MX2011001006A

MX2011001006A - Celulasa de la familia 6 con inactivacion disminuida mediante lignina.

Info

Publication number: MX2011001006A
Application number: MX2011001006A
Authority: MX
Inventors: John Tomashek; James Lavigne; Brian Scott; Martine Whissel
Original assignee: Iogen Energy Corp
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2011-04-21
Also published as: CA2732082A1; US8110389B2; BRPI0917395A2; EP2318523A4; AU2009276270A1; EP2318523A1; WO2010012102A1; US20100041100A1; CN102159707A

Abstract

Se proporciona una enzima de la celulasa Trichoderma reesei Familia 6 (TrCe16A) modificada que comprende sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de 129, 322, 363 y 410 de la SEQ ID NO: 1. También se proporcionan los constructos genéticos y los microbios modificados genéticamente que comprenden las secuencias nucleicas que codifican para la celulasa TrCe16A modificada. La celulasa TrCe16A modificada de la invención exhibe al menos un 15% de disminución en la inactivación mediante lignina con relación a una celulasa TrCe16A parenteral a partir de la cual se deriva de la TrCe16A modificada. Estas celulasas encuentran uso en una variedad de aplicaciones en la industria que requieran la hidrólisis enzimática de celulosa en presencia de lignina, por ejemplo, la hidrólisis de materias primas de alimentación lignocelulásicas pre-tratadas para la producción de azúcares fermentables, alcoholes de azúcar y alcoholes para quemar.

Description

CELUIASA DE LA FAMILIA 6 CON INACTIVACIÓN DISMINUIDA MEDIANTE LIGNINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención, se relaciona con célulasas de la familia 6 modificadas. Más específicamente, la invención se relaciona con célulasas Trichoderma reesei familia 6 (TrCel6A) modificadas con inactivación disminuida mediante lignina. La presente invención, también se relaciona con constructos genéticos que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican para las célulasas TrCel6A modificadas, los métodos para la producción de la celulasa TrCel6A modificada a partir de cepas hospederas y el uso de las célulasas TrCel6A modificadas en la hidrólisis de sustratos lignocelulósicos . : ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Más de la mitad de carbono orgánico en la tierra se encuentra en las paredes celulares de las plantas. Las paredes celulares de las plantas comprenden tres compuestos principales: celulosa, hemicelulosa, y lignina.

Colectivamente estos compuestos se denominan "lignoce'lulosa", y representan una fuente potencial de azúcares i ,y otras moléculas orgánicas para la fermentación a etanol' ; u otros productos de alto valor.

La conversión de la biomasa lignocelulósica a etanol se ha convertido en una característica clave de las políticas energéticas en surgimiento debido a la naturaleza ambientalmente favorable y sostenible del etanol celulósico. Existen diversas tecnologías que se están desarrollando para la conversión de celulosa. Aquí es interesante un método mediante el cual la biomasa lignocelulósica se someta a un pre-tratamiento que aumente su susceptibilidad a las enzimas hidrolíticas , seguido por la hidrólisis enzimática a azúcares y la fermentación de esos azúcares a etanol u otras moléculas orgánicas de alto valor (por ejemplo, butanol). Los métodos comunes de pre-tratamiento incluyen la explosión por vapor de ácido diluido (patente de los Estados Unidos No. 4,461,648), la explosión por congelación de amoniaco (AFEX; Holtzapple et al., 1991), y la extracción de organosolventes (patente de los Estados Unidos No. 4,409,032). Los sistemas para hidrólisis y fermentación pueden ser ya sea separados (hidrólisis y fermentación secuenciales; SHF) o coincidente (sacarificación y fermentación simultáneas; SSF) . En todos los casos, la hemicelulosa y la celulosa se descomponen a azucares que se pueden fermentar, mientras que la lignina se convierte por separado y se puede utilizar ya sea i como un combustible sólido o como una fuente de otras moléculas orgánicas. ; La elección de las enzimas para la conversión de la biomasa lignocelulósica pre-tratada a azúcares depende en gran medida del método de pre-tratamiento . La explosión por vapor de ácido diluido da por resultado en una hidrólisis química significativa de la hemicelulosa, haciendo con esto que las enzimas para la conversión de hemicelulosa a: azucares sea menos relevante para el proceso. Por el contrario, la extracción de AFEX y organosolventes ambas dejan la hemicelulosa y celulosa bastante intactas. La extracción de organosolventes, a diferencia de la explosión por !vapor de ácido diluido o AFEX elimina una porción significativa de la lignina del sustrato. En todos los casos, el : objetivo primario para la hidrólisis enzimática es la celulosa1, que se convierte a azúcares utilizando una combinación de en'zimas de la celulasa . : j Existen dos tipos principales de enzimas de celulasa: endoglucanasas , que escinden los ! enlaces glicosídicos a la mitad de las cadenas de la celulosa, y haciendo esto, crean nuevos extremos de cadena, y celobiohidrolasas, que escinden los oligosacáridos cortos de los extremos de las cadenas de celulosa. Las glucosidasas digieren los oligosacáridos cortos en monosacáridos : Estos tres componentes enzimáticos de esta forma> : actúan sinérgicamente para crear un sistema eficiente del enzimas celulolíticas . La mayoría de las celulasas tienen una estructura modular similar, que consiste de un , dominio catalítico, un péptido enlazante y un módulo de unión con carbohidratos (CBM, por sus siglas en inglés) .

Las enzimas de celulasa modificadas y los métodos para modificación se han descrito extensivamente. Por ejemplo, se han reportado las variantes de Trichoderma reesei Cel7A y Cel6A para mejorar la termoestabilidad (patente de los Estados Unidos No. 7,375,197; WO 2005/028636, publicación de los Estados Unidos No. 2007/0173431; publicación1 de los Estados Unidos No. 2008/167214, WO 2006/074005; publicación de los Estados Unidos No. 2006/0205042; publicación de los Estados Unidos No. 7,348,168; WO 2008/025164). En particular, la sustitución de la serina en la posición 413 en T. reesei con una prolina, o la sustitución del aminoácido en el equivalente a la posición 413 con una prolina en otras celulasas de la familia 6 confiere una termoestabilidad aumentada (WO 2008/025164) . Las mutaciones en el equivalente de las posiciones 103, 136, 186, 365 y 410 dentro del dominio catalítico de T reesei Cel6A y otras celulasas de la, familia 6 ha mostrado que conduce a la inhibición reducida mediante glucosa (solicitud de patente de los Estados Unidos No. : 2009/0186381) . Se han creado variantes con resistencia a proteasas y a tensioactivos para formulaciones de detergentes para aplicaciones textiles (WO 99/01544, O 94/07998; y patente de los Estados Unidos No. 6,114,296) Han quedado bien documentados los efectos negativos de la lignina sobre los sistemas enzimáticos de celulasa. Se mostró que el retiro de la lignina de madera dura (álamo) aumenta el rendimiento de azúcar mediante la hidrólisis enzimática (Kong et al., 1992) de manera similar, se mostró que el retiro de la lignina de madera suave (abeto Douglas) mejora la hidrólisis enzimática de la celulosa, un efecto atribuido a la accesibilidad mejorada de las enzimas a la celulosa (Mooney et al., 1998) otros grupos han demostrado que las celulasas purificadas a partir de Trichoderma reesei se unen a la lignina aislada (Chernoglazov et al., 1988) y se ha especulado sobre la función de los diferentes dominios de unión en la interacción de la enzima-lignina (Palonen et al., 2004). La unión a la lignina y la inactivación; de las celulasas Trichoderma reesei se ha observado cuando la lignina se agrega de nuevo a un sistema de celulosa pura (Escoffier et al., 1991). Únicamente en un caso, se reportó que la lignina no tuvo ningún efecto significativo sobre las celulasas (Meunier-Goddik and Penner, 1999) . Otros reportes sugieren que algunas hemicelulasas pueden ser resistentes a, e incluso se inactivan mediante la lignina y los productos para descomposición de lignina (Kaya et al., 2000). De esta forma, en general se reconoce que la lignina es una seria limitación para la hidrólisis enzimática de la celulosa.

Se ha reportado que los CBM están implicados en la unión de lignina. Por ejemplo, el retiro del CBM de Trichoderma Cel7A elimina esencialmente la unión a la ; lignina extraída de álcali y a la lignina residual preparada mediante hidrólisis enzimática (Palonen et al., 2004).

También se ha reportado que los dominios catalíticos están implicados en la unión de lignina. CelVB a partir de Humicola sp. , que no posea un CBM, se une extensivamente mediante la lignina (Berlín et al., ¦ 2005b) . De manera similar, el núcleo de Trichoderma Cel5A, que carece de un CBM, no se une a la lignina enzimática ni se une a la lignina extraída de álcali a un grado menor de lo que se une a la proteína de longitud total (Palonen et al., 2004).

El desarrollo de celulasas resistentes a lignina con afinidad de unión conservada de celulosa y la actividad celulolítica natural representa un gran obstáculo en la comercialización de la conversión de celulosa a azúcares solubles que incluyen la glucosa para la producción de etanol y otros productos. Se han sugerido una variedad de métodos para reducir el impacto negativo de la lignina sobre el sistema de celulasa. Se ha mostrado que las proteínas de unión no específicas (por ejemplo, albúmina de suero< bovino; BSA) bloquean las interacciones entre las celulasas y las superficies de lignina (Yang and Wyman, 2006; US24185542 Al; US26088922 Al; WO05024037 A2, A3; WO09429474 Al) . ; Otros agentes y tensioactivos bloqueadores químicos han mostrado que tienen un efecto similar (Tu et al., 2007; US 7,354,743). Mientras que se ha propuesto buscar e identificar las variantes resistentes a la lignina de las enzimas de celulasa (Berlín et al., 2005a), no se ha documentado con anterioridad ningún trabajo exitoso en esa dirección.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con enzimas de celulasa modificada. Más específicamente, la presente invención se relaciona con celulasas de Trichoderma reesei familia 6 (TrCel6A) modificadas con inactivación disminuida mediante lignina. La presente invención se relaciona! también con constructos genéticos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para las celulasas TrCel6A modificadas, los métodos para la producción de la celulasa TrCel6A modificada a partir de cepas hospederas y el uso de las celulasas TrCel6A modificadas en la hidrólisis de sustratos lignocelulósicos .

Un objetivo de la invención es proporcionar una celulasa TrCel6A modificada con inactivación disminuida mediante lignina.

La presente invención se relaciona con una celulasa TrCel6A modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: la sustitución de un aminoácido básico en una o más de las posiciones 129 y 410 mediante un aminoácido de carga neutra o ácida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y la sustitución de un aminoácido en la posición 186 mediante una treonina; la celulasa TrCel6A modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe entre aproximadamente 47% a aproximadamente 99.9% de identidad con el aminoácido 83-447 de la SEQ ID NO: 1. Además, la celulasa TrCel6A modificada puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de K129E, S186T, A322D, Q363E, R410G, y R410Q. La celulasa TrCel6A modificada es capaz de hidrolizar polisacáridos utilizando un mecanismo de inversión.

La posición de una o más de las sustituciones de aminoácidos definidas anteriormente se puede determinar a partir de la alineación de secuencias de los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 83-447 de la SEQ ID NO: 1 de una enzima de la celulasa TrCel6A parental con los aminoácidos 83-447 que comprenden el dominio catalítico de la secuencia de aminoácidos Trichoderma reesei Cel6A según se define en la SEQ ID NO: 1.

La celulasa TrCel6A modificada se puede derivar de una celulasa TrCel6A parental que de otra manera es idéntica a la celulasa TrCel6A modificada excepto para la sustitución del aminoácido que se presenta en la naturaleza en una o más de las posiciones 129, 186, 322, 363 ó 410. Por ejemplo, esta invención incluye una celulasa TrCel6A modificada como se definió anteriormente y que comprende además una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de Y103H, Y103K, Y103R, Y103A, Y103V, Y103L, Y103P, L136V, L136I, y S413P o cualesquiera otras mutaciones adicionales en las posiciones distintas de 129, 186, 322, 363 ó 410, con la condición de que la enzima exhiba una actividad de la celulasa Cel6A.

La presente invención también se relaciona con una celulasa TrCel6A modificada, según se definió anteriormente, que exhibe al menos una reducción del 15% en el grado de desactivación mediante lignina con relación a la de la celulasa TrCel6A parental a partir de la cual se deriva la celulasa TrCel6A modificada.

La presente invención también se relaciona con una celulasa de la familia 6 modificada seleccionada del grupo que consiste de: TrCel6A-Kl29E-S413P (SEQ ID NO: 37); TrCel6A-S186T-S413P (SEQ ID NO: 38); TrCel6A-A322D-S413P (SEQ ID NO: 39); TrCel6A-Q363E-S413P (SEQ ID NO: 40); TrCel6A-R410G-S413P (SEQ ID NO: 41); TrCel6A-R410Q-S413P (SEQ ID NO: 42); TrCel6A-Kl29E-S186T-A322D-Q363E-S413P (SEQ ID NO: 43); y TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P (SEQ ID NO: 44).

La presente invención, se relaciona con constructos genéticos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para una celulasa TrCel6A modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: la sustitución de un aminoácido básico en uha o más de las posiciones 129 y 410 mediante un aminoácido de carga neutra o ácida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y la sustitución de un aminoácido en la posición 186 mediante una treonina; la celulasa TrCel6A modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe entre 47% hasta 99.9% de identidad con el aminoácido 83-447 de la SEQ ID NO: 1. La secuencia de ácido nucleico se puede enlazar funcionalmente a otras secuencias de ácido nucleico que regulan su expresión y secreción a partir de un microbio hospedero. Las otras secuencias nucleicas que regulan la expresión y secreción de la celulasa TrCel6A modificada se pueden derivar del microbio hospedero utilizado para la expresión de la celulasa , TrCel 6A modificada. El microbio hospedero puede ser una levadura, tal como, Saccharomyces cerevisiae, o un hongo filamentoso, tal como Trichoderma reesei.

La invención, también se relaciona con un constructo genético como se definió anteriormente, en donde la celulasa TrCel6A modificada codificada por el constructo genético comprende además una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste: Y103H, Y103K, Y103R, Y103A, Y103V, Y103L, Y103P, L136V, ' L136I y S413P, o cualesquiera otras mutaciones adicionales; en las posiciones distintas a 129, 186, 322, 363 ó 410. ; Con la condición de que la enzima exhiba una actividad de la celulasa Cel6A.

La invención también se relaciona con un microbio modificado genéticamente que comprende un constructo genético que codifica para una celulasa TrCel6A modificada y capaz de expresión y secreción de una celulasa TrCel6A modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: la sustitución de un aminoácido básico en una o más de las posiciones 129 y 410 mediante un aminoácido de carga neutra o ácida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y la sustitución de un aminoácido en la posición 186 mediante una treonina; la celulasa TrCel6A modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe entre 47% y 99.9% de identidad con el aminoácido 83-447 de la SEQ ID NO:: i. En una modalidad, el microbio modificado genéticamente es capaz de expresión y secreción de una celulasa TrCel6A modificada que comprende además una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de Y103H, Y103K; Y103R, Y103A, Y103V, Y103L, Y103P, L136V, L136I, y S413P, o cualesquiera otras mutaciones adicionales en las posiciones distintas de 129, 186, 322, 363 ó 410. El microbio modificado genéticamente puede ser una levadura u hongo filamentoso. Por ejemplo, el microbio modificado genéticamente puede ser una especies de Saccharomyces , Pichia, Hansenula , Trichoderma , Hypocrea , Aspergí 1 lus , Fusarium , Humicola or Neurospora .

La presente invención, también se relaciona con un proceso para la hidrolización de celulosa en presencia de lignina con una celulasa TrCel6A modificada.

La invención, también se relaciona con un 1 proceso para la producción de una celulasa TrCel6A modificada como se definió anteriormente, incluyendo la transformación de una levadura u hongo hospedero con un constructo genético que comprende una secuencia de ADN que codifica para una celulasa TrCel6A modificada, la selección de una levadura recombinante o cepas de hongos que expresen una celulasa TrCel6A modificada, el cultivo de las cepas recombinantes seleccionadas en fermentaciones sumergidas en líquido bajo condiciones que induzcan la expresión de una celulasa TrCel6A modificada y la recuperación de la TrCel6A modificada producida así mediante la separación del filtrado del cultivo a partir del microbio hospedero.

Los inventores han realizado el descubrimiento de que la sustitución de un aminoácido básico o de carga neutra en la posición 129, 322, 363 ó 410 o del aminoácido en la posición 186 mediante una treonina, da por resultado en una disminución en el grado de desactivación de la celulasa TrCel6A modificada mediante lignina con relación a la de , una celulasa TrCel6A parental a partir de la cual se deriva. Como se muestra en la figura 8, todos estos aminoácidos se ubican en la superficie de la celulasa TrCel6A.

Las celulasas TrCel6A modificadas de la presente invención pueden exhibir al menos una 15% de reducción en el grado de desactivación mediante lignina con relación ¡a la de una celulasa TrCel6A parental a partir de la cual sé deriva la celulasa TrCel6A modificada. Esta inactivación disminuida de la lignina contribuye a una actividad aumentada para la hidrólisis de un sustrato de celulosa en una reacción de hidrólisis que contiene la celulasa TrCel6A modificada, la celulosa y la lignina con relación a la celulasa : TrCel6A parental a partir de la cual se deriva la celulasa : TrCel6A modificada . i Estas celulasas TrCel6A encuentran uso,; en una variedad de aplicaciones en la industria que requieren una alta actividad de hidrolización de celulosas en presencia de lignina. Por ejemplo, la celulasa TrCel6A modificada, como se describe en la presente, se puede utilizar en ( procesos industriales en los cuales los sustratos lignocelulópicos se convierten a azúcares fermentables utilizados para la producción de alcoholes para quemar, alcoholes de azúcar u otros productos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Estas y otras características de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a los dibujos anexos en donde: La figura 1 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos entre las celulasas de hongos seleccionadas a partir de la familia 6 de glicosilhidrolasa y una secuencia de la celulasa de la familia 6 consensual. Por debajo de las secuencias alineadas se muestra una representación gráfica de la frecuencia de ocurrencia del aminoácido en cada posición de la celulasa de la familia 6 consensual entre las 36 celulasas de la familia 6 fúngales. Se indican mediante flechas los residuos de ácido aspártico catalítico: en las posiciones equivalentes 175 y 221 en TrCel6A. Con un asterisco se indican los aminoácidos bastante conservados en el equivalente de las posiciones 129, 186, 363, 322, y 410 en TrCel6A. Para las celulasas con un dominio de unión a celulosa, sólo se presentan las secuencias con núcleo catalítico.

La figura 2 representa el vector del plásmido YEp352/PGK91-lANheI-ass-rrCel6A-S413P que dirige la expresión y secreción de la TrCel6A natural y modificada a partir del Saccharomyccs cerevisiae recombinante.

La figura 3 contiene dos gráficas de dispersión. El panel A es una gráfica de dispersión de la actividad enzimática en presencia de lignina tratada con BSA (+BSA) contra la actividad enzimática en presencia de lignina sin tratar (-BSA) para un ensayo 1 de alto rendimiento (ejemplo 6) . Los datos se relacionan con la selección de una placa de cultivo de 96 cavidades que contiene celulasas 1 TrCel6A modificada y (TrCel6A-S413P) parental o filtrados a partir de transformantes con vector vacio (controles negativos) . El panel B es una gráfica de dispersión de la actividad enzimática en presencia de lignina tratada con BSA (+BSA) contra una actividad enzimática en presencia de lignina sin tratar (-BSA) para el ensayo 2 de alto rendimiento (ejemplo 7) . Los datos se relacionan con la selección de una placa de cultivo de 96 cavidades que contiene las celulasas ', TrCel6A modificada y (TrCel6A S413P) parental o filtrados a partir de los transformantes con vector vacio (controles negativos).

La figura 4 es una gráfica de barras que muestra las proporciones de lignina ± BSA para las celulasas TrCel6A modificadas normalizadas con respecto a las proporciones de lignina ± BSA para la celulasa TrCel6A-S413P parental como se mide en un ensayo 1 de alto rendimiento (ejemplo 6) .

La figura 5 contiene dos gráficas de dispersión. El panel A es una gráfica de dispersión de la actividad enzimática en presencia de lignina tratada con BSA (+BSA) contra la actividad enzimática en presencia de lignina sin tratar (-BSA) para el ensayo 1 de alto rendimiento (ejemplo 6) . Los datos se relacionan con la selección de la celulasa modificada TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P ' y la celulasa parental TrCel6A-S413P . El panel B es una gráfica de dispersión de la actividad enzimática en presencia de lignina tratada con BSA (+BSA) contra la actividad enzimática en presencia de lignina sin tratar (-BSA) para el ensayo 2 de alto rendimiento (ejemplo 7). Los datos se relacionan con la selección de las celulasas modificadas TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P, TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P y la celulasa parental TrCel6A-S413P.

La figura 6 muestra los resultados en curso de tiempo para la inactivación de lignina para TrCel6A-S413P y TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P. La actividad de TrCel6A residual como una función de tiempo en la suspensión de lignina se midió y analizó como se describe en el ejemplo 9.

La figura 7 es una gráfica de dispersión del KL relativo y las actividades especificas relativas de las celulasas TrCel6A modificadas y TrCel6A-S413P según se determina en los ensayos en curso de tiempo para la inactivación de lignina.

La figura 8, muestra el modelo para llenar espacios (CPK) para las estructuras cristalinas de Cel6A G. reesei utilizando las coordenadas a partir de los archivos 1CB2 de PDB. La vista a la derecha es un giro de 180' grados alrededor del eje vertical centrado de la vistta a la i zquierda .

La figura 9 muestra una matriz de identidad ; para la alineación de los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 83-447 de la SEQ ID NO: 1 para cada una de las 36 secuencias de aminoácidos de la celulasa de la familia 6 entre sí.

La figura 10 muestra un 10% de gel SDS-PAGE de las enzimas TrCel6A parentales y modificadas purificadas. Las celulasas TrCel6A purificadas (5 g cada una) se separaron mediante el 10% de gel SDS-PAGE y el gel se tíñó con Coomassie Brilliant Blue R250. En esta figura, el agregado 1 de TrCel6A (línea 10) y el agregado 2 de TrCel6A (línea 11) se refieren a TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P y TrCel6A-Kl29E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P, respectivamente. La TrCel6A purificada a partir de la celulasa Tri'choderma (línea 2) y los estándares de masa molecular (línea 1) se muestran como referencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención, se relaciona con celulasas modificadas. Más específicamente, la invención se relaciona con celulasas Trichoderma reesei de la familia 6 (TrCel6A) modificadas con inactivación disminuida mediante lignina. La presente invención también se relaciona con los constructos genéticos que comprenden las secuencias de aminoácidos que codifican para las celulasas TrCel6A modificadas, los métodos para la producción de la celulasa TrCel6A modificada a partir de cepas hospederas y el uso de la celulasa TrCel6A modificada en la hidrólisis de la celulosa en presencia de lignina .

La presente invención, proporciona una celulasa TrCel6A modificada con inactivación disminuida mediante lignina y de esta forma, una actividad de hidrolización aumentada de celulosa en una reacción de hidrólisis que comprende la celulasa TrCel6A modificada, celulosa y lignina, con relación a la actividad de hidrolización con celulosa de una celulasa TrCel6A parental a partir de la cual se deriva la celulasa TrCel6A modificada, en una reacción de hidrólisis de la composición equivalente.

La siguiente descripción es una modalidad preferida a manera de ejemplo únicamente y sin limitación a la combinación de las características necesaria para llevar a cabo la invención.

Celulasas TrCel6A modificadas Una enzima de celulasa se clasifica como una celulasa de la familia 6 si exhibe similitud en sus estructuras proteicas primarias, secundarias y terciarias con relación a aquella de otras celulasas de la familia 6. Por ejemplo, todas las celulasas de la familia 6 comprenden dos residuos de ácido aspártico (D) que puedan servir como residuos catalíticos. Estos residuos de ácido aspártico se encuentran en las posiciones 175 y 221 (véase la figura 1; con base TrCel6A, Trichoderma reesei Cel6A, la numeración de aminoácidos) . La mayoría de las celulasas de la familia 6 identificadas hasta ahora son mesofilicas ; sin embargo, esta familia también incluye celulasas termoestables a partir de Thermobifida fusca (TfCel6A y TfCel6B) y las celulasas alcalofílicas a partir de Humicola insolens (HiCel6A y HiCel6B) . Las celulasas de la familia 6 también comparten una estructura tridimensional similar: una centrífuga alfa/beta con una centrífuga beta central que contiene siete cadenas beta paralelas conectadas por cinco hélices alfa. Se conocen estructuras tridimensionales de diversas celulasas de la familia 6, tales como TrCel6A (Rouvinen, J. , et al'. 1990), endo-beta-1 , 4-glucanasa Thermobifida fusca Cel6A (TfCel6A, Spezio, ., et al. 1993), celobiohidrolasa Humicola Insolens Cel6A (HiCel6A, Varrot, A., et al. 1999), endo-beta-1 , 4-glucanasa Humicola insolens Cel6B (HiCel6B, Davies, G.J., et al. 2000) y Mycobacterium tuberculosis H37Rv Cel6A ( tCel6A, Varrot, A., et al. 2005).

Tabla 1: % de identidad de la secuencia de aminoácidos de las celulasas fúngales de la familia 6 para TrCel6A Identidad con el SEQ Organismo Proteina ID dominio catalítico TrCel6Á (83-477) (%) 2 Hypocrea koningii celobiohidrolasa II (Cbh2) 98.9 3 Trichoderma viride CICC 13038 celobiohidrolasa II (Cbhll;Cbh2) 98.9 4 Hypocrea koningii 3.2774 celobiohidrolasa II (Cbh2;Cbhll) 98.1 5 Hypocrea koningii AS3.2774 cbh2 97.8 6 Trichoderma parceramosum celobiohidrolasa II (Cbhll) 97.8 7 Aspergillus nidulans FGSC A4 celobiohidrolasa (AN5282.2) 72.4 8 Aspergillus niger CBS 513.88 An12g02220 72.4 9 Aspergillus oryzae RIB 40 AO090038000439 67.8 10 Aspergillus niger CBS 513.88 An08g01760 67.7 11 Acremonium cellulolyticus Y-94 celobiohidrolasa II (Acc2) i 67.3 12 Talaromyces emersonii celobiohidrolasa II (Cbhll) i 66.8 14 Gibberella zeae K59 Cel6-Cel6 66.1 14 Fusarium oxysporum endoglucanasa 3 ; 66.1 15 Neurospora crassa OR74A NCU09680.1 (64C2.180) 65.9 16 Aspergillus nidulans FGSC A4 AN1273.2 65.5 17 Aspergillus tubingensis producto proteínco no identificado (fragmento) 65.5 18 Magnaporthe grísea 70-15 MG05520.4 ¡ 65-4 19 Chaetomium thermophilum producto proteínco no identificado 65.1 20 Chaetomium thermophilum CT2 celobiohidrolasa (Cbh2) 65.0 21 Stílbella annulate producto proteínco no identificado 64.9 22 Humicola insolens avicelasa 2 (Avi2) 63.7 23 Humicola insolens celobiohidrolasa (CBHII)-Cel6A 63.1 24 Cochliobolus heterostrophus C4 celobiohidrolasa II (CEL7) 5&6 25 Agaricus bisporus D649 celobiohidrolasa II (Cel3;Cel3A) 57.7 26 Polyporus arculanus 69B-8 celobiohidrolasa II (Cel2) 57.1 27 Lentinula edodes Stamets CS— 2 celulasa-Cel6B ,56.3 28 Lentinula edodes L54 celobiohidrolasa (Cbhll-I) ,'56.0 29 Malbranchea cinnamomea producto proteínco no identificado 54.9 30 Phanerochaete chrysosporium celobiohidrolasa II : 54.9 31 Volvariella volvacea celobiohidrolasa ll-l (Cbhll-I) I53.8 32 Chrysosporium lucknowense celobiohidrolasa (EG6.CBH II) - Cel6A !49.5 33 Pleurotus sajor- aju celobiohidrolasa II 47.2 34 Trametes versicolor ORF 47.0 35 Neurospara crassa OR74A NCU03996.1 ^46.8 36 Magnaporthe grísea 70-15 MG04499.4 : I45.1 Como se muestra en la figura 1, existe un alto grado de conservación de la secuencia de aminoácidos primaria entre las celulasas de la familia 6. Múltiples alineamientos a través de 36 secuencias de aminoácidos de la celulasa de la familia 6 actualmente conocidas de origen fungal muestran que la mayoría de las celulasas de la familia 6 que se presentan en la naturaleza exhiben entre aproximadamente 47% hasta aproximadamente 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 83-447 que comprenden el dominio catalítico de TrCel6A (tabla 1) y de aproximadamente 70% hasta 100% de la identidad de secuencia de aminoácidos para al menos otra celulasa de la familia 6. Las celulasas de la familia 6 de origen bacteriano muestran un grado mucho menor de identidad de secuencia de aminoácidos para TrCel6A o para otras celulasas de la familia 6 de origen fungal. TrCel6A es un miembro de la familia 6, de glicósido hidrolasa, que comprende las enzimas que hidrolizan los enlaces b-1,4 glicosidicos con la inversión de una configuración anomérica, denominada en la presente como un "mecanismo de inversión". La familia 6 de glicósido hidrolasas se definen : por el sistema CAZy que se acepta como una nomenclatura estándar para estas enzimas (véase URL: cazy.org).

Por "numeración TrCel6A", se debe entender la numeración correspondiente a la posición de aminoácidos con base en la secuencia de aminoácidos de TrCel6A (ID SEQ NO. 1) . Como se establecerá más adelante, y como resulta evidente por la figura 1, las celulasas de la familia 6 exhiben un grado sustancial de similitud de secuencia. Por lo tanto, mediante la alineación de los aminoácidos para optimizar la similitud de secuencia entre los dominios catalíticos de la familia 6 de las enzimas de celulasa, y al utilizar la numeración de aminoácidos de TrCel6A como la base para la numeración, se pueden determinar las posiciones de los aminoácidos dentro de otras celulasas de la familia 6 con relación a TrCel6A.

Son bien conocidos los métodos para alinear secuencias de aminoácidos y están disponibles para aquellos expertos en la técnica e incluyen BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, URL: blast . ncbi . nlm. nih . gove/Blast . chi; Altschul et al.,' 1990; utilizando los ajustes por omisión publicados) lo cual es útil para alinear dos secuencias y CLUSTALW. (URL: ebi . cak. ak/Tools/clustalw2/index . html ) para la alineación de dos o más secuencias.

Por "celulosa TrCel6A modificada" o "celulasa modificada", se debe entender una celulasa de Trichoderma reesei familia 6 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: la sustitución de un aminoácido básico en una o más de las posiciones 129 y 410 mediante un aminoácido de carga neutra o ácida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y la sustitución de un aminoácido en la posición 185 mediante una treonina; Por ejemplo, lo cual no se debe considerar limitante, la celulasa de TrCel6A modificada puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de K129E, S186T, A322D, Q3.63E, R410G, y R410Q.

En el sentido en el que se define en la presente, "aminoácido básico", se refiere a cualquiera¦ de histidina, lisina o arginina, "aminoácido de carga ácida", se refiere a cualquiera de ácido aspártico o ácido glutámico y "aminoácido de carga neutra" es cualquier aminoácido que no sea un aminoácido ni básico ni ácido.

Se debe entender que la celulasa TrCel6A modificada se puede derivar de una celulasa TrCel6A tipo silvestre o de una celulasa TrCel6A que ya contenga otras sustituciones de aminoácidos.

Una "celulasa TrCel6A modificada", también se puede definir como una enzima capaz de hidrolizar polisacáridos utilizando un mecanismo de inversión y que tenga una o más sustituciones de aminoácidos, introducidas mediante técnicas de ingeniería genéticas, seleccionadas del grupo que consiste de: la sustitución de un aminoácido básico en una o más de las posiciones 129 y 410 mediante un aminoácido de carga neutra o ácida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y la sustitución de un aminoácido en la posición 186 mediante una treonina; y que se caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente 47% hasta aproximadamente 99.9% idéntica a los aminoácidos 83 hasta 447 de la secuencia de aminoácidos TrCel6A (ID SEQ NO 1). Por ejemplo, una celulasa TrCel6A modificada puede tener una secuencia de aminoácidos que sea aproximadamente 47%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 de la SEQ ID NO: 1. Alguien con experiencia en la técnica apreciará que la secuencia de aminoácidos de una celulasa TrCel6A determinada se puede modificar mediante la adición, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos y todavía se considerará una celulasa TrCel6A modificada, dado que se conserva la estructura y función básica de la enzima.

La celulasa TrCel6A modificada de la presente invención se codifica por una secuencia de aminoácidos que se puede generar utilizando material genético o ácido nucleico o una información de secuencia de aminoácidos específica para la celulasa TrCel6A modificada deseada o para una celulasa TrCel6A parental correspondiente. Como se sabe por alguien con experiencia en la técnica, este material o información de secuencia se puede utilizar par generar una secuencia de aminoácidos que codifique para una celulasa TrCel6A deseada utilizando una o más técnicas de biología molecular para alterar las secuencias de aminoácidos incluyendo, dé manera enunciativa, mutagénesis sitio-dirigida, mutagénesis en cásete, mutagénesis aleatoria, construcción de oligonucleótidos sintéticos, clonación, sub-clonación, amplificación mediante PCT, síntesis in vitro y otras técnicas de ingeniería genéticas (Eijsink VG, et al., 2005). Se debe entender que la celulasa TrCel6A modificada se puede derivar de cualquier celulasa TrCel6A -es decir, sé puede derivar de una celulasa de TrCel6A que se presenta en la naturaleza o "tipo silvestre" o de una celulasa TrCel6A que ya contenga otras sustituciones de aminoácidos.

En una modalidad de la invención, la celulasa TrCel6A modificada comprende una secuencia de aminoácidos que sea de aproximadamente 70% hasta 99.9% idéntica; a los aminoácidos 83-447 de la SEQ ID NO: 1, y exhiba al menos un 15% de reducción en el grado de desactivación de la celulasa TrCel6A modificada mediante lignina con relación a la de una celulasa TrCel6A parental a partir de la cual se deriva la celulasa TrCel6A modificada. La celulasa TrCel6A modificada es capaz de hidrolizar polisacáridos utilizando un mecanismo de inversión.

En otras modalidades de la invención, la celulasa TrCel6A modificada comprende una secuencia de aminoácidos que sea entre aproximadamente 90% hasta aproximadamente 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 de la SEQ ID NO: 1, y exhiba al menos un 15% de reducción en el grado de desactivación de la celulasa TrCel6A modificada mediante lignina con relación a la de una celulasa TrCel6A parental a partir de la cual se deriva la celulasa TrCel6A modificada. La celulasa TrCel6A modificada es capaz de hidrolizar polisacáridos utilizando un mecanismo de inversión.

Por celulasa TrCel6A "tipo silvestre" o "natural", se debe entender las celulasas de la SEQ ID NO: , 1, sin ninguna de las sustituciones de aminoácidos.

Para los fines de la presente invención, una "celulasa TrCel6A parental" o "celulasa parental" es una celulasa TrCel6A que no contenga las sustitución de aminoácidos presentes en la celulasa TrCel6A¦ modificada, a saber una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: la sustitución de un aminoácido básico en una o más de las posiciones 129 y 410 mediante un aminoácido de carga neutra o ácida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y ; la sustitución de un aminoácido en la posición 186 mediante una treonina; pero que de otra manera sea idénticas a la celulasa TrCel6A modificada. Como tal, la celulasa TrCel6A parental puede ser una celulasa TrCel6A que contenga las sustituciones de aminoácidos en otras posiciones que se hayan introducido mediante ingeniería genética u otra técnica y que sea capaz de hidrolizar polisacáridos utilizando un mecanismo de inversión. A manera de ejemplo, la celulasa parental correspondiente a una celulasa TrCel6A modificada qüe tiene las sustituciones de aminoácidos básicas en las posiciones 129 y 410 para los aminoácidos de carga neutra o ácidos podría ser una celulasa TrCel6A que no tenga los aminoácidos de carga neutra o ácida, en ambas de estas porciones, pero que de otra manera podría ser idéntica a la TrCel6A modificada. Sin embargo, la celulasa parental y la TrCel6A modificada pueden contener sustituciones de aminoácidos en otras posiciones con la condición de que estas- sustituciones de aminoácidos estén presentes en las celulasas tanto modificadas como parentales. La celulasa parental , también podría ser una enzima tipo silvestre. Al' comparar la actividad de la celulasa TrCel6A modificada con una celulasa parental que sea idéntica a la celulasa modificada excepto para las sustituciones de aminoácidos introducidas de 'acuerdo con la invención, el efecto de estas sustituciones de aminoácidos sobre la actividad de la enzima en presencia de lignina se puede cuantificar utilizando los ensayos descritos más adelante.

Alternativamente, después de la producción, de una celulasa TrCel6A modificada que comprende una , o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: la sustitución de un aminoácido básico en una o más de las posiciones 129 y 410 mediante un aminoácido de carga neutra o ácida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y la sustitución de un aminoácido en la posición 186 mediante una treonina; la celulasa TrCel6A modificada se puede modificar además posteriormente para que contenga sustituciones de aminoácidos adicionales. La celulasa TrCel6A modificada será capaz de hidrolizar polisacáridos utilizando un mecanismo de inversión .

Con el fin de ayudar a alguien experto en la técnica con relación al lugar en donde se puedan realizar otras sustituciones de aminoácidos (distintas . de las posiciones 129, 186, 322, 363 y 410) de una celulasa TrCel6A determinada para producir una enzima activa, en la figura 1 se proporciona una alineación de las treinta y seis celulasas de la familia 6 derivadas de fuentes fúngales junto con una gráfica que muestra la frecuencia de ocurrencia de cada aminoácido de la secuencia consensual en cada posición. Utilizando la información proporcionada en la figura 1, alguien experto en la técnica podría reconocer las regiones de baja conservación de secuencias entre las celulasas de la familia 6 y podría introducir sustituciones de aminoácidos adicionales en estas regiones con la condición de . que la enzima exhiba una actividad de la celulasa Cell6A.

Disminución de la inactivación de las celulasas TrCel6A mediante lignina La disminución en la inactivación de la celulasa TrCel6A modificada mediante lignina se determina al medir la degradación de la celulosa u otro sustrato adecuado de celulasa (tal como beta-glucano) en presencia y ausencia de lignina y luego tomar la proporción de actividad en presencia de lignina a la actividad en ausencia de lignina. La , lignina presente en esta reacción de hidrólisis de celulosa puede formar parte del sustrato insoluble, tal como, en la lignocelulosa pre-tratada, o se puede aislar en una forma soluble o insoluble. Si la lignina se aisla o purifica, la inactivación de la celulasa TrCel6A modificada o parental mediante lignina se determina al medir la actividad de' la celulasa en reacciones de hidrólisis equivalentes, en donde una de las reacciones contiene una cantidad suficiente de lignina para reducir la actividad de la celulasa. Alternativamente, la lignina aislada que se ha tratado será menos desactivante mediante el recubrimiento con una proteína no específica tal como la albúmina de suero bovino (BSA) , un tensioactivo u otro producto químico se puede agregar a la reacción control en las mismas cantidades que la lignina sin tratar. Si la lignina forma parte del sustrato insoluble, la inactivación de la celulasa o TrCel6A modificada parental mediante lignina se determina al tomar la proporción de la actividad de la celulasa en un sustrato aclarado (a partir del cual se ha retirado la lignina, por ejemplo, mediante un oxidante tal como, dióxido de cloro) y la actividad de la celulasa en un sustrato que contiene lignina, sin aclarar. Una celulasa TrCel6A modificada con inactivación disminuida mediante lignina mostrará una mayor proporción de actividad (+ lingina aislada, sin tratar: sin lignina o .lignina tratada) que la celulasa TrCel6A parental.

Existen diversos ensayos para medir la actividad de la celulasa de las celulasas TrCel6A modificadas y parentales conocidas por un experto en la técnica. Sin embargo, se debe entender que la práctica de la presente invención no se limita por el método utilizado para valorar la actividad de la celulasa TrCel6A modificada.

Por ejemplo, la hidrólisis de celulosa se puede supervisar al medir la liberación dependiente de enz;imas de agentes reductores, que se cuantifican en análisis químicos o quimioenzimáticos posteriores conocidos por un experto en la técnica, incluyendo la reacción con ácido dinitrosalisilico (DNS) . La hidrólisis de polisacáridos también se puede supervisar mediante métodos cromatográficos que separen y cuantifiquen los mono-, di- y oligo-sacáridos solubles, liberados por la actividad enzimática. Además, se pueden incorporar sustratos colorimétricos solubles en un medio de agar en el cual se desarrolla un microbio hospedero que expresa y secreta una celulasa de la familia 6 parental o modificada. En este ensayo de placa con agar, la actividad de la celulasa se detecta como un halo de color o sin color alrededor de la colonia microbiana individual que expresa y secreta una celulasa activa.

El efecto de las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 129, 186, 322, 363 y 410 sobre la inactivación de lignina de una TrCel6A parental se determinó : vía un estudio comparativo de las actividades relativas de hidrolización con celulosa de la TrCel6A-S 13P parental y las celulasas TrCel6A modificadas en presencia de lignina sin tratar, aislada (-BSA) y lignina tratada (+BSA) , como se describe en el ejemplo 6. Para cada proteína, cada proporción de las dos actividades se normaliza a 1.0 .para la TrCel6A-S413P parental. Los resultados se muestran en la figura 4. La totalidad de celulasas de la familia 6 modificadas muestran al menos un 15% de proporción superior de actividad después de la preincubación con lignina sin tratar: actividad después de la preincubación con lignina tratada con BSA.

En una modalidad preferida, la celulasa TrCel6A modificada exhibe al menos un 15% de disminución en su inactivación mediante lignina con relación a una celulasa parental según se mide en los ensayos descritos . en los ejemplos 6 y 7. Por ejemplo, la celulasa TrCel6A modificada puede exhibir entre aproximadamente 15% hasta aproximadamente 400%, o cualquier cantidad entre las mismas, de disminución en su inactivación mediante lignina con relación a una celulasa parental. La celulasa TrCel6A modificada puede exhibir 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350% o 400% de disminución en su inactivación mediante lignina con relación a una celulasa parental.

Constructos genéticos que codifican para la celulasa TrCel6 modificada La presente invención también se relaciona con constructos genéticos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para una celulasa TrCel6A modificada. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la celulasa modificada se puede enlazar funcionalmente a secuencias de ácido nucleico reguladoras que dirigen la expresión y secreción de la celulasa TrCel6A modificada a partir de un microbio hospedero. Mediante "secuencias de ADN reguladoras", se debe entender un promotor y una secuencia de ADN que codifica para un péptido con señal de secreción. Las secuencias de ADN reguladoras de preferencia son funcionales en un hospedero fungal. Las secuencias de ADN se pueden derivar de secuencias de ácido nucleico que se expresen y secreten bastante en el microbio hospedero bajo condiciones de fermentación industrial. En una modalidad preferida, las secuencias reguladoras se derivan de una o más de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la celulasa o hemicelulasa Tríchoderma reesei.

El constructo genético puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable para permitir el aislamiento de un microbio modificado genéticamente transformado con la estructura como se sabe comúnmente por un experto en la técnica. El marcador seleccionable puede conferir resistencia a un antibiótico o la capacidad de crecer en medio que carezca de un nutriente especifico al organismo hospedero que de otra manera podría no crecer bajo estas condiciones. Sin embargo, la presente invención no se limita por la elección del marcador seleccionable o secuencia de ácido nucleico que codifica para el marcador seleccionable, y alguien con experiencia en la técnica puede determinar fácilmente un marcador adecuado. En una modalidad preferida, el marcador seleccionable confiere resistencia a higromicina, fleomicina, canamicina, geneticina, o G418, complementa una deficiencia del microbio hospedero en uno de los genes trp, arg, leu, pyr4 , pyr, ura3, ura5, his, o ade o confiere la capacidad de crecer en acetamida como una fuente única de nitrógeno. ! El constructo genético puede comprender, además otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, terminadores transcripcionales , secuencias de ácido nucleico que codifican para marcas de péptidos, secuencias sintéticas para , enlazar las diversas secuencias de ácido nucleico conjuntamente, los orígenes o replicación, y lo semejante. Sin embargo, ; se debe entender que la práctica de la presente invención no se limita por la presencia de cualquiera de uno o más de estas otras secuencias de ácido nucleico.

Microbios modificados geneticamentes que producen las celulasas TrCel6 modificadas La celulasa TrCel6A modificada se pueden expresar y secretar a partir de un microbio modificado genéticamente producido mediante la transformación de un microbio hospedero con un constructo genético que codifica para la celulasa TrCel6A modificada. El microbio hospedero puede ser una levadura o un hongo filamentoso, en particular aquellos microbios que son miembros del phylum Ascomycota'. Los géneros de levaduras útiles como microbios hospederos para la expresión de las celulasas TrCel6A modificadas de la presente invención, incluyen Saccharomyces , Pichia, Hansenula, Kluyveromyces , Yarrowia, y Arxula. Los géneros de hongos útiles como microbios para la expresión de beta-glucosidasas TrCel3A modificadas de la presente invención incluyen Trichoderma , Hypocrea, Aspergillus , Fusarium, Húmicola, neuroespora , y Penicillium. Típicamente, el microbio hospedero es uno a partir del cual se pueden suprimir los genes que codifican para cualquiera o la totalidad de celulasa de la familia 6. En una modalidad más preferida, el microbio hospedero es una cepa industrial de Trichoderma reesei .

El constructo genético se puede introducir en el microbio hospedero mediante cualquier número de métodos conocidos por un experto en la técnica de transformación microbiana, incluyendo de manera enunciativa, el tratamiento de las células con CaCl2, electroporación, bombardeo biolístico, fusión de protoplastos suministrada por PEG (por ejemplo, hite et al., WO 2005/093072). Después de seleccionar las cepas fúngales recombinantes que expresan la celulasa TrCel6A modificada, las mismas se pueden cultivar en fermentaciones sumergidas en líquido bajo condiciones que induzcan la expresión de la celulasa TrCel6A modificada. De preferencia, la celulasa TrCel6A modificada se .produce en una fermentación de cultivo sumergido en liquido y se separa de las células al término de la fermentación. Las células se pueden separar mediante filtración, centrifugación u otros procesos familiares por aquellos expertos en la técnica. La fracción que contiene celulasa libre de células entonces se puede concentrar (por ejemplo, vía ultrafiltración) , conservar, y/o estabilizar antes de utilizarse.

Por lo tanto, la presente invención ¡ también proporciona un proceso para producir una celulasa de TrCel6A modificada. El método comprende desarrollar un microbio modificado genéticamente que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica parea una celulasa ; TrCel6A modificada, en un medio de cultivo bajo condiciones que induzcan la expresión y secreción de la celulasa : TrCel6A modificada, y recuperar la celulasa TrCel6A modificada del medio de cultivo. La celulasa TrCel6A modificada comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: la sustitución de un aminoácido básico en una o más de las posiciones 129 y 410 mediante un aminoácido de carga neutra o ácida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y la sustitución de un aminoácido en la posición 186 mediante una treonina; en donde los aminoácidos 83-447 de la celulasa TrCel6A modificada son entre aproximadamente 47% hasta aproximadamente 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 de la SEQ ID NO: 1. .

Producción de las celulasas TrCel6 modificadas Una celulasa TrCel6A modificada de la presente invención se puede producir en un proceso de fermentación utilizando un microbio modificado genéticamente que comprende un constructo genético que codifica para la celulasa TrCel6A modificada, por ejemplo, en una fermentación de cultivo sumergida en liquido.

Las fermentaciones de microorganismos sumergidas en liquido, entre las que se incluyen Trichoderma y hongos filamentosos relacionados, típicamente se conducen como un proceso por lotes, alimentado por lotes o continuo.1 En un proceso por lotes, todos los materiales necesarios, con excepción del oxígeno para procesos aeróbicos, se colocan en un reactor al inicio de la operación y se deja que la fermentación prosiga hasta término, en cuyo punto el ,producto se recolecta. Un proceso por lotes para producir la celulasa TrCel6A modificada de la presente invención se puede llevar a cabo en un matraz librador o un bio-reactor.

En un proceso de alimentación por lotes, el, cultivo se alimenta continua o secuencialmente con uno o más componentes del medio sin el retiro del fluido de cultivo. En un proceso continuo, se suministra medio recién preparado y el fluido para cultivo se retira continuamente a velocidades volumétricamente iguales para mantener el cultivo a un índice de desarrollo estable.

Un experto en la técnica se dará cuenta de que el medio de fermentación comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y otros nutrientes, vitaminas y minerales que se pueden agregar al medio de fermentación para mejorar el desarrollo y producción de enzimas de la célula hospedera. Estos otros componentes del medio se pueden agregar antes de, simultáneamente con o después de la inoculación del cultivo con la célula hospedera.

Para el proceso para producir la celulasa' TrCel6A modificada de la presente invención, la fuente de- carbono puede comprender un carbohidrato que inducirá la expresión de la celulasa TrCel6A modificada a partir de un constructo genético en el microbio modificado genéticamente. Por ejemplo, si el microbio modificado genéticamente es una cepa de Trichoderma, la fuente de carbono puede comprender uno o más de celulosa, celobiosa, seforosa, y oligo o polisacáridos relacionados conocidos para inducir la expresión de célulasas y beta-glucosidasa en Trichoderma . ; En el caso de la fermentación por lotes, la fuente de carbono se puede agregar al medio de fermentación ' antes o simultáneamente con la inoculación. En el caso, de la alimentación por lotes o las operaciones continuas, la fuente de carbono también se puede suministrar continua o intermitentemente durante el proceso de fermentación. Por ejemplo, cuando el microbio modificado genéticamente es una cepa Trichoderma, la velocidad de alimentación de carbono es entre 0.2 y 2.5 g carbono/L de cultivo/h, o cualquier cantidad entre las mismas.

El proceso para producir la celulasa .¦ TrCel6A modificada de la presente invención se puede llevar á cabo a una temperatura entre aproximadamente 20 °C ; hasta aproximadamente 40°C, o cualquier temperatura entre las mismas, por ejemplo entre aproximadamente 25 °G hasta aproximadamente 37 °C, o cualquier temperaturas entre' las mismas, o de 20, 22, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, ;37, 40°C o cualquier temperatura entre las mismas. i El proceso para producir la celulasa. ; TrCel6A modificada de la presente invención se puede llevar a cabo a un pH de aproximadamente 3.0 hasta 6.5, o cualquier pH entre los mismos, por ejemplo de aproximadamente pH 3.5 hasta pH 5.5, o cualquier pH entre éstos, por ejemplo de aproximadamente pH 3.0, 3.2, 3.4, 3.5, 3.7, 3.8, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.2, 5.4, 5.5, 5.7, 5.8, 6.0, 6.2, 6.5 o cualquier pH entre éstos.

Después de la fermentación, el caldo de fermentación que contiene la celulasa TrCel6A ' modificada se puede utilizar directamente, o la celulasa TrCel6A modificada se puede separar de las células fúngales, por ejemplo, mediante filtración o centrifugación. Los ¡solutos moleculares inferiores tales como componentes sin consumir del medio de fermentación se pueden retirar mediante ultra-filtración. La celulasa de la familia 6 modificada se puede concentrar, por ejemplo, mediante evaporación, precipitación, sedimentación o filtración. Los productos químicos, tales como glicerol, sacarosa, sorbitol y lo semejante se pueden agregar para estabilizar la enzima de la celulasa., Otros productos químicos, tales como benzoato de sodio o sorbato de potasio, se pueden agregar a la enzima de la celulasa para evitar el desarrollo de contaminación microbiana.

Proceso de hidrólisis para celulosa utilizando una celulasa TrCel6A modificada La celulasa TrCel6A modificada de la jpresente invención se utiliza para la hidrólisis enzimá'tica de celulosa en una reacción de hidrólisis que comprende además lignina. Por ejemplo, la celulasa TrCel6A modificada de la presente invención se utiliza para la hidrólisis enzimática de un sustrato lignocelulósico pre-tratado. La celulasa TrCel6A modificada de la presente invención se puede utilizar en procesos industriales tales como la producción de azúcares fermentables , alcoholes de azúcar o alcoholes para quemar,.

La enzima de celulasa TrCel6A modificada de la invención se puede utilizar para la hidrólisis enzimática de un "sustrato lignocelulósico pre-tratado". Un sustrato lignocelulósico pre-tratado es un material de origen vegetal que, antes del pre-tratamiento, contiene al menos 20% de celulosa (peso en seco) , de mayor preferencia mayor de aproximadamente 30% de celulosa, incluso de mayor preferencia más del 40% de celulosa, por ejemplo 20, 22, 24, 26,: 28,. 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 55, 60, 65, j 70, 75, 80, 85, 90% o cualquier % entre los mismos, y al menos 10% de lignina (peso en seco) , más típicamente al menos 12% (peso seco) y que haya sido sometido a procesos físicos y/o químicos para hacer la fibra más accesible y/o receptiva a las acciones de las enzimas celulolíticas .

Después del pre-tratamiento, la materia prima de alimentación lignocelulósica puede contener : niveles superiores de celulosa. Por ejemplo, si se emplea pre- tratamiento con ácido, el componente de hemicelulosa es hidroliza, lo cual aumenta el nivel relativo de celulosa. En este caso, la materia prima de alimentación pre-tratada puede contener más de aproximadamente el 20% de celulosa y más de aproximadamente el 12% de lignina. En una modalidad, la materia prima de alimentación del lignocelulósica pre-tratada contiene más de aproximadamente el 20% de celulosa y más de aproximadamente el 10% de lignina. ; Las materias primas de alimentación lignocelulósica que se pueden utilizar en la invención incluyen, de manera enunciativa, residuos agrícolas tales como forraje de maíz, paja de trigo, paja de cebada, paja de arroz, paja de avena, paja de cañóla, y forraje de soya; los residuos del' proceso de fibra tales como, fibra de maíz, pulpa de betabel blanco, finos y desechos del molido de pulpa o el bagazo de; caña de azúcar; residuos forestales tales como, madera de álamo, otras maderas duras, madera suave, y aserrín; pastos tales como, pasto de vara, miscanthus, pasto cord, y ;caña de alpiste, o productos de papel para desechar después de consumir.

La materia prima de alimentación lignocelulósica se puede someter primero a reducción de tamaño mediante métodos que incluyen, de manera enunciativa, molienda, trituración, agitación, desagarrado, compresión/expansión, u otros tipos de acción mecánica. La reducción de tamaño mediante la acción mecánica se puede realizar por cualquier tipo de equipo adaptado para este fin, por ejemplo, de; manera enunciativa, un molino triturador.

Los ejemplos no limitantes de los procesos de pre-tratamiento incluyen que el tratamiento químico de una materia prima de alimentación lignocelulósica con ácido sulfúrico o sulfuroso, u otros ácidos; amoniaco, cal, hidróxido de amonio, u otro álcali; etanol, butanol, : u otros solventes orgánicos; o agua presurizada (véanse, las; patente de los Estados Unidos Nos. 4,461,648, 5,916,780, 6,090,595, 6,043,392, 4,600,590, Weil et al., (1997)).

El pre-tratamiento se puede llevar a cabo para hidrolizar la hemicelulosa, o una porción de la misma, que esté presente en la materia prima de alimentación lignocelulósica para azúcares monoméricos, por ! ejemplo xilosa, arabinosa, mañosa, galactosa, o combinaciones de las mismas. De preferencia, el pre-tratamiento se lleva a cabo de tal forma que se presente una hidrólisis casi completa de la hemicelulosa y una pequeña cantidad de conversión de la celulosa a glucosa. Durante el pre-tratamiento, típicamente una concentración de ácido en la suspensión acuosa de aproximadamente 0.02% (p/p) hasta aproximadamente 2% (p/p) , o cualquier cantidad entre los mismos, se utiliza para el tratamiento de la materia prima de alimentación lignocelulósica . El ácido puede ser, de manera enunciativa, ácido clorhídrico, ácido nítrico, o ácido sulfúrico. Por ejemplo, el ácido utilizado durante el pre-tratamiento es ácido sulfúrico.

Un método de realizar el pre-tratamiento con ácido de la materia prima de alimentación es la explosión de vapor utilizando las condiciones del proceso establecidas en la patente de los Estados Unidos No. 4,461,648. Otro método para pre-tratar la suspensión de la materia prima de alimentación implica un pre-tratamiento continuo, lo que significa que la materia prima de alimentación lignocelulósica se bombea a través de una , reactor continuamente. El pre-tratamiento continuo con ácido es familiar para aquellos expertos en la técnica; véáse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,536,325; WO 2006/128304; y la patente de los Estados Unidos No. 4,237,226. Según se requiera se pueden utilizar en este campo técnicas adicionales conocidas tales como el, proceso expuesto en la patente de los Estados Unidos No. 4,556,430.

Como se observó anteriormente, el pre-tratamiento se puede conducir con álcali. En contraste con el pre-tratamiento con ácido, el pre-tratamiento con álcali no hidroliza el componente de hemicelulosa de la materia prima de alimentación, sino que en su lugar el álcali reacciona con los grupos ácidos presentes en la hemicelulosa para abrir la superficie del sustrato. La adición de álcali también puede alterar la estructura cristalina de la celulosa de tal forma que sea más tratable para la hidrólisis. Los ejemplos de álcali que se pueden utilizar en el pre-tratamiento incluyen amoniaco, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, e hidróxido de sodio. El pre-tratamiento de preferencia no se conduce con álcali que sea insoluble en agua, tal como cal y hidróxido de magnesio.

Un ejemplo de un pre-tratamiento con, álcali adecuado, diversamente conocido como explosión por congelación con amoniaco, explosión de fibras con amoniaco o expansión de fibras con amoniaco (proceso "AFEX"), implica poner en contacto la materia prima de alimentación lignocelulósica con amoniaco e hidróxido de amonio en un recipiente á presión durante un tiempo suficiente para permitir que el amoniaco o hidróxido de amonio alteren la estructura cristalina de las fibras de celulosa. La presión luego se reduce rápidamente, lo cual permite que el amoniaco se encienda o hierva y haga estallar la estructura de fibra de celulosa. (Véanse las patente de los Estados Unidos Nos. 5,171,592, 5,037,663, 4,600,590, 6,106,888, 4,356,196, 5, 939, 544, 6, 176, 176, 5,037, 663 y 5,171, 592). amoniaco encendido entonces se puede recuperar de acuerdo con procesos conocidos .

La materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada se puede procesar después del pre-tratamiento pero antes de la hidrólisis enzimática mediante cualquiera de diversos pasos, tales como, dilución con agua, lavado con agua, amortiguamiento, filtración, o centrifugación, o una i combinación de estos procesos, antes de la hidrólisis enzimática, como es familiar para aquellos expertos en la técnica.

La materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada enseguida se somete a hidrólisis enzimática. Mediante el término "hidrólisis enzimática", se debe entender un proceso mediante el cual las enzimas de celulasa actúan sobre la celulosa para convertir la totalidad o una . porción de la misma a azucare solubles. Se debe entender que los azúcares solubles incluyen monómeros y oligómeros de hexosa solubles en agua de hasta seis unidades monoméricas' que se derivan de la porción de celulosa de la materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada. Los ejemplos de azúcares solubles incluyen, pero no se limitan a, glucosa, celobiosa, celodextrinas, o mezclas de las mismas. Los azúcares solubles pueden ser predominantemente celobiosa y glucosa. Las azúcares solubles pueden ser predominantemente glucosa .

El proceso de hidrólisis enziraática de preferencia convierte entre aproximadamente 80% hasta aproximadamente 100% de la celulosa a azúcares solubles, o cualquier combinación entre los mismos. De mayor preferencia, el proceso de hidrólisis enzimática convierte entre aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100% de la celulosa a azúcares solubles, o cualquier variación entre los mismos. En la modalidad más preferida, el proceso de hidrólisis enzimática convierte entre aproximadamente 98%· hasta aproximadamente 100% de la celulosa a azúcares solubles, o cualquier variación entre los mismos. El proceso de hidrólisis enzimática puede ser hidrólisis por lotes, hidrólisis continua, o una combinación de las mismas. El proceso de hidrólisis puede ser agitado o sin mezclar, o una combinación de los mismos.

El proceso de hidrólisis enzimática de preferencia se lleva a cabo a una temperatura entre aproximadamente 45°C hasta aproximadamente 75 °C, o cualquier temperatura entre las mismas, por ejemplo una temperatura de 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75°C, o cualquier temperatura entre las mismas, a un pH de entre aproximadamente 3.5 hasta aproximadamente' 7.5, o cualquier pH entre los mismos, por ejemplo una temperatura de 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, o pH entre las mismas. La concentración inicial de celulosa en el: reactor para hidrólisis, antes de iniciar la hidrólisis, de preferencia es entre aproximadamente 4% (p/p), hasta aproximadamente 15% (p/p) , o cualquier cantidad entre los mismos, por ejemplo 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15% o 'cualquier cantidades entre las mismas. La dosificación combina'da de la totalidad de enzimas de celulasa primarias puede ser entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg de ¡ proteína por gramo de celulosa, o cualquier cantidad entre las' mismas, por ejemplo 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70;,; 80, 90, 100 mg de proteína por gramo de celulosa o cualquier' .cantidad entre las mismas. La hidrólisis se puede llevar cabtí durante un periodo de tiempo entre aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 200 horas, o cualquier tiempo e'ritre los mismos, por ejemplo, la hidrólisis se puede llevar a cabo durante un período de 15 horas hasta 100 horas, o cualquier tiempo entre los mismos, o se puede llevar a cabo durante 12, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70175, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200 o cualquier tiempo entre los mismos. Se debe apreciar que las condiciones de reacción no se deben interpretar como limitantes de la invención de ninguna forma y se pueden ajusfar como ,se desee por aquellos expertos en la técnica. ' El proceso de hidrólisis enzimática típicamente se lleva a cabo en un reactor para hidrólisis. La enzima de celulasa se agrega a la materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada (también denominada ! como el "sustrato") antes, durante, o después de la adición del sustrato al reactor para hidrólisis.

La enzima de celulasa puede ser una mezcla de enzimas de celulasa que comprende la celulasa TrCel6A modificada y otras enzimas de celulasa producidas én una o más fermentaciones de cultivo sumergidas en liquido. La celulasa TrCel6A modificada y otras enzimas de celulasa de esta forma producidas se pueden separar de las células al término de la fermentación mediante filtración, centrifugación, u otros procesos familiares para aquellos expertos en la técnica. Las fracciones que contienen celulasa libres de células luego se pueden concentrar (por ejemplo, vía ultrafiltración) , conservar, y/o estabilizar antes de utilizarse. Alternativamente, la celulasa: TrCel6A modificada y otras enzimas de celulasa no se separan de las células, pero se agregan a la hidrólisis enzimática con las células .

EJEMPLOS La presente invención se ilustrará adicionalmente los siguientes ejemplos. Sin embargo, se debe entender que estos ejemplos son para fines ilustrativos únicamente y no se deben utilizar para limitar el alcance de la presente invención en ninguna forma.

El ejemplo 1 describe las cepas y .vectores utilizados en los siguientes ejemplos. El ejemplo 2: 'describe la clonación del gen y la transformación de TrCel6A-S413P en levadura. El ejemplo 3 resume la preparación: de la biblioteca PCR propensa a errores de TrCel6A-S413P. El ejemplo 4 describe la expresión de las celulasas ; TrCel6A modificadas a partir de micro-cultivo. El ejemplo 5' ¡describe el aislamiento y preparación de la lignina. Los ejemplos 6 y 7 describen los ensayos de selección de alto rendimiénto para identificar las celulasas TrCel6A modificadas ; : con la inactivación disminuida mediante lignina. El ejemplo 8 describe la preparación de las celulasas TrCel6A modificadas agregadas. El ejemplo 9 describe la expresión y purificación de las celulasas TrCel6A parentales y modificadas. El ejemplo 10 resume la prueba de las celulasas TrCel6A parentales y modificadas purificadas en el ensayo: 1 y el ensayo 2 de alto rendimiento. Por último, el ejemplo 11 describe la prueba de las celulasas TrCel6A parentales y modificadas purificadas en experimentos del curso de tiempo de inactivación con lignina. ; Ejemplo 1 : Cepas y vectores La cepa Saccharomyces cerevisiae YDR483W BY4742 [14317] (MATa his3Al leu2A0 lys2 ?0 ura3 ?0 Akre2) se obtuvo de ATCC (#401317). El vector YEp352/PGK91-l se obtuvo del instituto nacional de salud. El vector YEpFLAG AKpnl0-S413P se describe en la WO2008/025154A1. El vector YEpFLAG-1 se obtuvo de sigma como parte del kit para expresión FLAG de levadura amino-terminal .

Ejemplo 2: Clonación del gen TrCel6A-S413P en el YEp352/PGK91-l y la transformación en levadura Para facilitar la clonación utilizando las enzimas de restricción Nhel y Kpnl, el único sitio de Nhel en la posición 1936 del vector YEp352 /PGK91-1 se hizo romo utilizando el fragmento largo de Polimerase I con ADN (Klenow) para generar el YEp352/PGK91-l ANhel . El gen TrCel6A-S413P se amplificó mediante PCR a partir del vector YEpFLAG A pn-10-S413P (WO2008/025164A1 ) utilizando los cebadores 5'NheCel6A y 3' BglKpnCel6A. En paralelo, la secuencia líder con factor alfa de levadura se amplificó mediante PCR a partir del vector YEpFLAG-1 (Sigma) utilizando los cebadores ( 5' BglAlphaSS y 3' NheAlphaSS) para introducir Bg/II en el extremo 5' y un sitio Nhel en el extremo 3' del amplicón .

La secuencia líder con factor alfa de levadura se aisló mediante digestión con Bg/II/Nhel y una ligación de tres piezas realizada con el gen TrCel6A-S413P (aislado mediante la digestión con Nhel/Bg/II) y el vector YEp352/PGK91-l ANhel (aislado mediante la digestión con Bg/II) . El vector resultante YEp352/PGK91-lANheI-alphass- TrCel 6A-S413P (Figura 2) se transformó en la cepa de levadura BY4742 utilizando el procedimiento descrito por Gietz, R. D. and Woods, R.' A. (2002) . Enseguida se listan las secuencias cebadoras: 5'BglAlphaSS: 5 'ACC AAA AGA TCT ATG AGA TTT CCT TCA ATT (SEQ ID NO: 46) 3'NheAlphaSS: 5 ' TGA GCA GCT AGC CCT TTT ATC CAA AGA TAC ( SEQ ID NO: 47) 5'NheCel6A:' 5' AAA AGG GCT AGC TGC TCA AGC GTC TGG GGC (SEQ ID NO: 48) 3'BglKpnCel6A: 5'GAG CTC AGA TCT GGT ACC TTA CAG GAA CGA TGG GTT (SEQ ID NO: 49) Ejemplo 3: Elaboración de las bibliotecas PCR propensas a error Las bibliotecas de mutagénesis aleatorias se generaron utilizando un método de polimerasa ;con ADN utazyme® II. Para el método de polimerasa con ADN Mutazyme® II, se realizó una serie de cuatro PCR independientes utilizando 10, 20, 30, 40 ng del vector de YEp352!/PGK91-1 ANheI-ass-TrCel6A-S 13P y la polimerasa con ADN Mutazyme® II con los cebadores YalphaN21 y el 3'PGK-term: La amplificación se realizó durante 25 ciclos. Los cuatro productos PCR se reunieron y diluyeron a 10 ng/^L. Se realizó un segundo paso de mutagénesis PCR utilizando 30 ng del producto PCR reunido con la polimerasa de · ADN Mutazyme© II utilizando los mismos cebadores para 30 ciclos de amplificación. El vector YEp352/PGK91-lAA/heI-ass- rCeI 6A-S413P se digirió con N el y Kpnl y se aisló el fragm'ento con vector vacio. Este fragmento lineal y el amplicón final se transformaron simultáneamente y se clonaron 1 mediante recombinación in vivo en la cepa de levadura BY4742' (Butler et al. , 2003) . 1 ; YalphaN21: 5'AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG (SEQ ID NO: 45) 3'PGK-term: 5'GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC (SEQ ID !NO: 56) Ejemplo 4: Expresión y aislamiento de las células TrCel6A parentales y modificadas a partir de cultivos en microplaca Este ejemplo describe la selección y expresión de las celulasas TrCel6A-S 13P y las celulasas : TrCel6A modificada a partir de Saccharomyces cerevisiáe para utilizarse en ensayos de selección de alto rendimiento (ejemplos 6 y 7) Los transformantes de Saccharomyces cerevisiáe a partir del ejemplo 3 se desarrollaron en placas que contuvieron medio completo sintético (SC: 2% de agar p/v, 0.17% base de nitrógeno en levadura p/v, 0.078% de suplemento con separación de Ura p/v, 2% de glucosa p/v, 2% de. ;casamino ácidos p/v, 0.5% de sulfato de amonio p/v, pH 5.5) y. ?.12% de Azo-cebada-beta-glucano (Megazyme) durante 4 días a 30°C.

Las colonias que mostraron halo de aclaramiento visible después de una incubación durante la noche a: 45°C se seleccionaron para pre-cultivos de medios en liquido^ ¡mediante inoculación por recolección dentada de 0.15 mL de medio completo sintético (SC: 0.17% de base de nitrógeno en levadura p/v, 0.078% de suplemento con separación de ¡Ura 'p/v, 2% de glucosa p/v, 2% de casamino ácidos p/v, 0.5% de sulfato de amonio p/v) en microplacas de 96 cavidades. Los pre-cultivos se desarrollaron durante la noche (16-18 horas) a 30°C con agitación vigorosa orbital a la fase estacionaria. Para la inoculación del cultivo de expresión, se utilizaron 25 L de pre-cultivo para inocular 1 mi del medio SC en microplacas de cavidad profunda que contuvieron una. :perla de vidrio. Los cultivos de expresión se desarrollaron durante 3 días a 30°C con agitación vigorosa orbital y control de humedad. Las placas se centrifugaron a 710 Xg durante 5 minutos a células sedimentadas y el sobre-nadante sé aspiró para los ensayos de selección (ejemplos 6 y 7). Para el pre-cultivo restante, se prepararon .concentrados mediante la adición de glicerol a una concentración final del 15% y se almacenaron a -80°C.

Ejemplo 5: Preparación de lignina Se pre-trató paja de trigo utilizando los métodos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 4,461,648. Después del pre-tratamiento, se agregó benzoato de sodio a una concentración del 0.5% como un conservador. El-material pre-tratado luego se lavó con seis volúmenes de agua de grifo templada (~350°C) utilizando un embudo Buchner y papel filtro. i Una muestra de paja de trigo pre-tratado (167 g húmedo; 30& de sólidos; 60% de celulosa) se agregó a 525 mL de 82% de H2S04 con agitación en un matraz de 1 L, luego se tapó y se incubó a 50°C con agitación vigorosa durante 4 horas. Los sólidos restantes se filtraron a humedad utilizando un embudo Buchner y un filtro de fibra de vidrio, se resuspendieron en 1 L de agua y se ajustaron a un pH 4.5 con NaOH. Los sólidos se filtraron y se lavaron con ~8 L de agua. Los sólidos se denominan en la presente como "lignina" .

El tratamiento de la lignina con albúmina de suero bovino (BSA) se realizó al incubar cantidades iguales (p/p) de lignina y BSA, a una concentración de 30..' g/1 en amortiguador de citrato 50 mM (pH 5) que contuvo1 , 0.1% de benzoato de sodio, durante 5 días a 50°C con a'gitación vigorosa .

Ejemplo 6: Selección de alto rendimiento de las bibliotecas del gen de Trichoderma reesei Cel6A para la c lulasa de la familia 6 modificada con resistencia a lignina - ensayo 1 Este ejemplo describe la selección de las celulasas TrCel6A modificadas para identificar aquellas con resistencia a la inactivación mediante lignina en comparación; con la TrCel6A S413P precursora que se había clonado en Saccharomyces cerevisiae. ', Pre-unión a celulosa de TrCel6A-S413P expresado en levadura . Una alícuota (0.175 mi) de sobré-nadante proveniente del cultivo que contuvo la celulasa Tr0el6A modificada como descrita en el ejemplo 4 se agregó a dos cavidades de microplaca por separado que contuvieron: 0.05 mi de celulosas a una concentración de 0.167% p/y, y se incubaron durante 90 minutos a 4°C con agitación vigorosa orbital. Las microplacas luego se sometieron a centrifugación a 2800 xg durante 3 minutos y se retiraron 0.175 mi de sobrenadante. Una alícuota adicional de sobrenadante (0.175 mi) a partir de cada TrCel6A modificada se agregó a las mismas cavidades de microplaca y se incubaron durante otros 90 minutos bajo las mismas condiciones. Las microplacas se sometieron a centrifugación nuevamente a 2800 Xg durante 3 minutos y se retiraron 0.175 mi de sobrenadante. Se agregaron 0.175 mi de volumen de amortiguador de sustrato 50 mm (pH 5) a todas las cavidades e inmediatamente las microplacas se sometieron a centrifugación a 2800 Xg durante 3 minutos. Se retiró el sobrenadante (0.175 mi).

Hidrólisis de celulosa . Cada celulasa TrCel6A modificada se incubó tanto con 2.68% de lignina (p/v) como lignina tratada con BSA (0.10 mi) durante 2 horas a ,50°C con agitación vigorosa orbital. Después de este periodo, se agregaron Trichoderma reesei Cel7B y Cel5A (40· mg de proteína/g de celulosa) y 125 IU/g de celulosa A. niger beta-glucosidasa y la incubación prosiguió durante unas 3 horas adicionales. Las microplacas se sometieron a centrifugación durante 3 minutos a 2800 xg y se muestreo para glucosa una alícuota del sobrenadante. La actividad enzimática :se midió vía la detección de glucosa utilizando un ensayo de¦ reacción estándar acoplado con glucosa oxidasa/peroxidasa (Trinder, 1969) . En la figura 3, panel A, se muestra una muestra de los datos provenientes de la placa de selección.

Se contuvieron en cada microplaca de 960 cavidades seis controles de TrCel6A-S413P parentáles utilizados para comparación. Se calculó una proporción de lignina; tratada con ± BSA para todas las celulasas TrCel6A modificadas y la celulasa TrCel6A-S413P parental al dividir la actividad de la celulasa en presencia de lignina sin tratar mediante la actividad de celulasa en presencia de lignina tratada con BSA. La proporción de actividad para cada celulasa! TrCel6A modificada se comparó con el promedio de seis controles TrCel6A-S413P parentáles en una microplaca particular y se seleccionaron los positivos (aquellos que tienen proporciones aumentadas) en un nivel, de 95% de confianza utilizando' una prueba t. Todas las celulasas positivas se produjeron nuevamente en microcultivo y se volvieron a seleccionar para reducir el número de positivos falsos. El ADN plasmí'dico que comprende los genes que codifican para las celulasas; TrCel6A modificadas con la inactivación disminuida de lignina se i aisló de los cultivos de levadura desarrollados a partir de i las concentraciones de glicerol preparadas en el ejemplo 4. Los genes de celulasa TrCel6A modificadas se sometieron a secuenciación de ADN para identificar las mutaciones que confieren la inactivación reducida mediante lignina.

Ejemplo 7: Selección de alto rendimiento de las bibliotecas del gen Trichoderma reesei CelfiA para la célulasa de la familia 6 modif cada con resistencia a lignina - Ensayo 2 Este ejemplo describe una selección adicional de las celulasas TrCel6A modificadas para aquellas resistentes a lignina utilizando otro ensayo de alto rendimiento. 1 Una alícuota (0.15 mi) de sobrenadante de levadura como se describe en el ejemplo 4 se pre-incubó con lignina (1.6% p/v) en una reacción amortiguada con 0.25 mi de citrato (50 mM; pH 5). Una alícuota equivalente de sobrenadante proveniente de cada celulasa modificada también se preincubó con lignina (1.6% p/v) la cual se pre-trató con BSA. La preincubación se realizó durante 5.5 horas en una mi'croplaca de 96 cavidades que contuvo 1 perla de vidrio, a 50 °C con agitación vigorosa orbital (NB Innova 44) . Se contuvieron en cada microplaca de 96 cavidades seis controles TrCel6A-S413P precursores utilizados para comparación. Después de la preincubación, las microplacas se sometieron a centrifugación durante 5 minutos a 2800 xg y el sobrenadante se aspiró para ensayos de actividad residual. · El sobrenadante (0.05 mi) se incubó con 0.5% de beta-glucanos en una reacción amortiguada con 100 L de citrato (50 mM; pH 5) . Los ensayos de actividad residual se realizaron durante 16 horas para las muestras preincubadas con lignina y 3 horas para las muestras preincubadas con lignina tratada con BSA, en una placa PCR, a 50°C. En la primera columna de la PCR que varia de 3 a 0.05 mg/ml se colocó una curva de glucosa estándar. Después1 de la incubación, 0.08 mi de reactivo DNS se agregaron a todas las cavidades y las placas se hirvieron durante 10 minutos. Una alícuota (0.15 mi) se transfirió a una micropíaca y se midió la absorbancia a 560 nm. La actividad enzimática residual se determinó al convertir los valores A56o a equivalentes de reducción utilizando la curva de glucosa estándar. Una muestra de los datos provenientes de una placa de selección se muestra en la figura 3, panel B. Se calculó una proporción de actividad para todas las celulasas TrCel6A modificadas y los controles de TrCel6A-S413P parentales al dividir la actividad enzimática residual en presencia de lignina sin tratar entre la actividad enzimática residual en presencia de lignina tratada con BSA. La proporción de actividad para cada TrCel6A modificada se comparó : con el promedio de seis controles TrCel6A-S413P parentales precursores en una micropíaca particular y se seleccionaron los positivos (aquellos que tuvieron proporciones aumentadas) al 95% del nivel de confianza utilizando una prueba Todas las celulasas TrCel6A modificadas positivas se produjeron nuevamente en microcultivos y se volvieron a seleccionar para reducir el número de positivos falso. 1 ; reactivo DNS contuvo: Componente g/L ; '· Ácido 3, 5-dinitrosalicílico (Acros) 20 ; Hidróxido de sodio (Fisher) 20 ; Fenol (sigma) 4 . ; Metabisulfato de sodio (Fisher) 1 : Ej mplo 8: Elaboración de las celulasas TrCel6A modificadas con agregado Las mutaciones resistentes a lignina se combinaron en dos celulasas TrCel6Á modificadas con agregado. ' ;La tabla 2, muestra los pasos realizados para generar las celulasas TrCel6A modificadas con agregado, TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P y TrCel6A-Kl29E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S;413P.

PSP4 -C 5 ' -GGCCACTGCTGCAGCAGCTGTCGCAGAAGTTCCCTCTTTTATGTGGC-3 ' (SEQ ID NO: 50) PSP5-C 5 ' -GCCACATAAAAGAGGGAACTTCTGCGACAGCTGCTGCAGCAGTGGCC- 3 ' (SEO ID NO: 51 ) PSP6-B 5 ' -GCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACACTATTGCCGATGGTGGCGTCGCC-3 ' (SEQ ID NO: 52) PSP7 -B 5' -GGCGACGCCACCATCGGCAATAGTGTATTCGCCATTCGAGGCAAGGGC-3 ' (SEQ ID NO: 53) PSP8 5' -TACACGCAAGGCAACGATGTCTACAACGAGAAG-3 ' (SEQ ID NO: 54) PSP9 5 ' -CTTCTCGTTGTAGACATCGTTGCCTTGCGTGTA-3 ' (SEQ ID NO: 55) DK091 5 ' -GACAGCAGTGCGCCACAGTTTGACCCCCACTGT-3 ' (SEQ ID NO: 57) DK092 5 ' -ACAGTGGGGGTCAAACTGTGGCGCACTGCTGTC-3 ' (SEQ ID NO: 58) Para realizar la reparación de separación, el vector YEp352/PGK91-l-ass-NKE se digirió con Nhel y Kpnl y se purificó en gel. El vector YEp352/PGK91-l-ass-NKE digerido y los amplicones se transformaron en levadura (cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae) utilizando el procedimiento descrito por Gietz, R. D. and oods, R. A., (2002).

Tabla 2 : Generación de las celulasas TrCel6A modificadas mediante PCR PCR Paso Molde Cebador 1 Cebador 2 Amplicón 1 1 YEp352/PGK91-l-CCss-NKE ?a?21 PSP9 PCR 1 TrCel6A-S413P-Q363E paso 1 1 YEp352/PGK91-l-ass-NKE PSP8 3'PGK-term PCR 1 TrCel6A-S413P-Q363E paso 1 2 ambos megacebadores PCR YaN21 3' PGK-term PCR 1 1, paso 1 paso 2 2 1 PCR 1 Paso 2 YccN21 PSP7B PCR 2 paso 1 3'PGK 1 PCR 1 Paso 2 PSP6B PCR 2 paso 1 3 ' PGK 2 ambos megacebadores PCR YaN21 PCR 2 2, paso 1 paso 2 3 1 PCR 2 Paso 2 YaN21 PSP5C PCR 3 paso 1 3'PGK 1 PCR 2 Paso 2 PSP4C PCR 3 paso 1 3'PGK 2 ambos megacebadores PCR YaN21 PCR 3 3, paso 1 paso 2 4 1 PCR 3 Paso 2 YccN21 DK092 PCR 4 paso 1 1 PCR 3 Paso 2 D 091 3' PGK-term PCR 4 paso 1 2 ambos megacebadores PCR Ambos fragmentos se clonaron en 1 YEp352/PGK91-l- ss-NKE 4, paso 1 ¡ utilizando el método de reparación de separaciones en levadura Ejemplo 9: Eiqpresión y purificación de las celulasas TrCel6A-S413P y de TrCel6A modificada a partir de cultivos a gran escala 500 mL de medio YPD estéril (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona y 20 g/1 de glucosa) se inocularon con 10 mi de un cultivo durante la noche de S. cerevisiae transformado desarrollado a partir de células recién recolectadas a partir de una placa de agar. Los cultivos de 500 mL luego se inocularon durante 96 horas a 30°C con agitación vigorosa orbital.

Después de la incubación, el caldo proveniente de cada cultivo se sometió a centrifugación durante 10 minutos a 16,700 xg y se desecho la sedimentación (que contuvo células de levadura). El pH del sobrenadante se ajustó a 5.0 y luego se dejó enfriar a 4°C durante una hora. Después del enfriamiento, se agregaron 625 g de ( H4)2S04 para llevar el sobrenadante de levadura al 93% de saturación. Se permitió la precipitación durante un periodo de 2 horas a ;4°C con agitación constante. Después de la centrifugación durante 15 minutos a 16,700 Xg, se desechó el sobrenadante.

El sedimento se volvió a suspender con pipeteo en 20 mi de citrato 50 mM, pH 5.0. Una vez que se volvió a suspender el sedimento, se agregaron 80 mi de acetato de sodio 0.1 M, glucosa 200 mM y lactona de ácido glucónico 1 ?t??, ?? 5.0. Las muestras luego se incubaron a 4°C durante 30 minutos con agitación suave. Cada muestra luego se sometió a centrifugación a 710 xg durante 3 minutos para sedimentar cualquier material insoluble. El sobrenadante se retiró cuidadosamente con una pipeta para evitar la descomposición del sedimento y se conservó. La celulasa TrCel6A en cada muestra se purificó mediante cromatografía por afinidad APTC como se describe por (Piyachomkwan et al., 1997). Las celulasas TrCel6A purificadas se intercambiaron con amortiguador en citrato 50 mM, pH 5.0 y se concentraron utilizando un concentrador por centrifugación Centricon (Millipore) con una membrana de poliétersul ona 5 kDa NM L. Las concentraciones proteínicas se midieron mediante absorbancia UV (280 nm) utilizando un coeficiente de extinción de 8280nm = 2.062 mL -ing-1 · cm.

Ejemplo 10: Análisis de las celulasas TrCel61A modificadas con agregado purificadas en el ensayo 1 y el ensayo 2 de alto rendimiento TrCel6A-S413P, TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E- S413P y TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 10. Las celulasas TrCel6A se probaron en el ensayo 1 y en el ensayo 2 de alto rendimiento como se describe en los ejemplos 6 y 7. La concentración de TrCel6A fue 0.02 mg/ml. La proporción de ± BSA-lignina se normalizó a TrCel6A-S 13P y los valores P se calcularon para las celulasas de TrCel6A modificadas con agregado (figura 5 y tabla 3) .

Tabla 3: Proporciones normalizadas de ± BSA-lignina y valores P para las celulasas TrCel6A modificadas con agregado Ejemplo 11: Prueba de las celulasas TrCel6A modificadas purificadas en ensayos de curso de tiempo de inactivación con lignina Las celulasas TrCel6A purificadas (0.06 mg) se incubaron con lignina sin tratar (1.04 mg) en matraces de vidrio tapados, en un volumen total de 2 mL de amortiguador de citrato 50 mM, pH 5.0. Las incubaciones sé realizaron a 50°C con agitación vigorosa orbital. Se recolectaron muestras de 0.2 mL a partir de cada matraz a 0, 0.5, ,1, 2, 3, 4, 6, 14 y 24 horas. Cada muestra se sometió a centrifugación para separar la lignina y se almacenó a 4°C.

Al término del curso de tiempo, cada muestra se mezcló brevemente para volver a suspender el sedimento y 0.05 mL de la suspensión que contuvo el material tanto soluble como insoluble, se agregaron a una placa microtituladora que contuvo 3 perlas de vidrio/cavidad. A cada cavidad, 0.02 mL de una preparación para dilución de la celulasa Trichoderma que carecía de la actividad de cellobiohidrolasa (1 µg de proteina total) y Cel3A de Trichoderma purificado (1.4 pg) para complementar la actividad de hidrólisis de TrCelGA. Por último, a cada cavidad se agregaron 0.2 mL de suspensión de la celulosa deslignificada (0.25% de celulosa). La placa de ensayo se incubó a 50°C durante 2 horas con agitación vigorosa orbital. La placa luego se sometió a centrifugación a 710 xg durante 2 minutos y se midieron las concentraciones de glucosa como se describe en el ejemplo 6. .

Las concentraciones de glucosa se convirtieron a la actividad de TrCel6A, se expresaron como mg de : glucosa producida/hr/mg de la proteina TrCel6A. La actividad medida a t=0 horas, en ausencia de incubación con lignina,' fue la actividad especifica de la enzima. Las actividades medidas a todo lo largo del costo de tiempo se dividieron entre la actividad medida a t=0 para calcular una actividad residual relativa de TrCel6A. Con el fin de analizar los resultados, las mediciones de la actividad residual relativa se consideraron representativas de la concentración TrCel6A activa residual relativa. Se utilizaron curvas estándar para demostrar que los cambios en la concentración y actividad de TrCel6A fueron lineales con respecto a la concentración de la enzima y el sustrato utilizados en este ensayo.

Utilizando la ecuación 1, se modelaron los datos de TrCel6A residual contra tiempo. En esta ecuación, E representa la enzima, L representa lignina, EL representa un complejo de enzima-lignina reversible y EL* representa un complejo de enzima-lignina irreversible. KL representa [E] [L]/[EL] en estado estable mientras que kL es una constante de velocidad que describe la velocidad de conversión del complejo de enzima-lignina reversible a la irreversible. Se generaron un mínimo de dos conjuntos de datos replicados para cada celulasa TrCel6A modificada;.

Para TrCel6A-S413P y TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P, en la figura 6 se muestran los resultados del curso del tiempo de inactivación de la muestra de lignina. En cada momento durante la incubación de 24 horas con lignina, la actividad residual de TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P es mayor que TrCel6A-S413P, indicando que una fracción mayor de la TrCel6A modificada fue activa en cada punto de tiempo. Como controles, TrCel6A-S413P y TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P se incubaron en ausencia de lignina bajo condiciones de otra manera iguales a las experimentales. Estos controles demuestran que ambas celulasas TrCel6A fueron estables en solución en ausencia de lignina con respecto a la duración de estos ensayos. Por lo tanto, un aumento en la actividad residual relativa de una celulasa TrCel6A modificada con relación a TrCel6A-S413P en presencia de lignina es debido a una velocidad de inactivación reducida debido a la presencia de lignina en lugar de cualquier mejora potencial en la estabilidad térmica de la TrCel6A modificada. : La modelación se realizó utilizando una hoja de cálculo Runge-Kutta de 4° orden en Microsoft Excel. Para modelar los resultados de la TrCel6A residual contra tiempo en un experimento determinado, los resultados para TrCel6A-S413P se ajustaron al variar KL y kL. La minimiza.ción de errores se realizó mediante el método de mínimos cuadrados como se conoce por aquellos expertos en la técnica: Para modelar las celulasas TrCel6A modificadas, el valor kL se fijó al determinado para TrCel6A-S413P en el: mismo experimento y al variar KL. Los errores estándar en el ajuste del modelo para al menos los conjuntos de datos duplicados se determinaron utilizando un procedimiento de comparación de modelos (Motulsky, H., and A. Christopoulos (2004)). El KL determinado para cada celulasa ¦ TrC.el6A modificada se dividió entre el KL determinado para la TrCel6A-S413P para calcular un KL relativo. De manera similar, la actividad especifica de cada TrCel6A modificada se dividió entre la actividad específica de TrCel6A-S 13P para calcular la actividad especifica relativa. Las celulasas TrCel6A modificadas con un KL significativamente mayor (P<0.05, prueba t de Student) que para TrCel6A-S413P se muestran en la tabla 4. Una gráfica de dispersión del KL relativo y la actividad específica relativa de cada celulasa TrCel6A modificada resistente a lignina y TrCel6A-S413P se muestra en la figura 7.

EL * EL* Ecuación Tabla 4: Constantes de inactivación con lignina 1 (KL) para las celulasas TrCel6A modificadas KL Error Valor Actividad TrCel6A relativo estándar P específica relativa TrCel6A-K129E-S 13P 2.1 0.11 <0.001 1.09 . : TrCel6A-S186T-S413P 2.3 0.07 <0.001 0.99 TrCel6A-A322D-S 13P 3.1 0.15 <0.001 1.10 TrCel6A-Q363E-S413P 2.9 0.16 <0.001 1.03 1 TrCel6A-R 10G-S413P 1.6 0.20 0.009 - 0.75 TrCel6A-R 10Q-S413P 1.3 0.04 0.02 0.84 TrCel6A-S413P 1.0 0.09 - 1.00 Este ensayo demuestra que seis celulasas TrCel6A modificadas tuvieron valores KL significativamente mayores y por lo tanto fueron más resistentes a la inactivación con lignina, en comparación con TrCel6A-S413P .

Las enzimas TrCel6A purificadas, parentales y modificadas, se separaron mediante 10% de SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con azul Coomassie (figura 10) . Este gel demuestra que la pureza relativa de las , enzimas TrCel6A modificadas (lineas 4-11) fueron similares a 1 TrCel6A S413P (linea 3) . La mayor banda principal observada para las enzimas TrCel6A modificadas y parentales tuvieron una masa molecular evidente de aproximadamente 60 kDa. En esta figura, el agregado 1 de TrCel6A (linea 10) y el agregado 2 de TrCel6A (linea 11) se refieren a TrCel6A-K129É-S186T-A322D-Q363E-S413P y TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P, respectivamente. La TrCel6A purificada a partir de la celulasa de Trichoderma (linea 2) y los estándares de masa molecular (linea 1) se muestran como referencia.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Una celulasa Trichoderma reesei familia 6 (TrCel6A) modificada caracterizada porque comprende una o más de las sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: : la sustitución de un aminoácido básico , en la posición 129 mediante un aminoácido de carga neutra o acida; la sustitución de un aminoácido de carga neutra en una o más de las posiciones 322 y 363 mediante un aminoácido de carga ácida; y la sustitución de un aminoácido en la posición 186 mediante una treonina; en donde los aminoácidos 83-447 de la TrCel6A modificada son entre aproximadamente 70% hasta aproximadamente 99.9% idénticos a los aminoácidos 83-447 de la SEQ ID NO: 1.

2. La celulasa TrCel6A modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la celulasa TrCel6A modificada exhibe al menos un 15% de reducción en el grado de desactivación mediante lignina con relación a la de una celulasa TrCel6A parental.

3. La celulasa TrCel6A modificada de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque los aminoácidos 83-447 de la celulasa TrCel6A modificada son entre aproximadamente 90% hasta aproximadamente 99.9% idénticos a los aminoácidos 83-447 de la SEQ ID NO: 1.

4. La celulasa TrCel6A modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque las sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de K129E, S186T, A322D, y Q363E.

5. La celulasa TrCel6A modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de| Y103H, Y103K, Y103R, Y103A, Y103V, Y103L, Y103P, L136V, ' L136I, R410G, R410Q, y S413P.

6. Un constructo genético aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la celulasa TrCel6A modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un microbio modificado genéticamente :aislado caracterizado porque comprende el constructo genético de conformidad con la reivindicación 6.

8. El microbio modificado genéticamente aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el microbio es una especie de levadura u hongo filamentoso.

9. El microbio modificado genéticamente aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el microbio es Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei.

10. Un proceso para producir una celulasa , TrCel6A modificada caracterizado porque comprende los pasos de desarrollar el microbio genéticamente modificado de conformidad con la reivindicación 7, en un medio de ; cultivo bajo condiciones que induzcan la expresión y secreción de la celulasa TrCel6A modificada y recuperar la celulasa TrCel6A modificada del medio de cultivo.

11. Un proceso para hidrolizar un sustrato de celulosa caracterizado porque comprende poner en contacto el sustrato con la celulasa TrCel6A modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en presencia de lignina.

12. El proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el sustrato de celulosa es una materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada y en donde la hidrólisis enzimática produce azúcares fermentables .

13. El proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la materia prima de alimentación lignocelulósica pre-tratada se selecciona del grupo que consiste de, forraje de maíz, paja de trigo, paja de cebada, paja de arroz, paja de avena, paja de cañóla, forraje de soya, fibra de maíz, pulpa de remolacha azucarera, finos y desechos del molido de pulpa, bagazo de caña de azúcar, madera dura, madera suave, aserrín, pasto de vara, miscanthus, pasto cord, y caña de alpiste.

14. Un proceso para producir una celulasa TrCel6A modificada caracterizado porque comprende los " pasos de (i) transformar las células hospederas fúngales con un constructo genético como se definió en la reivindicación 6, para producir cepas fúngales recombinantes; (ii) seleccionar las cepas fúngales recombinantes que expresan la celulasa TrCel6A modificada; y (iii) cultivar las cepas fúngales recombinantes seleccionadas en el paso (ii) en fermentaciones sumergidas en líquido bajo condiciones que induzcan la expresión de la celulasa TrCel6A modificada.

15. Una glicosidasa de la familia 6 modificada caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de : SEQ ID NO: 37 (TrCel6A-K129E-S413P) SEQ ID NO: 38 (TrCel6A-S186T-S413P) SEQ ID NO: 39 (TrCel6A-A322D-S413P) SEQ ID NO: 40 (TrCel6A-Q363E-S413P) ; SEQ ID NO: 41 (TrCel6A-R410G-S413P) ; SEQ ID NO: 43 (TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P) ; o SEQ ID NO: 44 (TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P) .