MX2011003185A - Formacion de toxinas del peptido. - Google Patents

Abstract

Se describen procedimientos que utilizan solventes para incrementar la actividad insecticida tópica de los péptidos tóxicos a los insectos. Estos procedimientos comprende secar los péptidos, si es necesario, seguido por la adición de cualquiera: 1) un solvente orgánico polar, con o sin agua, a un péptido secado, o 2) a adición de un solvente aprótico polar u otro adyuvante al péptido secado, seguido por la adición de cualquiera: 1) un solvente orgánico polar, con o sin agua, (en donde un solvente aprótico polar se agrega primero o 2) un solvente aprótico polar, u otro adyuvante al solvente orgánico polar del péptido (en donde el solvente orgánico polar es agregado primero), a la formulación del péptido.

Description

FORMACION DE TOXINAS DEL PEPTIDO Campo de la Invención Esta invención se relaciona con el campo de las formulaciones para péptidos insecticidas.

Antecedentes de la Invención Los péptidos insecticidas son tóxicos para sus objetivos cuando son liberados internamente, pero algunas veces tienen poca o nada de actividad tópica. La actividad insecticida tópica se refiere a la capacidad de una toxina de inhibir el crecimiento, deteriorar el movimiento o incluso matar a un insecto cuando la toxina es liberada al insecto o al ambiente del insecto rociando, u otros medios, a diferencia de liberar la toxina directamente al intestino del insecto o a los órganos internos mediante inyección o induciendo al insecto a consumir la toxina de su alimento, por ejemplo un insecto que se alimenta sobre una planta transgénica.

La capacidad de mejorar con éxito o incluso cambiar las propiedades de péptidos con solventes, hasta este momento, han probado ser evasivas. La amplia variedad, las propiedades únicas y la naturaleza especial de los péptidos, combinadas con la enorme variedad de solventes posibles uno podría seleccionar de, haber producido solamente algunos métodos descritos para el mejoramiento de algunos péptidos seleccionados en los últimos 50 años más o menos. Existen Ref . : 218788 varios textos en el objeto. Ver por ejemplo, Principies of Dairy Chemistry Jenness and Patton (1959) pp. 115-117, 127, 317, 326-328, 333.

Se han hecho intentos de mejorar la actividad de algunos péptidos a través de purificación y extracción. Por ejemplo, la Patente US No. 5,840,838, Hensley, describe un procedimiento para mejorar la actividad del péptido ß amiloide, un péptido de 39-43 residuos, con un proceso que implica disolver el péptido en un solvente orgánico, incubarlo por 45 minutos hasta 3 horas arriba de la temperatura ambiente, equilibrar a temperatura ambiente y después extraer el solvente.

La Patente US 4,530,784, Rosenberg, se relaciona con un método de extraer un factor biológicamente activo que restaura la inhibición de contacto del crecimiento a las células malignas en mamíferos mezclando medios especialmente preparados con un agente de precipitación sin desnaturalizar volátil. El precipitado formado por esta reacción es separado de la formulación y se extrae con un agente amortiguador iónico biológicamente aceptable.

La patente US No. 4,337,94, Díaz, es un proceso de preparar somatostatina utilizando una reacción de acoplamiento del péptido paso a paso en una solución de DMF. El producto de la reacción es aislado mediante evaporación o mediante precipitación con un segundo solvente que hace la somatostatina insoluble, entonces el péptido crudo obtenido es purificado.

Hay pocas incluso ninguna descripción, sin embargo, para un método de convertir un péptido que tiene baja actividad insecticida tópica en uno que tiene actividad insecticida tópica significativamente mayor.

El procedimiento descrito aquí aumenta la toxicidad insecticida tópica de péptidos insecticidas. Los péptidos así tratados son referidos aquí como "péptidos tópicos mejorados." El proceso aquí descrito de hacer péptidos tópicos mejorados es llamado algunas veces elaboración de péptidos "especiales." El proceso de hacer los péptidos especiales de este modo hace los péptidos más activos que antes de que sean tratados con el proceso o tratamiento descrito aquí. Üna vez que los péptidos se hayan hecho especiales pueden ser aplicados tópicamente al insecto, el ambiente del insecto, a los lugares que habita, su habitat y al alimento que toca, come o consume; para controlar el insecto, en lugar de tener que dirigir el péptido dentro del genoma de una planta u otro alimento apropiados. Ambos el nuevo proceso, las formulaciones, y los péptidos tópicos mejorados nuevos producidos por el proceso se describen y se reivindican aquí.

Sumario de la Invención Se describen procedimientos que utilizan solventes para aumentar la toxicidad de los péptidos tóxicos del insecto. Esos procedimientos implican la preparación de los péptidos mediante el secado de los péptidos, si es necesario, seguido por la adición de cualquiera: 1) un solvente orgánico polar, con o sin agua, a un péptido secado, o 2) un solvente aprótico polar u otro adyuvante al péptido secado, seguido por la adición de cualquiera: 1) un solvente orgánico polar, con o sin agua, (en donde el solvente aprótico polar se agrega primero o 2) un solvente aprótico polar, u otro adyuvante al solvente orgánico polar del péptido (en donde el solvente orgánico polar es agregado primero) , a la formulación del péptido.

Los procedimientos también pueden ser descritos como sigue: Un método de aumentar la actividad insecticida tópica de un péptido tóxico para insecto, aquí llamado elaboración del péptido especial comprende: agregar cualquiera i) un solvente orgánico polar o ii) un solvente o adyuvante aprótico polar al péptido y después agregar cualquiera i) un solvente orgánico polar o ii) un solvente o adyuvante aprótico polar, que no fueron agregados siempre inicialmente a la formulación inicial del péptido de arriba.

Se describe un método aquí en donde el solvente orgánico polar comprende desde aproximadamente 50, hasta aproximadamente 99.9 por ciento (%) del volumen final de la formulación. Se describe específicamente el método en donde el solvente orgánico polar comprende desde aproximadamente 60, 70, 85, 90 hasta aproximadamente 99.0 por ciento (%) del volumen final de la formulación. El método se describe en donde el solvente orgánico polar comprende desde aproximadamente 70, hasta aproximadamente 99.0 por ciento (%) del volumen final de la formulación. El método se describe específicamente en donde el solvente orgánico polar comprende desde aproximadamente 60, 70, 80, 85, 90, hasta aproximadamente 99.0 por ciento (%) del volumen final de la formulación. El solvente orgánico polar puede ser seleccionado de la acetona, metanol, etanol, propanol y todos sus isómeros, metil etil cetona, dietil cetona, acetonitrilo, acetoacetato de etilo. Los solventes orgánicos polares pueden ser seleccionados de la acetona, metanol, etanol, propanol y todos sus isómeros son especialmente útiles.

El solvente o adyuvante aprótico polar comprenderá desde aproximadamente 20%, hasta aproximadamente 0.001%, del volumen final de la formulación. Específicamente el solvente o adyuvante aprótico polar, comprende desde aproximadamente 15%, hasta aproximadamente 0.005%, desde aproximadamente 10%, hasta aproximadamente 0.01%, desde aproximadamente 8%, hasta aproximadamente 0.1%, desde aproximadamente 5%, hasta aproximadamente 0.1%, del volumen final de la formulación. El solvente o adyuvante aprótico polar es seleccionado del sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida, dioxano y dimetil hexametilfosforotriamida . Sulfoxido de dimetilo, conocido como DMSO también es ejemplificado.

Los péptidos tóxicos a los insectos son preferiblemente aquellos con a) mas de 10 residuos de aminoácidos y menos de 3000 residuos del aminoácido; b) un peso molecular desde aproximadamente 550 Da hasta aproximadamente 350,000 Da; y c) tienen actividad insecticida. Los péptidos pueden tener opcionalmente 1 a 5 enlaces de disulfuro. La actividad insecticida de los péptidos son opcionalmente péptidos que tienen actividad tópica en por lo menos un análisis insecticida tópico reproductible . Los péptidos tóxicos a los insectos pueden ser seleccionados del veneno de una araña, de un ácaro, escorpión, serpiente, caracoles, ciertas plantas o cualquier combinación de los mismos. La araña puede ser una araña con tela en embudo Australiana, y los péptidos del género de Atrax o Hadronyche son fácilmente hechos especiales con los procedimientos descritos aquí. Los péptidos específicos de arañas, escorpiones y plantas se proporcionan en el listado de secuencias.

Se describen formulaciones de péptidos tóxicos especiales que comprenden: a) un péptido; b) un solvente orgánico polar; c) un solvente o un adyuvante aprótico polar; d) en donde el solvente orgánico polar comprende desde aproximadamente 80, hasta aproximadamente 99 por ciento (%) del volumen final de la formulación; e) en donde el solvente o adyuvante aprótico polar comprende desde aproximadamente 1, hasta aproximadamente 10 por ciento (%) del volumen final de la suspensión; y f) una fase de agua opcional, en donde la fase de agua comprende desde 0 (cero) , hasta aproximadamente 10 por ciento (%) del volumen final de la suspensión. , Los péptidos hechos especiales por el proceso de esta invención son nuevos y pueden ser reivindicados por separado. Estos péptidos son descritos por todas sus propiedades y no simplemente su secuencia. Para la mayoría la información de secuencia del péptido de los péptidos que pueden ser hechos especiales, de acuerdo a lo descrito aquí, es conocida; sin embargo, una vez sean tratados los mismos péptidos tendrán gran actividad tópica. Estos péptidos hechos especiales son nuevos con propiedades únicas, los péptidos y el proceso de hacerlos se describen y se reivindican aquí.

También se describen métodos para controlar insectos, en particular aplicaciones de los péptidos tóxicos especiales o las formulaciones tóxicas especiales del péptido se aplican al ambiente del insecto. El péptido tóxico especial se puede aplicar como una formulación seca o líquida. La formulación puede incluir agentes de humectación y de dispersión, los tensioactivos y otros componentes comunes de formulaciones insecticidas de péptido. También, son descritos los péptidos tóxicos especiales producidos como el producto de cualquiera de los procesos descritos aquí. Los procesos descritos aquí se pueden utilizar con cualquier péptido. Los péptidos siguientes se mencionan en forma de ejemplos específicos y no están previstos para limitar el intervalo, tipo o número de péptidos que pueden ser hechos especiales con este proceso.

Descripción Detallada de la Invención "Ingrediente activo" significa un péptido o polipéptido, aquí algunas veces es llamado una toxina.

"Actividad insecticida" , "control del insecto" o "controlar el insecto" significa que en o después de la exposición del insecto al ingrediente activo, el insecto o muere, para o retarda su movimiento o su alimentación, para o retarda su crecimiento, falla al crisalidar, no puede reproducirse ni puede producir vastagos fértiles.

"Ambiente del insecto" significa cualquier lugar o superficie que estén o sean expuestos a un insecto. El ambiente del insecto incluye los lugares que habita, su habitat y el alimento que toca, come o consume.

"Péptido tóxico al insecto" significa un péptido que tiene actividad insecticida cuando es ingerido por o inyectado dentro de un insecto pero que tiene poca, baja o ninguna actividad insecticida tópica.

"Péptido hechos especiales" significa lo mismo como "péptido tópico especial" abajo.

"Solventes apróticos polares" son solventes orgánicos que tienen energía que disuelve el ión pero carecen de un hidrógeno ácido. Un solvente aprótico polar no puede donar hidrógeno (H+ o protón.) . Estos solventes generalmente tienen altas constantes dieléctricas y alta polaridad. Ejemplos adicionales que deben ser considerados representativos y no limitantes son; sulfóxido de dimetilo (DMSO) , dimetilformamida, dioxano, hexametilifosforotriamida y metil sulfóxido (MSO®) . Adyuvantes como solventes apróticos polares . Ciertos adyuvantes también pueden ser solventes apróticos polares. Las mezclas de aceites con tensioactivos , referidas comúnmente como adyuvantes son otros ejemplos de solventes apróticos polares. Los aceites de cultivos en combinación con tensioactivos también pueden actuar como solventes apróticos polares. Ejemplos tales como Agicide Activator®, Herbimax®, aximizer® , y MSO® todos disponibles del Loveland Company sirven para demostrar que los adyuvantes comerciales pueden actuar como solventes apróticos polares como el término es definido por esta invención. MSO® es un aceite de semilla metilado y la mezcla de tensioactivo que utiliza ésteres de metilo de aceite de soya en cantidades de entre aproximadamente 80 y 85 por ciento de aceite de petróleo con 15 a 20 pos ciento de tensioactivo. El uso y descripciones de MSO® utilizado como un solvente aprótico polar se pueden encontrar en el ejemplo 7.

"Solventes orgánicos polares" son solventes orgánicos con momentos de dipolo suficientes para conferir una constante dieléctrica de 15 o más alta, acetona es un ejemplo. Otros ejemplos de solventes orgánicos polares incluyen compuestos con un H+ disociable, tal como alcoholes alquilo inferiores. Ejemplos adicionales que deben ser considerados representativos y no limitantes son como sigue: acetona, metanol, etanol, propanol, todos los isómeros de propanol incluyen 1- y 2-, propanol (n e iso-propanol, respectivamente) . Otros solventes orgánicos polares que se pudieron utilizar con éxito como parte de esta formulación pueden ser determinados por las personas experimentadas en la técnica; éstos pueden incluir metil etil cetona, dietil cetona, acetonitrilo, acetoacetato de etilo, etc.

"Péptido tópico especial" significa un péptido que tiene previamente actividad insecticida tópica baja que tiene actividad insecticida tópica relativamente más alta debido a los procedimientos descritos aquí utilizados para aumentar la actividad tópica de péptidos.

"Actividad tópica" o "actividad insecticida tópica" significan la actividad insecticida que resulta de la exposición o contacto de las capas externas del insecto, al péptido insecticida. La actividad tópica puede resultar de la exposición o contacto entre un material o superficie tratada y la parte externa del insecto, tal como sus pies, abdomen, antena, boca. La actividad tópica puede resultar de la limpieza del insecto de las partes externas del insecto seguida por la ingestión de la toxina. El tratamiento de cualquier material o superficie con el insecticida o toxina que después entra en contacto con el insecto con actividad insecticida resultante se considera una actividad tópica.

"Aplicación tópica" significa la aplicación del ingrediente activo al ambiente de un insecto, o al insecto mismo. El ambiente de un insecto puede ser tratado con una "aplicación tópica" de cualquier manera que incluye: rociar, pintar, cebar, impregnar materiales, tal como tratar papel u otros objetos que después se ponen en la misma área que se sabe o se espera que el insecto visite o frecuente. La aplicación tópica también puede significar contacto directo con el insecto y el insecticida.

El proceso para hacer especial Descripción del proceso para hacer péptidos especiales.

Agregar un solvente orgánico polar, con o sin agua, a un péptido secado y después agregar el solvente aprótico polar u otro adyuvante a la formulación del solvente orgánico polar del péptido (agua opcional) , o en alternativa primero agregar un solvente aprótico polar u otro adyuvante a un péptido seco y después agregar un solvente orgánico polar (con o sin agua) a la formulación del solvente aprótico polar del péptido. Tratamientos y pretratamientos adicionales a los péptidos y formulaciones de solventes del péptido son opcionales y se discuten abajo.

Los péptidos hechos especiales entonces son utilizados de acuerdo a lo deseado para el efecto. La aplicación y uso de los péptidos hechos especiales pueden ser con cualquier medio, ya sea estándar o de acuerdo a lo determinado que es eficaz por una persona experimentada en la técnica, incluyendo pero no limitado a: rociar con el atomizador u otro tipo de inyector de aerosol, aplicación directa/indirecta de las gotitas de la formulación, aplicación del residuo secado de la formulación a cualquier superficie del cuerpo del insecto objetivo, inmersión del insecto objetivo en un baño, etc.

El péptido se hace especial durante la terminación de la adición del solvente orgánico polar y el solvente aprótico polar u otro adyuvante, con los solventes agregados en cualquier orden. Es mejor comenzar con un péptido que está en un ambiente no acuoso. El orden preferido de adición del solvente será determinado por una persona experimentada en la técnica de la formulación de insecticida, dando atención y consideración a los péptidos particulares utilizados. Las numerosas variaciones de la manera en la cual se agrega el solvente se pueden hacer y deben ser evidentes para la persona experimentada en la técnica. Algunas variaciones y más detalles del procedimiento se proporcionan abajo.

La preparación del péptido mediante la extracción de agua puede ser necesaria si los péptidos de partida se disuelven en agua. El procedimiento de hacer los péptidos especiales puede ser practicado con péptidos que tienen alta o baja solubilidad en agua. Frecuentemente los péptidos están preparados en solventes a base de agua o expresados en ambientes acuosos. Si el péptido que se hará especial está en un ambiente acuoso, la mayor parte de agua primero debe ser extraída, en este caso el péptido debe ser secado. Si el péptido está ya en un estado seco, entonces el secado no es necesario. La preparación de péptidos puede implicar concentrar, purificar, aislar o identificar los péptidos y las cantidades o concentración del péptido en la muestra. Una vez que el péptido está en un estado, condición o concentración preferida, debe ser "secado." Un método de secar un péptido, o tomarlo de un ambiente acuoso, es liofilizar el péptido usando procedimientos tradicionales de liofilización del péptido. Ver Protein Analysis and Purification 2da Ed. Rosenberg 2005 pp 140. Otros métodos incluyen, pero no se limitan a, secado por aerosol, evaporación rotatoria, y centrifugación por vacío. El secado del Péptido se debe hacer de una forma tal que los péptidos no son dañados ni destruidos indebidamente. El calor excesivo debe ser evitado. Las personas experimentadas en la técnica sabrán y podrán practicar procedimientos apropiados para secar el péptido.

Agregar el solvente orgánico polar al péptido secado. Una vez que el péptido es preparado al tener la mayor parte de agua extraída, está listo para mezclarse con el solvente orgánico polar o el solvente o adyuvante aprótico polar. Se obtienen resultados mejores algunas veces cuando se agrega el solvente orgánico polar al péptido secado antes de que se agregue el solvente aprótico polar y el orden es descrito más abajo, pero con algunos péptidos en algunas situaciones el solvente aprótico polar es agregado al péptido secado seguido por la adición del solvente orgánico polar.

El solvente orgánico polar.

Muchos solventes orgánicos polares pueden ser utilizados, algunos parecen producir péptidos que tienen mayor actividad tópica que otros. Hemos encontrado que los siguientes solventes orgánicos polares trabajan bien en este procedimiento para hacer péptidos especiales: acetona, metanol, etanol, propanol, todos los isómeros del propanol incluyendo 1- y 2-, propanol (n e iso-propanol , respectivamente) . Otros solventes orgánicos polares que se pudieron utilizar con éxito como parte de esta formulación pueden ser determinados por las personas experimentadas en la técnica; éstos pueden incluir metil etil cetona, dietil cetona, acetonitrilo, acetoacetato de etilo, etc. El mezclado de péptido y solvente se puede hacer con cualquier método del laboratorio de mezclado tal como mezclado de vórtice, agitar, sacudir, etc.

Si el solvente orgánico polar se agrega al péptido secado antes que el solvente/adyuvante aprótico entonces este (el solvente orgánico polar) puede ser tanto como aproximadamente 98 a 100% del líquido en la formulación, y el péptido formará probablemente un precipitado en el solvente. La formulación puede aparecer como una suspensión nublada o nebulosa. Debe ser mezclada vigorosamente. El solvente orgánico polar puede tener un poco de agua en él, ver "agua" abajo, pero el solvente puro o seco también trabaja bien. Las concentraciones finales óptimas de agua y solvente orgánico polar pueden ser determinadas para una formulación de un péptido tópico especial particular por las personas experimentadas en la técnica. Hemos formulado péptidos tópicos especiales con solvente orgánico polar en concentraciones finales de 80 a 99%. Concentraciones más bajas que 80% también trabajarían con algunos péptidos. Describimos específicamente solventes orgánicos polares en concentraciones finales de 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99% y con agua en concentraciones finales de 0% a 10%, en particular se describen concentraciones finales de agua de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10%. Las personas experimentadas en la técnica podrán utilizar con éxito valores fuera de estos intervalos de la muestra para formulaciones particulares de péptidos tópicos especiales particulares. Sonicación. Una vez que el péptido se toma correctamente en el solvente puede ser sonicado o de lo contrario tratado para aumentar adicionalmente su actividad tópica. La sonicación puede romper las partículas del péptido en solución y reducir el tamaño de las partículas suspendidas. La sonicación u otros procedimientos para reducir el tamaño de partícula parece aumentar la toxicidad tópica de los péptidos. Otros procedimientos que reducen el tamaño de partícula, además de la sonicación, se pueden utilizar para aumentar la actividad tópica. Varios procedimientos para reducir el tamaño de partícula deben ser conocidos para las personas experimentadas en la técnica de la manipulación de péptido. Sin ser limitado por cualquier procedimiento o mecanismo particular, utilizar un mezclador de alta velocidad, sacudir o agitar con perlas de vidrio también puede ser útil para aumentar la toxicidad de los péptidos tóxicos especiales.

Agua . De acuerdo a lo mencionado arriba, el solvente orgánico polar no necesita ser puro o absoluto cuando es utilizado: puede contener agua. Por otra parte, esta agua puede contener sales, moléculas orgánicas, péptidos, etc. El agua se puede agregar probablemente al péptido ya sea antes de que el solvente orgánico polar se agregue a la formulación del péptido, o al mismo tiempo o después de la adición del solvente orgánico polar. Se debe tener cuidado de no utilizar una concentración demasiado grande de agua, puesto que hemos observado que ésta puede reducir o eliminar la actividad de ciertas formulaciones de ciertos péptidos tópicos especiales. El agua no necesita ser pura, puede incluir varias proteínas tales como quitinasas, fosfolipasas , lectinas, etc., o sales, azúcares, carbohidratos, etc., para crear una solución final más útil y más estable. Alternativamente, la fase del agua puede inicialmente ser agua pura y entonces varias proteínas tales como quitinasas, fosfolipasas , lectinas etc. podrían ser agregadas a la fase de agua después de que se mezclen con el solvente orgánico polar y los péptidos.

El solvente aprótico polar.

El solvente o adyuvante aprótico polar se puede utilizar como el primer ingrediente agregado al péptido secado o puede ser agregado a la formulación polar del solvente orgánico del péptido (agua opcional) descrita arriba. Las personas experimentadas en la técnica pueden determinar si el solvente aprótico polar o solvente orgánico polar debe ser el primer líquido agregado al péptido secado para determinar la manera mejor de hacer los péptidos especiales. Esta determinación dependerá de las circunstancias de cada caso y en particular exactamente que el péptido tóxico del insecto es utilizado y la formulación final deseada. Sin embargo, tales variaciones deben ser practicadas con cuidado, pues hemos observado que en algunos casos resultó actividad insecticida más baja si el solvente aprótico polar fue agregado al péptido antes de que se agregue el solvente orgánico polar.

Los solventes apróticos polares carecen de un hidrógeno ácido. Estos solventes tienen generalmente altas constantes dieléctricas y alta polaridad. Ejemplos incluyen sulfoxido de dimetilo, dimetilformamida, dioxano y hexametilfosforotriamida .

El adyuvante puede ser cualquier aceite y/o tensioactivo emulsionante formulados para aplicación agrícola de pesticidas y especialmente de péptidos . Estas formulaciones comerciales tienen típicamente aceites y tensioactivos emulsivos formulados "para llevar y dispersar" los ingredientes activos. Los ejemplos incluyen: "Aero-Dyneamic" de Helena Chemical Co. Que tiene aceite vegetal metilado o etilado, un tensioactivo no iónico y un agente amortiguador o acidificadó . Se describe además como una "mezcla propietaria de ásteres de alquil fosfato etoxilados, polidimetilsiloxano modificado con polialquileno, emulsionadores no iónicos y aceites vegetales metilados. Para uso aéreo solamente en 2-8 qt/100 gal. 30-70 por ciento, proporciona la reducción del pH y neutraliza, el NIS y la mezcla de aceite" ver la etiqueta para los índices. Ejemplos y fabricantes adicionales de adyuvantes se pueden encontrar en la tabla 1 Tabla 1 (abajo) : Tensioactivos agroquímicos página siguiente.) Las concentraciones finales óptimas del solvente y/o adyuvante aprótico polar pueden ser determinadas para la formulación de un péptido tópico particular hecho especial por las personas experimentadas en la técnica. Hemos formulado con éxito péptidos tópicos especiales con solvente aprótico polar en concentraciones finales de 10% y tan bajas como 0.01%, con 0.5% trabajando bien. El adyuvante Silwet L-77, por ejemplo, trabaja bien en una concentración final tan baja como 0.01%, y las personas experimentadas en la técnica deben poder encontrar con éxito otros adyuvantes que utilicen incluso valores más altos o más bajos que los intervalos descritos aquí para formulaciones particulares de péptidos tópicos particulares hechos especiales.

El agua y los pasos de sonicación descritos arriba se pueden aplicar en cualquier orden. Los modos particulares de aplicación insecticida para formulaciones particulares de péptidos tópicos especiales serán determinados por las personas experimentadas en la técnica.

Péptidos tóxicos tópicos y su preparación.

Ejemplos de péptidos tóxicos del insecto son bien conocidos y se pueden encontrar en numerosas referencias. Pueden ser identificados por su naturaleza y su actividad peptídica, generalmente actividad insecticida oral o inyección. Aquí proporcionamos algunos ejemplos para ilustrar y para describir mejor la invención, pero la invención no se limita a estos ejemplos. Todos estos ejemplos y otros no demostrados aquí son descriptivos de nuevos materiales, descritos y reivindicados aquí por primera vez.

Los péptidos tóxicos a los insectos son péptidos mayores que 5 residuos de aminoácido y menores que 3000 residuos de aminoácido. Se encuentran en el intervalo en peso molecular desde aproximadamente 550 Da hasta aproximadamente 350,000 Da. Los péptidos tóxicos a los insectos tienen cierto tipo de actividad insecticida. Típicamente muestran actividad cuando son inyectados dentro de insectos pero la mayoría no tiene actividad significativa cuando es aplicada tópicamente a un insecto. La actividad insecticida de péptidos tóxicos a los insectos se mide en una variedad de formas. Los métodos comunes de medición son conocidos extensamente para las personas experimentadas en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no son limitados a la determinación de dosis de respuesta media (por ejemplo, LD50, PDS0, LCS0, ED50) mediante el ajuste de diagramas de respuesta de dosis basados en varios parámetros de calificación tales como: parálisis, mortalidad, falta de ganancia de peso, etc. Las mediciones se pueden hacer para cohortes de insectos expuestos a varias dosis de la formulación insecticida en cuestión. El análisis de los datos puede ser hecho creando curvas definidas por análisis probit y/o ecuación de Hill, etc. En tales casos, las dosis serían administradas por inyección hipodérmica, por infusión hiperbárica, por presentación de la formulación insecticida como parte de una muestra de alimento o cebo, etc .

Los péptidos tóxicos a los insectos se definen aquí como todos los péptidos mostrados que son insecticidas durante la liberación a los insectos ya sea por inyección hipodérmica, infusión hiperbárica, o durante liberación de administración oral a un insecto (en este caso, por ingestión como parte de una muestra de alimento presentado al insecto) . Esta clase de péptidos comprende así, pero no se limita a, muchos péptidos producidos naturalmente como componentes de venenos de arañas, ácaros, escorpiones, serpientes, caracoles, etc. Esta clase también comprende, pero no se limita a, varios péptidos producidos por las plantas (por ejemplo, varias lecitinas, proteínas inactivadoras de ribosomas, y proteasas de cisteína) , y varios péptidos producidos por los microbios entomopatogénicos (por ejemplo la familia de la endotoxina Cryl/delta de proteínas producidas por varias especies Bacillus) .

Los siguientes documentos son incorporados por referencia en los E.U.A en su totalidad, en otras jurisdicciones en donde son permitidos y son de conocimiento común dada su publicación. Además son incorporados por referencia y conocidos específicamente por sus listados de secuencias al grado que describen secuencias del péptido. Ver lo siguiente: Patentes Estadounidenses: US 5,763,568, publicadas el 9 de junio de 1998, específicamente las secuencias en el listado de secuencias, y aquellas numeradas 1 - 26, y aquellas conocidas como toxinas "kappa" u "Omega" , incluyendo las que pueden formar 2-4 puentes disulfuro intracadena, y los péptidos que aparecen en las columnas 2 y 4, y Tabla 5, y en la Fig. 5, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18. La Patente US 5,959,182, publicada el 28 de septiembre de 1999, específicamente las secuencias en el listado de secuencias, y aquellas numeradas 1-26 y aquellas conocidas como toxinas "kappa" u "Omega" , incluyendo las toxinas que pueden formar 2-4 puentes disulfuro intracadena, y los péptidos que aparecen en las columnas 2 y 4, y la Tabla 5, y en la Fig. 5, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18. La Patente US 6,583,264 B2 , publicada el 24 de junio de 2003, y la Patente US 7,173,106 B2 , publicada el 6 de febrero de 2007 específicamente la secuencia número 1, llamada "omeg -atracotoxin-Hv2a u co-atracotoxin-Hv2a, incluyendo las toxinas que pueden formar 2-4 puentes disulfuro intracadena. La Patente US 7,279,547 B2 , publicada el 9 de octubre de 2007, específicamente las secuencias en el listado de secuencias, y aquellas numeradas 1-35, y variantes de cj-atracotoxin-Hv2a, toxinas que pueden formar 2-4 puentes disulfuro intracadena, y los péptidos que aparecen en las columnas 4-8 de la especificación, y en la Fig. 3 y Fig. 4. La Patente US 7,354,993 B2 , publicada el 8 de abril de 2008 específicamente las secuencias de péptido enumeradas en el listado de secuencias, y aquellos numerados 1-39, y aquellos llamados polipéptidos U-ACTX, las toxinas que pueden formar 2-4 puentes disulfuro intracadena, y variantes de los mismos, y los péptidos que aparecen en las columnas 4-9 de la especificación y en la Fig. 1. La patente EP 1 812 464 Bl, publicada y concedida el 08.10.2008 Boletín 2008/41, específicamente las secuencias de péptido enumeradas en el listado de secuencias, las toxinas que pueden formar 2-4 puentes disulfuro intracadena, y aquellas numeradas como 1-39, y aquellas llamadas polipéptidos U-ACTX, y variantes de los mismos, y los péptidos que aparecen en los párrafos 0023 a 0055, y aparecen en la Fig. 1.

Descritas e incorporadas por referencia a los péptidos identificados aquí son variantes homologas de las secuencias mencionadas, tienen homología a tales secuencias o referidas aquí que también son identificadas y reivindicadas como apropiadas para ser hechas especiales de acuerdo a los procesos descritos aquí incluyen pero no se limitan a todas las secuencias homologas incluyendo secuencias homologas que tienen por lo menos cualquiera de los porcentajes de identidades siguientes con respecto a cualquiera de las secuencias descritas aquí o a cualquier secuencia incorporada por referencia: 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o mayor identidad a cualquiera y todas las secuencias identificadas en las patentes registradas arriba, y a cualquier otra secuencia identificada aquí, incluyendo cada una y todas las secuencias en el listado de secuencias de esta solicitud. Cuando el término homólogo u homología se utiliza aquí con un número tal como 30% o mayor entonces significa que es el porcentaje de identidad porcentaje de similaridad entre los dos péptidos . Cuando homólogo u homología se utiliza sin un porcentaje numérico entonces se refiere a dos secuencias de péptido que se relacionan de cerca en el aspecto evolutivo o de desarrollo en que comparten aspectos físicos y funcionales comunes como toxicidad tópica y tamaño similar dentro de 100% de longitud mayor o 50% de longitud más corta del péptido.

Descritos e incorporados por referencia a los péptidos identificados aquí que son derivados de cualquier fuente mencionada en los documentos de patente US y EP referidos arriba, incluyen pero no se limitan a los siguientes: Toxinas aisladas de plantas e insectos, especialmente toxinas de arañas, escorpiones y plantas que se alimentan de o se defienden ellas mismas de insectos, tales como, arañas de embudo y especialmente araña de embudo australiana, incluyendo toxinas encontradas en, aisladas de o derivadas del género Atrax o Hadronyche, incluyendo la especie del género, Hadronyche versuta, o la araña de embudo de la montaña azul, Atrax robus tus , Atrax formidahilis , Atrax infensus incluyendo las toxinas conocidas como "atracotoxinas , " "co-atracotoxinas , " atracotoxins kappa, atracotoxinas "Omega" , "también conocidas como ?-atracotoxina, polipétidos de U-ACTX, U-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvla, rU-ACTX-Hvlb, o mutantes o variantes, especialmente péptidos de cualquiera de estos tipos y especialmente aquellos de menos de aproximadamente 200 aminoácidos pero mayores que aproximadamente 10 aminoácidos, y especialmente péptidos de menos de aproximadamente 150 aminoácidos pero mayor que aproximadamente 20 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de aproximadamente 100 aminoácidos pero mayor que aproximadamente 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de aproximadamente 65 aminoácidos pero mayor que aproximadamente 25 aminoácidos, especialmente péptidos de menos de aproximadamente 55 aminoácidos pero mayor de aproximadamente 25 aminoácidos, especialmente péptidos desde aproximadamente 37 o 39 o aproximadamente 36 a 42 aminoácidos, especialmente péptidos con menos que aproximadamente 55 aminoácidos pero mayor que aproximadamente 25 aminoácidos, especialmente péptidos con menos de aproximadamente 45 aminoácidos pero mayor de aproximadamente 35 aminoácidos, especialmente péptidos con menos de aproximadamente 115 aminoácidos pero mayor que aproximadamente 75 aminoácidos, especialmente péptidos con menos de aproximadamente 105 aminoácidos pero mayor de aproximadamente 85 aminoácidos, especialmente péptidos con menos de aproximadamente 100 aminoácidos pero mayor de aproximadamente 90 aminoácidos, incluyendo toxinas del péptido de las longitudes mencionadas aquí que pueden formar 2, 3 y o 4 o más puentes disulfuro intracadena, incluyendo toxinas que interrumpen corrientes del canal de calcio, incluyendo toxinas que interrumpen las corrientes del canal de potasio, especialmente canales de calcio de insectos o híbridos de los mismos, especialmente toxinas o variantes de los mismos de cualquiera de estos tipos, y cualquier combinación de cualquiera de estos tipos de toxinas descritas aquí que tienen actividad insecticida tópica, se puede hacer especial por el proceso descrito aquí.

Los péptidos venenosos de la araña de embudo Australiana, del género Atrax y Hadronyche son particularmente apropiados y trabajan bien cuando son tratados por los métodos, procedimientos o procesos descritos por esta invención. Estos péptidos de araña, como muchos otros péptidos tóxicos, incluyendo especialmente péptidos de escorpión tóxico y de plantas tóxicas, se convierten en tópicamente activos o tóxicos cuando son tratados por los procesos descritos por esta invención. Ejemplos de péptidos apropiados probados y con datos se proporcionan aquí . Además de los organismos mencionados arriba, las especies siguientes también son conocidas específicamente por llevar toxinas apropiadas para ser hechas especiales por el proceso de esta invención. Las siguientes especies son llamadas específicamente: Agelenopsis Aperta, Androctonus australis Héctor, Antrax formidahillis, Antrax infensus, Atrax robustus, Bacillus thuringiensis, Bo'ihus martensii Karsch, Bothus occitanus tunetanus, Buthacus arenicola, Buthotus judaicus, Buthus occitanus mardochei , Centruroides noxius, Centruroides suffusus suffusus, Hadronyche infensa, Hadronyche versuta, Hadronyche versutus, Hololena curia, Hottentotta judaica, Leiurus quinquéstriatus, Leiurus quinquestriatus hebraeus, Leiurus quinqu striatus quinquestriatus, Oldenlandia affinis, Scorpio maurus palmatus, Tityus serrulatus, Tityus zulianu. Cualquier toxina peptídica de cualquiera del género enumerado arriba y o especie de género es apropiada para ser hecha especial de acuerdo con el proceso en esta invención.

Los ejemplos en esta especificación no son previstos para, y no deben ser utilizados para limitar la invención, se proporcionan solamente para ilustrar la invención.

Como es observado arriba, muchos péptidos son candidatos apropiados como el sujeto del proceso a hacerse especial. Las secuencias observadas arriba, abajo y en el listado de secuencias son especialmente péptidos apropiados que se pueden hacer especiales, y muchos de éstos se han hecho especiales de acuerdo con esta invención con los resultados mostrados en los ejemplos abajo.

SEQ ID NO: 60 (código de una letra) SPTCI PSGQP CPYNE NCCSQ SCTFK ENENG NTVKR CD 1 5 10 15 20 25 30 35 37 SEQ ID NO: '60 (código de tres letras) Ser Pro Thr Cys lie Pro Ser Gly GIn Pro Cys Pro Tyr Asn Glu Asn 1 5 10 15 Cys Cys Ser Gln Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly Asn Thr 20 25 30 Val Lys Arg Cys Asp 35 37 Llamada "?- ACTX-Hvla" tiene puentes disulfuro en las posiciones: 4-18, 11-22 y 17-36. El peso molecular es 4096. ID NO: 117 (código de una letra) GSSPT CIPSG QPCPY NENCC SQSCT FKENE NGNTV KRCD 1 5 10 15 20 25 30 35 39 SEQ ID NO: 117 (código de tres letras) Gly Ser Ser Pro Thr Cys lie Pro Ser Gly GIn Pro Cys Pro Tyr Asn 1 5 10 15 Glu Asn Cys Cys Ser Gin Ser Cys Thr Phe Lys Glu Asn Glu Asn Gly 20 25 30 Asn Thr Val Lys Arg Cys Asp 35 39 Llamada "co-ACTX-Hvla+2" tiene puentes disulfuro en las posiciones: 6-20, 13-24 y 19-38. El peso molecular es 4199. SEQ ID NO: 118 (código de una letra) GSAIC TGADR PCAAC CPCCP GTSCK AESNG VSYCR KDEP 1 5 10 15 20 25 30 35 39 SEQ ID NO: 118 (código de tres letras) Gly Ser Ala lie Cys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Cys Ala Ala Cys Cys 1 5 10 15 Pro Cys Cys Pro Gly Thr Ser Cys Lys Ala Glu Ser Asn Gly Val Ser 20 25 30 Tyr Cys Arg Lys Asp Glu Pro 35 39 llamada "rK-ACTX-Hvlc" tiene puentes disulfuro en las posiciones: 5-19, 12-24, 15-16, 18-34. El peso molecular es 3912.15 SEQ ID NO: 119 (código de una letra) GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A 1 5 10 15 20 25 30 35 40 41 ID NO: 119 (código de tres letras) Gly Ser Gin Tyr Cys Val Pro Val Asp Gln Pro Cys Ser Leu Asn Thr 1 5 10 15 Gin Pro Cys Cys Asp Asp Ala Thr Cys Thr Gin Glu Arg Asn Glu 20 25 30 Gly His Thr Val Tyr Tyr Cys Arg Ala 35 40 41 Llamada "rU-ACTX-Hvla ( "Híbrido" ) +2" tiene puentes disulfuro en las posiciones: 5-20, 12-25, 19-39. El peso molecular es 4570.51 Preparación de los Péptidos Tóxicos Tópicos Los péptidos tóxicos descritos arriba pueden ser preparados en una variedad de formas y en algunas modalidades no necesitan ser preparados por ningún proceso formal. Los péptidos simplemente pueden ser recogidos con o sin otras impurezas en una composición y ser utilizados. En una modalidad en la cual se proporcionan varios ejemplos abajo, los péptidos son liofilizados o tienen algo, la mayoría o casi todo el líquido extraído antes de ser hechos especiales. En algunas modalidades los péptidos siguen estando mojados y solamente el exceso de líquido es extraído. En algunas modalidades los péptidos están en soluciones acuosas o en algunas similares a una solución acuosa. Los péptidos no necesitan ser aislados o purificados antes de ser hechos especiales .

Ensayos Reproducibles para medir la actividad insecticida tópica .

La actividad insecticida tópica de un péptido puede ser medida y cuantificada . Numerosos ensayos están disponibles. Se proporcionan varios ejemplos de los ensayos reproducibles útiles para determinar la actividad tópica de un péptido en los ejemplos abajo. Estos ejemplos describen el péptido y el ensayo en detalle pero no deben ser utilizados para limitar el alcance de las reivindicaciones o la invención.

MATERIALES Y MÉTODOS - EJEMPLOS EJEMPLO 1.

Ensayo tópico con Acetona y DMSO utilizando la mosca doméstica La toxina es ?-ACTX-Hvla: SPTCIPSGQPCPY^CCSQS T^EENGOTVKRCD (SEQ ID NO: 60) Sintética. Peso molecular: 4050 Da. LD50 en mosca doméstica: 90.2 pmol/g Administración y Aplicación de la formulación.

El insecto es mosca doméstica {Musca domestica) de Benzon research que pesa entre 12-20 mg (masa promedio 16 mg) cada uno recibiría 2µ1 de aplicaciones de micropipeta de formulaciones sobre la superficie torácica dorsal del cuerpo.

Dosis de toxina: -90,000 pmol/g de ?-ACTX (lOOOx inyección LD50) disuelta en 90% de Acetona/10% de DMSO o DMSO (10%-20%) con 0.1% de Tween 20. -9,000 pmol/g (lOOx inyección LD50) , y -900 pmol/g (lOx LD50) disuelta en DMSO (10-20%) con 0.1% de Tween 20. Preparación Soluciones de Aplicación a Base de Agua Solución concentrada de ?-ACTX/DMSO 3.5 mi de ?-ACTX liofilizado (Auspep) se concentró y disolvió en 70 µ? de DMSO (50 µ?/µ? de solución concentrada) . Agua + solución concentrada de Tween - 1000 µ? de alícuotas de Tween 20 fueron preparadas en agua con respecto al porcentaje de volumen con respecto a los valores del volumen (enumerados abajo) de una solución concentrada de Tween 20 al 1% (por ejemplo 111 µ? de una solución concentrada de Tween 20 al 1% + 889 µ? de agua para la solución concentrada de Tween 20 al 0.111%, etc.) . En todos los casos, la solución concentrada de Tween 20 fue agregada al primer tubo, después DMSO, y finalmente la solución amortiguadora de ?-ACTX/DMSO.

Dosis de [DMSO] ?-ACTX DMSO Agua + Volumen ?-ACTX (%) Tween Final (pmol/g) (% ?/?) 17.5 µ? de sol .

Concnetrada de 270 µ? 90,000 ?-ACTX 10 % 12.5 µ? (0.111 300 µ? (50 pg/µ? en de DMSO) Tween) 270 µ? -ve (0.111 10 % 30 µ? 300 µ? - de Tween) 17.5 µ? de sol . 240 µ? Concnetrada de 90, 000 (0.125 20 % ?-ACTX 42.5 µ? 300 µ? de (50 µ9 µ1 en Tween) DMSO) 30 µ? 90, 000 pmol/g de sol. 216 µ? 9,000 54 µ? 20 % de ACTX (0.138 de 300 µ? Tween) 30 µ? 90, 000 216 µ? pmol/g de sol. 900 20 % de ACTX 54 µ? (0.138 300 µ? de Tween) 240 µ? -ve 60 µ? (0.125 20 % 300 µ? de Tween) Tabla 2 (arriba) . Tratamientos de DMSO en Agua. Observar. En la Tabla 2 y muchas Tablas abajo se utilizan alguna o todas las abreviaturas siguientes: "crispar" o "crisp" significa crispado; "morb" significa moribundo y "-ve" significa "condiciones de control negativo" que son las mismas que las condiciones experimentales pero sin ningún ingrediente activo. Preparación de las soluciones de Aplicación a base de Acetona : Acetona - la misma acción de 50 pg/µ? de solución amortiguadora de ?-ACTX en DMSO fue utilizada para crear una formulación en 90% de acetona y 10% de DMSO que liberaría un equivalente de dosis de 90,000 pmol/g cuando es aplicada como una gota de 2 L a las moscas domésticas de una masa promedio de 16 mg . En este caso, la solución concentrada de la toxina fue agregada a la acetona primero, y después un volumen final de DMSO fue agregado para alcanzar el 10% m/v de DMSO. Esto fue hecho para examinar la cantidad de precipitado cuando la toxina disuelta fue agregada a la acetona.

Una segunda solución de ?-ACTX también fue preparada disolviendo 1.2 mg de ?-ACTX liofilizado (Auspep) en 240 µ? de acetona (5 µ?/µ? de solución concentrada) . 50 µ? de esta solución concentrada fue diluida en 121.5 µ? de acetona después de lo cual 17.15µ1 de DMSO fueron agregados (10% de concentración) . Los cálculos que conducen a una estimación la dosificación del ?-ACTX para esta formulación son como sigue : . 50µ1? x de 5µ?/µ1 de solución concentrada de ?-ACTX = 250µ? de ?-ACTX ÷ 171.5µ1 de volumen total = 2.915µg/insecto 2.915 x 1 µ?a?1/4050µ? x 106 pmol/?µ???? = 719.7 pmol/insecto x 1 insecto/0.016g = 45.000 pmol/g Una formulación de control de albúmina de suero bovino (BSA) también fue preparada en acetona y DMSO. Debido a la concentración de la BSA de solución concentrada, la concentración de acetona fue solamente aproximadamente 60% en DMSO al 10%.

Tabla 3 (arriba) . Tratamientos de Acetona-DMSO Administración y Aplicación de la formulación Moscas domésticas fueron refrigeradas por ~4 horas y después anestesiadas con C02. Cada formulación de tratamiento descrita arriba fue aplicada a un grupo de diez moscas anestesiadas. Los tratamientos consistieron de una gotita de 2 yL de la formulación respectiva, medida con una pipeta sobre la superficie torácica dorsal del cuerpo de una mosca. Grupos de diez moscas anestesiadas fueron utilizados para probar cada régimen de tratamiento. La solución de Acetona/DMSO se evaporó rápidamente de la cutícula. Las formulaciones de DMSO fueron permitidas absorberse a través de la cutícula. Moscas tratadas que revivieron1 en su superficie dorsal tendieron a pegarse al fondo del depósito y luchar después de colocar alimento y agua; la intervención fue hecha para evitar esto suavemente golpeando ligeramente el depósito o manipulando moscas pegadas nuevamente a una orientación vertical con las pinzas. Un grupo de control de moscas sin tratar también fue reservado para asegurar que la mortalidad no fuera afectada por exposición de C02. Todos los tratamientos fueron dados en alimento y agua y observados por 24 horas.

Resultados (n=10 para todos los grupos de tratamiento, número de moscas muertas por grupo reportado en la segunda columna) : Tratamiento (tiempo Muerte (tiempo aplicado) después del Notas tratamiento -Ve 20 % de DMSO/Tween (3:54 Todas las moscas 0 (~8hr) PM 7/1/08) saludables/activas 90,000 pmol/g de ?-ACTX 20% 1 murió en de DMSO/Tween (4:09 PM 1 (~8hr) alimento, otras 7/1/08) saludables 9,000 pmol/g de ?-ACTX 20% 1 adherida al 1 (~7.5hr) de DMSO/Tween (4:22 PM fondo (?) 7/1/08) muerta (? ) 900 pmol/g de ?-ACTX 20% de 0 (~7.5hr) DMSO/Tween (4:32 PM 7/1/08) -Ve 10% de DMSO/Tween (5:39 0 (~6.5hr) 1 adherida al PM 7/1/08) fondo y removida 90,000 pmol/g de ?-ACTX 10% 0 (~7hr) de DMSO/Tween (4:52 PM 7/1/08) -ve Acetona/10% de DMSO 1 (~7.5hr) (5:25 PM 7/1/08) 1 inerte en el +ve proteína de BSA (5:01 PM 1(?) (~7hr) lado del plato 7/1/08) de comida 90,000 pmol/g de ?-ACTX 1 adherida a la (sol.conc. DMSO) 0 (~7hr) parte trasera y 90% de Acetona/10% de DMSO removida (5:11 PM 7/1/08) 45,000 pmol/g de ?-ACTX (sol.conc. Acetona) 1 (~6.5hr) 1 muerta en el 90% de Acetona/10% de DMSO plato de comida (5:19 PM 7/1/08) -ve sin tratar (5:40 PM 0 (~6.5hr) 7/1/08) Muerta Tratamiento (tiempo aplicado) (Tiempo Notas después del tratamiento -Ve 20% de DMSO/Tween (3:54 0 (~19hr) Todas las moscas PM 7/1/08) saludables/activas 90,000 pmol/g de ?-ACTX 20% de 1 (~19hr) 1 crispada DMSO/Tween (4:09 PM 7/1/08) Muerta de la 9,000 pmol/g de ?-ACTX 20% de 1 (~18.5hr) adherencia al DMSO/Tween (4:22 PM 7/1/08) fondo 900 pmol/g de ?-ACTX 20% de 0 (~18.5hr) Todas las moscas DMSO/Tween (4:32 PM 7/1/08) saludables/activas -Ve 10 % de DMSO/Tween (5:39 Muerta en la 1 (~7.5hr) PM 7/1/08) comida 90,000 pmol/g de ?-ACTX 10% de DMSO/Tween (4:52 PM 1 (~18hr) 2 crispadas 7/1/08) -Ve 90 % de Acetona/10% de 1 (~17.5hr) DMSO (5:25 PM 7/1/08) -Ve proteína de BSA (5:01 PM 1 (~18hr) 7/1/08) 90,000 pmol/g de co-ACTX (sol.conc. DMSO) 1 (~18hr) 1 crispada 90% de Acetona/10% de DMSO (5:11 PM 7/1/08) 45,000 pmol/g de ?-ACTX ( sol . conc. acetona) 5 (~17.5hr) 2 crispadas 90% de Acetona/10% de DMSO (5:19 PM 7/1/08) -ve sin tratar (5:40 PM 0 (~17.5hr) Todas las moscas 7/1/08) saludables/activas Muerta (Tiempo Tratamiento (tiempo aplicado) Notas después del tratamiento -Ve 20 % de DMSO /Teen (3:54 0 (~27.5hr) PM 7/1/08) 90,000 pmol/g de ?-ACTX 20% 3 (~27hr) de DMSO/Tween (4:09 PM 1 crispada 7/1/08) 9,000 pmol/g de ?-ACTX 20% 1 (~27hr) de DMSO/Tween (4:22 PM 7/1/08) Muerta (Tiempo Tratamiento (tiempo aplicado) Notas después del tratamiento 900 pmol/g de ?-ACTX 20% de 0 (~27hr) DMSO/Tween (4:32 PM 7/1/08) -Ve 10% de DMSO/Tween (5:39 1 (~26hr) PM 7/1/08) 9,000 pmol/g de ?-ACTX 10% de 3 (~26.5hr) 1 crispada DMSO/Tween (4:52 PM 7/1/08) Tabla 4 (arriba) . Resultados de tratamientos Acetona-DMSO La aplicación tópica del ?-ACTX disuelto en acetona con 10% de DMSO fue insecticida para moscas (mortalidad del 70% en 24 horas.) mientras que una preparación similar del ?-ACTX disuelta en DMSO después que fue diluida hasta 10% de DMSO en acetona fue menos insecticida ~30%) . Estos resultados son similares a los ensayos tópicos en los cuales ?-ACTX disuelto en acetona con DMSO agregado a una concentración del 10% mató 90% de las moscas domésticas (6/19/08) mientras que el ?-ACTX disuelto en DMSO y después diluido en acetona a una concentración de 90,000 pmol/g mató 40% de insectos tratados. La aplicación tópica de ?-ACTX en 10-20% de DMSO en agua fue también insecticida, pero considerablemente menos que la solución de Acetona/DMSO (30% contra 70%) . 4 EJEMPLO 2.

Ensayo tópico con Acetona/Metanol/DMSO utilizando mosca doméstica La toxina es ?-ACTX-Hvla: SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO : 60) Sintética. Peso molecular: 4050 Da. LD50 en mosca doméstica : 90.2 pmol/g Administración y Aplicación de la formulación.

Insectos: mosca doméstica (Musca domestica) de Benzon research que pesa entre 12-18 mg (masa promedio 15 mg) 2 L de aplicación de micropipeta de formulaciones sobre el tórax dorsal .

Cálculo de la Dosis de Toxina: 90,000 pmol/g de ?-ACTX (lOOOx inyección LD50) 0.015 g/mosca x 90,000 pmol/g = 1350 pmol /mosca x 4050 pg/pmol x 1 yg/106 pg = 5.467 pg/insecto. 5.467 pg/2 µ? aplicación = 2.733 pg/µ? x 150 µL = 410.06 g x 1 µL/5 µg = 82 5 µg/µL de solución concentrada de ?-ACTX Preparación Soluciones de Aplicación Las mezclas de ?-ACTX en acetona (90%) y D SO (10%) fueron preparadas de acuerdo con la tabla 5 de una preparación de solución concentrada de 1.5 mg de ?-ACTX liofilizado disuelto en 300 µ? de acetona para producir una solución de 5 mg/ml . ?-ACTX formó un precipitado nublado cuando se agregó acetona que se asentó cuando se dejó sobre el banco. La preparación fue sometida a agitación vorticial por ~5 seg para homogeneizar el precipitado antes de la dilución .

Metanol/DMSO - Las mezclas de ?-ACTX en metanol (90%) y DMSO (10%) fueron preparadas de acuerdo con la tabla 5 de una preparación de solución concentrada de 2.3 mg de ?-ACTX liofilizado disuelto en 460 µ? de metanol para producir una mezcla con una concentración de péptido final de 5 mg/ml. El ?-ACTX formó un precipitado nublado cuando el metanol fue agregado que se asentó cuando se dejó sobre el banco, en una manera similar a las suspensiones de atracotoxina/acetona . La preparación fue sometida a agitación vorticial por ~5 seg para homogeneizar el precipitado antes de la dilución.

Tabla 5 (arriba) . Preparaciones del tratamiento.

Las preparaciones del tratamiento de la tabla 5 son formulaciones de acetona/metanol/D SO; orden de adición cuando la preparación de cada formulación fue solvente, solución concentrada de ?-ACTX (cuando es necesario) , y finalmente DMSO .

Administración y aplicación de la formulación.

Cada formulación de tratamiento descrita arriba fue aplicada a un grupo de diez moscas domésticas anestesiadas con C02. La aplicación de tratamiento consistió en una gotita de 2 µ? dé la formulación respectiva, medida con una pipeta sobre la superficie torácica dorsal del cuerpo de una mosca. Cada mezcla fue sometida a agitación vorticial inmediatamente antes de cada aplicación para asegurar .la suspensión de las partículas del precipitado. Después del tratamiento, los insectos fueron colocados en recipientes con alimento fresco y agua, se les permitió recuperarse, y fueron observados durante 24 horas.

Cada formulación de tratamiento descrita arriba también fue aplicada a un grupo de diez de segundo instar de T. ni. La aplicación del tratamiento consistió en una gotita de 2 L de la formulación respectiva, medida con una pipeta sobre la superficie dorsal anterior del cuerpo. Cada mezcla fue sometida a agitación vorticial inmediatamente antes de cada aplicación para asegurar la suspensión de las partículas del precipitado. Todas las mezclas de tratamiento fueron sometidas a agitación vorticial inmediatamente antes de la aplicación para asegurar la suspensión de las partículas del precipitado. Después del tratamiento, los insectos fueron colocados en medios frescos y observados por 24 horas .

Tabla 6a - Mosca doméstica (abajo.) Tabla 6b - Mosca doméstica (abajo.) Tabla 6a y tabla 6b (arriba) . Resultados de administración de las formulaciones de acetona/metanol/DMSO a la mosca doméstica y Cabbage Looper.

El tratamiento tópico de mosca doméstica con una alta dosis de ?-ACTX en metanol con DMSO fue insecticida con 100% de mortalidad en 18 horas después del tratamiento comparado a la mortalidad de solamente 40% de las moscas tratadas solamente con ?-ACTX en acetona. No hubo control de mortalidad en ningún tratamiento. No hubo diferencia entre ?-ACTX y los tratamientos de control de gusanos falsos medidores en términos de muerte, alimentación, o comportamiento del insecto. El metanol reforzó la actividad tópica del ?-ACTX más que la acetona en este experimento.

EJEMPLO 3.

Ensayo tópico con metanol y etanol utilizando mosca doméstica La toxina es ?-ACTX-Hvla: SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO : 60) Sintética. Peso molecular: 4050 Da.

LD50 en mosca doméstica : 90.2 pmol/g Administración y Aplicación de la formulación.

Insecto: mosca doméstica {Musca domestica) de Benzon research que pesa entre 12-20 mg (masa promedio 16 mg) 2 µ? de aplicación de micropipeta de formulaciones sobre el tórax dorsal .

Cálculo de la Dosis de Toxina: -90,000 pmol/g de ?-ACTX (lOOOx inyección LD50) 0.015 g/mosca x 90,000 pmol/g = 1350 pmol /mosca x 4050 pg/pmol x 1 µ?/106 pg = 5.467 pg/insecto. 5.467 g/2 µ? aplicación = 2.733 pg/µ? x 250 L = 683.43 µ? x 1 µ1/5 µg = 136.7 µ? 5 µ?/µ? de solución concentrada de ?-ACTX NOTA: Las soluciones de tratamiento calculadas para moscas de una masa promedio de 15 mg (intervalo 12-18 mg) ; la masa promedio real de insectos utilizados fue 16 mg (intervalo de 12-20 mg) . La dosis de ?-ACTX en las tablas abajo se ha ajustado para esta discrepancia.

Preparación de Soluciones de Aplicación Metanol - Las soluciones de ?-ACTX en metanol fueron preparadas de acuerdo a la Tabla 7, usando una preparación de solución concentrada de 1.0 mg de ?-ACTX liofilizado disuelto en 200 µ? de metanol (solución de 5 mg/ml) .

Tabla 7 (arriba) . Formulaciones de tratamiento de Metanol Metanol + DMSO - Las soluciones de ?-ACTX en metanol fueron preparadas de acuerdo con la Tabla 8 utilizando una solución de 5 mg/ml. La solución de 84,375 pmol/g fue preparada 4 diluyendo la mezcla solución concentrada en metanol (88.3 µ?) antes de agregar DMSO (25 µ?) a una concentración final del 10% de DMSO. Un 10% de DMSO en la solución de metanol después fue preparada y repartida en alícuotas como se describe más abajo para la serie de dilución serial.

Tabla 8 (arriba) . Soluciones de Tratamiento Metanol/DMSO Etanol + DMSO - Las soluciones de ?-ACTX en etanol fueron preparadas de acuerdo con la Tabla 9 de una preparación de solución concentrada de 0.8 mg de ?-ACTX liofilizados disueltos en 160µ1 de etanol para producir una solución de 5 mg/ml. La solución de 84.375 pmol/g fue preparada diluyendo la solución concentrada dentro del etanol (88.3 µ?) antes de agregar DMSO (25 µ?) a una concentración 4 final de 10% de DMSO. Una solución de 10% de DMSO/etanol después fue preparada y repartida en alícuotas como se describe más abajo para la serie de dilución serial.

Tabla 9 (arriba) . Formulaciones de Solución de Etanol; el orden de adición cuando la preparación de la formulación de 84,375 pmol/g era etanol, solución concentrada de co-A TX y finalmente DMSO. Una solución de 10% de DMSO/Etanol fue preparada y repartida en alícuotas en tubos etiquetados, y fue realizada una dilución serial 5x del tratamiento de 84,375 pmol/g.

Administración y Aplicación de la formulación Cada formulación del tratamiento descrita arriba fue aplicada a un grupo de diez moscas domésticas anestesiadas de 0¾. La aplicación del tratamiento consistió de una gotita de 2 µ? de la formulación respectiva, medida con una pipeta sobre la superficie torácica dorsal del cuerpo de una mosca. Cada mezcla fue sometida a agitación vorticial inmediatamente antes de cada aplicación para asegurar la suspensión de las partículas del precipitado. Después del tratamiento, los insectos fueron colocados en recipientes con alimento fresco y agua, se les permitió recuperarse, y fueron observados durante 60 horas.

Resultados tratamientos de metanol o etanol y DMSO Muerta Muerta Muerta Muerta Muerta Tratamiento (19.5hrs) (24hrs) (50 (6 hrs) (60 hrs) hrs) -ve control Etanol 0 0 + DMSO 0 0 0 135 pmol/g Etanol + 0 0 0 0 0 DMSO 675 pmol/g Etanol + 1 1 1 1 1 DMSO 3,375 pmol/g 0 0 0 1 0 Eetanol + DMSO 16,785 pmol/g 3 (1 3 (2 7 (1 0 7 Etanol + DMSO crisp. ) cris . ) crisp. ) 84,375 pmol/g 7 (1 2 7 7 7 Etanol + DMSO cris . ) Sin tratar 0 0 0 0 0 Tabla 10 (arriba) . Los resultados del tratamiento con metanol o etanol y DMSO El tratamiento tópico de moscas domésticas con una alta dosis (84,375 pmol/g) de ?-ACTX en etanol con DMSO fue insecticida causando 30% y 70% de mortalidad en 24 y 50 horas después del tratamiento, respectivamente. Los tratamientos preparados con etanol fueron más potentes que aquellos preparados con metanol (70% contra 30% de mortalidad en 24 horas para dosis más altas, y 30% contra 0% de mortalidad en 16.875 pmol/g de tratamiento en 24 horas.). El efecto de la dosis más alta de ?-ACTX en metanol con DMSO no fue tan potente como en el análisis anterior (3 muertas, 3 crispadas contra 10 muertas en la dosis más alta después de 24 horas.) .

Los tratamientos de Metanol/?-???? sin DMSO no fueron insecticidas, sugiriendo la inclusión de un aprótico penetrante o algún otro tipo de adyuvante molecular es importante para la actividad de las preparaciones tópicas del co-ACTX.

Este experimento muestra ejemplos de intervalos de dosis efectivas de ?-ACTX tópicamente aplicado diluido en metanol, y que efectúa la inclusión de DMSO y etanol tiene actividad insecticida de la formulación en el paradigma del bioensayo tópico utilizado.

EJEMPLO 4.

Ensayo tópico con la toxina: ?-ACTX-Hvla : SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO. 55) Peso molecular: 4050. LD50 en mosca doméstica: 90.2 pmol/g, Alícuotas Secadas Congeladas de 1.5 mg de toxina preparada de las soluciones congeladas Aplicación tópica: grupos de diez moscas domésticas (Musca domestica) de Benzon Research, pesando entre 12-20 mg (16 mg de masa promedio) , cada una recibió una aplicación de micropipeta de 2 µ? del precipitado de toxina suspendido en Etanol-DMSO en la superficie torácica dorsal del cuerpo.

Preparación de soluciones concentradas para tratamiento tópico y administración oral: Solución concentrada 1 (preparación sometida a agitación vorticial) : 1 mi de etanol fue agregado a -1500 µ? de ?-ACTX liofilizado, y la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial vigorosamente. Una alícuota de 50 \i de suspensión del péptido después fue extraída para ensayos de aplicación tópica y mantenida en hielo por ~2 horas; el resto fue dividido en dos alícuotas de -475 µ? y después mantenida en hielo por -2 horas.

Solución concentrada 2 (preparación sonicada y sometida a agitación vorticial) : 1 mi de etanol fue agregado a -1500 g de ?-ACTX íiofilizado, y la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial vigorosamente, y después sonicada -10 -15 seg., incrementando suavemente de la intensidad ajustada "0" a ajustada "5" durante este período. Una alícuota de 50 µ? de la suspensión del péptido después fue extraída para ensayos de aplicación tópica y mantenida en hielo por -2 horas; el resto fue dividido en dos alícuotas de -475 µ? y después mantenida en hielo por -2 horas.

Cálculos de la dosis de toxina: 1.5 µ?/µ? x 2 µ?/aplicación x 106 pg/1 g x 1 pmol/4050 pg x 1 mosca/0.016 g = 46.875 pmol/g Aplicación tópica de las soluciones de toxina y resultados de la misma Las soluciones concentradas de ?-ACTX en etanol fueron preparadas como se describió anteriormente. La tabla 11, abajo, indica las recetas usadas para diluir las soluciones concentradas para aplicación tópica a las moscas domésticas: Tabla 11 (arriba) : Formulaciones de Etanol/DMSO Las moscas tratadas fueron mantenidas en envases con acceso ad libitu a alimento y agua y mortalidad (y el comportamiento "crispado" , que resulta probablemente de la interrupción de normas fisiológicas por la acción de la toxina) fueron calificadas después de eso de acuerdo a lo indicado en la Tabla 12 abajo: N Muerta Muerta Muerta Muerta Muerta Muerta Tratamiento (7.5 (14 (24 (40 hr) (48 hr) (76 hr) h ) hr) hr) 2 3 9, 000 pmol/g 10 0 2 (1 1 1 (1 (2 (1 Ag. Vort. , crisp. ) crisp. ) crisp. ) crisp . ) 10 1 6 45,000 pmol/g (2 6 (1 8 8 Ag. Vort. 8 crisp. ) crisp. ) 10 2 2 2 3 9,000 pmol/g (2 (1 (2 3 3 (1 sonicada crisp. ) crisp. ) crisp. ) crisp. ) 9,000 pmol/g 10 5 (2 8 9 9 9 9 sonicada crisp. ) Tabla 12 (arriba) . Resultados del tratamiento con Etanol/D SO Este experimento demuestra que sonicar el ?-ACTX suspendido en etanol aumenta la actividad insecticida tópica de la formulación de la toxina que resulta.

La sonicación de los precipitados de etanol -DMSO de Omega-ACTX-Hvla mejora la actividad insecticida de la toxina omega aumentando la mortalidad de moscas domésticas tratadas por contacto, hasta 24 horas después de la aplicación.

EJEMPLO 5.

Las toxinas son: 1) o-ACTX-Hvla+2 : GSSPT CIPSG QPCPY NENCC SQSCT FKENE NGNTV KRCD (SEQ ID NO. 117) tiene tres puentes disulfuro: 6-20, 13-24 y 19-38.

Peso molecular: 4199. Inyección LD50 en mosca doméstica: r 77 pmol/g 2) rKappa-ACTX-Hvlc : GSAIC TGADR PCAAC CPCCP GTSCK AESNGVSYCR KDEP NO. 118 tiene cuatro puentes disulfuro: 5-19, 12-24, 15-16, 18-34 Recombinante de pDR2 (pET-32a) . Peso molecular: 3912.15 Inyección LD5Q en mosca doméstica: 389 pmol/g 3) rU-ACTX-Hvla+2 : GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR SEQ ID NO. 119 tiene tres puentes disulfuro: 5-20, 12-25, 19-39 Peso Molecular: 4570.51 Inyección LD50 en Mosca doméstica: 81.5 pmol/g Preparación de las mezclas para el tratamiento tópico: Recetas para soluciones concentradas de toxina utilizadas para mezclas de tratamiento son como sigue: Solución concentrada 1: co-ACTX-Hvla+2 : una alícuota de 1.5 mg de toxina liofilizada suspendida en 850 de etanol y sonicada por 10-15 segundos con incremento ligero del ajuste "0" al ajuste "5" en el sonicador para crear partículas finas.

Solución concentrada 2 : rU-ACTX-Hvla+2 una alícuota de 1.5 mg de la toxina liofilizada suspendida en 900 µ? de acetona y sonicada por 10-15 segundos con incremento ligero de ajuste"0" a ajuste "5" en el sonicador para crear partículas finas.

Solución concentrada 3 : rU-ACTX-Hvla+2 : una alícuota de 1.5 mg de toxina liofilizada suspendida en 900 µ? de metanol y sonicada por 10-15 segundos con incremento ligero de ajuste "0" a ajuste "5" en el sonicador para crear partículas finas. Solución concentrada 4: rKappa-Hvlc+2: una alícuota de 1.5 mg de toxina liofilizada suspendida en 900 µ? de acetona y sonicada por 10-15 segundos con incremento ligero de ajuste "0" a ajuste "5" en el sonicador para crear partículas finas. Solución concentrada 5: rKappa-Hvlc+2 : una alícuota de 1.5 mg de toxina liofilizada suspendida en 900 µ? de metanol y sonicada por 10-15 segundos con incremento ligero de ajuste "0" a ajuste "5" en el sonicador para crear partículas finas.

La preparación final de las mezclas para aplicaciones tópicas fue hecha mezclando las soluciones concentradas con otros reactivos como es enumerado abajo: Control 1 - Etanol + 0.05% LI-700 - 475µ1 de etanol. 25µ1 1% LI-700 en etanol Control 2- Etanol + 0.05% LI-700 - 475µ1 de etanol. 5µ1 1% LI-700 en Etanol Control 3- Etanol + 0.1% MSO® - 450µ1 de etanol. 50µ1 1% MSO® en Etanol Control 4- Etanol + 0.02% MSO® - 490µ1 de etanol. ??µ? 1% MSO® en Etanol Tratamiento 1- precipitado de a-ACTX-Hvla+2 en etanol + 10% de DMSO + 0.05% de Silwet - 425 µ? Solución concentrada 1 25µ1 1% de Silwet en Etanol. 50µ1 de DMSO Control 5 - Etanol + 10% de DMSO + 0.05% de Silwet - 425µ1 de Etanol 25µ1 1% de Silwet in Etanol. 50µ1 de DMSO Tratamiento 2 - Precipitado de rU-ACTX-Hvla+2 acetona + 10% de DMSO - 450µ1 solución concentrada 2. 50µ1 de DMSO Tratamiento 3 - Precipitado de rU-ACTX-Hvla+2 Metanol + 10% de DMSO - 450 L de solución concentrada 3. 50µ1 de DMSO Tratamiento 4 - Precipitado de rKappa-ACTX-Hvlc acetona + 10% de DMSO - 450µ1 de solución concentrada 4. 50µ1 de DMSO Tratamiento 5 - Precipitado de rKappa-ACTX-Hvlc Metanol + 10% de DIVISO - 450µ1 de solución concentrada 5. 50µ1 de DMSO Control 6 - Acetona + 10% de DMSO- 450µ1 de Acetona. 50µ1 de DMSO Control 7 - Metanol + 10% de DMSO - 450µ1 de Metanol. 50µ1 de DMSO Control 8 - Etanol + 10% de DMSO - 450µ1 de Etanol. 50µ?, de DMSO Administración y Aplicación de la formulación.

La Aplicación tópica de gotitas de 2µ1 al abdomen ventral de moscas domésticas entre 12-18 mg con micropipetas PIO, como se describió en ejemplos anteriores. Después de la aplicación, las moscas fueron provistas de alimento y agua ad Ubitum y observadas para la mortalidad.

Resultados de las mezclas de tratamientos tópicos. Tabla 13 (abajo) 6 hrs 24 42 hrs Tratamiento hrs LI-700 (n=10) muerta Crisp./ muerta Crisp./ muerta Crisp./ orib Morib Morib Control 1- Etanol + 0.05% 0 4/0 0 3/1 1 1/1 LI-700 Control 2- Etanol + 0.01% 0 6/0 1 4/1 1 4/2 LI-700 MSO (n=10) Control 3- Etanol + 0.1% 2 4/1 2 4/0 3 2/1 MSO® Control 4- Etanol + 0.02% 0 7/0 1 5/0 4 1/1 MSO® Las concentraciones de LI-700 debajo de 0.01% resultaron en interrupción considerable en el comportamiento de las moscas tratadas, y posiblemente cierta mortalidad también. Las concentraciones de MSO® debajo de 0.02% resultaron en interrupción considerable en el comportamiento de las moscas tratadas, y considerable (en este caso, 30-40%) mortalidad también. Silwet al 0.05%, puede reforzar ligeramente la actividad insecticida tópica de las suspensiones de toxina-omega/etanol/DMSO en este paradigma experimental. De acuerdo con los resultados presentados aquí y otros estudios de potenciación no descritos están en el intervalo de 15-20%.

Las formulaciones tópicamente aplicadas del híbrido y la atracotoxina-ls kappa son insecticidas cuando la acetona al 90% o metanol al 90% se substituyen por etanol al 90%. Las formulaciones de acetona y metanol de la toxina híbrida pueden ser ligeramente menos insecticidas que la formulación de etanol probada previamente. Creemos que las formulaciones de esa acetona y metanol resultan en niveles equivalentes o ligeramente más altos de actividad insecticida cuando son comparadas a las formulaciones de etanol de la toxina kappa. EJEMPLO 6.

La toxina a aplicarse tópicamente es ?-ACTX-Hvla: SPTCEPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID. NO. 60) Tienen un peso molecular: 4050. LD50 en moscas domésticas: 90.2 pmol/g.

Las alícuotas liofilizadas de 1.5 mg de toxina se prepararon de las soluciones concentradas congeladas.

Administración y aplicación de la formulación Aplicación tópica: grupos de diez moscas domésticas (Musca domestica) de Benzon Research, que pesan entre 12-20 mg (16 mg de masa promedio) , cada una recibió una aplicación de micropipeta de 2 µ? del precipitado de toxina suspendido en Etanol-DMSO en la superficie torácica dorsal del cuerpo. Preparación de soluciones concentradas para tratamiento tópico: Solución concentrada 1 (preparación de etanol sometida a agitación vorticial y sonicada) : 0.9 mi de etanol se agregaron a -1500 de c-ACTX liofilizado, y la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial vigorosamente, y después sonicada -10-15 segundos, incrementando ligeramente de ajuste "0" a ajuste "5" durante este período 0.1 mi de DMSO entonces se agregó a la suspensión de toxina, la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial y una alícuota de 100 µ? de la suspensión de alcohol-DMSO-péptido después fue extraída para ensayos de aplicación tópica y mantenida en hielo por -2 horas.

Solución concentrada 2 (preparación de etanol sometida a agitación vorticial y sonicada): 0.9 mi de 1-propanol se agregaron a -1500 de ?-ACTX liofilizado, y la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial vigorosamente, y después sonicada -10-15 segundos, incrementando ligeramente de ajuste "0" a ajuste "5" durante este período 0.1 mi de DMSO después se agregó a la suspensión de toxina, la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial y una alícuota de 100 µ? de la suspensión de alcohol-DMSO-péptido después fue extraída para ensayos de aplicación tópica y mantenida en hielo por -2 horas.

Solución concentrada 3 (preparación de 2 -propanol sometida a agitación vorticial y sonicada) : 0.9 mi de 2 -propanol se agregaron a -1500 g de ?-ACTX liofilizado, y la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial vigorosamente, y después sonicada -10-15 segundos, incrementando ligeramente de ajuste "0" a ajuste "5" durante este período 0.1 mi de DMSO entonces se agregó a la suspensión de toxina, la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial y una alícuota de 100 µ? de la suspensión de alcohol-DMSO-péptido después fue extraída para ensayos de aplicación tópica y mantenida en hielo por ~2 horas .

Solución concentrada 4 (preparación de etanol sometida a agitación vorticial y sonicada): 0.9 mi de etanol se agregaron a -1500 ]iq de ?-ACTX liofilizado, y la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial vigorosamente, y después sonicada -10-15 segundos, incrementando ligeramente de ajuste "0" a ajuste "5" durante este período 0.1 mi de DMSO después se agregó a la suspensión de toxina, la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial y una alícuota de 100 µ? de la suspensión de alcohol-DMSO-péptido después fue extraída para ensayos de aplicación tópica y mantenida en hielo por ~2 horas.

Observar que cada solución concentrada fue elaborada a una concentración de manera que una aplicación de 2 µ? de la solución concentrada a la superficie del cuerpo de un mosca doméstica de -16 mg resultaría en una dosis de toxina de ~45,000 pmol/g. Por lo tanto, en algunos casos descrito más adelante, una de las cuatro soluciones concentradas descritas arriba fue aplicada tópicamente en toda su longitud a las moscas domésticas, pero en otros casos, fueron realizadas diluciones seriales quíntuples (utilizando las soluciones concentradas y la solución de alcohol al 10%-DMSO al 90% correspondiente) para obtener una solución que se podría utilizar para liberar una dosis más baja de la toxina en un volumen de 2 µ?. Los procedimientos de control negativo (indicados como "-ve" en la tabla abajo) comprendieron moscas domésticas tratadas con 2 µ? de aplicaciones torácicas dorsales de las soluciones de los alcoholes en cuestión (diluidas hasta 90% v/v con DMSO) .

Aplicación tópica de las soluciones de toxina y resultados de la misma: Las soluciones concentradas de ?-ACTX en varios alcoholes fueron preparadas como se describió anteriormente.

La tabla 14 abaj o indica las formulaciones y dosif icación de la solución concentrada utilizada para aplicación tópica a las moscas domésticas y la mortalidad observada para los grupos correspondientes de moscas : Tabla 14 ( arriba) . Resultados de la aplicación tópica de las soluciones de toxina Cuando son normalizados para la mortalidad observada en los grupos de control negativos (dosificados con la solución de alcohol-DMSO correspondiente) , precipitados del etanol de la toxina omega parecen tener actividad insecticida tan alta o mayor que cualquier otro precipitado de toxina-alcohol 'probado en esta serie de experimentos.

Octanol al 90% - D SO al 10%, 2 butanol al 90% - D SO al 10%, y 2 -propanol al 90%-DMSO al 10% parecen provocar niveles inaceptables de mortalidad de fondo; el último podría enmascarar probablemente la mortalidad debido a la acción del sitio objetivo de la toxina omega en moscas domésticas tratadas. 90% de 1-Propanol - 10% de DMSO no parece causar niveles inaceptables de mortalidad de fondo, sino que también no parece reforzar la actividad del sitio objetivo de la toxina aplicada así como etanol al 90 % - DMSO al 10%.

EJEMPLO 7.

Toxina para aplicar tópicamente C0-ACTX-Hvla+2 : GSSPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID. NO. 117) . Peso molecular: 4196 Alícuotas liofilizadas de 1.5 mg de toxina preparada de las soluciones concentradas congeladas Preparación de la mezcla de tratamiento Todos los tratamientos fueron hechos a 1.5 µ?/µ? de concentración final de co-ACTX-Hvla+2. Como previamente, se agregó etanol a -1500 µ? de co-ACTX-Hvla+2 liofilizado, la mezcla resultante fue sometida a agitación vorticial vigorosamente, y después sonicada -10-15 segundos, incrementando ligeramente de intensidad de ajuste "0" a ajuste "5" durante este período. Ingredientes adicionales tales como DMSO, MSO®, agua, y detergente Tween 20 fueron agregados, después de la sonicación, y las mezclas resultantes fueron sometidas a agitación vorticial vigorosamente antes de la aplicación tópica para asegurar incluso el mezclado de los ingredientes. Asumiendo la masa promedio de la mosca de 16 mg (cohorte de 12-20 mg) la dosificación se calcula como sigue: 3 µ?/insecti x 1 g x 106 pmol/1 µp??? x 1 insecto/0.016 g = 44,685 pmol/g Las recetas para la solución concentrada de la toxina utilizada para formular mezclas de tratamiento fueron como sigue: Solución concentrada 1 - 1.5 mg de G)-ACTX-Hvla+2 liofilizado disuelto en 500 µ? de etanol, sometido a agitación vorticial y sonicado .

Solución concentrada 2 - 1.5 mg de w-ACTX-Hvla+2 liofilizado disuelto en 150 µ? de agua estéril (10 mg/ml) .

Ensayos tópicos utilizando o-ACTX-Hvla+2 con DMSO: Las recetas para las mezclas de tratamiento fueron como sigue: 45,000 pmol/g de o-ACTX-Hvla+2 solución de 90% de Etanol /10% de DMSO (-ve control) -50 µ? de solución concentrada 1, 40µ1 de etanol, 10 µ? de DMSO. 90% Agua /10% DMSO /0.1% Tween 20 (-ve control) - 7.5 µ? de solución concentrada 2, 82.5 µ? de agua estéril, 10 µ? de DMSO. 1 µ? de 10% de Tween 20. 45,000 pmol/g de ?-ACTX-Hvla+2 80% de Etanol/10% de agua/10% de DMSO - 50 µ? de solución concentrada 1, 30 µ? de etanol, 10 µ? de agua estéril, 10 µ? de DMSO. 45,000 pmol/g de cj-ACTX-Hvla+2 70% de Etanol/20% de agua/10% de DMSO - 50 µ? de solución concentrada 1, 20 µ? de etanol, 20 µ? de agua estéril, 10 µ? de DMSO. 45,000 pmol/g de o-ACTX-Hvla+2 60% de Etanol/30% de agua/10% de DMSO - 50 µ? de solución concentrada 1, 10 µ? de etanol, 30 µ? de agua estéril, 10 µ? de DMSO. 45,000 pmol/g de u-ACTX-Hvla+2 50% de Etanol/30% de agua/10% de DMSO - 50 µ? de solución concentrada 1, 40 µ? de agua estéril, 10 µ? de DMSO.

Para el ensayo tópico se utiliza cú-ACTX-Hvla+2 con MSO® Tensioactivo : 5% de MSO® (-ve control) - 95 µ? de Etanol, 5 µ? de MSO® concentrado. 1.25% de MSO® (-ve control) - 98.75 µ? de Etanol, 1.25 µ? de MSO® concentrado. 45,000 pmol/g de Q-ACTX-Hvla+2 5% de MSO® - 50 µ? de solución concentrada 1, 45 µ? de Etanol, 5 µ? de MSO® concentrado . 45,000 pmol/g de co-ACTX-Hvla+2 2.5% de MSO® - 25 µ? de solución concentrada 1, 23.75 µ? de Etanol, 1.25 µ? de MSO® concentrado . 45,000 pmol/g de o-ACTX-Hvla+2 1.25% de MSO® - 25 µ? de solución concentrada 1, 24.37 µ? de Etanol, 0.625 µ? de MSO® concentrado .

Todas las mezclas de tratamiento fueron mantenidas en hielo por ~1 hora. Antes de la administración y aplicación. Administración y aplicación de la formulación.

Muestras de 2 µ? de cada mezcla de tratamiento fueron manchadas sobre el tórax dorsal de las moscas domésticas individuales (10 moscas domésticas tratadas por mezcla) . Un segundo grupo de diez moscas cada uno fue tratado con 2 muestras de 2 µ? de 45,000 pmol/g de G)-ACTX-Hvla+2 en 90% de Etanol/10% de DMSO pero con el tratamiento aplicado a la superficie abdominal ventral de las moscas en lugar de la superficie torácica dorsal. Después de la aplicación, las moscas fueron mantenidas en pozos de recipientes de plástico con acceso ad libitu al alimento (mezcla 1:1 de leche en polvo seca y azúcar de mesa) y agua (presentada en bolas de algodón empapadas) y observadas cada 8-24 horas, por dos días. Resultados de aplicación tópica de Cú-AC X-Hvla+2 La mortalidad después de la aplicación (y comportamiento "crispado" y "moribundo" , ambos resultan probablemente de la interrupción de normas fisiológiqas por la acción de la toxina) se resume en la Tabla 15, abajo.

N Muerta Muerta Muerta Muerta Muerta Tratamiento (14 (22 hr) (38 hr) (48 hr) (4hr) hr) -ve 90EtOH/ 10 0 0 0 0 10DMSO 45,000 pmol/g 5 (1 90EtOH/ 10 1 2 3 5 crisp. ) 10DMSO 45,000 pmol/g 2 (1 4 (1 80EtOH/10H2O/ 10 0 1 4 crisp. ) crisp. ) 10DMSO 45,000 pmol/g 70EtOH/20H2O/ 10 0 0 0 0 0 10DMSO 45,000 pmol/g 60EtOH/30H2O/ 10 0 0 0 0 0 10DMSO 45,000 pmol/g 50EtOH/40H2O/ 10 0 0 0 -1 1 10D SO 45,000 pmol/g 1 (3 90H2O/ 10 0 1 0 1 crisp. ) 10DMSO -Ve 5% de MSO® 10 0 0 0 0 1 1 -Ve 1.25% de 0 10 0 1 (1 1 MSO® (1 morb) morb) 4 45,000 pmol/g 2 (1 4 5 (1 10 4 (1 5% de MSO® crisp. ) (1 morb) crisp. ) morb) 45,000 pmol/g 4 (1 5 (1 10 0 3 4 2.5% de MSO® crisp. ) crisp. ) 45,000 pmol/g 5 (1 6 (1 10 1 1 1 1.25% de MSO® crisp. ) crisp. ) 45,000 pmol/g 1 (3 5 (1 5 (1 90EtOH/lODMSO 10 0 7 crisp.) crisp. ) crisp. ) O TUMMY Tabla 15 (arriba) . Resultados de ensayos tópicos de D SO, preparaciones de etanol y MSO® de co-ACTX-Hvla+2 , administradas tópicamente. Los números de arriba son descritos más abajo.

Número 1 - la adición de 10% de agua a ios precipitados de la toxina omega en soluciones de Etanol/DMSO parece reducir la actividad insecticida tópica del precipitado bajo condiciones probadas arriba.

Número 2 - la adición de 20%, 30%, y 40% de agua a los precipitados de la toxina Omega en soluciones de Etanol/DMSO parece eliminar totalmente la actividad insecticida tópica del precipitado bajo condiciones probadas arriba.

Número 3 - Solvación/dilución de la toxina en 90% de agua/10% de DMSO resulta en una solución sin actividad insecticida bajo condiciones probadas arriba.

Número 4 -El reemplazo de 10% de DMSO con 1.25% de MSO®, 2.5% de MSO®, o 5% de MSO® resulta aparentemente en mezclas con actividad insecticida significativa bajo condiciones probadas arriba.

Número 5 - Bajo condiciones experimentales usadas arriba, la aplicación abdominal ventral del precipitado (de la toxina omega en 90% de etanol/10% de DMSO) parece inducir la mortalidad del insecto con velocidad y eficacia similar a, si no mayor que, la . inducción de la mortalidad por la aplicación torácica dorsal de la misma mezcla del precipitado. Puesto que la aplicación abdominal ventral se puede ejecutar apenas dos veces más rápidamente que la aplicación torácico dorsal, esto apunta a una mejora técnica significativa para bioensayos de aplicación tópica futuros.

Ejemplos adicionales de péptidos tóxicos y el listado de secuencias.

Los péptidos tóxicos del insecto se refieren a los péptidos que no son de insectos tóxicos, pero que son tóxicos a los insectos. Su fuente no necesita ser insectos. En el listado de secuencias de esta solicitud se proporciona un amplio intervalo de péptidos tóxicos apropiados del insecto. Esta selección pequeña de aproximadamente 174 péptidos incluye los péptidos representativos de arañas, escorpiones y plantas. Las secuencias 1 - 140 son de arañas de embudo, las secuencias 141 a 171 son de escorpiones y las secuencias 172 a 174 son de plantas. El listado de secuencias incluye ejemplos de péptido en donde la fuente es Oldenlandia affinís que se sabe que produce un péptido cíclico referido a un péptido tipo "Kalata" . La familia de la planta Oldenlandia se sabe que produce los péptidos que tienen actividad insecticida. Otros péptidos insecticidas de las plantas son conocidos. También se proporcionan numerosos péptidos de la araña venenosa, que se discuten a través de esta solicitud.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para incrementar la actividad insecticida tópica de un péptido tóxico caracterizado porque comprende : a) preparar un péptido tóxico tópico; b) mezclar un primer solvente con el péptido, en donde el primer tipo de solvente es ya sea un solvente aprótico polar o un solvente orgánico polar; c) mezclar un segundo tipo de solvente con la primera mezcla de péptido solvente en donde el segundo tipo de solvente no es el mismo tipo de solvente que el primer tipo de solvente y es ya sea un solvente aprótico polar o un solvente orgánico polar.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el solvente aprótico polar es seleccionado de: sulfóxido de dimetilo (DMSO) , dimetilformamida, dioxano y hexametilfosforotriamida .

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el solvente aprótico polar es seleccionado de acetona, metanol, etanol, propanol y todos sus isómeros, metil etil cetona, dietil cetona, acetonitrilo, y acetoato de etilo.

4. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el solvente aprótico polar es seleccionado de sulfóxido de dimetilo (DMSO) o MSO® y el solvente orgánico polar es seleccionado de acetona, metanol, etanol y propanol.

5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el péptido es liofilizado antes de que el primer solvente sea mezclado con el péptido.

6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque- el primer solvente es un solvente aprótico polar.

7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el solvente aprótico polar es desde aproximadamente 60 % hasta aproximadamente 99 %, y el solvente orgánico polar es aproximadamente 40% hasta aproximadamente 1%, del volumen del solvente total .

8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el solvente aprótico polar es desde aproximadamente 75 % hasta aproximadamente 95 %, y el solvente orgánico polar es aproximadamente 25% hasta aproximadamente 5%, del volumen del solvente total .

9. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el solvente aprótico polar es desde aproximadamente 80 % hasta aproximadamente 90 % por ciento del volumen del solvente total y el solvente orgánico polar es aproximadamente 20% hasta aproximadamente 10% del volumen del solvente total.

10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el péptido es cualquier péptido tóxico tópico seleccionado o derivado de un péptido tóxico de cualquiera de las especies de araña, escorpión, serpiente, acaro, caracol o planta y en cualquier péptido que tenga 50 % o más de homología a cualquier péptido .

11. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la longitud del péptido es desde 10 hasta 200, aminoácidos en longitud.

12. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido tiene desde 1-5, enlaces de disulfuro internos.

13. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es seleccionado de una araña o escorpión.

14. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es seleccionado de la araña con tela en embudo Australiana del género Atrax o Hadronyche.

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es seleccionado de cualquier secuencia en el listado de secuencias o cualquier secuencia que tiene 50 % o mayor homología a cualquiera de las secuencias listadas.

16. El proceso de conformidad con la reivindicación 15 ( caracterizado porque el péptido es seleccionado de cualquiera de las secuencias en el listado de secuencias.

17. El proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido es seleccionado de cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119.

18. Una formulación de péptido caracterizada porque comprende : a) un péptido; b) un solvente orgánico polar; c) un solvente o adyuvante aprótico polar; d) en donde el solvente aprótico polar comprende desde aproximadamente 70 hasta aproximadamente 99 por ciento (%) del volumen final de la formulación; e) en donde el solvente o adyuvante aprótico polar comprende desde aproximadamente 30, hasta aproximadamente 1 por ciento (%) del volumen final de la suspensión; f) una fase acuosa opcional, en donde la fase acuosa comprende desde 0 (cero) hasta aproximadamente 10 por ciento (%) del volumen final de la suspensión; y

19. Un péptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es hecho especial por el proceso descrito en la reivindicación 1.

20. El control de un insecto con la formulación de péptido tóxico especial de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque los péptidos tóxicos especiales y las formulaciones son aplicadas al ambiente del insecto.