MX2011000894A - Proteinas cry insecticidas de bacilus thuringiensis con actividad anticancerígena. - Google Patents

Abstract

La presente invención hace referencia a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de los grupos Cry1, Cry2, Cry3 y Cry4 preferentemente, sin limitar el uso de otras proteínas Cry insecticidas derivados de Bacillus thuringiensis, que presentan actividad citotóxica contra células neoplásicas de humanos, pero no contra células normales.Asimismo, la presente invención provee una proteína o mezcla de proteínas de los grupos Cry1, Cry2, Cry3 y Cry4 preferentemente, derivadas de la bacteria Bacillus thuringiensis, que exhiben actividad citotóxica preferentemente contra células neoplásicas de humanos, sin afectar a las células normales. Las proteínas Cry aisladas no presentan actividad hemolítica ni pertenecen al grupo de las parasporinas. La invención también refiere a una mezcla o composición farmacéutica que incluye a las proteínas Cry insecticidas y a un método, para el control o eliminación de células neoplásicas de humanos.

Description

PROTEÍNAS CRY INSECTICIDAS DE BaciUus thuringiensis CON ACTIVIDAD ANTICANCERÍGENA CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo técnico de la biomedicina y más específicamente esta relacionada con la producción y uso de moléculas alternativas para tratar el cáncer, como son las proteínas Cry insecticidas derivadas de las cepas de BaciUus thuringiensis (Bt), que presentan actividad citotóxica específica contra líneas celulares de cáncer de humanos, pero no contra células normales.

ANTECEDENTES Actualmente se sabe que el cáncer es una de las enfermedades más devastadoras en humanos, y que es originada por fallas en los mecanismos de regulación que controlan el crecimiento y proliferación celular. La mortalidad causada por el cáncer se ha incrementado en los últimos años, por lo que es necesaria la búsqueda de tratamientos alternativos a los hasta hoy utilizados. La radioterapia, quimioterapia o remoción del tumor, muestran ser efectivos para reprimir la enfermedad solo si son aplicados en la primera fase. Además, su costo es elevado y los efectos adversos de las terapias perjudican seriamente la salud del individuo ( INEGI, 2008).

Con la finalidad de encontrar una cura y suprimir estos inconvenientes, en la actualidad se están buscando biomoléculas que se puedan emplear como una alternativa nueva para la erradicación del cáncer. Algunas biomoléculas estudiadas a la fecha han demostrado tener un efecto sobre la función celular del organismo o tejido, inhibiendo la proliferación celular. Un ejemplo son los extractos y compuestos de diferentes organismos terrestres o marinos, aunque la gran mayoría son moléculas muy difíciles de producir lo que ha dificultado la realización de pruebas clínicas (Chu y Radhakrishnan, 2008).

Por lo anterior, se requieren biomoléculas novedosas que logren curar y/o eliminar el cáncer, que sean económicamente factibles de producir en grandes cantidades y que sean específicas, para que no generen efectos adversos tan severos como los expuestos por la radio y quimioterapia.

Al día de hoy no existe cura para el cáncer, por lo que la búsqueda de alternativas es intensa, motivo por el cuál esta invención propone dar una posible solución con resultados efectivos que muestra ser más eficiente que las terapias empleadas a la fecha.

Bacillus thuringiensis (Sí) es un bacilo gram positivo, de flagelación perítrica, que mide de 3 a 5 µ?p de largo por 1 a 1.2 µ?? de ancho. Es un microorganismo anaerobio facultativo, quimioorganótrofo y con actividad de catalasa. Pertenece a la familia Bacillaceae y se ubica dentro del grupo 1 del género Bacillus. Se caracteriza porque en su proceso de esporulación produce una inclusión parasporal formada por uno o más cuerpos cristalinos de naturaleza proteica que son tóxicos para distintos invertebrados, especialmente larvas de insectos del género Lepidóptera, Díptera y Coleóptera (Bravo y Güereca, 1998; Sauka y Benintende, 2008). Estas proteínas son conocidas como proteínas cristal insecticidas (ICP) o d-endotoxinas. Se clasifican en proteínas Cry que van de un tamaño de 45-160 kDa y en proteínas Cyt que pesan de 22-30kDa, diferenciándose principalmente por el mecanismo de acción insecticida y la actividad hemolítica, respectivamente. Las proteínas Cry son utilizadas en insecticidas comerciales a nivel mundial (Bravo y Güereca, 1998; Rukmini ef al, 1999; Sauka y Benintende, 2008; Sun eí al 2008; Yan Wu eí al, 2008).

Mientras que un gran número de proteínas Cry son tóxicas a insectos, estudios recientes han demostrado que existen inclusiones parasporales donde las proteínas Cry producidas carecen de actividad insecticida, incluso aún y cuando son sometidas a pruebas in vitro que simulan las condiciones de los insectos. Sin embargo, estas proteínas Cry inocuas para insectos, presentan actividad citotóxica contra una gran variedad de líneas celulares de cáncer de humano (Ohba eí al, 2009). A estas proteínas se les ha denominado como parasporinas (PS), a la fecha se encuentran reportadas alrededor de 13 y han sido clasificadas en 4 grupos. Las PS no poseen actividad insecticida ni hemolítica, tampoco poseen gran homología de secuencia con ninguna de las dos. Su actividad citotóxica preferentemente por células de cáncer, hace de las PS posibles candidatos como agentes anticancerígenos para uso médico, aunque hasta el momento no se han hecho pruebas clínicas con humanos ni animales (Jung et al, 2007; Kitada eí al, 2005; Mizuki eí al, 2000, Nadarajah eí al, 2006 y 2008; Ohba eí al, 2009; Sauka y Benintende, 2008;).

Las proteínas Cry insecticidas en su forma de protoxina ó toxina no tienen actividad citotóxica contra células normales de humanos ni de animales, como se ha demostrado en todos los documentos publicados como US 5 616,319, US 5'985, 267, US 2005/0155112a 1 , AU652774(B2) y en este trabajo. Adicionalmente, ninguna proteína Cry insecticida ha sido reportada con actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer de animales ni de humanos.

En este sentido, esta invención es novedosa y cuenta con actividad inventiva ya que las proteínas Cry aisladas de cepas nuevas de Bf; presentan actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer pero no contra líneas celulares normales, no son parasporinas (PS) y no tienen actividad hemolítica como las proteínas Cyt. Sin embargo, nuestras proteínas Cry presentan actividad insecticida debido a que pertenecen a los grupos de proteínas Cry insecticida más importantes.

La actividad anticancerígena es una propiedad que hasta la fecha no había sido descrita para una proteína Cry insecticida de Bt.

OBJETO DE LA INVENCION La presente invención tiene como objeto proporcionar moléculas de ácido nucleico provenientes de diferentes cepas nuevas de Sf, recolectadas de la región de Baja California, México, las cuales codifican proteínas Cry insecticidas de los grupos 1 , 2, 3, y 4 principalmente, que presentan actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer, pero no sobre células normales.

La presente invención tiene como objeto proporcionar proteínas Cry insecticidas que comprenden principal pero no exclusivamente a los grupos 1 , 2, 3, 4, así como sus mutantes, las que una vez activadas, presentan actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer de humanos, sin que se limite el uso en animales.

Otro objeto de esta invención, es el de aportar una mezcla (formulación) para tratar células neoplásicas de animales y humanos; donde dicha mezcla puede comprender proteínas Cry de los grupos 1 , 2, 3, 4 principalmente, así como también, la combinación con otras proteínas Cry y/o moléculas biológicas y/o químicas.

Por otra parte, la presente invención comprende también un método para curar y/o eliminar el cáncer, el cual consiste en aplicar una cantidad efectiva de la mezcla mencionada anteriormente; donde la aplicación se puede realizar por cualquier vía de administración.

Otro objeto de esta invención es el uso de las proteínas Cry de los grupos 1 , 2, 3, 4, y sus mutantes, así como la mezcla (formulación) en la preparación de un fármaco, que auxilie para prevenir, curar y/o eliminar el cáncer de origen animal y/o humano.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN A continuación se describe la metodología y los detalles característicos de la invención, así mismo se acompaña a la presente descripción, una serie de tablas y figuras con el objeto de ayudar a la mejor comprensión de la misma.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1.- Electroforesis de proteínas Cry en poliacrilamida. De izquierda a derecha; Carril 1 , marcador de peso molecular. Carril 2, perfil de proteínas de la cepa 6-1 obtenido después de sonicar los cristales. Carril 3, la misma muestra mas el proceso de solubilización. Carril 4, la misma muestra mas la activación con tripsina. Siguientes carriles, perfil proteico de otras cepas de Bt activadas con tripsina. El último carril corresponde a la cepa 17-3 activada con tripsina.

Figura 2.- Efecto de proteínas Cry en la línea celular HeLa. La figura a, muestra células HeLa sin proteínas Cry. La figura b, muestra células HeLa con 1 g/ml de proteínas Cry producidas por la cepa 18-5. El efecto de citotoxicidad se puede distinguir por la morfología circular sin brillo, que presentan las células tratadas con las proteínas Cry.

Figura 3.- Efecto de proteínas Cry en tumores inducidos con células HeLa. La figura a, muestra el ratón nud con un tumor de seis días. La figura b, muestra el mismo ratón después de 15 días de la aplicación de las proteínas Cry producidas por la cepa 18-5. La figura c, muestra el mismo ratón a los 25 días de la aplicación de las proteínas Cry producidas por la cepa 18-5.

Aislamiento y selección de cepas de Bacillus thuringiensis Se recolectaron 120 muestras de suelo y agua de la región de Baja California, México. Las muestras se trataron por el método de seleccción de esporas y se crecieron en medio Luria Bertani (LB) durante 24 h a 30°C. Se aislaron colonias de acuerdo a su morfología semejante a la descrita para Bt en medio LB y se incubaron durante 24 h a 30°C. Las colonias elegidas se resembraron en medio SP líquido y se incubaron a 30°C durante 96 h con agitación constante de 275 rpm, para inducir la producción de cristales paraesporales. Aquéllas cepas que presentaban similitud en su morfología con Bt y producían cristales, se calificaron como presuntivas.

Caracterización molecular de las cepas de Bt y de los genes cry Extracción de ADN Para el aislamiento del ADN de las cepas de Bacillus thuringiensis identificadas y seleccionadas, se utilizó el método de lisis alcalina y fenol-cloroformo (Sambrook et al., 1989). La integridad del ADN fue verificada en un gel de agarosa al 0.8% sometido a luz ultravioleta. Del ADN de las cepas seleccionadas se amplificaron los genes 16S rDNA utilizando oligonucleotidos universales. Los genes cry se amplificaron también por medio de la técnica de PCR utilizando oligos específicos para cada grupo. Para las reacciones de PCR se utilizaron las siguientes condiciones: un ciclo de 2 min a 95°C, 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a la temperatura de alineamiento indicada para cada oligonuclétido, 1 min a 72°C y uno más de 5 min a 72° C. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis y secuenciación para corroborar la identidad de las cepas de Bt e identificar los genes cry presentes en las cepas seleccionadas (Tabla 1 ).

Tabla 1.- Caracterización por PCR de los genes cry presentes en las cepas de Bt seleccionadas.

Como se puede observar en la Tabla 1 , solo se muestran las cepas de Bt que amplificaron genes cry de los grupos 1 , 2, 3 y 4, por considerarse los grupos insecticidas más importantes y abundantes, sin embargo no se descarta el uso de otros grupos . Es importante comentar que todas las cepas seleccionadas fueron especies de Bt según los resultados de secuencia del 16S rDNA (SEQ ID No. EF206345.1 y SEQ ID No. AM292033.1 . Adicionalmente, se utilizaron oligonucleótldos específicos para identificar si alguna de las cepas seleccionadas contenía genes que codificaran para proteínas del grupo de las parasporinas (PS) (Ohba et al, 2003). Los resultados obtenidos pero no mostrados comprobaron que ninguna de las cepas seleccionadas producía parasporinas, por lo que se descarta que la actividad citotóxica contra células de cáncer fuera generada por este tipo de proteínas.

Las cepas que amplificaron genes cyt fueron excluidas del estudio por contener actividad hemolítica contra eritrocitos de humanos y animales, lo que no era apropiado para su uso.

Los resultados de secuencia de los productos de PCR amplificados con los oligonucleótidos específicos para los grupos 1, 2, 3 y 4, comprobaron que los genes amplificados efectivamente codificaban para los grupos mencionados. Adicionalmente, los resultados de la secuenciación mostraron que los genes no eran idénticos, pero contenía al menos un 90 % de similitud con los genes cryIA (SEQ ID AY319967.1 ), cryI D (SEQ ID AF337948.1 ), cry2A (SEQ ID AF273218.1 ), cry2B (SEQ ID AF336115.1 ), cry3A (SEQ ID EU332160.1 ) y cry4A (SEQ ID EF208904.1 ), reportados.

Electroforesis de proteínas Cry activadas Una vez identificados los genes, se procedió a confirmar la presencia de las proteínas Cry insecticidas en las cepas de Bt seleccionadas (Tabla 1). Las cepas fueron crecidas en medio SP y los cristales obtenidos fueron sonicados, solubilizados y activados por proteólisis enzimática. Las muestras tratadas se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida para proteínas. Las proteínas Cry insecticidas se caracterizan por presentar bandas entre 45 a 160 kDa, para los grupos 1 , 2, 3 y 4. En la figura 1 , se muestra el perfil de proteínas de algunas de las cepas aisladas en la región de Baja California. En esta figura, el perfil de la cepa 6-1 muestra una banda mayoritaria de 130 kDa y otra de 70 KDa, en las muestras sonicadas y solubilizadas, que corresponden a las protoxinas de Cry1 y Cry2. En la muestra activada con tripsina se pueden observar proteínas de 60 y 65kDa, tamaños esperados para toxinas Cry1 y Cry2 activadas.

Ejemplo 1 Actividad insecticida de las proteínas Cry producidas por las cepas de Bt Los cristales lavados fueron diluidos para obtener concentraciones de 2 pg/cm2 de las toxinas Cry. Con las diluciones se determinó la actividad insecticida en larvas de Manduca sexta. Las evaluaciones de toxicidad se realizaron en placas de 24 pozos, conteniendo una larva por pozo. Se agregaron las concentraciones mencionadas de toxina y las placas se incubaron por 7 días. En la tabla 2, se muestra la actividad insecticida a los 7 días de experimentación con las cepas de Bt seleccionadas. Los resultados demuestran que las proteínas Cry evaluadas, ya sea en conjunto o por separado tienen actividad tóxica importante contra insectos.

Tabla 2.- Porcentaje de mortalidad de larvas de Manduca sexta con toxinas Cry provenientes de las cepas de Sf seleccionadas.

Activación de protoxinas Cry de las cepas de Bt seleccionadas Los cristales provenientes de las cepas de Bt seleccionadas, se sometieron a diferentes tratamientos para solubilizar y activar las protoxinas que estaban contenidas en las inclusiones parasporales. La solubilización se realizó una vez cosechado y lavado el cultivo de Bt. El botón se resuspendió con buffer TTN e incubó a 37°C por 30 min, para pasar a un proceso de sonicado de 6 min. Las muestras sonicadas se solubilizaron a través de un pH alcalino entre 9-11 , para obtener las protoxinas. Las protoxinas se activaron utilizando tripsina a concentraciones de 5-50 g/ml, así como diferentes tiempos de incubación dependiendo de la cepa utilizada. Las toxinas activadas se filtraron utilizando un disco de 0.2 µp?, con la intención de eliminar toda posible contaminación de bacterias o esporas remanentes . Las toxinas activadas se preservaron a -20°C para su posterior purificación por HPLC.

Ensayo de citotoxicidad in-vitro utilizando lineas celulares de cáncer y las toxinas Cry.

La línea celular de queratinocitos humanos (HaCat), fue utilizada como control no canceroso se cultivó en el medio RPMI. Las líneas celulares de cáncer cervico-uterino (HeLa) y cáncer de mama (MDA-MB-231 ), fueron cultivadas en el mismo medio que HaCat. El medio fue suplementado con 10% de SFB y 1 % de antibiótico-antimicótico. Los cultivos se incubaron a 37°C con 5% de C02 y atmósfera humidificada. Las células se mantuvieron en crecimiento por medio de subcultivos dos veces por semana. Previo a realizar los ensayos con líneas celulares, las toxinas de las cepas seleccionadas, se sometieron a una prueba de actividad hemolítica con eritrocitos humanos, para descartar efectos hemolíticos ocasionados por la presencia de proteínas Cyt. De acuerdo a lo esperado, las toxinas de las cepas seleccionadas no presentaron actividad hemolítica, ya que al momento de la selección por PCR se descartaron aquellas que contenían genes cyt.

Ejemplo 2 Efecto citotóxico de las proteínas Cry insecticidas en líneas celulares de cáncer.

En 10?µ? de medio se sembraron 2x104 células por pozo en placas de microcultivo de 96 pocilios. Se incubaron por 5 h a 37°C y 5% C02. Después de transcurrido el tiempo de adhesión, se desechó el medio y se adicionó la toxina activada en concentraciones de 1.0, 0.5 y 0.25 Mg/ml, utilizando la misma cantidad de medio como vehículo. Cada concentración se analizó por triplicado. Después de 24 h de incubación en las condiciones mencionadas, se procedió a medir la viabilidad celular por medio de microscopía (Figura 2) y con la técnica de MTT. En la tabla 3, se muestra la actividad citotóxica de las proteínas Cry insecticida de las cepas de Bt seleccionadas. Las toxinas que presentaron mayor actividad citotóxica en HeLa y MDA y por consecuencia mayor porcentaje de mortalidad en estas líneas celulares, fueron las producidas por las cepas 2-2 y 18-5. Sin embargo, la mayoría de las cepas de Bt seleccionadas en esta invención, también presentaron actividad citotóxica importante contra las líneas celulares analizadas (Tabla 3). En el caso particular de HaCat la cual fue utilizada como control no canceroso, se observó que ninguna de las proteínas Cry insecticidas utilizadas, presentaron actividad citotóxica por lo que la sobrevivencia se mantuvo al 100%, incluso a concentraciones de 10 pg/ml. Lo que confirma que la actividad citotóxica de las proteínas Cry insecticidas utilizadas en este trabajo, fue específica y exclusiva para líneas celulares de cáncer. Otro control utilizado en los ensayos con líneas celulares fue el uso de las protoxinas Cry insecticidas, dando como resultado que no hubo actividad citotóxica en las líneas celulares de cáncer (HeLa y MDA-MB-231 ), ni en las normales (HaCat). Lo que demuestra que las protoxinas tienen que ser activadas para que lleve a cabo su efecto en contra de las líneas celulares de cáncer.

Tabla 3.- DL50 de las proteínas Cry insecticida sobre diferentes líneas celulares ND: No detectado En el trabajo US 5'824,636 utilizan una proteína Cyt a concentraciones de hasta 100 pg/ml para poder obtener efectos citotóxicos sobre líneas celulares de cáncer. Sin embargo, las proteínas Cyt son hemolíticas y su uso no es recomendado en ningún padecimiento. Otros trabajos como US2003/0210317a1 y US7'329,733 B2 utilizan parasporinas que son proteínas Cry pero sin actividad insecticida, con las cuales han tenido buenos resultados a concentraciones similares a las nuestras (0.5 pg/ml), principalmente para células de leucemia. En este sentido, nuestra invención representa una alternativa novedosa para tratar células de cáncer, principalmente cervicouterino y mama, ya que a concentraciones de 0.5 pg/ml se obtuvieron buenos resultados utilizando toxinas Cry catalogadas como insecticidas, las cuales no habían sido utilizadas ni reportadas para tratar líneas celulares de cáncer. Es importante, resaltar que estas proteínas Cry insecticidas no tuvieron efecto citotóxico contra las células HaCat utilizadas como control no canceroso.

Ejemplo 3 Efecto citotóxico de las proteínas Cry insecticida en ratones nud con tumores inducidos.

Las toxinas contenidas en las cepas de Bt 2-2 y 18-5 fueron utilizadas para tratar ratones nud, los cuales presentan la característica de ser inmunológicamente deficientes. A estos ratones se les indujeron tumores con células HeLa y MDA, los que después de 6 días de crecimiento presentaban un tamaño promedio de 2 cm de diámetro y 1 cm de altura. En este tiempo los ratones fueron inoculados directamente en el tumor con las toxinas producidas en las cepas 2-2 y 18-5 por separado, y su progreso fue monitoreado cada 5 días. Satisfactoriamente, a los 25 días de haberse inoculado las toxinas Cry insecticida los ratones presentaron una recuperación del 100 %, lo que significaba que no existía evidencia física del tumor y todos sus signos vitales y parámetros hematológicos eran normales (Figura 3). Demostrando que in-vivo las toxinas Cry insecticidas utilizadas tampoco afectaron a las células normales o sanas, solo a las de cáncer. Los ratones fueron evaluados durante 25 días más para determinar si existía regresión del tumor, lo cual no sucedió para ninguna de las dos muestras evaluadas.

Este experimento in-vivo demostró que efectivamente las proteínas Cry insecticidas pueden ser utilizadas para tratar cáncer.

Los resultados de citotoxicidad obtenidos y mostrados en la tabla 3 y los resultados con los ratones nud, son por demás valiosos y prometedores debido a que por primera vez se demuestra que las proteínas Cry catalogadas como insecticidas, tienen un gran potencial para ser utilizadas como anticancerígenos.

Bibliografía Aggarwall, B. y Rodríguez-Padilla, Cristina. 1998. Antiproliferative protein from Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. US: 5' 824, 636.

Bravo, A. y Güereca, L. 1998. The oligomeric state of Bacillus thuringiensis Cry toxins in solution. Biochimica and Biophysica 1429: 342-350.

Coté, J., Jung, Y., Mizuki, E. y Akao, T. 2008. Bacillus thuringiensis strain crystal gene and Crystal protein and uses thereof. US : 7, 329, 733 B2.

Donovan, W., Tan, Y., Jany, C. y González, José. 1997. Bacillus Thuringiensis CryEtS Gene y related plasmids, bacteria and Insecticides. US: 5'616, 319.

Hickle, L, Payne, J., Bradfisch, G. y Sick, August. 1994. The use of Bacillus thuringiensis microbes for controlling the lesser mealworm alphitobius diaperinus. AU652774(B2).

Jung, Y., Mizuki, E., Asao, T. y Coté J. 2007. Isolation and characterization of a novel Bacillus thuringiensis strain expressing a novel cristal protein with cytocidal activity against human cáncer cells. Journal of Applied Microbiology 103, p. 65-79.

Kitada, S., Abe, Y., Ito, A., Kuge, O., Akao, T., Mizuki, E. y Ohba, M. (2005) Molecular Identification and Cytocidal Action of Parasporin, a Protein Group of Novel Crystal Toxins Targeting Human Cáncer Cells. ß1" Pacific Rim Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Enviromental Impact. Victoria, BC.

Mizuki, E., Shin Park, Y., Saitoh, H., Yamashita, S., Akao, T., Higuchi, K. y Ohba, M. (2000) Parasporin, a Human Leukemic Cell- Recognozing Parasporal Protein of Bacillus Thuringiensis. Clinical and Diagnostic Laboratory Inmunology 625-634.

Nadarajah, V.D., Ting, D., Mohamed, SM., Kanakeswary, K y Lee, HL. (2008).Selective Cytotoxic Activity against Leukemic Cell Lines From Mosquitocidal Bacillus Thuringiensis Parasporal Inclusions. Human Biology Section. Faculty of Medicine, International Medical University.

Nadarajah, V.D., Chai, S.H., Mohamed, SM., Chan, K.K. y Kanakeswary, K. (2006). Malaysian Mosquitocidal Soil Bacterium (Bacillus thuringiensis) Strains with Selective Hemolytic and Lectin Activity Against Human and Rat Erythrocytes Human Biology Section. Faculty of Medicine, International Medical University 37: no.1.

Ohba, M., Mizuki, E. y Uemori, A. (2009). Parasporin, a ne anticancer Protein Group from Bacillus thuríngiensis. Anticancer Research 29: 427-434.

Ohba, M., Mizuki, E. y Uemori, A., Akao, T., Saito, H., Katayama, H., Yamashita, S. y Lee, D. Proteín Having Cell recognizing activity and/or cytocidal activity. US: 2003/0216317 A1 .

Payne, J., Sick, A., Narva, K., Schnepf, H. y Shwab, G. 1999. Protein toxins active against Lepidopteran pests. US: 5, 985, 267.

Rukmini, V., Reddy, C. y Venkates erlu, G. 1999. Bacillus thuringiensis cristal ¦ endotoxin: Role of porteases in the conversión of protoxin to toxin. Biochimie 82: 109-1 16.

Sambrook, K.T., Frisch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Sauka, D. y Benintende, G. (2008). Bacillus thuringiensis: generalidades. Un acercamiento a su empleo en el biocontrol de insectos lepidóptéros que son plagas agrícolas. Revista argentina de Microbiología 40: 124-140.

Sun, Y., Fu, Z., Ding, X. y Xia, L. (2008) Evaluating the Insecticidal Genes and their Expressed Products in Bacillus Thuringiensis Strains by Combining PCR with Mass Spectrometry. Applied and Enviromental Microbiology. P. 681 1-6813.

Chu, W.L. y Radhakrishnan, A. (2008). Research on bioactive molecules: Achievements and the Way Forward. JSME Suppl 1 , S21 -S24.

Wu, Y., Gao, M., Dai, S., Yi, D. y Fan, H. (2008). Investigaron of the cyt gene in Bacillus thuringiensis and the biological activities of Bt isolates from the soil of China. Biological Control 47; 335-339.

Claims (19)

1. Una molécula aislada de ácido nucleico y sus mutantes caracterizada porque codifica una proteína con actividad citotóxica contra células de cáncer.
2. La molécula y sus mutantes de la reivindicación 1 , caracterizada porque la proteína codificada puede provenir del grupo Cry1 y/o Cry2 y/o Cry3 y/o Cry4 y la posible combinación de ellas, sin que se limite el uso de otros grupos Cry.
3. La molécula y sus mutantes de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la proteína codificada al menos presenta un 90% de similitud con la secuencias de los grupos Cry1 y/o Cry2 y/o Cry3 y/o Cry4.
4. Las moléculas de las reivindicaciones 1 , 2 y 3, caracterizadas porque la actividad citotóxica puede ser contra células cancerígenas humanas y/o animales.
5. Las moléculas de las reivindicaciones 1, 2, 3 y 4 caracterizadas porque la o las proteínas identificadas son codificadas por especies de Bacillus, sin que se limite su producción en otros microorganismos.
6. Las moléculas de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 y 5 caracterizadas porque las proteínas codificadas presentan actividad insecticida.
7. Las moléculas de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque las proteínas no tienen actividad hemolítica y no son parasporinas .
8. Una proteína aislada de la reividicación 1 y sus mutantes, caracterizada porque tiene actividad citotóxica contra células de cáncer.
9. La proteína de la reivindicación 8, caracterizada porque puede pertenecer a los grupos: Cry1 y/o Cry2 y/o Cry3 y/o Cry4 y la posible combinación de ellas, sin que se limite el uso de otros grupos Cry.
10. 10. Las proteínas de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la proteína codificada al menos presenta un 90% de similitud con la secuencias de los grupos Cry1 y/o Cry2 y/o Cry3 y/o Cry4.
11. 1 1. La proteína y sus mutantes de las reividicaciones 8, 9 y 10 caracterizadas porque la actividad citotóxica puede ser contra células cancerígenas humanas y/o animales.
12. 12. La proteína de las reivindicaciones 8, 9, 10 y 1 1 caracterizadas porque la o las proteínas identificadas son codificadas por especies de Bacillus, sin que se limite s'u producción en otros microorganismos.
13. 13. Las proteínas de las reivindicaciones 8, 9, 10, 1 1 y 12 caracterizadas porque presentan actividad insecticida.
14. 14. Las proteínas de las reivindicaciones 8, 9, 10. 11 , 12 y 13 caracterizadas porque no tienen actividad hemolítica y no son parasporinas .
15. 15. Un método de preparación de un compuesto farmaceútico, caracterizado porque comprende la incorporación de las proteínas de las reivindicaciones 8- 14, con al menos otra molécula y/o compuesto químico y/o biológico.
16. 16. Un método para inhibir y/o eliminar la proliferación de células de cáncer que consiste en: la aplicación eficaz de una dosis efectiva, por cualquier vía de administración utilizando las proteínas de la reivindicación 8-14.
17. 17. El uso de las moléculas de ácido nucleico aisladas, de la reivindicación 1 , caracterizadas porque codifican proteínas con actividad citotóxica contra células de cáncer de humanos y/o animales.
18. 18. El uso de las proteínas de la reivindicación 8, caracterizadas porque tienen actividad citotóxica contra células de cáncer de humanos y/o animales.
19. 19. El uso de las proteínas de la reivindicación 8, caracterizada para preparar un compuesto farmaceútico, que comprende la adición al menos de otra molécula y/o compuesto químico y/o biológico.