MX2011004803A

MX2011004803A - Composiciones y metodos que comprenden una variante de subtilisina.

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Publication number: MX2011004803A
Application number: MX2011004803A
Authority: MX
Inventors: David A Estell; James T Kellis Jr; Ayrookaran J Poulose; Frits Goedegebuur; Luis G Cascao-Pereira
Original assignee: Danisco Inc
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2011-06-16
Also published as: EP2361300B1; US20100152087A1; BRPI0921827A2; JP5412523B2; EP2361300A1; RU2011123903A; US8183024B2; JP2012508032A; WO2010056671A1; AR074106A1; CN102209777A; CN102209777B; KR20110095254A; CA2743123A1

Abstract

La presente invención provee una variante de subtilisina que está particularmente bien adaptada a aplicaciones de limpieza. En particular, la presente invención provee una variante de subtilisina de Bacillus sp. y composiciones de limpieza que comprenden esta variante.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS QUE COMPRENDEN UNA VARIANTE DE SUBTILISINA Campo de la Invención La presente invención provee una variante de subtilisina que está particularmente bien adaptada a aplicaciones de limpieza. En particular, la presente invención provee una variante de subtilisina de Bacillus sp. y composiciones de limpieza que comprenden esta variante.

Antecedentes de la Invención Típicamente, las composiciones de lavado de vajilla domésticas e industriales tradicionales se basan en una combinación de lavados con detergente de alta alcalinidad y blanqueado con cloro para limpieza y saneamiento de vajillas. Esos sistemas generalmente tienen buen rendimiento sobre manchas blanqueables . Sin embargo, la remoción de suciedades que contienen proteína que a menudo está presente en vajillas en los hogares, hospitales, cafeterías e industrias proveedoras de servicios de comida es problemática. Además, las composiciones que contienen materiales alcalinos y cloro muy altos no son consideradas como inocuas para el consumidor y el ambiente.

Se han hecho varios intentos para producir composiciones de lavado de vajilla que sean efectivas para Ref. 219555 remover suciedades proteináceas . Estas composiciones típicamente incluyen proteasas activas bajo condiciones alcalinas (v.gr. , pH de por lo menos 9.5) . Sin embargo, esas composiciones tienen desventajas significativas ya que son difíciles de formular en las formas líquida o de gel comúnmente preferidas por los consumidores para detergentes para lavado de vajilla. Además, a menudo se considera que las composiciones de lavado de vajilla son irritantes.

Se han hecho algunos intentos para producir composiciones de lavado de vajilla de pH bajo (v.gr., pH menor que 9.5) . Estas composiciones son más seguras, más ambientalmente inocuas y capaces de formularse en formas de gel y líquidas. Sin embargo, las composiciones de lavado de vajilla de pH bajo actuales han probado ser muy inefectivas para remover suciedades proteináceas, aun cuando se formulan altas concentraciones de enzimas (v.gr., proteasas) dentro de las composiciones de lavado de vajilla.

Por lo tanto, persiste la necesidad en la técnica de composiciones de lavado de vajilla que remuevan efectivamente suciedades proteináceas de la vajilla. Además, persiste la necesidad de composiciones de lavado de vajilla que sean más inocuas para el ambiente y para el consumidor y estén en una forma que sean fácil de usar y efectivas en costos .

De manera similar, persiste la necesidad de composiciones de limpieza de telas que remuevan efectivamente suciedades proteináceas de telas.

Sumario de la Invención La presente invención provee una variante de subtilisina de Bacillus sp . particularmente adaptada para usarse en composiciones de limpieza. Además, la presente invención provee composiciones de limpieza que comprenden esta variante de subtilisina.

La presente invención provee una variante de subtilisina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades preferidas, la presente invención provee composiciones que comprenden la variante de subtilisina que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades particularmente preferidas, la composición es una composición de limpieza. En algunas modalidades preferidas alternativas, las composiciones de limpieza son detergentes para lavandería, mientras que en algunas otras modalidades preferidas, las composiciones de limpieza are detergentes para lavado de vajilla. En algunas modalidades, el detergente para lavado de vajilla son detergentes para lavado automático de vajilla, mientras que en otras modalidades son detergentes para lavado manual de vajilla. En algunas modalidades preferidas, las composiciones de limpieza son detergentes líquidos, mientras que en algunas otras modalidades, las composiciones de limpieza son detergentes en gel, tableta, polvo o gránulos. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza no contienen fosfato, mientras que en algunas otras modalidades, las composiciones de limpieza contienen fosfato. En algunas modalidades preferidas, las composiciones de limpieza además comprenden por lo menos un agente de blanqueado. En algunas modalidades preferidas adicionales, las composiciones de limpieza además comprenden por lo menos una enzima adicional. En algunas modalidades, la enzima adicional es/son seleccionadas de hemicelulasas , celulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas, cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenases , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas.

La presente invención también provee métodos de limpieza, que comprenden proveer un artículo que ha de ser limpiado y una composición que comprende la variante de subtilisina expuesta en SEQ ID NO: 5, y poner en contacto ese artículo con la composición. En algunas modalidades adicionales, los métodos además comprenden el paso de enjuagar el artículo que ha de ser limpiado. En algunas modalidades adicionales, el artículo es un artículo de vajilla o de tela.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención provee una variante de subtilisina particularmente bien adaptada para aplicaciones de limpieza. En particular la presente invención provee una variante de subtilisina de Bacillus sp . y composiciones de limpieza que comprenden la variante. La presente invención además provee composiciones de enzima que tienen rendimiento de lavado comparable o mejorado, en comparación con las proteasas de subtilisina actualmente usadas.

A menos que se indique otra cosa, la práctica de la presente invención implica técnicas convencionales comúnmente usadas en biología molecular, microbiología, purificación de proteína, ingeniería de proteína, secuenciación de proteína y ADN, campos de ADN recombinante , y uso y desarrollo de enzima industrial, todas las cuales están dentro del alcance de la técnica .

Además, los encabezados provistos aquí no son limitaciones de los varios aspectos o modalidades de la invención que se pueden tener por referencia a la especificación como un todo. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación son definidos de manera más completa por referencia a la especificación como un todo. No obstante, para facilitar el entendimiento de la invención, a continuación se proveen definiciones para un número de términos .

A menos que se defina de otra manera en la presente, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual está dirigida esta invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí encuentran uso en la práctica de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen en la presente. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación son más completamente descritos por referencia a la especificación como un todo. También, como se usa en la presente, los términos singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. A menos que se indique otra cosa, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi , respectivamente. Cabe entender que esta invención no está limitada a los protocolos de metodología particulares y reactivos descritos, ya que ésos pueden variar, según el contexto en que sean usados por los expertos en la técnica.

Se pretende que cada limitación numérica máxima dada a lo largo de esta especificación incluya cada limitación numérica más baja, como si esas limitaciones numéricas más bajas fueran escritas expresamente aquí. Cada limitación numérica mínima dada a lo largo de esta especificación incluirá cada limitación numérica más alta, como si esas limitaciones numéricas más altas fueran escritas expresamente aquí . Cada intervalo numérico dado a lo largo de esta especificación incluirá cada intervalo numérico más estrecho que caiga dentro de ese intervalo numérico más amplio, como si esos intervalos numéricos más estrechos fueran todos ellos escritos expresamente aquí.

Como se usa en la presente, el término "compatible", significa que los materiales de composición de limpieza no reducen la actividad enzimática de la enzima (s) proteasa provista aquí a un grado tal que la proteasa no es efectiva como se desea durante situaciones de uso normal. Los materiales de composición de limpieza específicos son ejemplificados en detalle más adelante.

Como se usa en la presente, "cantidad efectiva de enzima" se refiere a la cantidad de enzima necesaria para lograr la actividad enzimática requerida en la aplicación específica. Esas cantidades efectivas son fácilmente obtenidas por un experto en la técnica y se basan en muchos factores, tales como la variante de enzima particular usada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición de limpieza, y si se requiere una composición líquida o seca (v.gr., granulada), y similares.

Como se usa en la presente, "que tiene propiedades mejoradas" usada en conexión con una "proteasa variante" se refiere a una variante de proteasa con rendimiento mejorado y/o estabilidad mejorada con rendimiento retenido, en relación con la proteasa de tipo silvestre correspondiente. En algunas modalidades particularmente preferidas, las propiedades mejoradas se seleccionan del grupo que consiste de rendimiento de lavado de vajilla y/o lavandería mejorado y estabilidad mejorada, así como la combinación de rendimiento de lavado de vajilla y/o lavandería mejorado y estabilidad mejorada .

Como se usa en la presente, la frase "estabilidad del detergente" se refiere a la estabilidad de una composición detergente. En algunas modalidades, la estabilidad se evalúa durante el uso del detergente, mientras que en otras modalidades el término se refiere a la estabilidad de una composición detergente durante el almacenamiento.

El término "estabilidad mejorada" se usa para indicar mejor estabilidad de una proteasa variante en composiciones durante el almacenamiento y/o mejor estabilidad en la espumación. En modalidades preferidas, la variante de proteasa presenta estabilidad mejorada en detergentes para cuidado de vajilla y/o para lavanderías durante el almacenamiento y/o estabilidad mejorada en la espumación, que incluye estabilidad contra agentes oxidantes, agentes secuestrantes, autólisis, agentes tensioactivos y alcalinidad alta, en relación con la enzima de tipo silvestre correspondiente .

Como se usa en la presente, la frase, "estabilidad a proteólisis" se refiere a la capacidad de una proteína (v.gr. , una enzima) para soportar proteólisis. No se pretende que el término se limite al uso de cualquier proteasa particular para evaluar la estabilidad de una proteína.

Como se usa en la presente, "estabilidad oxidativa" se refiere a la capacidad de una proteína para funcionar bajo condiciones oxidativas. En particular, el término se refiere a la capacidad de una proteína para funcionar en presencia de varias concentraciones de H202, perácidos y otros oxidantes. Estabilidad bajo varias condiciones oxidativas se puede medir ya sea por procedimientos estándares conocidos por los expertos en la técnica y/o por los métodos descritos aquí. Un cambio sustancial en estabilidad oxidativa es evidenciado por lo menos por aproximadamente un 5% o mayor incremento o disminución (en la mayoría de las modalidades, es preferiblemente un incremento) en la vida media de la actividad enzimática, en comparación con la actividad enzimática presente en ausencia de compuestos oxidativos.

Como se usa en la presente, "estabilidad al pH" se refiere a la capacidad de una proteína para funcionar a un pH particular. En general, la mayoría de las enzimas tienen un intervalo de pH finito al cual funcionarán. Además de las enzimas que funcionan en pHs de intervalo medio (de alrededor de pH 7) , hay enzimas que son capaces de funcionar bajo condiciones con pHs muy altos o muy bajos. La estabilidad a varios pHs se puede medir ya sea por procedimientos estándares conocidos por los expertos en la técnica y/o por los métodos descritos aquí. Un cambio sustancial en estabilidad al pH es evidenciado por lo menos por aproximadamente 5% o mayor incremento o disminución (en la mayoría de las modalidades, es preferiblemente un incremento) en la vida media de la actividad enzimática, en comparación con la actividad enzimática al pH óptimo de la enzima. Sin embargo, no se pretende que la presente invención sea limitada a cualquier estabilidad al nivel de pH ni intervalo de pH.

Como se usa en la presente, "estabilidad térmica" y "termoestabilidad" se refieren a la capacidad de una proteína para funcionar a una temperatura particular. En general, la mayoría de las enzimas tienen un intervalo finito de temperaturas a las cuales funcionarán. Además de enzimas que funcionan a temperaturas en intervalo medio (v.gr., temperatura ambiente) , hay enzimas que son capaces de trabajar en temperaturas muy altas o muy bajas. La estabilidad térmica se puede medir ya sea por procedimientos conocidos o por los métodos descritos aquí. Un cambio sustancial en estabilidad térmica es evidenciado por lo menos por aproximadamente 5% o mayor incremento o disminución (en la mayoría de las modalidades, es preferiblemente un incremento) en la vida media de la actividad catalítica de una variante cuando se expone a una temperatura dada. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a algún nivel de estabilidad a la temperatura ni intervalo de temperatura.

Como se usa en la presente, el término "estabilidad química" se refiere a la estabilidad de una proteína (v.gr., una enzima) hacia compuestos químicos que pueden afectar adversamente su actividad. En algunas modalidades, esos compuestos químicos incluyen, pero no se limitan a peróxido de hidrógeno, perácidos, detergentes aniónicos, detergentes catiónicos, detergentes no iónicos, quelantes, etc. Sin embargo, no se pretende que la presente invención esté limitada a algún nivel de estabilidad química particular ni intervalo de estabilidad química.

Como se usa en la presente, los términos "purificado" y "aislado" se refieren a la remoción de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, una enzima de interés es purificada por remoción de proteínas contaminantes y otros compuestos dentro de una solución o preparación que no son la enzima de interés. En algunas modalidades, enzimas recombinantes de interés son expresadas en células hospederas bacterianas o fúngicas y estas enzimas recombinantes de interés son purificadas por la remoción de otros constituyentes de las células hospederas; el por ciento de polipéptidos de enzima recombinante de interés es por lo tanto incrementado en la muestra.

Como se usa en la presente, "proteína de interés," se refiere a una proteína (v.gr., una enzima o "enzima de interés") que está siendo analizada, identificada y/o modificada. Proteínas que ocurren naturalmente, así como recombinantes (v.gr., "imitantes" o "variantes") encuentran uso en la presente invención. Como se usa en la presente, "proteína" se refiere a cualquier composición compuesta de aminoácidos y reconocida como una proteína por los expertos en la técnica. Los términos "proteína," "péptido" y polipéptido se usan indistintamente aquí. En donde un péptido es una porción de una proteína, los expertos en la técnica entienden el uso del término en contexto.

Como se usa en la presente, "vector de expresión" se refiere a un constructo de ADN que contiene una secuencia de ADN que es operablemente enlazada a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedero adecuado. Esas secuencias de control incluyen un promotor para efectuar transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a ribosoma de AR m adecuados y secuencias que controlan la terminación de transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un hospedero adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del hospedero o, en algunos casos, puede integrarse en el genoma mismo. En la presente especificación, "plásmido," "plásmido de expresión" y "vector" a menudo se usan indistintamente, ya el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector en la actualidad. Sin embargo, se pretende que la invención sea destinada a incluir otras formas de vectores de expresión que tienen funciones equivalentes y que son, o llegan a ser, conocidas en la técnica.

En algunas modalidades preferidas, el gen de proteasa es ligado en un plásmido de expresión apropiado. El gen de proteasa clonado se usa después para transformar o transfectar una célula hospedera a fin de expresar el gen de proteasa. Este plásmido puede replicarse en hospederos en el sentido que contiene los elementos bien conocidos necesarios para replicación de plásmido o el plásmido puede ser diseñado para integrarse en el cromosoma del hospedero. Los elementos necesarios se proveen para expresión de gen eficiente (v.gr., un promotor operablemente enlazado al gene de interés) . En algunas modalidades, estos elementos necesarios son suministrados como el promotor homólogo propio del gene si es reconocido, (es decir, transcrito por el hospedero) , y un terminador de transcripción que es exógeno o es suministrado por la región de terminador endógeno del gen de proteasa. En algunas modalidades, también se incluye un gen de selección tal como un gen de resistencia a antibióticos que permite el mantenimiento en cultivo continuo de células hospederas infectadas por plásmido por crecimiento en medio que contiene antimicrobianos .

El siguiente método de mutagénesis de cásete se puede usar para facilitar la construcción de la variante de proteasa de la presente invención, aunque se pueden usar otros métodos. Primero, como se describe en la presente, un gen que ocurre naturalmente que codifica la proteasa se obtiene y se secuencia en su totalidad o en parte. Después, la secuencia es escudriñada para un punto en el cual se desea hacer una mutación (v.gr., por deleción, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la proteasa codificada. Las secuencias que flanquean este punto se evalúan para la presencia de sitios de restricción para reemplazar un segmento corto del gen con un acervo de oligonucleótido que cuando se expresan codificarán varios mutantes . Esos sitios de restricción son preferiblemente sitios únicos dentro del gen de proteína para facilitar el reemplazo del segmento de gen. Sin embargo, cualquier sitio de restricción conveniente que no sea demasiado redundante en el gen de proteasa se puede usar, siempre que los fragmentos de gen generados por digestión de restricción puedan ser reensamblados en secuencia apropiada. Si los sitios de restricción no - están presentes en lugares dentro de una distancia conveniente desde el punto seleccionado (de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 nucleótidos) , esos sitios son generados al sustituir nucleótidos en el gen de tal manera que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados son cambiados en la construcción final. La mutación del gene a fin de cambiar su secuencia para conformarse a la secuencia deseada se logra por extensión de cebador de acuerdo con métodos generalmente conocidos. La tarea de localizar regiones de flanqueo adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llevar a dos secuencias de sitio de restricción convenientes se hace rutina por la redundancia del código genético, un mapa de enzima de restricción del gen y el número grande de diferentes enzimas de restricción. Nótese que si un sitio de restricción de flanqueo conveniente está disponible, el método anterior se necesita usar sólo en conexión con la región de flanqueo que no contiene un sitio. Una vez que el ADN que ocurre naturalmente y/o ADN sintético es clonado, los sitios de restricción que flanquean las posiciones que han de ser mutadas son digeridas con las enzimas de restricción cognadas y una pluralidad de casetes de oligonucleótido de extremo terminal complementario son ligados en el gen. La mutagénesis es simplificada por este método porque todos los oligonucleótidos pueden ser sintetizados para tener los mismos sitios de restricción, y no son necesarios enlazadores sintéticos para crear los sitios de restricción.

Como se usa en la presente, "correspondiente a", se refiere a un residuo en la posición enumerada en una proteína o péptido, o un residuo que es análogo, homólogo o equivalente a un residuo enumerado en una proteína o péptido. Como se usa en la presente, "región correspondiente", generalmente se refiere a una posición análoga a lo largo de proteínas relacionadas o una proteína de referencia.

Los términos "molécula de ácido nucleico que codifica", "secuencia de ácido nucleico que codifica", "secuencia de ADN que codifica" y "ADN que codifica" se refieren al orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico . El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de aminoácidos a lo largo de la cadena de polipéptido (proteína) . La secuencia de ADN por lo tanto codifica para la secuencia de aminoácidos.

Como se usa en la presente, proteínas de "tipo silvestre" y "nativas" son aquellas encontradas en la naturaleza. Los términos "secuencia de tipo silvestre" y "gen de tipo silvestre" se usan indistintamente en la presente, para referirse a una secuencia que es nativa o que ocurre naturalmente en una célula hospedera. En algunas modalidades, la secuencia de tipo silvestre se refiere a una secuencia de interés que es el punto de partida de un proyecto de ingeniería de proteína. Los genes que codifican la proteína que ocurre naturalmente se pueden obtener de acuerdo con los métodos generales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos generalmente comprenden sintetizar sondas marcadas que tienen secuencias putativas que codifican regiones de la proteína de interés, preparar bibliotecas genómicas de organismos que expresan la proteína, y determinar selectivamente las bibliotecas para el gen de interés por hibridización a las sondas. Los clones que hibridan positivamente son después mapeados y secuenciados .

El término "molécula de ADN recombinante" , como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ADN que está compuesta de segmentos de ADN unidos entre sí por medio de técnicas de biología molecular. El término "oligonucleótido recombinante" se refiere a un oligonucleótido creado mediante el uso de manipulaciones biológicas moleculares, que incluyen pero no se limitan a, la ligación de dos o más secuencias de oligonucleótidos generadas por digestión con enzima de restricción de una secuencia de polinucleótido, la síntesis de oligonucleótidos (v.gr., la síntesis de cebadores u oligonucleótidos) y similares.

Como se usa en la presente, "residuos equivalentes" se refiere a proteínas que comparten residuos de aminoácidos particulares. Por ejemplo, los residuos equivalentes pueden ser identificados al determinar la homología al nivel de estructura terciaria para una proteína (v.gr., proteasa) cuya estructura terciaria ha sido determinada por cristalografía de rayos x. Los residuos equivalentes se definen como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de cadena principal de un residuo de aminoácido particular de la proteína que tiene residuos equivalentes putativos y la proteína de interés están dentro de aproximadamente 0.13 nm y preferiblemente aproximadamente 0.1 nm después de alineación. La alineación se logra después de que el mejor modelo ha sido orientado y ubicado para dar el traslape máximo de coordenadas atómicas de átomos de proteína que no son hidrógeno de las proteínas analizadas. El modelo preferido es el modelo cristalográfico que da el factor más bajo para datos de difracción experimentales en la resolución más alta disponible, determinados mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica de cristalografía y caracterización/análisis de proteína.

El término "elemento regulador", como se usa en la presente, se refiere a un elemento genético que controla algún aspecto de la expresión de secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador que facilita el inicio de transcripción de una región codificante operablemente enlazada. Los elementos reguladores adicionales incluyen señales de corte y empalme, señales de poliadenilación y señales de terminación.

Como se usa en la presente, "célula hospederas" son generalmente hospederos procarióticos o eucarióticos que son transformados o transfectados con vectores construidos mediante el uso de técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Las células hospederas transformadas son capaces ya sea de replicar vectores que codifican la variante de proteína o que expresan la variante de proteína deseada. En el caso de vectores que codifican la pre- o prepro-forma de la variante de proteína, esa variante, cuando se expresa, es típicamente secretada de la célula hospedera en el medio de la célula hospedera.

El término "introducido", en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa transformación, transducción o transfección . Los medios de transformación incluyen, pero no se limitan, a algunos de los métodos adecuados conocidos en la técnica, tales como transformación de protoplasto, precipitación de cloruro de calcio, electroporación, ADN desnudo y similares, como se conoce en la técnica. (Véase, v.gr. , Chang y Cohén, Mol Gen Genet, 168: 111-115, 1979; Smith et al., Appl Env Microbiol, 51:634, 1986; y Ferrari et al, en Harwood, Bacillus. Plenum Publishing Corporation, pp. 57-72, 1989).

El término "promotor/incrementador" denota un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proveer tanto función de promotor como de incrementador. El incrementador/promotor puede ser "endógeno" o "exógeno" o "heterólogo" . Un incrementador/promotor endógeno es uno que está naturalmente enlazado con un gen dado en el genoma. Un incrementador/promotor exógeno (heterólogo) es uno que es colocado en yuxtaposición a un gen por medio de manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular) .

La presencia de "señales de corte y empalme" en un vector de expresión a menudo da por resultado niveles de expresión más altos del transcrito recombinante . Las señales de corte y empalme mediante la remoción de intrones del transcrito de ARN primario y consiste de un sitio donador y aceptor de corte y empalme (véase, v.gr., Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p . 16.7-16.8, 1989).

El término "transfección estable" o "establemente transfectado" se refiere a la introducción e integración de ADN extraño en el genoma de la célula transfectada . El término "transfectante estable" se refiere a una célula que tiene ADN extraño o exógeno establemente integrado en el ADN genómico de la célula transíectada .

Los términos "marcador seleccionable" o "producto de gen seleccionable", como se usa en la presente, se refieren al uso de un gen que codifica una actividad enzimática que confiere resistencia a un antibiótico o fármaco sobre la célula en la cual el marcador seleccionable es expresado.

Como se usan en la presente, los términos "amplificación" y "amplificación de gen" se refieren a un proceso por el cual las secuencias de ADN específicas son desproporcionadamente replicadas de tal manera que el gen amplificado se hace presente en un número de copia más alto del que estaba inicialmente presente en el genoma . En algunas modalidades, la selección de células por crecimiento en presencia de un fármaco (v.gr. , un inhibidor de una enzima inhibible) da por resultado la amplificación ya sea de un gen endógeno que codifica el producto de gen requerido para crecer en presencia de fármaco o por amplificación de secuencias exógenas (es decir, de entrada) que codifican este producto de gen, o ambos. La selección de células por crecimiento en presencia de un fármaco (v.gr., un inhibidor de una inhibible) puede dar por resultado la amplificación ya sea de un gen endógeno que codifica el producto de gen requerido para crecer en presencia de fármaco o por amplificación de secuencias exógenas (es decir, de entrada) que codifican este producto de gen, o ambos.

"Amplificación" es un caso especial de replicación de ácido nucleico que implica especificidad de plantilla. Se ha de contrastar con replicación de plantilla no específica (es decir, replicación que es dependiente de la plantilla pero no dependiente de una plantilla específica) . La especificidad de plantilla aquí se distingue de fidelidad de replicación (es decir, síntesis de la secuencia de polinucleótidos apropiada) y especificidad del nucleótido (ribo- o desoxirribo- ) . La especificidad de plantilla se describe frecuentemente en términos de especificidad "objetivo". Secuencias objetivo son "objetivos" en el sentido de que han de ser buscadas para ser distribuidas de otro ácido nucleico. Las técnicas de amplificación han sido diseñadas principalmente para esta distribución.

Como se usa en la presente, los términos "marcador amplificable" , "gen amplificable" y "vector de amplificación" se refieren a un marcador, gen o un vector que codifica un gen que permite la amplificación de ese gen bajo condiciones de crecimiento apropiadas.

Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico amplificable" se refiere a ácidos nucleicos que pueden ser amplificados por cualquier método de amplificación. Cabe contemplar que "ácido nucleico amplificable" usualmente comprenderá "plantilla de la muestra" .

Como se usa en la presente, el término "plantilla de la muestra" se refiere a ácido nucleico que se origina de una muestra que es analizada para la presencia de "objetivo" (definido más adelante) . Por el contrario, "plantilla de fondo" se usa en referencia a ácido nucleico distinta de plantilla de la muestra que puede o no estar presente en una muestra. La plantilla de fondo es muy frecuentemente inadvertida. Puede ser el resultado de sobrante, o se puede deber a la presencia de ácidos nucleicos contaminantes que se busca que sean purificados de la muestra. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de organismos distintos de aquellos que han de ser detectados pueden estar presentes como fondo en una muestra de prueba.

Como se usa en la presente, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea que ocurra naturalmente como en una digestión por restricción purificada o producida sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico es inducido (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados) . El cebador es preferiblemente de cadena sencilla para eficiencia máxima en amplificación, pero alternativamente puede ser de doble cadena. Si es de doble cadena, el cebador primero es tratado para separar sus cadenas antes de ser usado para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido . El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependen de muchos factores, que incluyen temperatura, fuente de cebador y el uso del método.

Como se usa en la presente, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos) , ya sea que ocurra naturalmente como en una digestión por restricción purificada o producida sintéticamente, recombinantemente o por amplificación por PCR, que es capaz de hibridar a otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invención será marcada con cualquier "molécula reportera", de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección, que incluye, pero no se limita a enzima (v.gr. , ELISA, así como pruebas histoquímicas basadas en enzimas) , sistemas fluorescentes, radioactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención esté limitada a algún sistema o etiqueta de detección particular.

Como se usa en la presente, el término "objetivo", cuando se usa en referencia a métodos de amplificación (v.gr. , la reacción en cadena de polimerasa) , se refiere a la región de ácido nucleico unida por los cebadores usados para reacción en cadena de polimerasa. Por lo tanto, se busca que el "objetivo" sea distribuido desde otras secuencias de ácido nucleico. Un "segmento" se define como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia objetivo.

Como se usa en la presente, los términos " reacción en cadena de polimerasa" y "PCR" se refieren a los métodos de las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,965,188, que incluyen métodos para incrementar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "reactivos de amplificación" se refiere a aquellos reactivos (trifosfatos de desoxirribonucleótido, reguladores de pH, etc.), necesarios para amplificación excepto para cebadores, plantilla de ácido nucleico y la enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción son colocados y contenidos en un recipiente de reacción (tubo de ensayo, micropozos, etc.).

Como se usa en la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales porta ADN de doble cadena en o cerca de una secuencia de nucleótido específica .

Como se usa en la presente, el término "composición de limpieza" se refiere a cualquier composición que encuentra uso en aplicaciones de limpieza. Se pretende que el término abarque (a menos que se indique otra cosa) , agentes de lavado para todos propósitos o de "trabajo pesado" granulados o en polvo (v.gr., detergentes para lavandería), agentes de lavado para todos propósitos líquidos, en gel, o en pasta (v.gr., detergentes de "líquidos de trabajo pesado"), detergentes para telas finas líquidos y en polvo, agentes para lavado manual de vajillas, agentes para lavado de vajillas de trabajo ligero (v.gr., detergentes de alta espumación) , agentes para lavado de vajillas en lavadora de vajillas (es decir, "detergentes para lavado automático de vajilla") que incluyen tableta, gránulos, líquidos, detergentes líquidos, detergentes con auxiliares de enjuague para uso doméstico y uso institucional, agentes de limpieza y desinfección líquidos (v.gr., jabones antibacterianos para manos), barras para lavandería, enjuagues bucales, limpiadores de dentaduras, champú para automóviles, champú para alfombras, limpiadores de baño, champú para el cabello para humanos y otros animales, enjuagues para el cabello para humanos y otros animales, geles para baño con regadera, geles para baño, baños de espuma y limpiadores de metal, y auxiliares de limpieza (v.gr., aditivos blanqueadores, aditivos para lavandería, composiciones de pre-tratamiento, que incluyen "lápiz quitamanchas" y otros formatos de pre-tratamiento) .

Como se usa en la presente, los términos "composición detergente" y "formulación detergente" se usan en referencia a mezclas que están diseñadas para usarse en un medio de lavado para limpieza de objetos sucios. En modalidades preferidas, el término se usa en referencia a detergentes usados para limpieza de ropa, vajilla, cubertería, etc. (v.gr., "detergentes para lavado de vajilla"). No se pretende que la presente invención esté limitada alguna formulación o composición detergente particular. De hecho, se pretende que además de detergentes que contienen por lo menos una proteasa de la presente invención, el término abarque detergentes que contienen agentes tensioactivos , transferasa (s) , enzimas hidrolíticas , óxido reductasas, mej oradores de detergencia, agentes blanqueadores, activadores de blanqueado, agentes blanqueadores y abrillantadores y colorantes fluorescentes, inhibidores de formación de torta, agentes cubridores, activadores de enzimas, antioxidantes y solubilizantes .

Como se usa en la presente, "composición para lavado de vajilla" se refiere a todas las formas de composiciones para limpiar vajilla, que incluyen cubertería, que incluyen pero no se limitan a formas de polvo, tableta, geles, granuladas y líquidas. Cabe entender que la presente invención está limitada a cualquier tipo particular de composición de limpieza de vajilla. De hecho, la presente invención encuentra uso en limpieza de vajilla (v.gr., vajillas, que incluyen, pero no se limitan a platos, tazas, vasos, tazones, etc.) y cubertería (v.gr., utensilios que, incluyen pero no se limitan a cucharas, cuchillos, tenedores, utensilios de servicio, etc.) de cualquier material, que incluye pero no se limita a cerámicas, plásticos, metales, porcelana, vidrio, acrílicos, etc. El término "vajilla" se usa en la presente en referencia tanto a vajilla como cubertería .

El término "condiciones de lavado relevantes" se usa en la presente para indicar las condiciones, particularmente temperatura de lavado, tiempo, mecánica de lavado, concentración de espuma, tipo de detergente y dureza del agua, realmente usadas en el hogar en un segmento de mercado de detergente para lavado de vajilla o de telas.

El término "rendimiento de lavado mejorado" se usa para indicar que un mejor resultado final se obtiene en remoción de manchas de vajilla, cubertería o telas bajo condiciones de lavado relevantes, o que menos proteasa mutante, sobre una base de peso, es necesaria para obtener el mismo resultado final en relación con la enzima de tipo silvestre correspondiente.

El término "rendimiento de lavado retenido" se usa para indicar que el rendimiento de lavado de una enzima proteasa mutante, sobre una base de peso, es por lo menos aproximadamente 80% en relación con la enzima de tipo silvestre correspondiente bajo condiciones de lavado relevantes .

El rendimiento de lavado de las proteasas es convenientemente medido por su capacidad para remover ciertas manchas representativas bajo condiciones de prueba apropiadas. En estos sistemas de prueba, otros factores relevantes, tales como composición detergente, concentración de espuma, dureza del agua, mecánica de lavado, tiempo, pH, y/o temperatura, pueden ser controlados de tal manera que las condiciones típicas para aplicación doméstica en un cierto segmento de mercado (v.gr., lavado de vajilla, limpieza de telas, etc.) son imitadas. El sistema de prueba de aplicación en laboratorio descrito en la presente es representativo para aplicación doméstica cuando se usa en enzimas proteolíticas modificadas a través de mutagénesis de ADN. Por lo tanto, los métodos provistos en la presente facilitan la prueba de grandes cantidades de diferentes enzimas y la selección de aquellas enzimas que son particularmente adecuadas para un tipo específico de aplicación a detergentes. De esta manera enzimas "hechas en forma personalizada" para condiciones de aplicación específica son fácilmente seleccionadas.

El término "actividad de limpieza" se refiere al rendimiento de limpieza logrado por la proteasa bajo condiciones que prevalecen durante el proceso proteolítico, hidrolizante , de limpieza u otro proceso de la invención. En algunas modalidades, el rendimiento de limpieza se determina por la aplicación de varias pruebas de limpieza relacionadas con manchas sensibles a la enzima, por ejemplo, pasto, sangre, leche o proteína de huevo como se determina por varias metodologías cromatográficas , espectrofotométricas , u otras metodologías cuantitativas después de someter las manchas a condiciones de lavado estándares. Pruebas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a aquellas descritas en O 99/34011, y la patente de E.U.A. 6,605,458 (ambas de las cuales son incorporadas aquí por referencia) , así como aquellos métodos incluidos en los ejemplos.

El término "cantidad efectiva de limpieza" de una proteasa se refiere a la cantidad de proteasa descrita anteriormente que logra un nivel deseado de actividad enzimática en una composición de limpieza específica. Esas cantidades específicas son fácilmente logradas por un experto en la técnica y se basan en muchos factores, tales como la proteasa particular usada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición de limpieza y si se requiere una composición líquida o seca (v.gr., granulada, en barras) , etc .

El término "materiales auxiliares de limpieza" , como se usa en la presente, significa cualquier material líquido, sólido o gaseoso seleccionado para el tipo particular de composición de limpieza deseada y la forma del producto (v.gr., composición líquida, granulada, en polvo, en barra, pasta, aspersión, tableta, gel; o de espuma), esos materiales también son preferiblemente compatibles con la enzima proteasa usada en la composición. En algunas modalidades, las composiciones granuladas están en forma "compacta", mientras que en otras modalidades, las composiciones líquidas están en una forma "concentrada" .

Como se usa en la presente, un sistema de "concentración de detergente baja" incluye detergentes en donde menos de aproximadamente 800 ppm de componentes de detergente están presentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses son típicamente considerados sistemas de concentración de detergente baja, ya que usualmente tienen aproximadamente 667 ppm de componentes de detergente presentes en el agua de lavado.

Como se usa en la presente, un sistema de "concentración de detergente media" incluye detergentes en donde entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de componentes de detergente están presentes en el agua de lavado. Los detergentes norteamericanos son generalmente considerados sistemas de concentración de detergente media ya que usualmente aproximadamente 975 ppm de componentes de detergente están presentes en el agua de lavado. Los detergentes brasileños típicamente tienen aproximadamente 1500 ppm de componentes de detergente presentes en el agua de lavado .

Como se usa en la presente, sistema de "concentración de detergente alta" incluye detergentes en donde más de aproximadamente 2000 ppm de componentes de detergente están presentes en el agua de lavado. Los detergentes europeos generalmente se consideran sistemas de concentración de detergente alta ya que tienen aproximadamente 3000-8000 ppm de componentes de detergente en el agua de lavado.

Como se usa en la presente, "composiciones de limpieza de telas", "composición de limpieza de lavandería", y "detergentes para lavandería" se refieren a composición para limpiar ropa y/o tela sucias. Se pretende que cualquier forma, que incluye formas de polvo, tableta, gel, granulada y líquida sean abarcadas por la presente invención. Cabe entender que la presente invención está limitada a cualquier tipo particular de ropa y/o tela. Estos términos abarcan composiciones detergentes para lavandería para lavado a mano o a máquina que incluyen composiciones aditivas para lavandería y composiciones adecuadas para usarse en el remojo y/o pretratamiento de telas con manchas (v.gr., ropa, ropa de cama, baño y mantelería y otros materiales textiles) .

Como se usa en la presente, "composiciones de limpieza de artículos que no son tela" incluyen composiciones de limpieza de superficie que no son textiles, que incluyen pero no se limitan a composiciones detergentes para lavado de vajilla, composiciones de limpieza oral, composiciones de limpieza para dentaduras, y composiciones para limpieza personal.

Como se usa en la presente, el término "desinfección" se refiere a la remoción de contaminantes de las superficies, así como la inhibición o muerte de microbios sobre las superficies de artículos. Cabe entender que la presente invención se limita a cualquier superficie particular, artículo o contaminante (s) o microbios que han de ser removidos .

Como se usa en la presente, el término "subtilisina" se refiere a cualquier miembro de la familia de serina proteasa S8 como se describe en MEROPS - The Peptidase Data base (Rawlings et al., MEROPS: the peptidase datábase, Nucí Acids Res, 34 Datábase issue, D270-272, 2006) .

Cepas hospederas adecuadas para la producción de la variante de proteasa provistas en la presente incluyen microorganismos transformables en los cuales se puede lograr la expresión de la proteasa. Específicamente, las cepas hospederas de la misma especie o género del cual se deriva la proteasa, son adecuadas, tales como una cepa de Bacillus, preferiblemente una cepa de Bacillus alcalofílica y muy preferiblemente Bacillus nov. spec. PB92 o un imitante del mismo, que tiene sustancialmente las mismas propiedades. También, las cepas de B . subtilis, B. licheniformis y B . amyloliquefaciens están entre las cepas preferidas. Otras cepas hospederas adecuadas y preferidas incluyen aquellas cepas que son sustancialmente incapaces de producir enzimas proteolíticas extracelulares antes de la transformación con un gen mutante. De particular interés son cepas hospederas de Bacillus deficientes en proteasa, tales como un derivado deficiente en proteasa de Bacillus nov. spec. PB92. La expresión de las proteasas se obtiene mediante el uso de señales de expresión que funcionan en el organismo hospedero seleccionado. Las señales de expresión incluyen secuencias de ADN que regulan la transcripción y traducción de los genes de proteasa. Los vectores apropiados son capaces de replicarse en números de copia suficientemente altos en la cepa hospedera de elección o permiten el mantenimiento estable del gen de proteasa en la cepa hospedera por integración cromosómica .

La variante de enzima proteolítica (es decir, proteasa variante) de conformidad con la invención se prepara al cultivar, bajo condiciones de fermentación apropiadas, una cepa hospedera transformada que comprende el gen o genes proteolíticos mutantes deseados, y al recuperar las enzimas producidas. Preferiblemente, la proteasa que es expresada es secretada en el medio de cultivo, que facilita su recuperación, o en el caso de cepas hospederas de bacterias gram negativas en el espacio periplásmico . Para secreción, se utiliza una secuencia de señal de amino terminal adecuada, preferiblemente la secuencia de señal codificada por el gen original si éste es funcional en la cepa hospedera de elección .

En algunas modalidades, varias sustituciones se combinan, a fin de incrementar la estabilidad y/o rendimiento de una subtilisina en composiciones detergentes. Por lo tanto, la presente invención provee la siguiente variante de proteasa que provee rendimiento de lavado mejorado (v.gr., variante PB 92 que tiene N76D+N87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+ S188D+N248R; con el uso de numeración de BP 1 ; "PX3" ) . Esta variante es referida aquí como una "variante de proteasa de subtilisina" "proteasa mutante" , "proteasa variante", "variante de proteasa", "proteasa de Bacillus sp." , "variante de subtilisina de Bacillus sp." y "variante de proteasa mutante" . La secuencia de aminoácidos de esta variante es expuesta en SEQ ID NO : 5.

Por consiguiente, la presente invención provee esta variante de subtilisina, adecuada para usarse en composición (es) detergentes y/o en procedimiento (s) de lavado. Cabe entender que posiciones homologas a posiciones de aminoácidos de la subtilisina referente PB92 (y numerada de conformidad con una alineación con BPN' ) caerá bajo el alcance de las reivindicaciones.

Composiciones de Limpieza A menos que se indique de otra manera, todos los niveles de componente o composición provistos aquí se hacen en referencia al nivel activo de ese componente o composición, y son exclusivos de impurezas, por ejemplo, solventes residuales o subproductos, que pueden estar presentes en fuentes comercialmente disponibles. Los pesos de los componentes de enzima se basan en proteína activa total. Todos los porcentajes y relaciones se calculan en peso a menos que se indique otra cosa. Todos los porcentajes y relaciones se calculan con base en la composición total a menos que se indique otra cosa. En las composiciones detergentes ejemplificadas, los niveles de enzimas se expresan por enzima pura en peso de la composición total y a menos que se especifique otra cosa, los ingredientes de detergente se expresan en peso de las composiciones totales.

Como se indica en la presente, en algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden materiales auxiliares que incluyen, pero no se limitan a, agentes tensioactivos , mejoradores de detergencia, blanqueadores, activadores de blanqueado, catalizadores de blanqueado, otras enzimas, sistemas estabilizadores de enzima, quelantes, abrillantadores ópticos, polímeros de liberación de suciedad, agentes de transferencia de colorante, dispersantes, supresores de espumas, tintes, perfumes, colorantes, sales llenadoras, hidrotropos, fotoactivadores , fluorescentes, acondicionadores de telas, agentes tensioactivos hidrolizables , conservadores, antioxidantes, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, germicidas, fungicidas, motas de colores, cuidado de la plata, agentes antiherrumbre y/o anticorrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes , vehículos, auxiliares de procesamiento, pigmentos y agentes de control de pH (véase v.gr., patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101, todas las cuales se incorporan aquí por referencia) . Modalidades de materiales de composición de limpieza específicos se ilustran con detalle más adelante. En modalidades en las cuales los materiales auxiliares de limpieza no son compatibles con las proteasas variantes de la presente invención en las composiciones de limpieza, entonces se usan métodos adecuados para mantener los materiales auxiliares de limpieza y las proteasas separadas (es decir, no en contacto unas con otras) hasta que la combinación de los dos componentes es apropiada. Esos métodos de separación incluyen cualquier método adecuado conocido en la técnica (v.gr. , cápsulas de gelatina, encapsulación, tableta, separación física etc.).

La variante de serina proteasa de la presente invención es útil en la formulación de varias composiciones detergentes. La composición de limpieza de la presente invención se puede utilizar ventajosamente, por ejemplo, en aplicaciones de lavandería, limpieza de superficies duras, aplicaciones de lavado automático de vajilla, así como aplicaciones cosméticas tales como dentaduras, dientes, cabello y piel . La proteasa variante de la presente invención encuentra uso en composiciones granuladas, polvo, gel y líquidas .

La variante de proteasa de la presente invención también encuentra uso en productos aditivos de limpieza. Un producto aditivo de limpieza que incluye la proteasa variante de la presente invención es idealmente adecuado para incluirse en un procedimiento de lavado cuando se desea efectividad de blanqueado adicional. Esos casos incluyen, pero no se limitan a aplicaciones de limpieza de solución a baja temperatura. El producto aditivo puede ser, en su forma más simple, la variante de proteasa como se provee por la presente invención. En algunas modalidades, el aditivo es empacado en forma de dosis para la adición a un procedimiento de limpieza en donde se utiliza una fuente de peroxígeno y se desea efectividad de blanqueado incrementada. En algunas modalidades, la forma de dosis individual comprende una pildora, tableta, cápsula de gel u otra unidad de dosis individual que incluye polvos y/o líquidos pre-medidos. En algunas modalidades, el material (es) de llenador y/o de vehículo se incluye, a fin de incrementar el volumen de esa composición. Los materiales de llenador o vehículo adecuados incluyen, pero no se limitan a, varias sales de sulfato, carbonato y silicato así como talco, arcilla y similares. En algunas modalidades, los materiales de llenador y/o vehículo para composiciones líquidas incluyen agua o alcoholes primarios y secundarios de peso molecular bajo que incluyen polioles y dioles. Ejemplos de esos alcoholes incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, propanol, e isopropanol . En algunas modalidades, las composiciones contienen de aproximadamente 5% a aproximadamente 90% de esos materiales. En modalidades adicionales, los llenadores ácidos se usan para reducir el pH de la composición. En algunas modalidades alternativas el aditivo de limpieza incluye por lo menos una fuente de peroxígeno activada como se describe más adelante y/o ingredientes auxiliares como se describe en forma más completa más adelante.

Las composiciones de limpieza y aditivos de limpieza de la presente invención requieren una cantidad efectiva de enzima serina proteasa como se provee en la presente invención. En algunas modalidades, el nivel requerido de enzima se logra mediante la adición de la variante de serina proteasa provista por la presente invención. Típicamente, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden por lo menos 0.0001 por ciento en peso, de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1, o incluso de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 por ciento en peso de por lo menos una serina proteasa provista por la presente invención .

En algunas modalidades preferidas, las composiciones de limpieza provistas aquí son típicamente formuladas de tal manera que, durante el uso en operaciones de limpieza acuosas, el agua de lavado tiene un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5, o en modalidades alternativas, incluso de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 10.5. En algunas modalidades preferidas, las formulaciones de producto líquido son típicamente formuladas para tener un pH neto de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 9.0, mientras que en algunas modalidades alternativas la formulación tiene un pH neto de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. En algunas modalidades preferidas, los productos de lavandería granulados son típicamente formulados para tener un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 11. Las técnicas para controlar el pH a niveles de uso recomendados incluyen el uso de reguladores de pH, álcalis, ácidos, etc., y son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas modalidades particularmente preferidas, cuando la variante de proteasa se utiliza en una composición granulada o líquida, la proteasa variante está en forma de una partícula encapsulada para proteger a la enzima de otros componentes de la composición granulada durante el almacenamiento. Además, la encapsulacion es también un medio para controlar la disponibilidad de la serina proteasa durante el procedimiento de limpieza y puede incrementar el rendimiento de la serina proteasa. Se contempla que la serina proteasa encapsulada de la presente invención encontrará uso en varios ambientes. También se contempla que la serina proteasa puede ser encapsulada mediante el uso de cualquier material (es) y método (s) de encapsulacion adecuados conocidos en la técnica.

En algunas modalidades preferidas, el material de encapsulacion típicamente encapsula por lo menos parte del catalizador de serina proteasa. En algunas modalidades, el material encapsulador es soluble en agua y/o dispersable en agua. En algunas modalidades, el material encapsulador tiene una temperatura de transición de vidrio de 0°C o más alta (véase, v.gr., WO 97/11151, particularmente de la página 6, línea 25 a la página 7, línea 2, para más información referente a temperaturas de transición de vidrio) .

En algunas modalidades, el material encapsulador se selecciona del grupo que consiste de carbohidratos, gomas naturales o sintéticas, quitina, quitosán, celulosa y derivados de celulosa, silicatos, fosfatos, boratos, alcohol polivinílico, polietilenglicol , ceras de parafina y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades en las cuales el material encapsulador es un carbohidrato, se selecciona del grupo que consiste de monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades preferidas, el material encapsulador es un almidón (véase, v.gr., EP 0 922 499; y patentes de E.U.A. Nos. 4,977,252, 5,354,559, 5,935,826, para descripciones de algunos almidones adecuados ilustrativos) .

En modalidades adicionales, el material encapsulador comprende una microesfera hecha de plástico (v.gr., termoplásticos , acrilonitrilo, metaacrilonitrilo, poliacrilonitrilo, polimetaacrilonitrilo y mezclas de los mismos; las microesferas comercialmente disponibles que encuentran uso incluyen, pero no se limitan a EXPANCEL® (Casco Products, Stockholm, Suecia) , PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES® , y Q-CEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA) , LUXSIL® y SPHERICELl® (Potters Industries, Inc., Carlstadt, NJ y Valley Forge, PA) .

Como se describe en la presente, en algunas modalidades, la proteasa variante de la presente invención encuentra uso en detergentes para lavandería. Estas aplicaciones ponen a las enzimas bajo varios estreses ambientales. La proteasa variante de la presente invención proveen ventajas sobre muchas enzimas actualmente usadas, debido a su estabilidad bajo varias condiciones.

De hecho, hay una variedad de condiciones de lavado que incluyen formulaciones detergentes variables, volúmenes de agua de lavado, temperaturas de agua de lavado y longitudes de tiempo de lavado, a las cuales se exponen las proteasas involucradas en el lavado. Además, las formulaciones detergentes usadas en diferentes áreas geográficas tienen diferentes concentraciones de sus componentes pertinentes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, un detergente europeo típicamente tiene aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado, mientras que un detergente japonés típicamente tiene aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. En Norteamérica, particularmente en los Estados Unidos, los detergentes típicamente tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Un sistema de concentración de detergente bajo incluye detergentes en donde menos de aproximadamente 800 ppm de componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses típicamente se consideran con un sistema de concentración de detergente baja ya que tienen aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Una concentración de detergente media incluye detergentes en donde entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes Norteamericanos generalmente se considera que son sistemas de concentración de detergente media ya que tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Los detergentes brasileños típicamente tienen aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Un sistema de concentración de detergente alta incluye detergentes en donde más de aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes europeos generalmente se considera que son sistemas de concentración de detergente alta ya que tienen aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.

En Latinoamérica los detergentes son generalmente detergentes con mej orador de detergencia de fosfato de alta espumación y el intervalo de detergentes usados en Latinoamérica puede caer en las concentraciones de detergentes media y alta ya que varían de 1500 ppm a 6000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Como se mencionó antes, los detergentes brasileños típicamente tienen aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras geografías con detergente con mejorador de detergencia de fosfato de alta espumación, no limitadas a otros países de Latinoamérica, pueden tener sistemas de concentración de detergente alta de hasta aproximadamente 6000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

A la luz de lo anterior, es evidente que concentraciones de composiciones detergentes en soluciones de lavado típicas en todo el mundo varían de menos de aproximadamente 800 ppm de composición detergente ("geografías de concentración de detergente bajas"), por ejemplo aproximadamente 667 ppm en Japón, a entre aproximadamente 800 ppm a aproximadamente 2000 ppm ("geografías de concentración de detergente medias"), por ejemplo aproximadamente 975 ppm en los Estados Unidos y aproximadamente 1500 ppm en Brasil, a más de aproximadamente 2000 ppm ("geografías de concentración de detergente altas") , por ejemplo aproximadamente 4500 ppm a aproximadamente 5000 ppm en Europa y aproximadamente 6000 ppm en geografías con mejorador de detergencia de fosfato de alta espumacion.

Las concentraciones de las soluciones de lavado típicas se determinan empíricamente. Por ejemplo, en los Estados Unidos, una máquina lavadora típica contiene un volumen de aproximadamente 64.4 L de solución de lavado. Por consiguiente, a fin de obtener una concentración de aproximadamente 975 ppm de detergente dentro de la solución de lavado aproximadamente 62.79 g de composición detergente se debe al medir a 64.4 L de solución de lavado. Esta cantidad es la cantidad típica medida en el agua de lavado por el consumidor mediante el uso de la tasa medidora provista con el detergente.

Como un ejemplo adicional, diferentes geografías usan diferentes temperaturas de lavado. La temperatura del agua de lavado en Japón es típicamente menos que aquella usada en Europa. Por ejemplo, la temperatura del agua de lavado en Norteamérica y Japón es típicamente entre 10 y 30°C (v.gr. , aproximadamente 20°C) , mientras que la temperatura del agua de lavado en Europa es típicamente entre 30 y 60 °C (v.gr., aproximadamente 40°C) . Además, en algunas regiones adicionales, típicamente se usa agua fría para lavandería, así como aplicaciones de lavado de vajilla. En algunas modalidades, el "lavado con agua fría" de la presente invención utiliza lavado a temperaturas de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 40°C, o de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30°C, o de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 25 °C, así como todas las demás combinaciones dentro del intervalo de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 35°C, y todos los intervalos dentro de 10°C a 40°C.

Como un ejemplo adicional, diferentes geografías típicamente tienen diferentes durezas de agua. La dureza del agua se describe usualmente en términos de gramos por litro de Ca2+/Mg2+ mixto . La dureza es una medición de la cantidad de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) en el agua. La mayor parte del agua en los Estados Unidos es dura, pero el grado de dureza varía. El agua moderadamente dura (60-120 ppm) a dura (121-181 ppm) tiene 60 a 181 partes por millón (partes por millón convertidas a granos por galón es ppm # dividido entre 17.1 es igual a granos por galón) de minerales de dureza.

La dureza del agua en Europa es típicamente mayor que 179.55 (por ejemplo 179.55-342) gramos por litro de Ca2+/Mg2+ mixto (v.gr. , aproximadamente 256.5 gramos por litro de Ca2+/Mg2+ mixto) . La dureza del agua en Norteamérica es típicamente mayor que la dureza del agua japonesa, pero menor que la dureza del agua europea. Por ejemplo, la dureza del agua en Norteamérica puede ser entre 51.3 y 171 granos, 51.3-136.8 granos o aproximadamente 102.6 granos. La dureza del agua en Japón es típicamente menor que la dureza del agua en Norteamérica, usualmente menor que 68.4, por ejemplo, 51.3 gramos por litro de Ca2/+Mg2+ mixto.

Por consiguiente, en algunas modalidades, la presente invención provee proteasa variante que provee rendimiento de lavado sorprendente en por lo menos un conjunto de condiciones de lavado (v.gr., temperatura del agua, dureza del agua y/o concentración de detergentes) . En algunas modalidades, la proteasa variante de la presente invención es comparable en rendimiento de lavado con otras proteasas de subtilisina. En algunas modalidades, la proteasa variante de la presente invención presenta rendimientos de lavado incrementados en comparación con proteasas de subtilisina comercialmente disponibles en la actualidad. Por lo tanto, en algunas modalidades preferidas de la presente invención, la proteasa variante provista aquí presenta estabilidad oxidativa incrementada, estabilidad térmica incrementada y/o estabilidad a quelatadores incrementada. Además, la proteasa variante de la presente invención encuentra uso en composiciones de limpieza que no incluyen detergentes, nuevamente ya sea solas o en combinación con mejoradores de detergencia y estabilizadores.

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza comprenden la variante de proteasa de la presente invención a un nivel de aproximadamente 0.00001 % a aproximadamente 10% en peso de la composición y el resto (v.gr. , aproximadamente 99.999% a aproximadamente 90.0%) que comprende materiales auxiliares de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden la proteasa variante a un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% en peso de la composición y el resto de la composición de limpieza (v.gr., aproximadamente 99.9999% a aproximadamente 90.0%, aproximadamente 99.999% a aproximadamente 98%, aproximadamente 99.995% a aproximadamente 99.5% en peso) que comprende materiales auxiliares de limpieza.

Como se describe además en la presente, en algunas modalidades, las composiciones de limpieza preferidas comprenden una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas que proveen rendimiento de limpieza y/o beneficios de cuidado de telas, además de una o más de la variante de proteasa provista en la presente.

Procedimientos para Hacer y Usar Composiciones de Limpieza En algunas modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan por cualquier proceso escogido por el formulador (véase, v.gr., patentes de E.U.A. Nos. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, y 5,486,303, para algunos ejemplos no limitantes) . En algunas modalidades en las cuales se desea una composición de limpieza de pH bajo, el pH de la composición se ajusta mediante la adición de un material ácido tal como HCl .

Materiales Auxiliares Aunque no es esencial para los propósitos de la presente invención, en algunas modalidades, el listado no limitante de auxiliares descritos en la presente son adecuados para usarse en las composiciones de limpieza de la presente invención. De hecho, en algunas modalidades, los auxiliares son incorporados en las composiciones de limpieza de la presente invención. En algunas modalidades, los materiales auxiliares ayudan y/o incrementan el rendimiento de limpieza, tratan el sustrato que ha de ser limpiado, y/o modifican la estética de la composición de limpieza (v.gr., perfumes, colorantes, tintes, etc.) . Cabe entender que los auxiliares son además de la variante de serina proteasa de la presente invención. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales, y niveles de incorporación de los mismos, depende de la forma física de la composición y la naturaleza de la operación de limpieza para la cual se ha de usar. Los materiales auxiliares adecuados incluyen, pero no se limitan a agentes tensioactivos , mejoradores de detergencia, agentes quelatadores , agentes inhibidores de transferencia de colorante, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas adicionales y estabilizadores de enzima, materiales catalíticos, activadores de blanqueado, reforzadores de blanqueado, peróxido de hidrógeno, fuente de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados , agentes de dispersión polimérica, agentes de remoción/anti -redeposición de suciedad de arcilla, abrillantadores, supresores de espuma, colorantes, perfumes, agentes de elasticidad de estructura, suavizantes de telas, vehículos, hidrotropos, auxiliares de procesamiento y/o pigmentos. Además de aquellos ejemplos provistos explícitamente en la presente, ejemplos adicionales son conocidos en la técnica (véase, v.gr., patentes de E.U.A. Nos. 5,576,282, 6,306,812 y 6,326,348). En algunas modalidades, los ingredientes auxiliares antes mencionados constituyen el resto de las composiciones de limpieza de la presente invención.

Agentes Tensioactivos En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden por lo menos un agente tensioactivo o sistema de agente tensioactivo en donde el agente tensioactivo se selecciona de agentes tensioactivos no iónicos, agentes tensioactivos aniónicos, agentes tensioactivos catiónicos, agentes tensioactivos anfolíticos, agentes tensioactivos zwiteriónicos , agentes tensioactivos no iónicos semi-polares y mezclas de los mismos. En algunas modalidades de composición de limpieza de pH bajo (v.gr., composiciones que tienen un pH neto de aproximadamente 3 a aproximadamente 5) , la composición típicamente no contiene alquilsulfato etoxilado, ya que se cree que ese agente tensioactivo puede ser hidrolizado por el contenido ácido de las composiciones. En algunas modalidades, el agente tensioactivo está presente a un nivel de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 60%, mientras que en modalidades alternativas el nivel es de aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, mientras que en modalidades adicionales el nivel es de aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, en peso de la composición de limpieza.

Mej oradores de Detergencia En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden uno o más mejoradores de detergencia o sistemas mej oradores de detergencia. En algunas modalidades que incorporan por lo menos un mej orador de detergencia, las composiciones de limpieza comprenden por lo menos aproximadamente 1%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 60% o incluso de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% de mej orador de detergencia en peso de la composición de limpieza. Los mejoradores de detergencia incluyen, pero no se limitan a, las sales de metal alcalino, amonio y alcanolamonio de polifosfatos , silicatos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalino térreo y alcalino, aluminosilicatos , compuestos de policarboxilato, éter hidroxipolicarboxilatos , copolímeros de anhídrido maleico con etileno o éter vinilmetílico, ácido 1 , 3 , 5-trihidroxibencen-2 , 4 , 6 -trisulfónico, y ácido carboximetiloxisuccínico, las varias sales de metal alcalino, amonio y amonio sustituido de ácidos poliacéticos tales como ácido etilendiaminotetraacético y ácido nitrilotriacético, así como policarboxilatos tales como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido bencen-1 , 3 , 5 -tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico y sales solubles de los mismos. De hecho, se contempla que cualquier mej orador de detergencia adecuado encontrará uso en varias modalidades de la presente invención.

En algunas modalidades, los mejoradores de detergencia forman complejos de iones de dureza solubles en agua (v.gr., mejoradores de detergencia secuestrantes), tales como citratos y polifosfatos (v.gr., tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de sodio hexahidratado, tripolifosfato de potasio, y tripolifosfato mixto de sodio y potasio, etc.). Se contempla que cualquier mejorador de detergencia adecuado encontrará uso en la presente invención, que incluye aquellos conocidos en la técnica (Ver v.gr., EP 2 100 949) .

Agentes Quelatadores En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen por lo menos un agente quelatador. Los agentes quelatadores adecuados incluyen, pero no se limitan a agentes quelatadores de cobre, hierro y/o manganeso y mezclas de los mismos. En modalidades en las cuales por lo menos se usa un agente quelatador, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15% o incluso de aproximadamente 3.0% a aproximadamente 10% de agente quelatador en peso de la presente composición de limpieza.

Auxiliares de Deposición En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen por lo menos un auxiliar de deposición. Los auxiliares de deposición adecuados incluyen, pero no se limitan a polietilenglicol , polipropilenglicol, policarboxilato, polímeros de liberación de suciedad tales como ácido politereftálico, arcillas tales como caolinita, montmorillonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita y mezclas de las mismas.

Agentes Anti-redeposición Como se indica en la presente, los agentes anti-redeposición encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, agentes tensioactivos no iónicos encuentran uso. Por ejemplo, en modalidades de lavado automático de vajilla, los agentes tensioactivos no iónicos encuentran uso para propósitos de modificación de superficie, en particular para láminas, para evitar formación de películas y manchas y para mejorar el brillo. Estos agentes tensioactivos no iónicos también encuentran uso en la prevención de re-deposición de suciedades. En algunas modalidades preferidas, el agente anti-redeposición es un agente tensioactivo no iónico como se conoce en la técnica (véase, v.gr., EP 2 100 949).

Agentes Inhibidores de Transferencia de Colorante En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen uno o más agentes inhibidores de transferencia de colorante. Los agentes inhibidores de transferencia de colorante pol iméricos adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros de pol ivinilpirrolidona , polímeros N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vini lpirrol idona y N-vini 1 imidazol , pol ivini loxazol idonas y pol ivini 1 imidazol es o mezclas de los mismos. En modalidades en las cuales se usa por lo menos un agente inhibidor de transferencia de colorante, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5%, o incluso de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% en peso de la composición de limpieza .

Silicatos En algunas modalidades, los silicatos se incluyen dentro de las composiciones de la presente invención. En algunas de esas modalidades, encuentran uso los silicatos de sodio (v.gr., disilicato de sodio, metasilicato de sodio, y filosilicatos cristalinos). En algunas modalidades, los silicatos están presentes a un nivel de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20%. En algunas modalidades preferidas, los silicatos están presentes a un nivel de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% en peso de la composición.

Dispersantes En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen por lo menos un dispersante. Los materiales orgánicos solubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a los ácidos homo- o co- poliméricos o sus sales, en las cuales el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales carboxilo separados uno de otro por no más de dos átomos de carbono.

Enzimas En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden una o más enzimas detergentes adicionales, que proveen rendimiento de limpieza y/o cuidado de telas y/o beneficios de lavado de vajilla. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hemicelulasas , celulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, se usa una combinación de enzimas (es decir, un "cóctel") que comprende enzimas aplicables convencionales como proteasa, lipasa, cutinasa y/o celulasa junto con amilasa.

Cualquier otra proteasa adecuada encuentra uso en las composiciones de la presente invención. Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. En algunas modalidades particularmente preferidas, se usan las proteasas microbianas. En algunas modalidades, se incluyen mutantes químicamente o genéticamente modificados. En algunas modalidades, la proteasa es una serina proteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas incluyen sutilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus (v.gr., subtilisina, lentus, amyloliquefacients, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168) . Ejemplos adicionales incluyen aquellas proteasas mutantes descritas en las patentes de E.U.A. Nos. RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936 y 6,482,628, todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Ejemplos de proteasas adicionales incluyen, pero no se limitan a tripsina (v.gr., de origen porcino o bovino) , y proteasa de Fusarium descrita en O 89/06270. Las enzimas proteasa comercialmente disponibles preferidas incluyen MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEA ®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX®, PURAFAST™, y EXCELLASE™ (Genencor) ; ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, KANNASE®, POLARZYME®, LIQUA ASE®, OVOZYME€, NEUTRASEC, RELASE® y ESPERASE® (Novozymes) ; y BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Alemania. Varias proteasas se describen en 095/23221, WO 92/21760, y patentes de E.U.A. Nos. 5,801,039, 5,340,735, 5,500,364, 5,855,625, US RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936 y 6,482,628, y algunas otras patentes. En algunas modalidades adicionales, las metaloproteasas encuentran uso en la presente invención, que incluyen pero no se limitan a la metaloproteasa neutral descrita en WO 07/044993.

Además, cualquier lipasa adecuada encuentra uso en la presente invención. Las lipasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes químicamente o genéticamente modificados son abarcados por la presente invención. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola lanuginosa (véase, v.gr., EP 258 068, EP 305 216, y patente de E.U.A. No. 6,939,702), lipasa de Rhizomucor miehei (véase, v.gr., EP 238 023), lipasa de Candida, tales como lipasa de C. antárctica (v.gr., la C. antárctica lipasa A o B véase, v.gr., EP 214761), lipasa de Pseudomonas tal como lipasa de P. alcaligenes y P. pseudoalcaligenes (véase, v.gr., EP 218272), lipasa de P. cepacia (véase, v.gr., EP331376), lipasa de P. stutzeri (véase, v.gr., GB1 , 372 , 034 ) , lipasa de fluorescens, lipasa de Bacillus (v.gr., lipasa de B . subtilis [Dartois et al . , Biochem. Biophys . Acta 1131:253-260

[1993]); lipasa de B . stearothermophilus [véase, v.gr., JP64/744992] ; y lipasa de B . pu ilus [véase, v.gr., W091/16422] ) .

Además, un número de lipasas clonadas encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención, que incluyen pero no se limitan a lipasa de Penicillum camembertii (véase, Yamaguchi et al., Gene 103:61-67

[1991]), lipasa de Geotricum candidum (véase, Schimada et al, J. Biochem., 106:383-388

[1989]), y varias lipasas de Rhizopus tales como lipasa de R. delemar (véase, Hass et al., Gene 109: 117-113

[1991]), una lipasa de R niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719

[1992]) y lipasa de oryza .

Otros tipos de enzimas lipolíticas tales como cutinasas también encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención que incluyen, pero no se limitan a, la cutinasa derivada de Pseudo onas mendocina (véase, WO 88/09367), y la cutinasa derivada de Fusarium solanipisi (véase, WO 90/09446) .

Lipasas adecuadas adicionales incluyen lipasas comercialmente disponibles tales como MI LIPASE™, LUMA FAST™, y LIPOMAX™ (Genencor) ; LIPOLASE® y LIPOLASE® ULTRA (Novozymes) ; y LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co . Ltd. , Japón) .

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden lipasas a un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de lipasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales auxiliares de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden lipasa a un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de lipasa en peso de la composición.

Cualquier amilasa (alfa y/o beta) adecuada para usarse en soluciones alcalinas encuentra un uso en algunas modalidades de la presente invención. Las amilasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. Las amilasas que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, a-amilasas obtenidas de B. licheniformis (véase v.gr., GB 1 , 296 , 839 ) . Las amilasas comercialmente disponibles que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a DURAMYL®, TE MAMYL® , FUNGAMYL® , STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA®, NATALASE® y BAN™ (Novozymes) , así como PO ERASE™, RAPIDASE® y MAXAMYL® P (Genencor) .

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden amilasas a un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de amilasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales auxiliares de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden, amilasas a un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 2%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% amilasa en peso de la composición.

En algunas modalidades adicionales, cualquier celulasa adecuada encuentra uso en composiciones de limpieza de la presente invención. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a celulasas de Humicola insolens (véase v.gr., patente de E.U.A. No. 4,435,307). Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen beneficios de cuidado de color (véase v.gr., EP 0 495 257). Las celulasas comercialmente disponibles que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, CELLUZYME® (Novozymes) , y KAC-500(B)™ (Kao Corporation). En algunas modalidades, las celulasas se incorporan como porciones o fragmentos de celulasas de tipo silvestre maduras o variantes, en donde una porción del N-terminal es suprimida (véase v.gr., patente de E.U.A. No. 5,874,276). En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden celulasas a un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de celulasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales auxiliares de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden celulasas a un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de celulasa en peso de la composición.

Cualquier mananasa adecuada para usarse en composiciones detergentes también encuentra uso en la presente invención. Las mananasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. Varias mananasas son conocidas las cuales encuentran en la presente invención (véase v.gr., patente de E.U.A. No. 6,566,114, patente de E.U.A. No. 6,602,842, y patente de E.U.A. No. 6,440,991, todas las cuales se incorporan aquí por referencia) . En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden mananasas a un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de mananasa adicional en peso de la composición y el resto de los materiales auxiliares de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden mananasas a un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de mananasa en peso de la composición.

En algunas modalidades, las peroxidasas se usan en combinación con peróxido de hidrógeno o una fuente del mismo (v.gr., a percarbonato, perborato o persulfato) en las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades alternativas, las oxidasas se usan en combinación con oxígeno. Ambos tipos de enzimas se usan para "blanqueado en solución" (es decir, para evitar la transferencia de un colorante textil de una tela teñida a otra tela cuando las telas son lavadas juntas en una solución de lavado) , preferiblemente junto con un agente incrementador (véase v.gr., WO 94/12621 y WO 95/01426). Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden enzimas de peroxidasa y/u oxidasa a un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de peroxidasa y/u oxidasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales auxiliares de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden enzimas peroxidasa y/u oxidasa a un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de enzimas peroxidasa y/u oxidasa en peso de la composición.

En algunas modalidades, las enzimas adicionales encuentran uso, que incluyen pero no se limitan a perhidrolasas (véase v.gr. , O 05/056782) . Además, en algunas modalidades particularmente preferidas, mezclas de las enzimas anteriormente mencionadas son abarcadas en la presente, en particular una o más proteasa, amilasa, lipasa, mananasa, y/o por lo menos una celulasa adicionales. De hecho, se contempla que varias mezclas de estas enzimas encontrarán uso en la presente invención. También se contempla que los niveles variables de las variantes de proteasa y una o más enzimas adicionales pueden variar independientemente a aproximadamente 10%, el resto de la composición de limpieza es materiales auxiliares de limpieza. La selección específica de materiales auxiliares de limpieza se hace fácilmente al considerar la superficie, producto o tela que ha de ser limpiada, y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante el uso (v.gr. , a través del uso de detergente de lavado) .

Estabilizadores de Enzimas En algunas modalidades de la presente invención, las enzimas usadas en las formulaciones detergentes de la presente invención son estabilizadas. En algunas modalidades, los estabilizadores de enzima incluyen oligosacáridos , polisacáridos y sales de metal divalente inorgánicas, que incluyen metales alcalinotérreos tales como sales de calcio. Se contempla que varias técnicas para estabilización de enzima encontrarán uso en la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, las enzimas utilizadas aquí son estabilizadas por la presencia de fuentes solubles en agua de iones de zinc (II), calcio (II) y/o magnesio (II) en las composiciones acabadas que proveen los iones a las enzimas, así como otros iones de metal (v.gr., bario (II), escandio (II), hierro (II), manganeso (II), aluminio (III), estaño (II) , cobalto (II) , cobre (II) , níquel (II) , y oxovanadio (IV) . Cloruros y sulfatos también encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. Ejemplos de oligosacáridos y polisacáridos adecuados (v.gr., dextrinas) son conocidos en la técnica (véase v.gr., WO 07/145964). En algunas modalidades, los inhibidores de proteasa reversibles también encuentran uso, tales como compuestos que contienen boro (v.gr., borato, ácido 4 -formilfenilborónico) y/o aldehido tripeptídico encuentran uso para mejorar adicionalmente la estabilidad, según se desee.

Blanqueadores, Activadores de Blanqueado y Catalizadores de Blanqueado En algunas modalidades los blanqueadores, activadores de blanqueado y/o catalizadores de blanqueado están presentes en las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden compuesto (s) de blanqueado inorgánicos y/u orgánicos. Los blanqueadores inorgánicos incluyen, pero no se limitan a, sales de perhidrato (v.gr., sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato y persilicato) . En algunas modalidades, las sales de perhidrato inorgánicas son sales de metal alcalino. En algunas modalidades las sales de perhidrato inorgánico son incluidas en los sólidos cristalinos, sin protección adicional, aunque en algunas otras modalidades, la sal es revestida. Cualquier sal adecuada conocida en la técnica encuentra uso en la presente invención (véase v.gr., EP 2 100 949) .

En algunas modalidades, los activadores de blanqueado se usan en las composiciones de la presente invención. Los activadores de blanqueado son típicamente precursores de perácido inorgánico para incrementar la acción de blanqueado en el curso de limpieza a temperaturas de 60 °C e inferiores. Los activadores de blanqueado adecuados para usarse en la presente incluyen compuestos que, bajo condiciones de perhidrólisis , dan ácidos peroxi carboxílieos alifáticos que tienen preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en particular de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono, y/o ácido perbenzoico opcionalmente sustituido. Los activadores de blanqueado adicionales son conocidos en la técnica y encuentran uso en la presente invención (véase v.gr., EP 2 100 949) .

Además, en algunas modalidades y como se describe más adelante, las composiciones de blanqueado de la presente invención comprenden además por lo menos un catalizador de blanqueado. En algunas modalidades, el triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados encuentran uso, así como complejos de cobalto, cobre, manganeso y hierro. Los catalizadores de blanqueado adicionales encuentran uso en la presente invención (véase v.gr., US 4,246,612, 5,227,084, 4,810410, WO 99/06521, y EP 2 100 949).

Complejos de Metal Catalíticos En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen uno o más complejos de metal catalíticos. En algunas modalidades, un catalizador de blanqueado que contiene metal encuentra uso. En algunas modalidades preferidas, el catalizador de blanqueado de metal comprenden un sistema de catalizador que comprende un catión de metal de transición de actividad catalítica de blanqueado definida (v.gr., cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno y manganeso) , un catión de metal auxiliar que tiene poca o nada actividad catalítica de blanqueado (v.gr., cationes de zinc o aluminio) y un secuestrante que tiene constantes de estabilidad definidas para los cationes de metal catalíticos y auxiliares, particularmente ácido etilendiaminotetraacético y ácido etilendiaminotetra (metilenfosfónico) y sales solubles en agua de los mismos se usan (véase, v.gr., patente de E.U.A. No 4,430,243). En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención son catalizadas por medio de un compuesto de manganeso. Estos compuestos y niveles de usos son bien conocidos en la técnica (véase, v.gr., patente de E.U.A. No 5,576,282). En modalidades adicionales, los catalizadores de blanqueado de cobalto encuentran uso en composiciones de limpieza de la presente invención. Varios catalizadores de blanqueado de cobalto son conocidos en la técnica (véase, v.gr., patentes de E.U.A. Nos. 5,597,936 y 5,595,967) y se preparan fácilmente por procedimientos conocidos.

En modalidades adicionales, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen un complejo de metal de transición de un ligando rígido macropolicíclico (MRL) . Como un material práctico, y no a manera de limitación, en algunas modalidades las composiciones y procedimientos de limpieza provistos por la presente invención se ajustan para proveer del orden de por lo menos una parte por 100 millones de la especie de MRL activa en el medio de lavado acuoso, y en algunas modalidades preferidas, proveen de 0.005 ppm a aproximadamente 25 ppm, muy preferiblemente de 0.05 ppm a aproximadamente 10 ppm, y muy preferiblemente aun de 0.1 ppm a aproximadamente 5 ppm, del MRL en el solución de lavado.

Los metales de transición preferidos en el presente catalizador de blanqueado de metal de transición incluyen, pero no se limitan a manganeso, hierro y cromo. MRLs preferidos también incluyen, pero no se limitan a ligandos ultra rígidos especiales que son de puente cruzado (v.gr., 5 , 12-dietil-l , 5 , 8 , 12 -tetraazabiciclo [6.6.2] hexadecano) . MRLs del metal de transición adecuados son fácilmente preparados por procedimientos conocidos (véase, v.gr., WO 2000/32601, y patente de E.U.A. No. 6,225,464).

Agentes para Cuidado de Metales En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden agentes para cuidado de metales. Los agentes para cuidado de metales encuentran uso en la prevención y/o reducción de decoloración, corrosión y/u oxidación de metales, que incluyen, aluminio, acero inoxidable y metales no ferrosos (v.gr., plata y cobre). Los agentes para cuidado de metales adecuados incluyen aquellos descritos en EP 2 100 949, WO 9426860 y WO 94/26859) . En algunas modalidades, el agente para cuidado de metales es una sal de zinc. En otras modalidades las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5% n peso de uno o más agentes para cuidado de metales.

Procedimientos para Hacer y Usar Composiciones de Limpieza Las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan por cualquier procedimiento adecuado escogido por el formulador (véase, v.gr., patentes de E.U.A. Nos. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, 5,486,303, 4,515,705, 4,537,706, 4,515,707, 4,550,862, 4,561,998, 4,597,898, 4,968,451, 5,565,145, 5,929,022, 6,294,514 y 6,376,445) .

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención se proveen en forma de dosis unitaria, que incluyen tableta, cápsulas, sacos, bolsas y bolsas de compartimientos múltiples. En algunas modalidades, el formato de dosis unitaria está diseñado para proveer liberación controlada de ingredientes dentro de una bolsa de compartimientos múltiples (u otro formato de dosis unitaria) . Los formatos de dosis unitaria y de liberación controlada adecuados son conocidos en la técnica (véase, v.gr., EP 2 100 949, WO 02/102955, patente de E.U.A. Nos 4,765,916 y 4,972,017, y WO 04/111178 para materiales adecuados para usarse en formatos de dosis unitaria y liberación controlada) .

Métodos de Uso En modalidades preferidas, las composiciones de limpieza de la presente invención encuentran uso en superficies de limpieza (v.gr., vajilla o telas) . En algunas modalidades, por lo menos una porción de la superficie y/o tela se pone en contacto con por lo menos una modalidad de las composiciones de limpieza de la presente invención, en forma neta o diluida en un solución de lavado, y después la superficie y/o tela es opcionalmente lavada y/o enjuagada. Para los propósitos de la presente invención, "lavado" incluye, pero no se limita a frotación y agitación mecánica. En algunas modalidades, la tela comprende cualquier tela capaz de ser lavada en condiciones de uso de consumidor normales. En modalidades preferidas, las composiciones de limpieza de la presente invención se usan a concentraciones de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ppm en solución. En algunas modalidades en las cuales el solvente de lavado es agua, la temperatura del agua típicamente varía de aproximadamente 5°C a aproximadamente 90°C. En algunas modalidades preferidas para limpieza de telas, la relación de agua a masa de tela es típicamente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 30:1.

Sección Experimental Los siguientes ejemplos se proveen a fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas modalidades preferidas y aspectos de la presente invención y no para ser consideradas como limitantes del alcance de la misma.

En la descripción experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: ppm (partes por millón); M (molar) ; mM (milimolar) ; µ? (micromolar) ; nM (nanomolar) ; mol (moles) ; mmol (milimóles) ; µt??? (micromoles) ; nmol (nanomoles) ; g (gramos) ; mg (miligramos) ; g (microgramos) ; pg (picogramos) ; L (litros) ; mi y mL (mililitros) ; µ? y µ?. (microlitros) ; cm (centímetros) ; mm (milímetros) µt? (micrómetros o mieras) ; nm (nanómetros) ; U (unidades) ; V (volts); PM (peso molecular); seg (segundos); min(s) (minuto/minutos); h y hr (hora/horas); °C. (grados centígrados) ; CS (cantidad suficiente) ; ND (no realizado) ; NA (no aplicable) ; rpm (revoluciones por minuto) ; p/v (peso a volumen) ; v/v (volumen a volumen) ; g (gravedad) ; DO (densidad óptica) ; aa (aminoácido) ; pb (par de bases) ; kb (kilopares de bases) ; kD (kilodaltons) ; suc-AAPF-pNA ( succinil -L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-alanil-para-nitroanilida) ; BPN' (subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens) ; DMSO (sulfóxio de dimetilo) ; ADNc (ADN de copia o complementario) ; ADN (ácido desoxirribonucleico) ; ADNcs (ADN de cadena sencilla) ; ADNdc (ADN de doble cadena) ; dNTP (trifosfato de desoxirribonucleótido) ; DTT ( 1 , 4 -ditio-DL-treitol ) ; H20 (agua) ; dH20 (agua desionizada) ; (HCl (ácido clorhídrico) ; MgC12 (cloruro de magnesio) ; MOPS (ácido 3- [N-morfolino] ropansulfónico) ; NaCl (cloruro de sodio); PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida) ; PB92 (subtilisina de Bacillus clausii) ; ??? (solución salina regulada en su pH con fosfato [NaCl 150 mM, regulador de pH de fosfato de sodio 10 mM, H 7.2]); PEG (polietilenglicol ) ; PCR (reacción en cadena de polimerasa) ; PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) ; ARN (ácido ribonucleico) ; SDS (dodecilsulfato de sodio); Tris ( tri s ( hidroximetil ) aminometano); SOC (2% de bacto-triptona, 0.5% de extracto de Bacto levadura, NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM) ; caldo terrífico (TB; 12 g/1 bacto triptona, 24 g/1 de glicerol, 2.31 g/1 de KH2P04, y 12.54 g/1 de K2HP04); DO280 (densidad óptica a 280 nm) ; DO600 (densidad óptica a 600 nm) ; A405 (absorbancia a 405 nm) ; Vmáx (la velocidad inicial máxima de una reacción catalizada por enzima) ; HEPES (ácido N- [2-Hidroxietil] piperazino-N- [2-etansulfónico] ) ; Tris-HCl (tris [Hidroximetil] aminometan-clorhidrato) ; TCA (ácido tricloroacético) ; HPLC (cromatografía de líquidos de alta presión) ; RP-HPLC (cromatografía de líquidos de alta presión de fase inversa) ; TLC (cromatografía de capa delgada) ; Taq (ADN polimerasa de Thermus aquaticus) ; Klenow (fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow) ) ; EDTA (ácido etilendiaminotetracético) ; EtOH (etanol) ; SDS (dodecilsulfato de sodio) ; Tris (tris [Hidroximetil] aminometano) ; TAED (?,?,?'?'-tetraacetiletilendiamina) ; PI (índice de rendimiento) ; SR (removedor de suciedad o mancha) ; MS (espectroscopia de masa) ; AATCC (Asociación Nortemericana de Químicos en Textiles y Colorantes) ; Arzberg (Arzberg- Porzel lan GmbH, Schirnding, Alemania) ; BASF (BASF Corp, Florham Park, NJ) ; BioRad (BioRad, Richmond, CA) ; Cognis (Cognis Corp, E.U.A., Cincinnati, OH) ; Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia); Henkel (Henkel, GmbH, Dusseldorf, Alemania) ; IK ( Industrieverband Kprperflege und aschmittel, = The Germán Cosmetic, Toiletry, Perfumery and Detergent Association, Frankfurt , Alemania); Invitrogen (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) ; Kontron (Kontron Instruments, Zurich, Suiza); Macherey-Nagel (Macherey-Nagel , Easton, PA) ; Miele (Miele, Princeton, NJ) Merieux (Instirut Merieux, Codex, FR) ; QIAGEN® (QIAGEN®, Inc., Valencia, CA) ; (Reckitt Benckiser, Berks, Reino Unido); Sigma (Sigma Chemical Co, St . Louis, MO) ; Sorvall (Sorvall Instruments, una subsidiaria de DuPont Co , Biotechnology Systems, Wilmington, DE); y wfk Testmaterials (Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht , Alemania) .

Ej emplo 1 Construcción de la Variante de Subtilisina Como se describe en la presente, la variante de subtilisina se preparó por PCR de fusión como se conoce en la técnica (véase, v.gr. , publicación de solicitud de patente de E.U.A. No. 2006/0252155. La tabla 1-1 provee las secuencias de los cebadores usados para PCR de fusión.

Tabla 1-1 Cebadores Usados en PCR de Fusión* *E1 'codón para generación de una sustitución en la posición 76 y líos sitios de enzima de restricción se muestran en negritas.

Una plantilla de ADN de una variante de B. clausii PB92 que contiene las siguientes sustituciones N87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R; que usan numeración de BPN' y designada aquí como GCI-P039) se usó para generar una variante de subtilisina que comprende además una sustitución de N76D (designada aquí como "PX3") . Una variante que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a PX3 también puede ser producida a partir de una plantilla de ADN de una variante de B. lentus GG36 (que contiene las siguientes sustituciones S87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R; que usa numeración BPN' ) mediante la introducción de sustitución de N76D.

El cebador BgIII-Fw se combinó con N76D-Rv en la primera reacción para generar el primer fragmento y el segundo fragmento se preparó al combinar el cebador BgIII-Rv con el cebador N76D-Fw en una segunda reacción. Polimerasa PHUSION™ (Finnzymes) se usó en las reacciones de PCR. En estos experimentos, 2 µ? de cebadores 10 mM hacia adelante y de reversa, ?µ? de dNTPs 10 mM, 10 µ? de 5X HF Phusion de regulador de pH, 1.5 µ? de DIVISO, una unidad de polimerasa y 1 µ? de plantilla se añadió a un volumen de 50 µ? . Se usó el siguiente programa de PCR: desnaturalización de 3 minutos a 95°C, 1 minuto de alineación a 65°C y 1 minuto, 15 segundos de alargamiento a 72°C, durante 30 ciclos, seguido por 7 minutos a 72°C. Al completarse, los productos de reacción se almacenaron a temperatura ambiente.

Los fragmentos de ADN de los tamaños esperados a partir de las dos reacciones de PCR fueron purificados a partir de geles de agarosa mediante el uso de columnas de purificación de PCR (Macherey-Nagel) . Los dos fragmentos deseados fueron fusionados por amplificación por PCR mediante el uso de cebadores hacia adelante y de reversa BglII y polimerasa PHUSION™, mediante el uso del siguiente programa: 3 minutos de desnaturalización a 95 °C, 1 minuto de alineación a 65°C y 2 minutos de alargamiento a 72°C, durante 25 ciclos, seguido por 7 minutos a 72°C. Al completarse, los productos de reacción se almacenaron a temperatura ambiente.

Los fragmentos de ADN de la reacción de PCR de fusión se obtuvieron por digestión con enzima de restricción BglII y se purificaron a partir de geles de agarosa. Los fragmentos de ADN fueron subsecuentemente ligados con estructura de plásmido pHPLT digerida con BglII con ?µ? T4 ADN ligasa, 8µ1 de regulador de pH de ligación 5X T4 en un volumen final de 40µ1, durante la noche a 14 °C.

Células de B. subtilis competentes (fenotipo: AaprE, AnprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, Aa yE: : [xylR,pxylA-comK] ) fueron transformadas mediante el uso de 10 µ? de producto de ligación para obtener transformantes positivos de proteasa como se conoce en la técnica (véase, v.gr. , WO 02/14490) . Las bacterias se hicieron competentes mediante la inducción del gen comK bajo control de un promotor inducible por xilosa (véase, v.gr., Hahn et al., Mol Microbiol, 21:763-775, 1996). Los clones positivos de proteasa se seleccionaron sobre placas con leche descremada/agar, aisladas, secuenciadas y se produjo proteína en cultivos de matraz con agitador para generar cantidades significativas de muestras de enzima para caracterización.

Ej emplo 2 Producción de la Variante de Subtilisina en Bacillus Subtilis La variante de subtilisina fue producida al hacer crecer transformantes de B. subtilis durante la noche a 37°C en 10 mi de medio de TSB (caldo basado en triptona y soya) una alícuota de 250 µ? del cultivo durante la noche fue transferida a 25 mi de un medio definido basado en MOPS en un matraz de agitación de 100 mi y se hizo crecer a 37°C durante i 68 horas. El medio definido se hizo esencialmente como se conoce en la técnica (véase Neidhardt et al., J Bacteriol, 119: 736-747,, 1974), excepto que NH4C12, FeS0 , y CaCl2 se dejaron fuera del medio de base, se usó 3 mM de K2HP04 y el medio de base fue suplementado con 60 de mM urea, 75 g/L de glucosa, y 1% soytone. También, los micronutrientes se acumularon como un abastecimiento de 100X que contenía en un litro, 400 mg de FeS04 .7H20, 100 mg de MnS04.H20, 100 mg de ZnS04.7H20, 50 mg de CuCl2.2H20, 100 mg de CoCl2.6H20, 100 mg de NaMo04.2H20, 100 mg de Na2B4O7-10H2O, 10 mi de CaCl2 1M, y 10 mi de citrato de sodio 0.5 M. La proteasa de interés (es decir la variante de proteasa) se aisló del medio de cultivo.

Ejemplo 3 Métodos Analíticos para Determinar la Pureza de la Variante de Subtilisina En este ejemplo, los métodos usados para determinar la pureza de la subtilisina recombinante obtenida de cultivos de B. subtilis se describen. La proteasa se consideró pura cuando una sola banda o pico se encontró por electroforesis de gel y cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) , respectivamente.

La electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) se condujo como se conoce en la técnica (Laemmli, Nature, 227:680-685, 1970).

Sin embargo, antes de la desnaturalización de las muestras de proteína (v.gr., 10 minutos en regulador de pH de muestra que contenía SDS a 100°C) , la inactivación de la actividad de proteasas se requirió para evitar auto-degradación. La inactivación de la proteasa se logró al incubar la muestra de proteína con 1 mM PMSF durante 30 minutos a temperatura ambiente o mediante precipitación de la proteína con 8% de ácido tricloroacético (TCA) durante 30 minutos sobre hielo. Muestras de proteínas fueron sometidas a PAGE nativo llevado a cabo a pH 7.45. El regulador de pH de gel consistió de 20 mM de histidina y 50 mM de ácido 3-[N-morfolino] propansulfónico (MOPS) , y el 5% de geles de poliacrilamida tuvo una relación de acrilamida :bisacrilamida de 20:1. Las muestras de proteína se cargaron sobre la parte superior de geles en rebanadas y se sometió a electroforesis hacia el cátodo. El mismo regulador de pH de histidina/MOPS se usó como regulador de pH de electroforesis (tanque) , pero se ajustó a un pH de 6.3. Después de la electroforesis (~ 1 -2 hr a 350 V) , el gel se remojó en 8% de ácido acético para fijar las proteínas en el gel y subsecuentemente teñir con azul de Coomassie Brilliant R250 y desteñir como se conoce en la técnica, para localizar bandas de proteína en el gel.

La pureza de la muestra de proteína también fue confirmada por análisis de HPCL mediante el uso de columna de intercambio de cationes MonoS seguido por columna de filtración de gel TSK 2000. El primero se realizó en un regulador de pH de fosfato de sodio 10 mM, pH 5.5 con elusión de la proteasa unida mediante el uso de un gradiente lineal de 10-300mM, pH 5.5. La columna de filtración de gel se realizó en 0.25M de acetato de sodio, pH 5.5. Los perfiles de elusión de proteína fueron monitoreados a 280 nm para localizar la proteasa de interés y para determinar el por ciento de pureza de la muestra.

Ejemplo 4 Determinación de la Concentración de Subtilisina En este ejemplo, los métodos usados para determinar concentraciones de subtilisina se describen. En algunos experimentos, mediciones de extinción se hicieron a 280 nm mediante el uso del coeficiente de extinción calculado ( ) y titulaciones de sitio activo se usaron para determinar la concentración de proteína en una solución de proteasa purificada, como se describe más adelante.

El coeficiente de extinción a 280 nm se calculó a partir del número de triptofanos (Trp, e [épsilon] = 5,600M_1. cm"1) y tirosinas (Tyr, e = 1,330 M"1 .cm"1) por molécula de enzima. Para la proteasa PB92 el coeficiente de extinción molar fue 26,100 M"1 . cm"1 (3 Trp + 7 Tyr residuos) , equivalente a e?%, medido a 280 nm = 9.7 (Mr = 26,729 Da) . En el caso de mutantes con un número alterado de residuos de triptofano y/o tirosina, se hicieron correcciones de acuerdo con ello.

Una estimación de la concentración de moléculas de enzima activas se obtuvo por titulación del sitio activo. Puesto que el método ampliamente usado de acilación por N- transcinamoilimidazol (Bender et al., J Am Chem Soc, 88:5890-5931, 1966) probó no funcionar satisfactoriamente para la proteasa PB92, un método que usó el inhibidor irreversible P SF fue desarrollado en lugar del mismo. En este método, una solución de proteasa con una concentración de enzima estimada (de' la absorción de 280 nm) se mezcló con 0.25, 0.50, 0.75, 1.00 y 1.25 equivalentes de PMSF, respectivamente, y se dejó reaccionar durante una hora a temperatura ambiente en fosfato de sodio 10 mM, pH 6.5. La actividad de proteasa residual se midió espectrofotométricamente mediante el uso de succinil-L-alani 1 -L- alañil - L-prolil-L-fenil - alani 1 -para -nitroanilida ( suc -AAPF-pNA) como un sustrato. Para estos estudios, la . pureza (y por tanto concentración) de PMSF se determinó por espectroscopia de NMR y soluciones de abastecimiento de PMSF se prepararon en isopropanol. Se encontró que los resultados de titulación de sitio activo estaban en concordancia con los resultados de concentración de proteína de la verificación de pureza mediante el uso del método de HPLC.

Ejemplo 5 Pruebas de Rendimiento de Lavado En este ejemplo, los métodos adecuados para evaluación de lavado de vajilla y rendimiento de limpieza de telas de la variante de subtilisina PX3 y la subtilisina de referencia GCI-P038 en detergentes para lavado de vajilla y de lavandería comercialmente disponibles se describen. La secuencia de aminoácidos de la variante de la proteasa PB92 madura referida aquí como PX3 y que tiene las sustituciones N76D+N87R+G118R+S128L+P129Q+S130A+S188D+N248R (numeración de ???' ) es: AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGT HVAGTLAALDNSIGVLGVAPRAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAG NRMHVANLSLGLQ APSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRADFSQYGAG LDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRRHLKNTATSLG STNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:5).

La secuencia de aminoácidos de la subtilisina de referencia GCI-P037 (PB92) madura es: AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGV VAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGT IIVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMIIVANLSIXiSP SPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGL DIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGS TNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:6).

La secuencia de aminoácidos de la subtilisina de referencia GCI-P038 madura es: AQSVPWGíSRVQAPAAHNRGL'roSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVreEPSTQDGNGHGT HVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAG VMHVANLSLGLQ APSATLEQAVNSATSRGVLVVAASG SGAGSISYPARYANA AVGATDQNNNRASFSQYGAGL DIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGS TNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID N0:7) Rendimiento de Lavado de Vajilla En este ejemplo, los métodos usados para medir el rendimiento de lavado de vajilla de la variante de subtilisina PX3 y la subtilisina de referencia GCI-P038 en detergentes para vajillas comerc ialmente disponibles se describen.

El rendimiento de la variante de proteasa se probó bajo varias condiciones de lavado de vajilla automáticas. Las composiciones de los detergentes para vajillas se muestran en las tablas 5-1 y 5-2. Estos detergentes están comercialmente disponibles de wfk Testmaterials y se refieren por sus designaciones de wfk Testmaterials. Estos detergentes se obtienen de la fuente sin presencia de enzimas, para permitir el análisis de la variante de proteasa.

Tabla 5-1 Detergente Libre de Fosfato IEC-60436 WFK Tipo B (pH=10.4 en 3 g/1) Tabla 5-2 Detergente que Contiene Fosfato IEC-60436 WFK Tipo C (pH=10.5 en 3 g/1) Los protocolos para la preparación de cada uno de los tipos de manchas (yema de huevo, carne molida y huevo, y huevo con leche) se proveen a continuación. Antes de que los tipos de suciedad individuales se aplicaran a las vajillas de prueba, las vajillas fueron lavadas uniformemente. Eso fue particularmente necesario, ya que residuos de ciertas manchas persistentes podrían estar presentes en las vajillas de pruebas anteriores. Vajillas nuevas también fueron sometidas a tres lavados uniformes antes de usarse por primera vez en una prueba.

Preparación de Manchas de Yema de Huevo sobre Acero Inoxidable Las láminas de acero inoxidable (10 x 15 cm, cepilladas en un lado) usadas en estos experimentos se lavaron uniformemente a 95 °C en una lavadora de vajilla de laboratorio con un detergente comercial de alta alcalinidad (v.gr., detergente ECOLAB®; Henkel) para proveer láminas que fueron limpias y libres de grasa. A estas láminas se les quitaron las rebabas antes del primer uso. Las láminas se secaron durante 30 minutos a 80 °C en un gabinete térmico antes de ser ensuciadas con yema de huevo. Las superficies que iban a ser cepilladas no fueron tocadas antes de ensuciarse. También, no se permitieron manchas de agua o lanilla sobre las superficies. Las láminas enfriadas se pesaron antes de ensuciarse.

Las yemas de huevo se prepararon separando las yemas de aproximadamente 10-11 huevos (200 g de yema de huevo) de las claras. Las yemas se agitaron con un tenedor en un vaso de precipitado para homogeneizar la suspensión de yema. Las yemas después se colaron (aproximadamente a una malla de 0.5 mm) para remover partículas gruesas y cualesquiera fragmentos de cascarón del huevo.

Un cepillo plano (6.5 cm) se usó para aplicar 2.0 +0.1 g de suspensión de yema de huevo de manera tan uniforme como fuera posible sobre un área de 140 cm2 en los lados cepillados de cada una de las láminas de acero inoxidable, y se dejó un reborde de aproximadamente 1 cm de ancho no ensuciado (si era necesario se usaba cinta adhesiva) . Las láminas ensuciadas se secaron horizontalmente (para evitar formación de gotas en los bordes de las láminas) a temperatura ambiente durante 4 horas (máx. 24 horas) .

Para desnaturalizar las proteínas de yema de huevo, las láminas fueron sumergidas durante 30 segundos en agua desmineralizada en ebullición (mediante el uso de un dispositivo de contención si era necesario) . Después las láminas se secaron nuevamente durante 30 minutos a 80 °C. Después de secarse y enfriarse, las láminas se pesaron. Después de pesarse, las láminas se dejaron por lo menos durante 24 horas (20°C, humedad relativa de 40-60%) antes de someterlas a , la prueba de lavado. Para satisfacer los requerimientos de prueba, sólo láminas con 1000 ± 100 mg/140 cm2 (yema de huevo después de la desnaturalización) se usaron en la prueba. Después de las pruebas de lavado fueron conducidas, las láminas se secaron durante 30 minutos a 80 °C en un gabinete térmico y se pesaron nuevamente después de enfriarse. El por ciento de rendimiento de limpieza se determinó al dividir los mg de yema de huevo liberados bajo lavado por los mg de yema de huevo desnaturalizada aplicada y al multiplicar por 100.

Preparación de Manchas de Carne Molida y Huevo sobre Platos de Porcelana Para estos experimentos, se usaron platos para postre (Arzberg, 19 cm de diámetro, porcelana blanca, brillosa) que se conformaba a EN 50242, forma 1495, No. 0219. Un total de 225 g de carne de cerdo y res magra (relación de 50:50) se picó finamente y se mantuvo fría. La mezcla se pasó dos veces por un molino. Las temperaturas por arriba de 35 °C se evitaron. Los 225 g de la carne molida se mezclaron después con 75 g de huevo (clara y yema mezcladas juntas) . La preparación después se congeló hasta por tres meses a -18°C, antes de usarse. Si no estaba disponible la carne de cerdo, se usó 100% carne de res, ya que estas eran indistintas.

La mezcla de carne molida y huevo (300 g) se llevó a temperatura ambiente y se mezcló con 80 mi de agua desmineralizada. La mezcla después se homogeneizó durante 2 minutos mediante el uso de un mezclador manual de cocina. Se usó un tenedor para distribuir 3 g de la mezcla de carne molida/huevo/agua sobre cada plato de porcelana blanco, pero dejando un margen no ensuciado con una anchura de aproximadamente 2 cm alrededor del borde. La cantidad aplicada fue 11.8 ± 0.5 mg/cm2. Los platos se secaron durante 2 horas a 120°C en un gabinete térmico precalentado . Tan pronto como los platos se enfriaron, estuvieron listos para usarse .

Después de conducir las pruebas de lavado de vajilla, los platos se rociaron con una solución de ninhidrina (preparada a 1% en etanol) para mejor identificación de los residuos de proteína de carne molida. Para promover la reacción de color, los platos se calentaron durante 10 minutos a 80°C en el gabinete térmico. La evaluación del rendimiento de lavado se hizo al inspeccionar visualmente las reacciones de color del residuo de carne molida con referencia al catálogo fotográfica (IKW - La Asociación Alemana de Cosméticos, Productos para Baño, Perfumería y Detergentes) .

Preparación de Manchas de Huevo/Leche sobre Acero Inoxidable Las láminas de acero inoxidable (10 x 15 cm; cepilladas en un lado) usadas en los experimentos se lavaron uniformemente a 95 °C en lavadora de va illas de laboratorio con un detergente comercial de alta alcalinidad para remover grasa y limpiar las láminas. Las láminas se secaron y pulieron con un paño de celulosa. Las superficies que se iban a cepillar no se tocaron antes de ensuciarse. También, no se permitieron manchas de agua o lanilla sobre las superficies. Antes de ensuciarse, las láminas se colocaron en un gabinete térmico a 80°C durante 30 minutos. Las láminas enfriadas se pesaron antes de ensuciarse.

Las yemas y claras de huevo de huevos enteros crudos (3-4 huevos, aproximadamente 160 g/huevo) se colocaron en un tazón y se batieron con un batidor de huevos. Después, 50 mi de leche semidescremada (1.5% de grasa, temperatura ultra alta, homogeneizada) se añadieron a la mezcla. La leche y huevo se mezclaron sin generar frotación. Un cepillo plano se usó para distribuir uniformemente 1.0 ± 0.1 g de la mezcla de huevo/leche sobre el lado cepillado de las láminas de acero inoxidable, mediante el uso de una balanza para verificar la distribución. Un margen de aproximadamente 1.0 cm se dejó alrededor de los lados cortos de las láminas. Las láminas ensuciadas se secaron horizontalmente (para evitar formación de gotas sobre los bordes de las láminas) , a temperatura ambiente durante 4 horas (máx. 24 horas) .

Las láminas después se sumergieron durante 30 segundos en agua desmineralizada en ebullición (mediante el uso de un dispositivo de contención si fuera necesario) . Después las láminas se secaron nuevamente durante 30 minutos a 80°C. Después de secarse y enfriarse las láminas se pesaron. Después de pesarse las láminas se dejaron asentar durante por lo menos 24 horas (20°C, humedad relativa de 40-60%) , antes de someterlas a prueba de lavado. A fin de satisfacer los requisitos de prueba, sólo láminas con 190 ± 10 mg de yema de huevo/leche.

Después de que se condujeron las pruebas de lavado, las láminas se secaron durante 30 minutos a 80°C, en el gabinete térmico, y se pesaron nuevamente después de enfriarse. El porcentaje de rendimiento de limpieza se determinó al dividir los mg de huevo/leche liberados por el lavado por los mg de huevo/leche aplicadas y al multiplicar por 100.

Equipo y Condiciones de Lavado Las pruebas de lavado se realizaron en una lavadora de vajilla automática (Miele modelo G690SC) , equipada con vajillas sucias y láminas de acero inoxidable, preparadas como se describió antes. Una cantidad definida del detergente se usó. La temperatura probada fue de 50°C. La dureza del agua fue de 21°C GH (dureza alemana) .

Como se describió antes, después del lavado de los platos ensuciados con carne molida se evaluaron visualmente mediante el uso de una escala de evaluación de foto de 0 a 10, en donde "0" designó un plato completamente sucio y "10" designó un plato limpio. Estos valores corresponden a la capacidad de remoción de manchas o suciedad (SR) del detergente que contiene enzima.

Los platos de acero inoxidable lavados ensuciados con yema de huevo o yema de huevo/leche se analizaron gravimétricamente para determinar la cantidad de mancha residual después del lavado. La variante de subtilisina PX3 y subtilisina de referencia GCI-P038 se probaron a un nivel entre 0 y 30 mg/proteína activa por lavado. Los resultados para varias pruebas de lavado de vajilla se proveen más adelante en las Tablas 5-3 a 5-6. En cada uno de esos experimentos, las diferentes concent aciones de proteasa activa por lavado se usaron. El rendimiento de lavado de la subtilisina de referencia GCI-P038 se asignó un valor de "100", mientras que el rendimiento de lavado de la variante se comparó con este valor. Por ejemplo, si la subtilisina de referencia GCI-P038 tuvo un resultado de 45% de remoción de manchas y una variante tuvo un resultado de 52% de remoción de manchas, el resultado para la variante de subtilisina mostrada como un índice de rendimiento (PI) sería 52/45 x 100 = 116. Por lo tanto, en ambos detergentes probados, la variante de subtilisina PX3 fue más o tan efectiva que la subtilisina de referencia GCI-P038 en remoción de manchas proteináceas en aplicaciones de lavado de vajilla.

Tabla 5-3 Detergente que Contiene Fosfato, °GH, Dosificado a 0.05% de Proteína Activa Tabla 5-4 Detergente que Contiene Fosfato, 50°C, 21°GH, Dosificado a 0.15% de Proteína Activa Tabla 5-5 50°C, 21°GH, Dosificado a 0.05% de Proteína Activa Enzima PI PI PI Yema de huevo Carne molida Yema de huevo/leche Referencia 100 100 100 GCI-P038 Variante 124 150 117 PX3 Tabla 5-6 Detergente Libre de Fosfato 50°C, 21°GH, Dosificado a 0.15% de Proteína Activa Ejemplo 6 Estabilidad y Rendimiento de Limpieza de Variante de Subtilisina En este ejemplo, se describen métodos para evaluar la estabilidad y rendimiento de limpieza de PX3.

Método de Prueba de Hidrólisis de AAPF La termoestabilidad de la variante de serina proteasa se determinó al probar la actividad de proteasa mediante el uso de la prueba de AAPF después de incubación de variante de proteasa a 68°C durante 1 hora. Bajo las condiciones de la prueba, la actividad residual de la proteasa de referencia (v.gr., GG36 de tipo silvestre = GCI-P036) fue aproximadamente 50%. El equipo usado fue: MTPs de fondo en F (Costar No. 9017) , Biomek FX y/o Biomek FXp Robot (Beckman Coulter) , Spectramax Plus 384 MTP Reader (Molecular Devices) , iEMS Incubator/Shaker (amplitud de 1 mm) (Thermo/Labsystems) , cinta de sellado (Nunc No. 236366) , y baño de hielo. El regulador de pH de glicina se preparó al disolver 3.75 g de glicina (Merck No. 1.04201.1000) en 960 mL de agua. 1 mi de TWEEN®-80 al 5% (Sigma No. P-8074) y 10 mi de una solución de abastecimiento de 1000 mM de CaCl2 (Merck No. 1.02382.1000) (29.4 g disuelto a 200 mi) se añadió a esta solución. El pH se ajustó a 10.5 con NaOH 4N y el volumen llevado a 1000 mi. Las concentraciones finales de glicina, CaCl2 y TWEEN®-80 fueron: 50 mM, 10 mM y 0.005% respectivamente. Las incubadoras se expusieron a 68°C (para incubación) y a 25°C (para la prueba de AAPF) . 90 µ? y 190 µ? de regulador de pH de glicina se añadió a las placas de dilución e incubación vacías, respectivamente. 10 µ? de sobrenadante se añadieron después a la placa de dilución, seguidos por la adición de 10 µ? de la placa de dilución a la placa de incubación. Después, 10 µ? de mezcla de la placa de incubación se añadió a una placa pre-calentada que contenía sustrato de suc-AAPF-pNA. La placa de suc-AAPF-pNA se leyó en un lector de MTP a 410 nm (medición de t = 0) . La placa de incubación se cubrió con cinta y se incubó durante 1 hora a 68°C y 400 rpm. Al final de la incubación, la placa se removió de la incubadora y se enfrió sobre hielo por lo menos durante 5 minutos. 10 µ? de mezcla de la placa de incubación fue transferida a la placa que contenía sustrato de suc-AAPF-pNA y la placa se leyó a 410 nm (medición de t=60) . El por ciento de actividad residual se calculó como: % de actividad residual: (mOD.min-1 a t=60) / (mOD.min-1 a t=0) x 100 Prueba de Estabilidad a LAS/EDTA La estabilidad a LAS/EDTA se midió después de la incubación de la proteasa de prueba en presencia de LAS/EDTA, como una función de actividad residual determinada mediante el uso de la prueba de AAPF.

La estabilidad de la variante de proteasa en presencia de un agente tensioactivo aniónico representativo (LAS= alquilbecensulfonato lineal, dodecilbencensulfonato de sodio-DOBS) y EDTA de di-sodio se midió después de incubación bajo condiciones definidas y la actividad residual se determinó mediante el uso de la prueba de AAPF. Los reactivos usados fueron dodecilbencensulfonato, sal de sodio (DOBS, Sigma No. D-2525) , TWEEN®-80 (Sigma No. P-8074), EDTA de disodio (Siegfried Handel No. 164599-02), HEPES (Sigma No. H-7523), regulador de pH sin estrés: 50 mM de HEPES (11.9 g/1) + 0.005% de TWEEN®-80, pH 8.0, regulador de pH con estrés: 50 mM de HEPES (11.9 g/1), 0.1% de (p/v) DOBS (1 g/1), 10 mM de EDTA (3.36 g/1), pH 8.0, sobrenadantes de cultivo de proteasa de referencia y variante de proteasa, que contenían 200 - 400 µg/ml de proteína. El equipo usado fue MTP con fondo en V o en U como placas de dilución (Greiner 651101 y 650161 respectivamente) , MTP de fondo en F (Corning 9017) para regulador de pH sin estrés y LAS/EDTA así como para placas de suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter) , lector de MTP Spectramax Plus 384 (Molecular Devices), incubadora/agitador iEMS (amplitud de 1 mm) de Thermo Electron Corporation, cinta de sellado: Nunc (236366) .

La incubadora/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) se fijó a 29°C. Los sobrenadantes de cultivo se diluyeron en placas que contenían regulador de pH sin estrés a una concentración de -25 ppm (placa de dilución maestra) . 20 µ? de muestra de la placa de dilución maestra se añadió a placas que contenían 180 µ? de regulador de pH sin estrés para dar una concentración de incubación final de 2.5 ppm. Los contenidos se mezclaron y se mantuvieron a temperatura ambiente y se realizó una prueba de AAPF en esta placa. 20 µ? de muestra de la placa de dilución maestra también se añadió a placas que contenían 180 µ? de regulador de pH con estrés (50 mM de HEPES (11.9 g/1) , 0.1% (p/v) de DOBS (1 g/1) , 10 mM de EDTA (3.36 g/1), pH 8.0) . Las soluciones se mezclaron e inmediatamente se colocaron en agitador de iEMS a 29°C durante 30 min a 400 rpm. Después de 30 minutos de incubación, se realizó una prueba de AAPF sobre la placa de estrés. La estabilidad de las muestras se determinó al calcular la relación de la actividad de AAPF residual e inicial como sigue: Actividad residual (%) = [mOD.min-1 con estrés] *100 / [mOD. min-1 sin estrés].

Prueba de Micromuestra de Yema de Huevo Horneada El rendimiento de remoción de manchas de la variante de subtilisina se determinó en una escala de placa de microtitulación (MTP) en detergente comercialmente disponible (CALGONIT® [Reckitt-Benckiser] ; y detergente CASCADE® [P&G] ) . Las muestras para probar la variante de subtilisina se obtuvieron a partir de caldo de cultivo filtrado de cultivos que crecieron en placas de MTP durante 3 días a 37°C/ 300 rpm/ 90% de humedad relativa. El equipo usado incluyó: un robot Biomek FX (Beckman Coulter) , un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices), una incubadora/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) ; MTPs de fondo en F (tipo Costar 9017) para lectura de placas de reacción después de la incubación y MTPs de fondo en V (Greiner 651101) para pre-dilución de sobrenadante. Micromuestras CS-38 (yema de huevo con pigmento, añejadas por calentamiento), obtenidas de CFT Vlaardingen se usaron como sustrato. Dos muestras se usaron por pozo. Tabletas de ADW de Calgonit 5inl se usaron para preparar la solución detergente. Para inactivar la actividad de proteasa presente en la tableta, una tableta de 21 g se disolvió en agua Milli-Q calentada en un baño de agua a una temperatura de 60°C. La solución se enfrió an temperatura ambiente y el volumen de agua se ajustó a 700 mL . La solución se diluyó adicionalmente con agua para lograr una concentración final de 3 g/l. La dureza de agua se ajustó a 21°GH al añadir 1.46 mi de la mezcla de Ca/Mg (mezcla de Ca/Mg [(3:1), 1.92 M de CaCl2 =282.3 g/L de CaCl2.2H20; 0.64 M de MgCl2 = 130.1 g/L de MgCl - 6H20) , 15000 gpg] . Las muestras de enzima fueron prediluidas en 10 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, 0.005% de solución de TWEEN®-80 y se probaron a concentraciones apropiadas .

La incubadora se fijó a la temperatura deseada de 40°C o 50°C, y 72 µ? de regulador de pH de dilución se añadió a la placa de fondo en V vacía (= placa de dilución) seguida por 8 µ? de sobrenadante. Después 9 µ? de la placa de dilución se añadió a placas que contenían las micromuestras incubadas en 171 µ? de solución de detergente. La placa de micromuestra (con detergente y enzima) se cubrió con cinta y se colocó en la incubadora/agitador durante 30 minutos a 1400 rpm. Después de la incubación, 75 µ? de la mezcla de reacción fue transferida a una placa con fondo en F vacía y la absorbancia se leyó en un lector de MTP a 405 nm después de eliminación de burbujas con una secadora de aire. Los controles testigo, que contenían una o dos micromuestras y detergente sin la adición de la subtilisina de referencia que contenía muestras también se incluyeron en la prueba.

Tabla 6-1 Condiciones de Lavado de Ropa y Vajilla *Abreviaturas : Procter & Gamble (P&G); y Reckitt Benckiser (RB) .

Prueba de Micromuestra de Sangre-Leche-Tinta (BMI) El rendimiento de remoción de manchas de la variante de subtilisina se determinó en una escala de placa de microtitulación (MTP) en detergentes comercialmente disponibles. Muestras de la subtilisina de referencia y la variante de subtilisina se obtuvieron de caldo de cultivo filtrado de cultivos que crecieron en placas de MTP durante 3 días a 37°C/ 300 rpm/ 90% de humedad relativa. El equipo usado incluyó: placas de poliestireno de 96 pozos (Costar No. 9017, fondo plano de unión de medio), Biomek FX y/o Biomek FXp (Beckman Coulter) , Spectramax Plus 384 (Molecular Devices) , Una incubadora/agitador iEMS con 1 mm de amplitud (Thermo Electron Corporación) y cinta de sellado (Nunc No. 236366) . Los reactivos usados incluyeron: 5 mM de HEPES, pH 8.0 o 5 mM de OPS, pH 7 regulador de pH, 3:1 de Ca:Mg para dureza de agua del medio. (CaCl2: MgCl2*6H20) ; 256500 g/1 (gramos por litro) de abastecimiento diluido a 6 gpg, dos muestras de BMI (sangre/leche/tinta) por placa: muestras de algodón con EMPA-116 BMI por CFT: dos muestras pre-enjuagadas y perforadas por pozo, y detergente TIDE® 2X en existencia inactivado con calor el cual carecía de actividad de proteasa se confirmó. En esta prueba, las proteasas hidrolizan el sustrato y liberan pigmento y partículas insolubles del sustrato.

Tabla 6-2 Soluciones de Detergente de Trabajo La incubadora se fijó a la temperatura deseada (16°C o 32°C) . Primero, muestras de 10 pL de la placa de dilución maestra de ~10 ppm de enzima se añadió a 2 placas de muestra con BMI con 190 \ih de soluciones de detergente de trabajo listadas anteriormente. El volumen se ajustó para dar una concentración final de 0.5 ppm para variantes en las placas de prueba. Las placas fueron inmediatamente transferidas a incubadoras iEMS y se incubaron durante 30 minutos con 1400 rpm de agitación a la temperatura dada. Después de la incubación, 100 µ?^ de sobrenadante fue transferido a una nueva placa de 96 pozos y la absorbancia se midió en un lector de MTP a 405 nm y/o 600 nm. Pozos de control, que contenían 1 ó 2 micromuestras y detergente sin la adición de muestras de proteasa también se incluyeron en la prueba. La medición a 405 nm provee un valor más alto y rastrea la remoción de pigmento, mientras que la medición a 600 nm rastrea turbidez y limpieza.

Cálculo de la Actividad de Remoción de Manchas El valor de absorbancia obtenido fue corregido para el valor del testigo (sustrato sin enzima) , al proveer una medición de actividad hidrolítica. Para cada muestra (variante) , se calculó el índice de rendimiento. El índice de rendimiento compara el rendimiento de la variante (valor real) y la enzima estándar (valor teórico) a la misma concentración de proteína. Además, los valores teóricos se pueden calcular mediante el uso de los parámetros de la ecuación de Langmuir de la enzima estándar. Un índice de rendimiento (PI) que es mayor que 1 (PI>1) identifica una mejor variante en comparación con el estándar (v.gr., tipo silvestre) , mientras que un PI de 1 (PI=1) identifica una variante que el mismo rendimiento que el estándar, y un PI que es menor que 1 (PI<1) identifica una variante que tiene un rendimiento peor que el estándar. Por lo tanto, el PI identifica ganadores, así como variantes que son menos deseables para usarse bajo ciertas circunstancias.

El rendimiento de limpieza de la variante de subtilisina se determinó mediante el uso de una prueba de micromuestra (muestras CS-38) . La estabilidad a LAS/EDTA y termoestabilidad para la variante también se determinó mediante el uso de métodos descritos anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 6-3.

Tabla 6-3 Valores para el Rendimiento de Remoción de Manchas en Muestras CS-38, Estabilidad y Termoestabilidad a LAS/EDTA *detergente CALGO IT® ; **detergente CASCADE® Además de estos experimentos, se proveen experimentos para determinar el rendimiento de limpieza en aplicaciones de lavandería de la variante de proteasa. Los detergentes de prueba son detergentes para lavandería inactivados con calor comercialmente obtenidos (v.gr., TIDE® 2X Free [P&G; "NA HDL"] TIDE® Free [P&G; "NA HDD"]). El rendimiento de limpieza de micromuestras manchadas con BMI se prueba mediante el uso de 0.2 ppm de la variante a 25°C durante 30 minutos con 1400 rpm de agitación en un volumen de 200 uL. La funcionalidad de la variante es cuantificada como un índice de rendimiento (Pi) , que es la relación de rendimiento de una variante a una proteína original GCI-P036.

Ejemplo 7 Composiciones Detergentes Líquidas para Lavandería En este ejemplo, se proveen varias formulaciones para composiciones detergentes líquidas para lavandería. Las siguientes composiciones detergentes líquidas para lavandería de la presente invención se preparan como se muestra a continuación. En cada una de estas formulaciones, por lo menos una variante de proteasa provista aquí se incluye a una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, según lo determine el formulador, con base en sus necesidades.

Monoetanolamina 5.0 5.0 5.0 5.0 2.0 Hidróxido de sodio - - 2.5 1.0 1.5 Solución acuosa de HCl 1N #1 #1 - - - Propanodiol 12.7 14.5 13.1 10. 8.0 Etanol 1.8 2.4 4.7 5.4 1.0 DTPA 0.5 0.4 0.3 0.4 0.5 Pectina liasa - - - 0.005 - Amilasa 0.001 0.002 - - Celulasa - - 0.0002 0.0001 Lipasa 0.1 - 0.1 - 0.1 NprE (opcional) 0.05 0.3 - 0.5 0.2 PMN - - 0.08 - - Proteasa A (opcional) - - - - 0.1 Aldosa oxidasa - - 0.3 - 0.003 ZnC12 0.1 0.05 0.05 0.05 0.02 Formiato de Ca , 0.05 0.07 0.05 0.06 0.07 DETBCHD - - 0.02 0.01 - SRP1 0.5 0.5 - 0.3 0.3 Acido bórico - - - - 2.4 Xilensulfonato de sodio - - 3.0 - - Cumensulfonato de sodio - - - 0.3 0.5 DC 3225C 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2 -butil -octanol 0.03 0.04 0.04 0.03 0.03 Abrillantador 1 0.12 0.10 0.18 0.08 0.10 El resto a 100% de perfume/colorante y/o agua #1: Se añade solución acuosa de HCl 1N para ajustar el pH neto de la fórmula en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 5.

El pH de los ejemplos anteriores 7(1) -(II) es aproximadamente 5 a aproximadamente 7, y de 7(III)-(V) es aproximadamente 7.5 a aproximadamente 8.5.

Ejemplo 8 Composiciones Detergentes Líquidas para Lavado Manual de vaj illa En este ejemplo, se proveen varias formulaciones detergentes líquidas para lavado manual. Las siguientes composiciones detergentes líquidas para lavado manual de la presente invención se proveen a continuación. En cada una de estas formulaciones, por lo menos una variante de proteasa provista aquí se incluye a una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, según lo determine el formulador, con base en sus necesidades.

El pH de los ejemplos 8(1) -(VI) es aproximadamente 8 a aproximadamente 11.

E emplo 9 Composiciones Detergentes Líquidas para Lavado Automático de Vajilla En este ejemplo, se proveen varias formulaciones detergentes líquidas para lavado automático de vajilla. Las siguientes composiciones líquidas para lavado manual de vajilla de la presente invención se proveen a continuación. En cada una de estas formulaciones, por lo menos una variante de proteasa provista aquí se incluye a una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, según lo determine el formulador, con base en sus necesidades.

Ejemplo 10 Composiciones para Lavandería Granuladas y/o en Tableta Este ejemplo provee varias formulaciones para detergentes para lavanderías granuladas y/o en tableta. Las siguientes composiciones para lavandería de la presente invención, que pueden estar en forma de gránulos o tableta, se proveen a continuación. En cada una de estas formulaciones, por lo menos una variante de proteasa provista aquí se incluye a una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, según lo determine el formulador, con base en sus necesidades .

Compuesto Formulaciones I II III IV v C14-C15AS O TAS 8.0 5.0 3.0 3.0 3.0 LAS 8.0 - 8.0 - 7.0 C12-C15AE3S 0.5 2.0 1.0 - - C12-C15E5 o E3 2.0 - 5.0 2.0 2.0 QAS - - - 1.0 1.0 Zeolit A 20.0 18.0 11.0 - 10.0 SKS-6 (añadido en seco) - - 9.0 - - MA/AA 2.0 2.0 2.0 - - AA - - - - 4.0 Citrato de 3Na 2H20 - 2.0 - - - Acido cítrico (anhidro) 2.0 - 1.5 2.0 - DTPA 0.2 0.2 - - - EDDS - - 0.5 0.1 - HEDP - - 0.2 0.1 - PB1 3.0 4.8 - - 4.0 Percarbonato - - 3.8 5.2 - NOBS 1.9 - - - - NACA OBS - - 2.0 - - TAED 0.5 2.0 2.0 5.0 1.00 BB1 0.06 - 0.34 - 0.14 BB2 - 0.14 - 0.20 - Carbonato de Na anhidro 15.0 18.0 - 15.0 15.0 Sulfato 5.0 12.0 5.0 17.0 3.0 Silicato - 1.0 - - 8.0 nprE (opcional) 0.03 - 0.1 0.06 - PMN - 0.05 - - 0.01 Proteasa B (opcional) - 0.01 - - - Proteasa C (opcional) - - - 0.01 - Lipasa - 0.08 - - - Amilasa 0.001 - - - 0.001 Celulasa - 0.0014 - - - Pectina liasa 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 Aldosa oxidasa 0.03 - 0.05 - - PAAC - 0.01 - - 0.05 El resto a 100% de humedad y/o misceláneos diversos * Perfume, colorante, abrillantador/SRPl/ carboximet i lcelulosa de Na/fotoblanqueador/MgS04/PVPVI/supresor de espumas / PEG de peso molecular alto/arcilla.

Ejemplo 11 Detergentes Líquidos para Lavandería Este ejemplo provee varias formulaciones líquidas de detergentes para lavandería. Las siguientes formulaciones líquidas de detergentes para lavandería de la presente invención se proveen a continuación. En cada una de estas formulaciones, por lo menos una variante de proteasa provista aquí se incluye a una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, según lo determine el formulador, con base en sus necesidades.

Ejemplo 12 Detergentes para Lavado de Vajilla de Alta Densidad Este ejemplo provee varias formulaciones ~ para detergentes para lavado de vajilla de alta densidad. Los siguientes detergentes para lavado de vajilla de alta densidad compactos de la presente invención se proveen a continuación. En cada una de estas formulaciones, por lo menos una variante de proteasa provista aquí se incluye a una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, según lo determine el formulador, con base en sus necesidades.

*Abrillantador/colorante/SRPl/carboximetilcelulosa de Na/fotoblanqueador/MgS04/PVPVI/supresor de espumas/PEG de peso molecular alto/arcilla .

El pH de los ejemplos 12(1) a (VI) es de aproximadamente 9.6 a aproximadamente Ejemplo 13 Composiciones Detergentes en Tableta Este ejemplo provee varias formulaciones detergentes en tableta. Las siguientes composiciones detergentes en tableta de la presente invención se preparan por compresión de una composición detergente granulada para lavado de vajilla a una presión de 13K /cm2 mediante el uso de una prensa giratoria de 12 cabezas estándar. En cada una de estas formulaciones, por lo menos una variante de proteasa provista aquí se incluye a una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, según lo determine el formulador, con base en sus necesidades.

Compuesto Formulaciones I II III IV V VI VII VII STPP - 48.8 44.7 38.2 - 42.4 46.1 46.0 Citrato de 3Na 2H20 20.0 - - - 35.9 - - - Carbonato de Na 20.0 5.0 14.0 15.4 8.0 23.0 20.0 - Silicato 15.0 14.8 15.0 12.6 23.4 2.9 4.3 4.2 Lipasa 0.001 - 0.01 - 0.02 - - - Proteasa B 0.01 - - - - - - - Proteasa C (opcional) - - - - - 0.01 - - nprE (opcional) 0.01 0.08 - 0.04 - 0.023 - 0.05 PMN - - 0.05 - 0.052 - 0.023 - Amilasa 0.012 0.012 0.012 - 0.015 - 0.017 0.002 Pectina Liasa 0.005 - - 0.002 - - - - Aldosa Oxidasa - 0.03 - 0.02 0.02 - 0.03 - PB1 - - 3.8 - 7.8 - - 4.5 Percarbonato 6.0 - - 6.0 - 5.0 - - BB1 0.2 - 0.5 - 0.3 0.2 - - BB2 - 0.2 - 0.5 - - 0.1 0.2 No iónico 1.5 2.0 2.0 2.2 1.0 4.2 4.0 6.5 PAAC 0.01 0.01 0.02 - - - - - DETBCHD - - - 0.02 0.02 - - - TAED - - - - - 2.1 - 1.6 HEDP 1.0 - - 0.9 - 0.4 0.2 - DETP P 0.7 - - - - - - - Parafina 0.4 0.5 0.5 0.5 - - 0.5 - BTA 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 - Policarboxilato 4.0 - - - 4.9 0.6 0.8 - PEG 400-30,000 - - - - - 2.0 - 2.0 Glicerol - - - - - 0.4 - 0.5 Perfume - - - 0.05 0.2 0.2 0.2 0.2 El resto a 100% de humedad y/o misceláneos diversos* *Abrillantador/SRPl/carboximetilcelulosa de Na/fotoblanqueador/MgS04/PVPVl/supresor de espumas/PEG de peso molecular alto/arcilla .

El pH de los ejemplos 13(1) a 13 (VII) es de aproximadamente 10 a aproximadamente 11.5; el pH de 13 (VIII) es de 8-10. El peso de la tableta de los ejemplos 13(1) a 13 (VIII) es de aproximadamente 20 gramos a aproximadamente 30 gramos .

Ejemplo 14 Detergentes Líquidos para Limpieza de Superficies Duras Este ejemplo provee varias formulaciones para detergentes líquidos para limpieza de superficies duras. Las siguientes composiciones detergentes líquidos para limpieza de superficies duras de la presente invención se proveen a continuación. En cada una de estas formulaciones, por lo menos una variante de proteasa provista aquí se incluye a una concentración de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, según lo determine el formulador, con base en sus necesidades.

El pH de los ejemplos 14(1) a (VII) es de aproximadamente 7.4 a aproximadamente 9.5.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica a los cuales incumbe la invención. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los extremos y ventajas mencionadas, así como aquellos inherentes en la misma. Las composiciones y métodos descritos en la presente son representativos de modalidades preferidas, son ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Es fácilmente evidente para un experto en la técnica que se pueden hacer substituciones y modificaciones variables a la invención descrita aquí sin apartarse del alcance y esencia de la invención.

La invención ilustrativamente descrita aquí adecuadamente se puede poner en práctica en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describen específicamente aquí. Los términos y expresiones que se han utilizado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención de que durante el uso de esos términos y expresiones de excluir cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino que se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, cabe entender que aunque la presente invención ha sido específicamente descrita por modalidades preferidas y características opcionales, la modificación y variación de los conceptos en la presente descritos pueden ser redistribuidos por los expertos en la técnica, y que esas modificaciones y variaciones se considera que están dentro del alcance de esta invención como se define por la presente.

La invención se ha descrito ampliamente y genéricamente aquí. Cada una de las especies y agrupaciones subgenéricas más estrechas que caen dentro de la descripción genérica también forma parte de la invención. Esta incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa de eliminar cualquier materia del género, independientemente de si el material eliminado es o no específicamente mencionado en la presente.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una variante de subtilisina caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5.

2. Una composición caracterizada porque comprende la variante de subtilisina de la reivindicación 1.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la composición es una composición de limpieza.

4. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la composición es un detergente para lavandería.

5. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la composición es un detergente para lavado de vajilla.

6. El detergente para lavado de vajilla de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el detergente para lavado de vajilla es un detergente para lavado automático de vajilla.

7. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la composición es un detergente líquido.

8. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la composición es un detergente en gel, tableta, polvo o granulos.

9. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la composición no contiene fosfato.

10. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-9, caracterizada porque comprende por lo menos un agente de blanqueado.

11. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-10, caracterizada porque comprende por lo menos una enzima adicional.

12. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque por lo menos una enzima adicional se selecciona de hemicelulasas , celulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenases , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa y amilasas, o mezclas de las mismas.

13. Un método de limpieza caracterizado porque comprende proveer un artículo que ha de ser limpiado y una composición que comprende la variante de subtilisina expuesta en SEQ ID NO : 5 , y poner en contacto el artículo con la composición .

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende el paso de enjuagar el artículo que ha de ser limpiado.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-14, caracterizado porque el artículo es un artículo de vajilla o de tela.