MX2010011384A - Sistema para la expresion de peptidos sobre la superficie bacteriana. - Google Patents

Abstract

Sistema de expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana caracterizado porque se utiliza como región de anclaje a la membrana la secuencia conservada de la proteína MSP1a de Anaplasma marginale.

Description

SISTEMA PARA LA EXPRESIÓN DE PÉPTIDOS SOBRE SUPERFICIE BACTERIANA La presente invención se encuentra dentro de los sectores biotecnológico, bioquímico, y químico-farmacéutico. El objeto de la invención es un método para exponer polipéptidos recombinantes expresados sobre la superficie bacteriana. Podrá ser aplicado en investigaciones básicas o aplicadas en biología molecular, bioquímica, biotecnología o en la producción de proteínas recombinantes para diversos fines.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La tecnología que permite la expresión de una proteína o péptido, uniéndola a la superficie celular, por ejemplo de microorganismos como bacterias o levaduras, tiene numerosas aplicaciones dependiendo del tipo de proteína expresada en la superficie, y por tanto, un enorme interés industrial.

Por eso, el interés por exponer proteínas o péptidos sobre la superficie de bacterias vivas ha ido en aumento en áreas de investigación bioquímica, de biología molecular y biotecnología. La exposición de proteínas heterólogas empleando motivos de anclaje a membrana de proteínas como los LamB, OmpA, PhoE, TratT, OprF, Oprl, FHA, INP, fimbrias, y AIDA-I y el sistema de auto-exposición han servido ya para expresar antígenos y enzimas. La proteína que se desea exponer tiene que ser fusionada con la proteína o proteínas de anclaje, que son a menudo proteínas de la superficie celular o fragmentos de éstas ("carrier proteins"), mediante una fusión N-terminal, una fusión C-terminal, o una fusión sándwich. Las características de la proteína de anclaje, la proteína expuesta y el método de fusión afecta la eficiencia de la expresión en la superficie de proteínas.

La expresión de proteínas en superficie tiene múltiples aplicaciones, incluyendo: a. el desarrollo de vacunas vivas, al exponer epítopos heterólogos de comensales humanos o células bacterianas patogénicas atenuadas para elicitar la respuesta de anticuerpos antígeno-específicos, b. la búsqueda de librerías de péptidos por unión secuencial y elusión o, más eficientemente por clasificación celular por fluorescencia {Fluorescence-activated cell-sorting, FACS), c. producción de anticuerpos expresando antígenos de superficie para obtener anticuerpos policlonales en animales, d. bioadsorventes para eliminar compuestos químicos perjudiciales y metales pesados, e. biocatálisis por inmovilización de enzimas, f. desarrollo de biosensores por anclaje de enzimas, receptores u otros componentes sensibles a señales para el diagnóstico, propósitos industriales o medioambientales, g. detección de cambios de aminoácidos en péptidos diana tras mutagénesis al azar.

Anaplasma margínale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) es un patógeno trasmitido por garrapatas que causa la anaplasmosis bovina, una enfermedad que ocasiona pérdidas económicas importantes en la producción ganadera. La proteína MSP1 a (por sus siglas del inglés Major Surface Protein 1 a) es una de las cinco proteínas principales de superficie conocidas de A. margínale y está involucrada en la adhesión del patógeno a los hospedadores y en las interacciones del patógeno con las garrapatas. Esta proteína ha evolucionado bajo una presión selectiva positiva y su tamaño molecular es diferente entre cepas de distintas áreas geográficas. Las variaciones se deben a que una secuencia de 23 a 31 aminoácidos consecutivos se repite distinto número de veces, en el extremo N-terminal, de la región que la proteína expone sobre la superficie bacteriana.

Se ha demostrado que MSP1a permite a la bacteria adherirse a los eritrocitos bovinos y a las células de garrapatas. El dominio de adhesión de la proteína ha sido identificado precisamente en la región variable del extremo N-terminal que contiene los péptidos repetidos. La MSP1 a también está involucrada en la transmisión de A. margínale por las garrapatas del género Dermacentor spp. y los péptidos repetidos del extremo N-terminal, que poseen epítopos celulares B, podrían estar involucrados en la respuesta protectiva del ganado frente a las infecciones por A. margínale. La garrapata Boophilus microplus (recientemente reclasificada como Rhipicephalus microplus) afecta considerablemente al ganado bovino de las regiones tropicales y subtropicales del planeta. El antígeno BM86, codificado por el gen Bm86, es una glicoproteína aislada de las células intestinales de R. microplus que ha sido utilizada en una vacuna contra las infestaciones por estas garrapatas. Un gen homólogo al Bm86, el Bm95, fue aislado también de una cepa de R. microplus (Cepa A) y su proteína codificante, la BM95, mostró capacidad protectora frente a un mayor número de cepas de garrapatas de diferentes regiones geográficas. Los primeros experimentos realizados por los inventores, caracterizaron la presencia de péptidos inmunogénicos en la proteína BM86. Posteriormente se demostró que estos péptidos eran los responsables de inducir la respuesta protectora del ganado vacunado frente a las infestaciones por garrapatas.

En la presente invención se demuestra que una proteína recombinante, compuesta por los péptidos inmunogénicos de BM95 fusionados con la región N-terminal de la proteína MSP1 a de A. margínale, se expone sobre la superficie de células vivas de E. coli y es reconocida por anticuerpos anti-BM86 y anti-MSP1a. Este sistema aporta un modelo novedoso de exposición de proteínas heterólogas sobre células vivas de bacterias y además sugiere la posibilidad de emplear bacterias recombinantes en estudios de inmunización del ganado frente a infestaciones de garrapatas.

Para el éxito de la expresión de la proteína en la superficie celular, el motivo de anclaje es el elemento más importante. Constituye el núcleo de esta tecnología la elección de un motivo capaz de expresar una proteína o péptido heterólogo en la superficie celular de forma efectiva. Una proteína de anclaje adecuada debe poseer los siguientes cuatro requerimientos: debe tener un transportador que permita a la proteína de fusión prematura pasar a través de la membrana interna; debe tener una fuerte estructura de anclaje para sostener las proteínas de fusión en la superficie celular; debe ser compatible con las secuencias externas a ser insertadas o fusionadas, y por último, debe ser resistente al ataque de las proteasas presentes en el medio o espacio periplásmico.

Los sistemas de expresión conocidos hasta el momento presentan desventajas, siendo la fundamental la limitación para la presentación en membrana de polipéptidos con diferente número y composición de aminoácidos, uno de los aspectos principales que aborda el objeto de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al empleo de una porción de la proteína MSP1 a de A. margínale para, dirigir la exposición de otros péptidos sobre la superficie celular, mediante su fusión N-terminal con esta proteína. Teniendo en cuenta el rango de tamaño natural de los péptidos repetidos en la región N-terminal de MSP1a (28-289 amino ácidos) y los ejemplos de realización expuestos en esta memoria, una ventaja de usar la proteína MSP1 a en lugar de otros motivos de anclaje de proteínas de membrana para exponer péptidos sobre la superficie celular, es la posibilidad de exponer polipéptidos de diferentes tamaños y composición de aminoácidos.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana, de aquí en adelante sistema de expresión de la invención, caracterizado porque comprende una región de anclaje a la membrana bacteriana y el péptido expuesto, donde se utiliza como región de anclaje a la membrana bacteriana cualquiera de las siguientes secuencias: Péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

Una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con la SEQ ID NO: 1.

De aquí en adelante, por "secuencia aminoacídica de la invención" se entiende la secuencia de aminoácidos de la porción de la proteína MSP1 a de Anaplasma margínale, o una proteína con una identidad de, al menos, el 80%, y más preferiblemente el 90%, el 95%, el 98%, y aún más preferiblemente el 99% con dicha porción de la proteína MSP1a, recogida en la SEQ ID NO: 1. Y se entenderá por "péptido expuesto" la secuencia de aminoácidos que se quiere expresar sobre la superficie bacteriana, y que está unida o fusionada a la secuencia aminoacídica de la invención.

El término "péptido", tal como se usa en la presente invención, incluye tanto la proteína de longitud completa, como las secuencias de polipéptidos y péptidos más cortas.

El término "polinucleótido" o "secuencia polinucleotídica", como aquí se usa, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos o bien desoxírribonucleótidos. Este término sólo se refiere a la estructura primaria de la molécula. Así, este término incluye ADN de cadena doble o sencilla, al igual que ARN de cadena doble o sencilla. También incluye todos los tipos de modificaciones conocidas (marcadores conocidos en la técnica, metilación, remates, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótidas como, por ejemplo, aquellas con uniones sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, triésteres de fósforo, amidatos de fósforo, carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (por ejemplo, tioatos de fósforo, ditioatos de fósforo, etc.), aquellos que contienen mitades colgantes, como, por ejemplo, proteínas (incluyendo por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercalantes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), al igual que formas no modificadas del polinucleótido. Por "secuencia polinucleotídica de la invención" se entiende la secuencia polinucleotídica que codifica para la secuencia aminoacídica de la invención, y que puede ser, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la bacteria en cuya superficie se expresa el péptido de interés es Escherichia coli (E. coli). Escherichia coli (E. coli), una bacteria gram negativa, anaerobia facultativa y no esporulada, con un genoma de aproximadamente 4,6 kb, es quizá el organismo procariota más estudiado por el hombre. Algunas cepas de esta bacteria son enormemente versátiles en laboratorio, tolerando muy bien la manipulación genética e incluso perdiendo su capacidad patogénica, por lo que se emplea como "organismo modelo" para el estudio de las estructuras, los mecanismos genéticos y fisiológicos y su extrapolación a gran número de microorganismos, incluida la célula eucariota.

En otra realización de este aspecto de la invención, el péptido expuesto no es MSP1.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción genética, de aquí en adelante construcción genética de la invención, que dirigiría la trascripción in vitro o intracelular de las secuencias polinucleotídicas del sistema de expresión de la invención, y comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a. secuencia de nucleótidos, preferentemente de doble cadena, que codifica la secuencia aminoacídica del sistema de expresión de la invención, o b. moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c. moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d. secuencia de nucleótidos de a), b), ó c), preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc..

Este método incluye los vectores de clonación y expresión que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos del sistema de expresión de la invención. Tales vectores de expresión incluyen secuencias de control adecuadas, tales como, por ejemplo, elementos de control de la traducción (como códigos de iniciación y de parada) y de la transcripción (por ejemplo, regiones de promotor-operador, sitios de unión). Los vectores conforme a la invención pueden incluir plásmidos y virus (comprendiendo bacteriófagos y virus eucarióticos), de acuerdo con procedimientos bien conocidos y documentados en la técnica, y pueden expresarse en una variedad de sistemas de expresión diferentes, asimismo bien conocidos y documentados en la técnica. Los vectores virales adecuados incluyen, baculovirus y también adenovirus y virus vacunales. Muchos otros vectores virales y no virales están descritos y son conocidos en la técnica.

Se conoce, así mismo, una variedad de técnicas que pueden utilizarse para introducir tales vectores en células procarióticas o eucarióticas para su expresión. Técnicas adecuadas de transformación o transfección están bien descritas en la bibliografía.

Las células hospedadoras eucarióticas o procarióticas transformadas o transfectadas, que contienen una molécula de ácido nucleico conforme a la invención, como se definió anteriormente, también forman parte de este aspecto de la invención.

Dado que las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas del sistema de expresión de la invención son afines en cuanto a su evolución, puede esperarse que la identidad global de los genomas al nivel de los aminoácidos, obtenidos de distintas cepas, poblaciones y/o individuos de Anaplasma margínale, y más concretamente a nivel de la secuencia aminoacídica que se recoge en la SEQ ID NO: 1 , sea de un 80% o mayor, y más preferiblemente de un 90% o mayor y más preferiblemente de un 95, un 98 o un 99% o mayor. La correspondencia entre la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 y la secuencia perteneciente a otro individuo u organismo se puede determinar por métodos conocidos en la técnica.

Múltiples de estos sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrook ef al., 1989) y forman parte de la presente invención.

En una realización particular de este aspecto de la invención, la construcción genética de la invención está incluida en un plásmido.

Los péptidos expuestos también pueden prepararse por expresión en una célula hospedadora que contiene una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que se transcribe a los péptidos, unida operativamente a una secuencia de control de la expresión, o un vehículo o vector de clonación de ADN recombinante que contiene tal molécula de ADN recombinante. Alternativamente, los péptidos pueden expresarse por inyección directa de una simple molécula de ADN en una célula hospedadora.

En otro aspecto de la invención se proporciona un método para elaborar el sistema de expresión de la invención, que comprende los siguientes pasos: a. Introducir la construcción genética de la invención, o un plásmido de la invención, en una célula hospedante, b. Incubar la célula hospedante según a. en un medio de reacción adecuado.

En una realización particular de este aspecto de la invención, la célula hospedante es E. coli.

En otro aspecto de la invención se proporciona un péptido recombinante, de ahora en adelante péptido recombinante de la invención, obtenible u obtenido a partir del sistema de expresión de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el péptido recombinante se obtiene a partir de la lisis de la célula hospedante que comprende el sistema de expresión de la invención, y su posterior purificación.

Los péptidos expuestos, pueden ser, por ejemplo pero sin limitarnos a ellos, péptidos antigénicos que actúan como vacunas para proteger contra futuras infecciones o para potenciar la respuesta inmune contra la infección en sujetos o animales ya infectados.

Como se ha comentado anteriormente, una posible ventaja de usar la proteína MSP1 a sobre lo descrito anteriormente acerca de emplear motivos de anclaje de proteínas de membrana para exponer proteínas sobre la superficie bacteriana, si se tiene en cuenta el rango de tamaño natural de los péptidos repetidos de MSP1 a (de 28 a 289 aminoácidos) y los resultados reportados en esta memoria, es la posibilidad de expresar y exponer sobre la superficie de las bacterias, péptidos de diferentes tamaños y composiciones.

Los péptidos expresados pueden presentar secuencias antigénicas protectoras. La expresión "antígeno protector", tal como se usa en la presente invención, define aquellos antígenos capaces de generar una respuesta inmune (inmunogénica) protectora del hospedador, es decir, una respuesta del hospedador, que conduce a la generación de moléculas efectoras inmunes, anticuerpos o células que esterilizan o reducen la tasa de reproducción del organismo invasor o lo dañan, inhiben o matan, "protegiendo" así al hospedador de una enfermedad clínica o subclínica y de una pérdida de productividad. Tal respuesta inmune protectora puede manifestarse comúnmente por la generación de anticuerpos que son capaces de inhibir la función metabólica del organismo invasor, conduciendo a un impedimento de su crecimiento normal, falta de reproducción y/o muerte.

El polipéptido así expresado puede ser un polipéptido de fusión que comprende una porción que despliega la inmunogenicidad, y un péptido adicional codificado por el ADN de la molécula recombinante fusionado a él, y que se traduce a la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1.

Los péptidos expuestos se pueden, por tanto, usar como inmunógeno. Estos inmunógenos pueden también ser usados como vacunas en animales, y más particularmente en mamíferos, incluyendo humanos, o producir una respuesta en la producción de anticuerpos en animales. Para ello, una cantidad efectiva inmunológicamente de al menos uno de estos péptidos recombinantes es administrado a mamíferos incluyendo humanos.

Un método alternativo de la producción de vacunas es el uso de técnicas de biología molecular para producir una proteína de fusión que contiene una o varias de las secuencias aminoacídicas de la presente invención y un péptido o proteína altamente inmunogénico/a, frente a una determinada infección o infestación.

Otro aspecto de la invención se refiere al sistema de expresión de la invención, la construcción genética de la invención, el plásmido de la invención o el péptido recombinante de la invención, para su uso como medicamento. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medicamento es una vacuna.

En otra realización preferida de la invención, la proteína fusionada o el péptido recombinante es BM95- SP1. El péptido BM95 podría ser utilizado para inducir respuesta inmune protectora contra las infestaciones por garrapatas Rhipicephalus microplus, en el ganado bovino.

El sistema de expresión, objeto de esta realización preferida de la invención, consta de un vector plasmídico con sistema de replicación para E. coli y marcador de selección mediante resistencia a antibiótico, preferiblemente ampicilina. En este vector se inserta un promotor eficiente en E. coli, como los derivados del operon lactosa (/ac) y triptofano (trip). Frente al promotor se inserta el gen codificante para un muíante de MSP1 a que carece de seis aminoácidos que preceden a los péptidos repetidos y los propios péptidos repetidos, pero que contiene los diez aminoácidos anteriores a la primera región transmembranal de la proteína comenzando con un codón de iniciación ATG. Finalmente se insertan los sitios de restricción Xhol y EcoRI para el clonaje de polipéptidos en fase con MSP1 a para la expresión expuesta sobre la membrana de E. coli. (FIG. 1). El sistema constituye un sistema novedoso de expresión de polipéptidos expuestos sobre células vivas de E. coli para diverso uso.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de aminoácidos idénticos entre dos secuencias aminoácidicas que se comparan.

Un "vector" es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar la replicación y/o expresión del segmento unido.

Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.

"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.

"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Un "marco de lectura libre" (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora completa.

Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a ARNm y/o se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.

Tal y como se usa en esta memoria, el término "transfección" se refiere a la introducción o transferencia de una molécula de ácido nucléico exógena en una célula eucariota, incluyendo, pero no limitándose a ella, una molécula de ácido ribonucléico o desoxiribonucleico (por ejemplo, ARN ó ADN desnudo).

El término "plásmido" se refiere a fragmento circular de ADN bicatenario, que se encuentra en el interior de casi todas las bacterias, y que actúan y se replican de forma independiente al ADN cromosómico bacteriano y pueden transferirse de unas bacterias a otras. Se utilizan como vectores en manipulación genética.

En el contexto de la presente invención el término "vacuna" se refiere a una preparación antigénica empleada para establecer la respuesta del sistema inmune a una enfermedad. Son preparados de antígenos que una vez dentro del organismo provocan la respuesta del sistema inmunitario, mediante la producción de anticuerpos, y generan memoria inmunológica produciendo inmunidad permanente o transitoria.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere, también, al sistema de expresión de la invención, la construcción genética de la invención, el plásmido de la invención o el péptido recombinante de la invención, capaz de generar una respuesta inmune frente a un organismo dado, que está causando dicha enfermedad en el hombre o los animales. Incluye, por tanto, lo que se conoce como vacuna, tal y como se ha definido previamente en esta memoria.

El término "antígeno" en esta memoria se refiere a una molécula (generalmente una proteína o un polisacárido) de superficie celular, que puede inducir la formación de anticuerpos. Hay muchos tipos de moléculas diferentes que pueden actuar de antígenos, como las proteínas o péptidos, los polisacáridos y, más raramente, otras moléculas como los ácidos nucleicos.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de péptidos o construcciones genéticas que permitan su expresión calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos péptidos, secuencias y construcciones y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia. Las composiciones proporcionadas por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Construcción del vector de expresión de la proteína fusionada BM95-MSP1 a (A). Representación esquemática del procedimiento usado para sintetizar la quimera BM95 y fusionarla a la mutante de MSP 1 a de A margínale, que carece de las secuencias repetidas en el extremo N-terminal, en el plásmido pAFORI (SEQ ID NO: 9) para generar la proteína fusionada en el vector de expresión pMBXAF3 (SEQ ID NO: 10). (B) Predicción de la secuencia (SEQ ID NO: 1 1) y estructura de la proteína fusionada MSP1a-BM95 expuesta sobre la membrana de E. coli. Las secuencias de la quimera bm95/BM95, msp1 a/MSP1 a y del plásmido se muestran en rojo, naranja y negro respectivamente. Se muestra la posición de los aminoácidos (aa) de BM95 incluidos en la quimera.

Figura 2. Expresión de las proteínas recombinantes MSP a, MSP1 b y de la proteína fusionada BM95-MSP1 a en E. coli. Las cepas de E. coli transformadas y la cepa control se indujeron con IPTG y se cultivaron durante 3.5 horas para la expresión de las proteínas recombinantes MSP1 a, MSP1 b y BM95-MSP1a fusionada (flechas). El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie y como marcador de peso molecular en la electroforesis se usó el ColorBurst (Sigma, Aldrich).

Figura 3. Cinética de expresión de la proteína fusionada BM95-MSP1 a en E. coli. (A) Las cepas fueron transformadas con el vector pMBXAF3, cultivadas en el fermentador e inducidas con IPTG para la expresión de la proteína fusionada BM95-MSP1 a (flecha). Se tomaron muestras equivalentes a 10 pg de proteínas totales a diferentes tiempos después de la inducción con IPTG y se corrieron en un gel de policarilamida al 10%. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie y como control se incluyó una cepa E. coli transformada sólo con el vector e inducida en las mismas condiciones. El marcador ColorBurst (Sigma, Aldrich) se usó como patrón de pesos moleculares en el gel de electroforesis. (B) El crecimiento celular se monitoreó midiendo la densidad óptica (OD60onm) del cultivo durante la fermentación. La concentración de proteínas se determinó mediante el sistema de electroforesis automatizado Experion (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y la concentración de las proteínas de interés se expresó como porciento de las proteínas totales (linea roja). El momento de inducción con IPTG se indica en la figura.

Figura 4. Localización de la proteína recombinante BM95-MSP1 a en la fracción de proteínas insolubles asociadas a las membranas de E. coli. Muestras equivalentes a 10 g de proteínas totales de E. coli transformadas sólo con el vector (C-) ó con los vectores de expresión de MSP1 a o BM95-MSP1 a (C+), después de 3.5 h. de inducción, se cargaron en cada pocilio de un gel de policacrilamida al 10%. Las células de E. coli que expresaron las proteínas recombinantes MSP1 a y BM95-MSP1 a fueron lisadas por sonicación y las fracciones de proteínas solubles e insolubles asociadas a membranas se separaron por centrifugación. 5 pg de proteínas totales de la fracción insoluble (P) fueron cargados en los pocilios del gel. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie y como marcador de pesos moleculares en la electroforesis se usó el patrón ColorBurst (Sigma, Aldrich). La posición de las proteínas recombinantes se indica con flechas.

Figura 5. Exposición de la proteína fusionada BM95-MSP1 a sobre la superficie de E. coli. En la inmunofluorescencia de células vivas de las cepas de E. coli transformadas que expresaron las proteínas MSP1 a (A-E), MSP1 b (F-J) y la proteína fusionada BM95-MSP1 a (K-O) estas reaccionaron con el anticuerpo primario o el suero pre-inmune (B, G, L), MSP1a (C, H, M), BM86 (D, I, N) y BM95- SP1a (E, J, O), seguido por una reacción secundaria con un anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de conejo marcado con peroxidasa (Aumento 1000X).

Figura 6. Reconocimiento de la proteína fusionada BM95- SP1 a por anticuerpos anti-BM86. Muestras equivalentes a 10 pg de proteínas totales de E. coli, después de 3.5 h de inducción con IPTG para expresar las proteínas recombinantes MSP1a o BM95-MSP1 a, se cargaron en cada pocilio, en un gel de poliacrilamida al 10%. Como control positivo se usaron 6 pg de la proteína recombinante BM86. Para el análisis de Western-blot, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa, expuestas a anticuerpos de conejo contra BM86 y reveladas con el conjugado anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano. La posición de la proteina fusionada y de la BM86 se indica con flechas. En la electroforesis de proteínas se usó como marcadores de peso molecular: ß-galactosidasa: 125 kDa; fosforilasa: 101 kDa y albúmina sérica bovina: 56.2 kDa (BioRad, Richmond, CA, USA).

EJEMPLOS DE REALIZACION DE LA INVENCIÓN.

EJEMPLO 1. CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR DE EXPRESION DE LA PROTEÍNA FUSIONADA A MSP1a El plásmido pAF0R1 se construyó para expresar una proteína mutante de MSP1a que no contiene las secuencias repetidas de aminoácidos. El gen mspl a que proviene del clon per1 , del aislado Oklahoma se amplificó mediante PCR. Este gen codifica para una mutante MSP1 a que carece de seis aminoácidos antes de las secuencias repetidas; pero que contiene los 10 aminoácidos anteriores a la primera región transmembranal de la proteína. Los primers introdujeron un codón de iniciación ATG y los sitios de restricción EcoRI y Bglll para la clonación en fase de la secuencia que codifica para el polipéptido recombinante, todo en un vector para la expresión en E. coli.

La proteína quimera de Bm95 se construyó mediante una PCR para resultar en un gen codificante de manera que la proteína tuviera los tres péptidos inmunogénicos (SEQ ID NO: 3) que corresponden a las secuencias de aminoácidos 21 a 35; 132 a 147 y 397 a 410 de BM95 respectivamente (SEQ ID NO: 4) (Figs. 1 A y 1 B).

Primero se sintetizaron dos oligonucleótidos, el Bmtin5 (SEQ ID NO: 5) y el Bmtin3 (SEQ ID NO: 6) y se hibridaron en la región central de solapamiento (región de solapamiento Tm=92 °C) (Fig. 1A). Posteriormente se realizó una reacción de PCR con los oligonucleótidos B5 (SEQ ID NO: 7) y B3 (SEQ ID NO: 8) para amplificar la quimera de Bm95 e introducir un codón de iniciación ATG y los sitios para las enzimas de restricción Xhol y EcoRI para la clonación en el vector pAFORI (Fig. 1A).

La reacción de PCR se realizó usando 10 pmol de cada primer en un volumen final de 50 µ? (1.5 mM MgS04, 1 X tampón RT/Thermus flavus (Tfl) del virus de la mieloblastosis aviaria (AMV), 0.2 mM de cada deoxinucleótido trifosfato (dNTP), 5 unidades de AMV RT, y 5 unidades de Tfl ADN polimerasa) empleando el sistema RT-PCR Access (Promega, Madison; Wl, EU). Las reacciones tuvieron lugar en un termociclador automático Techne (modelo TC-512, Cambridge, Inglaterra) durante 35 ciclos. Después de un paso inicial de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, cada ciclo consistió de una etapa de desnaturalización a 94 °C durante de 30 segundos y una etapa de anillamiento/extensión de 1 min a 68 °C. Los productos de la PCR se visualizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se comparó el tamaño de los fragmentos amplificados con un patrón de bandas (1 Kb Plus DNA Ladder, Promega). El producto de PCR (amplicón) se purificó en columnas de resina (Wízard, Promega), y fue digerido con las enzimas Xhol y EcoRI para clonarlo en el vector pAFORI y generar el vector pMBXAF3 para la expresión de la proteína fusionada BM95-MSP1a (Fig. 1A).

La proteína MSP1 a contiene péptidos repetidos en la región N-terminal que se exponen sobre la superficie de A. margínale y que están involucrados en la interacción del patógeno con los receptores de las células hospedadoras. El tamaño de las regiones repetidas de SP1 a varía entre 28 y 289 aminoácidos. Estas regiones también se exponen sobre la superficie de la bacteria cuando la proteína recombinante es expresada en E. coli.

El plásmido pAFORI codificante para una mutante de MSP1a que carece de 6 aminoácidos antes de las secuencias repetidas; pero que contiene 10 aminoácidos antes de la primera región transmembranal de la proteína putativa se usó como vector para la expresión de los péptidos de BM95 expuestos sobre la superficie de £ coli. La quimera BM95 expresada en este estudio presentó 29 aminoácidos (Fig. 1 B), lo que la sitúa dentro del rango de tallas de las secuencias repetidas de MSP1 a. Adicionalmente, el promotor tac del vector pARORI , que es altamente inducible, permitió altos niveles de expresión de las proteínas recombinantes SP1 a nativa, MSP1 a mutante y MSP1 b.

EJEMPLO 2. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA FUSIONADA BM95-MSP1a.

Los plásmidos fueron transformados en la cepa JM109 de E. coli para la inducción de la expresión de la proteína recombinante BM95-MSP a, tal y como ocurre con las proteínas nativas SP1 a y MSP1 b, usadas como control en los experimentos. En las construcciones, los genes expresados estuvieron bajo el control del promotor de inducción tac. Las cepas de £ coli transformadas se cultivaron en medio LB (Luria-Bertani) suplementado con 50 g/ml de ampicilina y 0.4% (p/v) de glucosa, a 37 °C hasta una densidad óptica de 0.4 uDO600nm. Para inducir la expresión de las proteínas recombinantes se adicionó Isopropil- -D-tio-galactósido (IPTG) hasta una concentración final de 0.5 mM y la incubación se continuó durante 3.5 horas.

Para producir las proteínas recombinantes, las cepas de E. coli transformadas se cultivaron en 10 mi de medio LB durante 2 horas en un agitador orbital a 37 °C y 200 rpm. Posteriormente los cultivos se inocularon en 250 mi de medio, se incubaron en las mismas condiciones durante 4 h hasta alcanzar 1 uDO600nm y se usaron para inocular un fermentador Biostast Bplus (B. Braun Biotech, elsungen, Alemania) con 4 L de medio de cultivo. Las fermentaciones en realizaron a 37 °C y pH 7.0 controlado por adición de HCI 1 M ó NaOH 4M y a una concentración de oxígeno disuelto en el medio superior al 30%, controlada mediante agitación a flujo de aire constante de 0.5 l/min. El cultivo se creció hasta 0.4 uDO600nm, se le añadió IPTG hasta una concentración final de 0.5 m y se continuó la fermentación durante 3.5 h más para inducir la expresión de las proteínas recombinantes. El crecimiento celular se monitoreó a lo largo de todo el proceso midiendo la densidad óptica a 600 nm.

Las células se cosecharon por centrifugación a 3,800 x g durante 10 min a 4 °C y posteriormente muestras de 1 g de las células precipitadas se resuspendieron en 5 mi de solución tampón de ruptura (Tris-HCI 100 mM pH 7.5, NaCI 150 mM, PMSF 1 mM, MgCI2 x 6H20 5 mM y Tritón X-100 0.1 % (v/v)). Para romper las células se empleó un sonicador Heidolph DIAX 900 (Bandelin Sonopuls, Berlín, Alemania) equipado con una micropunta de titanio, modelo MS73, de 3 mm de diámetro y 192 mm de longitud que se sumergió 10 mm en la suspensión de células. La frecuencia del equipo se fijó en 20kHz y la potencia acústica en 70 kW. Durante la ruptura, la suspensión de células en tubos de 15 mi se mantuvo en un baño helado para prevenir el sobrecalentamiento. El ciclo de ruptura consistió de intervalos de 5 segundos de actuación y 5 segundos de descanso hasta completar 10 minutos de tiempo de ruptura total. Después de la ruptura la fracción de proteínas insolubles asociadas a membrana se separó de las proteínas solubles por centrifugación a 12,500 x g durante 15 min a 4 °C y se almacenó a -20 °C. Posteriormente esta fracción se resolvió en un gel de electroforesis como se describe más adelante, y la banda de la proteína de interés se extrajo del gel para usarla en los experimentos de inmunización en conejos.

Los niveles de expresión de las proteínas recombinantes y las concentraciones de proteínas durante la fermentación y en los pasos de purificación se determinaron usando el sistema semiautomático para electroforesis Experion (Bio-Rad, Hercules, CA, EU). Para hacer las determinaciones se cargaron 4 µ? de las muestras en el Chip Pro 260 (Experion, Bio-Rad) y se analizaron en el Experion siguiendo las instrucciones del fabricante.

La expresión de las proteínas recombinantes se detectó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% (Criterion XT, Bio-Rad). Las muestras, de 10 pg de proteínas totales, fueron aplicadas en cada pocilio y las corridas electroforéticas se realizaron a corriente constante de 20mA durante 4 h. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R250 o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa PROTRAN BA85 (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania) en una unidad de transferencia semi-seca Minie-Genie Electroblotter (Idea Scientific, Corvallis, OR, E.U.) siguiendo las instrucciones del fabricante, para luego ser analizadas por Western blot.

Para el análisis por Western blot, las membranas de nitrocelulosa se bloquearon con una solución de leche semidesnatada al 5 % (p/v) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron tres veces en solución de tris tramponada (TBS, Tris-HCI 25 mmol/L, NaCI 150 mmol/L, pH 7.6) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el suero de los conejos inmunizados previamente con Gavac (Revetmex, México) o con las vacunas que contenían las proteínas recombinantes.

Los antisueros de conejo fueron diluidos a concentraciones de 1:1000 o 1 :5000 respectivamente en una solución al 3% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) en solución tampón TBS. Posteriormente, las membranas se lavaron otras tres veces TBS y se incubaron nuevamente con un anticuerpo policlonal anti-lgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (horseradish peroxidase, HRP, Sigma-Aldrich) diluido 1 :1000 en TBS. Después de lavar nuevamente las membranas se rebeló el color empleando el sustrato 3,3'5,5' tetrametilbenzidina (TMB, Promega, EUA) durante 20 minutos.

El ensayo dé ¡nmunofluorescencia de células vivas, para detectar la expresión de la proteína recombinante fusionada BM95-MSP1 a, se hizo usando los anticuerpos policlonales contra MSP1 a, BM86 y la proteína fusionada BM95-MSP1 a producidos en conejos. Como controles positivos y negativos se incluyeron las proteínas recombinantes MSP1 a y MSP1 b expresadas en E. coli.

Las células inducidas de 1 mi de cultivo (aproximadamente 3x108) se separaron por centrifugación a 5000 x g durante 5 min. y se lavaron con 1 mi de solución tamponada de fosfatos (PBS). Se colectaron nuevamente por centrifugación, se resuspendieron en 100 µ? de suero de conejo preinmune o inmune y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, fueron nuevamente separadas, lavadas con PBS y resuspendidas en 100 µ? de solución de IgG de cabra anti-conejo marcado con fluoresceína (KPL, Inc., Gaithersburg, MD, USA) diluida 1 :100 en suero de cabra al 3% (Sigma Aldrich) en PBS. Se incubaron nuevamente, durante 30 minutos a temperatura ambiente, y el complejo célula-anticuerpos se separó por centrifugación, se lavó con PBS y se resuspendió en 100 µ? de suero de cabra al 3% en PBS. Finalmente las células fueron extendidas en laminillas de vidrio y secadas al aire, antes de ser fijadas en metanol y lavadas con PBS. Las extensiones de células secas se montaron sobre un portaobjetos con Mowiol/glicerol/1 ,4-diazab¡ciclo-(2,2,2)-octano (DAPCO, Sigma) y se examinaron con un microscopio de epífluorescencia (Eclipse 50i, Nikon Instruments Inc., Melville, Y, USA).

Con el plásmido pMBXAF3 construido se logró un alto nivel de expresión de la proteína fusionada BM95-MSP1 a en E. coli. En el fermentador, la proteína fusionada B 95-MSP1a comenzó a acumularse después de las 0.5 h. de inducción con IPTG y su concentración final alcanzó el 2.8 % de la proteína total producida por las células a las 3.5 h. de inducción (Figs. 3A and 3B).

El peso molecular de la proteína fusionada BM95-MSP a se estimó entre 65 y 70 kDa por SDS-PAGE (Figs. 2 and 3A). Este valor estuvo en concordancia con la estimación teórica de 67 kDa, de los cuales, 62 kDa corresponden a los 5 primeros aminoácidos que preceden a la proteína quimera BM95 y a la región de MSP1 a y 5 kDa a la quimera BM95 (Fig. 1 B).

Se realizó un experimento para caracterizar y purificar a la proteína fusionada BM95-MSP1 a. Las células de E. coli se rompieron por sonicación y, las fracciones de proteínas solubles e insolubles asociadas a membranas se separaron por centrifugación. Los resultados mostraron que, tanto la proteína fusionada BM95-MSP1 a como la proteína recombinante MSP1a, se localizan en la fracción insoluble asociada a las membranas y no hubo evidencias de su acumulación en el citoplasma (Fig. 4).

EJEMPLO 3. INMUNIZACIÓN DE CONEJOS Y PREPARACIÓN DE ANTISUEROS.

Tres grupos de dos conejos de raza Nueva Zelanda se inmunizaron en las semanas 0, 3 y 6 con dosis de 1 mi que contenían 50 pg de las proteínas purificadas MSP1 a y de fusión BM95-MSP1a, adyuvadas en Montanide ISA 50 V2 (Seppic, París, Francia), y BM86 (Gavac, Revetmex, México). Las vacunas se suministraron por vía subcutánea usando una jeringa de tuberculina con aguja de 27½G. Dos semanas después de la última inmunización se tomaron muestras de sangre de cada conejo en tubos estériles, se trasladaron al laboratorio, se obtuvieron los sueros por centrifugación y posteriormente se almacenaron a -20 °C. Los conejos se mantuvieron y cuidaron de acuerdo con las normas de Uso de Animales de Laboratorio.

Se hizo un estudio de inmunofluorescencia con células vivas (IFA) para analizar si la proteína fusionada BM95-MSP1a estaba expuesta sobre la superficie de E. coli (Fig. 5). Empleando como controles células de E.coli que expresaron las proteínas recombinantes MSP1 a y MSP1 b y usando los sueros de conejo pre-inmune se obtuvieron los resultados esperados (Figs. 5A-L). Además de ello, la IFA de la cepa de E. coli que expresó la proteína de fusión B 95-MSP1a mostró que la proteína estaba expuesta sobre la superficie de las células (Figs. 5K-0).

La caracterización antigénica de la proteína de fusión BM95-MSP1a se realizó por inmunofluorescencia de células vivas. La proteína BM95-MSP1a no sólo fue reconocida por los anticuerpos específicos de conejo inmunizado con la proteína fusionada (Fig. 50), sino también por anticuerpos contra la proteína MSP1a (Fig. 5M) y contra BM86 (Fig. 5N). Además, los sueros de conejos inmunizados con la proteína recombinante reconocieron a la proteína fusionada mediante Western-blot (Fig. 6). Estos resultados indicaron que los epítopos de la proteína fusionada que son expuestos sobre la superficie de la célula se reconocieron por anticuerpos anti-B 86 y demostraron que los epítopos de BM95 se tradujeron correctamente y mantuvieron su antigenicidad aún después de la fusión.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Sistema de expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana caracterizado porque comprende una región de anclaje a la membrana bacteriana y el péptido expuesto, donde la región de anclaje a la membrana bacteriana es cualquiera de las siguientes secuencias: a. Péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 ; o b. Una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con la SEQ ID NO: 1 ;

2. Sistema de expresión de péptidos según la reivindicación anterior, donde la bacteria es E. coli.

3. Construcción genética que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a. secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia aminoacídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, o b. moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c. moléculas de ácido nucléico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d. secuencia de nucleótidos de a), b), ó c), preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

4. Plásmido que comprende la construcción genética según la reivindicación 3.

5. Método para elaborar el sistema de expresión de péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, que comprende los siguientes pasos: a. Introducir una construcción genética según la reivindicación, 3 o un plásmido según la reivindicación 4, en una célula hospedante. b. Incubar la célula hospedante según a. en un medio de reacción adecuado.

6. Método según la reivindicación anterior, donde la célula hospedante es E. coli.

7. Péptido recombinante que comprende la secuencia aminoacídica de la invención y la secuencia de aminoácidos del péptido expuesto, obtenido a partir del sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, de la construcción genética según la reivindicación 3, o del plásmido según la reivindicación 4.

8. Sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, construcción genética según la reivindicación 3, plásmido según la reivindicación 4 o péptido recombinante según la reivindicación 7, para su uso como medicamento.

9. Sistema de expresión según la reivindicación anterior, donde el medicamento es una vacuna.

10. Sistema de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la secuencia de aminoácidos del péptido expuesto comprende la SEQ ID NO: 3.

11. Uso del sistema de expresión según la reivindicación anterior para la elaboración de una vacuna para inmunizar frente a garrapatas del género Rhipicephallus.

12. Uso del péptido recombinante según la reivindicación 7 como inmunógeno.