MX2011003013A

MX2011003013A - Formulacion liquida estable de anticuerpos.

Info

Publication number: MX2011003013A
Application number: MX2011003013A
Authority: MX
Inventors: Alanta Lea Lary; Advait Vijay Badkar; Leigh Kristen Bohack; Kevin Roger King
Original assignee: Pfizer
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-04-11
Also published as: EP3329911A1; HK1160389A1; IL211295A0; BRPI0917888A2; DK2331090T3; KR101355750B1; PL2331090T3; US20220175663A1; US20110171217A1; JP5642683B2; AU2009294214B2; CN102159204B; CA2736864C; TR201802935T4; JP2012502976A; RU2011108025A; RU2518278C2; CN102159204A; EP2331090A1; WO2010032220A1

Abstract

La presente invención se refiere, en general al campo de las formulaciones farmacéuticas de anticuerpos; en concreto, la presente invención se refiere a una formulación líquida estable de anticuerpo y a su preparación y uso farmacéutico; la presente invención se ejemplifica mediante una formulación liquida de un anticuerpo anti-NGF humanizado.

Description

FORMULACIÓN LÍQUIDA ESTABLE DE ANTICUERPOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de las formulaciones farmacéuticas de anticuerpos. En concreto, la presente invención se refiere a una formulación liquida estable de anticuerpos y a su preparación y uso farmacéutico.

ANTECEDECENTES DE LA INVENCIÓN Las preparaciones de anticuerpos destinadas a uso terapéutico o profiláctico requieren estabilizantes para evitar la pérdida de actividad o de integridad estructural de la proteina debido a los efectos de la desnaturalización, oxidación o agregación a lo largo de un periodo de tiempo durante el almacenamiento y transporte antes del uso. Estos problemas empeoran a las altas concentraciones de anticuerpo deseadas con frecuencia para su administración terapéutica.

Un objetivo principal en el desarrollo de formulaciones de anticuerpos es mantener la solubilidad, estabilidad y potencia de unión a antígeno del anticuerpo. Es particularmente deseable evitar agregados y particulados en solución, que requerirían esterilización por filtración antes de su uso para inyección intravenosa o subcutánea y limitarían la vía de administración. Los agregados de anticuerpos pueden causar dolor y efectos secundarios anafilactoides cuando la formulación que los contiene se inyecta por vía intravenosa.

La liofilización y el secado por congelación son alternativas a la formulación líquida de anticuerpos. Ambos procedimientos tienen tendencia a inducir la desnaturalización del anticuerpo y disminuir su actividad de unión a antígeno, particularmente tras su reconstitución.

Las sales, tensioactivos, agentes de pH y de tonicidad tales como azúcares, pueden contribuir a superar los problemas de agregación. La formulación de preparaciones de anticuerpos requiere una selección cuidadosa de estos factores entre otros para evitar la desnaturalización de la proteína y la pérdida de actividad de unión a antígeno. Respecto a un intervalo de pH de una preparación de anticuerpo, si una formulación de anticuerpo que tiene un bajo valor de pH se inyecta por vía intravenosa a menudo se produce dolor o inyección. Cuando una formulación de anticuerpo se usa como una inyección es deseable que tenga un valor de pH en un intervalo de pH aproximadamente neutro, también es ventajoso minimizar los niveles de tensioactivo para evitar burbujas en la formulación que sean perjudiciales para su inyección a sujetos.

Se conoce una formulación líquida de anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 a partir del documento WO2006/096491 (Pharmacia and Upjohn Company), y comprende anticuerpo 20 mg/ml, tampón de histidina 20 mM, trehalosa 84 mg/ml, tensioactivo PS80 0.2 mg/ml, EDTA 0.05 mg/ml pH 5.5.

Existe la necesidad de una formulación líquida estable de anticuerpo que sirva de soporte de forma estable a altas concentraciones de anticuerpo bioactivo en solución y sea adecuada para su administración parenteral, incluyendo la inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. Es deseable además que la formulación tenga un riesgo minimizado de formación de burbujas y efectos secundarios anafilactoides.

Además, existe la necesidad de proporcionar dicha formulación líquida estable para un anticuerpo anti-NGF. Se sabe que el NGF desempeña un papel central en el desarrollo y mantenimiento de neuronas tanto centrales como periféricas. Además de sus efectos en el sistema nervioso, los niveles de NGF aumentados se han relacionado una diversidad de afecciones inflamatorias, incluyendo lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis, cistitis intersticial y asma. El NGF también tiene una actividad demostrada en una diversidad de afecciones dolorosas. Se ha demostrado que el anticuerpo anti-NGF E3 es útil en el tratamiento de afecciones de dolor crónico y agudo, incluyendo dolor por cáncer, dolor por artritis reumatoide, dolor por artrosis y dolor postquirúrgico también (véase, por ejemplo, el documento WO2004/058184). Existe la necesidad de una preparación líquida estable de anticuerpo de un anticuerpo anti-NGF para satisfacer la necesidad médica de pacientes que padecen afecciones inflamatorias y de dolor mediadas por NGF.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona una composición liquida que comprende; al menos un anticuerpo, al menos un agente de tonicidad, al menos un tampón, al menos un agente quelante, al menos un tensioactivo, en la que el pH de dicha composición es de 5.0 a 7.5.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición líquida que comprende; al menos un anticuerpo, al menos un agente de tonicidad, al menos un tampón, al menos un agente quelante, al menos un tensioactivo, en la que el pH de dicha composición es de 5.8 a 6.8.

La presente invención también proporciona una composición líquida que consiste en, o que consiste esencialmente en; al menos un anticuerpo, al menos un agente de tonicidad, al menos un tampón, al menos un agente quelante, al menos un tensioactivo, en el que el pH de dicha composición es de 5.8 a 6.8.

La composición líquida de acuerdo con la presente invención proporciona las ventajas de que sirve de soporte de forma estable a altas concentraciones de anticuerpo bioactivo en solución y es adecuada para administración parenteral, incluyendo inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. Además tiene un riesgo minimizado de formación de burbujas y efectos secundarios anafilactoides.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la composición líquida puede comprender al menos un anticuerpo.

En algunas realizaciones, puede estar presente más de un anticuerpo. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más anticuerpos diferentes. Generalmente, los dos o más anticuerpos diferentes tienen actividades complementarias que no se ven afectadas perjudicialmente entre sí. El, o cada, anticuerpo también puede usarse junto con otros agentes que sirven para potenciar y/o complementar la eficacia de los anticuerpos.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el pH puede estar en el intervalo de 5.0 a 7.5, más preferentemente entre aproximadamente un pH de 7.5 y cualquiera de aproximadamente un pH de 5.1 , 5.2, 5.3, 5.4 ó 5.5. Además, preferentemente, el pH está en el intervalo seleccionado de entre uno cualquiera de un pH de 5.6, 5.7 ó 5.8 y uno cualquiera de aproximadamente un pH de 7.5, 7.4, 7.3, 7.2, 7.1 , 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1 , 6.0, 5.9, 5.8 ó 5.7. j En una realización preferida, el pH puede estar en el intervalo de entre aproximadamente un pH de 5.5 y cualquiera de aproximadamente un pH de 6.0, 6.2, 6.5 ó 6.8, como alternativa el pH puede estar en el intervalo de entre aproximadamente un pH de 5.8 y cualquiera de aproximadamente un pH de 6.0, 6.2, 6.5 0 6.8.

Más preferentemente, el pH puede seleccionarse de valores de pH de cualquiera de aproximadamente 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 , 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 , 7.2, 7.3, 7.4 ó 7.5, más preferentemente el pH es un pH de 6.0 +/- 0.2. Valores de pH en estos intervalos proporcionan a la composición líquida una protección aumentada frente a la agregación y fragmentación de anticuerpos y están próximos al pH fisiológico (pH de aproximadamente 7.2 a 7.4) para reducir el riesgo de dolor o efectos secundarios anafilactoides en la inyección.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la presente invención, el agente de tonicidad comprende preferentemente un poliol, un sacárido, un carbohidrato, una sal, tal como cloruro sódico, o mezclas de los mismos. Preferentemente el poliol tiene un peso molecular que es inferior a aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD), preferentemente seleccionado de manitol, trehalosa, sorbitol, eritritol, isomalta, lactitol, maltitol, xilitol, glicerol, lactitol, propilenglicol, polietilenglicol, inositol o mezclas de los mismos. Preferentemente, el sacárido o carbohidrato se selecciona del grupo de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos, o mezclas de los mismos. Preferentemente, el sacárido o carbohidrato se selecciona del grupo que consiste en fructosa, glucosa, mañosa, sacarosa, sorbosa, xilosa, lactosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrinas, almidón soluble, hidroxietil almidón, glucanos solubles en agua y mezclas de los mismos. Preferentemente, el agente de tonicidad comprende un sacárido seleccionado del grupo de azúcar reductor o azúcar no reductor o mezclas de los mismos. Preferentemente además, el agente de tonicidad comprende un sacárido que es un azúcar no reductor, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa y mezclas de los mismos. Más preferentemente, el agente de tonicidad comprende trehalosa, preferentemente trehalosa dihidrato. De acuerdo con la presente invención, el agente de tonicidad, particularmente trehalosa, preferentemente trehalosa dihidrato, proporciona a la composición líquida una estabilidad de anticuerpo aumentada y resistencia a la agregación, oxidación y fragmentación durante el almacenamiento refrigerado, por ejemplo, de 0 a 10°C, particularmente de 5 a 8°C, más particularmente 5°C, o el almacenamiento congelado, y en ciclos de congelación y descongelación. La trehalosa es particularmente ventajosa ya que la formulación de anticuerpo resultante no experimenta glucosilación.

La concentración del agente de tonicidad en la composición líquida varía de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml. Preferentemente, la concentración del agente de tonicidad en la composición líquida es de aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 65 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 75 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 81 mg/ml, aproximadamente 82 mg/ml, aproximadamente 83 mg/ml, aproximadamente 84 mg/ml, aproximadamente 85 mg/ml, aproximadamente 86 mg/ml, aproximadamente 87 mg/ml, aproximadamente 88 mg/ml, aproximadamente 89 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 91 mg/ml, aproximadamente 92 mg/ml, aproximadamente 93 mg/ml, aproximadamente 94 mg/ml, aproximadamente 95 mg/ml, aproximadamente 96 mg/ml, aproximadamente 97 mg/ml, aproximadamente 98 mg/ml, aproximadamente 99 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 105 mg/ml, aproximadamente 110 mg/ml, aproximadamente 120 mg/ml o aproximadamente 130 mg/ml. Más preferentemente, la concentración del agente de tonicidad en la composición liquida es de aproximadamente 84 mg/ml.

Cuando el agente de tonicidad comprende una sal, la concentración de la sal en la composición líquida varía de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las sales que son farmacéuticamente aceptables y adecuadas para la presente invención incluyen cloruro sódico, succinato sódico, sulfato sódico, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y cloruro calcico. Las sales preferidas para la presente invención son cloruro sódico y cloruro de magnesio, el cloruro de magnesio también puede mejorar la estabilidad del anticuerpo protegiendo a la proteina frente a la desamidación. Preferentemente, la sal en la composición líquida se selecciona de un intervalo de concentraciones de cualquiera de aproximadamente 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8, mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml y 20 mg/ml.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el tensioactivo se selecciona preferentemente del grupo que consiste en polisorbatos, poloxámeros, tritones, dodecilsulfato sódico, laurilsulfato sódico, octilglucósido sódico, lauril-sulfobetaína, miristil-sulfobetaína, linoleil-sulfobetaína, estearil-sulfobetaína, lauril-sarcosina, miristil-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaina, miristil-betaina, cetil-betaína, lauroamidopropil-betaína, cocamidopropil-betaina, linoleamidopropil-betaína, miristamidopropil-betaína, palmidopropil-betaina, isoestearamidopropil-betaina, miristamidopropil-dimetilamina, palmidopropil-dimetilamina, isoestearamidopropil-dimetilamina, metil cocoil-taurato sódico, metil oleil- taurato disódico, cloruro de dihidroxipropil PEG 5 linoleamonio, polietilenglicol, polipropilenglicol y mezclas de los mismos. Además, preferentemente, el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 21, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 61 , polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81 , polisorbato 85 y mezclas de los mismos. Más preferentemente, el tensioactivo se selecciona de polisorbato 20, polisorbato 80, PEG3350 o mezclas de los mismos. Más preferentemente, el tensioactivo es polisorbato 20. De acuerdo con la presente invención, el tensioactivo, particularmente polisorbato 20, proporciona a la composición líquida una estabilidad de anticuerpo aumentada y resistencia frente a la agregación y fragmentación.

La concentración del tensioactivo generalmente varía de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 5.0 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 2.0 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 1.5 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 01.0 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 0.5 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 0.4 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 0.3 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 0.2 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 0.15 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 0.1 mg/ml o de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 0.05 mg/ml. Además, preferentemente, la concentración del tensioactivo es de aproximadamente 0.5 mg/ml, aproximadamente 0.05 mg/ml, aproximadamente 0.06 mg/ml, aproximadamente 0.07 mg/ml, aproximadamente 0.08 mg/ml, aproximadamente 0.09 mg/ml, aproximadamente 0.1 mg/ml, aproximadamente 0.11 mg/ml, aproximadamente 0.12 mg/ml, aproximadamente 0.13 mg/ml, aproximadamente 0.14 mg/ml, aproximadamente 0.15 mg/ml, aproximadamente 0.16 mg/ml, aproximadamente 0.17 mg/ml, aproximadamente 0.18 mg/ml, aproximadamente 0.19 mg/ml, aproximadamente 0.2 mg/ml. Más preferentemente, la concentración del tensioactivo es de aproximadamente 0.1 mg/ml. Son altamente preferidas realizaciones con una concentración del tensioactivo de aproximadamente 0.1 mg/ml ya que esta concentración permite el mantenimiento de la estabilidad del anticuerpo de la formulación en solución, reduciendo al mismo tiempo la tendencia a la formación de burbujas en la formulación durante la preparación de la formulación, la manipulación de la formulación y la preparación para su administración parenteral, y especialmente la tensión relacionada con las sacudidas y la agitación durante la preparación y también durante el transporte.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el tampón puede seleccionarse del grupo que consiste en acetato, succinato, gluconato, citrato, histidina, ácido acético, fosfato, ácido fosfórico, ascorbato, ácido tartárico, ácido maleico, glicina, lactato, ácido láctico, ácido ascórbico, imidazol, bicarbonato y ácido carbónico, ácido succinico, benzoato sódico, ácido benzoico, gluconato, edetato, acetato, malato, imidazol, tris, fosfato y mezclas de los mismos. Preferentemente, el tampón es histidina, en el que la histidina puede comprender L-histidina o D-histidina, una forma solvatada de histidina, una forma hidratada (por ejemplo, monohidrato) de histidina o una forma anhidra de histidina, o una mezcla de las mismas.

De acuerdo con la presente invención, el tampón, particularmente el tampón preferido histidina, proporciona a la composición liquida un pH próximo al pH fisiológico para una reducción del riesgo de dolor o efectos secundarios anafilactoides en la inyección, y también proporciona una estabilidad de anticuerpo aumentada y resistencia a la agregación, oxidación y fragmentación.

La concentración del tampón puede variar de aproximadamente 0.1 milimolar (mM) a aproximadamente 100 mM. Preferentemente, la concentración del tampón es de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 50 mM, preferentemente además de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 30 mM, más preferentemente de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 18 mM, cada vez más preferentemente de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 15 mM. Preferentemente, la concentración del tampón es de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 21 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 23 mM, aproximadamente 24 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM o aproximadamente 50 mM. Más preferentemente, la concentración del tampón es de aproximadamente 10 mM.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el agente quelante puede seleccionarse del grupo que consiste en ácidos aminopolicarboxílicos, ácidos hidroxiaminocarboxílicos, glicinas N-sustituidas, ácido 2-(2-amino-2-oxoctil)aminoetano sulfónico (BES), deferoxamina (DEF), ácido cítrico, niacinamida y desoxicolatos y mezclas de los mismos. Además, preferentemente, el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido ?/-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), bis(aminoetil)glicoléter, ácido ?,?,?',?'- tetraacético (EGTA), ácido trans-diaminociclohexano tetraacético (DCTA), ácido glutámico y ácido aspártico; ácido N-hidroxietiliminodiacético (HI DA), ?/,/V-bis-hidroxietilglicina (bicina) y N-(trishidroximetilmetil) 10 glicina (tricina), glicilglicina, desoxicolato sódico, etilendiamina; propilendiamina; dietilentriamina; trietilentetraamina (trieno), etilendiaminotetraaceto EDTA; EDTA disódico, EDTA calcico, ácido oxálico, malato, ácido cítrico, ácido cítrico monohidrato y citrato-dihidrato trisódico, 8-hidroxiquinolato, aminoácidos, histidina, cisteína, metionina, péptidos, polipéptidos y proteínas y mezclas de los mismos. Además, preferentemente, el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en sales de EDTA incluyendo edetato dipotásico, edetato disódico, edetato de calcio disódico, edetato sódico, edetato trisódico y edetato de potasio; y una sal adecuada de deferoxamina (DEF) es mesilato de deferoxamina (DFM), o mezclas de los mismos. Los agentes quelantes usados en la invención pueden estar presentes, cuando sea posible, como la forma de ácido libre o base libre o forma de sal del compuesto, también como forma anhidra, solvatada o hidratada del compuesto o sal correspondiente.

Más preferentemente, el agente quelante es EDTA disódico, EDTA cálcico, más preferentemente EDTA disódico.

Es particularmente preferible EDTA disódico ya que proporciona a la composición líquida una estabilidad de anticuerpo aumentada y/o resistencia a la agregación.

La concentración de agente quelante varía generalmente de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10.0 mg/ml, de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 5.0 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 1.0 mg/ml, o de aproximadamente 0.03 mg/ml a aproximadamente 0.5 mg/ml Además, preferentemente, la concentración de agente quelante varía generalmente de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 2.0 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 1.5 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.5 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.4 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.3 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.2 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.15 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.1 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.09 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.08 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.07 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.06 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.05 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.04 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.03 mM, de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 0.02 mM o de aproximadamente 0.05 mM a aproximadamente 0.01 mM. Preferentemente, la concentración de agente quelante puede ser de aproximadamente 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.03 mg/ml, aproximadamente 0.04 mg/ml, aproximadamente 0.05 mg/ml, aproximadamente 0.06 mg/ml, aproximadamente 0.07 mg/ml, aproximadamente 0.10 mg/ml, aproximadamente 0.20 mg/ml. Además, preferentemente, la concentración de agente quelante es de aproximadamente 0.045 mg/ml, aproximadamente 0.046 mg/ml, aproximadamente 0.047 mg/ml, aproximadamente 0.048 mg/ml, aproximadamente 0.049 mg/ml, aproximadamente 0.05 mg/ml, aproximadamente 0.051 mg/ml, aproximadamente 0.052 mg/ml, aproximadamente 0.053 mg/ml, aproximadamente 0.054 mg/ml, aproximadamente 0.055 mg/ml o aproximadamente 0.056 mg/ml. Más preferentemente, la concentración de agente quelante es de aproximadamente 0.05 mg/ml.

Los agentes quelantes pueden disminuir la formación de especies de oxigeno reducidas, reducir la formación de especies ácidas (por ejemplo, desamidación), reducir la agregación de anticuerpos y/o reducir la fragmentación de anticuerpos y/o reducir la oxidación de anticuerpos en las composiciones de la presente invención. Dichos agentes quelantes pueden reducir o prevenir la degradación de un anticuerpo que se formula en comparación con el anticuerpo sin la protección de un agente quelante.

A menos que se indique otra cosa, las concentraciones enumeradas en el presente documento son las concentraciones en condiciones ambientales [es decir, a 25°C y presión atmosférica].

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la composición líquida puede comprender además un agente antioxidante. Preferentemente, el agente antioxidante se selecciona del grupo que comprende metionina, tiosulfato sódico, catalasa y platino.

La concentración de antioxidante generalmente varía de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10.0 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 5.0 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 1.0 mg/ml, o de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 0.02mg/ml. Preferentemente, la concentración de antioxidante es de aproximadamente 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.03 mg/ml, aproximadamente 0.04 mg/ml, aproximadamente 0.05 mg/ml, aproximadamente 0.06 mg/ml, aproximadamente 0.07 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.09 mg/ml, aproximadamente 0.10 mg/ml, 0.11 mg/ml, 0.12 mg/ml, 0.13 mg/ml, aproximadamente 0.14 mg/ml, aproximadamente 0.15 mg/ml, aproximadamente 0.16 mg/ml, aproximadamente 0.17 mg/ml, 0.18 mg/ml, 0.19 mg/ml, aproximadamente 0.20 mg/ml, aproximadamente 0.25 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1.0 mg/ml. Más preferentemente, la concentración de antioxidante es de aproximadamente 0.01 mg/ml.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la presente invención, la composición líquida puede comprender además un conservante. Preferentemente, el agente conservante se selecciona de Fenol, m-cresol, alcohol bencílico, cloruro de benzalconio, cloruro de benzalconio, fenoxietanol y metil parabeno.

La concentración de conservante varía generalmente de aproximadamente 0.001 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 0.005 mg/ml a aproximadamente 15.0 mg/ml, de aproximadamente 0.008 mg/ml a aproximadamente 12.0 mg/ml o de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10.0 mg/ml. Preferentemente, la concentración de conservante puede ser de aproximadamente 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, aproximadamente 0.4 mg/ml, aproximadamente 0.5 mg/ml, aproximadamente 0.6 mg/ml, aproximadamente 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, aproximadamente 1.0 mg/ml, 2.0 mg/ml, 3.0 mg/ml, aproximadamente 4.0 mg/ml, aproximadamente 5.0 mg/ml, aproximadamente 6.0 mg/ml, aproximadamente 7.0 mg/ml, 8.0 mg/ml, 9.0 mg/ml, aproximadamente 9.1 mg/ml, aproximadamente 9.2 mg/ml, 9.3 mg/ml, 9.4 mg/ml, 9.5 mg/ml, 9.6 mg/ml, 9.7 mg/ml, 9.8 mg/ml, 9.9 mg/ml, 10.0 mg/ml. Más preferentemente, la concentración de conservante es de aproximadamente 0.1 mg/ml o 9.0 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la formulación líquida no contiene un antioxidante.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la formulación líquida no contiene un conservante.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la concentración de anticuerpo puede variar de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 200 mg/ml. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es de aproximadamente 0.5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2.5 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 3.5 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 4.5 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 5.5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 6.5 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 7.5 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 8.5 mg/ml, aproximadamente 9 mg/ml, aproximadamente 9.5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 11 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 13 mg/ml, aproximadamente 14 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 16 mg/ml, aproximadamente 17 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml, aproximadamente 23 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 26 mg/ml, aproximadamente 27 mg/ml, aproximadamente 28 mg/ml, aproximadamente 29 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 31 mg/ml, aproximadamente 32 mg/ml, aproximadamente 33 mg/ml, aproximadamente 34 mg/ml, aproximadamente 35 mg/ml, aproximadamente 36 mg/ml, aproximadamente 37 mg/ml, aproximadamente 38 mg/ml, aproximadamente 39 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, aproximadamente 41 mg/ml, aproximadamente 42 mg/ml, aproximadamente 43 mg/ml, aproximadamente 44 mg/ml, aproximadamente 45 mg/ml, aproximadamente 46 mg/ml, aproximadamente 47 mg/ml, aproximadamente 48 mg/ml, aproximadamente 49 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 51 mg/ml, aproximadamente 52 mg/ml, aproximadamente 53 mg/ml, aproximadamente 54 mg/ml, aproximadamente 55 mg/ml, aproximadamente 56 mg/ml, aproximadamente 57 mg/ml, aproximadamente 58 mg/ml, aproximadamente 59 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml o aproximadamente 110 mg/ml. Más preferentemente, la concentración de anticuerpo es inferior a o igual a aproximadamente 50 mg/ml y puede seleccionarse del grupo que comprende aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2.5 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, 22 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml, El anticuerpo se selecciona preferentemente del grupo de; anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fe, ScFv etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecificos, anticuerpo heteroconjugados, cadena sencilla (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio), anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad necesaria, incluyendo variantes de glucosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. El anticuerpo puede ser de origen murino, de rata, ser humano o cualquier otro origen (incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados). En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser humano pero más preferentemente está humanizado. Preferentemente, el anticuerpo está aislado, preferentemente además es sustancialmente puro. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, este conserva preferentemente las características funcionales del anticuerpo original, es decir, la unión a ligando y/o la actividad agonista o antagonista.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la región constante de cadena pesada de anticuerpo puede ser de cualquier tipo de región constante, tal como IgG, IgM, IgD, IgA e IgE; y cualquier isotipo, tal como IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo lgG2.

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo puede comprender la región constante de lgG2a de cadena pesada humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende la región constante kappa de cadena ligera humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte, por ejemplo, que no desencadena lisis mediada por complemento o que no estimula la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). En otras realizaciones, la región constante está modificada como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624; publicación PCT No. WO099/58572; y/o Solicitud de Patente del Reino Unido No. 9809951.8. En otras realizaciones más, el anticuerpo comprende una región constante de lgG2a de cadena pesada humana que comprende las mutaciones siguientes: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos con referencia a la secuencia de lgG2a de tipo silvestre), Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo anti-NGF que se une a NGF (tal como NGF humano) con alta afinidad. En algunas realizaciones, la alta afinidad es (a) la unión a NGF con una D de menos de aproximadamente 2 n (tal como cualquiera de aproximadamente 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40pM, 30pM, 20pM, 10pM, 5pM o menos) y/o una koff más lenta de aproximadamente 6 x 10"5 s"1; y/o (b) la inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF) de cualquiera de aproximadamente 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM o menos; y/o (c) la inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 1.5 pM de NGF) de cualquiera de aproximadamente 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM o menos; y/o (d) la inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF de rata de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF) de cualquiera de aproximadamente 150 pM, 125 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM o menos; y/o (e) la inhibición (reducción y/o bloqueo) de la supervivencia dependiente de NGF de rata de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 1.5 pM de NGF) de cualquiera de aproximadamente 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM, 1 pM o menos; y/o (f) y/o la unión de NGF con mayor afinidad que el receptor trkA.

En otro aspecto, los anticuerpos (a) se unen a NGF (tal como NGF humano) con una KD de menos de aproximadamente 2 nM (tal como cualquiera de aproximadamente 1 nM, 800 pM, 600 pM, 400 pM, 200 pM, 100pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM o menos) y/o una k0tf más lenta de aproximadamente 6 x 0"5 s"1; y/o (b) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF) de cualquiera de aproximadamente 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM, 60 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM o menos; y/o (c) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E 3.5 de ratón con una CI50 (en presencia de aproximadamente 1.5 pM de NGF) de cualquiera de aproximadamente 50 pM, 40 pM, 30 pM, 10 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2 pM, 1 pM o menos; y/o se unen a NGF con mayor afinidad que el receptor trkA. En algunas realizaciones, los anticuerpos (a) se unen a NGF con una KD de menos de aproximadamente 2 nM; y/o (b) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 100 pM o menos, en la que la CI50 se mide en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF; y/o (c) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 10 pM o menos, en la que la CI50 se mide en presencia de aproximadamente 1.5 pM de NGF. En algunas realizaciones, los anticuerpos (a) se unen a NGF con una KD de menos de aproximadamente 100 pM; y/o (b) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronal trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 20 pM o menos, en la que la CI50 se mide en presencia de aproximadamente 15 pM de NGF; y/o (c) inhiben la supervivencia dependiente de NGF humano de neuronas trigeminales E13.5 de ratón con una CI50 de aproximadamente 2 pM o menos, en la que la CI50 se mide en presencia de aproximadamente 1.5 pM de NGF.

El epítopo o epítopos que pueden unirse por el anticuerpo pueden ser continuos o discontinuos. En una realización, el anticuerpo se une esencialmente a los mismos epítopos de hNGF que un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en AcM 9 1 , AcM 912 y AcM 938, como se describe en Hongo y col., Hybridoma, 19: 215-227 (2000), un anticuerpo definido en el presente documento (tal como el anticuerpo E3); y/o descrito en el documento WO2005019266 (incluyendo los anticuerpos 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F 1 y 4G6) o el documento WO2006131951 (incluyendo el anticuerpo Hu-aD1 1 ), el documento WO09023540 o US20090041717, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. En otra realización, el anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo de hNGF que el AcM 91 1. En otra realización más, el anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo que el AcM 909. Hongo y col., anteriormente. Por ejemplo, el epitopo puede comprender uno o más restos K32, K34 y E35 dentro de la región variable 1 (aminoácidos 23-35) de hNGF; los restos F79 y T81 dentro de la región variable 4 (aminoácidos 81-88) de hNGF; los restos H84 y K88 dentro de la región variable 4; el resto R103 entre la región variable 5 (aminoácidos 94-98) de hNGF y el extremo C-terminal (aminoácidos 11 1-118) de hNGF; el resto E1 dentro de la región prevariable 1 (aminoácidos 10-23) de hNGF; Y52 entre la región variable 2 (aminoácidos 40-49) de hNGF y la región variable 3 (aminoácidos 59-66) de hNGF; los restos L112 y S113 dentro del extremo C-terminal de hNGF; los restos R59 y R69 dentro de la región variable 3 de hNGF; o los restos V18, V20 y G23 dentro de la región prevariable 1 de hNGF. Además, un epitopo puede comprender una o más de la región variable 1 , región variable 3, región variable 4, región variable 5, la región del extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal de hNGF. En otra realización más, el anticuerpo reduce significativamente la accesibilidad al disolvente del resto R103 de hNGF. Se entiende que aunque los epítopos descritos anteriormente se refieren a NGF humano, un experto en la materia puede alinear las estructuras de NGF humano con el NGF de otra especie e identificar probablemente homólogos de estos epítopos.

En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 9, en la que I34 es S, L, V A o I; y N35 se sustituye con N, T o S. Por comodidad en el presente documento, los términos "sustituido" o "es" en este contexto o referencia a un aminoácido se refieren a elecciones de un aminoácido o aminoácidos para una posición dada. Como es evidente, la sustitución, o elección, puede ser el aminoácido representado en una SEQ ID o Figura. Los números de resto se determinan fácilmente por referencia a la SEQ ID NO: indicada y siguen la numeración de restos del anticuerpo.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 10, en la que M50 es M, I, G, Q, S o L; A62 es A o S; y L63 es L o V.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo), que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 1 1 , en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es D, N, o G; y en la que Y110 es Y, K, S, R o T.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 1 1 , en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y1 10 es cualquier amihoácido.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 11 , en la que G98 es G, S, A, C, V, N, D o T ; en la que G99 es G, S, A, C, V, N, D o T ; en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y110 es cualquier aminoácido.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:12, en la que S26 es S o F; D28 es D, S, A o Y; y H32 es H, N o Q.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 13, en la que 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es K, H, R o S; y en la que Y96 es Y o R.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y en la que Y96 es Y o R.

En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9, en la que 134 es S, L, V, A o I; y N35 es N, T o S.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10, en la que M50 es M, I, G, Q, S o L; A62 es A o S; y L63 es L o V.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 , en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es D, N o G ; y en la que Y1 10 es Y, K, S, R o T.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 , en la que Y100 es Y, L, o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y1 10 es cualquier aminoácido.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 1 , en la que G98 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que G99 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y1 10 es cualquier aminoácido.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12, en la que S26 es S o F; D28 es D, S, A o Y; y H32 es H, N o Q.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13, en la que 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es K, H, R o S; y en la que Y96 es Y o R.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y en la que Y96 es Y o R.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como anticuerpos, incluyendo anticuerpos humanizados) que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la región CDR1 de la SEQ ID NO: 9, en la que I34 es S, L, V A o I; y N35 es N, T o S; la región CDR2 de la SEQ ID NO: 10, en la que M50 es M, I, G, Q, S o L; A62 es A o S; y L63 es L o V; y la región CDR3 de la SEQ ID NO: 11 , en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es D, N o G; en la que Y110 es Y, K, S, R o T. En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende la región CDR3 de la SEQ ID NO: 11, en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T 04 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; en la que Y110 es cualquier aminoácido. En otras realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende la región CDR3 de la SEQ ID NO: 11 , en la que G98 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que G99 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o ; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y110 es cualquier aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido (tal como un anticuerpo) comprende además una región variable de cadena ligera de anticuerpo.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la región CDR1 de la SEQ ID NO.: 12, en la que S26 es S o F; D28 es D, S, A o Y; y H32 es H, N o Q; la región CDR2 de la SEQ ID NO: 13, en la que 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T; y la región CDR3 de la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es K, H, R o S; y en la que Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende la región CDR3 de la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y en la que Y96 es Y o R. En algunas realizaciones el polipéptido (tal como un anticuerpo) comprende además una cadena pesada de anticuerpo.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprende (a) una región variable de cadena pesada que comprende la región CDR1 de la SEQ ID NO: 9, en la que I34 es S, L, V A o I ; y N35 es N, T o S; la región CDR2 de la SEQ ID NO: 10, en la que M50 es M, I, G, Q, S o L; A62 es A o S; y L63 es L o V; y la región CDR3 de la SEQ ID NO: 11 , en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es D, N o G; en la que Y1 10 es Y, K, S, R o T; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la región CDR1 de la SEQ ID NO: 12, en la que S26 es S o F; D28 es D, S, A o Y; y H32 es H, N o Q; la región CDR2 de la SEQ ID NO: 13, en la que 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T; y la región CDR3 de la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es K, H, R o S; y en la que Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende la región CDR3 de la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es cualquier aminoácido; T93 es cualquier aminoácido; y en la que Y96 es Y o R. En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende la región CDR3 de la SEQ ID NO: 11 , en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; en la que Y110 es cualquier aminoácido. En otras realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende la región CDR3 de la SEQ ID NO: 11 , en la que G98 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que G99 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y110 es cualquier aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende además una cadena ligera de anticuerpo.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo, incluyendo el anticuerpo humanizado) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9, en la que I34 es S, L, V A o I ; y N35 es N, T o S; una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10, en la que M50 es M, I, G, Q, S o L; A62 es A o S; y L63 es L o V; y una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 , en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W ; en la que D109 es D, N o G ; en la que Y110 es Y, K, S, R o T. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 , en la que Y100 es Y, L o R; y en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G; y en la que Y110 es cualquier aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 1 , en la que G98 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que G99 es G, S, A, C, V, N, D o T; en la que Y100 es Y, L o R; en la que Y101 es Y o W; en la que G103 es G, A o S; en la que T104 es T o S; en la que S105 es S, A o T; en la que Y106 es Y, R, T o M; en la que Y107 es Y o F; en la que F108 es F o W; en la que D109 es S, A, C, G, D, N, T o G ; y en la que Y110 es cualquier aminoácido. En algunas realizaciones, el polipéptido (tal como un anticuerpo) comprende además una región variable de cadena ligera de anticuerpo.

En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos (tales como un anticuerpo) que comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12, en la que S26 es S o F; D28 es D, S, A o Y; y H32 es H, N o Q; una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13, en la que 151 es I, T, V o A; y S56 es S o T; y una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14, en la que S91 es S o E; K92 es K, H, R o S; y en la que Y96 es Y o R.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-NGF que comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 mostrada en la SEQ ID NO: 3; (b) una región CDR2 mostrada en la SEQ ID NO: 4; y (c) una región CDR3 mostrada en las SEQ ID NO: 5, 1 1 , 56, 58, 60, 62, 64.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-NGF que comprende una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una región CDR1 mostrada en la SEQ ID NO: 6; (b) una región CDR2 mostrada en la SEQ ID NO: 7; y (c) una región CDR3 mostrada en la SEQ ID NO: 8, 14, 55, 57, 59, 61 ó 63.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-NGF que comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 mostrada en la SEQ ID NO: 3; (b) una región CDR2 mostrada en la SEQ ID NO: 4; y (c) una región CDR3 mostrada en la SEQ ID NO: 5.

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-NGF que comprende una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una región CDR1 mostrada en la SEQ ID NO: 6; (b) una región CDR2 mostrada en la SEQ ID NO: 7; y (c) una región CDR3 mostrada en la SEQ ID NO: 8.

El anticuerpo anti-NGF puede comprender además una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 mostrada en la SEQ ID NO: 3; (b) una región CDR2 mostrada en la SEQ ID NO: 4; y (c) una región CDR3 mostrada en la SEQ ID NO: 5.

El anticuerpo anti-NGF puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de cualquiera de al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y/o una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de cualquiera de al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que el anticuerpo se une específicamente a NGF.

La región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-NGF humanizado puede comprender una o más mutaciones de la región flanqueante respectiva. En un aspecto, la mutación de la región flanqueante puede sustituir un resto de región flanqueante humana con el resto de la región flanqueante de ratón complementario. La mutación puede comprender la sustitución V71 K en la región variable de la cadena pesada.

El anticuerpo anti-NGF puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y/o puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

El anticuerpo anti-NGF puede ser un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 1 y 2.

El anticuerpo anti-NGF puede comprender una región de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de cualquiera de al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y/o una región de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de cualquiera de al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, en la que el anticuerpo se une específicamente a NGF.

El anticuerpo anti-NGF puede comprender una región de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y/o puede comprender una región de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

El anticuerpo anti-NGF puede ser un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 16 y 17.

El anticuerpo anti-NGF puede competir por la unión a NGF con un anticuerpo anti-NGF como se define en el presente documento. El anticuerpo anti-NGF puede competir por la unión a NGF con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

El anticuerpo anti-NGF puede ser un anticuerpo humanizado y madurado por afinidad, E3, que se une específicamente a NGF humano y de roedor. El anticuerpo E3 se describe en el documento WO2004/058184, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de E3 se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2 (Figuras 1A y 1 B del documento WO2004/058184), respectivamente. Las porciones CDR del anticuerpo E3 (incluyendo CDR de Chothia y Kabat) se representan en forma esquemática en las Figuras 1A y 1 B del documento WO2004/058184. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de E3 y de las CDR extendidas individuales también se muestran a continuación (véase, "secuencias de anticuerpo" a continuación). El anticuerpo E3 es muy potente para secuestrar NGF e impedir la interacción con su receptor. E3 y su anticuerpo precursor murino 91 1 han demostrado ser un analgésico eficaz en modelos animales no clínicos de dolor patológico incluyendo artritis, dolor por cáncer y dolor postquirúrgico.

El anticuerpo anti-NGF también puede comprender un fragmento o una región del anticuerpo E3 (denominados indistintamente ?3" en el presente documento). En una realización, el fragmento es una cadena ligera del anticuerpo E3 como se muestra en la Figura 1 B del documento WO2004/058184 y en la SEQ ID NO: 17 en el presente documento. En otra realización, el fragmento es una cadena pesada del anticuerpo E3 como se muestra en la Figura 1A del documento WO2004/058184 y en la SEQ ID NO: 16 en el presente documento. En otra realización más, el fragmento contiene una o más regiones variables de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo E3. En otra realización más, el fragmento contiene una o más CDR de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo E3, como se muestra en las Figuras 1A y 1 B del documento WO2004/058184 y en las SEQ ID NO: 17 y 16, respectivamente, en el presente documento.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4893 o ATCC No. PTA-4894. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que sé produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4895. En otro aspecto, el anticuerpo comprende (a) una cadena ligera que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4894 o ATCC No. PTA-4893; y (b) una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4895 (por comodidad en el presente documento, el polinucleótido o polinucleótidos producidos por una célula huésped depositada se denominan con el número de depósito de la ATCC No. PTA-4894, PTA-4893 y PTA-4895). En otro aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera de una cadena ligera que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4894 o ATCC No. PTA-4893. En otro aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4895. En otro aspecto, el anticuerpo comprende (a) una región variable de cadena ligera de una cadena ligera que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4894 o ATCC No. PTA-4893, y (b) una región variable de cadena pesada de una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4895. En otro aspecto más, el anticuerpo comprende una o más CDR codificadas por (a) un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4894; y/o (b) una cadena pesada que está codificada por un polinucleótido que se produce por una célula huésped con un número de depósito de la ATCC No. PTA-4895.

En otro aspecto, el anticuerpo comprende una o más de cualquiera de las siguientes: a) una o más CDR de anticuerpo E3 mostradas en las SEQ ID NO: 1-8 o SEQ ID NO: 3-8 (Figuras 1A y 1B del documento WO2004/058184); b) la CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostrada en las SEQ ID NO: 1 y 5 (Figura 1A del documento WO2004/058184); c) la CDR L3 de la cadena ligera del anticuerpo E3 mostrada en las SEQ ID NO: 2 y 8 (Figura 1 B del documento WO2004/058184); d) tres CDR de la cadena ligera del anticuerpo E3 mostradas en las SEQ ID NO: 2, 6-8 (Figura 1 B del documento WO2004/058184); e) tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostradas en las SEQ ID NO: 1 , 3-5 (Figura 1A del documento WO2004/058184); y f) tres CDR de la cadena ligera y tres CDR de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostradas en las SEQ ID NO: 1-8 (Figuras 1A y 1 B del documento WO2004/058184). En otro aspecto, el anticuerpo puede comprender una o más de cualquiera de las siguientes: a) una o más (una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) CDR derivadas del anticuerpo E3 mostradas en las SEQ ID NO: 1-8 (Figuras 1A y 1 B del documento WO2004/058184); b) una CDR derivada de la CDR H3 de la cadena pesada del anticuerpo E3 mostrada en las SEQ ID NO: 1 y 5 (Figura 1A del documento WO2004/058184); y/o c) una CDR derivada de la CDR L3 de la cadena ligera del anticuerpo E3 mostrada en las SEQ ID NO: 2 y 8 (Figura 1 B del documento WO2004/058184). En algunas realizaciones, las CDR pueden ser CDR de Kabat, CDR de Chothia o una combinación de CDR de Kabat y Chothia (denominadas CDR "extendidas" o "combinadas" en el presente documento). En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden cualquiera de las configuraciones de CDR (incluyendo combinaciones, variantes, etc.) descritas en el presente documento.

En otra realización, el anticuerpo puede comprender: (a) una región variable de cadena pesada que comprende: (i) una región CDR1 de la SEQ ID NO: 30; (¡i) una región CDR2 que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 31 ; (iii) una región CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11 , 56, 58, 60, 62 y 64; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende: (i) una región CDR1 de la SEQ ID NO: 8; (ii) una región CDR2 de la SEQ ID NO: 19; (iii) una región CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 55, 57, 59, 61 y 63.

En algunas realizaciones de la presente invención, se deleciona la lisina C-terminal de la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos anti-NGF descritos en el presente documento. En diversos casos la cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos anti-NGF descritos en la presente memoria puede incluir opcionalmente una secuencia señal.

En otra realización, el anticuerpo puede seleccionarse de un anticuerpo anti-NGF conocido en la técnica, tal como los anticuerpos descritos en el documento WO2005019266 (incluyendo los anticuerpos 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F11 y 4G6), el documento WO2006131951 (incluyendo el anticuerpo Hu-aD1 1), los documentos WO09023540 o US20090041417. El anticuerpo puede unirse al mismo epítopo que un anticuerpo anti-NGF conocido en la técnica, tal como AcM 911 , AcM 912 y AcM 938, como se describe en Hongo y col., Hybridoma, 19: 215-227 (2000), y los anticuerpos descritos en el documento WO2005019266 (incluyendo los anticuerpos 4D4, 14D10, 6G9, 7H2, 14F1 1 y 4G6), el documento WO2006131951 (incluyendo el anticuerpo Hu-aD11), los documentos WO09023540 o US20090041417, y/o puede competir por la unión a NGF con dicho anticuerpo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida que comprende o consiste en; de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml de al menos un anticuerpo, de aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 15 mM de tampón de histidina, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de trehalosa dihidrato, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.15 mg/ml de PS20, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/ml de EDTA disódico, en la que dicha composición es de un pH seleccionado del intervalo de entre aproximadamente un pH de 5.5 y cualquiera de aproximadamente un pH de 6.0, 6.2, 6.5 ó 6.8 o, como alternativa, del intervalo de entre aproximadamente un pH de 5.8 y cualquiera de aproximadamente un pH de 6.0, 6.2, 6.5 ó 6.8.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición liquida que comprende o consiste en; cualquiera de aproximadamente 2.5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 22 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml de al menos un anticuerpo, de aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 15 mM de tampón de histidina, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de trehalosa dihidrato, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.15 mg/ml de PS20, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/ml de EDTA disódico, en la que dicha composición es de un pH seleccionado del intervalo de entre aproximadamente un pH de 5.5 y cualquiera de aproximadamente un pH de 6.0, 6.2, 6.5 ó 6.8 o, como alternativa, del intervalo de entre aproximadamente un pH de 5.8 y cualquiera de aproximadamente un pH de 6.0, 6.2, 6.5 ó 6.8.

De acuerdo con una realización preferida, la composición líquida comprende o consiste en; cualquiera de aproximadamente 2.5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 22 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml de al menos un anticuerpo, aproximadamente 10 mM de tampón de histidina, aproximadamente 84 mg/ml de trehalosa dihidrato, aproximadamente 0.1 mg/ml de PS20, aproximadamente 0.05 mg/ml dé EDTA disódico, en la que dicha composición es de un pH seleccionado del intervalo de entre aproximadamente un pH de 5.5 y cualquiera de aproximadamente un pH de 6.0, 6.2, 6.5 ó 6.8 o, como alternativa, del intervalo de entre aproximadamente un pH de 5.8 y cualquiera de aproximadamente un pH de 6.0, 6.2, 6.5 ó 6.8, preferentemente es de un pH de 5.8 a 6.5, y en la que dicho anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1 y una secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con una realización preferida, la composición liquida comprende o consiste en; cualquiera de aproximadamente 2.5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 22 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml de al menos un anticuerpo, aproximadamente 10 mM de tampón de histidina, aproximadamente 84 mg/ml de trehalosa dihidrato, aproximadamente 0.1 mg/ml de PS20, aproximadamente 0.05 mg/ml de EDTA disódico, en la que dicha composición es de un pH de 6.0, +/- 0.2 y en la que dicho anticuerpo comprende una secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1 y una secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, el volumen de dosis usado es de 1 mi.

En un aspecto, se proporciona una composición líquida que no está liofilizada y que no se ha sometido a liofilización.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición es resistente a la agregación del anticuerpo después de múltiples ciclos de congelación y descongelación.

Preferentemente, el anticuerpo es resistente a la agregación durante al menos un ciclo de congelación y descongelación de la composición, preferentemente además en el que el anticuerpo es resistente a la agregación durante múltiples ciclos de congelación y descongelación, preferentemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ó 15 ciclos de congelación-descongelación. Más preferentemente, el anticuerpo es resistente a la agregación durante al menos quince ciclos de congelación y descongelación de la composición líquida, preferentemente además cuatro o quince ciclos.

Preferentemente además, el anticuerpo demuestra un aumento de la agregación de menos de aproximadamente el 10% después de los múltiples ciclos de congelación y descongelación de la composición líquida en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes de la congelación y descongelación, más preferentemente un aumento de la agregación de menos de o aproximadamente el 9, 8, 7 ,6, 5, 4, 3, 2, 1 , 0.5 ó 0% después de los múltiples ciclos de congelación y descongelación de la composición líquida en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes de la congelación y descongelación.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 ó 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C, y en la que existe un aumento en la agregación del anticuerpo de la composición de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

Preferentemente, existe un aumento en la agregación del anticuerpo de la formulación líquida de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, cuando se almacena durante un periodo de cualquiera de aproximadamente 2, 4, 8, 9, 3, 26 ó 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml.

Más preferentemente, el anticuerpo de la composición líquida demuestra un aumento de la agregación de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, más preferentemente menos de cualquiera de aproximadamente el 34%, 33%, 32%, 31 %, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21 %, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11 %, 10%, 9%, más preferentemente menos de aproximadamente el 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ó 0.5% o igual a aproximadamente el 0% después del periodo de almacenamiento de 2, 4, 8, 9, 13, 26 ó 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C, más preferentemente, menos de aproximadamente el 20% a 40°C durante 52 semanas, o menos de aproximadamente el 10% a 40°C durante 26 semanas, en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 ó 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C, y en la que existe un aumento en la oxidación del anticuerpo de la composición de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

Preferentemente, el anticuerpo de la composición líquida demuestra un aumento de la oxidación de menos de aproximadamente el 35%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, más preferentemente menos de cualquiera de aproximadamente el 34%, 33%, 32%, 31 %, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21 %, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 1 1%, 10%, 9%, más preferentemente menos de aproximadamente el 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ó 0.5%, o igual a aproximadamente el 0%, después del periodo de almacenamiento de cualquiera de aproximadamente 2, 4, 8, 9, 13, 26 ó 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C, más preferentemente, menos de aproximadamente el 31 % o 30% durante 52 semanas, o menos de aproximadamente el 1 1 % o 10% a 40°C durante 26 semanas, en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición liquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 ó 52 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C, y en la que existe una disminución en la actividad del anticuerpo de la composición de menos del 30%.

Preferentemente, existe una disminución en la actividad del anticuerpo de la formulación líquida de menos de aproximadamente el 30%, más preferentemente de menos de aproximadamente el 25%, más preferentemente del 20%, más preferentemente una disminución en la actividad del anticuerpo de la formulación de menos de aproximadamente el 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , 0.5 ó 0% cuando se almacena durante un periodo de cualquiera de al menos aproximadamente 2, 4, 8, 9, 13 ó 26 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C, y en la que existe un aumento en la fragmentación del anticuerpo de la composición de menos de aproximadamente el 15% en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento, preferentemente en la que la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml. Preferentemente, el anticuerpo de la composición líquida demuestra un aumento de la fragmentación de menos de aproximadamente el 15%, más preferentemente menos de cualquiera de aproximadamente el 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 % ó 0.5% o igual a aproximadamente el 0%, después del periodo de almacenamiento de cualquiera de aproximadamente 2, 4, 8, 9, 13 ó 26 semanas a una temperatura de cualquiera de aproximadamente 5, 25 ó 40°C, más preferentemente menos de aproximadamente el 14% a aproximadamente 40°C durante aproximadamente 26 semanas, en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración del anticuerpo es de aproximadamente 10 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición liquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 52 semanas a una temperatura de entre 2 y 8°C, preferentemente 5°C, en la que existe una disminución de menos del 20% en la actividad del anticuerpo de la composición. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es cualquiera de aproximadamente 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml.

Preferentemente, existe una disminución en la actividad del anticuerpo de la formulación líquida de menos de aproximadamente el 15%, más preferentemente de menos de aproximadamente el 10%, cuando se almacena durante un periodo de cualquiera de al menos aproximadamente 2, 4, 8, 13, 26 ó 52 semanas, preferentemente además cualquiera de al menos aproximadamente 2, 3, 6, 9, 12, 18 ó 24 meses, a una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C, preferentemente 5°C, en comparación con la misma composición, una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es cualquiera de aproximadamente 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml.

Más preferentemente el anticuerpo de la composición líquida demuestra un aumento de la agregación de menos de aproximadamente el 15%, más preferentemente de menos de aproximadamente el 10%, más preferentemente una disminución de la actividad de menos de aproximadamente el 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , 0.5 ó 0% después del periodo de almacenamiento en comparación con la misma composición, o una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 52 semanas o al menos 24 meses a una temperatura de entre 2 y 8°C, preferentemente 5°C, en la que existe aumento en la agregación del anticuerpo de la composición de menos del 20%. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es cualquiera de aproximadamente 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml.

Preferentemente, existe un aumento en la agregación del anticuerpo de la formulación líquida de menos de aproximadamente el 15%, más preferentemente de menos de cualquiera de aproximadamente el 14, 13, 12, 1 1 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , 0.5% o igual al 0%, cuando se almacena durante un periodo de cualquiera de al menos aproximadamente 2, 4, 8, 13, 26 ó 52 semanas, más preferentemente durante cualquiera de al menos aproximadamente 2, 3, 6, 9, 12, 18 ó 24 meses, a una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C, preferentemente 5°C, en comparación con la misma composición, una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es de cualquiera de aproximadamente 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 52 semanas, o al menos 24 meses, a una temperatura de entre 2 y 8°C, preferentemente 5°C, en la que existe un aumento en la oxidación del anticuerpo de la composición de menos del 20%. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es cualquiera de aproximadamente 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml.

Preferentemente, existe un aumento en la oxidación del anticuerpo de la formulación líquida de menos de aproximadamente el 15%, más preferentemente de menos de cualquiera de aproximadamente el 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , 0.5% o igual al 0%, cuando se almacena durante un periodo de cualquiera de al menos aproximadamente 2, 4, 8, 13, 26 ó 52 semanas, más preferentemente durante cualquiera de al menos aproximadamente 2, 3, 6, 9, 12, 18 ó 24 meses, a una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C, preferentemente 5°C, en comparación con la misma composición, una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es cualquiera de aproximadamente 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición líquida de la invención en la que la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 52 semanas, o al menos 24 meses, a una temperatura de entre 2 y 8°C, preferentemente 5°C, en la que existe un aumento en la fragmentación del anticuerpo de la composición de menos del 20%. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es cualquiera de aproximadamente 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml.

Preferentemente, existe un aumento en la fragmentación del anticuerpo de la formulación liquida de menos de aproximadamente el 15%, más preferentemente de menos de cualquiera de aproximadamente el 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 , 0.5% o igual al 0%, cuando se almacena durante un periodo de cualquiera de al menos aproximadamente 2, 4, 8, 13, 26 ó 52 semanas, más preferentemente durante cualquiera de al menos aproximadamente 2, 3, 6, 9, 12, 18 ó 24 meses, a una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C, preferentemente 5°C, en comparación con la misma composición, una muestra equivalente de idéntica o aproximadamente idéntica composición, antes del periodo de almacenamiento. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es cualquiera de aproximadamente 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml.

De acuerdo con un aspecto adicional preferido de la presente invención, se proporciona una composición liquida de acuerdo con cualquier aspecto o realización anterior, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor en un mamífero. Preferentemente, el dolor se selecciona de uno o más de dolor agudo, dolor crónico, dolor neuropático, inflamatorio, nociceptivo, de etiología mixta, hiperalgesia, alodinia, dolor visceral, dolor somático y dolor de espalda.

De acuerdo con otra realización más de la invención, se proporciona una composición líquida de acuerdo con cualquier aspecto o realización anterior, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor y/o de síntomas del tracto urinario inferior (TUI) asociados con cistitis intersticial y/o síndrome de vejiga dolorosa y/o síndrome de dolor de vejiga.

De acuerdo con otra realización más de la invención, se proporciona una composición líquida de acuerdo con cualquier aspecto o realización anterior, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor y/o de la prostatitis crónica y/o del síndrome de dolor pélvico crónico. De acuerdo con otro aspecto, se proporciona una composición liquida de acuerdo con cualquier aspecto o realización anterior, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor y/o otros síntomas asociados con endometriosis y/o fibroides uterinos.

Preferentemente, el mamífero se selecciona de roedores (tales como ratones, ratas y conejos), mascotas (tales como gatos, perros y caballos), animales de granja (tales como vacas, ovejas, cerdos y cabras), animales deportivos y/o mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates, más preferentemente un ser humano.

De acuerdo con una realización preferida, la composición líquida puede administjarse directamente en el torrente sanguíneo, en músculo, en tejido, en grasa o en un órgano interno. Los medios adecuados para su administración parenteral incluyen por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, ¡ntraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, intraósea, intradérmica y subcutánea. Los dispositivos adecuados para administración parenteral incluyen inyectores con aguja (incluyendo microaguja, microproyecciones, agujas solubles y otras técnicas de formación de microporos), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.

En algunas realizaciones, el patrón de administración del medicamento comprende la administración de una dosis del medicamento una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada diez semanas, una vez cada quince semanas, una vez cada veinte semanas, una vez cada veinticinco semanas o una vez cada veintiséis semanas. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista anti-NGF se administra una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses. Más preferentemente, en el patrón de administración del medicamento comprende la administración de una dosis del medicamento una vez cada ocho semanas.

En algunas realizaciones, el volumen de una dosis es inferior a o igual a aproximadamente 20 mi, aproximadamente 15 mi, aproximadamente 10 mi, aproximadamente 5 mi, aproximadamente 2.5 mi, aproximadamente 1.5 mi, aproximadamente 1.0 mi, aproximadamente 0.75 mi, aproximadamente 0.5 mi, aproximadamente 0.25 mi o aproximadamente 0.01 mi. En algunas realizaciones, el volumen de Una dosis es de aproximadamente 20 mi, aproximadamente 19 mi, aproximadamente 18 mi, aproximadamente 17 mi, aproximadamente 16 mi, aproximadamente 15 mi, aproximadamente 14 mi, aproximadamente 13 mi, aproximadamente 12 mi, aproximadamente 1 1 mi, aproximadamente 10 mi, aproximadamente 9 mi, aproximadamente 8 mi, aproximadamente 7 mi, aproximadamente 6 mi, aproximadamente 5 mi, aproximadamente 4 mi, aproximadamente 3 mi, aproximadamente 2 mi o aproximadamente 1 mi. Como alternativa, de aproximadamente 20.5 mi, aproximadamente 19.5 mi, aproximadamente 18.5 mi, aproximadamente 17.5 mi, aproximadamente 16.5 mi, aproximadamente 15.5 mi, aproximadamente 14.5 mi, aproximadamente 13.5 mi, aproximadamente 12.5 mi, aproximadamente 1 1.5 mi, aproximadamente 10.5 mi, aproximadamente 9.5 mi, aproximadamente 8.5 mi, aproximadamente 7.5 mi, aproximadamente 6.5 mi, aproximadamente 5.5 mi, aproximadamente 4.5 mi, aproximadamente 3.5 mi, aproximadamente 2.5 mi, aproximadamente 1.5 mi o aproximadamente 0.5. Como alternativa, de aproximadamente 900 microlitros, aproximadamente 800 microlitros, aproximadamente 700 microlitros, aproximadamente 600 microlitros, aproximadamente 500 microlitros, aproximadamente 400 microlitros, aproximadamente 300 microlitros, aproximadamente 200 microlitros o aproximadamente 100 microlitros, como alternativa, de aproximadamente 950 microlitros, aproximadamente 850 microlitros, aproximadamente 750 microlitros, aproximadamente 650 microlitros, aproximadamente 550 microlitros, aproximadamente 450 microlitros, aproximadamente 350 microlitros, aproximadamente 250 microlitros, aproximadamente 150 microlitros o aproximadamente 50 microlitros. Más preferentemente, el volumen de la dosis es inferior a o igual a aproximadamente 2.5 mi.

De acuerdo con una realización preferida, la concentración de anticuerpo puede variar de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 200 mg/ml. Preferentemente, la concentración de anticuerpo es de aproximadamente 0.5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2.5 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 3.5 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 4.5 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 5.5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 6.5 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 7.5 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 8.5 mg/ml, aproximadamente 9 mg/ml, aproximadamente 9.5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 1 1 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 13 mg/ml, aproximadamente 14 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 16 mg/ml, aproximadamente 17 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml, aproximadamente 23 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 26 mg/ml, aproximadamente 27 mg/ml, aproximadamente 28 mg/ml, aproximadamente 29 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 31 mg/ml, aproximadamente 32 mg/ml, aproximadamente 33 mg/ml, aproximadamente 34 mg/ml, aproximadamente 35 mg/ml, aproximadamente 36 mg/ml, aproximadamente 37 mg/ml, aproximadamente 38 mg/ml, aproximadamente 39 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, aproximadamente 41 mg/ml, aproximadamente 42 mg/ml, aproximadamente 43 mg/ml, aproximadamente 44 mg/ml, aproximadamente 45 mg/ml, aproximadamente 46 mg/ml, aproximadamente 47 mg/ml, aproximadamente 48 mg/ml, aproximadamente 49 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 51 mg/ml, aproximadamente 52 mg/ml, aproximadamente 53 mg/ml, aproximadamente 54 mg/ml, aproximadamente 55 mg/ml, aproximadamente 56 mg/ml, aproximadamente 57 mg/ml, aproximadamente 58 mg/ml, aproximadamente 59 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml o aproximadamente 110 mg/ml. Más preferentemente, la concentración de anticuerpo es inferior a o igual a 50 mg/ml y puede seleccionarse del grupo que comprende aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2.5 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml.

De acuerdo con una realización preferida, la dosis contiene menos de o es igual a aproximadamente 0.5 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 11 mg, aproximadamente 12 mg, aproximadamente 13 mg, aproximadamente 14 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 16 mg, aproximadamente 17 mg, aproximadamente 18 mg, aproximadamente 19 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 21 mg, aproximadamente 22 mg, aproximadamente 23 mg, aproximadamente 24 mg, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 26 mg, aproximadamente 27 mg, aproximadamente 28 mg, aproximadamente 29 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 31 mg, aproximadamente 32 mg, aproximadamente 33 mg, aproximadamente 34 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 36 mg, aproximadamente 37 mg, aproximadamente 38 mg, aproximadamente 39 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 41 mg, aproximadamente 42 mg, aproximadamente 43 mg, aproximadamente 44 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 46 mg, aproximadamente 47 mg, aproximadamente 48 mg, aproximadamente 49 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 51 mg, aproximadamente 52 mg, aproximadamente 53 mg, aproximadamente 54 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 56 mg, aproximadamente 57 mg, aproximadamente 58 mg, aproximadamente 59 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 100 mg o aproximadamente 110 mg de anticuerpo. Más preferentemente la dosis contiene menos de o es igual a aproximadamente 50 mg de anticuerpo.

De acuerdo con una realización preferida, la dosis contiene una cantidad de anticuerpo que es de aproximadamente 1 Mg kg, aproximadamente 10 µg/kg, aproximadamente 20 g/kg, aproximadamente 25 µg kg) aproximadamente 50 µg/kg, aproximadamente 100 µg kgI aproximadamente 200 µg/kg, aproximadamente 250 µg/kg, aproximadamente 500 M9/k9. aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 1 1 mg/kg (de masa del mamífero al que se va a administrar la dosis). Más preferentemente, la dosis contiene aproximadamente 20 g/kg, aproximadamente 25 Mg/kg, aproximadamente 50 Mg/kg, aproximadamente 100 Mg/kg, aproximadamente 200 Mg/kg, aproximadamente 250 g kg, 1 mg/kg o aproximadamente 2 mg/kg.

Los regímenes de dosificación pueden depender del patrón de declive farmacocinético que desee conseguir el médico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se contempla una dosificación de una-cuatro veces por semana. Puede usarse una dosificación aún menos frecuente. En algunas realizaciones, la dosis se administra una vez cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas, cada 10 semanas, cada 15 semanas, cada 20 semanas, cada 25 semanas o más tiempo. En algunas realizaciones, la dosis se administra 1 vez al mes, cada 2 meses, cada 3 meses, cada 4 meses, cada 5 meses, cada 6 meses o más tiempo. Más preferentemente, la dosis se administra una vez cada ocho semanas. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación puede variar con el tiempo.

Para los fines de la presente invención, la dosificación apropiada del medicamento dependerá del anticuerpo empleado, del tipo y gravedad del dolor a tratar, de si el agente se administra con fines terapéuticos o preventivos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al agente, y del juicio del médico adjunto. Típicamente, el clínico administrará el medicamento hasta que se alcance una dosificación que consiga el resultado deseado. Las dosificaciones pueden determinarse empíricamente, por ejemplo, se administra a individuos dosificaciones crecientes para evaluar la eficacia del medicamento, puede seguirse un indicador de dolor, tal como un cambio en una escala de calificación numérica del dolor (ECN).

La dosis y/o frecuencia pueden variar con el transcurso del tratamiento. Consideraciones empíricas tales como la semivida del anticuerpo contribuirán generalmente a la determinación de la dosificación. La frecuencia de dosificación puede determinarse y ajustarse con el transcurso de la terapia y, generalmente, pero no necesariamente, se basa en el tratamiento y/o supresión y/o mejoría y/o retraso del dolor. En algunos individuos, puede ser necesaria más de una dosis. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse con el transcurso de la terapia. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más tiempo, dependiendo del dolor y de su gravedad, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión de síntomas deseada o hasta que se consiguen niveles terapéuticos suficientes para reducir el dolor.

La administración de un medicamento que comprende la composición líquida puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, de si el propósito de al administración es terapéutico o profiláctico y de otros factores conocidos por los expertos en la materia. La administración del medicamento que comprende la composición liquida puede ser esencialmente continua a lo largo de un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, antes, durante o después del desarrollo del dolor.

Preferentemente, la administración de la dosis es una administración parenteral, preferentemente seleccionada de intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, intraósea, intradérmica y subcutánea. Preferentemente, el medicamento está en una forma liquida estéril de dosificación unitaria para su administración parenteral.

La eficacia del tratamiento puede evaluarse por control del alivio del dolor. El alivio del dolor puede caracterizarse por el curso de tiempo de alivio. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se observa alivio en aproximadamente 24 horas después de la administración. En otras realizaciones, se observa alivio en aproximadamente 36, 48, 60, 72 horas o 4 días después de la administración. En algunas realizaciones, se disminuye la frecuencia y/o intensidad del dolor y/o se aumenta la calidad de vida de aquellos que padecen dolor. En algunas realizaciones, se proporciona alivio del dolor por una duración de al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 21 días, al menos aproximadamente 28 días, al menos aproximadamente 35 días, al menos aproximadamente 42 días, al menos aproximadamente 49 días, al menos aproximadamente 56 días, al menos aproximadamente 63 días, al menos aproximadamente 70 días, al menos aproximadamente 77 días, al menos aproximadamente 84 días, al menos aproximadamente 180 días o más tiempo después de una sola dois del medicamento.

Combinaciones La composición líquida de acuerdo con cualquier aspecto o realización puede combinarse provechosamente con otro compuesto farmacológicamente activo, o con dos o más compuestos farmacológicamente activos distintos, particularmente en el tratamiento del dolor en un mamífero, y puede administrarse simultáneamente, de forma secuencial o por separado en combinación con uno o más agentes seleccionados de: (i) un analgésico opioide, por ejemplo, morfina, heroína, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanilo, cocaína, codeína, dihidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina o pentazocina; (ii) un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), por ejemplo, aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufén, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina o zomepiraco, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (iii) un sedante barbitúrico, por ejemplo, amobarbital, aprobarbital, butabarbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metohexital, pentobarbital, fenobartital, secobarbital, talbutal, teamilal o tiopental o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (iv) una benzodiazepina que tiene una acción sedante, por ejemplo, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam o triazolam, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (v) un antagonista de Hi que tiene una acción sedante, por ejemplo, difenhidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina o clorciclizina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (vi) un sedante tal como glutetimida, meprobamato, metacualona o dicloralfenazona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (vii) un relajante del músculo esquelético, por ejemplo, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol u orfrenadina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (viii) un antagonista de receptor de NMDA, por ejemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidroxi-A/-metilmorfinano) o su metabolito dextrorfano ((+)-3-hidroxi-/V-metilmorfinano), ketamina, memantina, pirroloquinolina quinona o ácido cis-4-(fosfonometil)-2-piperidinecarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (ix) un alfa-adrenérgico, por ejemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina o 4-amino-6,7-dimetoxi-2-(5-metanesulfonamido-1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil)quinazolina; (x) un antidepresivo tricíclico, por ejemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina o nortriptilina; (xi) un anticonvulsionante, por ejemplo, carbamazepina o valproato; (xii) un antagonista de taquiquinina (NK), particularmente un antagonista de NK-3, NK-2 o NK-1 , por ejemplo, (aR,9f?)-7-[3,5-bis(trifluorometil)bencil]-8,9, 10,11 -tetrahidro-9-metil-5-(4-metilfenil)-7H-[1 ,4]diazocino[2,1-g][1 ,7]naftridin-6-13-diona (TAK-637), 5-[[(2f?,3S)-2-[( )-1-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)-4-morfolinil]metil]-1 ,2-dihidro-3H-1 (2,4-triazol-3-ona (MK-869), lanepitant, dapitant o 3-l[2-metox¡-5-(trifluorometoxi)fenil]metilamino]-2-fenil-piperidina (2S.3S); (xiii) un antagonista muscarínico, por ejemplo, oxibutina, tolterodina, propiverina, cloruro de tropsio o darifenacina; (xiv) un inhibidor de COX-2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib o valdecoxib; (xv) un inhibidor de COX no selectivo (preferentemente con protección Gl), por ejemplo, nitroflurbiprofeno (HCT-1026); (xvi) un analgésico de alquitrán de hulla, en particular paracetamol; (xvü) un neuroléptico tal como droperidol; (xvüi) un agonista (por ejemplo, resinferatoxina) o antagonista (por ejemplo, capsazepina) del receptor vaniloide; (xix) un beta-adrenérgico tal como propranolol; (xx) un anestésico local, tal como mexiletina; (xxi) un corticosteroide, tal como dexametasona (xxii) un agonista o antagonista del receptor de serotonina; (xxiii) un analgésico colinérgico (nicotínico); (xxiv) Tramadol (marca comercial); (xxv) un inhibidor de PDEV, tal como sildenafilo, vardenafilo o taladafilo; (xxvi) un ligando alfa-2-delta tal como gabapentina o pregabalina; y (xxvii) un canabinoide.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 Resumen de los Datos de % de Agregación (mediante CET) de anticuerpo anti-NGF 50 mg/ml: Estudio de Exploración de Agente de Tonicidad a 40°C.

La figura 2 Resumen de los Datos de % de Fragmentos (mediante ECG reducido) de anticuerpo anti-NGF 50 mg/ml: Estudio de Exploración de Agente de Tonicidad a 40°C.

La figura 3 Resumen de los Datos de % de Agregación (mediante CET) de anticuerpo anti-NGF 22 mg/ml sometido a 15 Ciclos de Congelación-Descongelación.

La figura 4 Datos de % de Agregación (mediante CET) a 5°C durante un Estudio de Estabilidad a Largo Plazo de una formulación de anticuerpo anti-NGF E3 que contiene trehalosa, EDTA, polisorbato 20 en tampón de histidina a pH 6.0 a 2.5, 5, 10, 20 y 50 mg/ml La figura 5 Datos de % de Fragmentación (mediante ECG reducido) a 5°C durante un Estudio de Estabilidad a Largo Plazo de una formulación de anticuerpo anti-NGF E3 que contiene trehalosa, EDTA, polisorbato 20 en tampón de histidina a pH 6.0 a 2.5, 5, 10, 20 y 50 mg/ml.

La figura 6 Datos de % de Oxidación a 5°C durante un Estudio de Estabilidad a Largo Plazo de una formulación de anticuerpo anti-NGF E3 que contiene trehalosa, EDTA, polisorbato 20 en tampón de histidina a pH 6.0 a 2.5, 5, 10, 20 y 50 mg/ml.

Definiciones Como se usan en el presente documento, los términos "formulación" o "composición" en lo que se refieren a un anticuerpo pretenden describir al anticuerpo en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, que comprende al menos un agente de tonicidad, al menos un tampón, al menos un agente quelante, al menos un tensioactivo, en la que el pH es como se ha definido.

La expresión "composición farmacéutica" se refiere a preparaciones que están en una forma tal que permite que la actividad biológica de los principios activos sea eficaz.

Los "excipientes farmacéuticamente aceptables" (vehículos, aditivos) son aquellos que pueden administrarse con seguridad a un sujeto para proporcionar una dosis eficaz del principio activo empleado. El término "excipiente" o "vehículo", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia inerte, que se usa comúnmente como diluyente, vehículo, conservante, aglutinante o agente estabilizante para fármacos. Como se usa en el presente documento, el término "diluyente" se refiere a un disolvente farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para su administración a un ser humano) y que es útil para la preparación de las formulaciones líquidas del presente documento. Los diluyentes ejemplares incluyen, pero sin limitación, agua estéril y agua bacteriostática para inyección (ABPI).

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto o a una porción de unión a antígeno que compite con el anticuerpo intacto por una unión específica. Véase, en general, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989). Pueden producirse porciones de unión a antígeno mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. En algunas realizaciones, las porciones de unión a antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, y fragmentos de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de un anticuerpo que es suficiente para conferir una unión a antigeno específica al polipéptido. Del extremo N-terminal al C-terminal, ambos dominios variables de cadena pesada y ligera maduros comprenden las regiones FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) o Chothia y col., Nature 342: 878-883 (1989). Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" incluye proteínas artificiales o nativas, fragmentos proteicos y análogos polipeptídicos de una secuencia proteica. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.

Como se usa en el presente documento, un fragmento Fd se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios VH y CH1 ; un fragmento Fv consiste en los dominios V-? y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward y col., Nature 341: 544-546 (1989)) consiste en un dominio VH.

La expresión "o una porción de unión a antigeno del mismo", cuando se usa con el término "anticuerpo", se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. En algunas realizaciones, los fragmentos tienen al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos tienen al menos 14, al menos 20, al menos 50 o al menos 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpo homogénea en la que el anticuerpo monoclonal está compuesto por aminoácidos (de origen natural y de origen no natural) que están implicados en la unión selectiva de un antigeno. Una población de anticuerpos monoclonales es altamente específica, estando dirigida contra un solo sitio antigénico. La expresión "anticuerpo monoclonal" incluye no sólo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadena sencilla (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad necesaria y la capacidad para unirse a un antígeno. No pretende limitarse con respecto a la fuente del anticuerpo o a la forma en la que se prepara (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fago, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.).

Un anticuerpo de cadena sencilla (scFc) es un anticuerpo en el que regiones VL y VH se emparejan para formar una molécula monovalente por medio de un engarce sintético que permite que se preparen como una sola cadena proteica (Bird y col Science, 242: 423-426 (1988) y Huston y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)).

Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que se expresan dominios VH y VL en una sola cadena polipeptídica, pero usando un engarce que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.

Los "anticuerpos quiméricos" se refieren a aquellos anticuerpos en los que una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras es homologa a secuencias correspondientes en anticuerpo derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase particular, mientras que el segmento restante de las cadenas es homólogo a secuencias correspondientes en otra. Típicamente, en estos anticuerpos quiméricos, la región variable de las cadenas tanto pesada como ligera mimetiza las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las porciones constantes son homologas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra. Una clara ventaja de dichas formas quiméricas es que, por ejemplo, las regiones variables pueden obtenerse convenientemente de fuentes actualmente conocidas usando hibridomas o células B fácilmente disponibles de organismos huésped no humanos en combinación con regiones constantes obtenidas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Aunque la región variable tiene la ventaja de facilidad de preparación y la especificidad no se ve afectada por su fuente, al ser humana la región constante es menos probable que genere una respuesta inmune de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que la que generaría la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, en solitario o en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera consisten cada una en cuatro regiones flanqueantes (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antigeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar CDR: (1 ) una estrategia basada en la variabilidad de secuencia cruzada entre especies (es decir, Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) una estrategia basada en estudios cristalográficos de complejos de antígeno-anticuerpo (Chothia y col. (1989) Nature 342: 877; Al-lazikani y col (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Como se usa en el presente documento, una CDR puede referirse a CDR definidas mediante cualquier estrategia o mediante una combinación de ambas estrategias.

Una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, en solitario o en combinación.

Como se usan en el presente documento, los términos ?3", "3E" y "anticuerpo E3" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera mostradas en las SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 (Figuras 1A y 1 B del documento WO2004/058184), respectivamente. La generación y la caracterización de E3 se describe en los Ejemplos del documento WO2004/058184, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. En algunas realizaciones, el término "E3" se refiere a una inmunoglobulina codificada por (a) un polinucleótido que codifica la cadena ligera de E3 que tiene un número de depósito de la ATCC No. PTA-4893 o ATCC No. PTA-4894 y (b) un polinucleótido que codifica la cadena pesada de E3 que tiene un número de depósito de la ATCC N° PTA-4895.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "anticuerpo aislado" o "anticuerpo purificado" se refieren a un anticuerpo que, en virtud de su origen o fuente de obtención, tiene de una a cuatro de las siguientes: (1) no está asociado con los componentes asociados de forma natural que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza.

Un anticuerpo es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente del 60 al 75% de una muestra muestra una sola especie de anticuerpo. Un anticuerpo sustancialmente puro puede comprender típicamente aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80% o 90% p/p de una muestra de anticuerpo, más habitualmente aproximadamente el 95%, y preferentemente tendrá una pureza superior al 99%. La pureza u homogeneidad del anticuerpo pueden ensayarse por varios medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacriiamida o HPLC.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humano" pretende incluir anticuerpos que tienen regiones constantes y variables derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Esta definición de anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena ligera humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos aminoacídicos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica in vitro, o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR obtenidas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tales como ratón, se hayan injertado en secuencias flanqueantes humanas.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo "humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos), que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Preferentemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región flanqueante (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los restos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR o secuencias flanqueantes importadas, pero que se incluyen para retinar adicionalmente y optimizar el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de un dominio o región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente de una inmunoglobulina humana. Se prefieren anticuerpos que tienen regiones Fe modificadas como se describen en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (CDR L1 , CDR L2, CDR L3, CDR H1 , CDR H2 o CDR H3) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.

Hay cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estas son: (1) determinar el nucleótido y la secuencia de aminoácidos esperada de los dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo de partida, (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región flanqueante de anticuerpo usar durante el procedimiento de humanización, (3) las metodologías/técnicas de humanización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos No. 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101 ; 5.693.761 ; 5.693.762; 5.585.089; y 6.180.370.

Se han descrito varias moléculas de anticuerpo "humanizadas" que comprenden sitios de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor o de roedor modificadas, y sus regiones determinantes de complementariedad asociadas (CDR) fusionadas a dominios constantes humanos. Véase, por ejemplo, Winter y col. Nature 349: 293-299 (1991), Lobuglio y col. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224 (1989), Shaw y col. J Immunol. 138: 4534-4538 (1987), y Brown y col. Cáncer Res. 47: 3577-3583 (1987). Otras referencias describen CDR de roedor injertadas en una región flanqueante (FR) de soporte humana antes de la fusión con un domino constante de anticuerpo humano apropiado. Véase, por ejemplo, Riechmann y col. Nature 332: 323-327 (1988), Verhoeyen y col. Science 239: 1534-1536 (1988), y Jones y col. Nature 321 : 522-525 (1986). Otra referencia describe CDR de roedor soportadas por regiones flanqueantes de roedor revestidas recombinantemente. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea N° 0519596. Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia moléculas de anticuerpo de roedor anti-humano que limita la duración y eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos. Por ejemplo, la región constante de anticuerpo puede modificarse por ingeniería genética de modo que sea inmunológicamente inerte (por ejemplo, que no desencadene la lisis por el complemento). Véase, por ejemplo, la Publicación PCT No. WO99/58572; Solicitud de Patente del Reino Unido No. 9809951.8. Otros procedimientos de humanización de anticuerpos que también pueden utilizarse se describen por Daugherty y col., Nucí. Acids Res. 19: 2471 -2476 (1991 ) y en las Patentes de Estados Unidos No. 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671 ; y 6.350.861 ; y en la Publicación PCT No. WO 01/27160.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo recombinante" pretende incluir todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, por ejemplo, los anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante usado para transfectar una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante combinatoria de anticuerpos humanos, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico para genes de inmunoglobulina humanos o anticuerpos preparados, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "es capaz de unirse específicamente", "se une específicamente" o "se une preferentemente" se refieren a cuando un anticuerpo se une a un antígeno con una constante de disociación que es < 1 µ?, preferentemente < 1 nM y, más preferentemente, < 10 pM. Un epítopo que "se une específicamente" o "se une preferentemente" (usadas indistintamente en el presente documento) a un anticuerpo o un polipéptido es una expresión bien entendida en la técnica, y también se conocen bien en la técnica procedimientos para determinar dicha unión específica o preferente. Se dice que una molécula muestra una "unión específica" o "unión preferente" si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular de lo que lo hace con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o preferentemente a un epítopo de NGF es un anticuerpo que se une a este epitopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otros epítopos de NGF o epitopos que no sean de NGF. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específicamente o preferentemente a una primera diana puede o no unirse específicamente o preferentemente a una segunda diana. Como tal, una "unión especifica" o "unión preferente" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) una unión exclusiva.

Como se usa en el presente documento, una unión "inmunoespecífica" de anticuerpos se refiere a la interacción de unión específica de antígeno que se produce entre el sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo y el antígeno específico reconocido por ese anticuerpo (es decir, el anticuerpo reacciona con la proteína en un ELISA u otro inmunoensayo y no reacciona de forma detectable con proteínas no relacionadas).

El término "competir", como se usa en el presente documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de una forma lo bastante similar a la unión de un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de modo que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo afín se disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en la que la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también se disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo puede ser, pero no tiene por qué ser el caso. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que el segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando afín, ya sea en el mismo, mayor o menor grado, se dice que los anticuerpos presentan "competición cruzada" entre sí por la unión de su epítopo o epítopos respectivos. Tanto los anticuerpos de competición como los de competición cruzada se incluyen en la presente invención. Independientemente del mecanismo por el que se produzca dicha competición o competición cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común o porción del mismo), el experto apreciará, basándose en los contenidos proporcionados en el presente documento, que dichos anticuerpos de competición y/o competición cruzada se incluyen y pueden ser útiles para los procedimientos desvelados en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "factor de crecimiento nervioso" y "NGF" se refieren al factor de crecimiento nervioso y a variantes del mismo que conservan al menos parte de la actividad biológica del NGF. Como se usa en el presente documento, el NGF incluye todas las especies de mamífero de NGF de secuencia nativa, incluyendo ser humano, canino, felino, equino o bovino.

El "receptor de NGF" se refiere a un polipéptido que se une por o se activa por NGF. Los receptores de NGF incluyen el receptor TrkA y el receptor p75 de cualquier especie de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, ser humano, canino, felino, equino, primate o bovino.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo anti-NGF" (denominado indistintamente "anticuerpo antagonista anti-NGF") se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a NGF e inhibir, bloquear, antagonizar, suprimir o reducir la actividad biológica de NGF y/o una ruta o rutas aguas abajo mediadas por la señalización de NGF. En algunas realizaciones, la expresión "anticuerpo antagonista anti-NGF" incluye todos los términos, títulos y estados funcionales identificados anteriormente y características por las que el propio NGF, una actividad biológica de NGF (incluyendo, pero sin limitación, su capacidad para mediar cualquier aspecto del dolor postquirúrgico) o las consecuencias de la actividad biológica, se anulan, disminuyen o neutralizan sustancialmente en cualquier grado significativo. En algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista anti-NGF se une a NGF e impide la dimerización dé NGF y/o la unión a un receptor de NGF (tal como p75 y/o trkA). En otras realizaciones, un anticuerpo anti-NGF se une a NGF e impide la dimerización del receptor trkA y/o la autofosforilación de trkA. Se proporcionan en el presente documento ejemplos de anticuerpos antagonistas anti-NGF.

El término "identidad" se refiere al porcentaje de "identidad" de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico. El porcentaje de identidad se determina generalmente por alineamiento de las secuencias con el fin de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la primera secuencia para un mejor alineamiento con la segunda secuencia) y comparación de los restos aminoacidicos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. El "mejor alineamiento" es un alineamiento de dos secuencias que da como resultado el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina por comparación del número de restos aminoacidicos o nucleótidos idénticos dentro de las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100).

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático conocido por los expertos en la materia. Un ejemplo de un algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, y col (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 han incorporado dicho algoritmo. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos en BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener J secuencias de nucleótidos homologas a una molécula de ácido nucleico de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas en BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una molécula proteica de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse BLAST con huecos como se describe en Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Como alternativa, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterativa que detecte relaciones distantes entre moléculas (ídem). Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST con Huecos y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG ha incorporado dicho logaritmo. Otros algoritmos para análisis de secuencia conocidos en la técnica incluyen ADVANCE y ADAM, como se describe en Torellis y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5; y FASTA, descrito en Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 2444-8. Dentro de FASTA, la ktup es una opción de control que ajusta la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios para conseguir el resultado terapéutico deseado, que en el contexto de anticuerpos anti-NGF incluye el tratamiento o la prevención profiláctica de la afección patológica diana, por ejemplo, la inflamación o el dolor. Debe señalarse que los valores de dosificación pueden variar con la gravedad de la afección a aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deberían ajustarse con el tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el juicio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento son solamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. Así mismo, una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para generar una respuesta deseada en el individuo y la vía de administración deseada de la formulación de anticuerpo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo pese menos que los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas preventivas o profilácticas, en el que el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir la gravedad) de la afección patológica diana, por ejemplo el dolor. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya presentan la afección, así como los propensos a presentar la afección o aquellos en los que debe prevenirse la afección. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" es una estrategia para obtener resultados clínicos deseados o beneficiosos incluyendo, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: incluyendo disminución de la gravedad, alivio de uno o más síntomas asociados con el dolor, incluyendo cualquier aspecto del dolor (tal como acortamiento de la duración del dolor, reducción de la sensibilidad al dolor o de la sensación de dolor).

Una "cantidad eficaz" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos tales como alivio o reducción de la afección patológica diana, por ejemplo, sensación de dolor. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de la presente invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para tratar, mejorar, reducir la intensidad de la afección patológica diana, por ejemplo, la inflamación o el dolor. En algunas realizaciones, la "cantidad eficaz" puede reducir el dolor en posición de descanso (dolor en reposo) o dolor inducido mecánicamente (incluyendo dolor después del movimiento), o ambos, y puede administrarse antes, durante o después del estimulo doloroso. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no alcanzarse junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, una "cantidad eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes distintos, puede conseguirse o se consigue un resultado deseable.

El "dolor", como se usa en el presente documento, se refiere a dolor de cualquier etiología, incluyendo dolor agudo y crónico, y cualquier dolor con un componente inflamatorio. Como se usa en el presente documento, el término "dolor" incluye nocicepción y sensación de dolor, y el dolor puede evaluarse objetivamente y subjetivamente, usando puntuaciones del dolor y otros procedimientos bien conocidos en la técnica. El dolor puede ser dolor primario o secundario, como se sabe bien en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" para los fines del tratamiento incluye cualquier sujeto y preferentemente es un sujeto que requiere el tratamiento de la afección patológica diana, por ejemplo, la inflamación o el dolor. Para los fines de la prevención, el sujeto es cualquier sujeto y, preferentemente, es un sujeto en riesgo de o predispuesto a desarrollar la afección patológica diana, por ejemplo, la inflamación o el dolor. El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos, por ejemplo, procariotas y eucariotas. Los ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo, seres humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas y animales transgénicos no humanos. En realizaciones específicas de la invención, el sujeto es un ser humano.

Cuando se introducen elementos de la presente invención o de la realización o realizaciones preferidas de la misma, los artículos "un", "uno/a", "el/la" y "dicho/a" pretenden significar que hay uno o más elementos. Los términos "que comprende" "comprender", "comprende", "que incluye" y "que tiene" pretenden ser incluyentes y significar que puede haber elementos adicionales distintos de los elementos enumerados.

Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" o "ácido nucleico", usados indistintamente en el presente documento, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos, o a una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y pueden ser formas monocatenarias y bicatenarias. Una secuencia "polinucleotídica" o "de ácido nucleico" incluye su complementaria a menos que se especifique otra cosa. Como se usa en el presente documento, la expresión "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" se refiere a un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o a alguna combinación de los mismos que, en virtud de su origen o fuente de procedencia, el polinucleótido aislado tiene de uno a tres de los siguientes: (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido con el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente a un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza o (3) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia de mayor tamaño.

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente quelante" es un excipiente que puede formar al menos un enlace (por ejemplo, covalente, iónico o de otro tipo) con un ión metálico. Un agente quelante es típicamente un ligando multidentado que puede usarse en composiciones liquidas como estabilizante para formar complejos con especies que, de otro modo, podrían promover la inestabilidad.

Como se usa en el presente documento, el término "tampón" se refiere a una composición añadida que permite que una formulación líquida de anticuerpo resista cambios en el pH, típicamente por acción de sus componentes conjugados con ácidos-bases. Cuando se hace referencia a una concentración de tampón, se pretende que la concentración indicada represente la concentración molar de la forma de base libre o ácido libre del tampón.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "agente de tonicidad" o "tonificante" se refieren a un excipiente que puede ajusfar la presión osmótica de una formulación liquida de anticuerpo. En ciertas realizaciones, el agente de tonicidad puede ajusfar la presión osmótica de una formulación liquida de anticuerpo a isotónica, de modo que la formulación de anticuerpo sea fisiológicamente compatible con las células del tejido corporal del sujeto. En otras realizaciones más, el "agente de tonicidad" puede contribuir a una mejora en la estabilidad de los anticuerpos descritos en el presente documento. Una formulación "isotónica" es una que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Generalmente las formulaciones isotónicas tienen una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. El término "hipotónico" describe una formulación con una presión osmótica por debajo de la de la sangre humana. De forma correspondiente, el término "hipertónico" se usa para describir una formulación con una presión osmótica por encima de la de la sangre humana. La isotonicidad puede medirse usando un osmómetro del tipo de presión de vapor o de punto de congelación, por ejemplo. El agente de tonicidad puede estar en forma enantiomérica (por ejemplo, enantiomero L o D) o forma racémica; isómeros tales como alfa o beta, incluyendo alfa, alfa; o beta, beta; o alfa, beta; o beta, alfa; una forma de base libre o ácido libre; una forma hidratada (por ejemplo, monohidrato) o una forma anhidra.

Como se usa en el presente documento, el término "poliol" se refiere a un excipiente con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azúcares (azúcares reductores y no reductores), alcoholes de azúcares y ácidos de azúcares.

Como se usa en el presente documento, el término "tensioactivo" se refiere a un excipiente que puede alterar la tensión superficial de una formulación líquida de anticuerpo. En ciertas realizaciones, el tensioactivo reduce la tensión superficial de una formulación líquida de anticuerpo. En otras realizaciones más, el "tensioactivo" puede contribuir a una mejora en la estabilidad de cualquier anticuerpo en la formulación. El tensioactivo puede reducir la agregación del anticuerpo formulado y/o minimizar la formación de particulados en la formulación y/o reduce la adsorción. El tensioactivo también puede mejorar la estabilidad del anticuerpo durante y después de un ciclo de congelación/descongelación.

Como se usa en el presente documento, el término "sacárido" se refiere a una clase de moléculas que son derivados de alcoholes polihídricos. Los sacáridos se denominan comúnmente carbohidratos y pueden contener diferentes cantidades de unidades de azúcar (sacárido), por ejemplo, monosacáridos, dísacáridos y polisacáridos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "azúcar reductor" se refiere a uno que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir los iones metálicos o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteínas, y un "azúcar no reductor" es uno que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor.

Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un principio activo, permite que el principio conserve su actividad biológica y no reaccione con el sistema inmune del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Los diluyentes preferidos para su administración parenteral o en aerosol son solución salina tamponada con fosfato o solución salina normal (0.9%). Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan por procedimientos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 8a edición, A. Gennaro, ed., Mack Publíshing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing, 2000).

El término "Koff", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo de antígeno/anticuerpo.

El término "Kd", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción de antígeno-anticuerpo. Un modo para determinar la Kd o la afinidad de unión de anticuerpos a NGF es midiendo la afinidad de unión de fragmentos Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener fragmentos Fab monofuncionales, un anticuerpo (por ejemplo, IgG) puede escindirse con papaína o expresarse de forma recombinante. La afinidad de un fragmento Fab anti-NGF de un anticuerpo puede determinarse por resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial (RPS) BIAcore3000™, BIAcore, INC, Piscaway NJ). Pueden activarse microplacas CM5 con clorhidrato de A/-etil-A/'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiinida (EDC) y AZ-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Puede diluirse NGF humano (o cualquier otro NGF) en acetato sódico 10 mM pH 4.0 e inyectarse sobre la microplaca activada a una concentración de 0.005 mg/ml. Usando un tiempo de flujo variable a través de los canales individuales de la microplaca, pueden conseguirse dos intervalos de densidad de antígeno: 100-200 unidades de respuesta (UR) para estudios cinéticos detallados y 500-600 UR para ensayos de exploración. Se inyectan diluciones seriadas (0.1 -10x KD estimada) de muestras de Fab purificados durante 1 min a 100 microlitros/min y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 h. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE usando un Fab de concentración conocida (según se determinó por análisis de aminoácidos) como patrón. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (koff) cinéticas se obtienen simultáneamente por ajuste de los datos a un modelo de unión de Langmuir 1 :1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando el programa BIAevaluation. Los valores de la constante de disociación en equilibrio (KD) se calcular como koff/kon. Este protocolo es adecuado para su uso en la determinación de la afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier NGF, incluyendo NGF humano, NGF de otro vertebrado (en algunas realizaciones de mamífero) (tal como NGF de ratón, NGF de rata, NGF de primate), asi como para su uso con otras neurotrofinas, tales como las neurotrofinas relacionadas NT3, NT4/5 y/o BDNF.

Los anticuerpos antagonistas anti-NGF para su uso en la invención pueden identificarse o caracterizarse usando procedimientos conocidos en la técnica, por los que se detecta y/o mide la reducción, mejoría o neutralización de una actividad biológica de NGF. Pueden usarse los procedimientos descritos en el documento PCT WO 04/065560. Otro procedimiento, por ejemplo, un ensayo de activación de receptor de quinasa (KIRA), descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5.766.863 y 5.891.650, puede usarse para identificar agentes anti-NGF.

También pueden identificarse anticuerpos antagonistas anti-NGF por incubación de un agente candidato, por ejemplo, un anticuerpo, o anticuerpo anti-NGF, con NGF, y control de una o más de cualquiera de las siguientes características: (a) unión a NGF e inhibición de la actividad biológica de NGF o de rutas aguas abajo mediadas por la función de señalización de NGF; (b) inhibición, bloqueo o disminución de la activación del receptor de NGF (incluyendo dimerización y/o autofosforilación de TrkA); (c) aumento del aclaramiento de NGF; (d) tratamiento o prevención del dolor; (e) inhibición (reducción) de la síntesis, producción o liberación de NGF. La capacidad de un anticuerpo antagonista anti-NGF para bloquear o neutralizar una actividad biológica de NGF también puede evaluarse por control de la capacidad del agente candidato para inhibir la supervivencia mediada por NGF en el bioensayo de supervivencia de ganglios de las raíces dorsales de rata embrionaria, como se describe en Hongo y col., Hybridoma 19: 215-227 (2000).

La "reducción de la incidencia" de dolor se refiere a cualquiera de reducir la gravedad (que puede incluir reducir la necesidad y/o la cantidad de (por ejemplo, exposición a) otros fármacos y/o terapias usados generalmente para estas afecciones, incluyendo, por ejemplo, opiatos), duración y/o frecuencia (incluyendo, por ejemplo, retrasar o aumentar el tiempo hasta el dolor postquirúrgico en un individuo). Como entienden los expertos en la materia, los individuos pueden variar en términos de su respuesta al tratamiento y, como tal, por ejemplo, un "procedimiento de reducción de la incidencia de dolor por artritis reumatoide o dolor por artrosis en un individuo" refleja administrar el anticuerpo antagonista anti-NGF basándose en una esperanza razonable de que dicha administración pueda causar probablemente una reducción en la incidencia en ese individuo particular.

La "mejoría" de un dolor o de uno o más síntomas de un dolor (tal como dolor por artritis reumatoide o dolor por artrosis) se refiere a disminuir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de un dolor en comparación con la no administración de un anticuerpo antagonista anti-NGF. La "mejoría" también incluye el acortamiento o la reducción de la duración de un síntoma.

La "paliación" de un dolor o uno o más síntomas de un dolor (tal como dolor por artritis reumatoide o dolor por artrosis) se refiere a disminuir el grado de una o más manifestaciones clínicas no deseables de dolor postquirúrgico en un individuo o población de individuos tratados con un anticuerpo antagonista anti-NGF de acuerdo con la invención.

Como se usa en el presente documento, el término "retrasar" el desarrollo de dolor se refiere a aplazar, obstaculizar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer la progresión del dolor (tal como dolor postquirúrgico, dolor por artritis reumatoide o dolor por artrosis). Este retraso puede ser de longitudes de tiempo variables, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o de los individuos a tratar. Como es evidente para un experto en la materia, un retraso suficiente o significativo puede, de hecho, incluir la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolle dolor. Un procedimiento que "retrasa" el desarrollo del síntoma es un procedimiento que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en una franja de tiempo dado y/o reduce el grado de los síntomas en una franja de tiempo dado, en comparación con no usar el procedimiento. Dichas comparaciones se basan típicamente en estudios clínicos, usando un número estadísticamente significativo de sujetos.

El "dolor" se entiende que se refiere a una experiencia sensitiva y emocional desagradable asociada con un daño tisular real o potencial o descrita en los términos de dicho daño. El dolor puede dividirse en varias áreas diferentes debido a una fisiopatología diferente, incluyendo estas dolor nociceptivo, inflamatorio, neuropático, etc. Debería señalarse que algunas tipos de dolor tienen múltiples etiologías y, por lo tanto, pueden clasificarse en más de un área, por ejemplo, el dolor de espalda y el dolor por cáncer tienen componentes tanto nociceptivos y neuropáticos.

El "dolor crónico", como se usa en el presente documento, se entiende que significa dolor asociado con un trastorno crónico, es decir, traumatismo, tumor maligno, enfermedad, infección o dolor que persiste más allá de la resolución de dicho trastorno subyacente, o de la cicatrización de una lesión, y que con frecuencia es más intenso de lo que el proceso o trastorno subyacente pronosticaría. El dolor crónico también puede ser un "dolor de etiología mixta", que implique por ejemplo tanto dolor neuropático como nociceptivo y/o dolor inflamatorio y/o dolor por cáncer. Como consecuencia, el dolor crónico es con frecuencia impredecible en su respuesta a la analgesia. El "dolor de mecanismo doble" se entiende que se refiere al dolor que se amplifica y mantiene tanto por sensibilización central como periférica.

El "dolor inflamatorio" se entiende que se refiere al dolor en respuesta a una lesión tisular y al proceso inflamatorio resultante. El dolor inflamatorio puede originarse en un tejido lesionado que experimenta un proceso inflamatorio reactivo que también puede afectar a la función neuronal. El dolor inflamatorio puede implicar la unión de mediadores bioquímicos (PGE2, bradiquinina, citocinas y neuropéptidos) a receptores en neuronas transmisoras de dolor y la alteración de su función, aumentando su excitabilidad y aumentando de este modo la sensación dolorosa. En el término de dolor inflamatorio se incluye el dolor crónico y agudo.

El "dolor de etiología mixta" se entiende que se refiere al dolor que contiene componentes inflamatorios y/o neuropáticos y/o nociceptivos. El "dolor de mecanismo doble" se entiende que se refiere al dolor que se amplifica y mantiene tanto por sensibilización periférica como central.

El "dolor neuropático" se entiende que se refiere al dolor producido por daños en o disfunción de neuronas en el sistema nervioso central o periférico.

El "dolor agudo" y el "dolor inflamatorio agudo" se entiende que se refieren a la respuesta fisiológica normal, predecible y apropiada a un estímulo químico, térmico o mecánico nocivo o a un proceso patológico que amenaza o produce una lesión tisular que conduce a la respuesta de inflamación aguda y dolor inflamatorio agudo, dicho dolor agudo implica con frecuencia un componente de dolor nociceptivo. En general, la intensidad del dolor agudo es proporcional a la intensidad del estímulo y persiste siempre que persista el estímulo o hasta que cicatrice la lesión tisular. El dolor inflamatorio agudo está asociado generalmente con una lesión, procedimientos invasivos, traumatismo, infección, reacción inmune, alergia, hipersensibilidad y enfermedad.

El "dolor nociceptivo" se entiende que significa un dolor que se transmite por nociceptores, causado por estímulos nocivos que señalizan una lesión tisular o una lesión tisular inminente. El dolor nociceptivo implica la transmisión de señales de dolor por neuronas aferentes hasta el asa dorsal de la médula espinal, las neuronas de segundo orden transmiten las señales a los centros superiores. El dolor nociceptivo se resuelve normalmente una vez que se resuelve la afección que lo ha precipitado, característica también del dolor agudo.

La "hiperalgesia" es una sensibilidad extrema al dolor, causada con frecuencia por daños en nociceptores en los tejidos blandos del cuerpo. Puede experimentarse de forma focal, que se asocia típicamente con una lesión, y se divide en dos subtipos: (1) hiperalgesia primaria, es decir, sensibilidad dolorosa que se produce directamente en los tejidos dañados; (2) hiperalgesia secundaria, es decir, sensibilidad dolorosa que se produce en tejidos no dañados circundantes. También puede experimentarse como una forma más difusa, de amplitud corporal. La hiperalgesia puede inducirse por una afección inflamatoria aguda o crónica. Es clave para el desarrollo de dicha hiperalgesia la acción del factor agregante plaquetario (PAF) resultante de dicha afección inflamatoria o de una respuesta alérgica, y que se produce por células inmunes que interaccionan con el sistema nervioso periférico y liberan citocinas y quimiocinas que conducen a dolor. Las afecciones inflamatorias pueden inducir la estimulación de fibras dolorosas en un patrón que concuerda con una forma de amplificación en la médula espinal denominada potenciación a largo plazo, y dicha amplificación en la médula espinal proporciona una vía que produce hiperálgesia.

La "alodinia" es el dolor resultante de estímulos que normalmente no son dolorosos, una respuesta exagerada a estímulos de otro modo no nocivos y que puede ser una alodinia estática o dinámica, es decir, aparecer espontáneamente sin movimiento o con movimiento. La alodinia también puede percibirse en otras áreas distintas a la estimulada; por lo tanto, también puede ser disestésica. Es común a las afecciones inflamatorias, particularmente la inflamación articular.

El "dolor somático" se entiende que se refiere al dolor que se origina en los tejidos profundos o cutáneos, cuando se produce en los tejidos musculoesqueléticos se denomina "dolor somático profundo". El "dolor visceral" se entiende que se refiere al dolor causado por la activación de receptores de dolor resultante de la infiltración, compresión, extensión o estrechamiento de las visceras torácicas, abdominales o pélvicas.

El término "dolor", como se usa en el presente documento, se refiere a dolor de cualquier etología, incluyendo dolor agudo y crónico y cualquier dolor con un componente inflamatorio. Los ejemplos de dolor incluyen dolor postquirúrgico, dolor postoperatorio (incluyendo dolor dental), migraña, cefalea y neuralgia trigeminal, dolor asociado con quemaduras, heridas o cálculos renales, dolor asociado con traumatismo (incluyendo lesión traumática craneal), dolor neuropático, dolor de espalda tal como el dolor crónico de la parte inferior de la espalda, dolor asociado con trastornos musculoesqueléticos tales como artritis reumatoide, dolor asociado con artrosis, espondilitis anquilosante, artropatías seronegativas (no reumatoides), trastornos periarticulares y de reumatismo no articular y dolor asociado con cáncer (incluyendo "dolor intercurrente", y dolor asociado con cáncer terminal y dolor debido a metástasis óseas), neuropatía periférica y neuralgia postherpética, dolor asociado con cistitis intersticial y/o síndrome de vejiga dolorosa y/o síndrome de dolor de vejiga, dolor asociado con prostatitis crónica y/o síndrome de dolor pélvico crónico, dolor asociado con endometriosis y/o fibroides uterinos. Los ejemplos de dolor con un componente inflamatorio (además de algunos de los descritos anteriormente) incluyen dolor reumático, dolor asociado con mucositis y dismenorrea.

El "dolor postquirúrgico" (denominado indistintamente "postincisional" o "dolor posttraumático") se refiere al dolor que surge o se obtiene como resultado de un traumatismo externo tal como un corte, punción, incisión, rotura o herida en un tejido de un individuo (incluyendo el que surge de todos los procedimientos quirúrgicos, ya sean invasivos o no invasivos). Como se usa en el presente documento, el dolor postquirúrgico no incluye el dolor que aparece (surge o se origina) sin un traumatismo físico externo. En algunas realizaciones, el dolor postquirúrgico es un dolor interno o externo (incluyendo periférico) y la herida, corte, traumatismo, rotura o incisión puede suceder accidentalmente (como con una herida traumática) o de forma deliberada (como con una incisión quirúrgica). Como se usa en el presente documento, el "dolor" incluye la nocicepción y la sensación de dolor, y el dolor puede evaluarse objetivamente y subjetivamente usando puntuaciones de dolor y otros procedimientos bien conocidos en la técnica. El dolor postquirúrgico, como se usa en el presente documento, incluye alodinia (es decir, una respuesta aumentada a un estímulo normalmente no nocivo) e hiperalgesia (es decir, una respuesta aumentada a un estimulo normalmente nocivo o desagradable) que, a su vez, puede ser de naturaleza térmica o mecánica (táctil). En algunas realizaciones, el dolor se caracteriza por sensibilidad térmica, sensibilidad mecánica y/o dolor en reposo. En algunas realizaciones, el dolor postquirúrgico comprende dolor inducido mecánicamente o dolor en reposo. En otras realizaciones, el dolor postquirúrgico comprende dolor en reposo.

El dolor puede ser un dolor primario o secundario, como se sabe bien en la técnica.

El dolor asociado con cistitis intersticial y/o síndrome de vejiga dolorosa y/o síndrome de dolor de vejiga puede comprender dolor abdominal inferior (pélvico); dolor de vejiga; dolor suprapúbico; dolor vaginal; dolor en el pene, testículos, escroto y perineo; dolor uretral; dispareunia; dolor, presión o malestar que puede aumentar a medida que se llena la vejiga.

El dolor asociado con prostatitis crónica y/o síndrome de dolor pélvico crónico puede comprender dolor abdominal inferior (pélvico); dolor en hipogastrio; dolor de vejiga; dolor suprapúbico; dolor vaginal; dolor en el pene, testículos, escroto y perineo; dolor uretral; dispareunia; dolor, presión o malestar que puede aumentar a medida que se llena la vejiga; disuria; y dolor eyaculatorio.

Los síntomas del tracto urinario inferior (TUI) pueden comprender tres grupos de síntomas urinarios, que pueden definirse como síntomas del almacenamiento (irritantes), del vaciamiento (obstructivos) y postmicción. Los síntomas del almacenamiento comprenden urgencia, frecuencia, nocturia, incontinencia de urgencia e incontinencia por estrés, que pueden estar asociados con vejiga sobreactiva (OAB) e hiperplasia prostética benigna (HPB). Los síntomas del vaciamiento comprenden vacilación, escaso flujo, intermitencia, esfuerzos y disuria. Los síntomas postmicción comprenden goteo terminal, goteo postvacíamiento y una sensación de vaciamiento incompleto.

El dolor y/u otros síntomas asociados con endometriosís y/o fibroides uterinos pueden comprender dismenorrea; dolor pélvico crónico no menstrual; dispareunia; disquecia; menorragia; dolor abdominal inferior o de espalda; infertilidad y subfertilidad; disuria; hinchazón y dolor en la micción; náuseas, vómitos y/o diarrea. Los síntomas también pueden comprender síntomas relacionados con lesiones endometriósicas o fibroides localizados fuera de la cavidad peritoneal incluyendo, por ejemplo, síndrome de endometriosís torácica manifestado como hemoptisis, neumotorax o hemotórax, y leíomiosís pulmonar manifestada como disnea y masa pulmonar.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ¡lustrar sin limitar la invención. Se hace referencia a los Ejemplos del documento WO2004/058 84 para ¡lustrar los anticuerpos para su uso en la presente invención. El contenido completo del documento WO2004/058 84 se incorpora en el presente documento por referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Producción y purificación de anticuerpo Para la expresión de anticuerpos completos, se clonaron las regiones variables de cadena ligera y pesada en dos vectores de expresión de mamífero (Eb.91 1.E3 o Eb.pur.911.3E para la cadena ligera y Db.911.3E para la cadena pesada; descritos en el presente documento) y se usaron para transfectar, usando lipofectamina, células HEK 293 para su expresión transitoria. Los anticuerpos se purificaron usando proteína A usando procedimientos convencionales.

La generación, producción, purificación y caracterización del anticuerpo anti-NGF E3 se describe en los Ejemplos del documento WO2004/058184, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento por referencia. Se han depositado vectores que incorporan la cadena ligera de E3 y la cadena pesada de E3 en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, Estados Unidos (ATCC): Material N° de Acceso ATCC Fecha de Depósito Eb.911.3E cadena ligera de E3 PTA-4893 8 de enero de 2003 Eb.pur.911.3E cadena ligera de E3 PTA-4894 8 de enero de 2003 Db.911.3E cadena pesada de E3 PTA-4895 8 de enero de 2003 Pueden encontrarse detalles en relación con estos depósitos en el documento WO2004058184, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Se diseñaron y construyeron tres vectores de expresión de mamífero para su uso en la expresión de anticuerpo E3 en células de mamífero.

El vector Db.91 1.3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo E3 y la región constante de lgG2a humana, y es adecuado para la expresión transitoria o estable de la cadena pesada. El Db.91 1.3E consiste en las secuencias de nucleótidos correspondientes a las regiones siguientes: la región promotora de citomegalovirus murino (nucleótidos 1-612); un intrón sintético (nucleótidos 619-1507); la región codificante de DHFR (nucleótidos 707-1267); el péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1525-1602); la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 3E (nucleótidos 1603-1965); la región constante de lgG2a de cadena pesada humana que contiene las mutaciones siguientes: A330P331 a S330S331 (numeración de aminoácidos respecto a la secuencia de lgG2a de tipo silvestre; véase Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624); señal de poliadenilación tardía de SV40 (nucleótidos 2974-3217); región potenciadora de SV40 (nucleótidos 3218- 3463); región de fago f1 (nucleótidos 3551-4006) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 4443-5300). El Db.91 i.3E se depositó en la ATCC el 8 de enero de 2003 y se le asignó el No. de Acceso de la ATCC PTA-4895.

El vector Eb.911.3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 y la región constante de la cadena kappa humana, y es adecuado para la expresión transitoria de la cadena ligera. El Eb.911.3E consiste en las secuencias de nucleótidos correspondientes a las regiones siguientes: la región promotora de citomegalovirus murino (nucleótidos 1-612); intrón EF-1 humano (nucleótidos 619-1142); péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1173-1 150); región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 (nucleótidos 1251-1571 ); región constante de la cadena kappa humana (nucleótidos 1572-1892); señal de poliadenilación tardía de SV40 (nucleótidos 1910-2153); región potenciadora de SV40 (nucleótidos 2154-2399); región de fago f1 (nucleótidos 2487-2942) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 3379-4236). El Eb.91 1.3E se depositó en la ATCC el 8 de enero de 2003 y se le asignó el No. de Acceso de la ATCC PTA-4893.

El vector Eb.pur.911.3E es un vector de expresión que comprende la región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 y la región constante kappa humana y es adecuado para la expresión estable de la cadena ligera. Eb.pur.911.3E consiste en las secuencias de nucleótidos correspondientes a las regiones siguientes: la región promotora de citomegalovirus murino (nucleótidos 1-612); intrón EF-1 humano (nucleótidos 619-1758); región codificante del gen pac (puromicina R) (nucleótidos 739-1235); región 5'UTR de hsp70 humano (nucleótidos 1771-1973); péptido señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1985-2062); región variable de la cadena ligera del anticuerpo E3 (nucleótidos 2063-2383); región constante de la cadena kappa humana (nucleótidos 2384-2704); señal de poliadenilación tardía de SV40 (nucleótidos 2722-2965); región potenciadora de SV40 (nucleótidos 2966-3211); región de fago f1 (nucleótidos 3299-3654) y región codificante de beta lactamasa (AmpR) (nucleótidos 4191-5048). El Eb.pur.911.E3 se depositó en la ATCC el 8 de enero de 2003 y se le asignó el No. de Acceso de la ATCC PTA-4894.

La expresión celular transitoria se realizó de la forma siguiente: células CHO y HEK293T en placas de 150 mm se cotransfectaron de forma transitoria con 25 ug de cada plásmido (es decir, un plásmido que contiene la cadena pesada y un plásmido que contiene la cadena ligera). El ADN se mezcló con 100 ul de lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se dejó que los complejos de ADN-lípido contactasen con las células en medio DMEM/F12 sin suero o antibióticos durante 5 horas. Después de esta incubación, los medios se cambiaron para la expresión a Opti-MEM (Invitrogen) sin ningún aditivo durante dos días. Los sobrenadantes celulares que contenían anticuerpo se recogieron secuencialmente hasta cuatro veces con sustitución de medios posterior. Los sobrenadantes se purificaron por cromatografía de afinidad usando resina de Proteína A MapSelect (Amersham biosciences 17-5199-02). El anticuerpo se unió a la resina de proteína A en glicina 0.3 M, tampón de NaCI 0.6 M a pH 8, después se eluyó con tampón citrato 0.1 M a pH 3. Las fracciones que contenían anticuerpos se neutralizaron inmediatamente con tampón Tris 1 M a pH 8.0. Después, las fracciones de anticuerpo se dializaron y se concentraron en PBS. Los anticuerpos se seleccionaron y se ensayaron de la forma siguiente: Ensayo de Biacore Se determinaron las afinidades de anticuerpos monoclonales y Fab anti-NGF usando el sistema de resonancia de plasmón superficial (RPS) BIAcore3000™ (BIAcore, INC, Piscaway NJ). Se activaron microplacas CM5 con clorhidrato de A/-etil-/V'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiinida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluyó NGF humano en acetato sódico 10 mM pH 4.0 y se inyectó sobre la microplaca activada a una concentración de 0.005 mg/ml. Usando un tiempo de flujo variable a través de los canales individuales de la microplaca, se consiguieron dos intervalos de densidad de antígeno: 100-200 unidades de respuesta (UR) para estudios cinéticos detallados y 500-600 UR para ensayos de exploración. La microplaca se bloqueó con etanolamina. Los estudios de regeneración mostraron que una mezcla de tampón de elución Pierce (Producto No. 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y NaCI 4 M (2:1) eliminaba eficazmente el Fab unido al tiempo que mantenía la actividad del hNGF en la microplaca durante más de 200 inyecciones. Se usó tampón HBS-EP (HEPES 0.01 M, pH 7.4, NaCI 0.15, EDTA 3 mM, Tensioactivo P29 al 0.005%) como tampón de procesamiento para todos los ensayos de BIAcore.

Ensayo de Exploración Se optimizó un ensayo de exploración de BIAcore para determinar la afinidad de clones de Fab de bibliotecas. Se inyectaron los sobrenadantes de lisados de cultivos pequeños a 50 µ?/min durante 2 min. Se usaron tiempos de disociación de 10 a 15 minutos para la determinación de una sola velocidad de disociación exponencial (k0ff) usando el software BIAevaluation. Las muestras que mostraban velocidades de k0ff en el mismo intervalo que el molde usado para crear la biblioteca (clon 8L2-6D5, k0ff 1 x 10" 3 s"1) se inyectaron para su confirmación y se permitieron tiempos de disociación de hasta 45 min para obtener mejores valores de k0ff- Los clones que mostraban valores de koff mejorados (más lentos) se expresaron a gran escala y los parámetros cinéticos completos, la kon y la k0ff, se determinaron sobre proteina purificada. El ensayo era capaz de detectar diferencias en la afinidad que eran de aproximadamente 2 veces o mayores.

Ensayo de determinación de la afinidad Se inyectaron diluciones seriadas (0.1 -10x KD estimada) de muestras de Fab purificados durante 1 min a 100 microlitros/min y se permitieron tiempos de disociación de hasta 2 h. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE usando como patrón un Fab de concentración conocida (según se determinó por análisis de aminoácidos). Se obtuvieron las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (k0ff) cinéticas simultáneamente por ajuste de los datos a un modelo de unión de Langmuir 1 :1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-1 10) usando el programa BIAevaluation. Los valores de la constante de disociación en equilibrio (KD) se calcularon como k0ff/kon- EJEMPLO 2 Análisis de ta m pones y pH Se realizó un estudio para evaluar el efecto de cuatro tampones diferentes sobre la agregación y fragmentación de anticuerpos.

En concreto, se prepararon cuatro formulaciones liquidas que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 y tamponadas con acetato, succinato, histidina o citrato. Después, las formulaciones se almacenaron a 5, 25 y 40°C y se tomaron mediciones de la agregación, fragmentación y oxidación de anticuerpo a las 0,' 4, 9 y 13 semanas.

El procedimiento de fabricación puede resumirse de la forma siguiente: se prepara el tampón, se ajusta al pH y se esteriliza por filtración (véase los cuadros 2.1 y 2.2 para detalles). El anticuerpo se concentra y después se cambia el tampón. El anticuerpo se analiza con UV y después se diluye con el tampón respectivo a 20 mg/ml. Después, la solución de 20 mg/ml se esteriliza por filtración. Finalmente, la solución estéril se rellena, se tapona y se cubre con un sello de aluminio.

Análisis de Agregación: Las formulaciones de anticuerpo del cuadro 2.2 se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40°C durante 0, 4, 9 y 13 semanas.

Cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (CET). La cromatografía de exclusión por tamaño se llevó a cabo usando una columna de gel TSK G3000SWXL-G2000SWXL, fase móvil tampón fosfato sódico 0.2 M a pH 7.0, un caudal de 1 ml/min y detección UV a 214 nm.

Se calcularon los niveles de agregación por integración de las áreas bajo los picos del cromatograma para cada formulación y descripción de las áreas integradas bajo los picos de especies de alto peso molecular como porcentaje del área total de picos. Como puede observarse en el cuadro 2.3, las formulaciones tamponadas con histidina, particularmente a pH 6, mostraban los menores niveles de agregación, seguidas del acetato, succinato, y después formulaciones tamponadas con citrato, en ese orden.

Análisis de Fragmentación: Las formulaciones de anticuerpo del cuadro 2.2 se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40°C durante 0, 4, 9 y 13 semanas.

Cada formulación se analizó también para determinar la fragmentación usando electroforesis capilar en gel reducido (ECGr). Las proteínas se despliegan (desnaturalizan) y se convierten en estructuras "tipo bacilo" después de la escisión de sus enlaces disulfuro en ECG-red. La proteina "reducida" se separa en sus cadenas pesada y ligera permitiendo su cuantificación junto con especies fragmentadas. La ECG reducido se considera un procedimiento fiable para cuantificar el porcentaje de fragmentos (% impurezas). El porcentaje de fragmentación se midió a los tiempos pertinentes para cada una de las formulaciones. Los niveles de fragmentación se calcularon como porcentaje del volumen total de bandas. Como puede observarse en el cuadro 2.4, las formulaciones tamponadas con histidina, particularmente a pH 6, mostraban los menores niveles de fragmentación.

Análisis de oxidación: Se midieron los niveles de oxidación de restos de metionina en las posiciones aminoacídicas X e Y en el anticuerpo anti-NGF E3 mediante un procedimiento de mapeo de Lisina-C después del almacenamiento a 5, 25 y 40°C durante 0, 4, 9 y 13 semanas. Las muestras de cada formulación ensayada se digirieron después con enzima Lyc-C en tampón tris a pH 8.0 en condiciones convencionales y se analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. La separación se logró usando una columna analítica de Proteína C4 Grace Vydae con elución en gradiente de TFA al 0.1 % en agua y TFA al 0.085% en acetonitrilo. Se registró el porcentaje de oxidación de aminoácidos de metionina en el anticuerpo anti-NGF E3.

Los resultados del cuadro 2.5 indican que el porcentaje de oxidación de la formulación de citrato es el mayor.

CUADRO 2.1 Cuadro de preparación de tampón: resumen de las cantidades de componentes de tampón registradas a partir de los registros de fabricación para preparar 250 mi de tampón CUADRO 2.2 Cuadro de matriz de formulación: CUADRO 2.3 Resumen de los datos de % de agregación (mediante CEO de anticuerpo anti-NGF 20 mg/ml: estudio de exploración de tampón y pH Condición 5e C 25°C 41 )°C Semanas 0 13 0 9 13 0 4 9 13 N° Lote Acetato pH 5.0 1.6 1.8 1.6 2.2 2.5 1.6 3.2 5.1 8.1 Acetato pH 5.5 1.8 2.1 1.8 2.7 3.0 1.8 3.4 4.9 7.1 Acetato pH 6.0 2.0 2.4 2.0 3.2 3.3 2.0 4.3 5.5 7.0 Acetato pH 6.5 2.0 2.5 2.0 3.5 3.9 2.0 4.4 5.8 7.0 Histidina pH 5.0 1.6 1.8 1.6 2.0 2.3 1.6 2.7 3.9 7.0 Histidina pH 5.5 1.6 1.8 1.6 2.2 2.4 1.6 2.7 3.4 5.1 Histidina pH 6.0 1.8 2.1 1.8 2.5 2.7 1.8 3.0 3.5 4.8 Histidina pH 6.5 1.9 2.2 1.9 2.8 3.1 1.9 3.4 4.2 5.6 Citrato pH 5.0 1.6 1.9 1.6 2.4 2.8 1.6 4.6 8.5 15.0 Citrato pH 5.5 1.8 2.2 1.8 3.0 3.3 1.8 4.9 8.7 12.2 Citrato pH 6.0 2.0 2.5 2.0 3.3 3.7 2.0 4.4 6.5 8.4 Citrato pH 6.5 2.1 2.8 2.1 3.7 4.2 2.1 4.8 6.5 8.4 Succinato pH 5.0 1.6 1.9 1.6 2.3 2.7 1.6 3.5 6.1 11.2 Succinato pH 5.5 2.0 2.2 2.0 2.8 3.2 2.0 3.9 5.7 8.4 Succinato pH 6.0 1.8 2.5 1.8 3.1 3.6 1.8 4.3 5.8 7.8 Succinato pH 6.5 2.2 2.8 2.2 3.7 4.1 2.2 4.8 5.9 7.5 CUADRO 2.4 Resumen de los datos de % de fragmentación (mediante ECG reducido de anticuerpo anti-NGF 20 mg/ml: estudio de exploración de tampón y pH Condición 5 C 25 C 40 C Semanas 0 13 0 9 13 0 4 9 13 N° Lote Acetato pH 5.0 1.1 1.1 1.1 1,4 1.0 1.1 4.2 7.0 10.3 Acetato pH 5.5 1.1 1.0 1.1 1.0 1.7 1.1 4.4 5.2 9.4 Acetato pH 6.0 1.1 1.1 1.1 1.4 1.3 1.1 3.6 5.9 7.2 Acetato pH 6.5 1.1 1.2 1.1 1.0 2.2 1.1 4.1 6.4 8.1 Histidina pH 5.0 1.1 1.0 1.1 1.0 1.8 1.1 5.8 7.5 11.2 Histidina pH 5.5 1.1 1.1 1.1 0.9 1.5 1.1 4.3 6.4 7.9 Histidina pH 6.0 1.1 1.0 1.1 1.6 1.5 1.1 3.1 3.8 6.1 Histidina pH 6.5 1.0 1.2 1.0 1.6 2.2 1.0 3.7 6.1 9.7 Citrato pH 5.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.1 1.0 5.4 9.1 14.5 Citrato pH 5.5 1.0 1.1 1.0 1.1 1.4 1.0 4.6 7.6 1 1.5 Citrato pH 6.0 1.1 1.6 1.1 2.0 1.6 1.1 3.7 6.9 10.6 Citrato pH 6.5 1.5 1.0 1.5 1.3 9.1 1.5 3.4 8.2 10.9 Succinato pH 5.0 1.2 1.0 1.2 2.1 7.9 1.2 5.4 8.8 13.1 Succinato pH 5.5 1.2 1.5 1.2 0.9 0.9 1.2 3.1 5.8 9.0 Succinato pH 6.0 1.2 1.0 1.2 1.3 6.8 1.2 3 5.0 8.0 Succinato pH 6.5 1.2 1 .1 1.2 1.5 11.8 1.2 3.5 7.2 8.0 CUADRO 2.5 Resumen de los datos de % de oxidación de anticuerpo anti-NGF 20 mg/ml: estudio de exploración de tampén y pH EJEMPLO 3 Análisis de agentes de tonicidad, trehalosa frente a sacarosa frente a sorbitol Se realizó un estudio para comparar el efecto de agentes de tonicidad, en particular trehalosa, sacarosa y sorbitol, sobre la estabilidad de formulaciones de anticuerpo anti-NGF E3.

En concreto, se prepararon tres formulaciones liquidas que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 y trehalosa, sacarosa o sorbitol como se enumeran en el cuadro 3.1. Las formulaciones se almacenaron después a 5, 25 y 40°C y se tomaron mediciones de la agregación, fragmentación y oxidación de anticuerpo a las 2, 4, 8, 13 y 26 semanas.

El procedimiento de fabricación para formulaciones en el cuadro 3.1 puede resumirse de la forma siguiente: se prepara el tampón, se ajusta el pH y se esteriliza por filtración (véase el cuadro 3.1 para detalles). Se preparan soluciones madre de excipientes y se esterilizan por filtración. El anticuerpo se concentra y después se cambia el tampón. El anticuerpo concentrado se analiza con UV y después se diluye con el tampón respectivo hasta 50 mg/ml y los excipientes respectivos combinados a la concentración necesaria. Después, la solución de 50 mg/ml se esteriliza por filtración. Por último, la solución estéril se rellena, se tapona y se cubre con un sello de aluminio. Todas las formulaciones tienen un pH de 6.0 y una concentración de anticuerpo anti-NGF E3 de 50 mg/ml.

Análisis de Agregación: Las formulaciones de anticuerpo del cuadro 3.1 se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40°C durante 2, 4, 8, 13 y 26 semanas.

Cada formulación se analizó para determinar su agregación usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Se calcularon los niveles de agregación y se muestran en la Figura 1.

Análisis de Fragmentación: Las formulaciones de anticuerpo del cuadro 3.1 se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40°C durante 2, 4, 8, 13 y 26 semanas.

Cada formulación se analizó también para determinar la fragmentación usando la metodología del Ejemplo 2. Como puede observarse en la Figura 2, la formulación de trehalosa mostraba los menores niveles de fragmentación en el almacenamiento de 13 semanas.

CUADRO 3.1 Matriz de formulación EJEMPLO 4 Estudio de exploración de agente de tonicidad: trehalosa frente a sacarosa Se realizó un estudio para comparar el efecto de agentes de tonicidad, en particular trehalosa y sacarosa, sobre la estabilidad y actividad de formulaciones de anticuerpo anti-NGF E3. La hidrólisis de la sacarosa en fructosa y glucosa en un solución ácida diluida es bien conocida. También se sabe que las moléculas de glucosa se unen aleatoriamente con los restos de lisina de la secuencia de aminoácidos de una proteína. Esto se conoce como glucosilación. Por lo tanto, una formulación de proteína, tamponada a un pH ácido, que contiene sacarosa, podría experimentar hidrólisis de sacarosa y después glucosilación. La proteina glucosilada podría experimentar procesos de degradación más fácilmente que una proteína no glucosilada. Por lo tanto, la presencia de sacarosa en una formulación líquida de proteína podría tener un impacto adverso sobre la calidad de la proteína a lo largo de su vida útil. Por el contrario, no se sabe que la trehalosa experimente dicha degradación basada en hidrólisis, y puede ser un agente modificador de la tonicidad preferente en formulaciones de proteínas.

En concreto, se prepararon seis formulaciones líquidas que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 con sacarosa y dos formulaciones líquidas que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 y trehalosa, véase el cuadro 4.1. Las formulaciones se almacenaron después a 5, 25 y 40°C y se tomaron mediciones de la agregación y glucosilación del anticuerpo a las 2, 4, 8, 13 y 26 semanas.

El procedimiento de fabricación para formulaciones en el cuadro 4.1 puede resumirse de la forma siguiente: se prepara el tampón, se ajusta el pH y se esteriliza por filtración (véase el cuadro 4.1 para detalles). Se preparan soluciones madre de excipientes y se esterilizan por filtración. El anticuerpo se concentra, después se cambia el tampón. El anticuerpo concentrado se analiza con UV y después se diluye con el tampón respectivo hasta 10 mg/ml o 50 mg/ml y los excipientes respectivos combinados a la concentración necesaria. Después, la solución de 10 mg/ml o 50 mg/ml se esteriliza por filtración. Por último, la solución estéril se rellena, se tapona y se cubre con un sello de aluminio.

Análisis de Agregación: Las formulaciones de anticuerpo del cuadro 4.1 se almacenaron a una temperatura de 5, 25, 40 y 50°C durante 2, 4, 8, 13 y 26 semanas.

Cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (CET) como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de agregación calculados se comparan en el cuadro 4.2 y muestran que la trehalosa demuestra niveles tan bajos sino menores de agregación en comparación con la sacarosa para las mismas concentraciones de anticuerpo investigadas.

Análisis de Glucosilación: Los niveles de glucosilación de restos de lisina en el anticuerpo anti- NGF E3 se midieron mediante un procedimiento de mapeo por espectrometría de masas después del almacenamiento de las formulaciones a 25, 40 y 50°C durante 0, 2, 4, 8 y 13 semanas para muestras de formulación que comprenden agente de tonicidad de sacarosa o trehalosa de acuerdo con el cuadro 4.1 (anticuerpo 10 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6.0). Se descubrió que la glucosilación era proporcional al índice de hidrólisis del agente de tonicidad. No se demostró hidrólisis de trehalosa, por lo tanto la trehalosa es un agente de tonicidad preferido sobre la sacarosa para la formulación de anticuerpo ya que se evita la glucosilación del anticuerpo de formulación, la sacarosa demostró una hidrólisis de entre el 1% y el 2% en formulaciones almacenadas a 25°C durante 104 semanas.

CUADRO 4.1 Cuadro de matriz de formulación para el ejemplo 4 CUADRO 4.2 Resumen de los datos de % de agregación (mediante CET) de anticuerpo anti-NGF 10 mg/ml: comparación de sacarosa frente a trehalosa CUADRO 4.3 Resumen de los datos de glucosilación del anticuerpo anti-NGF (descrita como % cadena pesada + 162 daltons) de anticuerpo anti-NGF 10 mg/ml: comparación de sacarosa frente a trehalosa Condición 25°C 40°C 50°C semanas 0 4 12 0 4 12 0 4 9 12 N° lote 112633-174 0 — ~ 0 — 4 0 3 19 23 112633-175 0 — — 0 — 4 0 4 22 29 112633-176 0 ~ ~ 0 — 3 0 4 13 17 112633-177 0 -- — 0 3 0 4 14 18 112633-178 0 0 — 4 0 7 29 49 112633-179 0 .-- — 0 — 4 0 7 30 52 112633-180 0 — 0 — — 0 ~ — — 112633-181 0 — — 0 — — 0 1 — 112633-182 19 67 — 19 92 60 19 100 EJEMPLO 5 Análisis de agentes tensioactivos y estabilizantes poliméricos Se realizó un estudio para comparar el efecto de tensioactivos y estabilizantes poliméricos, en particular PS20, PS80, PEG3350, PEG3350+PS20 sobre la estabilidad de formulaciones de anticuerpo anti-NGF E3.

En concreto, se prepararon cuatro formulaciones líquidas que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 y PS20, PS80, PEG3350, PEG3350+PS20 como se enumeran en el cuadro 5.1. Las formulaciones se almacenaron después a 5, 25 y 40°C y se tomaron mediciones de la agregación, fragmentación y oxidación de anticuerpo a las 2, 4, 8, 13 y 26 semanas.

Todas las formulaciones tenían un pH de 6.0 y una concentración de anticuerpo anti-NGF E3 de 50 mg/ml. El procedimiento de fabricación para las formulaciones en el cuadro 5.1 puede resumirse de la forma siguiente: se prepara el tampón, se ajusta el pH y se esteriliza por filtración (véase el cuadro 5.1 para detalles). Se preparan soluciones madre de excipientes y se esterilizan por filtración. El anticuerpo se concentra y después se cambia el tampón. El anticuerpo concentrado se analiza con UV y después se diluye con el tampón respectivo hasta 50 mg/ml y los excipientes respectivos combinados a la concentración necesaria. Después, la solución de 50 mg/ml se esteriliza por filtración. Por último, la solución estéril se rellena, se tapona y se cubre con un sello de aluminio. Los cuadros 5.2 y 5.3 describen los resultados.

Análisis de agregación: Las formulaciones de anticuerpo del cuadro 5.1 se almacenaron a una temperatura de 5, 25, 40 y 50°C durante 2, 4, 8, 13 y 26 semanas.

Cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (CET) como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de agregación calculados se comparan en el cuadro 5.2 y muestran que el PS20 a una concentración de 0.2 mg/ml demuestra niveles equivalentes de agregación en comparación con el PS80 de 0.2 mg/ml y PEG3350 1 mg/ml investigados. El PS20 a una concentración de 0.1 mg/ml también demuestra resultados equivalentes (datos de 40°C).

Análisis de la fragmentación: Las formulaciones de anticuerpo del cuadro 5.1 se almacenaron a una temperatura de 5, 25, y 40°C durante 2, 4, 8, 13 y 26 semanas.

Cada formulación se analizó para determinar la fragmentación usando la metodología del Ejemplo 2. Los datos recogidos de las muestras a 40°C se muestran en el cuadro 5.3 y muestran que el PS20 a una concentración de 0.2 mg/ml demuestra niveles equivalentes de fragmentación en comparación con el PS80 de 0.2 mg/ml y el PEG3350 1 mg/ml investigados. También se mostró que el PS20 a una concentración de 0.1 1 4 mg/ml demuestra resultados equivalentes.

CUADRO 5.1 Matriz de formulación para estudio de exploración de agente tensíoactivo Número de _ ? ? O Lote de o— {5 _ - °— w Formulación ? *^ ^ ¾ 2 E E o .§ + 8 C E .2 - o o S E 8 " - ? a (0 » o. - w Q. CL O. 1 4069-001 -D# 6.0 50 10 0.2 - - 1 4069-001 -E# 6.0 50 10 - 0.2 - 114069-001 -F# 6.0 50 10 - - 10 114069-001-G# 6.0 50 10 - - 0.2 + CUADRO 5.2 Resumen de los datos de % de agregación (mediante CET) de anticuerpo anti-NGF 50 mg/ml: estudio de exploración de agente tensíoactivo 25C 40C Semanas T0 4 8 13 26 2 4 8 13 26 114069-001-D2 PS20 1 1.4 1.5 1.8 2.4 1.8 2.2 2.8 4.2 8.2 114069-001-E2 PS80 0.9 1.3 1.5 1.8 n/a 1.8 2.2 3.1 4.2 n/a 114069-001-F2 PEG3350 1 1.4 1.5 1.9 n/a 1.8 2.2 2.8 3.9 n/a 114069-001-G2 PS20+PEG3350 0.9 1.3 1.5 1.9 n/a 1.8 2.1 3 4.3 n/a CUADRO 5.3 Resumen de los datos de % fragmentos (mediante ECG reducido) de anticuerpo anti-NGF 50 mg/ml: estudio de exploración de tensioactivo EJEMPLO 6: Análisis de agentes antioxidantes Se realiza un estudio para comparar el efecto de agentes antioxidantes, en particular metionina, sobre la estabilidad de formulaciones de anticuerpo anti-NGF E3.

En concreto, se prepararon nueve formulaciones líquidas que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 con y sin metionina. Todas las formulaciones tenían un pH de 6.0 y una concentración de anticuerpo anti-NGF E3 de 10 ó 50 mg/ml, trehalosa o sacarosa 84 mg/ml y PS20 0.1 mg/ml, histidina 10 mM, más o menos EDTA 0.05 mg/ml.

El procedimiento de fabricación para formulaciones puede resumirse de la forma siguiente: se prepara el tampón, se ajusta el pH y se esteriliza por filtración. Se preparan soluciones madre de excipientes y se esterilizan por filtración. El anticuerpo se concentra, después se cambia el tampón. El anticuerpo concentrado se analiza con UV y después se diluye con el tampón respectivo hasta 10 ó 50 mg/ml y los excipientes respectivos combinados a la concentración necesaria. Después, la solución de 10 mg/ml o 50 mg/ml se esteriliza por filtración. Por último, la solución estéril se rellena, se tapona y se cubre con un sello de aluminio.

Las formulaciones se almacenan después a 5, 25 y 40°C y se toman mediciones de la agregación, fragmentación y oxidación de anticuerpo a las 2, 4, 8, 13, 26 y 52 semanas.

Análisis de agregación: Las formulaciones de anticuerpo se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40°C durante 0, 8, 13, 26 y 52 semanas.

Cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (CET) como se describe en el Ejemplo 2. Se compararon los niveles de agregación calculados y se descubrió que eran significativamente diferentes para muestras almacenadas a 5 ó 25°C durante 26 semanas con o sin metionina, la presencia de metionina no tiene un efecto discernible sobre la agregación.

Análisis de fragmentación: Las formulaciones de anticuerpo se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40°C durante 0, 8, 13 y 26 semanas, se tomaron medidas de la fragmentación a las 26 semanas.

Cada formulación se analizó para determinar la fragmentación usando la metodología del Ejemplo 2. Se compararon los niveles de fragmentación calculados y se descubrió que eran significativamente diferentes para las muestras almacenadas a 5 ó 25°C durante 26 semanas con o sin metionina, la presencia de metionina no tiene ningún efecto discernible sobre la fragmentación.

Análisis de oxidación: Se midieron los niveles de oxidación de los restos de metionina en las posiciones aminoacídicas X e Y en el anticuerpo anti-NGF E3 mediante un procedimiento de mapeo de Lisina-C después del almacenamiento a 5, 25 y 40°C durante 0, 13, 26 y 52 semanas. Se registró el porcentaje de oxidación de aminoácidos de metionina en el anticuerpo anti-NGF E3 como se describe en el Ejemplo 2.

Los resultados del cuadro 6.1 indican que el porcentaje de oxidación del anticuerpo se reduce por presencia de metionina en periodos de almacenamiento más prolongados.

CUADRO 6.1 Resumen de los datos de % de oxidación de anticuerpo anti-NGF 10 y 50 mg/ml: estudio de exploración de agente antioxidante 25°C 40°C Semanas 0 13 26 52 13 26 52 Histidina 10 mM + Sac + PS20 + AcM 10 3.50 3.40 4.70 7.80 21.00 51.60 mg/ml Histidina 10 mM + Sac + PS20 + EDTA + 4.70 3.20 0.00 7.00 10.90 0.00 Met + AcM 10 mg/ml Histidina 10 mM + Sac + PS20 + AcM 50 1.77 3.90 3.80 5.50 8.40 15.50 39.20 mg/ml Histidina 10 mM + Sac + PS20 + EDTA + 1.72 2.70 3.40 3.10 5.10 10.10 30.60 Met + AcM 50 mg/ml Histidina 10 mM + Tre + PS20 + AcM 50 1.79 3.40 3.80 5.80 6.80 15.00 30.00 mg/ml Histidina 10 mM + Tre + PS20 + EDTA + 1.65 3.30 4.00 5.90 6.60 11.20 20.20 AcM 50 mg/ml Histidina 10 mM + Tre + PS20 + Met + 1.72 2.70 2.80 2.60 3.90 6.50 14.40 AcM 50 mg/ml Histidina 10 mM + Tre + PS20 + EDTA + 1.70 2.70 3.30 3.10 4.60 7.00 14.00 Met + AcM 50 mg/ml Histidina 10 mM + Tre + PS20 + EDTA + 0.00 4.10 3.30 3.30 6.20 6.80 12.60 Met + AcM 10 mg/ml EJEMPLO 7 Estudio de estabilidad a la congelación-descongelación con y sin trehalosa Se prepararon formulaciones de anticuerpo que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 50 mg/ml, tampón histidina 10 mM pH 6.0 y trehalosa 84 mg/ml, y se prepararon muestras idénticas que carecían de trehalosa. Las muestras se sometieron a hasta 4 ciclos de congelación y descongelación y se determinó la agregación para las muestras. Los ciclos de congelación- descongelación son de congelación 72 h a -70°C y descongelación 48 h a 5°C.

Cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (CET) como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de agregación calculados se comparan en el cuadro 7.1 y muestran que las muestras que comprenden trehalosa ofrecen una protección completa frente a los efectos de la congelación-descongelación sobre la agregación del anticuerpo. Las muestras con trehalosa no muestran un aumento apreciable en el nivel de agregación con el tiempo.

CUADRO 7.1 Resumen de los datos de % de agregación (mediante CET) de anticuerpo anti-NGF 50 mg/ml: Ciclo de %HMMS de Muestra %HMMS de Congelación/Descongelación de Control (sin Muestra con Trehalosa) Trehalosa 0 0.60 0.60 1 0.75 0.60 2 0.90 0.60 3 1.00 0.60 4 1.30 0.60 EJEMPLO 8 Estabilidad a múltiple congelación-descongelación de la formulación de anticuerpo anti-NGF E3 con trehalosa Se prepararon formulaciones de anticuerpo (1 12746-124 y 112746-125) que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 22 mg/ml, tampón de histidina 10 mM pH 6.0 y trehalosa 84 mg/ml, EDTA disódico 0.05 mg/ml y polisorbato 20 0.1 mg/ml. Las muestras se sometieron a hasta 15 ciclos de congelación y descongelación y se determinó la agregación para las muestras.

Cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (CET) como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de agregación calculados se comparan en la Figura 3 y muestran que todas las muestras que comprenden trehalosa ofrecen una protección completa frente a los efectos de la congelación y descongelación sobre la agregación del anticuerpo. Las muestras con trehalosa no muestran un aumento apreciable en el nivel de agregación con el tiempo.

EJEMPLO 9 Estudio de estabilidad a largo plazo en anticuerpo anti-NGF E3 10 y 50 mg/ml: efecto de la trehalosa como estabilizante Se prepararon formulaciones de anticuerpo que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 10 mg/ml, tampón de histidina 10 mM pH 6.0 y trehalosa 84 mg/ml, se prepararon muestras idénticas que carecían de trehalosa. Los detalles de las muestras estudiadas se proporcionan en el cuadro 9.1. Las muestras se almacenaron a una temperatura de 5, 25 y 40°C durante 2, 4, 8, 13, 26 y 52 semanas y se determinó la agregación para las muestras. Cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (CET) como se describe en el Ejemplo 2. Los datos recogidos mostraban que las muestras que comprenden trehalosa ofrecen altos niveles de protección frente a los efectos sobre la agregación del anticuerpo en el almacenamiento en condiciones aceleradas de 40°C.

CUADRO 9.1 Matriz de formulación para estudio de estabilidad a largo plazo en anticuerpo anti-NGF E3 10 v 50 mg/ml: efecto de la trehalosa como estabilizante CUADRO 9.2 Datos de % de agregación (mediante CET) a 40°C durante el estudio de estabilidad a largo plazo en anticuerpo anti-NGF E3 10 y 50 mg/ml: efecto de la trehalosa como estabilizante EJEMPLO 10 Estudio de la estabilidad a largo plazo, de una formulación de anticuerpo anti-NGF E3 que contiene trehalosa, EDTA, polisorbato 20 en tampón de histidina a pH 6.0 a 2.5, 5, 10. 20 y 50 mg/ml Se prepararon formulaciones de anticuerpo que comprendían anticuerpo anti-NGF E3 2.5 ó 5 ó 10 ó 20 ó 50 mg/ml, tampón de histidina 10 mM pH 6.0 y trehalosa 84 mg/ml, EDTA 0.05 mg/ml y polisorbato 20 0.1 mg/ml. Las muestras se almacenaron a una temperatura de entre 5 y 8°C durante hasta 24 meses y más, y se determinó la agregación, fragmentación y oxidación para las muestras.

Los datos recogidos y presentados en las Figuras 4, 5 y 6 indican que dicha formulación de anticuerpo anti-NGF E3 a una concentración de AcM de 2.5, 5, 10, 20 ó 50 mg/ml es estable durante hasta 52 semanas.

Un ejemplo de una composición líquida de anticuerpo de acuerdo con la presente invención es el siguiente: cualquiera de aproximadamente 2.5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 22 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml de un anticuerpo que comprende una secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y una secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 2, tampón de histidina aproximadamente 10 mM, trehalosa dihidrato aproximadamente 84 mg/ml, Polisorbato 20 aproximadamente 0.01 peso/volumen, EDTA disódico aproximadamente al 0.005%, en el que dicha composición es de un pH de 6.0 +/- 0.2. La composición líquida de anticuerpo es preferentemente de un volumen total de aproximadamente 1 mi.

Secuencias de Anticuerpo Región variable de cadena pesada de E3 (las CDR de Kabat están subrayadas; las CDR de Chothia están en NEGRITA Y CURSIVA) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGyDLA/WIRQPPGKGLEWIG/WG PG7TPyA/S^y SRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGY YiATS yyro VGQGTLVTVS (SEQ ID NO: 1) Región variable de cadena ligera de E3 (las CDR de Kabat están subrayadas; las CDR de Chothia están en NEGRITA Y CURSIVA) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ¾/\SQS/SA/ VL/WVYQQKPGKAPKLLIYY S/? FHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPV7FGQGTKLEI KRT (SEQ ID NO: 2) CDR extendidas de cadena pesada de E3 CDRH1 : GFSLIGYDLN (SEQ ID NO: 3) CDRH2: IIWGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID NO: 4) CDRH3: GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO: 5) CDR extendidas de cadena ligera de E3 CDRL1 : RASQSISNNLN (SEQ ID NO: 6) CDRL2: YTSRFHS (SEQ ID NO: 7) CDRL3: QQEHTLPYT (SEQ ID NO: 8) CDR extendidas de anticuerpo monoclonal de ratón 911 CDR extendidas de cadena pesada de 91 1 CDRH1 : GFSLIGYDIN (SEQ ID NO: 9) CDRH2 : MIWGDGTTDYNSALKS (SEQ ID NO: 10) CDRH3: GGYYYGTSYYFDY (SEQ ID NO: 11 ) CDR extendidas de cadena ligera de 911 CDRL1 : RASQDISNHLN (SEQ ID NO: 12) CDRL2: YISRFHS (SEQ ID NO: 13) CDRL3: QQSKTLPYT (SEQ ID NO: 14) Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de E3 (completa) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWG DGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATS YYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHK PSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 16) Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 3E (anticuerpo completo) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSR FHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW VDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID NO: 17) Secuencias de CDR adicionales distintas a las que se hace referencia RASQSISNNLN (SEQ ID NO: 18) YTSRFHS (SEQ ID NO: 19) GFSLIGYDLN (SEQ ID NO: 30) IIWGDGTTDYNSAV (SEQ ID NO: 31) QQEHTLPYT (SEQ ID NO: 55) GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO: 56) QQESTLPYT (SEQ ID NO: 57) GGYWYSTSYYFDY (SEQ ID NO: 58) QQEKTLPYT (SEQ ID NO: 59) GGYYYATSYYFDY (SEQ ID NO: 60) QQERTLPYT (SEQ ID NO: 61) GGYWYATSYYFDY (SEQ ID NO: 62) QQERTLPYT (SEQ ID NO: 63) GGYYYATSYYFDY (SEQ ID NO: 64) Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de 3E (anticuerpo completo) CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGA CCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATC TTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATT ATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTC ACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTC TGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATT GGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTC ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCC CATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTC TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACC CAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGA CAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCC CCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGG ACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGA CGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGA GTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACT CCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCT GAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCA GCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACA GGTGTATACCCTGCCACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGT CCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAAT GCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACA AGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAA GTAA (SEQ ID NO: 65) Secuencia de nucleótidos del dominio variable de la cadena pesada de 3E CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGA CCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATC TTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATT ATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTC ACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTC TGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATT GGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTC ACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 66) Secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de 3E (anticuerpo completo) GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGA CCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAA CTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACA CCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCT GGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCC ACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGC ACCAAGCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTT CCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATA ACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACMAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA (SEQ ID NO: 67) Secuencia de nucleótidos del dominio variable de la cadena ligera de 3E GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGA CCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGA ACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTAC ACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTC TGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTG CCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAA GGCACCAAGCTGGAGATCAAACGC (SEQ ID NO: 68) Las secuencias anteriores y otras secuencias descritas en el presente documento se proporcionan en la lista de secuencias adjunta.

Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento son con fines ilustrativos solamente, y que les sugerirán a los expertos en la materia diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos, y deben incluirse en el espíritu y ámbito de la presente solicitud .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. - Una composición líquida que comprende; al menos un anticuerpo, al menos un agente de tonicidad, al menos un tampón, al menos un agente quelante, al menos un tensioactivo, en la que el pH de dicha composición es de 5.8 a 6.8.

2. - La composición liquida de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque consiste esencialmente en; al menos un anticuerpo, al menos un agente de tonicidad, al menos un tampón, al menos un agente quelante, al menos un tensioactivo, en la que el pH de dicha composición es de 5.8 a 6.8.

3. - La composición líquida de conformidad con la reivindicación 1 0 la reivindicación 2, caracterizada además porque el agente de tonicidad es un azúcar no reductor, preferentemente trehalosa dihidrato.

4 - La composición líquida de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la trehalosa dihidrato es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml.

5. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque el tensioactivo es un polisorbato, preferentemente polisorbato 20.

6. - La composición líquida de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la concentración de polisorbato es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.15 mg/ml.

7. - La composición liquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque el tampón es tampón de histidina.

8. - La composición líquida de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la concentración de tampón de histidina es de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 15 mM.

9. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque el agente quelante es EDTA disódico, preferentemente una concentración de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/ml.

10. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada además porque la concentración de anticuerpo es inferior a o igual a aproximadamente 50 mg/ml.

11. - La composición líquida de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la concentración de anticuerpo se selecciona de aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 2.5 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml.

12. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizada además porque comprende además un agente antioxidante y/o un agente conservante.

13. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada además porque no comprende un agente antioxidante, un agente conservante o ambos.

14. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque comprende; de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml de al menos un anticuerpo, de aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 15 mM de tampón de histidina, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de trehalosa dihidrato, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.15 mg/ml de PS20, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/ml de EDTA disódico, en la que dicha composición es de un pH de 5.8 a 6.8.

15. - La composición líquida de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque consiste en; de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml de al menos un anticuerpo, de aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 15 mM de tampón de histidina, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de trehalosa dihidrato, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.15 mg/ml de PS20, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/ml de EDTA disódico, en la que dicha composición es de un pH de 5.8 a 6.8.

16. - La composición líquida de conformidad con la reivindicación 14 o la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende o consiste en; aproximadamente 2.5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 22 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml de al menos un anticuerpo, aproximadamente 10 mM de tampón de histidina, aproximadamente 84 mg/ml de trehalosa dihidrato, aproximadamente 0.1 mg/ml de PS20, aproximadamente 0.05 mg/ml de EDTA disódico, en la que dicha composición es de un pH de 6.0 +/-0.2.

17. - La composición líquida de conformidad con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, caracterizada además porque comprende o consiste en; aproximadamente 2.5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 22 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml de al menos un anticuerpo, aproximadamente 10 mM de tampón de histidina, aproximadamente 84 mg/ml de trehalosa dihidrato, aproximadamente 0.1 mg/ml de PS20, aproximadamente 0.05 mg/ml de EDTA disódico, en la que dicha composición es de un pH de 5.8 a 6.5.

18. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada además porque el al menos un anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado.

19. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada además porque el al menos un anticuerpo es un anticuerpo lgG2.

20.- La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada además porque el al menos un anticuerpo se une a NGF humano con una Kd de menos de o de aproximadamente 2 nM.

21. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada además porque el al menos un anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 1 , y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 2.

22. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , caracterizada además porque el al menos un anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 16, y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90% con una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 17.

23. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada además porque el anticuerpo comprende una secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 , y una secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 2.

24.- La composición liquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizada además porque la composición no está liofilizada.

25.- La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada además porque la composición es resistente a la agregación del anticuerpo después de múltiples ciclos de congelación y descongelación.

26.- La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada además porque la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, y en la que existe un aumento de menos de aproximadamente el 10% en la agregación del anticuerpo de la composición.

27.- La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada además porque la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, y en la que existe un aumento de menos de aproximadamente el 10% en la oxidación del anticuerpo de la composición.

28. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada además porque la composición puede almacenarse durante un periodo de al menos aproximadamente 26 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, y en la que existe una disminución de menos de aproximadamente el 10% en la actividad del anticuerpo de la composición.

29. - La composición líquida de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizada además porque la composición se puede almacenar durante un periodo de al menos aproximadamente 26 semanas a una temperatura de entre 2 y 8°C, y en la que existe un aumento de menos de aproximadamente el 10% en la agregación del anticuerpo de la composición.

30.- Uso de la composición líquida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor en un mamífero.

31. - Uso de la composición líquida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor en un mamífero, en el que el medicamento se adapta para ser administrable en una dosis de una vez cada ocho semanas.

32. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 31 , en donde el volumen de la dosis es inferior a o igual a aproximadamente 2.5 mi.

33. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 31 o la reivindicación 32, en donde la dosis contiene menos de o es igual a 50 mg de anticuerpo.

34. - El uso como el que se reclama en una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, en donde la dosis se adapta para ser administrable intravenosamente o subcutáneamente.