermedad novedosos marcadores de cáncer de próstata premetastásicos o prerrefractarios a las hormonas . Estos marcadores también pueden desempañar un rol en la biología de la progresión o evolución del cáncer de próstata metastásico o refractario a las hormonas. Los ejemplos recientes de genes presentes en tumores primarios que se correlacionan con el desenlace o diagnóstico y que desempeñan un rol en la biología de la progresión del cáncer de próstata incluyen la EZH2 y LIM quinasa (Varambally et al., Nature, 419: 624-629 (2002); Yoshioka et al., Proc Nati Acad Sci U S A, 100: 7247-7252 (2003)). Sin embargo, no se secreta ninguno de estos genes.

[0006] A efectos de identificar nuevos candidatos a marcadores de sueros o tejidos de cáncer de próstata refractario a las hormonas, hemos comparado previamente perfiles de expresión de genes de xenoinjertos apareados de cáncer de próstata dependientes e independientes de hormonas . Se estableció el xenoinjerto LAPC-9 a partir de una metástasis osteoblástica de hueso y de sus progresos desde dependencia de hormonas androgenas a independencia de drogas androgenas después de castración en ratones inmuno deficientes (Craft et al., Cáncer Research, In Press (1999) ) . Esto se ha utilizado anteriormente para identificar candidatos a agentes terapéuticos en cáncer de próstata. Se validaron genes expresados diferencialmente y seguidamente se los examinó para establecer la homología de las secuencias en cuanto a proteínas secretadas o proteínas de las superficies de las células. Se ha identificado la N-cadherina como marcador de cáncer. Se ha informado anteriormente acerca de la identificación, caracterización y validación inicial de la N-cadherina, que se expresa tanto en el cáncer de próstata como en el cáncer de vejiga refractario a las hormonas (documento WO/2007/109347) .

[0007] Un tipo de movimiento de células que puede observarse en la embriogénesis requiere la pérdida de los contactos entre células para la migración de las células individuales o de pequeños grupos de células a través de la matriz extracelular . Este proceso recibe la denominación de EMT (mesenchymal transition, transición mesenquimal) . El EMT se presenta también en situaciones patológicas, tales como la adquisición de un fenotipo motil e invasivo de células tumorales de origen epitelial . Una de las características del EMT es la pérdida de E-cadherina y la expresión de novo de las moléculas de adhesión de la N-cadherina . La N-cadherina promueve la supervivencia de las células del tumor, su migración e invasión, y los elevados niveles de N-cadherina se asocian frecuentemente con un pobre pronóstico. La N-cadherina se expresa también en las células endoteliales y desempeña un rol esencial en la maduración y estabilización de los vasos sanguíneos normales y de los vasos sanguíneos angiogénicos asociados con tumores. La creciente evidencia experimental sugiere que la N-cadherina es un potencial agente terapéutico para el tratamiento del cáncer.

[0008] La función de la N-cadherina ha sido estudiada a nivel molecular. La región extracelular N-terminal N-cadherina (160 a 724 a. a) consiste en 5 dominios (ECD1-ECD5) . El ECD1 y ECD2 son los dominios mínimos requeridos para la adhesión intracelular, pero si interviene la totalidad de los dominios extracelulares, se refuerza el nivel de adhesión. Además, un estudio ha demostrado que una porción de 69 aminoácidos de ECD4 es esencial para la migración y movilidad pero no en la adhesión celular ( imet al. J célula Biol 2000).

[0009] Por lo tanto, la invención provee composiciones y métodos que apuntan a la N-cadherina en el diagnóstico y tratamiento de cánceres que expresan que incluyen a título no limitante el cáncer de próstata y el cáncer de vejiga. En la presente también se informa sobre anticuerpos y fragmentos de ellos, que son específicos para los dominios extracelulares de la N-cadherina.

BREVE SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN

[0010] La presente solicitud provee anticuerpos completamente humanos contra la N-cadherina para métodos terapéuticos y de diagnóstico en cáncer, por ejemplo cáncer de próstata y cáncer de vej iga .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0011] Figura 1. Enriquecimiento en anticuerpo fago anti-N-cadherina mediante sucesivas recorridos de paneo.

[0012] Figura 2. Teñidos de diacuerpo A14, C7, E4 y D4 de células PC3.

[0013] Figura 3. Ligazón de diacuerpo C7 a células negativas a N-cadherina .

[0014] Figura 4. Ligazón específica de diacuerpos E4 y D4 a células que expresan N-cadherina.

[0015] Figura 5. Localización de tumores o localización de D4 Db etiquetado con 12 I en tumores LAPC9 AI .

[0016] Figura 6. La N-cadherina activa el NF-KB.

[0017] Figura 7. La N-cadherina activa el NF-KB.

[0018] Figura 8. La N-cadherina se expresa sobre la superficie celular de las células Cl.

[0019] Figura 9. El NF-KB se localiza en el núcleo de células positivas a N-Cadherina (Cl) .

[0020] igura 10. La expresión de N-cadherina tiene como resultado la inducción de IL-6, IL-8, TGF ß2, y bcl-2.

[0021] Figura 11. Correlación de genes inducidos con el nivel de N-cadherina .

[0022] Figura 12. El knockdown de la N-cadherina conduce a la regulación descendente de IL-6 y IL-8.

[0023] Figura 13. Actividad de NF-KB después del tratamiento con anticuerpos de N-cadherina.

[0024] Figura 14. Ncad en células PC3 : incubación de anticuerpos durante 48 horas.

[0025] Figura 15. El knockdown de la N-cadherina conduce a la regulación descendente de Akt activado.

[0026] Figura 16. Los anticuerpos específicos con respecto a la N-cadherina activan y seguidamente regulan descendentemente la activación del Akt.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0027] Aquí informamos acerca del método para tratar un paciente de cáncer y acerca del método para identificar células madre de cáncer, en los que la proteína N-cadherina en las células de cáncer se expresa en niveles normales o bajos, o se expresa mediante un subconjunto de células de cáncer y no está sobre expresado. Además de ello, en la presente informamos acerca de anticuerpos, y sobre fragmentos de ellos, que son específicos con respecto a los dominios extracelulares de la N-cadherina.

[0028] La expresión de la N-cadherina puede contribuir a la invasión y metástasis de cáncer de vejiga asi como a la progresión de la enfermedad refractaria a las hormonas. Es posible apuntar a la N-cadherina terapéuticamente tanto sola como en combinación con otros inhibidores de molécula pequeña de mTOR y EGFR. El apuntar a la N-cadherina puede ayudar a prevenir o a controlar el cáncer de próstata invasivo y metastásico.

[0029] Esta invención se refiere al descubrimiento de que no es necesario que la N-cadherina esté sobre expresada a diferencia de los tejidos normales para ser un objetivo para el tratamiento y diagnóstico. Puede expresarse con bajos niveles y también puede expresarse solamente mediante un subconjunto de células. Hemos descubierto que el apuntar a la N-cadherina aún en el 5 % de las células de cáncer de próstata es suficiente para bloquear la progresión del cáncer de próstata con respecto a la resistencia a la castración.

[0030] Esta invención también se relaciona con la N-cadherina como un objetivo en las células madre de cáncer. Hemos descubierto que el apuntar a la N-cadherina en 5 % o menos de las células es suficiente para bloquear la progresión del tumor. Este descubrimiento es coherente con la hipótesis de que la N-cadherina es un marcador de células madre de cáncer, y que la inhibición de la N-cadherina sobre estas células vástago es suficiente para bloquear el desarrollo o crecimiento del tumor como un todo.

[0031] Esta invención se refiere también al descubrimiento de que las células que expresan N-cadherina, compatible con el hecho de que se trata de un marcador de células madre de cáncer, son más tumorigénicas que las células que no expresan N-cadherina. Las células que son N-cadherina positivas pueden dar origen a células que son N-cadherina negativas, lo que también es compatible con la teoría de que la N-cadherina es un novedoso marcador de células madre de cáncer. Finalmente, los tumores deben regularse ascendentemente o adquirir N-cadherina para crecer. Es decir, las células vástago tumorales han de adquirir propiedades malignas de transición epiteliales a mesenquimales para ser tumorigénicas.

[0032] Por lo tanto, la N-cadherina es un objetivo terapéutico especialmente prometedor. Se la encuentra sobre las superficies de las células, expresada en muchos tumores epiteliales, y está asociada con la invasión, metástasis y posiblemente independencia con respecto a las hormonas androgenas . Por ello los anticuerpos contra la N-cadherina son un agente particularmente preferido para su uso en el tratamiento de cánceres epiteliales, los que incluyen pero no a título de limitación, los cánceres urogenitales (vejiga, próstata), y más particularmente, sus formas invasivas o de metástasis. En algunas formas de realización, se prefieren anticuerpos monoclonales dirigidos contra un dominio extracelular de N-cadherina. En otras formas de realización, para tratar estos cánceres se prefieren el primer dominio extracelular (EC1) , porciones de los dominios primero y segundo, de los dominios primero a tercero, o el cuarto dominio extracelular. En algunas formas de realización, para estos tratamientos se prefiere particularmente el uso de un anticuerpo dirigido hacia el dominio extracelular por cuanto se ha comprobado que este dominio es importante para el potencial de pro-motilidad e invasivo (Véase, Kim et al, J célula Bíol. 151 (6) : 1193-206 (2000), incorporado a título de referencia en su totalidad en cuanto a la definición de los diversos dominios N-cadherina .

[0033] Aquí describimos la selección y caracterización de ScFvs humanos que son específicos con respecto a dos proteínas recombinantes N-cadherina independientes: los dominios extracelulares N-cadherina uno a tres (ECD1-3) y el cuarto dominio N-cadherina (ECD4) . Se diseñaron las dos detecciones selectivas correspondientes en un esfuerzo por generar reactivos capaces de influir sobre el fenotipo de adhesión y migración de esta molécula así como para generar reactivos para apuntar a las células que expresan N-cadherina. Los clones de fago individuales tomados de la cuarta corrida de paneo fueron caracterizados mediante ELISA y citometría de flujo. Los ligantes específicos fueron secuenciados , y algunos de los clones seleccionados fueron reformateados en forma de pequeños fragmentos de anticuerpo bivalentes (diacuerpos) . Los diacuerpos muestran una ligación específica con respecto a las células que expresan N-cadherina.

[0034] Los fragmentos anti-N-cadherina, descritos en la presente, son el bloque constructivo o ladrillo básico sobre el cual es posible fabricar anticuerpos humanos enteros o anticuerpos diseñados de diversos tamaños y formas, siendo el atributo primario de ellos su capacidad de ligarse específicamente a la proteína N-cadherina. Estos anticuerpos pueden utilizarse para el tratamiento o diagnóstico de cáncer de próstata, vejiga u otros cánceres que expresan la proteína N-cadherina. Es importante destacar que la expresión de la N-cadherina en el tumor puede ser por las células como tales o mediante cualquiera de los estromas rodeantes (músculos, fibroblastos, vasos sanguíneos, etc.). Hemos mostrado previamente que la N-cadherina es un importante determinante biológico de la invasión, desarrollo, metástasis y progresión de los cánceres de próstata, de vejiga y otros, y que es un agente terapéutico crítico para el diagnóstico, pronóstico y terapia. Los anticuerpos monoclonales murinos contra la N-cadherina tienen la capacidad de bloquear el desarrollo de los tumores, su metástasis, invasión y progresión hacia la independencia con respecto a las hormonas andrógenas en los modelos animales de cáncer. El descubrimiento de scFV humanos que pueden reformatearse fácilmente en anticuerpos enteros o diseñados provee la capacidad de apuntar a cánceres sin incitar una inmunorrespuesta contra los anticuerpos .

[0035] De acuerdo con nuestro conocimiento, estamos describiendo los primeros fragmentos de anticuerpos contra N-cadherina derivados con la finalidad de diagnóstico y tratamiento de cáncer de próstata y de otros cánceres. La invención se basa en la técnica anterior desarrollada por nuestro grupo que implica la N-cadherina en la progresión del cáncer de próstata y de vejiga, y de otros cánceres, así como el concepto de apuntar a la misma con fines terapéuticos. La visualización de los fagos describe una técnica bien establecida para la aislación de fragmentos de anticuerpos. La biblioteca de fagos no inmunes utilizada en la presente ha sido desarrollada por el Dr. JD Marks en UC. San Francisco .

[0036] La invención describe la aislación y caracterización de fragmentos monocatenarios que reconocen la N-cadherina. Los mismos pueden utilizarse como fragmentos monocatenarios o reformatearse en forma de fragmentos más grandes, tales como IgG entero, que pueden utilizarse para el diagnóstico o tratamiento de cánceres .

[0037] Como se mencionó, la invención describe una cantidad de fragmentos candidato con una posible utilidad para diagnóstico y terapia que pueden ser reformateados en forma de constructos más grandes y utilizarse para reconocer N-cadherina en cáncer de próstata y otros cánceres. Estos anticuerpos pueden utilizarse tal cual (anticuerpos desnudos) o pueden ser conjugados a radioisótopos, nanopartículas, liposomas, virus o cualquier otra "carga útil" para su entrega a tumores para fines de terapia, formación de imágenes u otra finalidad. Pueden utilizarse los fragmentos para incrementar el carácter específico de cualquier modalidad de formación de imágenes para tumores que expresan N-cadherina .

[0038] Hasta donde sabemos, somos los primeros en demostrar que los anticuerpos contra N-cadherina tienen una actividad terapéutica, superior a la de cualquier otro medio conocido para apuntar a tales tumores. La ventaja de la invención es que los fragmentos de anticuerpo son inmunógenos y humanos y pueden utilizarse en pacientes sin una modificación adicional. Por otra parte, los fragmentos que reconocen N-cadherina tienen la ventaja de su flexibilidad, ya que es fácil diseñarlos para prácticamente cualquier finalidad.

Definiciones

[0039] Las expresiones "N-cadherina" y "E-cadherina" se refieren a ácidos nucleicos, por ejemplo genes, pre-mAKN, mARN, y polipéptidos, variantes polimorfas, alelos, mutantes, e homólogos interespecies que: (1) tienen una identidad de secuencia de aminoácidos superior a aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferentemente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o mayor, preferentemente sobre una región de por lo menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000, o más aminoácidos, con respecto a un polipéptido codificado por un ácido nucleico respectivamente referenciado o de una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 7, 8, y 9, respectivamente; (2) se ligan específicamente a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos policlonales, preparados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de referencia como se ilustra en las Figuras 7, 8, y 9, respectivamente; fragmentos inmunogenos respectivamente de ellos; y variantes modificados de manera conservadora, de ellos; (3) se hibridan específicamente bajo condiciones de hibridación a un secuencia de aminoácidos de referencia como se ilustra en las Figuras 7, 8, y 9/ respectivamente, y variantes modificadas de manera conservadora, de ellos; (4) tienen una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencias de nucleótidos superior a aproximadamente 95%, preferentemente superior a aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o superior, preferentemente sobre una región de por lo menos aproximadamente 25, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1.000, o más nucleótidos, con respecto a una secuencia de ácido nucleico de referencia mostrada, respectivamente, en las Figuras 7, 8, y 9. Una secuencia de polinucleótido o polipéptido proviene típicamente de un mamífero que incluye a titulo no limitativo, los primates, por ejemplo, un ser humano; un roedor, por ejemplo, rata, ratón, hámster; vaca, cerdo, caballo, oveja o cualquier mamífero. Los ácidos nucleicos y las proteínas de la invención incluyen tanto moléculas de presentación natural como recombinante .

[0040] El término "cáncer" se refiere a cánceres y carcinomas, adenocarcinomas , linfornas, leucemias, etc., humanos; lo que incluye tumores sólidos y cánceres linfoides, cáncer de riñon, pecho, pulmón, riñon, vejiga, colon, de ovario, de próstata, páncreas, de estómago, de cerebro, cabeza y cuello, piel, de útero, testicular, de esófago e hígado, linforna, lo que incluye linforna de Hodgkin y linforna que no es de Hodgkin, y mieloma múltiple. La expresión "cáncer urogenital" se refiere a los cánceres humanos del tracto urinario y de los tejidos genitales, lo que incluye pero no a título de limitación los tejidos renales, de la vejiga, tracto urinario, uretra, próstata, pene, testículos, de vulva, vagina, cuello de útero y de ovario.

[0041] El cáncer a ser tratado en la presente puede ser uno caracterizado por una excesiva activación de N-cadherina. Como alternativa, el cáncer a ser tratado en la presente puede ser uno en el que la proteína N-cadherina se expresa con niveles normales o bajos, o uno en el que la proteína N-cadherina está expresada por un subconjunto de células, y donde la proteína N-cadherina no está sobreexpresada . En una forma de realización de la invención, se llevará a cabo un ensayo de diagnóstico o de pronóstico para determinar si el cáncer del paciente se caracteriza por la expresión de N-cadherina. Se consideran diversos ensayos para determinar dicha amplificación/expresión, y los mismos incluyen ensayos de inmunohistoquímica, FISH y antlgeno de shed, southern blotting, o técnicas de PCDR. Por otra parte, la expresión o amplificación de la N-cadherina puede ser evaluada mediante un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo mediante la administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que se liga a la molécula a ser detectada y que est rotulada con una etiqueta detectable (por ejemplo un radioisótopo radioactivo) y escaneando externamente el paciente para localizar la etiqueta. En algunas formas de realización, el cáncer a ser tratado no es todavía invasivo, pero expresa N-cadherina.

[0042] Las expresiones cánceres, células tumorales, y tumores "resistentes a la terapia" se refieren a cánceres que se han hecho resistentes o refractarios a cualquiera o a ambos de los siguientes tipos de terapia: terapias de cáncer mediadas por apóptosis (por ejemplo, mediante la señalización de células receptoras muertas, por ejemplo, el receptor de ligando Fas, receptores TRAIL, TNF-R1, drogas quimioterapéuticas, radiación) y terapias de cáncer no mediadas por apóptosis (por ejemplo, fármacos tóxicos, productos químicos) , lo que incluye quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia, e inmunoterapia .

[0043] La expresión "sobreexpresión" se refiere a una expresión de ARN o de proteína de N-cadherina, LY6-E, y de E-cadherina en una muestra de tejido de prueba que es significativamente más elevada que la expresión de ARN o de proteína de N-cadherina, LY6-E, y E~ cadherina, respectivamente, en una muestra de tejido de control. En una forma de realización, la muestra de tejido es autóloga. Las muestras de tejido de prueba canceroso (por ejemplo, vejiga, próstata) asociadas con el grado de invasión, metástasis independiente con respecto a las hormonas (por ejemplo independiente con respecto a las hormonas andrógenas) o el grado refractario frente a un tratamiento o con una mayor probabilidad ser llegar a ser refractario, típicamente tienen una expresión de proteína N-cadherina o LY6-E que es por lo menos el doble, frecuentemente una expresión de N-cadherina o de LY6-E de hasta tres, cuatro, cinco, ocho o diez veces, en comparación con tejidos de cáncer tomados de pacientes que tienen una menor probabilidad de evolucionar hacia una metástasis o con respecto a muestras de tejido normales (es decir, que no tienen cáncer) . Tales diferencias pueden ser fácilmente evidentes cuando se examinan las bandas de geles con una carga aproximadamente igual de muestras de prueba y muestras de control . Los cánceres de próstata que expresen cantidades incrementadas de N-cadherina o de Ly6-E tienen más probabilidades de llegar a ser invasivas, formar metástasis o de evolucionar en formas de cáncer independientes de las hormonas andrógenas o refractarias al tratamiento. Hay varios cortes pertinentes para el carácter positivo frente a N-cadherina o Ly6-E, ya que es posible que un pequeño porcentaje de células positivas frente a N-cadherina o Ly6-E en tumores primarios permitan identificar tumores con un elevado riesgo de recurrencia y metástasis. Los términos "sobreexpresa" , "sobreexpresión" o "sobreexpresado" se refieren de manera intercambiable a un gen que se transcribe o traduce en un nivel detectablemente más elevado, usualmente en una célula de cáncer, en comparación con una célula normal. Por ello la sobreexpresión se refiere tanto a la sobreexpresión de proteína como de AR (debido a la transcripción incrementada, procesamiento transcripcional , traducción, procesamiento post traducción, estabilidad alterada, y degradación de la proteína alterada) , así como la sobreexpresión local debida a los patrones alterados del tráfico de proteínas (mayor localización nuclear) , y una mayor actividad funcional, por ejemplo, como en una hidrólisis enzimática incrementada del substrato. La sobreexpresión también puede ser del 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con una célula normal o con una célula de comparación (por ejemplo, una célula de BPH) .

[0044] Las expresiones "cáncer que expresa N-cadherina" y "cáncer asociado con la expresión de N-cadherina" se refieren de manera intercambiable a células o tejidos de cáncer que expresan N-cadherina de acuerdo con la precedente definición.

[0045] Las expresiones "antígeno asociado a cáncer" o "marcador especifico para tumor" se refieren de manera intercambiable a una molécula (típicamente una proteína, carbohidrato de lípido) que se expresa de manera preferente en una célula de cáncer en lugar de en una célula normal, y que es útil para el apuntamiento preferencial de un agente farmacológico a la célula de cáncer. Es posible expresar un marcador o antígeno sobre la superficie de la célula o dentro de la célula. Frecuentemente un antígeno asociado a cáncer es una molécula que se expresa o estabiliza con una degradación mínima en una célula de cáncer en comparación con una célula normal, por ejemplo, una expresión del doble, una expresión del triple o más en comparación con una célula normal . Frecuentemente un antígeno asociado a cáncer es una molécula que está inadecuadamente sintetizada en una célula de cáncer, por ejemplo, una molécula que contiene supresiones, adiciones o mutaciones si se compara con la molécula expresada sobre una célula normal . Frecuentemente un antígeno asociado a cáncer se expresará exclusivamente en una célula de cáncer y no se sintetizará ni expresará en una célula normal. Los ejemplos de marcadores de tumores de superficie celular incluyen las proteínas c-erbB-2 y el factor del receptor del desarrollo epidérmico humano (HER, human epidermal growth factor receptor) para el cáncer de mama, PSMA para el cáncer de próstata, y los carbohidratos mucina en numerosos cánceres, lo que incluye cáncer de mama, de ovario y colorrectal . Los ejemplos de marcadores intracelulares incluyen, por ejemplo, proteínas supresoras de tumor mutadas, o proteínas de los ciclos de las células, lo que incluye p53.

[0046] A la inversa, típicamente la E-cadherina se subexpresa en muestras de tejidos cancerosos en muestras de tejidos tomados de pacientes de cáncer de los cuales es probable que se hagan invasivos, hagan metástasis o evolucionen en forma de un cáncer independiente a los andrógenos o refractarios al tratamiento. Esta subexpresión puede ser del doble, del triple, del cuádruplo, o de por lo menos el quíntuplo. Tales diferencias pueden ser fácilmente evidentes cuando se observan las bandas de geles con cargas aproximadamente iguales de muestras de prueba y de control. Los valores combinados de N-cadherina/E-cadherina en cánceres de los que es probable que se harán invasivos, formen metástasis o evolucionen en forma de un cáncer independiente de las hormonas andrógenas o refractarios al tratamiento, son por ello aun más grandes y pueden ser de por lo menos el doble, triple, cuádruple, décuplo o de veinte veces más grandes. Hay varios cortes pertinentes para el carácter positivo de la N-cadherina /carácter negativo de la E-cadherina, por cuanto es posible que un pequeño porcentaje de células positivas a la N- cadherina en los tumores primarios permitan identificar tumores con un elevado riesgo de recurrencia y metástasis.

[0047] La expresión "agonista" se refiere a un agente que se liga a un polipéptido o polinucleótido de la invención, estimula, incrementa, activa, facilita, refuerza la activación, sensibiliza o regula ascendentemente la actividad o expresión de un polipéptido o polinucleótido de la invención.

[0048] La expresión "un antagonista" se refiere a un agente que inhibe la expresión de un polipéptido o polinucleótido de la invención o que se liga a, bloquea total o parcialmente la estimulación, disminuye, impide, retarda la activación, desactiva, desensibiliza, o regula descendentemente la actividad de un polipéptido o polinucleótido de la invención.

[0049] Las expresiones "activadoras" y "moduladoras" de la expresión o de la actividad se utilizan para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras, o moduladoras, que se identifican mediante ensayos in vitro e in vivo para establecer la expresión o actividad, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas, y sus homólogos y miméticos. El término "modulador" incluye inhibidores y activadores . Los inhibidores son agentes que, por ejemplo, inhiben la expresión de un polipéptido o de un polinucleótido de la invención o que se ligan a, bloquean parcialmente o totalmente la estimulación de bloque o la actividad enzimática, o que se ligan o bloquean parcialmente o totalmente la estimulación de bloque o la actividad enzimática, disminuyen, previenen, retardan la activación, desactivan, desensibilizan o regulan descendentemente la actividad de un polipéptido o polinucleótido de la invención, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son agentes que, por ejemplo, inducen o activan la expresión de un polipéptido o polinucleótido de la invención o que se ligan, estimulan, incrementan, abren, activan, facilitan, refuerzan la activación o la actividad enzimática, sensibilizan o regulan ascendentemente la actividad de un polipéptido o polinucleótido de la invención, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen ligandos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas y similares, de presentación natural o sintéticos . Los ensayos para identificar inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, la aplicación de potenciales compuestos moduladores a células, en la presencia de o ausencia de un polipéptido o polinucleótido de la invención y seguidamente se determinan los efectos funcionales sobre la actividad de un polipéptido o polinucleótido de la invención. Las muestras o ensayos que comprenden un polipéptido o polinucleótido de la invención que son tratados con un activador, inhibidor, o modulador, potenciales, se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador, o modulador para observar la amplitud del efecto . A las muestras de control (no tratadas con 4 moduladores) se les asigna un valor de actividad relativa del 100%. Se lleva a cabo la inhibición cuando el valor de la actividad de un polipéptido o polinucleótido de la invención con respecto al control es de aproximadamente el 80%, opcionalmente 50% o 25-1%. Se logra la activación cuando el valor de la actividad de un polipéptido o polinucleótido de la invención con respecto al control es del 110%, opcionalmente 150%, opcionalmente 200-500%, o 1.000-3.000% superior.

[0050] Las expresiones "compuestos de prueba" o "candidato a fármaco" o "modulador" o sus equivalentes gramaticales, tal como se utilizan en la presente describen cualquier molécula, de presentación natural o sintética, por ejemplo, proteína, oligopéptido (por ejemplo, con una longitud de aproximadamente 5 aproximadamente 25 aminoácidos, preferentemente con una longitud de aproximadamente 10 a 20 o de 12 a 18 aminoácidos, preferentemente con una longitud de 12, 15, o 18 aminoácidos), pequeñas moléculas orgánicas, polisacáridos , lípidos, ácidos grasos, polinucleótidos , A i, siARN, anticuerpo, oligonucleótido, etc. Los compuestos de prueba pueden estar en forma de una biblioteca de compuestos de prueba, tal como una biblioteca combinatoria o aleatorizada que provea un suficiente intervalo de diversidad. Los compuestos de prueba están opcionalmente ligados a un compañero de fusión, por ejemplo, compuestos de apuntamiento, compuestos de rescate, compuestos de dimerización, compuestos estabilizadores, compuestos dirigibles, y otras partes funcionales. De manera convencional, las nuevas entidades químicas con propiedades útiles se generan mediante la identificación de un compuesto de prueba (denominado "compuesto de guía") con alguna propiedad o actividad deseables, por ejemplo, una actividad inhibidora, creándose variantes del compuesto de guía, y evaluándose la propiedad o actividad de dichos compuestos variantes. Es frecuente que para un análisis de este tipo se utilicen métodos HTS (high throughput screening, detección selectiva de elevado paso) .

[0051] La expresión "pequeña molécula orgánica" se refiere a una molécula orgánica, de presentación natural o sintética, que tiene un peso molecular de más de aproximadamente 50 Daltons y de menos de aproximadamente 2.500 Daltons, preferentemente, inferior a aproximadamente 2.000, preferentemente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1.000 Daltons, más preferentemente entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500 Daltons.

[0052] Los agentes citotóxicos incluyen fármacos "específicos para el ciclo de las células" o "antimitóticos" o de "interacción citoesquelética" . Estos términos se refieren de manera intercambiable a cualquier agente farmacológico que bloquee las células en mitosis. Tales agentes son útiles en quimioterapia. En términos generales, los fármacos específicos para el ciclo de las células se ligan a la proteína tubulina citoesquelética y bloquean la capacidad de la tubulina de polimerizarse en forma de microtúbulos , con el resultado de la detención de la división de las células en metafase. Los ejemplos de fármacos relacionados con el ciclo de las células incluyen los alcaloides vinca, taxanos, colchicina, y podofilotoxina. Los ejemplos de vinca alcaloides incluyen la vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina. Los ejemplos de taxanos incluyen paclitaxel y docetaxel . Otro ejemplo de fármaco de interacción citoesquelética es 2-metoxiestradiol .

[0053] Las expresiones "siARN" o "ARNi" se refieren a un ácido nucleico que forma un AR de doble filamento, cuyo ARN de doble filamento tiene la capacidad de reducir o inhibir la expresión de un gen o gen apuntado cuando el siARN expresado en la misma célula como el gen o gen apuntado. Por lo tanto, las expresiones "siARN" o "ARNi" se refieren al ARN de doble filamento formado por los filamentos complementarios . Las porciones complementarias del siARN que se hibridan de manera de formar la molécula de doble filamento tienen una identidad sustancial o completa. En una forma de realización, un siARN se refiere a un ácido nucleico que tiene una identidad sustancial o completa con un gen apuntado y forma un siARN de doble filamento. Típicamente, el siARN tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 15-50 nucleótidos (por ejemplo, cada secuencia complementaria del siARN de doble filamento tiene una longitud de aproximadamente 15-50 nucleótidos, y la longitud del sIR A de doble filamento es de aproximadamente 15-50 pares de base, preferentemente de aproximadamente 20-30 nucleótidos de base, preferentemente aproximadamente 20-25 o de aproximadamente 24-29 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos de longitud.

[0054] El diseño y la preparación de moléculas y vectores de siARN son bien conocidos de la persona con pericia en la especialidad. Por ejemplo, un proceso eficiente para diseñar un siARN adecuado consiste en empezar en el codón de inicio AUG del transcripto de mARN (por ejemplo, véase la Figura 5) y escanear en busca de secuencias de dinucleótidos de AA (Véase, Elbashir et al. EMBO J 20: 6877-6888 (2001). Cada AA y los nucleótidos 3' adyacentes son sitios potenciales de objetivos siARN. La longitud de la secuencia de sitio adyacente determinará la longitud del siARN. Por ejemplo, 19 sitios adyacentes darían un siARN de 21 nucleótidos de longitud. Los siARNs con 3' que sobrevuela dinucleótidos UU son frecuentemente los más efectivos. Este enfoque es también compatible con el uso de ARN pol III para transcribir siARNs de hebilla. El ARN pol III termina la transcripción en los tractos poli (T) de 4 nucleótidos de manera de crear moléculas de AR que tienen un corta cola poli (U) . Sin embargo, los siARNs con otros sobrevuelos de dinucleótidos 3 ' terminales también pueden inducir de manera efectiva los ARNi, y es posible seleccionar la secuencia empíricamente. Para la selectividad, es posible evitar secuencias objetivo con más de 16 - 17 pares de bases contiguas de homología con respecto a otras secuencias codificadoras, para lo cual se lleva a cabo una búsqueda con BLAST (Véase, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

[0055] El siARN puede administrarse directamente, o es posible utilizar vectores de expresión siAR para inducir con dichos criterios de diseño. Un vector puede tener dos repeticiones invertidos separados por una corta secuencia separadora que terminan con un filamento de T que sirven para terminar la transcripción. Se predice que el transcripto de ARN expresado se plegará en un siARN de hebilla corta. La selección de la secuencia objetivo de siARN, la longitud de las repeticiones invertidas que codifican el vástago de una hebilla potencial, el orden de las repeticiones invertidas, la longitud y composición de la secuencia separadora que codifica el bucle de la hebilla, y la presencia o ausencia de los sobrevuelos 5', pueden variar. Un orden preferido para el cásete de expresión de siARN es : filamento de sentido, separador corto, y filamento antisentido.

Los siAR s de hebilla con varias longitudes de vastago (por ejemplo, de 15 a 30) pueden ser adecuados. La longitud de los filamentos de sentido y antisentido que ligan los bucles del siAR de hebilla pueden tener variadas longitudes (por ejemplo, de 3 a 9 nucleótidos, o más largos) . Los vectores pueden contener promotores y reforzadores de expresión u otros elementos reguladores que están operablemente ligados a la secuencia de nucleótidos que codifican el siARN. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ARN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora operablemente ligada en un organismo hospedante particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de ligación ribosoma. Es sabido que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y reforzadores. Estos elementos de control pueden estar diseñados para permitir que el médico clínico active o desactive la expresión del gen mediante la adición o control de factores externos a los cuales responden los elementos reguladores.

[0056] Para la construcción de vectores adecuados que contienen el agente terapéutico deseado y las secuencias de control se emplean técnicas de ligación de restricción estándar bien conocidos de la persona con pericia en la especialidad. (Véase Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)). Los plásmidos, secuencias de DNA, o oligonucleótidos sintetizados, aislados, son desdoblados, ajustados a medida, y vueltos a enlazar en la forma deseada.

[0057] El ácido nucleico está "operablemente ligado" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA para una presecuencia o líder secretorio está operablemente ligado a DNA para un polipéptido si está expresado como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido: un promotor o reforzador está operablemente ligado a una secuencia de codificación si influye sobre la transcripción de la secuencia; o un sitio de ligación ribosoma está operablemente ligado a una secuencia de codificación si está posicionado de manera de facilitar la traducción. En términos generales, "operablemente ligado" significa que las secuencias de ADN que se están ligando están cercanas entre sí, y, en el caso de un líder secretorio, contiguos y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los reforzadores sean contiguos entre sí. La ligación se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción adecuados. Si tales sitios no existen, se utilizan los adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos, de acuerdo con la práctica convencional .

[0058] La expresión "determinación del efecto funcional" se refiere al hecho de someter a ensayo un compuesto que incrementa o disminuye un parámetro que se halla indirecta o directamente bajo la influencia de un polinucleótido de la invención, por ejemplo, la medición de efectos físicos y químicos o fenotípicos. Tales efectos funcionales pueden medirse mediante cualquier medio conocido de la persona con pericia en la especialidad, por ejemplo, mediante cambios en las propiedades espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorción, índice de refracción) , hidrodinámicos (por ejemplo, la forma), cromatográficas o de solubilidad de la proteína; la medición de marcadores inducibles o la activación transcripcional de la proteína; la medición de la actividad de ligación o de los ensayos de ligación, por ejemplo la ligación a los anticuerpos; la medición de cambios en la afinidad de la ligación del ligando; la medición del flujo de calcio ingresante; la medición de la acumulación de un producto enzimática de un polipeptido de la invención o el agotamiento de un substrato; cambios en la actividad enzimática, por ejemplo, la actividad de quinasa, la medición de cambios en los niveles de las proteínas de un polipeptido de la invención; la medición de una estabilidad de ARN; la ligación de la proteína G; la fosforilación o desfosforilación de GPCR; la transducción de señales, por ejemplo, las interacciones entre receptor y ligando; las concentraciones del segundo mensajero (por ejemplo, cAMP, IP3, o Ca2+ intracelular) ; la identificación de la expresión de genes corriente abajo o de genes informantes (CAT, luciferasa, ß-gal, GFP y similares), por ejemplo, mediante guimioluminiscencia, fluorescencia, reacciones colorimétricas , ligación de anticuerpos, marcadores inducibles, y ensayos de ligación de ligandos .

[0059] Las muestras o ensayos que comprenden un ácido nucleico o proteína revelados en la presente que son tratados con un activador, inhibidor, o modulador potenciales, son comparados con muestras de control sin el inhibidor, activador, o modulador a efectos de examinar la amplitud de la inhibición. A las muestras de control (no tratadas con inhibidores) se les asigna un valor de actividad relativa de proteína del 100%. La inhibición ha sido realizada cuando el valor relativo de la actividad con respecto al control es de aproximadamente 80%, preferentemente 50%, más preferentemente 25-0%. La activación se ha logrado cuando el valor relativo de la actividad con respecto al control (que no ha sido tratado con activadores) es de 110%, más preferentemente 150%, más preferentemente 200-500% (por ejemplo, con un valor que es del doble o quíntuplo del valor del control) , más preferentemente superior en 1.000-3.000%.

[0060] La expresión "muestra biológica" incluye secciones de tejidos tales como muestras de biopsia y autopsia, y secciones congeladas tomadas para estudios histológicos. Tales muestras incluyen sangre y fracciones o productos de sangre (por ejemplo, suero, plasma, plaquetas, células rojas de la sangre, y similares) , esputos, tejidos, células cultivadas, por ejemplo, cultivos primarios, explantes, y células transformadas, heces, orina, etc. Típicamente se obtiene una muestra biológica a partir de un microorganismo eucariota, más preferentemente un mamífero tal como un primate por ejemplo, chimpancé o ser humano; vaca; perro; gato; un roedor, por ejemplo, cobayo, rata, ratón, conejo; o un ave, reptil o pez.

[0061] El término "biopsia" se refiere al proceso de remover un tejido para su evaluación para diagnóstico o pronóstico; y al espécimen de tej ido como tal . En los métodos de diagnóstico y de pronóstico de la presente invención puede emplearse cualquier técnica de biopsia. La técnica de biopsia utilizada dependerá del tipo de tejido a ser evaluado (es decir, próstata, nodulo linfático, hígado, célula sanguínea) , el tamaño y tipo del tumor (es decir, tumor sólido o en suspensión (es decir, sangre o ascitis) ) , entre otros factores. Las técnicas representativas de biopsia abarcan biopsia de escisión, biopsia de aguja, biopsia quirúrgica, y biopsia de médula ósea. Una "biopsia de escisión" se refiere a la remoción de una masa tumoral entera con un pequeño margen de tejido normal que lo rodea. Una "biopsia de incisión" se refiere a la remoción de una cuña de tejido que incluye un diámetro en sección transversal del tumor. Se si efectúa un diagnóstico o pronóstico mediante endoscopía o fluoroscopia puede requerirse una "biopsia de núcleo-agu a" de la masa tumoral, o una "biopsia de aspiración por aguja fina" que en términos generales permite obtener una suspensión de células de dentro de la masa tumoral. Las técnicas de biopsia se exponen por ejemplo en Harrison's Principies of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed. , 2005, Chapter 70, y a lo largo de la Parte V.

[0062] Las expresiones "idéntico" o "identidad porcentual" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de radicales aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, con una identidad de aproximadamente el 60%, preferentemente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o una identidad superior sobre una región determinada, en comparación y alineado de manera de obtener una máxima correspondencia en una ventana de comparación o región designadas, medida mediante algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros por defecto descritos en lo que sigue o mediante alineación manual e inspección visual (Véase, por ejemplo, NCBI web site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ o similares). En este caso se dice que tales secuencias son "sustancialmente idénticas" . Esta definición también se refiere a, o puede aplicarse a, al complemento de una secuencia de prueba. La definición también incluye secuencias que tienen supresiones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones . Como se describe en lo que sigue, los algoritmos preferidos pueden tener en cuenta los huelgos y similares. Es preferible que la identidad exista sobre una región que tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos, o más preferentemente sobre una región que tiene una longitud de 50-100 aminoácidos o nucleótidos .

[0063] Para la comparación de las secuencias, típicamente una de las secuencias actúa como una secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utilice un algoritmo para la comparación de secuencias, se ingresan las secuencias de prueba y de referencia en un computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, en caso de ser necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo para las secuencias. Es preferible que puedan utilizarse parámetros de programa por defecto, o que pueden designarse parámetros alternativos. Seguidamente el algoritmo de comparación calcula las identidades porcentuales de las secuencias para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, sobre la base de los parámetros del programa.

[0064] La expresión "ventana de comparación", tal como se la utiliza en la presente, incluye referencias a un segmento de una cualquiera de entre la pluralidad de posiciones contiguas seleccionadas entre el grupo consistente en de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en la cual es posible comparar una secuencia con una secuencia de referencia con la misma cantidad de posiciones contiguas después de haberse alineado de manera óptima las dos secuencias. Los métodos para la alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos de la persona con pericia en la especialidad. La alineación óptima de secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol . 48:443 (1970), mediante el método de la búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Scí. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) , o mediante alineación manual e inspección visual (Véase, por ejemplo, Current Protocole in Molecular Biology (Ausubel et al., eds . 1995 suplemento)).

[0065] Ejemplos preferidos de algoritmo que son adecuados para determinar la identidad ' orcentual de las secuencias y la similitud entre las secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, descritos en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. El BLAST y el BLAST 2.0 se utilizan, con los parámetros descritos en la presente, para determinar la identidad porcentual de las secuencias y para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para llevar a cabo los análisis por BLAST está disponible públicamente por intermedio del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica empezar por identificar HSPs (high scoring sequence pairs, pares de secuencias de elevado puntaje) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que sea concuerden con satisfagan algún puntaje T de umbral de valor positivo cuando están alineadas con una palabra de la misma longitud en la secuencia de base de datos . Por definición T es el umbral de puntaje de palabras de vecindad (Altschul et al., supra) . Estas coincidencias de palabras de vecindad inicial 8 actúan como semillas para iniciar búsquedas destinadas a encontrar HSPs más largos que los contengan. Las concordancias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras sea posible incrementar el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos se calculan mediante la utilización, para las secuencias de nucleótidos, de los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos concordantes; siempre > 0) y N (puntaje de penalización para residuos no concordantes; siempre < 0) . Para las secuencias de aminoácidos se utiliza una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detienen cuando: decae el puntaje de alineación acumulativo por la cantidad X a partir de su máximo valor logrado; el puntaje acumulativo pasa a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo; o se ha llegado al extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como defectos una longitud de palabra (W) igual a 11, una expectativa (E) igual a 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambos filamentos. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como defectos una longitud de palabra igual a 3 , y una expectativa (E) igual a 10, y la matriz de puntaje BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) iguales a 50, expectativa (E) igual a 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambos filamentos.

[0066] La expresión "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleotidos y polímeros de ellos en forma de un solo filamento o de dos filamentos, y a complementos de ellos. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos o enlaces de nucleotidos, o residuos medulares análogos o modificados que son sintéticos, de presentación natural, y de presentación no natural, que tienen propiedades de ligación similares a las del ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de una manera similar a la de los nucleotidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos , metil fosfonatos, quiral-metil fosfonatos, 2-0-metil ribonucleotidos, péptido-ácidos nucleicos (PNAs) .

[0067] A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico en particular también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservadora, de ellos (por ejemplo, sustituciones degeneradas de codones) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, es posible lograr sustituciones degeneradas de codones mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o la totalidad de ellos) está sustituida por radicales de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Ácido nucleico Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)) . La expresión ácido nucleico se utiliza de manera intercambiable con gen, cADN, mARN, oligonucleótido y polinucleótido .

[0068] Una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente "variantes de empalme" . De manera similar, una proteína particular codificada por un ácido nucleico abarca implícitamente cualquier proteína codificada por una variante de empalme de dicho ácido nucleico . Las "variantes de empalme" , como sugiere el nombre, son productos de empalme alternativo de un gen. Después de la transcripción, es posible desempalmar un transcripto de ácido nucleico inicial de manera tal que diferentes (alternados) productos de empalme de ácido nucleico codifiquen diferentes polipéptidos. Los mecanismos para la producción de las variantes de empalme varían, pero incluyen el empalmado alternado de exones . La presente definición también abarca polipéptidos alternados derivados del mismo acido nucleico mediante transcripción de lectura pasante. En esta definición también se incluyen productos de una reacción de empalme, lo que incluye formas recombinantes de los productos de empalme. Un ejemplo de variantes de empalme de canales de potasio se expone en Leicher, et al., J. Biol. Chem. 273 (52) :35095-35101 (1998).

[0069] En la presente, las expresiones "polipéptido, "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable para referirse a un polímero de radicales aminoácidos. Las expresiones rigen para polímeros de aminoácidos en los que uno o más radicales aminoácidos son un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido de presentación natural, así como para polímeros de aminoácidos que se presentan en la naturaleza y polímeros de aminoácidos de presentación natural.

[0070] La expresión "aminoácido" se refiere a aminoácidos de presentación natural y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a las de los aminoácidos que se presentan naturalmente. Los aminoácidos que se presentan naturalmente son aquellos codificados por el código genético, tales como aquellos aminoácidos que se modifican ulteriormente, por ejemplo hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y 0-fosfoserina . La expresión "análogos de aminoácidos" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de presentación natural, es decir, un carbono a que está ligado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o médulas de péptido modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de presentación natural . La expresión "miméticos de aminoácidos" se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a la de un aminoácido de presentación natural .

[0071] En la presente, los aminoácidos pueden designarse sea mediante sus símbolos de tres letras, comúnmente conocidos, o mediante los símbolos de una sola letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. De manera similar, los nucleótidos pueden designarse mediante sus códigos comúnmente aceptados de una sola letra.

[0072] La expresión "variantes modificadas de manera conservadora" rige tanto para secuencias de aminoácidos como para secuencias de ácidos nucleicos . Con respecto a secuencias particulares de ácidos nucleicos, la expresión "variantes modificadas de manera conservadora" se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina está especificada por un codón, es posible alterar el codón en forma de cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas" , que son una especie de variaciones modificadas de manera conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifique un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Una persona con pericia en la especialidad reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es habitualmente el único codón para metionina y TGG, que es habitualmente el único codón para triptofano) puede ser modificado de manera de obtener una molécula funcionalmente idéntica. Por lo tanto, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifique un polipéptido se halla implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a las secuencias de sonda reales .

[0073] En cuanto a las secuencias de aminoácidos, una persona con pericia en la especialidad reconocerá que las sustituciones, supresiones o adiciones, individuales, a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína que altere, añada o suprima un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservadora" en la que la alteración tiene como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. En la técnica son bien conocidas tablas de sustitución conservadoras que proveen aminoácidos funcionalmente similares. Además, tales variantes modificadas de manera conservadora no excluyen variantes polimorfas, homólogos interespecie, y alelos de la invención.

[0074] Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) alanina (A), glicina (G) ; 2) ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) ; 3) asparagina (N) , glutamina (Q) ; 4) arginina ( ) , lisina (K) ; 5) isoleucina (I) , leucina (L) , metionina (M) , valina (V) ; 6) fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) ; 7) serina (S) , treonina (T) ; y 8) cisteína (C) , metionina (M) (Véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

[0075] Una "etiqueta" o "parte detectable" es una composición que es detectable mediante medios espectroscopicos, fotoquímicos, bioquímicas, u otros medios físicos. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se utilizan comúnmente en ELISA) , biotina, digoxigenina, o haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, mediante la incorporación de una radioetiqueta en el péptido utilizado para detectar los anticuerpos que de manera específica reaccionan con el péptido.

[0076] La expresión "recombinante" cuando se la utiliza, por ejemplo con referencia a una célula, o anticuerpo, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogos o mediante la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos, o que la célula ha sido derivada de una célula así modificada. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se hallan dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o que expresan genes nativos que por lo demás se expresan anormalmente, se subexpresan o no se expresan en absoluto.

[0077] La expresión "heterólogo/a" cuando se la utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, típicamente el ácido nucleico se produce de manera recombinante, teniendo dos o mas secuencias de genes no relacionados dispuestos de manera de obtener un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor tomado de una fuente y una región de codificación tomada de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se hallan en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión) .

[0078] La expresión "condiciones de hibridación estrictas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará con su subsecuencia apuntada, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias . Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más elevadas . Puede encontrarse una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic ácid assays" (1993) . En términos generales, se seleccionan las condiciones estrictas de manera que sean de aproximadamente 5-10°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica bajo una intensidad iónica definida pH. El Tm es la temperatura (bajo una intensidad iónica definida, pH, y bajo una concentración nucleica definida) bajo la cual el 50% de las sondas complementarias con respecto al objetivo se hibridan con la secuencia objetivo en equilibrio (dado que las secuencias objetivo se hallan presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Las condiciones estrictas también pueden lograrse mediante la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es de por lo menos dos veces el segundo plano, preferentemente una hibridación de 10 veces el segundo plano. Ejemplos de condiciones de hibridación estrictas pueden ser las siguientes: 50% de formamida, 5x SSC, y SDS al 1%, incubación a 42°C, o, 5x SSC, SDS al 1%, incubación a 65°C, con lavado en 0,2 x SSC, y SDS al 0,1 % a 65°C.

[0079] Los ácidos nucleicos que no se hibridan bajo condiciones estrictas siguen siendo sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando el codón de degeneración máxima permitido por el código genético. En tales casos, típicamente los ácidos nucleicos hibridan bajo condiciones de hibridación moderadamente estrictas. Las "condiciones de hibridación moderadamente estrictas" incluyen una hibridación en una solución tampón de 40% de formamida, 1 M NaCl , 1% SDS a 37°C, y un lavado en IX SSC a 45°C. Una hibridación positiva es de por lo menos el doble del segundo plano. Una persona con pericia en la especialidad reconocerá fácilmente que es posible utilizar condiciones de hibridación y de lavado alternativas a efectos de proveer condiciones iguales de estrictas. Se proveen directivas adicionales para determinar parámetros de hibridación en numerosas referencias, por ejemplo, en Current Protocole in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., John Wiley & Sons.

[0080] Para el PCR, una temperatura de aproximadamente 36°C es típica para una amplificación poco estricta, si bien las temperaturas para el tratamiento térmico pueden variar entre aproximadamente 32°C y 48°C en función de la longitud del cebador. Para la amplificación por PCR muy estricta, una temperatura de aproximadamente 62°C es típica, si bien las temperaturas de tratamiento térmico muy estrictas pueden variar entre aproximadamente 50°C y aproximadamente 65°C, en función de la longitud del cebador y de su carácter específico. Las condiciones de ciclo típicas tanto para las ampliaciones muy estrictas como poco estrictas incluyen una fase de desnaturalización de 90°C - 95°C durante 30 sec - 2 rain. , una fase de tratamiento térmico que dura 30 sec. - 2 min. , y una fase de extensión de aproximadamente 72°C durante 1 - 2 min. Se proveen protocolos y directivas para la amplificación poco y muy estricta en por ejemplo Innis et al. (1990) PCR Protocole, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.) .

[0081] El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región de armazón tomada de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que de manera específica se ligan a, y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon, y mu, así como la miríada de las regiones variables de inmunoglobulina. Las cadenas livianas se clasifican sea como kappa sea como lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o ypsilón, los que su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, Ig , IgA, IgD e IgE, respectivamente. Típicamente, la región de ligación de antígeno de un anticuerpo será el más crítico en cuanto al carácter específico y de afinidad de la ligación.

[0082] Un ejemplo de unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "liviana" (de aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kD) . El terminal N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos primariamente responsables del reconocimiento del antígeno. Las expresiones "cadena variable liviana" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas cadenas livianas y pesadas, respectivamente.

[0083] Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como una cantidad de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces disulfuro en la región de bisagra de manera de producir el F(ab)'2, que es un dímero de Fab que de por si es una cadena liviana unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse bajo condiciones moderadas para descomponer el enlace disulfuro en la región de bisagra, con lo que se convierte el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de bisagra (Véase Fundamental Immunology (Paul ed. , 3d ed. 1993). Si bien se definen varios fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, una persona con pericia en la especialidad comprenderá que tales fragmentos pueden sintetizarse de novo sea químicamente sea mediante la utilización de tecnología de ADN recombinante . Por lo tanto, la expresión "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente, también incluye fragmentos de anticuerpo sea producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros, sea aquellos sintetizados de novo mediante tecnologías de DNA recombinantes (por ejemplo, Fv de cadena simple) o aquellos identificados mediante bibliotecas de visualización de fagos (Véase, por ejemplo, cCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).

[0084] Para la preparación de anticuerpos adecuados de la invención y para su uso de acuerdo con la invención, es posible utilizar muchas técnicas recombinantes , monoclonales, o policlonales conocidas de la persona con pericia en la especialidad (Véanse, por ejemplo, Kohler & ilstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Colé et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies y Cáncer Terapia, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991) ; Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual L0 (1988) ; y Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice (2d ed. 1986)). Los genes que codifican las cadenas livianas y pesadas de un anticuerpo de interés pueden clonarse a partir de una célula, por ejemplo, los genes que codifican un anticuerpo monoclonal pueden ser clonados a partir de un hibridoma y L5 utilizarse para producir un anticuerpo monoclonal recombinante .

Las bibliotecas de gen que codifican cadenas livianas y pesadas de anticuerpos monoclonales también pueden hacerse a partir de células de hibridoma o de plasma. Las combinaciones aleatorias de los productos de genes de las cadenas livianas y pesadas generan 20 un gran conjunto de anticuerpos con diferentes caracteres antigénicos (Véase, por ejemplo, Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)). Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple o de anticuerpos recombinantes (Patente de los EE.UU. N° 4.946.778, Patente de los EE.UU. M° 4.816.567) pueden adaptarse para producir anticuerpos mediante polipéptidos de esta invención. Asimismo, es posible utilizar ratones transgénicos y otros organismos tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanos (Véanse,, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nros. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); y Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13:65-93 (1995)) . Como alternativa, es posible utilizar la tecnología de visualización de fagos para identificar anticuerpos y fragmentos de Fab heteroméricos que de manera específica se ligan a antígenos seleccionados (Véase, por ejemplo, cCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). También es posible hacer que los anticuerpos sean biespecífieos, es decir, capaces de reconocer dos antígenos diferentes (Véase, por ejemplo, WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); y Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)). Los anticuerpos también pueden ser heteroconjugados , por ejemplo, dos anticuerpos unidos de manera covalente, o inmunotoxinas (Véanse, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 4.676.980, WO 91/00360; WO 92/200373; y EP 03089).

[0085] Los métodos para humanizar o primatizar anticuerpos no humanos son bien conocidos de la persona con pericia en la especialidad. En términos generales, un anticuerpo humanizado tiene uno o más radicales aminoácidos introducidos en él procedentes de una fuente que no es humana. Estos radicales aminoácidos no humanos reciben frecuentemente la denominación de radicales importados, que típicamente están tomados de un dominio variable de importación. La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992)), mediante la sustitución de secuencias CDRs o CRD de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por lo tanto, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de los EE.UU. N.° 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido reemplazado por la correspondiente secuencia tomada de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanizados en los que algunos radicales CDR y eventualmente algunos radicales FR han sido reemplazados por radicales tomados de sitios análogos de anticuerpos de roedor.

[0086] Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que: (a) la región constante, o una porción de la misma, es alterada, reemplazada o intercambiada de manera tal que el sitio de ligación del antígeno (región variable) está ligado a una región constante de una clase diferente o alterada, función y/o especie efectoras, o a una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de desarrollo, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, es alterada, remplazada o intercambiada con una región variable que tiene un carácter específico distinto con respecto al antígeno diferente o alterado. Los anticuerpos preferidos de, y para uso de acuerdo con la invención, incluyen anticuerpos monoclonales humanizados y/o quiméricos.

[0087] En una forma de realización, el anticuerpo está conjugado a una parte "efectora" . La parte efectora puede ser cualquier cantidad de moléculas, lo que incluye partes etiquetantes tales como etiquetas radioactivas o etiquetas fluorescentes, o puede ser una parte terapéutica. En un aspecto el anticuerpo modula la actividad de la proteína. Dichas partes efectoras incluyen, pero no se limitan a, un fármaco anti-tumor, una toxina, un agente radioactivo, una citoquina, un segundo anticuerpo o una enzima. Por otra parte, la invención provee una forma de realización en la que el anticuerpo de la invención está ligado a una enzima que convierte un pro fármaco en un agente citotóxico.

[0088] El inmunoconjugado puede ser utilizado para apuntar la parte efectora hacia una célula positiva frente a la N-cadherina, particularmente células que expresan la N-cadherina o la proteína Ly6. Dichas diferencias pueden ser fácilmente evidentes cuando se examinen las bandas de geles con cargas aproximadamente iguales de muestras de prueba y de control. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina D, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, y glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelador de metales o una enzima.

[0089] En algunas formas de realización, la invención provee anticuerpos a la N-cadherina. Los anticuerpos de N-cadherina pueden ser utilizados sistémicamente para tratar el cáncer (por ejemplo, el cáncer de próstata o el cáncer de vejiga) solo o cuando están conjugados con una parte efectora. Los anticuerpos de N-cadherina conjugados con agentes tóxicos, tales como ricina, asi como también los anticuerpos no conjugados pueden ser agentes terapéuticos útiles naturalmente apuntados a células de cáncer de próstata portadoras de N-cadherina. Tales anticuerpos pueden ser útiles para bloquear el grado de invasión. Los anticuerpos de N-cadherina para uso de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, GC4, 1H7, 1F12, 2B3.

[0090] Adicionalmente, la proteína recombinante de la invención que comprende la región antigeno-ligación de cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invención pueden utilizarse para tratar cáncer. En una situación como ésta, la región antígeno-ligación de la proteína recombinante se une a por lo menos una porción funcionalmente activa de una segunda proteína que tiene una actividad terapéutica. La segunda proteína puede incluir, pero no se limita a, una enzima, linfoquina, oncostatina o toxina. Las toxinas adecuadas incluyen doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina D, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, ricina, abrina, glucocorticoides y radioisótopos .

[0091] Las técnicas para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas (Véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy" , i Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc . 1985); Hellstrom et al . , "Antibodies For Drug Delivery" in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al . (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); y Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody- oxin Conjugates", Inmunol . Rev. , 62:119-58 (1982) ) .

[0092] La expresión "se liga de manera específica (o de manera selectiva) " a un anticuerpo o "es inmunorreactivo de manera específica (o de manera selectiva) con" , cuando se refiera a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de ligación que es determinante de la presencia de la proteína, frecuentemente en una población heterogénea de proteínas y otros materiales biológicos. Por lo tanto, bajo condiciones de inmunoensayo designados, los anticuerpos especificados se ligan a una proteína particular por lo menos en un magnitud que es de por lo menos dos veces la del segundo plano y más típicamente más de 10 a 100 veces que el segundo plano. La ligación específica bajo tales condiciones requiere un anticuerpo que haya sido seleccionado en base a su carácter específico frente a una proteína en particular. Por ejemplo, es posible seleccionar anticuerpos policlonales de manera de obtener solamente aquellos anticuerpos policlonales que de manera específica sean inmunorreactivos con el antígeno seleccionado y no contra proteínas. Esta selección puede efectuarse eliminando por resta los anticuerpos que reaccionen cruzadamente con otras moléculas. Puede utilizarse una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA de fase sólida para seleccionar anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con una proteína (Véase, por ejemplo, Harlow & Lañe, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactivitidad específica.

[0093] La expresión "dosis o cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere en la presente a una dosis que produce los efectos para los cuales se la administra. La dosis y la formulación exactas dependerán de la finalidad del tratamiento, y podrán ser determinadas por una persona con pericia en la especialidad que utilice las técnicas conocidas (Véase, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Artr Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), y Pickar, Dosage Calculations (1999)).

[0094] La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable" tiene por finalidad referirse a la inclusión de sales de los compuestos activos que se preparan con ácidos o bases relativamente no tóxicos, en función de los sustituyentes particulares hallados en los compuestos descritos en la presente . Si los compuestos de la presente invención contienen funcionalidades relativamente acidas, las sales por adición de ácidos pueden obtenerse poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, sea pura sea en un solvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales por adición de base farmacéuticamente aceptables incluyen sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio, sales de amonio, sales amino orgánicos, o sales de magnesio, o sales similares. Si los compuestos de la presente invención contienen funcionalidades relativamente básicas, es posible obtener sales por adición de ácidos mediante la puesta en contacto de la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, sea en forma pura sea en un solvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales por adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen los derivados de ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido carbónico, ácido monohidrógeno-carbónico, ácido fosfórico, ácido monohidrógeno-fosfórico, ácido dihidrógeno-fosfórico, ácido sulfúrico, ácido monohidrógeno-sulfúrico, ácido yodhídrico o ácido fosforoso y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos relativamente no tóxicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido isobutírico, ácido aleico, ácido malónico, ácido benzoico, ácido succínico, ácido subérico, ácido fumárico, ácido láctico, ácido mandélico, ácido ftálico, ácido bencensulfónico, ácido p-tolilsulfónico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido metanosulfónico, y similares. También se incluyen las sales de aminoácidos tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos tales como ácido glucurónico o ácido galacturonico y similares (Véase, por ejemplo, Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977)). Determinados compuestos específicos de la presente invención contienen ambas funcionalidades, la básica y la ácida, que permiten que los compuestos sean convertidos en bases de adición de base o de ácido. Para la presente invención son también adecuados otros vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos de la persona con pericia en la especialidad.

[0095] Las formas neutras de los compuestos pueden regenerarse poniendo en contacto la sal con una base o ácido y aislando el compuesto progenitor de la manera convencional . La forma progenitora del compuesto difiere de las diversas formas de sales en determinadas propiedades físicas, tales como la solubilidad en solventes polares, pero por lo demás para los fines de la presente invención las sales son equivalentes a la forma progenitora del compuesto .

[0096] Además de las formas de sal, la presente invención provee compuestos que se hallan en una forma de profármaco . Los profármacos de los compuestos descritos en la presente son aquellos compuestos que fácilmente experimentan cambios químicos bajo condiciones fisiológicas de manera de proveer los compuestos de la presente invención. Adicionalmente, es posible convertir los profármacos en los compuestos de la presente invención mediante métodos químicos o bioquímicas en un entorno ex vivo. Por ejemplo, los profármacos pueden convertirse lentamente en los compuestos de la presente invención cuando se los coloca en un reservorio parche transdérmico junto con un enzima o reactivo químico adecuados .

[0097] Determinados compuestos de la presente invención pueden existir en formas no solvato así como en formas solvato, lo que incluye las formas hidratadas. En términos generales, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y están destinadas a quedar incluidas dentro de los alcances de la presente invención. Determinados compuestos de la presente invención pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. En términos generales, todas las formas físicas son equivalentes para los usos considerados por la presente invención, y están destinadas a quedar incluidas dentro de los alcances de la presente invención.

[0098] Determinados compuestos de la presente invención poseen átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o enlaces dobles; los racematos, diastereómeros , isómeros geométricos y los isómeros individuales, están destinados a quedar incluidos, todos ellos, dentro de los alcances de la presente invención.

[0099] La expresión EMT (Mesenchymal Transición, Transición Mesenquimal) se refiere a la adquisición de rasgos estrotnales por células de tumor epitelial. En el cáncer, el EMT está asociado con un comportamiento invasivo y motil y puede ser un proceso central subyacente a la metástasis. El EMT está asociado con un pobre pronóstico y es mediado por múltiples factores de transcripción, tales como, SNAIL, SLUG y TWIST.

La E-cadherina es una proteína de la superficie de las células que interviene en la adhesión entre células epiteliales y células y que se pierde comúnmente en los tumores sólidos invasivos y metastásicos .

Formas de realización detalladas

[0100] La presente invención provee métodos para tratar un paciente de cáncer. En términos generales los métodos comprenden los pasos siguientes: (a) obtener una muestra de tejido de prueba tomado de un individuo en riesgo de tener un cáncer que expresa una proteina N-cadherina; (b) determinar la presencia o ausencia o la cantidad de proteína N-cadherina en la muestra de tejido de prueba en comparación con una muestra de tejido de control tomado de un individuo del que se sabe que es negativo para el cáncer; con ello diagnosticar dicho cáncer que expresa una proteína M-cadherina, donde la proteína N-cadherina se expresa en niveles normales o bajos, o está expresada por un subconjunto de células y no está sobreexpresada; y (c) administrar una cantidad efectiva de anticuerpo de N-cadherina al individuo que está en riesgo de tener un cáncer que expresa una proteína N-cadherina. Típicamente, la muestra de tejido es suero, pero también puede tratarse de un tejido tomado de una biopsia, particularmente de un tejido urogenital, lo que incluye tejido de próstata o tejido de vejiga. Usualmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Se indica un diagnóstico positivo para un cáncer que expresa una proteína N-cadherina o un transcripto de mARN si se detecta un nivel superior de la proteína N-cadherina en la muestra de tejido de prueba en comparación con una muestra de tejido de control tomada de un individuo del que se sabe que no tiene cáncer, por ejemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, el doble, el triple, el cuádruple, más elevado, o más. Los métodos de detección pueden llevarse a cabo por ejemplo mediante técnicas ELISA estárdar conocidas de la persona con pericia en la especialidad (reviewed in Gosling, Immunoassays : A Practical Approach, 2000, Oxford University Press) . La detección se lleva a cabo etiquetando un anticuerpo primario o un anticuerpo secundario con, por ejemplo, un isótopo radioactivo, una etiqueta fluorescente, una enzima o cualquier otra etiqueta detectable conocida de la persona con pericia en la especialidad.

[0101] En otra forma de realización, los métodos de detección pueden llevarse a cabo poniendo en contacto una muestra de tejido de prueba tomada de un paciente que expresa una proteína N-cadherina o un transcripto de mARN con un primer conjunto de un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido cada uno de los cuales se híbrida de manera específica a un ácido nucleico de N-cadherina; amplificando el ácido nucleico de N-cadherina en la muestra; y determinando la presencia o ausencia del ácido nucleico de N-cadherina en la muestra de tejido de prueba en comparación con una muestra de tejido de control tomada de un dividuo del que se sabe que es negativo para un cáncer que expresa una proteína N-cadherina o un transcripto de mARN.

Nuevamente, usualmente la muestra de tejido es suero, pero también podría ser un te ido tomado de una biopsia, particularmente un tejido urogenital, lo que incluye un tejido de próstata o vejiga. Se indica un diagnóstico positivo para un cáncer que expresa una proteína N-cadherina o un transcripto de mARN si en una muestra de tejido de prueba se detecta un nivel más elevado de ARN transcripto de N-cadherina en comparación con una muestra de tej ido de control tomada de un individuo del que se sabe que no tiene cáncer.

[0102] Los métodos encuentran una aplicación particular en el tratamiento de los cánceres de próstata y de vejiga. En determinadas formas de realización se aplican los métodos a cánceres refractarios a hormonas o resistentes a la terapia. En determinadas formas de realización se aplican los métodos a cánceres metastásicos . Por ejemplo pueden utilizarse las comparaciones de expresión diferencial de la proteína N-cadherina y/o de mARN para determinar la etapa de un cáncer en un individuo que tiene un cáncer que expresa una proteína N-cadherina o un transcripto de mARN.

[0103] En términos generales el tratamiento implicará la administración repetida de los anticuerpos anti-N-cadherina por intermedio de una vía de administración aceptable tal como IV (inyección intravenosa) , con una dosis efectiva. Las dosis dependerán de diversos factores generalmente evaluados por la persona con pericia en la especialidad, lo que incluye sin limitación el tipo de cáncer y la gravedad, grado o etapa del cáncer, la afinidad de ligación y la semivida de los agentes utilizados, el grado de expresión de la N-cadherina en el paciente, la amplitud del antígeno de N-cadherina shed circulante, el nivel deseado para la concentración de anticuerpo en estado constante, la frecuencia del tratamiento, y la influencia de los agentes quimioterapéuticos utilizados en combinación con el método de tratamiento de la invención. Las dosis diarias típicas pueden variar entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg. Las dosis en el intervalo de 10-500 mg del mAb por semana pueden ser efectivas y bien toleradas, si bien dosis semanales más elevadas pueden ser adecuadas y/o bien toleradas. El principal factor determinante en la definición de la dosis apropiada es la cantidad de un agente particular necesario para ser terapéuticamente efectivo en un contexto particular. Pueden ser necesarias administraciones repetidas a efectos de lograr la inhibición o regresión del tumor. Las dosis de carga iniciales pueden ser más elevadas. La dosis de carga inicial puede administrarse en forma de una infusión. De manera similar pueden administrarse dosis de mantenimiento periódicas, con la condición de que la dosis inicial sea bien tolerada.

[0104] También es posible la administración directa de los agentes, y esto puede ser ventajoso en determinados contextos. Por ejemplo, para el tratamiento del carcinoma de vejiga es posible inyectar los agentes directamente en la vejiga. Dado que los agentes administrados directamente a la vejiga serán rápidamente eliminados por el paciente, puede ser posible utilizar anticuerpos no humanos o quiméricos de manera efectiva sin complicaciones antigenéticos significativos.

[0105] En algunas formas de realización, la invención provee un método para tratar el cáncer, en particular un cáncer que expresa N-cadherina, o para inhibir el desarrollo de una célula de cáncer que expresa una proteína N-cadherina mediante el tratamiento de un sujeto o poniendo en contacto la célula de cáncer con un anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce y se liga a la proteína N-cadherina en una cantidad que es efectiva para inhibir el desarrollo de la célula de cáncer. En algunas formas de realización, el cáncer de célula es un cáncer de células de próstata o un cáncer de células de vejiga. El anticuerpo de puesta en contacto puede ser un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo quimérico. En algunas formas de realización, el anticuerpo quimérico comprende una región constante de inmunoglobulina humana. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano o comprende una región constante de inmunoglobulina humana. En otras formas de realización, el fragmento de anticuerpo comprende un Fab, F(ab)2í o Fv. En otras formas de realización, el fragmento comprende una proteína recombinante que tiene una región de ligación con antígeno .

[0106] En cualquiera de las formas de realización arriba descritas, es además posible administrar un fármaco quimioterapéutico y/o una terapia de radiación. En algunas formas de realización, el paciente recibe también una terapia antagonista de hormonas. La puesta en contacto del paciente con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, puede efectuarse administrando el anticuerpo al paciente por vía intravenosa, intraperitoneal , intramuscular, intratumoral o intradérmica. En algunas formas de realización, el paciente tiene un cáncer urogenital (por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de próstata). En algunas formas de realización de las precedentes, el paciente adolece de cáncer de próstata y el paciente recibe además de manera óptima una terapia de ablación de hormonas . En algunas formas de realización, la puesta en contacto comprende administrar el anticuerpo directamente en el cáncer o en una metástasis del cáncer.

[0107] En algunas formas de realización, la invención provee un método para tratar un paciente de cáncer. En términos generales el método comprende (a) obtener una muestra de tejido de prueba tomada de un individuo con el riesgo de tener un cáncer que expresa una proteína N-cadherina; (b) determinar la presencia o ausencia o la cantidad de la proteína N-cadherina en la muestra de tejido de prueba por comparación con una muestra de tejido de control tomada de un individuo del que se sabe que es negativo al cáncer; con ello diagnosticar el cáncer que expresa una proteína N-cadherina, en la que la proteína N-cadherina se expresa en niveles normales o bajos, o está expresada por un subconjunto de células y no está sobreexpresada; (c) determinar si es probable que un cáncer llegue a ser invasivo, haga metástasis, se haga independiente de las hormonas, o se haga refractario al tratamiento; (d) administrar un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico, terapia hormonal o radioterapia de acuerdo con si hay una mayor probabilidad de que el cáncer se haga invasivo, haga metástasis, se vuelva independiente de las hormonas o se haga refractario al tratamiento.

[0108] En algunas formas de realización, es posible seleccionar el agente quimioterapéutico entre el grupo consistente en ricina, cadena A de ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina D, toxina de difteria, toxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de arbrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, gelonina mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomiocina, curicina, crotina, calicheamicina, inhibidor de saponaria officinalis, maitansinoides y glucocorticoidricina .

[0109] Por otra parte la invención provee métodos para identificar células madre de cáncer. En términos generales, los métodos comprenden (a) obtener una muestra de tejido de prueba tomada de un individuo con el riesgo de tener un cáncer que expresa una proteína N-cadherina; (b) determinar la presencia o ausencia de células madre de cáncer en la muestra de tejido de prueba por comparación con una muestra de tej ido de control tomada de un individuo del que se sabe que es negativo al cáncer; en la que la proteina N-cadherina se expresa con niveles normales o bajos, o se expresa mediante un subconjunto de las células vástago y no está sobreexpresada .

[0110] En algunas formas de realización, la invención comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo capaz de ligarse al dominio extracelular 4 de la N-cadherina, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : SEQ ID NO: 1: ^QVQLVQSGGGl^QPGGSLRLSCAASGFTFSRHAMIWVRQAPGKGLEWVSSISGSSDSTSYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCAKATGYSYYYGMDVWGPGTTVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGATTLQHG VPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFAIYFCQQAHSFPPTFGGGTKLEIKR

[0111] En algunas formas de realización, la invención comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo capaz de ligarse a los dominios extracelulares 1-3 de la N-cadherina, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre los siguientes grupos : SEQ ID NO 2: MAQVQLVQSGAEVIPGASVKVSCQASGYTFTSYYIH VRQAPGQGFEWMGIINPSGGSASYAQK FQGRVTMTRDTSTSTVYMELRSLR SEQ ID NO 3: MAQVQLQESGWYFDLWGRGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCR ASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCL QDYNGWTFGQGTKVEIKR SEQ ID NO 4: IVIAQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMHWWQAPGKGLEWVAVISYDGRVKSYADA VKGRFTISRDNSENILYVQIDSLRVEDTAVYYCARRGGDHAAGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGGRSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVGNRPS GVSNRFSGSKSGNT SEQ ID NO 5: 1VLAPGAAGGVGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTXVYYCARLEYSSSSRAFD GQGTTVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYAS YQQKPGQAPVLVIYGK RPSGIP DRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHWFGGGTKLTVLG SEQ ID NO 6: MAQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGF SEQ ID NO 7: mQVQLVQSGAEVKRPGASVRISCKASGYPFTTYPIH VRQAPGQGLEWMGGINPNSGAT NVQK FQGRVTMTADTSIRTAYMELSRLTSDDTAVYYCARGEGDTGSYLGGYWGLGTLVTVSSGGGGSGG GGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGRAPLLVIYGKNIRPSGIP DRFSGSSSGNSASLTITGAQAEDEADYYCNSRDRSGNYLFGVGT VTVLG SEQ ID NO 8: mQVQLVQSGAEVKKPGESLEISCKGSGYSFA!MWIGW QMPG GLEWMGSIYPGDSDVRYSRS FQGHVTISADKSIS AYLQWSSLKASDTAMYYCARHRVAYSGYDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSSVLTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYPSWYQQKPGQAPVLVIYG RPSGI PDRFSGSSSGNTASLTI GAQAEDEADYYCHSRDRSGNQVLFGGGT VTVLG SEQ ID NO 9 : MAQVQLVQSGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADS V GRFTISRDNS TLYLQ NSLRAEDTAVYYCARVGGEGGVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSDIVMTQSPSTLSAS En algunas formas de realización, esta invención provee fragmentos de anticuerpo capaces de ligarse a los dominios extracelulares 1-3 de la N-cadherina o al dominio extracelular 4 de la N-cadherina, en donde el fragmento es un cFv. En algunas formas de realización, esta invención provee fragmentos de anticuerpo capaces de ligarse a los dominios extracelulares 1-3 de la N-cadherina o al dominio extracelular 4 de la N-cadherina, en donde el fragmento es un diacuerpo. Para generar diacuerpos se reemplazó el linker SGGGGSGGGGSGGGGS con SGGGGS Métodos de administración y formulación

[0112] Los anticuerpos anti-N-cadherina o los inmunoconjugados se administran a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa, por ejemplo, en forma de un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal , intracerebroespinal , subcutánea, intraarticular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo. La administración puede ser local o sistémica.

[0113] Las composiciones para administración comprenderán habitualmente un agente descrito en la presente (por ejemplo, inhibidores de la N-cadherina, anticuerpos de N-cadherina e inmunoconjugados, siARN de N-cadherina y vectores de ellos) disueltos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente en un vehículo acuoso. Puede utilizarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas y similares. Estas soluciones son estériles y en términos generales están exentas de material indeseable. Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables en la medida de lo requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes para ajustar y tamponar el pH, agentes ajustadores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, lactato de sodio y similares. La concentración del agente activo en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará primariamente en base a los volúmenes del fluido, viscosidades, peso corporal, y similares de acuerdo con el modo de administración particular de administración seleccionado y de las necesidades el paciente.

[0114] Por lo tanto, una composición farmacéutica típica para administración intravenosa variará en función del agente. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos de la persona con pericia en la especialidad o evidentes para la persona con pericia en la especialidad y se han descrito con mayor detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980) .

[0115] Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una variedad de formas de dosis unitarias en función del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosis unitarias incluyen, pero no se limitan a, polvos, comprimidos, pildoras, capsulas y pastillas. Se reconoce que los anticuerpos, si se los administra oralmente, deberían estar protegidos contra la digestión. Esto se lleva a cabo típicamente sea formando complejos de las moléculas con una composición para hacerlas resistentes a la hidrólisis ácida y enzimática, o envasando las moléculas en un vehículo adecuadamente resistente, tal como un liposoma o una barrera de protección. Los medios para proteger los agentes contra la digestión son bien conocidos en la especialidad.

[0116] Las formulaciones farmacéuticas, en particular, de los anticuerpos e inmunoconjugados e inhibidores destinados a ser utilizados en la presente invención pueden prepararse mediante el mezclado de un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con opcionalmente vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables. Tales formulaciones pueden ser formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores, farmacéuticamente aceptables, carecen de toxicidad para los receptores destinatarios en las dosis y concentraciones utilizadas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores, farmacéuticamente aceptables, pueden ser acetato, fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico) polipéptidos, agentes de conservación de bajo peso molecular; proteínas tales como albúmina de suero o gelatina, o polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; y aminoácidos, monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes; y surfactantes iónicos y no iónicos (por ejemplo, polisorbato) ; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos. El anticuerpo puede ser formulado con una concentración de entre 0.5 - 200 mg/ml, o entre 10-50 mg/ml.

[0117] La formulación también puede proveer compuestos activos adicionales que incluyen agentes quimioterapéuticos, agentes citotóxicos, citoquinas, agentes inhibidores del desarrollo, y agentes antihormonales. Los ingredientes activos también pueden prepararse en forma de preparaciones de liberación prolongada (por ejemplo, matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos (por ejemplo, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (alcohol vinílico) ) , poliláctidos . Los anticuerpos e inmunoconjugados también pueden estar entrampados en micro cápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, micro cápsulas de hidroximetilcelulosa o micro cápsulas de gelatina y micro cápsulas de poli (metacrilato de metilo) , respectivamente, en sistemas coloidales para la entrega de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones .

[0118] Las composiciones pueden administrarse para tratamientos terapéuticos o profilácticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que adolece de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) en una "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas para esta utilización dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de la salud del paciente. Es posible administrar administraciones simples o múltiples de la composición en función de la dosis y frecuencia requeridas y toleradas por el paciente. Un "paciente" o "sujeto" para los fines de la presente invención incluye tanto seres humanos como otros animales, en particular mamíferos. Por lo tanto los métodos pueden aplicarse tanto para fines de terapia humana como veterinaria. En la forma de realización preferida el paciente es un mamífero, preferentemente un primate, y en la forma de realización más preferida el paciente es un ser humano. Es posible utilizar otras terapias de cáncer conocidas en combinación con los métodos de la invención. Por ejemplo, las composiciones para utilizar de acuerdo con la invención también pueden utilizarse para apuntar a o sensibilizar una célula a otros agentes terapéuticos para cáncer tales como 5FU, vinblastina, actinomicina D, cisplatino, metotrexato, y similares .

[0119] En otras formas de realización, los métodos de la invención con otras terapias de cáncer (por ejemplo, prostatectomía radical) , terapia de radiación (haz exterior o braquiterapia) ) , terapia de hormonas (por ejemplo, orquiectomía, terapia con LHRH-análogo para suprimir la producción de testosterona, terapia anti-andrógeno) , o quimioterapia. La prostatectomía radical implica la remoción de la totalidad de la glándula próstata y además algo de tejido rodeante. Se utiliza este tratamiento comúnmente cuando se considera que el cáncer no se ha propagado más allá del tejido. Se utiliza comúnmente la terapia de radiación para tratar un cáncer de próstata que está todavía confinado a la glándula próstata, o que se ha propagado al tejido circundante. Si la enfermedad está más avanzada puede utilizarse la radiación para reducir el tamaño del tumor. Se emplea frecuentemente la terapia de hormona en los pacientes en los que el cáncer de próstata se ha propagado más allá de la próstata o tiene una recurrencia. El objetivo de la terapia hormonal es la de reducir los niveles de las hormonas masculinas, los andrógenos y con ello hacer que el cáncer de próstata se contraiga o crezca más lentamente. Los agonistas de LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone, hormona liberadora de la hormona luteinizante) disminuyen la producción de testosterona. Estos agentes pueden inyectarse sea mensualmente sea a intervalos más prolongados . Dos de estos análogos son el leuprolide y goserelin. También pueden utilizarse anti ndrógenos (por ejemplo, flutamide, bicalutamide y nilutamide) . La expresión "bloqueo total de andrógeno" se refiere al uso de antiandrógenos en combinación con la orquietomia o análogos de LHRH. La quimioterapia es una opción para pacientes cuyo cáncer de próstata se ha propagado fuera de la glándula próstata y para los que la terapia hormonal ha fallado. No se espera destruir la totalidad de las células de cáncer, pero puede ralentizar el desarrollo del tumor y aliviar el dolor. Algunos de los fármacos de quimioterapia utilizados en el tratamiento del cáncer de próstata que ha regresado o sigue creciendo y se propaga después del tratamiento con terapia hormonal incluyen doxorrubicina (adriamicina) , estramustina, etopósido, mitoxantrona, vinblastina y paclitaxel . Es frecuente que se administren dos o más fármacos juntos a efectos de reducir la probabilidad de que las células de cáncer se hagan resistentes a la quimioterapia. El carcinoma de células pequeñas es un tipo raro de cáncer de próstata del que es probable que reaccione más a la quimioterapia que a la terapia hormonal .

[0120] En algunas formas de realización, también se administra un "cardioprotector" junto con el anticuerpo de N-cadherina, inhibidor de ligación de N-cadherina, o molécula de N-cadherina siARN para su uso de acuerdo con la invención (Véase la Patente de los EE.UU. N.° 6.949.245) . Un cardioprotector es un compuesto o composición que impide o reduce la disfunción del miocardio (es decir, la cardiomiopatía y/o la insuficiencia cardiaca congestiva) asociada con la administración de un fármaco, tales como un antibiótico antraciclina a un paciente. El cardioprotector puede, por ejemplo, bloquear o reducir un efecto cardiotóxico mediado por radicales libres y/o prevenir o reducir la lesión por stress oxidativo. Los ejemplos de cardioprotectores abarcados por la presente definición incluyen el agente quelante de hierro dexrazoxane (ICRF-187) (Seifert et al. The Annals of Pharmacotherapy 28:1063-1072 (1994)); un agente reductor de los lipidos y/o anti-oxidante tal como probucol (Singal et al. J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063 (1995)); amifostina (aminotiol 2- [ (3-aminopropil) amino] etanotiol-dihidrógeno fosfato éster, también denominado WR-2721, y la ingestión celular defosforilada de la misma denominada WR-1065) y el ácido S-3-(3-metilaminopropilamino) ropilfosfotioico (WR-151327) , véase Green et al. Cáncer Research 54:738-741 (1994); digoxina (Bristow, M. R. In: Bristow M R, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 (1980) ) ; beta-bloqueadores tales como metoprolol (Hjalmarson et al. Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994); y Shaddy et al. Am. Heart J. 129:197-9 (1995)); vitamina E; ácido ascórbico vitamina C) ; agentes secuestradores de radicales libres tales como ácido oleanólico, ácido ursólico y N-acetilciste£na (MAC) ; compuestos atrapadores de espín tales como alfa-fenil-ter-butilnitrona (PBN) (Paracchini et al., Anticáncer Res. 13:1607-1612 (1993)); compuestos selenoorgánicos tales como P251 (Elbesen) ; y similares.

[0121] Las administraciones combinadas incluyen la administración conjunta, para lo cual se utilizan formulaciones separadas o una única composición f rmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde hay preferentemente un periodo de tiempo mientras ambos agentes activos (o todos ellos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas .

[0122] Las moléculas y compuestos identificados que indirectamente o directamente modulan la expresión y/o función de una proteína N-cadherina pueden ser útiles para tratar cánceres que respectivamente, expresan la N-cadherina. Los moduladores de la proteína N-cadherina puede ser administrados solos o conjuntamente en combinación con la quimioterapia, radioterapia o inmunoterapia convencionales, así como con los métodos terapéuticos actualmente desarrollados.

[0123] Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad efectiva del ácido nucleico empacado suspendido en diluentes, tales como agua, solución fisiológica salina o PEG 400; (b) cápsulas, sachets o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de los comprimidos pueden incluir uno o más de los siguientes: lactosa, sucrosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de papa, celulosa microcristalina, gelatina, dióxido de silicio coloidal, talco, estearato de magnesio, acceso esteárico, y otros excipientes, colorantes, rellenos, ligantes, diluyentes, agentes tamponantes de soluciones, agentes de humectación, agentes conservadores, agentes saborizantes , tintes, agentes de desintegración, y vehículos farmacéuticamente compatibles. Las formas de tabletas pueden comprender el ingrediente activo en un saborizante, por ejemplo, sucrosa, así como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tales como gelatina y glicerina o suspensiones de sucrosa y acacia, y similares que contienen, además del ingrediente activo, vehículos conocidos de la persona con pericia en la especialidad.

[0124] El compuesto elegido, solo o en combinación con otros compuestos adecuados, puede ser preparado como formulaciones de aerosol (es decir, se lo puede "nebuli2ar" ) a ser administradas vía inhalación. Las formulaciones de aerosol puede ser colocados en agentes propelentes aceptables presurizados , tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares.

[0125] Las formulaciones adecuadas para la administración rectal incluyen, por ejemplo, supositorios que consisten en el ácido nucleico envasado con una base de supositorio. Las bases adecuadas para los supositorios incluyen triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarbonos parafina. Además de ello, es también posible utilizar capsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación del compuesto elegido con una base, lo que incluye, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles, e hidrocarbonos parafina.

[0126] Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral tales como, por ejemplo, por vía intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intratumoral , intradérmica, intraperitoneal , y subcutánea, incluyen soluciones acuosas y no acuosas, isotónicas estériles, que pueden contener antioxida tes, tampones en solución, agentes bacteriostáticos y 4 solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes , agentes de espesamiento, estabilizantes, y agentes de conservación. En la práctica de esta invención, es posible administrar las soluciones por ejemplo, por infusión intravenosa, o por administración oral, topical, intraperitoneal , intravesical o intratecal . La administración parenteral, la administración oral, y la administración intravenosa son los métodos de administración preferidos. Las formulaciones de los compuestos pueden ser presentadas en contenedores sellados de una sola dosis o de múltiples dosis, tales como ampollas y frascos.

[0127] Las soluciones y suspensiones para inyecciones pueden prepararse a partir de polvos estériles, granulos, y comprimidos del tipo arriba descrito. Las células transducidas por ácidos nucleicos para la terapia ex vivo también pueden administrarse por vía intravenosa o parenteral como arriba descrito .

[0128] Es preferible que la preparación farmacéutica se halle en forma de dosis unitaria. En una forma de este tipo la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades adecuadas del componente activo. La forma de dosis unitarias puede ser una preparación envasada; el envase contiene cantidades discretas de la preparación, tales como comprimidos, capsulas envasados, y polvos en frascos o ampollas. Por otra parte, la forma de dosis unitaria puede ser una capsula, comprimido, cachet, o tabletas por si mismo, o puede ser la cantidad adecuada de cualquiera de ellos en forma envasada. Si se desea, la composición puede también contener otros agentes terapéuticos adecuados .

[0129] Las preparaciones farmacéuticas entregan uno o más moduladores de la proteína N-cadherina, opcionalmente en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inmunoterapéuticos , en una formulación de liberación prolongada.

Típicamente, se administra el modulador de la N-cadherina terapéuticamente como un agente de sensibilización que incrementa la sensibilidad de las células tumorales con respecto a otras terapias citotóxicas contra el cáncer, lo que incluye la quimioterapia, terapia de radiación, inmunoterapia y terapia hormonal .

[0130] En el uso terapéutico para el tratamiento del cáncer, los moduladores o inhibidores de la N-cadherina utilizados en el método farmacéutico de la invención de la invención son administrados con una dosis inicial de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1.000 mg/kg por día. Puede utilizarse un intervalo de dosis diaria de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, o de aproximadamente 0,1 mg/kg a 6 aproximadamente 200 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Sin embargo, las dosis pueden variarse en función de las necesidades del paciente, la gravedad de la condición que se está tratando, y del compuesto que se está empleando. Por ejemplo, es posible determinar las dosis empíricamente teniendo en cuenta el tipo y la etapa del cáncer diagnosticado en un paciente en particular. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, deberla ser suficiente para lograr una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo. La magnitud de la dosis también será determinada por la existencia, naturaleza y amplitud de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompañan la administración de un vector en particular, o de un tipo de célula transducida en un paciente en particular. La determinación de la dosis correcta para una situación en particular se halla dentro de la capacidad de la persona con pericia en la especialidad. En términos generales se inicia el tratamiento con dosis más pequeñas que son inferiores a la dosis óptima del compuesto. Seguidamente se incrementa la dosificación de a pequeños incrementos hasta lograr el efecto óptimo bajo las circunstancias . Por razones de comodidad es posible dividir la dosis diaria administrada en porciones durante el día, si se .

[0131] Las preparaciones farmacéuticas (por ejemplo, N-cadherina siARNs, anticuerpos de N-cadherina, vacunas de N-cadherina, inhibidores de N-cadherina, e inmunoconjugados) para uso de acuerdo con la invención, se entregan típicamente a un mamífero, lo que incluye animales humanos y no humanos. Los mamíferos no humanos tratados mediante los métodos de la presente incluyen animales domesticados (es decir, caninos, felinos, roedores, y lagomorfos) y animales de ganadería y agricultura (bovinos, equinos, ovinos, porcinos) .

EJEMPLOS

[0132] Se presentan los siguientes ejemplos a título de ilustración, que no tienen por objeto delimitar la invención reivindicada .

E emplo 1 : aisiación y caracterización de ScFVs humanos específicos con respecto a la N-cadherina humana MATERIALES y MÉTODOS Expresión de proteína recombinante N-cadherina y cepas de células .

[0133] Se generaron dos proteínas recombinantes N-cadherina independientes (Z Wainberg) ; los dominios extracelulares de N-cadherina uno a tres (ECD1-3) y el cuarto dominio de N-cadherina (EDCD4) . Se clonó la secuencia cADN utilizando RT- PCR a partir de una preparación de mARN. Se clonaron los ácidos nucleicos 160 a 497 para ECD1-3 y los ácidos nucleicos 489 a 603 en el sistema bacterial de expresión en marco con un rótulo 6 histidina en un vector en marco con un rótulo GST. Se indujo la expresión dentro de horas después de la inducción; se aisló la fracción periplásmica y se purificó la proteína recombinante mediante cromatografía Ni-NTA. Se analizó la proteína en SDS-PAGE para determinar su tamaño y pureza. Se generaron células transfectadas con N-cadherina. Se clonó el cADN de N-cadherina completa en el vector y se transfectó en LNCap por infección. Se utilizaron dos células PC3 y dos cepas de células de próstata DU145 para caracterizar los fragmentos de anticuerpo anti-N-cadherina aislados .

Paneo de biblioteca de fagos

[0134] Planificamos una biblioteca de fagos inmune que despliega un Fv humano de cadena única (scFv) , que contiene 8.2 x 108 miembros generados en JD arks laboratory tal como se describió previamente (Sheets M.D. PNAS 1998) . Los fagos se seleccionaron por afinidad para proteínas recombinantes de N-cadherina. ECD1-3 y ECD4 se absorbieron por separado en dos inmunotubos (Nunc) . Los inmunotubos se lavaron luego con PBS, se bloquearon con 4% de leche en PBS a temperatura ambiente durante 2 horas, luego se lavaron 3 veces con PBS. Se mezclaron alícuotas de 1 mi de la biblioteca de scFv visualizada por fagos (8.1011 pfu) con 1 mi de 8% de MPBS y se añadieron a los inmunotubos recubiertos con antígeno. Los inmunotubos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente . Los inmunotubos se lavaron luego una vez con 0,05% de Tween 20 en PBS y tres veces con PBS. Los fagos se eluyeron con 1 mi de 100 mM de trietilamina durante 5 minutos y se neutralizaron con 0,5 mi de 1 M de Tris-Hcl pH 7,4. La mitad del fago eluido para cada corrida se congeló mientras que la otra mitad se usó para infectar las células TG1. La amplificación y purificación de fagos se llevaron a cabo tal como se describió con anterioridad (Sheets M.D. PNAS 1998) . La selección incluía otras 3 vueltas de paneo similares a la primera vuelta. Se usaron 2 mi de 40 µ?/ml para recubrir los inmunotubos para las vueltas 1 y 2, mientras que se usaron 20 µ?/ml para recubrir inmunotubos para las vueltas 3 y 4. La cantidad de lavados se incrementó progresivamente en las vueltas 2, 3 y 4. Los anticuerpos de fagos policlonales de las vueltas 1, 2, 3 y 95 clones objeto de la cuarta vuelta de paneo se evaluaron por medio de ELISA tal como se describió previamente (referencia Marks JD J Mol Biol . 1991 Dec 5; 222 (3) .581-97. ) .

Análisis ELISA de clones individuales

[0135] La unión de 95 clones del fago individual a su blanco se determinó por ELISA (Marks JD J Mol Biol. 1991 Dec 5;222 (3) :581-97) (Poul M, et al. JMB Volume 301, Issue 5, Páginas 1149-1161) . El blanco usado para la selección se empleó para recubrir una placa de ELISA de 96 pocilios. Se determinó el número de scFv por identificación de huella genética de los genes scFv con la enzima de restricción BstNI y se confirmó por la secuenciación del ADN.

Reformateado de scFvs en dxacuerpos

[0136] Se cortaron insertos de ScFv del pHENl usando enzimas de restricción Ncol y Notl y se clonaron en el vector pSyn usando los mismos sitios enzimáticos de restricción. Para reformatear scFv en diacuerpo el ligador de 15 a 5 a. a mediante el empalme con PCR de extensión superpuesta (SOE-PCR) (Yazaki PJ, et al. PEDS 2004 May;17 (5) :481-9) . Los productos de SOE-PCR se clonaron en el vector TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron para verificar que no se generaron mutaciones a partir de la PCR. Los constructos del diacuerpo se clonaron finalmente en el vector pSynl usando los sitios de restricción de Ncol y Notl.

Expresión y purificación de scFv y diacuerpos

[0137] Los scFvs y diacuerpos clonados en pSynl se transfectaron en las bacterias TG1 para la expresión de proteínas. Las bacterias se cultivaron a una densidad de D.06oonm 0,5 antes de inducir la expresión con 1 mM de IPTG. Después de cuatro horas de la inducción, las bacterias se centrifugaron y se preparó la fracción periplásmica . Las proteínas de marca HIS se purificaron en una columna Ni-NTA. La proteína eluida se dializó contra PBS, se concentró y filtró.

Caracterización bioquímica

[0138] Las proteínas purificadas se analizaron por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Se determinó el tamaño estructural nativo por columnas de exclusión por tamaño (Superdex 75) (Pharmacia) Citómetria de flujo

[0139] La citometría de flujo se realizó para evaluar la unión de los clones de anticuerpo del fago y diacuerpos a la N-cadherina celular. Para la tinción del anticuerpo del fago se usó sobrenadante concentrado 20 veces. Los clones individual se cultivaron en 20 mi de 2TY a una densidad de D.06oonm 0,5 cuando el fago se rescató con los fagos auxiliares . Después de un cultivo de toda la noche, el los fagos monoclonales se recolectaron del sobrenadante por precipitación con PEG/NaCl y se resuspendieron en 1 mi de PBS/1% de BSA. Para la tinción de citometría de flujo, 5 x 105 células se incubaron durante una hora en hielo con 100 µ? de clon de anticuerpo del fago concentrado en 20x PEG. Las células se lavaron en buffer de flujo (PBS 1%FBS, 1 mM de EDTA, 0,02% de azida sódica) y los clones del anticuerpo del fago se detectaron con anticuerpo anti-M13 monoclonal (Amersham Biosciences) . Las células se lavaron y tiñeron con anticuerpo anti-ratón conjugado R-PE. Para la tinción del diacuerpo, 5 x 105 células se incubaron durante una hora en hielo con el diacuerpo a una concentración de 2 ^g/ml en buffer de flujo. Las células se lavaron y el diacuerpo se detectó con 1/100 de anticuerpo anti-c-Myc-biotina en buffer de flujo. Las células se lavaron finalmente y tiñeron con 1/40 estreptavidina-R-PE (SIG A) en buffer de flujo.

Estudios in vivo

[0140] La proteína D4Db se marcó con 12 I y se inyectó en la vena de cola de ratones SCID que portan tumores LAPC9 Aly ratones desnudos que portan tumores PC3. La visualización de imágenes MicroPET se realizó 4 y 20 horas pos-inyección. Se realizó la biodistribución 20 horas pos- inyección.

Inmunopurificación

[0141] Las mismas bibliotecas de fagos no inmune que exhiben anticuerpos Fv de cadena simple humanos (scFv) , que contienen 8,2xl08 miembros se inmunopurificaron de modo independiente contra proteína recombinante ECD1-3-6HÍS o ECD4-6HIS. Los resultados de la inmunopurificación que incluyen, entrada, salida, recuperación y enriquecimiento se presentan en la Tabla 1. La inmunopurificación contra un ECD1-3 produjo el enriquecimiento temprano a partir de la ronda 2, mientras que el enriquecimiento solo fue superior a uno en la última ronda de inmunopurificación para el ECD4. Estos resultados son compatibles con el ELISA policlonal ELISA ya que una señal apareció en la segunda ronda de inmunopurificación con ECD1-3 mientras que solo la muestra de la tercera ronda de inmunopurificación con ECD4 mostró una señal .

[0142] Como se muestra en la FIG. 1, los anticuerpos del fago policlonal de las rondas de inmunopurificación 1, 2 y 3 se analizaron por ELISA. Los blancos usados para las rondas de inmunopurificación se usaron para recubrir la placa de ELISA. La unión del anticuerpo del fago se detectó con anticuerpo anti-M13 conjugado a HRP.

Tabla 1 a) ECD1-3 Proteína Entrada Salida Recupera Enriquec inmóvili (pfu) (pfu) ción imiento zada Ronda 1 40 /¿l/mi 8*101 2*106 2 , 5*10"6 Ronda 2 40 µ?/ml 5*1010 2*105 4*10"6 1,6 Ronda 3 20 µ?/ml 5*101:L 4*106 10"5 2,5 Ronda 4 20 µ?/ml 2*101? 5*108 2,5*10"3 250 b) ECD4 Detección

[0143] Se aislaron 95 de la quinta ronda de selección para ECDl-3 y ECD4 y se analizaron por ELISA. Los 95 clones aislados de la cuarto ronda de selección para ECDl-3 -6HIS se analizaron contra ECDl-3 -6HIS y ECDl-3 -GST. 93 de los 95 clones fueron positivos cuando se ensayaron con ECDl-3 6HIS. Veintidós de los clones positivos para ECDl-3 6HIS también fueron positivos para ECDl-3 - GST. Los veintidós clones positivos para ECDl-3 6HIS y ECDl-3 -GST se identificaron por huella genética para aislar clones únicos. 7 clones tenían solo una copia A7, C7, C12 , DIO, E4 , E10 y G2. B12 tenía otra copia. D4 tenía 3 copias diferentes y A8 tenía otras 8 copias. El inserto A8 Ncol-Notl fue más corto que los otros clones cuando se analizó en el gel de agarosa. Los 95 clones aislados de la cuarta ronda de selección para ECD4-6HIS se analizaron contra ECD4-6HIS y ECD1-3 6HIS. Los 95 clones analizados fueron positivos cuando se analizaron en ECD4-6HIS y negativos cuando se analizaron en ECD1-3 6HIS . Nosotros seleccionamos 8 de los clones positivos que dieron la señal más fuerte en el ELISA y se los identificó por huella genética. Estos 8 clones tenían la misma huella genética. Uno de estos clones, Al se llamó Al4

[0144] En síntesis, nosotros seleccionamos 10 clones del fago individual que unen proteína recombinante ECD1-3 de N-cadherina (A7, A8, B12, C7, C12, D4 , DIO, E4, E10, G2) y un clon del fago que une proteína recombinante ECD14 de N-cadherina (A14) Unión de clones del fago a la N-cadherina de la superficie celular

[0145] Los once clones del fago individuales seleccionados por ELISA se ensayaron para determinar la unión celular de las células positivas a N-cadherina (células transíectadas con N-cadherina PC3 y LNCaP) por citometría de flujo. Los clones también se analizaron para determinar reactividad cruzada en las células negativas para N-cadherina (DU-145 y LNCap) . En estos experimentos, se generó un segundo lote de anticuerpos del fago y se analizaron nuevamente por ELISA. Ambos resultados de ELISA para los clones seleccionados se presentan en la Tabla 2. Todos los clones del fago excepto uno tiño con D4 las células positivas para N-cadherina pero no las células negativas para N-cadherina. La intensidad de fluorescencia media para cada clon se presenta en la Tabla 2. Nosotros seleccionamos A14 como el único anti-ECD4 y C7 y E4 ya que estos clones del anticuerpo del fago muestran la tinción celular más fuerte al ser reformateados en el diacuerpo . Se generó el diacuerpo; se usaron A14Db, C7Db y E4 Db para teñir las células positivas y negativas para N-cadherina. A14Db y E4Db mostraron una tinción débil comparable mientras que C7 Db mostró tinción más fuerte de las células positivas para N-cadherina cuando se analizaron por citometría de flujo (datos nos mostrados) . Sin embargo C7Db también muestra tinción de una célula negativa para N-cadherina.

[0146] la proteína de scFv de estos clones se han secuenciado. Las secuencias se listan a continuación: A14SCFV SEQ ID NO: 1 A7 ScFv incompleto SEQ ID NO: 2 A8 ScFv truncado SEQ ID NO: 3 B12 ScFv incompleto SEQ ID NO: 4 C7 ScFc SEQ ID NO: 5 C12 ScFv incompleto SEQ ID NO: 6 D4 ScFv SEQ ID NO E4 ScFv SEQ ID NO ElO ScFv incompleto SEQ ID NO Tabla 2 Tabla 3 Tumor Sangre Hígado Bazo Riñon Pulmón LAPC9 0,6 0,9 0,3 0,2 0,6 0,3 AI PC3 0,3 0,6 0,3 0,1 0,6 0,3 Los datos de biodistribución se obtuvieron a 22h pos- inyección de los tumores o ratones .

Tumor/sangre =0,7 (LAPC9) y 0,5 PC3) Selección del mejor ligador

[0147] En un esfuerzo adicional para seleccionar el mejor de los 10 ligadores ECD1-3, se generaron estos clones del fago, se redujeron en las células LNCaP y se inmunopurificaron dos veces contra las células LNCaP transíectadas con N-cadherina. Los clones se secuenciaron. Si bien, la tinción de las células LNCaP transfectadas con N-cadherina con los clones del fago D4 fue negativa, el clon D4 fue prevalente con X copias.

[0148] Se generó el diacuerpo D4 (D4Db) y se comparó con E4Db por la tinción con PC3 y DU145 (Figura 2) . E4Db y D4Db tiñeron PC3 y fueron negativos para DU145. La tinción de D4Db de. PC3 fue más fuerte que E4Db (FIG. 4) .

[0149] Como se muestra en la FIG. 2, las células positivas para N-cadherina (PC3) se incubaron con diacuerpos, se tiñeron y analizaron por citometría de flujo. Solo anticuerpos secundarios: anti-C-Myc-FITC (relleno en gris) , A14 Db (línea discontinua) , E4 Db (línea fina) C7 Db (línea gruesa) .

[0150] Como se muestra en la FIG. 3, las células negativas para N-cadherina (DU 145) y células positivas para N-cadherína (PC3) se incubaron con C7 Db, se tiñeron y analizaron por citometría de flujo. Solo anticuerpos secundarios: anti-C-Myc-FITC (relleno en gris) , C7 Db (línea entera) .

[0151] Como se muestra en la FIG. 4, las células negativas para N-cadherina (DU 145) y las células positivas para N-cadherina (PC3) se incubaron con diacuerpos, se tiñeron y analizaron por citometría de flujo. Solo anticuerpos secundarios: anti-C-Myc-biotina en esptreptavidina R-PE (relleno en gris) , E4 Db (línea discontinua) , D4 Db (línea entera) .

[0152] La FIG. 5 muestra la localización del tumor de D4 Db marcado con 124I en tumores LAPC9 AI. Se registraron las secciones coronales 4 horas después de la inyección.

[0153] Se entiende que los ejemplos y formas de realización descriptas en la presente son solo con fines ilustrativos y que a la luz de estos varias modificaciones o cambios serán sugeridas a los expertos en la técnica y están dentro del alcance del espíritu y ámbito de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas publicaciones, patentes, y solicitudes de patente mencionadas en la presente se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los fines .

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos capaces de ligarse con el dominio extracelular 4 de N-cadherina, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento es un scFv.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento es un diacuerpo.

4. Un anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos capaces de ligarse al dominio extracelular 1-3 de N-cadherina, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9.

5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el fragmento es un scFv.

6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4 , en donde el fragmento es un diacuerpo .

7. Un método de tratamiento de un paciente con cáncer, que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de tejido de prueba tomada de un individuo con riesgo de tener cáncer que expresa una proteína N-cadherina; (b) determinar la presencia o ausencia o la cantidad de la proteína N-cadherina en la muestra de tejido de prueba por comparación con una muestra de tejido de control tomada de un individuo del que se sabe que es negativo al cáncer; diagnosticando aquí dicho cáncer que expresa una proteína N-cadherina, en donde la proteína N-cadherina se expresa con niveles normales o bajos, o está expresada por un subconjunto de células, o está sobreexpresada; y (c) administrar una cantidad efectiva de anticuerpo de N-cadherina o fragmento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 4 al individuo en riesgo de tener cáncer que expresa una proteína N-cadherina .

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha muestra de tejido es tejido de próstata o vejiga.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho cáncer es un cáncer de próstata.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho cáncer es un cáncer de vejiga.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho cáncer es un cáncer de próstata refractario a las hormonas .

12. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho anticuerpo bloquea el cáncer de próstata refractario a las hormonas .

13. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho anticuerpo bloquea las células madre de cáncer.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho cáncer es un cáncer metastásico .

15. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo es un scFv.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo es un diacuerpo.

18. Un método de diagnóstico de un paciente con cáncer, que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de tejido de prueba tomada de un individuo con riesgo de tener cáncer que expresa una proteína N-cadherina; (b) determinar la presencia o ausencia o cantidad de la proteina N-cadherina en la muestra de tejido de prueba por comparación con una muestra de tejido de control tomada de un individuo del que se sabe que es negativo al cáncer poniendo en IOS contacto una muestra con una cantidad efectiva de un anticuerpo de N-cadherina o fragmento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 4; diagnosticando aquí dicho cáncer que expresa una proteína N-cadherina, en donde la protelna N-cadherina se expresa con niveles normales o bajos, o está expresada por un subconjunto de células, o está sobreexpresada .

19. Un método de identificación de células madre de cáncer, que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de tejido de prueba tomada de un individuo con riesgo de tener cáncer que expresa una proteína N-cadherina; (b) determinar la presencia o ausencia de células madre de cáncer en la muestra de tejido de prueba por comparación con una muestra de tej ido de control tomada de un individuo del que se sabe que es negativo al cáncer; en donde la proteína N-cadherina se expresa con niveles normales o bajos, o se expresa mediante un subconjunto de las células vastago y no está sobreexpresada, usando los anticuerpos de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 4.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha muestra de tejido es tejido de próstata o vejiga.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho cáncer es un cáncer de próstata.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho cáncer es un cáncer de vejiga.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho cáncer es un cáncer de próstata refractario a las hormonas .

24. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho cáncer es un cáncer metastásico.

25. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó .

26. Un vector aislado que comprende el ácido nucí acuerdo con la reivindicación 25.

27. Una célula huésped que comprende el vector acuerdo con la reivindicación 26.