MX2011004268A

MX2011004268A - Composiciones y metodos para inhibir la expresion de transtiretina.

Info

Publication number: MX2011004268A
Application number: MX2011004268A
Authority: MX
Inventors: Stuart Milstein; Dinah Wenyee Sah; Gregory Hinkle; Rene Alvarez; Qingmin Chen
Original assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-10-20
Filing date: 2009-10-20
Publication date: 2011-06-01
Also published as: HK1216652A1; HUE037875T2; CN106834291A; CN102186978A; JP2018171072A; KR20160079921A; CA3018487A1; IL310600A; ES2543004T3; US10240152B2; EP3848461A1; WO2010048228A2; EA020312B1; AU2009307677A1; IL243178A0; MX360460B; NZ797298A; IL281434B2; JP5791505B2; US12227744B2

Abstract

La invención se refiere a un ácido ribonucleico de hebra doble (ARNds) que tiene como objetivo un gen de transtiretina (TTR), y métodos para usar el ARNds para inhibir la expresión de la TTR.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INHIBIR LA EXPRESIÓN DE TRANSTIRETINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) que tiene como objetivo un gen de transtiretina (TTR) , y métodos para utilizar el ARNds para inhibir la expresión de la TTR.

Referencia Cruzada para las Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana Número de Serie 61/106,956, presentada el 20 de Octubre de 2008; Solicitud Provisional Norteamericana Número de Serie 61/115,738, presentada el 18 de Noviembre de 2008; Solicitud Provisional Norteamericana Número de Serie 61/156,670, presentada el 2 de Marzo de 2009; Solicitud Provisional Norteamericana Número de Serie 61/185,545, presentada el 9 de Junio de 2009; Solicitud Provisional Norteamericana Número de Serie 61/242,783, presentada el 15 de Septiembre de 2009; y Solicitud Provisional Norteamericana Número de Serie 61/244,794, presentada el 22 de Septiembre de 2009, todas las cuales se incorporan aquí por referencia, en sus totalidades, para todos los propósitos.

Referencia al Listado de Secuencias Esta solicitud incluye un Listado de Secuencias propuesto electrónicamente como un archivo de texto nombrado . txt, creado el on un tamaño de bytes. El listado de secuencias se incorpora por referencia .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La transtiretina (TTR) es una proteina de enlace a la hormona tiroidea secretada. La TTR enlaza y transporta la proteina de enlace al retinol (RBP) /Vitamina A, y la tiroxina en suero (T4) en plasma y el liquido cerebroespinal.

Tanto la TTR de secuencia normal como la TTR de secuencia variante causan amiloidosis. La TTR de secuencia normal causa amiloidosis cardiaca en las personas de edad avanzada y se denomina amiloidosis sistémica senil (SSA) (también llamada amiloidosis cardiaca senil (SCA) ) . La SSA a menudo está acompañada por depósitos microscópicos en muchos otros órganos. Las mutaciones de la TTR aceleran el proceso de formación amiloidea de TTR y son el factor de riesgo más importante para el desarrollo de amiloidosis por TTR clínicamente significativa (también llamada ATTR (tipo amiloidosis-transtiretina) ) . Se sabe que más de 85 variantes de TTR amiloidogénicas causan amiloidosis familiar sistémica. El hígado es el sitio principal de expresión de TTR. Otros sitios significativos de expresión incluyen el plexo coroideo, la retina y el páncreas. amiloidosis por TTR se manifiesta en varias formas Cuando el sistema nervioso periférico se afecta en una manera más notable, el padecimiento se denomina polineuropatia amiloidótica familiar (FAP). Cuando el corazón está primariamente involucrado pero no lo está el sistema nervioso, el padecimiento se denomina cardiomiopatia amiloidótica familiar (FAC). Un tercer tipo principal de amiloidosis por TTR se denomina amiloidosis leptomeningea/CNS (Sistema Nervioso Central).

Las moléculas de ARN de doble hebra (ARNds) han sido mostradas por bloquear la expresión del gen en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia de ARN (iARN) . La WO 99/32619 (Fire et al.) describió el uso de un ARNds de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión de genes en C. elegans . El ARNds también ha sido mostrado por degradar el ARN objetivo en otros organismos, incluyendo plantas (vea, por ejemplo, WO 99/53050, Waterhouse et al.; y WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (vea, por ejemplo, Yang, D. , et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200), y mamíferos (vea WO 00/44895, Limmer; y DE 101 00 586.5, Kreutzer et al) .

La U.S. 20070207974 describe ARNsi's funcionales e hiper-funcionales. La U.S. 20090082300 describe moléculas antisentido dirigidas contra la TTR. La Patente Norteamericana Número 7,250,496 describe microARNs dirigidos contra la TTR.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención proporciona un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR) , en donde dicho ARNds comprende un hebra sentido y una hebra antisentido, la hebra antisentido que comprende una región complementaria para una parte de un ARNm que codifica la transtiretina (TTR) , en donde dicha región de complementariedad es de menos que 30 nucleótidos de longitud y la hebra antisentido comprende 15 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 730, o SEQ ID NO: 1010. En una modalidad relacionada, la hebra sentido comprende 15 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 729, o SEQ ID NO: 1009. En aún otra modalidad relacionada, la hebra sentido consiste de SEQ ID NO: 449 y la hebra antisentido consiste de SEQ ID NO: 450. En aún otra modalidad relacionada, la hebra sentido consiste de SEQ ID NO: 729 y la hebra antisentido consiste de SEQ ID NO: 730. En todavía otra modalidad relacionada, la hebra sentido consiste de SEQ ID NO: 1009 y la hebra antisentido consiste de SEQ ID NO: 1010. En aún otra modalidad relacionada, el ARNds comprende una hebra sentido seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7, y 16, y una hebra antisentido seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7, y 16.

En ciertas modalidades, la región de complementariedad entre la hebra antisentido del ARNds y el ARNm que codifica la transtiretina es de 19 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la región de complementariedad consiste de SEQ ID NO: 169. En otras modalidades, cada hebra del ARNds es de 19, 20, 21, 22, 23, o 24 nucleótidos de longitud. En todavía otra modalidad, cada hebra es de 21 nucleótidos de longitud.

En ciertas modalidades, el ARNds para inhibir la expresión de la transtiretina no escinde un ARNm TTR entre el nucleótido de adenina en la posición 637 de la SEQ ID NO: 1331 y el nucleótido de guanina en la posición 638 de la SEQ ID NO: 1331. En otras modalidades, el ARNds escinde un ARNm TTR entre el nucleótido de guanina en la posición 636 de la SEQ ID NO: 1331 y el nucleótido de adenina en la posición 637 de la SEQ ID NO: 1331. En ciertas modalidades, el ARNds se hibridiza por calentamiento y enfriamiento a un ARNm TTR entre el nucleótido de guanina en la posición 628 de la SEQ ID NO: 1331 y el nucleótido de uracilo en la posición 646 de la SEQ ID NO: 1331.

En aún otras modalidades relacionadas, la invención proporciona un ARNds como se describe anteriormente para inhibir la expresión de la transtiretina en donde el ARNds comprende uno o más nucleótidos modificados. En modalidades relacionadas, al menos un nucleótido (o nucleótidos) modificado se selecciona del grupo que consiste de: un nucleótido modificado 2' -O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5' -fosforotioato, y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico. En otra modalidad relacionada, el nucleotido modificado se escoge del grupo de: un nucleotido modificado con 2' -desoxi-2' -fluoro, un nucleotido modificado con 2'-desoxi, un nucleotido cerrado, un nucleotido abásico o no básico, nucleotido modificado con 2'-amino, nucleotido modificado con 2' -alquilo, nucleotido de morfolino, un fosforamidato, y un nucleotido que comprende base no natural. En ciertas modalidades, el ARNds comprende al menos un nucleotido modificado con 2'-0-metilo.

En otras modalidades, un ARNds como se describe anteriormente para inhibir la expresión de la transtiretina se conjuga a un ligando, o se formula en una formulación de lipido. En ciertas modalidades, la formulación de lipido puede ser una formulación LNP, una formulación LNP01, una formulación XTC-SNALP, o una formulación SNALP. En modalidades relacionadas, la formulación XTC-SNALP es como sigue: utilizando 2, 2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [1,3] -dioxolano (XTC) con XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA en una proporción de 57.1/7.1/34.4/1.4 y una proporción lipido:ARNsi de aproximadamente 7. En aún otras modalidades relacionadas, la hebra sentido del ARNds consiste de SEQ ID NO: 1009 y la hebra antisentido consiste de SEQ ID NO: 1010, y el ARNds se formula en una formulación XTC-SNALP como sigue: utilizando 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [ 1 , 3] -dioxolano (XTC) con XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA en una proporción de 57.1/7.1/34.4/1.4 y una proporción lipido:ARNsi de aproximadamente 7. Alternativamente, un ARNds tal como aquellos descritos anteriormente se puede formular en una formulación LNP09 como sigue: utilizando XTC/DSPC/Col/PEG2ooo-C14 en una proporción de 50/10/38.5/1.5 % mol y una proporción lipido:ARNsi de aproximadamente 11:1. En otra variación, el ARNds se formula en una formulación LNP11 como sigue: utilizando MC3/DSPC/Col/PEG20oo-C14 en una proporción de 50/10/38.5/1.5 % mol y una proporción lipido:ARNsi de aproximadamente 11:1. En aún otra modalidad, el ARNds se formula en una formulación LNP09 o una formulación LNP11 y reduce los niveles de ARNm TTR por aproximadamente 85 a 90% en una dosis de 0.3 mg/kg, con relación a un grupo de control PBS. En todavía otra modalidad, el ARNds se formula en una formulación LNP09 o una formulación LNP11 y reduce los niveles de ARNm TTR por aproximadamente 50% en una dosis de 0.1 mg/kg, con relación a un grupo de control PBS. En todavía otra modalidad, el ARNds se formula en una formulación LNP09 o una formulación LNP11 y reduce los niveles de proteína TTR en una manera dependiente de la dosis con relación a un grupo de control PBS según se mide mediante una mancha estern. En todavía otra modalidad, el ARNds se formula en una formulación SNALP como sigue: utilizando DlinDMA con DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG2ooo-cDMA en una proporción de 57.1/7.1/34.4/1.4 y una proporción lípido:ARNsi de aproximadamente 7.

En ciertas modalidades, la invención proporciona un ARNds tal como aquellos descritos anteriormente para inhibir la expresión de la transtiretina, en donde la administración del ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente 95% de la expresión del ARNm TTR según se mide mediante un ensayo PCR en tiempo real, en donde la célula es una célula HepG2 o una célula Hep3B, y en donde la concentración del ARNds es ????. En modalidades relacionadas, la administración del ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente 74% de la expresión del ARNm TTR según se mide mediante una prueba de ADN ramificado, en donde la célula es una célula HepG2 o una célula Hep3B, y en donde la concentración del ARNds es ????. En otras modalidades relacionadas, el ARNds tiene una IC50 de menos que 10 pM en una célula HepG2, en donde la concentración del ARNds es ????. En aún otras modalidades relacionadas, el ARNds tiene una ED50 de aproximadamente 1 mg/kg. En aún otras modalidades relacionadas, la administración del ARNds reduce el ARNm TTR por aproximadamente 80% en el hígado del mono cinomolgo, en donde la concentración del ARNds es 3 mg/kg. En aún otras modalidades relacionadas, la administración del ARNds no da como resultado una actividad inmunoestimulante en las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) según se mide mediante los ensayos ELISA IFN-alfa y TNF-alfa. En aún otras modalidades relacionadas, la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm TTR del hígado por aproximadamente 97% o los niveles de proteína TTR en suero por aproximadamente 90%, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg. En aún otras modalidades relacionadas, la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm TTR del hígado y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 22 días, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg o 3 mg/kg. En aún otras modalidades relacionadas, el ARNds suprime los niveles de proteína TTR en suero hasta el día 14 post-tratamiento cuando se administra a un sujeto en necesidad del mismo en 1 mg/kg o 3 mg/kg. En aún otras modalidades relacionadas, el ARNds reduce la expresión de TTR por 98.9% en una célula Hep3B en una concentración de 0. InM según se mide mediante PCR en tiempo real. En aún otras modalidades relacionadas, el ARNds reduce la expresión de TTR por 99.4% en una célula Hep3B en una concentración de ???? según se mide mediante PCR en tiempo real.

En otras modalidades, la invención proporciona un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR) , en donde dicho ARNds comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, la hebra antisentido que comprende una región complementaria para una parte de un ARNm que codifica la transtiretina (TTR) , en donde dicha región de complementariedad es de menos que 30 nucleótidos de longitud y en donde el ARNds comprende una hebra sentido seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7, y 16, y una hebra antisentido seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7, y 16.

En otra modalidad, la invención proporciona un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR) , en donde dicho ARNds comprende una hebra antisentido que comprende una región complementaria para 15-30 nucleótidos de los nucleótidos 618-648 de la SEQ ID NO: 1331 y en donde dicha hebra antisentido hace pares de base con la guanina en la posición 628 de la SEQ ID NO: 1331.

En ciertas modalidades, la invención proporciona una célula que contiene cualquiera de los ARNds' s descritos anteriormente en el Resumen. En ciertas otras modalidades, la invención proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra de cualquiera de los ARNds descritos anteriormente en el Resumen. En ciertas modalidades, el vector está en una célula.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de TTR que comprende cualquiera de los ARNds' s descritos anteriormente en el Resumen, y un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades relacionadas, la invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de TTR que comprende un ARNds y una formulación SNALP, en donde el ARNds comprende una hebra antisentido que es de menos que 30 nucleótidos de longitud y comprende 15 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 730, o SEQ ID NO: 1010, y en donde la formulación SNALP comprende DlinDMA, DPPC, Colesterol y PEG2000-cDMA en una proporción de 57.1/7.1/34.4/1.4 respectivamente .

En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de TTR en una célula, el método que comprende: (a) contactar la célula con cualquiera de los ARNds's descritos anteriormente en el Resumen; y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito del ARNm de un gen de TTR, inhibiendo por consiguiente la expresión del gen de TTR en la célula.

En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar un desorden mediado por la expresión de TTR que comprende administrar a un humano en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los ARNds's descritos anteriormente en el Resumen. En modalidades relacionadas, el ARNds se administra al humano en aproximadamente 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, o 5.0 mg/kg. En aún otra modalidad relacionada, el ARNds se administra al humano en aproximadamente 1.0 mg/kg. En aún otra modalidad relacionada, el humano que se trata tiene amiloidosis por transtiretina, y/o un desorden del hígado. En una modalidad relacionada, al humano se le proporciona adicionalmente un trasplante de hígado. En aún otra modalidad, la administración del ARNds reduce el ARNm TTR por aproximadamente 80% en el hígado humano, en donde la concentración del ARNds es 3 mg/kg. En aún otra modalidad relacionada, la administración del ARNds no da como resultado una actividad inmunoestimulante en el humano según se mide mediante los ensayos ELISA IFN-alfa y TNF-alfa. En aún otra modalidad relacionada, la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm TTR del hígado por aproximadamente 97% o los niveles de proteína TTR en suero por aproximadamente 90%, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg. En aún otra modalidad relacionada, la administración del ARNds reduce los niveles de ARNm TTR del hígado y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 22 días, en donde la concentración del ARNds es 6 mg/kg o 3 mg/kg. En aún otra modalidad relacionada, el ARNds se formula en una formulación LNP09 como sigue: utilizando XTC/DSPC/Col/PEG20oo-C14 en una proporción de 50/10/38.5/1.5 % mol y una proporción lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1. En aún otra modalidad relacionada, el ARNds se formula en una formulación LNP11 como sigue: utilizando MC3/DSPC/Col/PEG2ooo-C14 en una proporción de 50/10/38.5/1.5 % mol y una proporción lípido:ARNsi de aproximadamente 11:1. En aún otra modalidad relacionada, el ARNds se formula en una formulación LNP09 o una formulación LNP11 y reduce los niveles de ARNm TTR por aproximadamente 85 a 90% en una dosis de 0.3 mg/kg, con relación a un grupo de control PBC . En aún otra modalidad relacionada, el ARNds se formula en una formulación LNP09 o una formulación LNP11 y reduce los niveles de ARNm TTR por aproximadamente 50% en una dosis de 0.1 mg/kg, con relación a un grupo de control PBC. En todavía otra modalidad relacionada, el ARNds se formula en una formulación LNP09 o una formulación LNP11 y reduce los niveles de proteina TTR en una manera dependiente de la dosis con relación a un grupo de control PBC según se mide mediante una mancha western. En todavía otra modalidad relacionada, la administración del ARNds suprime los niveles de proteína TTR en suero hasta el día 14 post-tratamiento cuando se administra al humano en 1 mg/kg o 3 mg/kg. En todavía otra modalidad relacionada, el ARNds se formula en una formulación SNALP como sigue: utilizando DIinDMA con DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG2ooo-cDMA en una proporción de 57.1/7.1/34.4/1.4 y una proporción lipidorARNsi de aproximadamente 7.

En otra modalidad, la invención proporciona el uso de un ARNds para tratar un desorden mediado por la expresión de TTR que comprende administrar a un humano en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los ARNds' s descritos anteriormente en el Resumen. En modalidades relacionadas, el ARNds se administra al humano en aproximadamente 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, o 5.0 mg/kg. En una modalidad relacionada particular, el ARNds se administra al humano en aproximadamente 1.0 mg/kg. En otra modalidad relacionada, el humano tiene amiloidosis por transtiretina, y/o un desorden del hígado. En aún otra modalidad del uso previsto por la invención, al humano tratado se le proporciona adicionalmente un trasplante de hígado.

En aún otra modalidad, la invención proporciona el uso de un ARNds en un método para inhibir la expresión de TTR en una célula, en donde el método comprende (a) contactar la célula con un ARNds descrito anteriormente en el Resumen; y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito del ARNm de un gen de TTR, inhibiendo por consiguiente la expresión del gen de TTR en la célula.

Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en la descripción de abajo. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 es una gráfica de los niveles de TNF-alfa e IFN-alfa en PB Cs humanas cultivadas después de la transfección con ARNsi TTR.

Las FIGURAS 2A y 2B son curvas de respuesta a la dosis para AD-18324 y AD-18328, respectivamente, en células HepG2.

La FIGURA 3 es una curva de respuesta a la dosis para AD- 18246 en células HepG2.

La FIGURA 4A y la FIGURA 4B muestran la inhibición del ARNm del hígado y los niveles de proteína en plasma, respectivamente, en ratones H129-mTTR-K0/iN0S-K0/hTTR transgénicos mediante una administración intravenosa en bolo de ARNds TTR (AD-18324, AD-18328 y AD-18246) formulado en LNP01.

La FIGURA 5 es una gráfica gue resume las mediciones de los niveles de ARNm TTR en hígados de primates no humanos después de una infusión intravenosa de 15 minutos de ARNds TTR (AD-18324 y AD-18328) formulado en SNALP.

La FIGURA 6A y la FIGURA 6B muestran la inhibición del ARNm del hígado TTR V30M humano y los niveles de proteína en suero, respectivamente, en ratones transgénicos mediante una administración intravenosa en bolo de SNALP-18328. Los promedios del grupo se determinaron, se normalizaron al grupo de control PBS, y posteriormente se graficaron. Las barras de error representan las desviaciones estándar. La reducción porcentual del promedio del grupo, con relación a PBS, se indica para los grupos SNALP-1955 y SNALP-18328. (***p< 0.001, ANOVA de una vía, con prueba post-hoc de Dunn) .

La FIGURA 7A y la FIGURA 7B muestran la durabilidad de la reducción del ARNm del hígado TTR V30M humano y los niveles de proteína en suero, respectivamente, en ratones transgénicos sobre 22 días después de una sola administración intravenosa en bolo de SNALP-18328. Se determinaron los promedios del grupo. Los niveles de ARNm TTR/GAPDH se normalizaron a los niveles del dia 0 y se graficaron. La reducción porcentual de los niveles de ARNm TTR normalizados con relación a SNALP-1955 para cada punto de tiempo se calculó y se indicó para los grupos SNALP-18328. (***p< 0.001, ANOVA de una vía, con prueba post-hoc de Dunn) .

La FIGURA 8 muestra el curso de tiempo de los niveles de proteina TTR en suero en primates no humanos sobre 14 dias después de una sola infusión intravenosa de 15 minutos de SNALP-18328.

La FIGURA 9 muestra la reducción de la inmunoreactividad de TTR en varios tejidos de ratones TTR V30M humano/sin expresión de HSF-1 después de la administración intravenosa en bolo de SNALP-18328. E, esófago; S, estómago; II, intestino/duodeno; 14, intestino/colon; N, nervio; D, ganglio de la raíz dorsal.

La FIGURA 10 muestra las mediciones de los niveles de ARNm TTR en hígados de primates no humanos después de la infusión intravenosa de 15 minutos de XTC-SNALP-18328.

Las FIGURAS 11A y 11B muestran las mediciones del ARNm TTR y los niveles de proteína en suero, respectivamente, en hígados de primates no humanos después de la infusión intravenosa de 15 minutos de LNP09-18328 o LNP11-18328. La FIGURA 11C muestra el curso de tiempo de los niveles de proteina TTR en suero sobre 28 días después de una infusión intravenosa de 15 minutos de 0.3 mg/kg de LNP09-18328, según se compara al grupo de control PBS .

La FIGURA 12 muestra la secuencia del ARNm TTR humana (Ref. Sec. NM_000371.3, SEQ ID NO: 1331) .

Las FIGURAS 13A y 13B son las secuencias del ARNm TTR humana y de rata, respectivamente. La FIGURA 13A es la secuencia del ARNm TTR humana (Ref. Sec. NM_000371.2 , SEQ ID NO: 1329) . La FIGURA 13B es la secuencia del ARNm TTR de rata (Ref. Sec. NM_012681.1, SEQ ID NO: 1330) .

La FIGURA 14 muestra la alineación de nucleótidos de NM_000371.3, NM_000371.2, y AD-18328.

La FIGURA 15 ilustra los síntomas y las mutaciones en TTR asociados con la neuropatía amiloidótica familiar, cardiomiopatía amiloidótica familiar y amiloidosis CNS.

La FIGURA 16 muestra la reducción de los niveles de ARNm TTR en el hígado con SNALP-18534 con diferentes duraciones de infusión. Los grupos de animales (n = 4/grupo) se administraron con 1 mg/kg de SNALP-18534 por medio de una infusión de 15 minutos, o 1, 2, o 3 horas. Cuarenta y ocho horas más tarde, las ratas se sometieron a eutanasia y se cosecharon los hígados. Los niveles de ARNm TTR y GAPDH se midieron a partir de los lisados del hígado utilizando el ensayo de ADNb de Quantigene. La proporción de niveles de ARNm TTR a GAPDH se calculó para cada animal. Los promedios del grupo se determinaron y normalizaron a un grupo de control PBS, y posteriormente se graficaron. Las barras de error representan las desviaciones estándar. (***p< 0.001, ANOVA de una vía con ensayo post-hoc de Bonferroni, con relación a PBS) .

La FIGURA 17 muestra las mediciones de los niveles de ARNm TTR en hígados de ratas después de la infusión intravenosa de 15 minutos de LNP07-18534 o LNP08-18534.

La FIGURA 18 muestra la inhibición in vivo de los niveles endógenos de ARNm TTR en hígados de ratas Sprague-Da ley después de una infusión IV de 15 min. de LNP09-18534 o LNP11-18534. Los grupos de animales (n= 4/grupo) se administraron por vía intravenosa con 0.01, 0.03, 0.1, o 0.3 mg/kg de LNP09-18534, LNP-11-18534; o PBS por medio de una infusión de 15 minutos. Cuarenta y ocho horas más tarde, los animales se sometieron a eutanasia y se cosecharon los hígados. Los niveles de ARNm TTR y GAPDH se midieron a partir de los lisados de la biopsia del hígado utilizando el ensayo de ADNb de Quantigene. La proporción de niveles de ARNm TTR a GAPDH se calculó para cada animal. Los promedios del grupo se determinaron, se normalizaron al grupo de control PBS, y posteriormente se graficaron. Las barras de error representan las desviaciones estándar.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona ARNds's y métodos para utilizar los ARNds' s para inhibir la expresión de un gen de TTR en una célula o un mamífero donde el ARNds tiene como objetivo un gen de TTR. La invención también proporciona composiciones y métodos para tratar condiciones patológicas y padecimientos, tales como una amiloidosis por TTR, en un mamífero causada por la expresión de un gen de TTR. El ARNds dirige la degradación específica a la secuencia del ARNm a través de un proceso conocido como interferencia de ARN (iARN) .

Los ARNds de las composiciones presentadas aquí incluyen una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que es de menos que 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, y es sustancialmente complementaria para al menos parte de un transcrito del ARNm de un gen de TTR. El uso de estos ARNds permite la degradación que se tiene como objetivo de los ARNm de los genes que están implicados en las patologías asociadas con la expresión de TTR en mamíferos. En particular, dosis muy bajas de ARNds TTR pueden específicamente y eficientemente mediar la iARN, dando como resultado la inhibición significativa de la expresión de un gen de TTR. Utilizando ensayos basados en células, los presentes inventores han demostrado que los ARNds' s que tienen como objetivo la TTR pueden específicamente y eficientemente mediar la iARN, dando como resultado la inhibición significativa de la expresión de un gen de TTR. De esta manera, los métodos y las composiciones que incluyen estos ARNds son útiles para tratar procesos patológicos que pueden ser mediados por la TTR de regulación descendente, tal como en el tratamiento de un desorden del hígado o una amiloidosis por TTR, por ejemplo, FAP.

Los métodos y las composiciones que contienen un ARNds TTR son útiles para tratar procesos patológicos mediados por la expresión de TTR, tales como una amiloidosis por TTR. En una modalidad, un método para tratar un desorden mediado por la expresión de TTR incluye administrar a un humano en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un ARNds enfocado a TTR. En una modalidad, un ARNds se administra al humano en aproximadamente 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 mg/kg.

La siguiente descripción detallada describe cómo hacer y utilizar las composiciones que contienen los ARNds para inhibir la expresión de un gen de TTR, así como también composiciones y métodos para tratar padecimientos y desórdenes causados por la expresión de este gen. Las composiciones farmacéuticas presentadas en la invención incluyen un ARNds que tiene una hebra antisentido que comprende una región de complementariedad que es de menos que 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, y es sustancialmente complementaria para al menos parte de un transcrito del ARN de un gen de TTR, conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones presentadas en la invención también incluyen un ARNds que tiene una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad que es de menos que 30 nucleotidos de longitud, generalmente 19-24 nucleotidos de longitud, y es sustancialmente complementaria para al menos parte de un transcrito del ARN de un gen de TTR.

La hebra sentido de un ARNds puede incluir 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o más nucleotidos contiguos de SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 729, o SEQ ID NO: 1009. La hebra antisentido de un ARNds puede incluir 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o más nucleotidos contiguos de SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 730, o SEQ ID NO: 1010. En una modalidad, la hebra sentido de un ARNds puede consistir de la SEQ ID NO: 449 o fragmentos de la misma y la hebra antisentido puede consistir de la SEQ ID NO: 450 o fragmentos de la misma. En una modalidad, la hebra sentido de un ARNds puede consistir de la SEQ ID NO: 729 o fragmentos de la misma y la hebra antisentido puede consistir de la SEQ ID NO: 730 o fragmentos de la misma. En una modalidad, la hebra sentido de un ARNds puede consistir de la SEQ ID NO: 1009 o fragmentos de la misma y la hebra antisentido puede consistir de la SEQ ID NO: 1010 o fragmentos de la misma.

En una modalidad, un ARNds puede incluir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más nucleotidos modificados. En una modalidad, un nucleótido modificado puede incluir un nucleótido modificado con 2' -O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5' -fosforotioato, y/o un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico. En una modalidad, un nucleótido modificado puede incluir un nucleótido modificado con 2 ' -desoxi-2 ' -fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido cerrado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2' -alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, ylo un nucleótido que comprende base no natural.

En una modalidad, la región de complementariedad de un ARNds es de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o más nucleótidos de longitud. En una modalidad, la región de complementariedad incluye 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 169.

En una modalidad, cada hebra de un ARNds es de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos de longitud. En una modalidad, el ARNds incluye una hebra sentido, o 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 fragmentos de nucleótidos de la misma, seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7, y 16, y una hebra antisentido, o 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 fragmentos de nucleótidos de la misma, seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7, y 16.

En una modalidad, la administración de un ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o más de la expresión del ARNm TTR según se mide mediante un ensayo PCR en tiempo real. En una modalidad, la administración de un ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente 40% a 45%, 45% a 50%, 50% a 55%, 55% a 60%, 60% a 65%, 65% a 70%, 70% a 75%, 75% a 80%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 95% o más de la expresión del ARNm TTR según se mide mediante un ensayo PCR en tiempo real. En una modalidad, la administración de un ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o más de la expresión del ARNm TTR según se mide mediante un ensayo de ADN ramificado. En una modalidad, la administración de un ARNds a una célula da como resultado una inhibición de aproximadamente 40% a 45%, 45% a 50%, 50% a 55%, 55% a 60%, 60% a 65%, 65% a 70%, 70% a 75%, 75% a 80%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 95% o más de la expresión del ARNm TTR según se mide mediante un ensayo de ADN ramificado .

En una modalidad, un ARNds tiene una IC50 de menos que O.OlpM, O.lpM, ???, 5pM, ????, ?????, o 1000pM. En una modalidad, un ARNds tiene una ED50 de aproximadamente 0.01, 0.1, 1, 5, o 10 mg/kg.

En una modalidad, la administración de un ARNds puede reducir el ARNm TTR por aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o más en monos cinomolgos. En una modalidad, la administración de un ARNds reduce los niveles de ARNm TTR del hígado por aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o más o los niveles de proteína TTR en suero por aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o más. En una modalidad, la administración de un ARNds reduce los niveles de 'ARNm TTR del hígado y/o los niveles de proteína TTR en suero hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más días.

En una modalidad, un ARNds se formula en una formulación LNP y reduce los niveles de ARNm TTR por aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o más en una dosis de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, o 1 mg/kg, con relación a un grupo de control PBC . En una modalidad, un ARNds se formula en una formulación LNP y reduce los niveles de proteína TTR aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o más con relación a un grupo de control PBC según se mide mediante una mancha western. En una modalidad, un ARNds suprime los niveles de proteína TTR en suero hasta el día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 post-tratamiento cuando se administra a un sujeto en necesidad del mismo en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 mg/kg.

Consecuentemente, en algunos aspectos, se presentan en la invención composiciones farmacéuticas que contienen un ARNds TTR y un portador farmacéuticamente aceptable, métodos para utilizar las composiciones para inhibir la expresión de un gen de TTR, y métodos para utilizar las composiciones farmacéuticas para tratar padecimientos causados por la expresión de un gen de TTR.

I . Definiciones Por conveniencia, a continuación se proporciona el significado de ciertas frases y términos utilizados en la especificación, ejemplos, y reivindicaciones anexas. Si existe una discrepancia aparente entre el uso de un término en otras partes de esta especificación y su definición provista en esta sección, prevalecerá la definición en esta sección.

"G", "C", "A" y "U" cada uno generalmente significa un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina, y uracilo como una base, respectivamente. "T" y "dT" se utilizan aqui de forma intercambiable y se refieren a un desoxiribonucleótido en donde la nucleobase es timina, por ejemplo, desoxiribotimina . Sin embargo, se entenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" o "desoxiribonucleótido" también se puede referir a un nucleótido modificado, como se detalla adicionalmente a continuación, o un radical de reemplazo extra. La persona experta está consciente que la guanina, la citosina, la adenina, y el uracilo se pueden reemplazar por otros radicales sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleotido que comprende un nucleótido que alberga tal radical de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base puede hacer pares de base con los nucleótidos que contienen adenina, citosina, o uracilo. Por lo tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina, o adenina se pueden reemplazar en las secuencias de nucleótidos de la invención por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden tales radicales de reemplazo son modalidades de la invención.

Como se utiliza aquí, "transtiretina" ("TTR") se refiere a un gen en una célula. La TTR también es conocida como ATTR, HsT2651, PALB, prealbúmina, TBPA, y transtiretina (prealbúmina, tipo I de amiloidosis) . La secuencia de un transcrito del ARNm TTR humana se puede encontrar en N _000371. La secuencia de ARNm TTR de ratón se puede encontrar en NM_013697.2 , y la secuencia de ARNm TTR de rata se puede encontrar en NM_012681.1.

Como se utiliza aquí, la "secuencia objetivo" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen de TTR, incluyendo el ARNm que es un producto del procesamiento del ARN de un producto de transcripción primario.

Como se utiliza aquí, el término "hebra que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleotido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe por la secuencia referida por utilizar la nomenclatura estándar del nucleótido.

Como se utiliza aquí, y a menos que se indique lo contrario, el término "complementario", cuando se utiliza para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación a una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la habilidad de un oligonucleotido o polinucleotido que comprende la primera secuencia de nucleótidos a hibridar y formar una estructura dúplex bajo ciertas condiciones con un oligonucleotido o polinucleotido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como se entenderá por la persona experta. Tales condiciones, por ejemplo, pueden ser condiciones rigurosas, donde las condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 m pH 6.4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C durante 12-16 horas seguido por lavado. Pueden aplicar otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes como se pueden encontrar dentro de un organismo. La persona experta podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de conformidad con la aplicación última de los nucleótidos hibridados.

Esta incluye el apareamiento de bases del oligonucleotido o polinucleotido que comprende la primera secuencia de nucleótidos al oligonucleótido o polinucleotido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos sobre la longitud completa de la primera y segunda secuencias de nucleótidos. Tales secuencias se pueden referir aquí como "completamente complementarias" entre si. Sin embargo, donde una primera secuencia se refiere aquí como "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero generalmente no más que 4, 3 o 2 pares de bases desapareados tras la hibridación, mientras que retienen la habilidad para hibridar bajo las condiciones más relevantes para su aplicación última. Sin embargo, donde dos oligonucleótidos se diseñan para formar, tras la hibridación, una o más proyecciones de una sola hebra, tales proyecciones no serán consideradas como desapareamientos con respecto a la determinación de complementariedad. Por ejemplo, un ARNds que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria para el oligonucleótido más corto, aún se puede referir como "completamente complementaria" para los propósitos aquí descritos .

Las secuencias "complementarias", como se utiliza aquí, también pueden incluir, o se pueden formar enteramente de, pares de base no Watson-Crick y/o pares de base formados a partir de nucleótidos no naturales y modificados, en tanto se cumplan los requerimientos anteriores con respecto a su habilidad para hibridar. Tales pares de base no Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a, apareamiento de bases Wobble u Hoogstein G:U.

Los términos "complementario", "completamente complementario" y "sustancialmente complementario" aquí se pueden utilizar con respecto al apareamiento de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNds, o entre la hebra antisentido de un ARNds y una secuencia objetivo, como se entenderá a partir del contexto de su uso.

Como se utiliza aquí, un polinucleótido que es "sustancialmente complementario para al menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario para una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, un ARNm que codifica la TTR) incluyendo una UTR 5' , un marco abierto de lectura (ORF) , o una UTR 3' . Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm TTR si la secuencia es sustancialmente complementaria para una porción no interrumpida de una ARNm que codifica la TTR.

El término "ARN de doble hebra" o "ARNds", como se utiliza aquí, se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tiene una estructura dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico anti-paralelas y sustancialmente complementarias, como se define anteriormente. En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra son ribonucleótidos, pero como se describe en detalle aquí, cada hebra o ambas hebras también pueden incluir al menos un no ribonucleótido, por ejemplo, un desoxiribonucleotido y/o un nucleótido modificado. Además, como se utiliza en esta especificación, el "ARNds" puede incluir modificaciones químicas a los ribonucleótidos, incluyendo modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos e incluyendo todos los tipos de modificaciones aquí descritas o conocidas en el arte. Cualquiera de tales modificaciones, como se utiliza en una molécula de tipo ARNsi, está abarcada por "ARNds" para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones.

Las dos hebras que forman la estructura dúplex pueden ser diferentes porciones de una molécula de ARN más grande, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Donde las dos hebras son parte de una molécula más grande, y por consiguiente se conectan mediante una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura dúplex, la cadena de ARN de conexión se refiere como un "lazo de horquilla". Donde las dos hebras se conectan de manera covalente por medios aparte de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura dúplex, la estructura de conexión se refiere como un "enlazador". Las hebras de ARN pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos . El número máximo de pares de base es el número de nucleótidos en la hebra más pequeña del ARNds menos cualquier proyección que esté presente en el dúplex. Además de la estructura dúplex, un ARNds puede comprender una o más proyecciones de nucleótidos. El término "ARÑsi" también se utiliza aquí para referirse a un ARNds como se describe anteriormente.

Como se utiliza aquí, una "proyección de nucleótido" se refiere al nucleótido o nucleótidos no apareados que se proyectan desde la estructura dúplex de un ARNds cuando un extremo 3' de una hebra del ARNds se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa. "Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos no apareados en ese extremo del ARNds, es decir, no hay proyección de nucleótido. Un ARNds "de extremo romo" es un ARNds que es de doble hebra sobre su longitud completa, es decir, no hay proyección de nucleótido en extremo alguno de la molécula.

El término "hebra antisentido" se refiere a la hebra de un ARNds que incluye una región que es sustancialmente complementaria para una secuencia objetivo. Como se utiliza aquí, el término "región de complementariedad" se refiere a la región en la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria para una secuencia, por ejemplo una secuencia objetivo, como se define aquí. Donde la región de complementariedad no es completamente complementaria para la secuencia objetivo, los desapareamientos son más tolerados en las regiones terminales y, si se presentan, están generalmente en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4, 3, o 2 nucleótidos del 5'- y/o 3' -terminal.

El término "hebra sentido", como se utiliza aquí, se refiere a la hebra de un ARNds que incluye una región que es sustancialmente complementaria para una región de la hebra antisentido .

Como se utiliza aquí, el término "SNALP" se refiere a una partícula de lípido-ácido nucleico estable. Una SNALP representa una vesícula de lípidos que recubre un interior acuoso reducido que comprende un ácido nucleico tal como un ARNds o un plásmido a partir del cual se trascribe un ARNds. Las SNALP se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Números 20060240093, 20070135372, y USSN 61/045, 228 presentada el 15 de Abril de 2008. Estas solicitudes se incorporan por este medio por referencia .

"Introducir en una célula", al referirse a un ARNds, significa facilitar la admisión o absorción en la célula, como se entiende por aquellos expertos en el arte. La absorción o admisión del ARNds puede ocurrir a través de procesos celulares activos o difusivos no asistidos, o mediante agentes o dispositivos auxiliares. El significado de este término no se limita a células in vitro; un ARNds también se puede "introducir en una célula", en donde la célula es parte de un organismo viviente. En tal caso, la introducción en la célula incluirá la entrega al organismo. Por ejemplo, para la entrega in vivo, el ARNds se puede inyectar en un sitio del tejido o se puede administrar sistémicamente . La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en el arte tales como electroporación y lipofección. Más acercamientos se describen aquí o son conocidos en el arte.

Los términos "silenciar", "inhibir la expresión de", "regular de manera descendente la expresión de", "suprimir la expresión de" y similares en tanto se refieran a un gen de TTR, aquí se refieren a la supresión al menos parcial de la expresión de un gen de TTR, como se manifiesta mediante una reducción de la cantidad de ARNm que se puede aislar a partir de una primera célula o grupo de células en las cuales se trascribe un gen de TTR y que se ha o han tratado tal que se inhibe la expresión de un gen de TTR, según se compara a una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no se ha o han tratado de este modo (células de control) . El grado de inhibición usualmente se expresa en términos de (ARNm en células de control) - (ARNm en células tratadas)^ (ARNm en células de control) Alternativamente, el grado de inhibición puede estar dado en términos de una reducción de un parámetro que está funcionalmente asociado a la expresión del gen de TTR, por ejemplo, la cantidad de proteina codificada por un gen de TTR que se secreta por una célula, o el número de células que exhiben un cierto fenotipo, por ejemplo, apoptosis. En principio, el silenciamiento del gen de TTR se puede determinar en cualquier célula que exprese el objetivo, ya sea constitutivamente o mediante ingeniería genómica, y mediante cualquier ensayo apropiado. Sin embargo, cuando se necesita una referencia para determinar si un ARNds dado inhibe la expresión de un gen de TTR por un cierto grado y por consiguiente si se abarca por la presente invención, los ensayos provistos en los Ejemplos debajo servirán como tal referencia .

Por ejemplo, en ciertas instancias, la expresión de un gen de TTR se suprime por al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, o 50% mediante la administración del oligonucleótido de doble hebra presentado en la invención. En algunas modalidades, un gen de TTR se suprime por al menos aproximadamente 60%, 70%, u 80% mediante la administración del oligonucleótido de doble hebra presentado en la invención. En algunas modalidades, un gen de TTR se suprime por al menos aproximadamente 85%, 90%, o 95% mediante la administración del oligonucleotido de doble hebra presentado en la invención.

Como se utiliza aquí en el contexto de la expresión de TTR, los términos "tratar", "tratamiento", y similares, se refieren a la mitigación de o el alivio de los procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. En el contexto de la presente invención a tal grado que se relacione con cualquiera de las otras condiciones recitadas aquí debajo (aparte de los procesos patológicos mediados por la expresión de TTR), los términos "tratar", "tratamiento", y similares significan mitigar o aliviar al menos un síntoma asociado con tal condición, o desacelerar o revertir la progresión de tal condición, tal como la desaceleración de la progresión de una amiloidosis por TTR, tal como FAP. Los síntomas de la amiloidosis por TTR incluyen neuropatía sensorial (por ejemplo, parestesia, hipestesia en extremidades distantes), neuropatía autonómica (por ejemplo, disfunción gastrointestinal, tal como úlcera gástrica, o hipotensión ortostática) , neuropatía motora, convulsiones, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, cardiomiopatía, opacidades vitreas, insuficiencia renal, nefropatía, mBMI (índice de Masa Corporal modificado) sustancialmente reducido, disfunción de los nervios craneales, y distrofia de retículos corneales.

Como se utiliza aquí, las frases "cantidad terapéuticamente efectiva" y "cantidad profilácticamente efectiva" se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, prevención, o manejo de los procesos patológicos mediados por la expresión de TTR o un síntoma aparente de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. La cantidad específica que es terapéuticamente efectiva se puede determinar fácilmente por un médico ordinario, y puede variar dependiendo de factores conocidos en el arte, tales como, por ejemplo, el tipo de procesos patológicos mediados por la expresión de TTR, la historia y la edad del paciente, la etapa de los procesos patológicos mediados por la expresión de TTR, y la administración de otros procesos anti-patológicos mediados por agentes de expresión de TTR.

Como se utiliza aquí, una "composición farmacéutica" comprende una cantidad farmacológicamente efectiva de un ARNds y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza aquí, "cantidad farmacológicamente efectiva", "cantidad terapéuticamente efectiva" o simplemente "cantidad efectiva" se refiere a esa cantidad de un ARN efectiva para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo, pretendido. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado se considera efectivo cuando hay al menos una reducción del 25% en un parámetro medible asociado con un padecimiento o desorden, una cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco para el tratamiento de ese padecimiento o desorden es la cantidad necesaria para efectuar al menos una reducción del 25% en ese parámetro. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un ARNds que tiene como objetivo la TTR puede reducir los niveles en suero de TTR por al menos 25%. En otro ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un ARNds que tiene como objetivo la TTR puede mejorar la función del hígado o la función renal por al menos 25%.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. El término específicamente excluye el medio de cultivo celular. Para los fármacos administrados oralmente, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluentes inertes, agentes de desintegración, agentes de aglutinamiento, agentes de lubricación, agentes dulcificantes, agentes saborizantes, agentes de coloración y conservadores. Los diluentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y de calcio, fosfato de sodio y de calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes de desintegración adecuados. Los agentes de aglutinamiento pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente de lubricación, si está presente, generalmente será estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, las tabletas se pueden recubrir con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal.

Como se utiliza aquí, una "célula transformada" es una célula en la cual se ha introducido un vector a partir del cual se puede expresar una molécula de ARNds.

II. Ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) Como se describe en más detalle aquí, la invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de un gen de TTR en una célula o mamífero, por ejemplo, en un humano que tiene una amiloidosis por TTR, donde el ARNds incluye una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad que es complementaria para al menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen de TTR, y donde la región de complementariedad es de menos que 30 nucleótidos de longitud, generalmente 19-24 nucleótidos de longitud, y donde dicho ARNds, tras el contacto con una célula que expresa dicho gen de TTR, inhibe la expresión de dicho gen de TTR por al menos 30% según se ensaya mediante, por ejemplo, un método basado en ADN ramificado (ADNb) o PCR, o mediante un método basado en proteínas, tal como mediante la mancha Western. La expresión de un gen de TTR se puede reducir por al menos 30% cuando se mide por un ensayo como se describe en los Ejemplos debajo. Por ejemplo, la expresión de un gen de TTR en el cultivo celular, tal como en células Hep3B, se puede ensayar midiendo los niveles de ARNm TTR, tal como mediante el ensayo de ADNb o TaqMan, o midiendo los niveles de proteina, tal como mediante el ensayo ELISA. El ARNds de la invención puede incluir además una o más proyecciones de nucleótidos de una sola hebra.

El ARNds se puede sintetizar por métodos estándar conocidos en el arte como se discute adicionalmente a continuación, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador automatizado de ADN, tal como está comercialmente disponible a partir de, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. El ARNds incluye dos hebras de ARN que son suficientemente complementarias para hibridar para formar una estructura dúplex. Una hebra del ARNds (la hebra antisentido) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria, y generalmente completamente complementaria, para una secuencia objetivo, derivada de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión de un gen de TTR, la otra hebra (la hebra sentido) incluye una región que es complementaria para la hebra antisentido, tal que las dos hebras hibridan y forman una estructura dúplex cuando se combinan bajo condiciones adecuadas. Generalmente, la estructura dúplex es de entre 15 y 30 o entre 25 y 30, o entre 18 y 25, o entre 19 y 24, o entre 19 y 21, o 19, 20, o 21 pares de base de longitud. En una modalidad el dúplex es de 19 pares de base de longitud. En otra modalidad el dúplex es de 21 pares de base de longitud. Cuando se utilizan dos ARNsis diferentes en combinación, las longitudes del dúplex pueden ser idénticas o puede diferir.

Cada hebra del ARNds de la invención es generalmente de entre 15 y 30, o entre 18 y 25, o 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 nucleotidos de longitud. En otras modalidades, cada hebra es de 25-30 nucleotidos de longitud. Cada hebra del dúplex puede ser de la misma longitud o de longitudes diferentes. Cuando se utilizan dos ARNsis diferentes en combinación, las longitudes de cada hebra de cada ARNsi pueden ser idénticas o pueden diferir.

El ARNds de la invención puede incluir una o más proyecciones de una sola hebra de uno o más nucleotidos. En una modalidad, al menos un extremo del ARNds tiene una proyección de nucleótido de una sola hebra de 1 a 4, generalmente 1 o 2 nucleotidos. En otra modalidad, la hebra antisentido del ARNds tiene proyecciones de 1-10 nucleotidos cada una en el extremo 3' y el extremo 5' sobre la hebra sentido. En modalidades adicionales, la hebra sentido del ARNds tiene proyecciones de 1-10 nucleotidos cada una en el extremo 3' y el extremo 5' sobre la hebra antisentido.

Un ARNds que tiene al menos una proyección de nucleótido puede tener propiedades inhibitorias inesperadamente superiores que la contraparte de extremo romo. En algunas modalidades la presencia de sólo una proyección de nucleótido intensifica la actividad de interferencia del ARNds, sin afectar su estabilidad global. Un ARNds que tiene sólo una proyección ha resultado ser particularmente estable y efectivo in vivo, asi como también en una variedad de células, medios de cultivo celular, sangre, y suero. Generalmente, la proyección de una sola hebra se localiza en el extremo 3'-terminal de la hebra antisentido o, alternativamente, en el extremo 3' -terminal de la hebra sentido. El ARNds también puede tener un extremo romo, generalmente localizado en el extremo 5' de la hebra antisentido. Tales ARNds' s pueden tener estabilidad y actividad inhibitoria mejoradas, permitiendo de esta manera la administración en bajas dosis, es decir, menos que 5 mg/kg de peso corporal del receptor por día. Generalmente, la hebra antisentido del ARNds tiene una proyección de nucleótido en el extremo 3' , y el extremo 5' está romo. En otra modalidad, uno o más de los nucleótidos en la proyección se reemplazan con un nucleosido tiofosfato.

En una modalidad, un gen de TTR es un gen de TTR humana. En modalidades .especificas, la hebra sentido del ARNds es una de las secuencias sentido de las Tablas 3A, 3B, 4, 6?, 6B, o 7, y la hebra antisentido es una de las secuencias antisentido de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, o 7. Los agentes antisentido alternativos que tienen como objetivo algún otro sitio en la secuencia objetivo provista en las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, o 7 se pueden determinar fácilmente utilizando la secuencia objetivo y la secuencia TTR flanqueante.

La persona experta está consciente que los ARNds que tienen una estructura dúplex de entre 20 y 23, pero específicamente 21, pares de base han sido aclamados como particularmente efectivos en inducir la interferencia de ARN (Elbashir et al, EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han encontrado que ARNds más cortos o más largos también pueden ser efectivos. En las modalidades descritas anteriormente, por virtud de la naturaleza de las secuencias de oligonucleótido provistas en las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, y 7, los ARNds' s presentados en la invención pueden incluir al menos una hebra de una longitud aquí descrita. Se puede esperar razonablemente que los ARNds más cortos que tienen una de las secuencias de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, o 7 menos sólo algunos nucleótidos en uno o ambos extremos pueden ser similarmente efectivos según se compara a los ARNds' s descritos anteriormente. Por lo tanto, los ARNds' s que tienen una secuencia parcial de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias de las Tablas 3, 4, 6 o 7, y que difieren en su habilidad para inhibir la expresión de un gen de TTR en un ensayo como se describe aquí debajo por no más que 5, 10, 15, 20, 25, o 30% de inhibición de un ARNds que comprende la secuencia completa, se contemplan por la invención. Adicionalmente, los ARNds' s que se escinden dentro de una secuencia objetivo TTR deseada se pueden hacer fácilmente utilizando la secuencia antisentido TTR correspondiente y una secuencia sentido complementaria.

Además, los ARNds provistos en las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, o 7 identifican un sitio en una TTR que es susceptible a la escisión basada en iARN. Como tal, la presente invención presenta además ARNds' s que se enfocan dentro de la secuencia que se tiene como objetivo por uno de los agentes de la presente invención. Como se utiliza aquí, se dice que un segundo ARNds se enfoca dentro de la secuencia de un primer ARNds si el segundo ARNds escinde el mensaje en cualquier lugar dentro del ARNm que es complementario para la hebra antisentido del primer ARNds. Tal un segundo ARNds generalmente consistirá de al menos 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias provistas en las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, o 7 acopladas a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en un gen de TTR.

El ARNds presentado en la invención puede contener uno o más desapareamientos a la secuencia objetivo. En una modalidad, el ARNds presentado en la invención contiene no más que 3 desapareamientos. Si la hebra antisentido del ARNds contiene desapareamientos a una secuencia objetivo, es preferible que el área del desapareamiento no esté localizada en el centro de la región de complementariedad. Si la hebra antisentido del ARNds contiene desapareamientos a la secuencia objetivo, es preferible que el desapareamiento esté restringido a 5 nucleótidos desde cualquier extremo, por ejemplo 5, 4, 3, 2, o 1 nucleótido desde ya sea el extremo 5' o 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una hebra del ARNds de 23 nucleótidos que es complementaria para una región de un gen de TTR, el ARNds generalmente no contiene desapareamiento alguno dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos dentro de la invención se pueden utilizar para determinar si un ARNds que contiene un desapareamiento a una secuencia objetivo es efectivo en inhibir la expresión de un gen de TTR. La consideración de la eficacia de los ARNds' s con desapareamientos en la inhibición de la expresión de un gen de TTR es importante, especialmente si se sabe que la región particular de complementariedad en un gen de TTR tiene una variación de secuencia polimórfica dentro de la población.

Modificaciones En aún otra modalidad, el ARNds está químicamente modificado para mejorar la estabilidad. Los ácidos nucleicos presentados en la invención se pueden sintetizar y/o modificar por los métodos bien establecidos en el arte, tales como aquellos descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S. L. et al. (Eds . ) , John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EEUU, la cual se incorpora aquí por este medio por referencia. Ejemplos específicos de compuestos de ARNds útiles en esta invención incluyen ARNds que contienen estructuras principales modificadas o uniones inter-nucleósido no naturales. Como se define en esta especificación, los ARNds que tienen estructuras principales modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la estructura principal y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura principal. Para los propósitos de esta especificación, y como en ocasiones se refiere en el arte, los ARNds modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal inter-nucleósido también se pueden considerar como oligonucleosidos.

Las estructuras principales de ARNds modificadas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos , fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres , metilo y otros fosfonatos de alquilo incluyendo 3' -alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres , y boranofosfatos que tienen uniones 3' -5' normales, análogos unidos 2' -5' de éstas, y aquellas que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos se unen 3' -5' a 5' -3' o 2' -5' a 5' -2' .

Las patentes Norteamericanas representativas que enseñan la preparación de las uniones que contienen fósforo anteriormente mencionadas incluyen, pero no se limitan a, las Patentes Norteamericanas Números 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,495; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519, 126; 5, 536, 821; 5,541,316; 5, 550, 111; 5, 563, 253; 5, 571, 799; 5, 587, 361; y 5, 625, 050, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia Las estructuras principales de ARNds modificadas que no incluyen un átomo de fósforo tienen estructuras principales que se forman mediante uniones inter-nucleósido alquilo o cicloalquilo de cadena corta, uniones inter-nucleósido alquilo o cicloalquilo y heteroátomos mixtos, o una o más uniones inter-nucleósido heteroatómicas o heterociclicas de cadena corta. Éstas incluyen aquellas que tienen uniones de morfolino (formadas en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metilen formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alquenos; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otras que tienen partes componentes N, 0, S y CH2 mixtas.

Las patentes Norteamericanas representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriormente mencionados incluyen, pero no se limitan a, las Patentes Norteamericanas Números 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5, 677, 437; y, 5, 677, 439, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia.

En otros miméticos de ARNds adecuados, tanto el azúcar como la unión inter-nucleósido, es decir, la estructura principal, de las unidades de nucleótidos se reemplazan con grupos nuevos. Las unidades base se mantienen para la hibridación con un compuesto objetivo del ácido nucleico apropiado. Un tal compuesto oligomérico, un mimético de ARNds que se ha mostrado por tener excelentes propiedades de hibridación, se refiere como un ácido nucleico peptidico (PNA). En los compuestos PNA, la estructura principal del azúcar de un ARNds se reemplaza con una estructura principal que contiene amida, en particular una estructura principal de aminoetilglicina . Las nucleobases se retienen y se unen directamente o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la porción de amida de la estructura principal. Las patentes Norteamericanas representativas que enseñan la preparación de compuestos PNA incluyen, pero no se limitan a, las Patentes Norteamericanas Números 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora aqui por referencia. Se puede encontrar enseñanza adicional de los compuestos PNA en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.

Otras modalidades de la invención son ARNds's con estructuras principales de fosforotioato y oligonucleósidos con estructuras principales de heteroátomos , y en particular -CH2-NH-CH2-, -CH2-N (CH3) -O-CH2- [conocida como una estructura principal de metileno (metilimino) o MMI], -CH2-0-N (CH3) -CH2-, -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2- y -N (CH3) -CH2-CH2- [en donde la estructura principal de fosfodiéster nativa se representa como -O-P-O-CH2-] de la Patente Norteamericana anteriormente referida Número 5,489,677, y las estructuras principales de amida de la Patente Norteamericana anteriormente referida Número 5,602,240. También son preferidos los ARNds que tienen estructuras principales de morfolino de la Patente Norteamericana anteriormente referida Número 5,034,506.

Los ARNds modificados también pueden contener uno o más radicales de azúcar sustituidos. Los ARNds preferidos comprenden uno de lo siguiente en la posición 2' : OH; F; O-, S-, o N-alquilo; 0-, S-, o N-alquenilo; 0-, S-, o N-alquinilo; u O-alquil-0-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de Ci a Ci0 o alquenilo de C2 a Cío y alquinilo sustituidos o no sustituidos. Son particularmente preferidos 0 [ (CH2) n0] mCH3, 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2, y 0(CH2)n0N[ (CH2)nCH3) ]2, donde n y m son desde 1 hasta aproximadamente 10. Otros ARNds preferidos comprenden uno de lo siguiente en la posición 2' : alquilo inferior de Ci a Cío, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo u 0-aralquilo, SH, SCH3, 0CN, Cl, Br, CN, CF3, 0CF3, S0CH3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo reportero, un intercalador , un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNds, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNds, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2 ' -metoxietoxi ( 2 ' -0-CH2CH2OCH3, también . conocido como 2 ' -0- (2-metoxietilo) o 2'-M0E) (Martin et al, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxi-alcoxi . Una modificación adicionalmente preferida incluye 2' -dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo 0 (CH2) 20N (CH3) 2, también conocido como 2'-DMA0E, como se describe en los ejemplos aqui debajo, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en el arte como 2' -O- dimetilaminoetoxietilo o 2' -DMAEOE) , es decir, 2' -0-CH2-0-CH2-N(CH2 ) 2 / también descrito en los ejemplos aquí debajo.

Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-OCH3) , 2' -aminopropoxi (2' -OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F) . También se pueden hacer modificaciones similares en otras posiciones en el ARNds, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en los ARNds unidos en 2' -5' y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los ARNds también pueden tener miméticos de azúcar tales como radicales ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo . Las Patentes Norteamericanas representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, las Patentes Norteamericanas Números 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920, ciertas de las cuales son comúnmente poseídas con la presente solicitud, y cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Los ARNds también pueden incluir sustituciones o modificaciones de la nucleobase (a menudo referidas en el arte simplemente como "base") . Como se utiliza aquí, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases púricas adenina (A) y guanina (G) , y las bases pirimídicas timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos , 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-daazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina . Nucleobases adicionales incluyen aquellas descritas en la Patente Norteamericana Número 3,687,808, aquellas descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas descritas por Englisch efc al, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y S., Capitulo 15, DsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. . and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos presentados en la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas , 6-azapirimidinas y purinas sustituidas N-2, N-6 y 0-6, incluyendo 2-aminopropiladenina , 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina . Las sustituciones de 5-metilcitosina han sido mostradas por incrementar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico por 0.6-1.2°C. (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278) y son sustituciones de base ejemplares, aun más particularmente cuando se combinan con modificaciones de 2 ' -O-metoxietil azúcar.

Las Patentes Norteamericanas representativas que enseñan la preparación de ciertas de las nucleobases modificadas anteriormente notadas asi como también otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, la Patentes Norteamericana anteriormente notada Número 3,687,808, asi como también las Patentes Norteamericanas Números 4,845,205; 5,130,30/ 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; y 5,681,941, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia, y la Patente Norteamericana Número 5,750,692, también incorporada aqui por referencia.

Conjugados Otra modificación de los ARNds de la invención implica unir químicamente al ARNds uno o más radicales o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la admisión celular del ARNds . Tales radicales incluyen pero no se limitan a radicales de lipidos tales como un radical · de colesterol (Letsinger et al, Proc. Nati. Acid. Sci. EEUU, 1989, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let . , 1994, 4:1053-1060), un tioéter, por ejemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al, Nucí. Acids Res., 1992, 20:533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de undecilo o dodecandiol (Saison-Behmoaras et al, EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al, FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75:49-54), un fosfolipido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1 , 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al, Nucí. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651- 3654), un radical palmitilo (Mishra et al, Biochim. Biophys . Acta, 1995, 1264:229-237), o un radical octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923-937) .

Las Patentes Norteamericanas representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de ARNds incluyen, pero no se limitan a, las Patentes Norteamericanas Números 4,828,979; 4, 948, 882; 5,218,105; 5, 525, 465; 5,541,313; 5, 545, 730; 5, 552, 538; 5, 578, 717, 5, 580, 731; 5, 591, 584; 5, 109, 124; 5, 118, 802; 5, 138, 045; 5, 414, 077; 5,486, 603; 5, 512, 39; 5, 578, 718; 5, 608, 046; 4, 587, 044; 4, 605, 735; 4, 667, 025; 4, 762, 779; 4,789, 737; 4,824, 941; 4, 835, 263; 4,876, 335; 4, 904, 582; 4, 958, 013; 5, 082, 830; 5, 112, 963; 5,214, 136; 5, 082, 830; 5, 112, 963; 5,214, 136; 5, 245, 022; 5,254, 469; 5, 258, 506; 5, 262, 536; 5,272,250; 5, 292, 873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416, 203, 5, 451, 463; 5, 510, 75; 5, 512, 667; 5, 514, 785; 5, 565, 552; 5, 567, 810; 5, 574, 142; 5, 585, 481; 5, 587, 371; 5, 595, 726; 5, 597, 696; 5,599, 923; 5,599, 928 y 5, 688, 941, cada una de las cuales se incorpora aqui por referencia.

No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado estén uniformemente modificadas, y de hecho más que una de las modificaciones anteriormente mencionadas se puede incorporar en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un ARNds. La presente invención también incluye compuestos de ARNds que son compuestos quiméricos. Los compuestos de ARNds "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos de ARNds, particularmente ARNds, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una constituida de al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNds. Estos ARNds típicamente contienen al menos una región en donde el ARNds se modifica a fin de conferir al ARNds resistencia incrementada a la degradación de la nucleasa, admisión celular incrementada, y/o afinidad de enlace incrementada por el acido nucleico objetivo. Una región adicional del ARNds puede servir como un sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos ARNrADN o ARN:ARN. A manera de ejemplo, la H RNasa es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de la H RNasa, por consiguiente, da como resultado la escisión del objetivo del ARN, mejorando en gran medida por consiguiente la eficiencia de inhibición del ARNds de la expresión del gen. Consecuentemente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con ARNds' s más cortos cuando se utilizan ARNds quiméricos, en comparación a fosforotioato desoxiARNds que hibridan a la misma región objetivo.

La escisión del objetivo del ARN se puede detectar rutinariamente por electrofóresis en gel y, si es necesario, técnicas asociadas de hibridación de ácidos nucleicos conocidas en el arte. El sitio de escisión en el ARNm objetivo de un ARNds se puede determinar utilizando métodos generalmente conocidos por uno de habilidad ordinaria en el arte, por ejemplo, el método 5' -RACE descrito en Soutschek et al., Nature; 2004, Vol. 432, pp. 173-178 (la cual se incorpora aquí por referencia para todos los propósitos) . En una modalidad, utilizando el método 5' -RACE descrito por Soutschek et al., se determinó que ALN-18328 escinde un ARNm TTR entre el nucleótido de guanina en la posición 636 de la SEQ ID NO: 1331 (NM_000371.3) y el nucleótido de adenina en la posición 637 de la SEQ ID NO: 1331. En una modalidad, se determinó que ALN-18328 no escinde un ARNm TTR entre el nucleótido de adenina en la posición 637 de la SEQ ID NO: 1331 y el nucleótido de guanina en la posición 638 de la SEQ ID NO: 1331.

En ciertas instancias, el ARNds se puede modificar por un grupo no ligando. Un número de moléculas no ligando se han conjugado al ARNds' s para mejorar la actividad, la distribución celular o la admisión celular del ARNds, y los procedimientos para realizar tales conjugaciones están disponibles en la literatura científica. Tales radicales no ligando han incluido radicales lípido, tales como colesterol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. ed. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let . , 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de undecilo o dodecandiol ( Saison-Behmoaras et al., E BO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al, Nucí. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido adamantano acético (Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), un radical palmitilo (Mishra et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), o un radical octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. , 1996, 277:923) . Las Patentes Norteamericanas representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de ARNds se han listado anteriormente. Los protocolos típicos de conjugación involucran la síntesis de ARNds' s que albergan un aminoenlazador en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino se hace reaccionar entonces con la molécula que se conjuga utilizando reactivos de activación o acoplamiento apropiados. La reacción de conjugación se puede realizar ya sea con el ARNds todavía enlazado al soporte sólido o después de la escisión del ARNds en fase de solución. La purificación del conjugado de ARNds mediante HPLC típicamente proporciona el conjugado puro.

ARNds codificados por vector En otro aspecto, las moléculas de ARNds TTR se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas introducidas en vectores de ADN o ARN (vea, por ejemplo, Couture, A, et al, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al, Publicación PCT Internacional No. WO 00/22113, Conrad, Publicación PCT Internacional No. WO 00/22114, y Conrad, Patente Norteamericana Número 6,054,299). Estos transgenes se pueden introducir como un constructo lineal, un plásmido circular, o un vector viral, que se puede incorporar y heredar como un transgen integrado al genoma hospedero. El transgen también se puede construir para permitir que sea heredado como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU (1995) 92:1292).

Las hebras individuales de un ARNds se pueden trascribir mediante promotores en dos vectores de expresión separados y se pueden co-transfectar en una célula objetivo. Alternativamente, cada hebra individual del ARNds se puede trascribir mediante promotores ambos de los cuales se localiza en el mismo plásmido de expresión. En una modalidad, un ARNds se expresa como una unidad de repetición invertida unida por una secuencia de polinucleótidos enlazadora tal que el ARNds tiene una estructura de tallo y lazo.

Los vectores de expresión de ARNds recombinantes son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales. Los vectores virales que expresan ARNds se pueden construir con base en, pero no limitado a, virus adeno-asociados (para una revisión, vea Muzyczka, et al, Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (vea, por ejemplo, Berkner, et al, BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al (1991, Science 252:431-434), y Rosenfeld et al (1992), Cell 68:143-155)); o alfavirus asi como también otros conocidos en el arte. Los retrovirus se ha utilizado para introducir una variedad de genes en muchos diferentes tipos de células, incluyendo células epiteliales, in vitro y/o in vivo (vea, por ejemplo, Eglitis, et al, Science (1985) 230: 1395-1398; Danos and ulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU (1998) 85:6460-6464; Wilson et al, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 85:3014-3018; Armentano et al, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 87:61416145; Huber et al, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 88:8039-8043; Ferry et al, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 88:8377- 8381; Chowdhury et al, 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 89:7640-19 ; Kay et al, 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104- 4115; Patente Norteamericana Número 4,868,116; Patente Norteamericana Número 4,980,286; Solicitud PCT WO 89/07136; Solicitud PCT WO 89/02468; Solicitud PCT WO 89/05345; y Solicitud PCT WO 92/07573) . Los vectores retrovirales recombinantes capaces de transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula se pueden producir mediante la transfección del genoma retroviral recombinante en lineas celulares de empaquetamiento adecuadas tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 81:6349) . Los vectores adenovirales recombinantes se pueden utilizar para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro, y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), y también tienen la ventaja de no requerir células mitóticamente activas para la infección .

Se puede utilizar cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias de codificación para que la(s) molécula (s) de ARNds se exprese (n), por ejemplo los vectores derivados de adenovirus (AV) ; virus adeno-asociados (AAV) ; retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV) , Rhabdovirus, virus de leucemia murina) ; virus de herpes, y similares. El tropismo de los vectores virales se puede modificar pseudotipificando los vectores con proteínas envolventes u otros antígenos superficiales de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápside viral, según sea apropiado.

Por ejemplo, los vectores lentivirales , presentados en la invención se pueden pseudotipificar con proteínas superficiales de virus de estomatitis vesicular (VSV) , rabia, Ébola, okola, y similares. Los vectores AAV presentados en la invención se pueden hacer para tener como objetivo diferentes células, diseñando los vectores para expresar diferentes serotipos de proteina de la cápside. Por ejemplo, un vector AAV que expresa una cápside de serotipo 2 sobre un genoma de serotipo 2 se refiere como AAV 2/2. Este gen de la cápside de serotipo 2 en el vector AAV 2/2 se puede reemplazar por un gen de la cápside de serotipo 5 para producir un vector AAV 2/5. Las técnicas para construir vectores AAV que expresan diferentes serotipos de proteina de la cápside están dentro de la habilidad en el arte; vea, por ejemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801, la divulgación completa de la cual se incorpora aquí por referencia.

La selección de vectores virales recombinantes adecuados para el uso en la invención, los métodos para insertar secuencias de ácidos nucleicos para expresar el ARNds en el vector, y los métodos para entregar el vector viral a las células de interés están dentro de la habilidad en el arte. Vea, por ejemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1 : 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; and Rubinson D A et al., Nat. Genet . 33: 401-406, las divulgaciones completas de las cuales se incorpora aquí por referencia.

Los vectores virales se pueden derivar de AV y AAV. En una modalidad, el ARNds presentado en la invención se expresa como dos moléculas de ARN de una sola hebra, separadas, complementarias, de un vector AAV recombinante que tiene, por ejemplo, ya sea los promotores U6 o Hl ARN, o el promotor de citomegalovirus (CMV) .

Un vector AV adecuado para expresar el ARNds presentado en la invención, un método para construir el vector AV recombinante, y un método para entregar el vector en las células objetivo, se describen en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.

Los vectores AAV adecuados para expresar el ARNds presentado en la invención, los métodos para construir el vector AV recombinante, y los métodos para entregar los vectores en las células objetivo se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61 : 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Patente Norteamericana Número 5,252,479; Patente Norteamericana Número 5,139,941; Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/13788; y Solicitud de Patente Internacional No. WO 93/24641, las divulgaciones completas de las cuales se incorpora aqui por referencia.

El promotor que conduce la expresión del ARNds en ya sea un plásmido de ADN o el vector viral presentado en la invención puede ser una ARN polimerasa eucariótica (por ejemplo, el promotor del ARN ribosómico) , ARN polimerasa II (por ejemplo, promotor temprano del CMV o promotor de actina o promotor de Ul ARNsn) o generalmente el promotor de ARN polimerasa III (por ejemplo, promotor U6 ARNsn o 7SK ARN) o un promotor procariótico, por ejemplo el promotor T7, siempre y cuando el plásmido de expresión también codifique la ARN polimerasa T7 requerida para la transcripción de un promotor T7. El promotor también puede dirigir la expresión del transgen para el páncreas (vea, por ejemplo, la secuencia reguladora de insulina para el páncreas (Bucchini et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 83:2511-2515)) .

Además, la expresión del transgen se puede regular de manera precisa, por ejemplo, utilizando una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión tales como una secuencia reguladora que es sensitiva a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, los niveles de glucosa circulante, u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24) . Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión del transgen en células o en mamíferos incluyen la regulación mediante ecdisona, mediante estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización, e isopropil-beta-Dl-tiogalactopiranosida (EPTG) . Una persona experta en el arte podría escoger la secuencia promotora/reguladora apropiada con base en el uso pretendido del transgen del ARNds .

Generalmente, los vectores recombinantes capaces de expresar moléculas de ARNds se entregan como se describe a continuación, y persisten en las células objetivo. Alternativamente, los vectores virales se pueden utilizar de modo que proporcionen la expresión transitoria de las moléculas de ARNds. Tales vectores se pueden administrar repetidamente según sea necesario. Una vez expresados, los ARNds' s se enlazan al ARN objetivo y modulan su función o expresión. La entrega de vectores que expresan ARNds puede ser sistémica, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a las células objetivo ex-plantadas del paciente seguido por la reintroducción en el paciente, o por cualquier otra manera que permita la introducción en una célula objetivo deseada.

Los plásmidos de ADN de expresión del ARNds típicamente se transfectan en las células objetivo como un complejo con portadores de lipidos catiónicos (por ejemplo, oligofectamina) o portadores basados en lipidos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™) . También se contemplan por la invención múltiples transíecciones de lipidos para las supresiones de expresión mediadas por el ARNds que tienen como objetivo diferentes regiones de un solo gen de TTR o múltiples genes de TTR sobre un periodo de una semana o más. La introducción exitosa de vectores en las células hospederas se puede monitorear utilizando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalizar con un reportero, tal como un marcador fluorescente, tal como la Proteína Fluorescente Verde (GFP) . La transfección estable de las células ex vivo se puede asegurar utilizando marcadores que proveen a la célula transfectada con resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tal como resistencia a la higromicina B.

Las moléculas de ARNds específico para TTR también se pueden insertar en los vectores y se pueden utilizar como vectores de terapia de genes para pacientes humanos. Los vectores de terapia de genes se pueden entregar a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, administración local (vea Patente Norteamericana 5,328,470) o mediante inyección estereotáctica (vea por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci . EEUU 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia de genes puede incluir el vector de terapia de genes en un diluente aceptable, o puede incluir una matriz de lenta liberación en la cual se incrusta el vehículo de entrega del gen. Alternativamente, donde el vector de entrega del gen completo se puede producir intacto de células recombinantes , por ejemplo, vectores retrovirales , la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de entrega del gen.

III . Composiciones Farmacéuticas que contienen ARNds En una modalidad, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un ARNds, como se describe aquí, y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que contiene el ARNds es útil para tratar un padecimiento o desorden asociado con la expresión o la actividad de un gen de TTR, tal como los procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. Tales composiciones farmacéuticas se formulan con base en el modo de entrega. Un ejemplo son composiciones que se formulan para la administración sistémica por medio de entrega parenteral, por ejemplo, mediante entrega intravenosa (IV) . Otro ejemplo son composiciones que se formulan para la entrega directa en el parénquima del cerebro, por ejemplo, mediante infusión en el cerebro, tal como mediante infusión con bomba continua.

Las composiciones farmacéuticas presentadas aquí se administran en dosis suficientes para inhibir la expresión de genes de TTR.

En general, una dosis adecuada de ARNds estará en el rango de 0.01 a 200.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por dia, generalmente en el rango de 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal por dia. Por ejemplo, el ARNds se puede administrar en 0.0059 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.0295 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.0590 mg/kg, 0.163 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.543 mg/kg, 0.5900 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.628 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5.0 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, o 50 mg/kg por dosis única.

En una modalidad, la dosis es entre 0.01 y 0.2 mg/kg. Por ejemplo, el ARNds se puede administrar en una dosis de 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg 0.08 mg/kg 0.09 mg/kg , 0.10 mg/kg, 0.11 mg/kg, 0.12 mg/kg, 0.13 mg/kg, 0.14 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.16 mg/kg, 0.17 mg/kg, 0.18 mg/kg, 0.19 mg/kg, o 0.20 mg/kg.

En una modalidad, la dosis es entre 0.005 mg/kg y 1.628 mg/kg. Por ejemplo, el ARNds se puede administrar en una dosis de 0.0059 mg/kg, 0.0295 mg/kg, 0.0590 mg/kg, 0.163 mg/kg, 0.543 mg/kg, 0.5900 mg/kg, o 1.628 mg/kg.

En una modalidad, la dosis es entre 0.2 mg/kg y 1.5 mg/kg. Por ejemplo, el ARNds se puede administrar en una dosis de 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, o 1.5 mg/kg.

La composición farmacéutica se puede administrar una vez diariamente, o el ARNds se puede administrar como dos, tres, o más sub-dosis en intervalos apropiados durante todo el dia o incluso utilizando infusión continua o entrega a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNds contenido en cada sub-dosis debe ser correspondientemente menor para lograr la dosis diaria total. La unidad de dosificación también se puede componer para la entrega durante varios días, por ejemplo, utilizando una formulación de liberación sostenida convencional que proporcione liberación sostenida del ARNds sobre un periodo de varios dias. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en el arte y son particularmente útiles para la entrega de agentes en un sitio particular, tal como se podría utilizar con los agentes de la presente invención. En esta modalidad, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.

El efecto de una dosis única sobre los niveles de TTR es duradero por largo tiempo, tal que las subsiguientes dosis se administran en no más que intervalos de 3, 4, o 5 días, o en no más que intervalos de 1, 2, 3, o 4 semanas, o en no más que intervalos de 5, 6, 7, 8, 9, o 10 semanas.

El técnico experto apreciará que ciertos factores pueden influenciar la dosis y el tiempo requerido para tratar eficientemente un sujeto, incluyendo pero no limitado a la severidad del padecimiento o desorden, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otros padecimientos presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición puede incluir un solo tratamiento o una serie de tratamientos. Las estimaciones de las dosis efectivas y las vidas medias in vivo para los ARNds individuales comprendidos por la invención se pueden hacer utilizando metodologías convencionales o con base en la experimentación in vivo utilizando un modelo animal apropiado, como se describe en otro sitio aquí.

Los avances en la genética del ratón han generado un número de modelos de ratón para el estudio de varios padecimientos humanos, tales como los procesos patológicos mediados por la expresión de TTR. Tales modelos se utilizan para la experimentación in vivo del ARNds, asi como también para determinar una dosis terapéuticamente efectiva. Un modelo de ratón adecuado es, por ejemplo, un ratón que contiene un plásmido que expresa TTR humana. Otro modelo de ratón adecuado es un ratón transgénico que transporta un transgen que expresa TTR humana.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos del cultivo celular y los estudios animales se pueden utilizar en la formulación de un rango de dosificación para el uso en humanos. La dosificación de las composiciones presentadas en la invención yace generalmente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o nula toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos presentados en la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de los ensayos del cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un rango de concentración circulante en plasma del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipéptido de una secuencia objetivo (por ejemplo, logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media-máxima de los síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar de manera más exacta las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.

Los ARNds presentados en la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos efectivos en el tratamiento de los procesos patológicos mediados por la expresión del gen objetivo. En cualquier caso, el médico que administra puede ajustar la cantidad y el tiempo de administración del ARNds con base en los resultados observados utilizando medidas estándar de eficacia conocidas en el arte o aquí descritas.

Administración La presente invención también incluye formulaciones y composiciones farmacéuticas que incluyen los compuestos de ARNds presentados en la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de muchas maneras dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser tópica, pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular o infusión; o administración intracraneal, por ejemplo, intraparenquimatosa, intratecal o intraventricular .

El ARNds se puede entregar en una manera para tener como objetivo un tejido particular, tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado) .

La presente invención incluye composiciones farmacéuticas que se pueden entregar mediante inyección directamente en el cerebro. La inyección puede ser mediante inyección estereotáctica en una región particular del cerebro (por ejemplo, la sustancia negra, corteza cerebral, hipocampo, estriatum, o globo pálido) , o el ARNds se puede entregar en múltiples regiones del sistema nervioso central (por ejemplo, en múltiples regiones "del cerebro, y/o en la médula espinal) . El ARNds también se puede entregar en regiones difusas del cerebro (por ejemplo, entrega difusa a la corteza del cerebro) .

En una modalidad, un ARNds que tiene como objetivo la TTR se puede entregar por medio de una cánula u otro dispositivo de entrega que tiene un extremo implantado en un tejido, por ejemplo, el cerebro, por ejemplo, la sustancia negra, corteza cerebral, hipocampo, estriatum, cuerpo calloso o globo pálido del cerebro. La cánula se puede conectar a un recipiente de la composición de ARNds . El flujo o la entrega se puede mediar mediante una bomba, por ejemplo, una bomba osmótica o una minibomba, tal como una bomba Alzet (Durect, Cupertino, CA) . En una modalidad, una bomba y un recipiente se implantan en un área distante del tejido, por ejemplo, en el abdomen, y la entrega se efectúa mediante un conducto que conduce de la bomba o recipiente al sitio de liberación. La infusión de la composición de ARNds en el cerebro puede ser durante varias horas o durante varios días, por ejemplo, durante 1, 2, 3, 5, o 7 días o más. Los dispositivos para la entrega al cerebro se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericana Números 6,093,180, y 5,814,014.

Las formulaciones y composiciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables los portadores farmacéuticos convencionales, bases aceitosas, acuosas, de polvo, espesadores y similares. Los condones revestidos, guantes y similares también pueden ser útiles. Las formulaciones tópica adecuadas incluyen aquellas en las cuales los ARNds' s presentados en la invención están en mezcla con un agente de entrega tópica tal como lipidos, liposomas, ácidos grasos, esteres de ácidos grasos, esteroides, agentes de quelación y surfactantes . Los lípidos y liposomas adecuados incluyen neutrales (por ejemplo, dioleoilfosfatidil etanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearoilfosfatidil colina) , negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA) . Los ARNds's presentados en la invención se pueden encapsular dentro de liposomas o pueden formar complejos a los mismos, en particular a liposomas catiónicos. Alternativamente, los ARNds's pueden formar complejos a lipidos, en particular a lipidos catiónicos. Los ácidos grasos y los esteres adecuados incluyen pero no se limitan a ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprilico, ácido cáprico, ácido miristico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un éster de alquilo de Ci-?? (por ejemplo, isopropilmiristato IP ) , monoglicérido, diglicérido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las formulaciones tópicas se describen en detalle en la Patente Norteamericana Número 6,747,014, la cual se incorpora aqui por referencia.

Formulaciones liposomales Existen muchas estructuras de surfactantes organizados además de microemulsiones que se han estudiado y utilizado para la formulación de fármacos. Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como los liposomas, han atraído gran interés debido a su especificidad y la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista de entrega del fármaco. Como se utiliza en la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas .

Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición a ser entregada. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fundirse a la pared de la célula. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fundirse tan eficientemente con la pared de la célula, son empleados por los macrófagos in vivo.

Para cruzar la piel de mamífero intacta, las vesículas de lípidos deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor que 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por consiguiente, es deseable utilizar un liposoma que sea altamente deformable y capaz de pasar a través de tales poros finos.

Ventajas adicionales de los liposomas incluyen; los liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables ; los liposomas pueden incorporar una gran variedad de fármacos solubles en agua y lipidos; los liposomas pueden proteger a los fármacos encapsulados en sus compartimientos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245). Las consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga superficial del lípido, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.

Los liposomas son útiles para la transferencia y la entrega de los ingredientes activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican a un tejido, los liposomas comienzan a unirse con las membranas celulares y a medida que progresa la unión del liposoma y la célula, los contenidos liposomales se vacían en la célula donde puede actuar el agente activo.

Las formulaciones liposomales han sido el foco de investigación extensiva como el modo de entrega para muchos fármacos. Existe evidencia creciente que para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas sobre otras formulaciones. Tales ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, acumulación incrementada del fármaco administrado en el objetivo deseado, y la habilidad para administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrofilicos como hidrofóbicos , en la piel.

Varios reportes han detallado la habilidad de los liposomas para entregar agentes incluyendo ADN de alto peso molecular a la piel. Los compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADNs de alto peso molecular han sido administrados a la piel. La mayoría de las aplicaciones dieron como resultado el direccionamiento como objetivo de la epidermis superior Los liposomas caen en dos amplias clases. Los liposomas catiónicos son liposomas positivamente cargados que interactúan con las moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. El complejo de ADN/liposoma positivamente cargado se enlaza a la superficie celular negativamente cargada y se interna en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se fisuran, liberando su contenido en el citoplasma de la célula (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

Los liposomas que son sensitivos al pH o que están negativamente cargados, entrampan el ADN en vez de formar un complejo con él. Debido a que tanto el ADN como el lípido están cargados de modo semejante, ocurre una repulsión en vez de la formación del complejo. No obstante, algún ADN se entrampa dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensitivos al pH se han utilizado para entregar el ADN que codifica el gen de timidina cinasa a las monocapas celulares en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en las células objetivo (Zhou et al, Journal of Controlled Reléase, 1992, 19, 269-274) .

Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolipidos aparte de la fosfatidilcolina derivada de manera natural. Las composiciones de liposomas neutrales, por ejemplo, se pueden formar de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) . Las composiciones de liposomas aniónicos generalmente se forman de dimiristoil fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman primordialmente de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) . Otro tipo de composición liposomal se forma de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soya, y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolipido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol .

Varios estudios han evaluado la entrega tópica de las formulaciones liposomales del fármaco a la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferón a la piel del conejillo de Indias dio como resultado una reducción de las escoceduras del herpes de piel mientras que la entrega de interferón via otro medio (por ejemplo, como una solución o como una emulsión) fue ineficaz (Weiner et al, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410) . Además, un estudio adicional probó la eficacia del interferón administrado como parte de una formulación liposomal para la administración del interferón utilizando un sistema acuoso, y concluyó que la formulación liposomal fue superior a la administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265) .

Los sistemas liposomales no iónicos también se han examinado para determinar su utilidad en la entrega de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden colesterol y surfactante no iónico. Las formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome™ I (gliceril dilaurato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) y Novasome™ II (gliceril diestearato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) se utilizaron para entregar la ciclosporina-A a la dermis de la piel de ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas liposomales no iónicos fueron efectivos en facilitar la deposición de la ciclosporina-A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S . T . P . Pharma . Sci., 1994, 4, 6, 466) .

Los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", un término que, como se utiliza aquí, se refiere a los liposomas que comprenden uno o más lipidos especializados que, cuando se incorporan en los liposomas, dan como resultado duraciones de vida en circulación mejoradas con relación a los liposomas que carecen de tales lipidos especializados. Ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados son aquellos en los cuales parte de la porción del lipido que forma la vesícula del liposoma (?) comprende uno o más glicolípidos , tales como el monosialogangliósido GMi, o (B) se deriva con uno o más polímeros hidrofílicos, tales como un radical de polietilenglicol (PEG) . Mientras que no se desea estar atado al alguna teoría particular, se considera en el arte que, al menos para los liposomas estéricamente estabilizados que contienen gangliósidos , esfingomielina, o lípidos derivados del PEG, la vida media en circulación mejorada de estos liposomas estéricamente estabilizados se deriva de una admisión reducida en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Alien et al, FEBES Letters, 1987, 223, 42; Wu et al, Cáncer Research, 1993, 53, 3765) .

Varios liposomas que comprenden uno o más glucolípidos son conocidos en el arte. Papahadjopoulos et al (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) reportó la habilidad del monosialogangliósido GMI, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar las vidas medias en sangre de los liposomas. Estas conclusiones se expusieron por Gabizon et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU, 1988, 85, 6949) . La Patente Norteamericana Número 4,837,028 y la O 88/04924, ambas para Alien et al., describen liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido GMi o un éster de sulfato de galactocerebrósido. La Patente Norteamericana Número 5,543,152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina . Los liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina se describen en la WO 97/13499 (Lim et al) .

Muchos liposomas que comprenden lipidos derivados con uno o más polímeros hidrofílieos , y los métodos de preparación de los mismos, son conocidos en el arte. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn. , 1980, 53, 2778) describió liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2Ci2i5G, que contiene un radical PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) notó que el recubrimiento hidrofílico de las partículas de poliestireno con glicoles poliméricos dio como resultado vidas medias en sangre significativamente mejoradas. Los fosfolípidos sintéticos modificados por la inserción de grupos carboxílicos de polialquilenglicoles (por ejemplo, PEG) se describen por Sears (Patentes Norteamericanas Números 4,426,330 y 4,534,899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describió experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivada con PEG o estearato de PEG tienen incrementos significativos en las vidas medias de circulación en sangre. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendió tales observaciones a otros fosfolípidos derivados de PEG, por ejemplo, DSPE-PEG, formados a partir de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen radicales PEG covalentemente enlazados en su superficie externa se describen en la Patente Europea Número EP 0 445 131 Bl y WO 90/04384 para Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen 1-20 por ciento mol de PE derivado con PEG, y los métodos de uso de las mismas, se describen por Woodle et al. (Patentes Norteamericanas Números 5,013,556 y 5,356,633) y Martin et al. (Patente Norteamericana Número 5, 213, 804 y Patente Europea Número EP 0 496 813 Bl) . Los liposomas que comprenden un número de otros conjugados lipido-polímero se describen en WO 91/05545 y Patente Norteamericana Número 5,225,212 (ambas para Martin et al) y en WO 94/20073 (Zalipsky et al) . Los liposomas que comprenden lípidos ceramida modificados con PEG se describen en WO 96/10391 (Choi et al) . La Patente Norteamericana Número 5,540,935 (Miyazaki et al.) y la Patente Norteamericana Número 5,556,948 (Tagawa et al.) describen liposomas que contienen PEG que se pueden derivar adicionalmente con radicales funcionales en sus superficies .

Un número de liposomas que comprenden ácidos nucleicos son conocidos en el arte. La WO 96/40062 para Thierry et al. describe métodos para encapsular ácidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La Patente Norteamericana Número 5,264,221 para Tagawa et al. describe liposomas enlazados a proteínas y afirma que los contenidos de tales liposomas pueden incluir un ARNds . La Patente Norteamericana Número 5,665,710 para Rahman et al. describe ciertos métodos para encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. La WO 97/04787 para Love et al. describe liposomas que comprenden ARNds's que tienen como objetivo el gen raf.

Los transfersomas o cuerpos transportadores son aún otro tipo de liposomas, y son agregados de lipidos altamente deformables los cuales son candidatos atractivos para vehículos de entrega de fármacos. Los transfersomes se pueden describir como gotitas de lípido que son tan altamente deformables que pueden fácilmente penetrar a través de poros que son más pequeños que la gotita. Los transfersomes son adaptables al ambiente en el cual se utilizan, por ejemplo, son auto-optimizables (adaptables a la forma de los poros en la piel) , auto-reparables, frecuentemente alcanzan sus objetivos sin fragmentarse, y a menudo auto-cargables . Para hacer transfersomes es posible agregar activadores del borde de la superficie, usualmente surfactantes, a una composición liposomal estándar. Los transfersomes se han utilizado para entregar la albúmina sérica a la piel. La entrega -mediada por transfersome- de la albúmina sérica ha sido mostrada por ser tan efectiva como la inyección subcutánea de una solución que contiene albúmina sérica.

Los surfactantes encuentran amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones ) y liposomas. La manera más común de clasificar y ordenar por rango las propiedades de los muchos diferentes tipos de surfactantes, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del balance hidrófilo/lipófilo (HLB) . La naturaleza del grupo hidrofilico (también conocido como la "cabeza") proporciona la manera más útil para categorizar los diferentes surfactantes utilizados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, p. 285) .

Si la molécula de surfactante no está ionizada, se clasifica como un surfactante no iónico. Los surfactantes no iónicos encuentran amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y son utilizables sobre un amplio rango de valores de pH. En general, sus valores HLB varían dentro del rango desde 2 hasta aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los surfactantes no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sucrosa, y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas y éteres no iónicos tales como etoxilatos de alcoholes grasos, alcoholes propoxilados , y polímeros de bloque etoxilados/propoxilados también están incluidos en esta clase. Los surfactantes de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de surfactantes no iónicos.

Si la molécula de surfactante transporta una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se clasifica como aniónico. Los surfactantes aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, acil lactilatos, acil amidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como alquil sulfatos y alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tales como alquil benceno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos y sulfosuccinatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de surfactantes aniónicos son los alquil sulfatos y los jabones.

Si la molécula de surfactante transporta una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se clasifica como catiónico. Los surfactantes catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más utilizados de esta clase.

Si la molécula de surfactante tiene la habilidad para transportar ya sea una carga positiva o negativa, el surfactante se clasifica como anfotérico. Los surfactantes anfotéricos incluyen derivados de ácido acrilico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetainas y fosfatidas.

El uso de surfactantes en productos de fármacos, formulaciones y en emulsiones ha sido revisado (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y. , 1988, p. 285) .

Partículas de lipidos-ácidos nucleicos En una modalidad, un ARNds TTR presentado en la invención está completamente encapsulado en la formulación de lípido, por ejemplo, para formar una SPLP, pSPLP, SNALP, u otra partícula de lípido-ácido nucleico. Como se utiliza aquí, el término "SNALP" se refiere a una partícula de lípido-ácido nucleico estable, incluyendo SPLP. Como se utiliza aquí, el término "SPLP" se refiere a una partícula de lípido-ácido nucleico que comprende ADN del plásmido encapsulado dentro de una vesícula de lípido. Las SNALPs y SPLPs típicamente contienen un lípido catiónico, un lípido no catiónico, y un lípido que previene la agregación de la partícula (por ejemplo, un conjugado PEG-lípido) . Las SNALPs y SPLPs son sumamente útiles para las aplicaciones sistémicas, ya que exhiben duraciones de vida en circulación extendidas después de la inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distantes (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración) . Las SPLPs incluyen "pSPLP", que incluyen un complejo de agente condensador-ácido nucleico encapsulado como se establece en la Publicación PCT Número O 00/03683. Las partículas de la presente invención típicamente tienen un diámetro promedio de aproximadamente 50 nm hasta aproximadamente 150 nm, más típicamente aproximadamente 60 nm hasta aproximadamente 130 nm, más típicamente aproximadamente 70 nm hasta aproximadamente 110 nm, más típicamente aproximadamente 70 nm hasta aproximadamente 90 nm, y son sustancialmente no tóxicas. Además, los ácidos nucleicos cuando están presentes en las partículas de lípido-ácido nucleico de la presente invención son resistentes en solución acuosa a la degradación con una nucleasa. Las partículas de lípido-ácido nucleico y su método de preparación se describen en, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Números 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; y Publicación PCT Número WO 96/40964.

En una modalidad, la proporción lípido a fármaco (proporción masa/masa) (por ejemplo, la proporción lípido a ARNds) estará en el rango de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 50:1, desde aproximadamente 1 : 1 hasta aproximadamente 25:1, desde aproximadamente 3:1 hasta aproximadamente 15:1, desde aproximadamente 4 : 1 hasta aproximadamente 10:1, desde aproximadamente 5:1 hasta aproximadamente 9:1, o aproximadamente 6 : 1 hasta aproximadamente 9:1.

El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N, -dioleil-N, N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N, N-dimetilamonio (DDAB) , cloruro de N- (I- (2,3-dioleoiloxi) propil) -N, N, N-trimetilamonio (DOTAP) , cloruro de N- (I- ( 2 , 3-dioleiloxi ) propil ) -N, N, N-trimetilamonio (DOTMA) , N, N-dimetil-2, 3-dioleiloxi ) propilamina ( DODMA) , 1,2- DiLinoleiloxi-N, N-dimetilaminopropano (DLinDMA) 1,2- Dilinoleniloxi-N, N-dimetilaminopropano (DLenD A), 1,2- Dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP) , 1, 2-Dilinoleioxi-3- (dimetilamino) acetoxipropano (DLin-DAC) , 1, 2-Dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP) , 1,2- Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano ( DLin-S-DMA) , 1-Linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano ( DLin-2-DMAP) , sal de cloruro de 1 , 2-Dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.C1), sal de cloruro de 1 , 2-Dilinoleoil-3-trimetilaminopropano ( DLin-TAP . Cl ) , 1 , 2-Dilinoleiloxi-3- (N-metilpiperazino) propano (DLin-MPZ) , o 3- (N, N-Dilinoleilamino ) -1 , 2-propanodiol (DLinAP) , 3- (N, N-Dioleilamino) -1 , 2-propanodio ( DOAP) , 1 , 2-Dilinoleiloxo-3- (2-N, -dimetilamino ) etoxipropano (DLin-EG-DMA) , 1, 2-Dilinoleniloxi-N, -dimetilaminopropano (DLinDMA) , 2, 2-Dilinoleil-4-dimetilaminometil- [1, 3] -dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de los mismos, (3aR, 5s, 6aS) -N, N-dimetil-2, 2-di ( (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienil) tetrahidro-3aH-ciclopenta [d] [1, 3] dioxol-5-amina (ALN100), 4- (dimetilamino ) butanoato de ( 6Z , 9Z , 28Z, 31Z ) -heptatriaconta-6, 9,28, 31-tetraen-19-ilo (MC3) , 1, 1' - (2- (4- (2- ( (2- (bis (2-hidroxidodecil) amino) etil) (2-hidroxidodecil) amino) etil) -piperazin-l-il) etilazanodiil ) didodecan-2-ol (Tech Gl), o una mezcla de los mismos. El lipido catiónico puede comprender desde aproximadamente 20% mol hasta aproximadamente 50% mol o aproximadamente 40% mol del lipido total presente en la partícula .

En otra modalidad, el compuesto 2 , 2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [ 1 , 3 ] -dioxolano se puede utilizar para preparar nanoparticulas lípido-ARNsi . La síntesis del 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [1, 3] -dioxolano se describe en la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana número 61/107,998 presentada el 23 de Octubre de 2008, la cual se incorpora aquí por referencia.

En una modalidad, la partícula lípido-ARNsi incluye 40% de 2, 2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [1, 3] -dioxolano: 10% de DSPC: 40% de Colesterol: 10% de PEG-C-DOMG (porciento mol) con un tamaño de partícula de 63.0 ± 20 nm y una Proporción ARNsi/Lípido de 0.027.

El lípido no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutral incluyendo, pero no limitado a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) , dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) , dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) , palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil ) -ciclohexano-1-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE) , diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE) , 16-O-monometil PE, 16-0-dimetil PE, 18-1 -trans PE, l-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE) , colesterol, o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede ser desde aproximadamente 5% mol hasta aproximadamente 90% mol, aproximadamente 10% mol, o aproximadamente 58% mol si se incluye colesterol, del lípido total presente en la partícula.

El lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido incluyendo, sin limitación, un PEG-diacilglicerol (DAG) , un PEG-dialquiloxipropilo (DAA) , un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida (Cer) , o una mezcla de los mismos. El conjugado PEG-DAA puede ser, por ejemplo, un PEG-dilauriloxipropilo (C12) , un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4) , un PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6) , o un PEG-diesteariloxipropilo (Cis) . El lípido conjugado que previene la agracación de partículas puede ser desde 0% mol hasta aproximadamente 20% mol o aproximadamente 2% mol del lípido total presente en la partícula .

En algunas modalidades, la partícula de lípido-ácido nucleico incluye además colesterol en, por ejemplo, aproximadamente 10% mol hasta aproximadamente 60% mol o aproximadamente 48% mol del lípido total presente en la partícula .

L P01 En una modalidad, el ND98 -4HC1 lipidoide (MW 1487) (Fórmula 1), Colesterol ( Sigma-Aldrich) , y PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) se pueden utilizar para preparar nanoparticulas de lipido-ARNsi (es decir, partículas LNP01) . Las soluciones madre o base de cada uno en etanol se pueden preparar como sigue: ND98, 133 mg/ml; Colesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramida C16, 100 mg/ml. Las soluciones madre de ND98, Colesterol, y PEG-Ceramida C16 se pueden combinar entonces en, por ejemplo, una proporción molar 42:48:10. La solución de lípidos combinada se puede mezclar con el ARNsi acuoso (por ejemplo, en acetato de sodio pH 5) tal que la concentración final de etanol sea aproximadamente 35-45% y la concentración final de acetato de sodio sea aproximadamente 100-300 mM. Las nanoparticulas de lipido-ARNsi típicamente se forman espontáneamente tras el mezclado. Dependiendo de la distribución del tamaño de partícula deseado, la mezcla resultante de nanoparticulas se puede extruir a través de una membrana de policarbonato (por ejemplo, corte de 100 nm) utilizando, por ejemplo, un extrusor de termobarril, tal como el Extrusor Lipex (Northern Lipids, Inc) . En algunos casos, se puede omitir la etapa de extrusión. La remoción de etanol y el cambio simultáneo de amortiguador se pueden lograr, por ejemplo, mediante diálisis o filtración de flujo tangencial.

El amortiguador se puede intercambiar con, por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en aproximadamente pH 7, por ejemplo, aproximadamente pH 6.9, aproximadamente pH 7.0, aproximadamente pH 7.1, aproximadamente pH 7.2, aproximadamente pH 7.3, o aproximadamente pH 7.4.

Isómero I de ND98 Fórmula 1 Las formulaciones LNP01 se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud Internacional Número WO 2008/042973, la cual se incorpora por este medio por referencia.

Formulaciones de lipido-ARNsi, ejemplares, adicionales, son como sigue: Lipido Catiónico Lípido catiónico/lípido no Proceso catiónico/colesterol/conjugado PEG-lípido Proporción LípidoiARNsi SNALP 1 ,2-Dílinoleníloxi-N,N- DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG- dimetilaminopropano (DLinDMA) cDMA (57.1/7.1/34.4/1.4) lípido:ARNsi ~ 7:1 SNALP- 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]- XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA XTC dioxolano (XTC) 57.1/7.1/34.4/1.4 lípidorARNsi - 7:1 LNP05 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]- XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Extrusión dioxolano (XTC) 57.5/7.5/31.5/3.5 líp¡do:ARNs¡ ~ 6:1 LNP06 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]- XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Extrusión dioxolano (XTC) 57.5/7.5/31.5/3.5 lípido:ARNsi - 11 :1 LNP07 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]- XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclado en dioxolano (XTC) 60/7.5/31/1.5, línea lípido:ARNsi - 6:1 LNP08 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]- XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclado en dioxolano (XTC) 60/7.5/31/1.5, línea lípido:ARNsi ~ 11 :1 LNP09 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]- XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclado en dioxolano (XTC) 50/10/38.5/1.5 línea Lípido:ARNs¡ 10:1 LNP10 (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)- ALN100/DSPC/Colesterol/PEG- Mezclado en octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH- DMG línea ciclopenta[d] 50/10/38.5/1.5 [1 ,3]dioxol-5-amina (ALN100) Upido:ARNsi 10:1 LNP11 4-(dimetilamino)butanoato de MC-3/DSPC/Colesterol/PEG-DMG Mezclado en (6Z,9Z,28Z,31 Z)-heptatriaconta- 50/10/38.5/1.5 línea 6,9,28,31- Lípido:ARNs¡ 10:1 tetraen-19-ilo (MC3) LNP12 1 ,1 '-(2-(4-(2-((2-(bis(2- Tech G1/DSPC/Colesterol/PEG- Mezclado en hidroxidodecil)amino) DMG línea etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin- 50/10/38.5/1.5 1-il)etilazanodül)didodecan-2-ol (Tech G1) Lípido:ARNsi 10:1 Las formulaciones LNP09 y las formulaciones que comprenden XTC se describen, por ejemplo, en la Provisional Norteamericana Número de Serie 61/239,686, presentada el 3 de Septiembre de 2009, la cual se incorpora por este medio por referencia. Las formulaciones LNP11 y las formulaciones que comprenden MC3 se describen, por ejemplo, en la Provisional Norteamericana Número de Serie 61/244,834, presentada el 22 de 'Septiembre de 2009, la cual se incorpora por este medio por referencia .

Las formulaciones preparadas por ya sea el método estándar o libre de extrusión se pueden caracterizar en maneras similares. Por ejemplo, las formulaciones típicamente se caracterizan mediante inspección visual. Deben ser soluciones translúcidas blanquecinas libres de agregados o sedimento. El tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula de las nanopartículas de lipidos se pueden medir mediante dispersión de la luz utilizando, por ejemplo, un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EEUU) . Las partículas deben ser de aproximadamente 20-300 nm, tal como 40-100 nm de tamaño. La distribución del tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración total de ARNsi en la formulación, así como también la fracción entrampada, se estima utilizando un ensayo de exclusión de tinte. Una muestra del ARNsi formulado se puede incubar con un tinte que enlaza el ARN, tal como Ribogreen (Molecular Probes) en la presencia o la ausencia de un surfactante que desestabiliza la formulación, por ejemplo, Tritón X100 al 0.5%. El ARNsi total en la formulación se puede determinar mediante la señal de la muestra que contiene el surfactante, con relación a una curva estándar. La fracción entrampada se determina sustrayendo el contenido de ARNsi "libre" (según se mide mediante la señal en la ausencia de surfactante) del contenido total de ARNsi. El porciento de ARNsi entrampado es típicamente > 85%. Para la formulación SNALP, el tamaño de partícula es al menos 30 nm, al menos 40 nm, al menos 50 nm, al menos 60 nm, al menos 70 nm, al menos 80 nm, al menos 90 nm, al menos 100 nm, al menos 110 nm, y al menos 120 nm. El rango adecuado es típicamente aproximadamente al menos 50 nm hasta aproximadamente al menos 110 nm, aproximadamente al menos 60 nm hasta aproximadamente al menos 100 nm, o aproximadamente al menos 80 nm hasta aproximadamente al menos 90 nm.

Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquitos, tabletas o minitabletas . Pueden ser deseables espesadores, agentes saborizantes, diluentes, emulsificadores, adyuvantes de desintegración o aglutinantes. En algunas modalidades, las formulaciones orales son aquellas en las cuales los ARNds presentados en la invención se administran en conjunción con uno o más surfactantes me oradores de penetración y agentes de quelación. Los surfactantes adecuados incluyen ácidos grasos y/o ásteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Las sales/ácidos biliares adecuados incluyen ácido chenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxichenodesoxicolico (UDCA) , ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-2 , 25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprilico, ácido cáprico, ácido miristico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, l-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo sodio) . En algunas modalidades, se utilizan combinaciones de mejoradores de penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos biliares/sales. Una combinación ejemplar es la sal de sodio del ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Mejoradores de penetración adicionales incluyen polioxietilen-9-lauril éter, polioxietilen-20-cetil éter. Los ARNds presentados en la invención se pueden entregar oralmente, en forma granular incluyendo partículas secas pulverizadas, o pueden formar complejos para formar micro o nanopartículas . Los agentes de formación de complejos con el ARNds incluyen poli-aminoácidos; poliiminas; poliacrilatos ; polialquilacrilatos , polioxetanos, polialquilcianoacrilatos ; gelatinas cationizadas , albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivadas de DEAE, polulanos, celulosas y almidones. Los agentes de formación de complejos, adecuados, incluyen chitosán, N-trimetilchitosán, poli-L-lisina, polihistidina , poliornitina , poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE) , poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino) , poli (metilcianoacrilato) , poli (etilcianoacrilato) , poli (butilcianoacrilato) , poli (isobutilcianoacrilato) , poli ( isohexilcianoacrílato) , DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli (ácido D, L-láctico) , poli (ácido DL-láctico-co-glicólico (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones orales para los ARNds' s y su preparación se describen en detalle en la Patente Norteamericana 6,887,906, Publicación Norteamericana Número 20030027780, y Patente Norteamericana Número 6,747,014, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia.

Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intraparenquimatosa (en el cerebro) , intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener amortiguadores, diluentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no limitado a, mej oradores de penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos auto-emulsificantes y semisólidos auto-emulsificantes . Son particularmente preferidas las formulaciones que tienen como objetivo el hígado al tratar desórdenes hepáticos tales como el carcinoma hepático.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que convenientemente se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de acuerdo con las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los ingredientes activos con el (los) excipiente ( s) o portador (es) farmacéutico ( s ) . En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniformemente y intimamente los ingredientes activos con los portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y posteriormente, si es necesario, moldeando el producto.

Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero no limitado a, tabletas, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios, y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.

Emulsiones Las composiciones de la presente invención pueden ser preparadas y formuladas como emulsiones.

Las emulsiones típicamente son sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotitas, que superan normalmente 0.1 µpt. de diámetro (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1981, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc. Nueva York., Volumen 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York. N.Y., volumen 2, p. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co-, Easton, Pa . , 1985, p. 301) . Las emulsiones son sistemas bifásicos que comprenden dos o más fases liquidas inmiscibles mezcladas y dispersadas intimamente entre si. En general, las emulsiones pueden ser ya sea de la variedad de agua en aceite (w/o) o de aceite en agua. Cuando una fase acuosa se divide finalmente y se dispersa como gotitas diminutas en una fase aceitosa voluminosa, la composición resultante se llama una emulsión de agua en aceite (w/o) . Alternativamente, cuando una fase aceitosa se divide finamente y se dispersa como gotas diminutas en una fase acuosa voluminosa, la composición resultante se llama una emulsión de aceite en agua (o/w) . Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo el cual puede estar presente como una solución ya sea en la fase acuosa, la fase aceitosa o en si como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulgentes, estabilizadores, tintes, y antioxidantes también pueden estar presentes en las emulsiones, según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que se componen de más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsione de aceite en agua en aceite (o/w/o) y de agua en aceite en agua (w/o/w) . Tales formulaciones complejas frecuentemente proporcionan ciertas ventajas que no proporcionan las emulsiones binarias simples. Las emulsiones múltiples en las cuales las gotitas de aceite individuales de una emulsione so/w encierran gotitas pequeñas de agua constituyen una emulsión w/o/w. igualmente, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizadas en una fase continua aceitosa proporciona una emulsiones o/w/o.

Las emulsiones se caracterizan por su poca o ninguna estabilidad térmica. Frecuentemente, la fase dispersa o discontinua de la emulsión está bien dispersada en la fase externa o discontinua y se mantiene en esta forma por medio de emulgentes o de la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de las bases para ungüentos y cremas de tipo emulsificadas . Otros medios para estabilizar las emulsiones implica el uso de emulgentes que pueden ser incorporados en cualquier fase de la emulsión. Los emulgentes pueden ser clasificados ampliamente en cuatro categorías: surfactantes sintéticos, emulgentes de formación natural, bases de absorción, y sólidos dispersados finamente (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199) .

Los surfactantes sintéticos, conocidos también como agentes tensioactivos, han encontrado amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y han sido estudiados en la literatura (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 199) . Los surfactantes típicamente son anfifílicos y comprenden una porción hidrofilita y una hidrofóbica. La proporción de la naturaleza hidrofilita a la naturaleza hidrofóbica del surfactante ha sido llamada el balance hidrofílico/lipofílico (HLB) y es una herramienta valiosa para categorizar y seleccionar los surfactantes en la preparación de formulaciones. Los surfactantes pueden ser clasificados en diferentes clases, con base en la naturaleza del grupo hidrofílico: no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfóteros (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York., Volumen 1, p. 285) .

Los emulgentes de formación natural usados en las formulaciones en emulsión incluyen lanolina, cera de abeja, fosfátidos, lecitina y acacia. Las bases de absorción poseen propiedades hidrofílicas de modo que estas pueden absorber el agua para formar emulsiones de w/o y aun retener las consistencias semisólidas, tales como lanolina anhidra y petrolato hidrofílico. Los sólidos divididos finamente también han sido usados como buenos emulgentes en especial en combinación con surfactantes y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas no exoansibles, tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorilonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de magnesio y aluminio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbón o triestearato de glicerilo.

Una gran variedad de materiales no emulgentes también se incluyen en las formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de la emulsión. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrofílicos, conservadores y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (1998, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., volumen 1, p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199).

Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides incluyen las gomas de origen natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, carragenano, goma de guar, goma de Baraya, y tragacanto) , los derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y poliedros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, celulosa éteres, y polímeros de carboxivinilo) .

Estos se dispersan o se expanden en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando películas interfaciales fuertes alrededor de las gotitas de la fase dispersada y aumentando la viscosidad de la fase externa.

Ya que las emulsiones frecuentemente contienen un número de ingredientes tales como carbohidratos, proteínas, esteróles y fosfátidas que pueden sustentar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones frecuentemente incorporan conservadores. Los conservadores usados comúnmente incluidos en las formulaciones en emulsión incluyen metil parabeno, propil parabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ásteres de ácido p-hidroxibenzoico, y ácido bórico. Los antioxidantes también se usan comúnmente para las formulaciones en emulsión, para evitar el deterioro de la formulación.

Los antioxidantes usados pueden ser depuradores de radicales libres tales como tocoferoles, alquil galatos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y agentes sinérgicos tales como ácido cítrico, ácido tartárico, y lecitina.

La aplicación de las formulaciones en emulsión por medio de las rutas dermatológica, oral y parenteral, y los métodos para su fabricación, han sido reportados en la literatura (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199) . Las formulaciones en emulsión para administración oral han sido usadas ampliamente debido a su facilidad de formulación, asi desde el punto de vista de su eficacia de absorción y biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199) . Los laxantes a base de aceite mineral, vitaminas solubles en aceite y preparaciones grasas altamente nutritivas están entre los materiales que comúnmente han sido administrados oralmente como emulsiones o/w.

En una modalidad de la presente invención, las composiciones de ARNds y de ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones . Una microemulsión puede ser definida como un sistema de agua, aceite y anfifila la cual típicamente es una solución liquida isotrópica ópticamente y estable termodinámicamente (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245) . Las microemulsiones típicamente son sistemas que se preparan dispersando primero un aceite en una solución de surfactante acuoso y agregando después una cantidad suficiente de un cuarto componente, en general un alcohol de longitud de cadena intermedia, para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones han sido descritas como dispersiones estables termodinámicaraente, isotrópicamente claras de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan por películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shan, en: Controlled Reléase of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, . , Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215) . Las microemulsiones se preparan comúnmente vía una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, surfactante, cosurfactante y electrolito. Si la microemulsión es del tipo de agua en aceite (w/o) o del tipo de aceite en agua depende de las propiedades del aceite y del surfactante usado y de la estructura y el empacamiento geométrico de las cabezas polares y las colas hidrocarbúricas de las moléculas de surfactante (Schott, en Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co . , Easton, Pa . , 1985, p. 271).

El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fase ha sido estudiado extensivamente y ha proporcionado un conocimiento extenso, para las personas experimentadas en la técnica, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 335) . En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar los fármacos insolubles en agua, en una formulación de gotitas estables termodinámicamente que se forman de manera espontánea.

Los surfactantes usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, surfactantes iónicos, surfactantes no iónicos, Brij 96, polioxietilen oleil éteres, poliglicerol ácido graso esteres, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol ( O310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinación con cosurfactantes . El cosurfactante, usualmente un alcohol de cadena corta, como por ejemplo, etanol, 1-propanol, y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar en la película del surfactante y crear consecutivamente una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas del surfactante. Las microemulsiones pueden ser preparadas, sin embargo, sin el uso de cosurfactantes y los sistemas de microemulsiones auto emulgentes, sin alcohol son conocidos en la técnica. La fase acuosa puede ser típicamente, pero no se limita a, agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles , y derivados de et ilenglicol . La fase aceitosa puede incluir, pero no se limita a materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul C , ácido graso ésteres, mono, di, y triglicéridos de cadena media (C8-C12), gliceril ácido graso ésteres polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados , glicéridos poliglicolizados , saturados de C8-C10, aceites vegetales y aceite de silicona.

Las microemulsiones son particularmente de interés desde el punto de vista de la solubilización de fármacos y la absorción mejorada de fármacos. Las microemulsiones a base de lípidos (tanto o/w y w/o) han sido propuestas para mejorar la biodisponibilidad oral de fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides et a., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find, Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205) . Las microemulsiones proporcionan las ventajas de solubilización mejorada de fármacos, protección de los fármacos contra la hidrólisis enzimática, posible aumento de la absorción de los fármacos debido a alteraciones inducidas por el surfactante en la fluidez y la permeabilidad de las membranas, facilidad de preparación, facilidad de administración oral a través de formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada, y toxicidad reducida (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm, Sci . , 1996, 85, 138-143) . Frecuentemente, las microemulsiones pueden formarse de forma espontánea cuando sus componentes se ponen juntos a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos, péptidos, o ARNds termolábiles . Las microemulsiones también han sido efectivas en la administración transdérmica de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas y farmacéuticas. Se espera que las composiciones y las formulaciones en emulsión de la presente invención faciliten la absorción sistémica aumentada de los ARNds y los ácidos nucleicos desde el tracto gastrointestinal, asi como mejorarán la asimilación celular local de los ARNds y los ácidos nucleicos.

Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales monoestearato de sorbitan (Grill 3) , Labrasol, y mejoradores de penetración, para mejorar las propiedades de la formularon y para mejorar la absorción de las ARNds y los ácidos nucleicos de la presente invención. Los mejoradores de penetración usados en las microemulsiones de la presente invención pueden ser clasificados como pertenecientes a una de cinco categorías amplias -- surfactantes , ácidos grasos, sales biliares, agentes de quelación, y surfactantes no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases ha sido discutida anteriormente.

Mejoradores de Penetración En una modalidad, la presente invención emplea varios mejoradores de penetración para efectuar la administración eficiente de los ácidos nucleicos, en particular los ARNds, en la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución tanto en forma ionizada y no ionizada. Sin embargo, usualmente solo los fármacos solubles en lípidos o lipofilicos cruzan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que aun los fármacos no lipofilicos pueden cruzar las membranas celulares si la membrana a ser cruzada se trata con un me orador de penetración. Además de ayudar en la difusión de los fármacos no lipofilicos a través de las membranas celulares, los mejoradores de penetración también mejoran la permeabilidad de los fármacos lipofilicos.

Los mejoradores de penetración pueden ser clasificados como pertenecientes a una de cinco categorías amplias, es decir, surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes de quelación, y surfactantes no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de las clases citadas anteriormente de los mejoradores de penetración se describe con más detalle a continuación .

Surfactantes : En conexión con la presente invención, los surfactantes (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas las cuales, cuando se disuelven en una solución acuosa, redicen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido con el resultado de que se mejora la absorción de los ARNds a través de las mucosas. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos mejoradores de penetraron incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter) (Lee et al., Critica], Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); y emulsiones de sustancias perfluoroquimicas , tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252) . Ácidos Grasos: Varios ácidos grasos y sus derivados, los cuales actúan como mejoradores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico) , ácido miristico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina ( 1-monooleoil-l-rac-glicerol ) , dilaurina, ácido caprilico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas , acilcolinas, C.sub.1-10 alquil ésteres de las mismas (por ejemplo, metil, isopropil y ter-butil) , mono y diglicéridos de las mismas (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linolato, etc.) (Lee et al., critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; uranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al.', J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654) .

Sales biliares: el papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación de la dispersión y la absorción de los lípidos y las vitaminas solubles en grasas (Brunton, Capitulo 38 en: Goodman & Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics , 9a Ed., Hardman et al., Eds . , McGrawHill, Nueva York, 1996, p/p. 934-935). Varias sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como mej oradores de penetración. Por lo tanto, el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes de formación natural de la bilis, asi como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio aceptable farmacéuticamente, colato de sodio) , ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio) , ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio) , ácido glicólico (glucolato de sodio) , ácido glicólico (glicolato de sodio) , ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio) , ácido taurocólico (taurocolato de sodio) , ácido taurodesoxicólico ( taurodesoxicolato de sodio) , ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio) , ácido ursodesoxicólico (UDCA) , tauro-24 , 25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF) , glicodihidrofusidato de sodio y polioxietilen-9-lauril éter (POR) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swindyard, Capitulo 30 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. , Gennaro, ed. , Mack Publishing Co., Easton, Pa . , 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79,579-583) .

Agentes de Quelación. Los agentes de quelación, cuando se usan en conexión con la presente invención, pueden ser definidos como compuestos que eliminan los iones metálicos de la solución a formar compuestos entre los mismos, con el resultado de que se mejorada la absorción de los ARNds a través de la mucosa. Con relación a su uso como mejoradores de penetración en la presente invención, los agentes de quelación tiene la ventaja añadida de que también sirven como inhibidores de DNasa, ya que la mayoría de las ADN nucleasas requiere un ion metálico divalente para la catálisis y por lo tanto son inhibidas por los agentes de quelación (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, (618, 315-339) . Los agentes de quelación adecuados incluye, pero no se limitan a etilendiamintetraacetato de disodio (EDTA) , ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato) , derivados de N-acilo de colágeno, derivados de laureth-9 y N-aminoacilo de beta-diacetona (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Reí., 1990, 14, 43-51) .

No surfactantes no quelantes: Como se usa aquí, los compuestos mejoradores de penetración no surfactantes no quelantes pueden ser definidos como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes de quelación o como surfactantes pero que no obstante, mejoran la absorción de los ARNds a través de la mucosa alimenticia (Muranishi , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de mejoradores de penetración incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil y 1-alquenolazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Portadores Ciertas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se usa aquí "compuesto portador" o "portador" puede referirse a un ácido nucleico o un análogo del mismo, el cual es inerte (es decir, que no pose actividad biológica per se) pero es reconocido como un ácido nucleico por los procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tenga actividad biológica por ejemplo, degradando el ácido nucleico activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador típicamente con un exceso de la última sustancia, puede resultar en una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, los ríñones y otros depósitos extracirculatorios, supuestamente debido a la competición entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un fosforotioato ARNds en el tejido hepático puede ser reducida cuando este se coadministra con ácido poliinosinico, sulfato de dextrano, ácido policitidílico o ácido 4-acetamido-4 ' isotiociano-estilben-2 , 2 ' -disulfónico (Miyao et al., ARNds Red. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., ARNds & Nucí. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.

Excipientes En constaste con un compuesto portador, un "portador farmacéutico" o "excipiente" es un solvente aceptable farmacéuticamente, agente de suspensión o cualquier otro vehículo inerte farmacológicamente para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la manera de administración planeada en mente, para hacer posible el volumen deseado, la consistencia, etc., cuando se combina con el ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes de aglutinamiento (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinil pirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa, etc.); rellenadores (por ejemplo, lactosa y otros azucares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etil celulosa, poliacrilatos o fosfato hidrógeno de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos de metal, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegradores (por ejemplo, almidón, ,glicolato de almidón sódico, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio, etc . ) .

Los excipientes orgánicos de inorgánicos aceptables farmacéuticamente adecuados para la administración no parenteral, los cuales no reaccionan de manera perjudicial con los ácidos nucleicos pueden ser usados para formular las composiciones de la presente invención. Los portadores aceptables farmacéuticamente incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetil celulosa, polivinilpirrolidona, y los similares.

Las formulaciones para administración tópica de los ácidos nucleicos incluyen soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en los solventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de los ácidos nucleicos en bases líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden usar los excipientes orgánicos o inorgánicos aceptables farmacéuticamente, se adecuados para la administración no parenteral los cuales no reaccionan de manera perjudicial con lo ácidos nucleicos.

Los excipientes aceptables farmacéuticamente incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, polietilenglicoles , gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, y los similares.

Otros Componentes Las composiciones de la presente invención pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos encontrados convencionalmente en las composiciones farmacéuticas, a sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales activos farmacéuticamente, compatibles, adicionales tales como, por ejemplo, antipruríticos , astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de varias formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como tintes, agentes saborizantes , conservadores, antioxidantes, opacificantes , agentes de espesamiento y estabilizadores. Sin embargo, tales materiales cuando se agregan, no deben interferir de forma indebida con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones pueden ser esterilizadas, y, si se desea, mezcladas con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, emulgentes, sales para influencias la presión osmótica, amortiguadores, colorantes, saborizantes, y/o sustancias aromáticas y los similares, los cuales no interactúen de manera perjudicial con los ácidos nucleicos de la formulación.

Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias las cuales aumentan la viscosidad de la suspensión, incluyendo por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. Las suspensiones también pueden contener estabilizadores.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas presentadas en la invención incluyen (a) uno o más compuestos de ARNds y (b) uno o más agentes biológicos anti-citocinas los cuales funcionan mediante un mecanismo distinto al ARNi. Los ejemplos de tales agentes biológicos incluyen los agentes biológicos que tienen como objetivo la ILpi (por ejemplo, anakinra) , IL6 ( tocilizumab) , o TNF (etenarcept, infliximab, adlimumab, o certolizumab) .

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden ser determinadas mediante los procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población y la ED50 (la dosis efectiva terapéuticamente en el 50% de la población) . La relación de las dosis entre los efectos toxico y terapéutico es el índice terapéutico y este puede ser expresado como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben índices terapéuticos altos.

Los datos obtenidos de los ensayos en cultivos celulares y estudios en animales pueden ser usados para formular un rango de dosis para ser usadas en humanos. La dosis de las composiciones presentadas en la invención esta generalmente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos presentados en la invención, la dosis efectiva terapéuticamente puede ser estimada inicialmente de los ensayos en cultivos celulares. Una dosis puede ser formulada en modelos animales para lograr un rango de concentraciones del plasma circulante del compuesto, o cuando sea apropiado, del producto polipéptido de una secuencia objetivo (por ejemplo, lograr una concentración reducida del polipéptido) que incluya la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba la cual logra una inhibición media máxima de los síntomas) cuando se determina en cultivos celulares. Tal información puede ser usada para determinar con más exactitud las dosis útiles en humanos. Los niveles en el plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.

Además de su administración como se discute anteriormente, los ARNds presentados en la invención pueden ser administrados en combinación con otros agentes conocidos efectivos en el tratamiento de los procesos patológicos mediados por la expresión de la TTR. En cualquier caso, la el médico que administra puede ajustar la cantidad y el calendario de administración de la ARNds sobre la base de los resultados observados usando las mediciones estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas aquí.

Métodos para tratar enfermedades provocadas por la expresión de un gen de TTR La invención se refiere en particular al uso del ARNds que tiene como objetivo la TTR y las composiciones que contienen al menos uno de tales ARNds para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediada por la TTR. Por ejemplo, un ARNds que tiene como objetivo un gen de TTR puede ser útil para el tratamiento de una amiloidosis por TTR, tal como polineuropatía amiloidótica familiar (FAP) , cardiomiopatía amiloidótica familiar (FAC), amiloidosis leptomeníngea/del CNS, forma VII de amiloidosis (conocida también como amiloidosis leptomeníngea o meningocerebrovascular ) , hipertiroxinemia, y amiloidosis cardiaca (llamada también amiloidosis sistémica senil (SSA) y amiloidosis cardiaca senil (SCA) ) .

La FIG. 15 ilustra los síntomas y las mutaciones en la TTR asociados con la neuropatía amiloidótica familiar, la cardiomiopatía amiloidótica familiar y la amiloidosis del CNS. La invención incluye composiciones y métodos para el tratamiento de estas enfermedades y los síntomas, y se dirige a estas versiones mutantes de la TTR.

Un ARNds que tiene como objetivo el gen de TTR también se usa para el tratamiento de los síntomas y los trastornos tales como amiloidosis por TTR. Los síntomas asociados con tal amiloidosis incluyen, por ejemplo, convulsiones, demencia, mielopatía, polineuropatía, síndrome del túnel carpiano, insuficiencia autonómica, cardiomiopatía, disfunción gastrointestinal (por ejemplo, ulceras gástricas, diarrea, constipación, síndrome de mala absorción) , pérdida de peso, hepatomegalia, linfadenopatía, bocio, opacidades vitreas, insuficiencia renal (incluyendo proteinuria y falla renal), nefropatía, disfunción de los nervios craneales, distrofia reticular córnea, y falla congestiva del corazón con debilidad generalizada y dificultad para respirar por la retención de fluidos .

Debido a los efectos inhibidores sobre la expresión de la TTR, una composición de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica preparada a partir de la misma puede mejorar la calidad de vida.

La invención se refiere además al uso de ARNds o una composición de las mismas; por ejemplo, para tratar la amiloidosis por TTR, en combinación con otros métodos farmacéuticos y/o terapéuticos, por ejemplo, con los métodos farmacéuticos y terapéuticos conocidos, tales como, por ejemplo, aquellos que se emplean actualmente para tratar estos trastornos. En un ejemplo, las ARNds que tienen como objetivo la TTR puede ser administrada en combinación con un trasplante de hígado. En otros ejemplos, las ARNds que tiene como objetivo la TTR se pueden administrar en combinación con un método farmacéutico o terapéutico para tratar un síntoma de una enfermedad por TTR, tales como diuréticos, inhibidores de ACE (enzima de conversión de la angiotensina) , bloqueadores del receptor de angiotensina (ARBs), o diálisis, por ejemplo, para el manejo de las funciones renales.

Los ARNds y un agente terapéutico adicional pueden ser administrados en la misma combinación, por ejemplo, parenteralmente, o el agente terapéutico adicional puede ser administrado como parte de una composición separada o mediante otro método descrito aquí.

La invención presenta además un método para administrar los ARNds que tienen como objetivo la TTR, a un paciente que tenga una enfermedad o trastorno mediado por la expresión de TTR, tal como amiloidosis de TTR, por ejemplo, FAP . La administración de las ARNds puede estabilizar y mejorar la función neurológica periférica, por ejemplo, en un paciente con FAP. A los pacientes se les puede administrar una cantidad terapéutica de ARNds, tal como 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, o 2.5 mg/kg de ARNds. Los ARNds pueden ser administradas por infusión intravenosa durante un periodo de tiempo, tal como durante un periodo de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 0 180 minutos. La administración se repite, por ejemplo, en una base regular, tal como cada dos semanas por un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más tiempo. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden ser administrados en base menos frecuente. Por ejemplo, después de la administración cada dos semanas por tres meses, la administración puede ser repetida una vez por mes, por seis meses o un año o más tiempo. La administración de los ARNds puede reducir los niveles de TTR en la sangre o la orina del paciente en al menos 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% o más.

Antes de la administración de una dosis completa de los ARNds, a los pacientes se les puede administrar una dosis más pequeña, tal como una dosis que sea 5% de la dosis completa, y se monitorean por efectos adversos. Como por ejemplo, una reacción alérgica o un cambio en las funciones del hígado. Por ejemplo, en los pacientes monitoreados por los cambios en las funciones del hígado, una incidencia baja de cambio en las LFT (Prueba de las funciones Hepáticas) (por ejemplo, una incidencia de 10-20% de las LFT) es aceptable (por ejemplo, un aumento reversible de la tercera parte en los niveles de ALT (alanina aminotransferasa) y/o la AST (aspartato aminotransferasa) .

Muchas enfermedades y trastornos asociados con la TTR son hereditarios. Por lo tanto, un paciente en necesidad de TTR ARNds puede ser identificado tomando el historial familiar. Un proveedor de cuidados de la salud, tal como un doctor, enfermera, o miembro de la familia, puede tomar un historial familiar antes de prescribir o administrar TTR ARNds. También se puede llevar a cabo una prueba de ADN sobre el paciente para identificar una mutación en el gen de TTR, antes de administrar al paciente los TTR ARNds.

Se puede realizar una biopsia al paciente antes de recibir los TTR ARNds. La biopsia puede ser por ejemplo, en un tejido, tal como la mucosa gástrica, los nervios periféricos, la piel, la grasa abdominal, o los ríñones, y la biopsia puede revelar placas amiloides, las cuales son indicativas de un trastorno mediado por la TTR. Tras la identificación de las placas amiloideas, se administra al paciente los TTR ARNds.

Métodos para inhibir la expresión de un gen de TTR En aun otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de un gen de TTR en un mamífero. El método incluye administrar al mamífero una composición presentada en la invención, de modo tal que se desactiva el gen de TTR objetivo.

Cuando el organismo a ser tratado es un mamífero, tal como un humano, la composición puede ser administrada por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitados a las rutas oral o parenteral, incluyendo la administración intracraneal (por ejemplo, intraventricular, intraparenquimal de intratecal) , intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, aérea (aerosol) , nasal, rectal y tópica (incluyendo bucal y sublingual) . En ciertas modalidades, las composiciones se administran por infusión o inyección intravenosa.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado entendido comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí, en la práctica de la evaluación de los ARNds y los métodos presentados en la invención, los métodos y los materiales adecuados se describen a continuación. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas aquí se incorporan como referencia en su totalidad. En el caso de un conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones tendrá el control. Además, los materiales, métodos, y los ejemplos son ilustrativos solamente y no tienen la intención de ser limitantes .

EJEMPLOS E emplo 1. Síntesis de las ARNds Fuente de los reactivos Cuando no se proporciona específicamente la fuente de un reactivo, tal reactivo puede ser obtenido de cualquier distribuidor de los reactivos para biología molecular con un estándar de calidad/pureza para su aplicación en biología molecular .

Síntesis de ARNsi Los ARN de hebra simple se produjeron mediante síntesis en fase sólida a una escala de 1 µp??? usando un sintetizador Expedite 8909 (Applied' Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y vidrio poroso controlado (CPG, 500Á, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte sólido. El ARN y el ARN que contiene 2'-0-metil nucleótidos se generaron mediante síntesis en fase sólida empleando las fosforamiditas correspondientes y 2 ' -O-metilfosforamiditas, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Estos bloques de construcción se incorporaron en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena del oligoribonucleotido usando la química estándar de fosforamiditas, como por ejemplo como se describe en Current protocols un nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al., (Edrs.)/ John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EUA. Se introdujeron enlaces de fosforotioato mediante el reemplazo de la solución oxidante de yodo con una solución del reactivo de Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, RU) en acetonitrilo (1%) . Otros reactivos adicionales se obtuvieron de Millinckrodt Baker (Griesheim, Alemania) .

La desprotección y la purificación de los oligoribonucleotidos crudos mediante HPLC de intercambio iónico se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Los rendimientos y las concentraciones se determinaron mediante absorción de UV de una solución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm, usando un fotómetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleiftheim, Alemania) . El ARN de hebra doble se generó mezclando una solución equimolar de las hebras complementarias en amortiguador de hibridaron (fosfato de sodio 20 m , pH 6.8; cloruro de sodio 100 mM) , calentando en un baño de agua a 85-90°C por 3 minutos y enfriando a la temperatura ambiente durante un periodo de 3-4 horas. La solución de ARN hibridado se almacenó a -20°C hasta su uso.

Para la síntesis de los ARNsi conjugado con 3'-colesterol (conocido aquí como -Chol-3' ) , se usó un soporte sólido modificado de manera apropiada para la síntesis de ARN. El soporte sólido modificado se preparó como sigue: Dietil-2-azabutano-l , 4-dicarboxilato AA Una solución 4.7M de hidróxido de sodio (50 mL) se agregó a una solución agitada, enfriada con hielo de clorhidrato de glicinato de etilo (32.19 g, 0.23 mol) en agua (50 mL) . Después de agregó acrilato de etilo (23.1 g, 0.22 mol) y la mezcla se agitó a la temperatura ambiente hasta que se determinó la terminación de la reacción por TLC. Después de 19h, la solución se fraccionó con diclorometano (3 x 100 mL) . La capa orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó. El residuo se destiló para dar AA (28.8 g, 61%).

Etil éster de ácido 3- { etoxicarbonilmetil- [ 6- ( H- fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino) hexanoil] -amino} -propiónico AB AB Ácido Fmoc-6-amino-hexanoico (9.12 g, 25.83 mol) se disolvió en diclorometano (50 mL) y se enfrió con hielo. Se agregó diisopropilcarbodiimida (3.25 g, 3.99 mL, 25.83 mmol) a la solución, a 0°C. Esta fue seguida por la adición de dietil- azabutano-1 , 4-dicarboxilato (5 g, 24.6 mmol) y dimetilamino piridina (0.305 g, 2.5 mmol) . La solución se trajo a la temperatura ambiente y se agitó otras 6 h. La terminación de la reacción se determinó por TLC. La mezcla de reacción se concentró bajo vacio y se agregó acetato de etilo para precipitar la diisopropil urea. La suspensión se filtró. El filtrado se lavó con ácido clorhídrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio al 55 y agua. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron para dar el producto rudo el cual se purificó mediante cromatografía en columna (50% EtOAc/hexanos ) para dar 11.87 g (88%) de AB.

Etil éster de ácido 3- [ 6-amino-hexanoil ) -etoxicarbonilmetil-amino] -propiónico AC AC Etil éster de ácido 3- { etoxicarbonilmetil- [ 6- ( 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino) -hexanol] -amino } -propiónico AB (11.5 g, 21.3 mmol) se disolvió en piperidina al 20% en dimetilformamida a 0°C. La solución se siguió agitando por 1 h. La mezcla de reacción se concentró bajo vacío, se agregó agua al residuo, y el producto se extrajo con acetato de etilo. El producto crudo se purificó mediante la conversión a la sal de clorhidrato.

Etil éster de ácido 3- ({ 6- [17- (1, 5-dimetil-hexil) -10, 13-dimetil-2, 3, 4, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxicarbonilamino] -hexanoil } etoxicarbonilmetil-amino) propiónico AD AD La sal de clorhidrato de etil éster de ácido 3— [ ( 6— amino-hexanoil) -etoxicarbonilmetil-amino] -propiónico AC (4.7 g, 14.8 mmol) se puso en diclorometano . La suspensión se enfrió a 0°C en hielo. A la suspensión se agregó diisopropiletilamina (3.87 g, 5.2 mL, 30 mmol). A la solución resultante se agregó cloroformiato de colesterilo (6.675 g, 14.8 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con ácido clorhídrico al 10%. El producto se purificó mediante cromatografía instantánea (10.3 g, 92%).

Etil éster de ácido 1- { 6- [ 17- ( 1 , 5-dimetil-hexil ) -10 , 13-dimetil-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxicarbonilamino] -hexanoil } -4-oxo- pirrolidin-3-carboxílico AE AE t-butóxido de potasio (1.1 g, 9.8 mmol) se suspendió en 30 mL de tolueno seco. La mezcla se enfrió a 0°C en hielo y se agregaron lentamente 5 g (6.6 mmol) del diéster AD, con agitación, en un periodo de 20 minutos. La temperatura se mantuvo debajo de 5°C durante la adición. La agitación se continuo por 30 mins a 0°C y se agregó 1 mL de ácido acético glacial, seguido inmediatamente por 4 g de NaH2PO ·?20 en 40 mL de agua. La mezcla resultante se extrajo dos veces con 100 mL de diclorometano cada una, y los extractos orgánicos combinados se lavaron dos veces con 10 mL de amortiguador de fosfato cada una, se secaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se disolvió en 60 mL de tolueno, se enfrió a 0°C y se extrajo con tres porciones de 50 mL de amortiguador de carbonato pH 9.5 frió. Los extractos acuosos se ajustaron a pH 3 con ácido fosfórico, y se extrajeron con cinco porciones de 40 mL de cloroformo, las cuales se combinaron, se secaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna usando acetato de etilo al 25 %/hexano para dar 1.9 g de b-cetoester (39%) . 17- ( (1, 5-dimetil-hexil) -10, 13-dimetil-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-il éster de ácido [ 6- ( 3-hidroxi-4-hidroximetil-pirrolidin-l-il) -6-oxo-hexil] -carbámico AF Se agregó metanol 82 mL) gota a gota durante un periodo de 1 h a una mezcla en reflujo de b-cetoester AE (1.5 g, 2.2 mmol) y borohidruro de sodio (0.226 g, 6 mmol) en tetrahidrofurano (10 mL) . La agitación se continuó a la temperatura de reflujo por 1 h. Después del enfriamiento a la temperatura ambiente, se agregó HC1 1N (12.5 mL) , la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 40 mL) . Las capas combinadas de acetato de etilo se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentraron bajo vacío para dar el producto, el cual se purificó mediante cromatografía en columna (10% MeOH/CHCl3) (89%) . 17- (1, 5-dimetil-hexil) -10, 13-dimetil-2, 3, , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-il éster de ácido ( 6- { 3- [bis (-4-metoxi-fenil) -fenil-metoximetil ] -4-hidroxi-pirrolidin-l-il } -6-oxo-hexil ) -carbámico AG AG El diol AF 1.25 mg, 1.994 itimol) se secó mediante evaporación con piridina (2 x 5 mL) al vacio. Se agregaron piridina anhidra (10 mL) y cloruro de , 4 ' -dimetoxitritilo (0.724 g, 2.13 mmol) con agitación. L reacción se llevó a cabo a la temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción se desactivó mediante la adición de metanol. La mezcla de reacción se concentró bajo vacio y al residuo se agregó diclorometano (50 mL) . La capa orgánica se lavó con bicarbonato de sodio acuoso 1M. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró. La piridina residual se remolió mediante evaporación con tolueno. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (2% MeOH/Cloroformo, Rf= 0.5 en 5% MeOH/CHCl3) ( 1.75 95%) .

Mono- (4- [bis- ( 4-metoxi-fenil ) -fenil-metoximetil ] -l-{ 6- [17- (1, 5-dimetil-hexil) -10, 13-dimetil- 1,2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxicarbonilamio] -hexanoil } -pirrolidin-3-il) éster de ácido succínico AH AH El compuesto AG (1.0 g, 1.05 mmol) se mezcló con anhídrido succínico (0.150 g, 1.5 mmol) y DMAP (0.073 g, 0.6 mmol) y se secó al vacío a 40°C durante toda la noche. La mezcla se disolvió en dicloroetano anhidro (3 mL) , se agregó trietilamina (0.318 g, 0.440 mL, 3.15 mmol) y la solución se agitó a la temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón por 16 h. Esta se diluyó entonces con diclorometano (40 mL) y se lavó con ácido cítrico acuoso enfriado con hielo (5%, 30 mL) y agua (2 x 20 mL) . La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a sequedad. El residuo se usó como tal para el siguiente paso.

CPG derivado con colesterol AI El succinato AH (0.254 g, 0.242 mmol) se disolvió en una mezcla de diclorometano/acetonitrilo (3:2, 3 mL) . A esa solución se agregaron sucesivamente DMAP (0.0296 g, 0.242 mmol) en acetonitrilo (1.25 mL, 2, 2' -ditio-bis (5-nitropiridina) (0.075 g, 0.242 mmol) en acetonitrilo/dicloroetano (3:1, 1.25 mL) . A la solución resultante se agregó trifenilfosfina (0.064 g, 0.242 mmol) en acetonitrilo (0.6 mL) . La mezcla de reacción se volvió de color naranja brillante. La solución se agitó brevemente usando un agitador con acción de remolino (5 mins) . Se agregó alquil amina de cadena larga-CPG (LCAA-CPG) (1.5 g, 61 mM) . La suspensión se agitó por 2 h. El CPG se filtró a través de un embudo sinterizado y se lavó con acetonitrilo, diclorometano y éter sucesivamente. Los grupos amino sin reaccionar se enmascararon usando anhídrido acético/piridina . La carga alcanzada del CPG se midió tomando mediciones de UV (37 mM/g) .

La síntesis de las ARNsi que contienen un gruido bisdecilamida de ácido 5' -12-dodecanoico (conocido aquí como "5'-C32-") o un grupo derivado de 5 ' -colesterilo (conocido aquí como "5'-Chol-") se llevó a cabo como se describe en WO 2004/065601, excepto que, para el derivado de colesterilo, el paso de oxidación se llevó a cabo usando el reactivo de Beaucage con el fin de introducir un enlace de fosforoato en el extremo 5' del oligómero de ácido nucleico.

Las secuencias de los ácidos nucleicos se representan a continuación usando la nomenclatura estándar, y en específico las abreviaciones de la Tabla 1.

Tabla 1 : Abreviaciones de los monómeros nucleotídicos usados en la representación de las secuencias de ácidos nucleicos . Se entenderá que estos monómeros , cuando están presentes en un oligonucleótido están enlazadas mutuamente por enlaces de 5' -3' -fosfodiester .

EJEMPLO 2A. Diseño de TTR ARNsi Transcriptos El diseño de ARNsi se llevó a cabo para identificar los ARNsi que se enfocan en el gen de transtiretina de humano (simbolizado por TTR) y de rata (simbolizado por TTR) . El diseño usa los transcriptos de TTR NM_000371.1 (SEC ID NO: 1329) (humano) y NM-012681.1 (SEC ID NO: 1330) (rata) de la colección NCBI Refseq. Los dúplex de ARNsi se diseñaron con 100% de identidad con sus genes de TTR respectivos.

Diseño del ARNsi y Predicción de Especificidad La especificidad pronosticada de todos los posibles 19meros se determinó para badea secuencia. Los ARNsi de TTR se usaron en una investigación extensiva contra los transcriptomas humanos y de rata (definidos como el conjunto de registros NM_ y X _ dentro del conjunto NCBI Refseq) usando el algoritmo FATSA. Se uso entonces la secuencia de instrucciones 'offtargetFasta . py' de Phyton para analizar las alienaciones y generar una puntuación con base en la posición y el número de no coincidencias entre el ARNsi y todos los transcriptos 'fuera de objetivo' potenciales. La puntuación fuera de objetivo se evalúa para enfatizar las diferencias en la región "seminal" de los ARNsi, en las posiciones 2-9 desde el extremo 5' de la molécula. La puntuación fuera de objetivo se calcula como sigue: a las no coincidencias entre el oligo y el transcripto se les dan penalidades. A una no coincidencia en la región seminal en las posiciones 2-9 del oligo se el da una penalidad de 2.8; a las no coincidencias en los sitios de escisión putativos 10 u 11 se les da una penalización de 1.2, y a las no coincidencias en las posiciones 12-19 se les da una penalización de 1. Las no coincidencias en la posición 1 no se consideran. La puntuación fuera de objetivo para cada par de oligo-transcripto se calcula entonces sumando las penalizaciones por no coincidencias. Se determina entonces la puntuación fuera de objetivo más baja de todos los pares oligo-transcripto y se usa en la clasificación posterior de los oligos. Ambas hebras de ARNsi se asignaron a una categoría de especificidad de acuerdo con las puntuaciones calculadas: una puntuación superior a 3 califica como altamente específica, una puntuación igual a 3 califica como específica, y una puntuación entre 2.2 y 2.8 como moderadamente específica. Para elegir cuales oligos sintetizar, las puntuaciones fuera de objetivo de la hebra antisentido se clasificaron de alta afinidad a baja afinidad, y se seleccionaron los 144 mejores (con la puntuaciones fuera de objetivo más bajas) pares de oligo de humano, y los mejores 26 pares de rata.

Selección de la secuencia de ARNsi Un total de 140 oligos de ARNsi derivados de TTR humano antisentido se sintetizaron y se convirtieron en dúplex. Los dúplex que incluían los oligos se presentan en las Tablas 2-4 (TTR humano) y las tablas 5-7 (TTR de rata) .

Tabla 2. Números de identificación para los ABNds de TTR de humano Véase la Tabla 4 para las secuencias y modificaciones de los oligos. # de Dúplex # de Oligo Sentido # de Oligo Antisentido AD- 18243 A-32153 A-32154 AD- 18244 A-32155 A-32156 AD- 18245 A-32157 A-32158 AD- 18246 A-32159 A-32160 AD- 18247 A-32163 A-32164 AD- 18248 A-32165 A-32166 AD- 18249 A-32167 A-32168 AD-18250 A-32169 A-32170 AD-18251 A-32171 A-32172 AD- 18252 A-32175 A-32176 AD- 18253 A-32177 A-32178 AD- 18254 A-32179 A-32180 AD-18255 A-32181 A-32182 AD- 18256 A-32183 A-32184 AD-18257 A-32187 A-32188 AD-18258 A-32189 A-32190 AD- 18259 A-32191 A-32192 AD- 18260 A-32193 A-32194 AD- 18261 A-32195 A-32196 AD- 18262 A-32199 A-32200 AD- 18263 A-32201 A-32202 AD- 18264 A-32203 A-32204 AD- 18265 A-32205 A-32206 AD-18266 A-32207 A-32008 AD-18267 A-3221 1 A-32212 AD-18268 A-32213 A-32214 AD- 18269 A-32215 A-32216 AD- 18270 A-32217 A-32218 AD- 18271 A-32219 A-32220 AD- 18272 A-32221 A-32222 AD- 18273 A-32223 A-32224 AD- 18274 A-32225 A-32226 AD-18275 A-32227 A-32228 AD-18276 A-32229 A-32230 AD-18277 A-32231 A-32232 AD-18278 A-32233 A-32234 AD-18279 A-32235 A-32236 AD- 18280 A-32237 A-32238 AD- 18281 A-32239 A-32240 AD-18282 A-32241 A-32242 AD-18283 A-32243 A-32244 # de Dúplex # de Oligo Sentido # de Oligo Antisentido AD- 18284 A-32247 A-32248 AD- 18285 A-32249 A-32250 AD- 18286 A-32251 A-32252 AD- 18287 A-32253 A-32254 AD- 18288 A-32255 A-32256 AD- 18289 A-32259 A-32260 AD- 18290 A32261 A-32262 AD- 18291 A-32263 A-32264 AD- 18292 A-32265 A-32266 AD- 18293 A-32267 A-32268 AD- 18294 A-32269 A-32270 AD- 18295 A-32271 A-32272 AD- 18296 A-32273 A-32274 AD- 18297 A-32275 A-32276 AD- 18298 A-32277 A-32278 AD- 18299 A-32279 A-32280 AD- 18300 A-32281 A-32282 AD- 18301 A-32283 A-32284 AD- 18302 A-32285 A-32286 AD- 18303 A-32287 A-32288 AD- 18304 A-32289 A-32290 AD- 18305 A-32291 A-32292 AD- 18306 A-32295 A-32296 AD- 18307 A-32297 A-32298 AD- 18308 A-32299 A-32300 AD- 18309 A-32301 A-32302 AD-18310 A-32303 A-32304 AD-1831 1 A-32307 A-32308 AD-18312 A-32309 A-32310 AD-18313 A-3231 1 A-32312 AD-18314 A-32313 A-32314 AD-18315 A-32315 A-32316 AD-18316 A-32319 A-32320 AD-18317 A-32321 A-32322 AD-18318 A-32323 A-32324 AD-18319 A-32325 A-32326 AD- 18320 A-32327 A-32328 AD- 18321 A-32331 A-32332 AD-18322 A-32333 A-32334 AD-18323 A-32335 A-32336 AD-18324 A-32337 A-32338 AD-18325 A-32339 A-32340 AD-18326 A-32341 A-32342 AD- 18327 A-32343 A-32344 AD- 18328 A-32345 A-32346 AD- 18329 A-32347 A-32348 AD-18330 A-32349 A-32350 AD- 18331 A-32351 A-32352 AD-18332 A-32353 A-32354 AD-18333 A-32355 A-32356 AD- 18334 A-32357 A-32358 # de Dúplex # de Oligo Sentido # de Oligo Antisentido AD-18335 A-32359 A-32360 AD-18336 A-32363 A-32364 AD-18337 A-32367 A-32368 AD-18338 A-32369 A-32370 AD-18339 A-32371 A-32372 AD- 18340 A-32373 A-32374 AD- 18341 A-32375 A-32376 AD- 18342 A-32379 A-32380 AD-18343 A-32381 A-32382 AD- 18344 A-32383 A-32384 AD- 18345 A-32385 A-32386 AD- 18346 A-32387 A-32388 AD- 18347 A-32391 A-32392 AD- 18348 A-32393 A-32394 AD- 18349 A-32395 A-32396 AD-18350 A-32397 A-32398 AD-18351 A-32399 A-32400 AD-18352 A-32401 A-32402 AD-18353 A-32403 A-32404 AD-18354 A-32405 A-32406 AD-18355 A-32407 A-32408 AD-18356 A-32409 A-32410 AD-18357 A-3241 1 A-32412 AD-18358 A-32415 A-32416 AD-18359 A-32417 A-32418 AD-18360 A-32419 A-32420 AD-18361 A-32421 A-32422 AD-18362 A-32423 A-32424 AD-18363 A-32427 A-32428 AD- 18364 A-32429 A-32430 AD- 18446 A-32161 A-32162 AD- 18447 A-32173 A-32174 AD- 18448 A-32185 A-32186 AD- 18449 A-32197 A-32198 AD- 18450 A-32209 A-32210 AD- 18451 A-32245 A-32246 AD- 18452 A-32257 A-32258 AD- 18453 A-32293 A-32294 AD- 18454 A-32305 A-32306 AD- 18455 A-32317 A-32318 AD- 18456 A-32329 A-32330 AD- 18457 A-32361 A-32362 AD- 18458 A-32365 A-32366 AD- 18459 A-32377 A-32378 AD- 18460 A-32389 A-32390 AD- 18461 A-32401 A-32402 AD- 18462 A-32413 A-32414 AD- 18463 A-32425 A-32426 Tabla 3A. Secuencias de las hebras sentido y antisentido de los ARNds de humano Hebra: s=sentido; as=antisentido; Posición: posición de a base 5' en el transcripto (NM 000371.2, SEC ID NO:1329) Hebra Posición Secuencia SEC ID Secuencia con dinucleotidos SEC NO: protuberantes en 3' ID (5' a 3') NO: s 100 CCGGUGAAUCCAAGUGUCC 1 CCGG UG AAUCCAAG UGUCCNN 281 as 118 GGACACUUGGAUUCACCGG 2 GGACACUUGGAUUCACCGGNN 282 S 11 ACUCAUUCUUGGCAGGAUG 3 ACUCAUUCUUGGCAGGAUGNN 283 as 29 CAU CCUG CCAAG AAUG AG U 4 CAUCCUGCCAAGAAUGAGUNN 284 s 111 AAGUGUCCUCUGAUGGUCA 5 AAGUGUCCUCUGAUGGUCANN 285 as 129 UGACCAUCAGAGGACACUU 6 UG ACCAUCAGAGG ACACU UNN 286 s 13 UCAUUCUUGGCAGGAUGGC 7 UCAUUCUUGGCAGGAUGGCNN 287 as 31 GCCAUCCUGCCAAGAAUGA 8 GCCAUCCUGCCAAGAAUGANN 288 s 130 AAGUUCUAGAUGCUGUCCG 9 AAGUUCUAGAUGCUGUCCGNN 289 as 148 CGGACAGCAUCUAGAACUU 10 CGGACAGCAUCUAGAACUUNN 290 s 132 GUUCUAGAUGCUGUCCGAG 11 GUUCUAGAUGCUGUCCGAGNN 291 as 150 CUCGGACAGCAUCUAGAAC 12 CUCGGACAGCAUCUAGAACN N 292 s 135 CUAGAUGCUGUCCGAGGCA 13 CUAGAUGCUGUCCGAGGCANN 293 as 153 UGCCUCGGACAGCAUCUAG 14 UGCCUCGGACAGCAUCUAGNN 294 s 138 GAUGCUGUCCGAGGCAGUC 15 GAUGCUGUCCGAGGCAGUCNN 295 as 156 GACUGCCUCGGACAGCAUC 16 GACUGCCUCGGACAGCAUCNN 296 s 14 CAUUCUUGGCAGGAUGGCU 17 CAUUCUUGGCAGGAUGGCUNN 297 as 32 AGCCAUCCUGCCAAGAAUG 18 AGCCAUCCUGCCAAGAAUGNN 298 s 140 UGCUGUCCGAGGCAGUCCU 19 UGCUGUCCGAGGCAGUCCUNN 299 as 158 AGGACUGCCUCGGACAGCA 20 AGGACUGCCUCGGACAGCANN 300 s 146 CCGAGGCAGUCCUGCCAUC 21 CCGAGGCAGUCCUGCCAUCNN 301 as 164 GAUGGCAGGACUGCCUCGG 22 GAUGGCAGGACUGCCUCGGNN 302 s 152 CAGUCCUGCCAUCAAUGUG 23 CAGUCCUGCCAUCAAUGUGNN 303 as 170 CACAUUGAUGGCAGGACUG 24 CACAUUGAUGGCAGGACUGNN 304 s 164 CAAUGUGGCCGUGCAUGUG 25 CAAUGUGGCCGUGCAUGUGNN 305 as 182 CACAUGCACGGCCACAUUG 26 CACAUGCACGGCCACAUUGNN 306 s 178 AUGUGUUCAGAAAGGCUGC 27 AUGUGUUCAGAAAGGCUGCNN 307 as 196 GCAGCCUUUCUGAACACAU 28 GCAGCCUUUCUGAACACAUNN 308 s 2 CAGAAGUCCACUCAUUCUU 29 CAGAAGUCCACUCAUUCUUNN 309 as 20 AAGAAUGAGUGGACUUCUG 30 AAGAAUGAGUGGACUUCUGNN 310 s 21 GGCAGGAUGGCUUCUCAUC 31 GGCAGGAUGGCUUCUCAUCNN 311 s 39 GAUGAGAAGCCAUCCUGCC 32 GAUGAGAAGCCAUCCUGCCNN 312 s 210 GAGCCAUUUGCCUCUGGGA 33 GAGCCAUUUGCCUCUGGGANN 313 as 228 UCCCAGAGGCAAAUGGCUC 34 UCCCAGAGGCAAAUGGCUCNN 314 s 23 CAGGAUGGCUUCUCAUCGU 35 CAGGAUGGCUUCUCAUCGUNN 315 as 41 ACGAUGAGAAGCCAUCCUG 36 ACGAUGAGAAGCCAUCCUGNN 316 s 24 AGGAUGGCUUCUCAUCGUC 37 AGGAUGGCUUCUCAUCGUCNN 317 as 42 GACGAUGAGAAGCCAUCCU 38 GACGAUGAGAAGCCAUCCUNN 318 s 245 AGAGCUGCAUGGGCUCACA 39 AGAGCUGCAUGGGCUCACANN 319 as 263 UGUGAGCCCAUGCAGCUCU 40 UGUGAGCCCAUGCAGCUCUNN 320 s 248 GCUGCAUGGGCUCACAACU 41 GCUGCAUGGGCUCACAACUNN 321 Hebra Posición Secuencia SEC Secuencia con dinucleotidos SEC ID protuberantes en 3' ID NO: (5' a 3') NO: as 266 AGUUGUGAGCCCAUGCAGC 42 AGUUGUGAGCCCAUGCAGCNN 322 s 25 GGAUGGCUUCUCAUCGUCU 43 GGAUGGCUUCUCAUCGUCUNN 323 as 43 AGACGAUGAGAAGCCAUCC 44 AGACGAUGAGAAGCCAUCCNN 324 s 251 GCAUGGGCUCACAACUGAG 45 GCAUGGGCUCACAACUGAGNN 325 as 269 CUCAGUUGUGAGCCCAUGC 46 CUCAGUUGUGAGCCCAUGCNN 326 s 253 AUGGGCUCACAACUGAGGA 47 AUGGGCUCACAACUGAGGANN 327 as 271 UCCUCAGUUGUGAGCCCAU 48 UCCUCAGUUGUGAGCCCAUNN 328 s 254 UGGGCUCACAACUGAGGAG 49 UGGGCUCACAACUGAGGAGNN 329 as 272 CUCCUCAGUUGUGAGCCCA 50 CUCCUCAGUUGUGAGCCCANN 330 s 270 GAGGAAUUUGUAGAAGGGA 51 GAGGAAUUUGUAGAAGGGANN 331 as 288 UCCCUUCUACAAAUUCCUC 52 UCCCU UCUACAAAU UCCUCNN 332 s 276 UUUGUAGAAGGGAUAUACA 53 UUUGUAGAAGGGAUAUACANN 333 as 294 UGUAUAUCCCUUCUACAAA 54 UGUAUAUCCCUUCUACAAANN 334 s 277 UUGUAGAAGGGAUAUACAA 55 UUGUAGAAGGGAUAUACAANN 335 as 295 UUGUAUAUCCCUUCUACAA 56 UUGUAUAUCCCUUCUACAANN 336 s 278 UGUAGAAGGGAUAUACAAA 57 UGUAGAAGGGAUAUACAAANN 337 as 296 UUUGUAUAUCCCUUCUACA 58 UUUGUAUAUCCCUUCUACANN 338 s 281 AGAAGGGAUAUACAAAGUG 59 AGAAGGGAUAUACAAAGUGNN 339 as 299 CACUUUGUAUAUCCCUUCU 60 CACUUUGUAUAUCCCUUCUNN 340 295 AAGUGGAAAUAGACACCAA 61 AAGUGGAAAUAGACACCAANN 341 as 313 UUGGUGUCUAUUUCCACUU 62 UUGGUGUCUAUUUCCACUUNN 342 s 299 GGAAAUAGACACCAAAUCU 63 GGAAAUAGACACCAAAUCUNN 343 as 317 AGAUUUGGUGUCUAUUUCC 64 AGAUUUGGUGUCUAUUUCCNN 344 s 300 GAAAUAGACACCAAAUCUU 65 GAAAUAGACACCAAAUCUUNN 345 as 318 AAGAUUUGGUGUCUAUUUC 66 AAGAUUUGGUGUCUAUUUCNN 346 s 303 AUAGACACCAAAUCUUACU 67 AUAGACACCAAAUCUUACUNN 347 as 321 AGUAAGAUUUGGUGUCUAU 68 AGUAAGAUUUGGUGUCUAUNN 348 s 304 UAGACACCAAAUCUUACUG 69 UAGACACCAAAUCUUACUGNN 349 as 322 CAGUAAGAUUUGGUGUCUA 70 CAGUAAGAUUUGGUGUCUANN 350 s 305 AGACACCAAAUCUUACUGG 71 AGACACCAAAUCUUACUGGNN 351 as 323 CCAGUAAGAUUUGGUGUCU 72 CCAGUAAGAUUUGGUGUCUNN 352 s 317 UUACUGGAAGGCACUUGGC 73 UUACUGGAAGGCACUUGGCNN 353 as 335 GCCAAGUGCCUUCCAGUAA 74 GCCAAGUGCCUUCCAGUAANN 354 s 32 UUCUCAUCGUCUGCUCCUC 75 UUCUCAUCGUCUGCUCCUCNN 355 as 50 GAGGAGCAGACGAUGAGAA 76 GAGGAGCAGACGAUGAGAANN 356 s 322 GGAAGGCACUUGGCAUCUC 77 GGAAGGCACUUGGCAUCUCNN 357 as 340 GAGAUGCCAAGUGCCUUCC 78 GAGAUGCCAAGUGCCUUCCNN 358 s 326 GGCACUUGGCAUCUCCCCA 79 GGCACUUGGCAUCUCCCCANN 359 as 344 UGGGGAGAUGCCAAGUGCC 80 UGGGGAGAUGCCAAGUGCCNN 360 s 333 GGCAUCUCCCCAUUCCAUG 81 GGCAUCUCCCCAUUCCAUGNN 361 as 351 AUGGAAUGGGGAGAUGCCTT 82 AUGGAAUGGGGAGAUGCCTTNN 362 s 334 GCAUCUCCCCAUUCCAUGA 83 GCAUCUCCCCAUUCCAUGANN 363 as 352 UCAUGGAAUGGGGAGAUGC 84 UCAUGGAAUGGGGAGAUGCNN 364 s 335 CAUCUCCCCAUUCCAUGAG 85 CAUCUCCCCAUUCCAUGAGNN 365 as 353 CUCAUGGAAUGGGGAGAUG 86 CUCAUGGAAUGGGGAGAUGNN 366 s 336 AUCUCCCCAUUCCAUGAGC 87 AUCUCCCCAUUCCAUGAGCNN 367 as 354 GCUCAUGGAAUGGGGAGAU 88 GCUCAUGGAAUGGGGAGAUNN 368 s 338 CUCCCCAUUCCAUGAGCAU 89 CUCCCCAUUCCAUGAGCAUNN 369 as 356 AUGCUCAUGGAAUGGGGAG 90 AUGCUCAUGGAAUGGGGAGNN 370 s 341 CCCAUUCCAUGAGCAUGCA 91 CCCAUUCCAUGAGCAUGCANN 371 as 359 UGCAUGCUCAUGGAAUGGG 92 UGCAUGCUCAUGGAAUGGGNN 372 Hebra Posición Secuencia SEC Secuencia con dinucleotidos SEC ID protuberantes en 3' ID NO: (5' a 3') NO: s 347 CCAUGAGCAUGCAGAGGUG 93 CCAUGAGCAUGCAGAGGUGNN 373 as 365 CACCUCUGCAUGCUCAUGG 94 CACCUCUGCAUGCUCAUGGNN 374 s 352 AGCAUGCAGAGGUGGUAUU 95 AGCAUGCAGAGGUGGUAUUNN 375 as 370 AAUACCACCUCUGCAUGCU 96 AAUACCACCUCUGCAUGCUNN 376 s 354 CAUGCAGAGGUGGUAUUCA 97 CAUGCAGAGGUGGUAUUCANN 377 as 372 UGAAUACCACCUCUGCAUG 98 UGAAUACCACCUCUGCAUGNN 378 s 355 AUGCAGAGGUGGUAUUCAC 99 AUGCAGAGGUGGUAUUCACNN 379 as 373 GUGAAUACCACCUCUGCAU 100 GUGAAUACCACCUCUGCAUNN 380 s 362 GGUGGUAUUCACAGCCAAC 101 GGUGGUAUUCACAGCCAACNN 381 as 380 G UUGGCUG UG AAUACCACC 102 GUUGGCUGUGAAUACCACCNN 382 s 363 GUGGUAUUCACAGCCAACG 103 GUGGUAUUCACAGCCAACGNN 383 as 381 CGUUGGCUGUGAAUACCAC 104 CGUUGGCUGUGAAUACCACNN 384 s 364 UGGUAUUCACAGCCAACGA 105 UGGUAUUCACAGCCAACGANN 385 as 382 UCGUUGGCUGUGAAUACCA 106 UCGUUGGCUGUGAAUACCANN 386 s 365 GGUAUUCACAGCCAACGAC 107 GGUAUUCACAGCCAACGACNN 387 as 383 GUCGUUGGCUGUGAAUACC 108 GUCGUUGGCUGUGAAUACCNN 388 s 366 GUAUUCACAGCCAACGACU 109 GUAUUCACAGCCAACGACUNN 389 as 384 AGUCGUUGGCUGUGAAUAC 110 AGUCGUUGGCUGUGAAUACNN 390 s 367 UAUUCACAGCCAACGACUC 111 UAUUCACAGCCAACGACUCNN 391 as 385 GAGUCGUUGGCUGUGAAUA 112 GAGUCGUUGGCUGUGAAUANN 392 s 370 UCACAGCCAACGACUCCGG 113 UCACAGCCAACGACUCCGGNN 393 as 388 CCGGAGUCGUUGGCUGUGA 114 CCGGAGUCGUUGGCUGUGANN 394 s 390 CCCCGCCGCUACACCAUUG 115 CCCCGCCGCUACACCAUUGNN 395 as 408 CAAUGGUGUAGCGGCGGGG 116 CAAUGGUGUAGCGGCGGGGNN 396 s 4 GAAGUCCACUCAUUCUUGG 117 GAAGUCCACUCAUUCUUGGNN 397 as 22 CCAAGAAUGAGUGGACUUC 118 CCAAG AAUGAGUGGACUUCNN 398 s 412 CCCUGCUGAGCCCCUACUC 119 CCCUGCUGAGCCCCUACUCNN 399 as 430 GAGUAGGGGCUCAGCAGGG 120 GAGUAGGGGCUCAGCAGGGNN 400 s 417 CUGAGCCCCUACUCCUAUU 121 CUGAGCCCCUACUCCUAUUNN 401 as 435 AAUAGGAGUAGGGGCUCAG 122 AAUAGGAGUAGGGGCUCAG NN 402 s 418 UGAGCCCCUACUCCUAUUC 123 UGAGCCCCUACUCCUAUUCNN 403 as 436 GAAUAGGAGUAGGGGCUCA 124 GAAUAGGAGUAGGGGCUCANN 404 s 422 CCCCUACUCCUAUUCCACC 125 CCCCUACUCCUAUUCCACCNN 405 as 440 GGUGGAAUAGGAGUAGGGG 126 GGUGGAAUAGGAGUAGGGGNN 406 s 425 CUACUCCUAUUCCACCACG 127 CUACUCCUAUUCCACCACGNN 407 as 443 CGUGGUGGAAUAGGAGUAG 128 CGUGGUGGAAUAGGAGUAGNN 408 s 426 UACUCCUAUUCCACCACGG 129 UACUCCUAU UCCACCACGGN N 409 as 444 CCGUGGUGGAAUAGGAGUA 130 CCGUGGUGGAAUAGGAGUANN 410 s 427 ACUCCUAUUCCACCACGGC 131 ACUCCUAUUCCACCACGGCNN 411 as 445 GCCGUGGUGGAAUAGGAGU 132 GCCGUGGUGGPUAGGAGUNN 412 s 429 UCCUAUUCCACCACGGCUG 133 UCCUAUUCCACCACGGCUGNN 413 as 447 CAGCCGUGGUGGAAUAGGA 134 CAGCCGUGGUGGAAUAGGANN 414 s 432 UAUUCCACCACGGCUGUCG 135 UAUUCCACCACGGCUGUCGNN 415 as 450 CGACAGCCGUGGUGGAAUA 136 CGACAGCCGUGGUGGAAUANN 416 s 433 AUUCCACCACGGCUGUCGU 137 AUUCCACCACGGCUGUCGUNN 417 as 451 ACGACAGCCGUGGUGGAAU 138 ACGACAGCCGUGGUGGAAUNN 418 s 437 CACCACGGCUGUCGUCACC 139 CACCACGGCUGUCGUCACCNN 419 as 455 GGUGACGACAGCCGUGGUG 140 GGUGACGACAGCCGUGGUGNN 420 s 438 ACCACGGCUGUCGUCACCA 141 ACCACGGCUGUCGUCACCANN 421 as 456 UGGUGACGACAGCCGUGGU 142 UGGUGACGACAGCCGUGGU NN 422 s 439 CCACGGCUGUCGUCACCAA 143 CCACGG CUG UCG U CACCAAN N 423 Hebra Posición Secuencia SEC ID Secuencia con dinucleotidos SEC NO: protuberantes en 3' ID (5' a 3') NO: as 457 UUGGUGACGACAGCCGUGG 144 UUGGUGACGACAGCCGUGGNN 424 s 441 ACGGCUGUCGUCACCAAUC 145 ACGGCUGUCGUCACCAAUCNN 425 as 459 GAUUGGUGACGACAGCCGU 146 GAUUGGUGACGACAGCCGUNN 426 s 442 CGGCUGUCGUCACCAAUCC 147 CGGCUGUCGUCACCAAUCCNN 427 as 460 GGAUUGGUGACGACAGCCG 148 GGAUUGGUGACGACAGCCGNN 428 s 449 CGUCACCAAUCCCAAGGAA 149 CGUCACCAAUCCCAAGGAANN 429 as 467 UUCCUUGGGAUUGGUGACG 150 UUCCUUGGGAUUGGUGACGNN 430 s 455 CAAUCCCAAGGAAUGAGGG 151 CAAUCCCAAGGAAUGAGGGNN 431 as 473 CCCUCAUUCCUUGGGAUUG 152 CCCUCAUUCCUUGGGAUUGNN 432 s 491 CCUGAAGGACGAGGGAUGG 153 CCUGAAGGACG AGGGAUGGN N 433 as 509 CCAUCCCUCGUCCUUCAGG 154 CCAUCCCUCGUCCUUCAGGNN 434 s 497 GGACGAGGGAUGGGAUUUC 155 GGACGAGGGAUGGGAUUUCNN 435 as 515 GAAAUCCCAUCCCUCGUCC 156 GAAAUCCCAUCCCUCGUCCNN 436 s 5 AAGUCCACUCAUUCUUGGC 157 AAGUCCACUCAUUCUUGGCNN 437 as 23 GCCAAGAAUGAGUGGACUU 158 GCCAAGAAUGAGUGGACUUNN 438 s 508 GGGAUUUCAUGUAACCAAG 159 GGGAUUUCAUGUAACCAAGNN 439 as 526 CUUGGUUACAUGAAAUCCC 160 CUUGGUUACAUGAAAUCCCNN 440 s 509 GGAUUUCAUGUAACCAAG 161 GGAUUUCAUGUAACCAAGANN 441 as 527 UCUUGGUUACAUGAAAUCC 162 UCUUGGUUACAUGAAAUCCNN 442 s 514 UCAUG U AACCAAG AG U AU U 163 UCAUGUAACCAAGAGUAUUNN 443 as 532 AAUACUCUUGGUUACAUGA 164 AAUACUCUUGGUUACAUGANN 444 s 516 AUGUAACCAAGAGUAUUCC 165 AUGUAACCAAGAGUAUUCCNN 445 as 534 GGAAUACUCUUGGUUACAU 166 GGAAUACUCUUGGUUACAUNN 446 s 517 UGU AACCAAG AGUAUUCCA 167 UGUAACCAAGAGUAUUCCANN 447 as 535 UGGAAUACUCUUGGUUACA 168 UGGAAUACUCUUGGUUACANN 448 s 518 GUAACCAAGAGUAUUCCAU 169 GUAACCAAGAGUAUUCCAUNN 449 as 536 AUGGAAUACUCUUGGUUAC 170 AUGGAAUACUCUUGGUUACNN 450 s 54 UGCCUUGCUGGACUGGUAU 171 UGCCUUGCUGGACUGGUAUNN 451 as 72 AUACCAGUCCAGCAAGGCA 172 AUACCAGUCCAGCAAGGCANN 452 s 543 UAAAGCAGUGUUUUCACCU 173 UAAAGCAGUGUUUUCACCUNN 453 as 561 AGGUGAAAACACUGCUUUA 174 AGGUGAAAACACUGCUUUANN 454 s 55 GCCUUGCUGGACUGGUAUU 175 GCCUUGCUGGACUGGUAUUNN 455 as 73 AAUACCAGUCCAGCAAGGC 176 AAUACCAGUCCAGCAAGGCNN 456 s 551 UGUUUUCACCUCAUAUGCU 177 UGUUUUCACCUCAUAUGCUNN 457 as 569 AGCAUAUGAGGUGAAAACA 178 AGCAUAUGAGGUGAAAACANN 458 s 552 GUUUUCACCUCAUAUGCUA 179 GUUUUCACCUCAUAUGCUANN 459 as 570 UAGCAU AUG AGG UGAAAAC 180 UAGCAU AUG AGG UGAAAACNN 460 s 553 UUUUCACCUCAUAUGCUAU 181 UUUUCACCUCAUAUGCUAUNN 461 as 571 AUAGCAUAUGAGGUGAAAA 182 AUAGCAUAUGAGGUGAAAANN 462 s 555 UUCACCUCAUAUGCUAUGU 183 UUCACCUCAUAUGCUAUGUNN 463 as 573 ACAUAGCAUAUGAGGUGAA 184 ACAUAGCAUAUGAGGUGAANN 464 s 557 CACCUCAUAUGCUAUGUUA 185 CACCUCAUAUGCUAUGUUANN 465 as 575 UAACAUAGCAUAUGAGGUG 186 UAACAUAGCAUAUGAGGUGNN 466 s 56 CCUUGCUGGACUGGUAUUU 187 CCUUGCUGGACUGGUAUUUNN 467 as 74 AAAUACCAG UCCAGCAAGG 188 AAAUACCAGUCCAGCAAGGNN 468 s 563 AUAUGCUAUGUUAGAAGUC 189 AUAUGCUAUGUUAGAAGUCNN 469 as 581 GACUUCUAACAUAGCAUAU 190 GACUUCUAACAUAGCAUAUNN 470 s 564 UAUGCUAUGUUAGAAGUCC 191 UAUGCUAUGUUAGAAGUCCNN 471 Hebra Posición Secuencia SEC ID Secuencia con dinucleotidos SEC NO: protuberantes en 3' ID (5' a 3') NO: as 582 GGACUUCUAACAUAGCAUA 192 GGACUUCUAACAUAGCAUANN 472 s 566 UGCUAUGUUAGAAGUCCAG 193 UGCUAUGUUAGAAGUCCAGNN 473 as 584 CUGGACU UCU AACAUAGCA 194 CUGGACUUCUAACAUAGCANN 474 s 57 CUUGCUGGACUGGUAUUUG 195 CUUGCUGGACUGGUAUUUGNN 475 as 75 CAAAUACCAGUCCAGCAAG 196 CAAAUACCAGUCCAGCAAGNN 476 s 578 AGUCCAGGCAGAGACAAUA 197 AGUCCAGGCAGAGACAAUANN 477 as 596 AGUCUCUGCCUGGACUTT 198 AUUGUCUCUGCCUGGACUTTNN 478 s 580 UCCAGGCAGAGACAAUAAA 199 UCCAGGCAGAGACAAUAAANN 479 as 598 UUUAUUGUCUCUGCCUGGA 200 UUUAUUGUCUCUGCCUGGANN 480 s 607 GUGAAAGGCACUUUUCAUU 201 GUGAAAGGCACUUUUCAUUNN 481 as 625 AAUGAAAAGUGCCUUUCAC 202 AAUGAAAAGUGCCUUUCACNN 482 s 62 UGGACUGGUAUUUGUGUCU 203 UGGACUGGUAUUUGUGUCUNN 483 as 80 AGACACAAAUACCAGUCCA 204 AGACACAAAUACCAGUCCANN 484 s 77 GUCUGAGGCUGGCCCUACG 205 GUCUGAGGCUGGCCCUACGNN 485 as 95 CGUAGGGCCAGCCUCAGAC 206 CGUAGGGCCAGCCUCAGACNN 486 s 79 CUGAGGCUGGCCCUACGGG 207 CUGAGGCUGGCCCUACGGGNN 487 as 97 CCCGUAGGGCCAGCCUCAG 208 CCCGUAGGGCCAGCCUCAGNN 488 s 81 GAGGCUGGCCCUACGGGCA 209 GAGGCUGGCCCUACGGGCANN 489 as 99 UGCCCGUAGGGCCAGCCUC 210 UGCCCGUAGGGCCAGCCUCNN 490 s 82 AGGCUGGCCCUACGGGCAC 211 AGGCUGGCCCUACGGGCACNN 491 as 100 GUGCCCGUAGGGCCAGCCU 212 GUGCCCGUAGGGCCAGCCU NN 492 s 84 GCUGGCCCUACGGGCACCG 213 GCUGGCCCUACGGGCACCGNN 493 as 102 CGGUGCCCGUAGGGCCAGC 214 CGGUGCCCGUAGGGCCAGCNN 494 s 85 CUGGCCCUACGGGCACCGG 215 CUGG CCCU ACGGG CACCGG N N 495 as 103 CCGGUGCCCGUAGGGCCAG 216 CCGGUGCCCGUAGGGCCAGNN 496 s 87 GGCCCUACGGGCACCGGUG 217 GGCCCUACGGGCACCGGUGNN 497 as 105 CACCGGUGCCCGUAGGGCC 218 CACCGG UGCCCGUAGGGCCNN 498 s 9 CCACUCAUUCUUGGCAGGA 219 CCACUCAUUCUUGGCAGGANN 499 as 27 UCCUGCCAAGAAUGAGUGG 220 UCCUGCCAAGAAUGAGUGGNN 500 s 90 CCUACGGGCACCGGUGAAU 221 CCUACGGGCACCGGUGAAUNN 501 as 108 AUUCACCGGUGCCCGUAGG 222 AUUCACCGGUGCCCGUAGGNN 502 s 91 CUACGGGCACCGGUGAAUC 223 CUACGGGCACCGGUGAAUCNN 503 as 109 GAUUCACCGGUGCCCGUAC 224 GAUUCACCGGUGCCCGUAGNN 504 s 92 UACGGGCACCGG UGAAUCC 225 UACGGGCACCGGUGAAUCCNN 505 as 110 GGAUUCACCGGUGCCCGUA 226 GG AU U CACCGGU G CCCG U AN N 506 s 93 ACGGGCACCGGUGAAUCCA 227 ACGGGCACCGGUGAAUCCANN 507 as 111 UGGAUUCACCGGUGCCCGU 228 UGGAUUCACCGGUGCCCGUNN 508 s 97 GCACCGGUGAAUCCAAGUG 229 GCACCGGUGAAUCCAAGUGNN 509 as 115 CACUUGGAUUCACCGGUGC 230 CACUUGGAUUCACCGGUGCNN 510 s 98 CACCGGUGAAUCCAAGUGU 231 CACCGGUGAAUCCAAGUGUNN 511 as 116 ACACUUGGAUUCACCGGUG 232 ACACUUGGAUUCACCGGUGNN 512 s 167 UGUGGCCAUGCAUGUGUUC 233 UGUGGCCAUGCAUGUGUUCNN 513 as 185 GAACACAUGCAUGGCCACA 234 GAACACAUGCAUGGCCACANN 514 s 168 GUGGCCAUGCAUGUGUUCA 235 GUGGCCAUGCAUGUGUUCANN 515 as 186 UGAACACAUGCAUGGCCAC 236 UGAACACAUGCAUGGCCACNN 516 s 171 GCCAUGCAUGUGUUCAGAA 237 GCCAUGCAUGUGUUCAGAANN 517 as 189 UUCUGAACACAUGCAUGGC 238 UUCUGAACACAUGCAUGGCNN 518 s 432 UAUUCCACCACGGCUGUCA 239 UAUUCCACCACGGCUGUCANN 519 as 449 UGACAGCCGUGGUGGAAUA 240 UGACAGCCGUGGUGGAAUANN 520 Hebra Posición Secuencia SEC ID Secuencia con dinucleotidos SEC NO: protuberantes en 3' ID (5' a 3') NO: s 447 GUCAUCACCAAUCCCAAGG 241 GUCAUCACCFUCCCAAGGNN 521 as 465 CCUUGGGAUUGGUGAUGAC 242 CCUUGGGAUUGGUGAUGACNN 522 s 115 GUCCUCUGAUGGUCAAAGU 243 GUCCUCUGAUGGUCAAAGUNN 523 as 133 ACUUUGACCAUCAGAGGAC 244 ACUUUGACCAUCAGAGGACNN 524 s 122 GAUGGUCAAAGUUCUAGAU 245 GAUGGUCAAAGUUCUAGAUNN 525 as 140 AUCUAGAACUUUGACCAUC 246 AUCUAGAACUUUGACCAUCNN 526 s 139 AUGCUGUCCGAGGCAGUCC 247 AUGCUGUCCGAGGCAGUCCNN 527 as 157 GGACUGCCUCGGACAGCAU 248 GGACUGCCUCGGACAGCAUNN 528 s 172 CCGUGCAUGUGUUCAGAAA 249 CCGUGCAUGUGUUCAGAAANN 529 as 190 UUUCUGAACACAUGCACGG 250 UUUCUGAACACAUGCACGGNN 530 s 238 AGUCUGGAGAGCUGCAUGG 251 AGUCUGGAGAGCUGCAUGGNN 531 as 256 CCAUGCAGCUCUCCAGACU 252 CCAUGCAGCUCUCCAGACUNN 532 s 252 CAUGGGCUCACAACUGAGG 253 CAUGGGCUCACAACUGAGGNN 533 as 270 CCUCAGUUGUGAGCCCAUG 254 CCUCAGUUGUGAGCCCAUGNN 534 s 33 UCUCAUCGUCUGCUCCUCC 255 UCUCAUCGUCUGCUCCUCCNN 535 as 51 GGAGGAGCAGACGAUGAGA 256 GGAGGAGCAGACGAUGAGANN 536 s 340 CCCCAUUCCAUGAGCAUGC 257 CCCCAUUCCAUGAGCAUGCNN 537 as 358 GCAUGCUCAUGGAAUGGGG 258 GCAUGCUCAUGGAAUGGGGNN 538 s 421 GCCCCUACUCCUAUUCCAC 259 GCCCCUACUCCUAUUCCACNN 539 as 439 GUGGAAUAGGAGUAGGGGC 260 GUGGAAUAGGAGUAGGGGCNN 540 s 431 CUAUUCCACCACGGCUGUC 261 CUAUUCCACCACGGCUGUCNN 541 as 449 GACAGCCGUGGUGGAAUAG 262 GACAGCCGUGGUGGAAUAGNN 542 s 440 CACGGCUGUCGUCACCAAU 263 CACGGCUGUCGUCACCAAUNN 543 as 458 AUUGGUGACGACAGCCGUG 264 AUUGGUGACGACAGCCGUGNN 544 s 496 AGGACGAGGGAUGGGAUUU 265 AGGACGAGGGAUGGGAUUUNN 545 as 514 AAAUCCCAUCCCUCGUCCU 266 AAAUCCCAUCCCUCGUCCUNN 546 s 556 UCACCUCAUAUGCUAUGUU 267 UCACCUCAUAUGCUAUGUUNN 547 as 574 AACAUAGCAUAUGAGGUGA 268 AACAUAGCAUAUGAGGUGANN 548 s 559 CCUCAUAUGCUAUGUUAGA 269 CCUCAUAUGCUAUGUUAGANN 549 as 577 UCUAACAUAGCAUAUGAGG 270 UCUAACAUAGCAUAUGAGGNN 550 s 570 AUGUUAGAAGUCCAGGCAG 271 AUGUUAGAAGUCCAGGCAGNN 551 as 588 CUGCCUGGACUUCUAACAU 272 CUGCCUGGACUUCUAACAUNN 552 s 78 UCUGAGGCUGGCCCUACGG 273 UCUGAGGCUGGCCCUACGGNN 553 as 96 CCGUAGGGCCAGCCUCAGA 274 CCGUAGGGCCAGCCUCAGANN 554 s 87 GGCCCUACGGGCACCGGUG 275 GGCCCUACGGGCACCGGUGNN 555 as 105 CACCGGUGCCCGUAGGGCC 276 CACCGGUGCCCGUAGGGCCNN 556 s 95 GGGCACCGGUGAAUCCAAG 277 GGGCACCGG UG AAUCCAAG NN 557 as 113 CUUGGAUUCACCGGUGCCC 278 CUUGGAUUCACCGGUGCCCNN 558 s 167 CCAUGCAUGUGUUCAGAAA 279 CCAUGCAUGUGUUCAGAAANN 559 as 185 UUUCUGAACACAUGCAUGG 280 UUUCUGAACACAUGCAUGGNN 560 Tabla 3B. Secuencias de las hebras en la dirección sentido y antisentido de los TTR AR ds humanos Hebra: s=sentido; as= antisentido; posición de la base 5' en el transcripto (NM 000371.2, SEC ID NO:1329) Secuencia con desoxitimidina protuberante en 3' Hebra Posición SEC ID NO: (5' a 3') as 42 GACGAUGAGAAGCCAUCCUdTdT 598 as 245 AGAGCUGCAUGGGCUCACAdTdT 599 s 263 UGUGAGCCCAUGCAGCUCUdTdT 600 as 248 GCUGCAUGGGCUCACAACUdTdT 601 s 266 AGUUGUGAGCCCAUGCAGCdTdT 602 as 25 GGAUGGCUUCUCAUCGUCUdTdT 603 s 43 AGACGAUGAGAAGCCAUCCdTdT 604 as 251 GCAUGGGCUCACAACUGAGdTdT 605 s 269 CUCAGUUGUGAGCCCAUGCdTdT 606 as 253 AUGGGCUCACAACUGAGGAdTdT 607 s 271 UCCUCAGUUGUGAGCCCAUdTdT 608 as 254 UGGGCUCACAACUGAGGAGdTdT 609 s 272 CUCCUCAGUUGUGAGCCCAdTdT 610 as 270 GAGGAAUUUGUAGAAGGGAdTdT 611 s 288 UCCCUUCUACAAAUUCCUCdTdT 612 as 276 UUUGUAGAAGGGAUAUACAdTdT 613 s 294 UGUAUAUCCCUUCUACAAAdTdT 614 as 277 UUGUAGAAGGGAUAUACAAdTdT 615 s 295 UUGUAUAUCCCUUCUACAAdTdT 616 as 278 UGUAGAAGGGAUAUACAAAdTdT 617 s 296 UUUGUAUAUCCCUUCUACAdTdT 618 as 281 AGAAGGGAUAUACAAAGUGdTdT 619 s 299 CACUUUGUAUAUCCCUUCUdTdT 620 as 295 AAGUGGAAAUAGACACCAAdTdT 621 s 313 UUGGUGUCUAUUUCCACUUdTdT 622 as 299 GGAAAUAGACACCAAAUCUdTdT 623 s 317 AGAUUUGGUGUCUAUUUCCdTdT 624 300 GAAAUAGACACCAAAUCUUdTdT 625 as 318 AAGAUUUGGUGUCUAUUUCdTdT 626 s 303 AUAGACACCAAAUCUUACUdTdT 627 as 321 AGUAAGAUUUGGUGUCUAUdTdT 628 s 304 UAGACACCAAAUCUUACUGdTdT 629 as 322 CAGUAAGAUUUGGUGUCUAdTdT 630 s 305 AGACACCAAAUCUUACUGGdTdT 631 as 323 CCAGUAAGAUUUGGUGUCUdTdT 632 s 317 UUACUGGAAGGCACUUGGCdTdT 633 as 335 GCCAAGUGCCUUCCAGUAAdTdT 634 s 32 UUCUCAUCGUCUGCUCCUCdTdT 635 as 50 GAGGAGCAGACGAUGAGAAdTdT 636 s 322 GGAAGGCACUUGGCAUCUCdTdT 637 as 340 GAGAUGCCAAGUGCCUUCCdTdT 638 s 326 GGCACUUGGCAUCUCCCCAdTdT 639 as 344 UGGGGAGAUGCCAAGUGCCdTdT 640 s 333 GGCAUCUCCCCAUUCCAUGdTdT 641 as 351 AUGGAAUGGGGAGAUGCCTTdTdT 642 s 334 GCAUCUCCCCAUUCCAUGAdTdT 643 as 352 UCAUGGAAUGGGGAGAUGCdTdT 644 Secuencia con desoxitimidina protuberante en 3' Hebra Posición SEC ID NO: (5' a 3') s 335 CAUCUCCCCAUUCCAUGAGdTdT 645 as 353 CUCAUGGAAUGGGGAGAUGdTdT 646 s 336 AUCUCCCCAUUCCAUGAGCdTdT 647 as 354 GCUCAUGGAAUGGGGAGAUdTdT 648 s 338 CUCCCCAUUCCAUGAGCAUdTdT 649 as 356 AUGCUCAUGGAAUGGGGAGdTdT 650 s 341 CCCAUUCCAUGAGCAUGCAdTdT 651 as 359 UGCAUGCUCAUGGAAUGGGdTdT 652 s 347 CCAUGAGCAUGCAGAGGUGdTdT 653 as 365 CACCUCUGCAUGCUCAUGGdTdT 654 s 352 AGCAUGCAGAGGUGGUAUUdTdT 655 as 370 AAUACCACCUCUGCAUGCUdTdT 656 s 354 CAUGCAGAGGUGGUAUUCAdTdT 657 as 372 UGAAUACCACCUCUGCAUGdTdT 658 s 355 AUGCAGAGGUGGUAUUCACdTdT 659 as 373 GUGAAUACCACCUCUGCAUdTdT 660 s 362 GG UGG UAU UCACAGCCAACdTdT 661 as 380 GUUGGCUGUGAAUACCACCdTdT 662 s 363 GUGGUAUUCACAGCCAACGdTdT 663 as 381 CGUUGGCUGUGAAUACCACdTdT 664 s 364 UGGUAUUCACAGCCAACGAdTdT 665 as 382 UCGUUGGCUGUGAAUACCAdTdT 666 s 365 GGUAUUCACAGCCAACGACdTdT 667 as 383 GUCGUUGGCUGUGAAUACCdTdT 668 s 366 GUAUUCACAGCCAACGACUdTdT 669 as 384 AGUCGUUGGCUGUGAAUACdTdT 670 s 367 U AU UCACAG CCAACG ACU CdTdT 671 as 385 GAGUCGUUGGCUGUGAAUAdTdT 672 s 370 UCACAGCCAACGACUCCGGdTdT 673 as 388 CCGGAGUCGUUGGCUGUGAdTdT 674 s 390 CCCCGCCGCUACACCAUUGdTdT 675 as 408 CAAUGGUGUAGCGGCGGGGdTdT 676 s 4 GAAGUCCACUCAUUCUUGGdTdT 677 as 22 CCAAGAAUGAGUGGACUUCdTdT 678 s 412 CCCUGCUGAGCCCCUACUCdTdT 679 as 430 GAGUAGGGGCUCAGCAGGGdTdT 680 s 417 CUGAGCCCCUACUCCUAUUdTdT 681 as 435 AAUAGGAGUAGGGGCUCAGdTdT 682 s 418 UGAGCCCCUACUCCU AU UCdTdT 683 as 436 GAAUAGGAGUAGGGGCUCAdTdT 684 s 422 CCCCU ACUCCU AU U CCACCdTdT 685 as 440 GGUGGAAUAGGAGUAGGGGdTdT 686 s 425 CUACUCCUAUUCCACCACGdTdT 687 as 443 CGUGGUGGAAUAGGAGUAGdTdT 688 s 426 UACUCCUAUUCCACCACGGdTdT 689 as 444 CCGUGGUGGAAUAGGAGUAdTdT 690 s 427 ACUCCUAUUCCACCACGGCdTdT 691 as 445 GCCGUGGUGGAAUAGGAGUdTdT 692 s 429 UCCUAUUCCACCACGGCUGdTdT 693 Secuencia con desoxitimidina protuberante en 3' Hebra Posición SEC ID NO: (5' a 3') as 447 CAGCCGUGGUGGAAUAGGAdTdT 694 s 432 UAUUCCACCACGGCUGUCGdTdT 695 as 450 CGACAGCCG UGG UGGAAU AdTdT 696 s 433 AUUCCACCACGGCUGUCGUdTdT 697 as 451 ACGACAGCCGUGGUGGAAUdTdT 698 s 437 CACCACGGCUGUCGUCACCdTdT 699 as 455 GGUGACGACAGCCGUGGUGdTdT 700 s 438 ACCACGGCUGUCGUCACCAdTdT 701 as 456 UGGUGACGACAGCCGUGGUdTdT 702 s 439 CCACGGCUGUCGUCACCAAdTdT 703 as 457 UUGGUGACGACAGCCGUGGdTdT 704 s 441 ACGGCUGUCGUCACCAAUCdTdT 705 as 459 G AU UGG UGACG ACAGCCG U dTdT 706 s 442 CGGCUGUCGUCACCAAUCCdTdT 707 as 460 GGAUUGGUGACGACAGCCGdTdT 708 s 449 CG U CACCAAU CCC A AG G AAdTdT 709 as 467 UUCCUUGGGAUUGGUGACGdTdT 710 s 455 CAAUCCCAAGGAAUGAGGGdTdT 711 as 473 CCCUCAUUCCUUGGGAUUGdTdT 712 s 491 CCUGAAGGACGAGGGAUGGdTdT 713 as 509 CCAUCCCUCGUCCUUCAGGdTdT 714 s 497 GGACGAGGGAUGGGAUUUCdTdT 715 as 515 GAAAUCCCAUCCCUCGUCCdTdT 716 s 5 AAGUCCACUCAUUCUUGGCdTdT 717 as 23 G CCAAG AAU G AGUGGACUUdTdT 718 s 508 GGGAUUUCAUGUAACCAAGdTdT 719 as •526 CUUGGUUACAUGAAAUCCCdTdT 720 s 509 GGAUUUCAUGUAACCAAG AdTdT 721 as 527 UCUUGGUUACAUGAAAUCCdTdT 722 s 514 UCAUG UAACCAAG AG U AU U dTdT 723 as 532 AAUACUCUUGGUUACAUGAdTdT 724 s 516 AUGUAACCAAGAGUAUUCCdTdT 725 as 534 GGAAUACUCUUGGUUACAUdTdT 726 s 517 UGUAACCAAGAGUAUUCCAdTdT 727 as 535 UGGAAUACUCUUGGUUACAdTdT 728 s 518 GUAACCAAGAGUAUUCCAUdTdT 729 as 536 AUGGAAUACUCUUGGUUACdTdT 730 s 54 UGCCUUGCUGGACUGGUAUdTdT 731 as 72 AUACCAGUCCAGCAAGGCAdTdT 732 s 543 UAAAGCAGUGUUUUCACCUdTdT 733 as 561 AGGUGAAAACACUGCUUUAdTdT 734 s 55 GCCUUGCUGGACUGGUAUUdTdT 735 as 73 AAUACCAGUCCAGCAAGGCdTdT 736 s 551 UGUUUUCACCUCAUAUGCUdTdT 737 as 569 AGCAUAUGAGG UGAAAACAdTdT 738 s 552 GUUUUCACCUCAUAUGCUAdTdT 739 as 570 UAGCAUAUGAGGUGAAAACdTdT 740 Secuencia con desoxitimidina protuberante en 3' Hebra Posición SEC ID NO: (5' a 3') s 553 UUUUCACCUCAUAUGCUAUdTdT 741 as 571 AUAGCAUAUGAGGUGAAAAdTdT 742 s 555 UUCACCUCAUAUGCUAUGUdTdT 743 as 573 ACAUAGCAUAUGAGGUGAAdTdT 744 s 557 CACCUCAUAUGCUAUGUUAdTdT 745 as 575 UAACAUAGCAUAUGAGGUGdTdT 746 s 56 CCUUGCUGGACUGGUAUUUdTdT 747 as 74 AAAUACCAGUCCAGCAAGGdTdT 748 s 563 AUAUGCUAUGUUAGAAGUCdTdT 749 as 581 GACUUCUAACAUAGCAUAUdTdT 750 s 564 UAUGCUAUGUUAGAAGUCCdTdT 751 as 582 GGACUUCUAACAUAGCAUAdTdT 752 s 566 UGCUAUGUUAGAAGUCCAGdTdT 753 as 584 CUGGACUUCUAACAUAGCAdTdT 754 s 57 CUUGCUGGACUGGUAUUUGdTdT 755 as 75 CAAAU ACCAG U CCAG C AAG dTdT 756 s 578 AGUCCAGGCAGAG ACAAU AdTdT 757 as 596 AUUGUCUCUGCCUGGACUTTdTdT 758 s 580 UCCAGGCAGAGACAAUAAAdTdT 759 as 598 UUUAUUGUCUCUGCCUGGAdTdT 760 s 607 GUGAAAGGCACUUUUCAUUdTdT 761 as 625 AAUGAAAAGUGCCUUUCACdTdT 762 s 62 UGGACUGGUAUUUGUGUCUdTdT 763 as 80 AGACACAAAUACCAGUCCAdTdT 764 s 77 GUCUGAGGCUGGCCCUACGdTdT 765 as 95 CGUAGGGCCAGCCUCAGACdTdT 766 s 79 CUGAGGCUGGCCCUACGGGdTdT 767 as 97 CCCGUAGGGCCAG CCU CAG dTdT 768 s 81 GAGGCUGGCCCUACGGGCAdTdT 769 as 99 UGCCCGUAGGGCCAGCCUCdTdT 770 s 82 AGGCUGGCCCUACGGGCACdTdT 771 as 100 GUGCCCGUAGGG CCAG CCU dTdT 772 s 84 GCUGGCCCUACGGGCACCGdTdT 773 as 102 CGGUGCCCGUAGGGCCAG CdTdT 774 s 85 CUGGCCCUACGGGCACCGGdTdT 775 as 103 CCGGUGCCCGUAGGGCCAGdTdT 776 s 87 GGCCCUACGGGCACCGGUGdTdT 777 as 105 CACCGGUGCCCGUAGGGCCdTdT 778 s 9 CCACUCAUUCUUGGCAGGAdTdT 779 as 27 UCCUGCCAAGAAUGAGUGGdTdT 780 s 90 CCUACGGGCACCGGUGAAUdTdT 781 as 108 AUUCACCGGUGCCCGUAGGdTdT 782 s 91 CUACGGGCACCGG UGAAUCdTdT 783 as 109 GAUUCACCGGUGCCCGUAGdTdT 784 s 92 UACGGGCACCGGUGAAUCCdTdT 785 as 110 GGAUUCACCGGUGCCCGUAdTdT 786 s 93 ACGGGCACCGGUGAAUCCAdTdT 787 as 111 UGGAUUCACCGG UGCCCG UdTdT 788 s 97 GCACCGGUGAAUCCAAGUGdTdT 789 Tabla . Secuencias modificadas químicamente de las hebras sentido y antisentido de TTR AR ds de humano Véase la Tabla 2 por el # de dúplex. Hebra: s=sentido; as=antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcripto (NM_000371.2, SEC ID NO:1329) Hebra # de Oligo Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID NO: s A-32153 100 ccGGuGAAuccAAGuGuccdTdT 841 as A-32154 118 GGAcACUUGGAUUcACCGGdTdT 842 s A-32155 11 AcucAuucuuGGcAGGAuGdTdT 843 as A-32156 29 cAUCCUGCcAAGAAUGAGUdTdT 844 s A-32157 111 AAGuGuccucuGAuGGucAdTdT 845 as A-32158 129 UGACcAUcAGAGGAcACUUdTdT 846 s A-32163 13 ucAuucuuGGcAGGAuGGcdTdT 847 as A-32164 31 GCcAUCCUGCcAAGAAUGAdTdT 848 s A-32165 130 AAGuucuAGAuGcuGuccGdTdT 849 as A-32166 148 CGGAcAGcAUCuAGAACUUdTdT 850 s A-32167 132 GuucuAGAuGcuGuccGAGdTdT 851 as A-32168 150 CUCGGAcAGcAUCuAGAACdTdT 852 s A-32169 135 cu AGAuGcuG uccG AGGcAdTdT 853 as A-32170 153 UGCCUCGGAcAGcAUCuAGdTdT 854 s A-32171 138 GAuGcuGuccGAGGcAGucdTdT 855 as A-321 72 156 GACUGCCUCGGAcAGcAUCdTdT 856 s A-32175 14 cAuucuuGGcAGGAuGGcudTdT 857 as A-32176 32 AGCcAUCCUGCcAAGAAUGdTdT 858 s A-32177 140 uGcuGuccGAGGcAGuccudTdT 859 as A-32178 158 AGGACUGCCUCGGAcAGcAdTdT 860 s A-32179 146 ccGAGGcAGuccuGccAucdTdT 861 as A-32180 164 GAUGGcAGGACUGCCUCGGdTdT 862 s A-32181 152 cAGuccuGccAucAAuGuGdTdT 863 as A-32182 170 cAcAUUGAUGGcAGGACUGdTdT 864 s A-32183 164 c AAu G u GG ccG u G cAu G u G dTdT 865 as A-32184 182 cAcAUGcACGGCcAcAUUGdTdT 866 s A-32187 178 AuGuGuucAGAAAGGcuGcdTdT 867 as A-32188 196 GcAGCCUUUCUGAAcAcAUdTdT 868 s A-32189 2 cAGAAGuccAcucAuucuudTdT 869 as A-32190 20 AAGAAUGAGUGGACUUCUGdTdT 870 s A-32191 21 GGcAGGAuGGcuucucAucdTdT 871 as A-32192 39 GAUGAGAAGCcAUCCUGCCdTdT 872 s A-32193 210 GAGccAuuuGccucuGGGAdTdT 873 as A-32194 228 UCCcAGAGGcAAAUGGCUCdTdT 874 s A-32195 23 cAGGAuGGcuucucAucGudTdT 875 as A-32196 41 ACGAUGAGAAGCcAUCCUGdTdT 876 s A-32199 24 AGGAuGGcuucucAucGucdTdT 877 as A-32200 42 GACGAUGAGAAGCcAUCCUdTdT 878 s A-32201 245 AGAGcuGcAuGGGcucAcAdTdT 879 as A-32202 263 UGUGAGCCcAUGcAGCUCUdTdT 880 . s A-32203 248 GcuGcAuGGGcucAcAAcudTdT 881 as A-32204 266 AG UUG UGAGCCcAUGcAGCdTdT 882 s A-32205 25 GGAuGGcuucucAucGucudTdT 883 as A-32206 43 AGACGAUGAGAAGCcAUCCdTdT 884 Hebra # de Oligo Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID NO: s A-32207 251 GcAuGGGcucAcAAcuGAGdTdT 885 as A-32208 269 CUcAGUUGUGAGCCcAUGCdTdT 886 s A-32211 253 AuGGGcucAcAAcuGAGGAdTdT 887 as A-32212 271 UCCUcAGUUGUGAGCCcAUdTdT 888 s A-32213 254 uGGGcucAcAAcuGAGGAGdTdT 889 as A-32214 272 CUCCUcAGUUGUGAGCCcAdTdT 890 s A-32215 270 GAGGAAuuuGuAGAAGGGAdTdT 891 as A-32216 288 UCCCUUCuAcAAAUUCCUCdTdT 892 s A-32217 276 uuuGuAGAAGGGAuAuAcAdTdT 893 as A-32218 294 UGuAuAUCCCU UCuAcAAAdTdT 894 s A-32219 277 uuGuAGAAGGGAuAuAcAAdTdT 895 as A-32220 295 UUGuAuAUCCCUUCuAcAAdTdT 896 s A-32221 278 uGuAGAAGGGAuAuAcAAAdTdT 897 as A-32222 296 UUUGuAuAUCCCUUCuAcAdTdT 898 s A-32223 281 AGAAGGGAuAuAcAAAGuGdTdT 899 as A-32224 299 cACUUUGuAuAUCCCUUCUdTdT 900 s A-32225 295 AAGuGGAAAuAGAcAccAAdTdT 901 as A-32226 313 UUGGUGUCuAUUUCcACUUdTdT 902 s A-32227 299 GGAAAuAGAcAccAAAucudTdT 903 as A-32228 317 AGAUUUGGUGUCuAUUUCCdTdT 904 s A-32229 300 GAAAuAGAcAccAAAucuudTdT 905 as A-32230 318 AAGAUUUGGUGUCuAUUUCdTdT 906 s A-32231 303 Au AG AcAccAAAucu u Acu dTdT 907 as A-32232 321 AGuAAGAUUUGGUGUCuAUdTdT 908 s A-32233 304 uAGAcAccAAAucuuAcuGdTdT 909 as A-32234 322 cAGuAAGAUUUGGUGUCuAdTdT 910 s A-32235 305 AGAcAccAAAucuuAcuGGdTdT 911 as A-32236 323 CcAGuAAGAUUUGGUGUCUdTdT 912 s A-32237 317 uuAcuGGAAGGcAcuuGGcdTdT 913 as A-32238 335 GCcAAG UG CCU UCcAG uAAdTdT 914 s A-32239 32 uucucAucGucuGcuccucdTdT 915 as A-32240 50 GAGGAGcAGACGAUGAGAAdTdT 916 s A-32241 322 GGAAGGcAcuuGGcAucucdTdT 917 as A-32242 340 GAGAUGCcAAGUGCCUUCCdTdT 918 s A-32243 326 GGcAcuuGGcAucuccccAdTdT 919 as A-32244 344 UGGGGAGAUGCcAAGUGCCdTdT 920 s A-32247 333 GGcAucuccccAuuccAuGdTdT 921 as A-32248 351 cAUGGAAUGGGGAGAUGCCdTdT 922 s A-32249 334 GcAucuccccAuuccAuGAdTdT 923 as A-32250 352 UcAUGGAAUGGGGAGAUGCdTdT 924 s A-32251 335 cAucuccccAuuccAuGAGdTdT 925 as A-32252 353 CUcAUGGAAUGGGGAGAUGdTdT 926 s A-32253 336 AucuccccAuuccAuGAGcdTdT 927 as A-32254 354 GCUcAUGGAAUGGGGAGAUdTdT 928 s A-32255 338 cuccccAuuccAuGAGcAudTdT 929 as A-32256 356 AUGCUcAUGGAAUGGGGAGdTdT 930 s A-32259 341 cccAuuccAuGAGcAuGcAdTdT 931 as A-32260 359 UGcAUGCUcAUGGAAUGGGdTdT 932 s A-32261 347 ccAuGAGcAuGcAGAGGuGdTdT 933 as A-32262 365 cACCUCUGcAUGCUcAUGGdTdT 934 s A-32263 352 AGcAuGcAGAGGuGGuAuudTdT 935 as A-32264 370 AAuACcACCUCUGcAUGCUdTdT 936 Hebra # de Oligo Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID NO: s A-32265 354 cAuGcAGAGGuGGuAuucAdTdT 937 as A-32266 372 UGAAuACcACCUCUGcAUGdTdT 938 s A-32267 355 AuGcAGAGGuGGuAuucAcdTdT 939 as A-32268 373 GUGAAuACcACCUCUGcAUdTdT 940 s A-32269 362 GGuGGuAuucAcAGccAAcdTdT 941 as A-32270 380 GUUGGCUGUGAAuACcACCdTdT 942 s A-32271 363 GuGGuAuucAcAGccAAcGdTdT 943 . as A-32272 381 CGUUGGCUGUGAAuACcACdTdT 944 s A-32273 364 uGGuAuucAcAGccAAcGAdTdT 945 as A-32274 382 UCGUUGGCUGUGAAuACcAdTdT 946 s A-3227 5 365 GGuAuucAcAGccAAcGAcdTdT 947 as A-32276 383 GUCGUUGGCUGUGAAuACCdTdT 948 s A-32277 366 GuAuucAcAGccAAcGAcudTdT 949 as A-32278 384 AGUCGUUGGCUGUGAAuACdTdT 950 s A-32279 367 uAuucAcAGccAAcGAcucdTdT 951 as A-32280 385 GAGUCGUUGGCUGUGAAuAdTdT 952 s A-32281 370 ucAcAGccAAcGAcuccGGdTdT 953 as A-32282 388 CCGGAGUCGUUGGCUGUGAdTdT 954 s A-32283 390 ccccGccGcuAcAccAuuGdTdT 955 as A-32284 408 cAAUGGUGuAGCGGCGGGGdTdT 956 s A-32285 4 GAAGuccAcucAuucuuGGdTdT 957 as A-32286 22 CcAAGAAUGAGUGGACUUCdTdT 958 s A-32287 412 cccuGcuGAGccccuAcucdTdT 959 as A-32288 430 GAGuAGGGGCUcAGcAGGGdTdT 960 s A-32289 417 cuGAGccccuAcuccuAuudTdT 961 as A-32290 435 AAuAGGAGuAGGGGCUcAGdTdT 962 s A-32291 418 uGAGccccuAcuccuAuucdTdT 963 as A-32292 436 GAAuAGGAGuAGGGGCUcAdTdT 964 s A-32295 422 ccccuAcuccuAuuccAccdTdT 965 as A-32296 440 GGUGGAAuAGGAGuAGGGGdTdT 966 s A-32297 425 cuAcuccuAuuccAccAcGdTdT 967 as A-32298 443 CGUGGUGGAAuAGGAGuAGdTdT 968 s A-32299 426 uAcuccuAuuccAccAcGGdTdT 969 as A-32300 444 CCGUGGUGGAAuAGGAGuAdTdT 970 s A-32301 427 AcuccuAuuccAccAcGGcdTdT 971 as A-32302 445 GCCGUGGUGGAAuAGGAGUdTdT 972 s A-32303 429 uccuAuuccAccAcGGcuGdTdT 973 as A-32304 447 cAGCCGUGGUGGAAuAGGAdTdT 974 s A-32307 432 uAuuccAccAcGGcuGucGdTdT 975 as A-32308 450 CGAcAGCCGUGGUGGAAuAdTdT 976 s A-32309 433 AuuccAccAcGGcuGucGudTdT 977 as A-32310 451 ACGAcAGCCGUGGUGGAAUdTdT 978 s A-32311 437 cAccAcGGcuGucGucAccdTdT 979 as A-32312 455 GGUGACGAcAGCCGUGGUGdTdT 980 s A-32313 438 AccAcGGcuGucGucAccAdTdT 981 as A-32314 456 UGGUGACGAcAGCCGUGGUdTdT 982 s A-32315 439 ccAcGGcuGucGucAccAAdTdT 983 as A-32316 457 UUGGUGACGAcAGCCGUGGdTdT 984 s A-32319 441 AcGGcuGucGucAccAAucdTdT 985 as A-32320 459 GAUUGGUGACGAcAGCCGUdTdT 986 s A-32321 442 cGGcuGucGucAccAAuccdTdT 987 as A-32322 460 GGAUUGGUGACGAcAGCCGdTdT 988 Hebra # de Oligo Posición Secuencia (5' a 3'] SEC ID NO: s A-32323 449 cGucAccAAucccAAGGAAdTdT 989 as A-32324 467 UUCCUUGGGAUUGGUGACGdTdT 990 s A-32325 455 cAAucccAAGGAAuGAGGGdTdT 991 as A-32326 473 CCCUcAUUCCUUGGGAUUGdTdT 992 s A-32327 491 ccuGAAGGAcGAGGGAuGGdTdT 993 as A-32328 509 CcAUCCCUCGUCCUUcAGGdTdT 994 s A-32331 497 GGAcGAGGGAuGGGAuuucdTdT 995 as A-32332 515 GAAAUCCcAUCCCUCGUCCdTdT 996 s A-32333 5 AAGuccAcucAuucuuGGcdTdT 997 as A-32334 23 GCcAAGAAUGAGUGGACUUdTdT 998 s A-32335 508 GGGAuuucAuGu A Acc AAG dTdT 999 as A-32336 526 CUUGGUuAcAUGAAAUCCCdTdT 1000 s A-32337 509 GGAuuucAuGuAAccAAGAdTdT 1001 as A-32338 527 UCUUGGUuAcAUGAAAUCCdTdT 1002 s A-32339 514 ucAuGuAAccAAGAGuAuudTdT 1003 as A-32340 532 AAuACUCUUGGUuAcAUGAdTdT 1004 s A-32341 516 AuGuAAccAAGAGuAuuccdTdT 1005 as A-32342 534 GGAAuACUCUUGGUuAcAUdTdT 1006 s A-32343 517 uGuAAccAAGAGuAuuccAdTdT 1007 as A-32344 535 UGGAAuACUCUUGGUuAcAdTdT 1008 s A-32345 518 G u AAccAAG AG u AuuccAu dTdT 1009 as A-32346 536 AUGGAAuACUCUUGGUuACdTdT 1010 s A-32347 54 uGccuuGcuGGAcuGGuAudTdT 1011 as A-32348 72 AuACcAGUCcAGcAAGGcAdTdT 1012 s A-32349 543 u AAAGcAG uGu u u ucAccu dTdT 1013 as A-32350 561 AGGUGAAAAcACUGCUUuAdTdT 1014 s A-32351 55 GccuuGcuGGAcuGGuAuudTdT 1015 as A-32352 73 AAuACcAGUCcAGcAAGG CdTdT 1016 s A-32353 551 uGuuuucAccucAuAuGcudTdT 1017 as A-32354 569 AGcAu AUGAGG UGAAAAcAdTdT 1018 s A-32355 552 GuuuucAccucAuAuGcuAdTdT 1019 as A-32356 570 uAGcAuAUGAGGUGAAAACdTdT 1020 s A-32357 553 uuuucAccucAuAuGcuAudTdT 1021 as A-32358 571 AuAGcAuAUGAGGUGAAAAdTdT 1022 s A-32359 555 uucAccucAuAuGcuAuGudTdT 1023 as A-32360 573 AcAuAGcAu AUGAGG UGAAdTdT 1024 s A-32363 557 cAccucAuAuGcuAuGuuAdTdT 1025 as A-32364 575 uAAcAuAGcAuAUGAGGUGdTdT 1026 s A-32367 56 ccuuGcuGGAcuGGuAuuudTdT 1027 as A-32368 74 AAAuACcAGUCcAGcAAGGdTdT 1028 s A-32369 563 AuAuGcuAuGuuAGAAGucdTdT 1029 as A-32370 581 GACUUCuAAcAuAGcAuAUdTdT 1030 s A-32371 564 uAuGcuAuGuuAGAAGuccdTdT 1031 as A-32372 582 GGACUUCuAAcAuAGcAuAdTdT 1032 s A-32373 566 uGcuAuGuuAGAAGuccAGdTdT 1033 as A-32374 584 CUGGACUUCuAAcAuAGcAdTdT 1034 s A-32375 57 cuuGcuGGAcuGGuAuuuGdTdT 1035 as A-32376 75 cAAAuACcAGUCcAGcAAGdTdT 1036 s A-32379 578 AGuccAGGcAGAGAcAAuAdTdT 1037 as A-32380 596 uAUUGUCUCUGCCUGGACUdTdT 1038 s A-32381 580 uccAGGcAGAGAcAAu AAAdTdT 1039 Hebra U de Oligo Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID NO: as A-32382 598 UUuAUUGUCUCUGCCUGGAdTdT 1040 s A-32383 607 GuGAAAGGcAcuuuucAuudTdT 1041 as A-32384 625 AAUGAAAAGUGCCUUUcACdTdT 1042 s A-32385 62 uGGAcuGGuAuuuGuGucudTdT 1043 as A-32386 80 AG Ac Ac AAAu ACcAGUCcAdTdT 1044 s A-32387 77 GucuGAGGcuGGcccuAcGdTdT 1045 as A-32388 95 CGuAGGGCcAGCCUcAGACdTdT 1046 s A-32391 79 cuGAGGcuGGcccuAcGGGdTdT 1047 as A-32392 97 CCCGuAGGGCcAGCCUcAGdTdT 1048 s A-32393 81 GAGGcuGGcccuAcGGGcAdTdT 1049 as A-32394 99 UGCCCGuAGGGCcAGCCUCdTdT 1050 a A-32395 82 AGGcuGGcccuAcGGGcAcdTdT 1051 as A-32396 100 GUGCCCGuAGGGCcAGCCUdTdT 1052 s A-32397 84 GcuGGcccuAcGGGcAccGdTdT 1053 as A-32398 102 CGGUGCCCGuAGGGCcAGCdTdT 1054 s A-32399 85 cuGGcccuAcGGGcAccGGdTdT 1055 as A-32400 103 CCGGUGCCCGuAGGGCcAGdTdT 1056 s A-32401 87 GGcccuAcGGGcAccGGuGdTdT 1057 as A-32402 105 cACCGGUGCCCGuAGGGCCdTdT 1058 s A-32403 9 ccAcucAuucuuGGcAGGAdTdT 1059 as A-32404 27 UCCUGCcAAGAAUGAGUGGdTdT 1060 s A-32405 90 ccuAcGGGcAccGGuGAAudTdT 1061 as A-32406 108 AUUcACCGGUGCCCGuAGGdTdT 1062 s A-32407 91 cuAcGGGcAccGGuGAAucdTdT 1063 as A-32408 109 G AU UcACCG G UG CCCG u AG dTdT 1064 s A-32409 92 uAcGGGcAccGGuGAAuccdTdT 1065 as A-32410 110 GGAUUcACCGGUGCCCGuAdTdT 1066 s A-32411 93 AcGGGcAccGGuGAAuccAdTdT 1067 as A-32412 111 UGGAUUcACCGGUGCCCGUdTdT 1068 s A-32415 97 GcAccGGuGAAuccAAGuGdTdT 1069 as A-32416 115 cACUUGGAUUcACCGGUGCdTdT 1070 s A-32417 98 cAccGGuGAAuccAAGuGudTdT 1071 as A-32418 116 AcACUUGGAUUcACCGGUGdTdT 1072 s A-32419 167 uGuGGccAuGcAuGuGuucdTdT 1073 as A-32420 185 GAAcAcAUGcAUGGCcAcAdTdT 1074 s A-32421 168 GuGGccAuGcAuGuGuucAdTdT 1075 as A-32422 186 UGAAcAcAUGcAUGGCcACdTdT 1076 s A-32423 171 GccAuGcAuGuGuucAGAAdTdT 1077 as A-32424 189 UUCUGAAcAcAUGcAUGGCdTdT 1078 s A-32427 432 uAuuccAccAcGGcuGucAdTdT 1079 as A-32428 449 UGAcAGCCGUGGUGGAAuAdTdT 1080 s A-32429 447 GucAucAccAAu cccAAG G dTdT 1081 as A-32430 465 CCUUGGGAUUGGUGAUGACdTdT 1082 s A-32159 115 GuccucuGAuGGucAAAGudTdT 1083 as A-32160 133 ACUUUGACcAUcAGAGGACdTdT 1084 s A-32161 122 GAuGGucAAAGuucuAGAudTdT 1085 as A-32162 140 AUCuAGAACUUUGACcAUCdTdT 1086 s A-32173 139 AuGcuGuccGAGGcAGuccdTdT 1087 as A-32174 157 GGACUGCCUCGGAcAGcAUdTdT 1088 s A-32185 172 ccGuGcAuGuGuucAG AAAdTdT 1089 as A-32186 190 UUUCUGAAcAcAUGcACGGdTdT 1090 Hebra # de Oligo Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID NO: s A-32197 238 AGucuGGAGAGcuGcAuGGdTdT 1091 as A-32198 256 CcAUGcAGCUCUCcAGACUdTdT 1092 s A-32209 252 cAuGGGcucAcAAcuGAGGdTdT 1093 as A-32210 270 CCUcAGUUGUGAGCCcAUGdTdT 1094 s A-32245 33 ucucAucGucuGcuccuccdTdT 1095 as A-32246 51 GGAGGAGcAGACGAUGAGAdTdT 1096 s A-32257 340 ccccAuuccAuGAGcAuGcdTdT 1097 as A-32258 358 GcAUGCUcAUGGAAUGGGGdTdT 1098 s A-32293 421 GccccuAcuccuAuuccAcdTdT 1099 as A-32294 439 GUGGAAuAGGAGuAGGGGCdTdT 1100 s A-32305 431 cuAuuccAccAcGGcuGucdTdT 1101 as A-32306 449 GAcAGCCGUGGUGGAAuAGdTdT 1102 s A-32317 440 cAcGGcuGucGucAccAAudTdT 1103 as A-32318 458 AUUGGUGACGAcAGCCGUGdTdT 1104 s A-32329 496 AGGAcGAGGGAuGGGAuuudTdT 1105 as A-32330 514 AAAUCCcAUCCCUCGUCCUdTdT 1106 s A-32361 556 ucAccucAuAuGcuAuGuudTdT 1107 as A-32362 574 AAcAuAGcAuAUGAGGUGAdTdT 1108 s A-32365 559 ccucAuAuGcuAuGuuAGAdTdT 1109 as A-32366 577 UCuAAcAuAGcAuAUGAGGdTdT 1110 s A-32377 570 AuGuuAGAAGuccAGGcAGdTdT 1111 as A-32378 588 CUGCCUGGACUUCuAAcAUdTdT 1112 s A-32389 78 ucuGAGGcuGGcccuAcGGdTdT 1113 as A-32390 96 CCGuAGGGCcAGCCUcAGAdTdT 1114 s A-32401 87 GGcccuAcGGGcAccGGuGdTdT 1115 as A-32402 105 cACCGGUGCCCGuAGGGCCdTdT 1116 s A-32413 95 GGGcAccGGuGAAuccAAGdTdT 1117 as A-32414 113 CUUGGAUUcACCGGUGCCCdTdT 1118 s A-32425 167 ccAuGcAuGuGuucAGAAAdTdT 1119 as A-32426 185 UUUCUGAAcAcAUGcAUGGdTdT 1120 Tabla 5 : Números de Identificación para los TTR AR ds de rata Véase la Tabla 7 por las secuencias . #de Dúplex # de Oligo Sentido # de Oligo Antisentido AD- 18529 A-32745 A-32746 AD-18530 A-32747 A-32748 AD- 18531 A-32749 A-32750 AD-18532 A-3275I A-32752 AD-18533 A-32753 A-32754 AD-18534 A-32755 A-32756 AD-18535 A-32757 A-32758 AD-18536 A-32759 A-32760 AD-18537 A-32761 A-32762 #de Dúplex # de Oligo Sentido # de Oligo Antisentido AD-18538 A-32763 A-32764 AD-18539 A-32159 A-32160 AD- 18540 A-32765 A-32766 AD-18541 A-32767 A-32768 AD-18542 A-32769 A-32770 AD- 18543 A-32771 A-32772 AD- 18544 A-32773 A-32774 AD-18545 A-32775 A-32776 AD- 18546 A-32777 A-32778 AD- 18547 A-32779 A-32780 AD- 18548 A-32781 A-32782 AD- 18549 A-32783 A-32784 AD-18550 A-32785 A-32786 AD- 185 1 A-32787 A-32788 AD-18552 A-32791 A-32792 AD-18553 A-32793 A-32794 AD-18554 A-32795 A-32796 Tabla 6A. Secuencias de las hebras sentido y antisentido para los TTR AR ds de rata Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcripto (NM 012681.1, SEC ID NO:1330) Hebra Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID Secuencia con dinucleótido SEC ID NO: protuberante en 3' NO: (5' a 3') s 115 GUCCUCUGAUGGUCAAAGU 1121 GUCCUCUGAUGGUCAAAGUNN 1173 as 133 ACUUUGACCAUCAGAGGAC 1122 ACUUUGACCAUCAGAGGACNN 1174 s 537 UUCUUGCUCUAUAAACCGU 1123 UUCUUGCUCUAUAAACCGUNN 1175 as 555 ACGGUUUAUAGAGCAAGAA 1124 ACGGUUUAUAGAGCAAGAANN 1176 s 543 CUCUAUAAACCGUGUUAGC 1125 CU CU AU AAACCG UG U UAGCNN 1177 as 561 GCUAACACGGUUUAUAGAG 1126 GCUAACACGGUUUAUAGAGNN 1178 s 392 UCGCCACUACACCAUCGCA 1127 UCGCCACUACACCAUCGCANN 1179 as 410 UGCGAUGGUGUAGUGGCGA 1128 UGCGAUGGUGUAGUGGCGANN 1180 s 538 UCUUGCUCUAUAAACCGUG 1129 UCUUGCUCUAUAAACCGUGNN 1181 as 556 CACGGUUUAUAGAGCAAGA 1130 CACGG U U U AU AG AG CAAGANN 1182 s 541 UGCUCUAUAAACCGUGUUA 1131 UGCUCUAUAAACCGUGUUANN 1183 as 559 UAACACGGUUUAUAGAGCA 1132 UAACACGGUUUAUAGAGCANN 1184 s 532 CAGUGUUCUUGCUCUAUAA 1133 CAGUGUUCUUGCUCUAUAANN 1185 as 550 UUAUAGAGCAAGAACACUG 1134 UUAUAGAGCAAGAACACUGNN 1186 s 542 GCUCUAUAAACCGUGUUAG 1135 GCUCUAUAAACCGUGUUAGNN 1187 as 560 CUAACACGGUUUAUAGAGC 1136 CUAACACGGUUUAUAGAGCNN 1188 Hebra Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID Secuencia con dinucleótido SEC ID NO: protuberante en 3' NO: (5' a 3') s 134 CCUGGAUGCUGUCCGAGGC 1137 CCUGGAUGCUGUCCGAGGCNN 1189 as 152 GCCUCGGACAGCAUCCAGG 1138 GCCUCGGACAGCAUCCAGGNN 1190 s 119 UCUGAUGGUCAAAGUCCUG 1139 UCUGAUGGUCAAAGUCCUGNN 1191 as 137 CAGGACUUUGACCAUCAGA 1140 CAGGACUUUGACCAUCAGANN 1192 s 241 CUGGAGAGCUGCACGGGCU 1141 CUGGAGAGCUGCACGGGCUNN 1193 as 259 AGCCCGUGCAGCUCUCCAG 1142 AGCCCGUGCAGCUCUCCAGNN 1194 s 544 UCUAUAAACCGUGUUAGCA 1143 UCUAUAAACCGUGUUAGCANN 1195 as 562 UGCUAACACGGUUUAUAGA 1144 UGCUAACACGGUUUAUAGANN 1196 s 530 AACAGUGUUCUUGCUCUAU 1145 AACAGUGUUCUUGCUCUAUNN 1197 as 548 AUAGAGCAAGAACACUGUU 1146 AUAGAGCAAGAACACUGUUNN 1198 s 118 CUCUGAUGGUCAAAGUCCU 1147 CUCUGAUGGUCAAAGUCCUNN 1199 as 136 AGGACUUUGACCAUCAGAG 1148 AGGACUUUGACCAUCAGAGNN 1200 s 140 UGCUGUCCGAGGCAGCCCU 1149 UGCUGUCCGAGGCAGCCCUNN 1201 as 158 AGGGCUGCCUCGGACAGCA 1150 AGGGCUGCCUCGGACAGCANN 1202 s 239 GUCUGGAGAGCUGCACGGG 1151 GUCUGGAGAGCUGCACGGGNN 1203 as 257 CCCGUGCAGCUCUCCAGAC 1152 CCCGUGCAGCUCUCCAGACNN 1204 s 531 ACAGUGUUCUUGCUCUAUA 1153 ACAGUGUUCUUGCUCUAUANN 1205 as 549 UAUAGAGCAAGAACACUGU 1154 UAUAGAGCAAGAACACUGUNN 1206 s 117 CCUCUGAUGGUCAAAGUCC 1155 CCUCUGAUGGUCAAAGUCCNN 1207 as 135 GGACUUUGACCAUCAGAGG 1156 GGACUUUGACCAUCAGAGGNN 1208 s 131 AGUCCUGGAUGCUGUCCGA 1157 AGUCCUGGAUGCUGUCCGANN 1209 as 149 UCGGACAGCAUCCAGGACU 1158 UCGGACAGCAUCCAGGACUNN 1210 s 217 UUGCCUCUGGGAAGACCGC 1159 UUGCCUCUGGGAAGACCGCNN 1211 as 235 GCGGUCUUCCCAGAGGCAA 1160 GCGGUCUUCCCAGAGGCAANN 1212 s 242 UGGAGAGCUGCACGGGCUC 1161 UGGAGAGCUGCACGGGCUCNN 1213 as 260 GAGCCCGUGCAGCUCUCCA 1162 GAGCCCGUGCAGCUCUCCANN 1214 s 244 GAGAGCUGCACGGGCUCAC 1163 GAGAGCUGCACGGGCUCACNN 1215 as 262 GUGAGCCCGUGCAGCUCUC 1164 GUGAGCCCGUGCAGCUCUCNN 1216 s 246 GAGCUGCACGGGCUCACCA 1165 GAGCUGCACGGGCUCACCANN 1217 as 264 UGGUGAGCCCGUGCAGCUC 1166 UGGUGAGCCCGUGCAGCUCNN 1218 s 399 UACACCAUCGCAGCCCUGC 1167 UACACCAUCGCAGCCCUGCNN 1219 as 417 GCAGGGCUGCGAUGGUGUA 1168 GCAGGGCUGCGAUGGUGUANN 1220 s 132 GUCCUGGAUGCUGUCCGAG 1169 GUCCUGGAUGCUGUCCGAGNN 1221 as 150 CUCGGACAGCAUCCAGGAC 1170 CUCGGACAGCAUCCAGGACNN 1222 s 245 AGAGCUGCACGGGCUCACC 1171 AG AGCUGCACGGGCUCACCN N 1223 as 263 GGUGAGCCCGUGCAGCUCU 1172 GGUGAGCCCGUGCAGCUCUNN 1224 Tabla 6B. Secuencias de las hebras sentido y antisentido para los TTR ARNds de rata Hebra: s= sentido; as=antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcripto (NM_012681.1, SEC ID NO: 1330) Hebra Posición Secuencia con desoxitimidina protuberante en 3' SEC ID NO: (5' a 3') as 235 GCGGUCUUCCCAGAGGCAAdTdT 1264 s 242 UGGAGAGCUGCACGGGCUCdTdT 1265 as 260 GAGCCCGUGCAGCUCUCCAdTdT 1266 s 244 GAGAGCUGCACGGGCUCACdTdT 1267 as 262 GUGAGCCCGUGCAGCUCUCdTdT 1268 s 246 GAGCUGCACGGGCUCACCAdTdT 1269 as 264 UGGUGAGCCCGUGCAGCUCdTdT 1270 s 399 UACACCAUCGCAGCCCUGCdTdT 1271 as 417 GCAGGGCUGCGAUGGUGUAdTdT 1272 s 132 GUCCUGGAUGCUGUCCGAGdTdT 1273 as 150 CUCGGACAGCAUCCAGGACdTdT 1274 s 245 AGAGCUGCACGGGCUCACCdTdT 1275 as 263 GGUGAGCCCGUGCAGCUCUdTdT 1276 Tabla 7. Secuencias de las hebras sentido y antisentido modificadas químicamente para los TTR ARNds de rata Véase la Tabla 5 por los # de dúplex (nombre del ARNds) . Hebra: s= sentido; as= antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcripto (NM_012681.1, SEC ID NO: 1330) Hebra n de Oligo Posición Secuencia (5' a 3') SEC ID NO: s A-32765 544 ucuAuAAAccGuGuuAGcAdTdT 1299 as A-32766 562 UGCuAAcACGGUUuAuAGAdTdT 1300 s A-32767 530 AAcAGuGuucuuGcucuAudTdT 1301 as A-32768 548 AuAGAGcAAGAAcACUGUUdTdT 1302 s A-32769 118 cucuGAuGGucAAAGuccudTdT 1303 as A-32770 136 AGGACUUUGACcAUcAGAGdTdT 1304 s A-32771 140 uGcuGuccGAGGcAGcccudTdT 1305 as A-32772 158 AGGGCUGCCUCGGAcAGcAdTdT 1306 s A-32773 239 GucuGGAGAGcuGcAcGGGdTdT 1307 as A-32774 257 CCCGUGcAGCUCUCcAGACdTdT 1308 s A-32775 531 AcAGuGuucuuGcucuAuAdTdT 1309 as A-32776 549 uAuAGAGcAAGAAcACUGUdTdT 1310 s A-32777 117 ccucuGAuGGucAAAGuccdTdT 1311 as A-32778 135 GGACUUUGACcAUcAGAGGdTdT 1312 s A-32779 131 AGuccuGGAuGcuGuccGAdTdT 1313 as A-32780 149 UCGGAcAGcAUCcAGGACUdTdT 1314 s A-32781 217 uuGccucuGGGAAGAccGcdTdT 1315 as A-32782 235 GCGGUCUUCCcAGAGGcAAdTdT 1316 s A-32783 242 uGGAGAGcuGcAcGGGcucdTdT 1317 as A-32784 260 GAGCCCGUGcAGCUCUCcAdTdT 1318 s A-32785 244 GAGAGcuGcAcGGGcucAcdTdT 1319 as A-32786 262 GUGAGCCCGUGcAGCUCUCdTdT 1320 s A-32787 246 GAGcuGcAcGGGcucAccAdTdT 1321 as A-32788 264 UGGUGAGCCCGUGcAGCUCdTdT 1322 s A-32791 399 uAcAccAucGcAGcccuGcdTdT 1323 as A-32792 417 GcAGGGCUGCGAUGGUGuAdTdT 1324 s A-32793 132 GuccuGGAuGcuGuccGAGdTdT 1325 as A-32794 150 CUCGGAcAGcAUCcAGGACdTdT 1326 s A-32795 245 AGAGcuGcAcGGGcucAccdTdT 1327 as A-32796 263 GGUGAGCCCGUGcAGCUCUdTdT 1328 Síntesis de las Secuencias de TTR Las secuencias de TTR se sintetizaron en un sintetizador MerMade 192 a una escala de 1 µp???. Para todas las secuiencias en las lista, se aplicó la química ^endolight' como se detalla a continuación.

• Todas las pirimidinas (citocina y uridina) en la hebra sentido se reempalzaron con bases de 2'-0-metilo correspondientes ( 2- ?0- ???1 C y 2'-0-Metil U) • En la hebra antisentido, las pirimidinas adyacentes a (hacia la piosicion 5' ) ribo a nucleósido se reemplazaron con sus 2-0-Metil nucleósidos correspondientes • Se introdujo una extensión de dos bases dTdT en el extremo 3' tanto de la secuencia sentido y antisentido · El archivos de secuencias de convirtió en un archivo de texto para hacerlo compatible para la carga en el programa de sintesis Mer ade 192 La sintesis de las secuencias de TTR usa sintesis de oligonucleótidos en soporte sólido usando la química de fosforamidita . La síntesis de las secuencias anteriores se realizó a una escala de 1 um en placas de 96 pozos. Las soluciones de amidita se prepararon a una concentración 0.1M y se uso etil tio tetrazol (0.6 M en Acetonitrilo) como el activador .

Las secuencias sintetizadas se escindieron y se desprotegieron en placas de 96 pozos usando metilamina en el primer paso y trietilamina .3HF en el segundo paso. Las secuencias crudas así obtenidas se precipitaron usando acetona: mezcla con etanol, y la pelotilla se resuspendió en amortiguador de acetato de sodio al 0.05 . Se analizaron muestras de cada secuencia mediante LC-MS y los datos de masa resultantes confirmaron la identidad de las secuencias. Un conjunto seleccionado de las muestras también se analizó por cromatografía IEX.

El siguiente paso en el proceso fue la purificación.

Todas las secuencias se purificaron en un sistema de purificación AKTA Explorer usando columnas Source 15Q. Un pico individual correspondiente a la secuencia de longitud completa se recolectó en el eluyente y posteriormente se analizó por su pureza mediante cromatografía de intercambio iónico.

Las secuencias purificadas se desalinizaron en una columna Sephadex G25 usando un purificador AKTA. Las secuencias TTR desalinizadas se analizaron por la concentración y la pureza. Las hebras individuales se hibridaron para formar TTR-ARNds .

Ejemplo 2B; Identificación in vitro de TTR ARNsi por la supresión del ARMm Los TTR que se enfocan en los ARNds (Tabla 2) se analizaron por la inhibición de la expresión endógena de TTR en células HepG2 y Hep3B, usando ensayos de qPCR (PCR en tiempo real) y ADNb (ADN ramificado), para cuantificar el TTR ARNm. El TTR de roedor que se enfoca en ARNds (Tabla 5) se sintetizó y se analizó por la inhibición de al expresión endógena de TTR usando ensayos de ADNb en células H.4.ILE. Los resultados de los ensayos de dosis individual se usaron para seleccionar un subconjunto de dúplex TTR ARNds para los experimentos de respuesta a la dosis para calcular la IC50. Los resultados de IC50 se usaron para seleccionar los TTR ARNds para su evaluación posterior.

Cultivo de células y transfecciones : Las lineas de células hepatocitarias HepG2, Hep3B y H.4.IL.E (ATCC, Mannassas, VA) se cultivaron casi a confluencia a 37 °C en una atmósfera de 5% de C02 en medio Tagle modificado de Dulbecco (ATCC) suplementado con 10% de FBS, estreptomicina, y glutamina (ATCC) antes de ser liberadas de las placas por tripsinización . Las células H.4.ILE se cultivaron en medio esencial mínimo de Earle. La transfección invertida se llevó a cabo agregando 5 µ? de Opti-MEM a 5 µ? de los dúplex de ARNsi por pozo, en una placa de 96 pozos junto con 10 µ? de Opti-MEM más 0.2 µ? de Lipofectamina RNAiMax por pozo (Invitrogen, Carlsbad CA, #de cat 13778-150) y se incubaron a la temperatura ambiente por 15 minutos. Se agregaron después 80µ1 de medio de cultivo completo sin antibióticos, conteniendo 4xl04 células (HepG2), 2xl04 células (Hep3B) ó 2xl04 células (H.4.IL.E). Las células se incubaron por 24 horas antes de la purificación el ARN . Los experimentos de dosis individual se realizaron a una concentración final de los dúplex de 10 nM y los experimentos de respuesta a la dosis se realizaron con 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 0.0001 nM.

Aislamiento del ARN total usando el Equipo de Aislamiento de ARN Total MagMax-96 (Applied Biosystems, Foster City CA, # de parte: AM1830) .

Las células se recolectaron y se sometieron a lisis en 140 µ? de solución de Lisis/Aglutinamiento, y después se mezclaron por 1 minuto a 850RPM usando un Eppendorf Thermomixer (la velocidad de mezclado fue la misma en todo el proceso) . Veinte microlitros de perlas magnéticas se agregaron al lisado de células y se mezclaron por 5 minutos. Las perlas magnéticas se capturaron usando un soporte magnético y el sobrenadante se removió sin perturbar las perlas. Después de remover el sobrenadante, las perlas magnéticas se lavaron con la Solución de Lavado 1 (con isopropanol agregado) y se mezclaron por 1 minuto. Las perlas se capturaron otra vez y el sobrenadante se removió. Las perlas se lavaron entonces con 150µ1 de la Solución de Lavado 2 (Etanol agregado) , se capturaron y el sobrenadante se removió. Entonces se agregaron 50 µ? de la mezcla de DNasa (Amortiguador de DNasa MagMax turbo y DNasa Turbo) a las perlas y estas se mezclaron por 10 a 15 minutos. Después del mezclado, se agregaron 100 µ? de Solución de Reenlace de ARN y se mezclaron por 3 minutos. El sobrenadante se removió y las perlas magnéticas se lavaron otra vez con 150 µ? de Solución de Lavado 2 y se mezclaron por 1 minuto, y el sobrenadante se removió completamente. Las perlas magnéticas se mezclaron por 2 minutos a sequedad antes que el ARN fuera eluido con 50 µ? de agua.

Síntesis de ADNc usando el Equipo de transcripción invertida de ADNc de alta capacidad ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, # de Cat: 4368813) : Una mezcla principal de 2µ1 de Amortiguador 10X, 0.8µ1 de dNTPs 25 X, 2µ1 de Cebadores aleatorios, ?µ? de Transcriptasa Inversa, ?µ? de inhibidor de RNasa y 3.2 µ? de H20 por reacción, se agregó a ??µ? de ARN total, el ADNc se generó usando un reciclador térmico Bio-Rad C-1000 o S-1000 (Hercules, CA) a través de los siguientes pasos: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 seg, 4°C acumulados.

PCR de -tiempo real : 2µ1 de ADNc se agregaron a una mezcla principal de ?µ? de Sonda TaqMaN 18S (Applied Biosystems, # de Cat; 4319413E) , ?µ? de sonda TTR TaqMan (Applied Biosystems, # de Cat: HS00174914 Mi) y 10 µ? de Mezcla Principal PCR Universal TaqMan (Applied Biosystems, # de Cat: 4324018) por pozo, en una Placa de 96 pozos Óptica MicroAmp (Applied Biosystems, # de Cat: 4326659) . La PCR en tiempo real se realizó en un sistema PCR en Tiempo Real ABI 7900HT (Applied Biosystems) usando el ensayo ?? Ct (RQ) . Todas las reacciones se realizaron por triplicado.

Los datos en tiempo real se analizaron usando el método ?? Ct y se normalizaron con los ensayos llevados a cabo en células transfectadas con Oligo fluorescente blockIT ???? (Invitrogen, # de Cat: 2013) o AD-1955 10 nM (un dúplex de control que se enfoca en el gen de luciferasa no mamífero) para calcular el grado de cambio.

Ensayos de ADN ramificado-QuantiGene 1.0 (Panomics, Fremont, CA, # de Cat: QG0004) - Usado para identificar los dúplex específicos de roedor Células H.4.IL.E (ATCC) se transfectaron con ARNsi 10 nM. Después de remover el medio las células H.4.IL.E se sometieron a lisis en 100 ul de Mezcla de Lisis Diluida (una mezcla de 1 volumen de Mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua sin nucleasa y 10 ul de Proteinasa-K por mi, para una concentración final de 20mg/ml) después se incubaron a 65°C por 235 minutos. Entonces se agregaron a la Placa de Captura 80 µ? de Conjunto de Sondas de Trabajo (una mezcla de sonda TTR o GAPDH) y 20 ul de lisado de células) . Las Placas de Captura se incubaron a 53°C±1°C durante toda la noche (aproximadamente 16-20 hrs.) . Las placas de captura se lavaron 3 veces con amortiguador de Lavado IX (una mezcla de agua sin nucleasa, Componente Amortiguador 1 y Componente 2 del Amortiguador de Lavado) , después se secaron por centrifugación por 1 minuto a 1000RPM. Se agregaron a las Placas de Captura 100 µ? de Reactivo de Trabajo amplificador, las cuales se sellaron entonces y se incubaron por 1 hora a 46°C±1°C. Los pasos de lavado y secado se repitieron después de 1 hora de la incubación y se agregaron ???µ? de Reactivo de solución de Etiquetado. Las placas se lavaron entonces, se secaron y se agregaron ???µ? de substrato (una mezcla de Lauril sulfato de Litio y solución de Substrato) . Las Placas de Captura se colocaron en un incubador por 30 minutos a 46°C±1°C. Las Placas de Captura se removieron del incubador y se incubaron a la temperatura ambiente por 30 minutos. Finalmente, las Placas de Captura se leyeron usando el Luminómetro Víctor (Perkin Elmer, altham, MA) .

Ensayo de ADN Ramificado-QuantiGene 2.0 (Panomics, # de Cat: QS0011) : Usado para identificar todos los otros dúplex Después de una incubación de 24 horas a la dosis o las dosis establecidas, el medio de removió y las células se sometieron a lisis en lOOul de Mezcla de Lisis 81 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua sin nucleasa y ??µ? de Proteinasa-K/ml para una concentración final de 20 mg/ml) después se incubaron a 65°C, por 35 minutos. Después se agregaron a las Placas de Captura 20µ1 del conjunto de Sondas de Trabajo (sonda TTR para el gen objetivo y GAPDH para el control endógeno) y 80µ1 de lisado de células. Las Placas de Captura se incubaron a 55°C++1°C (aproximadamente 16-20hrs) . El siguiente día, las Placas de Captura se lavaron 3 veces con IX Amortiguador de Lavado (agua sin nucleasa, Componente de Amortiguador 1), después se secaron por centrifugación por 1 minutos a 240g. Se agregaron a las Placas de Captura ???µ? de Reactivo de Trabajo pre-Amplificador , las cuales se sellaron con papel aluminio y se incubaron por 1 hora a 55°C±1°C. Enseguida de una 1 hora de incubación, se repitió el paso de lavado, después se agregaron ???µ? de Reactivo de Trabajo de Etiquetado. Después de 1 hora, los pasos de lavado y secado se repitieron, y se agregaron ???µ? de Sonda de Etiquetado. Las Placas de Captura se incubaron a 50°C±1°C por 1 hora. Las placas se lavaron entonces con IX Amortiguador de Lavado y se secaron, y después se agregaron a las Placas de Captura ???µ? de substrato. Las Placas de Captura se leyeron usando el Luminómetro SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) enseguida de 5 a 15 minutos de incubación.

Análisis de Datos de ADNb : Los datos de ADNb se analizaron (i) restando el fondo promedio de cada muestra triplicada, (ii) promediando los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) triplicados, resultantes, y después (iii) tomando la relación: (sonda experimental-fondo) /( sonda de control-fondo).

Resultados Un resumen de los resultados de dosis única y de IC50 para los TTR-ARNds (TTR ARNsi) se presenta a continuación en la Tabla 8. Los resultados de dosis individual se expresan como % TTR ARNm con relación al control, analizado en las células HepG2. Las IC50 se determinaron en células HepG2 y/o Hep3B, como se indica.

Tabla 8. Resultados de dosis individual e IC50 para las identificaciones in vitro de TTR ARNsi ND: sin datos; * indica los resultados que representan un promedio de dos experimentos. dosis Individual a 10nM % con relación al control IC50 (nM) HerpG2 HepG2 Hep3B Dúplex # qPCR bDNA qPCR bDNA oPCR bDNA AD- 18243 50.35 141.53 ND ND ND ND AD- 18244 64.26 158.55 ND ND ND ND AD- 18245 56.89 107.22 ND ND ND ND AD- 18246 10.53 32.51 * 0.265 0.086 ND ND AD- 18247 125.56 69.57 ND ND ND ND AD- 18248 127.78 66.97 ND ND ND ND AD- 18249 48.77 48.76 ND ND ND ND AD- 18250 96.94 86.42 ND ND ND ND AD- 18251 170.41 129.15 ND ND ND ND AD-18252 73.52 81.90 ND ND ND ND AD- 18253 25.25 61.25 ND ND ND ND AD- 18254 95.13 103.96 ND ND ND ND AD- 18255 1 19.46 ND ND ND ND ND AD- 18256 42.64 95.67 ND ND ND ND AD- 18257 146.25 141.75 ND ND ND ND AD- 18258 10.20 13.41 * 0.007 0.005 0.004 0.005 AD- 18259 9.30 20.91 * 0.1 02 0.005 ND ND AD- 18260 125.37 81.36 ND ND ND ND AD- 18261 14.27 19.40* 0.210 ND ND ND AD- 18262 84.95 104.05 ND ND ND ND AD- 18263 16.32 23.25* 0.1 10 ND ND ND AD- 18264 104.18 83.69 ND ND ND ND AD- 18265 41.62 64.87 ND ND ND ND AD- 18266 39.98 1 10.53 ND ND ND ND AD- 18267 149.64 ND ND ND ND ND AD- 18268 152.93 174.04 ND ND ND ND AD- 18269 37.27 92.28 ND ND ND ND AD- 18270 99.44 164.75 ND ND ND ND AD- 18271 18.89 28.33* 0.503 0.004 ND ND AD- 18272 128.32 132.58 ND ND ND ND AD- 18273 1 15.78 201.95 ND ND ND ND AD- 18274 8.97 20.04* 0.009 0.176 0.036 0.012 AD- 18275 4.09 22.25* 0.026 0.1 18 ND ND AD- 18276 19.73 45.22* 0.198 0.677 ND ND AD- 18277 10.55 26.31 * 0.121 0.426 ND ND AD- 18278 108.86 1 16.26 ND ND ND ND AD- 18279 66.59 ND ND ND ND ND AD- 18280 103.26 170.52 ND ND D ND AD- 18281 87.98 123.88 ND ND ND ND AD- 18282 82.47 140.32 ND ND ND ND AD- 18283 106.54 182.78 ND ND ND ND AD- 18284 106.93 151.78 ND ND ND ND AD- 18285 26.58 60.05* ND 0.089 ND ND AD- 18286 109.95 173.66 ND ND ND ND AD- 18287 54.23 155.45 ND ND ND ND AD- 18288 73.52 174.09 ND ND ND ND AD- 18289 103.36 174.76 ND ND NO ND dosis Individual a lOnM % con relación al control IC50 (nM) HerpG2 HepG2 Hep3B Dúplex # qPCR bDNA qPCR bDNA qPCR bDNA AD- 18290 17.06 52.04* 1.253 0.181 ND ND AD- 18291 7.71 169.29* 1.304 0.019 ND ND AD- 18292 7.51 210.03* 0.604 0.005 ND ND AD- 18293 3.61 62.53* 0.078 .0.003 ND ND AD- 18294 1 1 1.53 107.56 ND ND ND ND AD- 18295 1 15.88 105.37 ND ND ND ND AD- 18296 57.03 38.03 ND ND ND ND AD- 18297 87.69 73.87 ND ND ND ND AD- 18298 10.39 7.25* 0.455 0.008 ND ND AD- 18299 18.79 18.06* 0.895 0.014 ND ND AD- 18300 108.70 ND ND ND ND ND AD- 18301 1 14.22 70.50 ND ND ND ND AD- 18302 1 16.19 122.40 ND ND ND ND AD-18303 124.89 ND ND ND ND ND AD- 18304 132.99 89.54 NO ND ND ND AD- 18305 153.10 ND ND ND ND ND AD- 18306 159.22 ND ND ND ND ND AD- 18307 1 16.83 84.57 ND ND ND ND AD- 18308 156.72 87.80 ND ND ND ND AD- 18309 1 13 .22 101.97 ND ND ND ND AD-18310 132.33 ND ND ND ND ND AD-1831 1 161.68 92.92 ND ND ND ND AD-18312 103.01 71.17 ND ND ND ND AD-18313 120.65 53.26 ND ND ND ND AD-18314 1 16.33 ND ND ND ND ND AD-18315 1 15.13 ND ND ND ND ND AD-18316 1 18.73 122.34 ND ND ND ND AD-18317 1 14.03 121.10 ND ND ND ND AD-18318 80.85 122.57 ND ND ND ND AD-18319 1 19.14 148.87 ND ND ND ND AD- 18320 22.86 55.43* ND 0.023 0.403 ND AD- 18321 6.44 31.56* 0.001 0.033 ND ND AD- 18322 54.21 100.46 ND ND ND ND AD- 18323 6.37 28.71 * 0.005 0.023 ND ND AD- 18324 2.53 15.98* 0.002 0.006 0.005 0.014 AD- 18325 2.52 1 1.96* 0.001 0.016 ND ND AD- 18326 18.34 43.16* 0.025 0.186 ND ND AD-18327 18.28 13.90* 0.044 0.215 ND ND AD-18328 4.53 26.04* 0.003 0.004 0.006 0.006 AD- 18329 96.93 131.54 ND ND ND ND AD- 18330 1 1.80 45.18* 0.0004 0.010 0.020 ND AD- 18331 1 17.77 163.07 ND ND ND ND AD- 18332 1 1.53 35.09* 0.001 0.076 0.065 ND AD-18333 12.24 46.94* 0.001 0.1 15 0.075 ND AD- 18334 16.27 55.28* 0.0004 0.181 1.071 ND AD-18335 53.52 1 12.80 ND ND ND ND AD- 18336 6.39 33.00* 0.001 0.1 12 0.081 ND AD- 18337 51.77 105.33 ND ND ND ND AD- 18338 48.21 102.86 ND ND ND ND AD-18339 6.48 26.56* 0.004 0.002 0.018 0.029 dosis Individual a lOnM % con relación al control IC50 (nM) HerpG2 HepG2 Hep3B Dúplex # qPCR bDNA qPCR bDNA qPCR bDNA AD- 18340 4.53 30.76* 0.002 0.002 ND ND AD- 18341 31.27 100.41 ND ND ND ND AD-18342 7.60 42.89* ND 0.016 0.076 ND AD-18343 3.42 17.45* ND 0.001 ND ND AD- 18344 75.08 134.31 ND ND ND ND AD- 18345 13.62 42.75* 0.002 0.013 ND ND AD- 18346 59.25 121.10 ND ND ND ND AD- 18347 91.23 139.54 ND ND ND ND AD-18348 89.95 159.29 ND ND ND ND AD- 18349 108.01 144.96 ND ND ND ND AD- 18350 123.65 125.87 ND ND ND ND AD- 18351 108.36 104.02 ND ND ND ND AD- 18352 87.82 128.72 ND ND ND ND AD-18353 14.40 65.77 0.012 0.027 ND ND AD-18354 99.27 123.53 ND ND ND ND AD-18355 135.04 150.88 ND ND ND ND AD- 18356 100.76 178.96 ND ND ND ND AD-18357 125.30 162.85 ND ND ND ND AD-18358 103.15 136.01 ND ND ND ND AD- 18359 34.74 140.48 ND ND ND ND AD- 18360 103.86 146.86 ND ND ND ND AD- 18361 105.74 152.74 ND ND ND ND AD- 18362 106.96 188.22 ND ND ND ND AD- 18363 124.22 58.46 ND ND ND ND AD- 18364 1 13.75 66.87 ND ND ND ND AD- 18446 29.73 13.30 ND ND ND ND AD- 18447 109.74 53.63 ND ND ND ND AD- 18448 22.96 8.81 ND ND ND ND AD- 18449 1 12.59 50.1 1 ND ND ND ND AD- 18450 89.41 34.89 ND ND ND ND AD- 18451 74.35 23.88 ND ND ND ND AD- 18452 125.25 54.86 ND ND ND ND AD- 18453 126.98 56.31 ND ND ND ND AD- 18454 1 13.88 52.48 ND ND ND ND AD- 18455 163.00 48.89 ND ND ND ND AD- 18456 15.70 10.52 ND ND ND ND AD- 18457 12.86 8.22 ND ND ND ND AD- 18458 13.00 7.00 ND ND ND ND AD- 18459 14.41 10.72 ND ND ND ND AD- 18460 121.16 74.87 ND ND ND ND AD- 18461 100.53 71.87 ND ND ND ND AD- 18462 47.75 29.35 ND ND ND ND AD- 18463 58.98 44.79 ND ND ND ND Los datos de respuesta a la dosis usados para identificar la IC50 para 5 TTR-ARNds (AD-18258, AD-18274, Ad-18324, AD-18328, y AD-18339) , se presentan en detalle a continuación en la Tabla 9. Se determinó que los 5 ARNsi tenían IC50 pM. Los datos de IC50 para los ARNds de la Tabla 8 son un resumen de los datos presentados en la Tabla 9 de aba o .

Tabla 9. Datos de respuesta a la dosis para 5 TTR-ARNds % de Inhibición con relación al control AD-1955 Dúplex AD-18339 Dosis del dúplex (nM) Tipo de Método de 10 1 0.5 0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001 0.00005 0.00001 IC50 células detección (nM) HepG2 qPCR 6.27 7.28 Nd 1 1 15.25 38.69 38.78 71.7 84.09 62.2 75.61 85.46 0.004 HepG2 bDNA 15.1 8.14 5.13 6.89 12.17 32.14 42.98 64.01 60.76 79.95 81.97 95.43 0.002 Hep3B qPCR 8.3 9.47 13.2 34.5 44.54 77.38 81.04 81.41 93.95 81.04 75.61 78.28 0.018 Hep3B bDNA 10.5 9.43 1 1.7 27.1 44.88 72.32 79.88 79.6 87.46 96.53 95.13 89.88 0.029 Un resumen de los resultados de dosis individual para los TTR-ARNds específicos de roedor (TTR ARNsi) se representa a continuación en la Tabla 10. Los resultados de dosis individual se expresan como % de TTR ARNm con relación al control, analizado en células H.4.IL.E de rata, después de la transfección de los TTR ARNsi específicos de roedor a 10 nM. Estos resultados muestran que algunos TTR ARNsi específicos de roedor son efectivos para suprimir el TTR ARMm endógeno de rata in vitro.

Tabla 10. Resultados de dosis individual de la identificación in vitro de TTR-ARNds específicos de ratón (TTR ARNsi) # de Dúplex % con Relación al control a 10 # de dúplex % con Relación al control a 10 nM nM AD-18529 19.83 AD-18542 6.3 AD-18530 44.49 AD-18543 16.46 AD-18531 6.01 AD-18544 17.55 AD-18532 24.06 AD-18545 3.53 AD-18533 37.78 AD-18546 2.75 AD-18534 8.19 AD-18547 7.01 AD-18535 10.18 AD-18548 5.02 AD-18536 16.13 AD-I 8549 1.61 AD-18537 15.88 AD-18550 9.58 AD-18538 19.93 AD-18551 7.74 AD-18539 49.24 AD-18552 3.74 AD-18540 2.99 AD-18553 50.39 AD-18541 1.32 AD-18554 1 1 1.06 Ejemplo 3. Ensayo in vitro de los TTR AKNsi para la inducción de la secreción de TNF-cx e IFN-ct Para evaluar el potencial de inmunoestimulación, los TTR ARNsi se analizaron in vitro por la inducción de la secreción de TNF-a e IFN-a.

Las PBMC se aislaron de capas leucocitarias recién obtenidas de donadores saludables (Research Blood Components, Inc., Boston, MA) mediante centrifugación de densidad Ficoll-Hypaque. Las células recién aisladas ( 1?105/????/100µ1 ) se sembraron en placas de 96 pozos y se cultivaron en medio RPMI 1640 GlutaMax (Invitrogen) suplementario con 10% de suero de bovino fetal desactivado por valor y 1% de antibiótico/antimicótico (Invitrogen) .

Los ARNsi se transíectaron en las PMRC usando el reactivo de transfección DOTAP (Roche Applied Science) . El reactivo DOTAP se diluyó primero en Opti-MEM (Invitrogen) por 5 minutos antes de mezclarlo con un volumen igual de Opti-MEM conteniendo los ARNsi. Los complejos ARNsi/DOTAP se incubaron como lo especifican las instrucciones del fabricante y posteriormente se agregaron a las PBMC (50µ1/????) las cuales se cultivaron entonces por 24 horas. Los ARNsi de control positivo y negativo se incluyeron en todos los ensayos. Se uso AD-5048 como un ARNsi de control positivo. El AD-5048 corresponde a una secuencia que se enfoca en la Apolipoproteina B humana (Soutschek et al., 2004) y provoca la secreción tanto de I FN -OÍ y TNF- en este ensayo. AD-1955, la cual no provoca la secreción de I FN-a y TNF-a en este ensayo, se uso como un ARNsi de control negativo. Todos los ARNsi se usaron a una concentración final de 133 nM. La proporción de ARN a reactivo de transfección fue de 16.5 pmol por µg de DOTAP .

Las citocinas se detectaron y se cuantificaron en los sobrenadantes del cultivo con un equipo ELISA para IFN-a (BMS216INST) y TNF-a (BMS223INST) , disponible comercialmente, ambos de Bender edSystems (Viena, Austria) . La inducción de la citocina por TTR ARNsi se expresa como el porcentaje de IFN-ot o TNF-a producida con relación al ARN de control positivo, AD-5048.

Los resultados de estimulación de la IFN-a y la TNF-a para un número de TTR ARNsi se presentan en la Fig. 1 (promedio de pozos por cuadruplicado ± SD) y a continuación en la Tabla 11 (porcentaje comparado con AD-50489. ninguno de los TTR ARNsi evaluados indujo una secreción significativa de TNF-a o IFN-a por las PBMC humanas cultivadas.

Tabla 11. Resultados de la estimulación de IFN-ot y TNF-ot para los TTR ARNsi Los cinco primeros TTR que se enfocan en los ARNds (TTR ARNsi) se seleccionaron con base en las IC50 en el rango pM en las lineas celulares hapatocitarias humanas HepG2 y Hep3B, y la ausencia de actividad inmunoestimulante . Es más probable que los dúplex sin ninguna no coincidencia logren una agenicidad significativa del transcripto objetivo que los dúplex con no coincidencias entre el oligo y el ARNm. Para permitir una mejor interpretación de los datos toxicológicos inter-especies y para tener la aplicabilidad más amplia para pacientes humanos, los dúplex que tienen 1005 de identidad en los genes ortólogos de rata, mono cynomolgus y humano, y que no se enfocan en las regiones con polimorfismo conocido se refieren en general, los cinco compuestos principales se seleccionaron con base en la IC50 en las lineas celulares hepatocitarias en el rango de pM, la ausencia de actividad inmunoestimulante, especificidad para los transcriptos de TTR humanos, y la ausencia de polimorfismos conocidos (mutaciones) en la región del ARNm buscada como objetivo por lo dúplex. En el caso del TTR, no se encontraron oligos de 19 bases con identidad completa en los humanos, ratas y monos cynomolgus. Un resumen de estos datos se presenta en la Tabla 12, la cual también incluye la información sobre las mutaciones conocidas de TTR en la región buscada como objetivo por el dúplex y la reactividad inter-especies. # de IC50 IC50 IFNa/TNFa Mutaciones Reactividad inter-especies Dúplex (qPCR): (bDNA): no cubiertas nM nM HepG2 HepG2 AD-18258 0.007 0.005 Negativo Ninguna Cyno: 1 no coincidencia en la posición 14 A (región no a G codificante) Rata: sin homología en ninguna posición AD- 18274 0.009 0.176 Negativo Lys70Asn; Cyno: sin no coincidencias Val71Ala; Rata: sin homología en ninguna posición Ile73Val; Asp74His AD- 18324 0.002 0.006 Negativo Ninguna Cyno: sin no coincidencias (región no Rata: sin homología en ninguna posición codificante) AD-18328 0.003 0.004 Negativo Ninguna Cyno: sin no coincidencias (región no Rata: 7 no coincidencias codificante) AD-18339 0.004 0.002 Negativo Ninguna Ninguna (región no codificante) E emplo 4. Reducción un vivo del TTR ARNm del hígado y la proteina TTR del plasma por LNP01-18324, L P01-18328 y LNP01-18246 en ratones transgénicos Dos TTR ARNsi, AD-18324 y AD-18328 se eligieron para la evaluación in vitro. Estos dúplex exhiben silenciamiento potente dependiente de la dosis in vitro, en las líneas celulares hepatocitarias (por ejemplo, HepG2 ) . La FIG. 2A y la FIG. 2B muestran las respuestas a la dosis en células HepG2 después de la transfección con AD-18324 (FIG. 2A) o AD-18328 (FIG. 2B) donde las dosis se expresan en mM en el eje x y las respuestas se expresan como la fracción de TTR ARNm que permanece con relación al control, en el eje y. En las células HepG2, las IC50 de AD-18324 y AD-18328 se determinaron como 2 pM y 3 pm respectivamente. Los sitios objetivo de la TTR para ambos ARNds candidatos principales están en la región 3' no traducida del TTR ARNm, en una región donde no se han reportado mutaciones en la literatura.

Las secuencias de cada hebra de los dos candidatos principales se reproducen debajo de las tablas. Hebra: s= sentido; as=antisentido; Posición: posición de la base 5' en el transcripto NM 000371.2 Además, un TTR ARNds de ratón con reactividad, cruzada, AD-18246, eligió para la evaluación posterior in vivo. AD-18246 se enfoca en una secuencia que comienza en la posición 88 del marco de lectura abierto, donde hay tres mutaciones reportadas en la literatura. Una curva de respuesta a la dosis para Ad-18246 en células HepG2 se muestra en la FIG. 3. AD-18246 es substancialmente menos potente que AD-18324 y AD-18328; la IC50 de AD-18246 se determinó como 265 pM.

AD-18324, AD-18328, y AD-18246 se administraron a ratones transgénicos después de la formulación en LNP01. A ratones transgénicos H-129-mTTR-KO/iNOS-KO/hTTR de 3-5 meses de edad (ratones agenicos para transtiretina/agenicos para óxido nítrico sintasa inducible/ transgénicos para transtiretina humana) se les administraron intravenosamente (IV) 200 µ? de LNP01 ARNsi específico para transtiretina formulado con LNP01 (AD-18324, AD-18328, o AD-18246) , el ARNsi de control formulado con LNP01 que se enfoca en el gen de luciferasa no mamífero (AD-1955) o PBS, vía la vena de la cola, a concentraciones de 1.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, o 6.0 mg/kg para los ARNsi AD-18324 y AD-18328, 3.0 mg/kg para el ARNsi AD-18246 y 6.0 mg/kg para el ARnsi Ad-1955. El LNP01 es una formulación lipidoide compuesta de ND98, colesterol, y PEG-Ceramida C16.

Después de aproximadamente cuarenta horas, los ratones se anestesiaron con 200 µ? de ketamina, y después se exsanguinaron cortando la arteria caudal derecha. La sangre completa se aisló y el plasma se separó y se almacenó a -80°C hasta el ensayo. El tejido del hígado se recolectó, se sometió a congelación instantánea y se almacenó hasta el procesamiento .

La eficacia se evaluó mediante (i) medición del TTR ARNm en el hígado 48 horas después de la dosis, y (ii) medición de la proteína TTR en el plasma antes del sangrado y a las 48 horas después de la dosis. Los niveles de TTR ARNm en el hígado se analizaron utilizando ensayos de ADN Ramificado QuantiGene (Panomics, # de Cat : QS0011) . En resumen, las muestras de hígados de ratón se trituraron y se prepararon lisados del tejido. La mezcla de lisis de hígado (una mezcla de 1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua libre de nucleasa y lOul de Proteinasa-K/ml para una concentración final de 20 mg/ml) se incubó a 65°C por 35 minutos. Se agregaron a Placas de Captura 20 µ? del Conjunto de Sondas de Trabajo (sonda TTR para el gene buscado como objetivo y GAPDH para en control endógeno) y 80 ul de lisado de tejido. Las Placas de Captura se incubaron a 55°C±1°C (aproximadamente 16-20 hrs) . El siguiente día, las Placas de Captura se lavaron 3 veces como IX Amortiguador de Lavado (agua libre de nucleasa, Componente de Amortiguador 1 y Componente de Amortiguador de Lavado 2), después se secaron mediante centrifugación por 1 minuto a 240g. Se agregaron a las Placas de Captura 100 ul de Reactivo de Trabajo pre-amplificador , las cuales se sellaron con papel aluminio y se incubaron por 1 hora a 55°C±1°C. Enseguida de 1 hora de incubación, el paso de lavado se repitió, después se agregaron ???µ? de Reactivo de Trabajo Amplificador. Después de 1 hora, los pasos de lavado y secado se repitieron, y se agregaron ???µ? de Sonda de Etiquetado. Las Placas de Captura se incubaron a 50°C ±1°C por 1 hora. Las placas se lavaron entonces con IX Amortiguador de Lavado, se secaron y se agregaron ???µ? de substrato a las Placas de Captura. Las Placas de Captura se leyeron usando el Luminómetro Spectra ax enseguida de 5 a 15 minutos de incubación. Los datos de ADNb se analizaron restando el fondo promedio de cada muestra triplicada, promediando los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) triplicados, resultantes, y después calculando la relación (sonda experimental-fondo) / (sonda de control-fondo).

Los niveles de TTR del plasma se analizaron utilizando el equipo disponibles comercialmente "Equipo ELISA de Prealbúmina Humana AssayMax" (AssayPro, St Charles, O, #de Catalogo: EP3010-1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Concretamente. El plasma de ratón se diluyó 1:10,000 en IX mezcla de diluentes y se agregó a placas revestidas previamente con los estándares del equipo, y se incubó por 2 horas a la temperatura ambiente seguido por 5x lavados con el amortiguador de lavado del paquete. Cincuenta microlitros de anticuerpo prealbúmina biotinilado se agregaron a cada pozo y se incubaron por 1 hr a la temperatura ambiente, seguido por 5X lavados con amortiguador de lavado. Cincuenta microlitros de conjugado de estreptavidina-peroxidasa se agregaron a cada pozo y las placas se incubaron por 30 minutos a la temperatura ambiente, seguido por lavado como se describe previamente. La reacción se desarrollo por la adición de 50 µ?/???? de substrato cromógeno e incubación por 10 minutos a la temperatura ambiente con detención de la reacción mediante la adición de 50 µ?/???? de solución de detención. La absorbancia a 450 nm se leyó en un lector de microplacas Versamax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y los datos se analizaron utilizando el paquete informático Sofmax 4.6 (Molecular Devices) .

Se encontró que LNP01-18324 y LNP01-18328 reducen los niveles de TTR ARNm del hígado (FIG. 4A) y de la proteína TTR del plasma (FIG. 4B) en una manera dependiente de la dosis con la administración de bolo IV. La ED50 de ARNm de LNP01-18328 se determinó como ~1 mg/kg en tanto que la ED50 de LNP01-18324 se determinó como ~2 mg/kg. Los efectos de LNP01-18324 y LNP01-18328 fueron específicos, puesto que el control, LNP01-1955 a 6 mg/kg no afecta significativamente los niveles de TTR ARNm del hígado en comparación con el grupo de PBS. LNP01-18324 y LNP01-18328 reducen los niveles de proteína TTR del plasma con relación al grupo de PBS, con potencias que son similares a aquellas en los niveles de TTR ARNm. A 3 mg/kg LNP01-18246 reduce los niveles de TTR ARNm del hígado a una extensión menor que 3 mg/kg de LNP01-18324 o LNP01-18328.

Estos resultados demuestran que LNP01-18324 y LNP01-18328, administrados por bolo IV, reducen sustancialmente el TTR ARNm humano expresado por el hígado de ratones transgénicos, lo cual resulta en la reducción de la proteína TTR humana en la circulación.

E emplo 5. Reducción un vio del TTR ARNm de tipo silvestre en el hígado de primates no humanos por SNALP-18324 y SNALP-18328 Para evaluar la eficacia de los TTR ARNsi Ad-18324 y AD- 18328 en los niveles de TTR ARNm en el hígado de primates no humanos, los ARNsi se formularon en SNALP y se administraron mediante infusión de 15 minutos. A monos Cynomolgus (Macaca fascicularis ) (2 a 5 kg, 3 animales por grupo) se les administró una infusión IV de 15 minutos de SNALP-18324 (0.3, 1.0 o 3.0 mg/kg), SNALP-18328 (0.3, 1 o 3 mg/kg) o SNALP-1955 (3 mg/kg, con el ARNsi de control negativo Ad-1955 el cual tiene como objetivo el gen de luciferasa no mamífero) . A las cuarenta y icho horas después de la dosificación, los monos se anestesiaron con pentobarbital sódico y se exanguinaron . Se recolectó tejido del hígado para la determinación del TTR ARNm, se sometió a congelación instantánea, y se almacenó a -80°C hasta el procesamiento.

Los niveles de TTR ARNm en el hígado se analizaron utilizando un ensayo de ADN ramificado diseñado de manera acostumbrada, utilizando la tecnología QuantiGene 1.0. En concreto, las muestras de hígado de los modos se trituraron y se prepararon lisados de tejido. La mezcla de lisado del hígado (1 volumen de mezcla de lisis, 2 volúmenes de agua libre de nucleasa, y ??µ? de Proteinasa-K/ml para una concentración final de 200 mg/ml) se incubaron a 65°C por 35 minutos. 20µ1 del Conjunto de Sondas de Trabajo (sonda TTR para el gen objetivo y GAPDH para el control endógeno) y 80µ1 de lisado de tejido se agregaron entonces a Placas de Captura. Las Placas de Captura se incubaron a 55°C±1°C (aproximadamente 16-20 horas) . El siguiente día, las Placas de Captura se lavaron tres veces como IX Amortiguador de Lavado (agua libre de nucleasa, Componente de amortiguador 1 y Componente de Amortiguador de Lavado 2), después se secaron mediante centrifugación por 1 minuto a 240g. Se agregaron a las Placas de Captura 100 µ? de Reactivo de Trabajo pre-Amplificador , las cuales se sellaron con papel aluminio y se incubaron por 1 hora a 55°C±1°C. Enseguida de una 1 de incubación, se repitió el paso de lavado, y después se agregaron ???µ? de Reactivo de Trabajo Amplificador. Después de 1 hora, se repitieron los pasos de lavado y secado y se agregaron 100 µ? de Sonda de Etiquetado. Las Placas de Captura se incubaron a 50°C±1°C por 1 hora. Las placas se lavaron entonces con IX Amortiguador de Lavado y se secaron, y después se agregaron ???µ? de Substrato a las Placas de Captura. Las placas de captura se leyeron usando el Luminómetro SpectraMax enseguida de una incubación de 5 a 15 minutos. Los datos de ADNb se analizaron mediante (i) restando al fondo promedio de cada muestra triplicada, (ii) promediando los valores de GAPDH (sonda de control) y TTR (sonda experimental) y después (ii) tomando la relación: (sonda experimental-fondo) /( sonda de control-fondo) .

Los resultados se muestran en la FIG. 5. SNALP-18324 y SNALP-18328 redujeron los niveles de TTR ARNm en el hígado en una manera dependiente de la dosis, en comparación con el control negativo SNALP-1955. La ED50 de ARNm de SNALP-18328 y SNALP-18324 se determinaron como ~0.3 y 1 mg/kg respectivamente .

Estos resultados demuestran que SNALP-18324 y SNALP-18328 son efectivos para suprimir el TTR ARNm de tipo silvestre en el hígado de primates no humanos, cuando se administran por infusión IV.

Ejemplo 6. Reducción in vivo de TTR ARNm mutante (V30M)y proteína por SNALP-18328 en ratones transgénicos Para evaluar la eficacia del TTR ARNsi, AD-18328 sobre TTR ARNm mutante (V30M) en el hígado y la proteína TTR mutante (V30M) en el suero, AD-18328 se formuló en SNALP y se administró mediante bolo IV a ratones transgénicos V30M hTTR. A ratones transgénicos V30 hTTR de 8-12 semanas de edad 85 animales/grupo) se les administraron intravenosamente 200 µ? de SNALP-18328 80.03, 0.3, o 3 mg/kg), SNALP-1955 (3 mg/kg, con el control negativo ARNsi AD-1955 el cual tiene como objetivo la luciferasa de gen no mamífero), o PBS. Los ratones usados fueron de la cepa Mus musculus H129-hTTR KO del Institute of molecular and Cellular Biology, Porto, Portugal. En concreto, los ratones transgénicos hTTR H129 se cruzaron con ratones TTR KO endógenos H129 (ratones nulos, para generar los ratones transgénicos H129-hTTR, en un fondo de TTR de ratones nulos (Maeda, S., (2003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl. 1, 17-20) .

A las 48 horas después de la inyección, a los animales de los cinco grupos de tratamiento se les proporcionó una dosis letal de ketamina/xilazina . Se recolectaron muestras de suero y se almacenaron a -80°C hasta el análisis. Se recolectó el tejido del hígado, se sometió a congelación instantánea y se almacenó a -80°C hasta el procesamiento.

Para la cuantificación del TTR ARNm, el tejido congelado del hígado se convirtió en polvo mediante trituración, y se prepararon lisados. Los niveles de TTR ARNm con relación a los del GAPDH ARNm se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA) . En concreto, el ensayo QuantiGene (Genospectra) se uso para cuantificar los niveles de ARNm en los lisados de muestras de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel medio de TTR ARNm se normalizo al nivel medio de GAPDH ARNm para cada muestra. Los promedios por grupo de los valores normalizados se normalizaron entonces al valor promedio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de la expresión de TTR ARNm.

Para la cuantificación de la proteína TTR, el suero se analizó usando el Paquete ELISA Prealbúmina Assaymax de AssayPro (St. Charles, O) de acuerdo con el protocolo del fabricante .

Los resultados se muestran en la FIG. 6A y la FIG. 6B para el ARNm del hígado y la proteína del suero respectivamente. Ratones transgénicos V30M hTTR tratados con SNALP-18328 tuvieron una reducción dependiente de la dosis y significativa en los niveles de TTR ARNm del hígado con relación al grupo de control de PBS, alcanzando una reducción máxima de 97% (p>0.001) a 3 mg/kg de SNALP-18328, y 50% de reducción (ED50) a -0.15 mg/kg de SNALP-18328. La proteína TTR del suero también fue suprimida en una manera dependiente de la dosis, con una reducción máxima de proteína TTR del suero de 99% (p<0.01) (con relación a los niveles antes de las dosis) a 3 mg/kg de SNALP-18328, consistente con la reducción en los niveles de TTR ARNm. SNALP-1955 a 3 mg/kg no tuvo un efecto significativo sobre los niveles de TTR ARNm o de proteína, en comparación con el PBS.

Estos resultados demuestran que SNALP-18328, cuando se administra IV, tiene actividad en la supresión de V30M TTR ARNm en el hígado de ratones transgénicos, lo cual resulta en la reducción de la proteína V30M TTR mutante en la circulación .

Ejemplo 7. Durabilidad del TTR ARNm y supresión de la proteina por SNALP-18328 en ratones •transgénicos Para evaluar la durabilidad de TTR ARNm y la supresión de la proteína por SNALP-18328, AD-18328 se formuló en SNALP y se administró mediante bolo IV a ratones transgénicos V30M hTTR. En varios puntos de tiempo después de la dosis se cuantificaron los niveles de TTR ARNm del hígado y los niveles de proteína TTR del suero. A ratones transgénicos V30M hTTR de 8-12 semanas de edad (4 animales/grupo) se les administraron intravenosamente (IV) 200 µ? de SNALP-18328 (1 mg/kg) o SNALP-1955 (1 mg/kg) con el control negativo ARNsi AD-1955 el cual tiene como objetivo la luciferasa .de gen no mamífero) . Los ratones usados fueron la cepa de Mus Musculus H129-hTTR KO del Institute of Molecular and Celular Biology, Porto. Portugal. En concreto, los ratones transgénicos hTTR H129 se cruzaron con ratones H129 TTR KO endógeno (ratones nulos, para generar los ratones transgénicos H129-hTTR, en un antecedente TTR de ratones nulos (Maeda, S. (2003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl . 1, 17-20). Los días 3, 8, 15 o 22 después de la dosis, a los animales en ambos grupos de tratamiento se les proporcionó una dosis letal de ketamina/xilazina . Se recolectaron muestras de suero y se almacenaron a -80°C hasta el análisis. Se recolectó tejido del hígado, se sometió a congelación instantánea y se almacenó a -80°C hasta el procesamiento.

Para la cuantificación, el tejido congelado del hígado se convirtió en polvo mediante trituración, y se prepararon lisados. Los niveles de TTR ARNm con relación a los del GAPDH ARNm se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremton, CA) . En concreto, el ensayo QuantiGene (Genospectra) se uso para cuantificar los niveles de ARNm en los lisados de muestras de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel medio de TTR ARNm se normalizó contra el nivel medio de GAPDH ARNm para cada muestra. Los promedios por grupo de los valores normalizados se normalizaron adicionalmente contra el valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de la expresión de TTR ARNm.

Para la cuantificación de la proteina TTR, se analizó el suero usando el Equipo ELISA Prealbúmina AssayMax de AssayPro (St. Charles, MO) de acuerdo con el protocolo del fabricante Los resultados se muestran en la FIG. 7A y la FIG. 7B para el ARNm del hígado y la proteina del suero respectivamente. Una administración única de bolo IV de SNALP-18328 en los ratones hTTR V30M transgénicos resulto en la inhibición duradera de los niveles de TTR ARNm en el hígado y los niveles de proteína en el suero. En comparación con el grupo de control 1 mg/kg de SNALP-1955) , una administración IV individual de SNALP-18328 a 1 mg/kg reduce significativamente los niveles relativos de TTR ARNm los días 3, 8, 15, y 22 después de la dosis, en 96% (p>0.001), 90% (p<0.001), 82% (p<0.001) y 73% (p<0.001), respectivamente, y no regresan a los niveles de referencia a la terminación del estudio (Día 22 después de la dosis) . Los niveles de proteína también se reducen con una reducción máxima de TTR del suero de 97% (p>0.001) (con relación a SNALP-1955) en el día 3 después de la dosis. En los dias 8, 15, y 22 después de la dosis, los niveles de proteína TTR se suprimen al 72% (p<0.005), y 40% (p<0.001), respectivamente, con relación a SNALP-1955.

Estos resultados demuestran que una administración IV única de SNALP-18328 produce la supresión durable del ARNm objetivo del hígado y los niveles séricos de la proteína en ratones transgénicos V30M hTTR, con reducciones significativas tanto de TTR ARNm del hígado y la proteína TTR del suero a los 22 días después de la dosis.

Ejemplo 8. Durabilidad de la supresión de la proteína TTR del suero por SNALP-18328 en primates no humanos Para evaluar la durabilidad de la supresión de la proteína TTR del suero por SNALP-18328, AD-18328 se formuló en SNALP y se administró mediante infusión IV a primates no humanos. En varios puntos de tiempo después de la dosis, se cuantificaron los niveles de la proteína TTR del suero.

A monos cynomolgus (Macacus fascicularis ) (n=5 animales/grupo para los grupos de SNALP-18328 y n=3 animales/grupo para los grupos de SNALP-1955 y PBS) se les administró una infusión IV de 15 minutos de SNALP-18328 (0.3, 1 o 3 mg/kg) , SNALP-1955 (3 mg/kg) con el control negativo ARNsi AD-1955 el cual tiene como objetivo la luciferasa del gen de no mamíferos), o PBS. En los días 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 y 14 de la fase de dosificación, se recolectaron muestras de suero y se almacenaron a -80°C hasta el análisis.

Se uso el análisis de transferencia Western para evaluar los niveles de la proteína TTR en las muestras de suero. Las muestras de suero de cada grupo se reunieron y se diluyeron 1:1 con amortiguador de muestras de Laemmli (se agregó ß-mercaptoetanol a una dilución 1:20). Las muestras se calentaron a 95°C por 10 minutos. Se cargaron 12.5 µ? de cada muestra en cada pista de un gel prep Criterio (Biorad, Hercules, CA) y se separan por SDS-PAGE a 120V por 1.5 horas, después se transfieren a una membrana de nítrocelulosa usando un sistema semi-seco a 15V por 1 hora. La membrana se bloqueó durante toda la noche a 4°C en amortiguador de bloqueo LiCOR (Lincoln, NE) diluido 1:1 con IX PBS. La transferencia se sondeo primero con anticuerpos primarios (anti-TTR de cabra de Santa Cruz (Santa Cruz, CA) a una dilución de 1:1000, diluidos en amortiguador de bloqueo LiCOR/PBS en un agitador por 1 hora a temperatura ambiente. Las transferencias se lavaron 4x con PBS + 0.1· de Tween 20 (10 minutos por lavado) . Los anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente (anti-cabra 680 nm de Invitrogen (Carlsbad, CA) se agregaron a una dilución de 1:10,000 en amortiguador de bloqueo LiCOR/PBS y la transferencia se incubó por 1 hora a la temperatura ambiente. Después de la incubación, las transferencias se lavaron 4X con PBS + 0.2% de Tween 20 seguido por un lavado con lx PBS. El Sistema de Formación de Imágenes Infrarrojas Odyssey de Li-COR se uso para detectar las bandas de proteína. El monómero de TTR migra a 15 kDa .

Los resultados se muestran en la FIG. 8. Los niveles de proteína TTR del suero mostraron una reducción dependiente de la dosis con 1 a 3 mg/kg de SNALP-18328, en compararon con los niveles anteriores a la dosis (Día 0) . La duración de la supresión, enseguida de una administración IV individual de SNALP-18328 es al menos de 14 días después de un tratamiento de 1 o 3 mg/kg de SNALP-18328.

Estos resultados demuestran que una administración IV individual se SNALP-18328 produce la supresión durable de la proteína TTR en la circulación en los primates no humanos (Macaca fascicularis ) , con reducción significativa en la proteína TTR a los 14 días después de la dosis.

Ejemplo 9: Reducción in vivo de TTR mutante (V30M) en los tejidos periféricos por SNALP-18328 en ratones transgénicos Para evaluar la eficacia del SNALP-18328 para reducir la TTR en los tejidos periféricos, ratones agenicos hTTR V30M/HSF-1 se evaluaron con teñido inmunohistoquímico por la TTR. A ratones agenicos hTTR V30M/HSF-1 de dos meses de edad (Maeda, S., (2003), Use of genetically altered mice to study the role of serum amyloid P component in amyloid deposition. Amyloid Suppl . 1, 17-20) se les administró un bolo IV de 3 mg/kg de SNALP-18328 (12 animales), 3 mg/kg de SNALP-1955 (con control negativo ARNsi AD-1955 el cual tiene como objetivo la luciferasa del gen no mamífero, 4 animales), o PBS (4 animales) o una vez cada dos semanas por un total de cuatro dosis los días 0, 14, 28, y 42. Los niveles de TTR ARNm del hígado y la inmuno-reactividad en varios tejidos periféricos se evaluaron a las 8 semanas después de la primera dosis en el día 56.

Los ratones se anestesiaron con 1 mg/kg de medetomidina, y se les proporcionó una dosis letal de ketamina. Los tejidos y los órganos de interés se recolectaron. Para la inmunohistoquímica, el esófago (E) , el estomago (Se) , los intestinos (duodeno (II) y colon (14)), los nervios (N) y los ganglios de la raíz dorsal (D) se fijaron en formalina amortiguada neutra y se insertaron en parafina. Para la detección de la TTR, anticuerpo primario TTR anti humano de conejo (1:1000, FAKO, Dinamarca) y anticuerpo secundario conjugado con biotina anti-conejo (1:10 Sigma, EUA) fueron rastreados por etiquetado con extravidina (1:20 Sigma, EUA) con el fin de teñir la proteína TTR. La reacción se desarrollo con 3-amino-9-et il-carbaxol , AEC (Sigma, EUA) . El análisis semi-cuantitativo de las rebanadas inmunohistoquímicas se realizó usando el programa Scion image quant que mide el área ocupada por el color de reacción del sustrato y normaliza este valor al área total de la imagen. Los valores promedio del % de área ocupada se muestran con la desviación estándar correspondiente. Los tejidos de cada animal se evaluaron en cuatro áreas diferentes. La presencia de TTR humana en los ganglios parasimpáticos del estomago y los intestinos se estudio por teñido de inmunofluorescencia doble con TTR antihumano de conejo (1:1000 DAKO, Dinamarca) y anti-PGP).5 de ratón (1:40, Serotec, EUA) como los anticuerpos primarios; los anticuerpos secundarios fueron, respectivamente; Alexa flúor 488 anti-conejo (Molecular Probes, RU) y Alexa Flúor 568 antiratón de cabra (Molecular Probes, RU) . Las rebanadas se montaron con vectashield vector) y se visualizaron en un microscopio Zeiss Cell Observer System (Cari Zeiss, Alemania) equipado con filtros para FITC y rodhamina.

Los resultados se grafican en la FIG. 9. en contraste con los animales tratados con PBS y SNALP-1955, los animales tratados con SNALP-18328 tuvieron una reducción significativa de la inmuno-reactividad de la TTR en todos los tejidos examinados (esófago (E) , estomago (S) , intestinos (Duodeno (II) y colon (14)), nervios (N) y ganglios de la raíz dorsal (D) .

Estos resultados demuestran que la administración de SNALP-18328 a ratones agenicos hTTR V30M/gsf-l provoca una reducción significativa de la proteina TTR en los tejidos y órganos periféricos. Incluyendo el esófago, el estomago, intestinos (duodeno y colon) , nervios, y ganglios de la raiz dorsal .

E emplo 10 : Reducción in vivo de TTR ARNm de tipo silvestre en el hígado de primates no htímanos por XTC-SNALP-18328 Para evaluar la eficacia de la nueva formulación de nanopartículas lipídicas XTC-SNALP para la administración de ARNsi en primates no humanos, la TTR ARN si AD-18328 se formuló en XTC-SNALP (XTC-SNALP-18328) y se administró mediante infusión IV de 15 minutos, y se cuantificó la TTR ARNm del hígado. A monos Cynomolgus (Macaca fascicularis ) se les administraron infusiones IV de 15 minutos de XTC-SNALP-18328 80.03, 0.1, 0.3 o 1 mg/kg) o XTC-SNALP-1955 (1 mg/kg, con el control negativo ARNsi AD-1955 el cual tiene como objetivo la luciferasa del gen no mamífero) . A las cuarenta y icho horas después de la dosificación, los monos se anestesiaron con pentobarbital sódico y se exsanguinaron . Se recolectó el tejido del hígado para la determinación de la TTR ARNm, se sometió a congelación instantánea, y se almacenó a -80°C hasta el procesamiento. Los métodos usados para la cuantificación de TTR ARNm en el tejido del hígado fueron similares a aquellos descritos en el Ejemplo 5 anteriormente.

Los resultados se muestran en la FIG. 10. XTC-SNALP-18328 redujo los niveles de TTR ARNm en el hígado en una manera dependiente de la dosis, en comparación con el control negativo XTC-SNALP-1955. La ED50 de ARNm se determinó como -0.1 mg/kg de XTC-SNALP-18328.

Estos resultados demuestran que XTC-SNALP-18328 es efectivo para suprimir el TTR ARNm de tipo silvestre en el hígado de primates no humanos cuando se administra por infusión IV.

Ejemplo 11: Reducción in vivo de TTR ARNm de tipo silvestre en el hígado de primates no humanos por LNP09-18328 y LNP11-18328 Para evaluar la eficacia de dos nuevas formulaciones de nanopartículas lipídicas, LNP09 y LNP11, para la administración de ARNsi en primates no humanos, TTR ARNsi AD-18328 se formuló en LNP09 (LNP09-18328 ) o LNP11 (LNP11-18328 ) y se administraron mediante infusión IV de 15 minutos, y se ensayaron los niveles de TTR ARNm en el hígado y de proteína TTR del suero. A monos Cynomolgus (Macaca fascicularis ) se les administraron infusiones IV de 15 minutos de LNP09-18328 (0.03, 0.1 o 0.3 mg/kg) , LNP11-18328 (0.03, 0.1, o 0.3 mg/kg) , o PBS. Se recolectaron muestras de biopsias del hígado a las 48 horas después de la dosificación, se sometieron a congelación instantánea, y se almacenaron a -80°C hasta el procesamiento. Se recolectó el suero antes de la dosificación (antes del sangrado) y los días 1, 2, 4, 7, 14, 21 y 18328 después de la dosificación y se almacenó a -80°C hasta el procesamiento. Los métodos usados para la cuantificación de TTR ARNm ene. Te ido del hígado y la evaluación de la proteína TTR del suero fueron similares a aquellos descritos en los ejemplos 5 u 8 anteriormente.

Los resultados se muestran en la FIG. 11A para el ARNm, y en la FIG. 11B y la FIG. 11C para la proteina. Los animales tratados con LNP09-18328 y LNP11-18328 mostraron reducción dependiente de la dosis en los niveles de TTR ARNm en el hígado, alcanzando una reducción máxima a 0.3 mg/kg de ~85% (LNP09-18328 ) y -90% (LNP11-289 de ARNm con relación al control de PBS. La ED50 de ARNm se determinó como ~0.02 mg/kg tanto para LNP09-18328 y LNP11-18328. En el día 7 después de la dosificación, las muestras de suero también exhibieron una reducción dependiente de la dosis de la proteína TTR para 0.1 y 0.3 mg/kg de LNP09-18328 y LNPll-18328, en comparación con los niveles del control de PBS. La FIG. 11C muestra una reducción en los niveles de proteína TTR con una dosis de 0.3 mg/kg de LNP09-18 que persiste durante al menos 28 días después de la dosificación, en comparación con el grupo de control de PBS y en comparación con las muestras anteriores al sangrado .

Estos resultados demuestran que LNP09-18328 y LNP11-18328 son efectivos para la supresión de la TTR ARNm de tipo silvestre en el hígado de primates no humanos y de la proteína TTR de tipo silvestre en la circulación, cuando se administran por infusión IV. Además, la supresión con LN09-18328 es durable, persistiendo por al menos 18328 días enseguida de la infusión IV.

E emplo 12 : síntesis de las Secuencias en Mosaico de TTR Se diseño un conjunto de dúplex TTR (dúplex en mosaico) que tienen como objetivo el gen de TTR cerca de la región objetivo de AD-18328, el cual tiene como objetivo el gen de TTR humano que comienza en el nucleótido 628 de NM_000371.3.

En los ejemplos siguientes, la numeración que representa la posición de la base 5' de un ARNsi en el transcripto se basa en NM_000371.3 ( FIG . 12; SEC ID N0.1331). En los ejemplos mostrados anteriormente, la numeración para el ARNsi que tiene como objetivo el ARNsi humano se basó en NM_000371.2 (FIG. 13A) . NM_000371.3 extiende la secuencia de 5' UTR en 110 bases en comparación con NM_000371.2 como se muestra en la FIG. 14. Por lo tanto, como un ejemplo, la posición inicial de AD-18328 es 628 en N _000371.3 y 518 en NM_000371.2 (FIG. 14).

Las secuencias de TTR en mosaico se sintetizaron en el sintetizador MerMade 192 a escala de 1 umol. Para todas las secuencias en la lista se aplicó la química ^endolight' como se detalla a continuación • Todas las pirimidinas (citocina y uridina) en la hebra sentido se reemplazaron con bases de 2'-0-metilo correspondientes (2- 0-????1 C y 2'-0-Metil U) • En la hebra antisentido, las pirimidinas adyacentes a (hacia la posición 5' ) ribo a nucleósido se reemplazaron con sus 2-0-Metil nucleosidos correspondientes • Se introdujo una extensión de dos bases dTdT en el extremo 3' tanto de la secuencia sentido y antisentido • El archivo de secuencias de convirtió en un archivo de texto para hacerlo compatible para la carga en el programa de síntesis MerMade 192 La síntesis de las secuencias de TTR usa síntesis de oligonucleótidos en soporte sólido usando la química de fosforamidita . La síntesis de las secuencias anteriores se realizó a una escala de 1 um en placas de 96 pozos. Las soluciones de amidita se prepararon a una concentración 0.1M y se uso etil tio tetrazol (0.6 M en Acetonitrilo) como el activador. Las secuencias sintetizadas se escindieron y se desprotegieron en placas de 96 pozos usando metilamina en el primer paso y un reactivo de fluoruro en el segundo en el segundo paso. Las secuencias crudas así obtenidas se precipitaron usando mezcla de acetona: etanol (80:20), y la pelotilla se resuspendió en amortiguador de acetato de sodio al 0.2M. Se analizaron muestras de cada secuencia mediante LC-MS y para confirmar la identidad, UV para la cuantificación y un conjunto seleccionado de las muestras por cromatografía IEX para determinar la pureza.

Purificación y desalinización Las secuencias de TTR en mosaico se purificaron en el sistema de purificación AKTA Explorer usando columnas Source 15Q. La temperatura de la columna de 65°C se mantuvo durante la purificación. La inyección y la recolección de las muestras se realizó en 96 pozos (1.8 mL-pozos profundos). Un solo pico correspondiente a la secuencia de longitud completa se recolectó en el eluyente. Las secuencias purificadas se desalinizaron en una columna Sephadex G25 usando el purificador AKTA. Las secuencias de TTR desalinizadas se analizaron por la concentración (por medición de UV a A260) y la pureza (por HPLC de intercambio iónico) . Las hebras individuales se enviaron entonces para hibridación.

Hebras individuales y dúplex de TTR: Una lista detallada de los dúplex en mosaico de TTR y las hebras individuales correspondientes (sentido y antisentido) se muestra en la tabla a continuación (Tabla 13) .

Tabla 13 : Dúplex en mosaico de TTR y hebras individuales correspondientes Hebra: s=sentido; as= antisentido; Posición: Posición de la base 5' en el transcripto (NM_000371.3 , SEC ID NO:1331). # de SEC ID # de Dúplex Posición Hebra Secuencia (5' a 3") Oligo NO: AD-18323 618 A-32335 S GGGAuuucAuGuAAccAAGdTdT 1332 A-32336 AS CUUGGUuAcAUGAAAUCCCdTdT 1333 AD-18324 619 A-32337 S GGAuuucAuGuAAccAAGAdTdT 1334 A-32338 AS UCUUGGUuAcAUGAAAUCCdTdT 1335 AD-23000 620 A-42927 S GAuuucAuG uAAccAAG AGdTdT 1336 A-42928 AS CUCU UGGUuAcAUGAAAUCdTdT 1337 AD-23001 621 A-42929 S AuuucAuGuAAccAAGAGudTdT 1338 A-42930 AS ACUCUUGGUuAcAUGAAAUdTdT 1339 AD-23002 622 A-42931 S uuucAuGuAAccAAGAGuAdTdT 1340 A-42932 AS uACUCUUGGUuAcAUGAAAdTdT 1341 AD-23003 623 A-42933 S uucAuGuAAccAAGAGuAudTdT 1342 A-42934 AS AuACUCUUGGUuAcAUGAAdTdT 1343 AD-18325 624 A-32339 S ucAuGuAAccAAGAGuAuudTdT 1344 A-32340 AS AAuACUCUUGGUuAcAUGAdTdT 1345 # de SEC ID # de Dúplex Posición Hebra Secuencia (5' a 3") Oligo NO: AD-23004 625 A-42935 S cAuGuAAccAAGAGuAuucdTdT 1346 A-42936 AS GAAuACUCUUGGUuAcAUGdTdT 1347 AD-18326 626 A-32341 S AuGuAAccAAGAGuAuuccdTdT 1348 A-32342 AS GGAAuACUCUUGGUuAcAUdTdT 1349 AD- 18327 627 A-32343 S uGuAAccAAGAGuAuuccAdTdT 1350 A-32344 AS UGGAAuACUCUUGGUuAcAdTdT 1351 AD-23005 628 A-42937 S uAAccAAGAGuAuuccAuudTdT 1352 A-42938 AS AAUGGAAuACUCUUGGUuAdTdT 1353 AD-23006 629 A-42939 S AAccAAGAGuAuuccAuu udTdT 1354 A-42940 AS AAAUGGAAuACUCUUGGUUdTdT 1355 AD-23007 631 A-42941 S AccAAGAGuAuuccAuuuudTdT 1356 A-42942 AS AAAAUGGAAuACUCUUGGUdTdT 1357 AD-23008 632 A-42943 S ccAAGAGuAuuccAuuuuudTdT 1358 A-42944 AS AAAAAUGGAAuACUCUUGGdTdT 1359 AD-23009 633 A-42945 S cAAGAGuAuuccAuuuuuAdTdT 1360 A-42946 AS uAAAAAUGGAAuACUCUUGdTdT 1361 AD-23010 634 A-42947 S AAGAGuAuuccAuuuuuAcdTdT 1362 A-42948 AS GuAAAAAUGGAAuACUCUUdTdT 1363 AD-23011 635 A-42949 S AGAGuAuuccAuuuuuAcudTdT 1364 A-42950 AS AGuAAAAAUGGAAuACUCUdTdT 1365 AD-23012 636 A-42951 S GAGuAuuccAuuuuuAcuAdTdT 1366 A-42952 AS uAGuAAAAAUGGAAuACUCdTdT 1367 AD-230B 637 A-42953 S AGuAuuccAuuuuuAcuAAdTdT 1368 A-42954 AS UuAGuAAAAAUGGAAuACUdTdT 1369 AD-23014 638 A-42955 S GuAuuccAuuuuuAcuAAAdTdT 1370 A-42956 AS UUuAGuAAAAAUGGAAuACdTdT 1371 AD-23015 639 A-42957 S uAuuccAuuuuuAcuAAAGdTdT 1372 A-42958 AS CUUuAGuAAAAAUGGAAuAdTdT 1373 AD-23016 640 A-42959 S AuuccAuuuuuAcuAAAGcdTdT 1374 A-42960 AS GCUUuAGuAAAAAUGGAAUdTdT 1375 AD-23017 641 A.42961 S uuccAuuuuuAcuAAAGcAdTdT 1376 A-42962 AS UGCUUuAGuAAAAAUGGAAdTdT 1377 AD-23018 642 A-42963 S uccAuuuuuAcuAAAGcAGdTdT 1378 A-42964 AS CUGCUUuAGuAAAAAUGGAdTdT 1379 AD-23019 643 A-42965 S ccAuuuuuAcuAAAGcAGudTdT 1380 A-42966 AS ACUGCUUuAGuAAAAAUGGdTdT 1381 AD-23020 644 A-42967 S cAuuuuuAcuAAAGcAGuGdTdT 1382 A-42968 AS cACUGCUUuAGuAAAAAUGdTdT 1383 AD-23021 645 A-42969 S AuuuuuAcuAAAGcAGuGudTdT 1384 A-42970 AS AcACUGCUUuAGuAAAAAUdTdT 1385 AD-23022 646 A-42971 S uuuuuAcuAAAGcAGuGuudTdT 1386 A-42972 AS AAcACUGCUUuAGuAAAAAdTdT 1387 AD-23023 647 A-42973 S uuuuAcuAAAGcAGuGuuudTdT 1388 A-42974 AS AAAcACUGCUUuAGuAAAAdTdT 1389 AD-23024 648 A-42975 S uuuAcuAAAGcAGuGuuuudTdT 1390 A-42976 AS AAAAcACUGCUUuAGuAAAdTdT 1391 AD-23025 649 A-42977 S u uAcuAAAGcAGuGuuuucdT dT 1392 A-42978 AS GAAAAcACUGCUUuAGuAAdTdT 1393 AD-23026 650 A-42979 S uAcuAAAGcAGuGuuuucAdTdT 1394 A-42980 AS UGAAAAcACUGCUUuAGuAdTdT 1395 # de SEC ID # de Dúplex Posición Hebra Secuencia (5' a 3") Oligo NO: AD-23027 651 A-42981 S AcuAAAGcAGuGuuuucAcdTdT 1396 A-42982 AS GUGAAAAcACUGCUUuAGUdTdT 1397 AD-23028 652 A-42983 S cuAAAGcAGuGuuuucAccdTdT 1398 A-42984 AS GGUGAAAAcACUGCUUuAGdTdT 1399 AD- 18330 653 A-32349 5 uAAAGcAGuGuuuucAccudTdT 1400 A-32350 AS AGGUGAAAAcACUGCUUuAdTdT 1401 AD-23029 654 A-42985 S AAAGcAGuGuuuucAccucdTdT 1402 A-42986 AS GAGGUGAAAAcACUGCUUUdTdT 1403 AD-23030 655 A-42987 S AAGcAGuGuuuucAccucAdTdT 1404 A-42988 AS UGAGGUGAAAAcACUGCUUdTdT 1405 AD-23031 656 A-42989 S AGcAGuGuuuucAccucAudTdT 1406 A-42990 AS AUGAGGUGAAAAcACUGCUdTdT 1407 AD-18328 628 A-32345 S GuAAccAAGAGuAuuccAudTdT 1408 A-32346 AS AUGGAAuACUCUUGGUuACdTdT 1409 Ejemplo 13: Identificación in vi ro de ARNsi en Mosaico de TTR Los dúplex de TTR en mosaico se analizaron en células Hep3B por la inhibición de la expresión endógena de TTR usando ensayos de PCR en tiempo real.

Cultivo y transfección de células: Las células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron casi a confluencia a 37°C en una atmósfera de 55 de C02 en Medio Esencial Mínimo de Tagle (EMEM, ATCC) suplementado con 10% de FBS, estreptomicina, y glutamina (ATCC) antes de ser liberadas de la placa por tripsinización . La transfección invertida se llevó a cabo agregando 5 µ? de Opti-MEM a 5 µ? de cada ARNsi en pozos individuales de una placa de 96 pozos. A estos 10 µ? de Opti-MEM plus se agregaron 0.2 µ? de Lipofectamina RNAiMax por pozo (Invitrogen, Carlsbad CA. # de Cat : 13778-150) y la mezcla se incubó a la temperatura ambiente por 15 minutos. 80 µ? del medio de cultivo completo descrito anteriormente, pero sin contener el antibiótico se agregaron entonces 2.0xl04 células Hep3B. Las células se incubaron por 24 horas antes de la purificación. Los experimentos se realizaron a una concentración final del dúplex de 0.1 ó 10n .

El aislamiento del ARN total usando el Equipo de Aislamiento de ARN Total agMax-96 (Applied biosystems, Foster City, CA, # de Parte: AM1830) : las células se recolectaron y se sometieron a lisis en 140 µ? de Solución de Lisis/Enlazamiento y después se mezclaron por 1 minuto a 850 RPM usando un Termomezclador Eppendorf (la velocidad de mezclado fue la misma en todo el proceso) . Veinte microlitros de perlas magnéticas y Mejorador de Lisis/Enlazamiento se agregaron a lisado de células y se mezclaron por 5 minutos. Las perlas magnéticas se capturaron usando un soporte magnético y el sobrenadante se removió sin perturbar las perlas. Después de remover el sobrenadante, las perlas magnéticas se lavaron con Solución de Lavado 1 (con isopropanol agregado) y se mezclaron por 1 minuto. Las perlas se capturaron otra vez y el sobrenadante se removió. Las perlas se lavaron entonces con 150 µ? de Solución de Lavado 2 (Etanol agregado), se capturaron y el sobrenadante se removió. Entonces se agregaron a las perlas 50 µ? de mezcla de DNasa (Amortiguador de DNasa MagMax turbo y Turbo DNasa) y estas se mezclaron por 10 a 15 minutos. Después del mezclado se agregaron 100 µ? de Solución de Reenlazamiento de ARN y se mezcló por 3 minutos. El sobrenadante se removió y las perlas magnéticas se lavaron otra vez con 150 µ? de Solución de Lavado 2 y se mezclaron por 1 minuto y el sobrenadante se removió completamente. Las perlas magnéticas se mezclaron por 2 minutos a sequedad antes que el ARN se eluyera con 50 µ? de agua .

Síntesis del ADNc usando el equipo de trascripción invertida de ADNc de alta capacidad ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, # de Cat : 4368813) : una mezcla principal de 2 µ? de lOx amortiguador, 0.8 µ? de 25X dNTPs, 2 µ? de Cebadores aleatorios, 1 µ? de Transcriptasa Inversa, 1 µ? de inhibidor de RNasa y 3.2 µ? de H20 por reacción se agregaron en 10 µ? de ARN total. El ADNc se generó usando un reciclador térmico Bio-Rad C-1000 o Se-1000 (Hercules, CA) PCR En tiempo real: 2 µ? de ADNc se agregaron a una mezcla principal conteniendo 0.5 µ? de la Sonda TaqMan GAPDH (Applied Biosystems, # de Cat 4326371E) , 0.5 µ? de sondas TaqMan TTR (Applied Biosystems, # de Cat: HS00174914 MI) y 10 µ? de Mezcla Principal de Sondas de Roche (Roche, # de Cat: 04887301001) por pozo en un en a placa de 384 pozos LightCycler 480 (Roche, # de Cat: 0472974001) . La PCR en tiempo real de realizó en una máquina de PCR en Tiempo Real LightCycler 480 (Roche) . Cada dúplex se evaluó en dos transfecciones independientes y cada transfección se ensayó por duplicado.

Los datos en tiempo real se analizaron usando el método A Ct . Cada muestra se normalizó contra la expresión de GAPDH y se evaluó la eliminación con relación a las células transfectadas con el dúplex AD-1955 no buscado como objetivo. La tabla 14 muestra la eliminación de TTR usando los ARNsi. Los datos se expresan como porcentaje del mensaje que permanece con relación a las células buscadas como objetivo con AD-1955.

Muchos peto no todos los TTR-ARNds en mosaico, la TTR buscada como objetivo cerca del objetivo de AD-18328, reducen la TTR ARNm en al menos 70% cuando se transfectan en células Hep3B a 0.1 nM.

Tabla 14 : Inhibición de TTR por el AR ds en mosaico que tiene como objetivo la TTR cerca del objetivo de AD-18328. % del mensaje % del mensaje restante 0.1 nM % de SD 0.1 # de Dúplex restante 0.1 nM % SD ? ? ?? nM AD- 18323 6.7 1.90 1.7 0.02 AD- 18324 1.8 0.58 0.9 0.10 AD-23000 5.5 0.93 2.1 0.87 AD-23001 15.2 4.89 4.9 1.74 AD-23002 3.1 1.12 1.4 0.55 AD-23003 17.3 3.13 1.7 0.06 AD-18325 1.5 0.27 1.4 0.66 AD-23004 9.0 0.15 10.5 0.96 AD- 18326 22.0 1.85 7.6 0.78 AD- 18327 1 1.6 2.64 9.6 1.67 AD-18328 1.1 0.70 0.6 0.16 AD-23005 0.8 0.31 0.6 0.21 AD-23006 1.5 0.46 1.2 0.43 AD-23007 2.4 0.91 1.9 0.46 AD-23008 0.6 0.10 0.8 0.26 % del mensaje % del mensaje restante 0. InM % de SD 0.1 # de Dúplex restante O.lnM % SD 10 nM nM AD-23009 1.0 0.13 0.9 0.22 AD-23010 60.1 15.66 66.2 22.71 AD-2301 1 56.5 16.99 53.6 4.70 AD-23012 7.7 2.36 7.7 3.25 AD-23013 7.0 0.64 8.0 1.06 AD-23014 0.7 0.01 0.6 0.10 AD-23015 15.4 0.25 16.5 7.07 AD-23016 27.1 0.37 6.7 1.80 AD-23017 4.5 1.26 1.4 0.40 AD-23018 44.6 9.45 7.5 1.09 AD-23019 2.2 0.68 0.8 0.10 AD-23020 52.7 6.45 29.7 1.17 AD-23021 95.4 16.16 45.0 3.00 AD-23022 70.1 3.01 60.8 12.1 1 AD-23023 2.7 1.12 1.8 0.07 AD-23024 1.7 0.30 1.8 0.33 AD-23025 64.2 13.21 10.5 1.34 AD-23026 1.9 0.15 1.9 0.78 AD-23027 2.5 0.21 1.6 0.49 AD-23028 6.7 4.41 1.2 0.50 AD- 18330 6.0 0.56 5.7 1.15 AD-23029 4.5 0.47 1.6 0.10 AD-23030 3.9 0.25 3.3 0.84 AD-23031 3.4 0.78 1.7 0.02 Ejemplo 14: Evaluación de la Duración de la Infusión sobre la Eficacia de una Administración Intravenosa Única de SNALP-18534 en Ratas de Sprague Da ley.

Obj etivos Determinar el efecto de la duración de la infusión en la eficacia de una infusión IV única de SNALP-18534 en los niveles de ATT ARNm en el hígado en ratas Sprague-Dawley .

Tabla 15 : Abreviaciones y Definiciones usadas SNALP- 18534 ARNsi específico de transtiretina de ratón formulada en SNALP SNALP- 1955 ARNsi específico de luciferasa no mamífera formulado en SNALP Las secuencias de las hebras sentido y antisentido AD-18534 se reproducen a continuación de las tablas anteriores : Materiales de Estudio Artículos de Prueba SNALP-18534 se compone de un ARNsi que tiene como objetivo el TTR ARNm de ratón (AD-18534) formulado en partículas lipídicas de ácido nucleico (SNALP) para la administración a tejidos objetivos. La formulación SNALP (partículas lipídicas) consiste de un nuevo aminolípido (DLinDMA), un lípido PEGilado (mPEG2000-C-D A) , un lípido neutro (DPPC) y colesterol. L relación de lípido: ácido nucleico en la formulación de SNALP es de aproximadamente 5.8:1 (p:p). SNALP-1955 contiene un ARNsi que tiene como objetivo el ARNm de luciferasa no mamífero, se formuela con las partículas lipídicas idénticas que el SNALP-18534, y sirve como un control que no es activo farmacológicamente. Los niveles de dosificación se expresan como mg/kg con base en el peso del contenido de ARNsi.

Diseño del Estudio y Procedimientos Animales y administración del articulo de prueba El estudio se compone de 9 grupos de ratas Sprague- Dawley (4 machos/grupo ) . Se permitido que los animales tuvieran un periodo de aclimatación de al menos 2 días antes del estudio y todos los animales tenían 7 semanas de edad al inicio de la dosificación. La dosis administrada se calculó con base en los datos de peso corporal recolectados antes de la dosificación en el día 1. Los artículos de prueba y de control se administraron como una infusión IV única de 15 minutos, 1 hora, 2 horas, 0 3 horas vía la vena caudal usando una cánula de 24G 3(4" sellada con un Septo de Sitio de Inyección Baxter, conectado vía una aguja de mariposa Terumo 27G a una Bomba de Jeringa Baxter AS40A. El volumen de dosificación fue de 3 ml/kg, la velocidad de infusión fue de 12 ml/kg/hr, y los animales se movían libremente en las jaulas durante la dosificación. Las ratas se dividieron en nueve grupos de tratamiento, y se les administró una infusión IV única de SNALP-18534, SNALP-1955, o PBS como se muestra en la Tabla 16: Tabla 16: Grupos de Dosificación de los Animales de Prueba Recolección de tejidos y aislamiento del AR : En el día 0 los animales se anestesiaron mediante inhalación de isofluorano y se recolectaron muestras de sangre pre-dosificación en tubos separadores de suero mediante sangrado retro-orbital. Se permitido que las muestras de sangre se coagularan a la temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos antes de la centrifugación a 4°C. Las muestras de suero se almacenaron entonces a -80°C hasta que se llevara a cabo el análisis. En el día 3 a los animales de los nueve grupos de tratamiento se les dio una dosis letal de ketamina/xilazina . Se recolectó la sangre por medio de la vena cava en tubos de separación de suero, y después se permitido que se coagulara a la temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos antes de la centrifugación a 4°C. Las muestras de suero se almacenaron a -80°C hasta que se llevó a cabo el análisis. Se recolectó el tejido del hígado y se congeló de manera instantánea en hielo seco. El tejido del hígado congelado se trituró y se prepararon lisados del tejido para la cuantificación del ARNm del hígado.

Cuantif cación del TTR ARNm: Los niveles de TTR ARNm con relación a aquellos de GAPDH ARNm se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA) . En concreto, el ensayo QuantiGene (Genospectra) se uso para cuantificar los niveles de ARNm en los lisados de las muestras de tejido, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel promedio de TTR ARNm se normalizó con el nivel medio de GAPDH ARNm para cada muestra.

Para obtener el nivel relativo de expresión de TTR ARNm, los valores promedio del grupo para los grupos tratados con SNALP-1955 y SNALP-18534 con duraciones de infusión de 15 minutos, 1 hora y 2 horas se normalizaron entonces con el valor promedio para el grupo tratado con PBS con duración de un fusión de 15 minutos en tanto que los valores promedio para los grupos tratados con SNALP-1955 y SNALP-18534 con duración de infusión de 3 horas se normalizaron entonces al valor promedio para el grupo tratado con PBS con duración de infusión de 3 horas.

Resultados Como se muestra en la FIG. 16, una infusión IV única de 1 mg/kg de SNALP-18534 con diferentes duraciones de infusión de 15 minutos a 3 horas resulta en una inhibición comparable de los niveles de TTR ARNm del hígado medidos dos días después de la dosificación. Una infusión IV única de 1 mg/kg de SNALP-18534 también muestra sub-regulación de TTR durable durante 29 días enseguida de una infusión IV única de 15 minutos, en comparación con el control SNALP-1955 (no se muestran los datos) . En comparación con el grupo tratado con PBS, una infusión IV única de 15 minutos, 1 hora, 2 horas, o 3 horas de SNALP-18534 a 1 mg/kg reduce significativamente los niveles de expresión de TTR ARNm relativos en 94% (p<0.001), 94% (p<0.001), 92% (p<0.001) y 93% (p<0.001) respectivamente. La especificidad de la actividad de SNALP-18534 se demuestra por la falta de inhibición focalizada significativa por la administración de SNALP-1955 vía infusión IV de 1 hora, 2 horas, o 3 horas al mismo nivel de dosificación.

Conclusiones Este estudio demuestra que variar la duración de la infusión de 15 minutos hasta 3 horas no afecta la eficacia de una administración IV única de 1 mg/kg de SNALP-18534 en ratas, cuando se evalúa por la reducción de los niveles de TTR ARNm en el hígado.

Ejemplo 15. Reducción in vivo de TTR ARNm de tipo, silvestre en el hígado de ratas por LNP07-18534 y LNP08-18534 Para evaluar la eficacia de de 2 nuevas formulaciones de nanopartículas lipídicas, LNP07 y LNP08, para la administración de ARNsi en ratas, el TTR ARNsi específico de roedor, AD-18534 se formuló en LNP07 (LNP07-1853 ) o LNP08 (LNP08-1853 ) , y se administró mediante infusión IV de 15 minutos y se cuantificó el TTR ARNm del hígado. A ratas Sprague-Dawley (4 animales por grupo) se administraron infusión IV de 15 minutos de LNP07-18534 (0.03, 0.1, 0, 13 o 1 mg/kg), LNP08-18534 (0.01, 0.03, 0 0.1 mg/kg), o LNP07-1955 (1 mg/kg) o LNP08-1955 (0.1 mg/kg) conteniendo el control negativo ARNsi AD-1955 el cual tiene como objetivo la luciferasa de gen no mamífero. Cuarenta y ocho horas después, los animales fueron eutanizados y se recolecto el tejido el hígado, se sometió a congelación instantánea y se almacenó a -80°C hasta el procesamiento.

Para la cuantificación del TTR ARNm, el tejido del hígado congelado se convirtió en polvo mediante trituración, y se prepararon lisados. Los niveles de TTR ARNm con relación a aquellos de GAPDH ARNm se determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, CA) . En concreto, el ensayo QuantiGene (Genospectra) se uso para cuantificar los niveles de ARNm en los lisados de muestras de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel promedio de TTR ARNm se normalizó al nivel promedio de GAPDH ARNm para cada muestra. Los promedios de grupo de los valores normalizados se normalizaron entonces al valor promedio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de la expresión de TTR ARNm.

Los resultados se muestran en la FIG. 17. LNP07-18534 reduce los niveles de TTR ARNm en el hígado en una manera dependiente de la dosis, con 94% de supresión de TTR ARNm a 1 mg/kg. El efecto fue específico, ya que el control negativo LNP07-1955 a 1 mg/kg no afecta significativamente los niveles de TTR ARNm en comparación con el control de PBS. La ED50 de ARNm se determinó como -0.05 mg/kg de LNP07-18534. El LNP08- 18534 reduce los niveles de TTR ARNm en el hígado en una manera dependiente de la dosis con 86% de supresión de TTR ARNm a 0.1 mg/kg. El efecto fue específico y que el control negativo LNP08-1955 a 0.1 mg/kg no afecta significativamente los niveles de TTR ARNm en comparación con el control de PBS. La ED50 de ARNm se determinó como -0.02 mg/kg de LNP08-18534.

Estos resultados demuestran que LNP07-18534 y LNP08-18534 son efectivos para suprimir el TTR ARNm de tipo silvestre en el hígado de ratas cuando se administra por infusión IV, y que LNP07 y LNP08 son formulaciones efectivas para administrar el ARNsi al hígado.

Ejemplo 16; Reducción del TTR ARNm del hígado mediante una administración intravenosa única de LNP09-18534 o LNP11-18534 en Ratas de Sprague-Dawley Ob etivo : Para evaluar la eficacia de dos nuevas formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) para la administración del ARNsi específico de TTR de roedor, AD-18534 en ratas de Sprague-Dawley para reducir los niveles de TTR ARNm endógeno (tipo silvestre) del hígado. Las ratas se dosificaron intravenosamente vía una infusión de 15 minutos ya sea con 0.01, 0.03 ó 0.3 mg/kg de LNP09-18534, LNP11-18534, o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y los niveles de TTR ARNm del hígado se analizaron a las 48 horas después del tratamiento.

Materiales y Métodos Formulación de LNP09: (XTC/DSPC/Chol/PEG2000- C14)=50/10/38.5/1.5 %mol; Lipido: ARNsi ~ 11.1. Formulación de LNP11: (MC3/DSPC/Chol/PEG20oo-C14) = 50/10/38.5/1.5 %mol; Lipido: ARNsi -11.1 Recolección de tejido y aislamiento de ARN: el Dia 3, se dio a los animales en todos los grupos de tratamiento una dosis letal de ketamina/xilazina . Se recolectó la sangre via la vena cava caudal, en tubos de separación de suero, y después se el permitió coagularse a la temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos antes de la centrifugación a 4°C. Las muestras de suero se almacenaron a -80°C hasta el futuro análisis. Los tejidos del hígado se recolectaron y se sometieron a congelaron instantánea en hielo seco. El tejido hepático congelado se trituro y de prepararon lisados de tejido para la cuantificación del ARNm del hígado.

Cuantificación de TTR ARNm: los niveles de TTR ARNm con relación a los de GAPDH ARNm de determinaron en los lisados usando un ensayo de ADN ramificado (QuantiGene Reagent System, Panomics, Fremont, A) . En concreto, el ensayo QuantiGene (Genospectra) se uso para cuantificar los niveles de ARNm en los lisados de muestras de tejido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel promedio de TTR ARNm se normalizó al nivel promedio de GAPDH ARNm para cada muestra.

Los valores promedio de grupo se normalizaron entonces al valor promedio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de TTR ARNm.

Resultados Como se muestra en la FIG. 18, en contraste con los animales tratados con PBS, los animales tratados con LNP09-18534 y LNP11-18534 tuvieron una reducción dependiente de la dosis significativa en los niveles de TTR ARNm en el hígado, alcanzando una reducción máxima de ~90% de reducción de ARNm tanto para los grupos formulados con LNP09 y LNPll, con relación al grupo de control de PBC a 0.3 mg/kg, y a una dosis que alcanza 50% de reducción (ED50) de <0.03 mg/kg para LNP11-18534 y <0.1 mg/kg para LNP09-18534.

Conclusiones Este estudio demuestra que una infusión IV única de 15 minutos de LNP09-18534 o LNP11-18534 en ratas Sprague-Dawley resulta en una reducción dependiente de la dosis de TTR ARNm del hígado. Esto datos demuestran la eficacia de LNP09-18328 y LNP11-18328 en la reducción del TTR ARNm expresado endógenamente (tipo silvestre) con niveles de ED50 de <0.03 y <0.01 mg/kg para LNP11-18534 y LNP09-18534 respectivamente.

Ejemplo 17 : Inhibición de la TTR en humanos Un sujeto humano se trata con un ARNds que tiene como objetivo un gen de TTR para inhibir la expresión del gen de TTR para tratar una condición.

Se selecciona o se identifica un sujeto en necesidad del tratamiento. El sujeto puede tener un trastorno hepático, amiloidosis transtiretinal , y/o un hígado transplantado.

La identificación del sujeto puede ocurrir en un establecimiento clínico, o en cualquier otro lado, por ejemplo, en el propio hogar del sujeto a través del uso debido de un equipo de auto evaluación.

En el tiempo cero se administra al sujeto una primera dosis adecuada de un anti TTR ARNsi. El ARNds se fórmula como se describe aquí. Después de un periodo de tiempo enseguida de la primera dosis, por ejemplo 7 días, 14 días, y 21 días, se evalúa la condición del sujeto, por ejemplo, midiendo la función hepática. Esta medición puede estar acompañada por una medición de la expresión de TTR en dicho sujeto, y/o de los productos de la focalización exitosa de ARNsi del TTR ARNm. Otros criterios relevantes también pueden ser medidos. El número y la fuerza de las dosis se ajustan de acuerdo con las necesidades del sujeto.

Después del tratamiento, la velocidad de crecimiento del tumor del sujeto se reduce con relación a la velocidad existente antes del tratamiento, o con relación a la velocidad medida en un sujeto con una aflicción similar pero no tratada.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido ribonucleico de doble hebra (ARNds) para inhibir la expresión de la transtireina, caracterizado porque, dicho ARNds comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, la hebra antisentido que comprende una región complementaria para una parte de un ARNm que codifica la transtiretina (TTR) , en donde dicha región de complementariedad es menor que 30 nucleotidos de longitud y la hebra antisentido comprende 15 o más nucleotidos contiguos de la SEC ID NO: 170.

2. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, la hebra sentido consiste de la SEC ID NO: 449 y la hebra antisentido consiste de la SEC ID NO: 450.

3. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, la hebra sentido consiste de la SEC ID NO: 729 y la hebra antisentido consiste de la SEC ID NO: 730.

4. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, la hebra sentido consiste de la SEC ID NO: 1009 y la hebra antisentido consiste de la SEC ID NO: 1010.

5. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, la región de complementariedad consiste de la SEC ID NO: 169.

6. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, cada hebra del ARNds es de 19, 29, 21, 22, 23, o 24 nucleotidos de longitud.

7. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, el ARNds no escinde un TTR ARNm entre el nucleótido de adenina en la posición 637 de la SEC ID NO: 1331 y el nucleótido de guanina en la posición 638 de la SEC ID NO: 1331.

8. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, el ARNds escinde un TTR ARNm entre el nucleótido de guanina en la posición 636 de la SEC ID NO: 1331 y el nucleótido adenina en la posición 637 de la SEC ID NO: 1331.

9. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, el ARN.ds se híbrida con el TTR ARNm entre el nucleótido guanina en la posición 628 de la SEC ID NO: 1331 y el nucleótido uracilo en la posición 646 de la SEC ID NO: 1331.

10. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, dicho ARNds comprende al menos un nucleótido modificado.

11. El ARNds de la reivindicación 10, caracterizado porque, al menos uno de dichos nucleótidos modificados se elige del grupo de: un nucleótido modificado por 2'-0-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5 ' -fosforotioato, y un nucleótido terminal enlazado a un derivado de colesterilo o un grupo ácido dodecanoico bisdecilamida .

12. El ARNds de la reivindicación 10, caracterizado porque, dicho nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2 ' -desoxi-2 ' -fluoro, un nucleótido modificado por 2'-desoxi, un nucleótido cerrado, un nucleótido abásico o no básico, un nucleótido modificado por 2'-amino, un nucleótido modificado por 2 ' -alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, una nucleótido que comprende una base no natural.

13. El ARNds de la reivindicación 14, caracterizado porque, comprende al menos un nucleótido modificado por 2'-metilo .

14. El ARNds de la reivindicación 1, caracterizado porque, el ARNds se conjuga con un ligando.

15. El ARNds de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, o 6, caracterizado porque, el ARNds de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, o 6, caracterizado porque, el ARNds se fórmula en una formulación lipidica.

16. Un ácido ribonucleico de hebra doble (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR) , caracterizado porque, dicho ARNds comprende una hebra antisentido que comprende una región complementaria a 15-30 nucleótidos de los nucleótidos 618-648 de la SEC ID NO: 1331 y en donde dichos pares de bases de la hebra antisentido se aparean con la guanina en la posición 628 de la SEC ID NO: 1331.

17. Células, caracterizadas porque, contienen el ARNds de las reivindicaciones 1-16.

18. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra del ARNds de las reivindicaciones 1-16.

19. Células, caracterizadas porque, comprende el vector de la reivindicación 18.

20. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de TTR, caracterizada porque, comprende el ARNds de las reivindicaciones 1-16 y un portador aceptable farmacéuticamente .

21. Un método para inhibir la expresión de la TTR en células, el método, caracterizado porque, comprende: (a) poner en contacto las células con el ARNds de las reivindicaciones 1-16; y (b) mantener las células producidas en el paso (a) por un tiempo suficiente para obtener la degradación de los transcriptos de un gen de TTR, inhibiendo por ello la expresión del gen de TTR en las células.

22. El uso de un ARNds para tratar un trastorno mediado por la expresión de la TTR, caracterizado porque, comprende administrar a un humano en necesidad del tal tratamiento, una cantidad efectiva terapéuticamente del ARNds de las reivindicaciones 1-16.

23. El uso de la reivindicación 22, caracterizado porque, el ARNds se administra al humano a aproximadamente 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 0 5.0 mg/kg.

24. El uso de las reivindicaciones 22-23, caracterizado porque, el ARNds se administra al humano a aproximadamente 1.0 mg/kg.

25. El uso de las reivindicaciones 22-24, caracterizado porque, el humano tiene amiloidosis por transtiretina .

26. El uso de las reivindicaciones 22-25, caracterizado porque, el humano tiene un trastorno del hígado.

27. El uso de las reivindicaciones 22-26, caracterizado porque, además se proporciona al humano un trasplante de hígado .

28. El uso de un ARNds para inhibir la expresión de la TTR en células, caracterizado porque, el uso comprende: (a) poner en contacto las células con el ARNds de las reivindicaciones 1-16; y (b) mantener las células producidas en el paso (a) por un tiempo suficiente para obtener la degradación del trascripto de ARNm de un gen de TTR, inhibiendo por ello la expresión del gen de TTR en las células. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un ácido ribonucleico de hebra doble (ARNds) que tiene como objetivo un gen de transtiretina (TTR) , y métodos para usar el ARNds para inhibir la expresión de la TTR.