MX2010012272A - Anticuerpos para interleucina-6 y sus usos. - Google Patents

Abstract

Se proveen anticuerpos y porciones de unión de antígeno de los mismos que se unen a la IL-6 humana; también se proveen ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos y porciones de unión de antígeno, métodos de preparación de dichos anticuerpos y porciones de unión de antígeno, composiciones que comprenden dichos anticuerpos o porciones de unión de antígeno, y usos de dichos anticuerpos o porciones de unión de antígeno.

Description

ANTICUERPOS PARA INTERLEUCINA-6 Y SUS USOS INTERREFERENCIA CON PATENTES Y SOLICITUDES DE PATENTE RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. de serie 61/073430, presentada el 18 de junio de 2008, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

ACUERDO DE INVESTIGACIÓN CONJUNTA La revelación y las reivindicaciones de la presente se hicieron como resultado de las actividades realizadas dentro del alcance de un acuerdo de investigación conjunta entre Pfizer Inc. y Medarex Inc., vigente en la fecha que se hizo la invención reclamada o antes de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a anticuerpos y porciones de unión de antígeno de los mismos que se unen a la IL-6 humana. Esta invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos y porciones de unión de antígeno de los mismos; métodos de preparación de dichos anticuerpos y porciones de unión de antígeno de los mismos; composiciones que comprenden dichos anticuerpos y porciones de unión de antígeno de los mismos; y usos de dichos anticuerpos y porciones de unión de antígeno de los mismos.

La interleucina 6 (IL-6), que también se conoce como interferón B2 (IFNB2) es una citocina pleiotrópica que pertenece a la familia de los ligandos gp130, y es producida por muchos tipos de células, incluso los i linfocitos T, fibroblastos y monocitos. La IL-6 es producida constitutivamente en bajas cantidades y es inducida rápidamente por estímulos infecciosos o citocinas inflamatorias. La IL-6 se une a un receptor específico, IL-6R (gp80), que forma un heterodimero con la gp130 unida a célula o soluble para formar un complejo receptor funcional. La unión de IL-6 con su receptor inicia eventos celulares que incluyen la activación de la ruta de JAK-STAT3 y la señalización de la MAP cinasa mediada por ras. La IL-6 puede provocar una serie de diversos efectos tales como proliferación y diferenciación de células B y monocitos, activación de células T, hematopoyesis, activación de osteoclastos, crecimiento de queratinocitos, crecimiento neuronal, activación de hepatocitos e inducción de proteína de fase aguda de hepatocitos.

La IL-6 desempeña una función importante en las anormalidades de las células B como se muestra en el lupus eritematoso sistémico, mieloma múltiple y trastornos linfoproliferativos. Similarmente, la IL-6 también está implicada en la patogénesis de enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como artritis reumatoide y osteoartritis. Recientemente, evidencia indirecta sugiere una asociación entre la IL-6 y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la resistencia a la insulina en la diabetes de tipo 2. La IL-6 tiene efectos tanto proinflamatorios como antiinflamatorios en el sistema inmune, indicando que esta citocina probablemente desempeña una función central en la regulación de la respuesta fisiológica a la enfermedad. Por lo tanto, la alteración dirigida de la IL-6 puede proveer potencialmente un beneficio terapéutico en una variedad de áreas de enfermedad.

Se ha observado un aumento de la producción de IL-6 en varias enfermedades que incluyen: la enfermedad de Alzheimer, enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide, inflamación, infarto de miocardio, enfermedad de Paget, osteoporosis, fibrosis del hígado, tumores sólidos (carcinoma de células renales), cáncer de la próstata y la vejiga, cáncer neurológico y malignidad de células B (por ejemplo, enfermedad de Castleman, algunos linfomas, leucemia linfocítica crónica y mieloma múltiple). La investigación ha indicado que la IL-6 está asociada con la patogénesis de muchas de estas enfermedades, particularmente el cáncer y la artritis reumatoide; por lo tanto, el bloqueo de la IL-6 se traduciría en beneficios clínicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se produce un anticuerpo aislado o una porción de unión de antígeno del mismo que se unen específicamente a la IL-6 y pueden actuar como antagonistas del receptor de IL-6, y composiciones que comprenden el anticuerpo o porción.

Se proveen composiciones que comprenden (i) la cadena pesada y/o ligera, los dominios variables de las mismas, o porciones de unión de antigeno de las mismas, o el anticuerpo anti-IL-6, o moléculas de ácido nucleico que los codifican; y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también pueden comprender otro componente, tal como un agente terapéutico o un agente diagnóstico.

También se proveen métodos diagnósticos y terapéuticos. Similarmente, se proveen los anticuerpos anti-IL-6 y las porciones de unión de antígeno de los mismos para la fabricación de medicamentos para tratar trastornos inflamatorios y no inflamatorios.

Se proveen vectores y células hospederas que comprenden las moléculas de ácido nucleico, así como también métodos de producción recombinante de los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 F muestran una alineación de las secuencias de aminoácidos de línea germinal de las regiones variables de cadena pesada y ligera en comparación con las regiones variables de cadena pesada y ligera respectivas de los anticuerpos anti-IL-6 9C8, 9C8 N68T T83S y 22B5 (solo se muestran las discordancias para el anticuerpo 9C8, 9C8 N68T T83S y 22B5).

Las CDR's están subrayadas y los espacios discordantes se indican con un signo de número (#).

La figura 2 muestra el total de proteina C reactiva (CRP) en el suero para el vehículo y para el anticuerpo 9C8 N68T T83S lgG2, determinado por medio de un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia. Cada punto representa un valor promedio de CRP en el suero de 3 monos cynomolgus (± SE) a los que se les administró vehículo o anticuerpo anti-IL-6 9C8 N68T T83S lgG2, a 0.5 mg/kg y 5.0 mg/kg. La CRP en el suero se midió por medio de Meso Scale Discovery (MSD). Se administró LPS en el punto de tiempo 0 horas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones y técnicas generales El término "anticuerpo" es sinónimo de inmunoglobulina y se entiende como se conoce comúnmente en la técnica. En particular, el término anticuerpo no está limitado por ningún método particular de producción del anticuerpo. Por ejemplo, el término anticuerpo incluye, entre otras cosas, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales.

La unidad estructural básica de un anticuerpo es un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par teniendo una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 120 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 aminoácidos o más, y la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 3 aminoácidos o más.

Las regiones variables de cada par de cadenas pesada/ligera (VH y VL), respectivamente, forman el sitio de unión del antígeno. De esta manera, un anticuerpo IgG intacto, por ejemplo, tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales.

Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera exhiben la misma estructura general de las regiones de armazón (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR's. El término "variable" se refiere al hecho de que las secuencias de algunas porciones de los dominios variables difieren extensamente entre anticuerpos y son usadas por su antígeno particular en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos, sino que se concentra en las CDR's, que están separadas por las FR's mucho más conservadas. Las CDR's de las dos cadenas de cada par son alineadas por las FR's, permitiendo la unión a un epítope específico. Del extremo N al extremo C, las cadenas tanto ligera como pesada comprenden los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos de cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico de Kabat (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987 y 1991)), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia.

Como se usa aquí, un anticuerpo que es referido por un número es el mismo anticuerpo monoclonal obtenido del hibridoma del mismo número. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-IL-6 9C8 es el mismo anticuerpo obtenido del hibridoma 9C8, o un subclon del mismo.

El término "análogo" o "análogo de polipéptido" significa un polipéptido que comprende un segmento que tiene identidad sustancial con alguna secuencia de aminoácidos de referencia, y tiene sustancialmente la misma función o actividad que la secuencia de aminoácidos de referencia. Normalmente los análogos de polipéptido comprenden una o más sustituciones conservativas de aminoácidos (o inserciones o supresiones) con respecto a la secuencia de referencia. Los análogos pueden ser de por lo menos 20 o 25 aminoácidos de largo, o pueden ser de por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos de largo, o más grandes, y frecuentemente pueden ser tan largos como el polipéptido de longitud completa. Algunas modalidades incluyen análogos de polipéptido con 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16 o 17 sustituciones de la secuencia de aminoácidos de referencia. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de referencia es una secuencia de linea germinal. Los análogos de anticuerpos o moléculas de ¡nmunoglobulina pueden ser preparados fácilmente por los expertos en la materia.

Como se expone en la presente descripción, las sustituciones de aminoácido para un anticuerpo de IL-6 o porción de unión de antígeno del mismo son aquellas que, normalmente: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) suprimen o crean un sitio de glicosilación, o (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos pero todavía retienen la unión específica a IL-6.

Los análogos pueden incluir varias sustituciones en la secuencia de péptido que ocurre normalmente Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples, preferiblemente sustituciones conservativas de aminoácidos, en la secuencia que ocurre normalmente. Normalmente una sustitución conservativa de aminoácidos no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia progenitora.

El término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo se refiere a un fragmento de un anticuerpo que retiene la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, IL-6). Se ha mostrado que la función de unión de antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL) VH, CL y CH1 ; (¡i) un fragmento F(ab')2, un fragmento divalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fd, que consiste en los dominios VH y CH1 ; (¡v) un fragmento Fv, que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un anticuerpo de dominio (dAb) (Ward et al. (1989), Nature 341 :544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se pueden unir usando métodos recombinantes por medio de un enlazador sintético que les permite hacerse una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv)). Tales anticuerpos de una sola cadena también se consideran abarcados dentro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo. También están abarcadas otras formas de anticuerpos de una sola cadena, tales como dianticuerpos. Los dianticuerpos son anticuerpos divalentes, biespecificos, en los cuales los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena de polipéptido, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando asi a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión de antígeno. Además, una o más CDR's de un anticuerpo se pueden incorporar en una cadena de polipéptido más grande, que se puede unir con otra covalentemente o no covalentemente. En modalidades que tienen uno o más sitios de unión, los sitios de unión pueden ser iguales o diferentes entre sí.

Además, un anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo puede ser parte de moléculas de inmunoadherencia más grandes, formadas por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos. Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadherencia incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para hacer una molécula scFv tetramérica, y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una marca de polihistidina C-terminal para hacer moléculas de scFv divalentes y biotiniladas. Otros ejemplos incluyen en donde una o más CDR's de un anticuerpo se incorporan en una molécula, ya sea covalentemente o no covalentemente, para hacer una inmunoadhesina que se une específicamente a un antigeno de interés, tal como IL-6. En tales modalidades, las CDR's se pueden incorporar como parte de una cadena de polipéptido más grande, pueden enlazarse covalentemente a otra cadena de polipéptido, o se pueden incorporar no covalentemente. Partiendo de anticuerpos completos se pueden preparar porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, usando cualquier técnica adecuada, tal como digestión con papaina o pepsina, respectivamente, de los anticuerpos completos. Además, se pueden obtener anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadherencia usando varias técnicas de ADN recombinante.

El término "anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo que comprende regiones de dos o más anticuerpos diferentes, incluso anticuerpos de especies diferentes. Por ejemplo, una o más de las CDR's de un anticuerpo quimérico se pueden derivar de un anticuerpo de IL-6 humano. En un ejemplo, las CDR's de un anticuerpo humano se pueden combinar con las CDR's de un anticuerpo no humano, tal como ratón o rata. En otro ejemplo, todas las CDR's se pueden derivar de anticuerpos de IL-6 humanos. En otro ejemplo, las CDR's de más de un anticuerpo de IL-6 humano se pueden combinar en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo de IL-6 humano, una CDR2 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo de IL-6 humano, y una CDR3 de la cadena ligera de un tercer anticuerpo de IL-6 humano; y las CDR's de la cadena pesada se pueden derivar de uno o más de otros anticuerpos de IL-6. Además, las regiones de armazón se pueden derivar de uno de los anticuerpos de IL-6 de los cuales se toman una o más de las CDR's, o de uno o más anticuerpos humanos diferentes. Además, el término "anticuerpo quimérico" abarca cualquiera de las combinaciones anteriormente mencionadas, en donde las combinaciones incluyen anticuerpos humanos y no humanos.

El término "compite" significa que un primer anticuerpo, o una porción de unión de antígeno del mismo, compite por la unión con un segundo anticuerpo, o porción de unión de antigeno del mismo, en donde la unión del primer anticuerpo con su epitope cognado disminuye detectablemente en presencia del segundo anticuerpo, en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. Puede darse el caso, aunque no necesariamente, de la alternativa en donde la unión del segundo anticuerpo con su epitope también disminuye detectablemente en presencia del primer anticuerpo. Esto es, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epitope sin que el segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo con su epitope respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe detectablemente la unión del otro anticuerpo con su epitope o ligando cognado, en una magnitud igual, mayor o menor, se dice que los anticuerpos "compiten cruzadamente" uno con otro por la unión con sus epítopes respectivos. Sin considerar el mecanismo mediante el cual ocurre dicha competencia o competencia cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional, o unión a un epitope común o porción del mismo), el experto en la materia apreciará, basándose en las enseñanzas aquí provistas, que tales anticuerpos competidores o cruzadamente competidores pueden ser útiles para los métodos aqui descritos.

El término "sustitución conservativa de aminoácidos" significa que un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácido sustancialmente no cambiará las propiedades funcionales de una proteína. En casos en donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencias se puede ajustar ascendentemente para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son muy conocidos. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifáticas de hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina: Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos pueden ser, por ejemplo, valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina.

Un reemplazo conservativo también es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz del logaritmo de probabilidad PAM250 descrito por Gonnet et al. , Science 256:1443-45 (1992), que se incorpora aquí como referencia. Un reemplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz del logaritmo de probabilidad PAM250.

"Poner en contacto" se refiere a poner juntos un anticuerpo o porción de unión de antigeno del mismo y una IL-4 objetivo, o un epítope de la misma, de tal manera que el anticuerpo pueda alterar la actividad biológica de IL-6. Dicho "contacto" se puede realizar "in vitro", por ejemplo en un tubo de ensayo, una caja de Petri, o similar. En un tubo de ensayo, el contacto puede incluir solo un anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo e IL-6 o un epítope de la misma, o puede incluir células completas. Las células también se pueden mantener o desarrollar en placas de cultivo de célula y ponerse en contacto con anticuerpos o porciones de unión de antígeno de los mismos en ese medio. En este contexto, la capacidad de un anticuerpo particular o porción de unión de antígeno del mismo para afectar un trastorno relacionado con IL-4, esto es, la Cl50 del anticuerpo, puede ser determinada antes de usar el anticuerpo ¡n vivo con organismos vivos más complejos. Para células fuera del organismo, existen múltiples métodos que son muy conocidos de los expertos en la materia para poner en contacto IL-6 con los anticuerpos o porciones de unión de antígeno de los mismos.

El término "ELISA" se refiere a una prueba de inmunoabsorbente enlazado a enzima. Este tipo de prueba es muy conocida de los expertos en la materia.

El término "epítope" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T, o interaccionar de otra manera con una molécula. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de carbohidrato o azúcar, y generalmente tienen tres características estructurales tridimensionales específicas, así como también características de carga específicas. Un epítope puede ser "lineal" o "conformacional". En un epítope lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula interaccionante (tal como un anticuerpo) ocurren linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un epítope conformacional, los puntos de interacción ocurren entre residuos de aminoácido en la proteína que están separados entre si. Una vez que se determina un epítope deseado sobre un antígeno se pueden generar anticuerpos para ese epítope. Un enfoque para lograr esto es realizar estudios de competencia cruzada para encontrar anticuerpos que se unen competitivamente unos con otros, esto es, los anticuerpos compiten por la unión al antígeno. Un proceso de alto rendimiento para "depositar" anticuerpos se basa en su competencia cruzada como se describe en la publicación de patente internacional de No. WO 03/48731.

El término "secuencia de control de expresión", como se usa aquí, significa las secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias codificadoras a las cuales se ligan. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias adecuadas de inicio de transcripción, terminación, promotora e incrementadora; señales de procesamiento eficiente de ARN, tales como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que incrementan la eficiencia de traducción (esto es, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que incrementan la estabilidad de la proteina; y cuando sea deseable, secuencias que incrementan la secreción de proteína. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedero; en los procariotes, tales secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de unión de ribosoma, y secuencia de terminación de transcripción; en los eucariotes generalmente las secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" incluye, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo secuencias guía y secuencias de socio de fusión.

El término "línea germinal" se refiere a las secuencias de nucleótidos de los genes y segmentos de genes de anticuerpo que pasan de los progenitores a la descendencia por medio de las células germinales. Esta secuencia de línea germinal se distingue de las secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos en células B maduras que han sido alteradas por eventos de recombinación e hipermutación durante la maduración de la célula B.

El término "anticuerpo humano" significa cualquier anticuerpo en el cual las secuencias de dominio variables y constantes son secuencias humanas. El término abarca anticuerpos con secuencias derivadas de genes humanos, que incluyen las que han sido cambiadas, por ejemplo, para reducir la posible inmunogenicidad, aumentar la afinidad, eliminar residuos de cisteína que podrían causar pliegue indeseable, etcétera. El término también abarca estos anticuerpos producidos recombinantemente en células no humanas, que podría impartir glicosilación atipica de células humanas. Estos anticuerpos se pueden preparar en una variedad de formas.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos de origen no humano en donde los residuos de aminoácido que son característicos de secuencias de anticuerpo de la especie no humana, son reemplazados con residuos encontrados en las posiciones correspondientes de los anticuerpos humanos. Este proceso de "humanización" reduce la inmunogenicidad del anticuerpo resultante en los humanos. Los anticuerpos de origen no humano se pueden humanizar usando cualquier técnica adecuada conocida. El anticuerpo de interés se puede construir por ingeniería mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios CH 1 , CH2, CH3, de gozne, o el dominio de armazón, con la secuencia humana correspondiente. El término "anticuerpo humanizado" también incluye en su significado anticuerpos humanos quiméricos y anticuerpos injertados con CDR. Los anticuerpos humanos quiméricos de la invención incluyen la VH y Vi. de un anticuerpo de una especie no humana y los dominios CH y C|_ de un anticuerpo humano. Los anticuerpos transplantados con CDR resultan del reemplazo de las CDR's de VH y VL de un anticuerpo humano con VH y VL, respectivamente, de un anticuerpo de un animal diferente de un humano.

El término "polinucleótido aislado", como se usa aquí, significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o sintético, o una combinación de los mismos, que en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con una parte o todos los polinucleótidos con los que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está enlazado operativamente a un polinucleótido al que no está enlazado en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

El término "proteína aislada", "polipéptido aislado", o "anticuerpo aislado", es una proteína, polipéptido o anticuerpo que, en virtud de su origen o fuente de derivación: (1 ) no está asociado con los componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado nativo; (2) está libre de otras proteínas de la misma especie; (3) es expresado por una célula de una especie diferente; o (4) no ocurre en la naturaleza. De esta manera, un polipéptido que, por ejemplo, se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula en la que se origina naturalmente, estará "aislado" de sus componentes asociados naturalmente. Una proteina también se puede hacer sustancialmente libre de sus componentes asociados naturales por aislamiento, usando cualquier técnica adecuada de purificación de proteína.

Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo de IL-6 que ha sido purificado por afinidad usando IL-6, y un anticuerpo de IL-6 que ha sido sintetizado in vitro por una línea celular.

El término "KD" se refiere a la constante de equilibrio de la afinidad de unión de una interacción anticuerpo-antigeno particular. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la KD es < 1 mM, de preferencia= 100 nM, muy de preferencia < 10 nM. Una constante de afinidad de unión KD se puede medir por resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ como se expone en el ejemplo 7.

El término "koff" se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Una constante de disociación kof{ se puede medir por resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ como se expone en el ejemplo 7.

El término "nucleótidos que ocurren naturalmente", como se usa aquí, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados", como se usa aquí, incluye por ejemplo nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos. El término "enlaces de oligonucleótido" referido aquí incluye enlaces de oligonucleótido tales como por ejemplo fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato. Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección si así se desea.

Las secuencias "enlazadas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas al gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.

El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de ácido nucleico significa los residuos en dos secuencias que son ¡guales cuando se alinean para correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de por lo menos aproximadamente nueve nucleótidos, usualmente por lo menos unos 18 nucleótidos, más usualmente por lo menos unos 24 nucleótidos, normalmente por lo menos unos 28 nucleótidos, más típicamente por lo menos unos 32 nucleótidos, y preferiblemente por lo menos unos 36, 48 o más nucleótidos. Existen diferentes algoritmos conocidos que se pueden usar para medir la identidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótido se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas de Wisconsin Package, versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. El FASTA, que incluye por ejemplo los programas FASTA2 y FASTA3, provee alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor traslape entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998), que se incorporan aquí como referencia). Típicamente se usan los parámetros por omisión para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencias entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar usando FASTA con sus parámetros por omisión (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación), o usando Gap con sus parámetros por omisión como se provee en GCG Versión 6.1 , que se incorpora aquí como referencia.

Una referencia a una secuencia de nucleótidos abarca su complemento a menos que se especifique de otra manera. De esta manera, una referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia particular se debe entender que abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria.

El término "porcentaje de identidad de secuencia", en el contexto de secuencias de aminoácidos, significa los residuos de dos secuencias que son iguales cuando se alinean para correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre por lo menos aproximadamente cinco aminoácidos, usualmente por lo menos unos 20 aminoácidos, más usualmente por lo menos unos 30 aminoácidos, típicamente por lo menos unos 50 aminoácidos, más típicamente por lo menos unos 100 aminoácidos, y más típicamente unos 150, 200, o más aminoácidos. Existen diferentes algoritmos conocidos que se pueden usar para medir la identidad d secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas de Wisconsín Package, versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin.

La identidad de secuencia para polipéptidos se mide típicamente usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteína compara secuencias usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, supresiones y otras modificaciones, que incluyen sustituciones conservativas de aminoácido. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit", que se pueden usar con parámetros por omisión como se especifica en los programas para determinar la homología de secuencias o la identidad de secuencias entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de especies de organismos diferentes, o entre una proteína de tipo silvestre y un análogo de la misma; véase por ejemplo GCG versión 6.1 (University of Wisconsin, Wisconsin). Las secuencias de polipéptido también se pueden comparar usando FASTA con los parámetros por omisión o recomendados; véase GCG versión 6.1. El FASTA (por ejemplo FASTA2 y FASTA3) provee alineaciones y porcentaje de identidad de secuencias de las regiones del mejor traslape entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Otro algoritmo para comparar una secuencia con una base de datos que contiene un número grande de secuencias de diferentes organismos, es el programa de computadora BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando los parámetros por omisión provistos por los programas; véase por ejemplo Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).

El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), como se usa aquí, significa una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que "célula hospedera recombinante" y "célula hospedera" no solo significan la célula sujeto particular sino también la progenie de dicha célula. Como pueden ocurrir algunas modificaciones en las generaciones subsiguientes debido a mutaciones o influencias ambientales, la progenie de hecho puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero todavía está incluida dentro del alcance del término "célula hospedera" como se usa en la presente.

Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo", o "sustancialmente purificado" cuando por lo menos aproximadamente 60% a 75% de una muestra exhibe una sola especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteína sustancialmente pura normalmente puede comprender aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% o 90% p/p de una muestra de proteína, más usualmente aproximadamente 95%, y de preferencia puede ser más de 99% pura. La pureza u homogeneidad de proteína puede ser indicada por varios medios muy conocidos, tales como electroforesis en gel de poliacrílamida de una muestra de proteína, seguida por visualización de una sola banda de polipéptido por tinción del gel con una tintura muy conocida. Como apreciará el experto en la materia, se puede obtener una resolución más alta usando para la purificación HPLC u otros medios muy conocidos.

El término "similitud sustancial" o "similitud sustancial de secuencia", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, significa que cuando se alinea óptimamente con inserciones o supresiones de nucleótido adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay identidad de secuencia de nucleótidos en por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, y por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98 o 99% de las bases de nucleótido, medida por un algoritmo muy conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se expone arriba.

Como se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" o "similitud sustancial", significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean óptimamente, por ejemplo mediante los programas GAP o BESTFIT usando las ponderaciones de hueco por omisión provistas con los programas, comparten por lo menos 70%, 75% u 80% de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia, y muy de preferencia por lo menos 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia. En algunas modalidades, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren por sustituciones conservativas de aminoácido.

El término "resonancia de plasmón de superficie" se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real por detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, Nueva Jersey). Para mayores detalles véase Johnson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51 :19-26 (1993); Johnson U. eí al., Biotechniques 11 :620-627 (1991); Johnson B. et. al., J. Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); y Johnson B. et al. , Anal. Biochem. 198:268-277 (1991 ).

"Cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a aquella cantidad del agente terapéutico administrada que aliviará a cierto grado uno o más de los síntomas del trastorno tratado. Con respecto al tratamiento de la artritis reumatoide, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad que tiene por lo menos uno de los siguientes efectos: reducción del daño estructural de las articulaciones; inhibición (esto es, cierto grado de retraso, preferiblemente detención) de la acumulación de fluido en la zona de la articulación; y cierto grado de alivio (o preferiblemente eliminación) de uno o más síntomas asociados con la artritis reumatoide.

"Tratar" y "tratamiento" se refieren a un método de alivio o anulación de un trastorno biológico o sus síntomas concomitantes.

El término "utiliza" con respecto a un gen particular, significa que la secuencia de aminoácidos de una región particular en un anticuerpo fue derivada finalmente de ese gen durante la maduración de las células B. Por ejemplo, la frase "una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que utiliza un gen de la familia VH-3 de humano", se refiere a la situación en donde la región VH del anticuerpo fue derivada de la familia VH-3 de segmentos de gen durante la maduración de células B. En las células B humanas, hay más de 30 genes variables funcionales distintos de cadena pesada con los cuales generar anticuerpos. Por lo tanto, el uso de un gen variable de cadena pesada particular es indicativo de un motivo de unión preferido de la interacción anticuerpo-antígeno con respecto a las propiedades combinadas de unión al antígeno y la actividad funcional. Como se apreciará, el análisis de la utilización de gen provee solo una vista general limitada de la estructura del anticuerpo. Como las células B humanas generan estocásticamente transcritos de cadena pesada V-D-J o cadena ligera V-J kappa, existen varios procesos secundarios que ocurren, que incluyen sin limitación hipermutación somática, adiciones y extensiones de CDR3; véase por ejemplo Méndez et al, Nature Genetics 15:146-156 (1997).

El término "vector", como se usa aquí, significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido enlazado. En algunos casos el vector es un plásmido, esto es, una pieza circular de doble cadena de ADN en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Por ejemplo, el vector es un vector viral, en donde se pueden ligar al genoma viral segmentos de ADN adicionales. En otro caso, los vectores son capaces de duplicarse de forma autónoma en una célula hospedera en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de duplicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). En otro ejemplo, los vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera por introducción en la célula hospedera, y con ello se duplican junto con el genoma hospedero. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están enlazados operativamente. Tales vectores son referidos aquí como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión").

Los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. Por ejemplo, la marca es un marcador detectable, por ejemplo la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de porciones de biotinilo que pueden ser detectadas por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente, o actividad enzimática que puede ser detectada por métodos ópticos o colorimétricos). En otra modalidad, la marca o marcador puede ser terapéutico, por ejemplo un conjugado de fármaco o toxina. Se conocen varios métodos de marcación de polipéptidos y glicoproteínas que se pueden usar. Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, 125l, 311), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánido fósforo), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo secuencias de par de cierre de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, marcas de epítopes), agentes magnéticos tales como quelatos de gadolinio, toxinas como toxina pertusis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicína, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaína, propanolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. En algunos casos, las marcas se unen por medio de brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

Métodos de uso terapéutico También se proveen métodos para inhibir la actividad de IL-6 administrando un anticuerpo de IL-6 a un paciente en necesidad del mismo. Cualquiera de los anticuerpos o porciones de unión de antígeno de los mismos aquí descritos se puede usar terapéuticamente. En una modalidad preferida, el anticuerpo de IL-6 es un anticuerpo humano, quimérico o humanizado. En otra modalidad preferida, la IL-6 es humana y el paciente es un paciente humano. Alternativamente, el paciente puede ser un mamífero que expresa una IL-6 con la cual reacciona cruzadamente el anticuerpo de IL-6. El anticuerpo se puede administrar a un mamífero no humano que expresa IL-6 o como un modelo de animal de enfermedad humana. Tales modelos de animal se pueden usar para demostrar la eficacia terapéutica de los anticuerpos.

Un anticuerpo de IL-6 o porción de anticuerpo del mismo se puede administrar a un paciente que expresa niveles de IL-6 anormalmente altos. El anticuerpo se puede administrar una vez, o se puede administrar múltiples veces. El anticuerpo se puede administrar de tres veces al día a una vez cada seis meses o más. La administración puede ser en un régimen tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo también se puede administrar de forma continua por medio de una minibomba. El anticuerpo se puede administrar por una vía mucosal, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, o intratumoral. El anticuerpo se puede administrar una vez, por lo menos dos veces o por lo menos el periodo en que la condición se trata, se alivia o se cura. Generalmente el anticuerpo se administrará siempre que la condición esté presente. Generalmente el anticuerpo se administrará como parte de una composición farmacéutica como aquí se describe. La dosis de anticuerpo generalmente estará en la escala de 0.1 mg/kg a 100 mg/kg, 0.5 mg/kg a 50 mg/kg, 1 mg/kg a 20 mg/kg, y 1 mg/kg a 10 mg/kg. La concentración en el suero del anticuerpo se puede medir mediante cualquier método adecuado.

También se proveen métodos para el tratamiento de la infiltración celular anormal en un mamífero, incluso un humano, que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de IL-6 o una porción de unión de antígeno del mismo, como aquí se describe, que es efectiva en el tratamiento de la infiltración celular anormal.

Los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos se pueden usar para tratar la artritis reumatoide. También se pueden usar para tratar otras enfermedades en las cuales está implicada la IL-6. Los ejemplos de otras enfermedades que se pueden tratar usando los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos, incluyen osteoartritis, particularmente el dolor asociado con osteoartritis, la enfermedad de Castleman, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Still de inicio en el adulto, (\ osteoporosis, sepsis, mieloma múltiple, carcinoma de célula renal y enfermedad de Crohn.

Más abajo se exponen algunas de las enfermedades que se pueden tratar con los anticuerpos o porciones de unión de antígeno de los mismos.

La artritis reumatoide (RA) se considera una enfermedad autoinmune e inflamatoria crónica que produce articulaciones inflamadas que finalmente se hinchan, se hacen dolorosas y experimentan degradación del cartílago, hueso y ligamentos de la articulación. Un resultado de la RA es la deformación, inestabilidad y rigidez de la articulación y cicatrización dentro de la articulación. Las articulaciones se deterioran con una frecuencia muy variable. Muchos factores que incluyen la predisposición genética pueden alterar el patrón de la enfermedad. Las personas con artritis reumatoide pueden tener un curso suave, brotes ocasionales con periodos largos de remisión sin enfermedad, o una enfermedad establemente progresiva, que puede ser lenta o rápida. La artritis reumatoide puede empezar repentinamente, con muchas articulaciones inflamándose al mismo tiempo.

Con más frecuencia inicia sutilmente, afectando gradualmente diferentes articulaciones. Usualmente la inflamación es simétrica, siendo afectadas las articulaciones de ambos lados del cuerpo. Típicamente primero se inflaman las articulaciones pequeñas de los dedos, dedos de los pies, manos, pies, muñecas, codos y tobillos, seguidos por las rodillas y caderas.

El dolor de la artritis reumatoide típicamente es un dolor nociceptivo somático de articulación. Las muñecas hinchadas pueden pellizcar un nervio produciendo entumecimiento u hormigueo debido al síndrome del túnel del carpo. Se pueden desarrollar quistes detrás de las rodillas afectadas, se pueden romper, ocasionando dolor e hinchazón en las extremidades inferiores.

La osteoartritis se caracteriza por pérdida del cartílago articular e hipertrofia del hueso. El inicio de la osteoartritis usualmente es gradual, siendo el dolor un síntoma inicial común. Conforme avanza la osteoartritis disminuye el movimiento de la articulación y pueden ocurrir sensaciones de sensibilidad dolorosa e irritación. La osteoartritis afecta comúnmente las manos, pies, espina dorsal y articulaciones que llevan mucho peso, tales como las caderas y las rodillas. El diagnóstico de la osteoartritis típicamente se basa en los síntomas o se hace por rayos X, que pueden mostrar un estrechamiento del espacio de la articulación, aumento de la densidad del hueso subcondral, formación de osteofitos en la periferia de las articulaciones, y formación de pseudoquistes en la médula subcondral. Se hacen pruebas de sangre para excluir otras condiciones que pueden imitar la osteoartritis. Además, en el diagnóstico de la osteoartritis se puede hacer una artrocentesis, en la cual se usa una aguja estéril para retirar fluido de la articulación. El análisis del fluido de la articulación es útil para excluir gota, infección y otras causas de la artritis. La osteoartritis también es conocida como enfermedad degenerativa de las articulaciones, artritis degenerativa u osteoartritis.

El síndrome de Reiter (artritis reactiva) es la inflamación de las articulaciones y uniones de tendón en las articulaciones, frecuentemente acompañada por inflamación de la conjuntiva del ojo y las membranas mucosas, como las de la boca y el tracto genitourinario, y por un salpullido distintivo. El síndrome de Reiter también se llama artritis reactiva porque la inflamación de la articulación parece ser una reacción a una infección que se origina en el intestino o tracto genital. Este síndrome es mas común en los hombres en edades entre 20 y 40 años. Existen dos formas del síndrome de Reiter: una ocurre con enfermedades transmitidas sexualmente tales como una infección de clamídia, y la otra usualmente aparece después de una infección intestinal tal como shigelosis o salmonelosis (la mayoría de las personas que tienen estas infecciones no desarrollan el síndrome de Reiter). Las personas que desarrollan el síndrome de Reiter después de exposición a estas infecciones parecen tener una predisposición genética a este tipo de reacción, relacionada en parte con el mismo gen encontrado en las personas que tienen espondilitis anquilosante.

La artritis infecciosa es la inflamación de una articulación originada por infección bacteriana, fúngica o viral de los tejidos sinovial o periarticular. Los factores de riesgo de la artritis infecciosa incluyen edad avanzada (esto es, mayores de 60 años); alcoholismo; anemia; artrocentesis o cirugía; enfermedad medica crónica (por ejemplo enfermedad pulmonar o hepática); diabetes; hemofilia; inmunodeficiencia incluso VIH; terapia inmunodepresora incluso corticosteroides; uso de fármacos IV; malignidad; implante de articulación prostética; falla renal; artritis reumatoide; enfermedad de células falciformes; infecciones de la piel; y lupus eritematoso sistémico. Los pacientes con artritis reumatoide tienen un riesgo particularmente elevado de artritis bacteriana. Las infecciones de la articulación pueden ser agudas, con inicio repentino de dolor e hinchazón de la articulación (por ejemplo en el transcurso de unas cuantas horas a unos cuantos días), o crónica con desarrollo insidioso de síntomas mas ligeros. La artritis bacteriana aguda comúnmente es acompañada por dolor de articulación moderado a severo, calor, sensibilidad dolorosa y movimiento restringido. La artritis bacteriana crónica comúnmente es acompañada por hinchazón gradual, calor ligero, enrojecimiento mínimo del área de la articulación, y dolor persistente que puede ser ligero.

La artritis psoriátíca es una artritis inflamatoria que afecta las articulaciones, que ocurre en una minoría de pacientes de psoriasis y cada vez más en pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La artritis psoriátíca puede ser ligera o puede producir deformidades severas de la articulación que se asemejan a los cambios en la articulación observados en la artritis reumatoide. Las articulaciones que pueden ser afectadas por la artritis psoriática incluyen las articulaciones interfalángicas distales (DIP) de los dedos de las manos y los pies, y comúnmente la implicación asimétrica de articulaciones grandes y pequeñas tales como la articulación sacroiliaca y la espina dorsal. La psoriasis de la piel o las uñas puede preceder o proseguir a la implicación de la articulación. El curso de la artritis psoriática se caracteriza por exacerbaciones y remisiones artríticas que pueden o no coincidir con exacerbaciones y remisiones en la piel, y puede ocurrir el avance a la artritis crónica. El diagnóstico incluye un diagnóstico de la psoriasis, una historia familiar de la psoriasis, hallazgos en rayos X que muestran implicación de articulación DIP, implicación asimétrica de articulación grande, una prueba sanguínea negativa del factor reumático para descartar artritis reumática, y en algunos pacientes la presencia del antígeno HLA-B27, especialmente cuando esta implicada la espina dorsal.

La poliartritis es cualquier tipo de artritis que incluye cinco articulaciones o más. La artritis de dos, tres o cuatro articulaciones se llama oligoartritis o pauciartritis. La poli artritis es causada más frecuentemente por un trastorno autoinmune tal como artritis reumatoide, artritis psoriática o lupus eritematoso, pero también puede ser causada por infecciones. La poliartritis se puede experimentar a cualquier edad y no es específica de género.

La artritis juvenil es la artritis que empieza antes de los 16 años.

Existen varios tipos diferentes de artritis juvenil. El tipo más común es la artritis reumatoide juvenil (JRA), conocida también como artritis idiopática juvenil. La JRA incluye JRA de inicio sistémico, JRA pauciarticular, que incluye menos de cinco articulaciones, y JRA poliarticular, que afecta cinco articulaciones o más. El diagnóstico de JRA incluye considerar los síntomas, tomar radiografías de rayos X y hacer análisis de sangre. Las pruebas específicas que el doctor puede utilizar para diagnosticar la JRA incluyen conteo completo de sangre, cultivo sanguíneo para infecciones, exámenes de la médula ósea, examen de la velocidad de sedimentación de eritrocitos, determinación del anticuerpo del factor reumatoide, determinación del anticuerpo antinuclear, y exploración ósea.

La artritis reumatoide juvenil es la inflamación persistente o recurrente de las articulaciones, similar a la artritis reumatoide pero empieza antes de los 16 años y se caracteriza por inflamación de articulaciones o tejido conectivo. Existen varios tipos de artritis reumatoide juvenil, que son determinados por los síntomas que se desarrollan durante los primeros meses de la enfermedad y el número de articulaciones afectadas. Estos tipos incluyen artritis reumatoide juvenil pauciarticular, poliartritis y enfermedad sistémica (enfermedad de Still). En la artritis reumatoide juvenil pauciarticular son afectadas cuatro articulaciones o menos, usualmente las de la pierna. En la poliartritis están afectadas cinco articulaciones o mas (algunas veces hasta 20 a 40). En la enfermedad sistémica (enfermedad de Still) puede estar implicado cualquier número de articulaciones.

La artritis reactiva juvenil es la inflamación persistente o recurrente de las articulaciones, similar a la artritis reactiva pero empieza antes de los 16 años.

La artritis psoriática juvenil es la artritis psoriática que empieza en un paciente antes de los 16 años y se caracteriza por la presencia de artritis crónica y psoriasis; o artritis crónica y por lo menos dos de lo siguiente: dactilitis, anormalidades de las uñas (por ejemplo punteado u onicólisis), y una historia familiar de psoriasis en por lo menos un pariente inmediato. Como en los adultos con artritis psoriática, la artritis puede preceder a la condición de la piel. El patrón predominante en el inicio de la artritis psoriática juvenil es una oligoartritis asimétrica de articulaciones pequeñas y grandes frecuentemente con dactilitis.

En un aspecto, el trastorno mediado por IL-6 se caracteriza por fibrosis. El término "fibrosis", como se usa aquí, se refiere a una condición patológica caracterizada por deposición y metabolismo excesivos de material fibrótico (por ejemplo, la matriz extracelular) en respuesta a un daño del tejido. En muchos casos la fibrosis representa un proceso de reparación normal (esto es, cicatrización de heridas) que se vuelve errado debido a ataques de tejido crónicos o excesivos que resultan en la activación y proliferación de fibroblastos o células estrelladas y la acumulación de colágena. Las condiciones fibróticas incluyen trastornos fibroproliferativos que están asociados con enfermedades vasculares tales como enfermedad cardiaca, enfermedad cerebral y enfermedad vascular periférica, así como también todos los principales tejidos y sistemas de órganos tales como el ojo, piel, riñon, pulmón, intestino e hígado (Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004); Bataller, R y Brenner, D., J. Clin. Invest. 1 15:209-218 (2005)). Otras fuentes son los fármacos quimioterapéuticos, fibrosis inducida por radiación, y lesiones y quemaduras. Aunque las condiciones fibróticas cubren un grupo amplio de enfermedades, se cree que para la mayoría de estas condiciones los mecanismos generales que conducen a la acumulación de tejido fibrótico tienen muchos elementos en común. Frecuentemente la condición se inicia en respuesta a una afluencia de células inflamatorias y se perpetúa por medio de las rutas subsiguientes de señalización de citocina entre las células de infiltración (por ejemplo macrófagos, células T) y células residentes dentro del tejido (por ejemplo células estrelladas, miofibroblastos, células de upffer). Además, los pericitos son un tipo de célula fibrogénica clave implicada en el desarrollo de esclerodermia, y se ha mostrado que los inhibidores de tirosina cinasa del receptor de PDGF (RTKI) retardan la proliferación de los pericitos y suprimen las lesiones de la piel en pacientes con esta enfermedad progresiva. En el riñon, la infiltración de leucocitos desempeña una función principal en la mediación de la inflamación del túbulo intersticial y la fibrosis en la enfermedad crónica del riñon.

Como se usa aquí, el término "fibrosis" también se usa como sinónimo de "acumulación de fibroblastos y deposición de colágena". Los fibroblastos son células de tejido conectivo que están dispersas en el tejido conectivo por todo el cuerpo. Los fibroblastos secretan una matriz extracelular no rígida que contiene colágena de tipo I o de tipo III. En respuesta a una lesión de un tejido, los fibroblastos o células estrelladas cercanas emigran a la herida, proliferan y producen grandes cantidades de matriz extracelular colagenosa. La colágena es una proteína fibrosa rica en glicina y prolina que es un componente mayor de la matriz extracelular y el tejido conectivo, el cartílago y el hueso. Las moléculas de colágena son estructuras helicoidales de triple cadena llamadas cadenas alfa, que se enrollan una alrededor de la otra en una hélice de tipo soga. La colágena existe en varias formas o tipos; de estos, el tipo I, mas común, se encuentra en la piel, tendón y hueso; y el tipo III se encuentra en la piel, vasos sanguíneos y órganos internos. Las condiciones de fibrosis ejemplares incluyen, sin limitación: (I) Enfermedades de pulmón relacionadas con fibrosis, por ejemplo fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis inducida por radiación, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), esclerodermia, fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, asma crónico, silicosis, fibrosis pulmonar inducida por asbestos, lesión aguda del pulmón y dificultad respiratoria aguda (incluso inducida por neumonía bacteriana, inducida por trauma, inducida por neumonía viral, inducida por ventilador, inducida por sepsis no pulmonar, e inducida por aspiración); (II) Nefropatías crónicas asociadas con lesión/fibrosis (fibrosis del riñon), por ejemplo lupus, diabetes, esclerodermia, nefritis glomerular, esclerosis glomerular segmental focal, nefropatía de IgA, hipertensión, aloinjerto, lupus y Alport; (III) Fibrosis del intestino, por ejemplo esclerodermia y fibrosis de intestino inducida por radiación; (IV) Fibrosis del hígado, por ejemplo cirrosis, fibrosis del hígado inducida por el alcohol, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), lesión del conducto biliar, cirrosis biliar primaria, infección o fibrosis del hígado inducida por virus (por ejemplo infección crónica por VHC), y hepatitis autoinmune; (V) Fibrosis de la cabeza y el cuello, por ejemplo inducida por radiación; (VI) Cicatrización corneal, por ejemplo LASIX™, transplante corneal y trabeculectomía; (VII) Cicatrización hipertrófica y queloides, por ejemplo inducidos por quemaduras y quirúrgicos; y otras enfermedades fibróticas, por ejemplo sarcoidosis, esclerodermia, lesión/fibrosis de la médula espinal, mielofibrosis, restenosis vascular, aterosclerosis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de tejido conectivo mixta, y enfermedad de Peyronie.

El término "fibromialgia" también, es conocido como síndrome de fibromialgia. El criterio de clasificación de 1990 del American College of Rheumatology (ACR) para fibromialgia incluye una historia de dolor crónico extendido durante más de tres meses y la presencia por examen físico de dolor en 1 1 (o más) de 18 puntos sensibles, en donde los puntos sensibles ocurren tanto arriba como debajo de la cadera y en ambos lados del cuerpo (véase por ejemplo Wolfe et al., Arthritis Rheum., 1990;33:160-172). Los pacientes de fibromialgia generalmente presentan anormalidades de percepción del dolor en forma tanto de alodinia (dolor en respuesta a un estímulo normalmente no doloroso) como hiperalgesia (sensibilidad incrementada a un estimulo doloroso). Los efectos de la fibromialgia en un paciente humano se pueden evaluar usando los criterios del ACR, la puntuación total del Cuestionario del índice de Fibromialgia (FIQ), índices de severidad e interferencia del dolor (por ejemplo, las escalas de dolor VAS o de Likert), el número de puntos sensibles, o una determinación del umbral de dolor.

Aunque el dolor crónico extendido es un síntoma distintivo de la fibromialgia, típicamente los pacientes también presentan otros síntomas que incluyen uno o más de los siguientes: fatiga, trastornos del sueño, migraña o cefaleas de tensión, síndrome de intestino irritable, cambios de la frecuencia urinaria, rigidez matutina, entumecimiento y hormigueo, dismenorrea, sensibilidad a múltiples agentes químicos, dificultad para concentrarse, y problemas circulatorios que afectan los vasos sanguíneos pequeños de la piel (fenómeno de Raynaud). Como con muchas condiciones que causan dolor crónico, los pacientes de fibromialgia también pueden experimentar ansiedad, depresión o ambas cosas inducidas por fibromialgia. Algunos pacientes de fibromialgia encuentran que el clima frío húmedo, el estrés emocional, el esfuerzo excesivo y otros factores exacerban sus síntomas.

El dolor asociado con la fibromialgia se refiere a cualquier dolor asociado con el síndrome de fibromialgia, incluso el dolor crónico extendido que es una marca distintiva de la fibromialgia y el dolor asociado con otros síntomas de la fibromialgia.

La espondilitis anquilosante es una enfermedad reumática que ocasiona artritis de la espina dorsal y las articulaciones sacroiliacas. Varía desde episodios intermitentes de dolor de la espalda que ocurren durante toda la vida, hasta la enfermedad severa crónica que ataca la espina dorsal, las articulaciones periféricas y otros órganos del cuerpo. Típicamente, los primeros síntomas son dolor y rigidez frecuentes en la región lumbar y las nalgas, que aparece gradualmente durante unas semanas o meses. Usualmente el dolor es sordo y difuso, más que localizado. La espondilitis anquilosante típicamente se diagnostica con un examen físico completo que incluye rayos X, historia médica individual, y una historia familiar de espondilitis anquilosante, así como también análisis sanguíneo que incluye una prueba para HLA-B27.

La psoriasis es un trastorno inflamatorio crónico de la piel que puede afectar a personas de todas las edades. Clínicamente, la psoriasis afecta más frecuentemente la piel de los codos, rodillas, cuero cabelludo, región lumbosacra, hendidura interglútea, o glande del pene. La piel afectada por la psoriasis contiene típicamente una o mas lesiones secas comprendidas de una placa bien delimitada de color rosa a color salmón cubierta por costras flojamente adheridas que son de color característicamente blanco plata. En aproximadamente el 30% de los pacientes de psoriasis también son afectadas las uñas, por ejemplo punteado u onicólisis. Se contemplan todas las formas de la psoriasis, incluso psoriasis anular y psoriasis annulata, que también son conocidas como psoriasis circinata; psoriasis artrópica; psoriasis difusa o psoriasis difundida; psoriasis exfoliativa; psoriasis flexural; psoriasis geográfica; psoriasis gyrata; psoriasis numularis; psoriasis palmar; psoriasis punctata; y una forma variante rara conocida como psoriasis pustulosa generalizada de Zambusch o simplemente psoriasis pustulosa. Morfológicamente, las lesiones establecidas de la psoriasis tienen características histológicas muy conocidas tales como engrosamiento epidérmico y cicatrización paraqueratótica. Patológicamente, actualmente se cree que la psoriasis es un trastorno autoinmune mediado por células T. El inicio de la psoriasis es gradual y el curso típico se caracteriza por remisiones y recurrencias crónicas, y ocasionalmente exacerbaciones agudas. El diagnóstico de la psoriasis se hace evaluando los signos y síntomas clínicos del paciente y la historia familiar de psoriasis. El diagnosticar la psoriasis solo inspeccionando visualmente las lesiones de la piel del paciente no es difícil, y usualmente es todo lo que se requiere para un diagnóstico completo. Sin embargo, ocasionalmente una biopsia de la piel se somete a un análisis histológico para observar los signos de la psoriasis.

El lupus eritematoso sistémico ("SLE"), llamado también lupus eritematoso diseminado, es un trastorno inflamatorio crónico del tejido conectivo de causa desconocida que puede incluir articulaciones, ríñones, superficies serosas y paredes de los vasos, que ocurre predominantemente en las mujeres jóvenes pero también en los niños. El 90% de los casos de SLE ocurren en mujeres. El SLE puede empezar abruptamente con fiebre, simulando infección aguda, o se puede desarrollar insidiosamente durante meses o años con episodios de fiebre y malestar. Cefaleas vasculares, epilepsia o psicosis pueden ser hallazgos iniciales. Pueden aparecer manifestaciones atribuibles a cualquier sistema de órgano. En aproximadamente 90% de los pacientes ocurren síntomas articulares que van de artralgias intermitentes a poliartritis aguda, y pueden existir durante años antes de que aparezcan otras manifestaciones. En una enfermedad de larga permanencia pueden ocurrir erosiones insercionales capsulares en las articulaciones metacarpofalangeales con marcada deformidad secundaria de articulación sin evidencia de rayos X de erosiones marginales obvias (artritis de Jaccoud). Sin embargo, la mayoría de la poliartritis de lupus no es destructiva ni deformante.

El lupus eritematoso sistémico es raro en menores de 5 años y la mayoría de los niños con SLE desarrollan la enfermedad durante la adolescencia. Los signos y síntomas del SLE son similares a los adultos. Sin embargo, los niños tienen un grado de transición particularmente alto del discoide a la enfermedad sistémica.

La gota (conocida también como artritis gotosa) es la artritis aguda o crónica recurrente de las articulaciones periféricas que se origina de la acumulación en el cuerpo de demasiado acido úrico, que forma cristales que se depositan en las articulaciones y ocasionan inflamación. Durante un ataque agudo de gota hay hinchazón, inflamación y dolor extremo en una articulación, frecuentemente de los dedos grandes del pie. La gota crónica se puede establecer después de varios años de ataques, dañando permanentemente y deformando las articulaciones y destruyendo las células del riñon. La mayoría de los casos ocurren en los hombres y el primer ataque ocurre raramente antes de los 30 años.

La espondiloartropatía no diferenciada (USpA) es un término usado para describir síntomas y signos de espondilitis en alguien que no satisface los criterios de un diagnóstico definitivo de espondilitis anquilosante o enfermedad relacionada. Varios síndromes bien establecidos están incluidos dentro de la familia de espondiloartropatía; incluyen espondilitis anquilosante, artritis psoriática, artritis de la enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome de Reiter, artritis reactiva crónica y artritis juvenil relacionada con entesitis. Con el tiempo, algunas personas con USpA desarrollaran una forma bien definida espondilitis tal como espondilitis anquilosante.

La espondiloartritis de inicio juvenil (JSpA), conocida también como espondiloartropatía juvenil, es el término médico de un grupo de enfermedades reumáticas de la niñez que ocasionan artritis antes de los 16 años y pueden abarcar toda la vida adulta. Las espondiloartropatias juveniles incluyen espondiloartropatía no diferenciada, espondilitis anquilosante juvenil, artritis psoriática juvenil, artritis asociada con enfermedad inflamatoria del intestino (artritis enteropatógena), artritis reactiva (el síndrome de Reiter es un tipo de artritis reactiva), y el síndrome de SEA (seronegatividad, entesopatía, artropatia). Típicamente, la JSpA ocasiona dolor e inflamación de las articulaciones en la parte inferior del cuerpo por ejemplo la pelvis, caderas, rodillas y tobillos. También pueden ser afectadas otras regiones del cuerpo, tales como la espina dorsal, ojos, piel e intestinos. También puede ocurrir fatiga y letargía.

La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria crónica inespecífica transmural que afecta más comúnmente el íleo distal y el colon, pero puede ocurrir en cualquier parte del tracto Gl. Los síntomas más comunes de la enfermedad de Crohn son la diarrea crónica con dolor abdominal, fiebre, anorexia, pérdida de peso y una masa o plenitud en el cuadrante inferior derecho. Síntomas menos comunes incluyen falta de apetito, fiebre, sudoraciones nocturnas, dolor rectal y sangrado rectal. La enfermedad de Crohn puede afectar el colon, el recto y el intestino delgado, y en casos raros también el estómago, la boca y el esófago. Los patrones más comunes de la patología de la enfermedad de Crohn son (1 ) inflamación caracterizada por dolor y sensibilidad abdominal en el cuadrante inferior derecho; (2) obstrucción parcial recurrente causada por estenosis intestinal y que produce cólicos severos, distensión abdominal, constipación y vómito; (3) yeyunoileitis difusa con inflamación y obstrucción que dan como resultado malnutrición y debilidad crónica, y (4) fístulas y abscesos abdominales, usualmente desarrollos tardíos, causando frecuentemente fiebre, masas abdominales dolorosas y desgaste generalizado. Se debe sospechar de enfermedad de Crohn en un paciente con los síntomas inflamatorios u obstructivos anteriormente descritos en un paciente sin síntomas prominentes del Gl pero con fístulas o abscesos perianales, o con artritis, eritema nodoso, fiebre, anemia o falta de crecimiento (en un niño), no explicados de otra manera. Los hallazgos del laboratorio no son específicos y pueden incluir anemia, leucocitosis, hipoalbuminemia, y aumento de los niveles de reactivos de fase aguda reflejados en ESR elevado, proteína C reactiva, y orosomucoides. La elevación de la fosfatasa alcalina y la ?-glutamil transpeptidasa que acompaña la enfermedad colónica frecuentemente refleja colangitis esclerosante primaria. El diagnóstico se hace usualmente por rayos X.

En casos avanzados, el signo del cordón se puede observar con estructuras ¡leales notables y separación de las asas intestinales. En los casos tempranos algunas veces puede ser difícil el diagnóstico con rayos X, pero el enema de bario de doble contraste y la enteroclisis pueden mostrar úlceras añosas superficiales y lineales. La colonoscopía y la biopsia pueden ayudar a confirmar el diagnóstico de la colitis de Crohn y permiten la visualización directa y biopsia del íleo terminal. La endoscopía Gl superior puede identificar implicación gastroduodenal en los pacientes de la enfermedad de Crohn con síntomas del Gl superior.

La colitis ulcerativa es una enfermedad inflamatoria y ulcerativa crónica que se origina en la mucosa colónica, caracterizada muy frecuentemente por diarrea sanguinolenta. Los síntomas más comunes de la colitis ulcerativa son la diarrea sanguinolenta de intensidad y duración variables intercalada con intervalos asintomáticos. Usualmente un ataque empieza insidiosamente, con un aumento de la urgencia por defecar, cólicos abdominales ligeros en la parte baja, y sangre y moco en las heces. Sin embargo, un ataque puede ser agudo y fulminante, con diarrea violenta repentina, fiebre alta, signos de peritonitis y toxemia profunda. Algunos casos se desarrollan después de una infección documentada (por ejemplo amebiasis, disenteria bacilar). Cuando la ulceración está confinada en la región rectosigmoide, las heces pueden ser normales o duras y secas, pero ocurren descargas rectales de moco cargado con eritrocitos y leucocitos entre los movimientos del intestino. Los síntomas sistémicos son leves o no existen. Si la ulceración se extiende proximalmente, las heces se hacen flojas y el paciente puede tener más de diez movimientos del intestino por día, frecuentemente con cólicos severos y molestias de tenesmo rectal, sin descanso en la noche. Las heces pueden ser aguadas, pueden contener moco y frecuentemente consisten casi completamente de sangre y pus. En la colitis ulcerativa activa extensa se puede presentar malestar, fiebre, anemia, anorexia, pérdida de peso, leucocitosis e hipoalbuminemia. La historia del paciente y el examen de las heces permiten un diagnóstico presuntivo de la colitis ulcerativa, que siempre debe ser confirmada por sigmoidoscopía, que provee una indicación directa inmediata de la actividad de la enfermedad. En los casos tempranos, la membrana mucosa es finamente granular y friable, con pérdida del patrón vascular normal y frecuentemente con zonas hemorrágicas cicatrizadas; el trauma mínimo (friabilidad) ocasiona sangrado en múltiples puntos. La mucosa pronto se rompe formando una superficie esponjosa roja punteada con muchas úlceras delgadas de sangre y de pus. Conforme se implica progresivamente la mucosa, la inflamación y la hemorragia se extienden hacia el músculo del intestino. Las úlceras mucosales grandes con exudado purulento abundante caracterizan la enfermedad severa. Islas de mucosa relativamente normal o inflamatoria hiperplásica (pseudopólipos) se proyectan sobre zonas de la mucosa ulcerada. Las biopsias pueden no ser específicas y algunas veces no pueden excluir colitis infecciosa aguda (autolimitada); sin embargo, las características que sugieren cronicidad (por ejemplo la arquitectura de la cripta distorsionada, atrofia de la cripta, un infiltrado inflamatorio crónico) apoyan el diagnóstico de colitis ulcerativa. Incluso durante los intervalos asintomáticos la apariencia sigmoidoscópica raramente es normal; casi siempre persiste cierto grado de friabilidad o granulosidad. Hay pérdida del patrón vascular normal y la biopsia muestra evidencia de inflamación crónica. La radiografía simple de rayos X del abdomen algunas veces ayuda a evaluar la severidad y la extensión proximal de la colitis al mostrar pérdida de haustración, edema mucosal y ausencia de heces formadas en el intestino enfermo. Sin embargo, más tarde en el curso de la enfermedad debe ser evaluado todo el colon para determinar la magnitud de la implicación. La colonoscopía total es el método más sensible y ampliamente utilizado, aunque el enema de bario puede ser informativo. La colonoscopía con biopsia es obligatoria para evaluar la naturaleza de una estructura. La biopsia también puede ayudar a distinguir la colitis ulcerativa de la enfermedad de Crohn si la inflamación es altamente focal o si se observa un granuloma.

El síndrome del intestino irritable (IBS) es un trastorno de la motilidad que incluye todo el tracto Gl, ocasionando síntomas recurrentes en el Gl superior e inferior, incluyendo grados variables de dolor abdominal, constipación o diarrea, y distensión abdominal. La causa del síndrome del intestino irritable (IBS) es desconocida. No se pude encontrar causa anatómica. Los factores emocionales, la dieta, medicamentos u hormonas pueden precipitar o agravar la motilidad incrementada del Gl. Las características del IBS son dolor aliviado por defecación, un patrón alternante de hábitos intestinales, distensión abdominal, moco en las heces y sensación de evacuación incompleta después de la defecación. En general, el carácter y localización del dolor, los factores precipitantes y el factor de defecación, son distintos en cada paciente Los pacientes con IBS también pueden tener síntomas extraintestinales (por ejemplo fibromialgia, cefaleas, dispareunia, síndrome de la articulación temporomandibular). Se han descrito dos tipos clínicos principales de IBS. En el IBS de constipación predominante, la constipación es común pero varían los hábitos intestinales. La mayoría de los pacientes tienen dolor sobre por lo menos una zona del colon, asociado con constipación periódica alternada con una frecuencia de defecación mas normal. Las heces frecuentemente contienen moco transparente o blanco. El dolor es de tipo cólico, viene por rachas, o es un dolor agudo continuo y persistente; puede ser aliviado por un movimiento intestinal. La ingestión de alimento comúnmente dispara los síntomas. También pueden ocurrir distensión, flatulencia, náusea, dispepsia y pirosis. El IBS de diarrea predominante se caracteriza por diarrea precipitada que ocurre inmediatamente al amanecer, o durante una comida o inmediatamente después de comer. La diarrea nocturna es inusual. Son comunes dolor, distensión y urgencia rectal, y puede ocurrir incontinencia. El diagnóstico de IBS se basa en patrones intestinales característicos, tiempo y carácter del dolor, y exclusión de otros procesos patológicos mediante examen físico y pruebas diagnósticas de rutina. Debido a la falta de una anormalidad estructural o bioquímica fácilmente identificable en este síndrome, la comunidad médica ha desarrollado una definición y criterios de consenso, conocidos como los criterios de Roma, para ayudar a diagnosticar el IBS. De acuerdo con el criterio de Roma, el IBS es indicado por dolor o molestia abdominal que (1) es aliviado por defecación o (2) esta asociado con un cambio de la frecuencia o consistencia de las heces; más dos o más de los siguientes eventos: frecuencia alterada de la defecación, formación alterada de las heces, pasaje alterado de las heces, paso de moco, e hinchazón o sensación de distensión abdominal. La palpación del abdomen puede revelar sensibilidad dolorosa, particularmente en el cuadrante inferior izquierdo, a veces asociada con un sigmoides sensible palpable. Se debe hacer un examen rectal digital rutinario en todos los pacientes y examen pélvico en las mujeres.

La enfermedad del intestino irritable (IBD), también conocida como enfermedad inflamatoria del intestino, se caracteriza por inflamación crónica en varios sitios del tracto Gl. La IBD comprende dos subtipos clínicos conocidos, la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerativa (UC). Algunas diferencias en los patrones de la enfermedad justifican una distinción entre la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa.

El dolor asociado con IBD e IBS puede estar presente como dolor crónico o agudo. Por ejemplo, una característica del IBS es el dolor agudo aliviado por la defecación, mientras que el dolor abdominal crónico es típico de la enfermedad de Crohn. Aunque el dolor asociado con IBD e IBS puede ocurrir de forma extraintestinal o extravisceral, generalmente estos males producen dolor visceral. El dolor visceral es dolor asociado con la viscera, que abarca los órganos de la cavidad abdominal. Estos órganos incluyen los órganos sexuales, bazo, intestino, colon, recto y otros órganos del sistema digestivo. El dolor visceral tiene cinco características clínicas importantes: (1 ) no es evocado desde todas la visceras (órganos tales como el hígado, riñon, la mayoría de las visceras sólidas y el parénquíma del pulmón no son sensibles al dolor); (2) no siempre está asociado con lesión visceral; (3) es difuso y es escasamente localizado; (4) es referido en otras localizaciones; (5) va acompañado de reflejos motores y autónomos tales como náusea, vómito y tensión muscular de la región lumbar que ocurre en el cólico renal.

El dolor es un mecanismo fisiológico protector importante diseñado para alertar del peligro de estímulos potencialmente nocivos del medio externo. El sistema opera por medio de un grupo específico de neuronas sensorias primarias y es activado por estímulos nocivos mediante mecanismos de transducción periféricos (véase Millan, 1989, Prog. Neurobiol., 57, 1-164 para una revisión). Estas fibras sensoriales son conocidas como nociceptores y característicamente son axones de diámetro pequeño con velocidades de conducción bajas. Los nociceptores codifican la intensidad, duración y calidad de los estímulos nocivos en virtud de su proyección organizada topográficamente hacia la médula espinal, la localización del estimulo. Los nociceptores se encuentran sobre las fibras nerviosas nociceptivas de las cuales hay dos tipos principales, las fibras A-delta (mielinizadas) y las fibras C (no mielinizadas). La actividad generada por la entrada del nociceptor es transferida, después de procesamiento complejo en el asta dorsal, ya sea directamente o por medio de núcleos de transmisión del tallo cerebral, al tálamo ventrobasal y después a la corteza, en donde es generada la sensación de dolor.

En general el dolor se puede clasificar como agudo o crónico. El dolor agudo empieza repentinamente y es de corta duración (usualmente doce semanas o menos). Usualmente se asocia con una causa específica tal como una lesión especifica y frecuentemente es agudo y severo. Es el tipo de dolor que puede ocurrir después de lesiones específicas producidas por cirugía, trabajo dental, un esguince o una torcedura. El dolor agudo generalmente no produce ninguna respuesta psicológica persistente. En contraste, el dolor crónico es dolor de larga duración, típicamente persiste durante más de 3 meses y conlleva a problemas psicológicos y emocionales significativos. Los ejemplos comunes del dolor crónico son el dolor neuropático (por ejemplo neuropatía diabética dolorosa, neuralgia postherpética), síndrome del túnel del carpo, dolor de la espalda, cefalea, dolor de cáncer, dolor artrítico y dolor postquirúrgico crónico.

Cuando ocurre una lesión sustancial en un tejido del cuerpo, por una enfermedad o trauma, las características de la activación del nociceptor se alteran y hay una sensibilización en la periferia, localmente alrededor de la lesión, y centralmente en donde terminan los nociceptores. Estos efectos producen una sensación incrementada de dolor. En el dolor agudo estos mecanismos pueden ser útiles, promoviendo conductas protectoras que permiten de mejor forma la ocurrencia de procesos de reparación. La expectativa normal sería que la sensibilidad retornara a lo normal una vez que haya sanado la lesión. Sin embargo, en muchos estados de dolor crónico la hipersensibilidad dura mucho mas que el proceso de sanación y frecuentemente se debe a un daño del sistema nervioso. Este daño frecuentemente acarrea anormalidades de las fibras nerviosas sensoriales asociadas con mala adaptación y actividad aberrante (Woolf y Salter, 2000, Science, 288,1765-1768).

Clínicamente, el dolor está presente cuando se presentan entre los síntomas del paciente molestia y sensibilidad anormal. Los pacientes tienden a ser muy heterogéneos y pueden presentar varios síntomas de dolor. Estos síntomas incluyen: 1) dolor espontáneo que puede ser sordo, quemante o punzante; 2) respuestas exageradas de dolor a estímulos nocivos (hiperalgesia); y 3) dolor producido por estímulos normalmente inocuos (alodinia -Meyer et al., 1994, "Textbook of pain", 13-44). Aunque los pacientes que padecen varias formas de dolor agudo y crónico pueden tener síntomas similares, los mecanismos subyacentes pueden ser diferentes y por lo tanto pueden requerir diferentes estrategias de tratamiento. Por lo tanto, el dolor también se puede dividir en varios subtipos diferentes de acuerdo con la patofisiología diferente, que incluyen dolor nociceptivo, inflamatorio y neuropático.

El dolor nociceptivo es inducido por lesión del tejido o por estímulos intensos con el potencial de causar lesión. Los aferentes del dolor son activados por transducción de estímulos por los nociceptores en el sitio de la lesión y activan las neuronas en la médula espinal en su terminación. Después, son transmitidos a los tractos espinales hasta el cerebro en donde es percibido el dolor (Meyer ef al., 1994, "Textbook of Pain", 13-44). La activación de los nociceptores activa dos tipos de fibras nerviosas aferentes. Las fibras A-delta mielinizadas transmiten rápidamente y son responsables de las sensaciones de dolor agudo y punzante, mientras que las fibras C no mielinizadas transmiten a una velocidad más baja y transportan un dolor sordo o persistente. El dolor nociceptivo agudo de moderado a severo es una característica prominente de dolor por trauma del sistema nervioso central, esguinces/torceduras, quemaduras, infartos de miocardio y pancreatitis aguda, dolor postoperatorio (dolor posterior a cualquier tipo de procedimiento quirúrgico), dolor postraumático, cólico renal, dolor de cáncer y dolor de espalda. El dolor de cáncer puede ser dolor crónico, tal como dolor relacionado con un tumor (por ejemplo dolor de hueso, cefalea, dolor facial o dolor visceral), o dolor asociado con la terapia del cáncer (por ejemplo síndrome de postquimioterapía, síndrome de dolor crónico postquirúrgico o síndrome posradiación). El dolor de cáncer también puede ocurrir en respuesta a la quimioterapia, inmunoterapía, terapia hormonal o radioterapia. El dolor de espalda se puede deber a discos intravertebrales herniados o rotos o anormalidades de las articulaciones facetarías lumbares, articulaciones sacroiliacas, músculos paraespinales o el ligamento longitudinal posterior. El dolor de espalda se puede resolver naturalmente pero en algunos pacientes, en donde dura más de doce semanas, se convierte en una condición crónica que puede ser particularmente debilitante.

Actualmente el dolor neuropático es definido como dolor iniciado o causado por una lesión primaria o disfunción del sistema nervioso. El daño del nervio puede ser ocasionado por trauma y enfermedades, y por lo tanto el término "dolor neuropático" abarca muchos trastornos con diversas etiologías. Estos incluyen sin limitación, neuropatía periférica, neuropatía diabética, neuralgia postherpética, neuralgia del trigémino, dolor de espalda, neuropatía de cáncer, neuropatía de VIH, dolor de miembro fantasma, síndrome del túnel del carpo, dolor central posterior a apoplejía y dolor asociado con alcoholismo crónico, hipotiroidismo, uremia, esclerosis múltiple, lesión de la médula espinal, enfermedad de Parkinson, epilepsia y deficiencia de vitaminas. El dolor neuropático es patológico ya que no tiene función protectora.

Frecuentemente se presenta bastante después de que la causa original se haya disipado, durando comúnmente durante años, reduciendo significativamente la calidad de vida del paciente (Woolf y annion, 1999, Lancet, 353, 1959 - 1964). Los síntomas del dolor neuropático son difíciles de tratar, ya que frecuentemente son heterogéneos incluso entre pacientes con la misma enfermedad (Woolf y Decosterd, 1999, Pain Supp., 6, S141-S1 7; Woolf y Mannion, 1999, Lancet, 353, 1959-1964). Puede ser dolor espontáneo, que puede ser continuo, y dolor evocado paroxístico o anormal, tal como hiperalgesia (aumento de la sensibilidad a estímulos nocivos) y alodinia (sensibilidad a un estímulo normalmente inocuo).

El proceso inflamatorio es una serie compleja de eventos bioquímicos y celulares, activados en respuesta a una lesión de tejido o la presencia de sustancias extrañas, lo que da como resultado hinchazón y dolor (Levine y Taiwo, 1994, "Textbook of Pain", 45-56). El dolor artrítico es el dolor inflamatorio más común. La enfermedad reumática es una de las condiciones inflamatorios crónicas más comunes en los países desarrollados, y la artritis reumatoide es una causa común de discapacidad. La etiología exacta de la artritis reumatoide es desconocida, pero las hipótesis actuales sugieren que pueden ser importantes los factores tanto genéticos como microbiológicos (Grennan y Jayson, 1994, "Textbook of Pain", 397-407). Se ha estimado que casi 16 millones de estadounidenses tienen osteoartritis sintomática (OA) o enfermedad degenerativa de la articulación, la mayoría de los cuales son mayores de 60 años, y se espera que esto aumente a 40 millones conforme aumente la edad de la población, haciendo esto un problema de salud pública de enorme magnitud (Houge y Mersfelder, 2002, Ann Pharmacother., 36, 679-686; McCarthy et al., 1994, "Textbook oí Pain", 387-395). La mayoría de los pacientes con osteoartritis buscan atención médica debido al dolor asociado. La artritis tiene un impacto significativo sobre la función psicosocial y física y se sabe que es la principal causa de discapacidad en la vida mayor. La espondilitis anquilosante también es una enfermedad reumática que ocasiona artritis de la espina dorsal y las articulaciones sacroiliacas. Varía de episodios intermitentes de dolor de espalda que ocurren durante toda la vida, hasta una enfermedad crónica severa que ataca la espina dorsal, las articulaciones periféricas y otros órganos del cuerpo.

Otro tipo de dolor inflamatorio es el dolor visceral que incluye el dolor asociado con la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD). El dolor visceral es dolor asociado con las visceras que abarcan los órganos de la cavidad abdominal. Estos órganos incluyen los órganos sexuales, el bazo y parte del sistema digestivo. El dolor asociado con las visceras se puede dividir en dolor visceral digestivo y dolor visceral no digestivo. Trastornos gastrointestinales (Gl) encontrados comúnmente que causan dolor incluyen el trastorno funcional del intestino (FBD) y la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD). Estos trastornos Gl incluyen una amplia gama de estados patológicos que actualmente solo se controlan moderadamente, que incluyen con respecto a FBD, reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome de intestino irritable (IBS) y síndrome de dolor abdominal funcional (FAPS), y con respecto a IBD, enfermedad de Crohn, ileitis y colitis ulcerativa, todos los cuales producen regularmente dolor visceral. Otros tipos de dolor visceral incluyen el dolor asociado con dismenorrea, cistitis y pancreatitis, y dolor pélvico.

Se debe notar que algunos tipos de dolor tienen múltiples etiologías y por lo tanto se pueden clasificar en más de un área, por ejemplo el dolor de espalda y el dolor de cáncer tienen componentes tanto nociceptivos como neuropáticos.

Otros tipos de dolor incluyen: - Dolor originado de trastornos musculoesqueléticos que incluyen mialgia, fibromialgia, espondilitis, artropatias seronegativas (no reumatoides), reumatismo no articular, distrofinopatía, glucogenólisis, polimiositis y piomiositis; - Dolor del corazón y vascular que incluye el dolor causado por angina, infarto de miocardio, estenosis mitral, pericarditis, fenómeno de Raynaud, esclerodermia e isquemia del músculo esquelético; - Dolor de cabeza, tal como migraña (que incluye migraña con aura y migraña sin aura), cefalea de racimo, cefalea de tipo tensión, cefalea mixta y cefalea asociada con trastornos vasculares; - Dolor orofacial, que incluye dolor dental, dolor ótico, síndrome de la boca ardiente y dolor miofacial temporomandibular.

Los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos se pueden usar en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo o porciones de unión de antigeno del mismo con un inhibidor de COX-2, tal como celecoxib, para el tratamiento de enfermedades tales como la artritis reumatoide, osteoartritis y dolor. Los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos y los otros agentes terapéuticos se pueden administrar al paciente en la misma forma farmacéutica o en formas farmacéuticas diferentes. Además, se pueden administrar al mismo tiempo o en tiempos diferentes. Más abajo se dan algunos ejemplos de los agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos anti-IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos.

Artritis reumatoide Los anticuerpos de IL-6 y las porciones de unión de antígeno de los mismos también se pueden usar en coterapias. Los compuestos para coterapia antiinflamatoria adecuados incluyen: ciclosporina, ácido zoledrónico, efalizumab, alefacept, etodolaco, lornoxicam, OM-89, valdecoxib, tocilizumab, abatacept, meloxicam, etanercept, nabumetona, rimexolona, 153Sm-EDTMP, prosorba, imidazol salicilato, oprelvekin, ácido hialurónico, naproxeno, piroxicam, diacerein, lumericoxib, tacrolimo, aceclofenaco, actarit, tenoxicam, rosiglitazona, deflazacort, adalimumab, leflunomida, risedronato de sodio, misoprostol y diclofenaco, SK-1306X, infliximab, anakinra, celecoxib, diclofenaco, etoricoxib y felbinac, reumacon, golimumab, denosumab, ofatumumab, anticuerpo 10rT1 , pelubiprofeno, licofelona, temsirolímo, eculizumab, iguratimod y prednisona. Otros antiinflamatorios adecuados incluyen CP-481715, ABN-912, MLN-3897, HuMax-IL-15, RA-1 , paclitaxel, Org-37663, Org 39141 , AED-9056, AMG-108, fontolizumab, pegsunercept, pralnacasan, apilimod, GW-274150, AT-001 , 681323 (GSK) K-832, R-1503, ocrelizumab, DE-096, Cpn10, THC+CBD (GW Pharma), 856553 (GSK), ReN-1869, inmunoglobulina, mm-093, amelubant, SCIO-469, ABT-874, LenkoVAX, LY-2127399, TRU-015, KC-706, amoxapinet y dipiridamol, TAK-715, PG 760564, VX-702, prednisolona y dipiridamol, P X-53, belimumab, prinaberel, CF-101 , tgAAV-TNFR:Fc, R-788, prednisolona y SSRI, CP-690550 y P I-001.

Osteoartritis Los anticuerpos de IL-6 y porciones de unión de antígeno de los mismos también se pueden coadministrar para el tratamiento de la osteoartritis con uno o más agentes útiles para el tratamiento de uno o más síntomas de la osteoartritis. Los ejemplos de agentes útiles para el tratamiento de uno o más síntomas de la osteoartritis para usarse en combinación con los anticuerpos de IL-6 y porciones de unión de antígeno de los mismos, incluyen los inhibidores de metaloproteinasa de matriz (MMP), inhibidores de agrecanasa, inhibidores de óxido nítrico inducible (iNOS), inhibidores de la expresión o actividad del factor de crecimiento similar a insulina (IGF), inhibidores de la expresión o actividad del factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), inhibidores de la expresión o actividad de CD44, inhibidores de la expresión o actividad de interleucina (IL), inhibidores de la expresión o actividad del factor de necrosis de tumor alfa (TNF-alfa), inhibidores de la expresión o actividad de la proteína 6 inducible por factor de necrosis de tumor (TSG-6), inhibidores de la expresión o actividad de Bikunin, inhibidores de beta-secretasa (BACE), inhibidores de PACE-4, inhibidores de la expresión o actividad del receptor nuclear rev-ErbA alfa (NR1 D1 ), inhibidores de la expresión o actividad del receptor 1 acoplado con proteína G esfingolipido de diferenciación endotelial (EDG-1), inhibidores de la expresión o actividad del receptor activado por proteinasa (PAR), inhibidores de la expresión o actividad de la proteína sensible al ácido retinoico derivada de cartílago (CD-RAP), inhibidores de la proteina cinasa C zeta (PKCz), inhibidores de la expresión o actividad de resistina, inhibidores de una desintegrina y metaloproteinasa 8 (ADAM8), inhibidores de la expresión o actividad del subcomponente del componente 1s del complemento (C1 s), inhibidores de la expresión o actividad del receptor de formil péptído de tipo 1 (FPRL1 ).

Ejemplos adicionales de agentes útiles en combinación con los anticuerpos de IL-6 y porciones de unión de antígeno de los mismos incluyen los inhibidores de MMP-2, -3, -9 o -13; inhibidores de agrecanasa 1 o 2; inhibidores de la expresión o actividad de IGF-1 o -2; inhibidores de la expresión o actividad de FGF-2, -18 o -9; e inhibidores de la expresión o actividad de IL-1 , -4 o -6.

Otros ejemplos de agentes útiles en combinación con los anticuerpos de IL-6 y porciones de unión de antígeno de los mismos incluyen los anticuerpos de IGF-1 o -2; antagonistas del receptor de FGF-2 o -3, anticuerpos de CD44, anticuerpos de IL-1 , -4 o -6, anticuerpos de TNF-alfa; anticuerpos de TSG-6; anticuerpos de bikunin; antagonistas de NR1 D1 ; antagonistas de EDG-1 ; antagonistas de PAR, anticuerpos de CD-RAP, anticuerpos de resistina, anticuerpos de C1 s y anticuerpos de FPRL1 .

Dolor Los anticuerpos de IL-6 y porciones de unión de antígeno de los mismos se pueden administrar en combinación con uno o más compuestos adicionales farmacológicamente activos para el tratamiento del dolor. Los compuestos se pueden administrar al mismo tiempo en una sola forma farmacéutica o separadamente en formas farmacéuticas que pueden ser iguales o diferentes. Alternativamente, los compuestos se pueden administrar secuencialmente. También se pueden usar en las combinaciones las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos farmacológicamente activos.

Los ejemplos de compuestos que se pueden administrar con los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos incluyen: Inhibidores selectivos de ciclooxigenasa 2 (COX-2) tales como celecoxib, rofecoxib, parecoxib, valdecoxib, deracoxib, etoricoxib y lumiracoxib; analgésicos opiodes tales como morfina, hidromorfona, oximorfona, fentanilo, codeína, dihidrocodeína, oxicodona, hidrocodona, buprenorfina, tramadol y nalbufina; agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE's) tales como aspirina, diclofenaco, diflunisal, ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, nepafenac y paracetamol; inhibidores de fosfodiesterasa V (PDEV) tales como sildenafil; ligandos alfa-2-delta tales como gabapentina y pregabalina; y anestésicos locales tales como benzocaína, lidocaína, ropivacaína, mentol, alcanfor y salicilato de metilo.

Los ejemplos de otros tipos de compuestos y clases de compuestos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos incluyen: sedantes barbitúricos; benzodiazepinas; antagonistas de histamina Hi que tienen una acción sedante; sedantes; relajantes del músculo esquelético; antagonistas del receptor de ácido N-metil-D-aspártico (NMDA); alfa-adrenérgicos; antidepresivos tricíclicos; anticonvulsivantes tales como carbamazepina; antagonistas de taquicinina (NK), particularmente antagonistas de NK-3, NK-2 o NK-1 ; antagonistas muscarínicos; neurolépticos; agonistas o antagonistas del receptor vainilloide; beta-adrenérgicos; corticosteroides; agonistas o antagonistas del receptor de serotonina (5-HT) tales como antagonistas del receptor 5-HTIB/ID, 5-HT2A y 5-HT3; analgésicos colinérgicos (nicotínicos); canabinoides; antagonistas del receptor de glutamato metabotrópico de subtipo 1 (mGluRI); inhibidores de la reincorporación de serotonina tales como sertralina; inhibidores de la reincorporación de noradrenalina (norepinefrina) tales como reboxetina, en particular (S,S)-reboxetina; inhibidores dobles de la reincorporación de serotonina-noradrenalina tales como duloxetina; inhibidores de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) tales como S-[2-[(1 -iminoetil)amino]etil]-L-homocisteína, S-[2-[(1-iminoetil)- amino]etil]-4,4-dioxo-L-cisteína, S-[2-[(1-iminoetil)amino]etil]-2-metil-L-c¡steína, ácido (2S,5Z)-2-amino-2-metil-7-[(1-iminoetil)amino]-5-heptenoico, 2-[[(1 R,3S)- 3- amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)-butil]tio]-5-doro-3-piridincarbonitrilo; 2-[[(1 R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)butil]tio]-4-clorobenzonitrilo, (2S,4R)-2-amino-4-[[2-cloro-5-(trifluorometil)fenil]tio]-5-tiazolbutanol, 2-[[( R,3S)-3-amino- 4- hidroxi-1-(5-tiazolil)butil]tio]-6-(trifluorometil)-3-piridincarbonitrilo, 2-[[(1 R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)butil]tio]-5-clorobenzonitrilo, N-[4-[2-(3-clorobencilamino)etil]fenil]tiofeno-2-carboxamidina, y disulfuro de guanidinoetilo; inhibidores de acetilcolinesterasa; antagonistas de prostaglandina E2 de subtipo 4 (EP4) tales como A/-[({2-[4-(2-etil-4,6-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]-piridin-1-il)fenil]etil}amino)-carbonil]-4-metilbenceno-sulfonamida o ácido 4-[(1 S)-1-({[5-cloro-2-(3-fluorofenoxi)piridin-3-il]carbonil}-amino)etil]benzoico; antagonistas de leucotrieno B4 tales como ácido 1-(3-bifenil-4-ilmetil-4-hidroxi-croman-7-il)-ciclopentanocarboxílico¡ inhibidores de 5-lipooxigenasa; y bloqueadores del canal de sodio.

Síndrome de fibromialgia Productos: analgésicos como paracetamol, naproxeno sódico, ibuprofeno, tramadol, trazodona; ciclobenzaprina; aspirina, celecoxib, valdecoxib, indometacina y otros AINE's; antidepresivos como los antidepresivos tricíclicos e inhibidores selectivos de la reincorporación de serotonina, por ejemplo antidepresivos tales como amitriptilina, imipramina, nortriptilina, doxepina, fluoxetina, sertralina y paroxetina; relajantes musculares tales como ciclobenzaprina; auxiliares para el sueño tales como zolpidem.

Clases: inhibidores de la reincorporación de norepinefrina-serotonina (NSRI's y SNRI's); inhibidores de la reincorporación de norepinefrina (NRI's); inhibidores selectivos de la reincorporación de serotonina (SSRI's); antidepresivos tricíclicos; inhibidores selectivos de ciclooxigenasa 2 (COX-2); agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE's); analgésicos.

Espondilitis anquilosante Productos: analgésicos como paracetamol, naproxeno sódico, ibuprofeno, tramadol, aspirina, celecoxib, valdecoxib, indometacina y otros AINE's; fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD's) como sulfasalazina o metotrexate; corticosteroides; y bloqueadores del factor de necrosis de tumor (TNF) como etanercept e infliximab.

Clases: analgésicos; AINE's; inhibidores de COX-2; DMARD's; corticosteroides, bloqueadores de TNF.

Psoriasis Productos: fototerapia incluso terapia con psoralenos y luz ultravioleta A (psoraleno UVA o PUVA), terapia con radiación ultravioleta B de banda estrecha (UVB), y terapia combinada de luz; corticosteroides tópicos; análogos de la vitamina D tales como calcipotrieno; antralina; retinoides tópicos (esto es, derivados de la vitamina A) tales como acitretina y tazaroteno; propionato de clobetasol; metotrexate; azatioprina; ciclosporina; hidroxiurea; y fármacos moduladores de la inmunidad tales como alefacept, efalizumab, y etanercept.

Clases: fototerapia; corticosteroides; análogos de la vitamina D; derivados de la vitamina A.

Gota Productos: AINE's como paracetamol, naproxeno sódico, ibuprofeno, tramadol, aspirina, celecoxib, valdecoxib e indometacina; y corticosteroides como prednisona.

Clases: analgésicos, AINE's; inhibidores de COX-2; y corticosteroides.

Enfermedad de Crohn Productos: analgésicos como paracetamol, naproxeno sódico, ibuprofeno, tramadol, aspirina, celecoxib, valdecoxib, indometacina y otros AINE's; fármacos antiinflamatorios; sulfasalazina, mesalamina, balsalazida y olsalazina; y corticosteroides como prednisona y budesonida; fármacos inmunosupresores como azatioprina, mercaptopurina, bloqueadores de TNF como infliximab y adalimumab, metotrexate y ciclosporina; antibióticos como metronidazol y ciprofloxacina; antidiarreicos como loperamida; y laxantes.

Clases: analgésicos; AINE's; inhibidores de COX-2; fármacos antiinflamatorios; bloqueadores de TNF; antibióticos; antidiarreicos; y laxantes.

Colitis ulcerativa Clases: analgésicos como paracetamol, naproxeno sódico, ibuprofeno, tramadol, aspirina, celecoxib, valdecoxib, indometacina y otros AINE's; fármacos antiinflamatorios; sulfasalazina, mesalamina, balsalazida y olsalazina; corticosteroides, fármacos inmunosupresores como azatioprina, mercaptopurina, bloqueadores de TNF como infliximab y adalimumab, metotrexate y ciclosporina; antidiarreicos como loperamida; y laxantes.

Clases: AINE's; inhibidores de COX-2; fármacos antiinflamatorios; bloqueadores de TNF; corticosteroides; inmunosupresores inhibidores de Janus cinasa 3 (Jak-3); bloqueadores de TNF; antidiarreicos; y laxantes.

Síndrome del intestino irritable Productos: antidiarreicos como loperamida; laxantes; fármacos anticolinérgicos; antidepresivos como antidepresivos tricíclicos e inhibidores selectivos de la reincorporación de serotonina, por ejemplo antidepresivos como amitriptilina, imipramina, nortriptilina, doxepina, fluoxetina, sertralina y paroxetina; alosetron; y tegaserod.

Clases: antidiarreicos; laxantes; fármacos anticolinérgicos; inhibidores de la reincorporación de norepinefrina-serotonina (NSRI's y SNRI's); inhibidores de la reincorporación de norepinefrina (NRI's); inhibidores selectivos de la reincorporación de serotonina (SSRI's); antidepresivos tricíclicos.

Composiciones farmacéuticas y administración También se proveen composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la infiltración celular anormal en un mamífero, incluso un humano, que comprende una cantidad de un anticuerpo de IL-6 o porción de unión de antígeno del mismo, como aquí se describe, que es efectiva para tratar la infiltración celular anormal, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones proveen un beneficio terapéutico a los pacientes con una o más de una variedad de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, tales como artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedades granulomatosas, esclerosis múltiple, asma y cáncer.

Los anticuerpos de IL-6 y porciones de unión de antígeno de los mismos se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Normalmente la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de IL-6 o porción de unión de antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes de retraso de absorsión, etcétera, que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina amortiguadora de fosfatos, dextrosa, glicerol, etanol, etcétera, asi como también combinaciones de los mismos. En muchos casos será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. Los ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes de mojado o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de mojado o agentes emulsionantes, conservadores o amortiguadores, que incrementan la vida útil en almacenamiento o la eficiencia del anticuerpo.

Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas farmacéuticas, por ejemplo formas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración deseado y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las que se utilizan para la inmunización pasiva de humanos. En un caso, el modo de administración es el parenteral (por ejemplo intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En otro caso, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otro caso, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea. Los preparados para inyección se pueden presentar en formas farmacéuticas, por ejemplo en ampolletas o en recipientes de dosis múltiples con o sin conservador. Las composiciones pueden tener formas tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizadores o agentes de dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución antes de usarse con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el anticuerpo de IL-4 en la cantidad requerida en un disolvente adecuado, con uno de los ingredientes anteriormente mencionados o una combinación de los mismos, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En un caso, el anticuerpo se administra en un preparado como una solución acuosa estéril que tiene un pH que varía de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5, y que comprende de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo; de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de amortiguador de histidina; de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80 o polisorbato 20; de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de un azúcar no reductor seleccionado sin limitación de trehalosa o sacarosa; y de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de EDTA disódico dihidratado; y que comprende opcionalmente un antioxidante farmacéuticamente aceptable además de un agente quelante. Los antioxidantes adecuados incluyen, sin limitación, metionina, tiosulfato de sodio, catalasa y platino. Por ejemplo, la composición puede contener metionina en una concentración que varía de 1 mM a aproximadamente 100 mM, y en particular aproximadamente 27 mM. En algunos casos, un preparado contiene 5 mg/ml de anticuerpo en un amortiguador de citrato de sodio 20 mM, pH 5.5, 140 mM de NaCI y 0.2 mg/ml de polisorbato 80. Es de notar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición que se quiere aliviar. En el caso de polvos estériles para preparar soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación adecuados incluyen secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada por filtración. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y usando agentes tensoactivos. La absorción de las composiciones inyectables se puede prolongar incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos se pueden administrar mediante una variedad de métodos, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas el modo o vía de administración puede ser subcutánea, intramuscular, o infusión intravenosa. Como será apreciado por los expertos en la materia, la vía o modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados.

En algunos casos, las composiciones de anticuerpo de IL-6 se pueden preparar con un vehículo que protege al anticuerpo contra una liberación rápida, tales como las composiciones de liberación controlada, que incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres y ácido poliláctico. Se pueden usar muchos métodos para preparar dichas composiciones; véase por ejemplo "Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978, que se incorpora aquí como referencia.

También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos adicionales. En algunos casos, un anticuerpo de IL-6 inhibitorio se formula o se administra conjuntamente con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Estos agentes incluyen, sin limitación, anticuerpos que se unen a otros objetivos, agentes antitumorales, agentes antiangiogénicos, inhibidores de la transducción de señal, agentes antiproliferativos, agentes quimioterapéuticos, o análogos de péptido que inhiben IL-6. Estas terapias de combinación pueden requerir dosis más bajas del anticuerpo de IL-6 inhibidor y de los agentes administrados conjuntamente, evitando así una posible toxicidad o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

Las composiciones pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva1' de un anticuerpo o porción de unión de antigeno. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos necesarios, para obtener el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de unión de antígeno puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para provocar la respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es aquella en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de unión de antígeno es rebasado por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos necesarios, para obtener el resultado profiláctico deseado. Normalmente como se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes de la enfermedad o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva puede ser menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo; se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo; o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis según lo dicten las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en formas farmacéuticas dosificadas para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma farmacéutica dosificada, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente distintas adecuadas como dosis unitarias para tratar a los sujetos mamíferos; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de anticuerpo IL-6 o porción de unión de antígeno del mismo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

Una escala ejemplar no limitativa para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo IL-6 o porción de anticuerpo, es de 0.025 mg/kg a 50 mg/kg, de 0.1 mg/kg a 50 mg/kg, 0.1-25, 0.1 a 10, o 0.1 a 3 mg/kg. En un caso, el anticuerpo de IL-6 o porción de anticuerpo se administra como una solución acuosa estéril que tiene un pH que varía de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5, y que comprende de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo; de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de amortiguador de histidina; de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80; de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa; y de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de EDTA disódico dihidratado. Es de notar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición que se quiere aliviar. Además se entiende que, para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajusfar con el tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el criterio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de las composiciones, y las escalas de dosificación indicadas en la presente son únicamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance ni la práctica de las composiciones reclamadas.

Otro aspecto aquí provisto son kits que comprenden un anticuerpo o una porción de unión de antígeno de IL-6, o una composición que comprende dicho anticuerpo o porción de unión de antigeno. Un kit puede incluir, además del anticuerpo o composición, agentes diagnósticos o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones de uso en un método diagnóstico o terapéutico. En un caso, el kit incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende y un agente diagnóstico, que se pueden usar en un método descrito en la presente. En otro caso, el kit incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende y uno o más agentes terapéuticos, que se pueden usar en un método que se describe en la presente.

Métodos de uso diagnóstico Otro aspecto aquí provisto son métodos diagnósticos. Los anticuerpos anti-IL-6, o porción de unión de antígeno de los mismos, se pueden usar para detectar IL-6 en una muestra biológica in vitro o in vivo. Un aspecto provee un método para diagnosticar la presencia o localización de células que expresan IL-6 en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende los pasos de inyectar el anticuerpo al sujeto, determinar la expresión de IL-6 en el sujeto, localizando en donde se ha unido el anticuerpo, comparar la expresión en el sujeto con la de un sujeto normal de referencia o un estándar, y diagnosticar la presencia o localización de las células. Los anticuerpos anti-IL-6 también se pueden usar como un marcador de la inflamación o infiltración de células inmunes, tales como monocitos y células T, a un tejido.

Los anticuerpos anti-IL-6 se pueden usar en cualquier inmunoensayo adecuado, que incluye sin limitación ELISA, RIA, citometría de flujo, inmunohistoquímica de tejido, Western blot, o inmunoprecipitación Los anticuerpos anti-IL-6, o porción de unión de antígeno de los mismos, se pueden usar para detectar IL-6 de humanos. En otro caso, los anticuerpos anti-IL-6 se pueden usar para detectar IL-6 de monos cynomolgus, monos rhesus, y roedores tales como ratones y ratas.

Los métodos para detectar IL-6 en una muestra biológica generalmente comprenden poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-IL-6, o porción de unión de antígeno del mismo, y detectar el anticuerpo unido. En un caso, el anticuerpo anti-IL-6 o porción de unión de antigeno del mismo se marca directamente con una marca detectable. En otro caso, el anticuerpo anti-IL-6 (el primer anticuerpo) no se marca, y se marca un segundo anticuerpo u otra molécula que se puede unir al anticuerpo anti-IL-6. Se elige un segundo anticuerpo que sea capaz de unirse específicamente a la especie y clase particular del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-IL-6 es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario podría ser un anti-lgG humano. Otras moléculas que se pueden unir a los anticuerpos incluyen, sin limitación, proteína A y proteína G, ambas disponibles comercialmente, por ejemplo de Pierce Chemical Company.

Se describen aquí marcas adecuadas para el anticuerpo o el anticuerpo secundario, e incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 25l, 131l, 35S o 3H.

La IL-6 se puede analizar en una muestra biológica por medio de un inmunoensayo de competencia utilizando estándares de IL-6 marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-6 no marcado. En esta prueba se combinan la muestra biológica, los estándares de IL-6 marcados y el anticuerpo anti-IL-6, y se determina la cantidad de estándar de IL-6 marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de IL-6 en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad del estándar de IL-6 marcado unido al anticuerpo anti-IL-6.

Se pueden usar estos inmunoensayos para varios propósitos.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos se pueden usar para detectar IL-6 en células cultivadas. En un caso, los anticuerpos anti-IL-6 o porciones de unión de antigeno de los mismos se usan para determinar la cantidad de IL-6 sobre la superficie de las células que han sido tratadas con varios compuestos. Este método se puede usar para identificar compuestos que modulan los niveles de proteina IL-6. De acuerdo con este método, una muestra de células se trata con un compuesto de prueba durante un periodo, mientras que otra muestra se deja sin tratar. Si se va a medir la expresión total de IL-6, las células se lisan y la expresión total de IL-6 se mide usando cualquier inmunoensayo adecuado. La expresión total de IL-6 en las células tratadas se compara con la de células no tratadas para determinar el efecto del compuesto de prueba.

Los inmunoensayos para medir la expresión total de IL-6 incluyen la citometría de flujo e inmunohistoquímica. Si se va a medir la expresión de IL-6 en la superficie celular, las células no se lisan y se miden los niveles de IL-6 en la superficie celular usando uno de los inmunoensayos anteriormente descritos. Un inmunoensayo preferido para determinar los niveles de IL-6 en la superficie celular incluye los pasos de marcar las proteínas de superficie celular con una marca detectable, tal como biotina o 125l, inmunoprecipitar la IL-6 con un anticuerpo anti-IL-6, y después detectar la IL-6 marcada.

Otro inmunoensayo preferido para determinar la localización de IL-6, por ejemplo los niveles en la superficie celular, es utilizando inmunohistoquímica. Un inmunoensayo para detectar los niveles de IL-6 en la superficie celular incluye la unión de un anticuerpo antí-IL-6 marcado con un fluoróforo adecuado, tal como fluoresceína o ficoerítrina, y detectar el anticuerpo primario usando citometría de flujo. En otro ejemplo, el anticuerpo anti-IL-6 no se marca, y se marca un anticuerpo secundario u otra molécula que se puede unir al anticuerpo anti-IL-6. Los métodos como ELISA, RIA, citometría de flujo, Western blot, inmunohistoquímica, marcación en superficie celular de proteínas integrales de membrana, e inmunoprectpitación, son muy conocidos; véase por ejemplo Harlow y Lañe. Además, los inmunoensayos se pueden escalar ascendentemente para exploración de alto rendimiento para probar la activación o inhibición de IL-6 de una gran cantidad de compuestos.

Los anticuerpos anti-IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos también se pueden usar para determinar los niveles de IL-6 en un tejido o en células derivadas del tejido. En algunos ejemplos, el tejido es un tejido enfermo o una biopsia de tejido. El tejido o biopsia se pueden usar en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, la expresión total de IL-6, los niveles de IL-6 en la superficie celular, o la localización de IL-6, mediante los métodos anteriormente expuestos. Tales métodos se pueden usar para determinar si un tejido expresa altos niveles de IL-6, lo que podría ser indicativo de que el tejido es un objetivo para el tratamiento con el anticuerpo anti-IL-6.

Los anticuerpos de IL-6 y las porciones de unión de antígeno de los mismos también se pueden usar ¡n vivo para identificar tejidos y órganos que expresan IL-6. En algunos casos, los anticuerpos anti-IL-6 se usan para identificar células que expresan IL-6. Los anticuerpos anti-IL-6 humanos se pueden usar in vivo sin peligro, sin provocar una respuesta inmune sustancial al anticuerpo tras su administración, a diferencia de los anticuerpos de origen no humano o los anticuerpos humanizados o quiméricos.

El método comprende los pasos de administrar un anticuerpo anti-IL-6 marcado detectablemente, o una composición que lo comprende, a un paciente en necesidad de dicha prueba diagnóstica, y someter al paciente a análisis de imagen para determinar la localización de los tejidos que expresan IL-6. Los análisis de imagen son muy conocidos en el campo médico e incluyen, sin limitación, análisis de rayos X, imagografia de resonancia magnética (MRI) o tomografía computarizada (CT). El anticuerpo se puede marcar con cualquier agente adecuado para imagografia in vivo, por ejemplo un agente de contraste, tal como bario, que se puede usar para análisis de rayos X, o un agente de contraste magnético, tal como un quelato de gadolinio, que se puede usar para MRI o CT. Otros agentes de marcación incluyen, sin limitación, radioisótopos tales como "Te. En otro caso, el anticuerpo anti-IL-6 no será marcado y será revelado administrando un segundo anticuerpo u otra molécula que sea detectable y que se pueda unir al anticuerpo anti-IL-6. En un ejemplo, se obtiene una biopsia del paciente para determinar si el tejido de interés expresa IL-6.

El anti-IL-6 marcado detectablemente puede comprender un fluoróforo. En algunos casos, el fluoróforo se selecciona del grupo que consiste en un colorante fluorescente de infrarrojo cercano, dinitrofenilo, fluoresceína y derivados de la misma, rodamina, derivados de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehído y fluorescamina, rojo de Texas, verde de Rodamina, verde de Oregon, azul de Cascada, ficoeritrina, CY3, CY5, CY2, CY7, cumarina, infrarrojo 40, MR 200, IRD 40, Alexa Fluor, azul de Cascada, tetrametilrodamina, azul del Pacífico, SYBR y BODIPY. En otro ejemplo, el fluoróforo incluye uno de los siguientes compuestos, con sus máximos de emisión indicados en nm entre paréntesis, Cy2™ (506), GFP (Rojo desplazado) (507), YO-PRO®-1 (509), YOYO®-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX® (519), Alexa® (520), rodamina 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green® 500 (522), Oregon Green® 488 (524), RiboGreen® (525), Rhodamine Green® (527), rodamina 123 (529), Magnesium Green® (531 ), Calcium Green® (533), TO-PRO®-1 (533), TOTO®-1 (533), JOE (548), BODIPY® 530/550 (550), Dil (565), BODIPY® (568), BODIPY® 558/568 (568), BODIPY® 564/570 (570), Cy3® (570), Alexa® 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange® (575), ficoeritrina R&B (575), rodamina faloidina (575), Calcium Orange® (576), pironina Y (580), rodamina B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red® (590), Cy3.5® (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa® 594 (615), Texas RedR™ (615), rojo del Nilo (628), YO-PRO®-3 (631), YOYO®-3 (631), R-ficocianina (642), C-ficocianina (648), TO-PRO®-3 (660), TOTO®-3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), tiadicarbocianina (671) y Cy5.5 (694).

En otro ejemplo más, los anticuerpos anti-IL-6 también se pueden usar para determinar la reducción de la expresión de IL-6 en la superficie de las células, por ejemplo, linfocitos o monocitos.

Los anticuerpos anti-IL-6 humanos o las porciones de unión de antigeno de los mismos minimizan las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas de los anticuerpos monoclonales (Mabs) no humanos o no derivados de humano, y por lo tanto aumentan la eficacia y seguridad de los anticuerpos o las porciones de unión de antígeno de los mismos administrados.

Otro aspecto provee anticuerpos anti-IL-6 humanos codificados en parte por una secuencia de linea germinal humana. Los genes VH, VK, VA se clasifican en familias basándose en la homología de secuencias. Dos genes VH, VK, VA pertenecen a la misma familia si comparten la misma secuencia de nucleótidos en más de 80% de las posiciones. Un anticuerpo anti-IL-6 puede comprender una cadena ligera kappa (VK) humana o una cadena ligera lambda (VA) humana o una secuencia de aminoácidos derivada de las mismas. En algunos casos en que comprende una cadena ligera lambda, el dominio variable de cadena ligera (VL) es codificado en parte por un gen humano de la familia VA1 , VA2, VA3, VA4, VA5, VA6, VA7, VA8, VA9 o VA10 (Williams S.C. et al. J. Mol. Bio. 264:220-232, 1996). En algunos casos en que comprende una cadena ligera kappa, el dominio variable de cadena ligera (VL) es codificado en parte por un gen humano de la familia VKI, VKII, VKIII, VKIV, VKV o VKVI (COX J. P. L , et al, Eur. J. Immunol 24:827-836, 1994), preferiblemente un gen de la familia VKI, VKII, V«IH, o VKIV, y de preferencia un gen de la familia V«l o VKVI . En algunos casos, la secuencia de línea germinal de cadena ligera se selecciona de secuencias VK humanas que incluyen, sin limitación, A1 , A10, A1 1 , A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1 , L10, L11 , L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, 01 , 011 , 012, 014, 018, 02, 04 y 08. En algunos casos, este armazón de linea germinal humana de cadena ligera se selecciona de V1-11 , V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1 -19, V1-2, V1 -20, V1 -22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1 , V2-1 1 , V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1 , V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5- 1 , V5-2, V5-4 y V5-6. Un anticuerpo anti-IL-6 puede comprender un dominio variable de cadena pesada (VH) codificado por un gen humano de la familia VH1 , VH2, VH3, VH4, VH5, Vh6 O Vh7. En ejemplos particulares, este armazón de línea germinal humana de cadena pesada se selecciona de VH1-18, VH1 - 2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1 -8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11 , VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21 , VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31 , VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4- 61 , VH5-51 , VH6-1 y VH7-81. En casos particulares, la región variable de cadena ligera o la región variable de cadena pesada comprenden una región de armazón, o por lo menos una porción de una región de armazón (por ejemplo, que contiene 2 o 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). En algunos casos, por lo menos FRL1 , FRL2, FRL3, o FRL4 es completamente humano. En otros ejemplos, por lo menos FRH1 , FRH2, FRH3, o FRH4 es completamente humano. En algunos casos, por lo menos FRL1 , FRL2, FRL3, o FRL4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana), o comprende secuencias de consenso humanas para el armazón particular (fácilmente disponibles en las fuentes de secuencias conocidas de Ig humana que se describen en la presente). En otros ejemplos, por lo menos FRH1 , FRH2, FRH3, o FRH4 es una secuencia de línea germinal (por ejemplo línea germinal humana), o comprende secuencias de consenso humanas para el armazón particular.

El VL del anticuerpo de IL-6 puede comprender una o más sustituciones de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de linea germinal del gen humano. En algunos casos, el VL del anticuerpo IL-6 comprende 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de línea germinal. En un ejemplo, una o más de las sustituciones de la línea germinal están en las regiones CDR de la cadena ligera. En un ejemplo, las sustituciones de aminoácido con respecto a la línea germinal están en una o más de las mismas posiciones que las sustituciones con respecto a la línea germinal en cualesquiera uno o más de los VL de los anticuerpos 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1. Por ejemplo, el VL de un anticuerpo de IL-6 puede contener una o más sustituciones de aminoácido en comparación con la línea germinal encontrada en el VL del anticuerpo 9C8 lgG1. En algunos casos, los cambios de aminoácido están en una o más de las mismas posiciones, pero incluyen una sustitución diferente que en el anticuerpo de referencia.

En algunos casos, los cambios de aminoácido con respecto a la linea germinal ocurren en una o más de las mismas posiciones que en cualquiera de los VL de los anticuerpos 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 , pero los cambios pueden representar sustituciones conservativas de aminoácido en dichas posiciones con respecto al aminoácido en el anticuerpo de referencia. Por ejemplo, si una posición particular en uno de estos anticuerpos se cambia con respecto a la linea germinal y es glutamato, se puede sustituir con aspartato en esa posición. Similarmente, si una sustitución de aminoácido en comparación con la linea germinal es serina, se puede sustituir conservativamente la serina con treonina en esa posición.

En algunos casos, la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-6 humano comprende la secuencia de aminoácidos VL del anticuerpo 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 , o la secuencia de aminoácidos que tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones conservativas de aminoácido o un total de 3 sustituciones no conservativas de aminoácido. En algunos casos, la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de cualquiera de los anticuerpos anteriores.

En algunos casos, la cadena ligera puede comprender las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 seleccionadas independientemente de las CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, respectivamente, de la cadena ligera de los anticuerpos 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 , o regiones CDR que tienen, cada una, menos de 4 o menos de 3 sustituciones conservativas de aminoácido o un total de tres sustituciones no conservativas de aminoácido o menos. En algunos casos, la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-6 comprende una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera, cada una de las cuales se selecciona independientemente de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1. En algunos casos, la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-6 comprende las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la región VL de un anticuerpo seleccionado de 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 , o las regiones CDR que tienen, cada una, menos de 4 o menos de 3 sustituciones conservativas de aminoácido o un total de tres sustituciones no conservativas de aminoácido o menos.

En algunos casos, el dominio variable (VH) es codificado, por lo menos en parte, por un gen humano. En algunos casos, la secuencia VH del anticuerpo de IL-6 contiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones (adiciones) de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de la linea germinal. En algunos casos, el dominio variable de cadena pesada comprende 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, o 17 mutaciones de la secuencia de aminoácidos de línea germinal. En algunos casos, las mutaciones son sustituciones, supresiones o inserciones no conservativas en comparación con la secuencia de aminoácidos de linea germinal. En algunos ejemplos, las mutaciones son en las regiones CDR de la cadena pesada. En algunos ejemplos, los cambios de aminoácido se hacen en una o más de las mismas posiciones que las mutaciones de la línea germinal en cualesquiera uno o más de los VH de los anticuerpos 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1. En otros ejemplos, los cambios de aminoácido son en una o más de las mismas posiciones pero incluyen una mutación diferente del anticuerpo de referencia.

En algunos casos, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de VH del anticuerpo 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 , la secuencia de aminoácidos de VH teniendo 1 , 2, 3, 4, 6, 8, o 10 sustituciones conservativas de aminoácido o un total de hasta 3 sustituciones no conservativas de aminoácido. En algunos ejemplos, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de cualquiera de los anticuerpos anteriores.

En algunos casos, la cadena pesada comprende las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 , o las regiones CDR que tienen, cada una, menos de 8, menos de 6, menos de 4, o menos de 3 sustituciones conservativas de aminoácido o un total de tres sustituciones no conservativas de aminoácido o menos.

En algunos casos, las regiones CDR de cadena pesada se seleccionan independientemente de las regiones CDR de los anticuerpos 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1. En otros casos, la cadena pesada comprende regiones CDR seleccionadas independientemente de dos o más regiones VH seleccionadas de 9C8 !gG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1.

En otros casos, el anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada. En un ejemplo más, las CDR's de cadena ligera y las CDR's de cadena pesada son del mismo anticuerpo.

Un tipo de sustitución de aminoácido que se puede hacer es cambiar una o más cisteínas del anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, con otro residuo tal como por ejemplo, sin limitación, alanina o serina. En un ejemplo, hay una sustitución de una cisteina no canónica. La sustitución se puede hacer en una CDR o una región de armazón de un dominio variable, o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunos casos la cisteina es canónica.

Otro tipo de sustitución de aminoácido que se puede hacer es cambiar cualquier sitio proteolitico potencial del anticuerpo. Tales sitios pueden ocurrir en una CDR o región de armazón de un dominio variable, o en el dominio constante de un anticuerpo. La sustitución de residuos de cisteina y la remoción de sitios proteolíticos pueden disminuir el riesgo de cualquier heterogeneidad en el producto de anticuerpo, y por lo tanto aumentan su homogeneidad. Otro tipo de sustitución de aminoácido es la eliminación de pares asparagina-glicina, que forman sitios potenciales de desamidación, alterando uno o los dos residuos.

En algunos casos, las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de IL-6 pueden incluir opcionalmente una secuencia de señal.

En algunos casos, el anticuerpo comprende las variantes de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1. Como se expone en mayor detalle en el ejemplo 3, se hicieron muchas mutaciones variantes de cadena pesada y ligera para igualar a las regiones CDR de línea germinal. Los aminoácidos específicos que se mutaron para llegar a las versiones de línea germinal serán evidentes para los expertos en la materia al comparar las secuencias de la linea germinal con un anticuerpo que no es de linea germinal. Por ejemplo, se provee una sustitución de aminoácido en la cadena pesada del anticuerpo 9C8, en donde una isoleucina en el residuo 24 se cambió a una valina y se le denominó 9C8 I24V. Una segunda sustitución de aminoácido ejemplar está en la cadena ligera del anticuerpo 9C8 y se sustituye la lisina en el residuo 92 con una asparagina, y se le denomina 9C8 K92N.

Como se apreciará, el análisis de la utilización de gen provee solo una vista general limitada de la estructura del anticuerpo. Como las células B humanas generan estocásticamente transcritos de cadena pesada V-D-J o de cadena ligera V-J kappa, existen varios procesos secundarios que ocurren, que incluyen, sin limitación, hipermutación somática, adiciones y extensiones de CDR3. Por consiguiente, para explorar más las estructuras de anticuerpo, se generaron secuencias de aminoácidos predichas de los anticuerpos, partiendo de los ADNc's obtenidos de los clones. Además, se obtuvieron secuencias de aminoácido N-terminales por medio de secuenciación de proteína.

Clases y subclases de anticuerpos anti-IL-6 La clase (por ejemplo, IgG, IgM, IgE, IgA, o IgD) y subclase (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, o lgG4) de los anticuerpos IL-6 se pueden determinar mediante cualquier método adecuado. En general, la clase y subclase de un anticuerpo se pueden determinar usando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase particulares de anticuerpo. Tales anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase y subclase se pueden determinar por medio de ELISA, o Western Blot, y también mediante otras técnicas.

Alternativamente, la clase y subclase se pueden determinar por secuenciación de una parte o todos los dominios constantes de las cadenas pesada o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos. Los anticuerpos de IL-6 pueden ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA, o IgD. Por ejemplo, los anticuerpos de IL-6 pueden ser una IgG que es de subclase lgG1 , lgG2, lgG3, o lgG4. En un ejemplo, los anticuerpos de IL-6 son de la subclase lgG2. En otro ejemplo, los anticuerpos de IL-6 son de la subclase lgG1 .

En un aspecto se proveen métodos para convertir la clase o subclase de un anticuerpo de IL-6 en otra clase o subclase. En algunos casos, una molécula de ácido nucleico que codifica un VL o VH que no incluye secuencias que codifican C|_ o CH, se aisla usando cualquier método adecuado. Después, la molécula de ácido nucleico se enlaza operativamente con una secuencia de ácido nucleico que codifica una CL o CH de una clase o subclase de inmunoglobulina deseada. Esto se puede lograr usando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL o CH, como se describe arriba. Por ejemplo, un anticuerpo de IL-6 que fue originalmente IgM se puede cambiar de clase a una IgG. Además, el cambio de clase se puede usar para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo de lgG1 a lgG2. Otro método para producir un anticuerpo que comprende un isotipo deseado comprende los pasos de aislar un ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo de IL-6 y un ácido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo de IL-6, aislar la secuencia que codifica la región VH, ligar la secuencia VH a una secuencia que codifica un dominio constante de cadena pesada del isotipo deseado, expresar el gen de cadena ligera y la construcción de cadena pesada en una célula, y recolectar el anticuerpo de IL-6 con el isotipo deseado.

Afinidad de unión de los anticuerpos de IL-6 a IL-6 La afinidad de unión y la velocidad de disociación de un anticuerpo anti-IL-6 a la IL-6 se pueden determinar mediante cualquier método adecuado. La afinidad de unión se puede medir por medio de ELISA, RIA, citometria de flujo y resonancia de plasmón de superficie, tal como BIACORE™. La velocidad de disociación se puede medir por resonancia de plasmón de superficie. Usando cualquier método adecuado se puede determinar si un anticuerpo tiene sustancialmente la misma KD que un anticuerpo anti-IL-6. El ejemplo 7 ilustra un método para determinar las constantes de afinidad de anticuerpos monoclonales.

Identificación de los epitopes de IL-6 reconocidos por los anticuerpos anti-IL-6 Usando cualquier método adecuado se puede determinar si un anticuerpo se une al mismo epítope o compite cruzadamente por la unión con un anticuerpo de IL-6. En un ejemplo, se deja que el anticuerpo de IL-6 se una a IL-6 bajo condiciones de saturación, y después se mide la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse a IL-6. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a IL-6 al mismo tiempo que al anticuerpo de IL-6, entonces el anticuerpo de prueba se une a un epítope diferente que el anticuerpo de IL-6. Sin embargo, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a IL-6 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de prueba se une al mismo epítope, un epítope traslapado, o un epítope muy cercano al epítope enlazado por el anticuerpo de IL-6 humano. Este experimento se puede realizar usando una prueba ELISA, RIA, BIACORE™, o citometría de flujo (FACS).

Para probar si un anticuerpo de IL-6 compite cruzadamente con otro anticuerpo de IL-6, se puede usar el método de competencia antes descrito en dos direcciones; esto es, se determina si el anticuerpo de referencia bloquea el anticuerpo de prueba, y viceversa. En un ejemplo, el experimento se realiza usando una prueba ELISA.

Métodos de producción de anticuerpos Los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antígeno de los mismos se pueden producir mediante una variedad de técnicas que incluyen la metodología convencional de anticuerpo monoclonal, por ejemplo la técnica estándar de hibridación de célula somática de Kohier y Milstein (1975), Nature 256: 495. También se pueden usar otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, tales como transformación viral u oncogénica de linfocitos B.

Un sistema animal ejemplar para preparar hibridomas es un sistema murino. Los protocolos de inmunización y las técnicas de aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos. También se conocen los socios de fusión (por ejemplo células de mieloma murinas) y procedimientos de fusión.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describe arriba. Se puede obtener ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera partiendo del hibridoma murino de interés, y usando las técnicas normales de biología molecular se le puede manipular para que contenga secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas). Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden enlazar con regiones constantes humanas usando los métodos conocidos (véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 4,816,567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo inmunizado, las regiones CDR murinas se pueden insertar en un armazón humano usando los métodos conocidos (véanse por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,225,539, y las patentes de EE. UU. Nos. 5,530, 101 ; 5,585,089; 5,693,762; y 6,180,370.

En un caso, los anticuerpos anti-IL-6 son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra IL-6 pueden ser generados usando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones referidos aquí como HuMAb Mouse® y KM Mouse®, respectivamente, y son referidos colectivamente como "ratones de Ig humana".

El ratón HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.) contiene minilocus de gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humana no rearregladas de cadena pesada (µ y ?) y de cadena ligera ?, junto con mutaciones dirigidas que desactivan los locus endógenos de cadena µ y ? (véase, por ejemplo, Lonberg et. al (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben expresión reducida de IgM o ? de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos introducidos de cadena pesada y ligera sufren cambio de clase y mutación somática para generar IgGK humana monoclonal de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), revisado por Lonberg, N. (1994) "Handbook of Experimental Pharmacology" 113:49-101 ; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995), Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995), Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso del ratón HuMAb Mouse®, y las modificaciones genómicas llevadas por dichos ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. et al. (1992), Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. eí al. (1993), International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993), Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993), EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994), J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994), International Immunology 6: 579-591 ; y Fishwild, D. ef al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851 ; el contenido de todas las cuales se incorpora aquí específicamente como referencia en su totalidad. Además, véanse, las patentes de EE. UU. Nos: 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661 ,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; la patente de EE. UU. No. 5,545,807; las publicaciones de PCT Nos: WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962; y la publicación de PCT No. WO 01/14424.

En otro aspecto, los anticuerpos humanos anti-IL-6 se pueden desarrollar usando un ratón que lleva secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tales como un ratón que lleva un transgen de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana.

Tales ratones, referidos aquí como "KM mice™", se describen en detalle en la publicación de PCT No. WO 02/43478.

Además, están disponibles sistemas de animal transgénico alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y se pueden usar para desarrollar los anticuerpos de IL-6. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo referido como el Xenomouse™ (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen por ejemplo en las patentes de EE. UU. Nos: 5,939,598; 6,075,181 ; 6,1 14,598; 6,150,584; y 6,162,963.

Más aún, están disponibles sistemas de animal transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, y se pueden usar para desarrollar los anticuerpos de IL-6. Por ejemplo, se pueden usar ratones que llevan un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana, referidos como "ratones TC"; tales ratones se describen en Tomizuka et al. (2000), Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA 97:722-727. Además, se han descrito vacas que llevan transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al. (2002), Nature Biotechnology 20:889-894), y se pueden usar para desarrollar los anticuerpos de IL-6.

Los anticuerpos monoclonales humanos también se pueden preparar usando ratones SCID en los cuales han sido reconstituidas células inmunes humanas de tal manera que puede ser generada una respuesta de anticuerpo humano por inmunización. Tales ratones se describen por ejemplo en las patentes de EE. UU. Nos: 5,476,996; y 5,698,767.

Inmunización de ratones con Iq humana Producción de anticuerpos y lineas celulares productoras de anticuerpo: Después de la inmunización de un animal con un antigeno IL-6, se pueden obtener del animal los anticuerpos o células productoras de anticuerpo. En algunos casos, el suero que contiene el anticuerpo de IL-6 del animal se obtiene sangrando o sacrificando el animal. El suero se puede usar tal como se obtiene del animal, o se puede obtener del suero una fracción de inmunoglobulina, o los anticuerpos de IL-6 se pueden purificar del suero.

En algunos casos se preparan líneas de células inmortalizadas productoras de anticuerpo partiendo de células aisladas del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y las células B de ganglios linfáticos o esplénicas se inmortalizan mediante cualquier método conocido. Los métodos para inmortalizar células incluyen, sin limitación, transfectarlas con oncogenes, infectarlas con un virus oncogénico, y cultivarlas bajo condiciones que seleccionan las células inmortalizadas, sometiéndolas a compuestos carcinogénicos o mutagénicos, fusionándolas con una célula inmortalizada, por ejemplo una célula de mieloma, y desactivando el gen supresor de tumor. Si se usa fusión con células de mieloma, preferiblemente las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretoria). Las células inmortalizadas se exploran usando IL-6, una porción de la misma, o una célula que expresa IL-6. En algunos casos, la exploración inicial se hace usando un inmunoensayo enlazado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo. Un ejemplo de exploración de ELISA se provee en la publicación de PCT No. WO 00/37504, que se incorpora aquí como referencia.

Las células productoras de anticuerpo de IL-6, por ejemplo hibridomas, se seleccionan, se clonan y se exploran adicionalmente para buscar características deseables que incluyen crecimiento robusto, alta producción de anticuerpo y características deseables del anticuerpo. Los hibridomas se pueden expandir in vivo en animales singeneicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo ratones sin pelo, o en cultivo de células in vitro. Los métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son muy conocidos de los expertos en la materia.

En un ejemplo, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana, y las células B esplénicas se fusionan con una línea de células de mieloma de la misma especie que el animal no humano. Uno de estos animales inmunizados es un ratón Kirin TC Mouse™, y la línea de células de mieloma es un mieloma de ratón no secretorio. En un ejemplo más, la línea de células de mieloma es Sp2/0-Ag14 (American Type Culture Collection (ATCC) CRL-1581).

También se proveen métodos para producir una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal humano o porciones de unión de antígeno del mismo, dirigido a IL-6, que comprenden: (a) inmunizar un animal transgénico no humano que se describe en la presente con IL-6, una porción de IL-6, o una célula o tejido que expresa IL-6; (b) permitir que el animal transgénico monte una respuesta inmune para IL-6; (c) aislar las células productoras de anticuerpo del animal transgénico; (d) inmortalizar las células productoras de anticuerpo; (e) crear poblaciones monoclonales individuales de las células productoras de anticuerpo inmortalizadas; y (f) explorar las células productoras de anticuerpo inmortalizadas para identificar un anticuerpo dirigido a IL-6.

En otro aspecto, se proveen hibridomas que producen un anticuerpo de IL-6 humano. El anticuerpo de IL-6 humano producido por el hibridoma puede ser un antagonista de IL-6. Los hibridomas se pueden producir en especies no humanas diferentes del ratón, tales como por ejemplo ratas, ovejas, cerdos, cabras, reses o caballos.

En un caso, las células productoras de anticuerpo se aislan y expresan en una célula hospedera, por ejemplo células de mieloma. En otra modalidad, un animal transgénico se inmuniza con IL-6, las células primarias (por ejemplo células de bazo o de sangre periférica) se aislan de un animal transgénico inmunizado, y las células individuales que producen anticuerpos específicos para el antigeno deseado se identifican. El ARNm poliadenilado de cada célula individual se aisla y se somete a una reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) usando iniciadores de sentido que se aparean con secuencias de región variable, por ejemplo iniciadores degenerados, que reconocen todas o la mayor parte de las regiones FR1 de los genes humanos de la región variable de cadena pesada y ligera, e iniciadores de antisentido que se aparean con secuencias de región constante o de unión. Entonces los ADNc's de los dominios variables de cadena pesada y ligera se clonan y se expresan en cualquier célula hospedera adecuada, por ejemplo una célula de mieloma, como anticuerpos quiméricos con regiones constantes de inmunoglobulina respectivas, tales como la cadena pesada y los dominios constantés ? o ?; véase Babcook, J. S. et al. (1996), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 7843-48, que se incorpora aquí como referencia.

Entonces se pueden identificar y aislar los anticuerpos de IL-6.

Métodos recombinantes de producción de anticuerpos Los anticuerpos de IL-6, o porciones de unión de antígeno de los mismos, se pueden preparar por expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula hospedera. Por ejemplo, para expresar recombinantemente un anticuerpo, una célula hospedera se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinante que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo, de tal manera que las cadenas ligera y pesada se expresan en la célula hospedera y preferiblemente son secretadas hacia el medio en el cual se cultivan las células hospederas, desde el cual se pueden recuperar los anticuerpos. Se usan varios métodos estándares de ADN recombinante para obtener los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, para incorporar estos genes en vectores de expresión recombinante, e introducir los vectores en células hospederas, tal como se describe en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel, F. M. el al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates (1989), y en la patente de EE. UU. No. 4,816,397; as descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia.

Mutaciones v modificaciones Para expresar los anticuerpos de IL-6, primero se pueden obtener fragmentos de ADN que codifican las regiones VH y VL usando cualquiera de los métodos aquí descritos. También se pueden introducir varias mutaciones, supresiones o adiciones en las secuencias de ADN, usando varios métodos adecuados. Por ejemplo, se puede hacer mutagénesis usando los métodos estándares como mutagénesis mediada por PCR, en la cual los nucleótidos mutados se incorporan en los iniciadores de PCR, de tal manera que el producto de PCR contiene las mutaciones deseadas, o mutagénesis dirigida al sitio. Por ejemplo, un tipo de sustitución que se puede hacer es cambiar una o más cisteínas del anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, con otro residuo, tal como por ejemplo, sin limitación, alanina o serina. Por ejemplo, puede haber una sustitución de una cisteína no canónica o canónica. La sustitución se puede hacer en una CDR o región de armazón de un dominio variable, o en el dominio constante de un anticuerpo. Los anticuerpos también se pueden mutar en los dominios variables de las cadenas pesadas o ligeras, por ejemplo para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer una mutación en una o más de las regiones CDR para aumentar o disminuir la KD del anticuerpo para IL-6, para aumentar o disminuir la kofí, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio incluyen por ejemplo las de Sambrook et al. , y Ausubel et al. , que se incorporan aquí como referencia.

También se puede hacer una mutación en una región de armazón o dominio constante para aumentar la vida media de un anticuerpo de IL-6; véase por ejemplo la publicación de PCT No. WO 00/09560, que se incorpora aquí como referencia También se puede hacer una mutación en una región de armazón o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proveer un sitio para unión covalente o no covalente con otra molécula, o para alterar propiedades tales como fijación de complemento, unión de FcR y citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC). Un solo anticuerpo puede tener mutaciones en cualesquiera una o más de las CDR's o regiones de armazón del dominio variable, o en el dominio constante.

En un proceso conocido como "igualación de línea germinal", algunos aminoácidos de las secuencias VH y VL se pueden mutar para igualarlos con los encontrados naturalmente en las secuencias VH y VL de la línea germinal. En particular, las secuencias de aminoácidos de las regiones de armazón en las secuencias VH y VL se pueden mutar para igualarlas con las secuencias de línea germinal para reducir el riesgo de inmunogenicidad cuando se administra el anticuerpo. Las secuencias de ADN de línea germinal para los genes VH y VL humanos son conocidas (véase por ejemplo la base de datos de secuencias de línea germinal humana "Vbase"; véase también Kabat, E. A. et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH No. 91-3242; Tomlinson et al. (1992), J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24:827-836.

Otro tipo de sustitución de aminoácido que se puede hacer es remover sitios proteoliticos potenciales del anticuerpo. Tales sitios pueden ocurrir en una CDR o región de armazón de un dominio variable, o en el dominio constante de un anticuerpo. La sustitución de residuos de cisteína y la remoción de sitios proteoliticos pueden reducir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpo, y de esta manera aumentan su homogeneidad. Otro tipo de sustitución de aminoácido es eliminar pares de asparagina-glicina, que forman sitios potenciales de desamidación, alterando uno o los dos residuos. En otro ejemplo, la lisina C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo de IL-6 se puede cortar. En varios ejemplos, las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de IL-6 pueden incluir opcionalmente una secuencia de señal. En algunos casos, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-6 puede ser cortada proteolíticamente.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas estándares de ADN recombinante, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmento Fab, o en un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VH O Vl se enlaza operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de un anticuerpo o un enlazador flexible. El término "enlazado operativamente", como se usa en este contexto, significa que los dos fragmentos de ADN están unidos de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.

El ADN aislado que codifica la región VH puede ser convertido en un gen de cadena pesada de longitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1 , CH2 y CH3). Las secuencias de los genes humanos de la región constante de cadena pesada son conocidas (véase, por ejemplo, Kabat, E. A. et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH No. 91-3242), y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por medio de amplificación estándar de PCR. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, Ig o IgD, pero preferiblemente es una región constante de lgG1 o lgG2. La secuencia de la región constante de lgG1 puede ser cualquiera de los diversos alelos o alotipos que se sabe ocurren entre individuos diferentes, tales como Gm(1 ), Gm(2), Gm(3) y Gm(17). Estos alotipos representan sustitución de aminoácido que ocurre naturalmente en las regiones constantes de lgG1. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH se puede enlazar operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante CH1 de cadena pesada. La región constante de cadena pesada CH1 se puede derivar de cualquiera de los genes de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL puede ser convertido en un gen de cadena ligera de longitud completa (y también un gen de cadena ligera de Fab), enlazando operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Se conocen las secuencias de los genes humanos de la región constante de cadena ligera (véase, por ejemplo, Kabat, E. A. et al. (1991 ), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH No. 91-3242), y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación estándar de PCR. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. La región constante kappa puede ser cualquiera de los diversos alelos conocidos que ocurren entre individuos diferentes, tales como lnv(1), lnv(2) e lnv(3). La región constante lambda se puede derivar de cualquiera de los tres genes lambda.

Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se enlazan operativamente con otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de tal manera que las secuencias VH y VL pueden ser expresadas como una proteina contigua de una sola cadena, con las regiones VL y V H unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al. , Nature 348:552-554 (1990)). El anticuerpo de una sola cadena puede ser monovalente si se usa únicamente un solo VH y VL, divalente si se usan dos VH y VL, o polivalente si se usan más de dos VH y VL. Se pueden generar anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unen específicamente a IL-6 y a otra molécula.

En otro caso, se puede hacer un anticuerpo de fusión que comprende una parte o todo el anticuerpo de IL-6 enlazado a otro polipéptido. En otro caso, solo los dominios variables del anticuerpo de IL-6 se enlazan al polipéptido. En otro caso, el dominio VH de un anticuerpo de IL-6 se enlaza a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo de IL-6 se enlaza a un segundo polipéptido, que se asocia con el primer polipéptido de tal manera que los dominios VH y VL pueden interaccionar uno con otro para formar un sitio de unión de antígeno. En otro caso, el dominio VH está separado del dominio VL por un enlazador, de tal manera que los dominios VH y VL pueden interaccionar uno con otro. El anticuerpo VH-enlazador-VL se enlaza entonces al polipéptido de interés. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los cuales se enlazan entre si dos anticuerpos (o más) de una sola cadena. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una sola cadena de polipéptido, o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.

En otros casos se pueden preparar otros anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo de IL-6. Por ejemplo, se pueden preparar "cuerpos Kappa" (III et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "Minicuerpos" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Dianticuerpos" (Holliger et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)), o "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et al. , Int. J. Cáncer (Supl.) 7:51-52 (1992)), usando las técnicas estándares de biología molecular, siguiendo las enseñanzas que aquí se exponen.

Mediante una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab', se pueden producir anticuerpos o fragmentos de unión de antigeno biespecificos; véase por ejemplo Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Además, se pueden formar anticuerpos biespecificos como "dianticuerpos" o "Janusins". En algunos casos, el anticuerpo biespecifico se une a dos epitopes diferentes de IL-6. En algunos casos, los anticuerpos modificados anteriormente descritos se preparan usando uno o más de los dominios variables o regiones CDR de un anticuerpo de IL-6 humano aquí provisto.

Vectores y células hospederas Para expresar los anticuerpos de IL-6 y porciones de unión de antigeno de los mismos, ADN's que codifican cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa, obtenidos como se describe aquí, se insertan en vectores de expresión de tal manera que los genes se enlazan operativamente a secuencias de control de transcripción y traducción. En este contexto, el término "enlazado operativamente" significa que un gen de anticuerpo se liga en un vector de tal manera que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven para la función deseada de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen de modo que sean compatibles con la célula hospedera de expresión utilizada. Los vectores de expresión incluyen, por ejemplo, plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus de planta tales como el virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YAC's, y episomas derivados de EBV. El gen del anticuerpo se liga en un vector de tal manera que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven para su función deseada de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen de modo que sean compatibles con la célula hospedera de expresión utilizada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en vectores separados o los dos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante varios métodos (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios sobre el fragmento del gen de anticuerpo y el vector, o ligación de extremo rasurado si no están presentes sitios de restricción).

Un vector conveniente es el que codifica una secuencia funcionalmente completa de inmunoglobulina humana CH o CL, con sitios de restricción adecuados construidos por ingeniería a fin de que cualquier secuencia VH o VL pueda ser insertada y expresada fácilmente, como se describe arriba. En tales vectores usualmente ocurre empalme entre el sitio donador de empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede al dominio C humano, y también en las regiones de empalme que ocurren dentro de los exones CH humanos. Ocurre poliadenilación y terminación de transcripción en sitios cromosómicos nativos en dirección 3' de las regiones codificadoras. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula hospedera. El gen de cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de tal manera que el péptido señal se enlaza en marco con el extremo amino de la cadena de inmunoglobulina. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (esto es, un péptido señal de una proteína diferente de inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula hospedera. El diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera por transformar, el grado de expresión deseado de la proteina.

I Las secuencias reguladoras para la expresión en la célula hospedera de mamífero incluyen elementos virales que manejan un alto grado de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores o ¡ncrementadores derivados de LTR's retrovirales, promotor de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/incrementador de CMV), promotor del virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/incrementador de SV40), promotor de adenovirus (por ejemplo el promotor tardío mayor de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores fuertes de mamífero, tales como los promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Para una mayor descripción de elementos reguladores virales y sus secuencias véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5, 168,062, la patente de EE. UU. No. 4,510,245, y la patente de EE. UU. No. 4,968,615, que se incorporan aquí como referencia. Se conocen métodos para expresar anticuerpos en plantas que incluyen promotores y vectores, así como también transformación de plantas; véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 6,517,529, que se incorpora aquí como referencia.

Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante pueden llevar secuencias adicionales tales como secuencias que regulan la duplicación del vector en células hospederas (por ejemplo, orígenes de duplicación) y genes marcadores seleccionares. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospederas en las que se ha introducido el vector (véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, que se incorporan aquí como referencia). Por ejemplo, normalmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexate, en una célula hospedera en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionabas adecuados incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usarse en células hospederas dhfr- con selección/amplificación de metotrexate), el gen de neomicina fosfotransferasa (para selección de G418), y el gen de glutamato sintetasa.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de IL-6, y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, se pueden usar para transfectar una célula hospedera adecuada de mamífero, planta, bacteria, o levadura. La transformación puede ser mediante cualquier método adecuado para introducir polinucleótidos en una célula hospedera. Los métodos para introducir polinucleótidos heterologos en células de mamífero incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en células de mamífero por medio de vectores virales. Los métodos de transformación de células son muy conocidos; véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 , y 4,959,455, que se incorporan aquí como referencia. Los métodos para transformar células de planta son muy conocidos e incluyen por ejemplo transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. También se conocen métodos para transformar células bacterianas y de levadura.

Las lineas de células de mamífero disponibles como hospederos para expresión son muy conocidas e incluyen muchas lineas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células de riñon de hámster crío (BHK), células de riñon de mono verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, y otras lineas de células. Las líneas de células particularmente preferidas se seleccionan determinando las lineas de células que tienen altos grados de expresión. Otras líneas de células que se pueden usar son las líneas de células de insecto, tales como células Sf9 o Sf21. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en células hospederas de mamífero, los anticuerpos son producidos cultivando las células hospederas durante un periodo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo al medio de cultivo en el cual se desarrollan las células hospederas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando varios métodos de purificación de proteína. Las células hospederas bacterianas incluyen especies de E. coli y Streptomyces. Las células hospederas de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.

Además, la expresión de anticuerpos en las líneas de células productoras se puede incrementar usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, los sistemas de expresión de gen de glutamina sintetasa (el sistema GS) y el gen de DHFR, son propuestas comunes para incrementar la expresión bajo ciertas condiciones. Los clones de células con alto grado de expresión se pueden identificar usando las técnicas convencionales, tales como por ejemplo clonación de dilución limitante y tecnología de microgota. El sistema GS se expone en las patentes europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997, y 0 338 841.

Es probable que los anticuerpos expresados por líneas celulares o en animales transgénicos diferentes tengan diferente glicosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico aquí provistas, o que comprenden las secuencias de aminoácidos aquí provistas, son parte de la presente revelación, sin considerar la glicosilación de los anticuerpos.

Colecciones de despliegue de fago También se proveen métodos para producir un anticuerpo de IL-6 o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende los pasos de sintetizar una colección de anticuerpos humanos en un fago, explorar la colección con IL-6 o una porción de la misma, aislar el fago que se une a IL-6, y obtener el anticuerpo del fago. A manera de ejemplo, un método para preparar la colección de anticuerpos para usarse en técnicas de despliegue de fago comprende los pasos de: inmunizar un animal no humano que comprende los locus de inmunoglobulina humana con IL-6 o una porción antigénica de la misma, para crear una respuesta inmune; extraer las células productoras de anticuerpo del animal inmunizado; aislar el ARN que codifica las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo de las células extraídas; transcribir inversamente el ARN para producir ADNc; amplificar el ADNc utilizando iniciadores; e insertar el ADNc en un vector de despliegue de fago de tal manera que los anticuerpos sean expresados en el fago. De esta manera se pueden obtener los anticuerpos recombinantes de IL-6.

Los anticuerpos recombinantes de IL-6 humanos se pueden aislar explorando una colección combinatoria de anticuerpos recombinantes. Preferiblemente, la colección es una colección de despliegue de fago de scFv, generada usando ADNc's humanos de VH y VL preparados de ARNm aislado de células B. Los métodos para preparar y explorar tales colecciones son conocidos. Se tienen disponibles comercialmente kits para generar colecciones de despliegue de fago (por ejemplo, el sistema de anticuerpo de fago recombinante Recombinant Phage Antibody System, de Pharmacia, No. cat. 27-9400-01 ; y el kit de despliegue de fago SurfZAP™ de Strategene, No. cat. 240612) También existen otros métodos y reactivos que se pueden usar para generar y explorar colecciones de despliegue de anticuerpo (véanse por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,223,409; las publicaciones de PCT Nos. WO 92/18619, WO 91/17271 , WO 92/20791 , WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, y WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom ef al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991 ); y Barbas eí a/. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991); todas incorporadas aquí como referencia.

Para aislar y producir anticuerpos de IL-6 humanos con las características deseadas, primero se usa un anticuerpo de IL-6 humano para seleccionar secuencias humanas de cadenas pesada y ligera que tienen actividad de unión similar hacia IL-6, usando los métodos de impresión de epítope que se describen en la publicación de PCT No. WO 93/06213, que se incorpora aquí como referencia. Las colecciones de anticuerpo usadas en este método son preferiblemente colecciones de scFv preparadas y exploradas como se describe en la publicación de PCT No. WO 92/01047, McCafferty eí al. , Nature 348:552-554 (1990); y Griffiths et al. , EMBO J. 12:725-734 (1993); todas incorporadas aquí como referencia.

Una vez que se seleccionan los dominios VL y VH humanos iniciales, se realizan experimentos de "mezclado e igualación", en los cuales diferentes pares de los segmentos VL y VH seleccionados inicialmente se exploran para determinar la unión de IL-6 y seleccionar las combinaciones del par VL/VH preferido. Adicionalmente, para mejorar la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH de los pares VL/VH preferidos se pueden mutar aleatoriamente, de preferencia dentro de la región CDR3 de VH O VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable de la maduración de la afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduración de la afinidad in vitro se puede realizar amplificando los dominios VH y VL usando iniciadores de PCR complementarios a la CDR3 de VH O CDR3 de VL, respectivamente; tales iniciadores han sido "clavados" con una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleótido en algunas posiciones, de tal manera que los productos de PCR resultantes codifican segmentos VH y VL en los cuales se han introducido las mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de VH o VL. Estos segmentos VH y VL mutados aleatoriamente pueden ser reexplorados para determinar la unión a IL-6.

Después de la exploración y aislamiento de un anticuerpo de IL-6 de una colección de despliegue de inmunoglobulina recombinante, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado se pueden recuperar del paquete de despliegue (por ejemplo del genoma del fago), y se subclonan en otros vectores de expresión mediante técnicas estándares de ADN recombinante. Si se desea, el ácido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención, como se describe en la presente. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado por exploración de una colección combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en células hospederas de mamífero como se describe arriba.

Anticuerpos desinmunizados En otro aspecto, los anticuerpos de IL-6 o porciones de unión de antigeno de los mismos se pueden desinmunizar para reducir su inmunogenicidad, usando las técnicas descritas por ejemplo en las publicaciones de PCT Nos: W098/52976 y WOOO/34317 (que se incorporan aquí como referencia).

Anticuerpos modificados y marcados Un anticuerpo de IL-6 o porción de unión de antigeno se puede modificar o enlazar a otra molécula (por ejemplo otro péptido o proteina). En general, los anticuerpos o porciones de unión de antígeno de los mismos se modifican de tal manera que la unión de IL-6 no sea afectada adversamente por la modificación o marcación. Por consiguiente, se considera que los anticuerpos y porciones de unión de antigeno incluyen formas tanto intactas como modificadas de los anticuerpos de IL-6 humanos que aquí se describen. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión de antigeno se puede enlazar funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otra manera), con una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un dianticuerpo), un agente de detección, una marca, un agente citotoxico, un agente farmacéutico, o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción de unión de antigeno con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una marca de polihistidina).

Un tipo de anticuerpo modificado se produce entrelazando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo para crear anticuerpos biespecificos). Los entrelazadores adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos distintamente reactivos separados por un espaciador adecuado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (por ejemplo suberato de disuccinimidilo). Tales enlazadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois.

Otro tipo de anticuerpo modificado es un anticuerpo marcado.

Agentes de detección útiles con los cuales se puede modificar un anticuerpo o porción de unión de antigeno, incluyen compuestos fluorescentes que incluyen por ejemplo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, cloruro de 5-dimettlamina-1-naftalenosulfon¡lo, ficoeritrina, lantánido fósforo. Un anticuerpo también se puede marcar con enzimas que son útiles para detección, tales como por ejemplo peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, o glucosa oxidasa. Cuando un anticuerpo se marca con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción que se puede discernir. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina produce un producto de reacción de color que es detectable. Un anticuerpo también se puede marcar con biotina y detectarse por medio de medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Un anticuerpo también se puede marcar con un epitope de polipéptido predeterminado reconocido por un reportero secundario (por ejemplo secuencias de par de cierre de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, marcas de epitope). En algunos casos, las marcas se unen por medio de brazos espaciadores de longitudes diversas para reducir el impedimento estérico potencial. También se puede modificar un anticuerpo de IL-6 con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidrato. Estos grupos son útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo para aumentar la vida media en el suero.

Los ejemplos específicos que aquí se describen tienen la intención de ilustrar aspectos particulares de la revelación y se considera que no limitan el alcance de las reivindicaciones.

EJEMPL0 1 Generación de hibridomas que producen el anticuerpo anti-IL-6 Los anticuerpos ejemplares de acuerdo con la revelación se prepararon, seleccionaron y analizaron de la siguiente manera: Razas de ratón Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos para IL-6 humana usando las razas de ratón transgénico de Ig humana HCo7 y HCo 2, así como también la raza transcromosómica/transgénica de humano KM (Medarex, Inc.). Todas estas razas expresan anticuerpos completamente humanos que son indistinguibles de los anticuerpos aislados de los humanos.

En las tres razas, el gen endógeno de cadena ligera kappa de ratón y el gen endógeno de cadena pesada de ratón han sido rotos homocigóticamente como se describe en Chen et al. (1993), EMBO J. 12:81 1-820, y en el ejemplo 1 de la publicación de PCT WO 01/09187, respectivamente. Además, las tres razas de ratón llevan un transgen humano de cadena ligera kappa, KCo5, como lo describen Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology 14:845-851. En contraste, las tres razas son distintas con respecto a sus genes humanos de cadena pesada. La raza HCo7 lleva el transgen humano de cadena pesada HCo7 como se describe en las patentes de EE. UU. Nos: 5,545,806; 5,625,825; y 5,545,807; la raza HCo12 lleva el transgen humano de cadena pesada HCo12 como se describe en el ejemplo 2 de la publicación de PCT WO 01/09187; y la raza KM lleva un minicromosoma humano como se describe en Ishida et al. (2002), Cloning and Stem Cells, 4: 91-102.

Inmunización con antigeno IL-6 y selección de ratones HuMab que producen anticuerpos monoclonales anti-IL-6 Los esquemas de inmunización general para ratones HuMab se describen en Lonberg, N. et al. (1994), Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851 , y en la publicación de PCT WO 98/24884. En el presente caso, se inmunizaron un total de 81 ratones HuMab de las razas HCo7, HCo12 y KM, empezando a las 6-16 semanas de edad, con 5-25 pg de IL-6 humana purificada en adyuvante de Ribi. La IL-6 humana se aisló de una célula estromal derivada de médula ósea humana, HS-5 (ATCC CRL-1 1882, Roecklein B. A. & Torok-Storb B., Blood 85: 997-1005, 1995), que secreta endógenamente IL-6 al medio. La IL-6 humana se purificó del medio de HS-5 que expresa IL-6, que se concentró por ultrafiltración, seguido por un paso de cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose y un paso de cromatografía de afinidad usando un MAb anti-hlL-6 de ratón (R&D Systems, No. cat. AB2061 , clon 1936). La IL-6 humana purificada tenía una pureza de aproximadamente 90% según SDS-PAGE. Las bandas mayores se extrajeron del gel SDS-PAGE, se digirieron con tripsina, y los péptidos trípticos purificados en el gel y extraídos se analizaron por medio de MALDI/MS en un analizador 4700 TOF TOF Proteomics Analyzer, y se confirmó que eran de IL-6 humana. Alternativamente, se puede usar IL-6 humana recombinante de fuentes comerciales (por ejemplo, IL-6 humana recombinante No. cat. 206-IL-6/CF, R&D Systems Inc. 614 Mckinley Place NE, inneapolis, MN 55413). La administración fue mediante inyección intraperitoneal, subcutánea o en la almohadilla plantar, a intervalos de 3-14 días, hasta un total de 8 inmunizaciones. La respuesta inmune se monitoreó por medio de análisis de ELISA como se describe abajo.

Selección de ratones HuMab que producen los anticuerpos anti-\L Se obtuvo sangre de los ratones transgénicos anteriormente descritos por medio de sangrados retroorbitales, y se analizó por medio de ELISA para determinar la unión especifica a la proteina recombinante IL-6 humana purificada, como lo describen Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851.

Brevemente, se recubrieron placas de microtitulación usando 50 µ?/pocillo de una solución de IL-6 recombinante purificada que contenia 1 pg/ml en PBS, y se incubaron durante la noche a 4 °C. Después, los pocilios se bloquearon usando 200 µ?/pocillo de suero de pollo al 5% en PBS/Tween (0.05%). A cada pocilio se le agregaron diluciones de plasma de ratones inmunizados con IL-6 y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y luego se incubaron con un anticuerpo policlonal anti-lgG Fe humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se revelaron con substrato ABTS (Moss Inc, producto No. ABTS-1000 mg/ml), y se analizaron en un espectrofotómetro a una DO 415-495. Los ratones que desarrollaron los títulos más altos de anticuerpos anti-IL-6 (22 animales en total) se usaron para las fusiones.

Generación de hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales humanos para IL-6 A los ratones seleccionados como se indica arriba se les administró un refuerzo vía intravenosa de IL-6 a los 3 días y después nuevamente a los 2 días antes del sacrificio y extirpación del bazo o los ganglios linfáticos. Se hicieron un total de 17 fusiones.

Los esplenocitos o linfocitos de ganglio linfático de ratón aislados de los ratones HuMab o KM inmunizados, se fusionaron con células de mieloma de ratón no secretadoras SP2/0 (ATCC, CRL-1581 , ATCC American Type Culture Collection, 1080 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 EE. UU ), usando electrofusión (E-fusión, Cyto Pulse™ Technology, Cyto Pulse™ Sciences, Inc., Glen Burnie, Maryland), de acuerdo con los protocolos estándares o recomendados por el fabricante.

Brevemente, se prepararon suspensiones celulares simples de esplenocitos o linfocitos de ganglio linfático de los ratones inmunizados y después se combinaron con un número igual de células de mieloma de ratón no secretadoras Sp2/0; después se hizo la E-fusión.

Después, las células se sembraron a 2x104 células/pocilio en una placa de microtitulación de fondo plano, y se incubaron durante 10-14 días en medio selectivo que contenia 10% de suero bovino fetal, 10% de medio acondicionado P388D1 (ATCC, CRL-TIB-63), 3-5% (IGEN) en DMEM (Mediatech, Herndon, Virginia, No. cat. CRL 10013, con alto contenido de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio), 5 mM de HEPES, 0.055 m de 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina y HAT 1x (Sigma, No. cat. CRL-P-7185).

Después de 1-2 semanas, las células se cultivaron en un medio en el que el HAT se reemplazó con HT. Aproximadamente 10-14 días después de cultivar las células, los sobrenadantes de los pocilios individuales se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos gamma, kappa humanos. Los sobrenadantes que fueron positivos para gamma, kappa se analizaron entonces por medio de ELISA (usando el protocolo arriba descrito) para determinar los anticuerpos monoclonales humanos de IgG anti-IL-6. Los hibridomas secretadores de anticuerpos se transfirieron a placas de 24 pocilios, se volvieron a analizar y si se confirmaba que eran positivos para anticuerpos monoclonales humanos de IgG anti-IL-6, se subclonaron por lo menos dos veces por dilución limitante. Después, los subclones estables se cultivaron in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en el medio de cultivo de tejido para caracterización ulterior.

EJEMPLO 2 Secuenciación de anticuerpos de IL-6 Los anticuerpos anti-IL-6 de longitud completa se subclonaron de los hibridomas y su secuencia se verificó, de la siguiente manera: Se aisló el ARNm poli(A)+ usando un RNeasy Mini Kit (Qiagen) y se sintetizó ADNc del ARNm con el kit RT-for-PCR Advantage (BD Biosciences), usando cebado con oligo(dT). El ADNc cebado con oligo(dT) para el clon 9C8 se amplificó usando los iniciadores degenerados listados en el cuadro 1 respectivamente.

CUADRO 1 Iniciadores degenerados (5' a 3') para 9C8 La amplificación se hizo usando la High Fidelity Polymerase (Roche) y una máquina PTC-200 DNA Engine (MJ Research) con los siguientes ciclos: 2'@95°C; 25x (20"@95°C, 30"@52°C, 2'@72°C); 10'@72°C. Los amplicones de PCR se clonaron en pCR2.1 TOPO y se transformaron en células TOP10 químicamente competentes (Invitrogen) usando el protocolo estándar. Se verificó la secuencia en los clones usando la química Grills 16,h BDTv3.1/dGTP (Applied Biosystems Inc) y un analizador de ADN 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems Inc). Todas las secuencias se analizaron por alineaciones con el "directorio de secuencias V BASE" (Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet, 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995). En el cuadro 2 se listan los usos del segmento de gen de línea germinal de los anticuerpos anti-IL-6 ejemplares.

CUADRO 2 Secuencias de longitud completa del anticuerpo anti-IL-6 derivado de los hibridomas 9C8 Secuencia de ADN de la cadena pesada de 9C8 de las células del hibridoma (dominio variable en mayúsculas): CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAG ACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTA CTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGG GGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTC GAGTCAACATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG ACCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG AATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCT TCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacag cggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctg accagcggcg tgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacc gtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaag gtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaact cctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctga ggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggc gtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcc ctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacac cctgcccc catcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctat cccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcc cgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagg ggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtc tccgggtaaa, SEQ ID N0:1 Secuencia de proteína derivada (por traducción) de la cadena pesada de 9C8 de las células del hibridoma (dominio variable en mayúsculas): QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIF HSGSTNYNPSLKSRVNISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCAREELDDFDI WGQGTMVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavl qssglyslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpk dtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeyk ckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt ppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnh ytqkslslspgk, SEQ ID NO: 3 Secuencia de ADN de la cadena ligera de 9C8 de las células del hibridoma (dominio variable en mayúsculas): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGA CAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTA GCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGC TGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGA TCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTT TGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAAAAGTTACCCTCGGACGTTCGGCC AAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaa agtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacag caaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaa gtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt gt, SEQ ID NO: 12 Secuencia de proteína derivada (por traducción) de la cadena ligera de 9C8 de las células del hibridoma (dominio variable en mayúsculas): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYKSYPRTFGQGTKV EIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtas vclInnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstysIss tltlskady ekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec, SEQ ID NO: 14 Los dominios variables de los anticuerpos anti-IL-6 se clonaron en vectores de expresión de la siguiente manera: Los dominios variables se amplificaron del ADNc clonado en pCR2.1 usando los iniciadores listados en el cuadro 3. La amplificación se hizo usando la polimerasa Pfx Platinum (Invitrogen) y una máquina PTC-200 DNA Engine (MJ Research) con los siguientes ciclos: 2'@94°C; 20x (30"@94°C, 45"@55°C, 1 '@68°C); 5'@68°C. Los dominios variables se clonaron entonces en vectores de expresión que contenían los dominios constantes del isotipo apropiado. Las secuencias de estos clones se verificaron usando la química Grills 16th BDTv3.1/dGTP (Applied Biosystems Inc) y un analizador de ADN 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems Inc).

CUADRO 3 Iniciadores de dominio variable (5' a 3') para 9C8 Secuencias de longitud completa de anticuerpos anti-IL-6 recombinantes Secuencia de ADN de la cadena pesada de lgG2 de 9C8 recombinante (dominio variable en mayúsculas): CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAG ACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTA CTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGG GGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTC GAGTCAACATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG ACCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG AATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCT TCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcaca gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctg accagcggcg tgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgacc gtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaag gtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggac cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgt ggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcat aatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcg tgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagccccca tcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatccc gggagg agatgaccaagaaccaggtcagcclgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatc gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactc cgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaag agcctctccctgtctccgggtaaa, SEQ ID NO: 23 Secuencia de proteína derivada (por traducción) de la cadena pesada de lgG2 de 9C8 recombinante (dominio variable en mayúsculas): QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIF HSGSTNYNPSLKSRVNISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCAREELDDFDI WGQGTMVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlq ssglyslsswtvpssnígtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmi srtpevtcwvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrwsvltwhqdwlngkeykckvsnk glpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmld sdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk, SEQ ID NO: 24 Secuencia de ADN de la cadena ligera kappa de 9C8 recombinante (dominio variable en mayúsculas): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGA CAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTA GCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGC TGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGA TCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTT TGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAAAAGTTACCCTCGGACGTTCGGCC AAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaa agtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacag caaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaa gtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt gt, SEQ ID NO: 25 Secuencia de proteína derivada (por traducción) de la cadena ligera kappa de 9C8 recombinante (dominio variable en mayúsculas): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAVVYQQKPEKAPKSLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYKSYPRTFGQGTKV EIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsst Itlskady ekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec, SEQ ID NO : 26 EJEMPLO 3 Mutagénesis del anticuerpo anti-IL-6 Se hicieron variantes de sustitución de aminoácido del anticuerpo anti-IL-6 9C8 en el dominio variable de cadena pesada en las posiciones 24 (I24V), 30 (R30S), 31 (E31G), 52 (F52N), 68 (N68T), 83 (T83S), ya sea individualmente o en combinación en el contexto de un formato tanto de lgG1 como de lgG2. Las variantes de sustitución de aminoácido del anticuerpo anti-IL-6 9C8 en el dominio variable de cadena ligera se hicieron en 92 (K92N) en el formato tanto de lgG1 como de lgG2. Se hicieron anticuerpos que tenían tanto un dominio variable de cadena pesada como una variante del dominio variable de cadena ligera. En los cuadros 6A y 6B se muestran algunas de las combinaciones de las diversas mutaciones. La mutagénesis en las regiones VH (I24V), VH (E31G), VH (N68T) y VH (T83S) del clon 9C8, se hizo con los iniciadores listados en el cuadro 4 (se muestran las cadenas de sentido; el residuo alcanzado se muestra con negritas) y con el kit QuickChange (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de las variantes mutadas se verificó y las variantes se clonaron en vectores de expresión mediante los procedimientos normales.

CUADRO 4 Iniciadores mutagénicos (5' a 3') para 9C8 9C8_H_I24V CCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCC, SEQ ID NO : 57 9C8_H_E31 G GGGTCCTTCAGGGGGTACTACTGGAGCTG, SEQ ID NO : 58 9C8_H_N68T CCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACG SEQ ID NO : 59 9C8_H_T83S CTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCC, SEQ ID NO : 60 Secuencia de ADN de la cadena pesada de lgG2 de 9C8 recombinante (N68T, T83S) cadena pesada: CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAG ACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTA CTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGG GGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTC GAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG AGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG AATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCC TCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcaca gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctg accagcggcg tgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgacc gtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaag gtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggac cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgt ggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcat aatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcg tgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagccccca tcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatccc gggagg agatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatc gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactc cgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag agcctctccctgtctccgggtaaa, SEQ ID NO: 27 Secuencia de proteina derivada (por traducción) de la cadena pesada de lgG2 de 9C8 recombinante (N68T, T83S) cadena pesada: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIF HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREELDDFDI WGQGTMVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgcIvkdyípepvtvswnsgaltsgvhtfpavIq ssglyslsswtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmi srtpevtc vvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrwsvltwhqdwlngkeykckvsn kglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppml dsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk, SEQ ID NO: 28 Secuencia de ADN de la cadena pesada de lgG1 de 9C8 recombinante (N68T, T83S) cadena pesada: CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAG ACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTA CTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGG GGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTC GAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG AGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG AATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCC TCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacag cggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctg accagcggcg tgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtagtgacc gtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaag gtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaact cctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctga ggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggc gtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcag cgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcc ctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacac cctgcccc catcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctat cccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcc cgtgctggactccgacggctcctlcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggg gaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct ccgggtaaa, SEQ ID NO: 31 Secuencia de proteína de la cadena pesada de lgG1 de 9C8 recombinante (N68T, T83S) cadena pesada: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIF HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREELDDFDI WGQGTMVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgcIvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavI qssglyslss vtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpk dtlmisrtpevtcwvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeyk ckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenny kttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnh ytqkslslspgk, SEQ ID NO: 32 Secuencia de ADN de dominio variable de la cadena pesada de 9C8 recombinante (E31G, N68T, T83S): CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAG ACCCTGTCCCTCACCTGCGCTATCTATGGTGGGTCCTTCAGGGGGTACTA CTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGG GGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTC GAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG AGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG AATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCC TCA, SEQ ID NO: 33 Secuencia de proteína traducida del dominio variable de la cadena pesada de 9C8 recombinante (E31 G, N68T, T83S): QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAIYGGSFRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEI FHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREELDDF DIWGQGTMVTVSS, SEQ ID NO: 34 Secuencia de ADN de dominio variable de la cadena pesada de 9C8 recombinante (I24V, N68T, T83S): CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAG ACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGGGAGTACTA CTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGG GGAAATCTTTCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTC GAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTG AGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGG AATTAGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCC TCA, SEQ ID NO: 36 Secuencia de proteina traducida del dominio variable de la cadena pesada de 9C8 recombinante (I24V, N68T, T83S): QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAWGGSFREYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIF HSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREELDDFDI WGQGTMVTVSS, SEQ ID NO : 37 El promotor de CMV que contiene los vectores de expresión se transfectó en células 293 Freestyle (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del vendedor. Los sobrenadantes de estas células se recolectaron por centrifugación y se purificaron por medio de cromatografía de afinidad de proteína A estándar para aislar las inmunoglobulinas recombinantes. Después, las proteínas se caracterizaron por SDS-PAGE, dispersión de luz y espectrofotometría .

Las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos anti-IL-6 indicados en el cuadro 5 se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 201 10-2209. A las cadenas pesadas y ligeras se les asignaron los siguientes números de registro: CUADRO 5 EJEMPLO 4 Proliferación de TF-1 Se obtuvieron células humanas, células TF-1 , de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginia), y se mantuvieron en medio RPMI-1640 que contenía 10% de suero bovino fetal desactivado con calor (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, California), con 2 ng/ml de GM-CSF humano recombinante. Las células TF-1 se dividieron a 1-2 x105 para su uso al siguiente día. Antes de sembrarlas, las células se lavaron tres veces con RPMI-1640, se contaron, y el volumen se ajustó con el medio de prueba para producir 2x105 células/ml. A cada pocilio se le agregaron 50 pl de las células lavadas y se incubaron durante la noche a 37 °C con 5% de C02. Todas las condiciones se hicieron por triplicado en placas tratadas de cultivo de tejido de 96 pocilios (Corning, Corning, Nueva York). A cada pocilio se le agregaron 25 ng/ml o 2.5 ng/ml de IL-6 en un volumen de 25 pl, y anticuerpos de prueba o de control a varias concentraciones en un volumen de 25 pl en amortiguador de fosfato de sodio (fosfato de sodio 10 mM y cloruro de sodio 150 mM, pH 7.4), hasta un volumen final de 100 µ?. Los anticuerpos se probaron solos y con IL-6 humana. Las placas se incubaron durante 48 horas (h) a 37 °C con 5% de C02. Después de 48 horas, se le agregaron 10 µ?/pocillo de 3H-timidina 0.5 pCi (Amersham Biosciences, Piscataway, Nueva Jersey) y se impulsaron con las células durante 3 h. Para detectar la cantidad de timidina incorporada, las células se cosecharon sobre placas de filtro Unifilter GF/C prehumedecidas (Packard, Meriden, Connecticut), y se lavaron 10 veces con agua. Las placas se dejaron secar durante la noche. A las placas de filtro se les agregaron sellos inferiores. Después se les agregaron 45 pl por pocilio de Microscint 20 (Packard, Meriden, Connecticut). Después de agregar un sello superior, las placas se contaron en un contador Trilux microbeta (Wallac, Norton, Ohio), y los datos se reportaron como CPM (cuentas por minuto). Los cuadros 6A y 6B muestran las Cl50's en la prueba de proliferación de TF-1 del anticuerpo 9C8 y los diversos anticuerpos que tienen sustituciones de aminoácido. Los resultados mostrados en los cuadros 6A y 6B son de pruebas hechas en dos ocasiones separadas.

CUADRO 6A CUADRO 6B He = cadena pesada; Le = cadena ligera EJEMPLO 5 Proteína C reactiva de estudio de LPS-mono La parte in vivo de este estudio fue realizada por Charles River Laboratories Preclinical Services en sus instalaciones de prueba de Worcester, Massachusetts. Brevemente, el estudio consistió en quince monos cynomolgus machos (cinco grupos; 3 monos/grupo). El día 1 los animales del grupo 1 recibieron vehículo; los animales de los grupos 2 y 3 recibieron el anticuerpo 9C8 N68T T83S a dosis de 0.5 y 5 mg/kg, respectivamente; y los animales de los grupos 4 y 5 recibieron lgG2 9C8 N68T T83S a dosis de 0.5 mg y 5 mg/kg, respectivamente. Todos los tratamientos se administraron por inyección de bolo IV a volúmenes de dosis de 1 ml/kg cada uno. Aproximadamente 2 horas después del tratamiento, todos los animales recibieron una dosis de provocación de 10 pg/kg de lipopolisacárido bacteriano (LPS) a un volumen de 1 ml/kg por inyección lenta de bolo IV. El día 1 se extrajo sangre de un vaso periférico en el punto de referencia (antes del tratamiento); inmediatamente después del tratamiento; 2 horas después del tratamiento (inmediatamente antes de la administración de LPS); y 30 minutos y 1 , 2, 3, 4, 6, 8 y 22 horas después de la provocación con LPS. También se extrajeron muestras de sangre los días 3, 4, 5, 6 y 7. Las muestras de sangre completa se procesaron para obtener suero y las muestras de suero se guardaron congeladas. La proteína C reactiva (CRP) se midió usando un kit de prueba de lesión vascular Panel II Multi-Spot® de Meso Scale Discovery (MSD®), Gaithersburg, Maryland. Las pruebas se hicieron como se describe en las instrucciones del kit de MSD publicadas. La figura 2 muestra el total de CRP en el suero para el anticuerpo lgG? 9C8 N68T T83S.

EJEMPLO 6 Prueba de pSTAT3 por citometría de flujo Se hicieron pruebas in vitro en sangre completa humana y en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC's) estimuladas con IL-6 humana recombinante (rhlL-6) para medir los niveles de STAT3 fosforilada (pSTAT3) en presencia de anticuerpos anti-IL-6.

Prueba en sangre completa Sangre completa humana heparinizada recién recolectada se incubó con anticuerpo anti-IL-6 o vehículo de control (volumen final de 300 µ?, en un tubo de polipropileno de 15 mi) durante 15 minutos a 37 °C. Las muestras se estimularon con IL-6 humana recombinante (rh) para una concentración final de 25 ng/ml y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C. Después se lisaron los eritrocitos (RBC's) con 4 mi de amortiguador de lisis de RBC (Sigma), y las muestras se mezclaron suavemente durante 10 minutos a 37 °C. Las muestras se centrifugaron a 400 x g durante 5 min para hacer pella las células. Los sobrenadantes se retiraron. A cada tubo se le agregaron 2 mi de amortiguador de lavado (4% de BSA en PBS, Gibco), y después las muestras se centrifugaron a 400 x g durante 5 min para hacer pella las células. Los sobrenadantes se retiraron y las pellas celulares se resuspendieron en 200 pl de amortiguador de permeabilización precalentado (37 °C) (formaldehido al 2% en PBS, Polysciences, Inc.) y se incubaron 10 minutos a 37 °C. A cada muestra se le agregaron 3 mi de MeOH enfriado con hielo para fijar las células. Las muestras se mezclaron y se pusieron sobre hielo durante al menos 30 min. Las muestras se centrifugaron (400 x g durante 5 min) y los sobrenadantes se retiraron. Las pellas se lavaron una vez con amortiguador de lavado. Después, las pellas celulares se marcaron con anticuerpo anti-STAT3 fosforilado (Y705) conjugado con AlexaFluor 488 (BD Pharmingen) diluido en amortiguador de lavado, volumen final de 100 µ?. Las muestras se incubaron sobre hielo durante 30 minutos y luego se lavaron 2X con amortiguador de lavado. Las pellas celulares finales se resuspendieron en 400 µ? de amortiguador IF (solución salina amortiguadora de Hank, 2% de suero fetal de becerro, 10 mM de Hepes, 0.2% de azida de sodio, Gibco). Se usó un instrumento FACSCalibur que utiliza el software CelIQuest (BD Biosciences) para recolectar y analizar los datos. El cuadro 7 muestra los niveles de pSTAT3 en presencia de los anticuerpos anti-IL-6 medidos en la sangre completa humana.

CUADRO 7 Prueba en PBMC Células mononucleares de sangre periférica (PBMC's) se aislaron de sangre completa humana heparinizada recién recolectada usando columnas Accuspin System-Histopaque 1077, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma-Aldrich A7054), y se pusieron en 0.1 % de penicilina estreptomicina en medio Macrophage SFM, Gibco. Se incubaron aproximadamente 2x106 PBMC's con anticuerpo anti-IL-6 o vehículo de control (vol. final de 300 µ?) durante 15 min a 37 °C. Las PBMC's se estimularon con rhlL-6 para una concentración final de 25 ng/ml y se incubaron 10 min a 37 °C. Las muestras se centrifugaron a 400 x g durante 5 min para hacer pella las células. Los sobrenadantes se retiraron. A cada muestra se le agregaron 2 mi de amortiguador de lavado (4% BSA en PBS). Las muestras se centrifugaron a 400 x g por 5 min para hacer pella las células. Los sobrenadantes se retiraron y las pellas celulares se resuspendieron en 200 µ? de amortiguador de permeabilización precalentado (37 °C) (formaldehído al 2% en PBS, Polysciences, Inc.), y se incubaron 10 min a 37 °C. A cada muestra se le agregaron 3 mi de MeOH enfriado en hielo para fijar las células. Las muestras se mezclaron y se guardaron sobre hielo durante al menos 30 min. Las muestras se centrifugaron a 400 x g por 5 min y los sobrenadantes se retiraron. Las pellas celulares se lavaron una vez con amortiguador de lavado, luego se marcaron y se analizaron como se describe en la prueba de sangre completa. El cuadro 8 muestra los niveles de pSTAT3 en presencia de los anticuerpos anti-IL-6, medidos en las células mononucleares de sangre periférica humana.

CUADRO 8 EJEMPLO 7 Afinidad de unión Preparación de chips BIAcore El anticuerpo lgG2 9C8 N68T T83S anti-IL-6 se inmovilizó sobre chips BIAcore CM5 (GE Biosciences - anteriormente BIAcore Inc, Piscataway, Nueva Jersey) por acoplamiento de amina a carboximetilcelulosa (CM) adherida a la matriz de dextrano del chip como lo describen Lofas y Johnsson (J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1990); 21 : p. 1526-1528). El chip se trató previamente con NaCI 1 M y NaOH 50 mM antes del acoplamiento. El acoplamiento con la amina se hizo combinando EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y NHS (N-hidroxisuccinimida) y pasando a través del chip para activar los grupos CM. El ligando en el amortiguador de acetato 10 mM pH5 se pasó a través de la superficie del chip y se unió covalentemente al grupo CM activado. Los grupos CM activos remanentes sobre la superficie del chip se desactivaron pasando etanolamina 1 M pH 8.5 a través del chip. La EDC, NHS y etanolamina se obtuvieron como parte del kit de acoplamiento de amina obtenido de GE Biosciences. El acoplamiento se hizo usando el Surface Preparation Wizard incluido con el software BiaControl V3.2.

Determinación de la afinidad de unión Todas las mediciones de SPR se hicieron en un instrumento BIAcore 3000 (GE Biosciences, Piscataway, Nueva Jersey). Se usó el software de BIAcore - BIAcore 3000 Control Software V3.2 para la operación y control del instrumento BIAcore 3000. Se usó el software BiaEvaluation Software V4.1 para el análisis de de los datos de SPR del instrumento BIAcore 3000 instrument y los datos se graficaron usando software Graph Pad Prism versión 5. La afinidad de unión de IL-6 a los anticuerpos monoclonales (mAb) se midió en amortiguador HBS-EP (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCI, 3.4 mM de EDTA, 0.005% de P20) a 25°C. La velocidad de flujo para el estudio de afinidad fue 40 µ?/minuto para minimizar los efectos del transporte (Myszka, D. G., et al., Biophysical Chemistry. 64, 127-137, 1997). Se usó lgG« humana como ligando para la construcción del canal de referencia del chip. La unión del analito (rhlL-6; R&D Systems, Minneapolis, MN, 206-IL) al ligando inmovilizado (lgG2 9C8 N68T T83S) se midió por duplicado y la concentración de IL-6 varió de 0 a 25 nM. El tiempo de inyección de IL-6 fue de 6 minutos y el tiempo de disociación fue de 25 minutos. La superficie se regeneró entre los ciclos por medio de glicina 10 mM pH 1.7 por 30 segundos a una velocidad de flujo de 30 µ?/min. Se estableció que las condiciones de regeneración eran óptimas después de un estudio de regeneración (datos no mostrados). Los datos se analizaron usando el Kinetics Wizard y los programas de ajuste manual incluidos en el software BiaEvaluation V4.1 usando un modelo de Langmuir 1 :1 (Karlson R y Falt A., J. Immunol. Methods. 200: p. 121-133, 1997). Se observó que el anticuerpo lgG2 9C8 N68T T83S anti-IL-6 tiene una ka= 9.95E+05 (Ms)"1, una kd= 1.34E-04 s"1 y una KD= 1 .35E-10 M o 135 pM.

RESUMEN DEL LISTADO DE SECUENCIAS (Las secuencias son secuencias de aminoácidos, excepto en donde "a. n." indica ácido nucleico)

Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una región CDR1 , CDR2 y CDR3 seleccionada del grupo que consiste en: (a) una CDR1 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de VH como se indica en la SEQ ID NO. 6, y una CDR3 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 7; (b) una CDR1 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 35, una CDR2 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 7; (c) una CDR1 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 41 ; (d) una CDR1 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 44; y (e) una CDR1 de VH como se indica en la SEQ ID NO. 5, una CDR2 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 45; en donde dicho anticuerpo se une específicamente a la IL-6 humana.

2.- El anticuerpo humano aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CD 1 de VL como se indica en la SEQ ID NO: 16, una CDR2 de VL como se indica en la SEQ I D NO: 17 , y una CDR3 de VL como se indica en la SEQ ID NO: 18.

3.- Un anticuerpo humano aislado o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 de VL como se indica en la SEQ ID NO: 16, una CDR2 de VL como se indica en la SEQ ID NO: 17, y una CDR3 de VL como se indica en la SEQ ID NO: 18; en donde dicho anticuerpo se une específicamente a la IL-6 humana.

4.- El anticuerpo aislado, o porción de unión de antigeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque que comprende una CDR-1 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 6, una CDR3 de VH como se indica en la SEQ ID NO: 7, una CDR 1 de VL como se indica en la SEQ ID NO: 16, una CDR2 de VL como se indica en la SEQ ID NO: 17, y una CDR3 de VL como se indica en la SEQ ID NO: 18.

5.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada (VH) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34 , SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 40, o difiere de cualquiera de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 40 en que tiene por lo menos una sustitución conservativa de aminoácido, o difiere de cualquiera de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 40 en que tiene por lo menos una sustitución de aminoácido de la línea germinal en comparación con la SEQ ID NO: 46, en donde dicho anticuerpo se une específicamente a la IL-6 humana.

6 - El anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el dominio VH es por lo menos 90% idéntico en su secuencia de aminoácidos a cualquiera de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO. 40.

7.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (VL) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, o difiere de la SEQ ID NO: 15 en que tiene una sustitución conservativa de aminoácido, o difiere de la SEQ ID NO: 15 en que tiene una sustitución de aminoácido de la línea germinal en comparación con la SEQ ID NO: 47; en donde dicho anticuerpo se une específicamente a la IL-6 humana.

8. - El anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende un dominio VL que es por lo menos 90% idéntico en su secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO: 15.

9. - El anticuerpo monoclonal humano aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (VL) seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 15, o difiere de la SEQ ID NO: 15 en que tiene una sustitución conservativa de aminoácido, o difiere de la SEQ ID NO: 15 en que tiene una sustitución de aminoácido de la línea germinal en comparación con su secuencia de linea germinal respectiva seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 47.

10. - Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende dominios VL y VH por lo menos 90% idénticos en sus secuencias de aminoácidos a los dominios VL y VH, respectivamente, del anticuerpo 9C8, 9C8 N68T T83S, 9C8 E31 G N68T T83S, 9C8 I24V N68T T83S, y 22B5; en donde dicho anticuerpo se une específicamente a la IL-6 humana. 1. - Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende: (a) por lo menos una CDR1 ,

CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada, seleccionada independientemente de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 ; o (b) por lo menos una CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera, seleccionada independientemente de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 ; o (c) por lo menos una CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada seleccionada independientemente de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 , y por lo menos una CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera, seleccionada independientemente de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales 9C8 lgG1 , 9C8 lgG2, 9C8 N68T T83S lgG1 , 9C8 N68T T83S lgG2, 9C8 E31 G N68T T83S lgG1 , 9C8 E31 G N68T T83S lgG2, 9C8 I24V N68T T83S lgG1 , 9C8 I24V N68T T83S lgG2 y 22B5 lgG1 ; en donde dicho anticuerpo se une específicamente a la IL-6 humana.

12.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 32, o difiere de cualquiera de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 32 en que tiene una sustitución conservativa de aminoácido, o difiere de cualquiera de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 32 en que tiene una sustitución de aminoácido de la línea germinal, en comparación con su secuencia de línea germinal respectiva seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 46; en donde dicho anticuerpo se une específicamente a la IL-6 humana.

13. - Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 43, o difiere de cualquiera de las SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 43 en que tiene una sustitución conservativa de aminoácido, o difiere de cualquiera de las SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 43 en que tiene una sustitución de aminoácido de la línea germinal, en comparación con la secuencia de línea germinal correspondiente seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 47; en donde dicho anticuerpo se une específicamente a la IL-6 humana.

14. - Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en: (a) la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, y la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 14; (b) la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, y la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26; (c) la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, y la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26; y (d) la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31 , y la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.

15. - El anticuerpo monoclonal humano aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la secuencia de aminoácidos de cadena pesada es la SEQ ID NO: 28, y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera es la SEQ ID NO: 26.

16. - El anticuerpo monoclonal humano aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 y 1 1 , caracterizado además porque comprende una o más secuencias de aminoácidos de FR1 , FR2, FR3 o FR4 de VH, y/o FR1 , FR2, FR3 o FR4 de VL de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: 9C8, 9C8 N68T T83S, 9C8 E31G N68T T83S, 9C8 I24V N68T T83S, y 22B5.

17.- Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o porción de unión de antigeno del mismo que se reclaman en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. - Una línea celular aislada que produce el anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o la cadena pesada o cadena ligera de dicho anticuerpo o dicha porción de unión de antígeno.

19. - Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

20. - Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 19, en donde el vector comprende opcionalmente una secuencia de control de expresión enlazada operativamente a la molécula de ácido nucleico.

21. - Una célula hospedera que comprende el vector que se reclama en la reivindicación 20, o la molécula de ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 19.

22. - El uso de un anticuerpo o porción de unión de antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o la composición farmacéutica de la reivindicación 17 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento, prevención o alivio de los síntomas de un trastorno mediado por IL-6 en un sujeto.

23. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde el sujeto padece una o más condiciones o trastornos seleccionados del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, un trastorno alérgico, un trastorno autoinmune, un trastorno de rechazo de injerto, aterosclerosis, osteoporosis, dolor neuropático, diabetes mellitus de tipo 2, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, esclerosis múltiple, sepsis, cáncer y una condición fibrótica.

24. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde dicho trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, psoriasis, enfermedad de Castleman, enfermedad de Crohn, y enfermedad de Still de inicio en el adulto.

25. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde dicha condición fibrólica se selecciona del grupo que consiste en fibrosis hepática, fibrosis renal y fibrosis pulmonar.

26. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, carcinoma de célula renal y enfermedad de Castleman.