MX2010011880A - Nuevos enfoques terapeuticos para tratar la enfermedad del alzheimer y trastornos relacionados mediante una modulacion de la respuesta de estres celular. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados. Más particularmente, la invención se refiere a terapias de combinación que modulan la respuesta de estrés celular para tratar dicha enfermedad.

Description

NUEVOS ENFOQUES TERAPEUTICOS PARA TRATAR LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y TRASTORNOS RELACIONADOS MEDIANTE UNA MODULACIÓN DE LA RESPUESTA DE ESTRÉS CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) y trastornos relacionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La EA es el prototipo de demencia cortical que se caracteriza por un déficit de memoria junto con disfasia (trastorno del lenguaje en el que existe un deterioro del habla y de la comprensión del habla), dispraxia (incapacidad para coordinar y realizar ciertos movimientos y gestos intencionados en ausencia de alteraciones motoras o sensoriales) y agnosia (capacidad para reconocer objetos, personas, sonidos, formas u olores) atribuible a la afectación de áreas de asociación corticales. También pueden estar implicados síntomas especiales, tales como paraparesia espástica (debilidad que afecta a las extremidades inferiores) (1-4).

La incidencia de la enfermedad de Alzheimer aumenta espectacularmente con la edad. La EA es, en la actualidad, la causa más habitual de demencia. Clínicamente se caracteriza por una disminución global de la función cognitiva que progresa lentamente y deja a los pacientes terminales confinados a la cama, incontinentes y dependientes de custodia. La muerte se produce, de media, 9 años después del diagnóstico (5).

La tasa de incidencia de la EA aumenta espectacularmente con la edad. Las proyecciones sobre la población de las Naciones Unidas estiman que el número de personas mayores de 80 años se acercará a los 370 millones en el año 2050. Actualmente, se ha estimado que el 50 % de las personas mayores de 85 años están afectadas por EA. Por tanto, más de 100 millones de personas de todo el mundo sufrirán demencia en 50 años. El gran número de personas que requiere atención constante y otros servicios afectará gravemente a los recursos médicos, monetarios y humanos (6).

La alteración de la memoria es la primera característica de la enfermedad e implica a la memoria episódica (memoria para los acontecimientos del día de hoy). La memoria semántica (memoria para los significados verbales y visuales) se ve afectada en etapas posteriores de la enfermedad. Por el contrario, la memoria de trabajo (memoria a corito plazo que afecta a las estructuras y procesos usados para el almacenamiento temporal y la manipulación de la información) y la memoria de procedimientos (memoria inconsciente que es la memoria a largo plazo de capacidades y procedimientos) se conservan hasta tarde. A medida que la enfermedad progresa aparecen las características adicionales de alteración del lenguaje, déficit visuales, preceptúales y espaciales, agnosias y apraxias.

El cuadro clásico de la enfermedad de Alzheimer es lo bastante característico como para permitir la identificación en aproximadamente el 80 % de los casos (7). No obstante, hay heterogeneidad clínica y esto no solo es importante para el tratamiento clínico sino que proporciona más implicaciones de los tratamientos médicos específicos para formas funcionalmente diferentes. (8).

El rasgos característico patológico de la EA incluye placas amiloides que contienen beta amiloide (Abeta), ovillos neurofibrilares (ONF) que contienen disfunción y pérdida de Tau, neuronal y sináptica (9-11) Durante la última década se han propuesto dos hipótesis principales sobre la causa de la EA: La "hipótesis de la cascada amiloide", que afirma que el proceso neurodegenerativo es una serie de acontecimientos desencadenados por el procesamiento anormal de la proteína precursora amiloide (APP) (12) y la "hipótesis de la degeneración del citoesqueleto neuronal" (13), que propone que los acontecimientos desencadenantes son los cambios en el citoesqueleto. La teoría más aceptada que explica la progresión de la EA sigue siendo la hipótesis de la cascada amiloide (14-16) y los investigadores sobre la EA se han centrado principalmente sobre la determinación del mecanismo subyacente a la toxicidad asociada con las proteínas Abeta. Por el contrario, la proteína Tau ha recibido mucha menos atención de la industria farmacéutica que la amiloide, por motivos tanto fundamentales como prácticos. Además, los cambios de densidad sináptica son la lesión patológica que se correlaciona mejor con la alteración cognitiva que los otros dos. Los estudios han revelado que la patología amiloide parece progresar de un modo específico de neurotransmisor, de modo que los terminales colinérgicos parecen más vulnerables, seguidos por los terminales glutamatérgicos y, por último, los terminales GABAérgicos (11 ).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El propósito de la presente invención es proporcionar nuevos enfoques terapéuticos para tratar la EA y trastornos relacionados.

Los inventores han identificado una vía molecular que está implicada en la génesis de la EA y ofrece nuevas dianas para el desarrollo de nuevos tratamientos para atenuar la EA y los trastornos relacionados, particularmente para el desarrollo de terapias de combinación usando moléculas nuevas o existentes previamente usadas en otras indicaciones. Más particularmente, los inventores han identificado varios fármacos que, solos o en combinación(ciones), pueden afectar de forma eficaz a dicha vía y representan una terapia nueva y eficaz para el tratamiento de la EA y trastornos relacionados.

Por tanto, la invención proporciona nuevas composiciones y procedimientos para tratar la EA y los trastornos relacionados.

Más particularmente, la invención se refiere a composiciones adecuadas para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno seleccionado en un sujeto que lo necesite, donde dichas composiciones comprenden un fármaco que inhibe la respuesta de estrés celular.

Otro objeto de la presente invención se refiere a composiciones adecuadas para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno seleccionado en un sujeto que lo necesite, donde dichas composiciones comprenden una combinación de al menos dos fármacos que inhiben la respuesta de estrés celular para administración combinada, por separado o secuencial.

Más preferentemente el fármaco o fármacos que inhiben la respuesta de estrés celular.se unen o modulan la actividad de una proteína codificada por un gen seleccionado de ACCN1, ADRA1A, ADRB2, AFADINA, AKT, ALDH2, ALOX12, AMPK, APBA1, APBA2BP, APG1, APG12, APOER2, ATG5, ATG7, ATM, ATP1A1, ATP2A3, ATP2B1, ATP6V1C1, ATR, BACE1, BAD, BAX, BCAR1, BCL2, BECLIN1, canales de BK (KCNMA1, KCNMB1), BRCA1 , CACNA1C, CALCINEURINA, CD36, CD44, CDH1, CDH2, CDK5, CDKN1A, CHK1, CHRM1, CHRM2, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CK1, CTNNA2, CTNNB1, CULLIN1, CICLINA, DCC, DGKB, DGKH, DNAJB9, DOCK3, DRD2, EDNRA, ELAVL2, ERK1, ERK2, EZRINA, FAS, FKBP12, FKBP12.6, FOX03A, FZ2, GADD45, GNPTAB, GPC5, GRK2, GRK5, GRP170, GRIN2B, GRIN3A, GSK3B, HAS1, HAS2, HAS3, HIPK2, HSPAS, HSP90B1, HSPA5, HTR1A, IDE, IMPDH1, IMPDH2, INS, INSR, IRF1, ITB1, ITGA1, ITGB1, ITPR1, JNK1, LAMA1, MAD1L1, MAO, MCC1, MDM1, MME, MOESIN, MTOR, NADPH OXIDASA, NEDD9, NETRIN1, NFKB1, NHERF, NOS1, NOS2A, NOS3, PAELR, PAK1, PARK2, PCAF, PDE11A, PDE3A, PDE4D, PDE5, PDE6D, PI3K, PIK3C3, PKCA, PLCB1, PLD2, PLN, PML, POP2, PRDX5, PRDX6, PRKG1, PTPRG, PTPRM, PVRL1 , RAC1, RACK1, RADIXINA, RHOA, ROR2, RTN1, RYR3, SAPK3, SCN1A, SCN1B, SCNN1D, SCNN1G, SH3BP5, SIL1, SLC8A1, SLC8A2, SLC8A3, SLN, SNCA, SNCAIP, SORBS2, SORCS2, SRC, SYN1, THBS2, TP53, TP63, TRPC3, TRPC4, TRPC5, UNC5C, VPS15, WNT1A, WNT5A, WWOX, XANTINA OXIDASA, y YES1.

Ejemplos específicos y preferidos de dichos fármacos incluyen, sin limitaciones, compuestos seleccionados de acamprosato, albuterol, alendronato, amlodipina, arabitol, cilostazol, dasatinib, fosfenitoína, leflunomida, manitol, metaraminol, metimazol, milrinona, nitropruasida, omeprazol, fenformina, fenilbutirato sódico, prilocaína, rapamicina, rifabutina, sulfisoxazol, tadalafilo, terbinafina, tioguanina, trehalosa.vidarabina y zonisamida, o una combinación de los mismos.

En una forma de realización concreta, las composiciones de la presente invención comprenden además al menos un fármaco que modula angiogénesis para el uso combinado, por separado o secuencial.

Como alternativa o. de manera adicional, las composiciones de la presente invención pueden comprender además al menos un fármaco que modula la función sináptica para el uso combinado, por separado o secuencial.

Normalmente, las composiciones de la presente invención comprenden además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro objeto de la presente invención reside en un procedimiento de producir un fármaco para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado, en donde el procedimiento comprende una etapa de someter a ensayo un fármaco candidato para determinar la actividad sobre la respuesta de estrés celular y seleccionar los fármacos candidatos que inhiben la respuesta de estrés celular.

La invención también se refiere a un procedimiento para producir una composición para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado, en donde el procedimiento comprende preparar una combinación de un fármaco que inhibe la respuesta de estrés ceular y un fármaco que modula la angiogénesis o la función sináptica, y formular dicha combinación de fármacos para la administración simultánea, por separado o secuencial a un sujeto que lo necesite.

La invención se refiere además a un procedimiento de tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado, en donde el procedimiento comprende administrar de forma simultánea, por separado o secuencialmente a un sujeto que lo necesite un fármaco o una combinación de fármacos que inhiben la respuesta de estrés celular.

La invención se refiere además a un procedimiento de tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado, en donde el procedimiento comprende administrar de forma simultánea, por separado o secuencialmente a un sujeto que lo necesite un fármaco que inhibe la respuesta de estrés celular y un fármaco que modula la angiogénesis y/o un fármaco que modula función sináptica .

La invención se refiere además al uso de un fármaco que inhibe la respuesta de estrés celular para la fabricación de un medicamento para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado.

La invención además se refiere al uso de una combinación de al menos dos fármacos que inhiben la respuesta de estrés celular para la fabricación de un medicamento para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado, en donde dichos al menos dos fármacos se administran juntos, por separado o secuencialmente.

Tal como se trata en la presente solicitud, las terapias anteriores y las terapias de combinación proporcionan nuevos y eficaces enfoques para tratar la EA en sujetos humanos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Efecto DE determinados FÁRMACOS sobre la viabilidad de PC12 diferenciada por NGF tras intoxicación con bte amiloide. 00000: p< 0,00001 ; significativamente diferente del vehículo. **:p < 0,01 ; *** p < 0,0001 ; Significativamente diferente de Abeta25-35. Prueba bilateral t de Student. Una ?ß25-35 10 µ? produce una intoxicación significativa, por encima del 25 %, en comparación con las neuronas tratadas con vehículo (Fig 1-A y B, en rojo). Esta intoxicación se previene con eficacia. Esta intoxicación se previene significativamente con prilocaína (Fig 1A) o amlodipina (Fig 1 B).

Figura 2: Efecto de determinados fármacos sobre la libración de LDH en nultivo de neuronas corticales primarias de rata intoxicadas con beta-amiloide. 00000: p< 0,000001 : significativamente diferente del vehículo, *. P< 0,05; **: p< 0,01 ; ***: p<0,001 *****p< 0,00001 : significativamente diferente de ?ß25-35. Prueba bilateral t de Student. La ? 25-35 20 µ? produce una intoxicación significativa, por encima del 25 %, en comparación con las neuronas tratadas con vehículo (Fig. 2A y B, en rojo). Esta intoxicación se previene con eficacia con BDNF a 10 ng/ml, que se considera un control positivo para neuroprotección. Esta intoxicación también se previene significativamente mediante zonisamida (Fig. 2A) o sulfisoxazol (Fig 2B) o leflunomida (Fig, 2C) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona nuevos enfoques terapéuticos para tratar la EA o trastornos relacionados. La invención da a conocer nuevos usos de fármacos o combinaciones de fármacos que permiten una corrección eficaz de dichas enfermedades y que pueden usarse para el tratamiento de pacientes.

El término "trastorno relacionado con la AE" designa enfermedad de Alzheimer (EA), demencia senil de tipo EA (DSTEA), enfermedad de Parkinson, demencia de cuerpos de Lewis, demencia vascular, alteración cognitiva leva (Mel), alteración de la memoria asociada con la edad (AMAE) y problemas asociados con el envejecimiento, parkinsonismo postencefalitis, ALS y síndrome de Down.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "tratamiento" de un trastorno incluye la terapia, la prevención, la profilaxis, el retraso o la reducción de los síntomas provocados por el trastorno. El término tratamiento incluye, en particular, el control de la progresión de la enfermedad y de los síntomas asociados.

El término "inhibe", en referencia a la respuesta de estrés celular ("REC"), incluye cualquier reducción en la REC en en comparación con la actividad nivel existente en el sujeto. Dicho reducción puede incluir una disminución parcial, por ejemplo de 5-25 %, que es suficiente para mejorar la afección del paciente, así como reducciones más sustanciales, por ejemplo de 20-50 % o más de inhibición completa, por ejemplo por encima del 50 %. La inhibición se puede evaluar o verificar usando pruebas biológicas conocidas, tales como las descritas en la sección experimental.

Asimismo, con la designación de compuestos específicos dentro del contexto de la presente invención se pretende incluir no sólo las moléculas específicamente citadas, sino también cualquier sal, hidrato, éster, éter, isómeros, racemato, conjugados o profármacos de los mismos.

El término "combinación" designa un tratamiento en el que al menos dos o más fármacos se administran de manera conjunta a un sujeto para producir un efecto biológico. En una terapia combinada de acuerdo con la presente invención, los al menos dos fármacos pueden administrarse juntos o por separado, al mismo tiempo o secuencialmente. Asimismo, los al menos dos fármacos pueden administrarse a través de diferentes vías y protocolos. Como resultado, aunque pueden formularse juntos, los fármacos o una combinación también se pueden formular por separado.

Tal como se ha tratado en párrafos anteriores, la invención se refiere a composiciones y procedimientos para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado en un sujeto que lo necesite, usando un fármaco o una combinación de fármacos que inhibe la respuesta de estrés celular.

Mediante una integración exhaustiva de los datos experimentales que cubren los resultados de estudios de biología celular, experimentos de perfiles y estudios de asociación genética, que describen diferentes aspectos de la enfermedad de Alzheimer y vínculos existentes en la señalización celular y las vías funcionales, los inventores han descubierto que la respuesta de estrés celular representa un mecanismo importante que está alterado en los sujetos con EA. Los genes localizados en dicha red funcional e implicados en la enfermedad de Alzheimer se seleccionaron mediante los criterios siguientes: 1 ) interacción directa con los genes causantes responsables de casos familiares de la enfermedad de Alzheimer (APP, ApoE, presenilinas, proteína tau), 2) parejas funcionales de los genes seleccionados mediante el criterio (1 ), 3) parejas funcionales más cercanas de los genes seleccionados mediante el criterio (2), A través de este procedimiento, los inventores pudieron establecer que la red responsable de la respuesta al estrés celular es una red funcional fundamental afectada en la enfermedad de Alzheimer.

Los inventores han establecido más específicamente que la respuesta de estrés celular es un rasgo fundamental funcionalmente relevante de la enfermedad de Alzheimer. Tal como se trata más adelante, los inventores han identificado tres familias de proteínas den la red de respuesta de estrés celular, que son funcionalmente relevantes para la génesis y el control de la enfermedad de Alzheimer y representan dianas valiosas para las terapias (de combinación). Estos grupos de proteínas son, más específicamente, proteínas participantes en la homeostasis del calcio, en el plegamiento de las proteínas y en la ejecución de la apoptosis.

En una forma de realización concreta, la presente invención se refiere más específicamente a composiciones y procedimientos que usan un fármaco o una combinación de fármacos que modulan la actividad de una proteína implicada en la homeostasis del calcio.

El calcio, uno de los mensajeros intracelulares más importantes, media en una serie de procesos celulares en células neuronales y endoteliales, incluidas la plasticidad sináptica, la angiogénesis y la apoptosis. Las mutaciones, los plegamientos anormales o la hiperfosforilación de la presenilina, las proteínas AP y tau afectan a la homeostasis del calcio. De forma recíproca, la alteración de la señalización del calcio intracelular exacerba las lesiones características de la enfermedad de Alzheimer que conducen a una acumulación acelerada de agregaciones amiloides e hiperfosforilación de la proteína tau, lo que indica la existencia de una retroalimentación reguladora entre la homeostasis del calcio y la patología celular específica de la EA.

Los niveles intracelulares de calcio están regulados con precisión mediante la acción colaboradora de una serie de canales permeables al calcio, bombas de calcio e intercambiadores de calcio en la membrana plasmática y el retículo endoplasmático. Por ejemplo, el calcio se almacena dinámicamente en el retículo endoplasmático (RE), que puede acumular niveles de Ca2+ muy elevados debido a la actividad de las bombas SERCA de Ca2+, alcanzando concentraciones milimolares (17). La liberación de Ca2+ desde el retículo endoplasmático está controlada por dos tipos de canales de liberación de Ca2*' los receptores de rianodina (RYR) y los receptores de IP2 (ITPR). Pueden estar directamente activados por múltiples mensajeros de señalización, incluida la fluctuación citoplásmica local de las concentraciones Ca2+ o IPR y están funcionalmente modulados por varias proteínas reguladoras como PKA, PRKGI, mTOR, calcineurina, FKBP, fosfolambano etc. (18). Las bombas SERCA pueden estar reguladas por concentraciones de Ca + dentro del RE, en el que la reducción del contenido ce calcio en el RE aumenta la actividad de SERCA. A nivel de membrana plasmática, la homeostasis del calcio está regulada principalmente por canales de calcio que funcionan según las reservas y dependientes ce voltaje, responsables de la entra de Ca2+, bombas ATPasa de salida de calcio, intercambiadores de Na+/Ca2+ y canales de Na+ dependientes de voltaje.

Los inventores han identificado una red de genes implicados en la vía de la homeostasis del calcio, cuya función podría modificarse por las proteínas mutantes de presenilina o por el ß-amiloide tóxico. Entre ellos, son de particular interés los receptores IP3R (ITPR1 ) y RYR3, ATP2A3 (SERCA3 Ca2+ ATPAsa) que regula la homeostasis del calcio a nivel del RE, la ATPasa ATP2B1 de membrana plasmática, que produce la salida de iones calcio dé las células eucarióticas en contra de gradiente de concentración y los canales de Na+ dependientes de voltaje. Se ha demostrado que APP, ?ß42 y PS1 mutada son capaces de modular La actividad de los receptores de rianodina y las bombas SERCA. ?ß42 y la variante FAD de PS1 aumentan la expresión de RYR3 y su actividad (19-21 ), I que conduce a una mayor vulnerabilidad neuronal a las agresiones excitotóxicas de glutamato (22)- Además, la inhibición de la recaptación de calcio a través de la bomba SERCA se correlaciona con una disminución de la liberación Abeta, mientras que la estimulación de la actividad de SERCA potencia la producción de Abeta (2·). Adicionalmente, a nivel de la membrana plasmática, presenilina y BACE-1 están implicadas en el procesamiento de subunidades ß de los canales de sodio dependientes de voltaje, que modulan y podrían, en condiciones patológicas, invertir la actividad de los intercambiadores de NA+/Ca2+ y provocar una excesiva acumulación de calcio intracelular (24).

En otra forma de realización concreta, la presente invención se refiere más específicamente a composiciones y procedimientos que usan un fármaco o una combinación de fármacos que modulan la actividad de una proteína implicada en el plegamiento o la agregación de proteínas.

La agregación de proteínas es un fenómeno citopatológico crucial en la EA. Dos rasgos característicos fundamentales de la enfermedad de Alzheimer se manifiestan en el desarrollo de ovillos neurofibrilares (ONF) y el depósito de placas de amiloide, compuestas por proteína tau hiperfosforilada agregada y fragmentos de ?ß de la proteína APP, respectivamente. No obstante, otra proteína propensa a la agregación, la a-sinucleína, reconocida como una característica bastante específica de la enfermedad de Parkinson, puede detectarse en placas amlloides en la mayoría de los casos de formas esporádicas y familiares de la enfermedad de Alzheimer (25-26).

Los inventores han identificado varios genes implicados en la modulación del plegamiento, la modificación postraduccional y el procesamiento de cada constituyente principal de las agregaciones proteicas asociadas con la enfermedad de Alzheimer. Este hallazgo subraya la importancia del efecto patológico combinado de las proteínas tau, Abeta y sinucleína plegadas de forma errónea para el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, los inventores han identificado la enzima de degradación de la insulina IDE, que también está implicada en la proteólisis de las proteínas Abeta, (27) y APBA1 y APBA2BP que interaccionan con la APP y regulan su estabilidad y funciones (28-29). Asimismo, el análisis de datos reveló que la a-sinucleína (SNCA), su pareja de interacción sinfilina (SNCAIP) y PARK2, una ubiquitin-protrína ligasa implicada en el aclaramiento de SNCA y la protección de las neuronas contra la toxicidad por la a-sinucleína, como factores de riesgo para el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (30).

El desequilibrio en la actividad de las quinasas, tales como as GSK3 , CDK5 y MARK (31-32) y las fosfatasas que regulan el nivel de fosforilación de la proteína tau podrían contribuir e intensificar la agregación de tau. Dado que la presenilina también está regulada funcionalmente por la fosforilación dependiente de GSK-3P, la GSK-3P podría desempeñar un papel particularmente importante en la patogenia de la enfermedad de Alzheimer. Esta conclusión se ve reforzada por el hallazgo de los inventores de que algunos módulos de señalización que regulan la actividad GSK-3P quinasa o su interacción directa con la proteína tau, WWOX (33), receptor de hialuronano CD44, los receptores Wnt Fz2/ROR2 y el complejo receptor de la insulina/PTPRG (34), podrían asociarse con la génesis de la enfermedad de Alzheimer.

En otra forma de realización concreta, la presente invención se refiere a composiciones y procedimientos que usan un fármaco o combinación de fármacos que inhibe la apoptosis.

La apoptosis, reconocida como un mecanismo celular fundamental responsable de la pérdida de células en la enfermedad de Alzheimer, puede estar desencadenada con eficacia por agresiones celulares que normalmente se asocian con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, alteración de la homeostasis del calcio e incremento de la producción de especies de oxígeno reactivas (ROS) estimuladas por agregados tóxicos del péptido ß- amiloide (Abeta).

Como se identifica en el análisis de los inventores, la apoptosis en el caso de la enfermedad de Alzheimer, muy probablemente, se ejecuta a través de vías canónicas dependientes de p53. La p53 es una proteína de unión a ADN y funciona como factor de transcripción que controla la expresión de los genes diana que inhiben el crecimiento y la invasión de células tumorales. Por tanto, la p53 se reconoce como una proteína de supresión tumoral y desempeña y papel esencial en la regulación de la progresión del ciclo celular, específicamente en la transición de GO a G1 y comprobación de los daños en ADN de G2/M e inducción de la apoptosis. Esto último parece estar mediado por la estimulación de la expresión de proteínas pro-apoptóticas, tales como Bax, o por la represión de la expresión de proteínas antiapoptóticas tales como Bcl-2.

La proteína p53 se puede regular a través de modificaciones postraduccionales y mediante interacciones con factores reguladores positivos y negativos. Los inventores han identificado varias proteínas reguladoras, WWOX, MDMI, HIPK2 y PML , que confirman la propuesta sobre el papel fundamental de la proteína p53 en la ejecución de la muerte celular en la enfermedad de Alzheimer. Un dominio WW que contiene oxidoreductasa (WOXW) de interacción con p53 es un mediador esencial de la citotoxicidad por TNFa y media en la apoptosis sinérgicamente con la p53 (35). La proteína serina/treonina nuclear quinasa-2 de interacción con homeodominio (HIPK2) fosforila la p53 en la Ser 46 y coopera con la p53 en la activación de la vías de transcripción dependientes de p53 y apoptóticas (36). Por último, la proteína PML antagoniza el efecto de la proteína MDM2, que estimula la degradación de p53 por el proteasoma y activa la p53 mediante reclutamiento en complejos multiproteicos denominados cuerpos nucleares de PML (37).

Entre lo sistemas receptores que podrían estar directa y específicamente implicados en la inducción de la apoptosis en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, los receptores de netrina UNC5C (Unc-5 Homólogo C) y DCC (delecionado en el carcinoma colorrectal), que afectan a las guías axónicas y la angiogénesls, representan intereses concretos. Estos receptores son supresores tumorales condicionales putativos designados, ya que se comportan como receptores dependientes de netrina que inducen apoptosis en ausencia de su ligando (38). La unión de netrina-1 a estos receptores inhibe la apoptosis dependiente de p53 supresor de tumor y la p53 está directamente implicada en la regulación transcripcional de la netrina-1 y sus receptores (39). Además, el receptor de d.C. es procesado por la presenilina para generar el dominio del receptor intracelular que posee actividad transcripcional (40). Por tanto, los análisis de datos de los inventores han sugerido que la apoptosis mediada por receptores de netrina y dependiente de p53 podría ser una de las vías proapotóticas específicas implicadas en la pérdida celular patológica en el contexto de la enfermedad de Alzheimer. Además de programas pro-apoptóticos bastante inespecíficos estimulados por la alteración de la homeostasis de calcio y excesiva producción de ROS.

En una forma de realización concreta, la presente invención se refiere más específicamente a composiciones y procedimientos que usan una combinación de fármacos que inhibe la actividad de al menos dos proteínas distintas implicadas en la homeostasis del calcio, en el plegamiento de proteínas, y en la ejecución de la apoptosis.

En la presente invención, los inventores proponen nuevas composiciones que se pueden usar para inhibir la respuesta de estrés ceullar inducida en la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos.

En una forma particular de realización, las composiciones y procedimientos de la presente invención usan fármacos que inhiben la respuesta de estrés celular a través de su interacción con o modulación de un gen o proteína tal como se ha indicado con anterioridad.

Más específicamente, las composiciones de la presente invención comprenden un fármaco o fármacos que inhiben la respuesta de estrés celular través de la unión a, o modulación de la actividad de una proteína codificada por un gen seleccionado de ACCN1 , ADRA1A, ADRB2, AFADIN, AKT, ALDH2, ALOX12, AMPK, APBA1 , APBA2BP, APG1 , APG12, AP0ER2, ATG5, ATG7, ATM, ATP1A1 , ATP2A3, ATP2B1 , ATP6V1C1 , ATR, BACE1 , BAD, BAX, BCAR1 , BCL2, BECLIN1 , canales de BK (KCNMA1 , KCNMB1 ), BRCA1 , CACNA1C, CALCINEURIN, CD36, CD44, CDH1 , CDH2, CDK5, CDKN1A, CHK1 , CHRM1 , CHRM2, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CK1 , CTNNA2, CTNNB1 , CULLINI, CICLINA, DCC, DGKB, DGKH, DNAJB9, D0CK3, DRD2, EDNRA, ELAVL2, ERK1 , ERK2, EZRIN, FAS, FKBP12, FKBP12.6, FOX03A, FZ2, GADD45, GNPTAB, GPC5, GRK2, GRK5, GRP170, GRIN2B, GRIN3A, GSK3B, HAS1, HAS2, HAS3, HIPK2, HSPAS, HSP90B1 , HSPA5, HTR1A, IDE, IMPDH1 , IMPDH2, INS, INSR, IRF1 , ITB1 , ITGA1 , ITGB1 , ITPR1 , JNK1 , LAMA1 , MAD1 L1 , MAO, MCC1 , MDM1 , MME, MOESIN, MTOR, NADPH OXIDASE, NEDD9, NETRIN1 , NFKB1 , NHERF, NOS1 , NOS2A, NOS3, PAELR, PAK1 , PARK2, PCAF, PDEIIA, PDE3A, PDE4D, PDE5, PDE6D, PI3K, PIK3C3, PKCA, PLCB1 , PLD2, PLN, PML, POP2, PRDX5, PRDX6, PRKG1 , PTPRG, PTPRM, PVRL1 , RAC1 , RACK1 , RADIXIN. RHOA, ROR2, RTNI, RYR3, SAPK3, SCN1A, SCN1B, SCNN1 D, SCNN1G, SH3BP5, SILI, SLC8A1 , SLC8A2, SLC8A3, SLN, SNCA, SNCAIP, SORBS2, SORCS2, SRC, SYN1 , THBS2, TP53, TP63, TRPC3, TRPC4, TRPC5, UNC5C, VPS15, WNT1A, WNT5A, WWOX, XANTINA OXIDAS A, y YESI.

Las secuencias de todos los genes y proteínas indicados anteriormente están disponibles en genotecas y se pueden aislar mediante técnicas conocidas en la técnica. Además, la actividad de estos genes y proteínas se puede evaluar mediante técnicas conocidas per se en la técnica, tal como se trata en la sección experimental.

La invención describe además fármacos que se pueden usar para modular estos genes y proteínas diana. La invención divulga la identificación y la actividad de fármacos concretos que, bien solos pero, preferentemente en combinación(es), modulan la vía anterior y pueden usarse para tratar dichas enfermedades. En particular, los inventores han identificado moléculas pequeñas que ya existen en la literatura pero usados para tratar enfermedades distintas en sujetos humanos.

A este respecto, en una forma de realización más preferida, las composiciones de la presente invención comprenden al menos un modulador de A PK (preferentemente seleccionado de fenformina y vidarabina), un inhibidor de ATPIAI (preferentemente , omeprazol), un inhibidor de CACNAIC (preferentemente , amlodipina), un antagonista del receptor de endotelina EDNRA (preferentemente sulfisoxazol), un modulador de los receptores GABAérgicos y glutamatérgicos GRIN2B y GRIN3A (preferentemente , acamprosato), un inhibidor de la actividad de GSK3B (preferentemente seleccionado de albuterol y metaraminol), un modulador de hialuronano sintasas HAS1-3 (preferentemente , leflunomida), un inhibidor de IMPDHI e IMPDH2 (preferentemente , tioguanina), un inhibidor de MTOR (preferentemente , rapamicina), un inhibidor de las fosfodiesterasas PDEIIA, PDE4A y PDE5A (preferentemente , tadalafilo), un inhibidor de PDE3A (preferentemente , cilostazol), un inhibidor de PDE4D (preferentemente milrinona), un modulador de PRDX5 y PRDX6 (preferentemente , metimazol), un activador de PRKG1 (preferentemente seleccionado de nitroprusida, tadalafilo y cilostazol), un modulador de RHOA (preferentemente seleccionado de alendronato y terbinafina), un modulador de RYR3 (preferentemente prilocaína), un inhibidor de SCNIA y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida), un inhibidor de SCN1A/B (preferentemente seleccionado de zonisamida y fosfenitoína), un inhibidor de YES1 y SRC (preferentemente dasatinib), un activador de la autofagia (preferentemente trehalosa), y/o auxiliares químicos (preferentemente seleccionado de fenilbutirato sódico, rifabutina, arabitol y manitol).

Tal como se ha tratado en párrafos anteriores, la invención propone particularmente diseñar terapias de combinación para abordar los mecanismos de la EA y trastornos relacionados. A este respecto, más adelante se dan a conocer ejemplos de dianas y combinaciones de fármacos más preferidos.

Más preferentemente la composición de la invención comprende al menos una de las siguientes combinaciones de fármacos, para administración combinada, por separado o secuencial: un modulador de AMPK (preferentemente fenformina) y un inhibidor de los canales de sodio SCNIA y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida), un modulador de los receptores GABAérgicos y glutamatérgicos (preferentemente acamprosato) y un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina). un inhibidor de los canales de sodio SCN1A y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida) y un modulador del receptor de rianodina RYR3 (preferentemente prilocaína), un modulador de AMPK (preferentemente fenformina) y un modulador del receptor de rianodina RYR3 (preferentemente prilocaína), un modulador de AMPK (preferentemente terbinafina) y un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina), un inhibidor de los canales de sodio SCN1A y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida) y un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina), - un modulador del receptor de rianodina RYR3 (preferentemente prilocaína) y un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina). un modulador de AMPK (preferentemente terbinafina) y un auxiliar químico (preferentemente rifabutina), un inhibidor de los canales de sodio SCN1A y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida) y un auxiliar químico (preferentemente rifabutina), un modulador del receptor de rianodina RYR3 (preferentemente prilocaína) y un auxiliar químico (preferentemente rifabutina). un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina) y un auxiliar químico (preferentemente rifabutina), o - un modulador de AMPK (preferentemente fenformina) y un inhibidor de las fosfodiesterasas PDE11 A y PDE4A, PDE5A (preferentemente tadalafilo).

Ejemplos más preferidos de composiciones de la presente invención comprenden un compuesto seleccionado de acamprosato, albuterol, alendronato, amlodipina, arabitol, cilostazol, dasatinib, fosfenitoína, leflunomida, manitol, metaraminol, metimazol, milrinona, nitroprusida, omeprazol, fenformina, fenilbutirato sódico, prilocaína, rapamicina, rifabutina, sulfisoxazol, tadalafilo, terbinafina, tioguanina, trehalosa, vidarabina y zonisamida, o una combinación de los mismos.

En otra forma de realización preferida, las composiciones de la invención comprenden al menos un compuesto escogido del grupo constituido acamprosato, cilostazol, metimazol, fenformina, prilocaína, tadalafilo, terbinafina, zonisamida y rifabutina, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para administración simultánea, por separado o secuencial.

En otra forma de realización más preferida, las composiciones de la invención comprenden una combinación de al menos dos compuestos escogidos del grupo constituido acamprosato, cilostazol, metimazol, fenformina, prilocaína, tadalafilo, terbinafina, zonisamida y rifabutina, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para administración simultánea, por separado o secuencial.

En otra forma de realización, la composición de acuerdo con la invención comprende una combinación de al menos dos compuestos escogidos del grupo constituido por acamprosato, cilostazol, metimazol, fenformina, prilocaína, tadalafilo, terbinafina, zonisamida y rifabutina, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, en la que dicha composición inhibe la respuesta de estrés celular inducido en trastornos neurodegenerativos seleccionados del grupo constituido por la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y esclerosis múltiple (EM).

En otra forma de realización preferida, las- composiciones de la invención comprenden una combinación de al menos dos compuestos escogidos del grupo constituido por acamprosato, cilostazol, metimazol, fenformina, prilocaina, tadalafilo, terbinafina, zonisamida y rifabutina, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para tratar la enfermedad de Alzheimer (EA).

Preferentemente la composición para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno seleccionado en un sujeto que lo necesite, comprende al menos uno de las siguientes combinaciones de fármacos para administración combinada, por separado o secuencial: - fenformina y zonisamida, - acamprosato y terbinafina, - zonisamida y prilocaína, - fenformina y prilocaína, - fenformina y terbinafina, - zonisamida y terbinafina, - prilocaína y terbinafina, - fenformina y rifabutina, - zonisamida y rifabutina, - prilocaína y rifabutina, - terbinafina y rifabutina, o - fenformina y tadalafilo, En la forma de realización preferida, la composición de acuerdo con la invención comprende al menos amlodipina y prilocaína, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para administración simultánea, por separado o secuencial.

En otra forma de realización preferida, la composición de la invención comprende al menos amlodipina y/o prilocaína, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado.

En otra forma de realización, la composición de la invención comprende además al menos un fármaco que inhibe la respuesta de estrés celular para el uso combinado, por separado o secuencial.

Preferentemente el fármaco adicional que inhibe la respuesta de estrés celular se selecciona de un modulador de AMPK (preferentemente vidarabina), un inhibidor de ATPIAI (preferentemente omeprazol), un inhibidor de la actividad de GSK3B (preferentemente seleccionado de albuterol y metaraminol), un inhibidor de IMPDHI e IMPDH2 (preferentemente tioguanina), un inhibidor de MTOR (preferentemente rapamicina), un inhibidor de PDE4D (preferentemente milrinona), un activador de PRKG1 (preferentemente cilostazol), un modulador de RHOA (preferentemente alendronato), un inhibidor de SCN1 A/B (preferentemente fosfenitoína), un inhibidor de YES1 y SRC (preferentemente dasatinib), un activador de la autofagia (preferentemente trehalosa), y/o auxiliares químicos (preferentemente seleccionado de fenilbutirato sódico, arabitol y manitol).

En otras formas de realización concretas, dicho fármaco adicional que inhibe la respuesta de estrés celular se selecciona del fármaco o fármacos que se unen o modulan la actividad de una proteína codificada por un gen seleccionado de ACCN1, ADRA A, ADRB2, AFADIN, AKT, ALDH2, ALOX12, AMPK, APBA1 , APBA2BP, APG1 , APG12, APOER2, ATG5, ATG7, ATM, ATP1A1 , ATP2A3, ATP2B1 , ATP6V1 C1 , ATR, BACE1 , BAD, BAX, BCAR1 , BCL2, BECLIN1 , canales de BK (KCNMA1 , KCNMB1 ), BRCA1 , CACNA1C, CALCINEURINA, CD36, CD44, CDH1 , CDH2, CDK5, CDKN1A, CHK1 , CHRM1 , CHRM2, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CK1 , CTNNA2, CTNNB1 , CULLIN1, CYCLINE, DCC, DGKB, DGKH, DNAJB9, DOCK3, DRD2, EDNRA, ELAVL2, ERK1 , ERK2, EZRINA, FAS, FKBP12, FKBP12.6, FOX03A, FZ2, GADD45, GNPTAB, GPC5, GRK2, GRK5, GRP170, GRIN2B, GRIN3A, GSK3B, HAS1, HAS2, HAS3, HIPK2, HSPAS, HSP90B1 , HSPA5, HTR1A, IDE, IMPDH1 , IMPDH2, INS, INSR, IRF1 , ITB1 , ITGA1 , ITGB1 , ITPR1 , JNK1 , LAMA1 , MAD1 L1, MAO, MCC1 , MDM1 , MME, MOESIN, MTOR, NADPH OXIDASA, NEDD9, NETRINA, NFKB1 , NHERF, NOS1, NOS2A, NOS3, PAELR, PAK1 , PARK2, PCAF, PDEIIA, PDE3A, PDE4D, PDE5, PDE6D, PI3K, PIK3C3, PKCA, PLCB1 , PLD2, PLN, PML, POP2, PRDX5, PRDX6, PRKG1 , PTPRG, PTPRM, PVRL1 , RAC1 , RACK1 , RADIXIN, RHOA, ROR2, RTN1 , RYR3, SAPK3, SCN1A, SCN1 B, SCNN1 D, SCNN1G, SH3BP5, SIL1 , SLC8A1 , SLC8A2, SLC8A3, SLN, SNCA, SNCAIP, SORBS2, SORCS2, SRC, SYN1 , THBS2, TP53, TP63, TRPC3, TRPC4, TRPC5, UNC5C, VPS15, WNTIA, WNT5A, WWOX, XANTHINE OXIDASE, y YES1.

Los inventores han establecido que los fármacos y combinaciones de fármacos anteriores proporcionan un mejor efecto biológico sinérgico que conduce a una corrección o normalización eficaz o una alteración de la regulación funcional que produce EA y trastornos relacionados.

Los compuestos citados con anterioridad se enumeran en la tabla 1 siguiente, junto con su número CAS. Tal como se ha tratado anteriormente, debe entenderse que la invención abarca el uso de los compuestos anteriores, así como cualquier sal, hidrato, éster, éter, isómeros, racemato, conjugados o profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los profármacos se pueden preparar (p. ej., mediante acoplamiento del fármaco a un vehículo adecuado) para ofrecer un control mejor sobre los parámetros farmacocinéticos del tratamiento.

Tabla 1 NOMBRE DEL FARMACO NUMERO CAS Acamprosato 77337-76-9 Albuterol 18559-94-9 Alendronato 66376-36-1 Amlodipina 88150-42-9 488-82-4, 7643-75-6, 6018-27- Arabitol 5 Cilostazol 73963-72-1 Dasanitib 302962-49-8 Fosfenitoína 93390-81-9 Leflunomida 75706-12-6 Man'itol 69-65-8 Metaraminol 54-49-9 Metimazol 60-56-0 Milrinona 78415-72-2 Nitroprusida 15078-28-1 Omeprazol 73590-58-6 Fenformina 114-86-3 Fenilbutirato sódico 1716-12-7 Prilocaína 721-50-6 Rapamicina 53123-88-9 Rifabutina 72559-06-9 Sulfisoxazol 127-69-5 Tadalafilo 171596-29-5 Terbinafina 91161-71-6 Tioguanina 154-42-7 Trehalosa 99-20-7 Vidarabina 24356-66-9 Zonisamida 68291-97-4 Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de ácido farmacéuticamente aceptables, sales de adición de base farmacéuticamente aceptables, sales metálicas farmacéuticamente aceptables, sales de amonio y de amonio alquilados. Las sales de adición de ácido incluyen sales de ácidos inorgánicos, así como ácidos orgánicos. Ejemplos representativos de ácidos inorgánicos adecuados incluyen ácidos clorhídrico bromhídrico, yodhídrico, fosfórico, sulfúrico, nítrico y similares. Ejemplos representativos de ácidos orgánicos adecuados incluyen los ácidos fórmico, acético, tricloroacético, trifluoroacético, propiónico, benzoico, cinnámico, cítrico, fumárico, glicólico, láctico, maleico, málico, malónico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico, salicílico, succínico, metanosulfónico etanosulfónico, tartárico, ascórbico, pamoico, bismetilensalicílico, etanodisulfónico, glucónico, citracónico, aspártico, esteárico, palmítico, EDTA, glicólico, p-aminobenzoico, glutámico, bencenosulfónico, o-toluenosulfónico, sulfatas, nitratos, fosfatos, percloratos, boratos, acetatos, benzoatos, hidroxinaftoatos, glicerofosfatos, cetoglutaratos y similares. Ejemplos adicionales de sales de adición de ácido inorgánico u orgánico farmacéuticamente aceptable se enumeran en, por ejemplo, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2, Que se incorpora en la presente memoria por referencia. Ejemplos de sales de metales incluyen sales de litio, sodio, potasio, magnesio y similares. Ejemplos de sales de amonio y de amonio alquilado incluyen sales de amonio, metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio, etilamonio, hidroxietilamonio, dietilamonio, butilamonio, tetrametilamonio y similares. Ejemplos de bases orgánicos incluyen lisina, arginina, guanidina, dietanolamina, clona y similares.

La terapia de acuerdo con la invención se puede realizar sola o como combinación de fármacos y/o junto con cualquier otra terapia, dirigida a la misma vía o que tienen distintos modos de acción. Se puede proporcionar en el domicilio, la consulta del médico, una clínica, el departamento ambulatorio de un hospital o un hospital, de modo que el médico pueda observar estrechamente los efectos de la terapia y realizar los ajustes que sean necesarios.

En una forma de realización concreta, las composiciones de la presente invención comprenden además al menos un fármaco que modula la angiogénesis, preferentemente que incrementa la angiogénesis, para el uso combinado, por separado o secuencial. Más preferentemente los fármacos que modulan la angiogénesis se seleccionan del grupo constituido por ambrisentan, ácido aminocapoico, argatrobán, balsalazida, becaplermin, cabergolina, clopidogrel, desirudina, dihidroergotamina, eplerenona, fenoldopam, fludrocortisona, gemfibrozilo, hesperetina, leflunomida, L-histidina, liotironina, marimastat, meloxicam, mepacrina, metazolamida, montelukast, netilmicina, nitroglicerina, pírimetamina, sulfisoxazol, sunitinib, tietilperazina, tirofibán, topotecán y warfarina (véase la tabla 2 a continuación).

Tabla 2 NOMBRE DEL FÁRMACO NUMERO CAS Ambrisentán 177036-94-1 Acido aminocaproico 60-32-2 Argatrobán 74863-84-6 Balsalazida 80573-04-2 Beclapermin 165101-51-9 Carbegolina 81409-90-7 Clopidogrel 113665-84-2 Desirudina 120993-53-5 Dihidroergotamina 6190-39-2 Eplerenona 107724-20-9 Fenoldopam 67227-57-0 Fludrocortisona 127-31-1 Gemfibrozilo 25812-30-0 Hesperetina 520-33-2 Leflunomida 75706-12-6 L-histidina 71-00-1 Liotironina 6893-02-3 Marimastat 154039-60-8 Meloxicam 71125-38-7 Mepacrina 83-89-6 Metazolamida 554-57-4 Montelukast 158966-92-8 Netilmicina 56391-56-1 Nitroglicerina 55-63-0 Pirimetamina 58-4-0 Sulfisoxazol 127-69-5 Sunitinib 557795-19-4 Tietilperacina 1420-55-9 Tirofibán 144494-65-5 Topotecán 119413-54-6 Warfarina 81-81-2 Como alternativa o además de la forma de realización precedente, las composiciones de la presente invención pueden comprender además al menos un fármaco que modula la función sináptica, preferentemente que mejora la función sináptica para el uso combinado, por separado o secuencial. Los fármacos más preferidos que modulan la función sináptica se seleccionan de alfentanilo, amilorda, amlodipina, aztreonam, baclofeno, buclizina, numetanida, buprenorfina, lidocaína, clorzoxazpn, cinacalcet, difilina, eletriptán, ergotamina, flunitrazepam, imatinib, ketotifeno, pegaptanib, pentazocina, fenofarbital, pregabalina, propiltiouracilo, temazepam, tiagabina, topiramato, triamtireno y vidarabina (véase la tabla 3 a continuación).

Tabla 3 NOMBRE DEL FARMACO NUMERO CAS Alfentanilo 71195-58-9 Amilorida 2016-88-8 Amlodipina 88150-42-9 Aztreonam 78110-38-0 Baclofeno 1134-47-0 Buclizina 82-95-1 Bumetanida 28395-03-1 Buprenorfina 52485-79-7 Clorzoxazoa 95-25-0 Cinacalcet 226256-56-0 Difilina 479-18-5 Eletriptán 143322-58-1 Ergotamina 113-15-5 Flunitrazepam 1622-62-4 Imatinib 152459-95-5 Ketotifeno 34580-14-8 Lidocaína 137-58-6 Pegaptanib 222716-86-1 Pentazocina 359-83-1 Fenobarbiital 50-06-6 148553-50-8 Pregabalina Propiltiouracilo 51-52-5 Temazepam 846-50-4 Tiagabina 115103-54-3 Topiramato 97240-79-4 Triamtireno 396-01-0 Vigabatrina 60643-86-9 En una forma de realización concreta, la invención se refiere a una composición que comprende un fármaco que incrementa la angiogénesis, un fármaco que atenúa la función sináptica y un fármaco que inhibe la respuesta de estrés celular, para administración simultánea, por separado o secuencial.

En otra forma de realización concreta, la invención usa un fármaco que exhibe al menos dos de las actividades enumeradas en lo que antecede. De hecho, los fármacos que inhiben la respuesta de estrés celular y que también incrementan la angiogénesis o mejoran la función sináptica representan formas de realización particularmente ventajosas de la presente invención.

Normalmente, las composiciones de la invención comprenden uno o varios vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. La duración de la terapia depende del estadio de la enfermedad que se está tratando, la combinación usada, la edad y estado del paciente y cómo responde el paciente al tratamiento.

La dosificación, frecuencia y modo de administración de cada componente de la combinación se puede controlar de forma independiente. Por ejemplo, se puede administrar un fármaco por vía oral, mientras que el segundo fármaco se puede administrar por vía intramuscular. La terapia de combinación se puede administrar en ciclos de terapia y descanso, que incluyen periodos de descanso de modo que el cuerpo del paciente tenga la posibilidad de recuperarse de cualquiera de los efectos secundarios todavía sin predecir. Los fármacos también se pueden formular juntos de modo que una administración libere todos los fármacos.

La administración de cada fármaco de la combinación puede ser por cualquier medio adecuado que tenga como resultado una concentración del fármaco que, combinada con el otro componente, sea capaz de corregir el funcionamiento de las vías implicadas en la EA.

Cuando es posible administrar los ingredientes activos de la combinación en forme del químico puro, es preferible presentarlos como una composición farmacéutica, también denominada en este contexto formulación farmacéutica. Las posibles composiciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, tópica (incluidas transdérmica, bucal y sublingual) o parenteral (incluidas subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica).

Más habitualmente, estas formulaciones farmacéuticas se prescriben al paciente en "paquetes para el paciente" que contienen una serie de unidades de dosificación u otros medios para administración de dosis unitarias medidas para usar durante un periodo de tratamiento distinto en un envase único, normalmente un envase blíster. Los paquetes para el paciente tienen una ventaja sobre las prescripciones tradicionales, en las que un farmacéutico divide un suministro para un paciente de un producto farmacéutico de un suministro global, en que el paciente siempre tiene acceso a la ficha técnica contenida en el paquete para el paciente, que normalmente no está disponible en las prescripciones tradicionales. Se ha demostrado que la inclusión de una ficha técnica mejora el cumplimiento del paciente con las instrucciones del médico. Por tanto, la invención además incluye una formulación farmacéutica, como se ha descrito antes en la presente memoria, en combinación con material de acondicionamiento adecuado para dichas formulaciones. En dicho envase para paciente, el uso destinado de una formulación para el tratamiento de combinación se puede deducir mediante instrucciones, instalaciones, condiciones, adaptaciones y/u otros medios auxiliares usando la formulación más adecuada para el tratamiento. Dichas medidas convierten un envase para paciente en específicamente adecuado para, y adaptado para, usar para el tratamiento con la combinación de la presente invención.

El fármaco puede estar contenido en cualquier cantidad adecuada y cualquier sustancia vehículoa adecuada y puede estar presente en una cantidad de 1-99 % en peso del peso total de la composición. La composición puede proporcionarse en una forma de dosificación que sea adecuada para la vía de administración oral, parenteral (p. ej., intravenosa, intramuscular), rectal, cutánea, nasal, vaginal, inhalado, cutánea (parche) y ocular. Por tanto, la composición puede estar en forma de, por ejemplo comprimidos, cápsulas, pildoras, polvos, granulados, suspensiones, emulsiones, soluciones, geles, incluidos hidrogeles, pastas, ungüentos, cremas, yesos, vendajes, dispositivos de liberación osmótica, supositorios, enemas, inyectables, implantes, aerosoles o aerosoles.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (véase, p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. 1. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York).

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden formularse para liberar el fármaco activo sustancialmente inmediatamente tras la administración o en cualquier momento o periodo de tiempo predeterminado tras la administración.

Las formulaciones de liberación controlada incluyen (i) formulaciones que crean una concentración sustancialmente constante del fármaco dentro del cuerpo durante un periodo de tiempo extendido; (¡i) formulaciones que después de un periodo de demora predeterminado crean una concentración sustancialmente constante del fármaco dentro del cuerpo durante un periodo de tiempo extendido; (iii) formulaciones que sostienen la acción del fármaco durante un periodo de tiempo predeterminado manteniendo un nivel de fármaco eficaz relativamente constante en el cuerpo, con minimización concomitante de efectos secundarios indeseables asociados con fluctuaciones a nivel plasmático de la sustancia farmacológica activa; (iv) formulaciones que localizan la acción del fármaco mediante, p. ej., colocación espacial de una composición de liberación controlada adyacente a o en el tejido u órgano enfermo; y (v) formulaciones dirigidas a la acción del fármaco mediante el uso de vehículos o derivados químicos para liberar el fármaco en un tipo de célula diana concreto.

Especialmente se prefiere la administración de fármacos en forma de una formulación de liberación controlada en los casos en los que el fármaco, bien solo o en combinación, tiene (i) un estrecho índice terapéutico (Es decir, la diferencia entre la concentración en plasma que da lugar a efectos secundarios dañinos o reacciones tóxicas y la concentración en plasma que producir un efecto terapéutico es pequeña; en general, el índice terapéutico, IT, se define como la proporción entre la mediana de la dosis letal (DL50) y la mediana de la dosis efectiva (DE50)); (II) un margen de absorción estrecho en el tracto gastrointestinal; o (iii) una semivida biológica muy corta de modo que durante un día se requiere dosificación frecuente con el fin de mantener el nivel plasmático en un nivel terapéutico.

Se puede ejercer una serie de estrategias con el fin de obtener liberación controlada en la que la velocidad de liberación supera a la velocidad del metabolismo del fármaco en cuestión. La liberación controlada se puede obtener mediante la selección adecuada de varios parámetros e ingredientes de formulación, incluidas, por ejemplo, varios tipos de composiciones y revestimientos de liberación controlada. Por tanto, el fármaco se formula con excipientes adecuados en una composición farmacéutica que, tras la administración, libera el fármaco de forma controlada (composiciones en comprimido o cápsula de una o múltiples unidades, soluciones de aceite, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, parches y liposomas).

Formas de dosificación sólida para uso oral Las formulaciones para uso oral incluyen comprimidos que contienen el(los) ingrediente(s) activo(s) en una mezcla con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o cargas inertes (p. ej., sacarosa, celulosa microcristalina, almidones, incluidos almidón de patata, carbonato cálcico, cloruro sódico, fosfato cálcico, sulfato cálcico o fosfato sódico); agentes de granulación y disgregantes (p. ej., derivados de celulosa, incluidas celulosa microcristalina, almidones, incluidos almidón de patata, croscarmelosa sódica, alginatos o ácido algínico); agentes aglutinantes (p. ej., goma arábiga, ácido algínico, alginato sódico, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, Hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona o polietilenglicol; y agentes lubricantes, deslizantes y antiadhesivos (p. ej., ácido esteárico, sílices o talco). Otros excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes tampón y similares.

Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas, opcionalmente para retrasar la disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal y, de este modo, proporcionar una acción sostenida durante un periodo de tiempo largo. El revestimiento puede adaptarse para liberar la sustancia farmacológica activa en un patrón predeterminado (p. ej., para conseguir una formulación de liberación controlada) o pueden adaptarse para no liberar la sustancia farmacológica activa hasta después de haber pasado el estómago (revestimiento entérico). El revestimiento puede ser un revestimiento de azúcar, un revestimiento pelicular (p. ej., basado en hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolímeros de acrilato, polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona) o un revestimiento entérico (p. ej., basado en copolímero de ácido metacrílico, acetato ftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato ftalato de polivinilo, goma shellac y/o etilcelulosa). Se puede usar un material de' retraso de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las composiciones sólidas pueden incluir un revestimiento adaptado para proteger la composición de cambios químicos indeseados (p. ej., degradación química antes de la liberación de la sustancia farmacológica activa). El revestimiento puede aplicarse sobre la forma de dosificación sólida de un modo similar al descrito en Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.

Varios fármacos se pueden mezclar en el comprimido o se pueden dividir. Por ejemplo, el primer fármaco está contenido en el interior del comprimido y el segundo fármaco está fuera, de modo que una porción sustancial del segundo fármaco se libera antes de la liberación del primer fármaco.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar en forma de comprimidos masticables o en forma de cápsulas de gelatina dura, en los que el ingrediente activo está mezclado con un diluyente sólido inerte (p. ej., almidón de maíz, celulosa microcristalina, carbonato cálcico, fosfato cálcico o caolín) o como cápsulas de gelatina blanda, en las que el ingrediente activo está mezclado con agua o con un medio oleoso, por ejemplo parafina líquida o aceite de oliva. Los polvos y granulados se pueden preparar usando los ingredientes mencionados en lo que antes en comprimidos y cápsulas de un modo convencional.

Se pueden construir composiciones de liberación controlada para uso oral para, por ejemplo, liberar el fármaco activo mediante el control de la disolución y/o la difusión de la sustancia farmacológica.

La disolución o difusión de liberación controlada se puede conseguir mediante el revestimiento adecuado de una formulación en comprimido, cápsula, pastilla o granulado de fármacos o mediante la incorporación del fármaco en una matriz adecuada. Un revestimiento de liberación controlada puede incluir una o más de las sustancias de revestimiento mencionadas en lo que antecede y/o, por ejemplo, goma shellac, cera de abeja, cera de glucosa, cera de ricino, cera carnauba, alcohol estearílico, monoestearato de glicerilo, diesterato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulosa, resinas acrílicas, ácido dl-poliláctico, acetato butirato de celulosa, cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo, pirrolidona de vinilo, polietileno, polimetacrilato, metilmetacrilato, 2-hidroximetacrilato, hidrogeles de metacrilato, 1 ,3-butilenglicol, metacrilato de etilenglicol y/o polietilenglicoles. En una formulación de matriz de liberación controlada, el material de la matriz también puede incluir, por ejemplo, metilcelulosa hidratada, cera de carnauba y alcohol estearílico, carbopol 934, silicona, triestearato de glicerilo, acrilato de metilo-metacrilato de metilo, cloruro de polivinilo, polietileno y/o fluorocarbono hidrogenado.

Una composición de liberación controlada que contiene uno o más de los fármacos de las combinaciones reivindicadas también puede estar en forma de un comprimido o cápsula flotante (es decir, un comprimido o cápsula que, tras la administración oral, flota encima del contenido gástrico durante un periodo de tiempo determinado). Una composición de comprimido flotante del(los) fármaco(s) se pueden preparar mediante granulación de una mezcla del(los) fármaco(s) con excipientes y 20-75 % p/p de hidrocoloides, tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa. A continuación, los gránulos obtenidos se pueden comprimir para formas comprimidos. Tras el contacto con el jugo gástrico, el comprimido forma una barrera en gel impermeable al agua alrededor de su superficie. Esta barrera en gel toma parte en el mantenimiento de una densidad inferior a uno, de modo que se permite que el comprimido permanezca flotando en el jugo gástrico.

Líquidos para administración oral Polvos, polvos dispersables o gránulos adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua son formas de dosificación conveniente para administración oral. La formulación en forma de suspensión proporciona el ingrediente activo en una mezcla con un agente de dispersión o humectación, agente de suspensión y uno o más conservantes. Agentes se suspensión adecuados son, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, alginato sódico y similares.

Composiciones parenterales La composición farmacéutica también se puede administrar por vía parenteral mediante inyección, infusión o implantación (intravenosa, intramuscular, subcutánea o similar) en formas de dosificación, formulaciones o mediante dispositivos de liberación adecuados o implantes que contienen vehículos y adyuvantes no tóxicos farmacéuticamente aceptables. La formulación y preparación de dichas composiciones son bien conocidas para los expertos en la técnica de la formulación farmacéutica.

Las composiciones para uso parenteral se pueden proporcionar en formas de dosificación unitaria (p. ej., en ampollas de una única dosis) o en viales que contienen varias dosis y en los que se puede añadir un conservante adecuado (véase más adelante). La composición puede estar en forma de una solución, una suspensión, una emulsión, un dispositivo de infusión o un dispositivo de liberación para implantar, o se puede presentar en forma de un polvo seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de usar. Aparte del(los) ingrediente(s) activo(s), la composición puede incluir vehículos y/o excipientes adecuados parenteralmente aceptables. El(los) fármaco(s) activo(s) se pueden incorporar en microesferas, microcápsulas, nanopartículas, liposomas o similares para liberación controlada. La composición puede incluir agentes de suspensión, solubilización, estabilización, de ajuste de pH y/o agentes de dispersión.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden estar en forma adecuada para inyección estéril. Para preparar dicha composición, el(los) fármaco(s) activo(s) adecuado(s) se disuelven o suspenden en un vehículo líquido parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar están agua, agua ajustada hasta un pH adecuado mediante la adición de una cantidad adecuada de ácido clorhídrico, hidróxido sódico o un tampón adecuado, -3-butanodiol, solución de Ringer y solución de cloruro sódico isotónico. La formulación acuosa puede también contener uno o más conservantes (p. ej., p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo). En los casos en los que uno de los fármacos es poco o ligeramente soluble en agua se puede añadir una disolución de potenciación o un agente solubilizante, o el disolvente puede incluir 10-60 % p/p de propilenglicol o similares.

Las composiciones parenterales de liberación controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluciones oleosas, suspensiones oleosas o emulsiones. Como alternativa, el(los) fármaco(s) activo(s) pueden incorporarse en vehículos biocompatibles, liposomas, nanopartículas, implantes o dispositivos de infusión. Materiales para usar en la preparación de microesferas y/o microcápsulas son, por ejemplo, polímeros biodegradables/bioerosionables tales como poligalactina, poli(cianoacrilato . de isobutilo), poli(2-hidroxietil-L-glutamina). Vehículos biocompatibles que se pueden usar al formular una formulación parenteral de liberación controlada son hidratos de carbono (p. ej., dextranos), proteínas (p. ej., albúmina), lipoproteínas o anticuerpos. Materiales para usar en implantes pueden ser no biodegradables (p. ej., polidimetílsíloxano) o biodegradables (p. ej., poli(caprolactona), poli(ácido glicólico) o poli(ortoésteres)).

Composiciones rectales Para aplicación rectal, formas de dosificación adecuadas para una composición incluyen supositorios (de tipo emulsión o suspensión) y cápsulas de gelatina rectal (soluciones o suspensiones). En una formulación de supositorio típica, el(los) fármaco(s) activo(s) se combinan con una base de supositorio adecuada farmacéuticamente aceptable, tal como manteca de cacao, ácidos grasos esterificados, gelatina glicerínada y varias bases hidrosolubles o dispersables como polietilenglicoles. Se pueden incorporar varios aditivos, potenciadores o tensioactivos.

Composiciones percutáneas y tópicas Las composiciones farmacéuticas pueden también administrarse tópicamente sobre la piel para absorción percutánea en formas de dosificación o formulaciones que contienen vehículos y excipientes farmacéuticos convencionalmente no tóxicos, incluidas microesferas y liposomas. Las formulaciones incluyen cremas, ungüentos, lociones, linimentos, geles, hidrogeles, soluciones, suspensiones, barras, aerosoles, pastas, yesos y otros tipos de sistemas de liberación transdérmica del fármaco. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables puede incluir agentes emulsionantes, antioxidantes, agentes tampón, conservantes, humectantes, potenciadores de la penetración, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases de ungüento, perfumes y agentes protectores de piel.

Los agentes emulsionantes pueden ser gomas naturales (p. e¡.. goma arábiga o goma de tragacanto) Los conservantes, humectantes, potenciadores dé la penetración pueden ser parabenes, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o propilo, y cloruro de benzalconio, glicerina, propilenglicol, urea etc.

Las composiciones farmacéuticas descritas en párrafos anteriores para administración tópica sobre la piel pueden también usarse en relación con la administración tópica o cerca de la parte del cuerpo que se va a tratar. Las composiciones se pueden adaptar para aplicación directa o para aplicación por medio de dispositivos de liberación de fármaco especiales, tales como vendajes o, como alternativa, yesos, compresas, esponjas, tiras u otras formas de material flexible adecuado.

Dosificaciones y duración del tratamiento Debe entenderse que los fármacos de la combinación se pueden administrar de forma concomitante, bien en la misma o en diferente formulación farmacéutica, o secuencialmente. Si hay administración secuencial, el retraso en la administración del segundo (o adicional) ingrediente activo no debe ser tal que se pierdan los beneficios del efecto eficaz de la combinación de los ingredientes activos. Un requisito mínimo para una combinación de acuerdo con esta descripción es que la combinación debe estar destinada al uso combinado con el beneficio del efecto eficaz de la combinación de los ingredientes activos. El uso pretendido de una combinación se puede deducir mediante instalaciones, condiciones, adaptaciones y/u otros medios auxiliares usando la combinación de acuerdo con la invención.

Aunque los fármacos activos de la presente invención se pueden administrar en dosis divididas, por ejemplo dos o tres veces al día, se prefiere una única dosis diaria de cada fármaco en la combinación, siendo más preferida una única dosis diaria de todos los fármacos en una única composición farmacéutica (forma de dosificación unitaria).

La expresión "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente pequeñas (tales como cápsulas, comprimidos o cilindros de jeringuilla cargados) adecuados como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, de modo que cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material o materiales activos calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un vehículo farmacéutico requerido.

La administración puede ser de una a varias veces al día durante varios días a varios años e, incluso, puede ser durante toda la vida del paciente. En la mayoría de los casos estará indicada la administración crónica, o al menos repetida periódicamente a largo plazo.

Adicionalmente, la información farmacogenómica (el efecto del genotipo sobre el perfil farmacocinético, farmacodinámico o de eficacia de una sustancia terapéutica) sobre un paciente concreto puede afectar a la dosificación usada.

Excepto cuando se responde a casos de enfermedad de EA especialmente deteriorantes, en donde se pueden requerir dosificaciones más altas, la dosificación referida de cada fármaco en la combinación normalmente residirá dentro del intervalo de dosis no superiores a la prescrita normalmente para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo o cuando se ha demostrado que son seguras en estudios clínicos de tamaño grande de fase 3.

Por ejemplo, la dosificación más preferida corresponderá a cantidades del 1 % hasta el 10 % de las normalmente prescritas para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo. fenformina por vía oral de aproximadamente 0,5 a 5 mg al día y rifabutina por vía oral de aproximadamente 6 a 60 mg al día fenformina por vía oral de aproximadamente 0,5 a 5 mg al día y arabitol por vía oral de aproximadamente 50 a 500 mg al día. tadalafilo por vía oral de aproximadamente 0,05 a 0,5 mg al día y omeprazol por vía oral de aproximadamente 0,4 a 4 mg al día. cilostazol por vía oral de aproximadamente 1 a 10 mg al día y omeprazol por vía oral de aproximadamente 0,4 a 4 mg al día. - fenformina por vía oral de aproximadamente 0,5 a 5 mg al día y dasatinib por vía oral de aproximadamente 1 a 10 mg al día dasatinib por vía oral de aproximadamente 1 a 10 mg al día y acamprosato por vía oral de aproximadamente 7 a 70 mg tres veces al día dasatinib por vía oral de aproximadamente 1 a 10 mg al día y terbinafina por vía oral de aproximadamente 2,5 a 25 mg una o dos veces al día Debe entenderse que la cantidad del fármaco administrado en realidad deberá determinarla un médico a la luz de circunstancias relevantes, incluida la afección o afecciones a tratar, la composición exacta que se va a administrar, la edad, el peso y la respuesta de cada paciente individual y la gravedad de los síntomas del paciente y la vía de administración elegida. Por tanto, con los intervalos de dosificación anteriores se pretende dar unas directrices generales y un soporte para las enseñanzas de la presente memoria, pero no están destinados a limitar el alcance de la invención.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no como limitación.

Ejemplos Validación del fármaco usando ensayos in vitro Los ensayos in vitro son una potente herramienta para mejorar los fármacos y sus combinaciones que actúan sobre las vías implicadas en la EA. Los fármacos de la presente invención, y sus combinaciones, se optimizan mediante la acción en ensayos in vitro específicos adaptados de acuerdo con la red de EA identificada en la presente invención. Posteriormente, estas moléculas o sus combinaciones podrían analizarse en un modelo in vivo de EA.

Estos ensayos in vitro se inicial con el estudio del nivel de expresión del gen de APP, seguido por los ensayos del potencial neuroprotector de los fármacos sobre las células expuestos al efecto tóxico de la proteína Abeta. Los fármacos en las vías implicadas podrían analizarse individualmente, seguido por ensayos de su acción en combinación. En la etapa posterior, las combinaciones más eficaces que actúan sobre las dianas en vías individuales se combinan y someten a ensayo en los ensayos neuroprotectores.

La regulación de la expresión de APP representa un importante punto de entrada para el tratamiento de la EA, ya que está situado antes de la generación de fragmentos tóxicos concretos y su acción sobre múltiples sistemas cerebrales, que, en última instancia, tienen como resultado la destrucción de funciones cognitivas.

En la EA, la proteína forma agregados de láminas ß de la proteína Abeta fibrilar (amiloide). El cambio conformacional de la forma soluble a fibrilar parece ser un acontecimiento espontáneo que aumenta con las concentraciones crecientes de Abeta, por lo que cualquier producción de mayores cantidades de Abeta con respecto a lo normal (o la producción de formas más grandes, menos solubles de Abeta) tenderá a incrementar la formación de placas. Una vez que la placa Abeta ha comenzado a formarse, otras moléculas pueden interaccionar con la placa naciente para producir, al final, la placa madura con sus áreas asociadas de muerte celular neuronal. Considerando este hecho, los inventores han dado prioridad a los ensayos de los efectos de los fármacos sobre la viabilidad de las células expuestas a la proteína ß amiloide.

Cultivo de células PC12 Células PC12 (feocromocitoma de rata, ATCC ref: CRL-1721 ) de la ATCC (ATCC CRL1721 ) se descongelaron rápidamente en agua a 37 °C. El sobrenadante se introdujo inmediatamente en 9 mi de un "medio de proliferación de PC12" que contienen medio Eagle modificado de Dulbecco DMEM-FI2 (Pan Biotech ref: P04-41450) con 15 % de suero de caballo inactivado con calor (Invitrogen ref: 16050-130), 2,5 % de suero bovino fetal (FBS; Invitrogen ref : 16000036), 1 % de penicilina 10.000 U/ml y estreptomicina 10mg/ml (PS ; Pan Biotech ref: P06-07100) y 1 % de L-glutamina 200mM (Pan Biotech ref: P04-80100).

Las células se centrifugaron (00 ciclos/min, 4 °C durante 5 min) y se añadieron en 5 mi de "medio de proliferación de PC12", se contaron las células viables con una celda Malassez usando el ensayo de exclusión por rojo neutro (Sigma).

A continuación, las células se sembraron a 3.104 células por cm2 en "medio de proliferación de PC12" en matraces de plástico de 75 cm2 (Greiner Ref: 658175) revestidos con poli-L-lisina (10 µg/ml, Sigma Ref: P2636).

El medio se cambió en días alternos. Tras 3 días de cultivo, cuando las células alcanzaron un 80 % de confluencia, se lavaron en HBSS sin calcio y magnesio (Pan Biotech Ref: P06-33500) y se incubaron con tripsina EDTA, (0,05 %, Pan Biotech Ref: P10-023100). La reacción enzimática se detuvo con medio de proliferación de PC12 añadido por 0,5 mg/ml de ADNasa 1 de grado 2 (Pan Biotech Ref: T60-37780100). Después, las células PC12 se centrifugaron (800 ciclos/min a 4 °C durante 10 min) y las células se sembraron a la densidad de 2,9 104 por cm2 en matraces de cultivo de 175 cm2 (Greiner Ref: 661195) pre-revestidos con poli-L-lisina.

Intoxicación y ensayo de viabilidad MTT Las células PC12 (pase n° 2) se siembran sobre la base de 3300 células por cm2 en placas de 96 pocilios (Greiner Ref: 655 180) pre-revestidos con poli-L-Lisina (Sigma) medio neurobasal (Invitrogen, Ref: 211 03049) que contiene B27 (2 %, Invitrogen, Ref: 211 03049), penicilina (50 U/ml)-estreptomicina (50 µg/ml) y glutamina (1 %) y 50 ng/ml de NGF (Sigma Ref: N1408). NGF permite que las PC12 se diferencien en células simpáticas similares a las neuronas.

Tras 5 días de cultivo, el medio se cambia con neurobasal con NGF (50 ng/ml), B27 sin antioxidante, glutamina y antibióticos. Tras 24 horas, las células se incuban durante 1 hora con fármacos a 5 concentraciones, 6 pocilios por condición. Tras 1 hora de pre-incubación, las células se intoxican con 10 µ? de beta-amiloide (25-35; Sigma) junto con fármacos en el medio de cultivo celular. 24 horas después, se lavan las células una vez con PSB (Pan Biotech, Ref: P04-36100) y se evaluó la supervivencia de las células PC12 mediante el ensayo de viabilidad con MTT (3,[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazoliubromuro).

Cultivo de células neuronales corticales Neuronas corticales primarias de rata se cultivan tal como han descrito Singer et al., 1999. Brevemente, mediante dislocación cervical se sacrifica a las ratas hembra preñadas de 15 días de gestación (ratas Wistar Janvier) y se extraen los fetos de útero. Se retira la corteza y se coloca en medio helado de Leibovitz (L15; Invitrogen) que contiene 1 % de Penicilina-estreptomicina (PS; Invitrogen) y 1 % de seroalbúmina bovina (BSA; Sigma). La corteza se disocia mediante tripsinización durante 20 min a 37 °C (Tripsina EDTA IX; Invitrogen) diluidas en PBS sin calcio y sin magnesio. La reacción se detiene mediante la adición de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Invitrogen) que contiene ADNasa I de grado II (0,1 mg/ml Roche Diagnostic) y 10 % de suero bovino fetal (FCS; Invitrogen).

Después, las células se disocian mecánicamente mediante 3 pases a través de una pipeta de 10 mi. Después, las células se centrifugan a 180 x g 10 min a 10 °C. Se desecha el sobrenadante y las células del sedimento se resuspenden en un medio de cultivo definido constituido por Neurobasal (Invitrogen) suplementado con B27 (2 %; Invitrogen), L-glutamina (0,2 mM; Invitrogen), 1 % de solución PS y 10 ng/ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, Pan Biotech). Las células viables se cuentan en un citómetro de NEubauer usando el ensayo de exclusión con azul tripán. Las células se siembran a una densidad de 30.000 células/pocilio en placas de 96 pocilios (los pocilios se pre-revisten con poli-L-lisina (10 µg ml; sigma) y se cultivan a 37 °C en una atmósfera de aire humidificado (95 %)/C02 (5 %).

Tras 6 días de cultivo, las células se incuban con fármacos (5 concentraciones). Tras 1 hora, las células se intoxican con 20 µ? del ß-amiloide (25-35; Sigma) en medio definido sin BDNF pero junto con los fármacos. Las neuronas corticales se intoxican durante 2 días. El BDNF (10 ng/ml) se usa como control positivo (neuroprotector).

Ensayo de actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) Tras 2 días de cultivo, se recoge el sobrenadante y se analiza con el kit de detección de citotoxicidad (LDH, Roche Applied Sciences). Este ensayo colorimétrico para la cuantificación de la muerte celular se basa en la medición de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada del citosol de células dañadas al sobrenadante. La densidad óptica (DO) se evalúa mediante espectrofotometría a 492 nm de longitud de onda mediante un aparato multiscan (Thermo, Ref Ascent). Los resultados se expresan en porcentaje de viabilidad celular en comparación con el control negativo (vehículo).

Resultados Los resultados presentados en las Figura 1 y 2 se extraen de dos cultivos independientes, 6 pocilios por afección. Todos los valores se expresan en forma de la media ± e.e.m.. Con los datos brutos se realiza un análisis con la prueba bilateral t de Student. Los resultados se expresan en porcentaje de la longitud de las neuriras en comparación con el control (vehículo).

Las células PC12 diferenciadas con NGF se incuban con fármacos una hora antes de intoxicar con ?ß25-35 10µ? de 24 horas de duración.

Un día después de esta incubación se cuantifica la viabilidad de PC12 diferenciadas con NGF usando un ensayo MTT. Los inventores han observado que 2 fármacos ejercen claramente un efecto protector contra esta intoxicación por A fí>25.35 (Fig. 1).

Las neuronas corticales primarias de rata se incuban con fármacos una hora antes de la intoxicación con ?ß25-35 20 µ? que dura 2 días. Dos días después de esta incubación se cuantifica la liberación de LDH en el medio de cultivo, lo que refleja el nivel de muerte celular. Los inventores han observado que 3 fármacos ejercen claramente un efecto protector contra esta intoxicación por A ß25-35 (Fig. 2).

Ensayos in vivo Los compuestos y sus combinaciones activas en los ensayos in vitro se han analizado en un modelo in vivo de enfermedad de Alzheimer. La sobreexpresión de los transgenes de la proteína precursora de beta amiloide (APP) humana mutante ligada con la enfermedad de Alzheimer ha sido el medio más fiable de estimular el depósito de Abeta en los cerebros de ratones transgénicos que sirvieron como modelos de enfermedad EA en numerosos estudios. A medida que envejecen, estos ratones con APP mutante desarrollan una patología amiloide sólida y otras características similares a la EA, incluidos disminución de la densidad sináptica, gliosis reactiva y algunos déficit cognitivos. Muchos modelos de ratones con APP mutante muestran pocas pruebas de pérdida neuronal franca y patología de ovillos neurofibrilares (ONF). Los ratones hemicigotos para este transgen BRI-Abeta42 son viables y fértiles con un ciclo de vida normal. El ARNm de BRI-Abeta42 transgénico se expresa en un patrón característico de, promotor de la proteína prión de ratón; mayores niveles de expresión del transgen se detectan el las células del gránulo cerebelar y el hipocampo, seguidos por la corteza, el puente troncocenfálico, el tálamo y el mesencéfalo.

En la proteína de fusión transgénica, Abetal -42 se condensa con el extremo C de a proteína BRI en el sitio de escisión de tipo furina, de modo que la escisión tiene como resultado una eficiente secreción de Abetal -42 en la luz del espacio extracelular. Por tanto, estos ratones expresan de forma específica la isoforma de Abetal -42. Los ratones BRI-Abeta42 hemocigóticos acumulan beta amiloide ¡nsoluble en detergente con la edad y desarrollan placas nucleadas en el cerebelo ya a los 3 meses de edad. El desarrollo de patología del prosencéfalo se produce más tarde, las placas Abeta extracelulares no están presentes de forma consistente en el hipocampo y las cortezas entorina/piriforme hasta los 12 meses de edad Los depósitos de beta amiloide (placas nucleadas) se pueden observar ya a los 3 meses en la capa molecular del cerebelo de ratones transgénicos y se convierte en más pronunciado con la edad; se observan placas extracelulares ocasionales en las cortezas entorina/piriforme y el hipocampo a los 6 meses de edad, pero no se encuentran de forma consistente hasta > 12 meses de edad. Los ratones más viejos muestran una patología más extendida con placas nucleadas y difusas en el cerebelo, la corteza, el hipocampo y el bulbo olfatorio. Las placas amiloides extracelulares muestran densos núcleos amiloides con fibrillas irradiantes; muchos haces de neuronas distróficas se observan en la periferia de estas placas. La gliosis reactiva se asocia con las placas.

Tratamientos farmacológicos Los ratones Tg (Pmp-ITM2B /APP695*42) AI2E me transgénicos (57) se han obtenido en Jackson Laboratory (http://jaxmice.jax.org/strain/007002.html). Los ratones con los niveles en plasma más elevados de Abeta42, línea BRI-Abeta42A (12e), se han mantenido en un fondo mixto con B6C3. Los ratones transgénicos machos adultos tienen acceso libre a alimento y agua. De acuerdo con un protocolo aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committee, se han pesado a los ratones y se inyectó i.p. o alimentaron a la fuerza una vez al día durante de 10 a 20 semanas consecutivas con una solución control (placebo) o fármacos PXT, preparados a dosis diferentes.

Análisis de la supervivencia Las tasas de supervivencia se han analizado usando procedimientos de Kaplan-Meier. Se han usado procedimientos de Holm-Sidak (post hoc) para todos los ensayos pareados de comparación múltiple. Las muertes extrañas se censuran. Todas las comparaciones se han realizado entre camadas para limitar cualquier efecto potencialmente confuso a partir de diferencias básicas en las cepas.

Ensayos conductuales Los ensayos conductuales se diseñaron y realizaron de acuerdo con los procedimientos publicados por varios autores (44-47).

Aprendizaje y memoria espacial en el laberinto de Morris Water (MWM) Este experimento se realiza en una piscina circular, de 90 cm de diámetro, hecha de plástico blanco y llena con agua de color lechoso. Una plataforma de escape de 8 cm de diámetro, hecha de plástico transparente, se sumergió 0,5 cm debajo del nivel de agua. Se proporcionan pistas visuales mediante diferentes formas geométricas impresas en letras de tamaño A4 y se colocan en las 4 paredes adyacentes (la distancia desde la piscina era de 50 a 70 cm). En cada ratón se realizaron cuatro ensayos diariamente (intervalo de 5 a 7 minutos entre ensayos, un total de 16 ensayos) durante 4 días. Cada ensayo se realizó desde uno de cuatro puntos de partida diferentes. El movimiento de los ratones se monitoriza usando Videotrack Software (View Point). Se ha determinado el tiempo necesario para colocar la plataforma de escape (latencia de escape; hasta 60 segundos). Después de colocar la plataforma, se permitió al ratón sentarse en ella durante 15 segundos. Los ratones que no encontraron la plataforma en 60 segundos fueron guiados a ella y se les dejó estar en ella durante 15 segundos. En el registro se introdujo una latencia de 60 segundos para este caso. Se realizó la media de los cuatro ensayos al día para el análisis estadístico, excepto por el primer ensayo el día 1. El día 9 (5 días después del último entrenamiento), los ratones se han sometido a un ensayo sonda de 60 segundos en el que se retira la plataforma y se deja que los ratones la busquen. El tiempo que cada animal tarda en cada cuadrante se registra (tiempo de búsqueda por cuadrante). Se han usado varios grupos de ratones macho a 3, 7, 10 y 12 meses.

Unos pocos ratones han mostrado un comportamiento de inmovilidad (p. ej., se quedan inmóviles en el agua y rechazan nadar) que interfirió considerablemente en el ensayo; se excluyó a estos animales del análisis de datos.

Todos los ensayos conductuales se realizan en un ambiente tranquillo y con reducción de luz.

Ensayo de la memoria de trabajo en el laberinto con agua de brazos radiales Esta medida sensible basada en la cognición de la memoria de trabajo se ha obtenido con ayuda del aparato constituido por una piscina llena de agua de 100 cm de diámetro (también usada para el laberinto de agua de Morris y las tareas de reconocimiento de plataforma) equipada con un inserto de aluminio para crear seis brazos de nado distribuidos radialmente. Los ensayos constan de cinco ensayos de 1 minuto por sesión diaria, durante 9-12 días consecutivos. Al principio de cada sesión, se coloca una plataforma transparente sumergida en el extremo de uno de los seis brazos (seleccionado al azar, cambiado a diario). Para cada uno de los primeros cuatro ensayos de adquisición, se introduce al animal en uno de los brazos que no contienen la plataforma (secuencia aleatorizada) y se les deja buscar la plataforma. Durante el ensayo de 60 s, cada vez que el animal entra en otro brazo que no contiene la plataforma, se le devuelve suavemente a su lugar de partida y se registra un error. Después del cuarto ensayo, se deja descansar al animal durante 30 minutos, seguido por un quinto ensayo (retención), que se inicia en el último brazo de nado que contiene la plataforma. El número de errores (elecciones incorrectas del brazo) y la latencia de escape (tiempo para llegar hasta la plataforma, máximo 60 s) se registran para cada ensayo.

Aprendizaje y memoria de referencia espacial en el ensayo de la plataforma circular Este ensayo de tareas basado en la cognición se realiza con la ayuda del aparato constituido por una plataforma circular de 69 cm que tiene 16 orificios de "escape" espaciados de forma equidistante alrededor de la circunferencia. Se instala un refugio de escape debajo de uno de los agujeros y rodeando a la plataforma una cortina negra, sobre la cual se colocan varias pistas visuales. El animal se coloca en el centro de la plataforma al principio de un único ensayo de 5 minutos y se presentan estímulos de aversión (luces brillantes, aire con ventilador). Se registra el número total de errores (husmeos en los agujeros sin escape) y la latencia del escape (tiempo hasta alcanzar el agujero de escape).

Capacidad de reconocimiento en el ensayo de reconocimiento de la plataforma Esta tarea de búsqueda basada en la cognición evalúa la capacidad de reconocimiento y de identificación de objetos. El objeto diana consiste en una plataforma circular de 9 cm de diámetro equipada con una enseña negra de 10 cm x 40 cm, que se coloca a 0,8 cm por encima de la superficie del agua en una piscina circular de 100 cm de diámetro. El ensayo consta de cuatro ensayos de 60 s al día en cada uno de cuatro días consecutivos. Cada día, el objeto diana se coloca en un cuadrante diferente de la piscina para cada ensayo y el animal se libera en el mismo lugar a lo largo de la circunferencia de la piscina para los cuatro ensayos. La latencia total (máximo 60 s) se registra para cada ensayo.

Examen de Irwin modificado Se usa un filtro exhaustivo, modificado de Irwin, para determinar si alguno de los ratones exhibía deteriores fisiológicos, conductuales o sensorimotores relacionado con su genotipo. Para explorar las capacidades motoras, la coordinación y la fuerza muscular, los ratones se colocan en un alambre tensado entre dos columnas de 30 cm de altura y se evalúa su capacidad para mantener el equilibrio sobre el alambre. Además, se determina su capacidad para agarrarse y colgarse del alambre con las cuatro patas durante al menos 5 segundos y de volver a escalar al alambre.

Cuantificación del depósito amiloide vascular Para cuantificar la angiopatía amiloide cerebral (AAC), secciones de 5 µ?? incluidas en parafina a intervalos de 30 µ?t? a través de las leptomeninges de la corteza cerebelar o parietal se someten a inmunotinción con anticuerpo Ab9 biotinilado (anti-?ß?-?ß, 1 :500) durante la noche a 4 °C (n= 5-7 ratones por genotipo en cada grupo de edad, n= 6 secciones por ratón). Los vasos sanguíneos cargados positivamente se evalúan visualmente usando el sistema de puntuación modificada de Vonsattel (62). La puntuación de la gravedad de AAC se calcula multiplicando el número de vasos AAC con el grado de gravedad de la AAC.

Histología: Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia Ratones Tg y WT de 3 a 12 meses de vida se anestesian y perfunden transcardialmente de modo secuencial con un 0,9 % de NaCI y un 4 % de paraformaldehído en 0,1 mol/l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) o un 10 % de formalina y un 4 % de paraformaldehído en 0,1 mol/l de PBS (pH 7,4). Se extraen los cerebros y las médulas espinales y se almacenan en paraformaldehído al 4 %. Algunas muestras se incluyen en parafina y se cortan en un microtomo de deslizamiento a un espesor de 10 µ?t?. Se cortan criosecciones (14 µ??) en un crioestat y se montan en portas recubiertos con aluminio— cromo. La peroxidasa endógena se inactiva tratando la sección con metanol que contiene un 0,3 % de H202 durante 30 minutos. Las secciones se bloquean en un 10 % de suero de caballo. Se usan anticuerpos primarios y se incuban durante la noche a 4 °C en presencia de un 1 % de suero de caballo. Todos los anticuerpos biotinilados o acoplados a fluoresceína, rojo Texas y AMCA, fluorocromos, kit ABC y 3.3'-diaminobencidina como cromógeno para la actividad peroxidasa proceden de Vector Laboratories La incubación con el anticuerpo secundario se realiza a temperatura ambiente durante 1 hora. Todas las etapas de lavado (3-10 minutos) y la dilución del anticuerpo se realizan usando solución salina tamponadas con fosfato (0,1 ml/l de PBS, Ph 7,4) o solución salina tamponada con Tris (0,01 mol/l de Tris, 0,15 mol/l de NaCI, pH 7,4). La incubación con el complejo ABC y la detección con 3,3'-diaminobencidina se llevan a cabo de acuerdo con el manual del fabricante. Se realiza contratinción con hematoxilina de acuerdo con procedimientos convencionales. Para cada determinación se usa un mínimo de tres ratones por genotipo, edad y sexo (49).

Preparación de extractos cerebrales Los cerebros se extraen rápidamente en hielo entre 90 y 120 minutos después de la última inyección y se congelan hasta -80 °C. El hemisferio cerebral derecho de cada ratón se pesa después de congelar. El análisis de la masa del hemisferio por mediana de la desviación absoluta permite a los inventores excluir las muestras con más de 4 desviaciones absolutas con respecto al resto del grupo. Los hemisferios cerebrales se homogeinizan y los lisados cerebrales que contienen la proteína total se preparan de acuerdo con las instrucciones del fabricante para los kit de ensayo enzimático (R&D Systems, Inc.). En resumen, las cortezas cerebrales se homogeinizan en 800 µ? de tampón de extracción 1x con bajo contenido en sales (kit de R&D) y se incuban en hielo durante 10 min. Los homogeneizados se centrifugan a 13.000 g durante 15 min a 4 °C. La concentración de proteínas en cada muestra se estima de acuerdo con un ensayo derivado de biuret (Pierce).

Los niveles de APP, ?ß40 y ?ß42 se miden mediante inmunotransferencia de tipo western y técnicas de ELISA de tipo sándwich, respectivamente, como se ha descrito (41 ). De forma adicional, las actividades de las a-, ß- y ?-secretasas se pueden medir en los mismos extractos.

Ensayo de los niveles de APP total en extractos de corteza cerebral de ratón Una cantidad de extractos cerebrales con igual proteína se carga en cada gel, 30 µg por calle por muestra. Cada gen contenía ocho tratamientos: control; fármaco 1 dosis de 7,5 mg/kg; y fármaco 2 en varias dosis. Para minimizar la variación intra-gel, cada gel contenía tres grupos de todos los grupos de tratamiento. Cada transferencia se sonda con anticuerpo 22C11. Asimismo, cada transferencia se sonda con el anticuerpo de ß-actina pata la normalización de la eficiencia de la transferencia. La intensidad de la señal de la banda de APP se normaliza con la de la ß-actina. Se cargan dos "controles" de muestra en cada gel/transferencia para someter a ensayo la variación de una transferencia a otra. El análisis de tras transferencias se realiza de dos formas: Por transferencia (n= 3) para analizar la variación de un gel a otro; y transferencias combinadas (n = 9 ó 10) como se ha descrito (50-51 ). El análisis por transferencia con n= 3 muestra la misma tendencia que el análisis final con n= 9 ó 10. Se presentan los resultados del análisis combinado.

ELISA de tipo sándwich de ?ß Para los ELISAS de ?ß en el cerebro, se determinan los niveles de ?ß en el prosencéfalo y el romboencéfalo de forma independiente, el bulbo olfatorio se excluye del análisis. Para el análisis de ?ß en plasma se obtiene sangre en tubos revestidos con EDTA tras punción cardíaca. Las muestras de sangre se centrifugan a 3000 rpm durante 10 min a 4 °C y el plasma se alícuota y almacena a -80 °C hasta que se usa. Los niveles de ?ß se determinan mediante ELISA de tipo sándwich terminal específico usando Ab9 (ab anti-?ß?-16) como el Ab de captura para ?ß40, 13.1.1-HRP (Ab anti-AB35-40) como Ab de detección para ?ß40, 2.1.3 (Ab anti^35-42) como Ab de captura para ?ß42 y Ab9-HRP como Ab de detección para ?ß42 (n = 5-7 ratones por genotipo en cada grupo de edad) Los niveles de ?ß se normalizan a los resultados previos usando los mismos grupos de ratones como controles internos para minimizar la potencial variabilidad del ELISA, como se ha descrito (41 ).

Transferencia de tipo western Muestras de prosencéfalo ultracongelado se homgeneizan en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) Boston BioProducts, Worcester, MA) con 1 % de mezcla de inhibidor de la proteasa (Roche). EL homogeneizado se centrifuga a 100.000 x g durante 1 hora a 4 °C. La concentración de proteínas en los sobrenadantes se determina usando el ensayo proteico BCA (Pierce). Las muestras de proteína (20 µg) se pasan a geles Bis-Tris 12 % XT o geles Bis-Tris 4-12 % XT (Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfieren a membranas de nitrocelulosa de 0,2 µ??. Las transferencias se someten a microondas durante 2 min en PBS 0,1 M dos veces y se sondan con Ab 82E1 (anti-?ß·^, 1 :1000; IBL, Gunma, Japón) y 20 aminoácidos en C terminal anti-APP (1 ;1000) como se ha descrito (41 ). 1000; IBL, Gunma, Japan) and anti-APP C-terminal 20 amino acids (1 : 1000) as described (41 ). Las transferencias se extraen y se vuelven a sondar con anti^-actina (1 :1000; Sigma) como control de carga. La intensidad relativa de la banda se mide usando el software ImageJ. Cuantificación del depósito amiloide parenqu i matosos Hemicerebros se fijan en inmersión en 10 % de formalina y se procesan para incluir en parafina. Las secciones de tejido cerebral (5 µ?t?) se inmunotiñeron con anticuerpo (Ab) anti-?ß total. Las secciones se someten a contratinción con hematoxilina. Seis secciones por cerebro desde el hipocampo, la corteza piriforme (bregma, -1 ,70 a -2,80 mm), o cerebelo (paraflóclulo, cruz ensiforme y lóbulos simples; bregma -5,40 a -6,36 mm) se usan para cuantificación (n = 5-7 ratones por genotipo en cada grupo de edad). La carga de la placa de ?ß se determina usando el software MetaMorph (Molecular Devices, Palo Alto, CA). Para la cuantificación de las placas nucleadas se tiñen secciones seriadas de las analizadas para la carga de ?ß con tioflavina S (TioS) y se cuenta el número de placas positivas pata TioS en el hipocampo, corteza entorina/piriforme o el cerebelo. Todos los análisis anteriores se realizan de forma enmascarada.

Análisis estadístico de los datos in vivo.

Los resultados de todos los experimentos se analizan con STATISTICA 8.0 (Statsoft).

Los niveles de ?ß, la carga de la placa amiloide y la gravedad de AAC se analizó usando un ANOVA con el ensayo post hoc de comparación múltiple de Holm-Sidak o dos pruebas t de Student. Si el conjunto de datos no cumple las suposiciones del ensayo parámetrico, se realiza bien el ensayo de Kruskal-Wallis, seguido por la comparación múltiple post hoc de Duna o la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. Para analizar si los niveles de ?ß en los ratones bitransgénicos eran consistentes con una suma aditiva de los niveles de ?ß en los hermanos transgénicos se usa un ensayo de regresión lineal múltiple sin intersección. Todas las comparaciones se realizan entre hermanos de carnada.

La modelización de la respuesta al fármaco se realiza excluyendo las muestras control (0 mg/kg). La DE50 corresponde a la dosis requerida (mg/kg) para inducir un 50 % de la respuesta máxima inducida por fármaco en los experimentos. Se calcula usando el modelo de ecuación de Hill para el log de la DE50.

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Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una composición caracterizada porque comprende una combinación de al menos dos compuestos escogidos del grupo constituido por acamprosato, amlodipina, cilostazol, leflunomida, metimazol, fenformina, prilocaína, sulfisoxazol, tadalafilo, terbinafina, zonisamida y rifabutina, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para administración simultánea, por separado o secuencial.

2. Una composición caracterizada porque comprende una combinación de al menos dos compuestos escogidos del grupo constituido por acamprosato, amlodipina, cilostazol, leflunomida, metimazol, fenformina, prilocaína, sulfisoxazol, tadalafilo, terbinafina, zonisamida y rifabutina, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, en donde dicha composición inhibe la respuesta de estrés celular inducida en trastornos neurodegenerativos seleccionados del grupo constituido por la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la esclerosis múltiple (EM).

3. La composición de la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende una combinación de al menos dos compuestos escogidos del grupo constituido por acamprosato, amlodipina, cilostazol, leflunomida, metimazol, fenformina, prilocaína, sulfisoxazol, tadalafilo, terbinafina, zonisamida y rifabutina, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para tratar la enfermedad de Alzheimer (EA).

4. Una composición caracterizada porque comprende al menos una de las siguientes combinaciones de fármacos, para administración combinada, por separado o secuencial. - un modulador de AMPK (preferentemente fenformina) y un inhibidor del canal de sodio SCN1A y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida), - un modulador de los receptores GABAérgicos y glutamatérgicos (preferentemente acamprosato) y un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina). - un inhibidor del canal de sodio SCN1A y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida) y un modulador del receptor de rianodina RYR3 (preferentemente prilocaína), - un modulador de AMPK (preferentemente fenformina) y un modulador del receptor de rianodina RYR3 (preferentemente prilocaína), - un modulador de AMPK (preferentemente terbinafina) y un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina), - un inhibidor del canal de sodio SCN1A y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida) y un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina), - un modulador del receptor de rianodina RYR3 (preferentemente prilocaína) y un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina). - un modulador de AMPK (preferentemente fenformina) y un auxiliar químico (preferentemente rifabutina), - un inhibidor del canal de sodio SCN1A y un activador de los canales de BK (preferentemente zonisamida) y un auxiliar químico (preferentemente rifabutina), - un modulador del receptor de rianodina RYR3 (preferentemente prilocaína) y un auxiliar químico (preferentemente rifabutina). - un modulador de RHOA (preferentemente terbinafina) y un auxiliar químico (preferentemente rifabutina), - un modulador de AMPK (preferentemente fenformina) y un inhibidor de las fosfodiesterasas PDE11A y PDE4A, PDE5A (preferentemente tadalafilo).

5. La composición de la reivindicación 1 para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado en un sujeto que lo necesite, caracterizada porque dicha composición comprende al menos una de las siguientes combinaciones de fármacos para administración combinada, por separado o secuencial: - fenformina y zonisamida, - acamprosato y terbinafina, - zonisamida y prilocaína, - fenformina y prilocaína, - fenformina y terbinafina, - zonisamida y terbinafina, - prilocaína y terbinafina, - fenformina y rifabutina, - zonisamida y rifabutina, - prilocaína y rifabutina, - terbinafina y rifabutina, - fenformina y tadalafilo,

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha composición además comprende al menos un fármaco que inhibe la respuesta de estrés celular, para uso combinado, por separado o secuencial.

7. La composición de la reivindicación 6, caracterizada porque dicho al menos un fármaco que inhibe la respuesta de estrés celular se selecciona de un modulador de AMPK (preferentemente vidarabina), un inhibidor de ATP1A1 (preferentemente omeprazol), un inhibidor de la actividad de GSK3B (preferentemente seleccionado de albuterol y metaraminol), un inhibidor de IMPDH1 e IMPDH2 (preferentemente tioguanina), un inhibidor de MTOR (preferentemente rapamicina), un inhibidor de PDE4D (preferentemente milrinona), un activador de PRKG1 (preferentemente cilostazol), un modulador de RHOA (preferentemente alendronato), un inhibidor de SCN1A/B (preferentemente fosfenitoína), un inhibidor de YES1 y SRC (preferentemente dasatinib), un activador de la autofagia (preferentemente trehalosa), y/o auxiliares químicos (preferentemente seleccionados de fenilbutlrato sódico, arabitol y manitol).

8. La composición de la reivindicación 6, caracterizada porque dicho al menos un fármaco que inhibe la respuesta de estrés celular se selecciona del fármaco o fármacos que se unen o modulan la actividad de una proteína codificada por un gen seleccionado de ACCN1, ADRA1A, ADRB2, AFADINA, AKT, ALDH2, ALOX12, AMPK, APBA1, APBA2BP, APG1, APG12, APOER2, ATG5, ATG7, ATM, ATP1A1, ATP2A3, ATP2B1, ATP6V1C1, ATR, BACE1, BAD, BAX, BCAR1, BCL2, BECLIN1, canales de BK (KCNMA1, KCNMB1), BRCA1, CACNA1C, CALCINEURINA, CD36, CD44, CDH1, CDH2, CDK5, CDKN1A, CHK1, CHRM1, CHRM2, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CK1, CTNNA2, CTNNB1, CULLIN1, CICLINA, DCC, DGKB, DGKH, DNAJB9, DOCK3, DRD2, EDNRA, ELAVL2, ERK1, ERK2, EZRINA, FAS, FKBP12, FKBP12.6, FOX03A, FZ2, GADD45, GNPTAB, GPC5, GRK2, GRK5, GRP170, GRIN2B, GRIN3A, GSK3B, HAS1, HAS2, HAS3, HIPK2, HSPAS, HSP90B1, HSPA5, HTR1A, IDE, IMPDH1, IMPDH2, INS, INSR, IRF1, ITB1, ITGA1, ITGB1, ITPR1, JNK1, LAMA1, MAD1L1, MAO, MCC1, MDM1, MME, MOESIN, MTOR, NADPH OXIDASA, NEDD9, NETRIN1, NFKB1, NHERF, NOS1, NOS2A, NOS3, PAELR, PAK1, PARK2, PCAF, PDE11A, PDE3A, PDE4D, PDE5, PDE6D, PI3K, PIK3C3, PKCA, PLCB1, PLD2, PLN, PML, POP2, PRDX5, PRDX6, PRKG1, PTPRG, PTPRM, PVRL1, RAC1, RACK1, RADIXINA, RHOA, ROR2, RTN1, RYR3, SAPK3, SCN1A, SCN1B, SCNN1D, SCNN1G, SH3BP5, SIL1, SLC8A1, SLC8A2, SLC8A3, SLN, SNCA, SNCAIP, SORBS2, SORCS2, SRC, SYN1, THBS2, TP53, TP63, TRPC3, TRPC4, TRPC5, UNC5C, VPS15, WNT1A, WNT5A, WWOX, XANTINA OXIDASA, y YES1.

9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha composición además comprende al menos un fármaco que modula la función sináptica, para uso combinado, por separado o secuencial.

10. La composición de la reivindicación 9, caracterizada porque dicho al menos un fármaco que modula la función sináptica se selecciona de alfentanilo amilorida amlodipina aztreonam, baclofeno, buclizina, bumetanida, buprenorfina, lidocaína, clorzoxazona, cinacalcet, difilina, eletriptán, ergotamina, flunitrazepam, imatinib, ketotifeno, pegaptanib, pentazocina, fenobarbital, pregabalina, propiltiouracilo, temazepam, tiagabina, topiramato, triamtereno y vigabatrina.

11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha composición comprende además al menos un fármaco que modula la angiogénesis para el uso combinado, por separado o secuencial.

12. La composición de la reivindicación 11, caracterizada porque dicho al menos un fármaco que modula la angiogénesis se selecciona del grupo constituido por ambrisentan, ácido aminocaproico, argatrobán, balsalazida, becaplermin, cabergolina, clopidogrel, desirudina, dihidroergotamina, eplerenona, fenoldopam, fludrocortisona, gemfibrozilo, hesperetina, leflunomida, L-histidina, liotironina, marimastat, meloxicam, mepacrina, metazolamida, montelukast, netilmicina, nitroglicerina, pirimetamina, sulfisoxazol, sunitinib, tietilperazina, tirofibán, topotecán y warfarina.

13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha composición se administra repetidamente al sujeto.

15. Un procedimiento de producir un fármaco para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado, caracterizado porque el procedimiento comprende una etapa de someter a ensayo un fármaco candidato para determinar la actividad sobre la respuesta de estrés celular y seleccionar los fármacos que inhiben la respuesta de estrés celular.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, caracterizado porque comprende una etapa de determinar si dicho fármaco se une a, o modula, la actividad de un gen o proteína tal como se ha enumerado en la reivindicación 8.

17. Un procedimiento de producir una composición para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado, caracterizado porque el procedimiento comprende preparar una combinación de un fármaco que modula la respuesta de estrés celular y un fármaco que modula la función sináptica o la angiogénesis, y formular dicha combinación para la administración simultánea, por separado o secuencial a un sujeto que lo necesite.

18. Un procedimiento de tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado, donde el procedimiento comprende administrar de forma simultánea, por separado o secuencialmente a un sujeto que lo necesite un fármaco que modula la respuesta de estrés celular y un fármaco que modula la función sináptica o la angiogénesis.

19. Una composición caracterizada porque comprende al menos amlodipina y prilocaína, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para administración simultánea, por separado o secuencial.

20. Una composición caracterizada porque comprende al menos amlodipina y/o prilocaína, o sales o profármacos o derivados o formulaciones de liberación sostenida de los mismos, para tratar la enfermedad de Alzheimer o un trastorno relacionado.