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MX2011003272A - Polipeptidos de eritropoyetina animal modificados y sus usos. - Google Patents

Polipeptidos de eritropoyetina animal modificados y sus usos.

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MX2011003272A
MX2011003272A MX2011003272A MX2011003272A MX2011003272A MX 2011003272 A MX2011003272 A MX 2011003272A MX 2011003272 A MX2011003272 A MX 2011003272A MX 2011003272 A MX2011003272 A MX 2011003272A MX 2011003272 A MX2011003272 A MX 2011003272A
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MX
Mexico
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dhad
sequences
sequence
cell
bacterial
Prior art date
Application number
MX2011003272A
Other languages
English (en)
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Feng Tian
Stephanie Chu
Joseph Sheffer
Peter C Canning
Putnam Anna-Maria A Hays
Frank Song
Richard S Barnett
Marc Siladi
Kyle Atkinson
Darin Lee
Original Assignee
Ambrx Inc
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Filing date
Publication date
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Abstract

Se proporcionan polipéptidos de eritropoyetina animal modificados y usos de los mismos.

Description

IDENTIFICACION Y USO DE DIHIDROXIACIDO DESHIDRATASAS [2Fe-2S] BACTERIANAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y a la expresión de actividad dihidroxiácido deshidratasa . Más específicamente, a dihidroxiácido deshidratasas bacterianas con un grupo [2Fe-2S] que se identifican y expresan como proteínas heterólogas en huéspedes bacterianos y de levadura.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) , también denominada acetohidroxiácido deshidratasa, cataliza la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato y de 2 , 3 -dihidroximetilvalerato a a-cetometilvalerato . La enzima DHAD, clasificada como E.C. 4.2.1.9, es parte de rutas biosintéticas de origen natural que producen valina, isoleucina, leucina y ácido pantoténico (vitamina B5) . La expresión incrementada de actividad DHAD es conveniente para una producción microbiana mejorada de aminoácidos de cadena ramificada o de ácido pantoténico.
La conversión catalizada por DHAD de 2,3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato también es una etapa común en las múltiples rutas biosintéticas del isobutanol que Ref . -.218182 se describen en la publicación de la solicitud de patente copendiente y de propiedad mancomunada de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al. En ella se describe la manipulación genética de microorganismos recombinantes para la producción de isobutanol. El isobutanol es útil como aditivo para combustibles, cuya disponibilidad puede reducir la demanda de combustibles petroquímicos .
Para una producción mejorada de compuestos sintetizados en rutas que incluyen dihidroxiácido deshidratasa, es conveniente expresar una enzima heteróloga que proporcione esta actividad enzimática en el huésped de producción de interés. La obtención de una expresión funcional alta de dihidroxiácido deshidratasas en un huésped heterologo se complica porque la enzima requiere de un grupo Fe-S, que implica la disponibilidad y la carga apropiada del grupo en la apoproteína de la DHAD.
Las enzimas DHAD que requieren grupos Fe-S se conocen en la técnica y se encuentran en la forma [4Fe-4S] o [2Fe-2S] . Algunas enzimas bacterianas son conocidas, y la mejor caracterizada de estas es de E. coli (Flint, DH, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:14732-14742). Sin embargo, todas estas enzimas bacterianas están en la forma [4Fe-4S] . La única forma [2Fe-2S] informada hasta la fecha es una enzima de la espinaca (Flint y Emptage (1988) J. Biol. Chem. 263:3558-3564).
Es conveniente usar la forma [2Fe-2S] de la enzima en células huésped para mejorar la producción de rutas biosintéticas introducidas, ya que la forma [2Fe-2S] crea una carga menor en el ensamble y/o la síntesis del grupo Fe-S. Desafortunadamente, se conoce solo una forma [2Fe-2S] de esta enzima.
Por lo tanto, existe la necesidad de identificar nuevas formas [2Fe-2S] de la DHAD para usarse en células huésped recombinantes , en donde la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato es una etapa de la ruta metabólica en una ruta biosintética deseada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se proporciona un método para identificar enzimas DHAD [2Fe-2S] ; el método comprende: a) buscar en una base de datos una o más secuencias de aminoácidos con un perfil de modelos ocultos de Markov preparado al usar las proteínas de secs. con núm. de ident.: 164, 168, 230, 232, 298, 310, 344 y 346, en donde una coincidencia con un valor E menor que 10"5 proporciona un primer subconjunto de secuencias, en virtud de lo cual el primer subconjunto de secuencias corresponde a una o más proteínas relacionadas con la DHAD; b) analizar el primer subconjunto de secuencias que corresponden a una o más proteínas relacionadas con la DHAD de la etapa (a) para determinar la presencia de tres cisteínas conservadas que corresponden a las posiciones 56, 129 y 201 en la secuencia de aminoácidos de la dihidroxiácido deshidratasa (sec. con núm. de ident . : 168) de Streptococcus mutans, en virtud de lo cual se identifica un segundo subconjunto de secuencias que codifican enzimas DHAD [2Fe-2S] ; y c) analizar el segundo subconjunto de secuencias de la etapa (b) para determinar la presencia de aminoácidos conservados distintivos en las posiciones correspondientes a las posiciones en la secuencia de aminoácidos de la DHAD (sec. con núm. de ident.: 168) de Streptococcus mutans que son ácido aspártico en la posición 88, arginina o asparagina en la posición 142, asparagina en la posición 208 y leucina en la posición 454, en virtud de lo cual también se identifica un tercer subconjunto de secuencias que codifican enzimas DHAD [2Fe-2S] .
En otro aspecto de la invención, el método mencionado anteriormente comprende, además: d) expresar un polipéptido que tiene una secuencia identificable por cualquiera de o la totalidad de las etapas a) , b) y c) en una célula; y e) confirmar que ese polipéptido tiene actividad DHAD en la célula.
En otro aspecto de la invención el método mencionado anteriormente comprende, además: d) purificar una proteína codificada por una secuencia identificable por cualquiera de o la totalidad de las etapas a) , b) y e); y e) confirmar que la proteína es una enzima DHAD [2Fe-2S] por espectroscopia ultravioleta visible (UV vis) y de EPR (resonancia paramagnética electrónica, por sus siglas en inglés) .
En otro aspecto de la invención el método mencionado anteriormente comprende, además, seleccionar una o más de las secuencias que corresponden a las secuencias de la enzima DHAD [2Fe-2S] bacteriana identificadas en cualquiera de o la totalidad de las etapas a) , b) y e). Las secuencias seleccionadas pueden expresarse en una célula; y puede confirmarse la actividad DHAD en la célula. Las secuencias seleccionadas pueden purificarse adicionalmente para obtener una proteína purificada, y la actividad de la enzima DHAD [2Fe-2S] de esa proteína purificada puede confirmarse por espectroscopia UV vis y de EPR.
Otro aspecto de la invención está dirigido a una célula huésped microbiana que comprende por lo menos una enzima DHAD [2Fe-2S] heteróloga que puede identificarse con los métodos descritos en la presente descripción. La célula puede ser una célula bacteriana o una célula de levadura. La célula también puede ser una célula recombinante que produce isobutanol.
Otro aspecto de la invención es un método para la producción de isobutanol; el método comprende: a) proporcionar una célula huésped microbiana que comprende por lo menos una enzima DHAD [2Fe-2S] heteróloga que puede identificarse con los métodos descritos en la presente descripción, en donde la célula huésped comprende, además, una ruta biosintética del isobutanol; y b) cultivar la célula huésped de la etapa (a) en condiciones en las que se produce isobutanol.
Otro aspecto de la invención es un método para la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato ; el método comprende: a) proporcionar una célula huésped microbiana que comprende por lo menos una enzima DHAD [2Fe-2S] heteróloga que puede identificarse con los métodos descritos en la presente descripción y una fuente de 2,3-dihidroxiisovalerato; y b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones en donde el 2 , 3 -dihidroxiisovalerato se convierte a a-cetoisovalerato .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se comprenderá con mayor facilidad a partir de la siguiente descripción detallada, las figuras y descripciones de secuencias acompañantes, que forman parte de esta solicitud.
La Figura 1 muestra las regiones de cisternas conservadas, con C para cisteína en negrita, en una DHAD [4Fe-4S] y en las DHAD [2Fe-2S] bacterianas representativas. Se usan abreviaturas de una sola letra para los aminoácidos.
La Figura 2 muestra un árbol filogenético de las proteínas relacionadas con la DHAD. Se marcan las ramas para las DHAD [2Fe-2S] y [4Fe-4S] , así como las EDD, deshidratasas del ácido aldónico y un grupo sin definir (Und) . Se marcan individualmente las DHAD seleccionadas.
La Figura 3 muestra las rutas biosintéticas para la producción de isobutanol.
Las Figuras 4A y 4B muestran gráficas de estabilidad de la actividad en presencia de aire para la DHAD de (Figura 4A) S. mutans, y (Figura 4B) DHAD de E. coli.
La Figura 5 muestra un trazado del espectro ultravioleta visible de la DHAD de S. mutans.
La Figura 6 muestra un trazado del espectro de resonancia paramagnética electrónica (EPR) de la DHAD de S. mutans a distintas temperaturas, entre -253 °C (20 °K) y -183 °C (90 °K) .
La Figura 7 muestra un análisis de HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución, por sus siglas en inglés) de un extracto de células de levadura que expresan genes acetolactato sintasa, KARI y DHAD de S. mutans, con un pico de isobutanol a los 47.533 minutos.
La Figura 8 muestra una gráfica de estabilidad de la DHAD de L. lactis en presencia de aire.
La Figura 9 muestra un trazado del espectro UV vis de la DHAD de L. lactis purificada.
La Tabla 1 es una tabla del perfil HMM (Modelo oculto de Markov, por sus siglas en inglés) para dihidroxiácido deshidratasas basado en enzimas con función ensayada conforme la preparación que se describe en el Ejemplo 1. La Tabla 1 se presenta como adjunto en forma electrónica y se incorpora en la presente descripción como referencia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS Las siguientes secuencias cumplen con el Título 37 del C.F.R., 1.821-1.825 ("Requisitos para solicitudes de patentes que contienen descripciones de secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos - reglas de las secuencias") según la norma ST. 25 (1998) de la Organización Mundial de Propiedad Intelectual (WIPO, por sus siglas en inglés) y los requisitos para listados de secuencias de la EPO y el PCT (Reglas 5.2 y 49.5(a-bis), y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones Administrativas) . Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen con las reglas que se describen en el Título 37 del C.F.R., §1.822.
Tabla 2a. Proteínas de DHAD [2Fe-2S] bacterianas representativas y secuencias codificantes Methylobacterium nodulans ORS 2060 49 50 Rhodopseudomonas palustris BisB5 51 52 Rhodopseudomonas palustris BisB18 53 54 Bradyrhizobium sp. ORS278 55 56 Bradyrhizobium japonicum USDA 110 57 58 Fulvimarina pelagi HTCC2506 59 60 Aurantimonas sp. SI85-9A1 61 62 Hoeflea phototrophica DFL-43 63 64 Mesorhizobium loti MAFF303099' 65 66 Mesorhizobium sp. BNC1 67 68 Parvibaculum lavamentivorans DS-1 69 70 Loktanella vestfoldensis SKA53 71 72 Roseobacter sp. CCS2 73 74 Dinoroseobacter shibae DFL 12 75 76 Roseovarius nubinhibens ISM 77 78 Sagittula stellata E-37 79 80 Roseobacter sp. AzwK-3b 81 82 Roseovarius sp. TM1035 83 84 Oceanicola batsensis HTCC2597 85 86 Oceanicola granulosus HTCC2516 87 88 Rhodobacterales bacterium HTCC2150 89 90 Paracoccus denitrificans PD1222 91 92 Oceanibulbus indolifex HEL-45 93 94 Sulfitobacter sp. EE-36 95 96 Gamma proteobacterium marina no 181 182 cultivada EBAC20E09 Gamma proteobacterium no cultivada 183 184 eBACHOT4E07 Alcanivorax borkumensis SK2 185 186 Chromohalobacter salexigens DSM 3043 187 188 Marinobacter algicola DG893 189 190 Marinobacter aquaeolei VT8 191 192 Marinobacter sp. ELB17 193 194 Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 195 196 Acinetobacter sp. ADP1 197 198 Opitutaceae bacterium TAV2 199 200 Flavobacterium sp. MED217 201 202 Cellulophaga sp. MED134 203 204 Kordia algicida OT-1 205 206 Flavobacteriales bacterium ALC-1 207 208 Psychroflexus torquis ATCC 700755 209 210 Flavobacteriales bacterium HTCC2170 211 212 Eubacterium SCB49 no identificada 213 214 Gramella forsetii KT0803 215 216 Robiginitalea biformata HTCC2501 217 218 Tenacibaculum sp. MED152 219 220 Polaribacter irgensii 23 -P 221 222 Pedobacter sp. BAL39 223 224 Nitrosospira multiformis ATCC 25196 311 312 Chloroflexus aggregans DSM 9485 313 314 Leptospirillum sp. Grupo II UBA 315 316 Leptospirillum sp. Grupo II UBA 317 318 Halorhodospira halophila SL1 319 320 Nitrococcus mobilis Nb-231 321 322 Alkalilimnicola ehrlichei MLHE-1 323 324 Deinococcus geothermalis DSM 11300 325 326 Polynucleobacter sp. QLW-P1DMWA-1 327 328 Polynucleobacter necessarius STIR1 329 330 Azoarcus s . EbNl 331 332 Burkholderia phymatum STM815 333 334 Burkholderia xenovorans LB400 335 336 Burkholderia multivorans ATCC 17616 337 338 Burkholderia cenocepacia PC184 339 340 Burkholderia mallei GB8 caballo 4 341 342 Ralstonia eutropha JMP134 343 344 Ralstonia metallidurans CH34 345 346 Ralstonia solanacearum UW551 347 348 Ralstonia pickettii 12J 349 350 Limnobacter sp. MEDI05 351 352 Herminiimonas arsenicoxydans 353 354 Bordetella parapertussis 355 356 Bordetella petrii DSM 12804 357 358 Polaromonas sp. JS666 359 360 Polaromonas naphthalenivorans CJ2 361 362 Rhodoferax ferrireducens T118 363 364 Verminephrobacter eiseniae EFOl-2 365 366 Acidovorax sp. JS42 367 368 Delftia acidovorans SPH-1 369 370 Methylibium petroleiphilum PM1 371 372 Gamma proteobacterium KT 71 373 374 Tremblaya princeps 375 376 Blastopirellula marina DSM 3645 377 378 Planctomyces maris DSM 8797 379 380 Salinibacter ruber DSM 13855 387 388 Tabla 2b. Otras proteínas de DHAD [2Fe-2S] bacterianas representativas y secuencias codificantes Rhodobacterales bacterium HTCC2083 585 586 Candidatus Pelagibacter sp. HTCC7211 587 588 Chitinophaga pinensis DSM 2588 589 590 Alcanivorax sp. DG881 591 592 Micrococcus luteus NCTC 2665 593 594 Verrucomicrobiae bacterium DG1235 595 596 Synechococcus sp. PCC 7335 597 598 Brevundimonas sp. BAL3 599 600 Dyadobacter fermentans DSM 18053 601 602 Gamma proteobacterium NOR5-3 603 604 Gamma proteobacterium NOR51-B 605 606 Cyanobium sp. PCC 7001 607 608 Jonesia denitrificans DSM 20603 609 610 Brachybacterium faecium DSM 4810 611 612 Paenibacillus sp. JDR-2 613 614 Octadecabacter antarcticus 307 615 616 Variovorax paradoxus SI10 617 618 Tabla 3. Números de identificación de secuencias de otras proteínas y secuencias codificantes Las secs. con núms . de ident.: 395-409, 412-421, 424 y 431-436 son cebadores para análisis de PCR, secuenciación o clonación usados y descritos en los ejemplos de la presente invención.
La sec. con núm. de ident.: 410 es la secuencia de nucleótidos del vector pDMl .
La sec. con núm. de ident . : 411 es la secuencia de nucleótidos del vector pLH532.
La sec. con núm. de ident.: 425 es el promotor FBA de S. cerevisiae .
La sec. con núm. de ident.: 430 es la secuencia de nucleótidos del vector pRS423 FBA ilvD(Strep).
La sec. con núm. de ident.: 437 es la secuencia de nucleótidos del vector pNY13 La sec. con núm. de ident.: 438 es la región codificante de alsS de B. subtilis .
La sec. con núm. de ident.: 439 es el promotor GPD de S. cerevisiae .
La sec. con núm. de ident.: 440 es el terminador CYC1 de S. cerevisiae .
La sec. con núm. de ident. : 442 es el gen ILV5 de S. cerevisiae .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se describe en la presente descripción, los solicitantes han resuelto el problema mencionado a través del descubrimiento de métodos para identificar DHAD [2Fe-2S] . A través del descubrimiento de estas enzimas y su uso en huéspedes recombinantes , se ha identificado una ventaja de actividad poco apreciada hasta ahora en la manipulación genética de rutas con DHAD.
La presente invención se refiere a células recombinantes bacterianas o de levadura manipuladas genéticamente para proporcionar la expresión heteróloga de dihidroxiácido deshidratasas (DHAD) que tienen un grupo [2Fe-2S] . La DHAD expresada actúa como componente de una ruta biosintética para la producción de un compuesto, tal como valina, isoleucina, leucina, ácido pantoténico o isobutanol. Estos aminoácidos y el ácido pantoténico pueden usarse como suplementos nutricionales , y el isobutanol puede usarse como aditivo para combustibles para reducir la demanda de petroquímicos .
Se usarán las siguientes abreviaturas y definiciones para la interpretación de la especificación y de las reivindicaciones .
Como se usa en la presente descripción, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene", o cualquier otra variante de estos, pretenden abarcar una inclusión no excluyente. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, método, artículo o aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente solo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente lo contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual) , A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual) , y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .
Asimismo, los artículos indefinidos "un(a) " y "unos (as)" que preceden un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias (es decir, ocurrencias) del elemento o componente. Por consiguiente, "un(a)" o "unos (as)" deben interpretarse para incluir uno o por lo menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente también incluye el plural, a menos que el número obviamente indique que es singular.
El término "invención" o "presente invención", tal como se usa en la presente descripción, es un término no limitante y no está previsto para referirse a cualquier modalidad individual de la invención en particular, sino que abarca todas las modalidades posibles según se describe en la especificación y en las reivindicaciones.
Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" , que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo empleados en la invención, se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos de manejo de líquidos y de mediciones típicos usados para preparar concentrados o soluciones de uso en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" abarca, además, cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial específica. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente" , las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad el término "aproximadamente" significa una cantidad dentro del 10 % del valor numérico reportado, preferentemente, dentro del 5 % del valor numérico reportado.
La expresión "DHAD [2Fe-2S] " se refiere a enzimas DHAD que tienen un grupo [2Fe-2S] ligado.
La expresión "DHAD [4Fe-4S] " se refiere a enzimas DHAD que tienen un grupo [4Fe-4S] ligado. La expresión "dihidroxiácido deshidratasa" se abrevia DHAD y se refiere a una enzima que convierte 2,3-dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato .
La expresión "ruta biosintética del isobutanol" se refiere a una ruta enzimática para producir isobutanol a partir de piruvato.
La frase "un anaerobio facultativo" se refiere a un microorganismo que puede crecer en ambientes tanto aerobios como anaerobios .
Las frases "sustrato de carbono" o "sustrato fermentable de carbono" se refieren a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por organismos huésped de la presente invención y, específicamente, a fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos y sustratos de un solo carbono, o mezclas de estos. Los sustratos de carbono pueden incluir azúcares de C6 y C5 y mezclas de estos.
El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica que incluye, opcionalmente, las secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificantes) y que siguen (secuencias 3' no codificantes) a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentren juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de distintos orígenes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan del mismo origen, pero se disponen de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen "foráneo" o "heterólogo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped, sino que se introduce en el organismo huésped por transferencia de genes . Los genes foráneos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma por medio de un procedimiento de transformación.
Como se usa en la presente descripción, la expresión "región codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras adecuadas" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro o corriente abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento del ARN, sitio de unión a efectores y estructura de tallo-lazo.
El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. Generalmente, una secuencia de codificación se localiza en dirección 3 ' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores distintos que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos sintéticos de ADN. Los experimentados en la técnica comprenderán que los distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos de células diferentes, o en distintas etapas del desarrollo, o en respuesta a condiciones ambientales o fisiológicas diferentes. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayor parte de los tipos de células la mayor parte de las veces se denominan, comúnmente, "promotores constitutivos". También se reconoce que dado que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido totalmente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad promotora idéntica.
El término "operativamente unido" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico para que la función de una se vea afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificantes pueden estar operativamente unidas a secuencias reguladoras en orientación codificante o no codificante.
Como se usa en la presente descripción, el término "expresión" se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN codificante (ARm) o ARN no codificante derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. El término también puede referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un organismo huésped, lo que produce una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos" , "recombinantes" o "transformados" .
Los términos "plásmido" y "vector" , como se usan en la presente descripción, se refieren a un elemento extracromosómico que frecuentemente presenta genes que no son parte del metabolismo central de la célula y, usualmente, están en la forma de moléculas de ADN bicatenario circular. Estos elementos pueden ser secuencias que se replican autónomamente, secuencias integradoras de genomas, secuencias de nucleótidos o fagos, lineales o circulares, de un ARN o ADN mono o bicatenario, derivadas de cualquier fuente, en donde varias de las secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única capaz de introducir un fragmento de un promotor y secuencia de ADN para un producto de gen seleccionado junto con la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula.
Como se usa en la presente descripción, la expresión "degeneración de codones" se refiere a la naturaleza del código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El técnico experimentado conoce perfectamente la "preferencia codónica" exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por ello, cuando se sintetiza un gen para expresión mejorada en una célula huésped, es conveniente diseñar el gen de manera que su frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia preferida de uso de codones de la célula huésped.
La expresión "optimizado por codones" , en lo que se refiere a genes o regiones codificantes de moléculas de ácido nucleico para transformación de diversos huéspedes, se refiere a la alteración de codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso típico de codones del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el ADN.
Como se usa en la presente descripción, las frases "fragmento aislado de ácido nucleico" o "molécula aislada de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que contiene, opcionalmente , bases nucleotídicas sintéticas no naturales o alteradas. Un fragmento aislado de ácido nucleico en la forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.
Un fragmento de ácido nucleico es "hibridable" con otro fragmento de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o molécula de ARN, cuando una forma monocatenaria del fragmento de ácido nucleico puede aparearse con el otro fragmento de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y potencia iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y de lavado son muy conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2°. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989) , particularmente, el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 de este manual (que se incorporan en la presente descripción como referencia) . Las condiciones de temperatura y potencia iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para identificar fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homologas de organismos poco relacionados) con fragmentos muy similares (tales como los genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados) . Los lavados posteriores a la hibridación determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones preferidas usa una serie de lavados que comienzan con 6X SSC, 0.5 % SDS a temperatura ambiente durante 15 min, para luego repetirse con 2X SSC, 0.5 % SDS a 45 °C durante 30 min, y después repetirse dos veces con 0.2X SSC, 0.5 % SDS a 50 °C durante 30 min. Un conjunto de condiciones de rigurosidad de mayor preferencia usa temperaturas más altas en las que los lavados son idénticos a los mencionados anteriormente, excepto que la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en 0.2X SSC, 0.5 % SDS se incrementó a 60 °C. Otro conjunto preferido de condiciones altamente rigurosas usa dos lavados finales en 0. IX SSC, 0.1 % SDS a 65 °C. Otro conjunto de condiciones rigurosas incluye la hibridación a 0.1X SSC, 0.1 % SDS, 65 °C y lavados con 2X SSC, 0.1 % SDS seguidos de 0.1X SSC, 0.1 % SDS, por ejemplo.
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles las faltas de coincidencias entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables muy conocidas en la técnica. A mayor grado de similaridad u homología entre las dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a un valor más alto de Tm) de hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN : ARN, ADN :ADN . Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tm (véase Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucléotidos , la posición de las faltas de coincidencias se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). En una modalidad, la longitud de un ácido nucleico hibridable es de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferentemente, la longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos; con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos; y, con la máxima preferencia, la longitud es de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, el técnico experimentado reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado podrán regularse según sea necesario de conformidad con factores tales como la longitud de la sonda.
Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos es aquella porción que comprende una cantidad suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, ya sea por evaluación manual de la secuencia por parte de una persona con experiencia en la técnica o por comparación e identificación de secuencias automatizada por computadora mediante el uso de algoritmos, tales como BLAST (Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)). Generalmente, se necesita una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos para identificar putativamente una secuencia de polipéptidos o de ácidos nucleicos como homologa de una proteína o un gen conocidos. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicas para genes que comprenden de 20 a 30 nucleótidos contiguos pueden usarse en métodos dependientes de secuencias para identificación (por ejemplo, hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación ín si tu de colonias bacterianas o placas bacteriófagas ) de genes. Además, los oligonucleótidos cortos de 12-15 bases pueden usarse como cebadores para la amplificación por PCR con el fin de obtener un fragmento específico de ácido nucleico que comprende los cebadores. Por consiguiente, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende una cantidad suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La especificación de la presente instruye sobre la secuencia completa de aminoácidos y de nucleótidos que codifican proteínas específicas. El técnico con experiencia, con el beneficio de las secuencias como se reportan en la presente descripción, puede usar ahora todas o una porción sustancial de las' secuencias descritas para propósitos conocidos para los experimentados en la técnica. Por lo tanto, la presente invención comprende las secuencias completas como se reportan en el Listado de secuencias anexo, así como las porciones sustanciales de aquellas secuencias, como se definió anteriormente.
El término "complementario" se usa para describir la relación entre bases nucleotídicas que son capaces de ibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria de la timina, y la citosina es complementaria de la guanina.
La frase "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según lo determinado al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" o "identidad de secuencia" también significa el grado de relación de secuencias entre las secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, conforme cada caso, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de estas secuencias. La "identidad" y "similitud" pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M . , Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W. , Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M . , y Griffin, H. G. , Eds . ) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G. , Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J. , Eds . ) Stockton: NY (1991).
Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los cálculos de alineamientos de secuencia y de porcentajes de identidad pueden realizarse con el programa MegAlign™ del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . El alineamiento múltiple de las secuencias se realiza con el "Método de alineamiento Clustal" , que abarca distintas variedades del algoritmo que incluyen el "Método de alineamiento Clustal V" que corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Coput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) e incluido en el programa MegAlign™ del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alineamientos múltiples, los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN10. Los parámetros predeterminados para los alineamientos por pares y para el cálculo del porcentaje de identidad de secuencias de proteínas con el método Clustal son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. Para ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=5, VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias con el programa Clustal V, es posible obtener un "porcentaje de identidad" al observar la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa. Además, está disponible el "Método de alineamiento Clustal W" que corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl . Biosci . 8:189-191(1992) Thompson, J. D., Higgins, D. G. , y Gibson T. J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673 4680) e incluido en el programa MegAlign™ v6.1 del paquete de programas de bioinformática de LASERGENE (DNASTAR Inc . ) . Parámetros predeterminados para alineamiento múltiple (PENALIDAD DEL GAP=10, PENALIDAD POR LONGITUD DEL GAP=0.2, Retardo de las secuencias divergentes (%) =30 , peso de transición del ADN=0.5, matriz de pesos para proteínas=Serie de Gonnet, matriz de pesos para el ADN=IUB) . Después del alineamiento de las secuencias mediante el uso del programa Clustal , es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa.
Una persona con experiencia en la técnica comprenderá muy bien que para identificar polipéptidos a partir de otras especies, en donde los polipéptidos tienen una función o actividad igual o similar, son útiles varios niveles de identidad de secuencia. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidades incluyen, pero no se limitan a: 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o puede ser útil cualquier porcentaje entero de 55 % a 100 % para describir la presente invención, tal como 55 %, 56 %, 57 %, 58 59 60 %, 61 62 %, 63 %, 64 %, 65 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 72 %, 73 , 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 79 80 %, 81 %, 82 %, 83 % , 84 %, 85 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 Los fragmentos de ácido nucleico adecuados no sólo tienen las homologías mencionadas anteriormente, sino que típicamente codifican un polipéptido que tiene por lo menos 50 aminoácidos, preferentemente, por lo menos 100 aminoácidos, con mayor preferencia, por lo menos 150 aminoácidos, aún con mayor preferencia, por lo menos 200 aminoácidos y, con la máxima preferencia, por lo menos 250 aminoácidos.
La frase "software/programa de análisis de secuencias" se refiere a cualquier algoritmo computacional o programa de software que sea útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El "software/programa de análisis de secuencias" puede estar comercialmente disponible o desarrollarse de manera independiente. El software de análisis de secuencias típico incluye, pero no se limita a: 1.) el conjunto de programas de GCG (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI) ; 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al . , J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc . adison, WI) ; 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) ; y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Fecha de reunión, 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY) . Dentro del contexto de esta aplicación, se entenderá que cuando el análisis se realiza con el programa de análisis de secuencias, los resultados del análisis estarán basados en los "valores predeterminados" del programa de referencia, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Como se usa en la presente descripción, "valores predeterminados" se refiere a cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el programa la primera vez que se inicia.
Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante usadas en la presente descripción son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (de aquí en adelante, "Maniatis"); y en Silhavy, T. J. , Bennan, M. L. y Enquist, L. W. , Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984) ; y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987) . Otros métodos que se usan aquí están en Methods in Enzymology, Volumen 194, Guiáe to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA) .
Descubrimiento de las DHAD [2Fe-2S] Las proteínas de las DHAD son conocidas por contener un grupo ligado de hierro-azufre (Fe-S) que se requiere para la actividad enzimática. La única DHAD con un grupo [2Fe-2S] informada hasta la fecha es una enzima de la espinaca (Flint y Emptage (1988) J. Biol. Chem. 263:3558-3564). También se conocen algunas enzimas bacterianas, y la mejor caracterizada de estas es de E. coli (Flint, DH, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:14732-14742), que tiene un grupo [4Fe-4S] .
Los solicitantes han determinado ahora que existe una clase de DHAD bacterianas que contienen un grupo [2Fe-2S] (las DHAD [2Fe-2S] ) . Los solicitantes han descubierto que el grupo de DHAD [2Fe-2S] puede distinguirse de un grupo de DHAD [4Fe-4S] por la presencia de tres residuos de cisteínas conservados en la proteína. Las tres cisteínas conservadas son similares a las tres cisteínas esenciales descritas en la arabonato deshidratasa (un ácido aldónico) de Azospirillum brasiliense (Watanabe, S et al. J. Biol. Chem. (2006) 281:33521-33536) que se informó contiene un grupo [4Fe-4S] . En la proteína arabonato deshidratasa de Azospirillum brasiliense, se determinó que las cisteínas localizadas en las posiciones de aminoácidos 56, 124 y 197 eran esenciales para la actividad enzimática y probablemente participaban en coordinación con el grupo Fe-S. Sorprendentemente, los solicitantes han descubierto que tres cisteínas conservadas que están en las posiciones correspondientes a las tres cisteínas esenciales de la arabonato deshidratasa de Azospirillum brasiliense son características de las DHAD que contienen un grupo [2Fe-2S ] . Los solicitantes han descubierto que la DHAD de E. coli, que contiene un grupo [4Fe-4S] , tiene dos de las cisteínas conservadas, pero no la tercera cisteína conservada. En la Figura 1 se muestra una comparación de las regiones de las secuencias de las cisteínas conservadas para las DHAD de E. coli que contienen grupos [4Fe-4S] y para casos representativos de un grupo filogenético de las DHDA con grupos [2Fe-2S] que se identificó en la presente en el Ejemplo 1 y que se describe más adelante.
Los solicitantes han desarrollado un método para identificar las DHAD [2Fe-2S] . En la presente invención las DHAD [2Fe-2S] bacterianas, que pueden ser identificadas con este método, pueden usarse para expresión heteróloga en bacterias .
Para caracterizar estructuralmente las enzimas DHAD, se preparó un perfil de modelos ocultos de Markov (HMM, por sus siglas en inglés), como se describe en el Ejemplo 1, mediante el uso de secuencias de aminoácidos de proteínas de DHAD con función verificada experimentalmente, según lo determinado en el Ejemplo 2 de la presente, y se proporcionan en la Tabla 1. Estas DHAD son de Nitrosomonas europaea (ADN, sec con núm. de ident.: 309; proteína, sec. con núm. de ident.: 310), Synechocystis sp. PCC6803 (ADN, sec con núm. de ident.: 297; proteina, sec. con núm. de ident.: 298), Streptococcus mutans (ADN, sec. con núm. de ident.: 167; proteína, sec. con núm. de ident.: 168), Streptococcus thermophilus (ADN, sec. con núm. de ident.: 163; sec. con núm. de ident.: 164), Ralstonia metallidurans (ADN, sec. con núm. de ident.: 345; proteína, sec. con núm. de ident.: 346), Ralstonia eutropha (ADN, sec. con núm. de ident.: 343; proteína, sec. con núm. de ident.: 344), y Lactococcus lactis (ADN, sec. con núm. de ident.: 231; proteína, sec. con núm. de ident.: 232). Además, se comprobó que la DHAD de Flavobacterium johnsoniae (ADN, sec. con núm. de ident.: 229; proteína, sec. con núm. de ident.: 230) tenía actividad dihidroxiácido deshidratasa al expresarse en E. coli y se usó para elaborar el perfil. Este perfil HMM para las DHAD puede usarse para identificar las proteínas relacionadas con la DHAD. Cualquier proteína que coincida con el perfil HMM que tenga un valor de E de < 10"5 es una proteína relacionada con la DHAD, que incluye las DHAD [4Fe-4S] , las DHAD [2Fe-2S] , deshidratasas del ácido aldónico y fosfogluconato deshidratasas. Un árbol filogenético de secuencias que coinciden con este perfil HMM se muestra en la Figura 2.
Después, se analizan las secuencias que coinciden con el perfil HMM dado en la presente para determinar la presencia de las tres cisteínas conservadas descritas anteriormente. Las posiciones exactas de las tres cisteínas conservadas pueden variar, y estas pueden identificarse en el contexto de la secuencia circundante al usar alineamientos múltiples de secuencias realizados con el algoritmo Clustal W (Thompson, J. D., Higgins, D. G. , y Gibson T. J. (1994) Nuc . Acid Res. 22: 4673 4680) mediante el uso de los siguientes parámetros: 1) para parámetros de alineamiento por pares, una apertura de interrupción = 10; extensión de la interrupción = 0.1; la matriz es Gonnet 250; y el modo - Lento-exacto, 2) para parámetros de alineamiento múltiple, apertura de interrupción = 10; extensión de la interrupción = 0.2; y la matriz es la serie de Gonnet. Por ejemplo, las tres cisteínas conservadas se localizan en las posiciones de aminoácidos 56, 129 y 201 en la DHAD de Streptococcus mutans (sec. con núm. de ident . : 168), y en las posiciones de aminoácidos 61, 135 y 207 en la DHAD de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident.: 232). Las posiciones exactas de las tres cisteínas conservadas en otras secuencias de proteínas corresponden a estas posiciones en la secuencia de aminoácidos de S. mutans o de L. lactis. Una persona con experiencia en la técnica podrá identificar fácilmente la presencia o ausencia de cada una de las tres cisteínas conservadas en la secuencia de aminoácidos de la proteína de DHAD al usar alineamientos por pares o múltiples de secuencias. Además, pueden usarse otros métodos para determinar la presencia de las tres cisteínas conservadas, tales como un análisis visual.
Las proteínas coincidentes con el perfil HMM para la DHAD que tienen dos cisteínas conservadas, pero no la tercera (posición 56) incluyen las DHAD [4Fe-4S] y fosfogluconato deshidratasas (EDD) . Las proteínas que tienen las tres cisteínas conservadas incluyen arabonato deshidratasas y DHAD [2Fe-2S] , y son miembros de un grupo DHAD [2Fe-2S] /deshidratasas del ácido aldónico. Las DHAD [2Fe-2S] pueden distinguirse de las deshidratasas del ácido aldónico mediante un análisis para determinar los aminoácidos conservados distintivos que se comprobó estaban presentes en las DHAD [2Fe-2S] o en las deshidratasas del ácido aldónico en posiciones que corresponden a las siguientes posiciones en la secuencia de aminoácidos de la DHAD de Streptococcus mutans . Estos aminoácidos distintivos están en las DHAD [2Fe-2S] o en deshidratasas del ácido aldónico, respectivamente, en las siguientes posiciones (con una frecuencia de aparición mayor que 90 %) : 88 asparagina en comparación con ácido glutámico; 113 no conservados en comparación con ácido glutámico; 142 arginina o asparagina en comparación con no conservados; 165: no conservados en comparación con glicina; 208 asparagina en comparación con no conservados; 454 leucina en comparación con no conservados; 477 fenilalanina o tirosina en comparación con no conservados; y 487 glicina en comparación con no conservados.
Los métodos descritos para la identificación de las enzimas DHAD [2Fe-2S] pueden llevarse a cabo en una sola secuencia o en un grupo de secuencias. En una modalidad preferida, se consulta una o más bases de datos de secuencias con un perfil HMM, tal como se describe en la presente descripción. Las bases de datos de secuencias adecuadas son del conocimiento de los experimentados en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, la base de datos para proteínas no redundante Genbank, la base de datos SwissProt, o la base de datos UniProt u otras bases de datos existentes, tales como GQPat (GenomeQuest , estboro, MA) y BRENDA (Biobase, Beverly, MA) .
Entre las DHAD [2Fe-2S] que pueden identificarse con este método, las DHAD [2Fe-2S] bacterianas pueden identificarse fácilmente a través del organismo de origen natural que es un tipo de bacteria. Cualquier DHAD [2Fe-2S] bacteriana que puede identificarse con este método puede ser adecuada para la expresión heteróloga en una célula huésped microbiana. También se comprenderá que cualquier DHAD [2Fe-2S] bacteriana descrita expresamente en la presente descripción por secuencia puede ser adecuada para la expresión heteróloga en células bacterianas.
Las enzimas DHAD [2Fe-2S] bacterianas preferidas pueden expresarse en una célula huésped y proporcionar actividad DHAD.
Inicialmente, se identificaron 193 DHAD [2Fe-2S] bacterianas diferentes con identidades de secuencia menores que 95 % (se eliminaron las proteínas con identidad mayor que 95 % para simplificar el análisis) , como se describe en el Ejemplo 1, y las secuencias de aminoácidos y codificantes de estas proteínas se proporcionan en el listado de secuencias; los números de identificación de secuencias se enumeran en la Tabla 2a.
Un análisis posterior descrito en el Ejemplo 11 produjo 268 DHAD [2Fe-2S] bacterianas diferentes. Las secuencias de aminoácidos y codificantes que no fueron idénticas a ninguna de las 193 DHAD [2Fe-2S] bacterianas proporcionadas por la identificación inicial se incluyen en el listado de secuencias, y los números de identificación de secuencias se enumeran en la Tabla 2b.
Cualquier proteína de DHAD [2Fe-2S] que coincida con una secuencia identificable a través de los métodos descritos en la presente descripción con una secuencia expresamente descrita en la presente descripción con una identidad de por lo menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % es una DHAD [2Fe-2S] que puede usarse para expresión heteróloga en células bacterianas, como se describe en la presente descripción. Entre las DHAD [2Fe-2S] bacterianas expresamente descritas en la presente invención, hay 100 % de conservación de aminoácidos distintivos en las posiciones: 88 ácido aspártico, 142 arginina o asparagina, 208 asparagina y 454 leucina.
Además, las DHAD [2Fe-2S] bacterianas que pueden usarse en la presente invención son' identificables por su posición en la rama de DHAD [2Fe-2S] de un árbol filogenético de proteínas relacionadas con la DHAD, tal como el que se muestra en la Figura 2 y se describe en el Ejemplo 1. Además, las DHAD [2Fe-2S] bacterianas que pueden usarse son identificables al usar comparaciones de secuencias con cualquiera de las 281 DHAD [2Fe-2S] bacterianas, cuyas secuencias se proporcionan en la presente invención, en donde la identidad de secuencia puede ser por lo menos aproximadamente 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 % o 95 %-99 %.
Además, las secuencias de las DHAD [2Fe-2S] proporcionadas en la presente invención pueden usarse para identificar otros homólogos en la naturaleza. Por ejemplo, cada una de las DHAD que codifican fragmentos de ácido nucleico descritas en la presente descripción pueden usarse para aislar genes que codifican proteínas homologas. El aislamiento de genes homólogos por medio de protocolos que dependen de secuencias es muy conocido en la técnica. Los ejemplos de protocolos que dependen de secuencias incluyen, pero no se limitan a: 1.) métodos de hibridación de ácidos nucleicos; 2.) métodos de amplificación de ADN y ARN, tal como se ilustra por diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos [por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), Mullís et al., la patente de los Estados Unidos núm. 4,683,202; la reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. Estados Unidos 82:1074 (1985); o amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA, por sus siglas en inglés), Walker, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos, 89:392 (1992)]; y 3.) métodos de construcción de genotecas y análisis por complementación.
Por ejemplo, los genes que codifican proteínas o polipéptidos similares a la DHAD [2Fe-2S] que codifica genes proporcionados en la presente invención podrían aislarse directamente al usar la totalidad o una porción de los fragmentos de ácido nucleico de la invención como sondas de hibridación de ADN para seleccionar genotecas a partir de cualquier organismo deseado mediante el uso de metodología muy conocida para los experimentados en la técnica. Las sondas de oligonucleótidos específicas basadas en las secuencias de ácidos nucleicos descritas pueden diseñarse y sintetizarse por métodos conocidos en la técnica (Maniatis, supra) . Más aún, todas las secuencias pueden usarse directamente para sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos para el técnico experimentado (por ejemplo, técnicas de mareaje de ADN con cebadores al azar, de traducción de mellas o de mareaje de extremos) , o sondas de ARN mediante el uso de sistemas de transcripción in vitro existentes. Además, pueden diseñarse cebadores específicos y usarse para amplificar una parte (o la longitud total) de las secuencias de la presente descripción. Los productos resultantes de la amplificación pueden marcarse directamente durante las reacciones de amplificación o después de las reacciones de amplificación, y pueden usarse como sondas para aislar fragmentos de ADN de longitud completa por hibridación en condiciones de rigurosidad adecuadas.
Típicamente, en las técnicas de amplificación del tipo de PCR, los cebadores tienen distintas secuencias y no son complementarios entre sí. Dependiendo de las condiciones de prueba deseadas, las secuencias de los cebadores deben diseñarse para proporcionar una réplica eficiente y fiel del ácido nucleico objetivo. Los métodos de diseño de cebadores para PCR son comunes y muy conocidos en la técnica (Thein y Wallace, "The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders" , en Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. E. Davis Ed., (1986) págs. 33-50, IRL: Herndon, VA; y Rychlik, ., en Methods in Molecular Biology, White, B. A. Ed., (1993) Vol . 15, págs. 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humania: Totowa, NJ) .
Generalmente, dos segmentos cortos de las secuencias descritas pueden usarse en protocolos de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican genes homólogos de ADN o ARN. La reacción en cadena de la polimerasa también puede realizarse sobre una genoteca de fragmentos de ácido nucleico clonados, en donde la secuencia de un cebador se deriva de los fragmentos de ácido nucleico descritos, y la secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de las cadenas de ácido poliadenilico al extremo 3 ' del precursor del ARNm que codifica genes microbianos.
Alternativamente, la secuencia del segundo cebador puede estar basada en secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, el técnico experimentado puede seguir el protocolo RACE (Frohman et al., PNAS, Estados Unidos 85:8998 (1988)) para generar los ADNc al usar una PCR para amplificar copias de la región entre un solo punto en el transcrito y el extremo 3' o 5'. Los cebadores orientados en las direcciones de los extremos 3 ' y 51 pueden diseñarse a partir de las secuencias de la presente descripción. Al usar los sistemas RACE 3' o RACE 5' disponibles en el mercado (por ejemplo, BRL, Gaithersburg, MD) , pueden aislarse fragmentos 3' o 5' específicos del ADNc (Ohara et al., PNAS, Estados Unidos 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)).
Alternativamente, las secuencias codificantes proporcionadas de la DHAD [2Fe-2S] pueden emplearse como reactivos de hibridación para la identificación de homólogos.
Los componentes básicos de una prueba de hibridación de ácidos nucleicos incluyen una sonda, una muestra que se sospecha contiene el gen o fragmento de gen de interés y un método de hibridación específico. Las sondas son, . típicamente, secuencias de ácido nucleico monocatenarias que son complementarias de las secuencias de ácido nucleico que se detectarán. Las sondas son "hibridables" para la secuencia de ácidos nucleicos que se detectará. La longitud de la sonda puede variar desde 5 bases hasta decenas de miles de bases y dependerá de la prueba específica que se practicará. Típicamente, es adecuada una longitud de sonda de aproximadamente 15 bases a aproximadamente 30 bases. Solo parte de la molécula de la sonda necesita ser complementaria de la secuencia de ácidos nucleicos que se detectará. Además, no es necesario que la complementariedad entre la sonda y la secuencia objetivo sea perfecta. La hibridación se producirá entre las moléculas de complementariedad imperfecta con el resultado de que una cierta fracción de las bases en la región hibridada no se apareará con la base complementaria apropiada.
Los métodos de hibridación están bien definidos.
Típicamente, la sonda y la muestra deben mezclarse en condiciones que permitan la hibridación de los ácidos nucleicos. Esto implica poner en contacto la sonda y la muestra en presencia de una sal orgánica o inorgánica en la concentración y condiciones de temperatura adecuadas. La sonda y los ácidos nucleicos de la muestra deben estar en contacto durante un tiempo suficientemente largo para que pueda producirse cualquier hibridación posible entre la sonda y los ácidos nucleicos de la muestra. La concentración de la sonda o del objetivo en la mezcla determinará el tiempo necesario para que se produzca la hibridación. Cuanto más alta sea la concentración de la sonda o del objetivo, menor será el tiempo que se necesitará para la incubación de la hibridación. Opcionalmente, puede agregarse un agente caotrópico. El agente caotrópico estabiliza los ácidos nucleicos al inhibir la actividad nucleasa. Además, el agente caotrópico permite la hibridación sensible y rigurosa de las sondas de oligonucleótidos cortas a temperatura ambiente (Van Ness and Chen, Nucí. Acids Res. 19:5143-5151 (1991)). Los agentes caotrópicos adecuados incluyen cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, tiocianato de sodio, tetracloroacetato de litio, perclorato de sodio, tetracloroacetato de rubidio, yoduro de potasio y trifluoroacetato de cesio, entre otros. Típicamente, el agente caotrópico estará presente en una concentración final de aproximadamente 3 M. Si se deseara, puede agregarse formamida a la mezcla de hibridación, típicamente, de 30 a 50 % (v/v) .
Pueden emplearse diversas soluciones de hibridación. Típicamente, estas comprenden de aproximadamente 20 a 60 % en volumen, preferentemente, 30 %, de un solvente polar orgánico.
Una solución común de hibridación emplea de aproximadamente 30 a 50 % v/v de formamida, de aproximadamente 0.15 a 1 M de cloruro de sodio, de aproximadamente 0.05 a 0.1 M de soluciones amortiguador (por ejemplo, citrato de sodio, Tris-HCl, PIPES o HEPES (intervalo de pH de aproximadamente 6-9)), de aproximadamente 0.05 a 0.2 % de detergente (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio), o de 0.5-20 mM de EDTA, FICOLL (Pharmacia Inc.) (aproximadamente 300-500 kdal) , polivinilpirrolidona (aproximadamente 250-500 kdal) y albúmina de suero. También se incluyen en la solución de hibridación típica ácidos nucleicos portadores sin marcar de aproximadamente 0.1 a 5 mg/ml, ADN nucleico fragmentado, (por ejemplo, ADN de timo de becerro o de esperma de salmón, o ARN de levadura) y, opcionalmente, de aproximadamente 0.5 a 2 % en peso/vol. de glicina. También pueden incluirse otros aditivos, tales como agentes de exclusión de volumen que incluyen una variedad de agentes polares dilatables o solubles en agua, (por ejemplo, polietilenglicol) , polímeros aniónicos (por ejemplo, poliacrilato o polimetilacrilato) , y polímeros sacarídicos aniónicos, (por ejemplo, sulfato de dextrano) .
La hibridación de ácido nucleico puede adaptase a una variedad de formatos de ensayo. Uno de los más adecuados es el formato de ensayo intercalado. Específicamente, el ensayo intercalado puede adaptarse a la hibridación en condiciones no desnaturalizantes. Un componente primario de un ensayo de tipo intercalado es un soporte sólido. El soporte sólido tiene adsorbida o acoplada covalentemente a él una sonda inmovilizada de ácidos nucleicos no marcada y que es complementaria de una porción de la secuencia.
Expresión de las DHAD [2Fe-2S] bacterianas heterólogas en huéspedes bacterianos y de levadura Los solicitantes han descubierto que una DHAD [2Fe-2S] heterologa proporciona actividad DHAD cuando se expresa en una célula microbiana. Cualquier DHAD [2Fe-2S] que pueda identificarse como se describe en la presente puede expresarse en una célula microbiana heterologa. La expresión de cualquiera de estas proteínas proporciona actividad DHAD para una ruta biosintética que incluye la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato o 2,3-dihidroximetilvalerato a -cetometilvalerato. La expresión de una DHAD [2Fe-2S] , en contraposición a una DHAD 4Fe-4D, reduce el requerimiento de grupos Fe y S para obtener actividad enzimática. Además, se comprobó en la presente invención que la DHAD [2Fe-2S] de S. mutans tiene mayor estabilidad en presencia de aire en comparación con la sensibilidad en presencia de aire de la DHAD [4Fe-4S] de E. coli, lo cual es deseable para obtener una mejor actividad en una célula huésped heterologa.
Las células bacterianas que también pueden ser huéspedes para expresión de una DHAD [2Fe-2S] bacteriana heterologa incluyen, pero no se limitan a, Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, y Brevibacterium, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, y Streptococcus . Manipular genéticamente la expresión de una DHAD [2Fe-2S] bacteriana heteróloga puede incrementar la actividad DHAD en una célula huésped bacteriana que naturalmente exprese una DHAD [2Fe-2S] o una DHAD [4Fe-4S] . Estas células huésped pueden incluir, por ejemplo, E. coli y Bacillus subtilis. Además, manipular genéticamente la expresión de una DHAD [2Fe-2S] bacteriana heteróloga proporciona actividad DHAD en una célula huésped bacteriana que no tiene actividad DHAD endógena. Estas células huésped pueden incluir, por ejemplo, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus y Leuconostoc .
Los huéspedes específicos incluyen: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus lichenifor is, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinariu , Enterococcus faecalis y Bacillus subtilis .
Una célula huésped bacteriana puede manipularse genéticamente para expresar una DHAD [2Fe-2S] bacteriana heteróloga con métodos muy conocidos para una persona con experiencia en la técnica. La región codificante de la DHAD que se expresará puede estar optimizada por codones para la célula huésped objetivo, como es muy conocido para una persona con experiencia en la técnica. Los vectores útiles para la transformación de una variedad de células huésped son comunes y están disponibles comercialmente a través de compañías tales como EPICENTRE® (Madison, WI) , Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) , Stratagene (La Jolla, CA) , y New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) . Típicamente, el vector contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica en el huésped deseado. Además, los vectores adecuados pueden comprender una región promotora que alberga controles de iniciación transcripcional y una región de control de terminación transcripcional entre las que puede insertarse un fragmento de región codificante de ADN para proporcionar la expresión de la región codificante insertada. Ambas regiones de control pueden derivarse de genes homólogos a la célula huésped transformada, aunque debe entenderse que estas regiones de control también pueden derivarse de genes que no son nativos para las especies específicas seleccionadas como huésped de producción.
Los promotores o las regiones de control de iniciación que son útiles para conducir la expresión de las regiones codificantes de DHAD [2Fe-2S] bacterianas en la célula huésped deseada son numerosos y conocidos para los experimentados en la técnica. Prácticamente, cualquier promotor capaz de conducir estos elementos genéticos es adecuado para la presente invención, los que incluyen, pero no se limitan a, promotores lac, ara, tet, trp, 1PL, lPRl T7, tac y trc (útiles para expresión en Escherichia coli, Alcaligenes y Pseudomonas) ; promotores amy, apr y npr y diversos promotores de fagos útiles para expresión en Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Paenibacillus acerans; nisA (útil para expresión en bacterias gram positivas, Eichenbaum et al. Appl . Environ. Microbiol. 64 (8) : 2763-2769 (1998)); y el promotor sintético Pll (útil para expresión en Lactobacillus plantarum, Rud et al., Microbiology 152:1011-1019 (2006)).
Las regiones de control de terminación también pueden derivarse de diversos genes nativos para los huéspedes preferidos. Opcionalmente , un sitio de terminación puede ser innecesario; sin embargo, si se incluyera, es de máxima preferencia.
Ciertos vectores tienen la capacidad de replicarse en un intervalo amplio de bacterias huésped y pueden transferirse por conjugación. Está disponible la secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados: pRK437, pRK442 y pRK442(H). Estos derivados han demostrado ser herramientas valiosas para la manipulación genética en bacterias Gram negativas (Scott et al., Plasmid 50(l):74-79 (2003)). También están disponibles varios derivados plasmídicos del plásmido de intervalo de huéspedes amplio RSF1010, IncP4 , con promotores que pueden actuar en un intervalo de bacterias Gram negativas.
Los plásmidos pAYC36 y pAYC37 tienen promotores activos junto con múltiples sitios de clonación para permitir la expresión de genes heterólogos en bacterias Gram negativas . Algunos vectores que son útiles para la transformación de Bacillus subtilis y Lactobacillus incluyen ???ß? y derivados de este (Renault et al., Gene 183:175-182 (1996); y O'Sullivan et al., Gene 137:227-231 (1993)); pMBBl y pHW800, un derivado de pMBBl (Wyckoff et al. Appl. Environ. Microbiol. 62:1481-1486 (1996)); pMGl, un plásmido conjugativo (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001)); y pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994)). También se han descrito varios plásmidos de Lactobacillus plantarum (van Kranenburg et al., Appl. Environ. Microbiol. 71 (3 ): 1223 - 1230 (2005)).
Además, hay una amplia disponibilidad de herramientas de reemplazo de genes cromosómicos . Por ejemplo, se ha modificado una variante termosensible del replicón de intervalo amplio de huéspedes pWVIOl para construir un plásmido pVE6002 que puede usarse para efectuar el reemplazo de genes en un intervalo de bacterias gram positivas (Maguin et al., J. Bacteriol. 174 (17) : 5633-5638 (1992)). Además, en el mercado se encuentran disponibles transposomas in vitro, por ejemplo, EPICENTRE®, para crear mutaciones aleatorias en una variedad de genomas.
Las células de levadura que pueden ser huéspedes para la expresión de una DHAD [2Fe-2S] bacteriana heteróloga son cualquier célula de levadura que pueda someterse a manipulación genética e incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces, Schizosaccharo yces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia y Pichia. Las cepas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces thermotolerans, Candida glabrata, Candida albicans, Pichia stipitis y Yarrowia lipolytica. La más adecuada es Saccharomyces cerevisiae.
La expresión se logra mediante la transformación con un gen que comprende una secuencia que codifica cualquiera de estas DHAD [2Fe-2S] . La región codificante de la DHAD que se expresará puede estar optimizada por codones para la célula huésped objetivo, como es muy conocido para una persona con experiencia en la técnica. Los métodos para la expresión de genes en levadura son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, Volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA) . La expresión de genes en levadura requiere, típicamente, un promotor operativamente unido a una región codificante de interés, y un terminador transcripcional . Pueden usarse varios promotores de levadura para construir los casetes de expresión para genes en levadura, que incluyen, pero no se limitan a, promotores derivados de los siguientes genes: CYC1, HIS3, GAL1, GALIO, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD, GPM, y AQX1. Los terminadores transcripcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, FBAt , GPDt, GPMt , ERGIOt, GALlt, CYC1 y ADH1.
Los promotores, terminadores transcripcionales y regiones codificantes de DHAD [2Fe-2S] adecuados pueden clonarse en vectores lanzadera de E. coli- levadura y transformarse en células de levadura. Estos vectores permiten la propagación de cepas tanto en cepas de E. coli como en cepas de levadura. Típicamente, el vector usado contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica en el huésped deseado. Típicamente, los plásmidos usados en levadura son los vectores transportadores pRS423, pRS424, pRS425 y pRS426 (Colección de cultivos de tipo estadounidense, ATCC, por sus siglas en inglés, Rockville, MD) , que contienen un origen de replicación de E. coli (por ejemplo, pMBl) , un origen de replicación de levadura de 2 µ y un marcador para selección nutricional. Los marcadores de selección para estos cuatro vectores son His3 (vector pRS423) , Trpl (vector pRS424) , Leu2 (vector pRS425) y Ura3 (vector pRS426) . La construcción de vectores de expresión con un gen quimérico que codifica las DHAD descritas puede realizarse por técnicas estándar de clonación molecular en E. coli o por el método de recombinación por reparación de la interrupción en levadura.
El método de clonación de reparación de la interrupción aprovecha la recombinación homologa sumamente eficiente en levadura. Típicamente, un ADN de un vector de levadura se digiere (por ejemplo, en su sitio de clonación múltiple) para crear una interrupción en su secuencia. Se generan varios insertos de los ADN de interés que contienen una secuencia de = 21 pb en ambos extremos 5' y 3', que se superponen secuencialmente entre sí, y con la terminal 5' y 3' del ADN del vector. Por ejemplo, para construir un vector de expresión en levadura para el "Gen X", se seleccionan un promotor de levadura y un terminador de levadura para el c sete de expresión. El promotor y el terminador se amplifican a partir del ADN genómico de la levadura, y el Gen X se amplifica o bien por PCR a partir de su organismo de origen o se obtiene de un vector de clonación que comprende la secuencia del Gen X. Por lo menos hay una secuencia de superposición de 21 pb entre el extremo 5' del vector linealizado y la secuencia promotora, entre el promotor y el Gen X, entre el Gen X y la secuencia terminadora, y entre el terminador y el extremo 3' del vector linealizado. Después, el vector con interrupciones y los insertos de ADN se cotransforman en una cepa de levadura y se siembran en una placa en el medio que contiene las mezclas de compuestos apropiados que permiten la complementación de los marcadores de selección nutricional en los plásmidos . La presencia de las combinaciones correctas de insertos puede confirmarse con mapeo por PCR mediante el uso del ADN plasmídico preparado a partir de las células seleccionadas. El ADN plasmídico aislado de levadura (habitualmente, de concentración baja) puede transformarse después en una cepa de E. coli, por ejemplo, TOP10, seguido de minipreparaciones y mapeo por restricción para verificar adicionalmente el constructo del plásmido. Finalmente, el constructo puede verificarse por análisis de secuencias.
Al igual que la técnica de reparación de la interrupción, la integración en el genoma de la levadura también aprovecha el sistema de recombinación homologa en levadura. Típicamente, un cásete que contiene una región codificante más elementos de control (promotor y terminador) y un marcador auxotrófico se amplifica por PCR con una ADN polimerasa de alta fidelidad mediante el uso de cebadores que se hibridizan con el cásete y contienen de 40 a 70 pares de bases de homología de secuencias para las regiones 5' y 3' del área genómica en donde se desea la inserción. Después el producto de la PCR se transforma en levadura y se siembra en una placa con un medio que contiene las mezclas de compuestos apropiados que permiten la selección del marcador auxotrófico integrado. Por ejemplo, para integrar el "Gen X" en la ubicación cromosómica "Y", el constructo de promotor-región codificante X-terminador se amplifica por PCR a partir de un constructo de ADN plasmídico y se une a un marcador autotrófico (tal como URA3) por medio de PCR SOE (PCR con método de unión por extensión de solapamiento, por sus siglas en inglés) o por métodos comunes de clonación y digestión por restricción. El cásete completo, que contiene el promotor-región codificante X-terminador-región de URA3 se amplifica por PCR con secuencias de cebadores que contienen de 40 a 70 pb de homología para las regiones 5' y 3' de la ubicación "Y" en el cromosoma de la levadura. El producto de la PCR se transforma en levadura y se selecciona en medios de crecimiento sin uracilo. Los transformantes pueden verificarse o bien por PCR de colonias o por secuenciación directa del ADN cromosómico.
Confirmación de la actividad DHAD La presencia de actividad DHAD en una célula manipulada genéticamente para expresar una DHAD [2Fe-2S] bacteriana puede confirmarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Para dar un ejemplo, y según lo demostrado en los ejemplos de la presente invención, los extractos crudos de las células manipuladas genéticamente para expresar una DHAD [2Fe-2S] bacteriana pueden usarse en un análisis de DHAD, según lo descrito por Flint y Emptage (J. Biol . Chem. (1988) 263(8): 3558-64) al usar dinitrofenilhidracina . En otro ejemplo, según lo demostrado en los ejemplos de la presente descripción, puede evaluarse la actividad DHAD al expresar una DHAD bacteriana que puede identificarse con los métodos descritos en la presente en una cepa de levadura que no tiene actividad DHAD endógena. Si la actividad DHAD está presente, la cepa de levadura crecerá en ausencia de aminoácidos de cadena ramificada. También puede confirmarse la actividad DHAD con métodos más indirectos, tales como mediante el análisis de un producto corriente abajo de una ruta que requiera actividad DHAD. Puede medirse cualquier producto que tenga a-cetoisovalerato o -cetometilvalerato como intermedio de una ruta para evaluar la actividad DHAD. Una lista de estos productos incluye, pero no se limita a, valina, isoleucina, leucina, ácido pantoténico, 2-metil-l-butanol, 3 -metil-l-butanol e isobutanol.
Producción de isobutanol La expresión de una DHAD [2Fe-2S] bacteriana en bacterias o levadura, como se describe en la presente descripción, proporciona la célula huésped recombinante transformada con actividad dihidroxiácido deshidratasa para la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato o 2 , 3 -dihidroximetilvalerato a -cetometilvalerato. Cualquier producto que tenga a-cetoisovalerato o a-cetometilvalerato como intermedio de ruta puede producirse con mayor eficacia en las cepas bacterianas o de levadura descritas en la presente descripción que tengan la DHAD [2Fe-2S] heteróloga descrita. Una lista de estos productos incluye, pero no se limita a, valina, isoleucina, leucina, ácido pantoténico, 2-metil-l-butanol , 3 -metil-l-butanol e isobutanol.
Por ejemplo, la biosíntesis de valina en levadura incluye las etapas de conversión de acetolactato a 2 , 3-dihidroxi-isovalerato por la acetohidroxiácido reductoisomerasa (ILV5) , conversión de 2 , 3-dihidroxi-isovalerato a a-cetoisovalerato (también denominado 2-cetoisovalerato) por la dihidroxiácido deshidratasa, y conversión de a-cetoisovalerato a valina por las transaminasas de aminoácidos de cadena ramificada (BAT2) y las aminotransferasas de aminoácidos de cadena ramificada (BATI) . La biosíntesis de leucina incluye las mismas etapas para a-cetoisovalerato, seguidas por la conversión de a-cetoisovalerato a alfa-isopropilmalato por la alfa-isopropilmalato sintasa (LEU9, LEU4) , conversión de alfa-isopropilmalato a beta-isopropilmalato por la isopropilmalato isomerasa (LEU1) , conversión de beta-isopropilmalato a alfa-cetoisocaproato por la beta-IPM deshidrogenasa (LEU2) y, finalmente, conversión de alfa-cetoisocaproato a leucina por las transaminasas de aminoácidos de cadena ramificada (BAT2) y las aminotransferasas de aminoácidos de cadena ramificada (BATI) . La ruta bacteriana es similar e involucra proteínas y genes denominados de manera diferente. La conversión incrementada de 2, 3-dihidroxi-isovalerato a a-cetoisovalerato aumentará el flujo en estas rutas, particularmente, si se sobreexpresan una o más enzimas adicionales de una ruta. Por ello, para la producción de valina o leucina, se desea usar una cepa descrita en la presente invención.
La biosíntesis de ácido pantoténico incluye una etapa realizada con DHAD, así como las etapas realizadas con cetopantoato hidroximetiltransferasa y pantotenato sintasa. La manipulación genética de la expresión de estas enzimas para la producción mejorada de la biosíntesis del ácido pantoténico en microorganismos se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 6,177,264.
El producto a-cetoisovalerato de DHAD es un producto intermedio en las rutas biosintéticas del isobutanol descritas en la publicación de patente copendiente y de propiedad mancomunada de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, que se incorpora en la presente descripción como referencia. En la Figura 3 se proporciona un diagrama de las rutas biosintéticas descritas del isobutanol. La producción de isobutanol en una cepa descrita en la presente descripción se beneficia de la actividad DHAD incrementada. Como se describe en la presente descripción, la actividad DHAD se proporciona mediante la expresión de una DHAD [2Fe-2S] bacteriana en una célula bacteriana o de levadura. Como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, las etapas en un ejemplo de la ruta biosintética del isobutanol incluyen la conversión de: piruvato a acetolactato (véase la Figura 1, etapa a de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la acetolactato sintasa, acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato (véase la Figura 1, etapa b de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la acetohidroxiácido isomerorreductasa ; - 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato (véase la Figura 1, etapa c de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la acetohidroxiácido deshidratasa, también denominada dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) ; - a-cetoisovalerato a isobutiraldehído (véase la Figura 1, etapa d de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la -ceto ácido descarboxilasa de cadena ramificada; y isobutiraldehído a isobutanol (véase la Figura 1, etapa e de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada.
El sustrato para las conversiones de productos y las enzimas involucradas en estas reacciones para las etapas f, g, h, I, j, y k de rutas alternativas se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al.
Los genes que pueden usarse para expresión de las enzimas de las etapas de ruta mencionadas anteriormente que no son las DHAD [2Fe-2S] bacterianas descritas en la presente descripción, así como aquellos para dos rutas adicionales del isobutanol, se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al, y otros genes que pueden usarse pueden ser identificados por una persona con experiencia en la técnica a través de métodos bioinformáticos o experimentales, tal como se describió anteriormente. El uso preferido en las tres rutas de enzimas cetoácido reductoisomerasa (KARI) con actividades particularmente altas se describe en la publicación de solicitud de patente copendiente y de propiedad mancomunada de los Estados Unidos núm. 20080261230A1. Los ejemplos de actividad alta de las KARI descritos en esa patente son los de Vibrio cholerae (ADN: sec. con núm. de ident.: 389; proteina, sec. con núm. de ident.: 390), Pseudomonas aeruginosa PA01, (ADN: sec. con núm. de ident.: 422; proteína, sec. con núm. de ident.: 423), y Pseudomonas fluorescens PF5 (ADN: sec. con núm. de ident.: 391; proteína, sec. con núm. de ident.: 392).
Además, en la patente de los Estados Unidos núm. 20070092957 Al se describen la construcción de genes quiméricos y la manipulación genética de bacterias y levadura para la producción de isobutanol mediante el uso de las rutas biosintéticas descritas.
Cultivo para producción Los huéspedes de levadura o bacterias recombinantes descritos en la presente descripción se cultivan en medios de fermentación que contienen sustratos de carbono adecuados. Los sustratos de carbono adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos tales como fructosa, oligosacáridos tales como lactosa, maltosa, galactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa, o mezclas de estos, y mezclas no purificadas de materias primas renovables tales como permeato de suero de queso, líquido de maceración de maíz, molasa de betabel azucarero, y malta de cebada. Otros sustratos de carbono pueden incluir etanol, lactato, succinato o glicerol.
Además, los sustratos de carbono también pueden ser sustratos de un solo carbono, tal como dióxido de carbono o etanol, para los que se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos clave. Además de los sustratos de uno y de dos carbonos, los organismos metilotróficos también son conocidos por usar muchos otros compuestos que contienen carbono, tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, las levadura metilotróficas son conocidas por usar el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd. , [Int. Symp.], 7o. (1993), 415-32, Editor(es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Editorial: Intercept, Andover, Reino Unido de Gran Bretaña) . Análogamente, diversas especies de Candida metabolizarán alanina u ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono empleada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y solo estará limitada por la elección del organismo.
Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de estos son adecuados en la presente invención, los sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa y sacarosa, o mezclas de estos con azúcares de C5, tales como xilosa y/o arabinosa, para células de levadura modificadas para usar azúcares de C5. La sacarosa puede derivarse de fuentes de azúcar renovables, tales como caña de azúcar, betabel azucarero, mandioca, sorgo dulce, y mezclas de estos. La glucosa y la dextrosa pueden derivarse de fuentes de granos renovables a través de la sacarificación de materias primas a base de almidón que incluyen granos, tales como maíz, trigo, centeno, cebada, avena y mezclas de estos. Además, los azúcares fermentables pueden derivarse de biomasa renovable celulósica o lignocelulósica a través de procesos de pretratamiento y sacarificación, tal como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente copendiente y de propiedad mancomunada de los Estados Unidos núm. 2007/0031918A1, que se incorpora en la presente descripción como referencia. La biomasa se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa y, opcionalmente, también comprenden hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos . La biomasa también puede comprender otros componentes, tales como proteínas y/o lípidos. La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas del maíz y rastrojos del maíz, o una mezcla de pastos y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bionergéticos , residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, sedimentos de la fabricación del papel, residuos orgánicos, residuos forestales y de silvicultura. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos, tales como cáscaras de granos de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de maderas, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol, y mezclas de estos.
Además de la fuente de carbono adecuada, los medios de fermentación deben contener minerales, sales, cofactores, soluciones amortiguador y otros componentes apropiados conocidos para los experimentados en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática que comprende una DHAD [2Fe-2S] bacteriana. Condiciones de cultivo Típicamente, las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C en un medio apropiado. Los medios de crecimiento adecuados en la presente invención son medios comunes comercialmente preparados, tales como el caldo Luria Bertani (LB) , el caldo Sabouraud Dextrose (SD) , caldo de medio de levadura (YM) o caldo que incluye una base nitrogenada de levadura, sulfato de amonio y dextrosa (como la fuente de carbono/energía) o medio YPD, una combinación de peptona, extracto de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para cultivar el mayor número de cepas de Saccharomyces cerevisiae . También pueden usarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos, y el medio adecuado para crecimiento del microorganismo específico será conocido para una persona con experiencia en la técnica de la ciencia de microbiología o fermentación. El uso de agentes conocidos para modular la represión de catabolitos directa o indirectamente, por ejemplo, adenosina cíclica 2 ' : 3 ' -monofosfato, también pueden incorporarse en el medio de fermentación.
Los intervalos de pH adecuados para la fermentación de levadura son, típicamente, de un pH de 3.0 a un pH de 9.0. , en donde se prefiere un pH de 5.0 a un pH de 8.0 como condición inicial. Los intervalos de pH adecuados para la fermentación de otros microorganismos son de un pH de 3.0 a un pH de 7.5, en donde se prefiere un pH de 4.5.0 a un pH de 6.5 como condición inicial.
Las fermentaciones pueden realizarse en condiciones aerobias o anaerobias, en donde se prefieren las condiciones anaerobias o microaerobias .
Fermentaciones industriales continuas y discontinuas La fermentación puede ser un método de fermentación discontinuo. Una fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado en donde la composición del medio se define al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por ello, al comienzo de la fermentación, el medio se inocula con uno o más organismos deseados y se deja que la fermentación se produzca sin ningún agregado al sistema. Sin embargo, típicamente, una fermentación "discontinua" es discontinua con respecto a la adición de la fuente de carbono y, frecuentemente, se hacen intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En sistemas discontinuos, las composiciones de biomasa y metabolito del sistema cambian constantemente hasta el momento que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos discontinuos, las células se moderan a través de una fase de retardo estático hasta una fase logarítmica de crecimiento alto para terminar con una fase estacionaria, en donde la velocidad de crecimiento disminuye o se interrumpe. Si no están tratadas, las células de la fase estacionaria, finalmente, morirán. Las células de la fase logarítmica son responsables, generalmente, de la producción en masa del producto final o intermedio.
Una variación del sistema discontinuo estándar es el sistema de alimentación discontinua o por lotes. Los procesos de fermentación con alimentación discontinua también son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema discontinuo típico, con la excepción de que el sustrato se agrega en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas de alimentación discontinua son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células, y en donde es conveniente tener cantidades limitadas de sustrato en los medios. Las mediciones de la concentración real del sustrato en los sistemas de alimentación discontinua es difícil y, por lo tanto, se calcula conforme a los cambios de factores medibles, tales como el pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases de desecho, tales como C02. Las fermentaciones discontinuas y de alimentación discontinua son comunes y muy conocidas en la técnica, y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock en Biotechnology. A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. , o en Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol . , 36:227, (1992), que se incorporan en la presente descripción como referencia.
El cultivo de la fermentación puede adaptarse a métodos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto, en donde un medio de fermentación definido se agrega continuamente a un biorreactor y se extrae, simultáneamente, una cantidad igual de medio acondicionado para procesamiento. Generalmente, la fermentación continua mantiene los cultivos a una densidad alta constante.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afecten el crecimiento celular o concentración del producto final. Por e emplo, un método mantendrá un nutriente limitante, tal como el nivel de nitrógeno o fuente de carbono, a una concentración fija y permitirá que se moderen todos los demás parámetros. En otros sistemas, varios factores que afectan el crecimiento pueden alterarse continuamente, mientras que la concentración celular, determinada por la turbidez del medio de cultivo, se mantiene constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento estables y, así, la pérdida celular debido al medio que se extrae debe equilibrarse contra la velocidad de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como las técnicas para maximizar la velocidad de la formación del producto, son muy conocidos en la técnica de la microbiología industrial y se detalla una variedad de métodos en Brock, supra.
Se contempla que los procesos discontinuos, de alimentación discontinua, continuos o cualquier modo de fermentación conocido, son adecuados para el crecimiento de la célula huésped microbiana recombinante descrita. Además, se contempla que las células pueden inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células enteras y someterse a condiciones de fermentación para la producción de isobutanol. Métodos para aislar el producto del medio de fermentación El isobutanol producido biológicamente puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como los de fermentaciones ABE (véanse, por ejemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:639-648 (1998), Groot et al., Process Biochem. 27:61-75 (1992), "y las referencias en ellos) . Por ejemplo, los sólidos pueden extraerse del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación, o similares. Después, el isobutanol puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos tales como destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido-líquido, adsorción, extracción por arrastre con gas, evaporación de membrana o pervaporación.
Dado que el isobutanol forma una mezcla azeotrópica con agua y de bajo punto de ebullición, puede usarse la destilación para separar la mezcla hasta su composición azeotrópica. La destilación puede usarse en combinación con otro método de separación para obtener la separación alrededor del azeótropo. Los métodos que pueden usarse en combinación con la destilación para aislar y purificar el butanol incluyen, pero no se limitan a, decantación, extracción líquido-líquido, adsorción y técnicas basadas en membranas. Además, el butanol puede aislarse mediante el uso de destilación azeotropica al usar un cosolvente (véase, por ejemplo, Doherty y Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, New York, 2001) .
La mezcla de butanol-agua forma un azeótropo heterogéneo para que la destilación pueda usarse en combinación con decantación para aislar y purificar el isobutanol. En este método, el caldo de fermentación que contiene isobutanol se destila hasta acercarse a la composición azeotropica. Luego, se condensa la mezcla azeotropica, y el isobutanol se separa del medio de fermentación por decantación. La fase acuosa decantada puede retornarse a la primera columna de destilación como reflujo. La fase orgánica decantada rica en isobutanol puede purificarse aún más por destilación en una segunda columna de destilación.
Además, el isobutanol también puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de extracción líquido-líquido en combinación con destilación. En este método el isobutanol se extrae del caldo de fermentación al usar una extracción líquido-líquido con un solvente adecuado. Después, la fase orgánica que contiene butanol se destila para separar el butanol del solvente.
También puede usarse la destilación en combinación con adsorción para aislar el isobutanol del medio de fermentación. En este método el caldo de fermentación que contiene el isobutanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica y después se extrae el resto del agua mediante el uso de un adsorbente, tal como los tamices moleculares (Aden et al. Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economice Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Informe NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory, junio de 2002) .
Adicionalmente , puede usarse la destilación en combinación con pervaporación para aislar y purificar el isobutanol del medio de fermentación. En este método, el caldo de fermentación que contiene el isobutanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica, y después se extrae el resto del agua por pervaporación a través de una membrana hidrófila (Guo et al., J. Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)).
EJEMPLOS La presente invención se define más detalladamente a través de los siguientes ejemplos. Debe entenderse que si bien señalan una modalidad preferida de la invención, estos ejemplos son sólo ilustrativos. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá establecer las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.
Métodos generales Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante que se describen en los ejemplos son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, Y, (1989) (Maniatis) y en T. J. Silhavy, M. L. Bennan, y L. W. Enguist, Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) , y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987), y en Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para usarse en los siguientes ejemplos pueden encontrarse en el Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, editores) , American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) o en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989). Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas se obtuvieron a través de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) , BD Diagnostic Systems (Sparks, MD) , Life Technologies (Rockville, MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que se especifique de cualquier otra forma.
Las cepas microbianas se obtuvieron de la colección de The American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Los cebadores de oligonucleótidos usados en los siguientes ejemplos se sintetizaron en Sigma-Genosys (Woodlands, TX) o Integrated DNA Technologies (Coralsville , IA) .
El medio sintético completo se describe en Amberg, Burke y Strathern, 2005, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
El análisis de la composición del subproducto de la fermentación es muy conocido para los experimentados en la técnica. Por ejemplo, un método de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) usa una columna Shodex SH-1011 con un guarda columna Shodex SH-G (ambos disponibles de aters Corporation, Milford, A) , con detección de índice de refracción (IR) . La separación cromatográfica se logra al usar H2S04 0.01 M como fase móvil con un régimen de flujo de 0.5 ml/min y una temperatura de columna de 50 °C. El tiempo de retención para él isobutanol es de aproximadamente 47.6 minutos.
El significado de las abreviaturas es el siguiente: "s" significa segundo (s), "min" significa minuto (s), "h" significa hora(s), "psi" significa libras por pulgada cuadrada, "nm" significa nanómetros, "d" significa día(s), "µ?" significa microlitro (s) , "mi" significa mililitro (s) , "1" significa litro, "mm" significa milímetro (s) , "mM" significa milimolar, "µ?" significa micromolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "µt???" significa micromol (es) , "g" significa gramo(s), "pg" significa microgramo (s) y "ng" significa nanogramo (s) , "PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa, "DO" significa densidad óptica, "DO600" significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, "kDa" significa kilodaltons, "g" significa constante de gravitación, "pb" significa par (es) de bases, "pKb" significa par (es) de kilobases, "~" significa aproximadamente, "% w/v" significa por ciento en peso/volumen, "% v/v" significa por ciento en volumen/volumen, "HPLC" significa cromatografía de líquidos de alta resolución, y "CG" significa cromatografía de gases .
Ejemplo 1 Identificación de dihidroxiácido deshidratasas bacterianas con grupo [2Fe- 2S] Análisis filogenético Las relaciones filogenéticas se determinaron por dihidroxiácido deshidratasas (DHAD) y proteínas relacionadas.
Las proteínas relacionadas se identificaron por búsquedas de BlastP en bases de datos públicamente disponibles mediante el uso de secuencias de aminoácidos de la DHAD de E. coli (sec. con núm. de ident. : 382) , fosfogluconato deshidratasa de E. coli (EDD, sec. con núm. de ident.: 384; región codificante, sec. con núm. de ident.: 383);, y arabonato deshidratasa de Azospirillum brasiliense (sec. con núm. de ident.: 386; región codificante, sec. con núm. de ident.: 385), con los siguientes parámetros de búsqueda: Valor de E = 10, tamaño de palabra = 3, Matriz = Blosum62, y apertura de la interrupción =11 y extensión de la interrupción =1. Las búsquedas de Blast emplean las tres secuencias diferentes de proteínas generadas al superponer conjuntos de coincidencias de secuencias. Las secuencias se seleccionaron a partir de los resultados de búsquedas basados en un valor de corte para E de 10"5 con la eliminación de secuencias con 95 % de identidad. También se eliminaron las secuencias de una longitud menor que 350 aminoácidos y las secuencias de una longitud mayor que 650 aminoácidos. El conjunto resultante de 976 secuencias de aminoácidos incluía dihidroxiácido deshidratasas, fosfogluconato deshidratasas y deshidratasas del ácido aldónico.
Se generó un perfil HMM a partir de las DHAD verificadas experimentalmente descritas en el Ejemplo 2. Véanse más adelante los detalles sobre la construcción, calibración y búsqueda con este perfil HM . Una búsqueda hmmer que usa este perfil HMM como consulta de la base de datos contra las 976 secuencias coincidió con todas las secuencias con un valor de E de < 10"5. Los alineamientos múltiples de secuencias de las secuencias de aminoácidos se realizaron con el algoritmo de Clustal W (Thompson, J. D., Higgins, D. G. , y Gibson T. J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673 4680) con los siguientes parámetros: 1) para parámetros de alineamiento por pares, una apertura de la interrupción = 10; extensión de la interrupción = 0.1; la matriz es Gonnet 250; y el modo - Lento-exacto, 2) para parámetros de alineamiento múltiple, apertura de la interrupción = 10; extensión de la interrupción = 0.2; y la matriz es la serie de Gonnet. Los árboles filogenéticos se generaron a partir de alineamientos de secuencias basados en el método del vecino más cercano. Un árbol que representa relaciones filogenéticas entre las 976 secuencias se muestra en la Figura 2. De este análisis emergen cuatro ramas principales. Están marcadas "DHAD 4Fe-4S" , "DHAD 2Fe-2S", "deshidratasa del ácido aldónico" y "EDD" , en función de los criterios que se detallan más adelante. Una quinta rama pequeña de 17 secuencias está marcada como "Und" por "sin definir" .
Las secuencias alineadas se analizaron inicialmente para determinar la presencia de tres cisteinas que son esenciales para la actividad enzimática y probablemente estén involucradas en la coordinación de Fe-S en la arabonato deshidratasa de Azospirillum brasiliense, que se informó como una proteína de grupo [4Fe-4S] (Watanabe, S et al. J. Biol. Chem. (2006) 281:33521-33536). Cada una de las 976 secuencias tiene las cisteínas que corresponden a dos de las cisteínas esenciales de arabonato deshidratasa de Azospirillum brasiliense (en las posiciones 124 y 197) . Dentro del árbol filogenético hay una rama de 168 secuencias que incluye la fosfogluconato deshidratasa [4Fe-4S] de Zymomonas mobilis (Rodríguez, M. et. al. (1996) Biochem Mol Biol Int. 38:783-789) . Solo los cuatro aminoácidos alanina, valina, o serina o glicina, pero no cisteína, se encontraron en la posición de la tercera cisteína esencial de la arabonato deshidratasa de A. brasiliense (posición 56). Esta rama de 168 secuencias está marcada en la Figura 2 como "EDD" .
Una rama diferente del árbol contiene 322 secuencias, entre las cuales está la DHAD de grupo [4Fe-4S] conocida de E. coli. Esta rama de 322 secuencias está marcada en la Figura 2 como "DHAD 4Fe-4S" . Todas las secuencias dentro de esta rama, y en la rama de 17 secuencias ("Und"), contienen glicina en la posición que corresponde a la tercera cisteína. Las 469 secuencias restantes, que se agrupan en dos ramas y comprenden tanto el ácido aldónico que reconoce la arabonato deshidratasa de A. brasiliense como un conjunto de DHAD poseen las tres cisteínas. Estas cisteínas están en las posiciones 56, 129 y 201 en la DHAD de S. mutans (sec. con núm. de ident . : 168) y en las posiciones 61, 135 y 207 en la DHAD de L. lactis (sec. con núm. de ident.: 232). En la Figura 1 se muestran ejemplos de regiones de alineamientos múltiples de secuencias que incluyen las cisteínas conservadas.
Se llevó a cabo un análisis adicional de alineamientos múltiples de secuencias y de árboles filogenéticos para identificar residuos específicos (distintivos) de DHAD para distinguir las DHAD de las arabonato deshidratasas y otras deshidratasas del ácido aldónico. Entre las secuencias que contienen las tres cisteínas conservadas especificadas, se comprobó que un ciado de 274 secuencias contenía las DHAD de S. utans y L. lactis. La arabonato deshidratasa de A. brasiliense se encontró en un ciado separado de 195 secuencias. Se analizaron los alineamientos múltiples de secuencias que contenían las secuencias del grupo de 274 con las DHAD, el grupo de deshidratasas del ácido aldónico, y la rama de "DHAD [4Fe-4S] " para determinar los residuos conservados en cada posición. Se detectó un conjunto de residuos que se conservaron en la mayor parte de ambos grupos de DHAD, pero no en el grupo de deshidratasas del ácido aldónico, y se muestra en la Tabla 4. Además, también se encontraron residuos que estaban conservados en las deshidratasas del ácido aldónico, pero en ninguno de los dos grupos de DHAD. Estos residuos diferencialmente conservados pueden actuar como determinantes de la especificidad del sustrato en sus respectivas enzimas.
Tabla 4. Residuos conservados* con discriminación de las DHAD de deshidratasas del ácido aldónico Residuo (s) conservado (s) en una mayoría de > 90 % de los casos representativos.
* La numeración de la posición toma como base la posición en la DHAD de S . mutans ** No conservados El grupo de las DHAD que forma el ciado de 274 secuencias que no incluye DHAD de grupo [4Fe-4S] de E. coli, fosfogluconato deshidratasa de grupo [4Fe-4S] de Z. mobilis, o arabonato deshidratasa de grupo [4Fe-4S] de A. brasiliense según lo informado fue identificado diferencialmente de los otros grupos por filogenia y residuos conservados hallados en alineamientos múltiples de secuencias, tal como se describió anteriormente. De conformidad con la propuesta de que el grupo incluye las DHAD con grupos [2Fe-2S] , la DHAD de Arabidopsis thaliana y la DHAD de S. solfataricus son parte del grupo. Dado que la Arabidopsis thaliana es una planta como lo es la espinaca, y que la DHAD de la espinaca se ha identificado como una DHAD con grupo [2Fe-2S] (Flint y Emptage (1988) J. Biol . Chem. 263:3558-3564), la DHAD de Arabidopsis thaliana puede ser una DHAD con un grupo [2Fe-2S] . Se describe que la DHAD de S. solfataricus es resistente al oxígeno como la DHAD de la espinaca que tiene un grupo [2Fe-2S] (Kim yLee (2006) J. Biochem. 139, 591-596) , lo cual es una indicación de que la DHAD de S. solfataricus puede ser una DHAD con un grupo [2Fe-2S] .
El ciado de 274 secuencias se marca en las Figuras 4A y 4B como "DHAD 2Fe-2S" . 193 de estas secuencias son de origen bacteriano. Las tres cisteínas conservadas y los residuos conservados especificados en la Tabla 4 pueden identificarse en alineamientos múltiples de secuencias de las 193 DHAD bacterianas al emplear el procedimiento de alineamiento descrito anteriormente. Las secuencias de las 193 DHAD [2Fe-2S] bacterianas se proporcionan en el listado de secuencias, y los números de identificación de secuencias se listan en la Tabla 2a.
Dentro del grupo DHAD [2Fe-2S] , las identidades de varias proteínas bacterianas se han confirmado por análisis funcional como DHAD, lo cual se describe en otros ejemplos de la presente invención. Otros ejemplos en la presente invención muestran que las proteínas de este grupo, tales como la DHAD de S. mutans y la DHAD de L. lactis, contienen un grupo [2Fe-2S] .
Preparación del perfil HMM Siete DHAD bacterianas que se identificaron como miembros del grupo filogenético [2Fe-2S] se expresaron en E. coli y se comprobó actividad dihidroxiácido deshidratasa como se describe en el Ejemplo 2 más adelante. Estas DHAD son de Nitrosomonas europaea (sec. con núm. de ident . : 310), Synechocystis sp. PCC6803 (sec. con núm. de ident.: 298), Streptococcus mutans (sec. con núm. de ident.: 168), Streptococcus ther ophilus (sec. con núm. de ident.: 164), Ralstonia metallidurans (sec. con núm. de ident.: 346), Ralstonia eutropha (sec. con núm. de ident.: 344), y Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident.: 232) . Además, se comprobó que la DHAD de Flavobacteriu johnsoniae (sec. con núm. de ident.: 230) tenía actividad dihidroxiácido deshidratasa cuando se expresaba en E. coli . Las secuencias de aminoácidos de estas DHAD bacterianas funcionales determinadas experimentalmente se analizaron con el conjunto de programas informáticos HMMER (el marco conceptual del perfil HMM se describe en R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh, y G. Mitchison, Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh et al., 1994; J. Mol. Biol . 235:1501-1531), que sigue la guía del usuario, que puede obtenerse de HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA) . La salida del programa informático HMMER es un perfil de modelos ocultos de Markov (HMM) que caracteriza las secuencias de entrada. Según se menciona en la guía del usuario, el perfil de los HMM son modelos estadísticos de alineamientos múltiples de secuencias. Capturan información específica de una posición respecto del grado de conservación de cada columna del alineamiento y de cuales residuos aminoácidos tienen más probabilidad de aparecer en cada posición. Así, los HMM tienen una base probabilística formal. El perfil de los HMM para un gran número de familias de proteínas está públicamente disponible en la base de datos PFAM (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA) .
El perfil HMM se construyó de la siguiente manera: Etapa 1. Crear un alineamiento de secuencias Las ocho secuencias para las DHAD verificadas funcionalmente que se enumeraron anteriormente se alinearon con Clustal W con los parámetros predeterminados.
Etapa 2. Crear un perfil HMM Se ejecutó el programa hmmbuild sobre el conjunto de secuencias alineadas con los parámetros predeterminados. El programa hmmbuild lee el archivo de alineamientos múltiples de secuencias, crea un nuevo perfil HMM y guarda este perfil en un archivo. Al usar este programa se generó un perfil sin calibrar a partir del alineamiento múltiple para cada uno de los conjuntos de secuencias de subunidades descritas anteriormente.
La siguiente información basada en la guía del usuario del programa HMMER proporciona una descripción de la forma en que el programa hmmbuild prepara un perfil HMM. Un perfil HMM es capaz de modelar los alineamientos con interrupciones, por ejemplo, al incluir inserciones y supresiones, lo que permite que el programa describa un dominio conservado completo (en lugar de solamente un motivo pequeño sin interrupciones) . Las inserciones y supresiones se modelan con los estados de inserción (I) y de supresión (D) . Todas las columnas que contienen más de una cierta fracción x de caracteres de la interrupción se asignarán como una columna de insertos . El valor predeterminado de x es 0.5. Cada estado de coincidencia tiene asociado un estado I y un estado D. El programa HMMER invoca un grupo de tres estados (M/D/I) en la misma posición consenso en la alineación, un "nodo" . Estos estados están interconectados con flechas denominadas probabilidades de transiciones de estados. Los estados M e I son emisores, en tanto que los estados D son mudos. Las transiciones están dispuestas para que, en cada nodo, se use el estado M (y se alinee y anote un residuo) o se use el estado D (y no se alinee ningún residuo, lo que produce un carácter de supresión en la interrupción, '-') . Las inserciones se producen entre nodos, y los estados I tienen una autotransición que permite que se produzcan uno o más residuos insertados entre columnas consenso.
Los puntajes de los residuos en un estado de coincidencia (es decir, puntajes de emisión del estado de coincidencia) , o en un estado de inserción (es decir, puntajes de emisión del estado de inserción) son proporcionales al Log_2 (p_x) / (null_x) . En donde p_x es la probabilidad de un residuo amino ácido, en una posición particular del alineamiento, de conformidad con el perfil HMM, y null_x es la probabilidad de conformidad con el modelo Nulo. El modelo Nulo es un modelo probabilí st ico simple de un solo estado con un conjunto precalculado de probabilidades de emisión para cada uno de los 20 aminoácidos derivados de la distribución de aminoácidos en la versión 24 de SWISSPROT.
También se calculan los puntajes de transición de estados como parámetros logarítmicos de posibilidades y son proporcionales a Log_2 (t_x) . En donde t_x es la probabilidad de transición a un estado emisor o no emisor.
Etapa 3. Calibrar el perfil HMM El perfil HMM se leyó con hmmcalibrate (calibrar) , que asigna un puntaje a un gran número de secuencias aleatorias sintetizadas con el Perfil (la cantidad predeterminada de secuencias sintéticas usadas es 5,000) , ajusta una distribución de valor extremo (EVD, por sus siglas en inglés) al histograma de esos puntajes y vuelve a guardar el archivo HMM que ahora incluye los parámetros EVD. Estos parámetros EVD (µ y ?) se usan para calcular los valores E de puntuación normalizada ("bit scores") cuando el perfil se busca en una base de datos de secuencias de proteínas. El programa hmmcalibrate escribe dos parámetros en el archivo HMM en una línea etiquetada "EVD" ; estos parámetros son los parámetros µ (ubicación) y ? (escala) de la distribución de valores extremos (EVD) que mejor se ajusta a un histograma de puntajes calculados sobre secuencias generadas aleatoriamente de aproximadamente la misma longitud y composición de residuos que SWISS-PROT. Esta calibración se realizó una vez para el perfil HMM .
El perfil HMM calibrado para el conjunto de secuencias de DHAD se proporciona en la Tabla 1. El perfil HMM se proporciona en un cuadro que da la probabilidad de frecuencia de aparición de cada aminoácido en cada posición en la secuencia de aminoácidos. La probabilidad más alta aparece resaltada para cada posición. La primera línea para cada posición informa los puntajes de emisión de coincidencias: la probabilidad de que cada aminoácido esté en ese estado (el puntaje más alto aparece resaltado) . La segunda línea informa los puntajes de emisión de inserción, y la tercera línea informa los puntajes de transiciones de estados: M?M, M?I, M?D ; I?M, I?I; D?M , D?D ; B?M ; M?E .
Por ejemplo, el perfil HMM para DHAD muestra que la metionina tiene una probabilidad de 1757 de estar en la primera posición, la probabilidad más alta, que aparece resaltada. En la segunda posición, el ácido glutámico tiene la probabilidad más alta, que es de 1356. En la tercera posición, la lisina tiene la probabilidad más alta, que es de 1569.
Etapa 4. Probar la especificidad y sensibilidad de los HMM del perfil creado El perfil HMM se evaluó con hmmsearch (buscar) , que lee un perfil HMM del archivo hmmfile (archivo) y busca un archivo de secuencias con coincidencias de secuencias significativamente similares. El archivo de secuencias buscado contenía 976 secuencias (véase lo mencionado anteriormente) . Durante la búsqueda, el tamaño de la base de datos (parámetro Z) se definió en mil millones. Esta configuración de tamaño asegura que los valores E significativos contra la base de datos actual seguirán siendo significativos en un futuro previsible. El punto de corte para el valor de E se definió en 10.
Una búsqueda de hmmer con el perfil HMM generado a partir del alineamiento de las ocho DHAD con función verificada experimentalmente coincidió con todas las 976 secuencias con un valor E de < 10"5. Este resultado indica que los miembros de la superfamilia de las deshidratasas comparten una similitud de secuencias significativa. Se usó una búsqueda hmmer con un punto de corte para el valor E de 10"5 para separar las deshidratasas relacionadas con las DHAD de otras proteínas más remotas, pero relacionadas, según se describió anteriormente.
Ejemplo 2 Expresión y caracterización de dihidroxiácido deshidratasas [2Fe-2S] bacterianas en E. coli Las regiones codificantes de ilvD de distintas bacterias, que a partir del análisis filogenético descrito en el Ejemplo 1 están en el grupo [2Fe-2S] , se expresaron bajo el control del promotor T7 en el vector pET28a (Novagen) en E. coli. Cada región codificante de ilvD se amplificó con un cebador directo específico con un sitio de restricción Nhel y un cebador inverso específico con un sitio de restricción Notl (enumerados en la Tabla 5 ) .
Tabla 5. Secs. con núm. de ident. de los cebadores usados para PCR de regiones que codifican para DHAD de los organismos listados.
El ADN genómico de cada cepa bacteriana se usó como plantilla. El ADN genómico se preparó a partir de cada cepa enumerada en la Tabla 1 con un estuche de purificación de ADN MasterPure (Epicentre, Madison, WI) . El vector plasmídico se amplificó con los cebadores pET28 a - F ( ot I ) (sec. con núm. de ident. : 397) y pET28a-R (Nhel ) (sec. con núm. de ident . : 398) para eliminar la región de etiqueta His . Los fragmentos plasmídicos y génicos se digirieron con Nhel y Notl antes de la ligación. La mezcla de ligación se transformó en células competentes (Top 10) (Invitrogen) de E. coli. Los transformantes se cultivaron en placas con medio LB-agar suplementado con 50 g/ml de kanamicina. Los clones positivos que se confirmaron por secuenciación se transformaron en la cepa Tuner (DE3) (Novagen) de E. coli para expresión. Las colonias seleccionadas se cultivaron en medio LB líquido suplementado con kanamicina a 30 °C. La inducción se llevó a cabo al añadir 0.5 mM de IPTG cuando el cultivo de E. coli alcanzó una DO de 0.3 a 0.4 a 600 nm . El cultivo se cosechó después de 5 horas de inducción. Los granulos de células se lavaron con solución amortiguador de Tris (pH de 8.0) .
La actividad enzimática del extracto crudo se analizó a 37 °C de la manera siguiente. La células por analizarse para DHAD se suspendieron en 2-5 volúmenes de solución amortiguador de 50 mM Tris y 10 mM MgS04(TM8), pH de 8, y luego se rompieron por sonicación a 0 °C. El extracto crudo de la ruptura de células se centrifugó para granular los restos celulares . Se retiraron los sobrenadantes y se almacenaron en hielo hasta el momento del ensayo (el ensayo inicial se realizó dentro de las dos horas de la ruptura de células) . Se comprobó que las DHAD analizadas en la presente eran estables en los extractos crudos mantenidos en hielo por algunas horas. La actividad también se mantuvo cuando se congelaron muestras pequeñas en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.
Los sobrenadantes se analizaron con el reactivo 2 , 4 - dini trofeni 1 hidracina, tal como se describe en Flint y Emptage (J. Biol . Chem . (1988) 263: 3558-64) . Cuando la actividad fue tan alta que se hizo necesario diluir el extracto crudo para obtener un análisis exacto, la dilución se hizo en 5 mg/ml de BSA en TM8.
Los análisis de proteínas se realizaron con el reactivo Better Bradford de Pierce (cat. núm . 23238 ) con BSA como estándar. Cuando fue necesario, las diluciones para los análisis de proteínas se hicieron en solución amortiguador TM8.
Todas las DHAD estuvieron activas cuando se expresaron en E. coli, y las actividades específicas se dan en la Tabla 6. La DHAD de Streptococcus mutans tuvo la actividad específica más alta.
Tabla 6. Actividad de las DHAD [2Fe-2S] bacterianas en E. coli Ejemplo 3 Purificación y caracterización de la DHAD de Streptococcus mutans expresada en E. coli La DHAD de S. mutans se caracterizó y purific adicionalmente . Para la purificación de la DHAD de S. mutans , seis litros de cultivo de la cepa Tuner de E. coli que incluye el plásmido pET28a con el ilvD de S. mutans se cultivaron e indujeron con IPTG. La enzima se purificó por ruptura de células, tal como se describió en el Ejemplo 2, en una solución amortiguador de 50 mM de Tris con un pH de 8.0 que contenía 10 mM de MgCl2 (solución amortiguador TM8), se centrifugó para eliminar los restos de células, y después se cargó el sobrenadante del extracto crudo en una columna Q Sepharose (GE Healthcare) para eluir la DHAD con una concentración incrementada de NaCl en la solución amortiguador TM8. Las fracciones que contienen la DHAD en función del aspecto del color (color pardusco debido a la presencia del grupo Fe-S) se recolectaron y cargaron en una columna Sephacryl S-100 (GE Healthcare) para eluirse con solución amortiguador TM8. Según lo evaluado con los geles de SDS, la pureza de la proteína eluida de la columna de Sephacryl se calculó en un 60-80 %. La actividad de la enzima parcialmente purificada se analizó a 37 °C según lo descrito por Flint et al. (J. Biol. Chem. (1988) 263(8): 3558-64) . La actividad específica de la proteína purificada fue de 40 µ?t??? min"1 mg"1. Se calculó que el valor kca para la enzima purificada fue de 50-70 s"1.
Se estudió la estabilidad en presencia de aire de la DHAD purificada al incubar la enzima purificada a 23 °C durante varios intervalos de tiempo en presencia de aire ambiental seguido de un análisis de actividad, tal como se describió anteriormente. La actividad de la DHAD de Streptococcus mutans, en contraposición con la DHAD purificada de manera similar de E. coli, fue estable incluso después de 72 horas de incubación, tal como se muestra en las Figuras 4A y 4B, en donde Figura 4A muestra los resultados de la DHAD de S. mutans y Figura 4B) muestra los resultados de la DHAD de E. coli.
El espectro UV visible de la S. mutans purificada se muestra en la Figura 5. La cantidad de picos por encima de 300 nm es típico de las proteínas con grupos [2Fe-2S] . La DHAD de S. mutans se redujo con ditionita de sodio, y se obtuvieron los espectros EPR a temperaturas variables. La Figura 6 muestra los espectros medidos a temperaturas de entre -253 °C (20 °K) y -203 °C (70 °K) . Como el espectro EPR de S. mutans puede medirse hasta 203 °C (70 °K) , esto es indicativo de que contiene un grupo [2Fe-2S] .Es muy conocido, por ejemplo, que los espectros EPR de proteínas que contienen grupos [4Fe-4S] no son observables a temperaturas muy mayores que 263 °C (10 °K) . (Véase, por ejemplo, Rupp, et al. Biochimica et Biophysica Acta (1978) 537:255-269.) Ejemplo 4 Construcción de casetes de expresión de dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) para Lactobacillus plantarum El propósito de este ejemplo es describir cómo clonar y expresar un gen (ilvD) de dihidroxiácido deshidratasa de distintos orígenes bacterianos en Lactobacillus plantarum PN0512 (ATCC PTA-7727) . Se usó un vector transportador pDMl (sec. con núm de ident.: 410) para la clonación y expresión de genes ilvD de Lactococcus lactis, subespecie lactis NCD02118 (NCIMB 702118) [Godon et al., J. Bacteriol . (1992) 174:6580-6589] y Streptococcus utans UA159 (ATCC 700610) en L. plantarum PN0512. El plásmido pDMl contiene un replicón mínimo pLFl (-0.7 pKb) y toxina-antitoxina (TA) pemK-peml del plásmido pLFlATCC14917 de Lactobacillus plantarum, un replicón P15A de pACYC184, marcador de cloranfenicol para selección en E. coli y en L. plantarum, y promotor sintético P30 [Rud et al, Microbiology (2006) 152:1011-1019]. El plásmido pLFl (C.-F. Lin et al., núm. de acceso al GenBank:. AF508808) se relaciona estrechamente con el plásmido p256 [Sorvig et al., Microbiology (2005) 151:421-431], cuyo número de copias se calculó en -5-10 copias por cromosoma para L. plantarum NC7. Un promotor sintético P30 se deriva de promotores para ARNr de L. plantarum que son conocidos por estar entre los promotores más fuertes en bacterias de ácido láctico (LAB) [Rud et al. Microbiology (2005) 152:1011-1019] .
La región codificante de ilvD de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident . : 231) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de Lactococcus lactis, subespecie lactis, NCD02118, con cebadores 3T-ilvDLI (BamHI) (sec. con núm. de ident.: 408) y 5B-ilvDLI (Notl) (sec. con núm. de ident.: 409). El ADN genómico de L. lactis, subespecie lactis, NCD02118, se preparó con un estuche Puregene Gentra (QIAGEN, CA) . El producto de PCR de 1.7 pKb del ilvD de L. lactis, {ilvDLI) , se digirió con Notl y se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para preparar extremos romos. El fragmento resultante de región codificante de ilvD de L. lactis se digirió con BamHI y se purificó en gel con el estuche de extracción en gel QIAGEN (QIAGEN, CA) . El plásmido pDMl se digirió con ApaLI, se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para preparar extremos romos y después se digirió con BamHI. El fragmento de región codificante de ilvD de L. lactis purificado en gel se ligó en los sitios BamHI y ApaLI (romo) del plásmido pDMl . La mezcla de ligación se transformó en células ToplO (Invitrogen, CA) de E. coli. Los transformantes se sembraron para selección en placas con medio LB y cloranfenicol . Los clones positivos se seleccionaron por digestión Salí para dar un fragmento con un tamaño esperado de 5.3 pKb. Los clones positivos se confirmaron, adicionalmente, por secuenciación del ADN. El clon correcto se denominó pDMl-ilvD(L. lactis) .
La región codificante del ilvD de S. mutans UA159 (ATCC 700610) del plásraido pET28a se clonó en el plásmido pDMl . La construcción de pET28a que contenía el ilvD de S. mutans se describió, por ejemplo, en el Ejemplo 2. El plásmido pET28a que contenía el ilvD de S. mutans se digirió con Xbal y Notl, tratados con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para preparar extremos romos, y un fragmento de 1,759 pb que contenia la región codificante de ilvD de S. mutans se purificó en gel. El plásmido pDMl se digirió con BamHI, se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para preparar extremos romos, y después se digirió con PvuII. El fragmento purificado en gel que contenía la región codificante de ilvD de S. mutans se ligó en los sitios BamHI (romo) y PvuII del plásmido pDMl . La mezcla de ligación se transformó en células ToplO (Invitrogen, CA) de E. coli. Los transformantes se sembraron para selección en placas con medio LB y cloranfenicol . Los clones positivos se seleccionaron por digestión Clal para dar un fragmento de un tamaño esperado de 5.5 pKb. El clon correcto de denominó pD l-ilvD (S. mutans) .
Ejemplo 5 Determinación de actividad DHAD expresada en L. plantarum PN0512 L. plantarum PN0512 se transformó con el plásmido pDMl - ilvD (L . lactis) o con pDMl-ilvD(S. mutans) por electroporación . Las células electrocompetentes se prepararon con el siguiente procedimiento. Cinco mi de medio MRS para lactobacilos que contiene glicina al 1 % se inoculó con células PN0512 y se cultivó durante toda la noche a 30 °C. Cien mi de medio MRS con glicina al 1 % se inoculó con el cultivo de toda la noche a una DO600 = 0.1 y se cultivó a una DO600 = 0.7 a 30 °C. Las células se cosecharon a 3700xg durante 8 minutos a 4 °C, se lavaron con 100 mi en frío de 1 mM de MgCl2, se centrifugaron a 3700xg durante 8 minutos a 4 °C, se lavaron con 100 mi en frío de PEG-1000 al 30 % (81188, Sigma-Aldrich , St. Louis, MO) , se volvieron a centrifugar a 3700xg durante 20 minutos a 4 °C y después se resuspendieron en 1 mi en frío de PEG-1000 al 30 %. Sesenta µ? de células electrocompetentes se mezclaron con -100 ng de ADN plasmídico en una cubeta de electroporación fría de 1 mm de separación y la electroporación se realizó en un pulsador de genes BioRad (Hercules, CA) a 1.7 kV, 25 pF y 400 O. Las células se resuspendieron en 1 mi de medio MRS que contenía 500 mM de sacarosa y 100 mM de MgCl2, se incubaron a 30 °C durante dos horas y luego se sembraron en placas con medio MRS que contenía 10 g/ml de cloranfenicol .
Los transformantes de L. plantarum PN0512 que incluyen pDMl-ilvD (L. lactis) o pDMl-ilvD(S. mutans) , así como los transformantes de control con el vector pDMl solamente, se cultivaron durante toda la noche en medio RS para lactobacilos a 30 °C. Ciento veinte mi de medio MRS suplementado con 100 mM de MOPS (pH de 7.5), 40 µ? de citrato férrico, 0.5 mM de L-cisteína y 10 pg/ml de cloranfenicol se inocularon con el cultivo de toda la noche a una DO600 = 0.1 en un matraz de tapa roscada de 125 mi para cada muestra durante la noche. Los cultivos se incubaron anaerobiamente a 37 °C hasta alcanzar una DO600 de 1-2. Los cultivos se centrifugaron a 3700xg durante 10 minutos a 4 °C. Los gránulos se lavaron con 50 mM de solución amortiguador de fosfato de potasio con un pH de 6.2 (6.2 g/1 de KH2P04 y 1.2 g/1 de K2HP04) y se volvieron a centrifugar. Los gránulos se congelaron y almacenaron a -80 °C hasta analizarse para determinar la actividad DHAD. Las muestras del extracto de células se analizaron para determinar la actividad DHAD con un método basado en dinitrofenilhidracina, según lo descrito en el Ejemplo 2. Los resultados de la actividad DHAD se dan en la Tabla 7. La actividad específica de la DHAD de L. lactis y la DHAD de S. mutans en L. plantarum PN0512 mostró 0.02 y 0.06 pmol min"1 mg"1, respectivamente, en tanto que la muestra de control del vector no exhibió actividad detectablé.
Tabla 7. Actividad DHAD en L. plantarum PN0512.
Ejemplo 6 Expresión de dihidroxiácido deshidratasa de S. mutans en levadura Se usó el vector transportador pRS423 FBA ilvD(Strep) (sec. con núm. de ident . : 430) para la expresión de DHAD de Streptococcus mutans. Este vector transportador contenía un origen de replicación Fl (1423 a 1879) para mantenimiento en E. coli y un origen de 2 mieras (nt 8082 a 9426) para replicación en levadura. El vector tiene un promotor FBA (nt 2111 a 3108; sec . con núm. de ident.: 425) y un terminador FBA (nt 4861 a 5860) . Además, porta el marcador His (nt 504 a 1163) para selección en levadura y el marcador de resistencia a la ampicilina (nt 7092 a 7949) para selección en E. coli. La región codificante de ilvD (nt 3116 a 4828) de Streptococcus mutans UA159 (ATCC 700610) está entre el promotor FBA y el terminador FBA y forma un gen quimérico para expresión.
Para probar la expresión de la DHAD de Streptococcus mutans en la cepa de levadura BY4741 (conocida en la técnica y que puede obtenerse de la ATCC, núra. 201388) , el vector de expresión pRS423 FBA IlvD(Strep) se transformó en combinación con el vector vacío pRS426 en células BY4741(que pueden obtenerse de la ATCC, núm. 201388) . Los transformantes se cultivaron en medio sintético sin histidina ni uracilo (Teknova) . El cultivo en medio líquido para análisis se llevó a cabo al añadir 5 mi de un cultivo de toda la noche en 100 mi de medio en un matraz de 250 mi. Los cultivos se cosecharon cuando alcanzaron una DO de 1 a 2 a 600 nm. Las muestras se lavaron con 10 mi de 20 mM de Tris (pH de 7.5) y después se resuspendieron en 1 mi de la misma solución amortiguador de Tris. Las muestras se transfirieron a tubos de 2.0 mi que contenían 0.1 mm de sílice (Lysing atrix B, MP biomedicals) . Después, se llevó a cabo la ruptura mecánica de las células en un macerador (BIO101) . El sobrenadante se obtuvo por centrifugación en una microcentrífuga a 13,000 rpm a 4 °C durante 30 min. Típicamente, se usó de 0.06 a 0.1 mg de proteínas en el extracto crudo para el análisis de DHAD a 37 °C, según lo descrito por Flint y Emptage (J. Biol. Chem. (1988) 263(8): 3558-64) al usar dinitrofenilhidracina . La deshidratasa de Streptococcus mutans tuvo una actividad específica de 0.24 pmol min"1 mg"1 al expresarse en levadura. Una cepa de control que contenía vectores vacíos pRS423 y pRS426 tuvo un historial de actividad en el intervalo de 0.03 a 0.06 µ???? min"1 mg*1.
Ejemplo 7 Expresión del gen IlvD de L. lactis en levadura La región codificante de ilvD de L. lactis se amplificó con el cebador directo IlvD(Ll)-F (sec. con núm. de ident . : 420) y cebador inverso IlvD(Ll)-R (sec. con núm. de ident. : 421) . El fragmento amplificado se clonó en el vector transportador pNY13 por reparación de la interrupción. El vector pNY13 (sec. con núm. de ident. : 437) se derivó de pRS423. Este vector transportador contenía un origen de replicación Fl (1423 a 1879) para mantenimiento en E. coli y un origen de 2 mieras (nt 7537 a 8881) para replicación en levadura. El vector tiene un promotor FBA (nt 2111 a 3110) y un terminador FBA (nt 4316 a 5315) . Además, porta el marcador His (nt 504 a 1163) para selección en levadura y el marcador de resistencia a la ampicilina (nt 6547 a 7404) para selección en E. coli.
Los clones positivos se seleccionaron sobre la base de amplificación con los cebadores directo e inverso para la región codificante de ilvD y se confirmaron adicionalmente por secuenciación . El constructo nuevo se designó como pRS423 FBA ilvD(L. lactis) . Este constructo se transformó en la cepa de levadura BY4743 (? LEU1) (Open Biosystems, Huntsville, AL; núm. de catálogo YSC1021-666629) junto con el vector vacío pRS426, según se describe en el Ejemplo 6. El cultivo y análisis de cepas de levadura que contenían el vector de expresión también se llevaron a cabo de conformidad con los procedimientos descritos en el Ejemplo 6. Se determinó que la actividad dihidroxiácido deshidratasa en cepas de levadura con el gen llvD de L. lactis estuvo el intervalo de 0.05 a 0.17 ymol min"1 mg"1. Esta actividad estuvo ligeramente por encima del control. Se llevaron a cabo experimentos de complementación para investigar la expresión de esta DHAD y las DHAD de otras bacterias (Ejemplo 8) .
Ejemplo 8 Complementación entre la cepa de levadura con supresión de ILV3 y las DHAD bacterianas.
La enzima endógena DHAD de «S. cerevisiae está codificada por el gen ILV3 y la proteína está dirigida a la mitocondria. La supresión de este gen produce la pérdida de actividad DHAD endógena y proporciona una cepa de prueba en donde la expresión de actividad DHAD citosólica heteróloga puede evaluarse fácilmente. La supresión de ILV3 impide que la cepa crezca en ausencia de aminoácidos de cadena ramificada. Se analizó la expresión de distintas DHAD bacterianas al determinar su capacidad para complementar la cepa de levadura con supresión de ILV3 para que la cepa crezca en ausencia de aminoácidos de cadena ramificada.
Se construyeron vectores lanzadera de expresión que contienen secuencias del gen ilvD que codifican las DHAD de las bacterias enumeradas en la Tabla 8. Los elementos básicos de estos constructos de expresión fueron los mismos que los del vector pRS423 FBA ilvD(strep) descrito en el Ejemplo 6. Cada una de las regiones codificantes de ilvD se prepararon por PCR como se describe en el Ejemplo 2 y se clonaron para reemplazar la región codificante de ilvD de Streptococcus ntutans en pRS423 FBA ilvD(Strep) y crear los plásmidos enumerados en la Tabla 8. Estos constructos de expresión se transformaron en la cepa con supresión de ILV3, BY4741 ilv3 : : URA3 que se preparó de la siguiente manera. Se construyó un cásete de trastorno ilv3 : URA3 con amplificación por PCR del marcador URA3 de pRS426 (ATCC núm. 77107) con los cebadores "ILV3 : :URA3 F" y "ILV3 : :URA3 R" , dados como secs. con núms. de ident.: 431 y 432. Estos cebadores produjeron un producto de PCR URA3 de 1.4 kb que contenía extensiones 5' y 3' de 70 pb idénticas a las secuencias corriente arriba y corriente abajo del locus cromosómico de ILV3 para recombinación homologa. El producto de la PCR se transformó en células BY4741 (ATCC 201388) mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Y, págs. 201-202) , y los transformantes resultantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes se seleccionaron por PCR al usar los cebadores "ILV3 F Check" y "URA3 REV Check" , dados como secs. con núms. de ident.: 433 y 434, para verificar la integración en el sitio correcto y la disrupción del locus endógeno de ILV3.
Los transformantes con las DHAD bacterianas de la Tabla 8 se seleccionaron en placas con medio sintético para levadura sin histidina. Después, las colonias seleccionadas se dispusieron en parches sobre placas sin valina, leucina ni isoleucina. Las cepas que contenían los vectores de expresión enumerados en la Tabla 8 fueron capaces de crecer en estas placas que carecían de aminoácidos de cadena ramificada, pero no sucedió así con la cepa de control que tenía el plásmido de control. Este resultado indicó que las DHAD de estas bacterias se expresaron activamente en S. cerevisiae.
Tabla 8. DHAD bacterianas sometidas a prueba y vectores de expresión Organismo origen de Sec. con núm. de Designación la DHAD ident . de la del vector secuencia de ácidos nucleicos de la DHAD Nitrosomonas europaea 309 pRS423 FBA ATCC 19718 ilvD (europ) Synechocystis sp. PCC 297 pRS 23 FBA 6803 ilvD (Synech) Streptococcus 163 pRS423 FBA thermophilus L G 18311 ilvD (thermo) Ralstonia eutropha H16 406 pRS423 FBA (ATCC 17699) ilvD (H16) Lactococcus lactis 231 pRS423 FBA ilvD (L. lactis) Ejemplo 9 Purificación y caracterización de DHAD de Lactococcus lactis expresada en E. coli Se purificó y caracterizó la DHAD a partir de L. lactis. Para la purificación de la DHAD de L. lactis, 14 litros de cultivo de la cepa Tuner (DE3) (Novagen) de E. coli, que alberga el plásmido pET28a que contiene el ilvD de L. lactis, se cultivaron e indujeron con IPTG. La enzima se purificó por ruptura de células, como se describe en el Ejemplo 2, en 120 mi de 50 mM de solución amortiguador de Tris con un pH de 8.0 que contenía 10 mM de MgCl2 (solución amortiguador TM8) , se centrifugó para eliminar los restos de células y después se cargó el sobrenadante del extracto crudo en una columna Q-Sepharose (GE Healthcare) de 5 x 15 cm para eluir la DHAD con una concentración incrementada de NaCl en la solución amortiguador TM8. Se recolectaron las fracciones que contenían la DHAD, se preparó 1 M en y se cargó en una columna de fenil-Sepharose de 2.6 x 15 cm, (GE Healthcare), equilibrada con 1 M de ( H4)2S04 en solución amortiguador TM8 y se eluyó con un gradiente decreciente de ( H4)2S04. Las fracciones que contenían DHAD fuera de la columna de fenil-Sepharose se recolectaron y se concentraron a 10 mi. Esto se cargó en una columna Superdex-200 de 3.5 x 60 cm (GE Healthcare) y se eluyó con G?8. Las fracciones que contenían actividad DHAD se recolectaron, concentraron y congelaron como bolillas en 2(D . Según lo determinado con los geles de SDS, se calculó que la pureza de la proteína eluída de la columna Superdex-200 fue > 80 %. La actividad de la enzima se analizó a 37 °C, según lo descrito por Flint et al. (J. Biol. Chem. (1988) 263(8): 3558-64). La actividad específica de la proteína purificada fue de 64 umol min"1 mg"1 a un pH de 8 y 37 °C. El valor kcat para la enzima purificada fue de 71 s"1.
Se estudió la estabilidad en presencia de aire de la DHAD purificada al incubar la enzima purificada a 23 °C durante varios intervalos de tiempo en presencia de aire ambiental seguido de un análisis de actividad, tal como se describió anteriormente. La DHAD de L. lactis estuvo casi totalmente activa incluso después de 20 horas de incubación en presencia de aire, tal como se muestra en la Figura 8.
El espectro UV visible de la L. lactis purificada se muestra en la Figura 9. Es característico de las proteínas con grupos [2Fe-2S] .
Ejemplo 10 Uso de la dihidroxiácido deshidratasa para construir una ruta para la producción de isobutanol en levadura Las primeras tres etapas de una ruta biosintética del isobutanol se realizan con las enzimas acetolactato sintasa, cetoácido reductoisomerasa (KARI) y dihidroxiácido deshidratasa. La acetolactato sintasa está codificada por alsS. Los genes KARI se conocen como ILV5 en levadura o ilvC en bacterias. Cuando se forma el -cetoisovalerato (KIV) a partir de piruvato mediante la reacción de estas tres enzimas, se puede convertir adicionalmente a isobutanol en levadura con alcohol deshidrogenasas .
El vector pLH532 (sec. con núm. de ident.: 411) se construyó para expresar genes alsS y KARI . Este vector se deriva del vector basado en dos mieras pHR81. En el pLH532, la región codificante de alsS de B. subtilis (nt 14216 a 15931) estuvo bajo el control del promotor CUP1 (nt. 15939 a 16386) . Hubo dos genes KARI en el pLH532: la región codificante de ilvC de P. fluorescens Pf5 (nt. 10192 a 11208) estuvo bajo el control del promotor ILV5 de la levadura (nt. 11200 a 12390), y la región codificante de ILV5 de la levadura (nt. 8118-9167) se puso bajo el control del promotor FBA (nt. 7454-8110) . El marcador de selección fue URA3 (nt. 3390 a 4190) .
El huésped de levadura para la producción de isobutanol fue BY4741 pdel : :FBAp-alsS-LEU2. Esta cepa se construyó de la manera siguiente. En primer lugar, se construyó el plásmido de expresión pRS426-FBAp-alsS. El fragmento de la región codificante de alsS de 1.7 kb de pRS426: :GPD: :alsS: : CYC se aisló por purificación en gel seguido de la digestión de BbvCI y Pací. Este plásmido tiene un gen quimérico que contiene el promotor GPD (sec. con núm. de ident.: 439), la región codificante de alsS de Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident.: 438) y el terminador CYC1 (sec. con núm. de ident.: 440), y se describió en el Ejemplo 17 de la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957A1, que se incorpora en la presente descripción como referencia. El fragmento ILV5 del plásmido pRS426 : : FBA: : ILV5 : : CYC, que también se describe en el Ejemplo 17 de la patente de los Estados Unidos núm. 20070092957, se eliminó por digestión de restricción con BbvCI y Pací, y el fragmento restante del vector de 6.6 kb se purificó en gel. Este vector tiene un gen quimérico que contiene el promotor FBA (sec. con núm. de ident. : 425) y terminador CYC1 que se une a la región codificante del gen ILV5 de S. cerevisiae (sec. con núm. de ident.: 442). Estos dos fragmentos purificados se ligaron durante toda la noche a 16 °C y se transformaron en células TOP10 químicamente competentes (Invitrogen) de E. coli. Los transformantes se obtuvieron por siembra de células en placas con medio LB/Ampl00. La inserción de alsS en el vector se confirmó por patrón de digestión de restricción y PCR (cebadores N98SeqFl y N99SeqR2, secs . con núms . de ident. : 412 y 413) .
Se creó un cásete de disrupción pdcl ·. FBAp-alSS-LEU2 mediante la unión del segmento FBAp-alsS de pRS426-FBAp-alsS al gen LEU2 de pRS425 (ATCC, núm. 77106) por PCR SOE (según lo descrito por Horton et al. (1989) Gene 77:61-68) al usar como plantilla los ADN plasmídicos pRS426-FBAp-alsS y pRS425, con ADN polimerasa Phusion (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; núm. de catálogo F-540S) y cebadores 112590-48A y 112590-30B a D, dados como sec. con núm. de ident.: 414, secs. con núms. de ident.: 415, 416 y 417. Los cebadores externos para la PCR SOE (112590-48A y 112590-30D) contenían regiones 5' y 3' de 50 pb homologas a las regiones corriente arriba y corriente abajo del promotor y terminador de PDC1. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4741(ATCC núm. 201388), y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin leucina y suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Y, págs. 201-202) . Los transformantes se seleccionaron por PCR al usar los cebadores 112590-30E y 112590-30F, dados como secs. con núms. de ident.: 419 y 418, para verificar la integración en el locus de PDCl con supresión de la región codificante de PDCl. Los transformantes correctos tienen el genotipo: BY4741 pdcl : :FBAp-alsS-LEU2.
Para probar si la DHAD de Streptococcus mutans que codifica el ilvD podría usarse para la biosíntesis de butanol, el vector de expresión que contiene este ilvD, pRS423 FBA ilvD(strep), preparado en el Ejemplo 6, se cotransformó con el vector pLH532 en una cepa de levadura BY4741 pdcl : .-FBAp-alsS-LEU2. La preparación, transformación y el medio de crecimiento de células competentes para la selección de los transformantes fueron iguales a los descritos en el Ejemplo 6. Las colonias seleccionadas se cultivaron en condiciones limitantes de oxígeno en 15 mi de medio en botellas de suero de 20 mi con tapones. Las botellas se incubaron a 30 °C en un agitador con una velocidad constante de 225 rotaciones por minuto. Después de 48 horas de incubación, las muestras se analizaron con HPLC para determinar la presencia de isobutanol. El resultado del análisis de la HPLC se muestra en la Figura 7. La presencia de isobutanol estuvo indicada por un pico con un tiempo de retención de 47.533 minutos. Este resultado demostró que la expresión del gen ilvD de Streptococcus mutans, junto con la expresión de los genes alsS y KARI, condujo a la producción de isobutanol en levadura.
Ejemplo 11 Consulta de bases de datos actualizadas para identificar otras dihidroxiácido deshidratasas [2Fe-2S] Más tarde se realizó una segunda consulta en la base de datos pública actualizada para descubrir nuevas secuencias de dihidroxiácido deshidratasas [2Fe-2S] . En el punto de corte de identidad de 95 %, se generó un conjunto inicial de 1425 secuencias a partir de una consulta de la base de datos, según lo descrito en el Ejemplo 1, "Análisis filogenético" . Después se ejecutaron alineamientos múltiples de secuencias con ClustalW, tal como se describe en el Ejemplo 1. Las secuencias se analizaron posteriormente para determinar los siguientes residuos conservados en las posiciones correspondientes en la DHAD de S. mutans: cisteínas en las posiciones 56, 129 y 201, ácido aspártico en la posición 88, arginina o asparagina en la posición 142, asparagina en la posición 208, y leucina en la posición 454. En una adición al conjunto original de 193, se identificaron 88 dihidroxiácido deshidratasas [2Fe-2S] novedosas de bacterias y se listan en la Tabla 2b.
Tabla 1 HMMER2.0 [2.2 g] Nombre y versión del programa ÑAME dhad_for_hmm Nombre del archivo de alineamiento de secuencias de entrada LENG 564 Longitud del alineamiento: incluye inserciones/supresiones ALPH Amino Tipo de residuos MAP yes (si) Mapa de los estados de coincidencia para las columnas del alineamiento COM/app/public/hmmer/currentibin/hmmbuild (construir) Comandos usados para generar el archivo: este significa que se aplicó hmmbuild -F dhad-exp_hmm dhadjor hmm. aln (parámetros predeterminados) al archivo de alineamiento COM/ app/public/hmmer/current/bin/ Comandos usados para generar el archivo: este significa que se aplicó hmmcalibrate hmmcalibrate (calibrar) dhad-expjimm (parámetros predeterminados) al perfil hmm NSEQ 8 Número de secuencias en el archivo de alineamiento FECHA: martes 3 de junio, 10:48:24, 2008 Fecha de generación del archivo XT -8455 -4 -1000 -1000-8455 -4 -8455 -4 La distribución de probabilidades de transición para el modelo nulo (único estado G) NULT -4 -8455 La distribución de probabilidades de emisión de símbolos para el modelo nulo (estado G); NULE 595 -1558 85338 -294453 -1158 197249902 - consiste de enteros K (por ejemplo, 4 o 20). La probabilidad de valores nulos usada para 1085 -142 -21 -31345531 201 384 -199 convertir estos nuevamente en probabilidades del modelo es 1/K.
EVD -499.6509700.086142 Los parámetros de distribución de valores extremos, µ y lambda, respectivamente; ambos valores de punto flotante. Lambda es positivo y distinto de cero. Estos valores se definen cuando el modelo se calibra con hmmcalibrate.
Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 lo 20 25 Tabla 1 Tabla 1 ' 3438. -1472 ¦2840 -304f •3287 -1720 -27301 -28401 -3028| -325T| -2236 -2447| -2730 -2944| -1210 -138 í ¦21S;3| -3430. •3320I 2S . 1 -£O0 -381 390: 100! -620- 210| -466| 275. 39¡»| 40. 96| 350: 11/' •-363 -29it: ¦240I , 1 -7108 -6150: ¦8S -1115 ,70)' -1370!' ·" I : 1 ¦7108 -6? ; •894- •1I15Í •70) 1(1) 1 2038. •985. •3380Í •29101 •1320: •2890I -23 · ¦587¡ •2593. ¦299¡2| «45¡> ¦-2697 ¦208?' ¦1200; 188'1 ,2220! ¦1840 ; 1 4 •500 230¡ ¦381 390I 210] 466 275. ¦39¡( • 96 350! 117' ¦360 -29^í •240 . 1 · -7108' ¦BISpI •89 -1115 O) -13* 1 2(G: I -1243; -2769I raí): ?902; •31721 «980. -697 •2936 -2152 19231 -19741 ·37?; -1331 •1030: 128¡I¡ ¦250;6| -3120' '-2300 : I -5O0I : 4 -381 390: 210| ???#ß .-720 2?5¡ :39jt 96 350: ; it;> ¦240 . I 4 ¦7-1081 ¦81$: : ¦1115 •70) -fj 1 ¾V) | -1738- -1298 428) ¦392J -17371 -3970 -366? -3774 ¦528 -3671 -383jt -3620 -3843 -3290: -173?; : -3210! ¦2770 1 -149! •500. 2$; 4i •381! 390 130 210 466 ¦720 27* 39¡l 96 350 f -36^ •29¡N ¦240 : 1 4 -7108 •d?f; -694- -1I1Í O) -!370 ' -833: -2344 10$. 2412, -2643 -148J -146| -2369 1505| -96. -717 -6601 860I •1966 -25601 -1810 .1 . •500 230¡ 43. •3811 3901 210| 456 ¦720 275i 96 3501 •363 ¦29¡t! -240 . 1 4 -7108. ??f| •894- •1I15Í •70) 1 -"¦38p> •1116 -36ft' ·3026?· 1322. -298)1 -I580¦ ¦2661 17751 : 556 •2562 ¦2860 •21?, •2424 •2O90Í ¦13$: ¦18? ¦620 -149] -500. : 233¡ 43· . -381 390! 1D0 210 466 ; -720 275. 39jl 96 350; ¦36^ ·2 I-240 4 -7108 Í ¡ •894. · •1115 ¦70) •1370' Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Tabla 1 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. /

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para identificar enzimas DHAD [2Fe- 2S] , caracterizado porque comprende: a) buscar en una base de datos una o más secuencias de aminoácidos con un perfil de modelos ocultos de Markov preparado al usar las proteínas de sec. con núm. de ident.: 164, 168, 230, 232, 298, 310, 344 y 346, en donde una coincidencia con un valor E menor que 10"5 proporciona un primer subconjunto de secuencias, en virtud de lo cual el primer subconjunto de secuencias corresponde a una o más proteínas relacionadas con la DHAD; b) analizar el primer subconjunto de secuencias que corresponden a una o más proteínas relacionadas con la DHAD de la etapa (a) para determinar la presencia de tres cisteínas conservadas que corresponden a las posiciones 56, 129 y 201 en la secuencia de aminoácidos de la dihidroxiácido deshidratasa (sec. con núm. de ident.: 168) de Streptococcus mutans, en virtud de lo cual se identifica un segundo subconjunto de secuencias que codifican enzimas DHAD [2Fe-2S] ; y c) analizar el segundo subconjunto de secuencias de la etapa (b) para determinar la presencia de aminoácidos conservados distintivos en posiciones que corresponden a las posiciones en la secuencia de aminoácidos de la DHAD de Streptococcus mutans (sec. con núm. de ident . : 168) que son ácido aspártico en la posición 88, arginina o asparagina en la posición 142, asparagina en la posición 208 y leucina en la posición 454, en virtud de lo cual también se identifica un tercer subconjunto de secuencias que codifican enzimas DHAD [2Fe-2S] .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende: d) expresar un polipéptido que tiene una secuencia identificable por cualquiera de o la totalidad de las etapas a) , b) y e) en una célula; y e) confirmar que ese polipéptido tiene actividad DHAD en la célula.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende: d) purificar una proteína codificada por una secuencia identificable por cualquiera de o la totalidad de las etapas a) , b) y c) ; y e) confirmar que la proteína es una enzima DHAD [2Fe-2S] por espectroscopia ultravioleta visible y de EPR.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende seleccionar una o más secuencias que corresponden a secuencias de enzimas DHAD [2Fe-2S] bacterianas identificadas en cualquiera de o la totalidad de las etapas a) , b) y e).
5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la célula carece de actividad DHAD endógena .
6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque además comprende: d) expresar una o más de las secuencias seleccionadas que corresponden a las secuencias de la enzima DHAD [2Fe-2S] bacteriana en una célula; y e) confirmar que la secuencia de la enzima tiene actividad DHAD en la célula.
7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque además comprende: d) purificar una proteína codificada por una o más de las secuencias seleccionadas que corresponden a las secuencias de enzimas DHAD [2Fe-2S] bacterianas, en virtud de lo cual se produce una proteína purificada; y e) confirmar que la proteína es una enzima DHAD [2Fe-2S] por espectroscopia ultravioleta visible y de EPR.
8. Una célula huésped microbiana caracterizada porque comprende por lo menos una enzima DHAD [2Fe-2S] heteróloga identificable por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. La célula huésped microbiana desconformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la célula es una célula bacteriana o una célula de levadura.
10. La célula huésped microbiana de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula huésped bacteriana es un miembro de un género de bacterias seleccionado del grupo que consiste de Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, y Brevijbacteriu-n, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus y Streptococcus .
11. La célula huésped microbiana de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula de levadura es un miembro de un género de levadura seleccionado del grupo que consiste de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia y Pichia.
12. La célula huésped microbiana de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la célula produce isobutanol.
13. Un método para la producción de isobutanol caracterizado porque comprende: a) proporcionar la célula huésped microbiana de conformidad con la reivindicación 8, en donde la célula huésped comprende una ruta biosintética del isobutanol; y b) cultivar la célula huésped de la etapa (a) en condiciones en las que se produce isobutanol.
14. Un método para la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato caracterizado porque comprende : a) proporcionar el huésped microbiano de conformidad con la reivindicación 8 y una fuente de 2,3-dihidroxiisovalerato; y b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones en las que el 2 , 3-dihidroxiisovalerato se convierte a a-cetoisovalerato .
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